BRPI0720048A2 - Proteínas de dedo de zinco não-canônicas otimizadas - Google Patents

Proteínas de dedo de zinco não-canônicas otimizadas Download PDF

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Jeffrey Miller
Fyodor Urnov
Vipula K Shukla
Joseph F Petolino
Lisa W Baker
Robbi J Garrison
Ryan C Blue
Jon C Mitchell
Nicole L Arnold
Sarah E Worden
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS DE DEDO DE ZINCO NÃO-CANÔNICAS OTIMIZADAS".
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.
No. 60/874,911, depositado em 14 de dezembro de 2006 e o Pedido Provi- sório U.S. No. 60/932.497 depositado em 30 de maio de 2007, cujas ambas as descrições são aqui incorpordas por referência em suas totalidades aqui. Campo Técnico
A presente invenção refere-se aos campos de engenheiramento de genoma, direcionamento de gene, integração cromossomal direcionada, expressão de proteína e edição epigenoma.
Antecedentes
Ligação específica de seqüência de proteínas a DNA1 RNA, pro- teína e outras moléculas está envolvida em numerosos processos celulares 15 tais como, por exemplo, transcrição, replicação, estrutura de cromatina, re- combinação, reparo de DNA, tradução e processamento de RNA. A especifi- cidade de ligação de proteínas de ligação celular que participam em intera- ções de proteína-DNA, proteína-RNA e proteína-proteína contribui para o desenvolvimento, diferenciação e homeostase.
Proteínas de dedo de zinco (ZFPs) são proteínas que se ligam a
DNA em um modo específico de seqüência. Dedos de zinco foram primeira- mente identificados no fator de transcrição TFIIIA a partir dos ovócitos dos African clawed toad, Xenopus laevis. Um único domínio de dedo de zinco dessa classe de ZFPs é cerca de 30 aminoácidos de comprimento, e vários 25 estudos estruturais demonstraram que ele contém uma volta beta (contendo dois resíduos de cisteína conservados) e uma alfa hélice (contendo dois re- síduos de histidina conservados), que são mantidos em uma conformação particular através de coordenação de um átomo de zinco pelas duas cisteí- nas e pelas duas histidinas. Essa classe de ZFPs é também conhecida como 30 C2H2 ZFPs. Classes adicionais de ZFPs também foram sugeridas. Vide, por exemplo, Jiang e outros (1996) J. Biol. Chem. 271 : 10723-10730 para uma discussão de Cys-Cys-His-Cys (C3H) ZFPs. Até agora, acima de 10.000 se- quências de dedo de zinco foram identificadas em vários milhares de fatores de transcrição putativos ou conhecidos. Domínios de dedo de zinco estão envolvidos não apenas no reconhecimento de DNA, mas também em ligação de RNA e em ligação de proteína-proteína. Estimativas corrente são que 5 essa classe de moléculas constituirão cerca de 2% de todos os genes de ser humano.
A maior parte das proteínas de dedo de zinco conservaram resí- duos de cisteína e histidina que tetraedralmente coordenam o único átomo de zinco em cada domínio de dedo. Em particular, a maioria de ZFPs são 10 caracterizados por componentes de dedo da seqüência geral: -CyS-(X)2-4- Cys-(X)i2-His-(X)3-5-His- (SEQ ID NO:1), em que X representa qualquer a- minoácido (os C2H2 ZFPs). As seqüências de coordenação de zinco dessa classe mais amplamente representada contêm duas cisteínas e duas histidi- nas com espaçamentos particulares. A estrutura dobrada de cada dedo con- 15 têm uma volta beta antiparalela, uma região de extremidade de dedo e uma [alfa]-hélice anfifática curta. Os Iigantes de coordenação de metal se ligam ao íon de zinco e, no caso de dedos de zinco de tipo zif268, a alfa-hélice anfifática curta liga no sulco principal de DNA. Além disso, a estrutura do dedo de zinco é estabilizada por certos resíduos de aminoácidos hidrofóbi- 20 cos conservados (por exemplo, o resíduo diretamente passa no primeiro Cys conservado e o resíduo na posição +4 do segmanto helicoidal do dedo) e por coordenação de zinco através dos resíduos de cisteína e histidina con- servados.
Proteínas de dedo de zinco canônicas (C2H2) tendo alterações 25 nas posições tornado contatos de base direto, resíduos de "suporte" ou "con- traforte" imediatamente adjacente às posições de contato de base, e posi- ções capazes de contatar a cadeia principal de fosfato do DNA foram descri- tas. Vide, por exemplo, as patentes U.S Nos. 6.007.988; 6.013.453; 6.140.081; 6.866.997; 6.746.838; 6.140.081; 6.610.512; 7.101.972; 30 6.453.242; 6.785.613; 7.013.219; PCT WO 98/53059; Choo e outros (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Segal e outros (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:34-39. Além disso, proteínas de dedo de zinco contendo dedos de zinco com resíduos de coordenação de zinco modificados foram também descritos (vide, por exemplo, Pedidos de Patente Nos. 20030108880, 20060246567 e 20060246588; cujas descrições são incorporadas por referência). No entan- 5 to, enquanto proteínas de dedo de zinco contendo esses dedos de zinco não-canônicos retêm a função reguladora de transcrição de gene, sua capa- cidade de agir como nucleases de dedo de zinco (ZFNs) é em alguns casos diminuídas em relação a proteínas de dedo de zinco que consistem de de- dos de zinco de C2H2, canônicos.
Assim, permanence uma necessidade, particularmente na cons-
trução de nucleases de dedo de zinco, para proteínas de ligação de dedo de zinco engenheiradas adicionais contendo dedos de zinco tendo regiões de coordenação de zinco não-canônicas otimizadas.
Sumário
A presente descrição provê domínios de ligação de DNA de de-
do de zinco com alterações em pelo menos um resíduo de coordenação de zinco. Em particular, descritos aqui são dedos de zinco de CCHC. Esses dedos de zinco de CCHC podem ulteriormente compreender alterações adi- cionais (substituições, inserções e/ou deleções), na proximidade dos resí- 20 duos de coordenação de zinco, por exemplo, nos resíduos que envolvem o resíduo de coordenação de zinco mais C-terminal do dedo de zinco. Polipep- tídeos de dedo de zinco e proteínas de fusão compreendendo um ou mais desses dedos de zinco de CCHC, polinucleotídeos que codificam esses de- dos de zinco e proteínas de fusão e métodos de uso desses polipeptídeos 25 de dedo de zinco e/ou proteínas de fusão são também descritos.
Assim, a presente descrição inclui, mas não é limitada às se- guintes concreizações numeradas:
1. Uma proteína de dedo de zinco compreendendo um dedo de zinco de (não C2H2) não-canônico, em que o dedo de zinco não-canônico tem uma porção helicoidal envolvida na ligação de DNA e em que a região de coordenação de zinco da porção helicoidal compreende a seqüência de a- -minoácidos HX1X2RCXL (SEQ ED NO:2); e em que a proteína de dedo de zinco é engenheirada para se ligar a uma sequência-alvo.
2. A proteína de dedo de zinco da concretização 1, em que X1 é Ae X2 é Q.
3. A proteína de dedo de zinco da concretização 1, em que X1 é Ke X2 é E.
4. A proteína de dedo de zinco da concretização 1, em que X1 é T e X2 é R.
5. A proteína de dedo de zinco da concretização 1, em que XL é G.
6. Uma proteína de dedo de zinco compreendendo dois ou mais de-
dos de zinco, em que pelo menos um dedo de zinco compreende a sequên-
' cia Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-( Xc)3-5-Cys-(XD)i.10 (SEQ ED NO:3), em que Xa, Xb, Xc e Xd podem ser qualquer aminoácido.
7. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 1 a 6, compreendendo qualquer uma das seqüências mostradas em
qualquer uma das tabelas 1, 2, 3 ou 4.
8. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 6 ou 7, em que X0 compreende a seqüência QLV ou QKP.
9. A proteína de dedo de zinco da concretização 8, em que a seqüên- cia QLV ou QKP são os 3 resíduos de aminoácidos C-terminais do dedo de
zinco.
10. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 6 a 9, em que X0 compreende 1, 2 ou 3 resíduos de Gly (G).
11. Uma proteína de dedo de zinco compreendendo uma pluralidade de dedos de zinco, em que pelo menos um dos dedos de zinco compreende
um dedo de zinco de CCHC de acordo com qualquer uma das concretiza- ções de 1 a 10.
12. A proteína de dedo de zinco da concretização 11, em que a prote- ína de dedo de zinco compreende 3, 4, 5 ou 6 dedos de zinco.
13. A proteína de dedo de zinco da concretização 11 ou 12, em que
dedo 2 compreende o dedo de zinco de CCHC.
14. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 11 a 13, em que o dedo de zinco C-terminal compreende o dedo de C- CHC.
15. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 11 a 14, em que pelo menos dois dedos de zinco compreendem o dedo de zinco de CCHC.
16. A proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações
de 11 a 15, em que a proteína de dedo de zinco compreende qualquer uma das seqüências mostradas na tabela 8 e é engenheirada para se ligar a uma sequência-alvo em um gene de IPP2-K.
17. Uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 1 a 16 e um ou mais domínios
funcionais.
18. Uma proteína de fusão compreendendo:
(a) um semidomínio de clivagem,
(b) a proteína de dedo de zinco de qualquer uma das concretizações de 1 a 16, e
(c) um Iigante de ZC interposto entre o semidomínio de clivagem e a proteína de dedo de zinco.
19. A proteína de fusão da concretização 18, em que o comprimento do Iigante de KC é 5 aminoácidos.
20. A proteína de fusão da concretização 19, em que a seqüência de
aminoácidos do Iigante de KC é GLRGS (SEQ ID NO:4).
21. A proteína de fusão da concretização 18, em que o comprimento do Iigante de KC é 6 aminoácidos.
22. A proteína de fusão da concretização 21, em que a seqüência de aminoácidos do Iigante de KC é GGLRGS (SEQ ID NO:5).
23. Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das concretizações de 1 a 16 ou uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das concretizações de 17 a 22.
24. Um método para a clivagem direcionada de cromatina celular em uma célula de planta, o método compreendendo expressão, na célula, um
par de proteínas de fusão de acordo com qualquer uma das concretizações de 18 a 22; em que: (a) as sequências-alvo das proteínas de fusão estão dentro de dez nucleotides entre si; e
(b) as proteínas de fusão dimerizam e clivam DNA localizado entre as sequências-alvo.
25. Um método de recombinação genética direcionada em uma célula
de planta hospedeira, o método compreendendo: (a) expressão, na célula hospedeira, um par de proteínas de fusão de acordo com qualquer uma das concretizações de 18 a 22, em que as sequências-alvo das proteínas de fu- são estão presentes em um local-alvo de hospedeiro escolhido; e (b) identificação de uma célula hospedeira recombinante que exibe
uma alteração de seqüência no local-alvo do hospedeiro.
26. O método de qualquer concretização 24 ou 25, em que a altera- ção de seqüência é uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma deleção de material genético, uma inserção de material genético, uma
substituição de material genético e qualquer sua combinação.
27. O método de qualquer uma das concretizações de 24 a 26, ulteri- ormente compreendendo introdução de um polinucleotídeo exógeno para dentro da célula hospedeira.
28. O método da concretização 27, em que o polinucleotídeo exógeno compreende seqüências homólogas ao local-alvo do hospedeiro.
29. O método de qualquer uma das concretizações de 24 a 28, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em um monocotiledôneo, um dicotiledôneo, gimnoespermas e algas eucarióticas.
30. O método da concretização 29, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, batata, soja, tomate, tabaco, mem- bros da família de Brassica, e Arabidopsis.
31. O método de qualquer uma das concretizações de 24 a 29, em que a planta é uma árvore.
32. O método de qualquer uma das concretizações de 24 a 31, em que as sequências-alvo estão em um gene de IPP2K.
33. Um método para a redução do nível de ácido fítico em sementes, o método compreendendo inativação ou alteração de um gene de IPP2-K de acordo com a concretização 32.
34. Um método para a produção de fósforo mais metabolicamente disponível em semente, o método compreendendo inativação ou alteração de um gene de IPP2-K de acordo com a concretização 32.
35. Uma célula de planta compreendendo uma proteína de dedo de
zinco de acordo com qualquer uma das concretizações de 1 a 16, uma pro- teína de fusão de acordo com qualquer uma das concretizações de 17 a 22 ou um polinculeotídeo de acordo com a concretização 23.
36. A célula de planta da concretização 35, em que a célula é uma semente.
37. A célula de planta da concretização 36, em que semente é uma semente de milho.
38. A célula de planta de qualquer uma das concretizações de 35 a 37, em que IPP2-K é parcialmente ou totalmente inativado.
39. A célula de planta da concretização 38, em que os níveis de ácido
fítico na semente são reduzidos.
40. A célula de planta da concretizaçãos 35 a 39, em que níveis me- tabolicamente disponíveis de fósforo na célula são aumentados.
Breve Descrição dos Desenhos Figura 1 é um gráfico que mostra taxas de correção de gene,
como medidas pela percentagem de células que expressam GFP, em um sistema de ensaio de repórter de célula de GFP como descrito na patente U.S. No. 2005/0064474 e abaixo. As variantes de ZFN são designadas X-Y," em que "X" refere-se ao número de tabela e Ύ" refere-se ao número dado o 25 dedo de zinco na tabela particularmente selecionável. Por exemplo, "2-21" refere-se a um ZFN tendo um dedo compreendendo a seqüência mostrada na tabela 2 na fileira numerada 21, a saber HAQRCGLRGSQLV (SEQ ID NO:53).
Figura 2 é um gráfico que mostra a percentagem de sinal de Cel- 1 que resulta da clivagem usando-se vários pares de variantes de ZFN. Os resultados de duas experiências são mostradas para cada par de ZFNs por referência ao número de amostra. Os pares de variantes usados para cada amostra são mostrados na caixa no canto direito superior, em que "5-8 de peso" e "5-9 peso" referem-se a pares de ZFN canônico descritos no exem- plo 14 (Tabela 17) do pedido de patente U.S. No. 2005/0064474. Nas amos- tras 3-12, a região C-terminal das hélices de reconhecimento de dedo 2 ou 5 dedo 4 do ZFN canônico 5-8 ou 5-9 são substituídos com seqüências não- canônicas. Seqüência parcial das variantes de ZFN não-canônicas designa- das 20, 21, 43, 45, 47 e 48 nas amostras 3-12 e a posição de dedo dessas variantes dentro do ZFN de dedo 4 são mostradas no canto esquerdo de topo acima do gráfico. O asterisco acima da barra que mostra resultados da 10 experiência 2 para as amostras 8 e 9 indica base na raia, que resulta em ums sob-estimação de eficácia de ZFN.
Figura 3 é um gráfico que mostra taxas de correção de gene no sistema de ensaio de repórter de célula de GFP descrito na patente U.S. No. 2005/0064474 e aqui. Os pares de ZFN testados em cada amostra são mos- 15 trados abaixo de cada barra, em que os números de dedo de zinco 20, 21, 43, 45, 47 e 48 e são aqueles descritos no exemplo 3 e dedos de zinco de CCHC 1a até 10a comprendem a seqüência mostrada na tabelas 3 e 4. De- dos de zinco 20, 21, 7a, 8a, 9a e 10a foram usados no Dedo 4; dedos de zinco 43, 45, 47, 48, Ia, 2a, 3a, 4a, 5a, e 6a foram usados no dedo 2.
Figura 4 é uma representação linear de plasmídio pDAB1585,
um vetor-alvo para tabaco.
Figura 5 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1585, um vetor-alvo para tabaco.
Figuras 6A e 6B mostram nucleases de dedo de zinco (ZFN). FIGURA 6 A é um esquemático que mostra ligação de ZFN. FIGURA 6B mostra a seqüência da sequência-alvo.
Figura 7 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB1400.
Figura 8 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB782.
Figura 9 é uma representação esquemática de plasmídio pDABI
582. Figura 10 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB354. Figura 11 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1583. Figura 12 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB2407. Figura 13 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1584. Figura 14 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB2418. Figura 15 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB4045. Figura 16 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1575. Figura 17 é uma representação esquemática de. plasmídio pDAB1577. Figura 18 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1579. Figura 19 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1580. Figura 20 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB3401. Figura 21 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1570. Figura 22 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1572. Figura 23 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB4003. Figura 24 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1571. Figura 25 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB7204. Figura 26 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1573. Figura 27 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1574.
Figura 28 é uma representação esquemática de plasmídio Figura 29 é uma representação esquemática de plasmídio pD Figura 30 são representações esquemáticas de plasmídio
pDAB1581.
AB 1576.
pDAB1600.
Figura 31
pDAB3731.
Figura 32
pDAB4322.
Figura 33
pDAB4331.
Figura 34 pDAB4332. Figura 35 pDAB4333.
Figura 36
PDAB4334.
Figura 37
PDAB4336.
Figura 38
pDAB4339.
Figura 39
pDAB4321.
Figura 40
pDAB4323.
Figura 41
pDAB4341.
Figura 42
pDAB4342.
Figura 43
pDAB4343.
Figura 44
pDAB4344.
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
é uma representação
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio
esquemática de plasmídio Figura 45 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB4346.
Figura 46 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB4330.
Figura 47 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB4351.
Figura 48 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB4356.
Figura 49 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB4359.
Figura 50 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB7002.
Figura 51 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB7025.
Figura 52 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB1591.
Figura 53 é uma representação esquemática de plasmídio pcD- NA3.1-SCD27a- LO-Fok I, o modelo de DNA usado para a ampliação de Scd27 ZFN.
Figura 54 é uma representação esquemática de plasmídio
PDAB1594.
Figura 55 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB1598.
Figura 56 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB1577.
Figura 57 é uma representação esquemática de plasmídio
pDAB1578.
Figura 58 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1601, o vetor de controle de gene de PAT.
Figura 59 é um esquemático que mostra a recombinação homó-
loga intracromossomal previstao estimulada por proteína de fusão de IL-1- Fok I. Figura 60 é uma representação esquemática de plasmídio pDAB1590, um controle de expressão de GFP positivo.
Figura 61 é um esquemático que mostra recombinação homólo- ga inter-cromossomal prevista estimulada por proteína de fusão de Fokl de 5 dedo de zinco de IL-1.
Figura 62 é um esquemático que mostra recombinação homólo- ga inter-cromossomal prevista estimulada por proteína de fusão de Fokl de dedo de zinco de Scd27.
Figura 63 é um gel que mostra análise de PCR dos recombinan- 10 tes. As 4 raias à esquerda à esquerda são marcadas acima do. Raias mar- cadas 1-5 mostram eventos de H da transformação de BY2-380 com Gene de proteína de fusão de IL-1-Fok I de C3H e raias marcadas 6-7 mostram eventos de H da transformação de BY2-380 com Gene de proteína de fusão de C3H SCD27-Fok1.
Figura 64 mostra uma seqüência de genes BPP2K de milho
(SEQ ID NO:6), derivada de cultura de célula de Hill1 e que serviram como um modelod de projeto para o engenheiramento de ZFNs direcionado a IPP2K de milho.
Figura 65 painéis de A a E, mostram um esquema de clonagem 20 de vetor de expressão de ZFN. Uma estratégia de clonagem por etapas foi usada para gerar construtos de expressão de ZFN. Genes de codificação de ZFN-individuais foram clonados em vetoress pVAX-N2A-NLSop2-EGFP- FokMono (A) e pVAX-C2A-NLSo[rho]2-EGFP-FokMono (B) para criar um cassete de proteína duplo (C). Esse cassete foi ligado em pDAB3872 (D) 25 para gerar um plasmídio final (E) para a expressão do heterodímero de ZFN.
Figura 66 mostra ligação de ZFN em um gene de IPP2K de mi- lho. Duas proteínas de ZFN são exigidas a realizar clivagem de fita dupla de DNA. A seqüência que envolve o sítio de clivagem (indicado como uma seta a jusante) é mostrada (SEQ ID NO:7). Uma proteína (8705) estava ligada a 30 seqüência CTGTGGGGCCAT (fio de topo) (SEQ ID NO:8), em que uma ou- tra proteína (8684, 8685, ou 8686) ligada a seqüência a jusante (CTTGAC- CAACTCAGCCAG, fio de fundo) (SEQ ID NO:9). Figura 67 mostra seqüências de tipo selvagem (seqüência de topo, SEQ ID NO: 10) e clone de ZFN 127 (seqüência de fundo, SEQ ID NO: 11). O alvo de clivagem para esse ZFN é altamente iluminado em uma caixa cinza.
Figura 68 mostra um alinhamento de múltiplas deleções que re-
sulta de união final não-homóloga (NHEJ) de uma quebra de dsDNA medi- dada por ZFN no gene de IPP2K de milho como a detecção por sequência- ção 454. O alvo de clivagem parar issso ZFN é altamente iluminado em uma caixa cinza.
Figura 69 é um gráfico que mostra taxas de correção de gene no
sistema de ensaio de repórter de célula de GFP descrito na patente U.S. No. 2005/0064474 e aqui. Os pares de ZFN testados em cada amostra são mos- trados abaixo em cada barra.
Figura 70 mostra plasmídio pDAB7471, construído como descri- to no exemplo 18B.
Figura 71 mostra plasmídio pDAB7451 , construído como descri- to no exemplo 18C.
Figura 72 é um esquemático que mostra um cassete de expres- são de gene de tolerância a herbicida autônoma exemplar. Essa construção compreende uma unitdade transcritiva de promotor completo (PTU) conten- do um promotor, gene de tolerância a herbicida e seqüência de terminação de poli adenilação (polyA) como descrito no exemplo 18D.
Figura 73 mostra plasmídio pDAB7422, construído como descri- to no exemplo 18E. O plasmídio inclui uma unidade transcritiva de promotor completa (PTU) contendo um promotor, gene de tolerância a herbicida e se- qüência de terminação de poli adenilação (polyA) inserido para dentro de uma cadeia principal de plasmídio na posição 1.
Figura 74 mostra plasmídio pDAB7452, construído como descri- to no exemplo 18E. O plasmídio inclui uma unidade transcritiva de promotor completa (PTU) contendo um promotor, gene de tolerância a herbicida e se- qüência de terminação de poli adenilação (polyA) inserido para dentro de uma cadeia principal de plasmídio na posição 2. Figura 75 é um esquemático que mostra um cassete de expres- são de gene de tolerância a herbicida não autônoma exemplar. Essa cons- trução compreende uma unidade transcritiva de promotor incompleta (PTU) contendo a gene de tolerância a herbicida e seqüência de terminação de poli adenilação (polyA) como descrito no exemplo 18F.
Figura 76 mostra plasmídio pDAB7423, construído como descri- to no Exemplo 18G. Esse plasmídio inclui an unidade transcritiva de promo- tor incompleta (PTU) contendo um gene de tolerância a herbicida e seqüên- cia de terminação de poli adenilação (polyA) inserido para dentro de uma cadeia principal de plasmídio na posição 1.
Figura 77 mostra plasmídio pDAB7454, construído como descri- to no Exemplo 18G. O plasmídio inclui an unidade transcritiva de promotor incompleta (PTU) contendo um gene de tolerância a herbicida e seqüência de terminação de poli adenilação (polyA) inserido para dentro de uma cadeia principal de plasmídio na posição 2 como descrito no exemplo 18G.
Figura 78 mostra plasmídio pDAB 7424 (um doador autônomo na posição 1 adaptado para Gateway(R) exemplar), construído como descri- to no exemplo 18H.
Figura 79 mostra plasmídio pDAB 7425 (um doador autônomo na posição 1 adaptado para Gateway(R) exemplar), construído como descri- to no exemplo 18H.
Figura 80 mostra plasmídio pDAB 7426, construído como descri- to no Exemplo 18H. pDAB 7426 é um plasmídio de combinação contendo o doador autônomo na posição 1 com um cassete de expressão de ZFN.
Figura 81 mostra plasmídio pDAB 7427, construído como descri-
to no exemplo 18H. pDAB 7427 é um plasmídio de combinação contendo o doador autônomo na posição 1 com a cassete de expressão de ZFN.
Figura 82 mostra ampliação de seqüências específicas de DNA de doador a partir de DNA genômico. A presença de um produto de 317 pb é diagnóstico para a presença de DNA de doador contendo o gene de PAT inserido para dentro do genoma de linha de calos de milho N0 61 - 72 como descrito no exemplo 20C. Hill indica um controle negativo de tipo selvagem. Figura 83 mostra ampliação do limite 5' entre DNA de doador e seqüências genômicas de milho específicas para EPP2K. Produtos de PCR secundários derivados de integração direcionada do doador no gene de IPP2K foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1.65 5 Kbp como descrito no exemplo 21 A. Hill indica um controle negativo de tipo selvagem.
Figura 84 mostra ampliação do limite 3' entre DNA de doador e seqüências genômicas de milho específicas para IPP2K. Produtos de PCR secundários derivados de integração direcionada do doador no gene de 10 IPP2K foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1.99 Kbp como descrito no exemplo 2 IA. Hill indica um controle negativo de tipo selvagem.
Figura 85 mostra ampliação do limite (5') a jusante entre geno- ma e doador. Produtos de PCR derivados de integração direcionada do doa- dor no gene de EPP2K (limite 5') foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1.35 Kbp de tamanho como descrito no exemplo 21B. Hill indica um controle negativo de tipo selvagem.
Figura 86 mostra ampliação do limite (3’-) a jusante entre doador e genoma. Produtos de PCR derivados de integração direcionada do doador no gene de IPP2K (limite 3') foram diagnosticados pela presença de frag- mentos de DNA de 1.66 Kbp de tamanho como descrito no exemplo 2 IB. Hill indica um controle negativo de tipo selvagem.
Figura 87 mostra a seqüência do flanqueamento de homologia na posição 15' (SEQ ID NO:171).
Figura 88 mostra a seqüência do flanqueamento de homologia
na posição 13' (SEQ ID NO: 172).
Figura 89 mostra a seqüência do flanqueamento de homologia na posição 25' (SEQ ID NO: 139).
Figura 90 mostra a seqüência do flanqueamento de homologia na posição 23'(SEQ ED NO: 140).
Figura 91 mostra a seqüência de uma seqüência genômica IPP2K (5‘) a jusante das regiões direcionadas de ZFN (SEQ ID NO: 141). Figura 92 mostra a seqüência de uma seqüência genômica IPP2K (3') a jusante das regiões direcionadas de ZFN (SEQ ID NO: 142).
Descrição Detalhada
Descritas aqui são composições compreendendo polipeptídeos 5 de ligação de dedo de zinco (ZFPs) contendo dedos de zinco não-canônicos do formato Cys-Cys-His-Cys. Visto que coordenação de zinco provê a ener- gia de dobra princpal para dedos de zinco, ajuste de resíduos de coordena- ção de zinco provê um meio pronto para a modificação de estabilidade e es- trutura de dedo, que impacta em uma variedade de características funcionais 10 importantes de proteínas de dedo de zinco, incluindo, por exemplo, semivida celular, interações com outros fatores celulares, afinidade e especificidade de ligação de DNA, e orientação relativa de domínios funcionais.
Proteínas de dedo de zinco compreendendo dedos de zinco não-canônicos tais como aquelas descritas nos pedidos de patente U.S. 15 Nos. 20030108880; 20060246567; e 20060246588 foram mostradas ligarem DNA e alterarem transcrição. No entanto, quando incorporadas em nuclea- ses de dedo de zinco (ZFNs, vide, por exemplo, publicação de pedido de patente US No. 2005/0064474), essas proteínas de dedo de zinco não- canônicas anteriormente descritas podem algumas vezes exibir atividade 20 sub-ótima na clivagem do DNA alvo.
Descritas aqui são proteínas de dedo de zinco compreendendo um ou mais dedos de zinco de CCHC, em que seqüências específicas que envolvem o par C-terminal de resíduos de coordenação de zinco foram alte- radas. Também descritas são proteínas de fusão, por exemplo, nucleases de 25 dedo de zinco (ZFNs), compreendendo esses dedos de zinco não-canônicos otimizados, em que osFNs clivam o DNA alvo a taxas comparáveis a cliva- gem alcançada usando-se ZFNs compreendendo dedos de zinco canônicos (CCHH).
Polipeptídeos de fusão, como descritas aqui, podem aumentar ou suprimir a transcrição de um gene, e/ou clivam uma sequência-alvo. Poli- nucleotídeos que codificam dedos de zinco não-canônicos otimizados, e po- linucleotídeos que codificam proteínas de fusão compreendendo um ou mais dedos de zinco não-canônicos otimizados são também providos. Adicional- mente providas são composições farmacêuticas compreendendo uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos polipeptídeos de ligação de nucleotídeo de dedo de zinco descritos aqui ou seus fragmentos funcio- 5 nais; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma seqüência de nu- cleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos modificados de liga- ção de nucleotídeo de dedo de zinco ou seus fragmentos funcionais, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Ulteriormente providas são composições agrícolas compreendendo uma quantidade agro- 10 nicamente eficaz de qualquer um dos polipeptídeos de ligação de nucleotí- deo de dedo de zinco descobertos aqui ou seus fragmentos funcionais; ou uma quantidade agronicamente eficaz de uma seqüência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos modificados de ligação de nu- cleotídeo de dedo de zinco ou seus fragmentos funcionais, em combinação 15 com um veículo agriculturalmente aceitável. Também providos são métodos de triagem para obtenção de um polipeptídeo de ligação de nucleotídeo de dedo de zinco modificado que se liga a uma seqüência genômica.
Seqüências genômicas incluem aquelas presentes em cromos- somas, epissomas, genomas organelares (por exemplo, mitocôndria, cloro- 20 plastos), cromossomas artificiais e qualquer outro tipo de ácido nucleico pre- sente em uma célula tais como, por exemplo, seqüências ampliadas, cro- mossomas de minuto duplo e os genomas de vírus e bactérias endógenas ou infecciosas. Seqüências genômicas podem ser normais (isto é, tipo sel- vagem) ou mutante; seqüências mutantes podem compreender, por exem- 25 pio, inserções, deleções, substituições, translocações, redisposições, e/ou mutações por ponto. Uma seqüência genômica pode também compreender um de numerosos alelos.
Geral
Prática dos métodos, bem como preparação e uso das composi- ções descritas aqui empregam, a não ser que de outra maneira indicada, ctécnicas convencionais na biologia molecular, bioquímica, análise e estrutu- ra de cromatina, química computacional, cultura de célula, DNA recombinan- te e campos relacionados quando estão dentro da habilidade da técnica. Es- sas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook e outros MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 e Third edition, 5 2001; Ausubel e outros, CURRENT PROTOCOLS NA BIOLOGIA MOLECU- LAR, John Wiley & Sons, New York, 1987 e periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, ES- TRUTURA DE CROMATINA E FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" 10 (P.M. Wassarman e A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS NA BIOLOGIA MOLECULAR, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definições
Os termos "ácido nucleico," "polinucleotídeo," e "oligonucleotí- 15 deo" são usados intercambeavelmente e referem-se a um polímero de deo- xirribonucleotídeo ou de ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular, e em qualquer forma de fio único ou de fita dupla. Para as finalidades da pre- sente descrição, esses termos não devem ser interpretados como Iimitantes com relação ao compimento de polímero. Os termos podem incluir análogos 20 conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modi- ficados na base, porções de fosfato e/ou açúcar (por exemplo, cadeias prin- cipais de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo particular tem a mesma especificidade de emparelhamento de base; isto é, um análo- go de A unirá na base com T.
Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados in-
tercambeavelmente para referir-se a um polímero de resíduos de aminoáci- do. O termo também se aplica a polímeros de aminoácido em que um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de ami- noácidos de ocorrência natural correspem quentes.
"Ligação" refere-se a uma interação não covalente, específica
de seqüência entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes da interação da ligação neces- sitam ser específicas de seqüência (por exemplo, contatos com resíduos de fosfato em uma cadeia principal de DNA), contanto que a interação como um todo seja específica de seqüência. Tais interações são em geral caracteriza- das por uma constante dissociação (K0) de 10'6 M'1 ou menor, "afinidade" 5 refere-se à resistência de ligação: afinidade de ligação aumentada estando correlacionada com Kd mais baixa.
Uma ligação proteína" é uma proteína que é capaz de se ligar não covalentemente a uma outra molécula. A ligação proteína pode se ligar
a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação de DNA), 10 uma molécula de RNA (uma proteína de ligação de RNA) e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação de proteína). No caso de uma proteína de ligação de proteína, ela pode se ligar à mesma (para formar homodíme- ros, homotrímeros, etc.) e/ou ela pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína diferente or proteínas. A ligação proteína pode ter mais do que 15 um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, proteínas de dedo de zinco têm atividade de ligação de DNA, ligação de RNA e ligação de proteína.
