BRPI0719288A2 - Polipeptídeos heterodiméricos il-17a/f e usos terapêuticos dos mesmos - Google Patents

Polipeptídeos heterodiméricos il-17a/f e usos terapêuticos dos mesmos Download PDF

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Sarah Hymowitz
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- DEOS HETERODIMÉRICOS IL-17A/F E USOS TERAPÊUTICOS DOS MESMOS".
CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se de modo geral à identificação e
ao isolamento de uma nova citocina humana designada aqui, neste relatório descritivo, como interleucina-17A/F (IL-17A/F).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Proteínas extracelulares desempenham papéis importantes, en- tre outras coisas, na formação, diferenciação e manutenção de organismos multicelulares. O destino de muitas células individuais, por exemplo, prolife- ração, migração, diferenciação, ou interação com outras células, é tipica- mente governado por informação recebida de outras células e/ou do ambien- te imediato. Esta informação é frequentemente transmitida por polipeptídeos secretados (por exemplo, fatores mitogênicos, fatores de sobrevida, fatores citotóxicos, fatores de diferenciação, neuropeptídeos, e hormônios) os quais são, por sua vez, recebidos e interpretados por diversos receptores celulares ou proteínas ligadas a membrana. Estas fitas polipeptídeos secretados ou moléculas de sinalização normalmente passam através do caminho secretor celular para atingir seu sítio de ação no ambiente extracelular.
Proteínas secretadas têm várias aplicações industriais, incluindo como farmacêuticos, diagnósticos, biossensores e biorreatores. A maioria dos fármacos de proteínas disponíveis atualmente, tais como agentes trom- bolíticos, interferons, interleucinas, eritropoietinas, fatores estimulantes de 25 colônia, e várias outras citocinas, são proteínas secretoras. Seus receptores, os quais são proteínas de membrana, também têm potencial como agentes terapêuticos ou diagnósticos.
Proteínas ligadas a membrana e receptores podem desempe- nhar papéis importantes, entre outras coisas, na formação, diferenciação e manutenção de organismos multicelulares. O destino de muitas células indi- viduais, por exemplo, proliferação, migração, diferenciação, ou interação com outras células, é tipicamente governado por informação recebida de outras células e/ou do ambiente imediateo. Esta informação é frequentemen- te transmitida por polipeptídeos secretados (por exemplo, fatores mitogêni- cos, fatores de sobrevida, fatores citotóxicos, fatores de diferenciação, neu- ropeptídeos, e hormônios) os quais são, por sua vez, recebidos e interpreta- dos por diversos receptores celulares ou proteínas ligadas a membrana. As proteínas ligadas a membrana e os receptores celulares referidos incluem, mas não estão limitados a, receptores de citocina, quinases receptoras, fos- fatases receptoras, receptores envolvidos em interações célula-célula, e mo- léculas de adesina celular como selectinas e integrinas. Por exemplo, trans- dução de sinais que regulam o crescimento e a diferenciação celular é regu- lada em parte por fosforilação de várias proteínas celulares. Tirosina quina- ses protéicas, enzimas que catalisam este processo, também podem agir como receptores de fatores de crescimento. Exemplos incluem receptor de fatores de crescimento de fibroblastos e receptor de fatores de crescimento nervoso.
Similarmente a proteínas secretadas, proteínas ligadas a mem- brana e moléculas receptoras têm várias aplicações industriais, inclusive como agentes farmacêuticos e diagnósticos. Imunoadesinas receptoras, por exemplo, podem ser empregadas como agentes terapêuticos para bloquear 20 interações entre receptor-ligante. As proteínas ligadas à membrana também podem ser empregadas para triagem de inibidores de molécula pequena ou peptídeo potencial da interação entre receptor/ligante relevante.
Estão sendo empreendidos esforços tanto pela indústria quanto pela academia para identificar novas, proteínas secretadas nativas e recep- 25 tores nativos ou proteínas ligadas a membrana. Muitos esforços estão focali- zados na triagem de bibliotecas de DNA recombinante de mamíferos para identificar as seqüências codificantes para novas proteínas secretadas. E- xemplos de métodos e técnicas de triagem são descritos na literatura [vide, por exemplo, Klein et ai, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 7108-7113 (1996); e a 30 Patente dos Estados Unidos No. 5.536.637)].
A este respeito, a presente invenção se refere à identificação de novos polipeptídeos secretados da família de interleucina-17 (IL-17) os quais se mostrou que estão relacionados com doença inflamatória e imunomedia- da. Doenças imunorrelacionadas e inflamatórias são as manifestação ou conseqüência de caminhos biológicos razoavelmente complexos, frequen- temente múltiplos interconectados os quais na fisiologia normal são cruciais 5 para responder a insulto ou lesão, iniciam reparo de insulto ou lesão, e mon- tam defesa inata e adquirida contra organismos estranhos. Ocorre doença ou patologia quando estas fitas caminhos fisiológicos normais causam insul- to ou lesão adicional quer diretamente relacionado com a intensidade da resposta, como uma conseqüência de regulação anormal ou estimulação 10 excessiva, como uma reação a si próprio, ou como uma combinação destas fitas.
Embora a gênese destas doenças frequentemente envolva ca- minhos multi-etapas e frequentemente múltiplos sistemas biológi- cos/caminhos diferentes, intervenção em pontos críticos em um ou mais des- 15 tas fitas caminhos pode ter um efeito de melhora ou terapêutico. Pode ocor- rer intervenção terapêutica ou por antagonismo de um processo/caminho prejudicial ou por estimulação de um processo/caminho benéfico.
Muitas doenças imunorrelacionadas são conhecidas e têm sido extensivamente estudadas. Semehlantes doenças incluem doenças inflama- 20 tórias imunomediadas (tais como artrite reumatoide, doença renal imuno mediada, doenças hepatobiliares, doença intestinal inflamatória (IBD), psorí- ase, e asma), doenças inflamatórias não-imunomediadas, doenças infeccio- sas, doenças por imunodeficiência, neoplasia, e etc.
Linfócitos T (células T) são um importante componente de uma 25 reação imune dos mamíferos. As células T reconhecem antígenos os quais estão associados com uma auto-molécula codificada por genes dentro do complexo de histocompatibilidade maior (MHC). O antígeno pode ser apre- sentado junto com moléculas do MHC sobre a superfície de células apresen- tando antígeno, células infectadas por vírus, células cancerígenas, enxertos, 30 e etc. O sistema de células T elimina estas células alteradas as quais apre- sentam uma ameaça à saúde para o mamífero hospedeiro. As células T in- cluem células T auxiliares e células T citotóxicas. As células T auxiliares se proliferam extensivamente depois do reconhecimento de um complexo antí- geno-MHC sobre uma célula apresentando antígeno. As células T auxiliares também secretam uma variedade de citocinas, isto é, linfocinas, as quais têm um papel central na ativação de células B1 células T citotóxicas e uma 5 variedade de outras células as quais participam da reação imune.
Um evento central tanto em reações imunes humorais quanto mediadas por células é a ativação e a expansão clonal de células T auxilia- res. A ativação de células T auxiliares é iniciada pela interação do complexo de receptor de células T (TCR) - CD3 com um antígeno-MHC sobre a super- 10 fície de uma célula apresentando antígeno. Esta interação media uma cas- cata de eventos bioquímicos que induz a célula T auxiliar em repouso a en- trar em um ciclo celular (a transição GO para G1) e resulta na expressão de um receptor de alta afinidade para IL-2 e algumas vezes IL-4. A célula T ati- vada progride através do ciclo proliferando e diferenciando em células de 15 memória ou células efetoras.
Além dos sinais mediados através do TCR1 a ativação de células T envolve coestimulação adicional induzida por citocinas liberadas pela célu- la apresentando antígeno ou através de interações com moléculas ligadas à membrana sobre a célula apresentando antígeno e a célula T. Foi demons- 20 trado que as citocinas IL-1 e IL-6 proporcionam um sinal coestimulatório. Além disso, a interação entre a molécula B7 expressada sobre a superfície de uma célula apresentando antígeno e moléculas CD28 e CTLA-4 expres- sadas sobre a superfície de células T efeta a ativação de células T. As célu- las T ativadas expressam um número crescente de moléculas de adesão 25 celular, tais como ICAM-1, integrinas, VLA-4, LFA-1, CD56, e etc.
A proliferação de células T em uma cultura mista de linfócitos ou em uma reação de linfócitos mistos (MLR) é uma indicação estabelecida da capacidade de um composto para estimular o sistema imune. Em muitas reações imunes, as células inflamatórias se infiltram no sítio de lesão ou de 30 infecção. As células migrantes podem ser neutrofílicas, eosinofílicas, mono- cíticas ou linfocíticas conforme pode ser determinado por exame histológico dos tecidos afetados. Current Protocols in Immunoloqy. ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.
As doenças imunorrelacionadas podem ser tratadas suprimindo a reação imune. O uso de anticorpos neutralizantes os quais inibem molécu- las tendo atividade estimulatória imune seria benéfico no tratamento de do- 5 enças imunomediadas e inflamatórias. Moléculas as quais inibem a reação imune podem ser utilizadas (proteínas diretamente ou através do uso de a- gonistas de anticorpos) para inibir a reação imune e deste modo melhorar doença imunorrelacionada.
lnterleucina-17 (IL-17) é uma molécula pró-inflamatória derivada de células que estimula células epiteliais, endoteliais e fibroblásticas para produzir outras citocinas inflamatórias e quimocinas incluindo IL-6, IL-8, G- CSF, e MCP-1 [vide, Yao, Z. et ai, J. Immunol.. 122(12): 5483-5486 (1995); Yao, Z. et ai, Immunitv, 3(6): 811-821 (1995); Fossiez, F., et al., J. Exp. Med.. 183(6): 2593-2603 (1996); Kennedy, J., et al., J. Interferon citocina Res., 16(8): 611-7 (1996); Cai, X. Y., et al., Immunol. Lett, 62(1): 51-8 (1998); Jovanovic, D.V., et al., J. Immunol., 160(7): 3513-21 (1998); Laan, M., et al., J. Immunol.. 162(4): 2347-52 (1999); Linden, A., et al., Eur Respir J, 15(5): 973-7 (2000); e Aggarwal, S. and Gurney, A.L., J Leukoc Biol1 71(1): 1-8 (2002)]. IL-17 também sinergiza com outras citocinas incluindo TNF-α e IL- 1β para induzir adicionalmente a expressão de quimocinas (Chabaud, M., et al., J. Immunol. 161(1): 409-14 (1998)). Interleucina 17 (IL-17) apresenta ati- vidades biológicas pleitrópicas sobre vários tipos de células. IL-17 também tem a capacidade de induzir a expressão superficial de ICAM-1, a prolifera- ção de células T, e o crescimento e a diferenciação de progenitoras huma- nas CD34+ em neutrófilos. IL-17 também foi implicado no metabolismo ósseo, e foi sugerido que desempenha um importante papel em condições patológi- cas caracterizadas pela presença de células T ativadas e a produção de TNF-α tais como artrite reumatoide e o afrouxamento de implantes ósseos (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14: 1513-1521 [1999]). Foi visto que as células T ativadas de tecido sinovial derivado de pacientes com artri- te reumatoide secretam maiores quantidades de IL-17 do que as derivadas de indivíduos normal ou de pacientes com osteoartrite (Chabaud et al., Art- hritis Rheum., 42: 963-970 [1999]). Foi sugerido que esta citocina proinfla- matória contribui ativamente para inflamação sinovial na artrite reumatoide. À parte de sua função proinflamatória, IL-17 parece contribuir para a patolo- gia da artrite reumatoide por ainda outro mecanismo. Por exemplo, foi de- 5 monstrado que IL-17 induz a expressão de mRNA do fator de diferenciação de osteoclastos (ODF) em osteoblastos (Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: 1345-1352 [1999]). ODF estimula a diferenciação de células progenitoras em osteoclastos, as células envolvidas na reabsorção óssea. Como o nível de IL-17 está significativamente aumentado no fluido sinovial de pacientes com 10 artrite reumatoide, parece que a formação de osteoclastos induzida por IL-17 tem um papel crucial na reabsorção óssea na artrite reumatoide. Também se acredita que IL-17 tenha um papel chave em alguns outros distúrbios autoi- munes tais como esclerose múltipla (Matusevicius et al., Mult. Scler.. 5: 101- 104 (1999); Kurasawa, K., et al., Arthritis Rheu 43(11): 2455-63 (2000)) e 15 psoríase (Teunissen, M.B., et al., J Invest Dermatol 111(4): 645-9 (1998); Albanesi, C., etal.. J Invest Dermatol 115(1): 81-7 (2000); e Homey, B., etal., J. Immunol. 164(12: 6621-32 (2000)).
Foi adicionalmente demonstrado que IL-17, por sinalização in- tracelular, estimula o influxo de Ca2+ e uma redução em [cAMP], em macró- 20 fagos humanos (Jovanovic et al., J. Immunol.. 160: 3513 [1998]). Fibroblas- tos tratados com IL-17 induzem a ativação de NF-κΒ, [Yao et al., Immunitv. 3: 811 (1995), Jovanovic et al., supra], ao passo que macrófagos tratados com este ativam NF-κΒ e quinases protéicas ativadas por mitógeno (Sha- Iom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273: 27467 [1998]). Adicionalmente, IL-17 25 também partilha similaridade de seqüência com fator 7 semelhante a citocina de mamífero que está envolvido no crescimento dos ossos e de cartilagem. Outras proteínas com as quais polipeptídeos IL-17 partilham similaridade de seqüência são fator relacionado com interleucina derivada de embrião hu- mano (EDIRF) e interleucina-20.
Consistente com a ampla faixa de efeitos de IL-17, foi visto que
o receptor superficial celular para IL-17 é amplamente expressado em mui- tos tecidos e tipos celulares (Yao et al., citocina, 9: 794 [1997]). Apesar da seqüência de aminoácidos do receptor de IL-17 humana (IL-R) (866 aminoá- cidos) prever uma proteína com um único domínio transmembrana e um domínio intracelular longo, de 525 aminoácidos de extensão, a seqüência do receptor é única e não é similar à de quaisquer dos receptores da família de 5 receptores de citocinas/fatores de crescimento. Isto ligado à falta de similari- dade da própria IL-17 a outras proteínas conhecidas indica que IL-17 e seu receptor podem ser parte de uma nova família de proteínas de sinalização e receptores. Foi demonstrado que a atividade de IL-17 é mediada através de ligação a seu único receptor superficial celular (designado aqui, neste relató- 10 rio descritivo, como IL-17R humano), em que estudos prévios mostraram que contactar células T com uma forma solúvel do polipeptídeo receptor de IL-17 inibiu a proliferação de células Tea produção de IL-2 induzida por PHA, concanavalina A e anticorpo monoclonal anti-TCR (Yao et al., J. Im- munol., 155: 5483-5486 [1995]). Deste modo, há significativo interesse em 15 identificar e caracterizar novos polipeptídeos tendo homologia com os recep- tores de citocina conhecidos, especificamente receptores de IL-17.
Interleucina 17 é agora reconhecida como o protótipo do mem- bro de uma família emergente de citocinas. O sequenciamento em larga escala dos genomas humano e de outros vertebrados revelou a presença de 20 genes adicionais codificando proteínas claramente relacionadas com IL-17, deste modo definindo uma nova família de citocinas. Há no mínimo 6 mem- bros da família IL-17 em seres humanos e camundongos incluindo IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F bem como novos receptores IL-17RH1, IL- 17RH2, IL-17RH3 e IL-17RH4 (vide a publicação de patente internacional No. 25 WO 01/46420 publicada em 28 de junho de 2001). Foi demonstrado que um membro IL-17 semelhante (designado como IL-17F) que liga ao receptor de IL-17 humano (IL-17R) (Yao etal., citocina, 9(11): 794-800 (1997)). Caracte- rização inicial sugere que, como IL-17, várias destas moléculas recém identi- ficadas têm a capacidade de modular a função imune. As potentes ações 30 inflamatórias que foram identificadas para vários destas fitas fatores e as associações emergentes com as principais doenças humanas sugere que estas proteínas podem ter muitas funções significativas em processos infla- matórios e podem oferecer oportunidades para intervenção terapêutica.
O gene codificando IL-17F humano está localizado adjacente a IL-17 (Hymowitz, S.G., et al., Embo J. 20(19): 5332-41 (2001)). IL-17 e IL- 17F partilham 44% de identidade de aminoácidos ao passo que os outros 5 membros da família IL-17 partilham uma identidade de aminoácidos mais limitada de 15 a 27% sugerindo que IL-17 e IL-17F formam um subgrupo distinto dentro da família IL-17 (Starnes, T., et al., J Immunol, 167(8): 4137- 40 (2001); Aggarwal, S. and Gurney, A.L., J. Leukoc Biol1 71(1): 1-8 (2002)). IL-17F parece ter ações biológicas similares a IL-17, e é capaz de promover 10 a produção de IL-6, IL-8, e G-CSF a partir de uma ampla variedade de célu- las. Similar a IL-17, é capaz de induzir a liberação da matriz de cartilagem e inibir nova síntese da matriz de cartilagem (vide o relatório descritivo dos Estados Unidos No. US-2002-0177188-A1 publicado em 28 de novembro de 2002). Deste modo, como IL-17, IL-17F pode potencialmente contribuir para 15 a patologia de distúrbios inflamatórios. Recentemente, estas fitas autores observaram que tanto IL-17 quanto IL-17F são induzidos em células T pela ação de interleucina 23 (IL-23) (Aggarwal, S., et al., J. Biol. Chem.. 278(3): 1910-4 (2003)). A observação de que IL-17 e IL-17F partilham localização cromossômica similar e significativa similaridade de seqüência bem como a 20 observação de que IL-17 e IL-17F parecem ser induzidos com a mesma po- pulação celular em resposta a alguns estímulos específicos levou à identifi- cação de uma nova citocina humana que consiste em um heterodímero co- valente de IL-17 e IL-17F (aqui, neste relatório descritivo, designado IL- 17A/F). IL-17A/F humana é uma citocina distintamente nova, diferenciável da 25 IL-17 e IL-17F humanas tanto na estrutura da protejína quanto em ensaios de atividade celular. Através do uso de IL-17A/F humana recombinante puri- ficada como um padrão, foi desenvolvido um ELISA específico para IL-17AF humana. Através do uso deste ELISA específico, foi detectada a expressão induzida de IL-17A/F humana, confirmando que IL-17A/F é produzido natu- 30 ralmente a partir de células T humanas ativadas em cultura. Portanto, IL- 17A/F é uma citocina distintamente nova, detectável como um produto natu- ral de células T humanas ativadas isoladas, cuja forma recombinante foi ca- racterizada, tanto na estrutura da proteína quanto em testas fitas celulares, como sendo diferente e distinguível de citocinas relacionadas. Portanto, es- tas fitas estudos proporcionam e identificam um novo estimulante imune (isto é, IL-17A/F) que pode reforçar o sistema imune para responder a um antíge- 5 no em particular que pode não ter sido imunologicamente ativo previamente. Deste modo, o estimulante imune recém identificado tem importantes aplica- ções clínicas. Esta nova citocina IL-17A/F ou agonistas da mesma, portanto encontrariam utilidade prática como um estimulante imune, ao passo que se esperaria que moléculas as quais inibem a atividade de IL-17A/F (antagonis- 10 tas) encontrassem utilidade prática quando se deseja uma inibição da rea- ção imune, tal como em doenças autoimunes. Especificamente, anticorpos para esta nova citocina os quais ou simulam (anticorpos agonistas) ou ini- bem (anticorpos antagonistas) as atividades imunológicas de IL-17A/F pos- suiriam qualidades terapêuticas. Pequenas moléculas as quais agem inibin- 15 do a atividade desta nova citocina também teriam aplicações terapêuticas potenciais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A. Modalidades
A presente invenção diz respeito a composições e métodos úteis
para o diagnóstico e tratamento de doença imunorrelacionada em mamíferos, incluindo humanos. A presente invenção se baseia na identificação de prote- ínas (incluindo anticorpos agonistas e antagonistas) as quais ou estimulam ou inibem a reação imune em mamíferos. Doenças imunorrelacionadas po- 25 dem ser tratadas suprimindo ou reforçando a reação imune. Moléculas que reforçam a reação imune estimulam ou potencializam a reação imune para um antígeno. Moléculas as quais estimulam a reação imune podem ser usa- das terapeuticamente onde seria benéfico o reforço da reação imune. Alter- nativamente, moléculas que suprimem a reação imune atenuam ou reduzem 30 a reação imune a um antígeno (por exemplo, anticorpos neutralizantes) po- dem ser usadas terapeuticamente onde seria benética a atenuação da rea- ção imune (por exemplo, inflamação). Por conseguinte, os polipeptídeos IL- 17A/F da presente invenção e agonistas e antagonistas dos mesmos tam- bém são úteis para preparar remédios e medicamentos para o tratamento de doenças imunorrelacionadas e inflamatórias. Em um aspecto específico, os remédios e medicamentos referidos compreendem uma quantidade terapeu- 5 ticamente eficaz de um polipeptídeo IL-17A/F, agonista ou antagonista do mesmo com um carregador farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, a mistura é estéril.
Em uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a um mé- todo para identificar agonistas de ou antagonistas para um polipeptídeo IL- 10 17A/F o qual compreende contactar o polipeptídeo IL-17A/F com uma molé- cula candidata e monitorar uma atividade biológica mediada pelo referido polipeptídeo IL-17A/F. Preferencialmente, o polipeptídeo IL-17A/F é um poli- peptídeo IL-17A/F de seqüência nativa. EM um aspecto específico, o agonis- ta ou antagonista de IL-17A/F é um anticorpo anti-IL-17A/F.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a uma composi-
ção de substância compreendendo um polipeptídeo IL-17A/F ou um anticor- po agonista ou antagonista o qual liga o polipeptídeo em mistura com um veículo ou excipiente. Em um aspecto, a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ou anticorpo. Em outro 20 aspecto, quando a composição compreende uma molécula imuno estimulan- te, a composição é útil para: (a) reforçar a infiltração de células inflamatórias em um tecido de um mamífero que necessite da mesma, (b) estimular ou reforçar uma reação imune em um mamífero que necessite da mesma, (c) aumentar a proliferação de linfócitos T em um mamífero que necessite da 25 mesma em resposta a um antígeno, (d) estimular a atividade de linfócitos T ou (e) aumentar a permeabilidade vascular. Em um aspecto adicional, quan- do a composição compreende uma molécula de inibição imune, a composi- ção é útil para: (a) reduzir a infiltração de células inflamatórias em um tecido de um mamífero que necessite da mesma, (b) inibir ou reduzir uma reação 30 imune em um mamífero que necessite da mesma, (c) reduzir a atividade de linfócitos T ou (d) reduzir a proliferação de linfócitos T em um mamífero que necessite da mesma em resposta a um antígeno. Em outro aspecto, a com- posição compreende um ingrediente ativo adicional, o qual pode ser, por exemplo, um anticorpo adicional ou um agente citotóxico ou quimioterápico. Preferencialmente, a composição é estéril.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um polipeptídeo IL-17A/F, um agonista do mesmo, ou um antagonista para o mesmo. Em um aspecto preferencial, o distúrbio imu- norrelacionado é selecionado entre o grupo consistindo em: lúpus eritemato- so sistêmico, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite crônica juvenil, espondi- loartropatias, esclerose sistêmica, miopatias inflamatórias idiopáticas, sín- drome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoi- mune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal i- munomediada, doenças desmielinantes dos sistemas nervosos central e pe- riférico tais como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa, hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangi- te esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, e doença de Whipple, doenças de pele autoimunes ou imunomediadas inclu- indo doenças de pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópi- ca, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão tais como pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite por hipersensibilidade, doenças associadas com transplante incluindo rejei- ção a enxerto e doença enxerto-versus-hospedeiro.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um anticorpo o qual especificamente liga a quaisquer dos polipeptídeos descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, anticorpo humanizado, fragmento de anticorpo ou anticorpo de cadeia única. Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado o qual liga um polipeptídeo IL-17A/F. Em outro aspecto, o anticorpo simula a atividade de um polipeptídeo IL-17A/F (um anticorpo agonista) ou ao contrário o anti- corpo inibe ou neutraliza a atividade de um polipeptídeo IL-17A/F (um anti- corpo antagonista). Em outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclo- nal, o qual preferencialmente tem resíduos de região determinante de com-
5 plementaridade não humana (CDR) e resíduos de região de estrutura huma- no (FR). O anticorpo pode ser rotulado e pode ser imobilizado sobre um su- porte sólido. Em um aspecto adicional, o anticorpo é um fragmento de anti- corpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia única, ou um anti- corpo anti-idiotípico. Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo ou anticor- 10 po de cadeia única compreende um fragmento Fab selecionado entre o gru- po consistindo da seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 6 como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 42, em que o referido fragmento Fab 20 adicionalmente compreende três regiões variáveis de cadeia pesada con- tendo CDR-H1 consistindo dos resíduos aminoácidos 7 a 16 de SEQ ID NOs: 9-42, CDR-H2 consistindo dos resíduos aminoácidos 30 a 46 de SEQ ID NOs: 9-42, e CDR-H3 consistindo do resíduo aminoácido 78 para no mí- nimo resíduo aminoácido 96 de SEQ ID NOs: 9-42, em que o referido frag- 25 mento Fab é capaz de ligar IL-17A/F. Em outro aspecto, o fragmento de an- ticorpo ou anticorpo de cadeia única compreende um fragmento Fab sele- cionado entre o grupo consistindo da seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 6 como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 30 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 42, em que o referi- do fragmento Fab adicionalmente compreende no mínimo região variável de 5 cadeia pesada contendo CDR-H1 consistindo dos resíduos aminoácidos 7 a
16 de SEQ ID NOs: 9-42, e CDR-H2 consistindo dos resíduos aminoácidos a 46 de SEQ ID NOs: 9-42, em que o referido fragmento Fab é capaz de ligar IL-17A/F. Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo ou anticorpo de cadeia única compreende um fragmento Fab selecionado entre o grupo con- sistindo da seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 6 como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 42, em que o referido fragmento Fab adicio- nalmente compreende no mínimo regiões variáveis de cadeia pesada con- tendo CDR-H1 consistindo dos resíduos aminoácidos 7 a 16 de SEQ ID NOs: 9-42 e CDR-H3 consistindo dos resíduo aminoácido 78 a no mínimo resíduo aminoácido 96 de SEQ ID NOs: 9-42, em que o referido fragmento Fab é capaz de ligar IL-17A/F. Em outro aspecto, o fragmento de anticorpo ou anticorpo de cadeia única compreende um fragmento Fab selecionado entre o grupo consistindo da seqüência de aminoácidos mostrada na Figura
6 como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID 30 NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 42, em que o referido frag- mento Fab adicionalmente compreende no mínimo regiões variáveis de ca- deia pesada contendo CDR-H2 consistindo dos resíduos aminoácidos 30 a 46 de SEQ ID NOs: 9-42, e CDR-H3 consistindo do resíduo aminoácido 78 5 para no mínimo o resíduo aminoácido 96 de SEQ ID NOs: 9-42, em que o referido fragmento Fab é capaz de ligar IL-17A/F. Em outro aspecto, o frag- mento de anticorpo ou anticorpo de cadeia única compreende um fragmento Fab selecionado entre o grupo consistindo da seqüência de aminoácidos mostrada na Figura 6 como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, 10 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID 15 NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, e SEQ ID NO: 42, em que o referido fragmento Fab adicionalmente compreende no mínimo uma da região variável de cadeia pesada contendo CDR-H1 consistindo dos resí- duos aminoácidos 7 a 16 de SEQ ID NOs: 9-42, CDR-H2 consistindo dos 20 resíduos aminoácidos 30 a 46 de SEQ ID NOs: 9-42, ou CDR-H3 consistindo do resíduo aminoácido 78 para no mínimo resíduo aminoácido 96 de SEQ ID Nos: 9-42, em que o referido fragmento Fab é capaz de ligar IL-17A/F. Em outro aspecto, a referida região CDR-H1 de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID 25 NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, 30 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 42 compreende no mínimo os resíduos aminoácidos 7-10 correspon- dentes à seqüência amino GFTI (designada aqui, neste relatório descritivo, como SEQ ID NO: 77), em que o referido SEQ ID NO: 77 é capaz de ligar IL- 17A/F. Em outro aspecto, a referida região CDR-H2 de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID 5 NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, 10 ou SEQ ID NO: 42 compreende no mínimo os resíduos aminoácidos 41-46 correspondentes à seqüência de aminoácidos YADSVK (designada aqui, neste relatório descritivo, como SEQ ID NO: 78), em que o referido SEQ ID NO: 78 é capaz de ligar IL-17A/F.
Em ainda outra modalidade, a invenção diz respeito a uma mo- lécula de ácido nucleico isolada selecionado entre o grupo consistindo da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica o fragmento Fab mostrado como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 42, em que o referido fragmento Fab é capaz de ligar a IL-17A/F.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um fragmento Fab isolado capaz de ligar IL-17A/F codificado por uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácidos semelhante conforme acima 5 descrito. Processos para produzir o mesmo também são descritos aqui, nes- te relatório descritivo,, em que estas fitas processos compreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor o qual compreende a mo- lécula de ácido nucleico codificante apropriada sob condições adequadas para expressão do referido fragmento Fab e recuperar o referido fragmento 10 Fab a partir da cultura celular.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um anticorpo anti-IL-17A/F em mistura com um carregador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, a compo- sição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo. 15 Preferencialmente, a composição é estéril. A composição pode ser adminis- trada sob a forma de uma formulação farmacêutica líquida, a qual pode ser preservada para obter prolongada estabilidade de armazenamento. Alterna- tivamente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticor- po, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo de cadeia única.
Em uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a um arti-
go de produção, compreendendo:
(a) uma composição de substância compreendendo um polipeptídeo
IL-17A/F ou agonista, antagonista, ou um anticorpo que especificamente liga ao referido polipeptídeo do mesmo;
(b) um recipiente contendo a referida composição; e
(c) um rótulo afixada ao referido recipiente, ou uma bula incluída no
referido recipiente referente ao uso do referido polipeptídeo IL-17A/F ou a- gonista ou antagonista do mesmo no tratamento de uma doença imunorrela- cionada. A composição pode compreender uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de o polipeptídeo IL-17A/F ou o agonista ou antagonista do mesmo.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um método para diagnosticar uma doença imunorrelacionada em um mamí- fero, compreendendo detectar o nível de expressão de um gene codificando um polipeptídeo IL-17A/F (a) em uma amostra de teste de células de tecido obtidas do mamífero, e (b) em uma amostra controle de células de tecido normal conhecido do mesmo tipo celular, em que um maior ou menor nível 5 de expressão na amostra de teste em comparação com a amostra controle indica a presença de doença imunorrelacionada no mamífero do qual foram obtidas as células do tecido de teste.
Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um método para diagnosticar uma doença imune em um mamífero, compreen- 10 dendo (a) contactar um anticorpo anti-IL-17A/F com uma amostra de teste de células de tecido obtidas do mamífero, e (b) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo e um polipeptídeo IL-17A/F, na amostra de teste; em que a formação do referido complexo é indicativa da presença ou ausên- cia da referida doença. A detecção pode ser qualitativa ou quantitativa, e 15 pode ser realizada em comparação com monitoração da formação de com- plexo em uma amostra controle de células de tecido normal conhecido do mesmo tipo celular. Uma maior quantidade de complexos formados na a- mostra de teste indica a presença ou ausência de uma doença imune no mamífero do qual foram obtidas as células de tecido de teste. O anticorpo 20 preferencialmente carrega um rótulo detectável. A formação de complexos pode ser monitorada, por exemplo, por microscopia ótica, citometria de fluxo, fluorimetria, ou outras técnicas conhecidas na técnica. A amostra de teste é geralmente obtida de um indíviduo suspeito de ter uma deficiência ou anor- malidade do sistema imune.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para
determinar a presença de um polipeptídeo IL-17A/F em uma amostra com- preendendo expor uma amostra de teste de células suspeitas de conter o polipeptídeo IL-17A/F a um anticorpo anti-IL-17A/F e determinar a ligação do referido anticorpo à referida amostra celular. Em um aspecto específico, a 30 amostra compreende uma célula suspeita de conter o polipeptídeo IL-17A/F e o anticorpo ligado à célula. O anticorpo é preferencialmente rotulado detec- tavelmente e/ou ligado a um suporte sólido. Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um kit de diagnóstico de doença imunorelacionada, compreendendo um anticorpo anti-IL-17A/F e um veículo em embalagem adequada. O kit preferencialmen- te contém instruções para usar o anticorpo para detectar a presença do poli- 5 peptídeo IL-17A/F. Preferencialmente o veículo é farmaceuticamente aceitá- vel.
Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um kit de diagnóstico, contendo um anticorpo anti-IL-17A/F em embalagem ade- quada. O kit preferencialmente contém instruções para usar o anticorpo para detectar o polipeptídeo IL-17A/F.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para diagnosticar uma doença imunorelacionada em um mamífero o qual com- preende detectar a presença ou ausência ou um polipeptídeo IL-17A/F em uma amostra de teste de células de tecido obtidas do mamífero referido, em 15 que a presença ou ausência do polipeptídeo IL-17A/F na referida amostra de teste é indicativa da presença de uma doença imunorelacionada no mamífe- ro referido.
Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um método para identificar um agonista de um polipeptídeo IL-17A/F compreen- dendo:
(a) contactar células e um composto de teste a ser triado sob condições a- dequadas para a indução de uma reação celular normalmente induzida por um polipeptídeo IL-17A/F; e (b) determinar a indução da referida reação ce- lular para determinar se o composto de teste é um agonista eficaz, em que a 25 indução da referida reação celular é indicativa de se o composto de teste referido está sendo um agonista eficaz.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para identificar um composto capaz de inibir a atividade de um polipeptídeo IL- 17A/F compreendendo contactar um composto candidato com um polipeptí- 30 deo IL-17A/F sob condições e por um tempo suficiente para permitir que es- tas fitas dois componentes interajam e determinar se a atividade de o poli- peptídeo IL-17A/F é inibida. Em um aspecto específico, ou o composto can- didato ou o polipeptídeo IL-17A/F é imobilizado sobre um suporte sólido. Em outro aspecto, o componente não-imobilizado carrega um rótulo detectável. Em um aspecto preferred, este método compreende as etapas de:
(a) contactar células e um composto de teste a ser triado na presença de um 5 polipeptídeo IL-17A/F sob condições adequadas para a indução de uma rea- ção celular normalmente induzida por um polipeptídeo IL-17A/F; e (b) deter- minar a indução da referida reação celular para determinar se o composto de teste é um antagonista eficaz.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para 10 identificar um composto que inibe a expressão de um polipeptídeo IL-17A/F em células que expressam normalmente o polipeptídeo, em que o método compreende contactar as células com um composto de teste e determinar se a expressão do polipeptídeo IL-17A/F é inibida. Em um aspecto preferencial, este método compreende as etapas de:
(a) contactar células e um composto de teste a ser triado sob condições a- dequadas para permitir a expressão do polipeptídeo IL-17A/F; e (b) determi- nar a inibição da expressão do referido polipeptídeo.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um método para tratar um distúrbio imunorelacionado em um mamífero que 20 sofre do mesmo compreendendo administrar ao mamífero uma molécula de ácido nucleico que codifica para ou (a) um polipeptídeo IL-17A/F, (b) um a- gonista de um polipeptídeo IL-17A/F ou (c) um antagonista de um polipeptí- deo IL-17A/F, em que o referido agonista ou antagonista pode ser um anti- corpo anti-IL-17A/F. Em uma modalidade preferencial, o mamífero é humano. 25 Em outra modalidade preferencial, o ácido nucleico é administrado através de terapia genética ex vivo. Em outra modalidade preferencial adicional, o ácido nucleico é compreendido dentro de um vetor, mais preferencialmente um vetor adenoviral, viral adeno-associado, Ientiviral ou retroviral.
Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma partícula viral recombinante compreendendo um vetor viral consistindo essencialmen- te em um promotor, ácido nucleico codificando (a) um polipeptídeo IL-17A/F,
(b) um polipeptídeo agonista de um polipeptídeo IL-17A/F, ou (c) um polipep- tídeo antagonista de um polipeptídeo IL-17A/F, e uma seqüência de sinaliza- ção para secreção celular do polipeptídeo, em que o vetor viral está em as- sociação com proteínas estruturais virais. Preferencialmente, a seqüência de sinalização é de um mamífero, tal como de um polipeptídeo IL-17A/F nativo.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a
uma célula produtora ex vivo compreendendo um constructo de ácido nucle- ico que expressa proteínas estruturais retrovirais e também compreende um vetor retroviral consistindo essencialmente de um promotor, ácido nucleico codificando (a) um polipeptídeo IL-17A/F, (b) um polipeptídeo agonista de 10 um polipeptídeo IL-17A/F ou (c) um polipeptídeo antagonista de um polipep- tídeo IL-17A/F, e uma seqüência de sinalização para secreção celular do polipeptídeo, em que a referida célula produtora envolve o vetor retroviral em associação com as proteínas estruturais para produzir partículas retrovirais recombinantes.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um
método para reforçar a infiltração de células inflamatórias da vasculatura em um tecido de um mamífero compreendendo administrar ao mamífero referido (a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um agonista de um polipeptídeo IL-17A/F, em que a infiltração de células inflamatórias da vasculatura no mamífero é reforçada.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um método para reduzir a infiltração de células inflamatórias da vasculatura em um tecido de um mamífero compreendendo administrar ao mamífero referido
(a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um antagonista de um polipeptídeo IL- 17A/F, em que a infiltração de células inflamatórias da vasculatura no mamí- fero é reduzida.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um método para aumentar a atividade de linfócitos T em um mamífero compre- endendo administrar ao mamífero referido (a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um agonista de um polipeptídeo IL-17A/F, em que a atividade de linfóci- tos T no mamífero é aumentada.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um método of reduzir a atividade de linfócitos T em um mamífero compreenden- do administrar ao mamífero referido (a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um antagonista de um polipeptídeo IL-17A/F, em que a atividade de linfócitos T no mamífero é reduzida.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um
método para aumentar a proliferação de linfócitos T em um mamífero com- preendendo administrar ao mamífero referido (a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um agonista de um polipeptídeo IL-17A/F, em que a proliferação de linfócitos T no mamífero é aumentada.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção proporciona um
método of reduzir a proliferação de linfócitos T em um mamífero compreen- dendo administrar ao mamífero referido (a) um polipeptídeo IL-17A/F ou (b) um antagonista de um polipeptídeo IL-17A/F, em que a proliferação de linfó- citos T no mamífero é reduzida.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção diz respeito ao
uso de um polipeptídeo IL-17A/F, ou um agonista ou antagonista do mesmo conforme anteriormente descrito, ou um anticorpo anti-IL-17A/F, para a pre- paração de um medicamento útil no tratamento de uma condição a qual é responsiva ao polipeptídeo IL-17A/F ou um agonista ou antagonista do 20 mesmo (por exemplo, anti-IL-17A/F). Em um aspecto particular, a invenção diz respeito ao uso de um polipeptídeo IL-17A/F, ou um agonista ou antago- nista do mesmo em um método para tratar um distúrbio cartilaginoso dege- nerativo.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção se refere a um método para tratar um distúrbio cartilaginoso degenerativo em um mamífero compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo IL-17A/F, agonista, ou antagonista do mesmo, ao mamífero re- ferido sofrendo do referido distúrbio.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção se refere a um kit compreendendo uma composição compreendendo um polipeptídeo IL- 17A/F, ou um agonista ou antagonista do mesmo, em mistura com um car- regador farmaceuticamente aceitável; um recipiente contendo a referida composição; e um rótulo afixada ao referido recipiente, referindo ao uso da referida composição, no tratamento de um distúrbio cartilaginoso degenerati- vo.
Em outro aspecto, a invenção diz respeito a um método para 5 tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um ou mais antagonistas capazes de inibir tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID No: 4) em um polipeptídeo IL-17A/F. Em uma modalidade preferencial, o mamífero é um indivíduo humano.
Em uma modalidade, este método compreende administração
de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de IL-17A e um antagonista de IL-17F.
Em outra modalidade, o antagonista de IL-17A é um anticorpo que especificamente liga IL-17A (SEQ ID NO: 3), ou um fragmento do mes- mo.
Em ainda outra modalidade, o antagonista de IL-17F é um anti- corpo que especificamente liga IL-17F (SEQ ID NO: 4), ou um fragmento do mesmo.
Em uma modalidade adicional, o antagonista de IL-17A é um anticorpo que especificamente liga IL-17A (SEQ ID NO: 3), ou um fragmento do mesmo, e o antagonista de IL-17F é um anticorpo que especificamente liga IL-17F (SEQ ID NO: 4), ou um fragmento do mesmo.
Em ainda uma modalidade adicional, o antagonista é um anti- corpo ligando especificamente a tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID NO: 4) em um polipeptídeo IL-17A/F, ou um fragmento do mesmo.
Em uma modalidade diferente, o anticorpo é um anticorpo de reação cruzada que reconhece epitopos idênticos ou similares presentes sobre tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID NO: 4).
Em uma modalidade adicional, o anticorpo é um anticorpo bies- pecífico tendo especificidade para IL-17A e IL-17F, ou um fragmento do mesmo.
Em todas as modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, o qual pode ser um anticorpo quimérico, humanizado ou huma- no.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tra- tar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mes- mo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração si- multânea ao mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de dois anticorpos distintos, em que um anticorpo especificamente liga a IL- 17A e o outro anticorpo especificamente liga a IL-17F. O distúrbio imunorre- Iacionado pode ser lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, osteoar- trite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tireoidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmie- Iinante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tra- tar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mes- mo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no 30 mamífero referido em que o referido método compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo de reação cruzada em que o referido anticorpo reconhece epitopos idênticos ou similares presentes tanto sobre IL-17A, um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, quanto sobre IL-17F, um poli- peptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. O distúrbio imunorrelacionado pode ser lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistê- mica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoi- mune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmielinante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia des- mielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmi- elinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infecciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, co- Iangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomedia- da, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hi- persensibilidade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hiper- sensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxerto-versus-hospedeiro.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tra- tar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mes- mo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao 25 mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo bi-específico em que o referido anticorpo consiste em dois braços em que um braço do referido anticorpo reconhece IL-17A e o outro braço do re- ferido anticorpo reconhece IL-17F. O distúrbio imunorrelacionado pode inclu- ir lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite crônica 30 juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflama- tória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, ane- mia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete meli- to, doença renal imunomediada, uma doença desmielinante do sistema ner- voso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infecciosa ou autoimune, 5 cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doen- ça intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bo- Ihosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alér- gica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar, 10 urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibro- se pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença as- sociada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxerto-versus- hospedeiro.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tra- tar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mes- mo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo bi-específico em que o referido anticorpo consiste em uma cadeia pe- sada a qual reconhece IL-17A e uma cadeia leve a qual reconhece IL-17F. O distúrbio imunorrelacionado pode incluir lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, es- clerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitope- nia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmielinante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropa- tia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infecciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granuloma- tosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sen- sível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imu- nomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite ató- pica, hipersensibilidade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxer- 5 to ou doença enxerto-versus-hospedeiro.
Em outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tra- tar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mes- mo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao 10 mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo bi-específico em que o referido anticorpo consiste em uma cadeia pe- sada a qual reconhece IL-17F e uma cadeia leve a qual reconhece IL-17A. O distúrbio imunorrelacionado pode incluir lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, osteoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, es- 15 clerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitope- nia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmielinante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropa- tia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia 20 desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infecciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granuloma- tosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sen- sível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imu- nomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de 25 contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite ató- pica, hipersensibilidade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxer- to ou doença enxerto-versus-hospedeiro.
30
B. Modalidades Adicionais
Em outras modalidades da presente invenção, a invenção pro- porciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo IL-17A/F.
Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico isolada compre- ende uma seqüência de nucleotídeo tendo no mínimo cerca de 80% de iden- tidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alter- nativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de se- quências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identidade de seqüências de ácido nucleico e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de ácido nucleico para (a) uma molécula de DNA codificando um polipeptídeo IL-17A/F tendo uma seqüência de aminoácidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de aminoácidos carecendo do peptídeo de sinal conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou qualquer outro fragmento definido especificamente da seqüência de aminoácidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Em outros aspectos, a molécula de ácido nucleico isolada com- preende uma seqüência de nucleotídeo tendo no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternatíva- mente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identidade de seqüências de ácido nucleico e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de ácido nucleico para (a) uma molécula de DNA compreen- dendo a seqüência codificante de um cDNA de polipeptídeo IL-17A/F de ex- tensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, a seqüência codificante de um polipeptídeo IL-17A/F carecendo do peptídeo de sinal con- forme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou a seqüência codificante de qualquer outro fragmento especificamente definido da seqüência de aminoá- cidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou
(b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma molécu- Ia de ácido nucleico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeo tendo no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identidade de seqüências de ácido nucleico e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de ácido nucleico para (a) uma molécula de DNA que codifica o mesmo polipeptídeo maduro codificado por quaisquer dos cDNAs de proteína humana depositao junto a ATCC conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Outra modalidade se refere a fragmentos de uma seqüência co- dificante de polipeptídeo IL-17A/F, ou o complemento da mesma, que podem encontrar uso como, por exemplo, sondas de hibridização, para codificar 5 fragmentos de um polipeptídeo IL-17A/F que pode opcionalmente codificar um polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação para um anticorpo anti- IL-17A/F ou como sondas de oligonucleotídeo antissenso. Os fragmentos de ácido nucleico têm geralmente no mínimo cerca de 20 nucleotídeos de ex- tensão, alternativamente no mínimo cerca de 30 nucleotídeos de extensão, 10 alternativamente no mínimo cerca de 40 nucleotídeos de extensão, alternati- vamente no mínimo cerca de 50 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 60 nucleotídeos de extensão, alternativamente no míni- mo cerca de 70 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 80 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 90 15 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 100 nucleo- tídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 110 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 120 nucleotídeos de ex- tensão, alternativamente no mínimo cerca de 130 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 140 nucleotídeos de extensão, alterna- 20 tivamente no mínimo cerca de 150 nucleotídeos de extensão, alternativa- mente no mínimo cerca de 160 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 170 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mí- nimo cerca de 180 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 190 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca 25 de 200 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 250 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 300 nucleo- tídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 350 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 400 nucleotídeos de ex- tensão, alternativamente no mínimo cerca de 450 nucleotídeos de extensão, 30 alternativamente no mínimo cerca de 500 nucleotídeos de extensão, alterna- tivamente no mínimo cerca de 600 nucleotídeos de extensão, alternativa- mente no mínimo cerca de 700 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 800 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mí- nimo cerca de 900 nucleotídeos de extensão e alternativamente no mínimo cerca de 1000 nucleotídeos de extensão, em que neste contexto o termo "cerca de" significa a extensão da seqüência de nucleotídeo referida mais ou 5 menos 10% da extensão referida. Observa-se que novos fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo IL-17A/F podem ser determinados em uma maneira de rotina alinhando a seqüência de nucleotí- deo codificando o polipeptídeo IL-17A/F com outras seqüências de nucleotí- deo conhecidas usando qualquer um de uma série de programas de alinha- 10 mento de seqüência de conhecimento geral e determinando qual ou quais fragmentos da seqüência de nucleotídeo codificando polipeptídeo são novos. Todas as seqüências de nucleotídeo codificando polipeptídeo referidas são contempladas aqui, neste relatório descritivo. Também são contemplados os fragmentos de polipeptídeo codificados por estas fitas fragmentos de molé- 15 cuias de nucleotídeos, preferencialmente os fragmentos de polipeptídeo IL- 17A/F que compreendem um sítio de ligação para um anticorpo anti-IL- 17A/F.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo IL-17A/F isolado codificado por quaisquer das seqüências de ácido nucleico isoladas acima identificadas.
Em um determinado aspecto, a invenção diz respeito a um poli- peptídeo IL-17A/F isolado, compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de 25 aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de aminoácidos, alterna- 30 tivamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 90% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- vamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 95% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- vãmente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identida- de de seqüências de aminoácidos e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com um polipeptídeo IL- 17A/F tendo uma seqüência de aminoácidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de aminoácidos ca- recendo do peptídeo de sinal conforme descrito aqui, neste relatório descriti- vo, conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou qualquer outro fragmento da seqüência de aminoácidos de extensão total especificamente definido conforme descrito aqui, neste relatório descritivo.
Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um polipep- tídeo IL-17A/F isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos ten- do no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de 25 aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de aminoácidos, alterna- 30 tivamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 90% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- vamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de aminoá- 5 cidos, alternativamente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 95% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- 10 vãmente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identida- de de seqüências de aminoácidos e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com uma seqüência de 15 aminoácidos codificada por quaisquer dos cDNAs de proteína humana de- positados junto a ATCC conforme descrito aqui, neste relatório descritivo.
Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a um polipep- tídeo IL-17A/F isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos com classificação no mínimo cerca de 80% positivos, alternativamente no mínimo 20 cerca de 81% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 82% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 83% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 84% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 85% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 86% positivos, alternativa- mente no mínimo cerca de 87% positivos, alternativamente no mínimo cerca 25 de 88% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 89% positivos, alter- nativamente no mínimo cerca de 90% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 91% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 92% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 93% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 94% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 95% 30 positivos, alternativamente no mínimo cerca de 96% positivos, alternativa- mente no mínimo cerca de 97% positivos, alternativamente no mínimo cerca de 98% positivos e alternativamente no mínimo cerca de 99% positivos quando comparada com a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo IL- 17A/F tendo uma seqüência de aminoácidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de aminoácidos ca- recendo do peptídeo de sinal conforme descrito aqui, neste relatório descriti- 5 vo, ou qualquer outro fragmento especificamente definido da seqüência de aminoácidos de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descri- tivo.
Em um aspecto específico, a invenção proporciona um polipep- tídeo IL-17A/F isolado sem a seqüência de sinal de N-terminal e/ou a metio- 10 nina iniciante e é codificado por uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácidos semelhante conforme anteriormente descrito. Processos para produzir sa mesmas também são descritos aqui, neste rela- tório descritivo, em que estas fitas processos compreebden cultivar uma cé- lula hospedeira compreendendo um vetor o qual compreende a molécula de 15 ácido nucleico codificante apropriada sob condições adequadas para ex- pressão do polipeptídeo IL-17A/F e recuperando o polipeptídeo IL-17A/F da cultura celular.
Em ainda outra modalidade, a invenção diz respeito a agonistas e antagonistas de um polipeptídeo IL-17A/F nativo conforme definido aqui, neste relatório descritivo. Em uma modalidade particular, o agonista ou an- tagonista é um anticorpo anti-IL-17A/F ou uma molécula pequena.
Em uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a um mé- todo para identificar agonistas ou antagonistas para um polipeptídeo IL- 17A/F o qual compreende contactar o polipeptídeo IL-17A/F com uma molé- 25 cuia candidata e monitorar uma atividade biológica mediada pelo referido polipeptídeo IL-17A/F. Preferencialmente, o polipeptídeo IL-17A/F é um poli- peptídeo IL-17A/F nativo.
Em ainda uma modalidade adicional, a invenção diz respeito a uma composição de substância compreendendo um polipeptídeo IL-17A/F, ou um agonista ou antagonista de um polipeptídeo IL-17A/F conforme aqui, neste relatório descritivo, descrito, ou um anticorpo anti-IL-17A/F, em combi- nação com um carregador. Opcionalmente, o carregador é um carregador farmaceuticamente aceitável.
Outra modalidade da presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo IL-17A/F, ou um agonista ou antagonista do mesmo conforme anteriormente descrito, ou um anticorpo anti-IL-17A/F, para a preparação de 5 um medicamento útil no tratamento de uma condição a qual é responsiva ao polipeptídeo IL-17A/F, um agonista ou antagonista do mesmo ou um anticor- po anti-IL-17A/F.
Em modalidades adicionais da presente invenção, a invenção proporciona vetores compreendendo DNA codificando quaisquer dos poli- 10 peptídeos descritos aqui, neste relatório descritivo. Também são proporcio- nadas células hospedeiras compreendendo qualquer vetor semelhante. A título de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO1 E. coli, levedura, ou células de inseto infectadas com Baculovírus. Um processo pa- ra produzir quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui, neste relatório descri- 15 tivo, é adicionalmente proporcionado e compreende cultivar células hospe- deiras sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo desejado e recuperar o polipeptídeo desejado a partir da cultura celular.
Em outras modalidades, a invenção proporciona moléculas qui- méricas compreendendo quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui, neste 20 relatório descritivo, fundidos a um polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácidos. Exemplo de similares moléculas quiméricas compreendem quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui, neste relatório descritivo, fundi- dos a uma seqüência de etiqueta de epitopo ou uma região Fc de uma imu- noglobulina.
Em ainda outra modalidade, a invenção proporciona um anticor-
po o qual especificamente liga a quaisquer dos polipeptídeos descritos aci- ma ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, anti- corpo humanizado, fragmento de anticorpo ou anticorpo de cadeia única.
Em ainda outras modalidades, a invenção proporciona sondas de oligonucleotídeo úteis para isolar seqüências de nucleotídeos genômicos e de cDNA ou como sondas antisenso, em que as sondas podem ser deri- vadsa de quaisquer das seqüências de nucleotídeos descritas acima ou a- baixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra os resultados de expressar e isolar uma nova citocina humana designada IL-17A/F. Células de rim humano 293 foram transfectadas com vetores de expressão de cDNA codificando IL-17 e IL-17F humano somente ou em combinação conforme indicado na Figura 1A e na Figura 1B. Meio condicionado de células transfectadas foi imunoprecipitado (IP) utilizando anticorpos que são capazes de reconhecer IL-17 (alamedas 1- 5), ou IL-17F (alamedas 6-10) conforme indicado na Figura 1A e na Figura 1B. Análise Western Blot é mostrada demonstrando a presença de um com- plexo IL-17A/F dimérico na alameda 8 da Figura 1A e na alameda 3 da Figu- ra 1B. O complexo IL-17A/F dimérico é consistente em tamanho com uma espécie heterodimérica covalente consistindo em uma cadeia de polipeptí- deo de IL-17 e uma cadeia de polipeptídeo de IL-17F.
A figura 2 mostra a purificação de IL-17A/F recombinante. A figu- ra 2A mostra os resultados de SDS-PAGE corado com prata de frações de proteína de fracionamento inicial de IL-17A/F sobre uma coluna S- Sepharose. As Frações 31 e 32 contém uma proteína com uma massa mo- 20 Iecular aparente de aproximadamente 33 kD consistente com IL-17A/F. A figura 2B mostra os resultados de purificação adicional de IL-17A/F usando cromatografía de coluna Vydac C4. É mostrado o cromatógrafo de proteínas elutriadas medidas a 214 nm e 280 nm. A figura 2C demonstra que as fra- ções de proteínas IL-17A/F purificadas da coluna de purificação Vydac C4 25 induzem produção de IL-8 em células TK-10.
A figura 3 mostra os resultados da análise de seqüência de ami- noácidos de IL-17A/F. A figura 3A mostra a análise SDS-PAGE não-redutora de IL-17A/F purificada. Proteína ressolvida foi transferida para uma mem- brana de PVDF e corada com tintura de proteína Coomassie blue. As posi- 30 ções de marcadores de peso molecular são indicadas no lado direito. A figu- ra 3B mostra os resultados da análise de seqüências de N-terminal de IL- 17A/F isolado (resíduos aminoácidos detectados a partir de uma análise de seqüência de N-terminal da banda mostrada na Figura 3A). A análise de se- qüência revela duas seqüências de N-terminal (a Seqüência 1 é designada SEQ ID NO: 1 e a Seqüência 2 é designada SEQ ID NO: 2, respectivamen- te). A figura 3C mostra a seqüência de aminoácidos de IL-17 humano (mos- 5 trada tanto na Figura 3C quanto na Figura 8, designada SEQ ID NO: 3) e a seqüência de aminoácidos de IL-17F humano (mostrada tanto na Figura 3C quanto na Figura 10, designada SEQ ID NO: 4). As seqüências de sinaliza- ção de IL-17 e IL-17F estão sublinhadas. As seqüências que têm identidade com as duas seqüências de peptídeos de N-terminal (SEQ ID NO: 1 e SEQ 10 ID NO: 2) presentes em IL-17A/F estão sublinhadas em negrito para as se- qüências de polipeptídeos IL-17 e IL-17F mostradas.
A figura 4 mostra análise por espectrometria de massa de IL- 17A/F. A figura 4A é um diagrama esquemático mostrando a seqüência de aminoácidos com suas ligações de dissulfeto de intercadeía e intracadeia de 15 heterodímero IL-17A/F maduro (SEQ ID NO: 77). As cisteínas envolvidas em ligações de dissulfeto são indicadas por bolinha, (·), e número do resíduo. As ligações de dissulfeto são indicadas por linhas pretas conectando as cisteí- nas ligadas. Estas ligações de dissulfeto que formam ligações de dissulfeto intercadeia são salientadas por linhas pretas em negrito. A figura 4B mostra 20 o diagrama esquemático dos fragmentos de peptídeo IL-17A/F no. 1 e no. 2 contendo ligações de dissulfeto entre a cadeia IL-17 e a cadeia IL-17F que seria previsto serem produzidos por digestão de IL-17A/F com tripsina [o fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F de no. 1 é designado SEQ ID NO: 7; o fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 2 é designado SEQ 25 ID NO: 8, respectivamente]. Os aminoácidos contidos dentro destas fitas fragmentos são indicados e numerados em relação à metionina iniciante de cada cadeia. Também é indicada a massa molecular aproximada calculada destas fitas fragmentos que se esperaria que fosse observado por espec- trometria de massa. A figura 4C mostra o mapa peptídico de IL-17A/F de 30 dessorção/ionização a laser assistida por matriz -espectrometria de massa de tempo de vôo (MALDI-TOF). O mapa peptídico resultante contém picos com [M+H]+ = 2420,12 Da e 3410,60 Da, consistentes com os peptídeos encadeados a dissulfeto. A figura 4D demonstra caracterização adicional de amostras não -reduzidas de IL-17A/F por espectrometria de massa por ioni- zação eletrospray com íon trap e cromatografia líquida (LC-ESI-MS). Os cromatogramas iônicos representam (de cima para baixo) o cromatograma 5 iônico total, cromatograma iônico reconstruído (RIC) do fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 2 [M+2H]2+, e do fragmento de ligação de dissul- feto IL-17A/F no. 1 [M+2H]3+. Picos consistentes com ambos os heterodíme- ros foram observados ao passo que não foram observados picos acima do ruído químico de fundo nas massas previstas para peptídeos homodiméricos. 10 A figura 5A mostra as curvas de dose resposta comparando a
reação pró-inflamatória induzida por IL-17A/F, IL-17 e IL-17F. IL-17A/F, IL-17 e IL-17F foram incubadas com células TK-10 nas concentrações indicadas por 24 horas. Foi mostrado que IL-17A/F tem potente atividade indutora de IL-8 com substancial atividade vista em concentrações sub-nM. A figura 5B 15 mostra as curvas de dose resposta comparando indução de IL-6 por IL- 17A/F, IL-17 e IL-17F. IL-17A/F, IL-17 e IL-17F foram incubadas com células TK-10 nas concentrações indicadas por 24 horas. Meio condicionado por TK-10 foi coletado e analisado por IL-6 ELISA.
A figura 6 mostra a seqüência de aminoácidos da região da regi- 20 ão variável de cadeia pesada contendo CDR H1-H3 de Fab que liga IL- 17A/F. É mostrado um alinhamento de uma região da seqüência de aminoá- cidos prevista de trinta e quatro (34) clones (SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 42, respectivamente) que codificam seqüências de cadeia pesada de anticorpos distintas que são capazes de ligar a IL-17A/F. As três regiões CDR de ca- 25 deia pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) são sombreadas.
A figura 7 mostra uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 5) de um cDNA de IL-17 da seqüência nativa.
A figura 8 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) derivada da seqüência codificante de SEQ ID NO: 5 mostrada na Figura 7.
A figura 9 mostra uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 6)
de um cDNA de IL-17F da seqüência nativa.
A figura 10 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) derivada da seqüência codificante de SEQ ID NO: 6 mostrada na Figura 9.
A figura 11 mostra IL-17A/F ELISA por medições de IL-17A/F produzido a partir de células T humanas ativadas anti-CD3/anti-CD28.
A figura 12 mostra a especificidade do IL-17A/F ELISA em que foi mostrado que três frações no. 31 a no. 33 testadas em paralelo contêm quantidades quase equivalentes de IL-17A/F (IL-17A e IL-17F foram usados como controles).
A figura 13 mostra o nível aumentado de produção de tanto IL- 17A quanto IL-17F quando células T são induzidas com IL-6 e TGFp.
A figura 14 representa a família IL-17 de citocinas e o padrão
complexo de sobreposição de especificidades de receptor-ligante. Da es- querda para a direita, a Figura 14 demonstra que o Iigante de IL-17 liga ao receptor de IL-17 (IL-17R; aqui, neste relatório descritivo, designado PR01); o Iigante de IL-17B (PR01031) liga ao receptor de IL-17RH1 (PR05801); o 15 Iigante de IL-17E (PR010272) liga ao receptor de IL-17RH1 (PR05801); o Iigante de IL-17F (PR020110) liga tanto ao receptor de IL-17 (IL-17R, aqui, neste relatório descritivo, designado PR01) bem como ao receptor de IL- 17RH2 (PR020040); o Iigante de IL-17C (PR01122) e o Iigante de IL-17D (PR021175) não interage com os receptores IL-17R, IL-17RH1 ou IL-17RH2. 20 A figura 15 mostra a estrutura de IL-17F. A figura 15A mostra um
traço da banda monomérica IL-17F. As fitas são rotulados. Dissulfetos são mostrados como representação de bola e traço com os átomos de enxofre coloridos de amarelo. As posições aproximadas das cisteínas adicionais são mostradas como bolas de cor laranja. A inserção mostra uma representação 25 em esboço do nó canônico. A figura 15B mostra o traço da banda dimérica IL-17F em vermelho e azul. Dissulfetos são mostrados como na Figura 15A. A figura 15C mostra a estrutura de NGF do complexo NGF-TrkA (Weismann et ai, Nature 401: 184-188 (1999)). Um laço desordenado conecta as fitas 2 e 3.
A figura 16 mostra o alinhamento de seqüência de IL-17F com
outros membros da família IL-17. Regiões de identidade e seqüências con- servadas entre IL-17 e IL-17F são salientadas em verde e amarelo, respecti- vãmente. Quando os outros membros da família também têm resíduos con- servados ou idênticos nestas regiões, são coloridos similarmente. Resíduos cisteína são indicados em laranja. As serinas conservadas que substituem as cisteínas de nós canônicos são salientadas com letras brancas. Ligações 5 de dissulfeto as quais se espera que estejam conservadas em todas as IL- 17s são indicadas por uma linha preta conectando as cistinas ligadas. As duas cistinas as quais formam o dissulfeto intercadeia em IL-17F são mar- cadas com um asterisco. Elementos estruturais secundários em IL-17F são mostrados acima das seqüências como setas azuis (fitas β) ou cilindros (a- 10 hélice). A numeração dos residuós é a partir do início das seqüências madu- ras.
As Figuras 17 mostram uma comparação de estrutura molecular IL-17F (PR020110) e IL-17. Duas perspectivas ortogonais, "lateal" (A) e "frontal" (B) da superfície molecular de IL-17F colorida de acordo com a con- 15 servação de seqüência entre IL-17 e IL-17F conforme mostrado na Figura 16. A superfície de resíduos que são idênticos entre as duas proteínas são de cor verde, resíduos homólogos são de cor amarela, ao passo que resíduos que diferem significativamente são de cor branca. A vista em (B) é orientada aproximadamente a 15° de rotação da vista na Figura 15B). Resíduos for- 20 mando a cavidade são marcados. A figura 17C é uma vista de "corte" da su- perfície na Figura 17B mostrando como as grandes cavidades sobre qual- quer lado de IL-17F penetra profundamente no corpo do dímero.
As Figuras 18 mostra uma comparação da superfície de IL-17F e o sítio de ligação TrkA em NGF. As Figuras 18A e 18B mostram a estrutura 25 molecular de IL-17F é orientada como na Figura 17. IL-17F é colorido de acordo com o potencial superficial eletrostático: vermelho, -5 kT, branco, 0 kT; e azul, +5 kT. As posições das cavidades são indicadas pelos círculos. A figura 18C mostra a estrutura molecular de NGF na mesma orientação que IL-17F no painel (B); o domínio 5 de TrkA é mostrado como uma banda ver- 30 de (Weismann etal., Nature 401: 184-188 (1999); pdb código 1WWW).
As Figuras 19 e 20 mostram a eficácia de anticorpos anti-IL- 17A/F em um modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) em camundongo. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS I. Definições
Um "polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma seqüência de aminoácidos que o polipeptídeo 5 IL-17A/F correspondente derivado da natureza. O polipeptídeos IL-17A/F de seqüência nativa referido pode ser isolado da natureza ou pode ser produzi- do por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa" especificamente engloba formas truncadas ou secretadas que ocorrem naturalmente do polipeptídeo IL-17A/F específico (por exemplo, 10 uma seqüência de domínio extracelular), formas que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas alternativamente unidas) e variantes alélicas do poli- peptídeo que ocorrem naturalmente. Em várias modalidades da invenção, os polipeptídeos IL-17A/F de seqüência nativa descritos aqui, neste relatório descritivo, são polipeptídeos molduras de seqüência nativa macuros ou de 15 extensão total compreendendo as seqüências de aminoácidos de extensão total mostradas nas figuras em anexo. Códons de início e de parada são mostrados em fonte em negrito e sublinhados nas figuras. No entanto, en- quanto se mostra que os polipeptídeos IL-17A/F descritos nas figuras ane- xadas iniciam com resíduos metionina designados aqui, neste relatório des- 20 critivo, como posição 1 de aminoácido nas figuras, é concebível e possível que outros resíduos metionina localizados a montagem ou a jusante da posi- ção 1 de aminoácido nas figuras possam ser empregados como o resíduo aminoácido de partida para os polipeptídeos IL-17A/F.
A localização aproximada dos "peptídeos de sinal" dos vários 25 polipeptídeos IL-17A/F descritos aqui, é mostrada no presente relatório des- critivo e/ou nas figuras anexadas. É observado, no entanto, que o limite de C-terminal de um peptídeo de sinal pode variar, mas mais ensaiovelmente por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite de C- terminal do peptídeo de sinal conforme inicialmente identificado aqui, neste 30 relatório descritivo, em que o limite de C-terminal do peptídeo de sinal pode ser identificado de acordo com critérios empregados rotineiramente na técni- ca para identificar o tipo de elemento da seqüência de aminoácidos (por e- xemplo, Nielsen et ai, Prot. Enq.. 10: 1-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids. Res., 14: 4683-4690 (1986)). Além disso, também é reconhecido que, em alguns casos, a clivagem de uma seqüência de sinal de um polipeptídeo secretado não é inteiramente uniforme, resultando em mais de uma espécie 5 secretada. Estas fitas polipeptídeos macuros, em que o peptídeo de sinal é clivado dentro de não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do limite de C-terminal do peptídeo de sinal conforme identificado aqui, neste relatório descritivo, e os polinucleotídeos codificando os mesmos, são con- templados pela presente invenção.
" Variante de polipeptídeo IL-17A/F" significa um polipeptídeo IL-
17A/F ativo conforme definido acima ou abaixo tendo no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos com uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total conforme des- crito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F 15 carecendo do peptídeo de sinal conforme descrito aqui, neste relatório des- critivo, ou qualquer outro fragmento de uma seqüência de polipeptídeo IL- 17A/F de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo. As variantes de polipeptídeo IL-17A/F referidas incluem, por exemplo, polipeptí- deos IL-17A/F em que um ou mais resíduos aminoácidos são adicionados, 20 ou eliminados, no N- ou C-término da seqüência de aminoácidos nativa de extensão total. Ordinariamente, uma variante de polipeptídeo IL-17A/F terá no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos, al- ternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de 25 seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de aminoácidos, alterna- tivamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de aminoá- 30 cidos, alternativamente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 90% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- vamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de aminoá- cidos, alternativamente no mínimo cerca de 92% de identidade de sequên- 5 cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identida- de de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternativamente no mí- nimo cerca de 95% de identidade de seqüências de aminoácidos, alternati- vamente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de aminoá- 10 cidos, alternativamente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüên- cias de aminoácidos, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identida- de de seqüências de aminoácidos e alternativamente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos com uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total conforme des- 15 crito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F carecendo do peptídeo de sinal conforme descrito aqui, neste relatório des- critivo, ou qualquer outro especificamente definido fragmento de uma se- qüência de polipeptídeo IL-17A/F de extensão total conforme descrito aqui, neste relatório descritivo. Ordinariamente, polipeptídeos da variante IL-17A/F 20 têm no mínimo cerca de 10 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 20 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 30 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 40 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 50 ami- noácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 60 aminoácidos 25 de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 70 aminoácidos de ex- tensão, alternativamente no mínimo cerca de 80 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 90 aminoácidos de extensão, alternati- vamente no mínimo cerca de 100 aminoácidos de extensão, alternativamen- te no mínimo cerca de 150 aminoácidos de extensão, alternativamente no 30 mínimo cerca de 200 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 300 aminoácidos de extensão, ou mais.
"Percentagem (%) de identidade de seqüências de aminoácidos" com relação às seqüências de polipeptídeo IL-17A/F identificadas aqui, nes- te relatório descritivo, é definida como a percentagem de resíduos aminoáci- dos em uma seqüência candidata que são idênticas com os resíduos amino- ácidos na seqüência de polipeptídeo IL-17A/F específica, depois de alinhar 5 as seqüências e introduzir distâncias, caso necessário, para obter a máxima percentagem de identidade de seqüências, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüências. Ali- nhamento para fins de determinar a percentagem de identidade de seqüên- cias de aminoácidos pode ser obtido em vários modos que estão dentro do 10 conhecimento da técnica, por exemplo, usando software de computação dis- ponível publicamente tais como o programa BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâme- tros apropriados para medir alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos ne- cessários para obter máximo alinhamento por toda a extensão das sequên- 15 cias sendo comparadas. Para os fins aqui, neste relatório descritivo, no en- tanto, os valores da % de identidade de seqüências de aminoácidos são ge- rados usando o programa de computação de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo e para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela 1 abaixo. O programa de computação de compara- 20 ção de seqüências ALIGN-2 foi autorizado pela Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arquivado com documentação do u- suário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está regis- trado sob U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente através da Genentech, Inc., South San Fran- 25 cisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte proporciona- do na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências são determinados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações onde se emprega ALIGN-2 para comparações de
seqüências de aminoácidos, a % de identidade de seqüências de aminoáci- dos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B (a qual pode ser alternativamente expres- sa como uma dada seqüência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de seqüências de aminoácidos para, com, ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculada como se se- 5 gue:
10O vezes a fração X/Y
onde X é o número de resíduos aminoácidos classificados como combina- ções idênticas pelo programa de alinhamento de seqüências ALIGN-2 em que o alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resí- duos aminoácidos em B. Será reconhecido que onde a extensão da seqüên- cia de aminoácidos A não for igual à extensão da seqüência de aminoácidos B, a % de identidade de seqüências de aminoácidos de A para B não eqüi- valerá a % de identidade de seqüências de aminoácidos de B para A. Como exemplos de cálculos da % de identidade de seqüências de aminoácidos usando este método, as Tabelas 2 e 3 demonstram como calcular a % de identidade de seqüências de aminoácidos da seqüência de aminoácidos de- signada "Proteína de Comparação" para a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo hipotético de interesse, "Proteína de Comparação" representa a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo contra a qual o polipeptídeo de interesse está sendo comparado, e "X", Ύ" e "Z" cada um representa di- ferentes resíduos aminoácidos hipotéticos.
A menos que especificamente determinado de modo diverso, todos os valores de % de identidade de seqüências de aminoácidos usados aqui, neste relatório descritivo, são obtidos conforme descrito no parágrafo 25 imediatamente precedente usando o programa de computação ALIGN-2. No entanto, os valores da % de identidade de seqüências de aminoácidos tam- bém podem ser obtidos conforme descrito abaixo usando o programa de computação WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymoloqy 266: 460- 480 (1996)). A maioria dos parâmetros de pesquisa WU-BLAST-2 são ajus- 30 tados para os valores determinados. Aqueles não-ajustados para valores determinados, isto é, os parâmetros ajustáveis, são ajustados com os se- guintes valores: de span de sobreposição (overlap span) = 1, fração de so- breposição = 0,125, limiar de palavra (T) = 11, e matriz de classificação = BLOSUM62. Quando se emprega WU-BLAST-2, um valor % de identidade de seqüências de aminoácidos é determinado dividindo (a) o número de re- síduos aminoácidos idênticos combinando entre a seqüência de aminoáci- 5 dos do polipeptídeo de interesse tendo uma seqüência derivada do polipep- tídeo nativo e a seqüência de aminoácidos de comparação de interesse (isto é, a seqüência contra a qual o polipeptídeo de interesse está sendo compa- rado o qual pode ser um polipeptídeo variante IL-17A/F) conforme determi- nado por WU-BLAST-2 pelo (b) número total de resíduos aminoácidos do 10 polipeptídeo de interesse. Por exemplo, na declaração "um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos A a qual tem ou tendo no mínimo 80% de identidade de seqüências de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos B", a seqüência de aminoácidos A é a comparação seqüên- cia de aminoácidos da "Proteína de Comparação" de interesse e a sequên- 15 cia de aminoácidos B é a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de inte- resse.
A percentagem de identidade de seqüências de aminoácidos também pode ser determinada usando o programa de comparação de se- qüências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 20 (1997)). O programa de comparação de seqüências NCBI-BLAST2 pode ser baixado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov ou obtido de modo diverso do Natio- nal Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 usa vários parâmetros de pesquisa, em que todos estas fitas parâmetros de pesquisa são ajustados para valores determinados incluindo, por exemplo, revelar (unmask) = sim, 25 fita = todas, ocorrências esperadas =10, extensão de baixa complexidade mínima = 15/5, valor-e multipasso = 0,01, constante para multipasso = 25, declínio gradual para alinhamento com distância final = 25 e matriz de classi- ficação = BLOSUM62.
Em situações onde NCBI-BLAST2 é empregado para compara- ções de seqüências de aminoácidos, a % de identidade de seqüências de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B (a qual pode ser alternativamente expressa como uma dada seqüência de aminoácidos A que tem ou compre- ende uma determinada % de identidade de seqüências de aminoácidos para, com, ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
5 10O vezes a fração X/Y
onde X é o número de resíduos aminoácidos classificados como combina- ções idênticas pelo programa de alinhamento de seqüências NCBI-BLAST2 no alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resí- duos aminoácidos em B. Será reconhecido que onde a extensão da sequên- 10 cia de aminoácidos A não é igual à extensão da seqüência de aminoácidos B, a % de identidade de seqüências de aminoácidos de A a B não será igual a % de identidade de seqüências de aminoácidos de B a A.
"Polinucleotídeo variante IL-17A/F " ou "seqüência de ácido nu- cleico variante IL-17A/F" significa uma molécula de ácido nucleico a qual codifica um polipeptídeo IL-17A/F ativo conforme definido abaixo e o qual tem no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de ácido nucleico com uma seqüência de ácido nucleotídeo codificando uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total conforme des- crito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total carecendo do peptídeo de sinal con- forme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou qualquer outro fragmento de uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de extensão total conforme des- crito aqui, neste relatório descritivo. Ordinariamente, um polinucleotídeo va- riante IL-17A/F terá no mínimo cerca de 80% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 81% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 82% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 83% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 84% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 85% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 86% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 87% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 88% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 89% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico, alternativamente no mínimo cerca de 90% de identidade de seqüências 5 de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 91% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 92% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 93% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativa- mente no mínimo cerca de 94% de identidade de seqüências de ácido nucle- 10 ico, alternativamente no mínimo cerca de 95% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 96% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 97% de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente no mínimo cerca de 98% de identidade de seqüências de ácido nucleico e alternativa- 15 mente no mínimo cerca de 99% de identidade de seqüências de ácido nucle- ico com uma seqüência de ácido nucleico codificando uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total conforme des- crito aqui, neste relatório descritivo, uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total carecendo do peptídeo de sinal con- 20 forme descrito aqui, neste relatório descritivo, ou qualquer outro fragmento de uma seqüência de polipeptídeo IL-17A/F de extensão total conforme des- crito aqui, neste relatório descritivo. Variantes não englobam a seqüência de nucleotídeo nativa.
Ordinariamente, polinucleotídeos variantes IL-17A/F são no mí- 25 nimo cerca de 30 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 60 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 90 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 120 nu- cleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 150 nucleotí- deos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 180 nucleotídeos de 30 extensão, alternativamente no mínimo cerca de 210 nucleotídeos de exten- são, alternativamente no mínimo cerca de 240 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 270 nucleotídeos de extensão, alterna- tivamente no mínimo cerca de 300 nucleotídeos de extensão, alternativa- mente no mínimo cerca de 450 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 600 nucleotídeos de extensão, alternativamente no mí- nimo cerca de 900 nucleotídeos de extensão, ou mais.
5 "Percentagem (%) de identidade de seqüências de ácido nuclei-
co" com relação a seqüências de ácido nucleico codificando IL-17A/F identi- ficadas aqui, neste relatório descritivo, é definida como a percentagem de nucleotídeos em uma seqüência candidata que são idênticas com os nucleo- tídeos na seqüência de ácido nucleico IL-17A/F de interesse, depois de ali- nhar as seqüências e introduzir distâncias, caso necessário, para obter a máxima percentagem de identidade de seqüências. Alinhamento para fins de determinar a percentagem de identidade de seqüências de ácido nucleico pode ser obtido em vários modos que estão dentro do conhecimento da téc- nica, por exemplo, usando um software de computação disponível publica- mente tal como o programa BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNAS- TAR). Para fins aqui, neste relatório descritivo, no entanto, os valores da % de identidade de seqüências de ácido nucleico são gerados usando o pro- grama de computação de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela 1 abaixo. O programa de computação de comparação de seqüências A- LIGN-2 foi autorizado pela Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arquivado com documentação do usuário no U.S. Cop- yright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Cop- yright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte proporcionado na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente digital UNIX V4.0D. Todos os parâmetros de com- paração de seqüências são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações de
seqüências de ácido nucleico, a % de identidade de seqüências de ácido nucleico de uma dada seqüência de ácido nucleico C para, com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico D (a qual pode ser alternativamente expressada como uma dada seqüência de ácido nucleico C que tem ou compreende uma determinada % de identidade de seqüências de ácido nu- cleico para, com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico D) é cal- 5 culada como se segue:
100 vezes a fração W/Z
onde W é o número de nucleotídeos classificados como combinações idênti- cas pelo programa de alinhamento de seqüências ALIGN-2 em que o ali- nhamento do program de C e D, e onde Z é o número total de nucleotídeos 10 em D. Será reconhecido que onde a extensão da seqüência de ácido nuclei- co C não é igual à extensão da seqüência de ácido nucleico D, a % de iden- tidade de seqüências de ácido nucleico de C para D não será igual a % de identidade de seqüências de ácido nucleico de D para C. Como exemplos de % de identidade de seqüências de ácido nucleico cálculos, as Tabelas 4 15 e 5, demonstram como calcular a % de identidade de seqüências de ácido nucleico da seqüência de ácido nucleico designada "DNA de Comparação" para a seqüência de ácido nucleico designada "IL-17A/F-DNA", em que "IL- 17A/F-DNA" representa uma seqüência de ácido nucleico codificante IL- 17A/F hipotética de interesse, "DNA de Comparação" representa a sequên- 20 cia de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molé- cula de ácido nucleico "IL-17A/F-DNA" de interesse está sendo comparada, e "N", "L" e "V" cada representam nucleotídeos hipotéticos diferentes.
A menos que determinado especificamente de modo diverso, todos os valores da % de identidade de seqüências de ácido nucleico usa- 25 dos aqui, são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente prece- dente usando o programa de computação ALIGN-2. No entanto, os valores da % de identidade de seqüências de ácido nucleico também podem ser ob- tidos conforme descrito abaixo usando o programa de computação WU- BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzvmoloqy 266: 460-480 (1996)). A 30 maioria dos parâmetros de pesquisa WU-BLAST-2 são ajustados para os valores determinados. Aqueles não-ajustados para valores determinados, isto é, os parâmetros ajustáveis, são ajustados com os seguintes valores: span de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) = 11, e matriz de classificação = BLOSUM62. Quando se emprega WU- BLAST-2, um valor da % de identidade de seqüências de ácido nucleico é determinado dividindo (a) o número de nucleotídeos idênticos combinando 5 entre a seqüência de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico codifi- cando o polipeptídeo IL-17A/F de interesse tendo uma seqüência derivada do ácido nucleico codificando o polipeptídeo IL-17A/F da seqüência nativa e a molécula de ácido nucleico de comparação de interesse (isto é, a seqüên- cia contra a qual a molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo IL- 10 17A/F de interesse está sendo comparada a qual pode ser um polinucleotí- deo IL-17A/F variante) conforme determinado por WU-BLAST-2 pelo (b) nú- mero total de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico codificando o poli- peptídeo IL-17A/F de interesse. Por exemplo, na declaração "uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma seqüência de ácido nucleico 15 Aa qual tem ou tendo no mínimo 80% de identidade de seqüências de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico B", a seqüência de ácido nuclei- co A é a comparação molécula de ácido nucleico de interesse e a seqüência de ácido nucleico B é a seqüência de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo IL-17A/F de interesse.
A percentagem de identidade de seqüências de ácido nucleico
também pode ser determinada usando o programa de comparação de se- qüências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). O programa de comparação de seqüências NCBI-BLAST2 pode ser baixado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov ou obtido de modo diverso do Natio- 25 nal Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 usa vários parâmetros de pesquisa, em que todos os parâmetros de pesquisa referidas são ajusta- dos para valores determinados incluindo, por exemplo, revelar = sim, fita = todos, ocorrências esperadas = 10, extensão de baixa complexidade mínima = 15/5, valor-e multipasso = 0,01, constante para multipasso = 25, dropoff 30 para alinhamento com distância final = 25 e matriz de classificação = BLO- SUM62.
Em situações onde se emprega NCBI-BLAST2 para compara- ções de seqüências, a % de identidade de seqüências de ácido nucleico de uma dada seqüência de ácido nucleico C para, com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico D (a qual pode alternativamente ser expressada como uma dada seqüência de ácido nucleico C que tem ou compreende 5 uma certa % de identidade de seqüências de ácido nucleico para, com, ou contra uma dada seqüência de ácido nucleico D) é calculada como se se- gue:
100 vezes a fração W/Z
onde W é o número de nucleotídeos classificados como combinações idênti- 10 cas pelo programa de alinhamento de seqüências NCBI-BLAST2 em que o alinhamento do programa de C e D, e onde Z é o número total de nucleotí- deos em D. Será reconhecido que onde a extensão da seqüência de ácido nucleico C não é igual à extensão da seqüência de ácido nucleico D, a % de identidade de seqüências de ácido nucleico de C para D não será igual a % 15 de identidade de seqüências de ácido nucleico de D para C.
Em outras modalidades, polinucleotídeos variantes IL-17A/F são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo IL-17A/F ativo e as quais são capazes de hibridizar, preferencialmente sob condições estrin- gentes de hibridização e lavagem, as seqüências de nucleotídeo codificando 20 um polipeptídeo IL-17A/F de extensão total conforme descrito aqui. Polinu- cleotídeos variantes IL-17A/F podem ser aquele que são codificados por um polinucleotídeo variante IL-17A/F.
"Isolados", quando usado para descrever os vários polipeptídeos descritos aqui, significa polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou re- 25 cuperado de um componente de seu ambientes naturais. Componentes con- taminantes de seus ambiente natural são materiais que tipicamente interferi- riam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos protenáceos ou não- protenáceos. Em modalidades preferenciais, o polipeptídeo será purificado 30 (1) para um grau suficiente para obter no mínimo 15 resíduos de seqüência de aminoácidos de N-terminal ou interna por uso de um "sequenator" de co- po giratório, ou (2) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não- redutoras ou redutoras usando tintura azul Coomassie ou, preferencialmente, de prata. Polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que no mínimo um componente do ambiente natu- ral do polipeptídeo IL-17A/F não estará presente. Ordinariamente, no entanto, 5 o polipeptídeo isolado será preparado por no mínimo uma etapa de purifica- ção.
Um ácido nucleico codificando polipeptídeo IL-17A/F "isolado” ou ácido nucleico codificando outro polipeptídeo é uma molécula de ácido nu- cleico que é identificada e separada a partir de no mínimo uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está ordinariamente associada na fonte natural do ácido nucleico codificando polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo isolado é diferente daquela sob a forma ou composição na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeo isolado portanto são diferenciadas da mo- lécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo específico conforme existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo isolado inclui moléculas de ácido nucleico codificando polipeptí- deo contido em células que ordinariamente expressam o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromos- sômica diferente daquela das células naturais.
O termo "seqüências controle" se refere a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificante encadeada o- peravelmente em um organismo hospedeiro particular. As seqüências con- trole que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promo- 25 tor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribos- somo. Células eucarióticas são conhecidas para utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e reforçadores.
Ácido nucleico é "encadeado operavelmente" quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por e- xemplo, DNA para uma pré-sequência ou Iider secretor é encadeado opera- velmente a DNA para um polipeptídeo se for expressado como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou reforça- dor é encadeado operavelmente a uma seqüência codificante se afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é encadeado operavelmente a uma seqüência codificante se for posicionado de modo a facilitar a translação. Geralmente, "encadeado operavelmente" significa que 5 as seqüências de DNA sendo encadeadas são contíguas, e, no caso de um Iider secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os reforçadores não precisam ser contíguos. O encadeamento é realizado por ligação em sítios de restrição convenientes. Se não existirem os sítios referidos, os en- cadeadores ou adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos são usados de 10 acordo com a prática convencional.
A "estringência" das reações de hibridização é prontamente de- terminável por uma pessoa com conhecimento regular da técnica, e geral- mente é um cálculo empírico dependente da extensão da sonda, da tempe- ratura de lavagem, e da concentração salina. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas mais elevadas para adequado recozimento, ao pas- so que sondas mais curtas necessitam de temperaturas menores. A hibridi- zação geralmente depende da capacidade de DNA desnaturado para reco- zer quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda e a seqüência hibridizável, maior a temperatura relativa a qual será usada. Em conseqüência, segue-se que maiores temperaturas relativas tenderiam a tornar as condições da reação mais estringentes, ao passo que menores temperaturas menos estringentes. Para detalhes adicionais e expli- cações da estringência de reações de hibridização, vide Ausubel et ai, Cur- rent Protocols in Molecular Bioloqy, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condições estringentes" ou "condições de elevada stringência", conforme definido aqui, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empre- gam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil 30 sulfato de sódio a 50EC; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (em v/ v) de formami- da com 0,1% de albumina sérica bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirro- lidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de clo- reto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42EC; ou (3) empregam 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de 5 Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42EC, com lavagens a 42EC em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55EC, seguida por uma lavagem de alta estringência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55EC.
" Condições moderadamente estringentes" podem ser identifica-
das conforme descrito por Sambrook et ai, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de so- lução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica e % de SDS) menos estringentes do que as descritas acima. Um 15 exemplo de condições moderamente estringentes é incubação de um dia para o outro a 37EC em uma solução compreendendo: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguida por 20 lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37 a 50EC. O técnico versado reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iônica, e etc. conforme ne- cessário para conciliar fatores tais como a extensão da sonda e similares.
O termo "epitopo rotulado" quando usado aqui, se refere a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo IL-17A/F fundido a 25 um "polipeptídeo de etiqueta". O polipeptídeo de etiqueta tem resíduos sufi- cientes para proporcionar um epitopo contra o qual um anticorpo pode ser preparado, mas é suficientemente curto de tal modo que não interfere com a atividade do polipeptídeo ao qual é fundido. O polipeptídeo de etiqueta prefe- rencialmente também é razoavelmente único de modo que o anticorpo subs- 30 tancialmente não tem reação cruzada com outros epitopos. Polipeptídeos de etiqueta adequados geralmente têm no mínimo seis resíduos aminoácidos e geralmente entre cerca de 8 e 50 resíduos aminoácidos (preferencialmente, entre cerca de 10 e 20 resíduos aminoácidos).
Conforme usado aqui, neste relatório descritivo, o termo "imuno- adesina" designa moléculas similares a anticorpo as quais combinam a es- pecificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulinas. Estruturalmen- te, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma seqüência de ami- noácidos com a especificidade de ligação desejada a qual é diferente do an- tígeno reconhecimento e do sítio de ligação de um anticorpo (isto é, é "hete- róloga"), e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma seqüência de aminoácidos contíguos compreendendo no mínimo o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. A seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os substipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e IgA- 2), IgE, IgD ou IgM.
O termo "antagonista" é usado no senso mais amplo, e inclui qualquer molécula que parcialmente ou totalmente bloqueia, inibe, ou neu- traliza uma atividade biológica de um polipeptídeo IL-17A/F nativo descrito aqui. Em uma maneira similar, o termo "agonista" é usado no senso mais amplo e inclui qualquer molécula que simulta uma atividade biológica de um polipeptídeo IL-17A/F nativo descrito aqui, . Moléculas agonistas ou antago- nistas adequadas especificamente incluem anticorpos agonistas ou antago- nistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de seqüências de aminoácidos de polipeptídeos IL-17A/F nativos, peptídeos, oligonucleotí- deos antissenso, pequenas moléculas orgânicas, e etc. Métodos para identi- ficar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo IL-17A/F podem compre- ender contactar um polipeptídeo IL-17A/F com uma molécula agonista ou antagonista candidata e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo IL-17A/F. "Tratamento" se refere tanto a tratamento terapêutico quanto
profilático ou medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (reduzir) a condição patológica ou distúrbios visados. Aqueles que necessi- tam de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles propensos a terem o distúrbio ou aqueles nos quais o distúrbio deve ser pre- venido.
Administração "crônica" se refere a administração do um ou mais 5 agentes em um modo contínuo em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo pro- longado. Administração "intermitente" é tratamento que não é feito consecu- tivamente sem interrupção, mas ao invés cíclico na natureza.
"Mamífero" para fins de tratamento se refere a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, e animais selvagens, de competição, ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, carneiro, porcos, cabras, coelhos, e etc. Prefe- rencialmente, o mamífero é humano.
Administração "em combinação com" um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecu- tiva em qualquer ordem.
"Veículos" conforme usado aqui, incluem veículos farmaceutica- mente aceitáveis, excipientes, ou estabilizantes os quais são não tóxicos para a célula ou o mamífero sendo expostos aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o carregador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e ou- tros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, as- paragina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros car- boidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcares tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos tais co mo TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.
O termo "anticorpo" é usado no senso mais amplo e cobre espe- cificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-IL-17A/F únicos (in- cluindo agonista, antagonista, e anticorpos neutralizantes), composições de anticorpos anti-IL-17A/F com especificidade poliepitópica (por exemplo, anti- corpos biespecíficos na medida que apresentam a atividade biológica dese- 5 jada), anticorpos policlonais, anticorpos anti-IL-17A/F de cadeia única, e fragmentos de anticorpos anti-IL-17A/F (vide abaixo) na medida que apre- sentem a atividade biológical ou imunológica desejada. O termo "imunoglo- bulina" (Ig) é usado de modo intercambiável com anticorpo aqui, .
Um "anticorpo isolado" é um o qual foi identificado e separado 10 e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir en- zimas, hormônios, e outros solutos protenáceos ou não-protenáceos. Em modalidades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) para mais de 95% 15 em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, e o mais preferencialmente mais de 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter no mínimo 15 resíduos de seqüência de aminoácidos de N- terminal ou interna por uso de um sequenator de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras 20 usando azul Coomassie ou, preferencialmente, tintura de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que no mínimo um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, no entanto, anticorpo isolado será preparado por no mínimo uma etapa de purificação.
A unidade de anticorpo de 4 cadeias básicas é uma glicoproteí-
na heterotetramérica composta de duas cadeias idênticas leves (L) e duas cadeias idênticas pesadas (H) (um anticorpo IgM consiste em 5 das unida- des heterotetraméras básicas junto com um polipeptídeo adicional denomi- nado cadeia J, e portanto contêm 10 sítios de ligação antigênica, ao passo 30 que anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes compreendendo 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeia tem geralmente cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é encadeada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, ao passo que as duas cadeias H são encadeadas uma à outra por uma ou mais ligações de dissulfeto dependen- do do isótipo de cadeia H. Cada cadeia HeL também tem pontes dissulfeto 5 intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem no N-término, um domínio variável (Vh) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os isótipos μ e ε. Cada cadeia L tem no N-término, um domínio variável (Vl) seguido por um domí- nio constante (Cl) em sua outra extremidade. O Vl é alinhado com o Vh e o 10 Cl é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH 1). Acredita-se que resíduos aminoácidos formem uma interface entre os domí- nios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O pareamento de um Vh e Vl juntos formam um único sítio de ligação antigênica. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic 15 and Clinicai Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tris- tram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, pg. 71 e Chapter 6.
A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lâmbda, com 20 base nas seqüências de aminoácidos de seus domínios constantes. Depen- dendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isótipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, tendo cadeias pesadas designada α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As clas- 25 ses γ e α são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferen- ças relativamente menores na seqüência e função de CH, por exemplo, hu- manos expressam as seguintes subclasses: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, e lgA2.
O termo "variável" se refere ao fato de que alguns segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em seqüência entre anticor- pos. O domínio V media a ligação de antígeno e define especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através de uma amplitude de 110 aminoá- cidos dos domínios variáveis. Ao invés, as regiões V consistem em trechos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade 5 denominadas "regiões hipervariáveis" que têm cada 9 a 12 aminoácidos de extensão. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compre- endem cada quatro FRs1 adotando largamente uma configuração de β - sheet, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam Ioops co- nectando, e em alguns casos formando parte de, a estrutura de β -sheet. As 10 regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proxi- midade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contri- buem para a formação do sítio de ligação antigênica de anticorpos (see Ka- bat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os do- 15 mínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anti- corpo para um antígeno, mas apresentam várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
O termo "região hipervariável" quando usado aqui, se refere aos 20 resíduos aminoácidos de um anticorpo os quais são responsáveis por liga- ção de antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, em torno de cerca dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL, e em torno de cerca dos 1-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) e 25 no VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de um "laço hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no VL, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no VH; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui, se refere
a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais as 5 quais incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determi- nante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclo- nais são vantajosos em que podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" não deve ser considerado 10 como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodologia do hibridoma primeiro descrita por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser preparados usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, eucarióticas de animais ou de plantas 15 (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567). Os "anti- corpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature. 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol.. 222: 581-597 (1991), por exem- plo.
Os anticorpos monoclonais aqui, incluem anticorpos "quiméricos"
nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos particu- lar, ao passo que o restante das cadeias é idêntico com ou homólogo a se- 25 quências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou per- tencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de similares anticorpos, de modo que apresentam a atividade biológica de- sejada (vide a Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de 30 interesse aqui, incluem anticorpos "primatizados" compreendendo seqüên- cias de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não-humano (por exemplo, Old World Monkey, Ape e etc), e seqüências de região constante humana.
Um anticorpo "intacto" é um o qual compreende um sítio de liga- ção de antígeno bem como um Cl e no mínimo domínios constantes de ca- deia pesada, Ch 1, Ch 2 e Ch 3. Os domínios constantes podem ser domí- 5 nios constantes de seqüência nativa (por exemplo, domínios constantes de seqüência nativa humana) ou variante de seqüências de aminoácidos dos mesmos. Preferencialmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um 10 anticorpo intacto, preferencialmente a região de ligação de antígeno ou vari- ável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diabodies; anticorpos lineares (vide a Patente dos Estados Unidos No. 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al., Prote- in Enq. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e 15 anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.
A digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", e um frag- mento "Fe" residual, uma designação refletindo a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o 20 domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch 1). Cada fragmento Fab é monovalente com re- lação a ligação de antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação de antígeno. O tratamento por pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande o qual corresponde grosseiramente a dois fragmentos Fab 25 encadeados por dissulfeto tendo atividade de ligação de antígeno divalente e ainda é capaz de reticulação de antígeno. Fragmentos Fab1 diferem de frag- mentos Fab por terem poucos resíduos adicionais no término carbóxi do domínio Ch 1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui, para Fab' no qual o um ou mais re- 30 síduos cisteína dos domínios constantes portam um grupo tiol livre. Frag- mentos de anticorpos F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab1 os quais têm articulações de cisteínas entre os mesmos. Também são conhecidas outras ligações químicas de fragmentos de anti- corpos.
O fragmento Fc compreende as porções de terminal carbóxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de 5 anticorpos são determinadas por seqüências na região Fe, cuja região tam- bém é a parte reconhecida por receptores de Fe (FcR) encontrados sobre alguns tipos de células.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo o qual contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação de antígeno. Este fragmento con- 10 siste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e uma cadeia leve em firme associação não-covalente. A partir da dobra des- tas fitas dois domínios emanam seis Ioops hipervariáveis (3 Ioops cada da cadeia HeL) que contribuem os resíduos aminoácidos para ligação de antí- geno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No en- 15 tanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreen- dendo somente três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.
"Fv de cadeia única" também abreviado como "sFv" ou "scFv" 20 são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos Vh e Vl conectados em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo sFv adicionalmente compreende um encadeador de polipeptí- deo entre os domínios Vh e Vl o qual permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, vide Pluckthun 25 in The Pharmacoloqy of Monoclonal Antibodies1 v. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
O termo "diabodies" se refere a pequenos fragmentos de anti- corpos preparados construindo fragmentos sFv (vide o parágrafo preceden- te) com encadeadores curtos (cerca de 5 a 10 resíduos) entre os domínios Vh e Vl de tal modo que é obtida pareamento intercadeia mas não intraca- deia dos domínios V, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmen- to tendo dois sítios de ligação de antígeno. Diabodies biespecíficos são hete- rodímeros de dois fragmentos sFv de cruzamento "crossover" nos quais os domínios Vh e Vl dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentes ca- deias de polipeptídeos. Diabodies são descritos mais completamente, por 5 exemplo, na patente européia No. EP 404.097; na publicação de patente internacional No. WO 93/11161; e em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 6444-6448 (1993).
Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima de- rivada do anticorpo não-humano. Para a maior parte, anticorpos humaniza- dos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a desejada especificidade, afinidade, e capacidade de anticorpo. Em alguns casos, resí- duos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituí- das por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar adicionalmente a performance do anticorpo. Em geral, o anticor- po humanizado compreenderá substancialmente todos de no mínimo um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humana e todos ou substancialmente todos das FRs são aqueles de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcio- nalmente também compreenderá no mínimo uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fe), tipicamente a de uma imunoglobulina hu- mana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
Um "anticorpo espécie-dependente", por exemplo, um anticorpo IgE antihumano de mamífero, é um anticorpo o qual tem uma afinidade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo espécie-dependente "liga especifi- camente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de Iiga- 5 ção (Kd) de não mais de cerca de 1 x 10'7 M, preferencialmente não mais de cerca de 1 x 10'8 e o mais preferencialmente não mais de cerca de 1 x 10'9 M) mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não-humano a qual é no mínimo cerca de 50 vezes, ou no mínimo cerca de 500 vezes, ou no mínimo cerca de 1000 10 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo espécie-dependente pode ser qualquer um dos vários tipos de anticorpos conforme definido acima, mas preferencialmente é um anticorpo humanizado ou humano.
Um " oligopeptídeo de ligação de IL-17A/F" é um oligopeptídeo que liga, preferencialmente de modo específico, a um polipeptídeo IL-17A/F conforme descrito aqui, . Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F podem ser sintetizados quimicamente usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recom- binante. Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F têm geralmente no mínimo cerca de 5 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos de exten- são ou mais, em que os oligopeptídeos referidos que são capazes de ligar, preferencialmente de modo específico, a um polipeptídeo IL-17A/F conforme descrito aqui, . Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F podem ser identifica- dos sem indevida experimentação usando técnicas de conhecimento geral. A este respeito, é observado que técnicas para triagem de bibliotecas de oligopeptídeos para oligopeptídeos que são capazes de ligar especificamen- te a um polipeptídeo-alvo são conhecidos de modo geral na técnica (vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; a Publi- cação de patente internacional PCT Nos. WO 84/03506 e W084/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 81: 3998-4002 (1984); Geysen 5 et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., em Svnthetic Peptides as Antiqens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistrv, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 10 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol.. 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88: 8363, e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.. 2: 668).
Uma " molécula orgânica de ligação de IL-17A/F" é uma molécu- la orgânica diferente de um oligopeptídeo ou anticorpo conforme definido 15 aqui, que liga, preferencialmente especificamente, a um polipeptídeo IL- 17A/F conforme descrito aqui, . Moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F podem ser identificadas e sintetizadas quimicamente usando metodologia conhecida (vide, por exemplo, a Publicação de patente internacional PCT Nos. W000/00823 e WOOO/39585). Moléculas orgânicas de ligação de IL- 20 17A/F têm geralmente menos de cerca de 2000 daltons de tamanho, alterna- tivamente menos de cerca de 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons de tama- nho, em que as moléculas orgânicas referidas que têm capacidade de liga- ção, preferencialmente especificamente, a um polipeptídeo IL-17A/F confor- me descrito aqui, podem ser identificadas sem indevida experimentação u- 25 sando técnicas de conhecimento geral. A este respeito, observa-se que téc- nicas para triagem de bibliotecas de moléculas orgânicas para moléculas que são capazes de ligação a um polipeptídeo-alvo são conhecidas de modo geral na técnica (vide, por exemplo, a Publicação de patente internacional PCT Nos. WO00/00823 e WOOO/39585).
Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "a qual
liga" um antígeno de interesse, por exemplo, um antígeno-alvo de polipeptí- deo associado a tumor, é um que liga o antígeno com suficiente afinidade de tal modo que o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica é útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de uma célula ou um tecido expressando o antígeno, e não tem reação cruzada sig- nificativa com outras proteínas. Em similares modalidades, a extensão da 5 ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a uma prote- ína "não-alvo" será menor do que cerca de 10% da ligação do anticorpo, oli- gopeptídeo ou outra molécula orgânica a sua proteína-alvo particular con- forme determinado por análise por classificação celular ativada por fluores- cência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Com relação à ligação de 10 um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a uma molécula-alvo, o termo "ligação específica" ou "liga especificamente a" ou é "específica pa- ra" um polipeptídeo particular ou um epitopo sobre um alvo polipeptídico par- ticular significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não-específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determi- 15 nando a ligação de uma molécula comparada com a ligação de uma molécu- la controle, a qual geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, ligação específica pode ser determi- nada por competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não-rotulado. Neste caso, ligação específica é 20 indicada se a ligação do alvo rotulado a uma sonda for inibido de modo competitivo por excesso de alvo não-rotulado. O termo "ligação específica" ou "liga especificamente a" ou é "específica para" um polipeptídeo particular ou um epitopo sobre um alvo polipeptídico particular conforme usado aqui, pode ser apresentado, por exemplo, por uma molécula tendo um Kd para o 25 alvo de no mínimo cerca de 10'4 M, alternativamente no mínimo cerca de 10' 5 M, alternativamente no mínimo cerca de 10‘6 M, alternativamente no míni- mo cerca de 10'7 M, alternativamente no mínimo cerca de 10'8 M, alternati- vamente no mínimo cerca de 10'9 M, alternativamente no mínimo cerca de 10'10 M, alternativamente no mínimo cerca de 10'11 M, alternativamente no 30 mínimo cerca de 10'12 M, ou mais. Em uma modalidade, o termo "ligação específica" se refere a ligação onde uma molécula liga a um polipeptídeo particular ou epitopo sobre um polipeptídeo particular sem ligar substancial- mente a qualquer outro polipeptídeo ou epitopo de polipeptídeo.
Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "i- nibe o crescimento de células tumorais expressando um "polipeptídeo IL- 17A/F" ou um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "inibidor/a 5 do crescimento" é um o qual resulta em inibição do crescimento mensurável de células cancerígenas expressando ou superexpressando o polipeptídeo IL-17A/F apropriado. Anticorpos anti-IL-17A/F, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas inibidores do crescimento preferenciais inibem o crescimento de células tumorais expressando IL-17A/F por mais de 20%, preferencialmente 10 a partir de cerca de 20% a cerca de 50%, e ainda mais preferencialmente, por mais de 50% (por exemplo, a partir de cerca de 50% a cerca de 100%) comparados com o controle apropriado, o controle tipicamente sendo células tumorais não-tratadas com o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula or- gânica sendo testados. Em uma modalidade, a inibição do crescimento pode 15 ser medida em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 pg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, onde a inibição do cresci- mento é determinada 1 a 10 dias depois de exposição das células tumorais ao anticorpo. A inibição do crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada de vários modos. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo 20 se a administração do anticorpo anti-IL-17A/F a cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resulta em redução no tamanho do tumor ou da proliferação de células tumorais dentro de cerca de 5 dias até 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferencialmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a qual
"induz apoptose" é um/a que induz morte celular programada conforme de- terminado por ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celu- lar, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou forma- ção de vesículas de membrana (denominados corpos apoptóticos). A célula 30 é geralmente uma a qual superexpressa um polipeptídeo IL-17A/F. Prefe- rencialmente a célula é uma célula tumoral, por exemplo, uma célula de próstata, de mama, de ovário, de estômago, endometrial, pulmonar, renal, de cólon, de bexiga. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os even- tos celulares associados com apoptose. Por exemplo, a translocação de fos- fatidil serina (PS) pode ser medida por ligação de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada através de Iaddering de DNA; e a condensação 5 nuclear/de cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento em células hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a qual induz apoptose é uma a qual resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferencialmente cerca de 5 a 50 vezes, e o mais preferencialmente cerca de 10 a 50 vezes, indução de Iiga- 10 ção de anexina relativa a célula não-tratada em um ensaio de ligação de a- nexina.
"Funções efetoras" de anticorpos se referem às atividades bioló- gicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou região Fc de seqüência de aminoácidos variante) de um anticorpo, e variam com o 15 isótipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento; ligação de re- ceptor de Fe; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos"
ou "ADCC" se refere a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada li- gada sobre receptores de Fe (FcRs) presentes sobre algumas células citotó- xicas (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e macrófa- gos) permite que estas células efetoras citotóxicas liguem especificamente a 25 uma célula-alvo portando antígeno e subsequentemente matem a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolu- tamente necessários para semelhante destruição. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcyRIII somente, ao passo que mo- nócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre célu- 30 Ias hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 à página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizada um ensaio de ADCC invenção, tal como a descrita na Patente dos Estados Unidos No. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para similares ensaios inclu- em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassi- nas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de 5 ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o descrito em Clynes et al.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95: 652-656 (1998).
"Receptor de Fe" ou "FcR" descreve um receptor que liga à regi- ão Fc de um anticorpo. O FcR preferencial é um FcR humano da seqüência nativa. Além disso, um FcR preferencial é um o qual liga um anticorpo IgG (um faixa receptor) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destas fitas receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativa- ção") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), os quais têm seqüências de a- minoácidos similares que diferem essencialmente nos domínios citoplasmá- ticos dos mesmos. Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ati- vação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplas- mático. Receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptora (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (vide a revisão M. in Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identifica- dos no futuro, são englobados pelo termo "FcR" aqui, . O termo também in- clui o receptor neonatal, FcRn, o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
" Células efetoras humanas" são leucócitos os quais expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam no mínimo FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exem- plos de leucócitos humanos os quais mediam ADCC incluem células mono- nucleares do sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sen- do preferenciais. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fon- te nativa, por exemplo, do sangue.
" Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" se refe- 5 re à Iise de uma célula-alvo na presença de complemento. A ativação do caminho do complemento clássico é iniciada pela ligação do primeiro com- ponente do sistema do complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) os quais são ligados a seu antígeno cognato. Para avaliar a ati- vação do complemento, pode ser realizada um ensaio de CDC, por exemplo, 10 conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
A palavra "etiqueta" quando usada aqui, se refere a um compos- to detectável ou composição a qual é conjugada diretamente ou indiretamen- te ao anticorpo de modo a gerar um anticorpo "rotulado". A etiqueta pode ser 15 detectável por si própria (por exemplo, etiquetas de radioisótopos ou etique- tas fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimática, pode catalisar alte- ração química de um composto ou composição do substrato o qual é detec- tável.
Por "fase sólida" se indica uma matriz não-aquosa à qual o anti- 20 corpo da presente invenção pode aderir. Exemplos de fases sólidas englo- bados aqui, incluem aqueles formados parcialmente ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, aga- rose), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil álcool e silicones. Em algumas modalidades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender a 25 cavidade de uma lâmina de teste; em outras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade). Este termo tam- bém inclui uma fase sólida descontínua de partículas distintas, tais como aquelas descritas na Patente dos Estados Unidos No. 4.275.149.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo o qual é útil para liberação de um fármaco (tal como um polipeptídeo IL-17A/F ou anticorpo para o mesmo) para um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente arranja- dos em uma formação bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.
Uma "molécula pequena" é definida aqui, por ter um peso mole- cular abaixo de cerca de 500 Daltons.
5 O termo "modular" significa afetar (por exemplo, quer regular
para cima, regular para baixo ou controlar de modo diverso) o nível de um caminho de sinalização. Processos celulares sob o controle de transdução de sinal incluem, mas não estão limitados a, transcrição de genes específi- cos, funções celulares normais, tais como metabolismo, proliferação, dife- 10 renciação, adesão, apoptose e sobrevida, bem como processos anormais, tais como transformação, bloqueio de diferenciação e metástase.
"Ativa" ou "atividade" para os fins aqui, se refere a uma ou mais formas de um polipeptídeo IL-17A/F as quais retêm uma atividade biológica e/ou uma imunológica de polipeptídeos IL-17A/F nativos ou que ocorrem 15 naturalmente, em que atividade "biológica" se refere a uma função biológica (quer inibitória ou estimulatória) causada por um polipeptídeo IL-17A/F nativo ou que ocorre naturalmente diferente da capacidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um polipeptídeo IL-17A/F nativo ou que ocorre naturalmente e uma atividade "imunológica" 20 se refere à capacidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um polipeptídeo IL-17A/F nativo ou que o- corre naturalmente. Uma atividade biológica preferencial inclui induzir ativa- ção de NF-κΒ e estimulação da produção das quimocinas pró-inflamatórias IL-8 e IL-6. Outra atividade biológica preferencial inclui estimulação de célu- 25 Ias mononucleares do sangue periférico ou células CD4+. Outra atividade biológica preferencial inclui estimulação da proliferação de linfócitos T. Outra atividade biológica preferencial inclui, por exemplo, a liberação de TNF-α a partir de células THP1. Outra atividade inclui um reforço da síntese de matriz em cartilagem articular. Alternativamente, outra atividade inclui promover 30 decomposição da matriz de cartilagem articular bem como inibir a síntese da matriz. Outra atividade biológica preferencial inclui modular o nível do cami- nho de sinalização de interleucina-17 durante estágios brandos a graves de doença intestinal inflamatória ou durante derrame.