Uma "proteína de ligação de DNA de dedo de zinco" (ou domí- nio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro dentro de proteína maior, que liga DNA em um modo específico de seqüência através de um ou 20 mais dedos de zinco, que são regiões de seqüência de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura está estabilizada através de coordena- ção de um íon de zinco. O termo proteína de ligação de DNA de dedo de zinco é frequentemente abreviado como dedo de zinco proteína ou ZFP.
Domínios de ligação de dedo de zinco podem "ser engenheira- 25 dos" para se ligar a uma seqüência de nucleotídeos predeterminada. Exem- plos não-limitantes de métodos para o engenheiramento de proteínas de dedo de zinco são projetos e seleção. Uma proteína de dedo de zinco proje- tada é uma proteína de não ocorrência natural cujo projeto/composição re- sulta principalmente de critérios racionais. Critérios racionais para o projeto 30 incluem aplicação de regras de substituição e algorrítmos computadorizados para o processamento de informação em uma informação de armazenagem de base de dados dados de ligação e projetos de ZPF existentes. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261; e 6.785.613; vide. também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496; e as patentes U.S. 6.746.838; 6.866.997; e 7.030.215.
Uma proteína de dedo de zinco "selecionada" é uma proteína 5 não encontrada na natureza cuja produção resulta principalmente a partir de um processo empírico tal com exibição de fago, armadilha de interação ou seleção híbrida. Vide por exemplo, US 5.789.538; US 5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; US 6.733.970; US RE39.229; e WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 10 01/60970 WO 01/88197 e WO 02/099084.
Uma proteína de dedo de zinco "não-canônica" é umaproteína compreendendo um dedo de zinco não-canônico (não C2H2). Um dedo de zinco não-canônico assim compreende uma substituição, adição e/ou dele- ção de pelo menos um aminoácido, em comparação com uma proteína de 15 dedo de zinco de C2H2 naturalmente ocorrente. Exemplos não-limitantes de dedos de zinco não-canônicos incluem aqueles compreendendo resíduos de coordenação de zinco (de amino a carbóxi) de Cys-Cys-His-Cys (por exem- plo, C3H).
Uma "seqüência homóloga" refere-se a uma primeira seqüência que partilha um grau de identidade de seqüência com uma segunda seqüên- cia, e cuja seqüência pode ser idêntica àquela da segunda seqüência. Uma "seqüência não-idêntica, homóloga" refere-se a uma primeira seqüência que partilha um grau de identidade de seqüência com uma segunda seqüência, mas cuja seqüência não é idêntica àquela da segunda seqüência. Por e- xemplo, um polinculeotídeo compreendendo a seqüência de tipo selvagem de um gene mutante é homóloga e não-idêntica à seqüência do gene mutan- te. Em certas concretizações, o grau de homologia entre as duas seqüências é suficiente para permitir recombinação homóloga entre as mesmas, utiliza- ção de mecanismos celulares normais. Duas seqüências não-idênticas ho- mólogas podem ter qualquer comprimento e seu grau de não homologia po- de ser tão pequeno quanto um único nucleotídeo (por exemplo, para a cor- reção de uma mutação de ponto genômico por recombinação homóloga di- recionada) ou tão grande quanto 10 ou mais quilobases (por exemplo, para a inserção de um gene a um sítio predeterminado em um cromossoma). Dois polinucleotídeos compreendendo as seqüências não-idênticas homólogas não necessitam ter o mesmo comprimento. Por exemplo, um polinucleotídeo 5 exógeno (isto é, polinucleotídeo de doador) de entre 20 e 10.000 nucleotí- deos ou pares de nucleotídeo podem ser usados.
Técnicas para a determinação de identidade de seqüência de aminoácidos e ácidos nucleicos são conhecidas na técnica. Tipicamente, tais técnicas incluem determinação da seqüência de nucleotídeos do RNA para 10 um gene e/ou determinação da seqüência de aminoácidos codificada desse modo, e comparação dessas seqüências com uma segunda seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos. Seqüências genômicas podem também ser determinadas e comparadas nessa forma, em geral, identidade refere-se a uma correspondência de nucleotídeo-para-nucleotídeo ou aminoácido-para- 15 aminoácido exata de duas seqüências de polinucleotídeos or polipeptídeos, respectivamente. Duas ou mais seqüências (polinucleotídeos ou aminoáci- dos) podem ser comparadas por determinação de sua percentagem de iden- tidade. A percentagem de identidade de duas seqüências, se seqüências de aminoácidos ou ácidos nucleicos, é o número emparelhamentos exatos en- 20 tre duas seqüências alinhadas divididas pelo comprimento das seqüências mais curtas e multiplicadas por 100. Um alinhamento aproximado para se- qüências de ácidos nucleicos é provido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Es- se algoritmo pode ser aplicado a seqüências de aminoácidos por uso da ma- 25 triz de classificação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences e Structure. M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Re- search Foundation, Washington, D. C, USA, e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Uma implentação exemplar desse algoritmo para determinar a percentagem de identidade da seqüência é pro- 30 vido pelo Genetics Computer Group (Madison, Wl) na aplicação de utilidade "BestFit". Os parâmetros padrão para esse método são descritos no Wis- consin Sequence Analysis Package Program Manual, Versão 8 (1995) (avai- Iable from Genetics Computer Group, Madison, Wl). Um método exemplar de estabelecimento de percentagem de identidade no contexto da presente descrição é usar a embalagem de MPSRCH de programas copyrighted by the University of Edinburgh, desenvolvido by John F. Collins e Shane S.
Sturrok1 e distribuído por InteIIiGenetics1 Inc. (Mountain View1 CA). A partir desse conjunto de embalagens o algoritmo Smith-Waterman pode ser em- pregado em que parâmetros padrão são usados para a tabela de classifica- ção (por exemplo, pênalti aberto de lacuna de 12, pênalti de extensão de lacuna de um, e uma lacuna de seis). A partir dos dados gerados o valor de 10 "Emparelhamento" reflete a identidade de seqüência. Outros programas a- dequados para o cálculo da percentagem de identidade ou similaridade entre seqüências são em geral conhecidos na técnica, por exemplo, uma outro programa de alinhamento é BLAST1 usado com parâmetros padrão. Por e- xemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados usando-se os seguintes pa- 15 râmetros padrão: código genético = padrão; filtro = nenhum; fio = ambos; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 seqüências; espécie por = HIGH SCORE; Base de dados = traduções de GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + proteína suíça + Spupdate + PIR não redundantes. Detalhes desses programas podem ser encontrados na 20 internet. Com relação a seqüências descritas aqui, a faixa de graus deseja- dos de identidade de seqüência é cerca de 35% a 100% e qualquer valor de número inteiro entre os mesmos. Tipicamente a percentagem de identidades entre seqüências são pelo menos de 35%-40%; 40%-45%; 45%-50%; 50%- 60%; 60%-70%; 70-75%, de preferência de 80-82%, mais de preferência 85- 25 90%, ainda mais de preferência 92%, ainda mais de preferência 95%, e com mais preferência 98% de identidade de seqüência.
Alternativamente, o grau de seqüência similaridade entre polinu- cleotídeos pode ser determinado por hibridização de polinucleotídeos sob condições que permitem a formação de duplex estáveis entre regiões homó- 30 Iogas, seguido por digestão com nuclease(s) específica(s) de fio único, e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. Duas seqüências de ácidos nucleicos, ou seqüências de polipeptídeos são substancialmente ho- mólogas entre si quando as seqüências exibem pelo menos cerca de 70%- 75%, de preferência 80%-82%, mais de preferência 85%-90%, mesmo mais de preferência 92%, ainda mais de preferência 95%, e e com mais preferên- cia 98% de identidade de seqüência sobre um comprimento definido das 5 moléculas, como determinados usando-se os métodos acima. Como usado aqui, substancialmente homóloga também refere-se a seqüências que mos- tram identidade completa com uma seqüência de DNA ou seqüência de poli- peptídeos especificada. Seqüências de DNA que são substancialmente ho- mólogas podem ser identificadas em uma experiência de hibridização de 10 Southern sob, por exemplo, condições rigorosas, como definidas para aque- le sistema particular. Definição de condições de hibridização apropriadas está dentro da habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, supra; Nucleic Acid Hibridização: A Practical Approach, editors B.D. Hames e SJ. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; ERL Press).
Hibridização seletiva de dois fragmentos de ácido nucleico pode
ser determinado como se segue. O grau de identidade de seqüência entre duas moléculas de ácido nucleico afeta a eficácia e resistência de eventos de hibridização entre tais moléculas. Um seqüência de ácidos nucleicos par- cialmente idêntica pelo menos parcialmente inibirá a hibridização de uma 20 seqüência totalmente idêntica a uma molécula-alvo. Inibição de hibridização da seqüência totalmente idêntica pode ser passada usando-se ensaios de hibridização que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, Southern (DNA) blot, Northern (RNA) blot, hibridização de solução, ou semelhantes, vide Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second 25 Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.). Tais ensaios podem ser conduzi- dos usando-se graus variáveis de seletividade, por exemplo, usando-se con- dições que variam de severidade de baixa a alta. Se condições de baixa se- veridade forem empregadas, a ausência de ligação não específica pode ser avaliada usando-se uma sonda secundária que carece mesmo um grau par- 30 ciai de identidade de seqüência (por exemplo, uma sonda tendo menos do que cerca de 30% de identidade de seqüência com a molécula-alvo), tal que, na ausência de eventos de ligação não específicos, a sonda secundária não hibridizará para dar o alvo.
Quando da utilização um sistema de detecção à base de hibridi- zação, uma sonda de ácido nucleico é escolhida que é complementar a uma seqüência de ácidos nucleicos de referência, e então por seleção de condi- ções apropriadas da sonda e da seqüência de referência seletivamente hi- bridizam, ou se ligam, entre si, para formar uma molécula duplex. Uma mo- lécula de ácido nucleico que é capaz de hibridizar seletivamente para dar uma seqüência de referência sob condições de hibridização moderadamente rigorosas tipicamente hibridiza sob condições que permitem a detecção de uma seqüência de ácidos nucleicos alvo de pelo menos cerca de 10-14 nu- cleotídeos de comprimento tendo pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência com uma seqüência da sonda de ácido nucleico selecionado. Condições de hibridização rigorosas tipicamente permitem a detecção de . seqüências de ácidos nucleicos alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleo- tídeos de comprimento tendo a identidade de seqüência de mais do que cer- ca de 90-95% com a seqüência da sonda de ácido nucleico selecionada. Condições de hibridização úteis para sonda/hibridização de seqüência de referência, em que a sonda e seqüência de referência têm um grau específi- co de identidade de seqüência, podem ser determinados como é conhecido na técnica (vide, por exemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Appro- ach, editors B.D. Hames e SJ. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).
Condições para a hibridização são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Hibridização rigorosa refere-se ao grau ao qual condi- 25 ções de hibridização desfavorecem a formação de híbridos contendo nucleo- tídeos desemparelhados, com servedidade mais alta correlacionada com uma tolerância mais baixa para híbridos desemparelhados. Fatores que afe- tam a severidad de hibridização são bem conhecidas por aqueles de versa- dos na técnica e incluem, mas não são limitados a, temperatura, pH, concen- 30 tração iônica, e concentração de solventes orgânicas tais como, por exem- plo, formamida e dimetilsulfóxido. Como é conhecido por aqueles versados na técnica, hibridização rigorosa é aumentada por temperaturas mais altas, concentração iônica mais baixa e concentrações de solvente mais baixas.
Com relação a condições rigorosa para a hibridização, é bem conhecido na técnica que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para estabelecer uma severidade particular por variação, por 5 exemplo, os seguintes fatores: o comprimento e natureza das seqüências, composição de base das várias seqüências, concentrações de sais e outros componentes de solução de hibridização, a presença ou a ausência de a- gentes de bloqueamento em uma soluções de hibridização (por exemplo, sulfato de dextrano, e polietileno glicol), temperatura de reação de hibridiza- 10 ção e parâmetros de tempo, bem como, condições de lavagem variáveis. A seleção de um conjunto particular de condições de hibridização é seleciona- da após os métodos padrão na técnica (vide, por exemplo, Sambrook, e ou- tros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.).
"Recombinação" refere-se a um processo de troca de informa-
ção genética entre dois polinucleotídeos. Para as finalidades dessa descri- ção, "recombinação homóloga (H)" refere-se à forma especializada de tal troca que ocorre, por exemplo, durante o reparo de rupturas de fita dupla em células. Esse processo exige homologia de seqüência de nucleotídeos, usa 20 uma molécula de "doador" para reparo de modelo de uma molécula "alvo" (isto é, aquela que experimentou a ruptura de fio dulo), e é variavelmente conhecida como a "conversão de gene de não cruzamento" ou "conversão de gene de trato curto," porque leva à transferência de informação genética a partir do doador para alvo. Sem querer estar ligado por qualquer teoria par- 25 ticular, tal transferência pode envolver correção emparelhada de DNA hete- roduplex que forma entre o alvo rompido e o doador, e/ou "anelamento de fio dependente de síntese," em que o doador é usado para ressintetizar a in- formação genética que tornará parte do alvo, e/ou processos relacionados. Tal H especializado frequentemente resulta em uma alteração da seqüência 30 da molécula-alvo tal que parte ou a totalidade da seqüência do polinucleotí- deo de doador é incorporada no polinucleotídeo alvo.
"Clivagem" refere-se à ruptura da cadeia principal covalente de uma molécula de DNA. Clivagem pode ser iniciada por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, hidrólise enzimática ou química de uma ligação de fosfodiéster. Tanto clivagem de fio único quanto clivagem de fita dupla são possíveis, e clivagem de fita dupla pode ocorrer como um re- 5 sutlado de dois eventos de clivagem de fio único distintos. Clivagem de DNA pode resultar na produção ou de extremidades abruptas ou extremidades escalonadas ("staggered"). Em certas concretizações, polipeptídeos de fu- são são usados para clivagem de DNA de fita dupla direcionado.
Um "domínio de clivagem" compreende um ou mais seqüência de polipeptídeos que possui atividade catalítica para a clivagem de DNA. A domínio de clivagem pode estar contido emu ma cadeia de polipeptído sim- ples ou atividade de clivagem pode resultar da associação de dois (ou mais).
Um "semidomínio de clivagem" é uma seqüência de polipeptí- deos que, em combinação com um segundo polipeptídeo (ou idêntico ou diferente) forma um complexo tendo atividade de clivagem (por exemplo, atividade de clivagem de fita dupla).
Os termos "domínio de clivagem" e "semidomínio de clivagem" inclui porções e domínios de tipo selvagem ou mutantes de domínios de cli- vagem ou semidomínios de clivagem que retêm a capacidade de multimeri- zar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional.
"Cromatina" é a estrutura de nucleoproteína compreendendo um genoma celular. Cromatina celular compreende ácido nucleico, principalmen- te DNA, e proteína, incluindo proteínas cromossomais de não histona e his- tonas. A maioria da cromatina celular eucariótica existe na forma de nucle- 25 ossomas, em que um núcleo de nucleossoma compreende cerca de 150 pares de base de DNA associado a um octâmero compreendendo duas de cada histonas H2A, H2B, H3 e H4; e DNA de Iigante (de comprimento variá- vel dependendo do organismo) estende entre núcleos de nucleossoma. Uma molécula de histona Hl está em geral associado ao DNA de ligante. Para as 30 finalidades da presente descrição, o termo "cromatina" destina-se a incluir todos os tipos de nucleoproteína celular, tanto procariótica quanto eucarióti- ca. Cromatina celular inclui tanto cromatina epissomal quanto cromossomal. Um "cromossoma," é um complexo de cromatina compreenden- do a totalidade ou uma porção do genoma de uma célula. O genome de uma célula é frequentemente caracterizado por seu cariótipo, que é a coleção de todos os cromossomas que compreendem o genoma da célula. O genome 5 de uma célula pode compreender um ou mais cromossomas.
Um "epissoma" é uma replicação de ácido nucleico, complexo de nucleoproteína ou outra estrutura compreendendo um ácido nucleico que não é parte carótipo cromossomal de uma célula. Exemplos de epissomas incluem plasmídios e certos genomas virais.
Uma "região acessível" é um sítio na cromatina celular em que
um sítio-alvo presente no ácido nucleico pode estar ligado por uma molécula exógena que reconhece o sítio-alvo. Sem querer estar ligado por qualquer teoria particular, acredita-se que uma região acessível seja um que não está embalada em uma estrutura nucleossomal. a estrutura distinta de uma regi- 15 ão acessível pode frequentemente ser detectada por sua sensibilidade a sondas químicas e enzimáticas, por exemplo, nucleases.
Um "sítio-alvo" ou "sequência-alvo" é uma seqüência de ácidos núcleicos que define uma porção de um ácido nucleico ao qual uma molécu- la de ligação ligará, condições suficientes providas para ligação existem. Por exemplo, a seqüência 5’-GAATTC-3' é um sítio-alvo para endonuclease de restrição de Eco RI.
Uma molécula "exógena" é uma molécula que não está normal- mente presente em uma célula, mas pode ser introduzida para dentro de uma célula por um ou mais métodos genéticos, bioquímicos ou outros méto- 25 dos. "Presença normal na célula" é determinada com relação ao estágio de desenvolvimento particular e condições ambientais da célula. Assim, por e- xemplo, uma molécula que está presente apenas durante desenvolvimento embriônico de músculo é uma molécula exógena com relação a uma célula muscular adulto. Similarmente, uma molécula induzido por de estoque térmi- 30 co é uma molécula exógena com relação a uma célula de de estoque não térmico. Uma molécula exógena pode compreender, por exemplo, uma ver- são de funcionamento de uma molécula endógen de mal funcionamento ou uma versão de mal funcionamento de uma molécula endógeno de funciona- mento normal.
Uma molécula exógena pode ser, entre outras coisas, uma mo- lécula pequena, tal como é gerada por um processo químico combinatórío, ou uma macromolécula tal como uma proteína, ácido nucleico, carboidrato, lipídio, glicoproteína, lipoproteína, polissacarídeo, qualquer derivado modifi- cado das moléculas acima, ou qualquer complexo compreendendo um ou mais das moléculas acima. Ácidos nucleicos incluem DNA e RNA, podem ser de fio único ou duplo; podem ser lineare, ramificados ou circulares; e po- dem ser de qualquer comprimento. Ácido nucleicos incluem aqueles capazes de formar duplex, bem como ácidos nucleicos formadores de triplex. Vide, por exemplo, as patentes US Nos. 5.176.996 e 5.422.251. Proteínas inclu- em, mas não são limitadas a, proteínas de ligação de DNA, fatores de trans- crição, fatores de remodelação de cromatina, proteínas de ligação de DNA metiladas, polímeroases, metilases, demetilases, acetilases, deacetilases, cinases, fosfatases, integrases, recombinases, ligases, topoisomerases, gi- rases e helicases.
Uma molécula exógena pode ser o mesmo tipo de molécula co- mo uma molécula endógena, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína exógena. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode compreender um genoma viral de infecção, um fio T de Agrogacterium tumefacians, um plas- mídio ou epissoma introduzido para dentro de uma célula, ou um cromosso- ma que não está normalmente presente na célula. Ácido nucleicos exógenos ou polinucleotídeos podem, no entanto, contêm seqüências que são homó- Iogos ou idênticos a seqüências endógenas. Com relação a uma região ge- nômica endógena particular, uma "seqüência endógena" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que não está presente naquela região. Tal se- qüência endógena pode estar presente a uma outra localização cromosso- mal endógena ou pode não estar presente no genoma sob qualquer condi- ção. Assim, um polinucleotídeo exógeno pode conter tanto seqüências exó- genas quanto endógenas: por exemplo, um transgene flanqueado porse- quências homólogas a uma região genômica. Tais ácido nucleicos exógenos são usados nos métodos para a integração direcionada e recombinação di- recionada como descrito infra. Métodos para a introdução de moléculas exó- genas para dentro de células são conhecidos por aqueles versados na técni- ca e incluem, mas não são limitados a, transferência mediada por lipídio (isto 5 é, lipossomas, incluindo lipídios neutros e catiônicos), eletroporação, injeção direta, fusão de célula, bombardeamento de partículas, coprecipitação de fosfato de cálcio, transferência mediada por DEAE-dextrano e transferência mediada por vetor viral.
Por contraste com isso, uma molécula "endógena" é uma que 10 está normalmente presente em uma célula particular a um estágio de desen- volvimento particular sob particular condições ambientais. Por exemplo, um ácido nucleico endógeno pode compreender um cromossoma, o genoma de uma mitocôndria, cloroplasto ou outra organela, ou um ácido nucleico epis- semai de ocorrência natural. Moléculas endógenas adicionais podem incluir 15 proteínas, por exemplo, enzimas e fatores de transcrição.
Uma molécula de "fusão" é uma molécula em que duas ou mais moléculas de subunidade estão ligadas, por exemplo, covalentemente. As moléculas de subunidade podem ser o mesmo tipo químico de molécula, ou podem ser diferentes tipos químicos de moléculas. Exemplos do primeiro 20 tipo de fusão molécula incluem, mas não são limitadas a, proteínas de fusão (por exemplo, a fusão entre um domínio de DNA de ZFP de ligação e um domínio de clivagem) e fusão ácidos nucleicos (por exemplo, um ácido nu- cleico que codifica a proteína de fusão descrita supra). Exemplos do segun- do tipo de molécula de fusão incluem, mas não são limitadas a, uma fusão 25 entre um ácido nucleico formador triplex e um polipeptídeo, e uma fusão en- tre um aglutinante de sulco menor e um ácido nucleico.
Expressão de uma proteína de fusão em uma célula pode resul- tar de fornecimento da proteína de fusão à célula ou por fornecimento de um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão a uma célula, em que o po- 30 linculeotídeo é transcrito, e o transcrito é traduzido, para gerar a proteína de fusão. Transunião, clivagem de polipeptídeo e ligação de polipeptídeo po- dem também estar envolvidos na expressão de uma proteína em uma célula. Métodos para fornecimento de polinucleotídeo e de polipeptídeo as células são apresentados em outro lugar nessa descrição.
Um "gene," para as finalidades da presente descrição, inclui uma região de DNA que codifica um produto de gene (vide infra), bem como 5 todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto de gene, se ou não tais seqüências reguladoras são adjacentes a seqüências de codificação e/ou transcritas. Correspem quentemente, um gene inclui, mas não é neces- sariamente limitado a, seqüências de promotor, terminadores, seqüências reguladoras traducionais tais como sítios de ligação de ribossoma e sítios de 10 entrada de ribossoma internos, aumentadores, sileciadores, isoladores, ele- mentos de limite, origens de replicação, sitos de ligação de matriz e regiões de controle de local.
"Expressão de gene" refere-se à conversão da informação, con- tida em um gene, em um produto de gené. Um próduto de gene pode ser o 15 produto transcritivo direto de um gene (por exemplo , mRNA, tRNA, rRNA, RNA de sem sentido, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um mRNA. Produtos de gene também incluem RNAs que são modificados, por processos tais como capeamento, poliadenilação, metilação, e edição, e proteínas modificadas 20 por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADP- ribosilação, miristilação, e glicosilação.
"Modulação" de expressão de gene refere-se a uma mudança na atividade de um gene. Modulação de expressão pode incluir, mas não é limitada a, ativação de gene e repressão de gene.
Células de "planta" células incluem, mas não são limitadas a,
células de plantas monocotiledôneas (monocots) ou dicotiledôneas (dicots). Exemplos não-limitantes de monocots incluem plantas de cereal tais como milho, arroz, cevada, aveias, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, cebola, banana, e coco. Exemplos não-limitantes de dicots incluem tabaco, 30 tomate, girassol, algodão, beterraba, batata, alface, melão, soja, canola (ra- peseed), e alfalfa. Células de planta pode ser de qualquer parte da planta e/ou de qualquer estágio do desenvolvimento da planta. Uma "região de interesse" é qualquer região de cromatina celu- lar, tal como, por exemplo, um gene ou uma seqüência de não-codificação dentro de ou adjacente a um gene, em que é desejável de ligar uma molécu- la exógena. Ligação pode ser para as finalidades de clivagem de DNA dire- 5 cionada e/ou recombinação direcionada. A região de interesse pode estar presente em um cromossoma, um epissoma, um genoma organelar (por e- xemplo, mitocondrial, cloroplasto), ou um genoma viral de infecção, por e- xemplo. A região de interesse pode estar dentro da região de codificação de um gene, dentro de regiões de não-codificação transcritas tais como, por 10 exemplo, seqüências líder, seqüências trailer ou íntrons, ou dentro de regi- ões não transcritas, ou a montante ou a jusante da região de codificação. A região de interesse pode ser tão pequena quanto um par de nucleotídeo simples ou até 25.000 pares de nucleotídeo de comprimento, ou qualquer valor integral de pares de nucleotídeo.
Os termos "ligação operativa" e "operativamente ligada" (ou "o-
peraveimente") são usados intercambeavelmente com referência à justa- posição de dois ou mais componentes (tais como elementos de seqüência), em que os components são dispostos tal que ambos os componentes fun- cionam normalmente e permitem a possilibidade de que pelo menos um dos componentes podem mediar uma função que é exercida em pelo menos um dos outros componentes. A título de ilustração, uma seqüência reguladora transcritiva, tal como um promotor, está operativamente ligada a uma se- qüência de codificação se a seqüência reguladora transcritiva controlar o nível de transcrição da seqüência de codificação em resposta à presença ou a ausência de um ou mais fatores reguladores transcritivos. A seqüência reguladora transcritiva está em geral operativamente ligada em cis com uma seqüência de codificação, mas não necessita ser diretamente adjacente a ela. Por exemplo, um aumentador é uma seqüência reguladora transcritiva que é operativamente ligada a uma seqüência de codificação, embora eles sejam contíguos.
Com relação a polipeptídeos de fusão, o termo "operativamente ligada" pode referir-se ao fato de que cada um dos componentes realiza a mesma função na ligação ao outro componente como seria se ele não fosse assim ligado. Por exemplo, com relação a um polipeptídeo de fusão em que um domínio de DNA de ZFP de ligação é fundido a um domínio de clivagem, o domínio de DNA de ZFP de ligação e o domínio de clivagem estão na Iiga- 5 ção operativa se, no polipeptídeo de fusão, a porção de domínio de DNA de ZFP de ligação é capaz de ligar seu sítio-alvo e/ou seu sítio de ligação, en- quanto o domínio de clivagem é capaz de clivar DNA na proximidade do sí- tio-alvo.
Um "fragmento funcional" de uma proteína, polipeptídeo ou áci- do nucleico é uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico cuja seqüência não é idêntica à proteína de comprimento total, polipeptídeo ou ácido nuclei- co, ainda retém a mesma função que a proteína de comprimento total, poli- peptídeo ou ácido nucleico. Um fragmento funcional pode possuir mais, me- nos ou o mesmo número de resíduos que a molécula nativa correspem quente, e/ou podem conter um ou mais substituições de aminoácido ou nu- cleotídeo. Métodos para a determinação da função de um ácido nucleico (por exemplo, função de codificação, capacidade de hibridizar para dar um outro ácido nucleico) são bem conhecidos na técnica. Similarmente, méto- dos para a determinação de função de proteína são bem conhecidos. Por exemplo, a função de ligação de DNA de um polipeptídeo pode ser determi- nado, por exemplo, por ensaio de ligação por filtragem, de deslocamento de mobilidade eletroforética ou imunoprecipitação. Clivagem de DNA pode ser avaliada por eletroforese de gel. Vide Ausubel e outros, supra. A capacidade de uma proteína de interagir com uma outra proteína pode ser determinada, por exemplo, por coimunoprecipitação, ensaios de dois híbridos ou comple- mentação, tanto genético quanto bioquímico. Vide, por exemplo, Fields e outros (1989) Natureza 340:245-246; a patente U.S. No. 5.585.245 e PCT WO 98/44350.
Domínios de ligação de dedo de zinco Descritos aqui são domínios de ligação de dedo de zinco não-
canônicos e polinucleotídeos que codificam esses domínios de ligação de dedo de zinco. Em certas concretizações, os domínios de ligação de dedo de zinco não-canônicos descritos aqui são dedos de zinco de C3H, em que um dos dois resíduos de histidina de coordenação de zinco conservados é convertido em cisteína. Em concretizações adicionais, o resíduo de histidina mais C-terminal é convertido em um resíduo de cisteína, geração de uma proteína de "CCHC."
Um domínio de ligação de dedo de zinco pode compreender um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco), e podem ser engenheirados para se ligar a qualquer sequência-alvo (por exemplo, uma seqüência genômica). Domínios de ligação de dedo de 10 zinco podem ser ligar a DNA, RNA e/ou proteína. Tipicamente, um único domínio de dedo de zinco é cerca de 30 aminoácidos de comprimento. De- dos de zinco incluem tanto dedos de zinco de C2H2 canônicos (isto é, aque- les em que o íon de zinco é coordenada por dois resíduos de cisteína e de histidina) quanto dedos de zinco não-canônicos incluindo, por exemplo, de- 15 dos de zinco de C3H (aqueles em que o íon de zinco é coordenado por três resíduos de cisteína e um resíduo de histidina). Vide também pedido de pa- tente U.S. Nos. 20030108880, 20060246567 e 20060246588; cujas descri- ções são incorporadas por referência.
Estudos Estruturais demonstraram que um domínio de dedo de 20 zinco canônico (pedaço) contém duas folhas beta (mantidas em um giro beta que contém os dois resíduos de cisteína não variante) e uma alfa hélice (contendo os dois resíduo de histidinas não variantes), que são mantidos em uma conformação particular através de coordenação de um átomo de zinco pelas duas cisteínas e as duas histidinas. Os dedos de zinco não-canônicos 25 descritos aqui retêm essa estrutura beta-beta-alfa.
Os dedos de zinco não-canônicos descritos aqui podem ser do- mínios de ligação de dedo de zinco de ocorrência natural. No entanto, mais tipicamente, dedos de zinco não-canônicos como descritos aqui incluem um ou mais componentes de dedo de zinco em que pelo menos um dos resí- 30 duos de histidina ou de cisteína de coordenação de zinco foi substituído com um ou mais aminoácidos. Por exemplo, em certas concretizações, o resíduo de His C-terminal de um módulo de ligação de dedo de zinco canônico é substituído com um resíduo de Cys.
Os dedos de zinco de CCHC descritos aqui podem também compreender uma ou mais alterações (com relação à seqüência de um dedo de zinco de C2H2 de ocorrência natural) nos resíduos de seqüência de ami- noácidos outros que não os resíduos de coordenação de zinco. Tais altera- ções pode compreender substituições, deleções, e/ou inserções. Aminoáci- dos podem ser alterados em qualquer lugar no dedo de zinco. Exemplos não-limitantes de alterações incluem: (1) substituições de resíduos simples que envolvem o resíduo de coordenação de zinco alterado; (2) adição de resíduos extra antes ou depois do resíduo de coordenação de zinco altera- do, (por exemplo, nos casos em que o resíduo de His mais C-terminal é con- vertido em Cys, adição de resíduos de aminoácido extra pode facilitar coor- denação de zinco por compensação para a cadeia lateral de cisteína mais curta); e/ou (3) substituição de resíduos localizados entre os resíduos de His e Cys de um dedo de zinco de CCHC de ocorrência natural na região cor- respem quente de um dedo de zinco de CCHC não-canônico.
Em certas concretizações, as proteínas de dedo de zinco descri- tos aqui incluem pelo menos um dedo de zinco compreendendo um dedo de zinco de (não C2H2) não-canônico, em que o dedo de zinco não-canônico 20 tem uma porção helicoidal envolvida na ligação de DNA e em que a região de coordenação de zinco da porção helicoidal compreende a seqüência de aminoácidos HX1X2RCXL (SEQ ID NO:2); e em que a proteína de dedo de zinco é engenheirada para se ligar a uma sequência-alvo, em certas concre- tizações, X1 é A ou K ou T; X2 é Q ou E ou R; e XL é G.
Em outras concretizações, os dedos de zinco não-canônicos
descritos aqui têm a estrutura geral: Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)i2-His-(Xc)3.5-Cys-( XD)i-io (SEQ TD NO:3), em que X[Lambda], XB, Xc e X0 representam qual- quer aminoácido, em concretizações em que Xc compreende 3 resíduos (i) pelo menos um desses resíduos é alterado quando em comparação com um 30 dedo de zinco de CCHC canônico; e/ou (ii) X0 compreende pelo menos uma deleção, substituição ou inserção quando em comparação com dedo de zin- co de CCHH canônico, em certas concretizações, X0 compreende a sequên- cia QLV ou QKP. Em outras concretizações X0 compreende um ou mais re- síduos (por exemplo, 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10) de Gly (G).