Uma atividade "imunológica" se refere somente à capacidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico pos- suído por um polipeptídeo IL-17A/F nativo ou que ocorre naturalmente.
5 "Distúrbio cartilagenoso degenerativo" descreve um hospedeiro
de distúrbios que se caracterizam principalmente pela destruição da matriz de cartilagem. Patologias adicionais incluem produção de óxido nítrico, e decomposição elevada de proteoglicano. Distúrbios exemplares englobados dentro desta definição, incluem, por exemplo, artrite (por exemplo, osteoartri- te, artrite reumatoide, artrite psoriática).
O termo "doença imunorrelacionada" significa uma doença na qual um componente do sistema imune de um mamífero causa, media ou contribui de modo diverso para uma morbidez no mamífero. Também são incluídas doenças nas quais a estimulação ou intervenção da reação imune 15 tem um efeito de melhora sobre a progressão da doença. Estão incluídas dentro deste termo doenças inflamatórias imunomediadas, doenças inflama- tórias não-imunomediadas, doenças infecciosas, doenças por imunodefici- ência, neoplasia, e etc.
O termo "doença mediada por células T" significa uma doença 20 na qual células T mediam diretamente ou indiretamente ou contribuem de modo diverso para uma morbidez em um mamífero. A doença mediada por células T pode ser associada com efeitos mediados por células, efeitos me- diados por linfocinas, e etc., e mesmos efeitos associados com células B se as células B são estimuladas, por exemplo, pelas linfocinas secretadas por 25 células T.
Exemplos de doenças imunorelacionadas e inflamatórias, algu- mas das quais são imunes ou mediadas por células T, as quais podem ser tratadas de acordo com a invenção incluem lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, espondiloartropatias, esclerose sis- 30 têmica (escleroderma), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxísmica no- turna), trombocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imunomediada), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Ha- shimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabete melito, doença renal imunomediada (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial), doenças 5 desmielinantes dos sistemas nervosos central e periférico tais como esclero- se múltipla, polineuropatia desmielinante idiopática ou síndrome de Guillain- Barré, e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, doenças hepato- biliares tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não-hepatotrópicos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, 10 hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, doença intestinal inflama- tória (colite ulcerativa: doença de Crohn), enteropatia sensível a glúten, e doença de Whipple, doenças de pele autoimunes ou imunomediadas inclu- indo doenças de pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópi- 15 ca, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão tais como pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite por hipersensibilidade, doenças associadas com transplante incluindo rejei- ção a enxerto e doença enxerto-versus-hospedeiro. Doenças infecciosas incluindo doenças virais tais como AIDS (infecção por HIV), hepatite A, B, C, 20 D, e E, herpes, e etc., infecções bacterianas, infecções fúngicas, infecções por protozoários e infecções parasitárias. O termo "quantidade eficaz" é uma concentração ou quantidade de um polipeptídeo IL-17A/F e/ou agonis- ta/antagonista a qual resulta em atingir uma finalidade determinada particular. Uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo IL-17A/F ou agonista ou anta- 25 gonista do mesmo pode ser determinada empiricamente. Além disso, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma concentração ou quantidade de um polipeptídeo IL-17A/F e/ou agonista/antagonista a qual é eficaz para a- tingir um efeito terapêutico determinado. Esta quantidade também pode ser determinada empiricamente.
O termo "agente citotóxico" conforme usado aqui, se refere a
uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destrui- ção de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegertal ou animal, ou fragmentos dos mesmos.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem adriami- cina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracil, citosina arabinosídeo ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, bussulfan, citoxina, taxóides, por exemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), e doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposídeo, ifosfamida, mitomicina C, mi- toxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposídeo, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver patente U.S. Pat. No. 4,675,187), melfalan e outras mostardas de nitro- gênio relacionadas. Também são incluídos nesta definição agentes hormo- nais que atuam regulando ou inibindo a ação hormonal sobre tumores tais como tamoxifeno e onapristona.
Um "agente inibidor do crescimento" quando usado aqui, se refe- re a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerígena superexpressando quaisquer dos 20 genes identificados aqui, quer invenção ou in vivo. Portanto, o agente inibi- dor do crescimento é um agente o qual reduz a percentagem de células su- perexpressando os genes referidos na fase S. Exemplos de agentes inibido- res do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem 25 parada da fase G1 e parada da fase M. Bloqueadores da fase M clássicos incluem os vincas (vincristina e vinblastina), taxol, e topo Il inibidores tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposídeo, e bleomicina. Estas fitas agentes que param G1 também extravasam na parada da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de de DNA tais como tamoxifeno, predni- 30 sona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila, e ara-C. Informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, intitulado "Cell cycle regula- tion, oncogens, and antineoplastic drugs" de Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia1 1995), especialmente p. 13.
O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células as quais agem sobre outra célula como medi- adores intercelulares. Exemplos de similares citocinas são linfocinas, mono- cinas, e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão hormônio de crescimento tal como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil, e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró- relaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio tiróide estimulante (TSH)1 e hormônio Iuteinizante (LH); fa- tor de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral -a e -β; substância de inibi- ção muleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso tais como NGF-β; fator de crescimen- to plaquetário; fatores de crescimento transformante (TGFs) tais como TGF- α e TGF-β; fator de crescimento semelhante a insulina -I e -II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tais como α, β, e γ interferon; fato- res estimulantes de colônia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); gra- nulócito- macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleuci- nas (ILs) tais como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, or IL-17; um fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídico incluindo fator inibidor de leucemia (LIF) e kit Iigante (KL). Conforme usado aqui, o termo citocina inclui proteí- nas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes bio- logicamente ativos das citocinas de seqüências nativas. Tabela 1
* C-C increased from 12 to 15 * Z is average of EQ
* B is average of ND
* match with stop is _M; stop-stop = 0; J (joker) match = 0 */
#define _M -8 /* value of a match with a stop */
int _day[26][26] = {
/* ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ*/
/* A*/ { 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1 ,-1, 0,-1 ,-2,-1, 0,_M, 1, 0,-2, 1,1,0, 0,-6, 0,-3, 0},
/* B */ { 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5,
0,-3, 1},
/* C*/ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8,
0, 0,-5},
/* D */ { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2),
/* E */ { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3),
/* F */ {-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5},
/* G */ {1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-1 ,-1 ,-3, 1, 0, 0,-1 ,-7, 0,-5, 0},
/* H */ {-1, 1 ,-3, 1, 1 ,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1 ,-1, 0,-2,-3, 0,
0, 2},
/* I */ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-2,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-5,
0,-1,-2},
/* J */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,
0, 0},
/* K */ {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0},
/* L*/
0,-1 ,-2}, /* M */
0.-2.-1}, /* N */ 0,-2, 1}, 1*0*1 0,_M,_M, 10 Ι*Ρ*Ι 0,-5, 0},
/* Q */ 0,-4, 3},
/* R*/
0,-4, 0},
/* S 7 0,-3, 0}, 1*1*1 0,-3, 0}, /* U */
0, 0},
/* V*/
ο,-2,-2},
/* W*/
0, 0,-6},
/* X */
0, 0},
/* Y*/ ο,10,-4}, I* Z */
4, 4}
};
{-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_Μ,-3,-2,-3,-3,-1, 0, 2,-2,
{-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_Μ,-2,-1, 0,-2,-1, 0, 2,-4,
{ 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_Μ,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4,
{_Μ ,_Μ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ,
.M ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ},
{ 1,-1 ,-3,-1,-1 ,-5,-1, 0,-2, 0,-1 ,-3,-2,-1 ,_Μ, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1 ,-6,
{ 0, 1,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1 ,-2,-1. 1,_Μ, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5,
{-2, 0,-4,-1 ,-1 ,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_Μ, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2,
{ 1, 0, 0, 0, 0,-3, 1,-1 ,-1, 0, 0,-3,-2, 1,_Μ, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1 ,-2,
{ 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1 ,-1, 0,_Μ, 0,-1 ,-1, 1, 3, 0, 0,-5,
{ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,
{ 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_Μ,-1 ,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6,
{-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_Μ,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17,
{ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,
{-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1 ,-2,-2,_Μ,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0,
{ 0, 1 ,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1 ,_Μ, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,- 10
15
25
30
7
#include <stdio.h> #include <ctype.h> #define MAXJMP #define MAXGAP ger than this 7 #define JMPS
#define
Iast jmp 7
#define
#define
#define
#define
#define
#define
MX
DMAT
DMIS
DINSO
DINS1
PINSO
PINS1
16 /* max jumps in a diag 7
24 /* don't continue to penalize distâncias Iar-
1024 /* max jmps in an path 7
4 /* save if there’s at Ieast MX-1 bases since
3 /* value of matching bases 7
0 /* penalty for mismatched bases 7 8 Γ penalty for a distância 7
1 /* penalty per base 7
8 /* penalty for a distância 7
4 /* penalty per residue 7
struct jmp {
short n[MAXJMP]; /* size of jmp (neg fordely) 7 unsigned short x[MAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x 7
};
struct diag { int score;
Iong offset;
short ijmp; struct jmpjp;
};
struct path {
/* Iimits seq to 2Λ16 -1 */
/* score at Iastjmp */
/* offset of prev block */
/* current jmp index */
/* Iist of jmps */
int
short
int
};
char
spc;
n[JMPS];
x[JMPS];
*ofile;
/* number of Ieading spaces */
/* size of jmp (distância) */
/* Ioc of jmp (last elem before distância) */
/* output file name */ char *namex[2]; /* seq names: getseqs() */
char *prog; /* prog name for err msgs */
char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() 7
int dmax; /* best diag: nw() 7
int dmaxO; /* final diag */
int dna; /* set if dna: main() */
int enddistâncias; /* set if penalizing end distân-
cias 7
int gapx, gapy; /* total distâncias in seqs 7
int IenO1 Ien1; /* seq Iens */
int ngapx, ngapy; /* total size of distâncias 7
int smax; /* max score: nw() 7
int *xbm; /* bitmap for matching 7
Iong offset; /* current offset in jmp file 7
struct diag *dx; /* holds diagonais */
struct path pp[2]; /* holds path for seqs 7
char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy();
char *getseq(), *g_calloc();
/* Needleman-Wunsch alignment program
20
* usage: progs filei file2
* where filei and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
* Any Iines beginning with or '<’ are ignored
* Max file Iength is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)
* Uma sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Output is in the file "align.out"
*
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
*/ #include "nw.h"
#include "day.h" static _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
};
static _pbval[26] = {
1, 2|(1 «('D'-'A'))|(1 «('Ν'-'Α')), 4, 8, 16, 32, 64,
128, 256, OxFFFFFFF, 1«10,1 «11, 1«12, 1 «13, 1«14,
1 «15, 1 «16, 1 «17, 1 «18, 1 «19, 1«20, 1 «21, 1«22,
1«23, 1«24, 1 «25|(1 «(Έ'-Ά'))|(1 «(Ό'-Ά1))
};
main(ac, av) main int ac;
char *av[];
{
prog = av[0]; if (ac != 3) {
fprintf(stderr,"usage: %s filei file2\n", prog); fprintf(stderr,"where filei and file2 are two dna or two protein se- quencesAn");
fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf(stderr,"Any Iines beginning with or '<’ are ignored\n"); fprintf(stderr,"Output is in the file Valign.outYYT); exit(1);
>
namex[0] = av[1]; namex[1] = av[2];
seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqx[1] = getseq(namex[1], &len1); xbm = (dna)? dbval : pbval;
enddistâncias = 0; /*1 to penalize enddistâncias 7
ofile = "align.out"; /* output file 7 nw(); Γ fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ print(); /* print stats, alignment 7 cleanup(O); /* unlink any tmp files */
}
/* do the alignment, return best score: main()
* dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equal, we prefer mismatches to any distância, prefer
* a new distância to extending an ongoing distância, and prefer a distância in seqx
* to a distância in seq y.
*/
nw() nw
{
char *px, *py; /* seqs and ptrs 7 int *ndely, *dely; /* keep track of dely */ int ndelx, delx; Γ keep track of delx 7 int *tmp; /* for swapping rowO, rowl 7 int mis; /* score for each type 7 int insO, ins1; /* insertion penalties 7 registe r id; /* diagonal index */ register ü; /* jmp index */ register *col0, *col1; /* score for curr, Iast row */ register xx, yy; Γ index into seqs *1 dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", Ien0+len1+1, sizeof(struct di- ag));
ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", Ien1+1, sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", Ien1+1, sizeof(int));
colO = (int *)g_calloc("to get colO", Ienl +1, sizeof(int)); col1 = (int *)g_calloc("to get col1", Ien1+1, sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINS0; insl = (dna)? DINS1 : PINS1; smax = -10000; if (enddistâncias) {
for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= Ienl; yy++) { colO[yy] = dely[yy] = col0[yy-1] - insl;
ndely[yy] = yy;
>
col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */
>
else
for (yy = 1; yy <= Ienl; yy++) dely[yy] = -insO;
/* fill in match matrix
Ί
for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= IenO; px++, xx++) {
/* initialize first entry in col
Ί
if (enddistâncias) { if (xx == 1)
col1 [0] = delx = -(ins0+ins1);
else
col1 [0] = delx = col0[0] - insl; ndelx = xx;
>
else {
col1[0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0;
}
...nw
for (py = seqx[1], yy = 1; yy <= Ienl; py++, yy++) { mis = col0[yy-1]; if (dna)
mis += (xbm[*px-’A']&xbm[*py-,A'])? DMAT : DMIS;
else
mis += _day[*px-’A’][*py-'A’];
/* update penalty for dei in x seq;
* favor new dei over ongong dei
* ignore MAXGAP if weighting enddistâncias */
if (enddistâncias || ndely[yy] < MAXGAP) {
if (col0[yy] - insO >= dely[yy]) {
dely[yy] = col0[yy] - (ins0+ins1); ndely[yy] = 1;
} else {
dely[yy] -= insl ;
ndely[yy]++;
}
} else {
if (col0[yy] - (ins0+ins1) >= dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] - (ins0+ins1);
ndely[yy] = 1;
} else
ndely[yy]++;
}
/* update penalty for dei in y seq;
* favor new dei over ongong dei
7
if (enddistâncias || ndelx < MAXGAP) { if (col1 [yy-1] - insO >= delx) {
delx = col1 [yy-1 ] - (ins0+ins1);
ndelx = 1;
} else {
delx -= insl; ndelx++;
}
} else {
if (col1 [yy-1] - (insO+ins1) >= delx) {
delx = col1 [yy-1] - (ins0+ins1);
ndelx = 1;
} else
ndelx++;
}
/* pick the maximum score; we're favoring
* mis over any dei and delx over dely */
...nw
id = xx - yy + Ienl -1;
if (mis >= delx && mis >= dely[yy])
col1[yy] = mis; else if (delx >= dely[yy]) { col1[yy] = delx; ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id);
ij = dx[id].ijmp = 0;
dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + size-
of(offset);
}
}
dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id],score = delx;
}
else {
col1 [yy] = dely[yy];
ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) {
writejmps(id);
ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + size-
of(offset);
}
}
dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = dely[yy];
}
if (xx == IenO && yy < Ienl) {
/* Iast coI */
if (enddistâncias)
col1 [yy] -= ins0+ins1 *(len1 -yy);
if (col1 [yy] > smax) { smax = col1[yy]; dmax = id;
}
}
}
if (enddistâncias && xx < IenO) col1 [yy-1 ] -= insO+ins1*(lenO-xx); if (col1[yy-1] > smax) { smax = col1 [yy-1]; dmax = id;
>
tmp = colO; colO = col1; col1 = tmp;
}
(void) free((char *)ndely);
(void) free((char *)dely);
(void) free((char *)colO);
(void) free((char *)col1); }
/*
15
print() -- only routine visible outside this module
* static:
* getmat() - trace back best path, count matches: print()
* pr_aNgn() — print alignment of described in array p[]: print()
* dumpblock() -- dump a block of Iines with numbers, stars: pr_align() * nums() - put out a number line: dumpblock()
* putline() -- put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock()
* stars() - -put a Iine of stars: dumpblockQ
* stripname() -- strip any path and prefix from a seqname Ί
#include "nw.h"
#define SPC 3
#define PJJNE 256 /* maximum output Iine */
#define P_SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern _day[26][26];
int olen; /* set output Iine Iength */
FILE *fx; /* output file */
printQ print int Ix1 ly, firstgap, lastgap; /* overlap */
if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile);
cleanup(1);
}
fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], IenO); fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[1], Ien1); olen = 60;
Ix = IenO;
Iy = Ienl;
firstgap = lastgap = 0;
if (dmax < Ien 1 -1) { /* Ieading distância in x */ pp[0].spc = firstgap = Ienl - dmax -1;
Iy-= pp[0].spc;
>
else if (dmax > Ienl -1) {/* Ieading distância in y */ pp[1].spc = firstgap = dmax - (Ien1 -1);
Ix -= pp[1].spc;
>
if (dmaxO < IenO -1) { /* trailing distância in x */ lastgap = IenO - dmaxO -1;
Ix -= lastgap;
}
else if (dmaxO > IenO -1) { /* trailing distância in y */ lastgap = dmaxO - (IenO -1);
Iy -= lastgap;
}
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap);
pr_align();
}
/* * trace back the best path, count matches */
static
getmat(lx, Iy1 firstgap, lastgap) getmat int Ix, ly; /* "core" (minus enddistâncias) */
int firstgap, lastgap; /* Ieading trailing overlap */
{
int nm, iO, i1, sizO, sizl;
char outx[32];
double pct;
register nO, n1; register char *p0, *p1;
/* get total matches, score 7
iO = i1 = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[1].spc; p1 = seqx[1] + pp[0].spc; nO = pp[1].spc + 1; n1 = pp[0].spc + 1;
nm = 0;
while (*p0 && *p1 ) { if (sizO) { p1++; n1++;
sizO--;
}
else if (sizl) { pO++; nO++;
sizl--;
}
else { if (xbm[*p0-'A']&xbm[*p1 -Ά']) nm++; if (η0++ == pp[0].x[i0])
sizO = pp[0].n[i0++];
if (η1++ == pp[1].x[i1])
sizl = ρρ[1 ].n[i1 ++];
PO++;
ρ1++;
}
}
/* pct homology:
* if penalizing enddistâncias, base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core */
if (enddistâncias)
Ix = (IenO < Ienl)? IenO : Ienl;
else
Ix = (Ix < ly)? Ix : ly; pct = 100.*(double)nm/(double)lx;
fprintf(fx, "\n");
fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n", nm, (nm == 1)? "": "es", Ix1 pct); fprintf(fx, "<distâncias in first sequence: %d", gapx); ...getmat if (gapx) {
(void) sprintf(outx," (%d %s%s)",
ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf(fx,", distâncias in second sequence: %d", gapy);
if (gapy) {
(void) sprintf(outx, " (%d %s%s)",
ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); }
if (dna)
fprintf(fx,
"\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, distância penalty = %d + %d per base)\n",
smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1);
else
fprintf(fx,
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, distância penalty = %d + %d per residue)\n",
smax, PINSO, PINS1); if (enddistâncias) fprintf(fx,
"<enddistâncias penalized. Ieft endgap: %d %s%s, right end- gap: %d %s%s\n",
firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "" : "s", lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s");
else
fprintf(fx, "<enddistâncias not penalized\n");
}
static nm; /* matches in core -- for checking */ static Imax; /* Iengths of stripped file names */ static Ü[2]; /* jmp index for a path 7 static nc[2]; /* number at start of current Iine */ static ni[2]; /* current elem number -- for gapping 7 static siz[2]; static char*ps[2]; Γ ptr to current element 7 static char*po[2]; /* ptr to next output char slot 7 static charout[2][P_LINE]; /* output Iine */ static charstar[P_LINE]; /* set by stars() */
/* * print alignment of described in struct path pp[]
7
static
pr_align() pr_align {
int nn; Γ char count 7
int more;
register i;
for (i = 0, Imax = 0; i < 2; i++) {
nn = stripname(namex[i]);
if (nn > Imax)
Imax = nn; nc[i] = 1; ni[i] = 1;
siz[i] = ij[i] = 0;
ps[i] = seqx[i];
Po[i] = out[i]; }
for (nn = nm = 0, more = 1; more; ) { ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) {
/*
* do we have more of this sequence?
7
if(!*ps[i])
continue;
more++;
if (pp[i].spc) { /* Ieading space 7 *po[i]++ ='
PP[i]spc—;
}
else if (siz[i]) { /* in a distância 7
*po[i]++ = siz[i]-; }
else { /* we're putting a seq element
7
*po[i] = *ps[i];
if (islower(*ps[i]))
*ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++;
/*
* are we at next distância for this seq?
7
if (ni[i] == pp[i].x[ij[i]]) {
/*
* we need to merge ali distâncias * at this Iocation
7
siz[i] = pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i] == pp[i].x[ij[i]])
siz[i] += pp[i].n[ij[i]++];
}
ni[i]++;
>
}
if (++nn == olen || !more && nn) {
dumpblock();
for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i];
nn = 0;
}
} * dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */
static
dumpblock() dumpblock {
register i;
for (i = 0; i < 2; i++)
*po[i]~ = ·\0·;
...dumpblock (void) putc('\n', fx); for (i = 0; i < 2; i++) {
if (*out[i] && (*out[i] !=11H *(po[i]) != '')) { if («== 0)
nums(i);
if (i == 0 && *out[1])
sta rs(); putline(i);
if (i == 0 && *out[1]) fprintf(fx, star);
if (i == 1)
nums(i);
}
}
}
/*
* put out a number line: dumpblock()
*/
static
nums(ix) nums int ix; /* index in out[] holding seq Iine 7
{
char nline[P_LINE]; register i, j;
register char *pn, *px, *py;
for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++)
*pn ='
for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) {
if (*py ==' ’ Il *py ==
*pn = ’ else {
if (í%10 == 0 Il (i == 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? -i : i;
for (px = pn; j; j /= 10, px--)
*px = j%10 + Ό'; if (i < 0)
*px =
}
else
i++;
}
}
*pn = ’\0'; nc[ix] = i;
for (pn = nline; *pn; pn++)
(void) putc(*pn, fx);
(void) putc('\n', fx);
}
/*
* put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock()
*1
static
putline(ix) putline
int ix; { ...putline int ί;
register char *ρχ;
for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != px++, i++)
(void) putc(*px, fx);
for (; i < lmax+P_SPC; i++)
(void) putc('', fx);
/* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current Iine 7
for (px = out[ix]; *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F, fx);
(void) putc('\n', fx);
>
/*
* put a Iine of stars (seqs always in out[0], out[1 ]): dumpblock()
Ί
static
sta rs() stars {
int i;
register char *p0, *p1, cx, *px; if (!*out[0] Il (*out[0] ==''&& *(po[0]) == ") Il !*out[1] Il (*out[1] == " && *(po[1]) == '')) return;
px = sta r;
for (i = lmax+P_SPC; i; i--)
*px++ = '';
for (pO = out[0], p1 = out[1 ]; *p0 && *p1; pO++, p1 ++) { if (isalpha(*p0) && isalpha(*p1)) { if (xbm[*p0-'A']&xbm[*p1-'A']) { cx = nm++;
}
else if (!dna && _day[*pO-'A'][*p1 -Ά'] > 0) cx =
else
else
cx = ";
*px++ = cx;
}
*px++ = Vi';
*px = '\0';
}
/*
* strip path or prefix from pn, return len: pr_align()
Ί
static
stripname(pn) stripname
char *pn; /* file name (may be path) */
{
register char *px, *py; py = 0;
for (px = pn; *px; px++) if (*px =='/') py = px + 1;
if (PY)
(void) strcpy(pn, py);
return(strlen(pn));
}
/* * cleanupO - cleanup any tmp file
* getseq() - read in seq, set dna, len, maxlen
* g_calloc() - callocQ with error checkin
* readjmps() - get the good jmps, from tmp file if necessary * writejmps() -- write a filled array of jmps to a tmp file: nw()
7
#include "nw.h"
#include <sys/file.h>
char *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps 7
FILE *fj;
int cleanupO; /* cleanup tmp file 7
Iong lseek();
/*
* remove any tmp file if we blow 7
cleanup(i) cleanup int i;
{
if (fl)
(void) unlink(jname);
exit(i);
}
/*
* read, retum ptr to seq, set dna, len, maxlen
* skip Iines starting with or ’>'
* seq in upper or Iower case 7
char *
getseq(file, len) getseq
char *file; /* file name 7 int *len; /* seq Ien 7 {
char line[1024], *pseq;
register char *px, *py;
int natgc, tlen;
FILE *fp;
if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit(1);
}
tlen = natgc = 0;
while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*line == || *line == '<’ || *line == '>') continue; for (px = line; *px != Yi'; px++)
if (isupper(*px) || islower(*px))
tlen++;
}
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog,
tlen+6, file);
exit(1);
}
pseq[0] = pseq[1] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';
...getseq py = pseq + 4;
*len = tlen;
rewind(fp);
while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*line == || *line == '<’ || *line == '>')
continue;
for (px = line; *px != Yi'; px++) { if (isupper(*px)) *py++ = *ρχ;
else if (islower(*px))
*py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU",*(py-1)))
natgc++;
}
}
*py++ = '\0';
*py = ’\0';
(void) fclose(fp);
dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4);
}
char *
g_calloc(msg, nx, sz) g calloc
char *msg; /* program, calling routine 7
int nx, sz; /* number and size of elements 7
{
char *px, *calloc();
if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) { if (*msg) {
fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog,
msg, nx, sz);
exit(1);
>
}
return(px);
}
/*
* get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main()
7
readjmps() readjmps {
int fd = -1;
int siz, iO, i1;
register i, j, xx;
if (fj) {
(void) fclose(fj);
if ((fd = open(jname, ORDONLY, 0)) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup(1);
}
}
for (i = iO = i1 = 0, dmaxO = dmax, xx = IenO; ; i++) { while (1){
for (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j--)
;
...readjmps if (j < 0 && dx[dmax].offset && fj) {
(void) lseek(fd, dx[dmax].offset, 0);
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp));
(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].offset, size-
of(dx[dmax].offset));
dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1;
}
else
break;
}
if (i >= JMPS){
fprintf(stderr, "%s: too many distâncias in alignment\n", prog); cleanup(1);
}
if (j >= 0) { siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz;
if (siz < 0) { /* distância in second seq 7
pp[1].n[i1] = -siz;
xx += siz;
/* id = xx - yy + Ienl -1
7
pp[1].x[i1] = xx - dmax + Ienl - 1; gapy++;
ngapy-= siz;
/* ignore MAXGAP when doing enddistâncias 7
siz = (-siz < MAXGAP || enddistâncias)? -siz : MAXGAP; i1++;
>
else if (siz > 0) { /* distância in first seq 7
pp[0].n[i0] = siz; pp[0].x[i0] = xx; gapx++; ngapx += siz;
/* ignore MAXGAP when doing enddistâncias 7
siz = (siz < MAXGAP || enddistâncias)? siz : MAXGAP; iO++;
}
}
else
break;
}
/* reverse the order of jmps
*/
for (j = 0, i0~; j < iO; j++, iO--) {
i = pp[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp[0].n[i0]; pp[0].n[i0] = i; i = pp[0].x[j]; pp[0].xBJ = pp[0].x[i0]; pp[0].x[i0] = i; }
for (j = 0, i1~; j < i1; j++, i1~){
i = pp[1].n[j]; PP[1 ] n[j] = pp[1].n[i1]; pp[1].n[i1] = i; i = pp[i].x[j]; pp[i] x[j] = pp[1] x[íi]; pp[1].x[íi] = i;
}
if (fd >= 0)
(void) close(fd);
if (fj) {
(void) unlink(jname);
fj = 0;
offset = 0;
} }
/*
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()
7
writejmps(ix) writejmps int ix;
{
char *mktemp();
if (!fj) {
if (mktemp(jname) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, jname); cleanup(1);
}
if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname); exit(1);
}
}
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj);
(void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj);
} Tabela 2
Proteína IL-17A/F XXXXXXXXXXXXXXX (Extensão = 15 aminoácidos)
Proteína de Comparação ΧΧΧΧΧΥΥΥΥΥΥΥ (Extensão = 12 aminoácidos)
% de identidade de seqüências de aminoácidos =
(o número de resíduos aminoácidos combinando identicamente entre as du- as seqüências de polipeptídeos conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos aminoácidos da proteína IL-17A/F) =
5 dividido por 15 = 33,3%
Tabela 3
Proteína IL-17A/F ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ (Extensão = 10 aminoácidos)
Proteína de Comparação ΧΧΧΧΧΥΥΥΥΥΥΖΖΥΖ (Extensão = 15 aminoácidos)
% de identidade de seqüências de aminoácidos =
(o número de resíduos aminoácidos combinando identicamente entre as du- as seqüências de polipeptídeos conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos aminoácidos da proteína IL-17A/F) =
5 dividido por 10 = 50%
Tabela 4
IL-17A/F-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Extensão = 14 nucleotídeos)
DNA de Comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (Extensão = 16 nucleotídeos)
% de identidade de seqüências de ácido nucleico =
(o número de nucleotídeos combinando identicamente entre as duas se- qüências de ácido nucleico conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucleico IL-17A/F- DNA) =
6 dividido por 14 = 42,9%
Tabela 5
IL-17A/F-DNA NNNNNNNNNNNN (Extensão = 12 nucleotídeos)
DNA de Comparação NNNNLLLVV (Extensão = 9 nucleotídeos)
% de identidade de seqüências de ácido nucleico =
(o número de nucleotídeos combinando identicamente entre as duas se- qüências de ácido nucleico conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucleico IL-17A/F- DNA) = 4 dividido por 12 = 33,3%
II. Composições e Métodos da Invenção
A. Polipeptídeos IL-17A/F de Extensão Total A presente invenção proporciona seqüências de nucleotídeos 5 codificando polipeptídeos recém identificados e isolados referidos no presen- te requerimento como polipeptídeos IL-17A/F. Em particular, foram identifi- cados e isolados cDNAs codificando vários polipeptídeos IL-17A/F, conforme descrito em mais detalhes nos Exemplos abaixo.
B. Variantes de Polipeptídeos IL-17A/F Além dos polipeptídeos IL-17A/F de seqüência nativa de exten-
são total descritos aqui, é contemplado que podem ser preparadas variantes de IL-17A/F. Variantes de IL-17A/F podem ser preparadas introduzindo alte- rações de nucleotídeos apropriadsa no DNA de IL-17A/F, e/ou por síntese do polipeptídeo IL-17A/F desejado. Os versados na técnica reconhecerão 15 que alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-translacionais do IL-17A/F, tal como mudando o número ou posição de sítios de glicosila- ção ou alterando as características de ancoragem de membrana.
Podem ser feitas variações nos IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total ou em vários domínios do IL-17A/F descrito aqui, por exemplo, usando quaisquer das técnicas e diretrizes para mutações conservativas e bão-conservativas determinadas, por exemplo, na Patente dos Estados Uni- dos No. 5.364.934. Variações podem ser uma substituição, eliminação ou inserção de um ou mais códons codificando o IL-17A/F que resulta em uma alteração na seqüência de aminoácidos da IL-17A/F comparada com o IL- 17A/F da seqüência nativa. Opcionalmente a variação é por substituição de no mínimo um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios do IL-17A/F. Diretrizes determinando qualquer resíduo amino- ácido pode ser inserido, substituído ou eliminado sem afetar de modo adver- so a atividade desejada podem ser encontradas comparando a seqüência do IL-17A/F com a de moléculas de proteínas conhecidas homólogas e minimi- zando o número de alterações da seqüência de aminoácidos feitas em regi- ões de alta homologia. Substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido tendo propriedades es- truturais e/ou químicas similares, tal como a substituição de uma Ieucina com uma serina, isto é, substituições de aminoácidos conservativas. Inser- ções ou eliminações podem opcionalmente estar na faixa de cerca de 1 a 5 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistemati- camente inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos na se- qüência e testando as variantes resultantes para atividade apresentada pela seqüência de extensão total ou madura nativa.
Fragmentos de polipeptídeo IL-17A/F são proporcionados aqui, . 10 Os fragmentos referidos podem ser truncados no N-término ou C-término, ou podem carecer de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com uma proteína nativa de extensão total. Alguns fragmentos carecem de resí- duos aminoácidos que não são essenciais para uma atividade biológica de- sejada do polipeptídeo IL-17A/F.
Fragmentos de IL-17A/F podem ser preparados por qualquer um
de uma série de técnicas convencionais. Fragmentos de peptídeos deseja- dos podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa en- volve gerar fragmentos de IL-17A/F por digestão enzimática, por exemplo, tratando a proteína com uma enzima conhecida para clivar proteínas en sí- 20 tios definidos por resíduos aminoácidos em particular, ou digerindo o DNA com enzimas de restrição adequadas e isolando o fragmento desejado. Ain- da outra técnica adequada envolve isolar e amplificar um fragmento de DNA codificando um fragmento de polipeptídeo desejado, por reação de cadeia polimerase (PCR). Oligonucleotídeos que definem os términos desejados do 25 fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5' e 3' na reação de PCR. Preferencialmente, fragmentos de polipeptídeo IL-17A/F partilham no mínimo uma atividade biológica e/ou imunológica com o polipeptídeo IL- 17A/F nativo descrito aqui, .
Em modalidades particulares, substituições conservativas de interesse são mostradas na Tabela 6 sob o título de substituições preferen- ciais. Se similares substituições resultam em uma alteração na atividade bio- lógica, então alterações mais substanciais, denominadas substituições e- xemplares na Tabela 6, ou conforme adicionalmente descrito abaixo em re- ferência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos triados.
Tabela 6
íduo
Substituições
Original
Substituições
Típicas
Preferenciais
(N)
(D)
10
15
Ala (A)
Arg (R)
gin; his; lys; arg glu
[m (L)
vai; leu; ile lys; gin; asn
gin
Met (M)
25
(W)
30
glu
Cys (C) ser
Gln (Q) asn
Glu (E) asp
Gly (G) pro; ala
His (H) asn; gin; lys; arg
Ne (I) leu; vai; met; ala; phe;
norleucine norleucine; ile; vai; met; ala; phe Lys (K) arg; gin; asn
leu; phe; ile Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr
Pro (P) ala
Ser (S) thr
Thr(T) ser
tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser
Val (V) ile; leu; met; phe;
ala; norleucine
Ieu
vai
Iys
ser
asn
asp
Ieu
ile
arg
Ieu
ala
thr
ser
ala
arg
phe
Ieu Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipeptídeo IL-17A/F são realizadas selecionando substituições que dife- rem significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da estrutura do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma 5 folha ou conformação helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem natu- ralmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeias laterais comuns:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) acidíferos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não-conservativas acarretarão permutar um mem-
bro de uma destas classes por outra classe. Os resíduos substituídos referi- dos também podem ser introduzidos nos sítios de substituições conservati- vas ou, mais preferencialmente, nos sítios remanescentes (não- conservados).
As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na
técnica tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos (sítio-dirigida), varredura de alanina, e mutagênese de PCR. Mutagênese sítio-dirigida [Car- ter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et ai, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagênese de cassete (Wells et al., Gene. 34: 315 25 [1985]), mutagênese de seleção de restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soe. London SerA. 317: 415 [1986]) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas sobre o DNA clonado para produzir o DNA de IL-17A/F varian- te.
Análise de aminoácido por varredura também pode ser empre- gada para identificar um ou mais aminoácidos junto a uma seqüência contí- gua. Entre os aminoácidos de varredura preferenciais estão aminoácidos neutros relativamente pequenos. Os aminoácidos referidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferencial entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do beta- carbono e é menos provável alterar a conformação de cadeia principal da variante (Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 [1989]). Alanina 5 também é tipicamente preferencial porque é o aminoácido mais comum. A- lém disso, é frequentemente encontrado tanto em posições escondidas quando expostas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 [1976]). Se a substituição de alanina não produ- zir quantidades adequadas de variante, pode ser usado um aminoácido iso- 10 térico.
C. Modificações de IL-17A/F Modificações covalentes de IL-17A/F são incluídas dentro do âmbito desta invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir resí- duos aminoácidos alvo de um polipeptídeo IL-17A/F com um agente de deri- vação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C- terminais do IL-17A/F. Derivatização com agentes bi- funcionais é útil, por exemplo, para reticular IL-17A/F a uma matriz de supor- te insolúvel em água ou superfície para uso no método para purificar anti- corpos anti-IL-17A/F, e vice-versa. Agentes de reticulação comumente usa- dos incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4- azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dissuccini- midílicos tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncio- nais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato.
Outras modificações incluem deamidação de resíduos glutamini- Ia e asparaginila para os resíduos glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hi- 30 droxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos α-amino de ca- deias laterais lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties1 W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina de N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila de C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo IL-17A/F incluída dentro do âmbito desta invenção compreende alterar o padrão de 5 glicosilação nativo do polipeptídeo. "Alterar o padrão de glicosilação nativo" é pretendido, para os fins aqui, para significar eliminar uma ou mais porções carboidrato encontradas no IL-17A/F da seqüência nativa (quer removendo o sítio de glicosilação subjacente ou eliminando a glicosilação por meios quí- micos e/ou enzimáticos), e/ou adicionando um ou mais sítios de glicosilação 10 que não estão presentes no IL-17A/F da seqüência nativa. Além disso, a expressão inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma alteração na natureza e nas proporções das várias porções de carboidrato presentes.
A adição de sítios de glicosilação ao polipeptídeo IL-17A/F pode 15 ser realizada alterando a seqüência de aminoácidos. A alteração pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos serina ou treonina para o IL-17A/F da seqüência nativa (para sítios de glico- silação encadeados por O). A seqüência de aminoácidos IL-17A/F pode ser opcionalmente alterada através de alterações no nível de DNA, particular- 20 mente mutando o DNA codificando o polipeptídeo IL-17A/F em bases pré- selecionadas tais que são gerados códons que se traduzirão nos aminoáci- dos desejados.
Outros meios para aumentar o número de porções de carboidra- to sobre o polipeptídeo IL-17A/F é por acoplamento químico ou enzimático 25 de glicosídeos ao polipeptídeo. Os métodos referidos são descritos na técni- ca, por exemplo, na publicação de patente internacional No. WO 87/05330 publicada em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.. pp. 259-306 (1981).
A remoção de porções de carboidrato presentes sobre o polipep- tídeo IL-17A/F pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou por substituição mutacional de códons codificando para resíduos aminoácidos que servem como alvos para glicosilação. Técnicas de desglicosilação quí- mica são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophvs., 259: 52 (1987) e por Edge et al., Anal. Bio- chern., 118: 131 (1981). A clivagem enzimática de porções de carboidrato sobre polipeptídeos pode ser realizada pelo uso de uma variedade de endo- 5 e exo-glicosidases conforme descrito por Thotakura et al., Meth. Enzvmol.. 138: 350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente de IL-17A/F compreende a ligação do polipeptídeo IL-17A/F a um de uma variedade de polímeros não- protenáceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, na maneira determinada nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337.
O IL-17A/F da presente invenção também pode ser modificado em um modo para formar uma molécula quimérica compreendendo IL-17A/F fundido a outro polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácidos.
Em uma modalidade, uma molécula quimérica semelhante com-
preende uma fusão do IL-17A/F com um polipeptídeo de etiqueta o qual pro- porciona um epitopo ao qual um anticorpo antietiqueta pode ligar seletiva- mente. A etiqueta de epitopo é geralmente colocada no término de amino ou de carboxila do IL-17A/F. A presença de similares formas etiquetadas com 20 epitopo do IL-17A/F pode ser detectada usando um anticorpo contra o poli- peptídeo de etiqueta. Além disso, provisão da etiqueta de epitopo permite que o IL-17A/F seja prontamente purificado por purificação por afinidade u- sando um anticorpo antietiqueta ou outro tipo de matriz de afinidade que liga à etiqueta de epitopo. Vários polipeptídeos de etiqueta e seus anticorpos 25 respectivos são conhecidos de modo geral na técnica. Exemplos incluem etiquetas de poli-histidina (poly-his) ou poli-histidína-glicina (poly-his-gly); o polipeptídeo de etiqueta flu HA e seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; a etiqueta c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para a mesma [Evan et al., Molecular and Cellular Bioloqy. 5: 30 3610-3616 (1985)]; e a etiqueta de glicoproteína D do Herpes Simplex vírus (gD) e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Enqineerinq, 3(6): 547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos de etiqueta incluem o Flag-peptídeo [Hopp et ai, BioTechnoloqy, 6: 1204-1210 (1988)]; o peptídeo do epitopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; um peptídeo de epitopo de a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem.. 266: 15163-15166 (1991)]; e a etiqueta peptí- dica T7 gene 10 proteína [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA.
5 87:6393-6397(1990)].
Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do IL-17A/F com uma imunoglobulina ou uma regi- ão particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como uma "imunoadesina"), uma fusão seme- 10 Ihante pode ser à região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig prefe- rencialmente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio trans- membrana eliminado ou inativado) de um polipeptídeo IL-17A/F ao invés de no mínimo uma região variável dentro de uma molécula de lg. Em uma mo- dalidade particularmente preferencial, a fusão de imunoglobulina inclui as 15 regiões de articulação, CH2 e CH3, ou a articulação, CH1, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina vide também a Patente dos Estados Unidos No. 5.428.130 emitida em 27 de ju- nho de 1995.
Em ainda uma modalidade adicional, os polipeptídeos IL-17A/F da presente invenção também podem ser modificados em um modo para formar uma molécula quimérica compreendendo um polipeptídeo IL-17A/F fundido a um ziper de leucina. Vários polipeptídeos de ziper de Ieucina foram descritos na técnica. Vide, por exemplo, Landschulz et al., Science. 240: 1759 (1988); a publicação de patente internacional No. WO 94/10308; Hoppe et al.. FEBS Letters, 344:1991 (1994): Maniatis et ai, Nature. 341: 24 (1989). Acredita-se que o uso de um ziper de leucina fundido a um polipeptí- deo IL-17A/F pode ser desejável para ajudar na dimerização ou trimerização de polipeptídeo IL-17A/F solúvel em solução. Os versados na técnica reco- nhecerão que o ziper de leucina pode ser fundido ou à extremidade de N- ou de C-terminal da molécula de IL-17A/F.
D. Preparação de IL-17A/F A descrição abaixo se refere essencialmente à produção de IL- 17A/F cultivando células transformdas ou transfectadas com um vetor con- tendo ácido nucleico IL-17A/F. Logicamente, é contemplado que métodos alternativos, os quais são conhecidos de modo geral na técnica, podem ser empregados para preparar IL-17A/F. Por exemplo, a seqüência de IL-17A/F, ou porções da mesma, pode ser produzida por síntese direta de peptídeos usando técnicas de fase sólida [vide, por exemplo, Stewart et al., Solid- Phase Peptide Svnthesis. W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. Síntese de proteína invenção pode ser realizada usando técnicas manuais ou por automação. Síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, usando um sintetiza- dos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando as instruções do fabricante. Várias porções do IL-17A/F podem ser sintetizadas quimicamente separadamente e combinadsa usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o IL-17A/F de extensão total.
1. Isolamento de DNA Codificando IL-17A/F
DNA codificando IL-17A/F pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que se acredita que possua o mRNA de 20 IL-17A/F e o expresse em um nível detectável. Por conseguinte, DNA de IL- 17A/F humano pode ser obtido convenientemente de uma biblioteca de cD- NA preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene codificando IL-17A/F também pode ser obtido a partir de uma biblioteca genômica ou por procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese 25 de ácido nucleico automatizada).
Bibliotecas podem ser triadas com sondas (tais como anticorpos para o IL-17A/F ou oligonucleotídeos de no mínimo cerca de 20 a 80 bases) designadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por este. A triagem da biblioteca genômica ou de cDNA com a sonda seleciona- 30 da pode ser conduzida usando procedimentos de rotina, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene codificando IL-17A/F é usar metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR lniciador: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Os Exemplos abaixo descrevem técnicas para triar uma bibliote- 5 ca de cDNA. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como sondas devem ser de extensão suficiente e suficientemente inequívocas de tal modo que sejam minimizados falsos positivos. O oligonucleotídeo é preferencial- mente rotulado de modo que pode ser detectado na hibridização a DNA na biblioteca sendo triada. Métodos de rotulação são conhecidos de modo geral 10 na técnica, e incluem o uso de radioetiquetas como ATP marcado com 32P1 biotinilação ou rotulação enzimática. Condições de hibridização, incluindo moderada estringência e elevada estringência, são proporcionados em Sambrook et al., acima.
Seqüências identificadas em similares métodos de triagem de 15 biblioteca podem ser comparadas e alinhadas a outras seqüências conheci- das depositadas e disponíveis em bancos de dados públicos tais como GenBank ou outros bancos de dados de seqüências privados. Identidade de seqüência (ou no nível de aminoácido ou de nucleotídeo) dentro de regiões definidas da molécula ou através da seqüência de extensão total pode ser 20 determinada usando métodos conhecidos na técnica e conforme descrito aqui, .
Ácido nucleico tendo seqüência codificante de proteína pode ser obtido por triagem de cDNA selecionado ou de bibliotecas genômicas usan- do a seqüência de aminoácidos deduzida descrita aqui, pela primeira vez, e, 25 caso necessário, usando procedimentos de extensão de iniciadores conven- cionais conforme descrito em Sambrook et al., acima, para detectar precur- sores e intermediários do processamento de mRNA que não podem ter sido reverso-transcritos em cDNA.
2. Seleção e Transformação de Células Hospedeiras Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com
vetores de expressão ou de clonagem descritos aqui, para produção de IL- 17A/F e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes codificando as seqüências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelo téc- nico versado sem undevida experimentação. Em geral, princípios, protocolos, 5 e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares po- dem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnoloqy: a Practical Appro- ach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook etal., acima.
Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidsa pelo técnico ordinariamente versado, por exemplo, CaCh, CaPO4, mediada por Iipossoma e eletroporação. De- pendendo da célula hospedeira usada, é realizada transformação usando técnicas de rotina apropriadas para similares células. O tratamento com cál- cio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito em Sambrook et al., acima, ou eletroporação é geralmente usado para procariotas. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de algumas células de plantas, conforme descrito por Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) e a pu- blicação de patente internacional No. WO 89/05859 publicada em 29 de ju- nho de 1989. Para células de mamíferos sem tais paredes celulares, pode ser empregado o método de precipitação de fosfato de cálcio de Graham and van der Eb, Viroloqy. 52: 456-457 (1978). Aspectos gerais de transfec- ções de sistema de hospedeiro de células de mamíferos foram descritos na Patente dos Estados Unidos No. 4.399.216. Transformações em levedura são tipicamente realizados de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76: 3829 (1979). No entanto, também podem ser usados outros métodos para introduzir DNA em células, tal como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, por e- xemplo, polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformar células de mamíferos, vide Keown et al., Methods in Enzvmoloqy, 185: 527-537 (1990) e Mansour etal., Nature, 336: 348-352 (1988).
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressando o DNA nos vetores aqui, incluem células de procariotas, levedura, ou eucari- otas superiores. Procariotas adequados incluem, mas não estão limitados a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias cepas de E coli estão disponíveis publicamente, tais como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, En- terobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilos tais como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheni- formis 41P descrito em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estas fitas exem- plos são ilustrativos ao invés de limitantes. A cepa W3110 é um hospedeiro particularmente preferencial ou hospedeiro parental porque é uma cepa hos- pedeira comum para fermentações de dutos IL-17A/F recombinantes. Prefe- rencialmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada para efetuar uma mutação genética nos genes codificando proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos de similares hospedeiros incluindo E. coli W3110 cepa 1A2, a qual tem o genótipo completo tonA ; E. coli W3110 cepa 9E4, a qual tem o genótipo completo tonA ptr3\ E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55,244), a qual tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT karí; E. coli W3110 cepa 37D6, a qual tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 HvG karí; E. coli W3110 cepa 40B4, a qual é cepa 37D6 com uma mutação de eliminação degP não- resistente a canamicina; e uma cepa de E. coli tendo protease periplásmica mutante descrita na Patente dos Estados Unidos No. 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem invenção, por exemplo, PCR ou outras reações de ácido nucleico polimerase. Além de procariotas, micróbios eucariótícos tais como fungas
fitasos ou levedura são hospedeiros de clonagem adequados ou de expres- são para vetores codificando IL-17A/F. Saccharomyces cerevisiae é um mi- cro-organismo hospedeiro eucariótico inferior usado comumente. Outros in- cluem Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); patente européia no. EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985]; Kluyveromyces hospedeiros (Patente dos Estados Unidos No. 4.943.529;
5 Fleer et al., Bio/Technoloqy, 9: 968-975 [1991]) tais como, por exemplo, K Iaetis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgarieus (ATCC 16.045), K wiekeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophi- Iarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technoloqy. 8: 135 [1990]), K. 10 thermotolerans, e K marxianus; yarrowia (patente européia no. EP 402.226); Piehia pastoris (patente européia no. EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Triehoderma reesia (patente euro- péia no. EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Aead. Sei. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyees tais como Schwanniomyees 15 oeeidentalis (patente européia no. EP 394.538 publicada em 31 de outubro de 1990); e fungas fitasos tais como, por exemplo, Neurospora, Penieillium, Tolypocladium (a publicação de patente internacional No. WO 91/00357 pu- blicada em 10 de janeiro de 1991), e Aspergillus hospedeiros tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 20 [1983]; Tilburn et al., Gene. 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Leveduras metilotrópicas são adequadas aqui, e incluem, mas não estão limitados a, levedura capaz de crescimento sobre metanol selecionado entre os gêneros consistindo em Hansenula, Candida, Kloeeke- 25 ra, Piehia, Saeeharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares desta classe de leveduras pode ser encon- trada em C. Anthony, The Biochemistrv of Methvlotrophs, 269 (1982).
Células hospedeiras adequadas para a expressão de IL-17A/F glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9 ou Spodoptera High 5, bem como células de de plantas. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e células COS. Exemplos mais específicos incluem linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Gra- 5 ham et a/., J. Gen Virol.. 36: 59 (1977)); Células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216 [1980]); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); célu- las hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundon- 10 go (MMT 060562, ATCC CCL51). A seleção da célula hospedeira apropriada é considerada como estando dentro do conhecimento da técnica.
3. Seleção e Uso de um Vetor Replicável O ácido nucleico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) codifi- cando IL-17A/F pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão disponíveis publicamente. O vetor pode estar, por exemplo, sob a forma de um plasmí- deo, cosmídeo, partícula viral, ou fago. A seqüência de ácido nucleico apro- priada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um ou mais sítios de endonuclease de restrição apropriados usando técnicas conhecidas na técnica. Componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de uma se- qüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento reforçador, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais des- tas fitas componentes emprega técnicas de ligação de rotina as quais são conhecidas pelo técnico versado.
O IL-17A/F pode ser produzido de modo recombinante não so- mente diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, o qual pode ser uma seqüência de sinal ou outro 30 polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no N-término da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a seqüência de sinal pode ser um com- ponente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA codificando IL-17A/F que é inserido no vetor. A seqüência de sinal pode ser uma seqüência de sinal procariótico selecionado, por exemplo, entre o grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou lideres de enterotoxina Il termo-estáveis. Para secreção de levedura a seqüência de sinal pode ser, por exemplo, a seqüência Iider 5 de invertase de levedura, Iider de fator alfa (incluindo Saccharomyces e Kluyveromyces lideres de fator α, o último descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.010.182), ou Iider de fosfatase ácida, a Iider de glucoamilase de C. albicans (patente européia No. EP 362.179 publicada em 4 de abril de 1990), ou a de sinal descrita na patente internacional No. WO 90/13646 pu- 10 blicada em 15 de novembro de 1990. Em expressão celular de mamífero, seqüências de sinal de mamífero podem ser usadas para secreção direta da proteína, tais como seqüências de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bem como lideres secretores virais.
Tanto vetores de expressão quanto de clonagem contêm uma
seqüência de ácido nucleico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. As seqüências referidas são de co- nhecimento geral para uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das 20 bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo de 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos.
Vetores de expressão e de clonagem tipicamente conterão um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de 25 seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióti- cos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nu- trientes cruciais não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilos.
Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para célu-
las de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células com- petentes para apreender o ácido nucleico codificando IL-17A/F, tais como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR selvagem é empregada é a linhagem celular CHO deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagada conforme descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 4216 (1980). Um gene de seleção adequado para 5 uso em Ievadura é o gene trp^ presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature. 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene. 7: 141
(1979); Tschemper et al., Gene. 10: 157 (1980)]. O gene írpl proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura carecendo da capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou
PEP4-1 [Jones, Genetics. 85: 12 (1977)].
Vetores de expressão e de clonagem geralmente contêm um promotor encadeado operavelmente à seqüência de ácido nucleico codifi- cando IL-17A/F para síntese de mRNA direta. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são de conhecimento geral. 15 Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e Iactose [Chang et al., Nature. 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature. 281: 544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057
(1980); patente européia No. EP 36.776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA1 80: 21-25 (1983)].
Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma se- qüência de Shine-Dalgarno (S.D.) encadeada operavelmente ao DNA codifi- cando IL-17A/F.
Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com 25 hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quina- se [Hitzeman et al., J. Biol. Chem.. 255: 2073 (1980)] ou outras enzimas gli- colíticas [Hess et al., J. Adv. Enzvme Req.. 7: 149 (1968); Holland, Bioche- mistrv, 17: 4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldehyde-3-fosfato deidro- genase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6- 30 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glucoquinase.
Outros promotores de levedura, os quais são promotores indutí- veis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool deudrogenase 2, isoci- tocromo C, fosfatase ácida, degradativa enzimas s associadas com o meta- bolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase, 5 e enzimas responsáveis por utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são adicional- mente descritos na patente européia No. EP 73.657.
A transcrição de IL-17A/F a partir de vetores em células hospe- deiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a 10 partir dos genomas de vírus tais como polioma vírus, vírus da varíola aviária (fowlpox virus) (patente do Reino Unido No. UK 2.211.504 publicada em 5 de julho de 1989), adenovírus (tais como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Simian Vírus 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, 15 por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e a partir de promotores de choque térmico, contanto que os promotores referi- dos sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.
A transcrição de um DNA codificando o IL-17A/F por eucariotas superiores pode ser aumentada inserindo uma seqüência reforçadora no vetor. Reforçadores são elementos de DNA de ação cis, geralmente a partir de cerca de 10 a 300 bp, que agem sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências de reforçador são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, e insu- lina). Tipicamente, no entanto, se usará um reforçador de um vírus celular eucariótico. Exemplos incluem o reforçador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o reforçador de promotor precoce de citomega- lovírus, o reforçador de polioma sobre o lado tardio da origem de replicação, e reforçadores de adenovírus. O reforçador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' à seqüência codificante de IL-17A/F, mas preferencialmente está localizado em um sítio 5' do promotor.
Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióti- cas (células de leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüên- cias necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o mRNA. As seqüências referidas comumente estão disponíveis nas regiões não- traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais.