Seqüência de aminoácidos parciais (incluindo e C-terminal ao tercerio resíduo de coordenação de zinco) de dedos de zinco não-canônicos 5 exemplares são mostrados na tabelas 1, 2, 3 e 4. Em todas as tabelas, os dois resíduos de coordenação de zinco mais C-terminal (isto é, o terceiro e o quarto) (H e C) são sublinhados. As alterações (por exemplo, substituições, inserções, deleções) quando em comparação com a seqüência do dedo não- canônico de "tipo selvagem" (Fileira 2 das tabelas 1 e 3) são mostradas no 10 sublinhamento duplo.
Tabela 1
C2H2 HTKIHLRGSQLV (canônico de tipo selvagem) (SEQ ID NO:12) 1=C3H HTKICLRGSQLV (alterado de tipo selvagem para canônico) (SEQ ID NO:13) 2 HTKGÇLRGSQLV (SEQ ID NO: 14) 3 HTKAÇLRGSQLV (SEQIDNO:15) 4 HTKVÇLRGSQLV (SEQ ID NO:16) 5 HTKLÇLRGSQLV (SEQIDNO:17) 6 HTKSÇLRGSQLV (SEQ ID NO:18) 7 HTKNÇLRGSQLV (SEQ ID NO:19) 8 HTKKÇLRGSQLV (SEQ ID N0:20) 9 HTKRÇLRGSQLV (SEQ ID NO:21) 10 HTKIGGCLRGSQLV (SEQ ID NO:22) 11 HTKIÇÜLRGSQLV (SEQ ID NO:23) 12 HTKICGGLRGSQLV ÍSEQ ID NO:24) 13 HTKIGÇGLRGSQLV (SEQ ID NO:25) 14 HTKIGCGGLRGSQLV (SEQ ID NO:26) 15 HLKGNCLRGSQLV (SEQ ID NO:27) 16 HLKGNCPAGSQLV (SEQ ID NO:28) 17 HSEGGCLRGSQLV (SEQ ID NO:291 18 HSEGGCPGGSQLV (SEQ ID NO:3fl} 19 HSSSNCLRGSOLV (SEQIDNO:31) 20 HSSSNCTIGSQLV (SEQ ID ΝΟ:32ϊ Tabela 2
1 HTKICGGGLRGSQLV (SEQ ID ΝΟ:33Ί 2 j HTKIGCGGGLRGSQLV (SEQ ID NO:34) 3 HTKIGGCLRGSQLV (SEQ ID NO:35) 4 HTKIGGCGLRGSQLV (SEQ ID NO:36) 5 HTKIGGCGGLRGSQLV (SEQ ID NO:37) 6 HTKRCGLRGSQLV (SEQ ID NO:38) 7 HTKRCGGLRGSQLV (SEQ ID NO:39) 8 HTKRCGGGLRGSQLV (SEQ ID N0:40} 9 HTKRGCLRGSQLV (SEQIDNO:41) HTKRGCGLRGSQLV (SEQ ID NO:42) 11 HTKRGCGGLRGSQLV (SEQ ID ΝΟ:43ϊ 12 HTKRGCGGGLRGSQLV (SEQ ID ΝΟΛΛ) 13 HTKRGGCLRGSQLV (SEQ ID NO:45} 14 HTKRGGCGLRGSQLV (SEQ ID NO:46) HTKRGGCGGLRGSQLV (SEQ ID NO:47) 16 HLKGNCGLRGSQLV (SEQ ID NO:48) 17 HLKGNCGGLRGSQLV (SEQ ID NO:49) 18 HLKGNCGGGLRGSQLV (SEQ ID N0:50) 19 HKERCGLRGSQLV (SEQ ID NO:51) HTRRCGLRGSQLV (SEQ ID NO:52} 21 HAQRCGLRGSQLV (SEQ ID NO:53) 22 HKKEYÇGLRGSQLV (SEQ ID NO:54) 23 HKKHYÇGLRGSQLV (SEQ ID NO:55) 24 HKK^CGLRGSQLV (SEQ ID NO:56) HKKWQGLRGSQLV (SEQ ID NO:57) 26 HKQYYCGLRGSQLV (SEQ ID NO:58) 27 HLLKKCGLRGSQLV (SEO ID NO:59) 28 HQKEPÇQLRGSQLV (SEQ ID N0:60) 29 HQKKLCGLRGSQLV (SEQIDNO:61) HQIRGCGLRGSQLV (SEQ ID NO:62) 31 HIKRQSCGLRGSQLV (SEO ID NO:63) 32 HIRRYTCGLRGSQLV (SEQ ID ΝΟ:64ϊ 33 HISSKKCGLRGSOLV ÍSEO ID NO:65) 34 HKIQKACGLRGSQLV ÍSEO ID NO-fifi) HKBirEÇGLRGSQLV (SEQ ID NO:67) 36 HLKGQNCGLRGSQLV (SEQ ID NO:68) 37 HLKKDGCGLRGSQLV ÍSEQ ID NO:69) 38 HLKYTPCGLRGSQLV (SEQ ID N0:70) 39 HTKRÇGRGSQLV (SEQ ID NO:71) 40 HTKIGCGGRGSQLV (SEQ ID NO:72) 41 HLKGNCGRGSQLV (SEQ ID NO:73^ 42 HLKGNCGGGSQLV (SEQ ID ΝΟ:74ϊ 43 HIRTCTGSQKB (SEQ ID NO:75) 44 HIRTCGTGSQKP (SEQ ID NO:76) 45 HIRTGCTGSQKB (SEQ ID NO:77) 46 HIRTGÇGTGSQKE (SEQ ID NO:78) 47 HIRRCTGSQKE (SEQ ID NO:79) 48 HIRRGCTGSQKP (SEQ ID N0:80) Tabela 3
Wt HTKIHTGSQKP (SEQ ID NO:81) 1a HTKIÇTGSQKP (SEQ ID NO:82) 2a HTKRCTGSQKP (SEQ ID NO:83) 3a HAQRCTGSQKP (SEQ ID NO:84) . 4a HTKIÇGTGSQKP (SEQ ID NO:85) 5a HTKRCGTGSQKP (SEQ ID NO:86) 6a HAQRCGTGSQKP (SEQ ID NO:87) Tabela 4
Wt HTKIHLRGSQLV (SEQ ID NO:88) 7a HAQRCGG (SEQ ID NO:89) 8a HAQRCGGG (SEQ ID Ν0:90ϊ 9a HTKICGGG (SEQ ID ΝΟ:91ϊ 10a HTKRCGGG (SEQ ID NO:92^ 11a HAQRCG (SEQ ID NO:93} Como observado acima, um ZFP pode incluir qualquer número
de domínios de ligação de dedo de zinco, por exemplo pelo menos 3 dedos de zinco. Além do mais, um, mais do que um, ou a totalidade dos dedos de zinco podem ser dedos de zinco não-canônicos como descrito aqui.
Em certas concretizações, o dedo mais C-terminal de uma pro- teína de dedo de zinco de múltiplos dedos compreende um dedo de zinco canônico. Em outras concretizações, o dedo mais C-terminal de uma proteí- na de dedo de zinco de múltiplos dedos compreende um dedo de CCHC como descrito aqui, por exemplo, um dedo de CCHC compreendendo um ou mais inserções de aminoácido de C-terminal no resíduo de Cys de coorde- nação mais C-terminal. Vide exemplos 1-5 que descrevem proteínas de de- do de zinco de dedo 4 em que dedo 2 (F2) e/ou dedo 4 (F4) são dedos de zinco não-canônicos como descrito aqui.
Domínios de ligação de dedo de zinco podem ser engenheira-
dos para se ligar a a seqüência de escolha. Vide, por exemplo, Beerli e ou- tros (2002) Natureza Biotechnol. 20:135-141; Pabo e outros (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan e outros (2001) Natureza Biotechnol. 19:656- 660; Segal e outros (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 10 e outros (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416. Um domínio de ligação de dedo de zinco engenheirado pode ter uma nova especificidade de liga- ção, em comparação com uma proteína de dedo de zinco de ocorrência na- tural. Métodos de engenheiramento incluem, mas não são limitados a, proje- to racional e vários tipos de seleção {por exemplo, métodos em que uma 15 pluralidade de diferentes seqüências de dedo de zinco são triadas contra uma seqüência de nucleotídeos alvo única). Projeto racional inclui, por e- xemplo, usando-se base de dados compreendendo seqüência de nucleotí- deos tripleto (ou quadripletoo) e seqüências de aminoácidos de dedo de zin- co individuais, em que cada seqüência de nucleotídeos tripleto ou quadriple- 20 too está associada a uma ou mais seqüências de aminoácidos de dedos de zinco que ligam a seqüência tripleto ou quadripletoo. Vide, por exemplo, as patentes U.S. copertencentes 6.453.242 e 6.534.261. Métodos de projeto adiconais são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. 6.746.838; 6.785.613; 6.866.997; e 7.030.215. Aumento de especificidade de ligação 25 parum domínios de ligação de dedo de zinco foi descrito, por exemplo, na patente U.S. copertencente No. 6.794.136.
Métodos de seleção exemplares, incluindo sistemas de dois hí- bridos e exibição de fago, são descritos nas patentes U.S. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237.
Uma vez que um dedo de zinco individual se liga a uma sequên- cia de três nucleotídeo (isto é, tripleto) (ou uma seqüência de quatro nucleo- tídeos que pode revestir, por um nucleotídeo, com o sítio de ligação de qua- tro nucleotídeos de um dedo de zinco adjacente), o comprimento da seqüên- cia à qual um domínio de ligação de dedo de zinco é engenheirada para ligar 5 (por exemplo, uma sequência-alvo) determinará o número de dedos de zinco em um domínio de ligação de dedo de zinco engenheirado. Por exemplo, para ZFPs em que os pedaços de dedo de zinco não se ligam a subsítios de sobreposição, uma sequência-alvo de seis nucleotídeos está ligada por um domínio de ligação de dois dedos; uma sequência-alvo de nove nucletoídeos 10 está ligada por um domínio de ligação de três dedos, etc. Sítios de ligação para dedos de zinco individuais (isto é, subsítios) em um sítio-alvo não ne-
w
cessitam ser contíguo, mas podem ser separados por um ou vários nucleotí- deos, dependendo do comprimento e natureza das seqüências de aminoáci- dos entre os dedos de zinco (isto é, os Iigadadores de interdedo) em um 15 domínio de ligação multidedos. Vide, por exemplo, as patentes US 6.479.626; 6.903.185 e 7.153.949 e a publicação de pedido de patente U.S. No. 2003/0119023; cujas descrições são incorporadas por referência.
Em um domínio de ligação de dedo de zinco de multidedos, de- dos de zinco adjacentes podem ser separados por seqüências de Iigante de aminoácidos de cerca de 5 aminoácidos (assim chamados Iigantes de inter- dedo "canônicos") ou, alternativamente, por um ou mais Iigantes não- canônicos. Vide, por exemplo, Patente US copertencentes de Nos.
6.453.242 e 6.534.261. Para domínios de ligação de dedo de zinco enge- nheirados compreendendo mais do que três dedos, inserção de seqüências 25 de Iigante de interdedos ("não cônicas") entre certos dos dedos de zinco po- dem aumentar a afinidade e/ou especificidade de ligação pelo domínio de ligação. Vide, por exemplo, a patente US No. 6.479.626 e publicação de pe- dido de patente U.S. No. 2003/0119023; cujas descrições são incorporadas por referência. Correspem quentemente, domínios de ligação de dedo de 30 zinco de multidedos podem também ser caracterizados com relação à pre- sença e localização de Iigantes de interdedos não-canônicos. uso de Iigantes de interdedos mais longos podem também facilitar a ligação de uma proteína de dedo de zinco a sítios alvos compreendendo nucleotídeos não contíguos. Como um resultado, um ou mais subsítios, em um sítio-alvo para um domí- nio de ligação de dedo de zinco, podem ser separados entre si por 1,2,3, 4, 5 ou mais nucleotídeos. Para prover mas um exemplo, um domínio de Iiga- 5 ção de quatro dedos pode se ligar a um sítio-alvo de 13 nucleotídeos com- preendendo, em seqüência, dois subsítios de 3 nucleotídeos contíguos, um nucleotídeos de intervenção, e dois subsítios tripletos contíguos.
Um subsítio é um seqüência de nucleotídeos (em geral 3 or 4 nucleotídeos) que está ligado por um dedo de zinco único. No entanto, não é necessário para um sítio-alvo a ser um múltiplo de três nucleotídeos. Por
Λ
exemplo, nos casos em que interações de fitas cruzadas ocorrem (vide, por
k
exemplo, as patentes US 6.453.242 e 6.794.136), um ou mais dos dedos de zinco individuais de um domínio de ligação de muti-dedos pode se ligar a sobreposição de subsítios quadripleto. Vide também as patentes US 15 6.746.838 e 6.866.997. Para prover mas um exemplo, um domínio de liga- ção de três dedo pode se ligar a um sítio-alvo de 10 nucleotídeos compreen- dendo três sobreposição de subsítios de 4 nucleotídeos.
Seleção de uma seqüência em cromatina celular para a ligação por um domínio de dedo de zinco (por exemplo, um sítio-alvo) pode ser rea- 20 lizada, por exemplo, de acordo com o métodos descritos na patente US co- pertencente No. 6,453,242 (em 17 de setembro de 2002), que também reve- la métodos para projeção de ZFPs para se ligarem a uma seqüência sele- cionada. Estará claro para aqueles versados na técnica que inspeção visual simples de uma seqüência de nucleotídeos pode também ser usada para a 25 seleção de um sítio-alvo. Correspem quentemente, quaisquer meios de se- leção de sítio-alvo podem ser usados nos métodos descritos aqui.
Proteínas de dedo de zinco de multidedos podem ser construí- das por união de dedos de zinco individuais obtidos, por exemplo, pelo proje- to e seleção. Alternativamente, módulos de ligação que consitem de dois 30 dedos de zinco podem ser unidos entre si, usando-se ou canônicos ou mais longos, Iigantes de interdedos não-canônicos (vide acima) para gerar proteí- nas de quatro e seis dedos. Tais dois módulos podem ser obtidos, por e- xemplo, por seleção para dois dedos adjacentes, que ligam uma sequência- alvo de seis nucleotídeos particular, no contexto de uma proteína de multi- dedos (em geral três dedos). Vide, por exemplo, WO 98/53057 e a publica- ção de pedido de patente U.S. No. 2003/0119023; cujas descrições são in- 5 corporadas por referência. Alternativamente, módulos de dois dedos podem ser construídos por montagem de dedos de zinco individuais.
Assim, os domínios de dedo de zinco descritos aqui podem ser usados individualmente ou em várias combinações para contruir proteínas de dedo de zinco de multidedos que se ligam a qualquer sítio-alvo.
Distância entre seqüências (por exemplo, sítios alvos) refere-se
ao número de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo que intervém entre as
<
* duas seqüências, como medidas a partir das arestas das seqüências mais próxima entere si.
Em concretizações usando-se ZFNs, por exemplo, em que cli-
vagem depende da ligação de dois domínio de dedo de zinco/semidomínio de clivagem de moléculas de fusão para separar sítios alvos, os dois sítios alvos podem ser opostos a fios de DNA. Em outras concretizações, ambos os sítios alvos estão no mesmo fio de DNA. Vide, por exemplo, WO 2005/084190; cuja descrição é incorporada por referência.
Polinucleotídeos que codificam dedos de zinco ou proteínas de
dedo de zinco estao também dentro do escopo da presente descrição. Esses polinucleotídeos podem ser construídos usando-se técnicas padrão e inseri- dos para dentro de um vetor, e o vetor pode ser introduzido para dentro de uma célula (vide abaixo para descrição adicional com relação a vetores e
métodos para introdução de polinucleotídeos para dentro de células) tal que a proteína codificada é expressa na célula.
Proteínas de fusão
Proteínas de fusão compreendendo um ou mais componentes de dedo de zinco não-canônico descritos aqui são também providos.
Moléculas de fusão são construídas por métodos de clonagem e
combinação bioquímica que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Moléculas de fusão compreendem um ZFP contendo CCHC e, por exemplo, um domínio de clivagem, um semidomínio de clivagem, um domí- nio de ativação transcritivo, um domínio de repressão transcritivo, um com- ponente de um complexo de remodelação de cromatina, um domínio isola- dor, um fragmento funcional de qualquer um desses domínios; e/ou quais- quer combinações de dois ou mais domínios funcionais ou seus fragmentos.
Em certas concretizações, moléculas de fusão compreendem uma proteína de dedo de zinco de planta modificada e pelo menos dois do- mínios funcionais (por exemplo, um domínio isolador ou um domínio de pro- teína de ligação de metila e, adicionalmente, um domínio de repressão ou ativação transcritiva).
Moléculas de fusão também opcionalmente compreendem um sinal de localização nuclear (tal como, por exemplo, que a partir do antígeno T de V40 ou NLS Opaque-2 de milho) e um etiqueta de epítopo (tal como, por exemplo, FLAG ou hemaglutinina). Proteínas de fusão (e ácidos nuclei- 15 cos que codificas elas) são projetadas tais que o quadro de leitura traducio- nal é preservado entre os componentes da fusão.
Métodos para o projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que codificam idênticos) são conhecidos por aqueles versa- dos na técnica. Por exemplo, métodos para o projeto e construção de proteí- na de fusão compreendendo proteínas de dedo de zinco (e polinucleotídeos que codificam idênticos) são descritos nas patentes US copertencentes
6.453.242 e 6.534.261.
Polinucleotídeos que codificam tais proteínas de fusão estão também dentro do escopo da presente descrição. Esses polinucleotídeos 25 podem ser construídos usando-se técnicas padrão e inseridos para dentro de um vetor e o vetor pode ser introduzido para dentro de uma célula (vide abaixo para a descrição adicional com relação a vetores e métodos para a introdução de polinucleotídeos para dentro de células).
Um domínio funcional, exemplar para a fusão com um domínio de ligação de DNA de ZFP, a ser usado para a repressão de expressão de gene, é um domínio de repressão de KRAB oriundo da proteína de KOX-1 de ser humano (vide, por exemplo, Thiesen e outros, New Biologist 2, 363- 374 (1990); Margolin e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue e outros, Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4514- 4518 (1994). O domínio de KOX é também adequado para o uso como um domínio de repressão. Um outro 5 domínio de repressão adequado é proteína 2B de domínio de ligação de me- tila (MBD-2B) (vide, também Hendrich e outros (1999) Mamm Genome 10:906-912 for description of MBD proteínas). Um outro domínio de repres- são útil é que associado à proteína de v-ErbA. Vide, por exemplo, Damm, e outros (1989) Natureza 339:593-597; Evans (1989) Int. J. Cancer Suppl. 10 4:26-28; Pain e outros (1990) New Biol. 2:284-294; Sap e outros (1989) Na- tureza 340:242-244; Zenke e outros (1988) Cell 52:107-119; e Zenke e ou- tros (1990) Cell 61:1035-1049. Domínios de repressão exemplares adicio- nais incluem, mas não são limitadas a, receptor de hormônio da tireoide (TR), SID, MBDI, MBD2, MBD3, MBD4, proteínas de tipo MBD, membros da 15 família de DNMT {por exemplo, DNMTI, DNMT3A, DNMT3B), Rb, MeCPI e MeCP2. Vide, por exemplo, Zhang e outros (2000) Ann Rev Physiol 62:439- 466; Bird e outros (1999) Cell 99:451-454; Tyler e outros (1999) Cell 99:443- 446; Knoepfler e outros (1999) Cell 99:447-450; e Robertson e outros (2000) Natureza Genet. 25:338-342. Domínios de repressão exemplares adicionais 20 incluem, mas não são limitadas a, ROM2 e AtHD2A. Vide, por exemplo, Chern e outros (1996) Plant Cell 8:305-321; e Wu e outros (2000) Plant J. 22:19-27.
Domínios adequados para alcaçar a ativação incluem o domínio de ativação de HSV VP 16 (vide, por exemplo, Hagmann e outros, J. Virol. 25 71, 5952-5962 (1997)) nuclear hormone receptors (vide, por exemplo, Tor- chia e outros, Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)); a sub-unidade de p65 de fator nuclear kappa B (Bitko & Bank, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) e Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu e outros, Cancer Gene Ther. 5:3- 28 (1998)), ou domínios funcionais quiméricos artificiais tal como 30 VP64 (Seifpal e outros, EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)).
Domínios de ativação exemplares adicionais incluem, mas não são limitadas a, p300, CBP, PCAF, SRCI PvALF, e ERF-2. Vide, por exem- plo, Robyr e outros (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood e ou- tros (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255- 275; Leo e outros (2000) Gene 245:1- 11; Manteuffel-Cymbogrownska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKen- na e outros (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik e outros 5 (2000) Trends Biochem. ScL 25:277-283; e Lemon e outros (1999) Curr. O- pin. Genet. Dev. 9:499-504. Domínios de ativação exemplares adicionais incluem, mas não são limitadas a, OsGAI, HALF-I, Cl, API, ARF-5, -6,’7, e -8, CPRFI, CPRF4, MYC-RP/GP, e TRABl. Vide, por exemplo, Ogawa e outros (2000) Gene 245:21-29; Okanami e outros (1996) Genes Células 1:87-99; 10 Goff e outros (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho e outros (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason e outros (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels e outros (2000) Plant J. 22:1-8; Gong e outros (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; e Hobo e outros (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:15,348-15,353.
Domínios funcionais adicionais são descritas, por exemplo, na a
patente US copertencente No. 6.933.113. Além disso, domínios isoladores, proteínas de remodelação de cromatina tais como domínios contendo ISWI, e proteínas de domínio de ligação de metila adequadas para uso nas molé- culas de fusão são descritos, por exemplo, nas publicações internacionais copertencentes WO 01/83793 e WO 02/26960.
Em outras concretizações, a proteína de fusão é uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) compreendendo um ou mais dedos de zinco de CCHC como descritos aqui e um domínio de clivagem (ou semidomínio de clivagem). Os dedos de zinco podem ser engenheirados para reconhecer 25 uma sequência-alvo em qualquer região genômica de escolha e, quando introduzida para dentro de uma célula, resultará na ligação da(s) proteína(n) de fusão a seu(s) sítio(s) de ligação site e clivagem dentro de ou próximo da dita região genômica. Tal clivagem pode resultar na alteração da seqüência de nucleotídeos da região genômica (por exemplo, mutação) após união final 30 não-homóloga. Alternativamente, se um polinucleotídeo exógeno contendo seqüências homólogas à região genômica estiver também presente em tal célula, recombinação homóloga ocorre a uma alta taxa entre a região genô- mica e o polinucleotídeo exógeno, após clivagem direcionada pelas ZFNs. Recombinação homóloga pode resultar na substituição de seqüência dire- cionada ou integração direcionada de seqüências endógenas, dependendo da seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo exógeno.
Os dedos de zinco não-canônicos descritos aqui provêem fun-
ção de clivagem aperfeiçoada quando incorporados em ZFNs. Como descri- to nos exemplos, ZFNs de 4 dedos contendo pelo menos um CCHC dedo como descrito aqui clivam pelo menos bem como nucleases contendo exclu- sivamente dedos de CCHH. Em certas concretizações, quando o dedo Ο- Ι O terminal compreende um dedo de zinco de CCHC não-canônico, os resíduos entre o terceiro e o quarto resíduos de coordenação de zinco (isto é, entre os resíduos de His e Cys C-terminais) são diferentes do que aqueles presentes no dedo de zinco de CCHH canônico, e um ou mais resíduos de glicina (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) são inseridos depois do resíduo de Cys Ο- Ι 5 terminal.
A porção de domínio de clivagem das ZFNs descritas aqui pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonuclea- ses exemplares a partir dos quais um domínio de clivagem pode ser deriva- do incluem, mas não são limitados a, endonucleases de restrição e homing 20 endonucleases. Vide, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Bio- labs, Beverly, MA; e Belfort e outros (1997) Nucleic Acid Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidos (por exemplo, Nuclease SI; nuclease de "mung bean"; DNase I pancreático; nuclease micrococcal nuclease; endonuclease de HO de levedura; vide também Linn e outros 25 (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou seus fragmentos funcionais) podem ser usados como uma fonte de domínios de clivages e semidomínios de clivagem.
Similarmente, um semidomínio de clivagem pode ser derivado de qualquer nuclease ou sua porção, como indicado acima, provisão do se- midomínio de clivagem exige dimerização para a atividade de clivagem. Em geral, duas proteínas de fusão são exigidas para a clivagem direcionada de DNA genômico se as proteínas de fusão compreendem semidomínios de clivagem. Alternativamente, uma única proteína compreendendo dois semi- domínios de clivagem podem ser usados. Os dois semidomínios de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease, ou cada semidomínio de clivagem pode ser derivado de uma diferente endonuclease. Além disso, os sítios alvos para as duas proteínas de fusão são dispostos, com relação en- tre si, tal que a ligação das duas proteínas de fusão a seus sítios alvo res- pectivos coloca os semidomínios de clivagem em uma orientação espacial entre si que permite que os semidomínios de clivagem forme um domínio de clivagem funcional, por exemplo, por dimerização. Assim, em certas concre- tizações, as arestas próximas do sítios alvos são separadas por 5-8 pares de nucleotídeo ou por 15-18 pares de nucleotídeo. Em concretizações adicio- nais, os sítios alvos estão dentro de dez pares de nucleotídeo entre si. No entanto qualquer número integral de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo podem intervir entre dois sítios alvos (por exemplo, de 2 a 50 nucleotídeos ou mais). Em geral, o ponto de clivagem está entre os sítios alvos.
Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão pre- sentes em muitas espécies e são capazes de ligar sequência-específica a DNA (em um sítio de reconhecimento), e clivagem de DNA a ou próximo ao sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, tipo HS) clivam 20 DNA em sítios removidos a partir do sítio de reconhecimento e têm domínios de clivagem e ligação separáveis. Por exemplo, o Fok I de enzima de tipo IIS catalisa clivagem de fita dupla de DNA, em 9 nucleotídeos oriundos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos oriundos de seu sítio de reconhecimento no outro. Vide, por exemplo, As patentes Us 5.356.802; 25 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4275-4279; Li e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2764- 2768; Kim e outros (1994a) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:883-887; Kim e outros (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Assim, em uma concreti- zação, proteínas de fusão compreendem o domínio de clivagem (ou semi- 30 domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição de tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que pode ou não podem ser engenheirados. Uma enzima de restrição de tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Essa enzima particular está ativa como um dímero. Bitinaite e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 10,570-10,575. Correspem quentemente, para as finalidades da 5 presente descrição, a porção da enzima de FoK I usada nas proteínas de fusão descritas is considered um semidomínio de clivagem. Assim, para a clivagem direcionada de fita dupla e/ou substituição direcionada de seqüên- cias celulares usando-se ZFNs compreendendo fusões de FoK I dededo de zinco, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um semidomínio 10 de clivagem de Fok I, pode ser usado para reconstituir um domínio de cliva- gem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula de polipep- tídeo contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e dois semidomínios de clivagem de Fok I podem também ser usados. Parâmetros para a cliva- gem direcionada e alteração de seqüência direcionada usando-se fusões de 15 Fok I de dedo de zinco são providas em outro lugar nessa descrição e, por exemplo, no pedido de patente US No. 2005/0064474; cuja descrição é in- corporada por referência.
Em concretizações adicionais, um semidomínio de clivagem de Fok I pode incluir uma ou mais mutações em qualquer resíduo de aminoáci- do que afeta dimerização. Tais mutações podem ser úteis na prevenção de que um de um par de fusões de ZFP/Fok I sofra homodimerização que pode levar a clivagem nas seqüências indesejadas. Por exemplo, resíduos de a- minoácido na posiçãos 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, e 538 de Fok I são todos próximos o suficiente à interface de dimerização para influenciar dimerização. Correspem quente- mente, alterações de seqüência de aminoácidos a um ou mais das posições acima mencionadas podem ser usadas para alterar as propriedades de di- merização do semidomínio de clivagem. Tais mudanças podem ser introdu- zidas, por exemplo, por construção de uma biblioteca contendo (o que codi- fica) diferentes resíduos de aminoácido nessas posições e seleção de vari- antes com as propriedades desejadas, ou por projeção racional de mutantes individuais, além de prevenir a homodimerização, é também possível que algumas dessas mutações podem aumentar a eficácia de clivagem, em comparação com aquela obtida com dois semidomínios de clivagem de tipo selvagem.
Assim, para a clivagem direcionada usando-se um par de fusões 5 de ZFP/Fok I, uma ou ambas das proteínas de fusão podem compreender uma ou mais alterações de aminoácido que inibem auto-dimerização, mas permitem que heterodimerização das dois proteínas de fusão ocorrem tal que clivagem ocorre no sítio-alvo desejado, em certas concretizações, alte- rações estão presentes tanto nas proteínas de fusão, quanto nas alterações 10 têm efeitos aditivos; isto é, homodimerização ou de fusão, que leva a cliva- gem aberrante, é minimizada ou abolida, enquanto heterodimerização das duas proteínas de fusão é facilitada em comparação com aquela obtida com semidomínios de clivagem de tipo selvagem.
Em certas concretizações, o domínio de clivagem compreende 15 dois semidomínios de clivagem, ambos os quais são partes de um único po- lipeptídeo compreendendo um domínio de ligação, um primeiro semidomínio de clivagem e um segundo semidomínio de clivagem. Os semidomínios de clivagem podem ter a mesma seqüência de aminoácidos ou diferentes se- qüências de aminoácidos, contanto que eles funcionem para clivar o DNA.
Semidomínios de clivagem podem também ser providos em mo-
léculas separadas. Por exemplo, dois polipeptídeos de fusão podem ser ex- pressos em uma célula, em que cada polipeptídeo compreende um domínio de ligação e um semidomínio de clivagem. Os semidomínios de clivagem podem ter a mesma seqüência de aminoácidos ou diferentes seqüências de 25 aminoácidos, contanto que elas funcionem para clivar o DNA. Além disso, os domínios de ligação se ligam a sequências-alvo que estão tipicamente dis- postos de modo que, na ligação dos polipeptídeos de fusão, os dois semi- domínios de clivagem são apresentados em uma orientação espacial entre si que permite reconstituição de um domínio de clivagem (por exemplo, por 30 dimerização dos semidomínios), desse modo posicionando os semidomínios em relação entre si para formar um domínio de clivagem funcional, que re- sulta em clivagem de cromatina celular em uma região de interesse. Em ge- ral, clivagem pelo domínio de clivagem reconstituído ocorre em um sítio loca- lizado entre as duas sequências-alvo. Uma ou ambas as proteínas podem ser engenheiradas para se ligar a seu sítio-alvo.
Expressão de duas proteínas de fusão em uma célula pode re- sultar de fornecimento das duas proteínas à célula; fornecimento de uma proteína e um ácido nucleico que codificam uma das proteínas para uma célula; fornecimento de dois ácido nucleicos, cada um que codifica uma das proteínas, para uma célula; ou por fornecimento de um único ácido nucleico, que codifica ambas as proteínas, para uma célula. Em concretizações adi- cionais, uma proteína de fusão compreende uma única cadeia de polipeptí- deo compreendendo dois semidomínios de clivagem e um domínio de liga- ção de dedo de zinco. Nesse caso, uma única proteína de fusão é expressa em uma célula e, sem querer estar ligado pela teoria, acredita-se que clivou DNA como um resultado da formação de um dímero intramolecular dos se- midomínio de clivagem.
Em certas concretizações, os componentes de um ZFN são dis- postos tal que o domínio de dedo de zinco está mais próxima do terminal de amino da proteína de fusão, e o semidomínio de clivagem está mais próximo do terminal carbóxi. Isso espelha a orientação relativa do domínio de cliva- 20 gem de dimerização ocorrência natural de domínios de clivagem tais como aqueles derivados da enzima de Fok I, em que o domínio de ligação de DNA está mais próximo do terminal amino e o semidomínio de clivagem está mais próximo do terminal carbóxi. Nessas concretizações, dimerização dos semi- domínios de clivagem para formar uma nuclease funcional é realizada por 25 ligação das proteínas de fusão a sítios nas fitas de DNA opostos, com a ex- tremidade 5' dos sítios de ligação estando próximos entre si.