5 Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmen- tos poliadenilados na porção não-traduzida do mRNA codificando IL-17A/F.
Ainda outros métodos, vetores, e células hospedeiras adequa- dos para adaptação à síntese de IL-17A/F em cultura celular de vertebrados recombinantes são descrito em Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); na patente européia No. EP 117.060; e na patente européia No. EP 117.058.
4. Detecção de Amplificação/Expressão Genética
A amplificação e/ou expressão genética pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 5201-5205 [1980]), dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda etiquetada adequadamente, com base nas seqüências proporcionadas aqui, . Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podem reconhecer duplexes específicos, inclu- indo duplexes de DNA, duplexes de RNA, e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser rotula- dos e o teste pode ser realizado onde o duplex é ligado a uma superfície, de modo que na formação de duplex sobre a superfície, pode ser detectada a presença de anticorpo ligado ao duplex.
A expressão genética, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imunohistoquímica de células ou seções de tecidos e ensaio de cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto genético. Anticorpos úteis 30 para coloração imunohistoquímica e/ou ensaio de fluidos da amostra podem ser ou monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo IL-17A/F de seqüência nativa ou contra um peptídeo sintéti- co baseado nas seqüências de DNA proporcionadas aqui, ou contra se- qüência exógena fundida a DNA de IL-17A/F e codificando um epitopo de anticorpo específico.
5 5. Purificação de Polipeptídeo
Formas de IL-17A/F podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou a partir de Iisados de células hospedeiras. Caso ligadas a mem- brana, podem ser liberadas da membrana usando uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. Células 10 empregadas na expressão de IL-17A/F podem ser rompidas por vários mei- os físicos ou químicos, tais como ciclagem congelamento-descongelamento, sonicação, disrupção mecânica, ou agentes de Iise celular.
Pode ser desejado purificar IL-17A/F a partir proteínas de células recombinantes ou polipeptídeos. Os procedimentos seguintes são exempla- res de procedimentos de purificação adequados: por fracionamento sobre uma coluna de permuta iônica; precipitação de etanol; HPLC de fase rever- sa; cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de permuta de cátions tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação de sulfato de amônio; filtração por gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metal para ligar formas etiquetadas com epitopo do IL-17A/F. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e os mé- todos referidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymoloqy. 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A uma ou mais etapas de purificação selecionadas dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e do IL-17A/F em particular produzido.
E. Usos para IL-17A/F Seqüências de nucleotídeos (ou seu complemento) codificando IL-17A/F têm várias aplicações na técnica de biologia molecular, incluindo usos como sondas de hibridização, em cromossoma e mapeamento genéti- co e na geração de RNA e DNA antissenso. Ácido nucleico IL-17A/F também será útil para a preparação de polipeptídeos IL-17A/F pelas técnicas recom- binantes descritas aqui, .
O gene IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total, ou por- ções da mesma, pode ser usado como sondas de hibridização para uma biblioteca de cDNA para isolar o cDNA de IL-17A/F de extensão total ou para isolar ainda outros cDNAs (por exemplo, aqueles codificando variantes que ocorrem naturalmente de IL-17A/F ou IL-17A/F de outras espécies) os quais têm uma identidade de seqüência desejada para a seqüência de IL-17A/F nativa descrita aqui, . Opcionalmente, a extensão das sondas terá cerca de 20 a cerca de 50 bases. As sondas de hibridização podem ser derivadas de no mínimo regiões parcialmente novas da seqüência de nucleotídeo nativa de extensão total em que as regiões podem ser determinadas sem indevida experimentação ou a partir de seqüências genômicas incluindo promotores, elementos reforçadores e íntrons de seqüência nativa IL-17A/F. A título de exemplo, um método de triagem compreenderá isolar a região codificante do gene de IL-17A/F usando a seqüência de DNA conhecida para sintetizar uma sonda selecionada de cerca de 40 bases. Sondas de hibridização po- dem ser etiquetadas por uma variedade de etiquetas, incluindo radionucleo- tídeos tais como 32P ou 35S, ou etiquetas enzimáticos tais como fosfatase alcalina acoplada à sonda através de sistemas de ligação de avidina/biotina. Sondas etiquetadas tendo uma seqüência complementar à do gene IL-17A/F da presente invenção podem ser usadas para triar bibliotecas de cDNA hu- mano, DNA genômico ou mRNA para determinar a quais membros de tais bibliotecas a sonda hibridiza. Técnicas de hibridização são descritas em de- talhes adicionais nos Exemplos abaixo.
Quaisquer seqüências EST descritas no presente requerimento podem ser empregadas de modo similar como sondas, usando os métodos descritos aqui, .
Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos IL-17A/F incluem oligonucleotídeos antissenso ou de senso compreendendo uma seqüência de ácido nucleico de fita único (quer RNA ou DNA) capaz de ligar a seqüên- cias alvo de mRNA de IL-17A/F (senso) ou DNA IL-17A/F (antissenso). Oli- gonucleotídeos antissenso ou de senso, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento da região codificante de DNA de IL-17A/F. Tal fragmento geralmente compreende no mínimo cerca de 14 nucleotídeos, preferencialmente a partir de cerca de 14 a 30 nucleotídeos. A capacidade 5 para derivar um oligonucleotídeo antissenso ou um de senso, com base em uma seqüência de cDNA codificando uma dada proteína é descrita em, por exemplo, Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659, [1988]) e van der Krol et al. (BioTechniques, 6: 958, [1988]).
A ligação de oligonucleotídeos antissenso ou de senso a se- quências de ácido nucleico alvo resulta na formação de duplexes que blo- queiam a transcrição ou translação da seqüência alvo por um de vários méi- os, incluindo degradação reforçada dos duplexes, terminação prematura de transcrição ou translação, ou por outros meios. Os oligonucleotídeos antis- senso portanto podem ser usados para bloquear a expressão de proteínas IL-17A/F. Oligonucleotídeos antissenso ou de senso compreendem adicio- nalmente oligonucleotídeos tendo espinhas dorsais de açúcar-fosfodiéster modificadas (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritas na patente internacional No. WO 91/06629) e em que as ligações de açúcar referidas são resistentes a nucleases endógenas. Os oligonucleotídeos referidos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (isto é, capazes de resis- tir à degradação enzimática) mas retêm especificidade de seqüência para serem capazes de ligar a seqüências de nucleotídeo-alvo.
Outros exemplos de oligonucleotídeos de senso ou antissenso incluem os oligonucleotídeos os quais são encadeados de modo covalente a 25 porções orgânicas, tais como as descritas na patente internacional No. WO 90/10048, e outras porções que aumentam a afinidade do oligonucleotídeo para uma seqüência de ácido nucleico alvo, tal como poli-(L-lisina). Ainda adicionalmente, agentes intercalantes, tais como elipticina, e agentes alqui- Iantes ou complexos de metais podem ser fixados a oligonucleotídeos de 30 senso ou antissenso para modificar as especificidades de ligação do oligo- nucleotídeo antissenso ou de senso para a seqüência de nucleotídeo-alvo.
Oligonucleotídeos antissenso ou de senso podem ser introduzi- dos em uma célula contendo a seqüência de ácido nucleico alvo por qual- quer método de transferência genética, incluindo, por exemplo, transfecção de DNA mediada por CaPO4-, eletroporação, ou usando vetores de transfe- rência genética tais como o vírus Epstein-Barr. Em um procedimento prefe- 5 rencial, um oligonucleotídeo antissenso ou de senso é inserido em um vetor retroviral adequado. Uma célula contendo a seqüência de ácido nucleico alvo é contactada com o vetor retroviral recombinante, quer in vivo ou ex vivo. Vetores retrovirais adequados incluem, mas não estão limitados a, os derivados do retrovírus murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M- 10 MuLV), ou os vetores designados de dupla cópia DCT5A, DCT5B e DCT5C (vide a patente internacional No. WO 90/13641).
Oligonucleotídeos de senso ou antissenso também podem ser introduzidos em uma célula contendo a seqüência de nucleotídeo-alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação de ligante, con- 15 forme descrito na patente internacional No. WO 91/04753. Moléculas de li- gação de ligante adequadas incluem, mas não estão limitadas a, receptores da superfície celular, fatores de crescimento, outras citocinas, ou outros Ii- gantes que ligam a receptores da superfície celular. Preferencialmente, con- jugação da molécula de ligação de ligante não interfere substancialmente 20 com a capacidade da molécula de ligação de ligante para ligar a sua molécu- la correspondente ou receptor, ou bloquear a entrada do oligonucleotídeo de senso ou antissenso ou de sua versão conjugada na célula.
Alternativamente, um oligonucleotídeo de senso ou um antissen- so pode ser introduzido em uma célula contendo a seqüência de ácido nu- 25 cleico alvo por formação de um complexo de oligonucleotídeo-lipídeo, con- forme descrito na patente internacional No. WO 90/10448. O complexo de oligonucleotídeo de senso ou antissenso-lipídeo é preferencialmente disso- ciado dentro da célula uma Iipase endógena.
Moléculas de RNA ou DNA antissenso ou de senso têm geral- mente no mínimo cerca de 5 bases de extensão, cerca de 10 bases de ex- tensão, cerca de 15 bases de extensão, cerca de 20 bases de extensão, cerca de 25 bases de extensão, cerca de 30 bases de extensão, cerca de 35 bases de extensão, cerca de 40 bases de extensão, cerca de 45 bases de extensão, cerca de 50 bases de extensão, cerca de 55 bases de extensão, cerca de 60 bases de extensão, cerca de 65 bases de extensão, cerca de 70 bases de extensão, cerca de 75 bases de extensão, cerca de 80 bases de 5 extensão, cerca de 85 bases de extensão, cerca de 90 bases de extensão, cerca de 95 bases de extensão, cerca de 100 bases de extensão, ou mais.
As sondas também podem ser empregadas em técnicas de PCR para gerar um grupo de seqüências para identificação de seqüências codifi- cantes de IL-17A/F intimamente relacionadas.
Seqüências de nucleotídeos codificando um IL-17A/F também
podem ser usadas para construir sondas de hibridização para mapear o ge- ne o qual codifica que IL-17A/F e para a análise genética de indivíduos com distúrbios genéticos. As seqüências de nucleotídeo proporcionadas aqui, podem ser mapeadas para um cromossomea e regiões específicas de um 15 cromossoma usando técnicas conhecidas, tais como hibridização in situ, a- nálise de ligação contra marcadores cromossômicos conhecidos, e triagem de hibridização com bibliotecas.
Quando as seqüências codificantes para IL-17A/F codificam uma proteína a qual liga a outra proteína (exemplo, onde a proteína é um recep- tor), a proteína pode ser usada em ensaios para identificar as outras proteí- nas ou moléculas envolvidas na interação de ligação. Por similares métodos, podem ser identificados inibidores da interação entre receptor/ligação de ligante. Proteínas envolvias em similares interações de ligação também po- dem ser usadas para triar para inibidores de molécula pequena ou peptídeo ou agonistas da interação de ligação. Além disso, a proteína receptora pode ser usada para isolar um ou mais Iigantes correlativos. Ensaios de triagem podem ser designadas para descobrir compostos de orientação que simulam a atividade biológica de um IL-17A/F nativo ou um receptor para IL-17A/F. Os ensaios de triagem referidas incluirão ensaios receptivas a triagem de alta produtividade de bibliotecas químicas, tornanda as mesmas particular- mente adequadas para identificar candidatos de fármacos de molécula pe- quena. Moléculas pequenas contempladsa incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos. Os ensaios podem ser realizadsa em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímica, imunoénsaios e ensaios celulares, as quais são caracte- rizadsa de modo geral na técnica.
5 Ácidos nucleicos os quais codificam IL-17A/F ou são formas mo-
dificadas também podem ser usados para gerar ou animais transgênicos ou animais de "nocaute" os quais, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e na triagem de reagentes terapeuticamente úteis. Um animal transgênico (por exemplo, um camundongo ou rato) é um animal tendo células que contêm 10 um transgene, cujo transgene foi introduzido no animal ou um ancestre do animal em um estágio pré-natal, por exemplo, um estágio embrionário. Um transgene é um DNA o qual é integrado no genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve um animal transgênico. Em uma modalidade, cDNA codi- ficando IL-17A/F pode ser usado para clonar DNA genômico codificando IL- 15 17A/F de acordo com técnicas estabelecidas e as seqüências genômicas usadas para gerar animais transgênicos que contêm células as quais ex- pressam DNA codificando IL-17A/F. Métodos para gerar animais transgêni- cos, particularmente animais tais como camundongos ou ratos, se tornaram convencionais na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes dos 20 Estados Unidos Nos. 4.736.866 e 4.870.009. Tipicamente, células particula- res seriam dirigidas para incorporação de transgene IL-17A/F com reforçado- res teciduais-específicos. Animais transgênicos que incluem uma cópia de um transgene codificando IL-17A/F introduzido na linhagem germinativa do animal em um estágio embrionário podem ser usados para examinar o efeito 25 da aumento da expressão de DNA codificando IL-17A/F. Os animais referi- dos podem ser usados como animais de teste para reagentes que se imagi- na que confiram proteção contra, por exemplo, condições patológicas asso- ciadsa com sua superexpressão. De acordo com esta faceta da invenção, um animal é tratado com o reagente e uma incidência reduzida da condição 30 patológica, comparado com animais não-tratados portando o transgene, in- dicaria uma intervenção terapêutica potencial para a condição patológica.
Alternativamente, homólogos não-humanos de IL-17A/F podem ser usados para construir um animal de "nocaute" IL-17A/F o qual tem um gene defeituoso ou alterado codificando IL-17A/F como um resultado de re- combinação homóloga entre o gene endógeno codificando IL-17A/F e DNA genômico alterado codificando IL-17A/F introduzido em uma célula-tronco 5 embrionária do animal. Por exemplo, cDNA codificando IL-17A/F pode ser usado para clonar DNA genômico codificando IL-17A/F de acordo com técni- cas estabelecidas. Uma porção do DNA genômico codificando IL-17A/F po- de ser eliminada ou substituída com outro gene, tal como um gene codifi- cando um marcador selecionável o qual pode ser usado para monitorar inte- 10 gração. Tipicamente, vários quilobases de DNA flanqueante inalterado (tanto nas extremidades 5' quanto 3') estão incluídos no vetor [vide, por exemplo, Thomas and Capecchi, Cell. 51; 503 (1987) para uma descrição de vetores de recombinação homóloga]. O vetor é introduzido em uma linhagem de cé- lulas-tronco embrinárias (por exemplo, por eletroporação) e são seleciona- 15 das células nas quais o DNA introduzido foi recombinado homologamente com o DNA endógeno [vide, por exemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]. As células selecionadas são então injetadas em um blastocisto de um animal (por exemplo, um camundongo ou rato) para formar quimeras de agregação [vide, por exemplo, Bradley, em Teratocarcinomas and Embryonie Stem Cel- 20 Is: A Praetieal Approaeh, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113- 152], Um embrião quimérico pode ser então implantado em um animal adoti- vo fêmea pseudoprenhe adequado e o embrião foi trazido a termo para criar um animal de "nocaute". A progênie portanto o DNA homologamente recom- binado em suas células germinativas pode ser identificada por técnicas de 25 rotina e usada para produzir animais nos quais todas as células do animal contêm o DNA homologamente recombinado. Animais de nocaute podem ser caracterizados por exemplo, por sua capacidade para defender contra algumas condições patológicas e por seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência o polipeptídeo IL-17A/F.
Ácido nucleico codificando os polipeptídeos IL-17A/F também
podem ser usados em terapia genética. Em aplicações de terapia genética, genes são introduzidos nas células de modo a obter síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo para substituição de um gene defeituoso. "Terapia genética" inclui tanto terapia genética conven- cional onde um efeito duradouro é obtido por um único tratamento, e a admi- nistração de agentes terapêuticos genéticos, a qual envolve a administração 5 em uma vez ou repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente eficaz. RNAs e DNAs antissenso podem ser usados como agentes terapêuticos pa- ra bloquear a expressão de alguns genes in vivo. Já foi demonstrado que oligonucleotídeos antissenso curtos podem ser importados em células onde agem como inibidores, apesar de suas baixas concentrações intracelulares 10 causadas por sua captação restrita pela membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 4143-4146 [1986]). Os oligonucleotídeos po- dem ser modificados para reforçar sua captação, por exemplo, substituindo seus grupos fosfodiéster negativamente carregados por grupos não carrega- dos.
Há uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos
nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas invenção, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de áci- do nucleico em células de mamíferos invenção incluem o uso de lipossomas, 20 eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, e etc. As técnicas de transferência genética in vivo atualmente preferenciais incluem transfecção com vetores virais (tipi- camente retrovirais) e transfecção mediada por lipossoma-proteína da capa viral (Dzau et al., Trends in Biotechnoloqy, 11: 205-210 [1993]). Em algumas 25 situações é desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que orienta as células-alvo, tal como um anticorpo específico para uma pro- teína da membrana da superfície celular ou a célula-alvo, um ligante para um receptor sobre a célula-alvo, e etc. Onde são empregados lipossomas, proteínas as quais ligam a uma proteína da membrana da superfície celular 30 associada com endocitose podem ser usadas para orientar e/ou para facilitar captação, por exemplo, proteínas do capsídeo ou fragmentos das mesmas trópicos para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas as quais sofrem internalização em ciclagem, proteínas que orientam a localização intracelular e reforçam a meia-vida intracelular. A técnica de endocitose me- diada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem.. 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 5 3410-3414 (1990). Para revisão de protocolos de marcação genética e tera- pia genética vide Anderson etal., Science. 256: 808-813 (1992).
Os polipeptídeos IL-17A/F descritos aqui, também podem ser empregados como marcadores de peso molecular para fins de eletroforese de proteína e as seqüências de ácido nucleico isoladas podem ser usadas para expressando de modo recombinante estas fitas marcadores.
As moléculas de ácido nucleico codificando os polipeptídeos IL- 17A/F ou fragmentos dos mesmos descritos aqui, são úteis para identifica- ção de cromossomas. A este respeito, existe uma necessidade contínua de identificar novos marcadores cromossômicos, uma vez que relativamente 15 poucos reagentes marcadores cromossômicos, baseados em dados de se- qüências reais estão disponíveis presentemente. Cada molécula de ácido nucleico IL-17A/F da presente invenção pode ser usada como um marcador cromossômico.
Os polipeptídeos IL-17A/F e moléculas de ácido nucleico da pre- 20 sente invenção também podem ser usados para diagnóstico para tipagem tecidual, em que os polipeptídeos IL-17A/F da presente invenção podem ser expressados diferencialmente em um tecido comparado com outro, prefe- rencialmente em um tecido doente comparado com um tecido normal do mesmo tipo de tecido. Moléculas de ácido nucleico IL-17A/F encontrarão uso 25 para gerar sondas para PCR, análise Northern, análise Southern e análise Western.
Os polipeptídeos IL-17A/F descrito aqui, também podem ser empregados como agentes terapêuticos. Os polipeptídeos IL-17A/F da pre- sente invenção podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos 30 para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que o produto IL- 17A/F destas fitas é combinado em mistura com um veículo farmaceutica- mente aceitável. Formulações terapêuticas são preparadas para armazena- mento misturando o ingrediente ativo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Reminqton1S Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, exci- pientes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para receptores nas do- sagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos tais como glicina, glu- tamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelan- tes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra- íons formadores de sais tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou PEG.
As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de mem- branas de filtração estéreis, antes de ou depois de liofilização e reconstitui- ção.
Composições terapêuticas aqui, geralmente são colocadas em
um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
A via de administração está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, injeção ou infusão por vias intravenosa, intraperitoneal, intrace- rebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial ou intralesional, administração tópica, ou pós sistemas de liberação sustentada.
Dosagens e concentrações de fármaco desejadas das composi- ções farmacêuticas da presente invenção podem variar dependendo do uso particular previsto. A determinação da dosagem ou via de administração a- propriada está bem dentro do conhecimento de um médico regular. Experi- mentos com animais proporcionam orientação confiável para a determinação de doses eficazes para terapia humano. O escalamento interespécies de doses eficazes pode ser realizado seguindo os princípios determinados por Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokine- tics" Em Toxicokinetics and New Druq Development, Yacobi et al., Eds., 5 Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.
Quando a administração in vivo de um polipeptídeo IL-17A/F ou agonista ou antagonista do mesmo é empregada, as quantidades de dosa- gem normal podem variar a partir de cerca de 10 ng/kg até 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 10 Mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Orientação quanto a dosagens e métodos de liberação em particular é proporcionada na literatura; vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.657.760; 5.206.344; ou 5.225.212. É previsto que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúr- 15 bios, que administração tendo por alvo um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de liberação em uma maneira diferente da de outro órgão ou tecido.
Onde se deseja administração de liberação sustentada de um polipeptídeo IL-17A/F em uma formulação com características de liberação adequadas para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio requerendo administração do polipeptídeo IL-17A/F, é contemplada microencapsulação do polipeptídeo IL-17A/F. Microencapsulação de proteínas recombinantes para liberação sustentada tem sido realizada com sucesso com hormônio de crescimento humano (rhGH), interferon- (rhIFN- ), interleucina-2, e MN rgp120. Johnson et at., Nat. Med2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technoloqy, 8: 755-758 (1990); Cle- land, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Poly- Iactide Polyglycolide Microsphere Systems," em Vaccine Design: The Sub- unit and Adiuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, patente internacional No. WO 96/40072, patente internacional No. WO 96/07399; e Patente dos Estados Unidos No. 5.654.010. As formulações de liberação sustentada destas proteínas foram desenvolvidas usando polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) devi- do a sua biocompatibilidade e ampla faixa de propriedades biodegradáveis. Os produtos da degradação de PLGA, ácidos lácticos e glicólicos, podem ser 5 clareados rapidamente dentro do corpo humano. Além disso, a degradabili- dade deste polímero pode ser ajustada a partir de meses até anos depen- dendo de seu peso molecular e composição. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," em: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodeqradable Polvmers as Druq Deliverv Systems (Mareei 10 Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.
Esta invenção engloba métodos de triagem de compostos para identificar aqueles que simulam o polipeptídeo IL-17A/F (agonistas) ou pre- vinem o efeito do polipeptídeo IL-17A/F (antagonistas). Ensaios de triagem para candidatos de fármacos antagonistas são designadas para identificar 15 compostos que ligam ou formam complexo com os polipeptídeos IL-17A/F codificados pelos genes identificados aqui, ou interferem de modo diverso com a interação dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celula- res. Os ensaios de triagem referidas incluirão ensaios receptivas a triagem de alta produtividade de de bibliotecas químicas, tornando-as particularmen- 20 te adequadas para identificar candidatos de fármacos de molécula pequena.
Os ensaios podem ser realizadas em uma variedade de forma- tos, incluindo ensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímica, imunoensaios, e ensaios celulares, as quais estão bem caracte- rizadas na técnica.
Todas os ensaios para antagonistas são comuns em que reque-
rem contactar o candidato a fármaco com um polipeptídeo IL-17A/F codifica- do por um ácido nucleico identificado aqui, sob condições e por um tempo suficiente para permitir que estas fitas dois componentes interagem.
Em ensaios de ligação, a interação está ligando e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura da reação. Em uma mo- dalidade particular, o polipeptídeo IL-17A/F codificado pelo gene identificado aqui, ou o fármaco candidato é imobilizado sobre uma fase sólida, por e- xemplo, sobre uma lâmina de microtítulo, por fixações covalentes ou não- covalentes. Fixação não-covalente geralmente é realizada por revestimento da superfície sólida com uma solução do polipeptídeo IL-17A/F e secagem. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo mo- 5 noclonal, específico para o polipeptídeo IL-17A/F a ser imobilizado pode ser usado para ancorar este a uma superfície sólida. O ensaio é realizado adi- cionando o componente não-imobilizado, o qual pode ser rotulado por um rótulo detectável, ao componente imobilizado, por exemplo, a superfície re- vestida contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, 10 os componentes não-reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e complexos ancorados sobre a superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não-imobilizado carrega um rótulo detectável, a detecção de etiqueta imobilizada sobre a superfície indica que ocorreu for- mação de complexo. Onde o componente originalmente não-imobilizado não 15 carrega um rótulo, pode ser detectada formação de complexo, por exemplo, usando um anticorpo rotulado ligando especificamente o complexo imobili- zado.
Se o composto candidato interage com mas não liga a um poli- peptídeo IL-17A/F particular codificado por um gene identificado aqui, sua interação com este polipeptídeo pode ser testada por métodos de conheci- mento geral para detectar interações de proteína-proteína. Os ensaios refe- ridos incluem abordagens tradicionais, tais como, por exemplo, reticulação, co-imunoprecipitação, e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, interações de proteína-proteína podem ser monitoradas usando um sistema genético à base de levedura descrito por Fields e colaboradores (Fields and Song, Nature (London). 340: 245-246 [1989]); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA1 88: 9578-9582 [1991]) con- forme descrito por Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA1 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores transcricionais, tais como GAL4 de Ie- vedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente distintos, um agindo como o domínio de ligação de DNA, o outro funcionando como o do- mínio de ativação de transcrição. O sistema de expressão de levedura des- crito nas publicações precedentes (geralmente referido como o " sistema de dois híbridos") tira proveito desta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma na qual a proteína-alvo é fundida ao domínio de ligação de DNA de GAL4, e outra, na qual proteínas de ativação candidatas são fundi- 5 das ao domínio de ativação. A expressão de um gene repórter GAL1-/acZ sob controle de um promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 através de interação proteína-proteína. Colônias conten- do polipeptídeos de interação são detectadas com um substrato cromogêni- co para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER™) para identificar 10 interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando a téc- nica de dois-híbridos está disponível comercialmente na Clontech. Este sis- tema também pode ser estendido para mapear domínios de proteínas envol- vidos em interações de proteínas específicas bem como para localizar com precisão resíduos aminoácidos que são cruciais para estas interações.
Compostos que interferem com a interação de um gene codifi-
cando um polipeptídeo IL-17A/F identificado aqui, e outros componentes in- tra- ou extracelulares podem ser testados como se segue: geralmente uma mistura da reação é preparada contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob condições e por um tempo permitindo a interação e 20 ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto candi- dato para inibir ligação, a reação é realizada na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, um placebo pode ser adicionado a uma ter- ceira mistura da reação, para servir como controle positivo. A ligação (for- mação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou 25 extracelular presente na mistura é monitorada conforme descrito aqui, acima. A formação de um complexo na uma ou mais reações de controle mas não na mistura da reação contendo o composto de teste indica que o composto de teste interfere com a interação do composto de teste e seu parceiro de reação.
Para testar para antagonistas, o polipeptídeo IL-17A/F pode ser
adicionado a uma célula junto com a composto a ser triado para uma ativi- dade particular e a capacidade do composto para inibir a atividade de inte- resse na presença do polipeptídeo IL-17A/F indica que o composto é um antagonista para o polipeptídeo IL-17A/F. Alternativamente, antagonistas podem ser detectados combinando o polipeptídeo IL-17A/F e um antagonista potencial com receptores de polipeptídeos IL-17A/F ligados a membrana ou receptores recombinantes sob condições apropriadas para um ensaio de inibição competitiva. O polipeptídeo IL-17A/F pode ser rotulado, tal como por radioatividade, de tal modo que o número de moléculas de polipeptídeo IL- 17A/F ligadas ao receptor pode ser usado para determinar a eficácia do an- tagonista potencial. O gene codificando o receptor pode ser identificado por numerosos métodos de conhecimento daqueles versados na técnica, por exemplo, peneiração de Iigante de Iigante e classificação FACS. Coligan et ai, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Preferencialmente, é empregada clonagem de expressão em que RNA poliadenilado é prepara- do a partir de uma célula responsiva ao polipeptídeo IL-17A/F e uma biblio- teca de cDNA criada a partir deste RNA é dividida em grupos (poo/s) e usa- da para transfectar células COS ou outras células que não são responsivas ao polipeptídeo IL-17A/F. Células transfectadas que são cultivadas sobre lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo IL-17A/F rotulado. O polipeptí- deo IL-17A/F pode ser rotulado por uma variedade de meios incluindo iodi- nação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteína quinase sítio-específica. Depois de fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise autorradiográfica. Grupos positivos são identificados e sub-grupos são preparados e re-transfectados usando um sub-pooling interativo e pro- cesso de retriagem, eventualmente produzindo um único clone que codifica o receptor putativo.
Como uma abordagem alternativa para identificação de receptor, polipeptídeo IL-17A/F rotulado pode ser encadeado por fotoafinidade com membrana celular ou preparações de extrato que expressam a molécula re- ceptora. Material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a filme de radio- 30 grafia. O complexo rotulado contendo o receptor pode ser excisado, resolvi- do em fragmentos de peptídeo, e submetido a microssequenciamento de proteína. A seqüência de aminoácidos obtida a partir de microssequencia- mento seria usada para designar uma série de sondas de oligonucleotídeos degenerados para triar uma biblioteca de cDNA para identificar o gene codi- ficando o receptor putativo.
Em outra ensaio para antagonistas, células de mamíferos ou 5 uma preparação de membrana expressando o receptor seria incubada com polipeptídeo IL-17A/F rotulado na presença do composto candidato. A capa- cidade do composto para reforçar ou bloquear esta interação poderia então ser medida.
Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluem 10 um oligonucleotídeo que liga às fusões de imunoglobulina com polipeptídeo IL-17A/F, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotípicos, e quiméricas ou versões humanizadas de simila- res anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos 15 de anticorpos. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma pro- teína intimamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipep- tídeo IL-17A/F que reconhece o receptor mas não confere nenhum efeito, deste modo inibindo competitivamente a ação do polipeptídeo IL-17A/F.
Outro antagonista de polipeptídeo IL-17A/F potencial é um cons- tructo de RNA ou DNA antissenso preparado usando tecnologia antissenso, onde, por exemplo, uma molécula de RNA ou DNA antissenso age bloque- ando diretamente a translação de mRNA por hibridização ao mRNA alvo e prevenindo translação de proteína. Tecnologia antissenso pode ser usada para controlar a expressão genética através de formação de tripla-hélice ou DNA ou RNA antissenso, cujos ambos os métodos se baseiam na ligação de um polinucleotídeo a DNA ou RNA. Por exemplo, a porção codificante 5' da seqüência de polinucleotídeos, a qual codifica os polipeptídeos IL-17A/F maduros aqui, é usada para designar um oligonucleotídeo RNA antissenso de a partir de cerca de 10 a 40 pares de base de extensão. Um oligonucleo- tídeo de DNA é designado para ser complementar a uma região do gene envolvido em transcrição (tripla hélice - vide Lee et al., Nucl. Acids Res.. 6: 3073 (1979); Cooney et ai, Science, 241: 456 (1988); Dervan et ai, Science, 251: 1360 (1991)), deste modo prevenindo transcrição e a produção do poli- peptídeo IL-17A/F. O oligonucleotídeo de RNA antissenso hibridiza ao mR- NA in vivo e bloqueia a translação da molécula de mRNA no polipeptídeo IL- 17A/F (antisense - Okano, Neurochem.. 56: 560 (1991); Oliqodeoxvnucleoti- 5 des as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton1 FL1 1988). Os oligonucleotídeos descritos acima também podem ser liberados a células de tal modo que o RNA ou DNA antissenso pode ser expressado in vivo para inibir a produção do polipeptídeo IL-17A/F. Quando se usa DNA antissenso, oligodesoxirribonucleotídeos derivados do sítio de iniciação de 10 translação, por exemplo, entre cerca de -10 e +10 posições da seqüência de nucleotídeo do gene alvo, são preferenciais.
Antagonistas potenciais incluem moléculas pequenas que ligam ao sítio ativo, o sítio de ligação de receptor, ou fator de crescimento ou outro sítio de ligação relevante do polipeptídeo IL-17A/F, deste modo bloqueando 15 a atividade biológica normal do polipeptídeo IL-17A/F. Exemplos de peque- nas moléculas incluem, mas não estão limitados a, pequenos peptídeos ou moléculas similares a peptídeos, preferencialmente peptídeo solúveis, e compostos orgânicos ou inorgânicos não-peptidil sintéticos.
Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes de cata- 20 Iisar a clivagem específica de RNA. Ribozimas agem por hibridização se- quência-específica ao RNA alvo complementar, seguido por clivagem endo- nucleolítica. Sítios de clivagem de ribozima específicos dentro de um RNA alvo potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para deta- lhes adicionais vide, por exemplo, Rossi, Current Bioloqy, 4: 469-471 (1994), 25 e a publicação de patente internacional PCT No. WO 97/33551 (publicada em 18 de setembro de 1997).
Moléculas de ácido nucleico em formação de tripla-hélice usada para inibir transcrição devem ser de fita único e compostas de desoxinucleo- tídeos. A composição de base destas fitas oligonucleotídeos é designada de 30 tal modo que promove a formação de tripla-hélice através de regras de pa- reamento de base de Hoogsteen, as quais geralmente requerem trechos bastante grandes de purinas ou pirimidinas sobre um fita de um duplex. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, a publicação de patente internacional PCT No. WO 97/33551, acima.
Estas pequenas moléculas podem ser identificadas por qualquer uma ou mais dos ensaios de triagem discutidas acima e/ou por quaisquer 5 outras técnicas de triagem de conhecimento geral para os versados na téc- nica.
Usos diagnósticos e terapêuticos das moléculas descritas aqui, também podem ser baseados nos hits de ensaio funcional positiva descritos e descritos abaixo.
F. Distribuição Tecidual
A localização de tecidos expressando o IL-17A/F pode ser identi- ficada determinando a expressão de mRNA em vários tecidos humanos. A localização de similares genes proporciona informação sobre cujos tecidos são mais prováveis de serem afetados pelas atividades de estimulação e de 15 inibição dos polipeptídeos IL-17A/F. A localização de um gene em um tecido específico também proporciona tecido da amostra para os ensaios de blo- queio de atividade discutidas abaixo.
Conforme mencionado acima, a expressão genética em vários tecidos pode ser medida por Southern blotting convencional, Northern blot- 20 ting para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77: 5201-5205 [1980]), dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando uma sonda adequadamente etiquetada, com base nas seqüên- cias proporcionadas aqui, . Alternativamente, podem ser empregados anti- corpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo duplexes de 25 DNA, duplexes de RNA, e duplexes de DNA-RNA híbridos ou duplexes de DNA-proteína.
A expressão genética em vários tecidos, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imunohistoquí- mica de seções de tecido e ensaio de cultura celular ou fluidos corporais, 30 para quantificar diretamente a expressão do produto genético. Anticorpos úteis para coloração imunohistoquímica e/ou ensaio de fluidos da amostra podem ser ou monoclonais ou policlonais, e pode ser preparados em quais- quer mamíferos. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra uma seqüência nativa de um polipeptídeo IL-17A/F ou contra um pep- tídeo sintéico baseado nas seqüências de DNA codificando o polipeptídeo IL-17A/F ou contra uma seqüência exógena fundida a um DNA codificando 5 um polipeptídeo IL-17A/F e codificando um epitopo de anticorpo específico. Técnicas gerais para gerar anticorpos, e protocolos especiais para Northern blotting e hibridização in situ são proporcionados abaixo.
G. Estudos de Ligação de Anticorpos A atividade dos polipeptídeos IL-17A/F pode ser adicionalmente
verificada por estudos de ligação de anticorpos, nos quais é testada a capa- cidade de anticorpos anti-IL-17A/F para inibir o efeito dos polipeptídeos IL- 17A/F, respectivamente, sobre células teciduais. Anticorpos exemplares in- cluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos, e heteroconjugados, cuja preparação será descrita abaixo aqui, .
Estudos de ligação de anticorpos podem ser realizados em
qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competi- tiva, ensaios de sanduíche direto e indireto, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Ensaios de ligação competitiva se baseiam na capacidade de
um padrão marcado para competir com o analisado (analyte) da amostra de teste para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de proteína-alvo na amostra de teste é inversamente proporcional à quanti- dade de padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determi-
nação da quantidade de padrão que se torna ligado, os anticorpos preferen- cialmente são insolubilizados antes ou depois da competição, de modo que o padrão e o analisado que são ligados aos anticorpos podem ser separados convenientemente entre o padrão e o analisado os quais permanecem não ligados.
Ensaios sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um
capaz de ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epitopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio sanduíche, o analisado da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo o qual é imobilizado sobre um suporte sólido, e depois disso um segundo anticorpo liga ao analisado, deste modo formando um complexo de três partes insolúvel. Vide, por exemplo, a Paten- te dos Estados Unidos No. 4.376.110. O segundo anticorpo pode ser o pró- 5 prio rotulado com uma porção detectável (ensaio sanduíche direto) ou pode ser medido usando um anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ensaio sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a porção detectável é uma enzima.
Para imunohistoquímica, a amostra de tecido pode ser fresca ou
congelada ou pode ser embutida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.
H. Ensaios Celulares
Ensaios celulares e modelos animais para doenças imunorrela- cionadas podem ser usados para entender adicionalmente a relação entre os genes e polipeptídeos identificados aqui, e o desenvolvimento e a pato- gênese da doença imunorrelacionada.
Em uma abordagem diferente, células de um tipo celular conhe- cido por estar envolvido em uma doença imunorrelacionada particular são transfectadas com os cDNAs descritos aqui, e é analisada a capacidade destas fitas cDNAs para estimular ou inibir a função imune. Células adequa- das podem ser transfectadas com o gene desejado, e monitoradas para ati- vidade de função imune. As linhagens celulares transfectadas referidas po- dem ser então usadas para testar a capacidade de anticorpos poli- ou mo- noclonais ou composições de anticorpos para inibir ou estimular a função imune, por exemplo para modular a proliferação de células T ou a infiltração de células inflamatórias. Células transfectadas com as seqüências codifican- tes dos genes identificados aqui, podem ser adicionalmente usadas para identificar fármacos candidatos para o tratamento de doenças imunorrelacio- nadas.
Além disso, culturas primárias derivadas de animais transgêni- cos (conforme descrito abaixo) podem ser usadas nos ensaios celulares aqui, embora sejam preferenciais linhagens celulares estáveis. Técnicas para de- rivar linhagens celulares contínuas de animais transgênicos são conhecidas de modo geral na técnica (vide, por exemplo, Small et ai, Mol. Cell. Biol.. 5: 642-648 [1985]).
5 Um ensaio celular adequado é a reação de linfócitos mistos
(MLR). Current Protocols in Immunoloqy. unit 3.12; editado por J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, Publicado pela John Wiley & Sons, Inc. Neste ensaio, é avaliada a capacidade de um composto de teste para estimular ou inibir a proliferação 10 de células T ativadas. Uma suspensão de células T respondedoras é culti- vada com células estimulatórias alogênicas e a proliferação de células T é medida por captação de timidina tritiada. Este ensaio é uma medida geral da reatividade de células T. Como a maioria de células T respondem a e produ- zem IL-2 na ativação, diferenças na responsividade neste teste em parte 15 refletem diferenças na produção de IL-2 pelas células respondendo. Os re- sultados da reação de linfócitos mistos podem ser verificados por um ensaio de detecção de Iinfocina de rotina (IL-2). Current Protocols in Immunoloqy. acima, 3.15, 6.3.
Uma reação de células T proliferativa em um ensaio de reação de linfócitos mistos pode ser devida a propriedades mitogênicas diretas de uma molécula testada ou a ativação induzida por antígeno externo. A verifi- cação adicional da atividade estimulatória de células T dos polipeptídeos IL- 17A/F pode ser obtida por um ensaio de coestimulação. A ativação de célu- las T requer um sinal antígeno específico mediado através do receptor de células T (TCR) e um sinal coestimulatório mediado através de uma segunda interação de ligação de ligante, por exemplo, a interação de ligação B7 (CD80, CD86)/CD28. A reticulação de CD28 aumenta a secreção de Iinfoci- nas por células T ativadas. A ativação de células T tem tanto controles nega- tivos quanto positivos através da ligação de Iigantes os quais têm um efeito negativo ou positivo. CD28 e CTLA-4 são glicoproteínas relacionadas na superfamília de Ig as quais ligam a B7. A ligação de CD28 a B7 tem um efei- to de coestimulação positiva de ativação de células T; ao invés, a ligação de CTLA-4 a B7 tem um efeito desativante de células T negativo. Chambers1 C. A. and Allison1 J. P.. Curr. Qpin. Immunol., (1997)_9: 396. Schwartz1 R. H., Cell (1992) 71_: 1065; Linsley1 P. S. and Ledbetter1 J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11: 191; June1 C. H. et ai., Immunol. Today (1994) 15: 321; Jenkins, 5 Μ. K., Immunitv (1994) 1: 405. Em um ensaio de coestimulação, os polipep- tídeos IL-17A/F são testados para atividade coestimulatória ou inibitória de células T.
Polipeptídeos IL-17A/F, bem como outros compostos da inven- ção, os quais são estimuladores (coestimuladores) da proliferação de células 10 Te agonistas, por exemplo, anticorpos agonistas, para esse fim conforme determinado por reação de linfócitos mistos e ensaios de coestimulação, por exemplo, são úteis no tratamento de doenças imunorrelacionadas caracteri- zadas por função imune pobre, subótima ou inadequada. Estas doenças são tratadas estimulando a proliferação e a ativação de células T (e imunidade 15 mediada por células T) e reforçando a reação imune em um mamífero atra- vés de administração de um composto estimulatório, tal como o polipeptí- deos IL-17A/F estimulante. O polipeptídeo estimulante pode ser, por exem- plo, um polipeptídeo IL-17A/F ou um anticorpo agonista do mesmo.
O uso direto de um composto estimulante como na invenção tem sido validado em experimentos com glicoproteína 4-1 BB, um membro da família de receptores de fator de necrose tumoral, os quais ligam a um Iigan- te (4-1BBL) expressado sobre células-T primed e ativação e crescimento de células T de sinais. Alderson, Μ. E. et a/., J. Immunol., 24: 2219 (1994).
O uso um composto estimulante de agonista também foi valida- 25 do experimentalmente. A ativação de 4-1BB por tratamento com um anticor- po anti-4-1BB agonista reforça a erradicação de tumores. Hellstrom1 I. and Hellstrom, K. E., Crit. Rev. Immunol.. 18: 1 (1998). Terapia imunoadjuvante para tratamento de tumores, descrita em mais detalhes abaixo, é outro e- xemplo do uso dos compostos estimulantes da invenção.
Um efeito imuno estimulante ou de reforço imune também pode
ser obtido antagonizando ou bloqueando a atividade de um IL-17A/F o qual se viu que ser inibidor no ensaio de reação de linfócitos mistos. A negação da atividade inibitório do composto produz um efeito estimulatório puro. Compostos antagonistas/de bloqueio adequados são anticorpos ou fragmen- tos dos mesmos os quais reconhecem e ligam à proteína inibitória, deste modo bloqueando a interação eficaz da proteína com seu receptor e inibindo 5 sinalização através do receptor. Este efeito foi validado em experimentos usando anticorpos anti-CTLA-4 os quais reforçam a proliferação de células T1 presumivelmente por remoção do sinal inibitório causado por ligação de C- TLA-4 . Walunas, T. L. et ai, Immunitv. V. 405 (1994).
Alternativamente, um efeito imuno estimulante ou de reforço i- 10 mune também pode ser obtido por administração de um polipeptídeo IL- 17A/F o qual tenha propriedades de reforço da permeabilidade vascular. Permeabilidade vacuolar reforçada seria benéfica para distúrbios os quais podem ser atenuados por infiltração local de células imunes (por exemplo, monócitos, eosinófilos, PMNs) e inflamação.
Por outro lado, polipeptídeos IL-17A/F, bem como outros com-
postos da invenção, os quais são inibidores diretos da proliferação/ativação de células T, secreção de linfocinas, e/ou permeabilidade vascular podem ser usados diretamente para suprimir a reação imune. Estas fitas compostos são úteis para reduzir o grau da reação imune e para tratar doenças imunor- 20 relacionadas caracterizadas por uma reação hiperativa, superótima, ou auto- imune. Este uso dos compostos da invenção foi validado pelos experimentos descritos acima nos quais CTLA-4 ligando ao receptor B7 desativa células T. Os compostos inibitórios diretos da invenção funcionam em uma maneira análoga. Se esperaria que o uso de compostos os quais suprimem a perme- 25 abilidade vascular reduzisse inflamação. Similares usos seriam benéficos para tratar condições associadas com inflamação excessiva.
Alternativamente, compostos, por exemplo, anticorpos, os quais ligam a polipeptídeos IL-17A/F estimulantes e bloqueiam o efeito estimulan- tes destas moléculas produzem um efeito inibitório puro e podem ser usados 30 para suprimir a reação imune mediada por células T inibindo a prolifera- ção/ativação de células T e/ou a secreção de linfocinas. O bloqueio do efeito estimulante dos polipeptídeos suprime a reação imune do mamífero. Este uso tem sido validado em experimentos usando um anticorpo anti-IL2. Nes- tas fitas experimentos, o anticorpo liga a IL2 e bloqueia a ligação de IL2 a seu receptor atingindo deste modo um efeito inibitório de células T.
I. Modelos Animais
5 Os resultados dos ensaios invenção celulares podem ser adicio-
nalmente verificados usando modelos animais in vivo e ensaios para função de células T. Uma variedade de modelos animais de conhecimento geral podem ser usados para entender adicionalmente o papel dos genes identifi- cados aqui, no desenvolvimento e na patogênese de doença imunorrelacio- nada, e para testar a eficácia de agentes terapêuticos candidatos, incluindo anticorpos, e outros antagonistas dos polipeptídeos nativos, incluindo anta- gonistas de molécula pequena. A natureza in vivo de similares modelos os torna preditivos de reações em pacientes humanos. Modelos animais de do- enças imunorrelacionadas incluem tanto animais não-recombinantes quanto recombinantes (transgênicos). Modelos animais não-recombinantes incluem, por exemplo, modelos de roedores, por exemplo, modelos murinos. Os mo- delos referidos podem ser gerados introduzindo células em camundongos singênicos usando técnicas de rotina, por exemplo, injeção subcutanêa, inje- ção na veia da cauda, implantação no baço, implantação intraperitoneal, im- plantação sob a cápsula renal, e etc.
Doença de enxerto-versus-hospedeiro ocorre quando células imunocompetentes são transplantadas em pacientes imunossuprimidos ou tolerantes. As células do doador reconhecem e respondem aos antígenos do hospedeiro. A reação pode variar de inflamação grave apresentando risco de 25 vida a casos brandos de diarréia e perda de peso. Modelos de doença de enxerto-versus-hospedeiro proporcionam um meio para avaliar a reatividade de células T contra antígenos MHC e antígenos de transplantes menores. Um procedimento adequado é descrito em detalhes em Current Protocols in Immunoloqy. acima, unit 4.3.
Um modelo animal para rejeição a aloenxerto de pele é um meio
de testar acapacidade de células T para mediar a destruição de tecido in vivo e uma medida de seu papel na rejeição de transplante. Os modelos mais comuns e aceitos usam enxertos de pele de cauda murina. Experimen- tos repetidos mostraram que a rejeição de aloenxerto de pele é mediada por células T1 células T auxiliares e células T assassinas-efetoras, e não anticor- pos. Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunoloqy, 2nd 5 ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 889-992 (1989). Um procedimento adequado é descrito em detalhes em Current Protocols in Immunoloqy. aci- ma, unit 4.4. Outros modelos de rejeição de transplante os quais podem ser usados para testar os compostos da invenção são os modelos de transplan- tes de coração alogênicos descritos por Tanabe, M. et ai, Transplantation. 10 58: 23 (1994) e Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., 4330-4338 (1994).
Modelos animais para hipersensibilidade do tipo retardado pro- porciona um ensaio da função imune mediada por células também. Reações de hipersensibilidade do tipo retardado são uma reação imune in vivo medi- ada por células T caracterizada por inflamação a qual não atinge um pico até 15 depois de um período de tempo ter decorrido depois do estímulo com um antígeno. Estas reações também ocorrem em doenças autoimunes tecido específicas tais como esclerose múltipla (MS) e encefalomielite autoimune experimental (EAE, um modelo para esclerose múltipla). Um procedimento adequado é descrito em detalhes em Current Protocols in Immunoloqy, aci- 20 ma, unit 4.5.
Encefalomielite autoimune experimental é uma doença autoimu- ne mediada por células T caracterizada por inflamação por células T e célu- las mononucleares e subsequente desmielinação de axônios no sistema nervoso central. A encefalomielite autoimune experimental é geralmente 25 considerada como sendo um modelo animal relevante para esclerose múlti- pla em seres humanos. Bolton, C., Multiple Sclerosis, V. 143 (1995). Foram desenvolvidos tanto modelos agudos quanto recidivantes-remitentes. Os compostos da invenção podem ser testados para atividade estimulatória ou inibitória de células T contra doença desmielinante imuno mediada usando o 30 protocolo descrito em Current Protocols in Immunoloqy. acima, units 15.1 e 15.2. Vide também os modelos para doença de mielina na qual oligodendró- citos ou células de Schwann são enxertados no sistema nervoso central con- forme descrito em Duncan, I. D. et ai, Molec. Med. Today, 554-561 (1997).
Hipersensibilidade de contato é um ensaio in vivo de hipersensi- bilidade do tipo retardado simples da função imune mediada por células. Neste procedimento, a exposição cutânea a haptenos exógenos a qual dá 5 origem a uma reação de hipersensibilidade do tipo retardado a qual é medi- da e quantificada. Sensibilidade de contato envolve uma fase de sensibiliza- ção inicial seguida por uma fase de elicitação. A fase de elicitação ocorre quando os linfócitos T encontram um antígeno com o qual tiveram contato anterior. Ocorre tumefação e inflamação, tornando este um excelente mode- 10 Io de dermatite de contato alérgica humana. Um procedimento adequado é descrito em detalhes em Current Protocols in Immunoloqy, Eds. J. E. Colo- gan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., unit 4.2 (1994). I also Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun. Today, 19(1): 37-44 (1998).
Um modelo animal para artrite é artrite induzida por colágeno.
Este modelo partilha características clínicas, histológicas e imunológicas de artrite reumatoide autoimune humana e é um modelo aceitável para artrite autoimune humana. Modelos de camundongo e rato são caracterizados por sinovite, erosão de cartilagem e osso subcondral. Os compostos da inven- 20 ção podem ser testados para atividade contra artrite autoimune usando os protocolos descritos em Current Protocols in Immunoloqy, acima, units 15.5. Vide também o modelo usando um anticorpo monoclonal para integrinas CD18 e VLA-4 descrito em Issekutz, A.C. et ai, Immunoloqy, 88: 569 (1996).
Foi descrito um modelo de asma no qual hiperreatividade das 25 vias aéreas induzida por antígeno, eosinofilia pulmonary e inflamação são induzidas sensibilizando um animal com ovalbumina e em seguida estimu- lando o animal com a mesma proteína liberada por aerosol. Vários modelos animais (porco-da-índia, rato, primata não-humano) apresentam sintomas similares a asma atópica em seres humanos no estímulo com antígenos em 30 aerosol. Modelos murinos têm muitas das características da asma humana. Procedimentos adequados para testar os compostos da invenção para ativi- dade e eficácia no tratamento da asma são descritos por Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18: 777 (1998) e nas referências citadas no mesmo.
Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser testados em modelos animais para doenças como psoríase. Evidência sugere uma 5 patogênese de células T para psoríase. Os compostos da invenção podem ser testados no modelo de camundongo scid/scid descrito por Schon, Μ. P. et al., Nat. Med., 3: 183 (1997), no qual os camundongos demonstram le- sões de pele histopatológicas similares a psoríase. Outro modelo adequado é a quimera de camundongo skin/scid humana preparada conforme descrito 10 por Nickoloff, B. J. etal., Am. J. Path., 146: 580 (1995).
Modelos animais recombinantes (transgênicos) podem ser pro- duzidos introduzindo a porção codificante dos genes identificados aqui, no genoma de animais de interesse, usando técnicas de rotina para produzir animais transgênicos. Animais que podem servir como um alvo para mani- 15 pulação transgênica incluem, sem limitação, camundongos, ratos, coelhos, porcos-da-índia, carneiro, cabras, porcos, e primatas não-humanos, por e- xemplo, babuínos, chimpanzés e macacos. Técnias conhecidas na técnica para introduzir um transgene em similares animais incluem microinjeção pronucléica (Hoppe and Wanger, Patente dos Estados Unidos No. 20 4.873.191); transferência genética mediada por retrovírus em linhagens germinativas (por exemplo, Van der Putten et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,
82. 6148-615 [1985]); direcionamento de gene em células-tronco embrioná- rias (Thompson etal., Cell. 56. 313-321 [1989]); eletroporação de embriões (Lo, Mol. Cel. Biol., 3. 1803-1814 [1983]); transferência genética mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell, 57. 717-73 [1989]). Para revisão, vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 4.736.866.
Para os fins da presente invenção, animais transgênicos incluem aqueles que carregam o transgene somente em parte de suas células ("ani- mais mosaico"). O transgene pode ser integrado ou como um único transge- 30 ne, ou em concatâmeros, por exemplo, tandems cabeça-para-cabeça ou cabeça-para-cauda. A introdução seletiva de um transgene em um tipo celu- lar particular também é possível seguindo, por exemplo, a técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89, 6232-636 (1992).
A expressão do transgene em animais transgênicos pode ser monitorada por técnicas de rotina. Por exemplo, análise Southern blot ou amplificação por PCR podem ser usadas para verificar a integração do 5 transgene. O nível de expressão de mRNA pode ser então analisado usando técnicas tais como hibridização in situ, análise Northern blot, PCR, ou imu- nocitoquímica.
Os animais podem ser adicionalmente examinados para sinais de patologia de doença imune, por exemplo, por exame histológico para de- 10 terminar a infiltração de células imunes em tecidos específicos. Também podem ser realizados experimentos de bloqueio nos quais os animais trans- gênicos são tratados com os compostos da invenção para determinar a ex- tensão da estimulação da proliferação de células T ou a inibição dos com- postos. Nestas fitas experimentos, anticorpos de bloqueio os quais ligam ao 15 polipeptídeo IL-17A/F, preparados conforme descrito acima, são administra- dos ao animal e o efeito sobre a função imune é determinado.
Alternativamente, podem ser construídos animais de nocaute os quais têm um gene defeituoso ou alterado codificando um polipeptídeo iden- tificado aqui, como um resultado de recombinação homóloga entre o gene 20 endógeno codificando o polipeptídeo e DNA genômico alterado codificando o mesmo polipeptídeo introduzido em uma célula embrionária do animal. Por exemplo, cDNA codificando um polipeptídeo particular pode ser usado para clonar DNA genômico codificando o polipeptídeo de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do DNA genômico codificando um polipeptídeo 25 particular pode ser eliminada ou substituída com outro gene, tal como um gene codificando um marcador selecionável o qual pode ser usado para mo- nitorar integração. Tipicamente, vários quilobases de DNA flanqueante inal- terado (tanto nas extremidades 5' quanto 3') são incluídos no vetor [vide, por exemplo, Thomas and Capecchi, Cell. 51: 503 (1987) para uma descrição de 30 vetores de recombinação homóloga]. O vetor é introduzido em uma linhagem de células-tronco embrionárias (por exemplo, por eletroporação) e células nas quais o DNA introduzido foi recombinado homologamente com o DNA endógeno são selecionadas [vide, por exemplo, Li et al., Cell, 69: 915
(1992)]. As células selecionadas são em seguida injetadas em um blastocis- to de um animal (por exemplo, um camundongo ou rato) para formar quime- ras de agregação [vide, por exemplo, Bradley, em Teratocarcinomas and 5 Embryonie Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (IRL, Ox- ford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode ser então implantado em um animal adotivo fêmea pseudoprenhe adequado e o embrião trazido a termo para criar um animal de "nocaute". A progênie portando o DNA re- combinado homologamente em suas células germinativas pode ser identifi- 10 cada por técnicas de rotina e usadas para produzir animais nos quais todas as células do animal contêm o DNA recombinado homologamente. Animais de nocaute podem ser caracterizados, por exemplo, por sua capacidade pa- ra defender contra algumas condições patológicas e para seu desenvolvi- mento de condições patológicas devido à ausência do polipeptídeo.