Nessa orientação, o dedo de zinco mais C-terminal está próximo do semidomínio de clivagem de Fok I. Foi anteriormente determinado que proteínas de dedo de zinco não-canônicas ligam seu alvos de DNA mais efi- 30 cazmente quando um dedo de zinco de tipo CCHC está presente quando o dedo mais C-terminal. É portanto possível que a presença de dedos de zinco de tipo CCHC anteriormente descritos na proximidade do semidomínio de clivagem de Fok I inibiu sua função. Se esse é o caso, os dedos de zinco de CCHC otimizados presentemente descritos aparentemente não exibem sua atividade inibitória postulada.
Em concretizações adicionais, os componentes das proteínas de 5 fusão (por exemplo, fusões de ZFP-Fok I) são dispostos tal que o semidomí- nio de clivagem está mais próximo do terminal amino da proteína de fusão, e o domínio de dedo de zinco está mais próximo do terminal carbóxi. Nessas concretizações, dimerização dos semidomínios de clivagem para formar uma nuclease funcional é realizada pela ligação das proteínas de fusão a sítios 10 nas fitas de DNA opostos, com as extremidades 3' dos sítios de ligação es- tando próximos entre si.
Em ainda concretizações adicionais, uma proteína proteína de fusão contém o semidomínio de clivagem mais próximo do terminal amino da proteína de fusão, e o domínio de dedo de zinco mais próximo do terminal 15 carbóxi, e uma segunda proteína de fusão está disposta tal que o domínio de dedo de zinco está mais próximo do terminal amino da proteína de fusão, e o semidomínio de clivagem está mais próximo do terminal carbóxi. Nessas concretizações, ambas as proteínas de fusão se liga a mesma fita de DNA, com o sítio de ligação da primeira proteína de fusão contendo o domínio de 20 dedo de zinco mais próximo do terminal carbóxi localizado do lado 5' do sítio de ligação da segunda proteína de fusão contendo o domínio de dedo de zinco mais próximo do terminal amino. Vide também WO 2005/084190; cuja descrição é incorporada por referência.
A seqüência de aminoácidos entre o domínio de dedo de zinco e 25 o domínio de clivagem (ou semidomínio de clivagem) é significado o "ligante de KC." O ligante de KC deve ser distinguido dos Iigantes de interdedos dis- cutidos acima. Vide, por exemplo, as publicações de patente US 20050064474A1 e 20030232410, e publicação de patente internacional WO 2005/084190; cujas descrições são incorporadas por referência, para deta- 30 lhes na obtenção do ligante de KCs que otimizam clivagem.
Vetores de expressão
Um ácido nucleico que codifica uma ou mais ZFPs ou proteínas de fusão de ZFP (por exemplo, ZFNs) podem ser clonados em um vetor para a transmissão em células procarióticas ou eucarióticas para a replicação e/ou expressão. Vetores podem ser vetores procarióticos ou eucarióticos, incluindo mas não limitados a, plasmídios, vetores de transporte nos dois 5 sentidos, vetores de inseto, vetores binários (vide, por exemplo, a patente US No. 4.940.838; Horsch e outros (1984) Science 233:496-498, e Fraley e outros (1983) Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 80:4803) e semelhantes. Um ácido nucleico que codifica um ZFP pode também ser clonado em um vetor de ex- pressão, para a administração a uma célula de planta.
Para expressar as proteínas de fusão, seqüências que codificam
as fusões de ZFPs ou ZFP são tipicamente subclonadas em um vetor de expressão que contém um promotor para dirigir transcrição. Promotores eu- carióticos e bacterianos adequados são bem conhecidos na técnica e descri- tos, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory 15 Manual (2nd ed. 1989; 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Express: A Laboratory Manual (1990); e Protocolos na biologia molecular atuais (Au- subel e outros, supra. Sistemas de expressão bacterianos para a expressão do ZFP estão disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus sp., e Salmonella (Paiva e outros, Gene 22:229-235 (1983)). Kits para tais sistemas de ex- 20 pressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarió- ticos paras células de mamíferos, levedura, e células de inseto são bem co- nhecidos por aqueles versados na técnica e estão também comercialmente disponíveis.
O promotor usado para dirigir a expressão de um ácido nucleico de codificação de ZFP depende da aplicação particular. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeira é tipicamente usado para a expressão e purificação de ZFPs.
Em contraste com isso, quando uma ZFP é administrado in vivo para regulação de gene de planta (vide, "Nucleic Acid Delivery to Plant Cells" seção abaixo), ou um promotor constitutivo ou induzível é usado, dependen- do do uso particular uso da ZFP. Exemplos não-limitantes de promotores de planta incluem seqüências de promotor derivadas de A. thaliana ubiquitin-3 (ubi-3) (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); sintase de mannopine de A. tumifaciens (DeItamas) (Petolino e outros, a patente US No. 6.730.824); e/ou Vírus de mosaico de nervura da mandioca (CsVMV) (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129- 1139). Vide, também, exemplos.
Além do promotor, o vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais exigidos para a expressão do ácido nucleico em célu- las hospedeiras, ou procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico assim contém um promotor operavelmente, por exemplo, a uma se- qüência de ácidos núcleicos que codifica a ZFP, e sinais exigidos, por e- xemplo, para poliadenilação eficaz do transcrito, terminação transcritiva, sí- tios de ligação de ribossoma, ou terminação de tradução. Elementos adicio- nais do cassete podem incluir, por exemplo, aumentadorés, e sinais de união heteró Iogos.
O vetor de expressão particular usado para transportar a infor- mação genética para dentro da célula é selecionada com com relação ao uso pretendido da ZFP, por exemplo, expressão em plantas, animais, bacté- rias, fungos, protozoários, etc. (vide vetores de expressão descritos abaixo). Vetores de expressão bacterianos e de animal padrão são conhecidas na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, a publicação de patente US 20050064474A1 e publicações de patentes internacionais WO 05/084190, WO 05/014791 e WO 03/080809; cujas descrições são incorpo- radas por referência.
Métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir
linhas de células bacterianas, de mamífero, de levedura ou de inseto que expressam grandes quantidades de proteína, que podem então ser purifica- das usando-se técnicas padrão {vide, por exemplo, Colley e outros, J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Métodos in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Transformação de células eu- carióticas ou procarióticas é realizada de acordo com técnicas padrão (vide, por exemplo, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Métodos in Enzymology 101:347-362 (Wu e outros, eds., 1983).
Qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para a intro- dução de seqüência de nucleotídeos estranha para dentro de tais células hospedeiras pode ser usado. Esses incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, métodos ultrassô- nicos (por exemplo, sonoporação), lipossomas, microinjeção, DNA nu, veto- res de plasmídio, vetores virais, tanto epissomais quanto integrativos, e qualquer um dos outros métodos bem conhecidos para a introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho para dentro de uma célula hospedeira (vide, por exemplo, Sambrook e ou- tros, supra). É apenas necessário que o procedimento de engenheiramento genético particular usado ser capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene para dentro da célula hospedeira capaz de expressar a proteína de escolha.
Fornecimento de ácido nucleico para as células de planta Como observado acima, construtos de DNA podem ser introdu- zidos para dentro de (por exemplo, para dentro do genoma de) um hospedei- ro de planta desejado por uma variedade de técnicas convencionais. Para revisões de tais técnicas vide, por exemplo, Weissbach & Weissbach Méto- dos for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, Ν. Y.) seção VIII, pág. 421-463; e Grierson & Corey, Plant Molecular Bioiogy (1988, 2d Ed.), Blackie, Londres, Ch. 7-9.
Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido para den- tro de uma célula de planta usando-se técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente para o tecido de planta usando-se mé- todos biolísticos, tal como bombardeamento de partículas de DNA (vide, por exemplo, Klein e outros (1987) Natureza 327:70-73). Alternativamente, os construtos de DNA podem ser combinados com suitabela regiões de flan- queamento de T-DNA e introduzidos para dentro de um vetor hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens convencional.
Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tume- faciens, incluindo o desarme e uso de vetores binários, são bem descritos na literatura científica. Vide, por exemplo Horsch e outros (1984) Science 233:496-498, e Fraley e outros (1983) Proc. Natl Acad. ScL USA 80:4803.
Além disso, transferirência de gene pode ser alcançada usando- se bactérias ou vírus de não Agrobacterium such as Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus de batata X, vírus de mo- saico de couve-flor e vírus de mosaico de nervura da mandioca e/ou vírus de mosaico de tabaco, Vide, por exemplo, Chung e outros (2006) Trends Plant ScL I l(l):l-4.
As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tume- faciens dirigirá a inserção do construto e marcador adjacente para dentro do DNA de célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias usando- se vetor de T DNA binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) ou o procedimento de cocultivo (Horsch e outros (1985) Science 227: 1229-1231). Em geral, os sistemas de transformação de Agrobacterium é usado para en- genheirar plantas dicotiledôneas (Bevan e outros 1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers e outros (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). O sis- tema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir, DNA para plantas monocotiledônea e célu- las de planta. Vide a patente US No. 5.591.616; Hernalsteen e outros (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren e outros (1984) Natureza 311 :763-764; Grimsley e outros (1987) Natureza 325:1677-179; Boulton e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40.; e Gould e outros (1991) Plant Phy- siol. 95:426-434.
Métodos de transformação e transferência de gene alternativos incluem, mas não são limitados a, transformação de protoplasto através de captação mediada por eletroporação ou de polietileno glicol (PEG), de cálcio de DNA nu (vide Paszkowski e outros (1984) EMBOJ 3:2717-2722, Potrykus e outros (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm e outros (1985) Proc. Nat. Acad. Sd. USA 82:5824-5828; e Shimamoto (1989) Natureza 338:274-276) e eletroporação de tecidos de planta (D'Halluin e outros (1992) Plant Cell 4:1495-1505). Métodos adicionais para a transformação de célula de planta incluem microinjeção, captação de DNA mediada por carbeto de silício (Kaeppler e outros (1990) Plant Cell Repórter 9:415-418), e bombar- deamento de microprojectil (vide Klein e outros (1988) Proc. Nat. Acad. ScL USA 85:4305-4309; e Gordon-Kamm e outros (1990) Plant Cell 2:603-618).
Os métodos e composições descritos podem ser usados para
inserir seqüências endógenas em uma localização predeterminada em um genoma de célula de planta. Isso é útil visto que a expressão de um trans- gene introduzido para dentro de um genoma de planta depende criticamente de seu sítio de integração. Correspem quentemente, genes que codificam, por exemplo, nutrientes, antibióticos ou moléculas terapêuticas podem ser inseridos, por recombinação direcionada, em regiões de um genoma de planta favorável a sua expressão.
Células de plantas transformadas que são produzidas por qual- quer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado e assim o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fito ôrmonios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regene- ração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans, e outros, "Protoplasts Isolation e Culture" in Handbook of Plant Cultura de cé- lula, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company1 New York, 1983; e Bin- ding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração pode também ser obtida a partir de calos de planta, explantes, órgãos, pólens, embriões ou suas partes. Tais técnicas de regeneração são descritas em geral em Klee e outros (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
Ácidos nucleicos introduzidos para dentro de uma célula de planta podem ser usados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula de planta podem ser engenheirados para as características agronômicas e fisio- lógicas desejadas descritas aqui usando-se os construtos de ácido nucleico da presente descrição e os vários métodos de transformação mencionados acima. Em certas concretizações, plantas-alvo e células de planta para o engenheiramento incluem, mas não são limitadas a, aquelas plantas mono- cotiledôneas e dicotiledôneas, tais como colheitas incluindo colheitas de grão (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), colheitas de fruta (por exemplo, tomate, maçã, pêra, morango, laranja), colheitas de forragem (por exemplo, alfalfa), colheitas de vegetal de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterraba, inhame), colheitas de vegetais frondosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas de floração (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), co- níferas e árvores de pinheiro (por exemplo, pinheiro fir, abeto vermelho); plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, plantas de acúmulo de metal pesado); colheitas oleosas (por exemplo, girassol, semente de colza) e plantas usadas para as finalidades experimentais (por exemplo, Arabidop- sis). Assim, os métodos e composições descritos usaram uma ampla faixa de plantas, incluindo, que não são limitadas a, espécies oriundas dos gêne- ros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Glycine1 Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lycopersicon, Malus, Ma- nihot, Nicotiana, Oryza, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorgo, Triticum1 Vitis, Vigna1 e Zea.
Aquele versados na técnica reconhecerá que depois que o cas- sete de expressão está estavelmente incorporado em plantas transgênicas e confirmou ser operável, ele pode ser introduzido para dentro de outras plan- tas por cruzamento sexual. Qualquer uma de uma série de técnicas de re- produção padrão podem ser usadas, dependendo da espécie de ser cruza- da.
Planta, tecido, calo ou célula de planta transformada pode ser identificado e isolado por seleção ou triagem do material de planta engenhei- rada para tratos codificados pelos genes de marcador presentes na trans- formação de DNA. Por exemplo, seleção pode ser realizada por desenvolvi- mento do material de planta engenheirada no meio contendo uma quantida- de inibitória do antibiótico ou herbicida ao qual a transformação de construto de gene confere resistência. Além disso, células de planta e plantas trans- formadas podem também ser identificadas por triagem quanto as atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes de [beta]- glucuronidase, luciferase, B ou Cl) que podem estar presentes nos constru- tos de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de triagem e sele- ção são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
Métodos físicos e bioquímicos também podem ser usados para identificar transformantes de planta ou de célula de planta contendo contru- tos de gene inseridos. Esses métodos incluem mas não são limitados a: 1) análise de Southern ou ampliação de PCR para a detecção e determinação da estrutura do inserto de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção de Sl RNase1 ampliação de PCR de transcriptase reversa ou extensão de inici- ador para a detecção e exame dos transcritos de RNA do construtos de ge- ne; 3) ensaios enzimáticos para a detecção de atividade de enzima ou ribo- zima, em que tais produtos de gene são codificados pelo construto de gene; 4) eletroforese de gel de proteína, técnicas de Western blot, imunoprecipita- ção, ou imunoensaios ligados a enzima, em que os produtos de construto de gene são proteínas. Técnicas adicionais, tai como hibridização in situ, man- chamento de enzima, e imunomanchamento, também podem também ser usadas para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em tecidos e órgãos de planta específicos. Os métodos para fazer todos es- ses ensaios são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
Efeitos de manipulação de gene usando-se os métodos descri- tas aqui podem ser observados por, por exemplo, northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isolado dos tecidos de interesse. Tipicamente, se a quanti- dade de mRNA aumentasse, pode ser admitido que o gene endógeno cor- respem quente está sendo expresso em uma taxa maior do que antes. Ou- tros métodos de medição de atividade de gene e/ou de CYP74B podem ser usados. Diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, depen- dendo do substrato usado e o método de detecção do aumento ou diminui- ção de um produto de reação ou um sub-produto. Além disso, os níveis de e/ou proteína de CYP74B expressa podem ser medidos imunoquimicamen- te, isto é, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios à base de anticorpo bem conhe- cidos por aqueles versados na técnica, tais como ensaios de detecção ele- troforética (ou com manchamento ou western blotting). O transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios em desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em substancialmen- te todos os tecidos de planta, substancialmente ao longo de seu ciclo de vida inteiro. No entanto, qualquer modo de expressão combinatória é também aplicável.
A presente descrição também inclui sementes das plantas transgênicas descritas acima em que a semente tem o contruto de gene ou de transgene. A presente descrição ulteriormente inclui a progênie, clones, linhas de células ou células das plantas transgênicas descritos acima em que o dito progênie, clone, linha de célula ou célula tem o contruto de gene ou de transgene.
ZFPs e vetores de expressão que codificam ZFPs podem ser administrados diretamente à planta para a clivagem direcionada e/ou recom- binação.
Administração de quantidades eficazes por qualquer uma das rotas normalmente usada para a introdução de ZFP para dentro do contato final com a célula de planta a ser tratada. As ZFPs são administradas de qualquer modo adequado. Métodos adequados de administração de tais composições estão disponíveis e bem conhecidos por aqueles de habildiade na técnica, e, embora mais do que uma rota possa ser usada para adminis- trar uma composição particular, uma rota particular pode freqüentemente prover uma reação mais imediata e mais eficaz do que uma outra rota. Veículos podem também ser usados e são determinados em
parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Correspem quentemente, há uma ampla variedade de formulações adequadas das composições far- macêuticas que estão disponíveis (vide, por exemplo, Remington 's Pharma- ceutical Sciences, 17th ed. 1985)).
Aplicações
Proteínas de dedo de zinco compreendendo um ou mais dedos de zinco não-canônicos como descrito aqui são úteis para todas as aplica- ções de edição e regulação de genoma para as quais C2H2 ZFPs canônicas são atualmente usadas, incluindo mas não limitadas a: ativação de gene; repressão de gene; edição de genoma (clivagem, inserção direcionada, substituição ou deleção); e edição de epigenoma (através da o direciona- mento de modificações covalentes de histonas ou de DNA).
ZFNs compreendendo dedos de zinco não-canônicos como descritas aqui podem ser usadas para clivar DNA a uma região de interesse na cromatina celular (por exemplo, a um sítio desejado ou predeterminado em um genoma, por exemplo, em um gene, ou mutante ou tipo selvagem). Para tal clivagem de DNA direcionada, um domínio de ligação de dedo de zinco é engenheirado para ligar um sítio-alvo a ou próximo do sítio de cliva- gem determinado, e uma proteína de fusão compreendendo o domínio de ligação de dedo de zinco engenheirado e um domínio de clivagem é expres- so em uma célula. Na ligação da porção de dedo de zinco da proteína de fusão para dar o sítio-alvo, o DNA é clivado próximo do sítio-alvo pelo domí- nio de clivagem. O sítio exato de clivagem pode depender do comprimento do Iigante de KC.
Alternativamente, dois ZFNs, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco e um semidomínio de clivagem, são expressas em uma célula, e se ligam a sítios alvos que são justapostos de tal modo que um domínio de clivagem funcional seja reconstituído e DNA é clivado na proximidade dos sítios alvos. Em uma concretização, clivagem ocorre entre os sítios alvos dos dois domínios de ligação de dedo de zinco. Um ou ambos os domínios de ligação de dedo de zinco podem ser enge- nheirados.
For clivagem direcionada usando-se um polipeptídeo de fusão de domínio de clivagem- domínio de ligação de dedo de zinco, o sítio de li- gação pode incluir o sítio de clivagem, ou próximo da aresta do sítio de Iiga- ção pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 ou mais nucleotídeos (ou qualquer valor integral entre 1 e 50 nucleotídeos) a partir do sítio de clivagem. O sítio de localização da ligação exata, com relação ao sítio de clivagem, depende- rá do domínio de clivagem particular, e o comprimento do Iigante de KC. Pa- ra os métodos em que dois polipeptídeos de fusão, cada um compreenden- do um domínio de ligação de dedo de zinco e um semidomínio de clivagem, são usados, os sítios de ligação em geral se estende sobre o sítio de cliva- gem. Assim a aresta próxima do primeiro sítio de ligação pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 ou mais nucleotídeos (ou qualquer valor integral entre 1 e 50 nucleotídeos) em um lado do sítio de clivagem, e da aresta próxima do se- gundo sítio de ligação podem ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 ou mais nucleotídeos (ou qualquer valor integral entre 1 e 50 nucleotídeos) no outro lado do sítio de clivagem. Métodos para o mapeamento de sítios de clivagem in vitro e in vivo são conhecidos por aqueles versados na técnica.
Uma vez que introduzido para dentro de, ou expresso em, a cé- lula alvo, a proteína de fusão se liga para dar a sequência-alvo e cliva na ou próximo da sequência-alvo. O sítio exato de clivagem depende da natureza do domínio de clivagem e/ou da presença e/ou da natureza de seqüências de Iigante entre a ligação e domínios de clivagem. Nesses casos em que dois ZFNs, cada uma compreendendo um semidomínio de clivagem, são usadas, a distância entre as arestas próximas dos sítios de ligação pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 ou mais nucleotídeos (ou qualquer valor inte- gral entre 1 e 50 nucleotídeos). Níveis ótimos de clivagem pode também de- pender tanto da distância entre os sítios de ligação das duas ZFNs (vide, por exemplo, Smith e outros (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369; Bibikova e outros (200I) Mol. Cell. Biol. 21:289-297) quanto o comprimento do Iigante de KC em cada ZFN. Vide, também, a publicação de patente US 20050064474A1 e publicações de patentes Internacionais WO 05/084190, WO 05/014791 e WO 03/080809, cujas descrições são incorporadas por re- ferência.
Duas ZFNs, cada uma compreendendo um semidomínio de cli- vagem, pode ligar na região de interesse na mesma polaridade ou na polari- dade oposta, e seus sítios de ligação (isto é, sítios alvos) podem ser separa- dos por qualquer número de nucleotídeos, por exemplo, de 0 a 50 pares de nucleotídeo ou qualquer valor integral entre as mesmas. Em certas concreti- zações, os sítios de ligação para duas proteínas de fusão, cada uma com- preendendo um domínio de ligação de dedo de zinco e um semidomínio de clivagem, podem ser localizados entre 5 e 18 pares de nucleotídeo à parte, por exemplo, 5-8 pares de nucleotídeo à parte, ou 15-18 pares de nucleotí- deo à parte, ou 6 pares de nucleotídeo à parte, ou 16 pares de nucleotídeo à parte, ou dentro de 10 pares de nucleotídeo entre si, como medidas a partir da aresta de cada sítio de ligação mais próximo do outro sítio de ligação, e clivagem ocorre entre os sítios de ligação.
O sítio em que o DNA é clivado em geral está entre os sítios de ligação para as duas proteínas de fusão. Ruptura de fita dupla de DNA fre- qüentemente resulta de duas rupturas de fio único, ou "nus", equivalência por 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais nucleotídeos, (por exemplo, clivagem de DNA de fita dupla por Fok I nativo resulta de rupturas de fita única equivalência por 4 nucleotídeos). Assim, clivagem não necessariamente ocorre em sítios exa- tamente opostos em cada fio de DNA. Além disso, a estrutura das proteínas de fusão e a distância entre os sítios alvos podem influenciar se clivagem ocorre adjacente um par de nucleotídeo único, ou se clivagem ocorre em vários sítios. No entanto, para muitas aplicações, incluindo recombinação direcionada e mutagênese direcionada, clivagem dentro de uma faixa de nucleotídeos está em geral suficiente, e clivagem meio de pares de base particulares não é exigida.
Como observado acima, uma proteína(s) de fusão pode(m) ser expressa(s) em uma célula após a introdução para dentro da célula, de poli- peptídeos e/ou polinucleotídeos. Por exemplo, dois polinucleotídeos, cada um compreendendo seqüências que codificam um dos polipeptídeos acima mencionados, podem ser introduzidas para dentro de uma célula, e quando os polipeptídeos são expressos e cada um se liga a sua sequência-alvo, cli- vagem ocorre na ou próxima a sequência-alvo. Alternativamente, um polinu- cleotídeo único compreendendo seqüências que codifica ambos os polipep- tídeos de fusão é introduzido para dentro de uma célula. Polinucleotídeos podem ter quaisquer análogos ou formas modificadas, DNA ou RNA ou DNA e/ou RNA. Em certas concretizações, clivagem direcionada em uma região genômica por uma ZFN resulta na alteração da seqüência de nucleotídeos da região, após reparo do evento de clivagem por união final não-homóloga (NHEJ).
Em outras concretizações, clivagem direcionada em uma região genômica por uma ZFN pode também ser parte de um procedimento em que uma seqüência genômica (por exemplo, uma região de interesse na croma- tina celular) é substituída com uma seqüência não-idêntica homóloga (isto é, por recombinação direcionada) através da mecanismos dependente de ho- mologia (por exemplo, inserção de uma seqüência de doador compreenden- do uma seqüência endógena juntamente com uma ou mais seqüências que são idênticas, ou homólogas mas não-idênticas, com uma seqüência genô- mica predeterminada (isto é, um sítio-alvo)). Uma vez que rupturas de fita dupla no DNA celular estimulam mecanismos de reparo celular várias milha- res de vezes na proximidade do sítio de clivagem, clivagem direcionada com ZFNs como descrito aqui permite para a alteração ou substituição (através da reparo direcionado por homologia) de seqüências em qualquer sítio virtu- almente no genoma.
Substituição direcionada de uma seqüência genômica selecio- nada exige, além das ZFNs descritas aqui, a introdução de um polinucleotí- deo exógeno (doador). O polinucleotídeo de doador pode ser introduzido para dentro da célula antes de, concorrentemente com, ou subsequente a, expressão das ZFNs. O polinucleotídeo de doador contém homologia sufici- ente a uma seqüência genômica para suportar recombinação homóloga (ou reparo direcionado por homologia) entre ele e a seqüência genômica à qual ela porta homologia. Cerca de 25, 50 100, 200, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.000 nucleotídeos ou mais de homologia de seqüência (ou qualquer valor integral entre 10 e 2.000 nucleotídeos, ou mais) suportarão recombinação homóloga. Polinucleotídeos de doador pode variar de comprimento de 10 a 5.000 nu- cleotídeos (ou qualquer valor integral de nucleotídeos entre os mesmos) ou mais.
Estará prontamente evidente que a seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo de doador é tipicamente não-idêntica àquela da seqüên- cia genômica que ela substitui. Por exemplo, a seqüência do polinucleotídeo de doador pode conter uma ou mais substituições, inserções, deleções, in- versões ou redisposições com relação à seqüência genômica, contanto que homologia suficiente com seqüências cromossomais esteja presente. Tais mudanças de seqüência podem ser de qualquer tamanho e podem ser tão pequeno quanto um par de nucleotídeo único. Alternativamente, um polinu- cleotídeo de doador pode conter uma seqüência não-homóloga (isto é, uma seqüência endógena, a ser distinguida de um polinucleotídeo exógeno) flan- queada por duas regiões de homologia. Adicionalmente, polinucleotídeos de doador podem compreender uma molécula de vetor contendo seqüências que não são homólogas à região de interesse na cromatina celular. Em ge- ral, a(s) região(ões) homóloga(s) de um polinucleotídeo de doador terá(ão) pelo menos 50% de identidade de seqüência com uma seqüência genômica com a qual recombinação é desejada. Em certas concretizações, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 99,9% de identidade de seqüência está pre- sente. Qualquer valor entre 1% e 100% de identidade de seqüência podem estar presentes, dependendo do comprimento do polinucleotídeo de doador.
Uma molécula de doador pode conter várias, regiões descontí- nuas de homologia a cromatina celular. Por exemplo, para a inserção dire- cionada de seqüências não normalmente presente em uma região de inte- resse, as ditas seqüências podem estar presentes em uma molécula de áci- do nucleico de doador e flanqueadas por regiões de homologia a seqüência na região de interesse.
Para simplificar ensaios (por exemplo, hibridização, PCR, diges- tão de enzima de restrição) para a determinação de inserção com sucesso de seqüências a partir do polinucleotídeo de doador, certas diferenças de seqüência podem estar presentes na seqüência de doador quando em com- paração com a seqüência genômica. De preferência, se localizada em uma região de codificação, tais diferenças de seqüência de nucleotídeos não mu- darão a seqüência de aminoácidos, ou produzirão mudanças de aminoácido silenciosas (isto é, mudanças que não afetam a estrutura ou função da pro- teína). O polinucleotídeo de doador pode opcionalmente conter mudanças nas seqüências que correspem quem aos sítios de ligação de domínio de dedo de zinco na região de interesse, para prevenir clivagem de seqüências de doador que foram introduzidas para dentro de cromatina celular por re- combinação homóloga.
Um polinculeotídeo pode ser introduzido para dentro de uma cé- lula como parte de um molécula de vetor tendo seqüências adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promoteres e genes que codifi- cam resistência a antibiótico. Além do mais, polinucleotídeos de doador po- dem ser introduzidos como ácido nucleico nu, como ácido nucleico comple- xado com um agente tal como um Iipossoma ou poloxâmero, ou podem ser fornecidos por bactérias ou vírus (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus de mosaico de tabaco, vírus X de batata, vírus de mosaico de couve-flor e Vírus de mo- saico de nervura da mandioca. Vide, por exemplo, Chung e outros (2006) Trends Plant ScL I l(l):l-4.
Para a alteração de uma seqüência cromossomal, não é neces- sário para a seqüência inteira do doador de ser copiada no cromossoma, contanto que o suficiente da seqüência de doador seja copiada para efetuar a alteração da seqüência desejada.
A eficácia de inserção de seqüências de doador por recombina- ção homóloga está inversamente relacionada com a distância, no DNA celu- lar, entre a ruptura de fita dupla e o sítio em que recombinação é desejado. Em outras palavras, eficácias homólogas de recombinção mais altas são observadas quando a ruptura de fita dupla está mais próxima do sítio em que recombinação é desejada. Nos casos em que um sítio preciso de re- combinação não é determinado (por exemplo, o evento de recombinação desejado pode ocorrer durante um intervalo da seqüência genômica), o comprimento e seqüência do ácido nucleico de doador, juntamente com o(s) sítio(s) de clivagem, são selecionados para se obter o evento de recombina- ção desejado. Em casos em que o evento desejado é projetado para mudar a seqüência de um par de nucleotídeo único em uma seqüência genômica, cromatina celular é clivada dentro de 10.000 nucleotídeos no outro lado da- quele par de nucleotídeo. Em certas concretizações, clivagem ocorre dentro de 1.000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, ou 2 nucleotí- deos, ou qualquer valor integral entre 2 e 1.000 nucleotídeos, no outro lado do par de nucleotídeo cuja seqüência deve ser mudada.
Inserção direcionada de seqüências endógena em uma região genômica é realizada por clivagem direcionada na região genômica usando- se ZFNs, de acordo com o fornecimento que polinucleotídeo exógeno (doo- dor) contendo as seqüências exógenas. O polinucleotídeo de doador tam- bém tipicamente contém seqüências que flanqueiam a seqüência endógena, que contém homologia suficiente a região genômica para suportar reparo direcionado por homologia da ruptura de fita dupla na seqüência genômica, desse modo inserindo a seqüência endógena na região genômica. Portanto, o doador ácido nucleico pode ser de qualquer tamanho suficiente para su- portar a integração da seqüência endógena por mecanismos dependentes de homologia (por exemplo, recombinação homóloga). Sem querer estar ligado por qualquer teoria particular, as regiões de homologia que flanquei- am a seqüência endógena são pensadas prover as extremidades de cro- mossoma rompidas com um modelo para ressíntese da informação genética no sítio da ruptura de fita dupla.
Integração direcionada de seqüências endógenas, como descri- to acima, pode ser usada para inserir um gene de marcador a uma localiza- ção cromossomal escolhida. Genes de marcador incluem, mas não são limi- tados a, seqüências que codificam proteínas que mediam resistência a anti- biótico (por exemplo, resistência a ampicilina, resistência a neomicina, resis- tência a G418, resistência a puromicina), seqüências que codificam proteí- nas coloridas ou fluorescentes ou Iuminescentes (por exemplo, proteína fluo- rescente verde, proteína fluorescente verde aumentada, proteína fluorescen- te vermelha, luciferase), e proteínas que mediam crescimento celular e/ou ampliação de gene (por exemplo, redutase de di-hidrofolato). Genes de mar- cador exemplares assim incluem, mas não são limitados a, [beta]- glucuronidase (GUS), transferase de N-acetil fosfinotricina (PAT, BAR), fos- fotransferase de neomicina, [beta]-lactamase, dioxigenase de catecol, [alfa]- amilase, tirosinase, [beta]-galactosidase, luciferase, aequorin, sintase de EPSP, nitrilase, sintase de acetolactato (ALS), redutase de diidrofolato (DH- FR), desalogenase de dalapon e sintase de antranilato. Em certas concreti- zações, integração direcionada é usada para inserir um construto de expres- são de RNA, por exemplo, seqüências responsáveis por expressão regulada de micro RNA ou siRNA. Promotores, aumentadores e seqüências regulado- ras de transcrição adicionais podem também ser incorporados em um cons- truto de expressão de RNA.
Outros aumentos na eficácia de recombinação direcionada, em células compreendendo uma molécula de fusão de nuclease/dedo de zinco e uma molécula de doador de DNA, são alcançados por bloqueio das células na fase G2 phase de um ciclo celular, quando processos de reparo acionado por homologia são maximamente ativos. Tal interrupção pode ser alcaçada em uma série de maneiras. Por exemplo, células podem ser tratadas com, por exemplo, fármacos, compostos e/ou moléculas pequenas que influenci- am progressão de modo que aprisionar células na fase G2. Moléculas e- xemplares desse tipo incluem, mas não são limitadas a, compostos que afe- tam polimerização de microtúbulo (por exemplo, vinblastina, nocodazol, Ta- xol), compostos que interagem com DNA (por exemplo, dicloridrato de dia- mina de cis-platina(ll), Cisplatina, doxorrubicina) e/ou compostos que afetam a síntese de DNA (por exemplo, timidina, hidroxiuréia, L-mimosina, etoposí- deo, 5-fluorouracila). Aumentos adicionais na eficácia de recombinação são alcaçados pelo uso de inibidores de histona deacetilase (HDAC) (por exem- plo, butirato de sódio, tricostatina A) que alteram estrutura de cromatina para produzir DNA genômico mais acessíveis a uma maquinaria de recombinação celular.
Métodos adicionais para a interrupção celular incluem ultraex- pressão de proteínas que inibem a atividad das cinases de ciclo celular de CDK1 por exemplo, por introdução de um cDNA que codifica a proteína para dentro da célula ou por introdução para dentro da célula de uma ZPF enge- nheirada que ativa expressão do gene que codifica a proteína. Interrupção de ciclo celular é também alcaçado por inibição da atividade de ciclinas e CDKs1 por exemplo, usando-se métodos de RNAi (por exemplo, a patente US No. 6.506.559) ou por introdução para dentro da célula uma ZPF enge- nheirada que reprime expressão de um ou mais genes envolvidos em pro- gressão de ciclo celular tais como, por exemplo, genes de CDK/ciclina. Vide, por exemplo, a patente US pertencente No. 6.534.261 para os métodos para a síntese de proteínas de dedo de zinco engenheiradas para regulação de expressão de gene.
Como descrito acuna, os métodos e composições descritos para a clivagem direcionada podem ser usados para induzir mutações em uma seqüência genômica. Clivagem direcionada pode também ser usada para criar inativações de gene (por exemplo, para genômicos funcionais ou vali- dação-alvo) e para facilitar a inserção direcionada da seqüência em um ge- noma (isto é, manutenção de gene). Inserção pode ser por meio de substitu- ições de seqüências cromossomais através de recombinação homóloga ou por integração direcionada, em que um nova seqüência (isto é, uma seqüên- cia não presente na região de interesse), flanqueada por seqüências homó- logas à região de interesse no cromossoma, é inserida em um sítio prede- terminado. O mesmo métodos pode também ser usado para substituir uma seqüência de tipo selvagem com uma seqüência mutante, ou para converter um alelo em um alelo diferente.
Clivagem direcionada de infecção ou patógenos de planta inte- grados pode ser usada para tratar infecções patogênicas em um hospedeiro de planta, por exemplo, por clivagem do genoma do patógeno tal que sua patogenicidade é reduzida ou eliminada. Adicionalmente, clivagem direcio- nada de genes que codifica receptores para vírus de planta podem ser usa- dos para bloquear expressão de tais receptores, desse modo prevenindo infecção viral e/ou propagação viral na planta.
Patógenos de planta exemplares incluem, mas não são limita- dos a, vírus de planta tais como Alfamoviruses, Alfacryptoviruses, Badnavi- ruses, Betacryptoviruses, Bigeminiviruses, Bromoviruses, Bymoviruses, Ca- pilloviruses, Carlaviruses, Carmoviruses, Caulimoviruses, Closteroviruses, Comoviruses, Cucumoviruses, Cytorhabdoviruses, Dianthoviruses, Enamovi- ruses, Fabaviruses1 Fijiviruses, Furoviruses, Hordeiviruses, Hybrigeminiviru- ses, Idaeoviruses, llarviruses, Ipomoviruses, Luteoviruses, Machlomoviruses, Macluraviruses, Marafiviruses, Monogeminiviruses, Nanaviruses, Neuroviru- ses, Nepoviruses, Nucleorhabdoviruses, Oryzaviruses, Ourmiaviruses, Phy- toreoviruses, Potexviruses, Potyviruses, Rymoviruses, satellite RNAs1 satelli- viruses, Sequiviruses, Sobemoviruses, Tenuiviruses, Tobamoviruses, Tobra- viruses, Tombusviruses, Tospoviruses, Trichoviruses, Tymoviruses, Umbra- viruses, Varicosaviruses e Waikaviruses; patógenos fúngicos tais como car- vões (por exemplo, Ustilaginales), ferrugens (Uredinales), moléstias dos ce- reais (Clavicepts pupurea) e míldio; mofos (Oomycetes) tal como Phytoph- thora infestans pulgão de batata); patógenos bacterianos tal como Erwinia (por exemplo, E. herbicola), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa, P. syringae, P. fluorescense e P. putida), Ralstonia (por exemplo, R. solanacea- rum), Agrobacterium e Xanthomonas; nemalteminto (Nematoda); e Phy- tomyxea (Polymyxa e Plasmodiophora).
Os métodos descritos para a recombinação direcionada podem ser usados para substituir qualquer seqüência genômica com a seqüência não-idêntica, homóloga. Por exemplo, uma seqüência genômica mutante pode ser substituída por seu correspem quente de tipo selvagem, desse mo- do provendo métodos para o tratamento de doenças de planta; provendo resistência a patógenos de planta; aumentando fornecimentos de colheita, etc. Da mesma forma, uma alelo de um gene pode ser substituído por um alelo diferente usando-se os métodos de recombinação direcionada descri- tos aqui.
Em muitos desses casos, a região de interesse compreende a mutação, e o polinucleotídeo de doador compreende a seqüência de tipo selvagem correspem quente. Similarmente, uma seqüência genômica de tipo selvagem pode ser substituída por uma seqüência mutante, se tal é deseja- do. De fato, qualquer patologia dependente de uma seqüência genômica particular, de qualquer forma, pode ser corrigida ou aliviada usando-se os métodos e composições descritos aqui. Clivagem direcionada e recombinação direcionada podem tam- bém ser usadas para alterar seqüências de não-codificação (por exemplo, seqüências reguladoras tais como promotores, aumentadores, iniciadores, terminadores, sítios de união) para alterar os níveis de expressão de um produto de gene. Tais métodos podem ser usados, por exemplo, para as finalidades terapêuticas, alterações em bioquímica e fisiologia celular, ge- nômicos funcionais e/ou estudos de validação alvo.
Os métodos e composições descritos aqui podem também ser usados para a ativação e repressão de expressão de gene usando-se fusões entre um dedo de zinco não-canônico domínio de ligação e um domínio fun- cional. Tais métodos são descritos, por exemplo, nas patentes US pertecen- tes 6.534.261; 6.824.978 e 6.933.113; cujas descrições são incorporadas por referência. Métodos de repressão adicionais incluem o uso de oligonucleotí- deos de sem sentido e/ou RNA de interferência pequeno (siRNA ou RNAi) direcionaos à seqüência do gene a ser reprimido.
Em concretizações adicionais, uma ou mais fusões entre um domínio de ligação de dedo de zinco e uma recombinase (ou seu fragmento funcional) podem ser usados, além de ou invés das fusões de domínio de clivagem de dedo de zinco descritas aqui, para facilitar recombinação dire- cionada. Vide, por exemplo, uma patente US pertencente No. 6.534.261 e Akopian e outros (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:8688-8691.
Em concretizações adicionais, os métodos e composições des- critos são usados para prover fusões de domínios de ligação de ZFP com domínios de repressão ou ativação transcritiva que exigem dimerização (ou homodimerização ou heterodimerização) para sua atividade. Nesses casos, um polipeptídeo de fusão compreende um domínio de ligação de dedo de zinco e um monômero de domínio funcional (por exemplo, um monômero de um domínio de repressão ou ativação transcritiva dimérica). Ligação de dois tais polipeptídeos de fusão para sítios alvos adequadamente situados permi- te dimerização de modo que reconstitutem um domínio de repressão ou ati- vação de transcrição funcional.
Exemplos A presente invenção é ulteriormente definida nos seguintes e- xemplos, em que todas as partes e percentagem são em peso e graus são Celsius, a não ser que de outra maneira afirmado. Seria entendido que es- ses exemplos, enquanto indicando certas concretizações da invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e esses e- xemplos, aquele versado na técnica pode determinar as características es- senciais dessa invenção, e sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adapta-la a vários usos e condições.
Exemplo 1: vetores de expressão de ZFN
Vetores de expressão compreendendo seqüências que codifi- cam ZFNs de 4 dedos (designados "5-8" e "5-9") como descrito nos exem- plos 2 e 14 da publicação de patente US 2005/0064474, cuja descrição é incorporada por referência (Vide exemplo 2 daquele pedido) foram modifica- dos como se segue. Resumidamente, o ZFN de 5-8 e 5-9 (compreendendo 4 domínios de dedo de zinco fundidos ao domínio de nuclease da enzima de restrição Fok I de tipo IIS (aminoácidos 384-579 da seqüência de Wah e ou- tros (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA 95:10564-10569) através da a quatro aminoácido Iigante de KC) foram modificados em uma estrutura de CCHC. Modificações adicionais (substituições e inserções) foram também produzi- das para dar resíduos entre as estruturas de coordenação de zinco de His e Cys C-terminal e/ou C-terminal ao Cys C-terminal no dedo 2 e/ou dedo 4.
Exemplo 2: Correção de gene de eGFP em linhas de células de
repórter
A capacidade de ZFNs compreendendo dedos de zinco de C- CHC como descrito aqui para facilitar a recombinação homóloga foi testada no sistema de GFP descrito em Urnov (2005) Natureza 435(7042):646-51 e a publicação de patente US No. 20050064474 (por exemplo, exemplos 6- 11). Resumidamente, 50 ng de cada ZFN e 500 ng do doador de GFP me- nos o promotor (Urnov (2005) Natureza) foram transfectados para dentro de 500.000 células repórter, usando-se 2 uL de Lipofectamina 2000 por amos- tra, como pelo protocolo de Invitrogen Lipofectamina 2000. Vinblastina foi adicionada 24 horas pós-transfecção a uma con- centração final de 0,2 uM, e foi removida 72 horas pós-transfecção.
As células foram analisadas quanto a expressão de GFP 5 dias pós-transfecção por medição de 40.000 células por transfecção no analisa- dorde FACS de topo de bancanda Guava.
Como mostrado na FIGURA 1, a maior parte de ZFNs compre- endendo dedos de zinco de CCHC alterados como mostradas na tabelas 1 e 2 acima facilitam recombinação homóloga no local de repórter (GFP), que resulta na expressão de GFP em níveis acima de dedos de zinco de CCHC não modificados e vários realizados comparavelmente com ZFNs compre- endendo dedos de CCHH de zinco. A ótima variante de realização quando posisionada no dedo 4 (F4) compreendia a seguinte seqüência (incluindo e C-terminal no resíduo de coordenação de zinco de His): HAQRCGLRGSQLV (SEQ ID NO:53) (o dedo de zinco na tabela 2 designado N°21 e mostrado na FIGURA 1 como "2- 21"). A ótima variante de realização quando posicionada no dedo 2 (F2) compreendia a seguinte seqüência (incluindo e C-terminal no resíduo de coordenação de zinco de His): HIRTCTGSQKP (SEQ ID NO:75) (o dedo de zinco na tabela 2 designado N°43 e mostrado na FIGURA 1 co- mo "2-43").
Exemplo 3: Edição de um gene de IL2Rgama cromossomal por recombinação direcionada ZFNs como descritos aqui foram também anali- sadas no ensaio de IL2Rgama endógeno descritas em Urnov (2005) Nature- za 435(7042):646-51 e exemplo 2 da publicação de patente US No. 20050064474. Resumidamente, dois e meio microgramas de cada construto de ZFN expressão foram transfectados para dentro de 500.000 de células de K562 usando-se um Nucleofector (Amaxa). DNA genômico foi coletado e rompimento de gene foi analisado no local de IL2Rgama endógena usando- se o kit de endonuclease Surveyor.
ZFNs são mostrados no esquerdo superior da FIGURA 2. Em particular, dedo de zinco 20 alterado refere-se a um dedo de CCHC de zinco compreendendo a seqüência HTRRCGLRGSQLV; dedo de zinco 21 com- preende a seqüência HAQRCGLRGSQLV (SEQ ID NO: 53); dedo de zinco 43 compreende a seqüência HIRTCTGSQKP (SEQ ID NO: 75); dedo de zin- co 45 compreende a seqüência HERTGCTGSQKP; dedo de zinco 47 com- preende a seqüência HIRRCTGSQKP; e dedo de zinco 48 compreende a seqüência HIRRGCTGSQKP. Dedos de zinco 20 e 21 foram usados no dedo 4 dos ZFNs de 4 dedos e dedos de zinco 43, 45, 47, e 48 foram usados no dedo 2 dos ZFNs de 4 dedos.
Os pares de ZFNs testados são mostrados na FIGURA 2 acima e à direita do gráfico na tabela 5:
Tabela 5
Amostra N0 5-8 ZFN 5-9 ZFN 1 Nenhum (GFP) 2 (CCHH) tipo de selvagem (CCHH) tipo de selvagem 3 43 (dedo 2) 43 (dedo 2) 4 43 (dedo 2) 20 (dedo 4) 43 (dedo 2) 21 (dedo 4) 6 43 (dedo 2) 45 (dedo 2) 7 43 (dedo 2) 47 (dedo 2) 8 20 (dedo 4) 43 (dedo 2) 9 21 (dedo 4) 43 (dedo 2) 45 (dedo 2) 43 (dedo 2) 11 47 (dedo 2) 43 (dedo 2) 12 48 (dedo 2) 43 (dedo 2)
Para determinar se mutações tinham sido induzidas no sítio de
clivagem, o produto de ampliação foi analisado usando-se um ensaio de Cel- 1, em que o produto de ampliação é desnaturado e é renaturado, seguido por tratamento com a nuclease de Cel-1 específica desemparelhada. Vide, por exemplo, Oleykowski e outros (1998) Nucleic Acids res. 26:4597- 4602;
Qui e outros (2004) BioTechnics 36:702-707; Yeung e outros (2005) BioTe- chnics 38:749-758.
Resultados de duas experiências são mostrados para cada a- mostra na FIGURA 2. Experiência N°2 para as amostras 8 e 9 tinham ruído de base significativo nas raias que reduziram a eficácia aparente daqueles ZFNs.
Como mostrado na FIGURA 2, certas variantes de CCHC são essencialmente equivalentes aos ZFNs de C2H2 de tipo selvagem. Dedo de zinco 21 no dedo 4 (amostras 5 e 9) produziu melhor resultado do que dedo de zinco 20 no dedo 4 (amostras 4 e 8). No Dedo 2, dedo de zinco 43 produ- zia o melhor resultado.
Exemplo 4: Correção de gene de eGFP em linhas de células de
repórter
Com base nos resultados mostrados na FIGs. 1 e 2, dedos de zinco de CCHC mostrados nas Tabelas 3 e 4 acima (designados Ia até 10a) foram produzidos. Esses dedos de zinco foram incorporados nos 5-8 e 5-9 ZFNs e foram testados no ensaio de correção de gene de GFP descrito no exemplo 2 acima. Os pares de ZFN testados em cada amostra são mostra- dos abaxo de cada barra, em que os números de dedo de zinco 20, 21, 43, 45, 47 e 48 são aqueles descritos no exemplo 3 e dedos de zinco de CCHC Ia até 10a compreendem a seqüência mostrada nas tabelas 3 e 4 acima. Dedos de zinco 20, 21, 7a, 8a, 9a e 10a foram usados no Dedo 4; dedos de zinco 43, 45, 47, 48, Ia, 2a, 3a, 4a, 5a, e 6a foram usados no Dedo 2.
Resultados são mostrados na FIGURA 3. A fileira de topo abai- xo cada barra refere-se ao dedo de zinco incorporado no ZFN 5-8 e a fileira de fundo abaixo cada barra refere-se ao dedo de zinco incorporado no ZFN 5-9. Por exemplo, a segunda barra oriunda da esquerda no gráfico da FI- GURA 3 refere-se a uma amostra transfectada com 5-8 e 5-9 ZFNs em que F4 de ambos os ZFNs compreende a seqüência de dedo de zinco 20. Como mostrados, muitos dos ZFNs compreendendo dedos de zinco de CCHC rea- lizados comparáveis com ZFNs de tipo selvagem (CCHH).
Exemplo 5: Projeto e geração de vetor-alvo
A. Estrutura global da sequência-alvo
O construto- alvo para tabaco (uma dicotiledônea) incluia os seguintes 7 componentes como mostrado na FIGs. 4 e 5: i) um cassete de expressão de fosfotransferase de higromicina (HPT) compreendendo um promotor de ubiquitina-3 (ubi-3) de A. thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493) que dirige o gene de HPT de E. coli (Waldron e outros, 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200) terminado por uma região não tra- duzida (UTR) 3' de quadro de leitura aberto 24 (orf-24) de A tumifaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493); ii) seqüência homóloga-1, compreen- dendo a região de ligação de matriz (MAR) de RB7 de N. tabacum (Thomp- son e outros, 1997, W09727207); iii) um fragmento de gene de proteína fluo- rescente verde (GFP) 5' (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Rússia) dirigido por um promotor (DeItamas) de sintase de mannopine de A. tumifa- ciens modificada (Petolino e outros, a patente US No. 6,730,824); iv) um cassete de expressão [beta]-glucuronidase (GUS) compreendendo um pro- motor de vírus de mosaico de nervura de mandioca (CsVMV) (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31 :1129-1139) que dirige um gene de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) terminado pelo 3' UTR de sintase de nopalina (nos) de A. tumifaciens (DePicker e outros, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573); v) um fragmento de gene de GFP 3' (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Rússia) terminado por 3' UTR de orf-1 de A. tumifaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822); vi) se- qüência homóloga-2, compreendendo íntron-1 de sintase de 4-cumaroíla- CoA de A thaliana (4-CoAS) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) e; vii) uma fosfotransferase de fosfinotricina de S. viridochromogenes (PAT) (Wohl- Ieben e outros, 1988, Gene 70:25-37) fragmentod e gene 3' terminado por 3' UTR de ORF-25/26 de A. tumifaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493).
Um sítio de ligação de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco (IL-1-LO-Fok I) (Umov e outros, 2005, US 2005/0064474) foi inserido a jusante do promotor de CsVMV (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139) e foi fundido na seqüência de codificação de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) no N-terminal. Duas có- pias de um sítio de ligação de Fok I de dedo de zinco (Scd27-L0-Fok I) (Ur- nov e outros, 2005, US 2005/0064474) flanqueavam os fragmentos de gene de GFP 5' e 3' (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Rússia). Cada sítio de ligação continha quatro repetições tandem da seqüência de reconheci- mento do fusão de proteína de Fok I de dedo de zinco particular de modo que cada sítio de ligação era de tamanho de~200pb (FIGURA 6A). Isso foi projetado para assegurar que a seqüência de reconhecimento como seria acessível à fusão de proteína de Fok I de dedo de zinco no ambiente de cromatina complexo. Cada seqüência de reconhecimento incluía uma se- qüência de repetição invertida à qual uma única proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco ligado como um homodímero e clivou o DNA de fita dupla (FIGURA 6B). Os fragmentos de gene de GFP 5' e 3' sobrepostos por 540 pb provendo homologia dentro da sequência-alvo e um códon de parada foi inserido na extremidade 3' do fragemnto de GFP 5' GFP para assegurar na tradução de GFP funcional a partir da sequência-alvo.
O vetor de transformação compreendendo a sequência-alvo foi gerado através de um processo de clonagem de múltiplas etapas como des- crito abaixo.
B. Construção do vetor binário de HPT (PDAB1584)
O vetor pDAB1400, que continha um cassete de expressão de GUS1 compreendendo um promotor de ubi-3 de A thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486- 12493) que dirige o gene de GUS (Jeffer- son, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) terminado por UTR de orf-1 de A. tumifaciens (Huang e outros, J. Bacterid. 172:1814-1822), foi usado como o construto de base de partida (FIGURA 7).
Para evitar quaisquer elementos reguladores repetidos não ne- cessários no construto- alvo , UTR de orf-1 de A. tumifaciens (Huang e ou- tros, J. Bacteriol. 172:1814-1822) em pDAB1400 foi substituído com um UTR de orf-24 de A. tumifaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493), que foi extir- pado de pDAB782 (FIGURA 8) como um fragmento de Sacl/Xbal e foi clona- do nos mesmos sítios em pDAB1400. O construto resultante continha um promotor de ubi-3 de A. thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265- 12486-12493) que dirige o gene de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) terminado por um UTR de orf-24 de A. tumifaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493) e foi chamado pDAB1582 (FIGURA 9).
A seqüência de codificação de HPT (Waldron e outros, 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200) foi ampliada por PCR a partir de plasmídio de pDAB354 (FIGURA 10) usando-se os iniciadores Pl e P2. Um sítio de Bbs I foi adicionado na extremidade 5' de iniciador Pl e o sítio de Sac I foi retido na extremidade 3' de iniciador P2. O fragmento de PCR de HPTII foi digerido com Bbs l/Saci e foi clonado em pDAB1582 digerido com Nco I-Sacl para usar o gene de GUS com o gene de HPT como substituto de fragmento de PCR. O plasmídio resultante foi chamado pDAB1583 (FIGURA 11).
O fragmento de ubi-3/ΗΡΤΜ de A. thaliana/orf-24 de A. tumifaci- ens foi então extirpado a partir de pDAB1583 por digestão de Not I e foi tra- tado com polimerase de T4 DNA para gerar extremidades abruptas. O cas- sete de expressão de HTP tratado com extremidade abrupta foi clonado em pDAB2407 (FIGURA 12), um vetor de base binária, no sítio de Pmel que re- sulta no plasmídio pDAB1584 (FIGURA 13).
C. Construção do vetor compreendendo as seqüências homólo- gas e o sítio de ligação de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de Scd27 (PDAB1580)
O UTR de orf-1 de A. tumefaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822) em pDAB2418 (FIGURA 14) foi substituído com o UTR de orf-25/26 de A. tumefaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493) para evitar seqüências reguladoras repetidas no vetor-alvo. Para produzir a troca de UTR, o UTR de orf-25/26 de A. tumefaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493) foi ampliado por PCR a partir do plasmídio de pDAB4045 (FI- GURA 15) usando-se iniciadores P3 e P4. Sítios de Smal e Agel foram adi- cionados à extremidade 3' do fragmento de PCR1 e o sítio de Sac I foi retido na extremidade 5'. O DNA de plasmídio de pDAB2418, que continha um cassete de expressão de gene de PAT compreendendo o promotor de ubi- quitins-10 (ubi-10) de A. thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265- 12486-12493) que dirige o gene de PAT (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37) terminado pelo UTR de orf-1 de A. tumefaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822) e a seqüência de RB7 MAR de N. tabacum (Thompson e outros, 1997, W09727207), foi digerido com Sac I e Agel e dois fragmentos maiores foram recuperados. Esses fragmentos foram liga- dos com o produto de PCR de UTR de orf-25/26 de A. tumefaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493) digerido com Sac I e Agel. O plasmídio resultante foi chamado pDAB1575 (FIGURA 16). O RB7 MAR de N. tabacum (Thomp- son e outros, 1997, W09727207) serve como seqüência homóloga-1 no ve- tor-alvo.
íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) foi selecionado para servir como seqüência homóloga-2 no ve- tor-alvo. A seqüência de codificação de gene de PAT (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37) foi analisada e os 299/300 bp a jusante do códon de partida foi identificado como o sítio para a inserção do íntron de modo que os sítios de união de 5' e 3' apropriados seriam formados. O íntron de compri- mento total foi então fundido com 253 pb da seqüência de codificação de PAT parcial 3' por síntese de DNA (Picoscript Ltd., LLP, Houston, Texas). Sítios de Not I e Sac I foram adicionados à extremidade 5' e 3' do fragmento de DNA, respectivamente. O fragmento de DNA sinteizado foi então digerido com Not l/Saci e inserido para dentro de pDAB1575 nos mesmos sítios para substituir a seqüência de codificação de PAT de comprimento total. O cons- truto resultante foi chamado pDAB1577 (FIGURA 17).
Um fragmento de DNA de 241 pb contendo 4 repetições tandem de sítios de reconhecimento de Scd27-L0-Fok I (FIGURA 6) foi sintetizado (Picoscript Ltd., LLP1 Houston, Texas) com um sítio de Smal adicionado tan- to as extremidades 5' quanto 3' do fragmento. O fragmento contendo sítio de ligação de Fok I de dedo de zinco sintetizado foi então digerido com Smal e foi inserido para dentro de pDAB1577 no sítio de Mscl. o vetor resultante foi chamado pDAB1579 (FIGURA 18). Um segundo fragmento digerido por Smal contendo sítio de ligação de Fok I de dedo de zinco foi então inserido para dentro de pDAB1579 no sítio de Swal. O construto resultante foi cha- mado pDAB1580 (FIGURA 19). Esse vetor contém seqüências homólogas 1 e 2 (íntron-1 de RB7 MAR de N. tabacum e de 4-CoAS de A. thaliana, res- pectivamente) e dois sítios de ligação de Fok I de dedo de zinco de Scd27 sintetizados, cada um contendo 4 repetições tandem de sitos de reconheci- mento de Scd27-L0-Fok I. D. Construção do vetor contendo dois fragmentos de GFP não funcional parcialmente duplicados (pDAB1572)
O gene de GFP, CopGFP, foi adquirido da Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Rússia) e a seqüência de codificação de comprimento total foi ampliada por PCR usando-se iniciadores P5 e P6. Sítios de Bbs I e Sac I foram adicionados às extremidades 5' e 3' do produto de PCR1 respec- tivamente. O produto de PCR de CopGFP foi então digerido com Bbs l/Saci e foi clonado em pDAB3401 (FIGURA 20) compreendendo o promotor del- tamas de A tumifaciens modificado (Petolino e outros, US6730824) que diri- ge o gene de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) e ter- minado por 3'UTR de orf-1 de A. tumifaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822) nos sítios de Nco l/Saci para substituir o gene de GUS. o vetor resultante foi chamado pDAB1570 (FIGURA 21).
Para produzir os dois fragmentos de GFP não funcionais parci- almente duplicados, um fragmento de DNA contendo a maior parte da se- qüência de codificação de CopGFP com uma deleção de 47 pb na extremi- dade 5' foi ampliada por PCR usando-se iniciadores P9 e P10. Um sítio de Apa I foi adicionada tanto às extremidades 5' quanto 3' e um sítio de Stul adicional foi adicionado à extremidade 5' a jusante do sítio de Apa I . O pro- duto de PCR foi então digerido com Apa I e foi inserido para dentro de pDAB1570 no sítio de Apa I, desse modo criando dois fragmentos de GFP não funcionais no mesmo vetor com uma seqüência duplicada de 540 pb. O construto resultante foi chamado pDAB1572 (FIGURA 22).
E. Construção do vetor contendo a fusão de sítio de ligação de proteína de Fok I de dedo de zinco/gene de GUS (pDABI573)
Um fragmento de DNA de 233 pb contendo 4 repetições tandem de sítio de reconhecimento de IL-I-LO-Fok I (FIGURA 6) foi sintetizado por Picoscript Ltd., LLP, (Houston, Texas) com sítios de Nco I e Afllll adiciona- dos às extremidades 5' e 3', respectivamente. O fragmento sintetizados foi então digerido com Nco I/ Afllll e foi inserido para dentro de pDAB4003 (FI- GURA 23), que continha um gene de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) dirigido por um promotor de CsVMV (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139) terminado por 3' UTR de orf-1 de A. tumefaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822) no sítio de Nco I. Uma fusão N-terminal entre sítio de ligação de IL-l_Lo-Fok I e seqüên- cia de codificação de GUS foi então gerada, o vetor resultante foi chamado pDAB1571 (FIGURA 24).
Para evitar elementos de 3' UTR repetidos no vetor-alvo, o 3' UTR de A. tumefaciens nos (DePicker e outros, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573) foi extirpado de pDAB7204 (FIGURA 25) como um fragmento de Sacl/Pmel e foi clonado em pDAB1571, que foi digerido com Sacl/Nael, para substituir o 3' UTR de orf-1 de A. tumefaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814-1822). O plasmídio resultante foi chamado pDABI573 (FIGURA 26).
F. Construção do vetor-alvo final (pDAB1585)
Para produzir para o vetor-alvo final, o cassete de expressão de GUS com a inserção de sítio-alvo de proteína de fusão de IL-1-Fok I foi ex- tirpado a partir de pDAB1573 por digestão de Not I, foi tratado com extremi- dade abrupta e foi inserido para dentro de pDAB1572 no sítio de Stul. O ve- tor intermediário resultante foi chamado pDAB1574 (FIGURA 27). O cassete total contendo o promotor deltamas modificado (Petolino e outros, US6730824), uma seqüência de GFP parcialmente duplicada 5' (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Rússia), o promotor de CsVMV (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139), uma sequência-alvo de proteína de fusão de IL-1-Fok I, o gene de GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) região de codificação, nos 3" UTR de A tumefaciens (DePicker e outros, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 :561- 573), a 3' duplicada parcialmente GFP (Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Rússia) e 3' UTR de orf-1 de A. tumefaciens (Huang e outros, J. Bacteriol. 172:1814- 1822) foi extirpado a partir de pDAB1574 e foi inserido para dentro de pDAB1580 no sítio de Not I. O plasmídio resultante foi chamado pDAB1581 (FIGURA 28). O fragmento de Agel de pDAB1581 foi então inserido para dentro de pDAB1584 no sítio de Agel desse modo criando o construto- alvo final, pDAB1585 (FIGs. 4 e 5). Exemplo 6: Geração de linhas de células transgênicas com se- quências-alvo integradas
Uma cultura de suspensão de célula de tabaco, chamado de BY2, foi usada para dentro da qual sequências-alvo do exemplo 5 foram es- tavelmente integrados através transformação de Agrobacterium. A linha de célula de base, BY2, foi obtida a partir de Jun Ueki de Japão Tabaco, Iwata1 Shizuoka, Japão. Esta cultura prolifera como células de 5-10 μ de diâmetro em grupos de 100-150 células com um tempo de dobramento grosseiramen- te de 18 horas. Culturas de suspensão de célula BY2 foram mantidas em meio contendo sais basais de LS (PhytoTechnoIogy Labs L689), 170 mg/L de KH2P04, 30 g/L de sacarose, 0,2 mg/L de 2,4-D e 0,6 mg/L de tiamina- HCL a um pH de 6,0. As células de BY2 foram sub-cultivadas a cada 7 dias por adição de 50 mL de meio à base de LS a 0,25 mL de PCV. A cultura de suspensão de célula BY2 foi mantida em frascos de 250 mL em um agitador rotativo a 25°C e 125 RPM.
A fim de gerar cultura de célula BY2 transgênica com sequên- cias-alvo integradas, um frasco de uma suspensão dé tabaco quatro dias após sub-cultura foi dividida em 10 - 12 alíquotas de quatro mL que foram cocultivadas que foram cocultivadas em placas de Petri de 100x25 mm com 100 μΙ de cepa de Agrobacterium LBA4404 que abriga pDAB1585 desenvol- vidas de um dia para o outro para um OD6oo ~1,5. Placas foram envolvidas com parafilme e foram incubadas a 25°C sem agitação por 3 dias depois do quais líquido em excesso foi removido e foi substituído com 11 mL de meio à base de LS contendo 500 mg/L de carbenicilina. Após a ressuspensão das células de tabaco, 1 mL de suspen-
são foi distribuído sobre placas de 100x25 mm de meio de base apropriado contendo 500 mg/L de carbenicilina e 200 mg/L de higromicina solidificada com 8 g/L TC de ágar, e foi incubado não enrolado a 28°C no escuro. Isso resultou em 120-144 placas de seleção para um único tratamento. Isolados de resistência a higromicina individuais apareceram 10-14 dias depois da laminação e foram transferidos para placas individuais de 60x20 mm (um isolado por placa) em que elas são mantidas como calo em uma escala de subcultura de 14 dias até que necessitasse de experiências de transforma- ção subsequente e análise.
Exemplo 7: Triagem e caracterização de eventos transgênicos
alvo
Os eventos transgênicos resistentes a higromicina gerados a pa- tir da transformação de vetor-alvo em culturas de célula de tabaco de BY2, como descrito no exemplo 6 foram analisados como se segue.
As análises iniciais conduzidas para a triagem desses eventos transgênicos incluíam análise de expressão de GUS para indicar a acessabi- Iidade da sequência-alvo, análise de PCR da sequência-alvo de comprimen- to total e parcial para confirmar a presença e integridade de vetor-alvo e aná- lise de Southern blot para determinar o número de cópias da sequência-alvo integrada. Um sub-conjunto dos eventos transgênicos que mostraram ex- pressão de GUS continha uma única cópia de sequência-alvo de compri- mento total; esses foram selecionados para re-estabelecimento de culturas de suspensão para gerar as linhas-alvo para retransformação subsequente. Essas linhas-alvo reestabelecidas estavam também sujeitas a caracteriza- ção, que incluíam análise Southern blot mais completa, confirmação de se- quenciação do inserto alvo total e flanqueamento de análise de seqüência genômica.