J. Terapia ImunoAdiuvante
Em uma modalidade, os compostos imunoestimulantes da in- venção podem ser usados em terapia imunoadjuvante para o tratamento de tumores (câncer). Está agora bem estabelecido que células T reconhecem antígenos específicos de tumores humanos. Um grupo de antígenos tumo- 20 rais, codificados pelas famílias MAGE, BAGE e GAGE de genes, são silen- ciosos (silent) em todos os tecidos normais adultos, mas são expressados em quantidades significativas em tumores, tais como melanomas, tumores pulmonares, tumores de cabeça e pescoço, e carcinomas de bexiga. DeS- met, C. et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93: 7149 (1996). Foi mostrado que 25 a coestimulação de células T induz regressão tumoral e uma reação antitu- moral tanto invenção quanto in vivo. Melero, I. et al., Nature Medicine, 3: 682 (1997); Kwon, E. D. et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 8099 (1997); Lyn- ch, D. H. et al., Nature Medicine, 3: 625 (1997); Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol., 21: 114 (1998). Os compostos estimulatórios da invenção po- 30 dem ser administrados como adjuvantes, sozinhos ou junto com um agente regulador do crescimento, agente citotóxico ou agente quimioterápico, para estimular a proliferação/ativação de céolulas T e uma reação antitumoral a antígenos tumorais. O agente regulador do crescimento, citotóxico, ou qui- mioterápico pode ser administrado em quantidades convencionais usando regimes de administração conhecidos. Atividade imunoestimulante pelos compostos da invenção permite quantidades reduzidas dos agentes regula- 5 dores do crescimento, citotóxicos, ou quimioterápicos deste modo reduzindo potencialmente a toxicidade para o paciente.
K. Ensaios de Triagem de Candidatos a Fármacos Ensaios de triagem para candidatos a fármacos são designadas para identificar compostos que ligam a ou formam complexo com os poIipep- tídeos codificados pelos genes identificados aqui, ou um fragmento biologi- camente ativo do mesmo, ou interferem de modo diverso com a interação dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares. Os ensaios de triagem referidos incluirão ensaios receptivas a triagem de alta produtividade de bibliotecas químicas, tornando-as particularmente adequadas para identi- ficar candidatos a fármacos de molécula pequena. Moléculas pequenas con- templadas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos, incluindo peptídeos, preferencialmente peptídeos solúveis, fusões de (poli)peptídeo- imunoglobulina, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anti- corpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotípicos, e versões quiméricas ou humanizadas de similares anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e frag- mentos de anticorpos. Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímica, imunoensaios e ensaios celulares, as quais são caracte- rizadas de modo geral na técnica. Todos os ensaios são comuns em que requerem contactar o candidato a fármaco com um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico identificado aqui, sob condições e por um tempo sufi- ciente para permitir que estas fitas dois componentes interajam.
Em ensaios de ligação, a interação está ligando e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura da reação. Em uma mo- dalidade particular, o polipeptídeo codificado pelo gene identificado aqui, ou o candidato a fármaco é imobilizado sobre uma fase sólida, por exemplo, sobre uma lâmina de microtítulo, por fixações covalentes ou não-covalentes. Fixação não-covalentes geralmente é realizada revestindo a superfície sólida com uma solução do polipeptídeo e secando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o poli- 5 peptídeo a ser imobilizado pode ser usado para ancorar este uma superfície sólida. A ensaio é realizado adicionando o componente não-imobilizado, o qual pode ser rotulado por um rótulo detectável, ao componente imobilizado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, os componentes não-reagidos são removi- 10 dos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados sobre a superfí- cie sólida são detectados. Quando o componente originalmente não- imobilizado carrega um rótulo detectável, a detecção da etiqueta imobilizada sobre a superfície indica que ocorreu formação de complexo. Onde o com- ponente originalmente não-imobilizado não carrega um rótulo, pode ser de- 15 tectada formação de complexo, por exemplo, usando um anticorpo rotulado ligando especificamente o complexo imobilizado.
Se o composto candidato interagir com mas não ligar a uma pro- teína particular codificada por um gene identificado aqui, sua interação com a proteína pode ser testada por métodos de conhecimento geral para detec- 20 tar interações de proteína-proteína. Os ensaios referidos incluem aborda- gens tradicional, tais como, reticulação, coimunoprecipitação, e co- purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, interações de proteína-proteína podem ser monitoradas usando um sistema genético à base de levedura descrito por Fields e colaboradores [Fields and 25 Song, Nature (London). 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 9578-9582 (1991)] conforme descrito por Chevray and Na- thans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89, 5789-5793 (1991). Muitos ativadores transcricionais, tais como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente distintos, um agindo como o domínio de ligação de 30 DNA, ao passo que o outro funciona como o domínio de ativação de trans- crição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações prece- dentes (geralmente referido como o sistema "de dois-híbridos") tira proveito desta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma na qual a prote- ína-alvo é fundida ao domínio de ligação de DNA de GAL4, e outra, na qual proteínas de ativação de candidato são fundidass ao domínio de ativação. A expressão de um gene repórter GALI-IacZ sob controle de um promotor ati- 5 vado por GAL4depende da reconstituição da atividade de GAL4 através de interação de proteína-proteína. Colônias contendo interagir polipeptídeos são detectados com um substrato cromogênico para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER®) para identificar interações de proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando a técnica de dois-híbridos está dis- 10 ponível comercialmente na Clontech. Este sistema também pode ser esten- dido para mapear domínios de proteína envolvidos em interações de proteí- na específicas bem como para localizar com precisão resíduos aminoácidos que são cruciais para estas interações.
De modo a descobrir compostos que interferem com a interação de um gene identificado aqui, e podem ser testados outros componentes intra- ou extracelulares, uma mistura da reação é geralmente preparada con- tendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob condi- ções e por um tempo permitindo a interação e ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto de teste para inibir ligação, a rea- ção é realizada na ausência e na presença do composto de teste. Além dis- so, um placebo pode ser adicionado a uma terceira mistura da reação, para servir como controle positivo. A ligação (formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente na mistura é monitorada conforme descrito acima. A formação de um complexo de uma ou mais reações de controle mas não na mistura da reação contendo o com- posto de teste indica qua o composto de teste interfere com a interação do composto de teste e seu parceiro da reação.
L. Composições e Métodos para o Tratamento de Doenças Imunorrelacionadas
As composições úteis no tratamento de doenças imunorrelacio-
nadas incluem, sem limitação, proteínas, anticorpos, pequenas moléculas orgânicas, peptídeos, fosfopeptídeos, moléculas antissenso e de ribozima, moléculas de tripla hélice, e etc. que inibem ou estimulam função imune, por exemplo, proliferação/ativação de células T, liberação de linfocinas, ou infil- tração de células imunes.
Por exemplo, moléculas de RNA e RNA antissenso agem dire- 5 tamente bloqueando a translação de mRNA hibridizando a mRNA alvo e prevenindo a translação de proteína. Quando se usa DNA antissenso, oligo- desoxirribonucleotídeos derivados do sítio de iniciação de translação, por exemplo, entre cerca de -10 e +10 posições da seqüência de nucleotídeo genética alvo, são preferenciais.
Ribozimas são moléculas de RNA enzimático capazes de catali-
sar a clivagem específica de RNA. Ribozimas agem por hibridização se- quência-específica ao RNA alvo complementar, seguida por clivagem endo- nucleolítica. Sítios de clivagem epecíficos de ribozima dentro de um alvo de RNA potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para deta- 15 lhes adicionais vide, por exemplo, Rossi, Current Bioloqy, 4, 469-471 (1994), e a publicação de patente internacional PCT No. WO 97/33551 (publicada em 18 de setembro de 1997).
Moléculas de ácido nucleico em formação de tripla hélice usada para inibir transcrição devem ser de fita único e compostas de desoxinucleo- 20 tídeos. A composição de base destas fitas oligonucleotídeos é designada de tal modo que promove formação de tripla hélice através de regras de parea- mento de base de Hoogsteen, as quais geralmente requerem trechos bas- tante grandes de purinas ou pirimidinas sobre um fita de um duplex. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, a publicação de patente internacional 25 PCT No. WO 97/33551, acima.
Estas moléculas podem ser identificadas por qualquer um ou qualquer combinação dos ensaios de triagem discutidas acima e/ou por quaiquer outras técnicas de triagem de conhecimento geral para os versados na técnica.
M. Anticorpos Anti-IL-17A/F
Em uma modalidade, a presente invenção proporciona anticor- pos anti-IL-17A/F os quais encontram uso aqui, como agentes terapêuticos e/ou diagnósticos. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos, e heteroconjugados.
1. Anticorpos Policlonais
Anticorpos policlonais são preferencialmente cultivados em ani- 5 mais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antí- geno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante (especialmente quando se usa peptídeos sintéticos) a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado a hemocianina de keyhole Iimpet (KLH), albumina sérica, tiroglo- 10 bulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster maleimidobenzoílico de sulfossuccinimi- da (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imu-
nogênicos, ou derivados combinando, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da prote- ína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via in- tradérmica em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são reforçados 20 com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adju- vante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos sítios. Sete a
14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é testado para título de anticorpos. Os animais são reforçados até o platô do título. Também podem ser feitos conjugados em cultura celular recombinante como fusões de prote- ína. Além disso, agentes de agregação tais como alúmen são usados con- venientemente para reforçar a reação imune.
2. Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o méto- do de híbridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567).
No método de híbridoma, um camundongo ou outro animal hos- pedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado conforme descrito acima para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados invenção. Depois da imu- 5 nização, os linfócitos são isolados e em seguida fundidos com uma linhagem de células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como poli- etileno glicol, para formar uma célula de híbridoma (Goding, Monoclonal An- tibodies: Principies and Practice1 pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de híbridoma preparadas deste modo são semeadas 10 e cultivadas em um meio de cultura adequado cujo meio preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida das células de mieloma parental não-fundidas (também refereridas como parceiro de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais care- cem da enzima hípoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou 15 HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previ- nem o crescimento de células deficientes de HGPRT.
Células de mieloma de parceiros de fusão preferenciais são a- quelas que se fundem de modo eficaz, suportam produção estável de alto nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não-fundidas. Linhagens de células de mieloma preferenciais são linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis na Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e SP-2 e derivados, por exemplo, células X63- Ag8-653 disponíveis na American Type Culture Collection, Manassas, Virgí- nia, USA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de ca- mundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibodv Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).
Meio de cultura nos quais células de híbridoma são cultivadas são testados para produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos mo- noclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imuno- precipitação ou por um ensaio de ligação invenção, tal como radioimunoen- 5 saio (RIA) ou ensaio imunossorvente encadeada a enzima (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser deter- minada, por exemplo, pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem.. 107: 220 (1980).
Uma vez que células de hibridoma que produzem anticorpos da 10 especificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas são identificadas, os clo- nes podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitantes e culti- vados por métodos de rotina (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, 15 as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal, por exemplo, por injeção i.p. das células em camundongos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são convenientemente separados do meio de cultura, do fluido da ascite, ou do soro por procedimentos de purificação de anticorpos convencionais tais co- 20 mo, por exemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de permuta iônica, cromato- grafia de hidroxiapatita, eletroforese por gel, diálise, e etc.
DNA codificando os anticorpos monoclonais é prontamente iso- lado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, u- 25 sando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de ligar especificamen- te a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de semelhante DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras tais como células 30 de E. coii, células COS de símio, células CHO (Chinese Hamster Ovary), ou células de mieloma que não produzem de modo diverso proteína de anticor- po, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bacté- rias de DNA codificando o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Qpinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188
(1992).
5 Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais ou frag-
mentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticor- pos geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature. 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos mu- 10 rinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afini- dade (alcance de nM) por embaralhamento (shuffling) de cadeia (Marks et al., Bio/Technoloqy, 10: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fa- 15 gos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266
(1993)). Portanto, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para isolamento de anti- corpos monoclonais.
O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produ- zir polipeptídeos de anticorpos quiméricos ou de fusão, por exemplo, substi- tuindo seqüências de domínio constante de cadeia pesada e de cadeia leve (CH e CL) humana pelas seqüências murinas homólogas (Patente dos Esta- dos Unidos No. 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA. 81: 6851 (1984)), ou fundindo a seqüência codificante de iunoglobulinaa com toda ou parte da seqüência codificante para um polipeptídeo não- imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As seqüências de polipeptídeos não-imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticor- po, ou são substituídas pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno tendo especifici- dade para um antígeno diferente. 3. Anticorpos Humanos e Humanizados Os anticorpos anti-IL-17A/F da invenção podem compreender adicionalmente anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são imu- noglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv1 Fab1 Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anti- corpos de ligação antigênica) as quais contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglo- bulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região de- terminante complementar (CDR) do receptor são substituídas por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como ca- mundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos de estrutura Fv da imunoglobulina hu- mana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Anticor- pos humanizados também podem compreender resíduos os quais não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas seqüências de CDR ou de estrutura importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de no mínimo um, e tipicamente dois, domínios vari- áveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR cor- respondem às de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancial- mente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de consenso i- munoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também com- preenderá no mínimo uma porção de uma região constante de imunoglobuli- na (Fe), tipicamente a de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Pres- ta, Curr. Qp. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Métodos para humanizar anticorpos não-humanos são conheci- dos de modo geral na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos aminoácidos introduzidos de uma fonte a qual é não- 30 humana. Estas fitas resíduos aminoácidos não-humanos são frequentemen- te referidos como resíduos de "importação" ("import"), os quais são tipica- mente tirados de um domínio variável de importação. Humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e et al. [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science. 239: 1534-1536 (1988)], substituindo CDRs ou seqüências de CDR de roedores pelas seqüências correspondentes de um 5 anticorpo humano. Por conseguinte, os anticorpos "humanizados" referidos são anticorpos quiméricos (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos 10 quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substi- tuídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados para produzir preparar os anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e a reação de HAMA (anti- 15 corpo anticamundongo humano) quando o anticorpo é pretendido para uso terapêutico humano. De acordo com o chamado método "best-fit', a seqüên- cia do domínio variável de um anticorpo de roedor é triada contra toda a bi- blioteca de seqüências de domínios variáveis humanos conhecidas. A se- qüência de domínio V humano a qual é mais próxima da do roedor é identifi- 20 cada e a região de estrutura principal humana (FR) dentro desta é aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.. 196: 901 (1987)). Outro método usa uma região de estrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anti- corpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O 25 mesmo estrutura pode ser usado para vários anticorpos humanizados dife- rentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humani- zados com retenção de alta afinidade de ligação para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferencial, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humaniza- dos conceituais usando modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão disponíveis comumente e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computação os quais ilustram e apresentam estruturas con- 5 formacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas fitas displays permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imuno- globulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capaci- dade da imunoglobulina candidata para ligar seu antígeno. Deste modo, re- 10 síduos FR podem ser selecionados e combinados entre as seqüências do receptor e de importação de modo que é obtida a característica do anticorpo desejada, tal como aumentada afinidade para o um ou mais antígenos alvo. Em geral, os resíduos de regiões hipervariáveis são diretamente e o mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação antigênica.
São contempladas várias formas de um anticorpo humanizado
anti-IL-17A/F. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, o qual é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos de modo a gerar um imunoconjugado. Alternati- vamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGI intacto.
Como uma alternativa para humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, atualmente é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, na imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de 25 produção endógena de imunoglobulina. Por exemplo, foi descrito que a eli- minação homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada de an- ticorpo (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes da linhagem germinati- va resulta na inibição completa da produção endógena de anticorpos. A transferência do arrnajo genético de imunoglobulina da linhagem germinativa 30 humana em similares camundongos mutantes da linhagem germinativa re- sultará na produção de anticorpos humanos ao estímulo antigênico. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7: 33 (1993); Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm); 5.545.807; e patente internacio- nal No. WO 97/17852.
5 Alternativamente, tecnologia "phage display de fago (McCafferty
et al., Nature 348: 552-553 [1990]) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos invenção, a partir de repertórios gené- ticos de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, genes do domínio V de anticorpos são clona- 10 dos "in-frame" em ou um gene de proteína da capa maior ou menor de um bacteriófago fitaso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula do fago. Como a partí- cula fitasa contém uma cópia de DNA de fita único do genoma do fago, sele- ções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam 15 em seleção do gene codificando o anticorpo apresentando estas proprieda- des. Portanto, o fago simula algumas das propriedades da célula B. Display de fago pode ser realizado em uma variedade de formatos, revisados em, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Bioloqy 3: 564-571 (1993). Várias fontes de segmentos genéticos 20 V podem ser usadas para display de fago. Clackson et al., Nature, 352: 624- 628 (1991) isolaram uma ordem diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatorial aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados e anticorpos para uma série 25 diversa de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essenci- almente seguindos as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Vide, também, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.565.332 e 5.573.905.
Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também ser geradas por células B ativadas invenção (vide as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.567.610 e 5.229.275). 4. Fragmentos de anticorpos
Em algumas circunstâncias há vantagens de usar fragmentos de anticorpos, ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmen- tos permite rápida liberação, e pode levar a aprimorado acesso a tumores 5 sólidos.
Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de frag- mentos de anticorpos. Tradicionalmente, estas fitas fragmentos foram deri- vados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por e- xemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophvsical Methods 24: 10 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, es- tas fitas fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv po- dem todos ser expressados em e secretados por E. coli, deste modo permi- tindo a fácil produção de grandes quantidades destas fitas fragmentos. 15 Fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados dire- 20 tamente a partir da cultura celular hospedeira recombinante. Fragmentos Fab e F(ab’)2 com aumentada meia-vida in vivo compreendendo um receptor selvagem ligando resíduos de epitopo são descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para o técnico versado. Em outras modalidades, 25 o anticorpo de escolha é um fragmento de de cadeia única (scFv). Vide a patente internacional No. WO 93/16185; a Patente dos Estados Unidos No. 5.571.894; e a Patente dos Estados Unidos No. 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são destituídas de regiões constantes; portanto, são adequados para ligação não-específica 30 reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora ou no término amino ou no car- bóxi de um sFv. Vide Antibodv Enoineering, ed. Borrebaeck, supra. O frag- mento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.641.870 por exem- plo. Os fragmentos de anticorpos lineares referidos podem ser monoespecí- ficos ou biespecíficos.
5. Anticorpos Biespecíficos
Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação para no mínimo dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar a dois epitopos diferentes de uma proteína IL-17A/F conforme descrito aqui, . Outros anticorpos similares podem combinar um 10 sítio de ligação de IL-17A/F com um sítio de ligação para outra proteína. Al- ternativamente, um braço anti-IL-17A/F pode ser combinado com um braço o qual liga a uma molécula de ligação sobre um leucócito tal como uma molé- cula receptora de células T (por exemplo, CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de 15 modo a focalizar e localizar mecanismos de defesa celular para a célula ex- pressando IL-17A/F. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células as quais expressam IL-17A/F. Estas fitas anticorpos possuem um braço de ligação de IL-17A/F e um braço o qual liga o agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, vinca 20 alcalóide, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de exten- são total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).
A patente internacional No. WO 96/16673 descreve um anticorpo 25 biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRIII e a Patente dos Estados Unidos No. 5.837.234 revela um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRI. Um anti- corpo biespecífico anti-ErbB2/Fca é mostrado na patente internacional No. WO 98/02463. A Patente dos Estados Unidos No. 5.821.337 ensina um anti- corpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.
Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos
na técnica. A tradicional produção de anticorpos biespecíficos de extensão total se baseia na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305: 537-539 (1983)). Devido à classificação aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estas fitas hibridomas (qua- dromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos 5 diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, a qual é geralmente feita por etapas de cromatografia por afinidade, é ao contrário trabalhosa, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos na patente inter- nacional No. WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 10 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combina- ção de anticorpo-antígeno) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de Ig, compreendendo no mínimo parte das regiões de articulação, CH2, e CH3. É preferencial ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve, presente em no mínimo uma das fusões. DNAs codificando as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, caso desejado, a cadeia leve de imuno- globulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotrans- fectados em uma célula hospedeira adequada. Isto proporciona maior flexibi- lidade para ajustar as proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptí- deo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias de poli- peptídeo usadas na construção proporcionam a produção ótima do anticorpo biespecífico desejado. No entanto, é possível inserir as seqüências codifi- cantes para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um único ve- tor de expressão quando a expressão de no mínimo duas cadeias de poli- peptídeo em iguais proporções resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não têm efeito significativo sobre o rendimento da combinação de cadeias desejada.
Em uma modalidade preferencial desta abordagem, os anticor- pos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi visto que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado 5 de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abor- dagem é descrita na patente internacional No. WO 94/04690. Para detalhes adicionais para gerar biespecíficos anticorpos vide, por exemplo, Suresh et 10 al.. Methods in Enzvmoloqy 121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente dos Esta- dos Unidos No. 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticor- pos pode ser produzida para maximizar a percentagem de heterodímeros os quais são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferen- 15 ciai compreende no mínimo uma parte do domínio Ch3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar a uma ou mais cadeias laterais grandes são criadas sobre 20 a interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais de aminoácidos grandes com cadeias laterais de aminoácidos pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar a produção do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.
Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "hete-
roconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugao pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Os anticorpos referidos foram propos- tos, por exemplo, para direcionar células do sistema imune para células in- desejadas (Patente dos Estados Unidos No. 4.676.980), e para tratamento 30 de infecção por HIV (patente internacional No. WO 91/00360, patente inter- nacional No. WO 92/200373, e patente européia No. EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser preparados usando quaisquer métodos de reti- culação convenientes. Agentes de reticulação adequados são conhecidos de modo geral na técnica, e são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 4.676.980, junto com uma série de técnicas de reticulação.
Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmen- tos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anti- corpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação químcia. Bren- nan et al., Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anti- corpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estas fitas fragmentos são reduzidos na presença do agente de formação de complexo ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são en- tão convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab1-TNB é então reconvertido para o Fab-tiol por redução com mercaptoeti- Iamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'- TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos pro- duzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab’-SH de E. coli, os quais podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado a partir de E. coli e submetido a ligação química direta invenção para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico formado deste modo foi capaz de ligar a células superexpressando o receptor ErbB2 e células T hu- manas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano. Também foram descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., JL Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíperes de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos dife- rentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e em seguida re-oxidizados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia "dia- 5 body" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448
(1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um Vh conectado a um Vl por um encadeador o qual é curto demais para permitir pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios 10 Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, deste modo formam do dois sítios de ligação antigênica. Também foi reportada outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv). Vide Gruber et al., J. Immunol.. 152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por
exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Im- munol. 147: 60(1991).
6. Anticorpos Heteroconiuqados Anticorpos heteroconjugados também estão dentro do âmbito da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois an- ticorpos unidos de modo covalente. Os anticorpos referidos foram propostos, por exemplo, para direcionar células do sistema imune para células indese- jadas [Patente dos Estados Unidos No. 4.676.980], e para tratamento de infecção por HIV [Patente internacional No. WO 91/00360; Patente interna- cional No. 92/200373; Patente européia No. EP 03089]. É contemplado que os anticorpos podem ser preparados invenção usando métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas usando uma reação de permuta de dissulfeto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato e os descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 4.676.980. 7. Anticorpos Multivalentes Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou cataboli- zado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula expressan- do um antígeno ao qual os anticorpos ligam. Os anticorpos da presente in- venção podem ser anticorpos multivalentes (os quais são diferentes da clas- se das IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), os quais podem ser prontamente produzidos por expressão recombinante de ácido nucleico codificando as cadeias de poli- peptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um do- mínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferencial compreende (ou consiste em ) uma região Fc ou uma região de articulação. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminal à regi- ão Fe. O anticorpo multivalente preferencial aqui, compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas preferencialmente quatro, sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende no mínimo uma cadeia de polipeptídeo (e preferencialmente duas cadeias de polipeptídeo), em que a uma ou mais cadeias de polipeptídeo compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a uma ou mais cadeias de polipeptídeo podem com- preender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio vari- ável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de uma região Fe, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a uma ou mais cadeias de polipeptídeo podem com- prender: cadeia de VH-CH1-encadeador flexível-VH-CH1-região Fe; ou ca- deia de VH-CH1-VH-CH1-região Fe. O anticorpo multivalente aqui, preferen- cialmente e adicionalmente compreende no mínimo dois (e preferencialmen- te quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo mul- tivalente aqui, pode compreender, por exemplo, a partir de cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptí- deos de domínio variável de cadeia leve contemplados aqui compreedem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem adicio- nalmente um domínio CL. 8. Engenharia de Funcão Efetora
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com rela- ção à função efetora, por exemplo, de modo a reforçar a citotoxicidade me- diada por células antígeno-dependentes (ADCC) e/ou citoxicidade depen- dente do complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser realizado introdu- zindo uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anti- corpo. Alternativamente ou adicionalmente, um ou mais resíduos cisteína podem ser introduzidos na região Fe, deste modo permitindo formação de ligação de dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico gerado deste modo pode ter capacidade de internalização aprimorada e/ou aumentada destruição celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Vide Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticor- pos homodiméricos com reforçada atividade antitumoral também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser produzido um anticorpo o qual tem regiões Fc duplas e deste modo pode ter Iise do complemento e capacidades de ADCC reforçadas. Vide Steven- son et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Para aumentar a a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epitopo de ligação de receptor selvagem no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.739.277, por exem- plo. Conforme usado aqui, o termo " epitopo de ligação de receptor selva- gem" se refere a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por e- xemplo, IgGi, IgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar a meia- vida sérica in vivo da molécula de IgG.
9. Imunoconiuqados
A invenção também diz respeito a imunoconjugados compreen- dendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimoterápico, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, ou fragmentos do mesmo), ou um isótopo radioativo (isto é, um ra- dioconjugado).
Agentes quimoterápicos úteis na geração de tais imunoconjuga- dos foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser usados incluem diftérica cadeia A, fragmentos ativos não de ligação de toxina diftérica, exotoxina cadeia A (de Pseudomo- nas aeruginosá), ricina cadeia A, abrina cadeia A, modecina cadeia A, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phyto- Iaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, res- trictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de ra- dionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjuga- dos. Exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y, e 186Re. Conjugados do anticor- po e agente citotóxico são fabricados usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCL de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como sube- rato de dissuccinimidil), aldeídeos (tais como glutareldeído), compostos de bisazido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdi- azônio (tais como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como tolieno 2,6-di-isocianato), e compostos de flúor bisativos (tais como
1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987). Ácido pentaacético de triamina de 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno mar- 25 cado com Carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para con- jugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide a patente internacional No. WO 94/11026.
Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina, também são contemplados aqui, .
Maitansina e maitansinoides Em uma modalidade preferencial, um anticorpo anti-IL-17A/F (extensão total ou fragmentos) da invenção é conjugado a uma ou mais mo- léculas de maitansinoide.
Maitansinoides são inibidores mitotóticos os quais agem inibindo a polimerização de tubulin. Maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto de Maytenus serrata do leste da África (Patente dos Estados U- nidos No. 3.896.111). Subsequentemente, foi descoberto que alguns micró- bios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres de C-3 maitansinol (Patente dos Estados Unidos No. 4.151.042). Maitansinol sintéticos e derivados e análogos dos mesmos são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, cujas descrições são por este expressamente incorporadas por meio de referência. Conjugados de maitansinoide-anticorpo
Em uma tentativa de melhorar seu índice terapêutico, maitansina e maitansinoides foram conjugados a anticorpos ligando especificamente a antígenos de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinoides e 20 seu usa terapêuticos são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.208.020, 5.416.064 e no relatório descritivo Européia No. EP 0 425 235 B1, cujas descrições são por este expressamente incorporadas por meio de referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) descreveu imunoconjugados compreendendo um maitansinoide de- 25 signado DM1 encadeado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra cân- cer colorretal humano. Foi visto que o conjugado é altamente citotóxico para células de câncer de cólon cultivadas, e apresentou atividade antitumoral em um ensaio de crescimento tumoral in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) descrevem imunoconjugados nos quais um maitansinoide foi 30 conjugado através de um encadeador de dissulfeto ao anticorpo A7 murino ligando a um antígeno sobre linhagens de células de câncer de cólon huma- no, ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que liga o oncogene HER- 2.1 neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansonóide foi testada inven- ção sobre a linhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, a qual expressa 3 x 105 antígenos superficiais HER-2 por célula. O conjugado de fámaco obteve um grau de citotoxicidade similar ao fármaco de maitan- 5 sonide livre, o qual pode ser aumentado aumentando o número de molécu- las de maitansinoide por molécula de anticorpo. O conjugado A7- maitansinoide apresentou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos. Conjugados de anticorpo antipolipeptídeo IL-17A/F-maitansinoide (imuno- coniuqados)
Conjugados de anticorpo anti-IL-17A/F-maitansinoide são prepa-
rados ligando quimicamente um anticorpo anti-IL-17A/F a uma molécula de maitansinoide sem diminuir significativamente a atividade biológica quer do anticorpo quer da molécula de maitansinoide. Uma média de 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticorpo apresentaram eficá- 15 cia no reforço de citotoxicidade de células-alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora se esperaria que mesmo uma molécula de toxina/anticorpo reforçasse a citotoxicidade em relação ao uso de anticorpo nu. Maitansinoides são conhecidos de modo geral na técnica e podem ser sintetizados por meio de técnicas conhecidas ou isolados de fon- 20 tes naturais. Maitansinoides adequados são descritos, por exemplo, na Pa- tente dos Estados Unidos No. 5.208.020 e nas outras patentes e publicações não patente referidas acima. Maitansinoides preferenciais são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posi- ções da molécula de maitansinol, tais como vários ésteres de maitansinol.
Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para produ-
zir conjugados de anticorpo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, os descri- tos na Patente dos Estados Unidos No. 5.208.020 ou no relatório descritivo européia No. EP Patent 0 425 235 BI, e Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissufeto, grupos tioé- 30 ter, grupos lábeis ácido, grupos fotolábeis, grupos peptidase Iabile groups, ou grupos lábeis esterase, conforme descrito nas patentes identificadas aci- ma, grupos dissulfeto e tioéter sendo preferenciais. Conjugados do anticorpo e maitansinoide podem ser produzidos usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT)1 derivados bifun- 5 cionais de imidoésteres (tais como HCL de dimetil adipimidato), ésteres ati- vos (tais como dissuccinimidil suberato), aldeídos (tais como glutareldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), deriva- dos bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamine), di- isocianatos (tais como tolueno 2,6-di-isocianato), e compostos de flúor bis- 10 ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de ligação particu- larmente preferenciais incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 [1978]) e N-succinimidil-4- (2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporiconar uma ligação de dissulfeto.
O encadeador pode ser fixado à molécula de maitansinoide em 15 várias posições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada por reação com um grupo oxidrila usando técnicas de ligação convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendo um grupo oxidrila, a posição C-14 modificada com hidroximetil, a posição C-15 modificada com um grupo oxidrila, e a posição C-20 tendo um grupo oxidrila. 20 Em uma modalidade preferencial, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.
Caligueamicina
Outro ímunoconjugado de interesse compreende um anticorpo anti-IL-17A/F conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A fa- 25 mília de antibióticos das caliqueamicinas são capazes de produzir rupturas de DNA de fita duplo em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família das caliqueamicinas, vide as patentes dos Estados Unidos No. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). 30 Análogos estruturais de caliqueamicina os quais podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, γΛ a2\ a3', N-acetyl-γΛ PSAG e θ'ι (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) e nas patentes dos Estados Unidos supracitadas para a American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral que o anticorpo pode ser conjugado é QFA o qual é um antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA têm sítios intracelulares de ação e não cruzam prontamente a membrana 5 plasmática. Portanto, a captação celular destas fitas agentes através de in- ternalização mediada por anticorpos reforça grandamente seus efeitos cito- tóxicos.
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados aos an- 10 ticorpos anti-IL-17A/F da invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristi- na e 5-fluorouracila, a família de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288 descrito nas patentes dos Estados Unidos Nos. 5.053.394, 5.770.710, bem como esperamicinas (patente dos Estados Uni- dos No. 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas os
quais podem ser usados incluem diftérica cadeia A, fragmentos ativos não de ligação de toxina diftérica, exotoxina cadeia A (from Pseudomonas aeru- ginosa), ricina cadeia A, abrina cadeia A, modeccina cadeia A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca ame- 20 ricana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide por exemplo, a patente inter- nacional No. WO 93/21232 publicada em 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla adicionalmente um imunoconju- gado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; DNase).
Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreen- der um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos anti-IL-17A/F radioconjuga- dos. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para diag- nose, pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo tc99m ou I123, ou um rótulo de spin para estudo por imagens de res- sonância magnética nuclear (NMR) (também conhecido como estudo por imagens de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, io- 5 do-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
As radio-etiquetas ou outras podem ser incorporadas no conju- gado em modos conhecidos. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossinteti- zado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando 10 precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 ao invés de hidrogênio. Etiquetas tais como tc99m ou I123, .Re186, Re188 e In111 podem ser fixadas através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser fixado através de um resíduo lisina. O método do IODOGEN (Fra- ker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser usado 15 para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antíbodies in Immunoscintigraphy" (ChataI1CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.
Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser produzi- dos usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- 20 (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como HCL de dimetil adipimidato), ésteres ativos (tais como dissuccinimidil suberato), aldeídos (tais como glutareldeí- do), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), 25 di-isocianatos (tais como tolieno 2,6-di-isocianato), e compostos de flúor bis- ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunoto- xina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Scien- ce 238: 1098 (1987). Ácido pentaacético de triamina 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno rotulado com carbono-14 (MX-DTPA) é um agente quelante 30 exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide a patente internacional No. WO 94/11026. O encadeador pode ser um "encadeador clivável" facilitating release of the citotóxico drug in the cell. Por exemplo, pode ser usado um encadeador lábil a ácido, encadeador sensível a pepti- dase, encadeador fotolábil, encadeador de dimetila ou encadeador contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente dos Estados Unidos No. 5.208.020).
5 Alternativamente, pode ser feita uma proteína de fusão compre-
endendo o anticorpo anti-IL-17A/F e agente citotóxico, por exemplo, por téc- nicas recombinantes ou síntese de peptídeo. A extensão de DNA pode com- preender regiões respectivas codificando as duas porções do conjugado quer adjacentes umas às outras ou separadas por uma região codificando 10 um peptídeo encadeador o qual não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento tumoral em que o conjugado de anticorpo-receptor é administrado ao pacien- 15 te, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulação usando um agente de clareamento e em seguida a administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) o qual é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).
10. Imunolipossomas Os anticorpos anti-IL-17A/F descritos aqui, também podem ser
formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma vesícula peque- na composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo o qual é útil para liberação de um fármaco a um mamífero. Os componentes do li- possoma são comumente arranjados em uma formação bicamada, similares 25 à disposição de lipídios de membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como des- crito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e patente internacional No. WO 97/38731 publi- 30 cada em 23 de outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação re- forçado são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo mé- todo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo com- preendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina PEG-derivada (PEG-PE). Lipossomas são extrusados através de filtros do tamanho de poro 5 definido para produzir Iipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos Iiposso- mas conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterápico é opcionalmente contido dentro do lipossoma. Vide Gabizon et al., J. National 10 Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989).
N. Oligopeptideos de Ligação de IL-17A/F Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F da presente invenção são oligopeptídeos que ligam, preferencialmente especificamente, a um polipep- tídeo IL-17A/F conforme descrito aqui, . Oligopeptídeos de ligação de IL- 17A/F podem ser quimicamente sintetizados usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recombinante. Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F têm geral- mente no mínimo cerca de 5 aminoácidos de extensão, alternativamente no mínimo cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,
83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 ami- noácidos de extensão ou mais, em que similares oligopeptídeos que são 25 capazes de ligar, preferencialmente especificamente, a um polipeptídeo IL- 17A/F conforme descrito aqui, . Oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F po- dem ser identificados sem undue experimentação usando de conhecimento geral técnicas. A este respeito, observa-se que técnicas para triar bibliotecas de oligopeptídeos para oligopeptídeos que são capazes de ligar especifica- 30 mente a um alvo polipeptídico são conhecidos de modo geral na técnica (vi- de, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; a Publi- cação de patente internacional PCT Nos. WO 84/03506 e W084/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol.
5 Meth., 102: 259-274(1987); Schoofsetal., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363, e Smith, G. P. (1991) Current 10 Opin. Biotechnol., 2: 668).
A este respeito, display de bacteriófago (fago) é uma técnica de conhecimento geral a qual possibilita triar grandes bibliotecas de oligopeptí- deos para identificar um ou mais membros destas bibliotecas os quais são capazes de ligar especificamente a um alvo polipeptídico. Display de fago é 15 uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são apresentados como prote- ínas de fusão para a proteína do revestimento sobre a superfície de partícu- las de bacteriófagos (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). A utilidade de display de fago se situa no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas seletivamente randomizadas (ou cDNAs clonados 20 aleatoriamente) podem ser classificadas rapidamente e de modo eficaz para as seqüências que ligam a uma molécula-alvo com alta afinidade. Bibliote- cas de display de peptídeo (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378) ou de proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), 25 J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363) sobre fago têm sido usadas para triar milhões de polipeptídeos ou oligopeptídeos para aqueles com propriedades de ligação específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668). Classificação de bibliotecas
r
de fagos de mutantes aleatórios requer uma estratégia para construir e pro- 30 pagar um grande número de variantes, um procedimento para purificação por afinidade usando o receptor alvo, e um meio para avaliar os resultados de enriquecimentos de ligação. Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, e 5.663.143.
Embora a maioria dos métodos de display de fago terem usado fago fitaso, também são conhecidos sistemas de display de fago lambdóide (patente internacional No. WO 95/34683; patente dos Estados Unidos No.
5 U.S. 5.627.024), sistemas de display de fago T4 (Ren, Z-J. et al. (1998) Gene 215: 439; Zhu, Z. (1997) CAN 33: 534; Jiang, J. et al. (1997) can 128: 44380; Ren, Z-J. etal. (1997) CAN 127: 215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5: 1833; Efimov, V. P. et al. (1995) Virus Genes 10: 173) e sistemas de dis- play de fago T7 (Smith, G. P. and Scott, J.K. (1993) Methods in Enzymology, 10 217, 228-257; patente dos Estados Unidos No. U.S. 5.766.905).
Atutalmente têm sido desenvolvidos muitos outros aprimoramen- tos e variações do conceito de display de fago básico. Estas fitas aprimora- mentos reforçam a capacidade dos sistemas de display para triar bibliotecas de peptídeos para ligar a moléculas-alvo selecionadas e para apresentar 15 proteínas funcionais com o potencial de triar estas proteínas para proprieda- des desejadas. Dispositivos de reação combinatorial para reações de display de fago foram desenvolvidos (patente internacional No. WO 98/14277) e bi- bliotecas de display de fago têm sido usadas para analisar e controlar intera- ções bimoleculares (patente internacional No. WO 98/20169; patente inter- 20 nacional No. WO 98/20159) e propriedades de peptídeos helicoidais restritas (patente internacional No. WO 98/20036). A patente internacional No. WO 97/35196 descreve um método para isolar um Iigante de afinidade no qual uma biblioteca de display de fago é contactada com uma solução na qual o Iigante ligará a uma molécula-alvo e uma segunda solução na qual o Iigante 25 de afinidade não ligará à molécula-alvo, para isolar seletivamente Iigantes de ligação. A patente internacional No. WO 97/46251 descreve um método de biopeneiração (biopanning) de uma biblioteca de display de fago aleatória com um anticorpo purificado por afinidade e em seguida isolando o fago de ligação, seguido por um processo de micropeneiração (micropanning) usan- 30 do cavidades de microlâminas para isolar fago de ligação de alta afinidade. O uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como um rótulo de afinidade também foi reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9: 187). A patente inter- nacional No. WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecas de subtração de substrato para distinguir especificidades enzimáticas usando uma biblioteca combinatorial a qual pode ser uma biblioteca de display de fago. Um método para selecionar enzimas adequadas para uso em detergentes usando dis- 5 play de fago é descrito na patente internacional No. WO 97/09446. Métodos adicionais para selecionar proteínas de ligação específica são descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.498.538, 5.432.018, e na patente inter- nacional No. WO 98/15833.
Métodos para gerar bibliotecas de peptídeos e triar estas biblio- tecas também são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192, e 5.723.323.
O. Moléculas Orgânicas de Ligação de IL-17A/F Moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F são moléculas or- gânicas diferentes de oligopeptídeos ou anticorpos conforme definido aqui, que ligam, preferencialmente e especificamente, a um polipeptídeo IL-17A/F conforme descrito aqui, . Moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F podem ser identificadas e sintetizadas quimicamente usando metodologia conhecida (vide, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional PCT Nos. WO 00/00823 e WO 00/39585). Moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F têm geralmente menos de cerca de 2000 daltons de tamanho, alternativamente menos de cerca de 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons de tamanho, em que as moléculas orgânicas referidas que têm capacidade de ligar, preferencial- mente e especificamente, a um polipeptídeo IL-17A/F conforme descrito aqui, podem ser identificadas sem indevida experimentação usando técnicas de conhecimento geral. A este respeito, observa-se que técnicas para triagem de bibliotecas de moléculas orgânicas para moléculas que têm capacidade de ligar a um alvo polipeptídico são conhecidas de modo geral na técnica (vide, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional PCT Nos. WO 00/00823 e WO 00/39585). Moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F po- dem ser, por exemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazo- nas, carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias, hidrazinas N-substituídas, hidrazidas, álcoois, éteres, tióis, tioéteres, dissul- fetos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureias, carbamatos, carbonatos, cetais, tiocetais, acetais, tioacetais, haletos de arila, sulfonatos de arila, hale- tos de alquila, sulfonatos de alquila, compostos aromáticos, compostos hete- 5 rocíclicos, anilinas, alquenos, alquinas, dióis, amino álcoois, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziri- dinas, isocianatos, sulfonil cloretos, compostos diazo, cloretos ácidos, ou similares.
P. Triagem para Anticorpos Anti-IL-17A/F, Oligopeptídeos Ligando IL-17A/F e Moléculas Orgânicas de Ligação de IL-17A/F Com as Propriedades Desejadas
Técnicas para gerar anticorpos, oligopeptídeos e moléculas or- gânicas que ligam a polipeptídeos IL-17A/F foram descritas acima. Pode-se adicionalmente selecionar anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculas orgânicas com algumas características biológicas, conforme desejado.
Os efeitos inibitórios do crescimento de um anticorpo anti-IL- 17A/F, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica da invenção podem ser avaliados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando células as quais expressam um polipeptídeo IL-17A/F quer endogenamente ou de- 20 pois de transfecção com o gene IL-17A/F. Por exemplo, linhagens de células tumorais apropriadas e células transfectadas com IL-17A/F podem ser trata- das com um anticorpo monoclonal anti-IL-17A/F, oligopeptídeo ou outra mo- lécula orgânica da invenção em várias concentrações por uns poucos dias (por exemplo, 2 a 7 dias) e coradas com cristal violeta ou MTT ou analisadas 25 por algum outro teste colorimétrico. Outro método para medir a proliferação seria comparando a captação de 3H-timidina pelas células tratadas na pre- sença ou ausência um anticorpo anti-IL-17A/F, oligopeptídeo de ligação de IL-17A/F ou molécula orgânica de ligação de IL-17A/F da invenção. Depois de tratamento, as células são colhidas e a quantidade de radioatividade in- 30 corporada no DNA é quantificada em um contador de cintilação. Controles positivos apropriados incluem tratamento de uma linhagem celular selecio- nada com um anticorpo inibidor do crescimento conhecido por inibir o cres- cimento desta linhagem celular. A inibição do crescimento de células tumo- rais in vivo pode ser determinada em vários modos conhecidos na técnica. Preferencialmente, a célula tumoral é uma célula que superexpressa um po- lipeptídeo IL-17A/F. Preferencialmente, o anticorpo anti-IL-17A/F, oligopeptí- 5 deo de ligação de IL-17A/F ou molécula orgânica de ligação de IL-17A/F ini- birão a proliferação celular de uma célula tumoral expressando IL-17A/F in- venção ou in vivo por cerca de 25 a 100% comparada com a célula tumoral não-tratada, mais preferencialmente, por cerca de 30 a 100%, e ainda mais preferencialmente por cerca de 50 a 100% ou 70 a 100%, em uma modali- 10 dade, em uma anticorpo concentração de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. A inibição do crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpo de cer- ca de 0,5 a 30 pg/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, onde a inibição do crescimento é determinada 1 a 10 dias depois de exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo 15 se a administração do anticorpo anti-IL-17A/F a cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal resulta em redução no tamanho do tumor ou redução da proliferação de células tumorais dentro de cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferencialmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.
Para selecionar um anticorpo anti-IL-17A/F, oligopeptídeo de
ligação de IL-17A/F ou molécula orgânica de ligação de IL-17A/F que induz morte celular, a perda de integridade de membrana conforme indicado por, por exemplo, captação de iodeto de propídio (PI), azul de tripano ou 7AAD pode ser avaliada em relação ao controle. Um ensaio de captação de Pl po- 25 dem ser realizada na ausência de complemento e células efetoras imunes. Células tumorais expressando polipeptídeo IL-17A/F são incubadas com meio somente ou com meio contendo o anticorpo anti-IL-17A/F apropriado (por exemplo, a cerca de 10 pg/ml), o oligopeptídeo de ligação de IL-17A/F ou a molécula orgânica de ligação de IL-17A/F. As células são incubadas por 30 um período de tempo de 3 dias. Depois de cada tratamento, as células são lavadas e divididas em alíquotas dentro de tubos de 12 x 75 de 35 mm de tampa de coador (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para re- moção de grumos celulares. Ostubos em seguida recebem Pl (10 Mg/ml). As amostras podem ser analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN® e software FACSCONVERT® CeIIQuest (Becton Dickinson). Estas fitas anti- corpos anti-IL-17A/F, oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F ou moléculas 5 orgânicas de ligação de IL-17A/F que induzem níveis estatisticamente signi- ficativos de morte celular conforme determinado por captação de Pl podem ser selecionados como anticorpos anti-IL-17A/F, oligopeptídeos de ligação de IL-17A/F ou moléculas orgânicas de ligação de IL-17A/F indutores de morte celular.
Para triagem de anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculas
orgânicas que ligam a um epitopo sobre um polipeptídeo IL-17A/F ligado por um anticorpo de interesse, pode ser realizada um ensaio de bloqueio cruza- do de rotina tal como a descrita em Antibodies, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Esta ensaio
pode ser usada para determinar se um anticorpo, oligopeptídeo ou outra mo- lécula orgânica de teste liga o mesmo sítio ou epitopo como um anticorpo anti-IL-17A/F conhecido. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser rea- lizado mapeamento de epitopo por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a seqüência de anticorpos pode ser mutagenizada tal como 20 por varredura de alanina, para identificar resíduos de contato. O anticorpo mutante é inicialmente testado para ligação com anticorpo policlonal para assegurar adequado dobramento. Em um método diferente, peptídeos cor- respondentes a diferentes regiões de um polipeptídeo IL-17A/F podem ser usados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um 25 anticorpo de teste e um anticorpo com um epitopo caracterizado ou conheci- do.
Q. Composições Farmacêuticas
As moléculas IL-17A/F ativas da invenção (por exemplo, polipep- tídeos IL-17A/F, anticorpos anti-IL-17A/F, e/ou variantes de cada) bem como outras moléculas identificadas pelos ensaios de triagem descritas acima, podem ser administradas para o tratamento de doenças imunorrelacionadas, sob a forma de composições farmacêuticas. Formulações terapêuticas da molécula IL-17A/F ativa, preferen- cialmente um polipeptídeo ou anticorpo da invenção, são preparadas para armazenamento misturando a molécula ativa tendo o grau desejado de pu- reza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitá- 5 veis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol1 A. Ed. [1980]), sob a forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo 10 ácido ascórbico e metionina; preservantes (tais como cloreto de octadecildi- metilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 15 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatin, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sucrose, manitol, 20 trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; comple- xos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
Compostos identificados pelos ensaios de triagem descritas aqui, podem ser formuladas em uma maneira análoga, usando técnicas de rotina conhecidas de modo geral na técnica.
Lipofecções ou Iipossomas também podem ser usadas para libe- rar a molécula IL-17A/F em células. Onde são usados fragmentos de anti- corpos, o menor fragmento inibitório o qual liga especificamente ao domínio de ligação da proteína-alvo é preferencial. Por exemplo, com base nas se- 30 quências de variáveis região de um anticorpo, podem ser designadas molé- culas de peptídeo as quais retêm a capacidade de ligar a seqüência da pro- teína-alvo. Os peptídeos referidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombinante (vide, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893 [1993]).
A formulação aqui, também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação em particular sendo tratada, pre- 5 ferencialmente aqueles com atividades complementares que não afetam de modo adverso um ao outro. Alternativamente, ou além disso, a composição podem compreender um agente citotóxico, citocina ou agente inibidor do crescimento. As moléculas referidas convenientemente estão presentes em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos.
As moléculas IL-17A/F ativas também podem ser capturadas em
microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, mi- 15 croesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. As técnicas referidas são relveladas em Remington1S Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de mem- branas de filtração estéreis.
Preparações de liberação gradual ou as moléculas IL-17A/F po- dem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação gradual incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos modela- 25 dos, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libera- ção gradual incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil- metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactidas (Patente dos Estados Unidos No. 3.773.919), copolymers de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etile- no-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico 30 degradáveis tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis com- postas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Apesar de polímeros tais como etileno- vinil acetato e ácido láctico-ácido glicólico permitirem a liberação de molécu- las por mais de 100 dias, algumas proteínas de liberação de hidrogéis por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permane- cem no corpo por um longo tempo, então podem desnaturar ou agregar co- 5 mo um resultado da exposição a umidade a 37DC, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estraté- gias razoáveis podem ser projetadas para estabilização dependendo do me- canismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for desco- berto como sendo formação de ligação S-S intermolecular através de permu- 10 ta de tio-dissulfeto, pode ser obtida estabilização por modificação de resí- duos sulfidrila, liofilização de soluções acidíferas, controlando o teor de umi- dade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matri- zes poliméricas específicas.
R. Métodos de Tratamento É contemplado que os polipeptídeos, anticorpos e outros com-
postos ativos da presente invenção podem ser usados para tratar várias condições e doenças imunorrelacionadas, tais como doenças mediadas por células T, incluindo as caracterizadas por infiltração de células inflamatórias em um tecido, estimulação da proliferação de células T, inibição da prolifera- 20 ção de células T, permeabilidade vascular aumentada ou reduzida ou a inibi- ção da mesma, tais como doenças autoimunes.
Condições ou distúrbios exemplares a serem tratados com os polipeptídeos, anticorpos e outros compostos da invenção, incluem, mas não está limitados a lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, artrite crôni- 25 ca juvenil, osteoartrite, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (esclero- derma), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria paroxísmica noturna), trom- bocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia 30 imunomediada), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabete melito, doença renal imunomedi- ada (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinantes dos sistemas nervosos central e periférico tais como esclerose múltipla, polineu- ropatia desmielinante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuro- patia desmielinante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não-hepatotrópicos), 5 hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granuloma- tosa, e colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória (colite ulcerati- va: doença de Crohn), enteropatia sensível a glúten, e doença de Whipple, doenças de pele autoimunes ou imunomediadas incluindo doenças de pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças a- 10 lérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão tais como pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite por hipersensibilidade, doenças associadas com transplante incluindo rejeição a enxerto e doença enxerto-versus-hospedeiro.
No lúpus eritematoso sistêmico, o mediador central de doença é
a produção de anticorpos autorreativos para auto proteínas/tecidos e a gera- ção subsequente de inflamação imunomediada. Anticorpos ou diretamente ou indiretamente mediam lesão tecidual. Embora não tenha sido mostrado que linfócitos T estejam diretamente envolvidos em lesão tecidual, os linfóci- 20 tos T são requeridos para o desenvolvimento de anticorpos autorreativos. A gênese da doença é portanto dependente de linfócitos T. Múltiplos órgãos e sistemas são afetados clinicamente incluindo fim, pulmão, sistema musculo- esquelético, mucocutâneo, olho, sistema nervoso central, sistema cardiovas- cular, trato gastrointestinal, medula óssea e sangue.
Artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória autoimune
sistêmica crônica que essencialmente envolve a membrana sinovial de múl- tiplas articulações com lesão resultante para a cartilagem articular. A pato- gênese é dependente de linfócitos T e está associada com a produção de fatores reumatoides, autoanticorpos dirigidos contra auto IgG, com a forma- 30 ção resultante de complexos imunes que atingem altos níveis em fluido das articulações e no sangue. Estas fitas complexos na articulação podem indu- zir o acentuado infiltrado de linfócitos e monócitos na sinóvia e subsequentes » 190
alterações sinoviais acentuadas; o espaço/fluido articular é infiltrado por cé- lulas similares com a adição de numerosos neutrófilos. Os tecidos afetados são essencialmente as articulações, frequentemente em padrão simétrico. No entanto, também ocorre doença extra-articular em duas formas principais.
5 Uma forma é o desenvolvimento de lesões extra-articulares com doença ar- ticular progressiva contínua e lesões típicas de fibrose pulmonar, vasculite, e úlceras cutâneas. A segunda forma de doença extra-articular é a denomina- da síndrome de Felty a qual ocorre posteriormente no curso da doença de artrite reumatoide, algumas vezes depois da doença articular ter se tornado 10 quiescente, e envolve a presença de neutropenia, trombocitopenia e esple- nomegalia. Isto pode ser acompanhado por vasculite em múltiplos órgãos com formações de enfartes, úlceras da pele e gangrena. Os pacientes fre- quentemente também desenvolvem nódulos reumatoides no tecido da sub- cutis sobrepondo as articulações afetadas; os nódulos em estágio tardio têm 15 centros necróticos circundados por um infiltrado celular inflamatório misto. Outras manifestações as quais podem ocorrer em artrite reumatoide inclu- em: pericardite, pleurite, arterite coronária, pneumonite intersticial com fibro- se pulmonar, ceratoconjuntivite seca, e nódulos reumatoides.
Artrite crônica juvenil é uma doença inflamatória idiopática crôni- 20 ca a qual frequentemente se inicia em menos de 16 anos de idade. Seu fe- nótipo tem algumas similaridades com RA; alguns pacientes os quais são positivos para reumatoide fator são classificados como artrite reumatoide juvenil. A doença é sub-classificada em três categorias principais: pauciarti- cular, poliarticular, e sistêmica. A artrite pode ser grave e é tipicamente des- 25 trutiva e leva a anquilose articular e crescimento retardado. Outras manifes- tações podem incluir uveíte anterior crônica e amiloidose sistêmica.