Culturas de suspensão ou tecido de calo de tabaco transgênicas iniciadas a partir dos eventos selecionados foram analisadas para a ativida- de de GUS por incubação de 50 mg de amostras em 150 μΙ_ de tampão de ensaio por 24-48 horas a 37°C. O tampão de ensaio consistia de fosfato de sódio a 0,2 M pH 8,0, 0,1 mM cada um de ferricianeto de potássio e ferrocia- neto de potássio, EDTA a sódio a 1,0 mM, 0,5 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3- indoil-[beta]-glucuronídeo e 0,6% (v/v) de Triton X-100 (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405). A aparência de regiões de cor azul foi usa- da como o indicador de expressão de gene de GUS, que indicava que a in- serção de sequência-alvo era transcricionalmente ativa e assim acessível no ambiente genômico local.
Os eventos transgênicos de expressão de GUS foram analisa- dos por PCR usando-se o par inciador P15/PI6 que foi levado para a amplia- ção de um fragmento de DNA de 10 kb que se estende do 3' UTR do casse- te de expressão de HTP na extremidade 5' de sequência-alvo em relação a 3' UTR do cassete de gene de PAT parcial na extremidade 3' da sequência- alvo. Uma vez que todos os eventos foram obtidos sob seleção de higromi- cina, foi admitido que o cassete de expressão de HPT estava intacto em to- dos os eventos-alvo. Portanto, apenas o 3' UTR do cassete de expressão de HPT estava coberto na análise de PCR de comprimento total. Um sub- conjunto de eventos foram também analisadas por PCR usando-se os pares de iniciador P15/PI7 e P18/PI9 para determinar a integridade das extremida- des 5' 3' da sequência-alvo, respectivamente. Todos os eventos-alvo confir- mados com análise de PCR foram ulteriormente analisados por análise de Southern blot para determinar o número de cópias da sequência-alvo inte- grada.
Análise de Southern blot foi realizada para todos os eventos-
alvo que passaram a triagem de expressão de GUS e PCR de comprimento total. Dez μg de DNA genômico foi digerido com Nsil, que era um único cor- tador dentro da sequência-alvo. O DNA genômico digerido foi separado em um gel de 0,8% de agarose e foi transferido sobre uma membrana de nylon. Depois da reticulação, o DNA transferido na membrana foi hibridizado com uma sonda de gene de HPT para determinar o número de cópias da extre- midade 5' da sequência-alvo. O mesmo blot foi então separado e foi re- hibridizado com uma sonda de gene de PAT para determinar o número de cópias da extremidade 3' da sequência-alvo. Múltiplos eventos que mostraram expressão de GUS e conti-
nham uma única cópia de sequência-alvo de comprimento total foram sele- cionados para outra caracterização, que incluíam análise de Southern blot mais total, confirmação total de sequência-alvo e flanqueamento de análise de seqüência genômica. Um evento, chamado de BY2-380, foi selecionado com base na caracterização molecular. Cultura de suspensão foi reestabele- cida a partir desse evento para a retransformação subsequente com vetores compreendendo DNA de doador e genes de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de não C2H2.
Para assegurar a cultura de suspensão estabelecida a partir do evento-alvo BY2-380 continha a sequência-alvo intacta como esperada, a principal sequência-alvo oriunda do 3'UTR do cassete de expressão de HPT na extremidade 5' da sequência-alvo em relação a 3' UTR do cassete de gene de PAT parcial na extremidade 3' da sequência-alvo foi ampliada por PCR usando-se o par inciador P15/P 16 e clonado em vetor pCR2.1 TOPO (Invitrogen, Carlsbad1 Califórnia). Os produtos de PCR inseridos no vetor de TOPO vetor foram sequenciados por Lark technology, Inc. (Houston, Texas). A seqüência resulta indicava que o BY2-380 tinha sequências-alvo comple- tas como esperadas.
A linha de célula de BY2-380 foi ulteriormente analisada para se obter as seqüências genômicas de flanqueamento usando-se o kit Universal Genome Walker (Clontech, Mountain View, Califórnia). Resumidamente, 2,5 μg de DNA genômico foram digeridos com três enzimas de restrição de ex- tremidade abrupta, EcoRV, Dral e Stul em reações separadas. O DNA dige- rido foi purificado através de extração de fenol/clorofórmio e foi ligado com BD Genome walker Adaptor. Ampliação de PCR mais aninhada foi realizada com a ligação como modelo e iniciador P20 (rota a montante da extremidade 5' de inserção de sequência-alvo) e P21 (rota a jusante da extremidade 3' de inserção de sequência-alvo) para a reação de PCR primária, e iniciador P22 (rota a montante da extremidade 5' de inserção de sequência-alvo) e P23 (rota a jusante da extremidade 3' de inserção de sequência-alvo) para a rea- ção de PCR mais aninhada secundária. Os fragmentos ampliados a partir da reações de PCR secundárias foram clonados no vetor de pCR2.1 TOPO ou pCR Blunt Il TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e foram sequenciados usando-se um kit de sequênciação de Dye Terminator Cycle (Beckman Coul- ter, Fullerton, CA). As seqüências genômicas de flanqueamento foram obti- das a partir da linha-alvo BY2-380 através desse processo. Iniciadores foram então projetados com base no flanqueamento de seqüências genômicas e foram usados para ampliar a sequência-alvo inteira.
Os fragmentos ampliados obtidos a patir dessa linha-alvo era de tamanho esperado. Ambas as extremidades dos fragmentos ampliados fo- ram confirmadas por sequênciação.
Exemplo 8: Projeto e geração de vetor de DNA de doador O construto de DNA de doador incluia seqüência homóloga-1 (RB7 MAR de N. tabacum) (Thompson e outros, 1997, W09727207), um promotor de ubi 10 de A. thaliana de comprimento total (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493), 299 pb de seqüência de codificação de gene de PAT parcial 5' (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37) e se- qüência homóloga-2 (íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074). Tanto seqüência homóloga- 1 quanto sequência-2 no vetor de doador eram idênticas às seqüência homóloga-1 e sequência-2 cor- respem quente no vetor-alvo (pDAB1585).
Para construir o vetor de doador, a seqüência de codificação de PAT parcial 5' de 299 pb foi fundida com o íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana de comprimento total (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) através de síntese de DNA por Picoscript Ltd., LLP, (Houston, Texas). Sítios de Nco I e Xho I foram adicionados às extremidades 5' e 3' do fragmento, respectiva- mente. Esse fragmento de DNA sintetizado foi entáo digerido com Nco l/Xho I e foi inserido para dentro de pDAB1575 nos mesmos sítios para substituir a seqüência de codificação de gene de PAT de comprimento total e seu 3' UTR. O construto resultante foi chamado pDAB1576 (FIGURA 29).
pDAB1576 foi entáo digerido com Agel e o fragmento inteiro contendo o cassete de expressão de PAT parcial 5' flanqueado por seqüên- cia homóloga-1 e seqüência homóloga-2 foi inserido para dentro de pDAB2407, o vetor de base binária, no mesmo sítio. O construto resultante foi chamado pDABI600 (FIGURA 30) e era a versão binária do vetor de doa- dor para retransformação de célula de planta.
Exemplo 9: Projeto e geração de vetores de expressão de nu- clease de dedo de zinco
O gene de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco foi dirigi- do por um promotor de CsVMV e 5' UTR (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31 : 1129-1139). Também incluído no cassete era uma região não traduzida (UTR) 3' de quadro-24 de leitura aberto (orf-24) de A. tumifaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493).
Para produzir esses vetores, os controles de C2H2 e suas vari- antes de C3H de seqüências de codificação de IL-I-Fok I e Scd27-Fok I des- critos nos exemplos 1 a 4 acima foram ampliados por PCR a partir dos seus projetos originais com sitos de Bbs I ou Nco I e Sac I adicionados às extre- midades 5' e 3' dos fragmentos de PCR, respectivamente e foram clonados no pDAB3731 (FIGURA 31) foram digeridos com Nco l-Sacl. Os plasmídios resultantes foram chamados de pDAB4322 (FIGURA 32), pDAB4331 (Fl- GURA 33), pDAB4332 (FIGURA 34), pDAB4333 (FIGURA 35) pDAB4334 (FIGURA 36), pDAB4336 (FIGURA 37), e pDAB4339 (FIGURA 38). Todos esses vetores continham os sítios de flanqueamento de attLI e attL2 do cas- sete de expressão de ZFN e eram compatíveis com sistema de clonagem sGateway® (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). Dois conjuntos de vetores de versão binária foram construídos
para a proteína de fusão de IL-1-Fok I. Continha-se o gene marcador sele- cionável por PAT e a ordem não continha o gene de marcador selecionável por PAT. Para a proteína de fusão de SCd27-Fok I, apenas uma versão bi- nária de vetor sem o gene de marcador selecionável por PAT foi construído. Para produzir os vetores binários com gene de marcador selecionável por PAT, o pacote de expressão de proteína de gene de IL-1-Fok I em PDAB4322, pDAB4331, pDAB4332, pDAB4333, pDAB4334, e pDAB4336 foram clonados em pDAB4321 (FIGURA 39) através de reação de recombi- nação de LR usando-se a mistura de enzima LR Clonase® (Invitrogen, Car- Isbad, Califórnia). O plasmídio resultante foram chamados de pDAB4323 (FIGURA 40), pDAB4341 (FIGURA 41), pDAB4342 (FIGURA 42), pDAB4343 (FIGURA 43), pDAB4344 (FIGURA 44), pDAB4346 (FIGURA 45). Para pro- duzir os vetores binários sem o gene de marcador selecionável por PAT, o cassete de expressão de C2H2 IL-1-Fok I, C3H IL-1-Fok I e Scd27-Fok I no pDAB4331, pDAB4336 e pDAB4339, respectivamente, foram clonados em pDAB4330 (FIGURA 46) através de reação de recombinação de LR usando- se a mistura de enzima LR Clonase® (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). O plasmídio resultante foram chamados pDAB4351 (FIGURA 47), pDAB4356 (FIGURA 48) e pDAB4359 (FIGURA 49), respectivamente.
Para produzir o controle de C2H2 de SCD27-Fok I, o fragmento de Hindlll/Sacl compreendendo promotor de CsVMV e 5'UTR que dirige PAT em pDAB7002 (FIGURA 50) foi substituído com um fragmento compreen- dendo promotor de CsVMV e 5' UTR e 5" UTR de N. tabacum que dirige GUS, que foi extirpado a partir de pDAB7025 (FIGURA 51) com Hindlll/Sacl. O plasmídio resultante foi chamado pDAB1591 (FIGURA 52). As seqüências de codificação de Scd27-L0-Fok I foram apliados por PCR a partir de seus vetores originais pCDNA3.1-SCD27a-L0-Fok I (FIGURA 53) usando-se par de iniciador P13/PI4. Sítios de Bbs I e Sac I foram adicionados às extremida- des 5' e 3' dos fragmentos de PCR, respectivamente. O gene de PAT em pDAB1591 foi substituído com o fragmento de PCR de gene de proteína de fusão de dedo de zinco através de clonagem de Sacl/Nco I. O plasmídio re- sultante foi chamado pDAB1594 (FIGURA 54). A versão binária desse vetor foi construído por extirpação do cassete de expressão de gene de proteína de fusão de dedo de zinco a partir de pDAB1594 como fragmentos de Pmel/Xho I, enchimento nas extremidades e clonagem em pDAB2407 no sítio de Pmel. O plasmídio resultante foi chamado ρDAB 1598 (FIGURA 55). Os detalhes de todos os vetores binários usados para a transformação de planta são sumarizados na tabela 6.
Vetor ZFN Tipo de ZFP Posição de dedo de de- do de zinco Seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: pDAB4323 IL 1-FokI C2H2 F4 C...C...HTKI H 94 pDAB4341 IL 1-Fokl. C2H2 F4 C...C...HTKI H 95 pDAB4342 IL 1-Fokl* C3H F4 C...C...HTKI C 96 pDAB4343 IL 1-Fokl* C3H F4 C...C...HTK RCGGG 97 pDAB4344 IL 1-Fokl* C3H F4 C...C...HAQ RÇG 98 pDAB4346 IL 1-Fokl* C3H F2 C...C...HIRT GC 99 pDAB4351 IL 1-Fokl* C2H2 F4 C...C...HTKI H 100 pDAB4356 IL 1-Fokl* C3H F2 C...C...HIRT GC 101 pDAB1598 Scd27- Fokl C2H2 F4 C...C...HTKI H 102 pDAB4359 Scd27- Fokl* C3H F4 C...C...HAQ RÇGG 103
* domínio de Fok I era códon de planta parcial
exemplo 10: Projeto e geração de vetor de controle positivo
Para estimar a freqüência de recombinação ilegítima e serve como um controle positivo, um vetor contendo o cassete de expressão de gene de PAT foi usado. A fim de ser comparável com os recombinantes fi- nais, o íntron-1 de 4-CoAS de A thaliana (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) foi inserido nos 299/300 pb da seqüência de codificação de PAT (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37). Para produzir esse construto, os 2559 pb de fragmento de Swal/Clal oriundos de pDAB1576 estava ligado com o fragmento de cadeia principal de pDAB1577 (FIGURA 56) que foi di- gerido com as mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante continham o cassete de expressão de gene de PAT com os 1743 pb de íntron-1 de 4- CoAS de A. thaliana (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) inserção no meio de seqüência de codifi- cação de PAT (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37). Esse vetor foi chamado pDAB1578 (FIGURA 57).
Para produzir a versão binária de pDAB 1578, o cassete de ex- pressão de gene de PAT com o íntron-1 de A. thaliana (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) foi extirpado a partir de pDAB1578 com Pmel/Xho I. Depois da extremidade 3' do fragmento foi tratado com extremidade abrupta, foi inserido para dentro de pDAB2407, o vetor de base binária, no sítio de Pmel. O vetor resultante foi chamado pDAB1601 (FIGURA 58) que compre- endia o gene de PAT (Wohlleben e outros, 1988, Gene 70:25-37) contendo íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) seqüência dirigida pelo promotor de ubi 10 de A. thaliana (Callis, e outros, 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493) e terminado pelo 3' UTR de orf25/26 de A. tumefaciens (Gelvin e outros, 1987, EP222493).
Exemplo 11: Demonstração de Recombinação homóloga intra- cromossomal por retransformação de Células de cultura-alvo com Genes de nucleoase de dedo de zinco de C3H. Para validar a funcionalidade de nucle- ases de dedo de zinco de C3H na simulação de recombinação homóloga intracromossomal, dois dos fragmentos de GFP não funcionais com seqüên- cias de sobreposição de 540 pb foram incluídas no vetor-alvo como mostra- do na FIGURA 59. No meio esses dois fragmentos era um cassete de ex- pressão de gene de GUS. A seqüência de ligação de proteína de fusão de IL-1-Fok I foi fundida com a seqüência de codificação de GUS em seu N- terminal. Sem querer estar ligado por uma teoria, levanta-se a hipótese de que na presença de proteína de fusão de IL-1-Fok I, as seqüências de liga- ção de IL-I ZFN seriam reconhecidas e um rompimento de DNA de fita dupla seria induzido, que estimularia o processo de reparo de DNA endógeno. Sem a presença de DNA de doador, os dois fragmentos de GFP parcialmen- te homólogos sofreriam um processo intracromossomal homólogo de re- combinação e um gene de GFP funcional seria reconstituído.
A linha de célula transgênica de BY2-380 que contém uma única cópia integrada de comprimento total, da sequência-alvo foi usada para rei- niciar culturas de suspensão por colocação ~ 250-500 mg de tecido de calo em 40-50 mL de meio basal à base de LS contendo 100 mg/L de higromicina e sub-cultura a cada 7 dias como descrito acima. Antes de retransformação, as culturas de suspensão foram transferidos para meio basal sem higromici- na para duas passagem, pelo menos.
Transformação mediada por Agrobacterium das células de cultu- ra-alvo foi realizada como descrito acima. Para cada experiência, 8 placas de cocultivação foram geradas como se segue: uma placa compreendias células cocultivadas com 300 μΐ de cepa de base Agrobacterium LBA4404; uma placa compreendias células cocultivadas com 300 μί de uma cepa de Agrobacterium que abriga pDAB1590 (constructo GFP funcional); cada seis placas compreendidas células cocultivadas com 300 μΙ_ de uma cepa Agro- bacterium que abriga pDAB4323, pDAB4341, pDAB4342, pDAB4343, pDAB4344, e pDAB4346, respectivamente. Após o cocultivo usando-se os métodos descritos acima, as células foram laminadas em oito placas con- tendo o meio basal à base de LS suplementado com 500 mg/L de carbenici- Iina sem reagente de seleção. Expressão evidente do gene de GFP funcio- nal constituído resultou em fluorescência visível em torno de 5-8 dias depois da transformação). O número de locais fluorescentes verdes por campo con- tado por visão de 5 campos microscópios "aleatórios" por placa, 8 placas por construtos em cada experiência, e calculado a média a partir de 6 experiên- cias independentes.
Como sumarizado na tabela 7, uma média de 9,50 e 7,57 locais fluorescentes verdes por campo foram observados a partir de duas nuclea- ses de dedo de zinco de C3H, pDAB4346 e pDAB4343, respectivamente. Esses dois projetos de C3H de IL-1-Fok I executaram melhor do que seus controles de C2H2, pDAB4341 (6,37 locais por campo) e pDAB4323 (5,53 locais por campo). Entretanto, em comparação com os controles de C2H2, a função de outras duas variantes de C3H de proteína de fusão de IL-1-Fok I, pDAB4344 (4,39 locais por campo) e pDAB4342 (0,25 locais por campo) foi significativamente diminuída, em particular o pDAB4342, em que a conver- são de C3H foi feita por substituição da segunda cisteína com histidina no quarto dedo. Nenhuma fluorescência apreciável além de leve experiência foi observada nos controles negativos transformados com a cepa de base A- grobacterium, LBA4404. Tabela 7
Constituição de GPF funcional através de recombinação homóloga intracro- mossomal estimulada por proteína de fusão de dedo de zinco de IL-1-Fok I
Vetor Tipo de ZFP Experssão de GFP Teste de GFP** pDAB4346 C3H 9,50 A pDAB4343 C3H 7,57 B pDAB4341 C2H2 6,37 C pDAB4323* C2H2 5,53 D pDAB4344 C3H 4,39 E pDAB4342 C3H 0,25 F
* contém domínio de Fok I parcial de códon de não-planta
** meios não-ligados pela mesma letra são Significativamente diferentes no
nível 0,05
Exemplo 12: Demonstração de recombinação homóloga inter- cromossomal por re-transformação de células de cultura-alvo com Genes de nucleoase de dedo de zinco de C3H e Seqüências de DNA de doador
Para validar a funcionalidade de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de C3H na simulação de recombinação homóloga inter- cromossomal sistema de tabaco no sistema de tabaco exemplar, duas estra- tégias foram desenvolvidas e foram testadas.
Na estratégia 1, o sítio de ligação para a proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco (IL-1-LO-Fok I), foi incluída no meio do construto- al- vo (FIGURA 61). Nessa estratégia, o sítio de ligação foi flaqueado por ~3 kb de seqüências não-homólogas em ambos os lados seguido por sequência-1 homóloga (RB7 MAR de N. tabacum) e sequência-2 homóloga (íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana) a montante e a jusante, respectivamente. Como an- teriormente demonstrado (por exemplo, a patente US Publication No. 20050064474) na presença de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco C2H2 IL-I, as seqüências de ligação de IL-1-LO-Fok I foram reconhecidas e um rompimento de DNA de fita dupla foi induzido nesse sítio específico, que estimulou o processo de reparo de DNA endógeno. Na presença de DNA de doador, que continha seqüência homólogas idênticas àquela na sequência- alvo, o gene de PAT parcial 5' juntamente com seu promotor, substituiu o fragmento de DNA de ~6 kb inteiro entre as seqüência homólogas no alvo através de recombinação homóloga. Através desse processo, os duas se- quências de gene de PAT parciais, com ρ íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana interposto entre, um gene de PAT funcional reconstituído, que resulta na ex- pressão de PAT e um fenótipo de resistência a herbicida.
Na estratégia 2, dois sítios de ligação de Folk de dedo de zinco (Scd27-L0-Fok I) foram incluídos no vetor-alvo: um diretamente a jusante do RB7 MAR de N. tabacum e o outro diretamente a montante do íntron-1 de 4- CoAs de A. tahaliana (FIGURA 62). No meio os dois sítios de ligação de pro- teína de fusão de Fok I de dedo de zinco eram de ~6 kb de seqüência, que incluíam o fragmento de GFP 5', um cassete de expressão de GUS e o fragmento GFP 3'. Como anteriormente demonstrado (por exemplo, a publi- cação de patente US No. 20050064474), na presença de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de Scd27, as duas seqüências de ligação reco- nhecidas e rompimentos de DNA de fita dupla foram induzidos em ambas as localizações, que removeram o fragmento de DNA de ~6 kb no meio dessas duas seqüências de ligação, e estimularam o processo de reparo de DNA endógeno. Similar à estratégia 1, na presença de DNA de doador, que conti- nha seqüências homólogas idênticas àquela na sequência-alvo, o gene de PAT parcial 5' juntamente com seu promotor, foram inseridos para dentro da sequência-alvo através de recombinação homóloga no sítio em que os rom- pimentos de DNA de fita dupla foram induzidos. Através desse processo, as duas seqüências de gene de PAT parcial, com o íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana interposto entre, um gene de PAT funcional reconstituído, que resul- ta na expressão de PAT e um fenótipo de resistência a herbicida.
Agrobacterium-med\a\ed transformação da cultura de célula alvo de BY2-380 foi realizada como descrito acima. Para cada experiência, 12 placas de cocultivação foram geradas como se segue: uma placa compre- endias células cocultivadas com 50 μΙ_ de uma cepa de Agrobcterium que abriga pDAB1600 (DNA de doador) e 250 μΙ_ de cepa de base de Agrobcte- rium, LBA4404; uma placa compreendias células cocultivadas com 50 μΙ_ de uma cepa de Agrobcterium que abriga pDAB1601 (marcador selecionável de PAT) e 250 μΙ_ de cepa de base de Agrobcterium, LBA4404; dois placas compreendiam células cocultivadas com 50 μΙ_ de uma cepa de Agrobaeteri- um que abriga pDAB1600 (DNA de doador) e 250 μΙ_ de uma cepa de Agro- bacterium que abriga pDAB4351 (C2H2 IL-I ZFP-Fok I); três placas compre- endiam células cocultivadas com 50 μΙ_ de uma cepa de Agrobacterium que abriga pDAB 1600 (DNA de doador) e 250 μΙ_ de uma cepa de Agrobacteri- um que abriga pDAB4356 (C3H IL-I ZFP-Fok I); dois placas compreendiam células cocultivadas com 50 μί de uma cepa de Agrobaeterium que abriga pDAB1600 (DNA de doador) e 250 μί de uma cepa de Agrobaeterium que abriga pDAB1598 (C2H2 Scd 27a ZFP-Fok I); três placas compreendiam células cocultivadas com 50 μί de uma cepa de Agrobaeterium que abriga pDAB 1600 (DNA de doador) e 250 μΐ de uma cepa de Agrobaeterium que abriga pDAB4359 (C3H Scd27a ZFP-Fok I). Após o cocultivo usando-se os métodos descritos acima, as células foram laminadas no meio basal à base de LS contendo 500 mg/L de carbenicilina e 15 mg/L de Bialaphos(R). Isola- dos resistentes Bialaphos® individuais apareceram de 2-4 semanas depois da laminação e foram transferidos para placas individuais de 60x20 mm (um isolado por placa) em que elas são mantidas como calo em uma escala de subcultura de 14 dias até que necessitasse de análise.
Múltiplos isolados resistentes a Bialaphos(R) foram obtidos a par- tir de tanto nuclease de dedo de zinco nuclease de C3H IL-1 (pDAB4356) quanto nuclease de dedo de zinco C3H Scd27 (pDAB4359). Esses isolados foram analisados por PCR usando-se par de iniciador P24/25, que ampliou um fragmento de DNA que varia o gene de PAT reconstituído. Iniciador P24 era homólogo à extremidade 5' da seqüência de codificação de PAT no DNA de doador e iniciador P25 era homólogo à extremidade 3' da seqüência de codificação de PAT no DNA alvo. Um fragmento de PCR de 2,3 kb resultaria se as duas seqüências de codificação de PAT parciais fossem unidas atra- vés de recombinação homóloga. Como mostrado na FIGURA 63, um produ- to de PCR de 2,3 kb foi obtido a patir de múltiplos isolados analisados. Es- ses isolados foram obtidos a partir de tanto a co-transformação de gene de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de C3H IL-1/DNA de doador e gene de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de C3H Scd27/DNA de doador. Os produtos de PCR de 2,3 kb oriundos de múltiplos isolados inde- pendentes representativos daqueles derivados de tanto tranformações de gene de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco de C3H IL-1 quanto C3H Scd27 foram purificadas de agarose géis e foram clonadas no vetor de pCR2.1 TOPO vetor (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). O produto de PCR de 2,3 kb inserido no vetor de TOPO foi então sequenciado usando-se o kit de sequênciação de Terminator Cycle (Beckman Coulter). Os resultados de se- quenciação confirmaram que todos os produtos de PCR clonados no vetor de TOPO continham as seqüências recombinadas como previstas, incluindo as seqüências de gene de PAT parciais 5' e 3' com a intervenção de íntron-1 de 4-CoAS de A. thaliana. Esses resultados confirmaram a recombinação intracromossomal prevista para tanto estratégias testadas quanto direciona- mento de gene exemplificados através da expressão de genes de proteína de fusão de Fok I de dedo de zinco C3H.
Exemplo 13: Identificação de seqüências de genes-alvo em cul- tura de célula de milho
A. Identificação de seqüência
Nesse exemplo, seqüências de DNA para um gene de milho en- dógeno de função conhecida foram selecionadas como alvos para a edição de genoma usando-se nucleases de dedo de zinco engenheiradas. A se- qüência e estrutura genômica desse gene, chamado de IPP2-K, que é deri- vado da proprietária linha congênita de milho 5XH751, foi descrita na W02006/029296; cuja descrição é incorporada por referência.
Em particular, a seqüência genômica de IPP2-K foi usada para indagar as bases de dados de milho TIGR (disponível na internet na http://www.tigr.org/tdb/tgi/milho/) usando-se algoritmos BLAST. Vários frag- mentos genômicos adicionais foram identificados com segmentos de homo- Iogia de sobreposição a IPP2-K, incluindo, mas não limitados a, acessos AZM515213 e TC311535. Com base na seqüência desses acessos bem como a seqüência de IPP2-K, múltiplos oligonucleotídeos curtos foram proje- tados para o uso como iniciadores de PCR usando-se o programa Iniciador (Rozen, S. e Skaletsky1 HJ. (2000) lniciador3 no WWW ou usuários gerais e para os programadores biologísticos. In: Krawetz S1 Misener S (eds.) Bioin- formatics Methods e Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ1 pp 365-386; também disponível na internet). Esses inici- adores incluem, mas não são limitados a, os seguintes oligonucleotídeos de orientação forward:
1.5 -ATGGAGATGGATGGGGTTCTGCAAGCCGC-S ' (SEQ E) NO: 104) 2. 5 '-CTTGGCAAGGTACTGCGGCTCAAGAAGATTC-S' (SEQ ID NO: 161)
3. 5 '-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGAC-S ' (SEQ ID NO: 162)
4. Si-Atgaagaaagacagggaatgaaggaccgccac-S' (seq id no:163)
5. 5 '-CATGGAGGGCGACGAGCCGGTGTAGCTG-S ' (SEQ ID NO: 164)
6. 5'-ATCGACATGATTGGCACCCAGGTGTTG-S' (SEQ ID NO: 165)
Além disso, os iniciadores incluem, mas não são limitados a, os
seguintes oligonucleotídeos de orientação reversa:
7. 5 '-TTTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAAC-S ' (SEQ ID NO:
166)
8. 5'-ACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-S' (SEQ ID NO: 167) 9. 5'-TTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-S' (SEQ ID NO:168)
10.5'-TGCTAAGAACATTCTTTTCGACAAGCTCC-S' (SEQ ID NO:169)
11. 5'-gaacattcttttcgacaagctccagaaaatcc-s' (seq id n0:170)
Todos os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados por
e adquiridos da Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). B. Cultura de célula de milho de Hi Il
Para se obter embriões imaturos para iniciação de cultura de ca- lo, F1 cruza entre parentes A e B de Hi-Il desenvolvidos em estufa (Arms- trong, C, Green, C. e Phillips, R. (1991) Milho Genet. Coop. News Lett. 65: 92-93) foram realizados. Embriões de cerca de 1,0-1,2 mm de tamanho (~ 9- dias depois da polinação), foram colhidos de orelhas saudáveis e superfí- ces foram esterilizadas por esfregamento com sabão de Liqui-Nox(R)1 foram imersos em 70% de etanol por 2-3 minutos, então foram imersos em 20% de alvenjante comercial (0,1% hipoclorito de sódio) por 30 minutos.
Orelhas foram enxaguadas em água destilada, estéril, água des- tilada, e os embriões zigóticos imaturos foram asseticamente extirpados e foram cultivados no meio de 15Ag10 (meio de N6 (Chu CC, Wang CC, Sun CS., Hsu C, Yin K.C, Chu CY., e Bi F. Y. (1975) Sei. Sinica 18:659-668), 1,0 mg/L de 2,4-D, 20 g/L de sacarose, 100 mg/L de hidrolisado de caseína (di- gesto enzimático), L-prolina a 25 mM, 10 mg/L de AgN03, 2,5 g/L de Gelrite, pH 5,8) por 2-3 semanas com o escutelo voltado para o lado contrário do meio. Tecidos que mostram a morfologia esperada (Welter, ME, Clayton, DS, Miller, MA, Petolino, JF. (1995) Plant Cell Rep: 14:725-729) foram seleti- vamente transferidos nos intervalos bissemanais sobre meio de 15Ag10 fresco por cerca de 6 semanas, então foram transferidos para 4 meios (meio de N6, 1,0 mg/L de 2,4-D, 20 g/L de sacarose, 100 mg/L de hidrolisado de caseína (digesto enzimático), L-prolina a 6 mM, 2,5 g/L de Gelrite, pH 5,8) em intervalos bisemanalmente por cerca de 2 meses.
Para iniciar culturas de suspensão embriogênicas, cerca de 3 ml de volume de célula envolvida (PCV) de tecido de calo que se originam de um único embrião foram adicionados a cerca de 30 ml de meio líquido de H9CP+ (mistura de sal basal de MS (Murashige T., & Skoog F. (1962) Phy- siol. Plant. 15:473-497), vitaminas de MS modificadas contendo 10 vezes menos ácido nicotínico e 5 vezes mais alta de tiamina-HCI, 2,0 mg/L de 2,4- D, 2,0 mg/L de ácido alfa-naftaleneacético (NAA), 30 g/L de sacarose, 200 mg/L de hidrolisado de caseína (digesto ácido), 100 mg/L de mioinositol, L- prolina a 6 mM, 5% v/v de água de coco (adeionada exatamente antes da subeultura), pH 6,0). Culturas de suspensão foram mantidas sob condições escuras em frascos de Erlenmeyer de 125 ml em um conjunto de agitador de temperatura controlada a 125 rpm a 28°C. Durante o estabelecimento de linha de célula (2-3 meses), suspensões foram subeultivadas a cada 3,5 dias por adição de 3 ml de PCV de células e 7 ml de meio condicionado a 20 ml de meio líquido de H9CP+ fresco usando-se uma pipeta de amplo furo. No alcance da maturidade, como evidenciado por dobramento de crescimento, suspensões foram submetidas e um aumento de escala e foram mantidas em frascos de 500 ml pelo que 12 ml de PCV de células e 28 ml de meio condicionado foram transferidos para dentro de 80 ml de meio de H9CP+.
No estabelecimento completa da cultura de suspensão, alíquotas foram crio- preservadas para o uso futuro. Vide, WO 2005/107437.