Espondiloartropatias são um grupo de distúrbios com algumas características clínicas comuns e a associação comum com a expressão do produto genético HLA-B27. Os distúrbios incluem: espondilite anquilosante, 30 síndrome de Reiter (artrite reativa), artrite associada com doença intestinal inflamatória, espondilite associada com psoríase, espondiloartropatia de iní- cio juvenil e espondiloartropatia indiferenciada. Características diferenciais incluem sacroileíte com ou sem espondilite; artrite assimétrica inflamatória; associação com HLA-B27 (um alelo sorologicamente definido do lócus HLA- B de MHC classe I); inflamação ocular, e ausência de autoanticorpos asso- ciados com outra doença reumatoide. A célula mais implicada como chave 5 para indução da doença é o linfócito T CD8+, uma célula a qual tem por alvo antígeno apresentado por moléculas MHC classe I. As células T CD8+ po- dem reagir contra a alelo HLA-B27 de MHC classe I como se fossem um peptídeo estranho expressado por moléculas MHC classe I. Foi sugerida a hipótese de que um epitopo de HLA-B27 pode simular um epitopo antigênico 10 bacteriano ou outro microbiano e deste modo induzir uma resposta de célu- las T CD8+.
A esclerose sistêmica (escleroderma) tem uma etiologia desco- nhecida. Uma característica da doença é induração da pele; ensaiovelmente isto é induzido por um processo inflamatório ativo. Escleroderma pode ser localizado ou sistêmico; lesões vasculares são comuns e lesão de células endoteliais na microvasculatura é um evento precoce e importante no de- senvolvimento de esclerose sistêmica; a lesão vascular pode ser imuno me- diada. Uma base imunológica é implicada pela presença de infiltrados de células mononucleares nas lesões cutâneas e a presença de anticorpos an- tinucleares em muitos pacientes. ICAM-1 é frequentemente regulado para cima sobre a superfície celular de fibroblastos em lesões de pele sugerindo que interação de células T com estas células pode ter um papel na patogê- nese da doença. Outros órgãos envolvidos incluem: o trato gastrointestinal: atrofia de músculos lisos e fibrose resultando em peristalse/motilidade anor- mal; rim: proliferação da íntima subendotelial concêntrica afetando artérias interlobulares e arqueadas pequenas com resultante fluxo sanguíneo cortical renal reduzido, resulta em proteinúria, azotemia e hipertensão; músculo es- quelético: atrofia, fibrose intersticial; inflamação; pulmão: pneumonite inters- ticial e fibrose intersticial; e coração: necrose de banda de contração, cicatri- zação/fibrose.
Miopatias inflamatórias idiopáticas incluindo dermatomiosite, po- Iimiosite e outras são distúrbios de inflamação muscular crônica de etiologia desconhecida resultando em fraqueza muscular. Lesão/inflamação muscular é frequentemente simétrica e progressiva. Autoanticorpos estão associados com a maioria das formas. Estas fitas autoanticorpos específicos de miosite são dirigidos contra e inibem a função de componentes, proteínas e RNA's, 5 envolvidos em síntese de proteína.
A síndrome de Sjogren é devida a inflamação imunomediada e destruição funcional subsequente das glândulas Iacrimais e das glândulas salivares. A doença pode estar associada com ou acompanhada por doen- ças inflamatórias do tecido conjuntivo. A doença está associada com produ- 10 ção de autoanticorpos contra Ro e La antígenos, ambos os quais são pe- quenos complexos de RNA-proteína. Lesões resultam em ceratoconjuntivite seca, xerostomia, com outras manifestações ou associações incluindo cirro- se biliar, neuropatia periférica ou sensorial, e púrpura palpável.
Vasculite sistêmica são doenças nas quais a lesão primária é inflamação e dano subsequente dos vasos sanguíneos o qual resulta em isquemia/necrose/degeneração para tecidos supridos pelos vasos afetados e eventual disfunção orgânica final em alguns casos. Vasculitides ambém po- dem ocorrer como uma lesão secundária ou seqüelas para outras doenças imuno-inflamatório mediadas tais como artrite reumatoide, esclerose sistêmi- ca, e etc., particularmente em doenças também associadas com a formação de complexos imunes. Deonças no grupo de vasculites sistêmicas primárias incluem: vasculite necrotizante sistêmica: poliarterite nodosa, angiite alérgica e granulomatose, poliangiite; granulomatose de Wegener; granulomatose linfomatóide; e arterite de células gigantes. Vasculitides diversas incluen: síndrome de Iinfonodos mucocutâneos (MLNS ou doença de Kawasaki), vasculite do sistema nervoso central isolada, doença de Behet, tromboangii- te obliterans (doença de Buerger) e venulite necrotizante cutânea. Acredita- se que o mecanismo patogênico da maioria dos tipos de vasculite listados seja devido essencialmente à deposição de complexos de imunoglobulina na parede dos vasos e subsequente indução de uma reação inflamatória quer por ADCC, ativação do complemento, ou ambos.
Sarcoidose é uma condição de etiologia desconhecida a qual se caracteriza pela presença de granulomas epitelióides em quase qualquer tecido no corpo; o envolvimento do pulmão é mais comum. A patogênese envolve a persistência de macrófagos ativados e células linfóides em sítios da doença com seqüelas crônicas subsequentes resultantes da liberação de 5 produtos localmente e sistemicamente ativos liberados por estas fitas tipos de células.
Anemia hemolítica autoimune incluindo anemia hemolítica auto- imune, pancitopenia imune, e hemoglobinuria noturna paroxísmica é um re- sultado da produção de anticorpos que reagem com antígenos expressados 10 sobre a superfície de células de hemácias (e em alguns cases outras células sanguíneas incluindo plaquetas também) e é um reflexo da remoção das células revestidas por anticorpo através de Iise mediada pelo complemento e/ou ADCC/mecanismos mediados por receptor de Fe.
Em trombocitopenia autoimune incluindo púrpura trombocitopê- nica, e trombocitopenia imunomediada em outras situações clínicas, destrui- ção de plaquetas/remoção ocorre como um resultado de ou anticorpo ou fixação de complemento a plaquetas e subsequente remoção por Iise do complemento, ADCC ou mecanismos mediados por receptor de FC.
Tiroidite incluindo doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroi- 20 dite linfocítica juvenil, e tiroidite atrófica, são o resultado de uma reação auto- imune contra antígenos tiroidianos com produção de anticorpos que reagem com proteínas presentes em e frequentemente específicas para a glândula tiroide. Existem modelos experimentais incluindo modelos espontâneos: ra- tos (ratos BUF e BB) e frangos (cepa de frango obeso); modelos indutíveis: 25 imunização de animais com ou tiroglobulina, antígeno microssômico tiroidia- no (peroxidase tiroidiana).
Diabete melito tipo I ou diabete insulino-dependente é a destrui- ção autoimune de células das ilhotas pancreáticas; esta destruição é media- da por autoanticorpos e células T autorreativas. Anticorpos para insulina ou o receptor de insulina também podem produzir o fenótipo de não responsivi- dade à insulina.
Doenças renais imuno mediadas, incluindo glomerulonefrite e nefrite tubulointersticial, são o resultado de lesão mediada por anticorpo ou por linfócitos T para tecido renal quer diretamente como um resultado da produção de anticorpos autorreativos ou células T contra antígenos renais ou indiretamente como um resultado da deposição de anticorpos e/ou com- 5 plexos imunes no rim que são reativos contra outros antígenos não-renais. Portanto outras doenças imuno mediadas que resultam na formação de complexos imunes também podem induzir doença renal imuno mediada co- mo algumas seqüelas indiretas. Tanto mecanismos imunes diretos quanto indiretos resultam em reação inflamatória que produz/induz o desenvolvi- 10 mento de lesão em tecidos renais com disfunção de função orgânica resul- tante e em alguns casos progressão para falência renal. Tanto mecanismos imunes humorais quanto celulares podem estar envolvidos na patogênese de lesões.
Acredita-se que doenças desmielinantes dos sistemas nervosos 15 central e periférico, incluindo esclerose múltipla; polineuropatia desmielinan- te idiopática ou síndrome de Guillain-Barré; e polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, tenham uma base autoimune e resultam em desmieli- nação nervosa como um resultado de dano causado para oligodendrócitos ou para mielina diretamente. Na esclerose múltipla há evidência sugerindo 20 que indução e progressão de doença sejam dependentes de linfócitos T. A esclerose múltipla é uma doença desmielinante que é dependente de linfóci- tos T e tem ou um curso relapsante-remitente ou um curso progressivo crô- nico. A etiologia é desconhecida; no entanto, infecções virais, predisposição genética, ambiente, e autoimunidade todos contribuem. Lesões contêm infil- 25 trados mediados predominantemente por linfócitos T, células microgliais e macrófagos infiltrantes; linfócitos CD4+T são o tipo celular predominante nas lesões. O mecanismo de morte celular de oligodendrócitos e subsequente desmielinação não é conhecido mas é provável que seja dirigido por linfóci- tos T.
Doença pulmonar inflamatória e fibrótica, incluindo pneumonia
eosinofílica; fibrose pulmonar idiopática, e pneumonite por hipersensibilidade podem envolver uma reação imune - inflamatória desregulada. A inibição da resposta seria de benefício terapêutico.
Doença de pele autoimune ou imunomediada incluindo doenças de pele bolhosas, eritema multiforme, e dermatite de contato são mediadas por autoanticorpos, cuja gênese é dependente de linfócitos T.
Psoríase é uma doença inflamatória mediada por linfócitos T. As
lesões contêm infiltrados de linfócitos T, macrófagos e células de processa- mento de antígenos, e alguns neutrófilos.
Doenças alérgicas, incluindo asma; rinite alérgica; dermatite ató- pica; hipersensibilidade alimentar; e urticária são dependentes de linfócitos T. Estas doenças são predominantemente mediadas por inflamação induzida por linfócitos T, inflamação mediada por IgE ou uma combinação de ambas.
Doenças associadas com transplante, incluindo rejeição a enxer- to e doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) são dependentes de linfóci- tos T; a inibição da função de linfócitos T é melhoradora.
Outras doenças nas quais intervenção da reação imune e/ou
inflamatória tem benefício são doença infecciosa incluindo mas não limitada a infecção viral (incluindo mas não limitada a AIDS, hepatite A, B, C, D, E e herpes), infecção bacteriana, infecções fúngicas, e infecções por protozoá- rios e parasitárias (moléculas (ou derivados/agonistas) as quais estimulam a 20 reação de linfócitos mistos podem ser utilizadas terapeuticamente para re- forçar a reação imune a agentes infecciosos), doenças de imunodeficiência (moléculas/derivados/agonistas) as quais estimulam a reação de linfócitos mistos podem ser utilizadas terapeuticamente para reforçar a reação imune para condições de imunodeficiência hereditária, adquirida, infecciosa induzi- 25 da (como em infecção por HIV), ou iatrogênica (isto é, como por quimiotera- pia), e neoplasia.
Foi demonstrado que alguns pacientes de câncer humano de- senvolvem uma reação de anticorpos e/ou linfócitos T a antígenos sobre cé- lulas neoplásicas. Também foi demonstrado em modelos animais de neopla- 30 sia que o reforço da reação imune pode resultar em rejeição ou regressão do neoplasma em particular. Moléculas que reforçam a reação de linfócitos T na reação de linfócitos mistos têm utilidade in vivo para reforçar a reação imune contra neoplasia. Moléculas as quais reforçam a reação proliferativa de linfó- ticos T na reação de linfócitos mistos (ou pequenos agonistas de moléculas ou anticorpos que afetaram o mesmo receptor em um modo agonístico) po- dem ser usadas terapeuticamente para tratar câncer. Moléculas que inibem 5 a reação de linfócitos na reação de linfócitos mistos também funciona in vivo durante neoplasia para suprimir a reação imune a um neoplasma; as molé- culas referidas podem ser ou expressadas pelas próprias células neoplási- cas ou sua expressão pode ser induzida pelo neoplasma em outras células.
O antagonismo de similares moléculas inibitórias (quer com anticorpo, pe- quenos antagonistas de moléculas ou outros meios) reforça rejeição tumoral imunomediada.
Adicionalmente, a inibição de moléculas com propriedades pró- inflamatórias pode ter benefício terapêutico em lesão por reperfusão; derra- me; enfarte do miocárdio; aterosclerose; lesão pulmonar aguda; choque he- morrágico; queimadura; sepse/choque séptico; necrose tubular aguda; en- dometriose; doença articular degenerativa e pancreatite.
Os compostos da presente invenção, por exemplo, polipeptídeos ou anticorpos, são administrados a um mamífero, preferencialmente um hu- mano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intra- 20 venosa como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tem- po, por vias intramuscular, intraperitoneal, espinhal intracerebral, subcutânea, intra-articular, intra sinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação (intranasal, intrapulmonar). É preferencial a administração intravenosa ou inalada de polipeptídeos e anticorpos.
Em terapia imunoadjuvante, outros regimes terapêuticos, tal co-
mo administração de um agente anticancerígeno, podem ser combinados com a administração das proteínas, anticorpos ou compostos da presente invenção. Por exemplo, o paciente a ser tratado com um imunoadjuvante da invenção também pode receber um agente anticancerígeno (agente quimio- 30 terápico) ou terapia de radiação. Esquemas de preparação e dosagem para similares agentes quimioterápicos podem ser usados de acordo com instru- ções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo profissional versado. Esquemas de preparação e dosagem para semelhante quimiotera- pia também são descritos em Chemotherapy Service. Ed., M.C. Perry, Willi- ams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O agente quimioterápico pode prece- der, ou seguir a administração do imunoadjuvante ou pode ser administrado 5 simultaneamente com o mesmo. Adicionalmente, um composto antiestrogê- nico tal como tamoxifeno ou uma antiprogesterona tal como onapristona (vi- de, a patente européia No. EP 616812) pode ser administrada em dosagens conhecidas para similares moléculas.
Pode ser desejável também administrar anticorpos contra outra doença imune associada ou antígenos associados tumorais, tais como anti- corpos os quais ligam a CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou fator endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou além disso, dois ou mais anticorpos ligando os mesmos ou dois ou mais diferentes antígenos descritos aqui, podem ser coadministrados ao paciente. Algumas vezes, po- de ser benéfico também administrar uma ou mais citocinas ao paciente. Em uma modalidade, os polipeptídeos IL-17A/F são coadministrados com um agente inibidor do crescimento. Por exemplo, o agente inibidor do cresci- mento pode ser administrado primeiro, seguido por um polipeptídeo IL-17A/F. No entanto, administração simultânea ou administração primeiro também é contemplado. Dosagens adequadas para o agente inibidor do crescimento são as presentemente usadas e podem ser reduzidas devido à ação combi- nada (sinergia) do agente inibidor do crescimento e do polipeptídeo IL-17A/F.
Para o tratamento ou redução na gravidade de doença imunorre- lacionada, a dosagem apropriada de um composto da invenção dependerá 25 do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou tera- pêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico do paciente e da reação ao composto, e do critério do médico assistente. O composto é administrado convenientemente ao paciente de uma vez ou durante uma série de trata- 30 mentos.
Por exemplo, dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 mg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de polipeptídeo ou anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao pacien- te, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar a partir de cerca de
1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.
5 Para administrações repetidas duranbte vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até ocorrer uma supressão desejada de sintomas de doença. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosa- gens. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e en- saios convencionais.
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S. Artigos de Produção
Em outra modalidade da invenção, é proporcionado um artigo de produção contendo materiais (por exemplo, compreendendo uma molécula IL-17A/F) úteis para o diagnóstico ou tratamento dos distúrbios descritos a- cima. O artigo de produção compreende um recipiente e uma instrução. Re- cipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascps, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente encerra uma composição a qual é eficaz para diagnosticar ou tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de in- jeção hipodérmica). O agente ativo na composição é geralmente um polipep- tídeo ou um anticorpo da invenção. Uma instrução ou rótulo sobre, ou asso- ciado com, o recipiente indica que a composição é usada para diagnosticar ou tratar a condição de escolha. O artigo de produção pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um tampão farma- ceuticamente aceitável, tal como salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de um ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso. T. Diagnóstico e Prognóstico de Doença Imunorrelacionada
Proteínas da superfície celular, tais como proteínas as quais são superexpressadas em algumas doenças imunorrelacionadas, são excelentes alvos para fármacos candidatos ou tratamento de doenças. As mesmas pro- 5 teínas junto com proteínas secretadas codificadas pelos genes amplificados em estados de doenças imunorrelacionadas encontram uso adicional no di- agnóstico e no prognóstico destas doenças. Por exemplo, anticorpos dirigi- dos contra os produtos protéicos de genes amplificados em esclerose múlti- pla, artrite reumatoide, distúrbio intestinal inflamatório, ou outra doença imu- 10 norrelacionada, podem ser usados como diagnósticos ou prognósticos.
Por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, podem ser usados para detectar qualitativamente ou quantitativamente a expressão de proteínas codificadas por genes amplificados ou superexpres- sados ("produtos genéticos marcadores"). O anticorpo preferencialmente é 15 equipado com um rótulo detectável, por exemplo, fluorescente, e a ligação pode ser monitorada por microscopia ótica, citometria de fluxo, fluorimetria, ou outras técnicas conhecidas na técnica. Estas técnicas são particularmen- te adequadas, se o gene superexpressado codificar uma proteina da super- fície celular. Os ensaios de ligação referidas são realizadas essencialmente 20 conforme descrito acima.
Pode ser realizada detecção de ligação de anticorpo in situ aos produtos genéticos marcadores, por exemplo, por imunofluorescência ou microscopia imunoeletrônica. Para este fim, uma amostra histológica é re- movida do paciente, e um anticorpo marcado é aplicado a esta, preferenci- 25 almente sobrepondo o anticorpo sobre uma amostra biológica. Este proce- dimento também permite determinar a distribuição do produto genético mar- cador no tecido examinado. Será evidente para os versados na técnica que uma ampla variedade de métodos histológicos estão prontamente disponí- veis para detecção in situ.
Os exemplos seguintes são oferecidos para fins ilustrativos so-
mente, e não se pretende que limitem o âmbito da presente invenção de qualquer modo. Todas as referências de patente e da literatura citadas na pre- sente especificação são por este incorporadas por meio de referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
Reagentes disponíveis comercialmente referidos nos exemplos
foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indi- cado de modo diverso. A fonte destas células identificadas nos seguintes exemplos, e do início ao fim da especificação, por números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EXEMPLO 1
Expressão Recombinante de uma Nova IL-17 Citocina Identificada como IL- 17A/F
Transfecção de células de rim humano 293 com vetores de ex- pressão de cDNA codificando IL-17 e IL-17F Células de rim humano 293 foram transfectadas com quantida-
des iguais de plasmídeos codificando os genes humanos IL-17, IL-17C e IL- 17F, usando um procedimento de precipitação de fosfato de cálcio. Para ca- da frasco 50% a 80% confluente T-150, 50 pg de cada plasmídeo foi mistu- rado para formar um precipitado para camada sobre as células. Um dia de- 20 pois de transfecção, 50:50 de F12:DMEM contendo 10% de FCS, 5 mM de L-glutamina, penicilina-estreptomicina foi removido e substituído com meio PS24 livre de soro e cultivado por um adicional de quatro dias. Depois de quatro dias, meio condicionado foi coletado centrifugado e filtrado estéril, antes de purificação.
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Purificação de IL-17 A/F recombinante
A. Fracionamento Inicial Etapa 1:
Dois litros e meio de meio condicionado IL-17A/F recombinante de culturas transitórias de células renais 293 humanas foi concentrado e dia- Iisado contra 20 mM de acetato de sódio, pH 5,0, 1 mM de azida de sódio (Tampão A) usando uma membrana de corte de 10 quilodaltons para um volume de 480 mililitros, em seguida aplicados a uma coluna Pharmacia Hi- Load S Sepharose 26/10 a 6 ml/min. A coluna foi elutriada com um gradiente linear até 100% de Tampão B (20 mM de acetato de sódio, 1 M de NaCI, 1 mM de azida de sódio, pH 5,0) em uma taxa de 1%/minuto com uma taxa de fluxo de 6 ml/min coletando frações de 12 ml. Foi realizada análise SDS 5 PAGE sobre as frações coletadas desta coluna. As proteínas foram descritas com tintura de prata. Marcadores de massa molecular são rotulados para as frações 25-37 contendo gel (Figura 2). As Frações 31 e 32 continham uma proteína com uma massa molecular aparente de aproximadamente 33 kD consistente com IL-17A/F.
B. Purificação de IL-17A/F:
Quatro ml da fração 32 (Figura 2) foi acidificado com 0,1% de ácido trifluoroacético e em seguida aplicado a 0,5 ml/min a uma coluna Vy- dac C4 equilibrada em 0,1% de ácido trifluoroacético (Tampão C) e gradien- te elutriado até 100% de Tampão D (0,1% de ácido trifluoroacético em 100% 15 de acetonirila) com um gradiente de três etapas (0 a 35% de D durante 10 minutos, 35 a 50% de D durante 35 minutos, 50 a 100% de D durante 10 minutos). A figura 2 mostra o cromatógrafo de proteínas elutriadas medido a 214 nm e 280 nm. O gradiente da etapa de acetonirila está revestido sobre o perfil. Foi visto que a concentração protéica da fração 38 é de 0,536 mg/ml 20 por análise de aminoácidos. Foram realizados ensaios de géis, blots, se- qüências de aminoácidos e de atividade sobre esta fração.
A Fração 31 e o volume remanescente da fração 32, da rodada de HiLoad S Sepharose foram reunidos e dialisados contra Tampão A por oito horas usando uma membrana de corte de 10 kD e passados através de 25 um filtro de 0,2 micron. Este material foi carregado sobre uma coluna Mono S equilibrada em Tampão A em uma taxa de fluxo de 1 ml/min e elutriado com um gradiente de três etapas até 100% de Tampão B (0 a 30% de B so- bre 10 volumes de coluna, 30 a 75% de B sobre 45 volumes de coluna, 75 a 100% de B sobre 10 volumes de coluna) enquanto coletando 1 ml/ fração. 30 As frações 26 a 43 foram testadas e as concentrações de proteína foram determinadas por análise de aminoácidos. A concentração das frações 31, 32 e 33 foram de 0,258, 0,359 e 0,291 mg/ml, respectivamente. Foram reali- zados testas fitas de géis, blots, seqüência de aminoácidos, espectrofotome- tria de massa e de atividade essencialmente sobre a fração 32 e a 33. As frações geradas por cromatografia foram testadas para teor de IL-17 e IL- 17F através do uso de Western blotting. Um pg/ml de anticorpo monoclonal 5 dirigido contra quer IL-17 quer IL-17F foi usado para detectar a presença de ou IL-17 ou IL-17F nas amostras.
Análise por Espectrometria de Massa de IL-17A/F A seqüência de aminoácidos e ligações de dissulfeto intercadei- as de IL-17A/F maduro foram determinadas por análise por espectrometria de massa (vide a Figura 4A; polipeptídeo heterodimérico IL-17A/F mostrado com ligações de dissulfeto intercadeia e intracadeia). Duas ligações de dis- sulfeto intercadeias foram detectadas entre as cadeias de polipeptídeos IL- 17F e IL-17 [entre o resíduo 47|L-i7f e o resíduo 129il-i7! e entre o resíduo 137|L-i7f e o resíduo 33|L-17, respectivamente (linhas pretas em negrito na Figura 4A). Além disso, duas ligações de dissulfeto intracadeia formam em cada uma das cadeias de polipeptídeo homodimérico IL-17 [entre os resí- duos 102 e 152; e entre os resíduos 107 a 154] e IL-17F [entre os resíduos 94 e 144; e entre os resíduos 99 e 146] (linhas pretas claras na Figura 4A). Os aminoácidos são numerados com relação à metionina de iniciação em cada cadeia de polipeptídeo precursor (Figura 4A). A figura 4B mostra um diagrama esquemático dos fragmentos do peptídeo IL-17A/F contendo liga- ções de dissulfeto entre a cadeia IL-17 e a IL-17F que seriam previstas por digestão do IL-17A/F com tripsina [fragmento de ligação de dissulfeto IL- 17A/F no. 1 é designado como SEQ ID NO: 7; fragmento de ligação de dis- sulfeto IL-17A/F no. 2 é designado como SEQ IDNO: 8, respectivamente]. Os aminoácidos contidos dentro destee fragmentos são indicados e nume- rados em relação à metionina de iniciação de cada cadeia.
A massa molecular aproximada calculada destas fitas fragmen- tos que seria observada por espectrometria de massa é mostrada na Figura 4B como 3410,58 Da e 2420,05 Da [fragmento de ligação de dissulfeto IL- 17A/F no. 1 e no. 2 respectivamente]. Foi realizado mapeamento peptídico de dessorção/ionização a laser assistida por matriz -espectrometria de mas- sa de tempo de vôo (MALDI-TOF) (Figura 4C). 55 pmol de IL-17A/F em um tampão de 400 mM de NaCI1 20 mM de tampão de NaOAC pH 5 foi digerido de um dia para o outro a 37EC com tripsina de grau de sequenciamento da Promega. Foi realizada dessorção/ionização a laser assistida por matriz - espectrometria de massa de tempo de vôo (MALDI-TOF) com extração re- tardada em modo de reflectron iônico positivo usando uma matriz de 2', 4', 6'-triidroxiacetofenona. O mapa peptídico resultante continha picos com [M+H]+ = 2420,12 Da para o fragmento no. 2 e 3410,60 Da para o fragmento no. 1, consistentes com os peptídeos encadeados por dissulfeto (Figura 4C). Uma segunda alíquota da amostra foi digerida em pH 8 depois de redução de ligações de dissulfeto com ditiotreitol e alquilação de grupos sulfidrila com iodoacetamida. O espectro MALDI-TOF desta amostra careceu dos picos em questão, corroborando sua atribuição como ligado por dissulfeto. A amostra não-reduzida foi adicionalmente caracterizada por cromatografia líquida com ionização por electrospray de trap iônico acoplada a espectrometria de mas- sa (LC-ESI-MS) (Figura 4D). Os cromatogramas iônicos representam (de cima para baixo) o cromatograma iônico total, cromatograma iônico recons- truído (RIC) do fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 2 [M+2H]2+, e fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 1 [M+2H]3+. Picos consis- tentes com ambos os heterodímeros foram observados ao passo que não foram observados picos acima do ruído químico de pano de fundo nas mas- sas anticipadas dos peptídeos homodiméricos deste modo indicando a au- sência dos homodímeros IL-17 ou IL-17F. A composição dos heterodímeros ligados por dissulfeto foi em seguida confirmada por espectrometria de mas- sa in tandem. Dissociação induzida por colisão do precursor duplamente car- regado em m/z 1210,9 correspondeu ao fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 2 e o precursor triplamente carregado em m/z 1138,0 corres- ponde ao fragmento de ligação de dissulfeto IL-17A/F no. 1. Os picos dos fragmentos séries b- e y-iônicas previstos foram observados nos espectros correspondentes.
Triagem de Biblioteca de Fago para Anticorpos que Ligam a IL-
17 A/F De modo a identificar anticorpos os quais ligam a IL-17A/F, foi triada uma biblioteca de fago de anticorpos Fab sintéticos. Trinta e quatro (34) clones independentes codificando seqüências de anticorpos Fab distin- tas foram identificadas, os quais tâm capacidade de mediar ligação a IL- 5 17A/F. A biblioteca de fago de seqüências de anticorpos humanos foi prepa- rada e triada para antígeno Fab específico em uma maneira similar à previ- amente descrita (Gerstner, R. B. et al., J. Mol. Biol., 321(5): 851-62 (2002). Em resumo, o anticorpo humanizado monoclonal 4D5, um anticorpo anti- HER2, foi usado como um andaime para construir bibliotecas de Fab apre- 10 sentados por fago. Estas fitas Fab são apresentados sobre o fago de modo monovalente e/ou de modo divalente por fusão a um ziper de Ieucina homo- dimerizável. Para gerar diversidade de biblioteca, nós escolhemos randomi- zar resíduos CDR de cadeia pesada expostos superficialmente que também foram considerados como sendo altamente diversos no banco de dados Ka- 15 bat de seqüências de anticorpos naturais e formam um trecho contíguo. A- lém disso, nós usamos mutagênese sítio-dirigida com códons degenerados personalizados para gerar diversidade de aminoácidos que simularam o re- pertório imune natural em cada sítio de CDR. Aos primeiros dois CDR de cadeia pesada, H1 e H2, foi permitida limitada diversidade da mesma exten- 20 são que Herceptina, ao passo que H3 é designado para ter alta degeneração com extensão variaram de 7 a 19. Todos os anticorpos gerados a partir da seleção da biblioteca inicial têm a cadeia leve idêntica. IgG ou Fab de ex- tensão total podem ser gerados por clonagem de uma etapa do domínio va- riável de cadeia pesada em vetores proporcionando a seqüência de região 25 constante isotipo específica desejada. Para aumentar adicionalmente a afi- nidade de Iigantes da biblioteca de cadeia pesada, pode ser empregada uma randomização de segunda etapa de CDRs de cadeia leve. A seqüência de aminoácidos da região do domínio variável das cadeias pesadas que contém as três (3) CDRs [H1-H3] de Fab que ligam IL-17A/F são mostradas na Figu- 30 ra 6. É mostrado o alinhamento de uma região da seqüência de aminoácidos prevista de 34 clones de Fab que codificam seqüências de cadeia pesada de anticorpos distintos que têm capacidade de ligar a IL-17A/F. As três regiões CDR de cadeia pesada são indicadas como CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente são sombreadas. O NO de SEQ ID correspondente para cada clone é como se segue:
Clone no. 1 = SEQ ID NO: 9; Clone no. 2 = SEQ ID NO: 10; Clone no. 3 = SEQ ID NO: 11; Clone no. 4 = SEQ ID NO: 12; Clone no. 5 = SEQ ID NO: 13; Clone no. 6 = SEQ ID NO: 14; Clone no. 7 = SEQ ID NO: 15; Clone no. 8 = SEQ ID NO: 16; Clone no. 9 =SEQ ID NO: 17; Clone no. 10 = SEQ ID NO: 18; Clone no. 11 = SEQ ID NO: 19; Clone no. 12 = SEQ ID NO: 20; Clone no. 13 = SEQ ID NO: 21; Clone no. 14 = SEQ ID NO: 22; Clone no. 15 = SEQ ID NO: 23; Clone no. 16 = SEQ ID NO: 24; Clone no. 17 = SEQ ID NO: 25; Clo- ne no. 18 = SEQ ID NO: 26; Clone no. 19 = SEQ ID NO: 27; Clone no. 20 =SEQ ID NO: 28; Clone no. 21 = SEQ ID NO: 29; Clone no. 22 = SEQ ID NO: 30; Clone no. 23 = SEQ ID NO: 31; Clone no. 24 = SEQ ID NO: 32; Clo- ne no. 25 = SEQ ID NO: 33; Clone no. 26 = SEQ ID NO: 34; Clone no. 27 = SEQ ID NO: 35; Clone no. 28 = SEQ ID NO: 36; Clone no. 29 = SEQ ID NO: 37; Clone no. 30 = SEQ ID NO: 38; Clone no. 31 = SEQ ID NO: 39; Clone no. 32 = SEQ ID NO: 40; Clone no. 33 = SEQ ID NO: 41; Clone no. 34 = SEQ ID NO: 42, respectivamente.
Além disso, as seqüências de DNA codificantes correspondentes para cada um dos trinta e quatro (34) clones são mostradas na Tabela 7 a- baixo (SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 76, respectivamente).
Tabela 7 SEQ ID NO: 43:
TT GT CCT GT GCAG CTT CTG G CTT CACCATT AGT GATT CCG CTAT ACACT G 25 GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGGGATTA CT CCTT AT AGCGGTT AT ACT GACT ATGCCG AT AGCGT CAAGGGCCGTTT CACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCAAAAGAGGCCC GCGAGGGCTACGACGTCGGCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA 30 SEQ ID NO: 44:
TT GT CCT GTGCAGCTT CTGGCTT CACCATT AGT GATT CCT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGAAATTTC TCCTCCTGGCGGCGATACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAG CG CAG ACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA G CTT AAG AG CT G AG G ACACT G CCGTCT ATT ATT GTG CTCGTCT CTT GTG GTGGTGGGACGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 45:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTG G CTT CACCATT ACT AATACTT G G AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGTTATTAC TCCTTATGGCGGTGCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA 10 G CTT AAGAG CT G AG G ACACT G CCGTCT ATT ATT GTG CAAG AG AG AGT AT GTGGAGT AAGTT CGACTACTGGGGT CAA SEQ ID NO: 46:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTG G CTT CACCATT AAT AGTT CT G CT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTATATTAC 15 TCCTGAT AACGGT GAT ACT AACTAT G CCG AT AGCGT CAAG GG CCGTTT C ACT AT AAG CGCAG AC ACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAATAGCTGAGGATACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGGCCACGG CAACTTCTACGGTACCTGGGCGGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 47:
TT GT CCT GTGCAGCTT CTGGCTT CACCATT AGTGGTT CT GAT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTATATTAA TCCTTATGGCGGTTCTACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCT GAGGACACTGCCGT CT ATTATT GTGCT CGTGCGT ACGA 25 G ATGTG GTACGTTATG GACT ACT G G G GT CAA SEQ ID NO: 48:
TTGTCCT GTGCAGCTT CTGG CTT CACCATT ACT AATT CCTGG AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGTTATTAC TCCTTCTAGCGGTTCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC 30 ACT AT AAG CG CAG AC ACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGTCTT CCCCGACATCGGGGACTGCAGCAACGCCTACTGCTACGCTATGGACTA CTGGGGTCAA SEQ ID NO: 49:
TTGT CCT GT GCAGCTUTGGCTT CACCATT ACT AGT ACTT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTC 5 TCCTTATAGCGGTTAJfcTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAG ACteATCCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGUeACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTGAGGTGG GGTGGGGGGACTCG»CGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 50:
TT GT CCT GTGCAGCTCTGGCTT CACCATT AGTGGTT CTT GGAT ACACT
GGGTGCGTCAGGCCÍCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGGGATT
TATCCTTATGACGGTÜTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTT
CACTATAAGCGCAG/SCACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAAC
agcttaagagctgaqbacactgccgtctattattgtgctcgtgaggccg agggcctgtaccagi®cgggatctacgacgcgggtatggactactggg GTCAA SEQ ID NO: 51
TTGTCCTGTG CAG CTfCTGGCTT CACCATT ACT AGTT ACT AT AT ACACT G
GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTA 20 TCCTGCTGACGGTGCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAG AGCTG AGGACACTGCCGTCT ATT ATTGTGCTCGT GGGT CCT A CTTCGGGGGCT ACGATATGG ACT ACT GGGGT CAA SEQ ID NO: 52:
TT GT CCTGT GCAGCTT CTGGCTT CACCATT AAT GATT CT GAT AT ACACT G
GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTATTATTTA TCCTTATGACGGTTATAGTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCT ACAAAT GAACA GCTT AAGAGCT G AGGACACTGCCGT CT ATT ATT GTGCAAG AAGCAACCT 30 GGACAACAACTTGTTCGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 53
TTGTCCTGTG CAG CTTCTGGCTT CACCATT AAT G GTT ACTG G AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTGATATTAA TCCTAATGGCGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAG CG CAG ACACAT CC AAAAAC AC AG CCT ACCT ACAAAT GAACA G CTT AAGAGCT GAGG ACACTGCCGT CT ATT ATT GTGCT CGTGCCT ACCG 5 GTGCGGCGGGCTCGCCGACTGGGCCGGGGCTATGGACTACTGGGGTC AA
SEQ ID NO: 54:
TT GT CCT GT GCAGCTT CT GGCTT CACCATT AGTGGTT CTT GGAT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTATTATTA 10 CTCCTTCTGGCGGTAATACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTT CACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAAC AG CTT AAG AG CT G AG G ACACT G CCGTCT ATT ATT GTG CTCGT G AG GT CT TCGCCGTGTCGACCGCCGGCTACCCCTGGGTTATGGACTACTGGGGTC AA
SEQ ID NO: 55:
TT GT CCT GTGCAGCTT CTGGCTT CACCATT ACT GATT CTTGGATACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTCTATTAC T CCTTATAACG GT AAT ACT GACT ATGCCGATAGCGT CAAG GGCCGTTT C ACT AT AAG CG CAG ACACAT CC AAAAAC AC AG CCT ACCT ACAAAT GAACA 20 GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCAGGGGGG AGTCCGACGAGGCCTACGCCGCGGTTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 56:
TT GT CCT GTGCAGCTT CT GGCTT CACCATT AGT AGTT CCGAT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTACTATTAA 25 TCCTGCTAGCGGTTCTACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAG CG CAG ACAC AT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGGCGCCA ACAGCAGCTTCTACGCGCTCCAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 57:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTGG CTT CACCATT ACTGAT AATT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTGGATTTC TCCTTATAGCGGTTATACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCT GAGGACACTGCCGT CTATTATT GTGCT CGT GAGACCCT CTT CT ACG ACAAG G ACC AGT ACT CCT ACGTT ATGGACTACTGGGGT CAA SEQ ID NO: 58:
5 TTGTCCTGT GCAGCTT CTG G CTT CACCATT AGT AGTT CTT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTC TCCTTATAGCGGTTATACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA G CTT AAGAG CT G AG G ACACT G CCGTCT ATT ATT GT G CTCGT GAG G G GCT 10 CCTGCGGTGGGGCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 59:
TTGTCCTGT GC AG CTT CTG G CTT CACCATT ACT GAT AAT G GG AT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTGGATT ACT CCT ACTAGCGGTT AT ACT AACT ATGCCGAT AGCGT CAAGGGCCGTT 15 T CACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAA CAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTG CTCG CG ACG G GGACACCT GGAAGT GGG ACGCCCCGT ACGTT AT GGACT ACT GGGGT CA A
SEQ ID NO: 60:
TT GT CCT GT G CAGCTT CTG G CTT CACCATT ACT AAT ACTT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTC T CCTT ATAGCG GTTATACT GACT ATGCCGATAGCGT CAAG G ACCGTTT C ACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACA GCTT AAGAGCT GAGGACACT GCCGT CT ATT ATT GTGCT CGCGAG AT CTT 25 GCTGGACTACGGTTCCGCGGGCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO: 61:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTACTAGTACCTGGATACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGTTATTA CTCCTACTAACGGTTCTACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTT 30 CACT AT AAG CG C AG AC AC AT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGAGGTGT GGTGGTGGGGCGACGGCCACGGCTACGTTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 62:
TT GT CCTGTG CAG CTT CT GGCTT CACCATT AGT AGTT CTGCT AT ACACTG GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGGGATTA CTCCTGCTAGCGGTTATACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTT 5 CACT AT AAG CG CAG ACACATCC AAAAACAC AG CCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCTCGCCCG GCGGGGTGTTCGTCGACGGCGGGGTTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 63:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTGGCTT CACCATT AAT AGT ACTGAT AT ACACTG 10 GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGATTAA TCCTTCTGGCGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCAGCGC GTACACCACGT GGGCGGT CGACT GGTT CAT CGGCT ACGTT ATGG ACT A 15 CTGGGGTCAA SEQ ID NO: 64:
TT GT CCT GT GCAGCTT CT GGCTT CACCATT ACT GGTT ACGGGAT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTT CT CCTT CT AACGGTT AT ACTT ACT ATGCCG AT AGCGT CAAG GGCCGTTT 20 CACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTCGCGTCA GCTACTACGTCTACAGGCACGACTGGGTCAGGGGCTACGTTATGGACT ACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 65:
TT GT CCT GTGCAGCTT CTGGCTT CACCATT ACT GAT ACCTGG AT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGTTATTA CT CCTTAT GGCGGTTATACTTACTATGCCGATAGCGT CAAGGGCCGTTT CACT AT AAG CG CAG ACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAAC AG CTT AAG AG CT G AG G AC ACT G CCGTCT ATT ATT GTG CAAG AG ACG G G 30 G G CTT CTT CGATT ACTG GG GT CAA SEQ ID NO: 66:
TT GT CCT GTGCAGCTT CTGGCTT CACCATT AGT GATT CCT CT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTTTATTTA TCCTACT AG CG GTT CT ACTT ACT AT G CCAAT AGCGT CAAG G G CCGTTT C ACT AT AAG CG CAG AC ACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCACGTGCCTCGTA 5 CGGGGT GAG CAAGTG G ACCTTT GACTACTGGGGT CAA SEQ ID NO: 67:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTG G CTT CACCATT ACT G GTT ACGG G AT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTT CTCCTTCTAACGGTTATACTTACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTT 10 CACT AT AAG CGCAT ACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTCGCGTCA GCTACTACGTCTACAGGCACGACTGGGTCAGGGGCTACGTTATGGACT ACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 68:
TTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCATTACTGGTACTTATATACACTG GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTC TCCTTATAGCGGTTATACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCAAGAGAGGCCC 20 GCTCCTCGTTGAGCGCGGACTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO: 69:
TTGTCCT GT G CAG CTT CTG G CTT CACCATT ACT GAT AATT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTTC T CCTT AT AG CG GTT AT ACTT ACT ATGCCGATAGCGT CAAG G G CCGTTT C 25 ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA GCTT AAGAGCT GAGGACACTGCCGT CTATT ATT GT GCT CGT GAGT CCGG CTTCTCCGCGTGCAACACGCGGGCGTACGCTATGGACTACTGGGGTCA A
SEQ ID NO: 70:
TTGTCCTGTG CAG CTT CTG G CTT CACCATT ACT GATT CTT G G AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTCTATTAC T CCTTAT AACGGT AAT ACT GACT AT G CCGAT AGCGT CAAGGG CCGTTT C ACT AT AAG CG C AG ACAC AT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCAGGGGGG AGT CCG ACGAGGCCT ACCCCGCGGTT AT GGACTACTGGGGT CAA SEQ ID NO: 71:
5 TT GT CCT GT GCAGCTT CTGGCTT CACCATT ACT AGT ACCGCT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTAC TCCTTATGACGGTTATACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAG CG CAG ACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACT AAT GAACA G CTT AAGAGCT G AGG ACACT G CCGTCT ATT ATT GTG CTCGT ACGTGGTT 10 CACGCTGGCCTCGGCTATGGAACTACTGGGGTCAA
SEQ ID NO: 72:
TTGTCCTGT GCAG CTT CTG G CTT CACCATT ACT GGT AAT G GG AT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTT CT CCT ACT AACGGTT CT ACTT ACT ATG CCG AT AG CGT CAAG GGCCGTTT 15 CACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTAGGGTCG ACTACCAGGT CT ACCACGACCGCTT CGAGGAGGGGTACGCTAT GGACT ACTGGGGTCAA
SEQ ID NO: 73:
TT GT CCTGTG CAG CTT CTG G CTT CACCATT AAT AGTT ATT GGAT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTGGATTTC TCCTGATAACGGTGCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC ACT AT AAG CGCAG ACAC ATCCAAAAACAC AG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTT AAGAGCT GAGGACACTGCCGT CT ATT ATT GT GCTCGT AAGTT CT G 25 GGGCTGGGACTGGGGGGGTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 74:
TT GT CCT GT GCAGCTT CTGGCTT CACCATT AGT GATT CTT AT AT ACACT G GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTGATATTAC TCCTACTGACGGTTATACTGACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTC 30 ACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAACA G CTT AAGAGCT GAGGACACTGCCGT CT ATT ATT GTGCT CGT AACTT GAT GTGGTGGGACTCGTCGGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 75:
TT GT CCT GT GCAGCTT CTGGCTT CACCATT AGT GATT CTGGGAT ACACT GGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTTTTATTT AT CCT AAT GGCGGTT CT ACTTACT AT GCCGAT AGCGT CAAGGGCCGTTT 5 CACT AT AAGCGCAGACACAT CCAAAAACACAGCCT ACCT ACAAAT GAAC AGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGTATGTCGT TGATCGGGTTCTCGTACGCTATGGACTACTGGGGTCAA SEQ ID NO: 76:
TTGTCCTGT GCAGCTT CTG G CTT CACCATT AAT AGT ACCT G G ATACACTG 10 GGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCTTGGATTAA T CCTT AT AACGGTT CT ACTT ACT ATGCCGAT AGCGT CAAGGGCCGTTT C ACT AT AAG CG CAG ACACAT CCAAAAACACAG CCT ACCT ACAAAT GAACA GCTT AAGAGCT GAGGACACTGCCGT CT ATT ATT GTGCAAGAGACTT GTA CGACT ACGACAT CGGCTT CGACT ACT GGGGT CAA 15 Ensaios Celulares - IL-17A/F Induz a produção de IL-8 e IL-6
Frações isoladas da etapa de purificação Vydac C4 descrita a- cima (Figura 3) foram testadas para a capacidade de IL-17A/F para induzir a produção de IL-8. As frações foram testadas por incubação com células TK- 10 por 24 horas (fração de 0,033 microlitros/ml de meio de cultura celular). 20 Meio condicionado foi em seguida coletado e foram realizadas medições da concentração de IL-8 e IL-6 sobre cada fração por ELISA. Foi visto que a Fração 38 tinha atividade robusta. Foi visto que a concentração de proteína da fração 38 tem 0,536 mg/ml por análise de aminoácidos. Foram realizados ensaios de féis, blots, seqüência de aminoácidos e de atividade sobre esta 25 fração (Figura 3). Alternativamente, a fração 31 e o volume remanescente da fração 32, da rodada HiLoad S Sepharose foram reunidos e dialisados con- tra Tampão A por oito horas usando uma membrana de corte de 10 kD e passados através de um filtro de 0,2 micron. Este material foi carregado so- bre uma coluna Mono S equilibrado em Tampão A em uma taxa de fluxo de 30 1 ml/min e elutriado com um gradiente de três etapas para 100% de Tampão B (0 a 30% de B sobre 10 volumes de coluna, 30 a 75% de B sobre 45 vo- lumes de coluna, 75 a 100% de B sobre 10 volumes de coluna) ao mesmo tempo que coletando 1 ml/ fração. As Frações 26 a 43 foroam testadas e foram determinadas as concentrações de proteína por análise de aminoáci- dos. IL-17A/F puro foi identificado nas frações 31 a 33 como uma única pro- teína com massa molecular aparente de 30 a 35 kD. As concentrações das 5 frações 31, 32 e 33 foram de 0,258, 0,359 e 0,291 mg/ml, respectivamente. Análise de géis e de seqüência de proteínas mostraram que este material é idêntico a IL-17A/F purificado por coluna de C4 (acima). Curvas de dose resposta comparando indução de IL-8 e IL-6 por IL-17A/F, IL-17 e IL-17F são mostradas na Figura 5. IL-17A/F, IL-17 e IL-17F foram incubados com célu- 10 Ias TK-10 nas concentrações indicadas por 24 horas. Meio condicionado com TK-10 foi coletado e analisado por IL-8 ELISA e IL-6 ELISA.
Discussão
A coexpressão de mRNA para IL-17 e IL-17F leva à secreção de uma nova espécie de proteína que é capaz de ligar tanto com alguns anti- corpos que são capazes de ligar a IL-17 quanto com alguns anticorpos que são capazes de ligar a IL-17F. Esta nova espécie de proteína é designada aqui, como interleucina-17A/F (IL-17A/F). Esta proteína não é observada quando células 293 renais humanas são produzidas paa expressar quer IL- 17 quer IL-17F em isolamento. Meio condicionado de células transfectadas foi imunoprecipitado (IP) utilizando anticorpos que são capazes de reconhe- cer IL-17 (alamedas 1-5) ou IL-17F (alamedas 6-10) conforme mostrado na Figura 1A e na Figura 1B. Proteínas imunoprecipitadas foram em seguida ressolvidas por análise Western blot e blotted com anticorpos para IL-17 (Fi- gura 1A) ou IL-17F (Figura 1B). A detecção de IL-17A/F é indicada na ala- meda 8 da Figura 1A e na alameda 3 da Figura 1B pela presença de IL-17 em complexo dimérico com IL-17F. A massa molecular desta espécie, con- forme determinado por SDS-PAGE não-redutor é de aproximadamente 30- kD, consistente com a espécie consistindo em uma molécula de IL-17 e uma molécula de IL-17F unida por ligação covalente. A existência desta no- va espécie (IL-17A/F) também pode ser reconhecida como proteína de mobi- lidade eletroforética que é distinta da observada quando quer IL-17 quer IL- 17F é expressado em isolamento. Deste modo, esta nova espécie também pode ser visualizada sem o uso de anticorpos através do uso de outros mé- todos de detecção de proteína tais como técnicas de tintura de proteína con- vencionais.
A existência de uma nova espécie de proteína produzida por co- 5 expressão de IL-17 e IL-17F também foi observada resolvendo as proteínas secretadas presentes em meio condicionado com cromatografia de fase re- versa. A comparação das frações de proteína observadas das proteínas se- cretadas produzidas por células coexpressando IL-17 e IL-17F com os pa- drões observados com células produzindo quer IL-17 quer IL-17F revelou a 10 presença de uma espécie de proteína adicional. Esta espécie de proteína, IL-17A/F, foi purificada e isolada para homogeneidade por cromatografia de coluna (Figuras 2 e 3).
Proteína purificada correu como uma única banda de aproxima- damente 30 a 35 kD conforme determinado por SDS-PAGE não-redutor (Fi- 15 gura 3A). No entanto, sob condições redutoras foram descritas duas bandas claramente distintas com uma massa molecular aparente de aproximada- mente 15 a 18 kD (não-mostrada). Portanto, IL-17A/F é um dímero covalente. Um meio independente para avaliar a composição da nova proteína, análise de seqüência de peptídeos de N-terminal, também indicou claramente que o 20 IL-17A/F isolado contém tanto IL-17 quanto peptídeos IL-17F (Figura 3B). As seqüências de peptídeos detectadas são idênticas à seqüência contida den- tro da extremidade N-terminal de IL-17 e IL-17F (Figura 3C). Análide Wes- tern Blot indicou que esta nova espécie proteína também é capaz de intera- gir tanto com um anticorpo que é capaz de ligar a IL-17 e com um anticorpo 25 que é capaz de ligar a IL-17F. Cada uma destas observações e a massa molecular distinta da nova espécie de proteína isolada sugere que a proteína IL-17A/F isolada é uma nova espécie de proteína consistindo em uma asso- ciação covalente de IL-17 e IL-17F.
A existência e a localização das ligações de dissulfeto que ligam as cadeias IL-17 e IL-17F de IL-17A/F foram adicionalmente caracterizadas por uso de espectrometria de massa. A posição de ligações de dissulfeto dentro de IL-17A/F é mostrada no diagrama esquemático da Figura 4A. Du- as ligações de dissulfeto intercadeias ligam as cadeias IL-17 e IL-17F em IL- 17A/F. Se esperaria que a digestão de IL-17A/F com tripsina produza dois fragmentos de peptídeos distintos contendo as ligações de dissulfeto inter- cadeias (ligação de dissulfeto IL-17A/F fragmento no. 1 e no. 2; SEQ ID 5 NOs: 7 e 8, respectivamente. Estas fitas peptídeos são apresentados es- quematicamente (Figura 4B) junto com a massa molecular prevista respecti- va. Estas fitas peptídeos foram observados por dessorção/ionização a laser assistida por matriz -espectrometria de massa de tempo de vôo (MALDI- TOF) (Figura 4C) e por cromatografia líquida com ionização por electrospray 10 de trap iônico acoplada a espectrometria de massa (LC-ESI-MS) (Figura 4D). Não foram detectados picos peptídicos correspondentes a homodímeros de IL-17 ou IL-17F, indicando que o IL-17A/F purificado consistia de heterodí- meros covalentes de cadeias IL-17 e IL-17F e não continham níveis detectá- veis de homodímeros de ou IL-17 ou IL-17F.
Além disso, anticorpos os quais a IL-17A/F foram identificados
por triagem de uma biblioteca de fago de anticorpos Fab sintéticos. Foram identificados trinta e quatro (34) clones independentes codificando seqüên- cias de anticorpos Fab distintas. As quais foram capazes de mediar ligação a IL-17A/F. As seqüências de aminoácidos da região do domínio variável das 20 cadeias pesadas que contém os três (3) CDRs [H1-H3] de Fab que ligam IL- 17A/F são mostradas na Figura 6. É mostrado o alinhamento de uma região da seqüência de aminoácidos prevista de 34 clones Fab que codificam se- qüências de cadeia pesada de anticorpos distintos que são capazes de ligar a IL-17A/F. As três regiões CDR de cadeia pesada são indicadas como 25 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente são salientados em amarelo. As seqüências de aminoácidos correspondentes para cada um dos trinta e quatro (34) clones são identificadas como SEQ ID NOs: 9 a 42. Além disso, as seqüências de DNA codificantes correspondentes para cada um dos trinta e quatro (34) clones identificados são mostradas na Tabela 7 abaixo (SEQ 30 ID NO: 43 a SEQ ID NO: 76, respectivamente). Portanto, foram identificados anticorpos específicos os quais ligam seletivamente ao novo complexo hete- rodimérico de IL-17A/F os quais podem servir para modular a atividade desta nova citocina.
IL-17A/F foi analisado para capacidade de estimular uma reação pró-inflamatória usando a linhagem de células renais humanas TK-10 (Figu- ra 5). Esta linhagem celular responde tanto a IL-17 quanto a IL-17F por pro- 5 dução de IL-8. IL-17A/F também induziu robustamente a produção de IL-8 nesta linhagem celular (Figura 5A). Interessantemente, se observou que IL- 17A/F tem uma única potência que difere da de ou IL-17 ou IL-17F. A dife- rença na atividade difere de IL-17 e IL-17F por cerca de uma ordem de mag- nitude em cada caso. A atividade substancialmente maior de IL-17A/F do 10 que IL-17F neste teste sugere que IL-17A/F pode compreender um compo- nente crucial da atividade de citocina resultante do produto genético de IL- 17F. Esta potência única pode permitir que a molécula possua série de a- ções distintas in vivo. IL-17A/F também induziu a produção de IL-6 a partir desta linhagem celular (Figura 5B). Adicionalmente, é provável que IL-17A/F 15 possa possuir características adicionais não presentes ou em IL-17 ou em IL-17F como um resultado de sua nova composição heterodimérica que po- de alterar a cinética e utilização de subunidades receptoras in vivo, resultan- do em conseqüências biológicas únicas.
EXEMPLO 2
Identificação de uma Nova Citocina IL-17 Produzida em Células T Humanas Ativadas
Uma nova citocina humana IL-17 (aqui, identificada como IL- 17A/F humana) é descrita aqui, pela primeira vez como sendo naturalmente produzida em células de linfócitos T humanos ativados. O isolamento e a 25 ativação de células de linfócitos T humanos foi relizado e a produção de IL- 17A/F foi detectada e medida quantitativamente por IL-17A/F ELISA confor- me demonstrado abaixo:
Isolamento e Ativação de Células T Humanas Sangue humano recém-colhido heparinizado (0,5 ml/50 cc) de um doador saudável normal foi diluído a 1:1 com solução salina fisiológica, em seguida aplicado sobre Meio de Separação de Linfócitos LSM (ICN) e centrifugado conforme recomendado pelo fabricante (ICN). Linfócitos mono- nucleares recuperados foram laminados em frascos de cultura de tecido em RPMI completo (RPMI, 10% de FCS1 2 mM de L-Glutamina, Penicili- na/Estreptomicina (GIBCO)), por uma hora a 37 graus C para fazer a deple- ção de monócitos. Os sobrenadantes da cultura foram centrifugados para peletizar as células remanescentes. Linfócitos T humanos foram em seguida isolados por seleção negativa usando um kit de isolamento de células T CD4+ (MACS). Para ativar os linfócitos T isolados, frascos de cultura de te- cido foram revestidos com 5 ug/ml cada de anti-CD3 (BD Bioscience) e anti- CD28 (BD Bioscience) em PBS de um dia para o outro a 4 graus C. Depois de remover o meio de revestimento, linfócitos T humanos isolados foram laminados em RPMI completo em uma densidade aproximada de 2 milões de células por mililitro de meio. Amostras de meio foram coletadas em vários pontos de tempo depois de laminação e testadas para IL-17A/F por ELISA. Sobrenadantes controle não-ativados foram coletados de sobrenadantes celulares de frascos não-revestidos com anti-CD3 e anti-CD28.