C. Isolamento e ampliação de DNA
Culturas de célula de Hill de milho como descrito acima foram desenvolvidas em frascos de 250 ml em meio de GN6 padrão (meio de N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 2,5 g/L de Gelrite, pH 5,8) e DNA genômico foi extraído usando-se o kit de extração Qiagen (Valencia, CA) Plant DNeasy como pelas recomendações do fabricante. Reações de ampli- ação de PCR usando-se os iniciadores descritos acima em todas as combi- nações possíveis foram realizadas sob as seguintes condições: 25 ul de vo- lume de reação contendo 20 ng de modelo de gDNA, 20 pmol de cada inici- ador, 1% de DMSO e 10 unidades de polimerase Accuprime® Pf (Invitrogen, Carlsbad, CA) no tampão do fabricante de enzima. Produtos de ampliação que variam de tamanho de 500 pb a 2 kb resultaram de ciclos de ampliação que consistem de 95°C-1' (95°C-30", 57-62°C-30", 72°C-1') X 30, 72°C-5', 4°C/suporte. Os fragmentos ampliados foram diretamente clonados em vetor pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando-se o kit de clonagem TA da Invi- trogen (Carlsbad, CA) como pelas recomendações do fabricante.
D. Análise de seqüência
Análise anterior do gene de IPP2-K em 5XH751 congênito de milho e cultura de célula Hill tinham indicado a presença de 2-3 genes distin- tos compreendendo uma família de gene pequena (Sun e outros, in press, Plant Physiology; W02006029296). Portanto, fragmentos clonados isolados foram sequenciados com o kit de sequênciação de ciclo CEQ Dye Termina- tor de Beckman Coulter (Fullerton, CA) como pelas recomendações do fabri- cante. Análise de seqüência de múltiplos clonados revelaram que 2 fragmen- tos de gene distintos, derivados de 2 locais distintos e anteriormente caracte- rizados do genoma de milho, tinham sido isolados de células de Hill. Comparação das 2 seqüências isoladas de células cultivadas de Hill indicava que, nas regiões de codificação previstas, pequenas diferenças tais como polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) existem entre os 2 paralógos, enquanto que as regiões de não-codificação e intrônicas variam significativamente no nível de nucleotídeo. Essas diferenças entre os 2 para- lógos são observados uma vez que eles iluminam regiões de seqüência que podem ser discriminadas por uma proteína de ligação de DNA depedente de seqüência tal como um domínio de dedo de zinco. Aquele versado na técni- ca pode projetar domínios de ligação de DNA de dedo de zinco que se ligam a uma seqüência de gene e não uma outra, seqüência de gene altamente similar. Seqüência de gene parcial de 1,2 kb que correspem que ao parálogo de interesse (FIGURA 66) foi selecionado como modelo para o projeto de proteína de nuclease de dedo de zinco e subseqüentemente submetido a análise de domínio de ligação de DNA de dedo de zinco descrito acima. Exemplo 14: Projeto de domínios de ligação de DNA de dedo de zinco de IPP2-K
Usando-se sítios alvos identificados para IPP2-K, hélices de re- conhecimento foram selecionados para dedos de zinco de IPP2-K. Os proje- tos de dedo de zinco são mostrados abaixo na tabela 8:
Tabela 8: Projetos de dedo de zinco de IPP2- K nome de ZFN F1 F2 F3 F4 F5 F6 IPP2-K- 1072a1 DRSALSR (SEQ ID N0:105) RNDDRKK (SEQ ID N0:106) RSDNLST (SEQ ID N0:107) HSHARIK (SEQ ID N0:108) RSDVLSE (SEQ ID N0:109) QSGNLAR (SEQ ID N0:110) IPP2-K- 1072b1 DRSALSR (SEQ ID N0:105) RNDDRKK (SEQ ID N0:106) RSDNLAR (SEQ ID N0:111) TSGSLTR (SEQ ID N0:112) RSDVLSE (SEQ ID N0:109) QSGNLAR (SEQ ID N0:110) IPP2-K- 1072c1 DRSALSR (SEQ ID N0:105) RNDDRKK (SEQ ID N0:106) TSGNLTR (SEQ ID NO:113) TSGSLTR (SEQ ID N0:112) RSDVLSE (SEQ ID N0:109) QSGNLAR (SEQ ID N0:110) IPP2-K- r1065a1 RSDHLSE (SEQ ID N0:114) QSATRKK (SEQ ID N0:115) ERGTLAR (SEQ ID N0:116) RSDALTQ (SEQ ID NO:117) NONE NONE IPP2-K- r1149a2 RSDSLSA (SEQ ID N0:118) RSAALAR (SEQ ID N0:119) RSDNLSE (SEQ ID N0:120) ASKTRTN (SEQ ID N0:121) DRSHLAR (SEQ ID NO: 122) NONE IPP2-K- 1156a2 RSDHLST (SEQ ID NO:123) QSGSLTR (SEQ ID NO:124) RSDHLSE (SEQ ID NO:114) QNHHRIN (SEQ ID NO:125) TGSNLTR (SEQ ID NO:126 ) DRSALAR (SEQ ID NO:127) Sítios-alvo dos projetos de dedo de zinco são mostrados abaixo na tabela 9: Tabela 9: Sítios-alvo de dedos de zinco de IPP2-K
Nome de ZFN Sítio Alvo (5' a 3') IPP2-K-1072a1 GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO:128) IPP2-K-1072b1 GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO: 129) IPP2-K-1072c1 GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO: 129) IPP2-K-r1065a1 ATGGCCCCACAG (SEQ ID N0:130) IPP2-K-M 149a2 GGCACCCAGGTGTTG (SEQ ID NO:131) IPP2-K-1156a2 GTCGATGGTGGGGTATGG (SEQ ID NO:132)
Os projetos de DPP2-K foram incorporados nos vetores de ex- pressão de dedo de zinco que codificam uma proteína tendo uma estrutura de CCHÇ. Vide, Tabelas 1 até 4 acima. As seqüências de codificação de dedo de zinco não-canônicas foram então fundidas ao domínio de nuclease da enzima de restrição de tipo IIS Fok I (aminoácidos 384-579 da seqüência de Wah e outros (1998) Proc. Natl. Acad. ScL USA 95:10564-10569 através de um Iigante de KC de quatro aminoácidos) para formar IPP2-K ZFNs.
Exemplo 15: Correção de gene usando-se nucleases de dedo de zinco de IPP2-K
A capacidade de IPP2-K ZFNs como descrita aqui para facilitar a recombinação homóloga foi testada no sistema de GFP descrita em Urnov (2005) Natureza 435(7042):646-51 e a publicação de patente US No.
20050064474 (por exemplo, exemplos 6-11). Resumidamente, 50 ng de ca- da ZFN e 500 ng do doador de GFP menos o promotor (Urnov (2005) Natu- reza) foram transfectados para dentro de 500.000 células repórter, usando- se 2 uL de Lipofectamina 2000 por amostra, como pelo protocolo de Invitro- gen Lipofectamine 2000.
Vinblastina foi adicionada 24 horas pós-transfecção a uma con-
centração final de 0,2 uM, e foi removida 72 horas pós-transfecção.
As células foram analisadas quanto a expressão de GFP 5 dias pós-transfecção por medição de 40.000 células por transfecção no analisa- dor Guava benchtop FACS. Resultados são mostrados na Figura 69. Exemplo 16: C3H1 ZFNs expressão em células de Hill de milho A. Projeto de vetor
Vetores de plasmídio para a expressão de proteínas de ZFN em células de milho foram construídos. A fim de otimizar a expressão e estequi- ometria relativa das 2 proteínas distintas exigidas para formar um heterodí- mero de nuclease de dedo de zinco funcional, uma estratégia de expressão foi adotada que resulta na inserção dos quadros de leitura aberto de ambos os monômeros de ZFNs em um único vetor, dirigidos por um único promotor. Esta estratégia explora a funcionalidade de uma seqüência de 2A (Mattion, N.M., Harnish1 E.C., Cfileiraley, J. C. & Reilly, P.A. (1996)J. Virol. 70, 8124- 8127) derivada do vírus Thesoa assigna, uma sinal de localização nuclear de milho (NLS) do gene de opaque-2 (op-2) (Maddaloni, M., Di Fonzo, N., Har- tings, H., Lazzaroni, N., Salaminil, F., Thompson, R., & Motto M. (1989) Áci- do nucleicos Research Vol. 17(18):7532), e um promotor derivado do gene de ubiquitin-1 de milho (Christensen A.H., Sharrock R.A., & Quail P.H. (1992) Plant Mol Biol. 18(4):675-89). Um esquema de clonagem por etapas modular foi planejado para densenvolver esses vetores de expressão para qualquer dado par de genes de codificação de ZFN selecionados do arquivo de biblio- teca ou sintetizados de novo.
Em primeiro lugar, um vetor de pVAX (vide, por exemplo a publi- cação de patente US 2005-0267061; cuja descrição é incorporada por refe- rência) foi modificado para incluir o domínio de expressão N-terminal como mostrado na FIGURA 65, painéis A até E. Características do plasmídio modi- ficado (pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono) (FIGURA 65A) incluem um segmento sintetizado e reprojetado que codifica um derivado de NLS de mi- lho op-2 (RKRKESNRESARRSRYRK, SEQ ID NO: 133), e um segmento reprojetado e sintetizado que codifica o domínio de nuclease de Fok I que utiliza a linha de códon de milho. Adicionalmente, uma única inserção de nucleotídeo (C) a jusante do único sítio de Xho I criado um sítio de Sac I ex- tra para conveniência de clonagem.
Em segundo lugar, um vetor de pVAX (vide, por exemplo a pu- blicação de patente US 2005-0267061) foi também modificado para incluir o domínio de expressão C-terminal. Características do plasmídio modificado (pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono) (FIGURA 65B) incluem um segmento reprojetado e sintetizado que codifica um derivado de NLS de milho op-2 (RKRKESNRESARRSRYRK, SEQ ID NO: 133), e um segmento reprojetado e sintetizado que codifica o domínio de nuclease de Fok I que utiliza a linha de códon de milho.
Adicionalmente, a seqüência de 2A do vírus de Thosea asigna (EGRGSLLTCGD VEENPGP, SEQ ID NO: 134) foi introduzida no N-terminal do ZFN ORF para a finalidade de ligação subsequente dos 2 domínios de codificação de proteína.
Os cassetes de gene que codificam os ORFs de proteínas de dedo de zinco individual foram clonadas ou no vetor de N2A ou C2A através da ligação usando-se as enzimas de restrição Kpnl e BamHI para criar ex- tremidades compatíveis. A seguir, o fragmento de Bglll/Xho I oriundo do ve- tor de C2A foi inserido para dentro de vetor de N2A através dos mesmos sítios de restrição, fornecendo um construto intermediário que contém um cassete incluindo 2 domínios de codificação de ZFN flanqueados por sítios de restrição de Nco I e Sac I.
Finalmente, o cassete de Nco l/Saci oriundo dessa construção de intermediário (FIGURA 65C), contendo ambos os genes de ZFN1 foi extir- pado através da restrição usando-se aquelas enzimas e foi ligado na cadeia principal de plasmídio pDAB3872 (FIGURA 65D). Os plasmídios resultantes incluem os genes de ZFN mais as seqüências terminadoras e promotoras relevantes, mais marcadores selecionáveis para a manutenção de plasmídio. Nas construções finais, cujo exemplo é mostrado na FIGURA
65E, o cassete de expressão de ZFN (incluindo elementos de promotor e terminador) é flanqueado por sítios de attL para manipulação conveniente usando-se o sistema de Gateway da Invitrogen (Carlsbad, CA). Cada um dos construtos de ZFN gerado usando-se esse esquema de clonagem foi transformado em células de DH5A de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) e subseqüentemente foi mantido sob a seleção apropriada. B. Expressão transitória e fornecimento de DNA Preparações de plasmídio de vetores de expressão de ZFN construídos como descritos na FIGURA 65E foram geradas a partir de 2 L de culturas de células de E. coli desenvolvidas em meio de LB mais antibióticos usando-se um kit Gigaprep de livre de endonuclease da Qiagen (Valencia, CA) como pelas recomendações do fabricante. DNA de plasmídio foi forne- cido diretamente as células de cultura de Hill de milho usando-se uma varie- dade de métodos.
Em um exemplo, células de milho foram submetidas a forneci- mento de DNA através da Whiskers(R). Cerca de 24 horas antes do forneci- mento de DNA1 3 ml de PCV de células de suspensão de milho de Hill mais 7 ml de meio condicionado foram subcultivados em 20 ml de meio líquido de GN6 (meio de GN6 que carece Gelrite) em um frasco de Erlenmeyer de 125 ml, e foram colocados em um agitador a 125 rpm a 28°C por 24 horas. 2 mL de PCV foram removidos e foram adicionados a 12 ml de meio osmótico de GN6 S/M (meio de GN6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 45,5 g/L de sorbitol, 45,5 g/L de manitol, 100 mg/L de mio-inositol, pH 6,0) em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. O frasco foi incubado no escuro por 30-35 minutos a 28°C com agitação moderada (125 rpm). Durante esse tempo uma suspen- são de 50 mg/mL de whiskers de carbeto de silício (Advanced Composite Materials, Inc., Eureka Springs, AK) foi preparada por adição do volume a- propriado de meio líquido de GN6 S/M para whiskers estéril pré-pesados. Após incubação em GN6 S/M, os conteúdos de cada frasco foram despeja- dos para dentro de um tubo de centrígua cônica de 15 mL.
Depois que as células depositaram, a totalidade mas 1 mL de Ii- quido de GN6 S/M foi retirado e foi coletado no frasco de 125 mL para o uso futuro. A suspensão pré-molhada de whiskers foi turbilhonada por 60 segun- dos na velocidade máxima, 160 μί foram adicionados ao tubo de centrígua usando-se uma extremidade de pipeta filtrada, de amplo furo, e 20 μg de DNA foram adicionados. O tubo foi "turbilhonado de dedo" e imediatamente foi colocado em um amalgamator dental Caulk 'Vari-Mix IF', foi mantido um tubo de cultura de 17x100 mm, e então foi agitado por 60 segundos na velo- cidade média. Depois da agitação, o coquetel de células, meios, whiskers e DNA foram retornados para um frasco Erlenmeyerjuntamente com 18 ml de
* meio líquido de GN6 adicional. As células foram deixadas que se recuperem
* em um agitador a 125 RPM por 2 horas a 28°C no escuro.
Cerca de 5-6 mL de suspensão dispersa foram filtrados sobre papel de filtragem Whatman N°4 (5,5 cm) usando-se uma unidade coletora de célula de vidro ligada a uma linha de vácuo doméstica tal que 5-6 filtros foram obtidos por amostra. Filtros foram colocados sobre placas de 60 χ 20 mm de meio de GN6 e foram cultivadas a 28°C sob condições escuras. De- pois 24, 48, ou 72 horas, as células oriundas de 2-5 papéis de filtragem fo- ram raspadas, foram coletadas para dentro de um tubo,foram colocadas em gelo seco, e então foram congeladas a -80°C.
Em um outro exemplo de fornecimento de DNA, as preparações de plasmídio livres de endonuclease purificadas foram fornecidas diretamen- te as células de milho usando-se técnicas de bombardeamento de micropro- jéctil adaptado do intrumento de protocolo do fabricante. Todos os bombar- deamentos foram conduzidos com o sistema Biolistic PDS-1000/He(R) (Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA). Para o revestimento de partícula, 3 mg de partículas de ouro de 1,0 micron de diâmetro foram lavados uma vez que com 100% de etanol, duas vezes com água destilada estéril e foram ressus- pensos em 50 μΙ de água em um tubo Eppendorf siliconizado. Cinco micro- gramas de DNA de plasmídio, 20 μΙ de espermidina (0,1 M) e 50 μΙ de clore- to de cálcio (2,5 M) foram adicionados à suspensão de ouro. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 10 min, foi transformada em péletes a 10K rpm por 10s, foi ressuspensa em 60 μΙ frio de 100% de etanol e 8-9 μΙ foram distribuídos sobre cada macroveículo. Para preparar as células para o bombardeamento, grupos de células foram removidos a patir de cultura de líquido 3 dias pós-subcultura e foram colocados em um círculo de 2,5 cm de diâmetro de meio osmótico que consiste em meio de crescimento mais 0,256 M cada um de manitol e sorbitol em uma placa de Petri. As células foram incubadas em osmótico por 4 h antes do bombardeamento. Bombardeamen- to ocorreu no instrumento descrito acima usando-se por colocação do tecido na prateleira do meio sob condições de 7,58 MPa (1100 psi) e 27 em de vá- cuo de Hg e após o manual operacional. Em um ponto de tempo de 24 horas pós-tratamento, os grupos de células bombardeados foram coletados, foram congelados em N2 líquido e foram armazenados a -80°C.
Um outro exemplo de expressão transitória e fornecimento de DNA de ZFNs em células de milho envolviam a utilização de preparações de protoplasto. Usando-se métodos modificados de Mitchell e Petolino (1991) J. Plant. Physiol. 137: 530-536 e Lyznik e outros (1995) Plant J. 8(2): 177-186), protoplastos foram preparados a partir de cultura de célula de milho de Hill. Suspensões de cultura foram coletadas 48 horas pós-subcultura (crescimen- to médio-longo) por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos. Meio de cultura foi removido e 5 ml de PCV embalado foram gentilmente lavados em 10 ml de meio de W5 (NaCI2 a 154 mM; CaCI2 a 125 mM H20; KCI2 a 5 mM; gli- cose a 5 mM; pH 5,8).
Células lavadas foram coletadas através da centrifugação a 100 rpm por 5 minutos e subseqüentemente foram incubadas em um coquetel enzimático contendo 3% de Celulase Y-C + 0,3% de pectoliase Y23 (Karlan Research Products Corp., Cottonwood, AZ) em 25 ml de meio de K3 esterili- zado de filtragem (2,5 g de KN03; 250 mg de NH4N03; 900 mg de CaCI2 (diidrato); 250 mg de Mg2S04; 250 mg de NH4S04; 150 mg de NaP04 (monobásico); 250 mg de xilose; 10 ml de sulfato ferroso/de estoque de que- Iato (F318); 1 ml de B5 micronutriente (1000X de estoque - 750 mg de iodeto de potássio; 250 mg de desidrato de ácido molibdíco (sal de sódio); 25 mg de cloreto de cobalto; 25 mg de sulfato cúprico); 10 ml de Vitaminas K3 (100X de estoque - 1 g de mio-inositol; 10 mg de HCI de piridoxina; 100 mg de HCI de tiamina; 10 mg de ácido de nicotina);+ manitol a 0,6 M; pH=5,8. Células foram incubadas a 25°C por 5-6 horas com leve agitação (50 rpm) a fim de digerir a parede celular de planta secundária.
Na degradação de uma parede de célula, a mistura de enzima- célula foi filtrada através de um manchador de célula de 100 micra e através de fluxo, contendo protoplastos e fragmentos de célula, foi lavada com um volume igual de meio K3+ manitol a 0,6 M. Os protoplastos foram centrifu- gados a 800 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e a lavagem foi repetida. A pélete de protoplasto foi lavada foi ressuspensa em solução de 20 ml de K3 + manitol a 0,6 M + 9% de Ficoll 400. Dez ml dessa solução foi distribuída em 2 tubos plásticos estéreis e 2 ml de meio de TM (19,52 g de MES; 36,45 g de manitol; 40 ml de CaCI2 a 2 M H20 de estoque;
pH=5,5)) foi Ievente revestida sobre a suspensão, formando um gradiente descontínuo.
Protoplastos viáveis foram separados de protoplastos não viá- veis, fragmentos de célula e células de suspensão intactas através da centri- fugação a 800 rpm por 5 minutos. A tira de protoplasto distinta formada na interface de gradiente foi removida com uma pipeta e foi lavada com 10 ml de solução de TM fresca, seguido por centrifugação a 800 rpm por 5 minu- tos. A pélete de protoplasto resultante foi ressuspensa em 1 ml de meio de TM e o número de protoplastos viáveis foi quantificado com 25 mg/mg de diacetato de fluoresceína (FDA) que mancha em um hemocitômetro. A solu- ção de protoplasto foi ajustada para dar uma concentração final para 1 χ 107 protoplastos/ml em meio de TM.
Cerca de 1x106 protoplastos (100 μΙ) foram transferidos para um tubo Eppendorf de 2 ml contendo 10-80 μg de DNA de plasmídio purificado. 100 μΙ de uma solução de 40% de PEG-3350 (Sigma Chemical Co., St. Louis1 MO) foram adicionados gota a gota e a suspensão foi levemente mis- turada. A mistura de protoplasto/DNA foi incubada por 30 minutos a tempe- ratura ambiente, seguido por uma diluição gota a gota com 1 ml de meio de crescimento de GN6. Os protoplastos diluídos foram incubados nesse meio por 24 horas a 25°C e subseqüentemente foram coletados, foram congela- dos em N2 líquido e foram armazenados -80°C.
Exemplo 17: Funcionalidade de ZFN in vivo
Funcionalidade de a ZFN nesse exemplo é entendido como in- cluindo (mas não ser limitada a) a capacidade de um ZFN expressar em cé- lulas de uma espécie de colheita, e para aquele ZFN mediar um rompimento de fita dupla no genoma endógeno daquela colheita através de reconheci- mento de, ligação a e clivagem de seu alvo desejado. É também entendido que, nesse exemplo, o alvo do ZFN é um gene em um local endógeno e con- formação dentro do genoma de colheita.
A fim de avaliar se ZFNs engenheirados têm funcionalidade con- tra o gene-alvo previsto em um contexto genômico, ensaios à base de se- qüência de DNA foram desenolvidos. Rompimentos de fita dupla induzidos por ZFN são previstos induzir mecanismos de reparo tal como como união final não-homóloga (NHEJ) (revisto por Cahill e outros, (2006) Mechanisms Front Biosci. 1(11): 1958-76). Um resultado de NHEJ é que uma proporção dos fios de DNA rompidos serão reparados de um modo imperfeito, que re- sulta em pequenas deleções, inserções ou substituições no sítio de cliva- gem. Aquele versado na técnica pode detectar essas mudanças na seqüên- cia de DNA através de uma variedade de métodos. A. Sequenciação e clonagem à base de PCR
Em um exemplo, células de milho cultivadas de Hill que expres- sam proteínas de ZFN foram isoladas a 24 horas pós-transformação, foram congeladas e foram submetidas a extração genômico de DNA usando-se o kit de extração Qiagen (Valencia, CA) Plant DNeasy como pelas recomen- dações do fabricante. Ampliação por PCR foi realizada usando-se iniciado- res de oligonucleotídeo específicos para o gene-alvo e flanqueando o sítio de clivagem previsto do ZFN. Iniciador de PCR de orientação forward (5- GGAAGCATTATTCCAATTTGATGATAATGG-3 ') (SEQ ID NO: 135) e inici- ador de PCR de orientação reverso (5- CCCAAGTGTCGAGGTTGTCAATATGTTAC-S') (SEQ ID NO: 136) específi- cos para o parálogo de gene de IPP2-K direcionado foram usados em com- binação para ampliar DNA genômico purificado sob as seguintes condições: 25 ul de volume de reação contendo-20 ng de modelo de gDNA, 20 pmols de cada iniciador, 1% de DMSO e 10 unidades de polimerase Accuprime Pf (In- vitrogen, Carlsbad1 CA) no tampão de fabricante de enzima. Produtos de ampliação do tamanho esperado resultados de ciclos de ampliação que constituem de 950C-1\ (95°C-30", 61°C-30", 72°C-1') X 30, 72°C-5\ 4°C/suporte.
Os fragmentos ampliados foram diretamente clonados em vetor de pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando-se o kit de clonagem de TA a Invitrogen (Carlsbad, CA). Fragmentos clonados isolados foram sequencia- dos com o CEQ Dye Terminator cycle sequencing kit Beckman Coulter (Ful- Ierton1 CA) como pelas recomendações do fabricante em um formato de 96 cavidades. Nessa experiência, as proteínas de ZFN são previstas para se Iigararem a 2 seqüências de genes específicas de IPP2-K curtas para criar uma nuclease heterodimérica que cliva o ds-DNA como mostrado na FIGU- RA 66.
Análise de sequenciação resulta de múltiplos clones revealaram que clone N°127 continha uma pequena deleção em precisamente o sítio de clivagem previsto do ZFN, indicando que o mecanismo de NHEJ mediou um reparo imperfeito da seqüência de DNA seqüência naquele sítio (FIGURA 67).
Esses resultados demonstram a capacidade desses ZFNs en- genheirados para induzir, rompimento de fita duplas, direcionado de um mo- do específico em um local de gene endógeno dentro de uma espécie de co- lheita.
B. Análise de sequenciação massivamente paralela
Em uma outra exemplo, uma combinação de PCR de métodos de pirossequênciação massivamente paralelos foram aplicados para interro- gar os genomas de múltiplas amostras de célula que expressam diferentes proteínas de ZFN direcionadas contra essa mesma seqüência. Três varian- tes de iniciador de PCR de orientação forward (5'- XXXCACCAAGTTGTATTGCCTTCTCA-3') (SEQ ID NO: 137) em que XXX = GGG, CCC, ou GGC e três variantes de um iniciador de PCR de orientação reverso (5- XXXATAGGCTTGAGCCAAGCAATCTT-3') (SEQ ID NO: 138) em que XXX=GCC, CCG ou CGG foram sintetizadas (IDT, Coralville, IA). As etiquetas de 3 pb na extremidade 5' de cada iniciador serve como um identi- ficadorchave e indicam que a amostra de célula o amplicon se originou. Pa- res de iniciador com etiquetas de identificador de emparelhamento (chaves) foram usadas em combinação para ampliar DNA genômico purificado deri- vado de amostras de célula de milho sob as seguintes condições: 50 ul de volume de reação contendo 40 ng de modelo de gDNA, 20 pmols de cada iniciador, 1% de DMSO e 10 unidades de polimerase de Accuprime Pf (Invi- trogen, Carlsbad, CA) no tampão de fabricante de enzima. Produtos de am- pliação do tamanho esperado resultaram de ciclos de ampliação que consis- tem de 95°C-1\ (95°C-30\ 65°C-30", 72°C-1') X 30, 4°C/suporte e foram puri- ficadas usando-se kit de purificação de PCR Qiagen1S (Valencia, CA) MinE- Iute como pelas recomendações do fabricante.
Reações de pirossequenciação massivamente paralelas (tam- bém conhecida como sequenciação 454) foram realizadas diretamente nos produtos de PCR como descrito em (Margulies e outros (2005) Natureza 437: 376-380) by 454 Life Sciences (Branford, CT). Análise de 454 sequen- ciação resulta foi realizada por identificação de leituras de seqüência con- tendo deleções do tamanho esperado e posição dentro da molécula de DNA.
Resultados dessas análises indicavam a presença de múltiplas pequenas deleções no sítio de clivagem esperado para esses ZFNs1 como mostrado na FIGURA 68. Essas deleções são precisamente localizadas para o sítio-alvo de ZFN e indicam que rompimentos de ds, induzidos pelo ZFN, foram geradas no genoma e subseqüentemente foram reparados por NHEJ. Esses resultados ulteriormente demonstram a capacidade desses ZFNs en- genheirados induzir, rompimento de fita duplas, direcionado de um modo específico em um local de gene endógeno dentro de uma espécie de colhei- ta.
Exemplo 18: Projeto de DNA de doador para a integração direcionada
Nesse exemplo, DNA de doador é entendido incluindo molécu- las de DNA de fita dupla que são fornecidas nas células de planta e incorpo- radas no genoma nuclear. O mecanismo pelo qual essa incorporação ocorre pode ser através da união final não-homóloga independente de homologia (NHEJ; revisto por Cahill e outros, (2006) Mechanisms Front Biosci. 1: 1958- 76) ou uma outro mecanismo similar no sítio de um rompimento de fita dupla no DNA nuclear. Tal incorporação de tipo ligação, dirigido por NHEJ de DNA de doador no genoma é chamado de integração aleatória, uma vez que a posição de integração do DNA de doador é principalmente determinada pela presença de um rompimento de DNA de fita dupla, nesse mecanismo, inte- gação de doador no genoma não é dependente ou da seqüência de nucleo- tídeos do genoma no sítio do rompimento ou da seqüência de nucleotídeos do próprio doador. Portanto, durante a integração aleatória, o "endereço" no genoma em que o DNA de doador é incorporado não é especificado em pre- visto com base na seqüência do DNA de doador. Integração aleatória é o mecanismo primário pelo qual transgenese DNA de doador ocorre durante transformação de planta padrão através da ou fornecimento de DNA media- do biolístico ou por Agrobacterium em células de planta vivas.
Em contraste com a integração aleatória, DNA de doador pode também incorporar no genoma através da integração direcionada. Integra- ção direcionada é entendida como ocorrendo no sítio de um rompimento de fita dupla (posição) através da mecanismos dependente de homologia tal como anelamento de fio único dependente de homologia ou recombinação homóloga (reveisto em van den Bosch e outros (2002) Biol Chem. 383(6): 873-892). No caso de reparo de rompimento de DNA dependente de homo- logia, DNA de doador que contém seqüência de nucleotídeos com identida- de ou similaridade ao DNA no sítio de rompimento pode incorporar naquele sítio. Portanto, o "endereço" em que o DNA de doador integra no genoma é dependente de identidade de seqüência nucleotídeo ou seqüência similari- dade entre o genoma e Moléculas de DNA de doador. Em sistemas de plan- ta, reparo de rupturas de fita dupla em DNA é conhecido como utilizando tanto trajetórias dependentes de homologia quanto NHEJ (revisto em Puchta (2005) J. Exp. Bot. 56: 1-14).
Nesse exemplo, descreve-se o projeto e construção de molécu- Ias de DNA de doador a ser integrado no genoma através da integração di- recionada no sítio de um rompimento de fita dupla induzido por proteínas de ZFN específicas de seqüência. Diferentes proteínas de ZFN podem induzir rupturas de fita dupla em diferentes nucleotídeos no seqüência de gene-alvo; o sítio específico do rompimento de fita dupla induzido é chamado da posi- ção.
Como descrito no exemplo 13, caracteriza-se a seqüência de nucleotídeos de um gene-alvo, IPP2K oriundo de milho. Subseqüentemente, nós projetamos proteínas de ZFN para se ligarem a bases específicas da- quele gene-alvo (exemplo 14) e validaram sua ligação/atividade de clivagem naquela seqüência dentro do gene-alvo tanto nos sistemas heterólogos quanto contra o gene endógeno nas células de milho (exemplos 15-17). A- qui, descreve-se a construção de várias moléculas de doador projetadas pa- ra incorporar no milho genoma na posição do rompimento de fita dupla me- diado por ZFN no gene de IPP2K através da integração direcionada. Aquele versado na técnica pode contruir uma molécula de DNA de doador projetada para incorporar em um rompimento de fita dupla induzido por ZFN através da integração acionada por homologia direcionada em qualquer posição em qualquer genome para o qual seqüência de nucleotídeos é conhecida e a- quela seqüência é prevista conhecer um rompimento de fita dupla.
Em uma concretização descrita aqui, a molécula de DNA de do- ador compreende um cassete de expressão de gene de tolerância a herbici- da autônomo ligado por segmentos de seqüência de nucleotídeos idênticas àquela do gene-alvo, IPP2K na posição direcionada. Nessa concretização, o cassete de tolerância a herbicida autônomo é entendido incluindo uma uni- dade de transcrição de promotor completa(PTU) contendo um promotor, ge- ne de tolerância a herbicida, e seqüência terminadora conhecida como sen- do funcional em células de planta. Aquele versado na técnica pode selecio- nar qualquer combinação de terminador, gene e promotor para constituir o PTU autônomo. Também incluído nesse construto de plasmídio são frag- mentos de DNA com identidade de seqüência para dar o gene-alvo de milho (IPP2K) na posição indicada. Esses fragmentos servem como os "flancos de homologia" do DNA de doador e dirigem a incorporação desse doador para dentro do gene-alvo na posição especificada através da integração direcio- nada. Os flancos de homologia são colocados tanto a montante quanto a jusante do PTU na orientação 5' a 3' correta em relação ao PTU. Aquele ver- sado na técnica pode prevenir flancos de homologia de orientação e tama- nho variável em uma construção de DNA de doador.