Medição por ELISA da Produção de IL-17A/F Humanos em Células T Humanas Ativadas Anti-CD3/Anti-CD28
Os níveis de IL-17A/F humano foram medidos por ELISA. IL-17 antihumano de camundongo foi diluído em tampão de revestimento (0,05 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6) e revestido sobre lâminas de mi- crotítulo de 96 cavidades (Nunc), por 12 a 15 horas em 2 a 8°C. Toda as etapas subsequentes foram realizadas em temperatura ambiente. Ligação não-específica foi bloqueada esvaziando as cavidades e adicionando tam- pão de bloqueio (PBS, 0,5% de BSA, 10 ppm de Proclin 300). Depois de uma incubação de 1 hora, as cavidades foram lavadas com tampão de lava- gem (PBS, 0,05% de Tween 20, 10 ppm de Proclin 300). Padrões de refe- rência e amostras de IL-17A/F humano, diluídos em tampão de teste (PBS, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 10 ppm de Proclin 300) foram então adi- cionados. Depois de uma incubação de 2 horas, as cavidades foram lavadas com tampão de lavagem. IL-17F antihumano de camundongo biotinilado, diluído em tampão de teste, foi adicionado e deixado para incubar por 1 hora. Depois de lavar as lâminas com tampão de lavagem, Estreptavidina-HRP (peroxidase de raiz-forte) (Amersham), diluída em tampão de teste, foi adi- cionada e deixada para incubar por 1 hora. Depois de lavar as lâminas com tampão de lavagem, a solução de substrato, TMB (tetra metil benzidina)- Peroxidase (R & D Systems) foi adicionado. O desenvolvimento de cor foi 5 interrompido adicionando 2 N de ácido sulfúrico. As lâminas foram então li- das em uma leitora de lâminas de microtítulo (SLT) a 450 nm com uma em branco subtraída a 540 nm. Um programa de ajuste de curva de quatro pa- râmetros foi usado para gerar uma curva-padrão, e as concentrações da amostra foram derivadas por interpolação da porção linear da curva. IL-17A 10 e IL-17F foram incluídos como controles no ELISA para ilustrar a especifici- dade do ensaio para IL-17A/F (Figura 12).
Resultados:
Os resultados de medições ELISA da produção de IL-17A/F são mostrados na Figura 11. Estas fitas estudos demonstram a produção de uma 15 nova citocina IL-17A/F a partir de células de linfócitos T humanos ativados anti-CD3/anti-CD28 comparadas com células T humanas não-ativadas em que não foi detectada produção de IL-17A/F. Estas fitas resultados mostram pela primeira vez a ocorrência natural de uma nova citocina a qual é produ- zida e liberada em resposta à ativação de linfócitos T humanos. Além disso, 20 a especificidade do ensaio ELISA foi demonstrada observando quantidades quase equivalentes de IL-17A/F em três amostras (no. 31 a no. 33) quando testadas em paralelo. Quantidades desprezíveis de IL-17A ou IL-17F foram detectadas neste ELISA específico para IL-17A/F (Figura 12).
Os estudos descritos aqui, em ambos os Exemplo 1 e 2 estabe- 25 lecem, que IL-17A/F humano recombinante é uma citocina distintamente no- va, diferenciável de IL-17 e IL-17F humanos tanto estrutura da proteína quanto em ensaios da atividade celular. Através do uso de IL-17A/F humano recombinante purificado como um padrão, foi desenvolvido um ELISA espe- cífico para IL-17AF humano (mostrado na Figura 11). Através do uso deste 30 ELISA específico, a expressão induzida de IL-17A/F humano foi detectada, confirmando que IL-17A/F é naturalmente produzido a partir de células T humanas ativadas em cultura. Portanto, IL-17A/F é uma citocina distintamen- te nova, detectável como um produto natural de células T humanas ativadas isoladas, cuja forma recombinante foi caracterizada, tanto na estrutura da proteína quanto em ensaios celulares, quanto a serem diferentes e distinguí- veis de citocinas relacionadas.
5 Esta nova citocina pode agir para modular a atividade de IL-17 in
vivo, atuando como um inibidor competitivo para sítios de ligação para IL-17 ou outras citocinas relacionadas. IL-17A/F também pode modular a atividade de outras citocinas relacionadas por regulação para baixo de sítios de liga- ção a si próprias e/ou sítios de ligação a outras citocinas relacionadas. IL- 10 17A/F pode apresentar atividade através de adaptadores intracelulares ou moléculas de sinalização as quais agem afetando sua própria atividade de sinalização ou a de outras citocinas relacionadas. IL-17A/F tem a capacida- de de afetar o pareamento de receptores e coreceptores encontrados na superfície de células ou dentro do compartimento intracelular.
Portanto, estas fitas estudos proporcionam e identificam um no-
vo estimulante imune (isto é, IL-17A/F) que pode reforçar o sistema imune para responder a um antígeno em particular que pode não ter sido imunolo- gicamente ativo previamente. Deste modo, o estimulante imune recém- identificado tem importantes aplicações clínicas. Outros estimulantes imunes 20 conhecidos tais como IL-12 foram identificados, [vide Gubler et al. PNAS 88, 4143 (1991)]. Em um experimento de vacina contra câncer recente, pesqui- sadores da University of Chicago e do Genetics Institute (Cambridge, MA) se basearam na atividade imuno estimulatória de IL-12, para o tratamento de melanoma. [Peterson et al. Journal of Clinicai Oncology 21 (12). 2342-48 25 (2003)] Eles extraíram células de leucócitos circulantes carregando um ou mais marcadores de células de melanoma, isolaram o antígeno, e as devol- veram aos pacientes. Normalmente os pacientes não teriam uma reação imune para seus próprios antígenos humanos. Os pacientes foram então tratados com diferentes doses de IL-12, um estimulante imune capaz de in- 30 duzir a proliferação de células T que foram coestimuladas por células dendrí- ticas. Devido ao efeito imuno estimulatório de IL-12, o tratamento proporico- nou resultados superiores em comparação com trabalho anterior, em as cé- lulas dendríticas dos próprios pacientes foram preparadas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), tratadas com antígenos, em seguida cultivadas invenção e devolvidas ao paciente para estimular reação anti-câncer. [Thurner et al. J. Exp. Med. 190 (11), 1669-78 (1999)] Igualmen- 5 te, esta nova citocina IL-17A/F ou agonistas da mesma, portanto encontrari- am utilidade prática como um imuno estimulante. Considerando moléculas as quais inibem a atividade de IL-17A/F (antagonistas) se esperaria encon- trar utilidade prática quando se deseja uma inibição da reação imune, tal como em doenças autoimunes.
Portanto, anticorpos para esta nova citocina os quais ou simulam
(anticorpos agonistas) ou inibem (anticorpos antagonistas) as atividades i- munológicas de IL-17A/F possuiriam qualidades terapêuticas. Pequenas mo- léculas as quais agem inibindo a atividade desta nova citocina também teri- am usos terapêuticos potenciais.
EXEMPLO 3
Uso de IL-17A/F como uma sonda de hibridização
O método seguinte descreve o uso de uma seqüência de nucleo- tídeo codificando IL-17A/F como uma sonda de hibridização.
DNA compreendendo a seqüência codificante de extensão total ou IL-17A/F maduro conforme descrito aqui, é empregado como uma sonda para triar DNAs homólogos (tais como aqueles codificando variantes que ocorrem naturalmente de IL-17A/F) em bibliotecas de cDNA de tecido huma- no ou bibliotecas genômicas de tecido humano.
Hibridização e lavagem de filtros contendo DNAs de uma ou ou- 25 tra biblioteca é realizada sob as seguintes condições de alta estringência. Hibridização de sonda derivada de IL-17A/F radiomarcado aos filtros é reali- zada em uma solução de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato de sódio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, 2x solução de Denhardt, e 10% de sulfato de dextrano a 42°C for 20 horas. É realizada Ia- 30 vagem dos filtros em uma solução aquosa de 0,1x SSC e 0,1% de SDS a 42°C.
DNAs tendo uma identidade de seqüência desejada com o DNA codificando IL-17A/F de seqüência nativa de extensão total podem ser então identificados usando técnicas de rotina conhecidas na técnica.
EXEMPLO 4
Expressão de IL-17A/F em E. coli 5 Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glocosilada
de polipeptídeos IL-17A/F por expressão recombinante em E. coli.
A seqüência de DNA codificando um polipeptídeo IL-17A/F é inicialmente amplificada usando iniciadores de PCR selecionados. Os inicia- dores devem conter sítios de enzimas de restrição os quais correspondem aos sítios de enzimas de restrição sobre o vetor de expressão selecionado. Pode ser empregada uma variedade de vetores de expressão. Um exemplo de um vetor adequado é pBR322 (derivado de E. coli; vide Bolivar et al., Ge- ne. 2: 95 (1977)) o qual contém genes para resistência a ampicilina e tetraci- clina. O vetor é digerido com enzima de restrição e desfosforilado. As se- quências amplificadas por PCR são então ligadas no vetor. O vetor prefe- rencialmente incluirá seqüências as quais codificam para um gene de resis- tência a antibiótico, um trp promotor, um Iider polyHis (incluindo os seis pri- meiros códons STII, seqüência de polyHis, e sítio de clivagem de enteroqui- nase), a região codificante do polipeptídeo IL-17A/F, terminador transcripcio- nal lâmbda, e um gene argU.
A mistura da ligação é então usada para transformar uma cepa de E. coli selecionada usando os métodos descritos em Sambrook et al., acima. Transformantes são identificados por sua capacidade para crescer sobre lâminas de LB e são então selecionadas colônias resistentes a antibió- 25 tico. Plasmídeo de DNA pode ser isolado e confirmado por análise de restri- ção e sequenciamento de DNA.
Clones selecionados podem ser cultivados de um dia para o ou- tro em meio de cultura líquido tal como caldo LB suplementado com antibió- ticos. A cultura de um dia para o outro pode ser usada em seguida para ino- cular uma cultura em maior escala. As células são então cultivadas até uma densidade ótica desejada, durante a qual o promotor de expressão é ligado.
Depois de cultivar as células por várias horas a mais, as células podem ser colhidas por centrifugação. O pélete celular obtida pela centrifu- gação pode ser solubilizado usando vários agentes conhecidos na técnica, e a proteína IL-17A/F solubilizada pode ser então purificada usando uma colu- na quelante de metal sob condições que permitem firme ligação da proteína.
5 Polipeptídeos IL-17A/F podem ser expressados em E. coli em
uma forma com rótulo de poly-His, usando o seguinte procedimento. O DNA codificando um polipeptídeo IL-17A/F é inicialmente amplificado usando ini- ciadores de PCR selecionados. Os iniciadores conterão sítios de enzimas de restrição os quais correspondem aos sítios de enzimas de restrição sobre o 10 vetor de expressão selecionados, e outras seqüências úteis proporcionando iniciação de translação eficiente e confiável, purificação rápida sobre uma coluna de quelação de metal, e remoção proteolítica com enteroquinase. As seqüências amplificadas por PCR, com etiqueta de poly-His são em seguida ligadas em um vetor de expressão, o qual é usado para transformar um hos- 15 pedeiro de E. coli baseado na cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Os transformantes são primeiro cultivados em LB contendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30EC com agitação até ser atingido um O.D.600 de 3-5. As culturas são então diluídas 50 a 100 vezes em meio CRAP (preparado misturando 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de só- 20 dio*2H20, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de levedura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF em 500 mL de água, bem como 110 mM de MPOS, pH 7,3, 0,55% (em peso/ volume) de glicose e 7 mM de MgSO4) e cultivados por aproximadamente 20 a 30 horas a 30EC com agitação. As amostras são re- movidas para verificar a expressão por análise SDS-PAGE, e a cultura em 25 massa é centrifugada para peletizar as células. Os péletes celulares são congelados até purificação e redobramento.
Pasta de E. coli de fermentações de 0,5 a 1 L (péletes de 6 a 10 g) é ressuspendida em 10 volumes (em peso/ volume) em 7 M de guanidina, 20 mM de Tris, tampão de pH 8. Sulfito de sódio sólido e tetrationato de só- 30 dio é adicionado para preparar concentrações finais de 0,1 Me 0,02 M, res- pectivamente, e a solução é agitada de um dia para o outro a 4EC. Esta eta- pa resulta em uma proteína desnaturada com todos os resíduos cisteína bloqueados por sulfitolização. A solução é centrifugada a 40.000 rpm em uma Ultracentrifuga Beckman por 30 min. O sobrenadante é diluído com 3 a 5 volumes de tampão de coluna de quelato metálico (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 micron para clarificar.
5 O extrato clarificado é carregado sobre uma coluna de quelato de metal Qia- gen Ni-NTA de 5 ml equilibrada no tampão de coluna de quelato de metal. A coluna é lavada com tampão adicional contendo 50 mM de imidazol (Calbio- chem, grau Utrol), pH 7,4. A proteína é elutriada com tampão contendo 250 mM de imidazol. As frações contendo a proteína desejada são reunidas e 10 armazenadas a 4EC. A concentração de proteína é estimada por sua absor- vência a 280 nm usando o coeficiente de extinção calculado com base em sua seqüência de aminoácidos.
As proteínas são redobradas diluindo a amostra lentamente em tampão de redobramento recém-preparado consistindo em: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCI, 2,5 M de ureia, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina e
1 mM de EDTA. Volumes de redobramento são escolhidos de modo que a concentração de proteína final seja entre 50 a 100 microgramas/ml. A solu- ção de redobramento é agitada suavemente a 4EC por 12 a 36 horas. A rea- ção de redobramento é extinta pela adição de TFA para uma concentração 20 final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de purificação adicional da proteína, a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 micron e acetonirila é adicionada para 2 a 10% de concentração final. A proteína redobrada é cromatografada sobre uma coluna de fase reversa Poros R1/H usando um tampão móvel de 0,1% de TFA com elutriação com um gradiente de acetoni- 25 rila de 10 a 80%. Alíquotas de frações com absorvência de A280 são anali- sadas sobre géis de SDS poliacrilamida e as frações contendo proteína re- dobrada homogênea são reunidas. Geralmente, as espécies adequadamen- te redobradas da maioria das proteínas são elutriadas nas menores concen- trações de acetonirila uma vez que estas espécies são as mais compactas 30 com seus interiores hidrofóbicos protegidos da interação com a resina de fase reversa. Espécies agregadas são geralmente elutriadas em maiores concentrações de acetonirila. Além de resolver formas inadequadamente dobradas de proteínas a partir da forma desejada, a etapa de fase reversa também remove endotoxina das amostras.
Frações contendo o polipeptídeo IL-17A/F dobrado desejado são reunidas e o acetonirila é removido usando um fluxo suave de nitrogênio di- 5 rígido na solução. Proteínas são formuladas em 20 mM de Hepes, pH 6,8 com 0,14 M de cloreto de sódio e 4% de manitol por diálise ou por filtração por gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão da formulação e filtradas estéreis.
EXEMPLO 5
Expressão de IL-17A/F em células de mamíferos
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma potencialmente glicosilada de polipeptídeos IL-17A/F por expressão recombinante em célu- las de mamíferos.
O vetor, pRK5 (vide a patente européia No. EP 307.247, publi- 15 cada em 15 de março de 1989), é empregado como o vetor de expressão. Opcionalmente, o DNA de IL-17A/F é ligado em pRK5 com enzimas de res- trição selecionadas para permitir inserção do DNA de IL-17A/F usando mé- todos de ligação tal como descrito em Sambrook et al., acima. O vetor resul- tante é denominado pRK5-IL-17A/F.
Em uma modalidade, as células hospedeiras selecionadas po-
dem ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são cultivadas até a confluência em lâminas de cultura de tecido em meio tal como DMEM suplementado com soro de feto de vitela e opcionalmente, componentes nu- trientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 pg de pRK5-IL-17A/F DNA é mistura- 25 do com cerca de 1 pg de DNA codificando o gene VA RNA [Thimmappaya et al., CeII, 3±: 543 (1982)] e dissolvido em 500 μΙ de 1 mM de Tris-HCI, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCI2. A esta mistura é adicionado, gota a gota, 500 μΙ de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCI, 1,5 mM de NaPO4, e se deixa formar um precipitado por 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspen- 30 dido e adicionado às células 293 e deixado para sedimentar por cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e 2 ml de 20% de glicerol em PBS é adicionado por 30 segundos. As células 293 são em seguida Ia- vadas com meio livre de soro, meio fresco é adicionado e as células são in- cubadas por cerca de 5 dias.
Aproximadamente 24 horas depois das transfecções, o meio de cultura é removido e substituído com meio de cultura (somente) ou meio de 5 cultura contendo 200 pCi/ml de 35S-Cisteina e 200 pCi/ml de 35S-metionina. Depois de uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é coletado, concentrado sobre um filtro de spin, e carregado sobre um gel SDS a 15%. O gel processado pode ser secado e exposto a filme por um período de tempo selecionado para revelara presença do polipeptídeo IL-17A/F. As cul- 10 turas contendo células transfectadas podem sofrer incubação adicional (em meio livre de soro) e o meio é testado em bioensaios selecionados.
Em uma técnica alternativa, IL-17A/F pode ser introduzido em células 293 transitoriamente usando o método do sulfato de dextrano descri- to por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Células 293 são cultivadas até máxima densidade em um frasco "spinner" e 700 pg de pRK5-IL-17A/F DNA é adicionado. As células são primeiro concentradas a partir do frasco do spinner por centrifugação e lavadas com PBS. O precipi- tado de DNA-dextrano é incubado sobre o pélete celular por quatro horas. As células são tratadas com 20% de glicerol por 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecido, e reintroduzidas no frasco do spinner contendo meio de cultura de tecido, 5 pg/ml de insulina bovina e 0,1 pg/ml de transfer- rina bovina. Depois de cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifu- gado e filtrado para remover células e debris. A amostra contendo o polipep- tídeo IL-17A/F expressado pode ser então concentrada e purificada por qualquer método selecionado, tal como diálise e/ou cromatografia de coluna.
Em outra modalidade, polipeptídeos IL-17A/F podem ser expres- sados em células CHO. O pRK5-IL-17A/F pode ser transfectado em células CHO usando reagentes conhecidos tais como CaPO4 ou DEAE-dextrano. Conforme descrito acima, as culturas celulares podem ser incubadas, e o 30 meio substituído com meio de cultura (somente) ou meio contendo um ra- diomarcador tal como 35S-metionina. Depois de determinar a presença do polipeptídeo IL-17A/F, o meio de cultura pode ser substituído com meio livre de soro. Preferencialmente, as culturas são incubadas por cerca de 6 dias, e em seguida o meio condicionado é colhido. O meio contendo o polipeptídeo IL-17A/F expressado pode ser então concentrado e purificado por qualquer método selecionado.
5 IL-17A/F com etiqueta de epitopo também pode ser expressado
em células CHO do hospedeiro. O IL-17A/F pode ser subclonado do vetor pRK5. O inserto do subclone pode sofrer PCR para fundir na estrutura com um rótulo de epitopo selecionada tal como um rótulo de poly-His em um ve- tor de expressão de Baculovírus. O inserto de IL-17A/F com etiqueta de 10 poly-His pode ser então subclonado em um vetor dirigido por SV40 contendo um narcador de seleção tal como DHFR para seleção de clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (conforme descrito acima) com o vetor dirigido por SV40. Rotulação pode ser realizada, confor- me descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo o 15 IL-17A/F com etiqueta de poly-His expressado pdoe ser então concentrado e purificado por qualquer método selecionado, tal como por cromatografia por afinidade de Ni2+-quelato.
Polipeptídeos IL-17A/F também podem ser expressados em cé- lulas CHO e/ou COS por um procedimento de expressão transitório ou em células CHO por outro procedimento de expressão estável.
Expressão estável em células CHO é realizada usando o seguin- te procedimento. As proteínas são expressadas como um constructo de IgG (imunoadesina), no qual as seqüências codificantes para as formas solúveis (por exemplo, domínios extracelulares) das proteínas respectivas são fundi- 25 das a uma seqüência de região constante de IgGI contendo os domínios de articulação, CH2 e CH2, e/ou como uma forma com etiqueta de poly-His.
Depois de amplificação por PCR, os DNAs respectivos são sub- clonados em um vetor de expressão de CHO usando técnicas de rotina con- forme descrito em Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Bioloqy. 30 Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vetores de expressão de CHO são construídos para ter sítios de restrição compatíveis 5' e 3' do DNA de inte- resse para permitir o transporte de vaivém conveniente de cDNA’s. O vetor usado em expressão em células CHO é conforme descrito em Lucas et al., Nucl. Acids Res.. 24: 9 (1774-1779 (1996), e usa o promotor/reforçador pre- coce SV40 para dirigir a expressão do cDNA de interesse e diidrofolato re- ductase (DHFR). A expressão de DHFR permite seleção para manutenção 5 estável do plasmídeo depois de transfecção.
Doze microgramas do plasmídeo de DNA desejado é introduzido em aproximadamente 10 milhões de células CHO usando reagentes de transfecção disponíveis comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são cultivadas conforme descri- 10 to em Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 107 células são congeladas em uma ampola para crescimento e produção posteriores conforme descrito abaixo.
As ampolas contendo o plasmídeo de DNA são degeladas por deslocamento em banho de água e misturadas por turbilhonamento. Os con- teúdos são pipetados para dentro de um tubo de centrífuga contendo 10 mLs de meio e centrifugados a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante é aspi- rado e as células são ressuspendidas em 10 mL de meio seletivo (0,2 pm de PS20 filtrado com 5% de 0,2 prn de soro bovino fetal diafiltrado). As células são em seguida aliquotadas em um spinner de 100 mL contendo 90 mL de meio seletivo. Depois de 1 a 2 dias, as células são transferidas para um spinner de 250 mL preenchido com 150 mL de meio de crescimento seletivo e incubadas a 37°C. Depois de outros 2 a 3 dias, spinners de 250 mL, 500 mL e 2000 mL são semeados com 3 x 105 células/mL. O meio celular é per- mutado com meio fresco por centrifugação e ressuspensão em meio de pro- dução. Embora possa ser empregado qualquer meio CHO adequado, um meio de produção descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5.122.469, emitida em 16 de junho de 1992 pode ser usado na verdade. Um spinner de produção de 3 L é semeado a 1,2 x 106 células/mL. No dia 0, é determinado o número do pH celular. No dia 1, o spinner é amostrado e é iniciada asper- são com ar filtrado. No dia 2, o spinner é amostrado, a temperatura alterada para 33°C, e tirado 30 mL de 500 g/L de glicose e 0,6 mL de 10% de anties- puma (por exemplo, 35% de emulsão de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medicai Grade Emulsion). Do início ao fim da produção, o pH é ajustado conforme necessário para mantê-lo em torno de 7,2. Depois de 10 dias, ou até a viabilidade ter caído abaixo de 70%, a cultura celular é colhida por cen- trifugação e filtragem através de um filtro de 0,22 μηη. O filtrado foi ou arma- 5 zenado a 4°C ou imediatamente carregado sobre colunas para purificação.
Para os constructos com etiqueta de poly-His, as proteínas são purificadas usando uma coluna Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, imi- dazol é adicionado ao meio condicionado para uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado sobre uma coluna de 6 ml de Ni-NTA e- 10 quilibrada em 20 mM de Hepes, pH 7,4, tampão contendo 0,3 M de NaCI e 5 mM de imidazol em uma taxa de fluxo de 4 a 5 ml/min. a 4°C. Depois de car- regar, a coluna é lavada com tampão de equilibração adicional e a proteína é elutriada como tampão de equilibração contendo 0,25 M de imidazol. A pro- teína altamente purificada é em seguida dessalgada em um tampão de ar- 15 mazenamento contendo 10 mM de Hepes, 0,14 M de NaCI e 4% de manitol, pH 6,8, com uma coluna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) e armazenada a -80°C.
Constructos de imunoadesina (contendo Fe) são purificados a partir do meio condicionado como se segue. O meio condicionado é bombe- 20 ado sobre uma coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) a qual tinha sido equilibrada em 20 mM de tampão de fosfato de Na, pH 6,8. Depois de carre- gar, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilibração antes de elutriação com 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. A proteína elutriada é imedi- atamente neutralizada coletando frações de 1 ml dentro de tubos contendo 25 275 pL de 1 M de tampão Tris, pH 9. A proteína altamente purificada é em seguida dessalgada em tampão de armazenamento conforme descrito acima para as proteínas com etiqueta de poly-His. A homogeneidade é avaliada por géis de SDS poliacrilamida e por sequenciamento de aminoácidos de N- terminal por degradação de Edman.
EXEMPLO 6
Expressão de IL-17A/F em Levedura
O método seguinte descreve expressão recombinante dos poli- peptídeos IL-17A/F em levedura.
Primeiro, vetores de expressão de levedura são construídos pa- ra produção intracelular ou secreção de IL-17A/F a partir do ADH2/GAPDH promotor. DNA codificando o polipeptídeo IL-17A/F e o promotor é inserido 5 em sítios de enzima de restrição adequados no plasmídeo selecionado para expressão intracelular direta do polipeptídeo IL-17A/F. Para secreção, DNA codificando IL-17A/F pode ser clonado no plasmídeo selecionado, junto com DNA codificando o ADH2/GAPDH promotor, um peptídeo de sinal IL-17A/F nativo ou outro peptídeo de sinal de mamífero, ou, por exemplo, um alfa- 10 fator de levedura ou seqüência de sinal/líder secretora de invertase, e se- qüências encadeadoras (caso necessário) para expressão de IL-17A/F.
Células de levedura, tais como a cepa de levedura AB110, po- dem ser então transformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivadas em meio de fermentação selecionado. Os sobrenadantes 15 da levedura transformada podem ser analilados por precipitação com 10% de ácido tricloroacético e separação por SDS-PAGE, seguida por tintura dos géis com tintura azul Coomassie Blue.
Polipeptídeos recombinantes IL-17A/F podem ser em seguida isolados e purificados removendo as células de levedura do meio de fermen- 20 tação por centrifugação e em seguida concentrando o meio usando filtros de cartuchos selecionados. O concentrado contendo o polipeptídeo IL-17A/F pode ser adicionalmente purificado usando resinas de cromatografia de co- luna selecionadas.
EXEMPLO 7
Expressão de IL-17A/F em Células de Inseto Infectadas por Baculovírus
O método seguinte descreve expressão recombinante de poli- peptídeos IL-17A/F em células de inseto infectadas por Baculovírus.
A seqüência codificante para IL-17A/F é fundida a montante de um rótulo de epitopo contida dentro de um vetor de expressão de Baculoví- rus. As etiquetas de epitopo referidos incluem etiquetas poly-His e etiquetas de imunoglobulina (como regiões Fe de IgG). Pode ser empregada uma va- riedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos dis- poníveis comercialmente tais como pVL1393 (Novagen). Em resumo, a se- qüência codificando IL-17A/F ou a porção desejada da seqüência codificante de IL-17A/F tal como a seqüência codificando o domínio extracelular de um proteína transmembrana ou a seqüência codificando a proteína madura se a 5 proteína for extracelular é amplificada por PCR com iniciadores complemen- tares às regiões 5’ a 3'. O iniciador 5' pode incorporar sítios de enzima de restrição flanqueantes (selecionados). O produto é então digerido com as enzimas de restrição selecionadas e subclonado no vetor de expressão.
Baculovírus recombinante é gerado cotransfectando o plasmídeo 10 acima e DNA de vírus BaculoGold® (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando Iipofectina (disponível comerci- almente na GIBCO-BRL). Depois de 4 a 5 dias de incubação a 28°C, os ví- rus liberados são colhidos e usados para amplificações adicionais. Infecção viral e expressão de proteína são realizadas conforme descrito por O1ReiIIey 15 et al., Baculovírus expression vectors: A Laboratorv Manual. Oxford: Oxford University Press (1994).
IL-17A/F com etiqueta de poly-His expressado pode ser então purificado, por exemplo, por cromatografia por afinidade de Ni2+-quelato co- mo se segue. Os extratos são preparados a partir de células Sf9 infectadas 20 com vírus recombinante conforme descrito por Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Em resumo, células Sf9 são lavadas, ressuspendidas em tampão de sonicação (25 mL de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; 0,4 M de KCI), e sonicadas duas vezes por 20 segundos sobre gelo. Os sonicados são clareados por centrifu- 25 gação, e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCI, 10% de glicerol, pH 7,8) e filtrados através de um filtro de 0,45 pm. Uma coluna de Ni2+-NTA agarose (disponível comercial- mente na Qiagen) é preparada com um volume de leito de 5 mL, lavada com 25 mL de água e equilibrada com 25 mL de tampão de carga. O extrato celu- 30 Iar filtrado é carregado sobre a coluna a 0,5 mL por minuto. A coluna é lava- da para A28O basal com tampão de carga, no qual se inicia a comleta da fra- ção do ponto. Em seguida, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI1 10% de glicerol, pH 6,0), o qual elutria proteína não ligada especificamente. Depois de atingir A2eo basali de novo, a coluna é desenvolvida com um gradiente de 0 a 500 mM de Imi- dazol no tampão de lavagem secundário. Frações de um mL são coletadas e 5 analisadsa por SDS-PAGE e tintura de prata ou Western blot com Ni2+-NTA- conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Frações contendo o IL-17A/F com etiqueta de His-ιο elutriado são reunidas e dialisadas contra tampão de carga.
Alternativamente, a purificação do IL-17A/F com etiqueta de IgG (ou com etiqueta de Fe) pode ser realizada usando técnicas de cromatogra- fia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína A ou de Proteína G.
EXEMPLO 8
Preparação de Anticorpos que Ligam IL-17A/F
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais os quais podem especificamente ligar IL-17A/F.
Técnicas para produzir os anticorpos monoclonais são conheci- das na técnica e são descritas, por exemplo, em Goding, acima. Imunogê- nios que podem ser empregados incluem polipeptídeos IL-17A/F purificados, proteínas de fusão contendo polipeptídeos IL-17A/F, e células expressando 20 polipeptídeos IL-17A/F recombinantes sobre a superfície celular. A seleção do imunogênio pode ser feita pelo técnico versado sem indevida experimen- tação.
Camundongos, tais como BALB/c, são imunizados com o imu- nogênio IL-17A/F emulsificado em adjuvante de Freund completo e injetados 25 por via subeutânea ou por via intraperitoneal em uma quantidade de 1 a 100 microgramas. Alternativamente, o imunogênio é emulsificado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injetado nas eminências hipotenares das patas traseiras dos animais. Os camundongos imunizados são em seguida reforçados 10 a 12 dias depois com imunogênio 30 adicional emulsificado no adjuvante selecionado. Depois disso, por várias semanas, os camundongos também podem ser reforçados com injeçõesde imunização adicionais. Amostras de soro podem ser obtidas periodicamente dos camundongos por sangria retro-orbital para experimentação em ensaios ELISA para detectar anticorpos anti-IL-17A/F.
Depois de ter sido detectado um título de anticorpos adequado, os animais "positivos" para anticorpos podem ser injetados com uma injeção 5 intravenosa final de IL-17A/F. Três a quatro dias depois, os camundongos são sacrificcados e as células do baço são colhidas. As células do baço são em seguida fundidas (usando 35% de polietileno glicol) a uma linhagem de células de mieloma murino selecionada tal como P3X63AgU.1, disponível na ATCC, No. CRL 1597. As fusões geraram células de hibridoma as quais po- 10 dem ser então laminadas em lâminas de cultura de tecido de 96 cavidades contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina, e timidina) para inibir a proli- feração de células não-fundidas, híbridos de mieloma, e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão triadas em um ELISA para reativi- dade contra IL-17A/F. A determinação de células de hibridoma "positivas" secretando os anticorpos monoclonais desejados contra IL-17A/F está den- tro do conhecimento da técnica.
As células de hibridoma positivas podem ser injetadas por via intraperitoneal em camundongos BALB/c singenéicos para produzir ascite 20 contendo os anticorpos monoclonais anti-IL-17A/F. Alternativamente, as cé- lulas de hibridoma podem ser cultivadas em frascos de cultura de tecido ou frascos rolantes. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos na ascite pode ser realizada usando precipitação de sulfato de amônio, seguida por cromatografia de exclusão de gel. Alternativamente, pode ser emprega- 25 da cromatografia por afinidade com base na ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G.
EXEMPLO 9
Purificação de Polipeptídeos IL-17A/F Usando Anticorpos Específicos
Polipeptídeos IL-17A/F nativos ou recombinantes podem ser pu- rificados por uma variedade de técnicas de rotina na técnica de purificação de proteína. Por exemplo, pro-polipeptídeo IL-17A/F, polipeptídeo IL-17A/F maduro, ou pre-polipeptídeo IL-17A/F é purificado por cromatografia de imu- noafinidade usando anticorpos específicos para o polipeptídeo IL-17A/F de interesse. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída por ligação covalente do anticorpo anti-polipeptídeo IL-17A/F a uma resina cromatográfi- ca ativada.
5 Imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros
imunes quer por precipitação com sulfato de amônio ou por purificação sobre Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Do mesmo modo, anticorpos monoclonais são preparados a partir do fluido da ascite de camundongo por precipitação com sulfato de amônio ou cromato- 10 grafia sobre Proteína A imobilizada. Imunoglobulina parcialmente purificada é fixada de modo covalente a uma resina cromatográfica tal como SEPHA- ROSE® ativada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada, e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.
Uma coluna de imunoafinidade semelhante é utilizada na purifi-
cação do polipeptídeo IL-17A/F preparando uma fração de células contendo polipeptídeo IL-17A/F em uma forma solúvel. Esta preparação é derivada por solubilização da célula inteira ou de uma fração subcelular obtida através de centrifugação diferencial pela adição de detergente ou por outros métodos 20 conhecidos de modo geral na técnica. Alternativamente, polipeptídeo IL- 17A/F solúvel contendo uma seqüência de sinalização pode ser secretado em quantidade útil no meio no qual as células são cultivadas.
Uma preparação contendo polipeptídeo IL-17A/F solúvel é pas- sada sobre a coluna de imunoafinidade, e a coluna é lavada sob condições 25 que permitem a absorvência preferencial de polipeptídeo IL-17A/F (por e- xemplo, tampões de alta força iônica na presença de detergente). Em segui- da, a coluna é elutriada sob condições que rompem a ligação de anticor- po/polipeptídeo IL-17A/F (por exemplo, um tampão de baixo pH tal como aproximadamente pH 2 a 3, ou uma alta concentração de um caótropo tal 30 como ureia ou íon tiocianato), e o polipeptídeo IL-17A/F é coletado. EXEMPLO 10 Triagem de Fármacos Esta invenção é particularmente útil para triar compostos usando polipeptídeos IL-17A/F ou ligando fragmento do mesmo em qualquer uma de uma variedade de técnicas triagem de fármacos. O polipeptídeo IL-17A/F ou fragmento empregado em um teste semelhante pode ou estar livre em solu- 5 ção, afixado a um suporte sólido, transportado sobre uma superfície celular, ou localizado intracelularmente. Um método de triagem de fármacos utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas as quais são estavelmente transformadas com ácidos nucleicos recombinantes expressando o polipep- tídeo IL-17A/F ou fragmento. Os fármacos são triados contra as células 10 transformadas referidas em ensaios de ligação competitiva. As células refe- ridas, quer em forma viável ou fixa, podem ser usadas para ensaios de liga- ção de rotina. Pode-se medir, por exemplo, a formação de complexos entre o polipeptídeo IL-17A/F ou um fragmento e o agente sendo testado. Alterna- tivamente, pode-se examinar a diminuição na formação de complexos entre 15 o polipeptídeo IL-17A/F e sua célula-alvo ou receptores-alvo causados pelo agente sendo testado.
Portanto, a presente invenção proporciona métodos para triagem de fármacos ou quaisquer outros agentes os quais podem afetar uma doen- ça ou um distúrbio associado ao polipeptídeo IL-17A/F. Estas fitas métodos compreendem contactar um agente semelhante com um polipeptídeo IL- 17A/F ou fragmento do mesmo e testar (i) para a presença de um complexo entre o agente e o polipeptídeo IL-17A/F ou fragmento, ou (ii) para a presen- ça de um complexo entre o polipeptídeo IL-17A/F ou fragmento e a célula, por meio de métodos conhecidos de modo geral na técnica. Em similares ensaios de ligação competitiva, o polipeptídeo IL-17A/F ou fragmento é tipi- camente rotulado. Depois de adequada incubação, o polipeptídeo IL-17A/F livre ou fragmento é separado daquele presente em forma ligada, e a quanti- dade de etiqueta livre ou não formando complexo é uma medida da capaci- dade do agente em particular para ligar o polipeptídeo IL-17A/F ou para in- terferir com o complexo de polipeptídeo IL-17A/F/célula.
Outra técnica para triagem de fármacos proporciona triagem de alta produtividade para compostos tendo adequada afinidade de ligação a um polipeptídeo e é descrita em detalhes na publicação de patente interna- cional No. WO 84/03564, publicada em 13 de setembro de 1984. Em resumo, grandes números de diferentes compostos de teste de peptídeos pequenos são sintetizados sobre um substrato sólido, tal como pinos plásticos ou al- 5 guma outra superfície. Conforme aplicado a um polipeptídeo IL-17A/F, os compostos de teste de peptídeo são reagidos com o polipeptídeo IL-17A/F e lavados. O polipeptídeo IL-17A/F ligado é detectado por meio de métodos conhecidos de modo geral na técnica. O polipeptídeo IL-17A/F purificado também pode ser revestido diretamente sobre lâminas para uso nas técnicas 10 de triagem de fármacos supracitadas. Além disso, anticorpos não- neutralizantes podem ser usados para capturar o peptídeo e imobilizá-lo so- bre o suporte sólido.
Esta invenção também contempla o uso de ensaios de triagem de fármacos competitivos nos quais anticorpos neutralizantes capazes de 15 ligar o polipeptídeo IL-17A/F especificamente competem com um composto de teste para ligar ao polipeptídeo IL-17A/F ou fragmentos do mesmo. Desta maneira, os anticorpos podem ser usados para detectar a presença de qual- quer peptídeo o qual partilha um ou mais determinantes antigênicos com o polipeptídeo IL-17A/F.
EXEMPLO 11
Desiqn de Fármaco Racional
O objetivo do design de fármaco racional é produzir análogos estruturais do polipeptídeo biologicamente ativo de interesse (isto é, um poli- peptídeo IL-17A/F) ou de moléculas pequenas com as quais interagem, por 25 exemplo, agonistas, antagonistas, ou inibidores. Quaisquer destas fitas e- xemplos podem ser usados para projetar fármacos os quais são formas mais ativas ou estáveis do polipeptídeo IL-17A/F ou os quais reforçam ou interfe- rem com a função do polipeptídeo IL-17A/F in vivo (c.fHodgson, Bi- o/Technoloqy. 9: 19-21 (1991)).
Em uma abordagem, a estrutura tridimensional do polipeptídeo
IL-17A/F, ou de um complexo inibidor-polipeptídeo IL-17A/F, é determinada por cristalografia de raios x, por modelagem por computador ou, o mais tipi- camente, por uma combinação das duas abordagens. Tanto o formato quan- to as cargas do polipeptídeo IL-17A/F devem ser determinados para elucidar a estrutura e para determinar um ou mais sítios ativos da molécula. Menos frequentemente, informações úteis relativas à estrutura do polipeptídeo IL- 5 17A/F podem ser obtidas por modelagem com base na estrutura de proteí- nas homólogas. Em ambos os casos, informação estrutural relevante é usa- da para desenhar moléculas similares a polipeptídeo IL-17A/F análogos ou para identificar inibidores eficientes. Exemplos úteis de design de fármacos racional podem incluir moléculas as quais têm atividade ou estabilidade a-
primoradas conforme mostrado por Braxton and Wells, Biochemistrv, 31: 7796-7801 (1992) ou as quais agem como inibidores, agonistas, ou antago- nistas de peptídeos nativos conforme mostrado por Athauda et al., J. Bio- chem.. 113: 742-746 (1993).
Também é possível isolar um anticorpo alvo-específico, selecio- 15 nado por ensaio funcional, conforme descrito acima, e em seguida solver sua estrutura cristalina. Esta abordagem, em princípio, produz um farmacore no qual o design do fármaco subsequente pode ser baseado. É possível by- pass a cristalografia da proteína totalmente gerando anticorpos anti- idiotípicos (anti-ids) para um anticorpo funcional, farmacologicamente ativo. 20 Como uma imagem em espelho de uma imagem em espelho, se esperaria que o sítio de ligação dos anti-ids fosse um análogo do receptor original. Os anti-id podem ser então usados para identificar e isolar peptídeos entre ban- cos de peptídeos quimicamente ou biologicamente produzidos. Os peptídeos isolados então agiriam como o farmacore.
Em virtude da presente invenção, podem ser produzidas quanti-
dades suficientes do polipeptídeo IL-17A/F para realizar estudos analíticos tais como cristalografia por raios x. Além disso, o conhecimento da seqüên- cia de aminoácidos do polipeptídeo IL-17A/F proporcionado aqui, proverá orientação para aqueles empregando técnicas de modelagem por computa- dos ao invés de ou além de cristalografia por raios x.
EXEMPLO 12
Modelos de Doencas In Vivo Os efeitos de combinar anticorpos anti-IL-17A e IL-17F como tratamento terapêutico para doenças autoimunes foi avaliado em modelos de camundongo para artrite reumatoide e esclerose múltipla. Os modelos de camundongo testados incluíram camundongos tratados com colágeno tipo Il 5 para induzir Artrite Induzida por Colágeno (CIA) (modelo murino para artrite reumatoide (RA)) ou tratados com mielina oligodendrócito glicoproteína (MOG) para induzir encefalomielite alérgica experimental (EAE) (modelo mu- rino para esclerose múltipla (MS)).
(I)CIA
Camundongos DBA-1J de sete a oito semanas de idade (Jack-
son Lab; Bar Harbor, Maine) foram imunizados com 100 μς de colágeno bo- vino tipo Il em 100 μΙ de Adjuvante Completo de Freund (CFA) no dia 0. (Barck et al., Arthritis & Rheumatism, 50: 3377-3386 (2004)) O colágeno tipo
Il em CFA foi injetado por via intradérmica (i.d.) na base da cauda sobre o lado direito. No dia 21, 100 μ9 de colágeno bovino tipo Il em 100 μΙ de Adju- vante Incompleto de Freund foi injetado por via intradérmica no lado esquer- do da cauda. No dia 45, os animais foram distribuídos nos seguintes grupos:
(1) mAb controle de isótipo de lgG2a murino (MulgG2a) 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina por via subcutânea (SC) 3 vezes por semana por 7 sema- 20 nas (n = 40), (2) TNFRII-Fc murino (substituto murino de Enbrel) (MuTNFII- Fc) 4 mg/kg em 100 μΙ de solução salina + metotrexato (MTX) 3 mg/kg em 100 μΙ de solução salina SC 2 vezes por semana por 7 semanas (n = 40), e (3) anticorpos monoclonais quiméricos anti-IL-17A de hamster-murinos (Mu- Anti-ILI 7) e anticorpos monoclonais quiméricos anti-IL-17F de hamster- 25 murinos (MuAnti-IL-17F) (mAbs) 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina SC três vezes por semana por sete semanas (n = 40).
Os animais foram classificados duas vezes por semana iniciando no dia 33 usando método de classificação de artrite de rotina. A classificação foi 0 a 4 por pata (onde 0 significa nenhuma doença e 4 representa eritema e 30 edema que envolve toda a pata) com um escore máximo de 16 escores por animal. Os animais nos grupos de tratamento 1 a 3 foram randomizados com base no peso corporal e a doença por escore no dia 45. Os três grupos de tratamento foram balanceados para conter número igual de camundongos com doença branda (escores médios 0 a 3; 22 a 23 camundongos por grupo de tratamento), moderada (escores médios 4a8;11a13 camundongos por grupo de tratamento) e grave (escores médios 9 e acima; 4 a 6 camundon- 5 gos por grupo de tratamento). Imagens por tomografia microcomputadoriza- da (MicroCT) (Barck et al., Arthritis & Rheumatism, 50: 3377-3386 (2004)) das articulações foram tiradas ao término do estudo, no dia 81, e foi calcula- do o volume ósseo cortical da articulação (JCBV).
Nos camundongos DBA-1J os quais foram tratados com coláge- no tipo Il para induzir Artrite Induzida por Colágeno (CIA), a combinação de anticorpos anti-IL-17A e anti-IL-17F (Grupo 3) resultou em escores clínicos terminais reduzidos no dia 81 quando comparados a escores clínicos termi- nais no dia 81 para camundongos tratados com a lgG2a controle somente (Grupo 1) (p = 0,02 (teste de Dunnett; Hsu, J.C., Multiple Comparisons The- ory and Methods, Chapman and Hall (1996)). Adicionalmente, nos camun- dongos DBA-1J os quais foram tratados com colágeno tipo Il para induzir Artrite Induzida por Colágeno (CIA), o tratamento com a combinação de anti- corpos anti-IL-17A e anti-IL-17F protegeu os camundongos contra dano ós- seo conforme medido por um maior volume ósseo cortical da articulação (JCBV), -4,5 para o grupo tratado com anti-IL-17A e IL-17F comparado a um volume ósseo cortical da articulação de -3,7 em camundongos tratados com mAb controle do isótipo de lgG2a murino (p < 0,001; teste de Dunnett).
A capacidade da combinação de anticorpos IL-17A e IL-17F para reduzir os escores de doença clínica terminal em camundongos com artrite 25 induzida por colágeno e para bloquear lesão óssea em camundongos com artrite induzida por colágeno, sugere que a combinação de IL-17A e IL-17F pode ser alvos para tratamento para doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide.
Em um experimento similar, tratamento com anticorpos anti- IL17A somente foi adicionado ao estudo, criando um quarto grupo. Os resul- tados são mostrados nas Figuras 19 e 20. O controle foi um anticorpo lgG2a de ambrosia americana (ragweed) antihumano combinado com isótipo (Ge- nentech, Inc.), listado como "ragweed" nas figuras. A classificação clínica para cada pata foi decidida usando os seguintes critérios:
0 = Sem evidência de eritema e tumefação
1 = Eritema e branda tumefação confinada ao meio da pata (tarsal) ou malé- olo
2 = Eritema e branda tumefação se prolongando do maléolo ao meio da pata
3 = Eritema e moderada tumefação se prolongando do maléolo às articula- ções metatarsais
4 = Eritema e grave tumefação engloba o maléolo, a pata e dedos Escore médio = soma dos escores das quatro patas.
Escore clínico diário médio = média do escore médio diário.
Escore clínico terminal = escore médio no último dia do estudo.
Os dados mostram que a combinação de anticorpos anti-IL17A e anti-IL17F é mais eficaz em uma maneira estatisticamente significativa do que tratamento com um anti-IL17A somente.
(2) EAE
Quatro grupos de camundongos, com 15 camundongos por gru- po, foram induzidos com mielina oligodendrócito glicoproteína (MOG) con- forme descrito abaixo e além disso, os grupos receberam as seguintes do- 20 ses de anticorpo três vezes por semana depois de indução com antígeno de peptídeo MOG35-55 em CFA: (1) (Grupo 1) mAb controle de isótipo de lgG2a murino (anticorpo anti-GP120), 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina, através de injeção intraperitoneal (IP), (2) (Grupo 2) mAb anti-IL-17A quimé- rico de hamster-murino (MuAnti-IL17), 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina, 25 via IP, (3) (Grupo 3) mAb anti-IL-17F quimérico de hamster-murino (MuAnti- IL-17F), g mg/kg em 100 μΙ de solução salina, via IP, e (4) (Grupo 4) mAb anti-IL-17A quimérico de hamster-murino (MuAnti-IL17), 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina, via IP, e mAb anti-IL-17F quimérico de hamster-murino (MuAnti-IL-17F), 6 mg/kg em 100 μΙ de solução salina, via IP.
No dia antes da indução com MOG (Dia menos 1), as doses de anti-
corpo conforme descrito acima foram administradas como uma primeira do- se. No dia de indução com MOG (Dia 0), os camundongos foram imunizados por via intradérmica com 200 μΙ de emulsão, contendo 200 μς de peptídeo MOG35-55 (Liu et al., Nat. Med., 4(1): 78-83 (1998); Suen et al.„ J. Exp. Med., 186(8): 1233-40 (1997)) em 100 μΙ de PBS e 100 μΙ de CFA1 o qual foi preparado misturando Adjuvante de Freund Incompleto (IFA) com M. tuber- 5 culosis H37A (morto e dessecado) até a concentração de M. tuberculosis em CFA de 2 mg/ml (200 μg de M. tuberculosis por camundongo). Os camun- dongos foram adicionalmente injetados com 200 ng de Toxina Pertussis em 100 μΙ de PBS por via IP.
No Dia 2, os camundongos foram adicionalmente injetados com 200 ng de Toxina Pertussis em 100 μΙ de PBX por via IP.
Durante o resto do estudo, os camundongos foram administra- dos com as doses de anticorpo conforme descrito acima três vezes por se- mana.
Os camundongos foram avaliados para doença clínica usando o método de classificação de esclerose múltipla (descrito abaixo) no mínimo três vezes por semana iniciando no Dia 1. Adicionalmente, camundongos os quais atingiram doença grau de 4 foram avaliados diariamente (se animais grau 4 não apresentam remissão até grau 3 ou menos em 5 dias, os animais foram eutanizados). Ainda adicionalmente, linfócitos na medula espinhal e no cérebro foram avaliados ao final do estudo. O método de classificação de esclerose múltipla foi avaliado usando o seguinte sistema de graduação: (1) grau 0 representa camundongo normal sem sinais evidentes de doença, (2) grau 1 representa cauda flácida (cauda flácida é descrita como completa flacidez da cauda e ausência de enrolamento na ponta da cauda quando o camundongo é selecionado) ou fraqueza dos membros posteriores (fraqueza dos membros posteriores é descrita como marcha gingando (wadding gait) com o sinal objetivo sendo que ao andar, os membros posteriores do ca- mundongo tombam através dos topos da gaiola de arame) mas não ambos,
(3) grau 2 representa cauda flácida e fraqueza dos membros posteriores, (4) grau 3 representa paralisia parcial dos membros posteriores (paralisia parcial dos membros posteriores é descrita como quando o camundongo é incapaz de usar os membros posteriores para manter postura da anca ou marcha mas ainda pode mover um ou ambos os membros em alguma extensão), (5) grau 4 representa paralisia completa de membros posteriores (paralisia completa dos membros posteriores é descrita como perda total do movimen- to nos membros posteriores com o camundongo se arrastando somente so- 5 bre seus membros dianteiros) e (6) grau 5 representa estado moribundo e morte por encefalomielite alérgica experimental (eutanizados por razões hu- manas).
Em camundongos com encefalomielite alérgica experimental (EAE) induzida por mielina oligodendrócito glicoproteína (MOG)1 e combina- 10 ção de anticorpos anti-IL-17A e anti-IL-17F (Group 4) resultou em redução dos escores clínicos terminais no dia 34 quando comparados aos escores clínicos terminais no dia 34 para camundongos tratados com gp120 (Grupo 1) (p < 0,01 (teste de Dunnett). Quer anti-IL-17A (Grupo 2) quer anti-IL-17F (Grupo 3) somente não foi tão eficaz was para reduzir os escores clínicos 15 como tanto anti-IL-17A quanto anti-IL-17F em combinação. Os resultados dos modelos de MOA e Artrite Induzida por Colágeno sugerem que o trata- mento de doenças autoimunes tais como artrite reumatoide (RA) e esclerose múltipla (MS) pode requerer o bloqueio de ambos os caminhos de IL-17A e IL-17F em combinação.
A capacidade da combinação de anticorpos de IL-17A e IL-17F
para reduzir escores de doença clínica terminal em camundongos com ence- falomielite alérgica experimental induzida por MOG, sugere que a combina- ção de IL-17A e IL-17F pode ser alvos para tratamento para doenças autoi- munes, tais como esclerose múltipla. O tratamento de combinação de dire- 25 cionamento para IL-17A e IL-17F pode incluir anticorpos de reação cruzada de dupla especificidade (anticorpos reconhecendo epitopos idênticos ou si- milares presentes sobre tanto IL-17A quanto IL-17F baseados em homologia de seqüência ou homologia de estrutura conforme descrito no Exemplo 15), anticorpos biespecíficos (anticorpos os quais foram produzidos para reco- 30 nhecer tanto IL-17A quanto IL-17F, por exemplo, um braço do anticorpo re- conhecendo IL-17A com o outro braço do mesmo anticorpo reconhecendo IL-17F ou a cadeia pesada do anticorpo reconhecendo IL-17A com a cadeia leve do mesmo anticorpo reconhecendo IL-17F) e anticorpos contra IL-17A + IL-17F administrados em combinação (dois anticorpos, um reconhecendo IL- 17A e um reconhecendo IL-17F).
EXEMPLO 13 5 Ativação de Células T Invenção
A linhagem auxiliar T, Th|L-i7, que é distinta de Th1 e Th2 (Vide o Relatório descritivo dos Estados Unidos No. 10/697.599, US2004/0156849, arquivado em 10/29/03), e a qual produz IL-17, é estimulada por IL-23 (Hun- ter, et al., Nat. Rev. Immunol., 5: 521-531 (2005); Holscher et al., Curr. Opin. 10 Invest. Drugs, 6: 489-495 (2005)) bem como outras citocinas, tais como IL-6 e TNFp(Veldhoen M et al., Immunity, 24: 179-89 (2006)). Para determinar o nível de produção de IL-17A e IL-17F em células Th|L-i7, células T foram ati- vadsa com IL6 e TGFp e os níveis de IL-17A e IL-17F foram quantificadas por análise por PCR. Dados emergentes referentes a células Th|L-i7 sugerem 15 que este subgrupo de células T é capaz de induzir inflamação tecidual e au- toimunidade, e deste modo desempenham um papel importante em doença autoimune (Bettelli et al., Nat Immunol 8: 345-350 (2007)).
Células T CD4+CD62L+CD25-CD44hi naíve purificadas por FACS (> 99% de pureza) ( uma população de células T CD4+ naive) foram incubadas 20 por 48 horas sobre uma lâmina revestida com _CD3 (anticorpo anti-CD3). Citocinas (incluindo IL-6, IL-27 e TGFp) e CD28 (anticorpo anti-CD28) fo- ram adicionadas em solução como se segue nos seguintes grupos: (1) sem citocinas, (2) IL-6, (3) IL-27, (4) IL-6 + IL-27), (5) IL-6 + TGFp ou (6) IL-6 + TGFp + IL-27. A expressão de IL-23R, IL-17A, e IL-17F foi determinada por 25 análise por PCR quantitativa e normalizada para rpl19. (o que é rp119?) A indução múltipla foi calculada normalizando a expressão para a expressão medida nas células purificadas por FACS antes da estimulação.
A ativação de células T invenção por IL-6 e TGFp resultou em aumen- tada produção de IL-17A (indução de ~ 18.000 vezes) e IL-17F (indução de ~ 300.000 vezes) (Grupo 5) quando comparada à ativação sem tratamento (Grupo 1), IL-6 somente (Grupo 2), IL-27 somente (Grupo 3), IL-6 + IL-27 (Grupo 4), e IL-6 + TGFp + e IL-27 (Grupo 6) (Figura 13). Os resultados de que IL-6 e TGF-β induzem produção de tanto IL-17A quanto IL-17F em combinação com os resultados in vivo do Exemplo 12, sugerem que tratamento eficaz de doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide e esclerose múltipla, bloqueando a função de células Th|L-i7, po- 5 de incluir a inibição tanto de IL-17A quanto de IL-17F. Tratamento de combi- nação de direcionamento para IL-17A e IL-17F pode incluir anticorpos duplo- específicos/de reação cruzada (anticorpos reconhecendo epitopos idênticos ou similares presentes sobre tanto IL-17A quanto IL-17F com base em ho- mologia de seqüência ou homologia de estrutura conforme descrito no E- 10 xemplo 15), anticorpos biespecíficos (anticorpos os quais foram produzidos para reconhecer tanto IL-17A quanto IL-17F, por exemplo, um braço do anti- corpo reconhecendo IL-17A com o outro braço do mesmo anticorpo reco- nhecendo IL-17F ou a cadeia pesada do anticorpo reconhecendo IL-17A com a cadeia leve do mesmo anticorpo reconhecendo IL-17F) e anticorpos 15 contra IL-17A + IL-17F administrados em combinação (dois anticorpos, um reconhecendo IL-17A e um reconhecendo IL-17F.
EXEMPLO 14
Identificação de Interações de Receptor/Liqante - Visão Geral do ensaio de Triagem de PRO Polipeptídeos para Identificação de Interações de Recep- tor/Liqante
Neste teste, vários PRO polipeptídeos são testados para capaci- dade para ligar a um painel de potenciais moléculas de receptores ou Iigan- tes para os fins de identificar interações de receptor/ligante. A identificação de um Iigante para um receptor conhecido, um receptor para um Iigante co- 25 nhecido ou um novo par de receptor/ligante é útil para uma variedade de indicações incluindo, por exemplo, moléculas bioativas de direcionamento (ligadas ao Iigante ou receptor) a uma célula conhecida por expressar o re- ceptor ou ligante, uso do receptor ou Iigante como um reagente para detec- tar a presença do ligante ou receptor em uma composição suspeita de con- 30 ter o mesmo, em que a composição pode compreender células suspeitas de expressarem o ligante ou receptor, modulando o crescimento de ou outra atividade biológica ou imunológica de uma célula conhecida por expressar ou responder ao receptor ou ligante, modulando a reação imune de células ou para células que expressam o receptor ou ligante, possibilitando a prepa- ração de agonistas, antagonistas e/ou anticorpos dirigidos contra o receptor ou ligante o qual modulará o crescimento de ou uma atividade biológica ou 5 imunológica de uma célula expressando o receptor ou ligante, e várias ou- tras indicações as quais serão prontamente evidentes para o técnico ordina- riamente versado.
Em geral, a ensaio é realizada como se segue. Um PRO poli- peptídeo da presente invenção suspeito de ser um ligante para um receptor é expressado como uma proteína de fusão contendo o domínio Fe de IgG humana (uma imunoadesina). Ligação de receptor-ligante é detectada per- mitindo interação do polipeptídeo imunoadesina com células (por exemplo, células Cos) expressando receptores de PRO polipeptídeo candidatos e vi- sualização de imunoadesina ligada com reagentes fluorescentes dirigidos para o domínio de fusão Fc e exame por microscópio. Células expressando receptores candidatos são produzidas por transfecção transitória, em parale- lo, de subgrupos definidos de uma biblioteca de vetores de expressão de cDNA codificando PRO polipeptídeos que podem funcionar como moléculas receptoras. As células são em seguida incubadas por 1 hora na presença do PRO polipeptídeo imunoadesina sendo testada para possível ligação de re- ceptor. As células são então lavadas e fixadas com paraformaldeído. As cé- lulas são então incubadas com anticorpo conjugado a fluorescente dirigido contra a porção Fe do PRO polipeptídeo imunoadesina (por exemplo, anti- corpo anti-Fc humano de cabra conjugado a FITC). As células são então lavadas de novo e examinadas por microscópio. Uma interação positiva é julgada pela presença de rotulação fluorescente de células transfectadas com cDNA codificando um receptor de PRO polipeptídeo particular ou grupo de receptores e uma ausência de rotulação fluorescente similar de células similarmente preparadas que foram transfectadas com outro cDNA ou gru- pos de cDNA. Se um grupo definido de vetores de expressão de cDNA for considerado como sendo positivo para interação com um PRO polipeptídeo imunoadesina, a espécie de cDNA individual que compreende o grupo são testados individualmente (o grupo é "decomposto") para determinar o cDNA específico que codifica um receptor capaz de interagir com o PRO polipeptí- deo imunoadesina.
Em outra modalidade deste teste, permite-se que um polipeptí- deo PRO de ligante potencial rotulado com epitopo (por exemplo, etiqueta de 8 histidinas "His") interaja com um painel de moléculas de polipeptídeo PRO receptoras potenciais que foram expressas como fusões com o domínio Fc de IgG humana (imunoadesinas). Depois de uma 1 hora de co-incubação com o polipeptídeo PRO rotulado com epitopo, os receptores candidatos são cada um imunoprecipitados com contas de proteína A e as contas são lava- das. Interação de ligante potencial é determinada por análise Western blot dos complexos imunoprecipitados com anticorpo dirigido para a etiqueta de epitopo. Imagina-se que ocorra uma interação se uma banda do peso mole- cular previsto da proteína etiquetada com epitopo é observada na análise Western blot com um receptor candidato, mas não se observa que ocorra com os outros membros do painel de receptores potenciais.
Usando os ensaios descritas acima, as seguintes interações de receptor/ligante foram identificadas aqui, :
(1) PR01031 (designado aqui, como ligante de IL-17B humano) liga a PR05801 (designado aqui, como receptor de IL-17RH1 humano).
(2) PR010272 (designado aqui, como ligante de IL-17E humano) liga a PR05801 (designado aqui, como receptor de IL-17RH1 humano).
(3) PR020110 (designado aqui, como ligante de IL-17F humano) liga ao receptor de IL-17 humano (IL-17R) [(Yao et al., Citooinai 9(11): 794-
800 (1997); também designado aqui, como PR01] e a PR020040 (designa- do aqui, como receptor de IL-17RH2 humano).
(4) PR01031 (ligante de IL-17B) e PR01122 (ligante de IL-17C) não liga ao receptor de IL-17 humano (Li et al., Proc.Natl. Acad. Sei. (USA). 97(2): 773-778 (2000)).
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EXEMPLO 15
Ligação de Receptorde IL-17F; Determinação Estructura de IL-17F A. Métodos
(1) Medições de Ligação
A cinética e a afinidade de IL-17, IL-17E (PR010272), ou IL-17F (PR020110) ligando a IL-17R ou IL-17RH1 (PR05801) foram determinadsa 5 por medições por SPR em um instrumento Pharmacia BIAcore 1000 (Pha- macia Biosensor, Piscataway NJ). Ligante de IL-17 ou receptor foi imobiliza- do sobre uma células de fluxo de um chip sensor CM5 através de ligação aleatória a grupos amino, química de N-hidroxissuccinimida, usando um pro- tocolo desenvolvido pelo fabricante. Um nível de imobilização de cerca de 10 500 unidades de ressonância (RU) foi obtido para IL-17R, IL-17RH1, e IL- 17F, ao passo que os níveis de imobilização de IL-17 e IL-17E foram 1200 e 1500 RU, respectivamente. Foi obtido um forte sinal para ligação de IL-17R a IL-17 imobilizado. No entanto, quando IL-17R foi imobilizado, somente foi obtido um sinal fraco para ligação de IL-17 sugerindo que a imobilização de 15 receptor inativa o sítio de ligação. Depois de bloquear sítios não reagidos com etanolamina, foram realizadas medições de ligação usando uma taxa de fluxo de 25 pL/min. Sensorgramas foram obtidos para uma série de seis soluções de proteínas, diluídas serialmente duas vezes. A maior concentra- ção usada foi 1000 ou 500 nM de proteína e as soluções foram preparadas 20 no tampão de operação, PBS contendo 0,05% de Tween-20. A superfície do chip sensor foi regenerada entre os ciclos de ligação por injeção de uma alí- quota de 25 pL de 0,1 M de ácido acético, 0,2 M de NaCI, pH 3 para elutriar proteína não-ligada de modo covalente. Sensorgramas foram avaliados de acordo com um modelo de ligação a 1:1 por análise de regressão não-linear 25 usando software suprido pelo fabricante. Em experimentos separados para medir a competição entre variantes de IL-17 para ligação de receptores, uma concentração fixa de receptor foi incubada com uma concentração variada de proteína IL-17 seguida por injeção desta mistura sobre uma célula de flu- xo tendo proteína IL-17 imobilizada. A quantidade de receptor ligado foi de- 30 terminada a partir do sinal de ressonância obtido depois do completamento da fase de associação.
(2) Cristalografia IL-17F cristalizado como lâminas hexagonais em gotas penden- tes sobre uma solução de cavidade contendo 1,0 M de sulfato de lítio, 0,5 M de sulfato de amônio, 1% de etanol, e 100 mM de citrato de sódio, pH 5,6, a
19 EC. Cristais foram colhidos em um licor matriz artificial consistindo na so- lução de cavidade sem etanol. Antes da coleta de dados, os cristais foram mergulhados em licor matriz artificial com 20% de glicerol e resfriados por cintilação em nitrogênio líquido. Dados iniciais foram coletados sobre um gerador de anodo rotatório in-house com radiação CuKa e foi visto que o grupo tridimensional é P61 ou P65, com dois dímeros na unidade assimétrica. Para faseamento, os cristais foram derivados embebendo por 6 horas em licor matriz artificial suplementado com 2 mM de thimersol. Uma série de da- dos nativos e um experimento três comprimento de onda Hg MAD (Multiwa- velength Anomalous Difraction) foram compilados na linha do feixe 9-2 no Stanford Synchrotron Radiation Laboratory. As séries de dados foram pro- cessadas usando os programas no pacote HKL (Otwinowski, Z., and Minor, W., Methods Enzymol. 176: 307-326 (1997)). A determinação da estrutura foi realizada usando a suite de programas CCP4 (CCP4, Acta Crvst. D50: 760- 763 (1994)). Mapas de Patterson indicaram a presença de vários átomos de Hg bem ordenados cuja localização foram determinados usando o programa Rantan. Foi realizado refinamento de fase com MLPHARE. Exame de mapas modificados por DM indicou que o grupo tridimensional era P65 e revelou os operadores de simetria não-cristalográficos (NCS). Cada protômero ligou um único thimerosal em um sítio equivalente, relacionado com NCS.
A estrutura inicial foi construída em um mapa experimental de 25 quádruplo NCS-ponderado e aplainada por solvente e foi refinada usando os programas REFMAC_4.0 (CCP4, Acta Cryst. D50: 760-763 (1994)) e Brun- ger, A. T. (1992), X-PLOR Manual, Versão 3.1 (New Haven, Connecticut: Yale University) conforme modificado pela Molecular Simulations, Inc. Refle- xões seqüestradas para calcular o valor R livre foram escolhidos em con- 30 chas de resolução fina. Uma função-alvo de máxima probabilidade, uma cor- reção anisotrópica global, e uma correção de solvente de massa em espaço real foram usadas durante refinamento posicionai, recozimento simulado, e refinamento do fator de temperatura isotrópica. Foi feito refinamento inicial contra a série de dados remotos de 2,65 Δ mas distúrbio em torno dos sítios de Hg se comensaioram difíceis para modelar portanto foi realizado refina- mento final contra a série de dados nativos de 2,85 Δ, usando a mesma série 5 de reflexões R livres. No modelo final, os resíduos derivados de quatro veto- res, resíduos 1 a 8, e resíduos 128-133 estão desordenados nos protômeros
A, B e X, enquanto os resíduos 1-6 e 130-133 estão desordenados no pro- tômero Y. No dímero XY, um laço interno (resíduos X20-X23 e Y20-Y25) está desordenado; o mesmo laço é pobremente ordenado nos monômeros
AB. Uma gráfico Ramachandran mostra que 90% de todos os resíduos não- glicina, não-prolina estão nas regiões mais favorecidas, 9,2% nas regiões permitidas adicionais, 0,7% (3 resíduos) nas regiões generosamente permi- tidas, e nenhum resíduo mas regiões desabilitadas. Coleção de dados e es- tatísticas de refinamento na Tabela 8. As coordenadas para IL-17F foram 15 depositadas no banco de dados Protein Data Bank e o código de acesso ainda deve ser atribuído. Os programas areaimol e resarea (CCP4, Acta Crvst. D50: 760-763 (1994)) foram usados para cálculos da área superficial acessível. Os programas Molscript (Kraulis, P. J., J. Appl. Crvst. 103: 1345- 1352 (1999)); Raster3D (Merrit, E. A., and Murphy, Μ. E. P., Acta Crvst. D50: 20 869-873 (1994)); Insight97 (MSI) e Grasp (Nichols et al., Proteins 11: 281- 296 (1991)) foram usados para análise e para preparar as Figuras 15, 17 e 18.
B.Resultados e Discussão (l)Liqacão de Receptores
Ressonância de plasmon superficial (SPR) foi usada para de-
terminar se IL-17F (PR020110) liga os domínios extracelulares (ECDs) de quaisquer dos dois receptores IL-17R (designado PR01) e IL-17RH1 (PR05801) reportados para ligar proteínas IL-17. No entanto, não foi obser- vada ligação de ou IL-17R ou IL-17RH1 (até 1 e 0,5 μΜ, respectivamente) a 30 IL-17F imobilizado. Em contraste, IL-17R ligou IL-17 imobilizado com uma modesta afinidade de ligação (vide a Tabela 8 abaixo), consistente com rela- tórios prévios sobre a afinidade para esta interação (Yao et al., citocina 9: 794-800 (1997)). Igualmente, IL-17RH1 apresentou alta afinidade de ligação a IL-17E (Tabela 7), consistente com a potência observada para indução de liberação de IL-8 pelas células (Lee et al., J. Biol. Chem. 276: 1660-1664 (2001)). Além disso, não foi observada ligação entre IL-17RH1 e IL-17 e en- 5 tre IL-17E e IL-17R conforme esperado (Shi et al., J. Biol. Chem. 275: 19167-19176 (2000); Lee et al., J. Biol. Chem. 276: 1660-1664 (2001)).
Para testar se a falta de ligação de IL-17R ou IL-17RH1 a IL-17F pode ser o resultado de ativação ligada a imobilização, a ligação de IL- 17F/receptor foi testada em experimentos de competição. Nestas fitas expe- 10 rimentos uma concentração fixa de IL-17R (500 nM) ou IL-17RH1 (31 nM) foi incubada com uma concentração variada de ligante, e em seguida injetada sobre a superfície de IL-17 ou IL-17E. Apesarde IL-17 solúvel poder bloque- ar de modo eficaz a ligação de IL-17R a IL-17 imobilizado, não foi observada competição com 2 μΜ de IL-17F. Além disso, 1,3 μΜ de IL-17F não pode 15 bloquear a ligação de IL-17RH1 a IL-17E imobilizado, embora ligação fosse completamente inibida por IL-17E solúvel. Estas fitas resultados indicaram que IL-17F não liga com alta afinidade ao domínio extracelular purificado, monomérico, de ou IL-17R ou IL-17RH1. Conforme mostrado no EXEMPLO
14 (Figura 14), foi mostrado que o ligante de IL-17F liga a novo receptor de IL-17RH2 (PR020040).
Embora IL-17F pareça ter atividade relacionada com a de IL-17, IL-17F não liga IL-17R com alta afinidade invenção. No entanto, pode ser detectada ligação reforçada de IL-17F a células Cos transfectadas com IL- 17R (não apresentada), sugerindo que IL-17F pode ser capaz de utilizar IL- 25 17R, mas somente em combinação com componentes adicionais, ainda não identificados para formar um complexo de sinalização de alta afinidade. Um mecanismo similar foi postulado para IL-17 para explicar a discrepância en- tre afinidade de receptor e a potência de sua atividade biológica (Yao et al., citocina 9: 794-800 (1997)). Os resultados apresentados aqui, sugerem que 30 independente do um ou mais receptores envolvidos, a sinalização de IL-17F resulta em atividades similares a jusante como estimulação de IL-17R por IL- 17. Tabela 8
Cinética e Afinidade de Ligação de Receptora IL-17 e IL-17E Imobilizada
Ligante KonXl O'5 KoffXlO4 Kp (M'1 s1) (s1) (nM) IL-17R 0,093 6,7 72 IL-17RH1 6,7 7,0 1,1 IL-17E 4,3 6,2 1,4 Determinação de Estrutura de IL-17F
A estrutura de IL-17F humana foi solvida por métodos de Hg Multiwavelength Anomalous Difraction e foi refinada para um Rfree e RcrySt de 28,8% e 23,3%, respectivamente, em 2,85 Δ de resolução (vide a Tabela 9 15 abaixo). O núcleo de um protômero de IL-17F é composto de dois pares de fitas β antiparalelos; um par inclui as fitas 1 (resíduos 52-59) e 2 (resíduos 66-73 e 77-79), enquanto o outro inclui as fitas 3 (89-103) e 4 (110-125). O fita 2 é interrompido por um trecho curto de estrutura β irregular. Duas pon- tes dissulfeto (Cys 72/Cys 122 e Cys 77/Cys 124) conectam as fitas 2 e 4. 20 Um terceiro dissulfeto (Cys 17/Cys 107) conecta o laço entre as fitas 3 e 4 de um protômero à extensão de N-terminal do protômero adjacente forman- do contactos diméricos extensivos (conforme discutido abaixo). Esta exten- são de N-terminal também contém um fita β (fita 0, resíduos 25-32), o qual liga por hidrogênio ao fita 3' sobre o outro protômero, e uma pequena hélice 25 α (resíduos 43-48). Observou-se densidade de elétrons adicional a Asn 53, consistente em glicosilação deste resíduo conforme foi esperado da análise de seqüência e caracterização da proteína purificada.
Esta estrutura revela que IL-17F é um homólogo distante da fa- mília de proteínas do nó de cistina (McDonald, N. Q., and Hendrickson, W. A., Cell 73: 421-424 (1993)), denominado por sua incomum conectividade a cistina (Figura 15). O nó de cistina é caracterizado por duas séries de fitas β pareados (fitas 1 e 2 e fitas 3 e 4) que são conectadas por ligações de dis- sulfeto entre as fitas 2 e 4 (Figura 15A, inserção). Uma terceira ponte dissul- feto passa através deste macrociclo para conectar as fitas 1 e 3. Em contras- te, IL-17F contém somente duas das três ligações cistina distintivas que dão seu nome à família. Em IL-17F, os dissulfetos Cys 72/Cys 122 e Cys 77/Cys 5 124 formam o macrociclo do nó de cistina típico. O terceiro dissulfeto que formaria o "nó" passando através deste macrociclo não está presente; ao contrário, os resíduos 50 e 89, os quais estão localizados no mesmo espaço tridimensional que o terceiro dissulfeto nas proteínas de nó de cistina, são serinas e, IL-17F. Enquanto Ser 50 está na mesma conformação que a ciste- 10 ína correspondente em em uma proteína de nó, Ser 89 não está. É digno de nota que serinas estão conservadas nestas posições em todos os membros da família IL-17 (vide a Figura 16), apesar do fato de que a estrutura sugere que o terceiro dissulfeto pode ser conciliado. Tabela 9 Compilação de Dados Estatísticos Cristaloqráficos e Faseamento MAD
Nativo Grupo tridimensional LO CD CL Constantes de Unidade Celular (Δ) a=126,4, b=89,9 a= Comprimento de onda (Δ) 0,979 Resolução (Δ) 2,85 l/lsig 7,7 Completude (%) 100(100) Rsymb 8,8 (54,1) Reflexões medidasc141778 228788 Reflexões únicas0 19294 Potência de faseamento cêntricod--- 1,4 Potência de faseamento acêntricod --- Rcullis acêntricad --- 0,76 Pico de Hg
Inflexão Hg
Hg Remoto
126,8, b=90,0 1,0067 1,0087 1,127 2,8 2,8 2,65 11,4 11,2 9,1 98,9(91,3) 98,8 (90,2) 99,9 (99,9) 5,8 (34,4) 5,9 (35,9) 6,4 (43,1) 228553 266735 40450 40459 46851 1,6 1,3 4,3 3,2 4,3 0,7 0,8 253 Refinamento Resolução (Δ) 30-2,85 N0 de reflexões 19246 Re 0,233 Rfree 0,288 N0 átomos de proteína 3716 N0 átomos de carboidrato 84 3 águas 21 ligações Rmsd (Δ) 0,12 Bs ligado por Rmsd 4,5 ângulos Rmsd (E) 1,7 3 Os números entre parênteses se referem à concha de maior resolução
b Rsym = 3l-<(/ 3I.<I> é a intensidade média de observações relacionadas com simetria de uma única reflexão. c Reflexões de Bijvoet são mantidas separadas na estatística de Hg d Estatísticas de faseamento são para reflexões com F>2o e R=3Fo-Fc/3Fo
254 (3) Dimerizacão
IL-17F dimeriza em um modo paralelo similar ao fator de cresci- mento nervoso (NGF) e outras neutrofinas (McDonald et al., Nature 354: 411-414 (1991)). No entanto, a interface do dímero é incomumente grande, 5 encobrindo um total de 6800 A2 (ou -3400 A2 por monômero) comparado com total de 3400 A2 (-1700 A2 por monômero) para NGF (PDB código 1WWW; Weismann et al., Nature 401: 184-188 (1999)). Aproximadamente um terço da interface é formada por interações entre as fitas 3 e 4 de um monômero com os mesmas fitas no outro monômero, análogo à interface do 10 dímero vista em neutrofinas. Única para IL-17F, é a vasta quantidade de á- rea superficial encoberta por interações envolvendo a extensão de N- terminal (resíduos 8-48) de cada protômero atingindo através da interface do dímero canônico e comprimindo contra várias porções do outro protômero.
A estrutura da estrutura global do dímero IL-17F pode ser descri- ta como uma peça de roupa em que as folhas 14 e 172' formam as mangas, os dissulfetos do nó de cistina revestem a gola, e as sheets 3/4 e 374' junto com as extensões de N-terminal formam o corpo, o qual é acabado com as duas sheets de três fitas (envolvendo as fitas 4/3/0' e 0/374') formando uma saia na parte de baixo (Figura 15B; dimensões 65 Δ x 25 Δ x 30 Δ). Uma ca- racterística surpreendente sobre a superfície da molécula é uma cavidade incomumente grande (18Ax10Ax10Ade profundidade) localizada na in- terface do dímero essencialmente posicionada como bolsos na peça de rou- pa. A base da cavidade é formada por resíduos nas fitas 3 e 3' (Gin 95, Glu 96, Thr 97, e Leu 98 de ambas as cadeias) e 4 e 4' (Lys 115', Val 118, e Val 120'). Resíduos no N-término revestem um lado da cavidade (resíduos Arg 37, Val 38, Met 40), ao passo que o outro lado é revestido por resíduos do fita 1 (Tyr 54), do fita 2 (Vai 68, Glu 66), e a volta entre estas fitas fitas (Tyr 63 e Pro 64). A ligação de peptídeo entre Tyr 63 e Pro 64 está na conforma- ção cis incomum. Como esta prolina é conservada em todas as seqüências IL-17 e é sempre procedido por um grande resíduo hidrofóbico (vide a Figura 16), é improvável que esta ligação de peptídeo está em uma conformação cis em todos os membros da família IL-17. O composto contendo mercúrio, thimerosal, o qual foi usado para fasear a estrutura, liga na extremidade infe- rior desta cavidade (conforme orientado na Figura 17), ocupando 30% do espaço.
As características estruturais discutidas acima demonstram que 5 um homólogo de IL-17 (IL-17F) é um membro da superfamília de dobra de nó de cistina e dimeriza similarmente a membros da subfamília NGF. Proteí- nas IL-17 partilham similaridade de seqüência desprezível com outros mem- bros da superfamília. Por exemplo, um alinhamento de seqüência à base da estrutura de IL-17F com NGF revela identidade para somente dez resíduos, 10 incluindo as quatro cisteínas conservadas no motivo do nó de cisteína (não mostrado). Limitada conservação de seqüência é típica da superfamília de dobra de nó de cistina (McDonald, N. Q., and Hendrickson, W. A., Cell 73: 421-424(1993)).
A estrutura de IL-17F permite generalização para os outros 15 membros da família IL-17. A dobra de nó de cistina incluindo a localização das β-sheets e a ligação de dissulfeto macrociclo devem ser preservadas em todos os homólogos de IL-17 (Figura 16). Em particular, IL-17 é tão similar a IL-17F, partilhando quase 50% de identidade de seqüência, que é possível prever onde IL-17 e IL-17F partilharão características superficiais e onde 20 divergirão. A figura 17 mostra a superfície molecular de IL-17F colorida de acordo com a identidade de seqüência com IL-17. Os únicos trechos conser- vados extensivos sobre a superfície de IL-17F estão sobre a face lisa de ca- da protômero (Figura 17B) e sobre a área "acima" da cavidade (Figura 17A). A área conservada sobre a face do protômero pode representar quer carac- 25 terísticas conservadas necessárias para manter a estrutura ou para os par- ceiros de ligação comuns potencialmente reconhecendo. Portanto também se espera que a grande cavidade na superfície de IL-17F estaria presente em IL-17, mas seria composta tanto de resíduos conservados quanto variá- veis.
Em contraste, as seqüências de IL-17B, IL-17C, e IL-17E diver-
gem significativamente entre IL-17F e IL-17, especialmente no número de localização de ligações cistina auxiliares e na extensão e seqüência da ex- tensão de N-terminal. Apesar desta divergência, é possível fazer várias pre- visões sobre a conectividade do dissulfeto e o efeito que terá sobre a exten- são de N-terminal em outros membros da família. Por exemplo, IL-17B é se- cretado como um dímero não-covalente (tanto de células CHO ou de células de inseto (Shi et al., J. Biol. Chem. 275: 19167-19176 (2000) e dados não mostrados) indicando que todos os oitro resíduos cisteína são pareados den- tro de uma única cadeia do dímero. Uma das duas cisteínas adicionais em IL-17B (Cys 103) está localizada entre as duas cisteínas no fita 2 que estão envolvidas no macrociclo enquanto a segunda cisteína adicional está na vol- ta entre as fitas 3 e 4 (Figura 16 e Figura 15). Com base na suposição de que a dobra do nó de cistina é conservada em todos homólogos de IL-17, a cisteína extra (Cys 103) no fita 2 de IL-17B estaria localizada longe demais para ligar a quaisquer das cisteínas no laço do fita 3/4. Portanto, Cys 103 de IL-17B deve ligar dissulfeto a Cys 64 na extensão de N-terminal, deixando as duas cisteínas no laço do fita 3/4 ligar uma à outra. De modo a estas intera- ções ocorrerem, a extensão de N-terminal deve estar em uma conformação radicalmente diferente em IL-17B do que em IL-17F. Isto é razoável uma vez que a seqüência nesta parte da estrutura não é conservada através da famí- lia, forma estrutura secundária muito pouco regular, e comprime primaria- mente sobre a periferia da molécula. Com base nesta análise, espera-se que IL-17C e IL-17E os quais também possuem uma cisteína extra no fita 2 tam- bém tenham ensaiovelmente seus N-términos em conformações significati- vamente diferentes do que os para IL-17F e IL-17. Esta análise divide a fa- mília em duas classes com base no padrão de ligações de dissulfeto do N- término.
Uma característica impressionante da estrutura de IL-17F é a cavidade incomumente grande formada pelos resíduos na interface do díme- ro (Figura 18) a qual é sugestiva de uma região que pode ligar outra molécu- la. A cavidade (duas por dímero) é composta de uma combinação de resí- 30 duos que são ou estritamente conservados ou sempre possuem um caráter químico similar (Tyr 54, Tyr 63, Pro 64, Val 120), bem como outros que são extremamente variáveis entre membros da família IL-17 (Arg 37, Val 38, Met 40, Ala 95) proporcionando potencial para conferir especificidade para inte- rações intermoleculares. A cavidade não tem uma característica superficial eletrostática acentuada, mas ao contrário é formada por uma combinação de resíduos hidrofóbicos, polares, e carregados (vide a Figura 17A e a Figura 5 18A). Com base na análise de seqüência, se esperaria que existisse uma cavidade análoga em outros membros da família IL-17; no entanto, dada a conformação provável diferente da extensão de N-terminal, as característi- cas específicas da cavidade podem ser bastante diferentes em IL-17B, IL- 17C, e IL-17E.
NGF liga seu receptor de alta afinidade, TrkA, em uma posição
análoga à localização das cavidades em IL-17F. Afigura 18B e a Figura 18C mostram IL-17F e NGF na mesma orientação salientando as localizações das cavidades e os sítios de ligação de TrkA (que se espera que sejam utili- zados por todos os complexos de neurotrofina/Trk; Weismann et al., Nature 401: 184-188 (1999)). As estruturas conhecidas de homodímeros de neuro- trofina (NGF, NT3, NT4) também têm uma indentação sobre suas superfícies nesta posição mas é muito menor e mais modesta do que a cavidade em IL- 17F (McDonald et al., Nature 354: 411 -414 (1991)); Butte et al., Biochemistrv 37: 16846-16852 (1998); Robinson et al., Protein Sei. 8: 2589-2597 (1999)). Membros da família Trk são tirosina quinases receptoras que interagem com neurotrofinas através de seu domínio semelhante a Ig extracelular membra- na-proximal. Apesar de não se esperar que a estrutura de IL-17R ou IL- 17RH1 contenha uma dobra semelhante a Ig, as proteínas IL-17 e neurotro- finas podem empregar regiões similares sobre suas superfícies para ligar seu receptor.
Neurotrofinas não somente ligam Trk receptores específicos, mas também podem ligar simultaneamente p75NTR, um segundo receptor comum a todas as neurotrofinas. p75NTR liga seus Iigantes de neurotrofina através de um domínio extracelular rico em cistina que se espera que se as- 30 semelhe às estruturas de receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1) ou do receptor de morte 5 (Banner et al., Cell 73: 431-445 (1993); Hymowitz et al., Mol. Cell 4: 563-571 (1999); Mongkolsapaya et al., Nat. Struc. Biol. 6: 1048-1053 (1999)). Um modelo da interação NGF:p75NTR foi proposto com base em dados de mutagênese (Weismann, C., and de Vos, A. M., Cell. Mol. Life Sei. 58: 1-12 (2001)) e sugere que os Ioops em qualquer extremidade do dímero ligante bem como a superfície lisa sobre cada protômero interagem
5 com p75NTR. As seqüências de IL-17R e IL-17RH1 não se assemelham a p75NTR e não se espera que adotem uma dobra semelhante a TNFR1. No entanto, dada a similaridade em dobras de neutrofina e IL-17, é razoável considerar a possibilidade de um segundo componente receptor para IL-17s, análogo ao sistema de neutrofina.
Adicionalmente, também foi sugerido que a proteína spáztle ado-
ta uma dobra de neurotrofina (Mizuguchi et al., TIBS 23: 239-242 (1998)) e foi demonstrado que geneticamente (embora não por experimentos de liga- ção direta) é um receptor para o receptor de drosphila Toll (Morisato et al., Cell 76: 677-688 (1994)). Como IL-17 sinaliza através de NF-κΒ em um ca-
minho similar ao usado por IL-1 e Toll receptores, os quais partilham uma dobra comum para seu domínio intracelular embora seus domínios extrace- Iulares sejam muito diferentes, é razoável esperar que ou os domínios intra- celulares ou extracelulares de receptores de IL-17, incluindo outros como componentes ainda desconhecidos do complexo de sinalização, possam
estruturalmente se assemelhar a porções destas fitas receptores. No entanto, independente da estrutura do receptor, o modo de interação entre Iigantes e receptores de IL-17 mais ensaiovelmente envolverá as cavidades profundas nos lados da estrutura do dímero de IL-17. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Genentech, Inc.
Arnott,David Balazs, Mercedes Ghilardi, Nico Gurney,Austin Hass,Phillip Hymowitz, Sarah Lee,James Ouyang, Wenjun Starovasnik, Melissa Wu,Yan
<120> IL-17AF POLIPEPTÍDEOS HETERODIMÉRICOS IL-17A/F E USOS TERAPÊU- TICOS DOS MESMOS
<130> 39766-0206-1RlPl.PCT
<140> Ainda não determinado
<141> com isso
<150> 11/606,192
<151> 2006-11-29
<160> 80
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Sem segurança <222> 10
<223> Aminoácido desconhecido <4 00> 1
Gly He Thr He Pro Arg Asn Pro Gly Xaa Pro Asn
5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 2
Arg Lys He Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln
5 10
<210> 3 <211> 155 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 3
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu 10 15
Ser Leu Glu Ala He Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn 20 25 30
Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val 35 40 45
Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro 50 55 60
Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn 65 70 75
Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp
80 85 90
Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn 95 100 105
Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu 110 115 120
Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 125 130 135
Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile 140 145 150
Val His His Val Ala 155
<210> 4
<211> 163
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 4
Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu 15 10 15
Leu Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala 20 25 30
Arg Lys Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu 35 40 45
Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly 50 55 60
Ile Ile Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu 65 70 75
Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro 80 85 90
Asn Arg Tyr Pro Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu 95 100 105
Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser 110 115 120
Val Pro Ile Gln Gln Glu Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln 125 130 135
Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val 140 145 150
Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val Ile His His Val Gln 155 160
<210> 5 <211> 1859 <212> DNA <213> Homo sapiens
<4 00> 5
gcaggcacaa actcatccat ccccagttga ttggaagaaa caacgatgac 50 tcctgggaag acctcattgg tgtcactgct actgctgctg agcctggagg 100 ccatagtgaa ggcaggaatc acaatcccac gaaatccagg atgcccaaat 150 tctgaggaca agaacttccc ccggactgtg atggtcaacc tgaacatcca 200 taaccggaat accaatacca atcccaaaag gtcctcagat tactacaacc 250 gatccacctc accttggaat ctccaccgca atgaggaccc tgagagatat 300 ccctctgtga tctgggaggc aaagtgccgc cacttgggct gcatcaacgc 350 tgatgggaac gtggactacc acatgaactc tgtccccatc cagcaagaga 400 tcctggtcct gcgcagggag cctccacact gccccaactc cttccggctg 450 gagaagatac tggtgtccgt gggctgcacc tgtgtcaccc cgattgtcca 500 ccatgtggcc taagagctct ggggagccca cactccccaa agcagttaga 550 ctatggagag ccgacccagc ccctcaggaa ccctcatcct tcaaagacag 600 cctcatttcg gactaaactc attagagttc ttaaggcagt ttgtccaatt 650 aaagcttcag aggtaacact tggccaagat atgagatctg aattaccttt 700 ccctctttcc aagaaggaag gtttgactga gtaccaattt gcttcttgtt 750 tactttttta agggctttaa gttatttatg tatttaatat gccctgagat 800 aactttgggg tataagattc cattttaatg aattacctac tttattttgt 850 ttgtcttttt aaagaagata agattctggg cttgggaatt ttattattta 900 aaaggtaaaa cctgtattta tttgagctat ttaaggatct atttatgttt 950 aagtatttag aaaaaggtga aaaagcacta ttatcagttc tgcctaggta 1000 aatgtaagat agaattaaat ggcagtgcaa aatttctgag tctttacaac 1050 atacggatat agtatttcct cctctttgtt tttaaaagtt ataacatggc 1100 tgaaaagaaa gattaaacct actttcatat gtattaattt aaattttgca 1150 atttgttgag gttttacaag agatacagca agtctaactc tctgttccat 1200 taaaccctta taataaaatc cttctgtaat aataaagttt caaaagaaaa 1250 tgtttatttg ttctcattaa atgtatttta gcaaactcag ctcttcccta 1300 ttgggaagag ttatgcaaat tctcctataa gcaaaacaaa gcatgtcttt 1350 gagtaacaat gacctggaaa tacccaaaat tccaagttct cgatttcaca 1400 tgccttcaag actgaacacc gactaaggtt ttcatactat tagccaatgc 1450 tgtagacaga agcattttga taggaataga gcaaataaga taatggccct 1500 gaggaatggc atgtcattat taaagatcat atggggaaaa tgaaaccctc 1550 cccaaaatac aagaagttct gggaggagac attgtcttca gactacaatg 1600 tccagtttct cccctagact caggcttcct ttggagatta aggcccctca 1650 gagatcaaca gaccaacatt tttctcttcc tcaagcaaca ctcctagggc 1700 ctggcttctg tctgatcaag gcaccacaca acccagaaag gagctgatgg 1750 ggcagaacga actttaagta tgagaaaagt tcagcccaag taaaataaaa 1800 actcaatcac attcaattcc agagtagttt caagtttcac atcgtaacca 1850 ttttcgccc 1859
<210> 6
<211> 559
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 6
caactgcacc tcggttctat cgatagccac cagcgcaaca tgacagtgaa 50 gaccctgcat ggcccagcca tggtcaagta cttgctgctg tcgatattgg 100 ggcttgcctt tctgagtgag gcggcagctc ggaaaatccc caaagtagga 150 catacttttt tccaaaagcc tgagagttgc ccgcctgtgc caggaggtag 200 tatgaagctt gacattggca tcatcaatga aaaccagcgc gtttccatgt 250 cacgtaacat cgagagccgc tccacctccc cctggaatta cactgtcact 300 tgggacccca accggtaccc ctcggaagtt gtacaggccc agtgtaggaa 350 cttgggctgc atcaatgctc aaggaaagga agacatctcc atgaattccg 400 ttcccatcca gcaagagacc ctggtcgtcc ggaggaagca ccaaggctgc 450 tctgtttctt tccagttgga gaaggtgctg gtgactgttg gctgcacctg 500 cgtcacccct gtcatccacc atgtgcagta agaggtgcat atccactcag 550 ctgaagaag 559
<210> 7 <211> 21 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 7
Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro Pro Val 15 10 15
Pro Gly Gly Ser Met Lys 20
<210> 8 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 8
His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu Lys
10
<210> 9 <211> 96 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 9
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Ser Ala Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Gly Ile Thr Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Lys Glu Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Ala 80 85 90
Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 10 <211> 93 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 10
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Ser Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Glu He Ser Pro Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Leu Leu Trp Trp Trp Asp Gly Ala Met Asp Tyr
80 85 90
Trp Gly Gln
<210> 11 <211> 91 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 11
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asn Thr Trp Ile 1 5 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Val Ile Thr Pro Tyr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Met Trp Ser Lys Phe Asp Tyr Trp Gly 80 85 90
Gln
<210> 12 <211> 96 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 12
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ser Ala Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Tyr Ile Thr Pro Asp Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Ile Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Gly His Gly Asn Phe Tyr Gly Thr Trp Ala Ala
80 85 90
Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 13 <211> 92 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 13
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Asp Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Tyr Ile Asn Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Glu Met Trp Tyr Val Met Asp Tyr Trp
80 85 90
Gly Gln
<210> 14 <211> 101 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 14
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asn Ser Trp Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Val Ile Thr Pro Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Val Phe Pro Asp Ile Gly Asp Cys Ser Asn
80 85 90
Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
95 100
<210> 15 <211> 94 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 15
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Val Gly Trp Gly Asp Ser Tyr Ala Met Asp
80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210 16 <211> 99 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 16
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Trp Ile
1 5 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Gly Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Glu Gly Leu Tyr Gln Ser Gly Ile Tyr
80 85 90
Asp Ala Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 17 <211> 93 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 17
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Tyr Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Tyr Pro Ala Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Tyr Asp Met Asp Tyr
80 85 90
Trp Gly Gln
<210> 18 <211> 92 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 18
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asp Ser Asp Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Ile Ile Tyr Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Leu Asp Asn Asn Leu Phe Asp Tyr Trp
80 85 90
Gly Gln
<210> 19 <211> 98 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 19
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Tyr Trp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Asp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Arg Cys Gly Gly Leu Ala Asp Trp Ala 80 85 90
Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 20 <211> 98 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 20
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser Trp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Ile Ile Thr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Val Phe Ala Val Ser Thr Ala Gly Tyr Pro 80 85 90
Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 21 <211> 96 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 21
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Ser Trp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Ser Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Glu Ser Asp Glu Ala Tyr Ala Ala Val 80 85 90
Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 22 <211> 97 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <400> 22
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Asp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Thr Ile Asn Pro Ala Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Asn Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Gln Tyr 80 85 90
Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 23
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Asn Tyr Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Thr Leu Phe Tyr Asp Lys Asp Gln Tyr Ser 80 85 90
Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 24
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Leu Arg Trp Gly Tyr Ala Met Asp
80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210> 25 <211> 96 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 25
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ala Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Gly Ile Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
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Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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<213> Seqüência artificial
<220> <223> polipeptídeos sintéticos <400> 26
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asn Thr Tyr Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
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Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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<223> polipeptídeos sintéticos <400> 27
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Thr Trp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
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Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ala Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Gly Ile Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Gly Gly Val Phe Val Asp Gly Gly Val 80 85 90
Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 29
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Thr Asp Ile 15 10 15
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95 100
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<213> Seqüência artificial
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Tyr Gly Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Trp Ile Ser Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 31
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Thr Trp Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Val Ile Thr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
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<210> 32 <211> 94 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos
<4 00>
32 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Ser Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Asp Ile Thr Pro Thr Asp Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
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50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
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80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210> 33 <211> 101 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 33
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Tyr Gly Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
Trp Ile Ser Pro Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos
<4 00> 34 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Thr Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
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Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95
<210> 35 <211> 98 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 35
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Asn Tyr Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 20 25 30
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<210> 36 <211> 96 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos
<400> 36 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Ser Trp Ile
10 15
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25 30
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80 85 90
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 37
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Ser Thr Ala Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Thr Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75
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80 85 90
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos
<400> 38 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Asn Gly Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Ser Pro Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
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50 55 60
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65 70 75
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80 85 90
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95 100
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <400> 39
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Tyr Trp Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Trp Ile Ser Pro Asp Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
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50 55 60
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65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Lys Phe Trp Gly Trp Asp Trp Gly Gly Met Asp
80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210> 40 <211> 94 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> polipeptídeos sintéticos
<4 00> 40 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Ser Tyr Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
25 30
Asp Ile Thr Pro Thr Asp Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Met Trp Trp Asp Ser Ser Ala Met Asp
80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210> 41 <211> 94 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos <4 00> 41
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Ser Gly Ile 15 10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 20 25 30
Phe Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 35 40 45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Met Ser Leu Ile Gly Phe Ser Tyr Ala Met Asp 80 85 90
Tyr Trp Gly Gln
<210> 42 <211> 93 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> polipeptídeos sintéticos
<400> 42 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Thr Trp Ile
10 15
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
25 30
Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
4 0 4 5
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
50 55 60
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
65 70 75
Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Asp Tyr Asp Ile Gly Phe Asp Tyr
80 85 90
Trp Gly Gln
<210> 43 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 43
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 44
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtgattcct atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct gaaatttctc 100 ctcctggcgg cgatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtctc ttgtggtggt 250 gggacggggc tatggactac tggggtcaa 279
<210> 45 <211> 273 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 45
ttgtcctgtg cagcttctgg ct tcaccatt actaatactt ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct gttattactc 100 cttatggcgg tgctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgcaagagag agtatgtgga 250 gtaagttcga ctactggggt caa 273 <210> 46 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 46
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt aatagttctg ctatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tatattactc 100 ctgataacgg tgatactaac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aatagctgag gatactgccg tctattattg tgctcgcggc cacggcaact 250 tctacggtac ctgggcggct atggactact ggggtcaa ; 288 <210> 47 <211> 276 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 47
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtggttctg atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tatattaatc 100 cttatggcgg ttctactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
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ggtacgttat ggactactgg ggtcaa 276
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 48
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actaattcct ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt gttattactc 100 cttctagcgg ttctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag gtcttccccg 250 acatcgggga ctgcagcaac gcctactgct acgctatgga ctactggggt 300 caa 303
<210> 49 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 49
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actagtactt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttatagcgg ttatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag gtggggtggg 250 gggactcgta cgctatggac tactggggtc aa 282 <210> 50 <211> 297 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 50
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtggttctt ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct gggatttatc 100
cttatgacgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag gccgagggcc 250
tgtaccagtc cgggatctac gacgcgggta tggactactg gggtcaa 297
<210> 51 <211> 279 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 51
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actagttact atatacactg 50
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ctgctgacgg tgctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtggg tcctacttcg 250
ggggctacga tatggactac tggggtcaa 279
<210> 52 <211> 276 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 52
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 53
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<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 54
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtggttctt ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct attattactc 100 cttctggcgg taatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag gtcttcgccg 250 tgtcgaccgc cggctacccc tgggttatgg actactgggg tcaa 294 <210> 55 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 55
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgattctt ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tctattactc 100 cttataacgg taatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcagg ggggagtccg 250 acgaggccta cgccgcggtt atggactact ggggtcaa 288
<210> 56 <211> 291 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 56
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtagttccg atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt actattaatc 100 ctgctagcgg ttctactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcggc gccaacagca 250 gcttctacgc gctccagtac gttatggact actggggtca a 291 <210> 57 <211> 294 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 57
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgataatt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tggatttctc 100 cttatagcgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag accctcttct 250 acgacaagga ccagtactcc tacgttatgg actactgggg tcaa 294 <210> 58 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <400> 58
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtagttctt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttatagcgg ttatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag gggctcctgc 250 ggtggggcta cgctatggac tactggggtc aa 282 <210> 59 <211> 291 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 59
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgataatg ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tggattactc 100 ctactagcgg ttatactaac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcgac ggggacacct 250 ggaagtggga cgccccgtac gttatggact actggggtca a 291 <210> 60 <211> 291 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 60
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actaatactt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttatagcgg ttatactgac tatgccgata gcgtcaagga ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcgag atcttgctgg 250 actacggttc cgcgggctac gctatggact actggggtca a 291 :210> 61 :211> 291 :212> DNA :213> Seqüência artificial :220> :223> synthetic polynucleotides :400> 61 cagcttctgg cttcaccatt actagtacct ggatacactg 50 ttgtcctgtg ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt gttattactc 100 ctactaacgg ttctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcgag gtgtggtggt 250 ggggcgacgg ccacggctac gttatggact actggggtca a 291
<210> 62 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 62
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtagttctg ctatacactg 50
ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt gggattactc 100
ctgctagcgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgctcg cccggcgggg 250
tgttcgtcga cggcggggtt atggactact ggggtcaa 288
<210> 63 <211> 303 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 63
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt aatagtactg atatacactg 50
ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt aggattaatc 100
cttctggcgg ttctactaac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtacc agcgcgtaca 250
ccacgtgggc ggtcgactgg ttcatcggct acgttatgga ctactggggt 300
caa 303
<210> 64 <211> 303 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 64
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actggttacg ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttctaacgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtcgc gtcagctact 250
acgtctacag gcacgactgg gtcaggggct acgttatgga ctactggggt 300
caa 303
<210> 65 <211> 267 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 65
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgatacct ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt gttattactc 100 cttatggcgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgcaagagac gggggcttct 250 tcgattactg gggtcaa 267
<210> 66 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 66
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtgattcct ctatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tttatttatc 100 ctactagcgg ttctacttac tatgccaata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgcacgtgcc tcgtacgggg 250 tgagcaagtg gacctttgac tactggggtc aa 282 <210> 67 <211> 303 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 67 ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actggttacg ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttctaacgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcat acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtcgc gtcagctact 250 acgtctacag gcacgactgg gtcaggggct acgttatgga ctactggggt 300 caa 303
<210> 68 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 68
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actggtactt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttatagcgg ttatactaac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgcaagagag gcccgctcct 250 cgttgagcgc ggactacgct atggactact ggggtcaa : 288 <210> 69 <211> 294 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 69
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgataatt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 cttatagcgg ttatacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtgag tccggcttct 250 ccgcgtgcaa cacgcgggcg tacgctatgg actactgggg tcaa 294 <210> 70 <211> 288 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <400> 70
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actgattctt ggatacactg 50
ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tctattactc 100
cttataacgg taatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgcagg ggggagtccg 250
acgaggccta ccccgcggtt atggactact ggggtcaa 288
<210> 71 <211> 280 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <400> 71
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actagtaccg ctatacactg 50
ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggattactc 100
cttatgacgg ttatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150
ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctactaa tgaacagctt 200
aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtacg tggttcacgc 250
tggcctcggc tatggaacta ctggggtcaa 280
<210> 72 <211> 303 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 72
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt actggtaatg ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggatttctc 100 ctactaacgg ttctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtagg gtcgactacc 250 aggtctacca cgaccgcttc gaggaggggt acgctatgga ctactggggt 300 caa 303 <210> 73 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 73
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt aatagttatt ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tggatttctc 100 ctgataacgg tgctactaac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtaag ttctggggct 250 gggactgggg gggtatggac tactggggtc aa 282 <210> 74 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 74
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtgattctt atatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt gatattactc 100 ctactgacgg ttatactgac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtaac ttgatgtggt 250 gggactcgtc ggctatggac tactggggtc aa 282 <210> 75 <211> 282 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <4 00> 75
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt agtgattctg ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttggt tttatttatc 100 ctaatggcgg ttctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgtatg tcgttgatcg 250
ggttctcgta cgctatggac tactggggtc aa 282
<210> 76 <211> 279 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> synthetic polynucleotides <400> 76
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaccatt aatagtacct ggatacactg 50 ggtgcgtcag gccccgggta agggcctgga atgggttgct tggattaatc 100 cttataacgg ttctacttac tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact 150 ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc tacctacaaa tgaacagctt 200 aagagctgag gacactgccg tctattattg tgcaagagac ttgtacgact 250 acgacatcgg cttcgactac tggggtcaa 279 <210> 77
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Arg Lys He Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu
10 15
Ser Cys Pro Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp He Gly
25 30
He He Asn Glu Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn He Glu
40 45
Ser Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro
50 55 60
Asn Arg Tyr Pro Ser Glu Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu
65 70 75
Gly Cys He Asn Ala Gln Gly Lys Glu Asp He Ser Met Asn Ser
80 85 90
Val Pro He Gln Gln Glu Thr Leu Val Val Arg Arg Lys His Gln
95 100 105
Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu Lys Val Leu Val Thr Val
110 115 120
Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val He His His Val Gln
125 130
<210> 78 <211> 132 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Gly He Thr He Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp 15 10 15
Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn He His Asn 20 25 30
Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn 35 40 45
Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu 50 55 60
Arg Tyr Pro Ser Val He Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly 65 70 75
Cys He Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val 80 85 90
Pro He Gln Gln Glu He Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 95 100 105
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys He Leu Val Ser Val Gly 110 115 120
Cys Thr Cys Val Thr Pro He Val His His Val Ala 125 130
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg
10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 80
Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys
10

Claims (25)

1. Método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo, compreendendo administrar ao mamífe- ro referido uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais antago- nistas capazes de inibir tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID No: 4) em um polipeptídeo IL-17A/F.
2. Método da reivindicação 1, em que o mamífero é um indivíduo humano.
3. Método da reivindicação 2, compreendendo administrar ao referido indivíduo humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de IL-17A e um antagonista de IL-17F.
4. Métododa reivindicação 3, em que o referido antagonista de IL-17A é um anticorpo que especificamente liga IL-17A (SEQ ID NO: 3), ou um fragmento do mesmo.
5. Método da reivindicação 3, em que o referido antagonista de IL-17F é um anticorpo que especificamente liga IL-17F (SEQ ID NO: 4), ou um fragmento do mesmo.
6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido antagonista de IL-17A é um anticorpo que especificamente liga IL-17A (SEQ ID NO: 3), ou um fragmento do mesmo, e o referido antagonista de IL-17F é um anticorpo que especificamente liga IL-17F (SEQ ID NO: 4), ou um frag- mento do mesmo.
7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido antagonista é um anticorpo ligando especificamente a tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID NO: 4) em um polipeptídeo IL-17A/F, ou um fragmento do mesmo.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido anticorpo é um anticorpo de reação cruzada que reconhece epitopos idênti- cos ou similares presentes sobre tanto IL-17A (SEQ ID NO: 3) quanto IL-17F (SEQ ID NO: 4).
9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido anticorpo é um anticorpo biespecífico tendo especificidade para IL-17A e IL- 17F, ou um fragmento do mesmo.
10. Método de qualquer uma das reivindicações 3 a 9, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, ou um fragmento do mesmo.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo é quimérico, humanizado ou humano.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o distúr- bio imunorrelacionado é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, os- teoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmieli- nante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido distúrbio imunorrelacionado é esclerose múltipla (MS) ou artrite reumatoide (RA).
14. Método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo compreendendo direcionamento simultâ- neo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um anticorpo de reação cruzada em que o referido anticorpo reconhece epitopos idênticos ou similares presentes tanto sobre IL-17A, um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3, quanto sobre IL-17F, um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou um fragmento do referido anticorpo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o distúr- bio imunorrelacionado é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, os- teoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmieli- nante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o distúr- bio imunorrelacionado é esclerose múltipla (MS) ou artrite reumatoide (RA).
17. Um método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo compreendendo direcionamento simultâneo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido mé- todo compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo bi-específico em que o referido an- ticorpo consiste em dois braços em que um braço do referido anticorpo re- conhece IL-17A e o outro braço do referido anticorpo reconhece IL-17F.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o distúr- bio imunorrelacionado é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, os- teoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmieli- nante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o distúr- bio imunorrelacionado é esclerose múltipla (MS) ou artrite reumatoide (RA).
20. Método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo compreendendo direcionamento simultâ- neo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um anticorpo bi-específico em que o referido anticor- po consiste em uma cadeia pesada a qual reconhece IL-17A e uma cadeia leve a qual reconhece IL-17F.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o distúr- bio imunorrelacionado é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, os- teoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmieli- nante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
22. Método de acordo com a reivindicação 21 em que o distúr- bio imunorrelacionado é esclerose múltipla (MS) ou artrite reumatoide (RA).
23. Método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um mamífero que necessite do mesmo compreendendo direcionamento simultâ- neo para IL-17A e IL-17F no mamífero referido em que o referido método compreende administração ao mamífero referido de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um anticorpo bi-específico em que o referido anticor- po consiste em uma cadeia pesada a qual reconhece IL-17F e uma cadeia leve a qual reconhece IL-17A.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o distúr- bio imunorrelacionado é lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, os- teoartrite, artrite crônica juvenil, uma espondiloartropatia, esclerose sistêmica, uma miopatia inflamatória idiopática, síndrome de Sjõgren, vasculite sistêmi- ca, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, tiroidite, diabete melito, doença renal imunomediada, uma doença desmieli- nante do sistema nervoso central ou periférico, polineuropatia desmielinante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, uma polineuropatia desmielinante inflamatória crônica, uma doença hepatobiliar, hepatite ativa crônica infec- ciosa ou autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória, enteropatia sensível a glúten, doença de Whipple, uma doença de pele autoimune ou imunomediada, uma doença de pele bolhosa, eritema multiforme, dermatite de contato, psoríase, uma doença alérgica, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibili- dade alimentar, urticária, uma doença imunológica do pulmão, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, pneumonite por hipersensibilidade, uma doença associada com transplante, rejeição a enxerto ou doença enxer- to-versus-hospedeiro.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o distúr- bio imunorrelacionado é esclerose múltipla (MS) ou artrite reumatoide (RA).
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