Em uma outra concretização descrita aqui, a molécula de DNA de doador compreende uma construção de plasmidio contendo um cassete 110
de expressão de gene de tolerância a herbicida não-autônomo ligado por segmentos de seqüência de nucleotídeos idênticas àquela de IPP2K no alvo posição. Nessa concretização, o cassete de tolerância a herbicida não- autônomo é entendido incluindo um unidade de transcrição de promotor in- completa (PTU) que carece um promotor funcional, o PTU não-autônomo contêm um gene de tolerância a herbicida, e seqüência terminadora conhe- cida como sendo funcional em células de planta. Aquele versado na técnica pode selecionar qualquer combinação de terminador e gene para constituir um PTU não-autônomo. Nesse exemplo de um doador de não-autônomo, expressão do gene de tolerância a herbicida é dependente de incorporação do segmento de doador em uma localização genômica proximal a um pro- motor funcional que pode dirigir expressão daquele gene. Pode-se prever a situação relativamente rara em que o doador incorporará através da integra- ção aleatória em um local genético em que um promotor de serendipitous reside e está disponível para dirigir a expressão do gene de tolerância a her- bicida. Alternativamente, com base na presença de flancos de homologia de fragmentos de DNA do comprimento apropriado com identidade de seqüên- cia para dar o gene-alvo de uma posição especificada de milho dentro da construção de DNA de doador, integração precisa direcionada do DNA de doador para dentro do gene-alvo na posição especificada pode ocorrer (co- mo descrito para o doador autônomo) e portanto explora o promotor endó- geno do dito gene-alvo. Nessa concretização, os flancos de homologia são colocados tanto a montante quanto a jusante do PTU na orientação 5" a 3' correta em relação ao PTU. Aquele versado na técnica pode prever flancos de homologia de orientação e tamanho variável em uma construção de DNA de doador.
Em ambas as concretizaçãos descritas aqui (projeto de doador autônomo e não-autônomo), as construções de plasmídio tipicamente con- têm elementos adicionais para permitir clonagem, expressão do gene de tolerância a herbicida, e análise subsequente. Tais elementos incluem ori- gens bacterianas de replicação, sítios de restrição engenheirados, etc. e são descritos abaixo. Aquele versado na técnica pode prever a utilização de dife- rentes elementos compreendendo uma molécula de DNA de doador.
A. Cepas bacterianas e condições de cultura
Cepas de Escherichia coli (One Shot(R) Top 10 Chemically Com- petent Cels; MAX Efficiency® DH5alfa® Chemically Competent Cels1 Invitro- gen Life Technologies, Carlsbad, CA), foram desenvolvidas a 37°C, 16 h u- sando-se caldo de Luria-Bertani (LB: 10 g/L de Bacto-triptona, 10 g/L de Na- Cl, 5 g/L de extrato de levedura de Bacto), ágar de LB (caldo de LB mais 15 g/L de Bacto-ágar), ou caldo de Terrific (TB: 12 g/L de Bacto-triptona, 24 g/L de extrato de levedura de Bacto, 0,4% v/v de glicerol, KH2P04 a 17 mM, K2HP04 a 72 mM). Culturas de líquido foram agitadas a 200 rpm. cloranfe- nicol (50 Mg/ml), canamicina (50 μg/ml), ou ampicilina (100 μg/ml) foram adi- cionados aos meios quando necessário. Todos os antibióticos, meios de cul- tura e reagentes de tampão usados nesse estudo foram adquiridos da Sig- ma- Aldrich Corporation (St. Louis1 MO) or Difco Laboratories (Detroit, Ml).
B. Posição-1 de cadeia principal de plasmídio
Uma cadeia principal de plasmídio contendo flancos de homolo- gia para a posição 1 de IPP2K foi engenheirada para permitir a integração de qualquer DNA de seqüência de doador no sítio-alvo correspem quente do gene de IPP2K. Aquele versado na técnica pode prever cadeias principais de plasmídio usando-se vários sítios de clonagem, elementos de projeto modular e seqüência homóloga a qualquer sequência-alvo dentro do geno- ma de interesse. A cadeia principal de plasmídio exemplificada aqui se origi- nou com o fagemídio de vetor de plasmídio de base pBCSK(-) (3,4 Kbp) (S- tratagene, La Jolla, CA). Uma síntese de quatro etapas como descrito abaixo foi usada para construir a cadeia principal de plasmídio da posição 1.
Na etapa N°1 , o plasmídio de base foi preparado. Três pg de pBC SK(-) foram Iinearizados usando-se 10 unidades de Spe I e 10 unidades de Not I (New England Biolabs, Beverly, MA) endonucleases de restrição por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% (tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 0,002 M) agarose gel suplementado com brometo de etílio a 0,5% (Sigma-AIdrich Corporation, St. Louis, MO). Fragmentos de DNA foram visualizados com luz de UV e tama- nho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O vetor de subclonagem dirigi- do por Spel/Not I de 3,4 Kbp, pBC SK(-) foi purificado e foi extirpado com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se kit extração de gel QIA- quick (QIAGEN Inc., Valencia, CA).
Na etapa N0 2, flancos de homologia 5'- e 3' - oriundos de IPP2K posição 1 foram isolados. Os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo fo- ram sintetizados por tecnologias de DNA integradas, Inc. (Coralville, IA) sob condições de dessalinização padrão e foram diluídos com água para dar concentração de 0,125 μς/ιιΙ: 5 - GCGGCCGCGTCTCACCGCGGCTTGGG- GATTGGATACGGAGCT -3' (SEQ ID NO:143)
5'- ACTAGTGATATGGCCCCACAGGAGTTGCTCATGACTTG -3' (SEQ ID NO: 144)
5'- ACTAGTCCAGAACTGGTTGAGTCGGTCAAACAAGATTGCT -3' (SEQ ID NO:145)
5*- GTCGACCTTGATGCTACCCATTGGGCTGTTGT -3' (SEQ ID NO: 146)
Ampliação por reações de PCR foi realizada usando-se reagen- tes providos por TaKaRa Biotechnology Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520- 2193, Japão e consistiam nas seguintes: Cinco μΙ de tampão Il 10X LA PCR® (Mg2+), 20 ng de modelo de fita dupla de gDNA (milho Hill), 10 pmol de inici- ador de oligonucleotídeo forward, 10 pmol de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 8 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 33,5 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA TaKaRa LA Taq®, 1 gota de óleo mineral. Reações de PCR foram realizadas usando-se um Perkin-Elmer Cetus, cicli- zador térmico de DNA de 48 amostras (Norwalk, CT) sob as seguintes con- dições de ciclo: 94°C, 4 min/1 ciclo; 98°C 20 s, 65°C 1 min, 68°C 1 min/30 ciclos; 72°C, 5 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Quinze μΙ de cada reação de PCR foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etídio a 0,5%. Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por compara- ção com escada de DNA de 1 kbp. Produtos de ampliação esperados foram diagnosticados pela presença de ou um fragmentos de DNA de 0,821 Kbp (flanco de homologia 5') ou 0,821 Kbp (flanco de homologia 3').
Esses fragmentos foram purificados e foram extirpados com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram então clonados em plasmídio de pCR2.1 usando-se kit TOPO TA Cloning® (com vetor de pCR(R)2.1) e células de E. coli quimicamente componente One Shot® TOPIO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad1 CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transfe- rido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de Costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foram transformados em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado de plasmídios de clone de flanco de homologia 5' foram digeridos com 10 unidades de spe I e Not I. Três plasmídios de clone de flanco de homologia de iniciador foram digeridos com 10 unidades de Spe I e 20 unidades de Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA). Todas as digestões de plasmídio fo- ram incubadas por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de frag- mento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA inseridos de 0,821 Kbp (flanco de homologia 5') ou 0,821 Kbp (flanco de homologia 3') em adição ao vetor de pCR® 2.1 de 3,9 Kbp.
Reações de sequenciação de fita dupla de clones de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ® (TM) DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purifi- cadas usando-se cartuchos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSys- tems, Gaithersburg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Rea- ções de seqüência foram analisadas em um sistema de análise de DNA Beckman-Coulter CEQ® 2000 XL DNA e caracterização de nucleotídeo reali- zada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). A seqüência do fragmento de 0,821 Kbp que correspem que à posição 1 flanco de homologia 5" derivada de IPP2K é mostrada na Figura 87 (SEQ ID NO: 171). A seqüência do fragmento de 0,821 Kbp que corres- pem que à posição 1 flanco de homologia 3' derivada de IPP2K é mostrada na Figura 88 (SEQ ID NO: 172). Na etapa N0 3 posição 1 flancos de homologia 5' foram estavam
ligados no plasmídio de base. Fragmentos restritos que correspem quem a clones que continham a posição correta 1 de seqüência de flanco de homo- logia 5' foram purificados e foram extirpados com gel de acordo com as dire- ções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos que correspem quem à posição 1 flanco de ho- mologia 5' (0,821 Kbp) estavam então ligados a plasmídio de base purificado digeridos com Spe l/Not I (etapa N°1) a uma razão de vetoninserto 1:5 u- sando-se 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em um volume de reação de 20 μΙ sob condições de 16 h de incubação em banho-maria de 16°C. Cinco μΙ de uma reação de ligação fo- ram subseqüentemente transformadas de células quimicamente compenten- tes de E. coli One Shot® Top 10, (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e foram colcoados sob condições de seleção descritas pelo fabricante. Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementa- do com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C de agita- ção a 200 rpm.
Após a incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformados em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removi- do e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Al- to, CA). Três μς de DNA de plasmídio isolado foram digeridos com 10 uni- dades de spe I e Not I. (New England Biolabs, Beverly, MA) e foram incuba- dos por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etídio a 0,5%.
Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento es- timado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA inserido de 0,821 Kbp (flanco de homologia 5') em adição ao plasmídio de base de 3,4 Kbp.
Na etapa N0 4, posição 1 flanco de homologia 3' foi ligado no
produto da etapa N0 3. Três μg do produto de engenheiramento descritos na etapa N°3 foram Iinearizados usando-se 10 unidades de Spe I e 20 unidades de Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA) endonucleases de restrição por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% (tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 0,002 M) suplemen- tado com brometo de etílio a 0,5% (Sigma-AIdrich Corporation, St. Louis, MO). Fragmentos de DNA foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp (Invitro- gen Life Technologies, Carlsbad, CA). O produto digerido de Spel/Sal I de 4,2 Kbp da etapa N°3 foi purificado e foi extirpado com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA).
Fragmentos isolados do doador de flanco de homologia 3' (0,821 Kbp) gerados na etapa N0 2 foram subseqüentemente combinados com o produto da etapa N0 3 que foram digeridos com Spe l/Sal I e foi purifi- cado como descrito acima em uma reação de ligação de 20 μΙ usando-se uma razão de vetorinserto 1:5 e 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Reações de ligação foram incubadas por 16 h em banho-marca de 16°C. Após a ligação, 5 μΙ de uma reação de Iiga- ção foram transformados em células quimicamente competentes MAX Effici- ency® DH5® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) como pelas reco- mendações do fabricante. Colônias individuais inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes1 NJ) contendo 2 ml de TB su- plementado com 50 μΙ/ml de cloranfenicol.
Culturas foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de mi- crocentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific1 Pittsburgh1 PA) e foram transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plas- mídio NucleoSpin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades de Sal I e Not I. (New England Biolabs, Beverly, MA) e foram incubados por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones esperados foram diag- nosticados pela presença de dois fragmentos de DNA de 1,64 Kbp (inserto) e 3,33 Kbp (plasmídio de base). O plasmídio resultante foi dado o nome pDAB7471 (FIGURA 70). C. Posição-2 de cadeia principal de plasmídio Uma cadeia principal de plasmídio contendo flancos de homolo-
gia para a posição-2 d IPP2K foi engenheirada para permitir a integração de qualquer seqüência de DNA de doador no sítio-alvo correspem quente do gene de IPP2K. Aquele versado na técnica pode prever cadeias principais de plasmídio usando-se vários sítios de clonagem, elementos de projeto modular e seqüência homóloga a qualquer sequência-alvo dentro do geno- ma de interesse. A cadeia principal de plasmídio exemplificada aqui se origi- nou com o fagemídio de vetor de base de plasmídio pBC SK(-) (3,4 Kbp) (Stratagene, La Jolla1 CA). Uma síntese de quatro etapas como descrito a- baixo foi usado para construir a cadeia principal de plasmídio na posição-2. Na etapa N0 1, o plasmídio de base foi preparado. Três μg de
pBC SK(-) foram Iinearizados usando-se 10 unidades de Spe I e 10 unidades de Not I (New England Biolabs, Beverly, MA) de endonucleases de restrição por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% (tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 0,002 M) suple- mentado com brometo de etílio a 0,5% (Sigma-AIdrich Corporation, St. Louis, MO). Fragmentos de DNA foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp (Invitro- gen Life Technologies, Carlsbad, CA). O vetor de subclonagem digerido por Spel/not I de 3,4 Kbp, pBC SK(-) foi purificado e foi extirpado com gel de a- cordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIA- quick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Na etapa N0 2, flancos de homologia 5'- & 3' oriundos da EPP2K
posição-2 foram isolados. Os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo fo- ram sintetizados por tecnologias de DNA integradas, Inc. (Coralville, IA) sob condições de dessalinização padrão e foram diluídos com água para dar uma concentração de 0,125 ug/μΙ: 5'-GCGGCCGCTAGATAGCAGATGCAGATTGCT-S' (SEQ ID NO: 147) 5'-ACTAGTATTGGCACCCAGGTGTTGGCTCA-S' (SEQ ED NO: 148) 5'-ACTAGTCATGTCGATGGTGGGGTATGGTTCAGATTCAG-S' (SEQ ID NO:149)
5'-GTCGACGTACAATGATTTCAGGTTACGGCCTCAGGAC-S' (SEQ ID NO: 150)
Reações de Ampliação de PCR foram realizadas usando-se re- agentes providos por TaKaRa Biotechnology Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japão e consistiam nas seguintes: 5 μΙ de tampão Il 10X LA PCR® (Mg2+), 20 ng de modelo de fita dupla de gDNA (milho Hill), 10 pmols de ini- ciador de oligonucleotídeo forward, 10 pmols de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 8 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 33,5 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA TaKaRa LA Tag®, 1 gota de óleo mineral. Reações de PCR foram realizadas usando-se um Perkin-Elmer Cetus, cicli- zador térmico de DNA de 48 amostras (Norwalk, CT) sob as seguintes con- dições de ciclo: 94°C, 4 min/1 de ciclo; 98°C 20 s, 55°C 1 min, 68°C 1 min/30 ciclos; 72°C, 5 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Quinze μΙ de cada reação de PCR foram eletroforetizados a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Produtos de ampliação espera- dos foram diagnosticados pela presença ou de um fragmentos de DNA de 0,855 Kbp (fIanco de homologia 5') ou 0,845 Kbp (flanco de homologia 3'). Esses fragmentos foram purificados e foram extirpados com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram então clonados em plasmídio de pCR2.1 usando-se kit de clonagem TOPO TA® (com vetor de pCR® 2.1 vetor) e células de E. coli quimicamente competentes One Shot® TOPIO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com protocolo do fabricante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transfe- rido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de Costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foram transformados em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado de plasmídios de clone de flanco de homologia 5' foram digeridos com 10 unidades de spe I e Not I. Três plasmídios de clone de flanco de homologia de iniciador foram digeridos com 10 unidades de spe I e 20 unidades Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA). Todas as digestões de plasmídio foram incubadas por 1 h a 37°C.
DNA restrito foi eletroforetizado a 100V por 1 h em um gel de agarose de TAE da 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento es- timado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA inse- ridos de 0,855 Kbp (flanco de homologia 5'-) ou 0,845 Kbp (flanco de homo- Iogia 3') além do vetor de pCR(R)2.1 de 3,9 Kbp.
Reações de sequenciação de fita dupla de clones de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ® DTCS- Quick Start Kit (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-se cartuchos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de seqüência foram analisadas em um sistema de análise de DNA Beckman- Coulter CEQ® 2000 XL e caracterização de nucleotídeo realizada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). A se- quência do fragmento de 0,855 Kbp que correspem que ao flanco de homo- Iogia 5' na posição-2 derivada de IPP2K é mostrada na Figura 89 (SEQ ID NO: 139). A seqüência do fragmetno de 0,845 Kbp que correspem que ao 3'- flanco de homologia posição-2 derivada de IPP2K é mostrada na Figura 90 (SEQ ID NO: 140).
Na etapa N0 3, flancos de homologia 5' na posição-1 foram liga-
dos no plasmídio de base. Fragmentos restritos que correspem quem a clo- nes que continham a seqüência de flanco de homologia 5' de posição-2 cor- reta, foram purificados e foram extirpados com gel de acordo com as dire- ções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos que correspem quem ao 5-flanco de homologia de posição-1 (0,855 Kbp) estavam então ligados a plasmídio de base purifi- cado digerido com Spe l/Not I (etapa N°1) a uma razão de vetor/inserto de 1:5 usando-se 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologi- es, Carlsbad, CA) em um volume de reação de 20 μΙ sob condições de 16 h de incubação em banho-marica de 16°C.
Cinco μΙ de uma reação de ligação foram subseqüentemente transformados de células quimicamente competentes de E. coli One Shot Top® 10, (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e foram colocados sob condições de seleção descritas pelo fabricante. Colônias individuais fo- ram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de ca- namicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de Costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plas- mídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucIeoS- pin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de DNA de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades de spe I e Not I. (New England Biolabs, Beverly, MA) e foram incubadas por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visua- Iizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diag- nosticados pela presença de um fragmento de DNA inserido de 0,855 Kbp (flanco de homologia 5') além do plasmídio de base de 3,4 Kbp plasmídio de base.
Na etapa N0 4, flancos de homologia 3' na posição-2 foram liga-
dos produto da etapa N0 3. Três μg do produto de engenheiramento descri- tos na etapa N0 3 foram Iinearizados usando-se 10 unidades de Spe I e 20 unidades de Sal I (New England Biolabs, Beverly, MA) endonucleases de restrição por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% (tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 0,002 M) suplementado com brometo de etílio a 0,5% (Sigma- Aldrich Corporation, St. Louis, MO). Fragmentos de DNA foram visualizados com luz de UV e tama- nho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). O produto digerido por Spel/Sal I de 4,25 Kbp da etapa N0 3 foi purificado e foi extirpado com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIA- quick (QIAGEN Inc., Valencia1 CA).
Fragmentos isolados do produto de doador de flanco de homo- logia 3' (0,845 Kbp) gerados na etapa N0 2 foram subseqüentemente combi- nados com produto da etapa N°3 que foi digerido com Spe l/Sal I e foi purifi- cado como descrito acima em uma reação de ligação de 20 μΙ usando-se uma razão de vetor:inserto de 1:5 e 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invi- trogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Reações de ligação foram incuba- das por 16 h em banho-maria de 16°C. Após a ligação, 5 μΙ de uma reação de ligação foram tranformados em células quimicamente competentes MAX Efficiency® DH5alfa® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) como pe- Ias recomendações do fabricante. Colônias individuais foram inoculadas pa- ra dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de cloranfenicol. Culturas foram incubadas por 16 h a 37°C de agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de Costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foram transformados em péle- tes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades Sal I e Not I (New England Biolabs, Beverly, MA) e foram incubados por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforeti- zado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones esperados foram diagnosticados pela presença de dois frag- mentos de DNA de -1,7 Kbp (inserto) e 3,33 Kbp (plasmídio de base). Ao plasmídio resultante foi dado o nome pDAB7451 (FIGURA 71).
D. Construção de cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida autônomo
Um cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida au- tônomo compreendendo uma unidade transcritiva de promotor completa (PTU) contendo promotor, gene de tolerância a herbicida, e seqüência de terminação de poliadenilação (polyA) foi construída (FIGURA 72). Nessa concretização, a seqüência de promotor é derivada de actina 1 O. sativa [McEIroy e outros (Plant Cell 2, 163-171; 1990); número de acesso GenBank S44221 e número de acesso GenBank X63830]. O gene de tolerância a her- bicida compreende o gene de PAT (fosfinotricina acetil transferase), que confere resistência ao herbicida bialaphos (uma versão modificada da região de codificação de PAT originalmente derivada de Streptomyces viridochro- mogenes (número de acesso GenBank M22827; Wohlleben e outros Gene 70, 25-37; 1988). As modificações na seqüência original do quadro de leitura aberto mais longa de M22827 são subtanciais, e incluem alteração do pa- drão de utilização de códon para otimizar expressão em plantas. Exceto quanto ao uso de metionina como substituto de valina como o primeiro ami- noácido codificado, e a adição de alanina como o segundo aminoácido codi- ficado, a proteína codificada do quadro de leitura aberto de PAT de pDAB3014 é idêntica àquela codificada pelo quadro de leitura aberto mais longo número de acesso M22827. A versão reconstruída de PAT é encon- trada sob número de acesso GenBank 143995. As seqüências terminadoras são derivadas de Z. mays L. Iipase [clone de cDNA de Iipase de milho de número de acesso GenBank L35913, exceto quanto a um C na posição 1093 de L35913 é substituído com um G na posição 2468 em pDAB3014. Essa seqüência de milho compreende a região 3' não-traduzida/região de termi- nador de transcrição para o gene de PAT].
Os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) sob condições de des- salinização padrão e foram diluídos com água para dar uma concentração de 0,125 Mg/μΙ:
5'- ACTAGTTAACTGACCTCACTCGAGGTCATTCATATGCTT- GA -31 (SEQ ID NO: 151)
5'- ACTAGTGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT -3' (SEQ ID NO:
152)
Reações de ampliação de PCR foi realizada usando-se reagen-
tes providos por TaKaRa Biotechnology Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga1 520- 2193, Japão e consistiam nas seguintes: 5 μΙ de tampão Il 10X LA PCR® (Mg2), 20 ng de modelo de fita dupla [DNA de plasmídio de pDAB3014], 10 pmols de iniciador de oligonucleotídeo forward, 10 pmols de iniciador de oli- gonucleotídeo reverso, 8 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 33,5 μΙ de H20, 0,5 μΙ de polimerase de DNA (2,5 unidades) TaKaRa LA Taq®, 1 gota de óleo mineral. Reações de PCR foram realizadas usando-se a Perkin- Elmer Cetus, ciclizador térmico de DNA de 48 amostras (Norwalk, CT) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 4 min/1 ciclo; 98°C 20 s, 55°C 1 min, 68°C 3 min/30 ciclos; 72°C, 5 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Quinze μΙ de cada reação de PCR foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%.
Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e ta- manho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Produtos de ampliação esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA de 2,3 Kbp. Essa mistura foi extirpada com gel e foi purificada de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de ex- tração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmento purificado foi clonado em plasmídio de pCR2.1 usando-se kit TOPO TA cloning® e transformado em Células de E. coli quimicamente competentes One Shot® TOPIO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com protoco- lo do fabricante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pitts- burgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrena- dante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima u- sando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey- Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foi digerido com 10 uni- dades de spe I e Not I. Todas as digestões de plasmídio foram incubadas por 1 h a 37°C.
DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Frag- mentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio espe- rados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA inserido de 2,325 Kbp além do vetor de pCR(R)2.1 de 3,9 Kbp. Reações de sequen- ciação de fita dupla de clones de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ® DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-se cartuchos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSystems1 Gaithersburg1 MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de seqüência foram analisadas em um sistema de análise de DNA Beckman- Coulter CEQ® 2000 XL e nucleotí- deo caracterização foi realizada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor1 Ml).
E. Inserção de cassete de cassete gene de tolerância autônomo na herbicida autônomo na cadeia principal de plasmídio - Doador autônomo A fim de criar um plasmídio doador, o cassete de gene de tole- rância a herbicida descritos autônomo no exemplo 18D foi inserido para den- tro das construções de cadeia principal de plasmídio descritos nos exemplos 18B e 18C. Fragmento restrito derivado de um clone que continha a sequên- cia esperada de 2,25 Kbp descrito acima (FIGURA 72) foi purificado e foi extirpado com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA).
Esse fragmento foi então combinado em uma reação de ligação ou com pDAB7471 purificado (posição 1 da cadeia principal de plasmídio, FIGURA 70) ou ρDAB 7451 (posição 2 da cadeia principal de plasmídio FI- GURA 71) que tinha sido digerido com enzima de restrição Spe I e subse- qüentemente foi desforilado. Ligação foi realizada sob as seguintes condi- ções: razão 1:5 de vetor/inserto e 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invitro- gen Life Technologies, Carlsbad1 CA) em um volume de reação de 20 μΙ sob condições de 16 h de incubação em banho-maria 16°C. Cinco μΙ de uma re- ação de ligação foram subseqüentemente transformados em 50 μΙ élulas quimicamente competentes de E. coli MAX Efficiency® DH5alfa®, (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e foram laminados sob condições de sele- ção descrita pelo fabricante. Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo
Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de cloranfenicol e foram incubadas por 16 h a 37°C de agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific1 Pitts- burgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrena- dante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima u- sando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Biosciences/Clontech/Macherey- Nagel1 Palo Alto1 CA). Três μg de DNA de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades de spe I (New England Biolabs1 Beverly, MA) e foram incu- bados por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmen- to estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plas- mídio esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 2,325 Kbp e 4,9 Kbp (vetor de pDAB7471) ou 2,325 Kbp e 5,0 Kbp (vetor de pDAB7451).
Os plasmídios resultantes foram chamados pDAB7422 (posição 1 de doador autônomo) (FIGURA 73) e pDAB7452 (posição 2 de doador au- tônomo) (FIGURA 74), respectivamente.
F. Construção de cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida não-autônomo
Um cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida não-autônomo compreendendo uma unidade transcritiva de promotor in- completa (PTU) foi construído (FIGURA 75). Nessa concretização, uma es- tratégia foi usada que explora a funcionalidade de uma seqüência 2A (Matti- on, N.M., Harnish, E.C., Cfileiraley, J.C. & Reilly, P.A. (1996) J. Virol. 70, 8124- 8127) derivados do vírus Thesoa assigna, um gene de tolerância a herbicida e seqüências de terminação de poliadenilação (polyA)s, mas ne- nhum promotor. Nessa concretização, a seqüência de sinal de terminação traducional de 2A foi engenheirada a ser traducionalmente em quadro com o gene de tolerância a herbicida. Além disso, a sequencia de codificação de 2A/herbicida foi engenheirada para coincidir com o quadro de leitura tradu- cional do gene de IPP2K alvo. O gene de tolerância a herbicida compreende o gene de PAT (fosfinotricina acetil transferase), que confere resistência ao herbicida bialaphos (uma versão modificada da região de codificação de PAT originalmente derivada de Streptomyces viridochromogenes (número de acesso GenBank M22827; Wohlleben e outros Gene 70:25-37; 1988). As modificações na seqüência original do quadro de leitura aberto mais longo de M22827 são subtanciais, e incluem a alteração do padrão de utilização de códon para otimizar expressão em plantas. Exceto quanto à substituição de metionina por valina como o primeiro aminoácido codificado, e a adição de alanina como o segundo aminoácido, a proteína codificada do quadro de leitura aberto de PAT de pDAB3014 é idêntica àquela codificada pelo quadro de leitura aberto mais longo de M22827 (que começa com GTG na posição 244 de M22827). A versão reconstruída de PAT é encontrada sob número de acesso GenBank 143995. As seqüências terminadoras são derivadas de Z. mays L. Iipase [clone de cDNA de Iipase de milho de número de acesso de GenBank L35913, exceto quanto ao C na posição 1093 de L35913 está substituído com um G na posição 2468 em pDAB3014]. Essa seqüência de milho compreende a região não-traduzida 3'/região de terminador de trans- crição para o gene de PAT.
Os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) sob condições de des- salinização padrão e foram diluídos com água para dar uma concentração de 0,125 μς/μΙ:
ACTAGTGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGG TGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGCTTCTCCGGAGAGGA GACCAGTTGA -3 (SEQ ID NO: 153)
5'- ACTAGTATGCATGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT -3' (SEQ ID NO: 154)
Reações de ampliação de PCR foram realizadas usando-se re- agentes providos por TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japão) e consistiam nas seguintes: 5 μΙ de tampão Il 10X LA P- CR® (Mg2+), 20 ng de modelo de fita dupla (DNA de plasmídio de pDAB3014), 10 pmols de iniciador de oligonucleotídeo forward, 10 pmols de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 8 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM ca- da), 33,5 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase TaKaRa LA Taq® DNA, 1 gota de óleo mineral. Reações de PCR foram realizadas usando-se um Perkin-Elmer Cetus, ciclizador térmico de DNA de 48 amostras (Norwalk, CT) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 4 min/1 ciclo; 98°C 20 s, 55°C 1 min, 68°C 2 min/30 ciclos; 72°C, 5 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Quinze μΙ de cada reação de PCR foram eletroforetizados a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Produ- tos de ampliação esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA de ~1 Kbp. Essa mistura foi purificada e foi extirpada com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmento purificado foram en- tão clonados em plasmídio de pCR2.1 usando-se kit TOPO Ta cloning® transformado em Células de E. coli quimicamente competentes One Shot® TOPIO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com protoco- lo do fabricante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após a incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pitts- burgh, PA) e foram transformados em péletes a 16.000 χ g por 1 min. So- brenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foi digerido com 10 unidades de Spe I. Todas as digestões de plasmídio fo- ram incubadas por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de frag- mento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA inserido de vetor de -1,0 Kbp e 3,9 Kbp (pCR(R)2.1). Reações de sequenciação de fita dupla de clones de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ(TM) DTCS-Quick Start (Beck- man-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-se cartu- chos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSystems1 Gaithersburg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de seqüência foram analisadas em um sistema de análise de DNA Beckman-Coulter CEQ® 2000 XL e caracterização de nucleotídeo realizada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). G. Inserção de cassete de gene de tolerância a herbicida não-
autônomo na cadeia principal de plasmídio - Doador não-autônomo
A fim de criar um donor plasmídio doador, o cassete de gene de tolerânica a herbicida não-autônomo descrito no exemplo 18F foi inserido nas construções de cadeia principal de plasmídio descrito nos exemplos 18B e 18C. Fragmento restrito que correspem que a um clone que continha a seqüência de 1 Kbp correta foi purificado e foi extirpado com gel de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Esse fragmento foi então combinado em uma reação de ligação ou com pDAB7471 purificado (posição 1 de cadeia princi- pai de plasmídio) (FIGURA 70) ou ρDAB 7451 (posição 2 de cadeia principal de plasmídio) (FIGURA 71) que tinha sido digerida com enzima de restrição Spe I e subseqüentemente foi desfosforilada. Ligação foi realizada sob as seguintes condições: razão 1:5de vetor/inserto e 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em um volume de rea- ção de 20 μΙ sob condições de 16 h de incubação em banho-maria 16°C. Cinco μΙ de uma reação de ligação foram subseqüentemente transformados em 50 μΙ de células quimicamente competentes de E. coli MAX Efficiency® DH5alfa®, (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e foram colocados sob condições de seleção descritas pelo fabricante. Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo
Falcon de 14 ml (Becton- Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de cloranfenicol e foram incubadas por 16 h a 37°C de agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transfe- rido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobre- nadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucIeoSpinR (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de DNA de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades de spe I (New England Biolabs, Beverly, MA) e foram incubados por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforeti- zado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1,0 Kbp e 4,96 Kbp (vetor de pDAB7471) ou 1,0 Kbp e 5,0 Kbp (vetor de pDAB7451). Os plasmídios resultantes foram cha- mados pDAB7423 (doador não-autônomo na posição 1) (FIGURA 76) e pDAB7454 (doador não-autônomo na posição 2) (FIGURA 77), respectiva- mente.
H. Seqüências de doador de ZFN + H na Posição 1: Plasmídio de combinação.
como uma estratégia alternativa para o fornecimento de dois
plasmídios separados em uma célula de planta (por exemplo, um plasmídio contendo elementos de ZFN e um segundo contendo as seqüências de doa- dor de tolerância a herbicida), plasmídios simples foram engenheirados con- tendo todos os elementos necessários ilustrados nessa patente. Os plasmí- dios de combinação descritos nesse exemplo contêm tanto os ZFNs projeta- dos para direcionar e gerar rupturas de fita dupla no local de IPP2K especifi- cado bem como o PAT PTU autônomo e/ou 2A/PAT PTU não-autônomo e flancos de doador projetados para integrar naqueles sítios de rompimento.
Tecnologia Gateway®, que usa recombinação específica de sito à base de fago Iambda (Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 55:913) foi utilizada para converter vetores pDAB7422 e pDAB7423 (descritos nos e- xemplos 6E e 6G) em vetores de destino Gateway®. Uma vez que converti- dos, plasmídios contendo cassete de expressão de ZFNs (abrigado em veto- res Gateway® Entry) podem ser mobilizados facilmente no vetor de destino que cria um plasmídio de combinação de ZFN/doador Um μ9 de cada tal plasmídio foi digerido com 10 unidades Not I (New England Biolabs, Beverly, MA) por 1 ha 37°C. Endonuclease de restrição de Not I foi ativado a quente a 65 C por 15 min e extremidades de fragmento subseqüentemente foram desfoforiladas a 37°C por 1 h usando-se 3 unidades de fosfatase alcalina de camarão (SAP) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim1 Alemanha). DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos de vetor (pDB7422 = 7,317 Kbp, pDAB7423 = 5,971 Kbp) foram visualizados com luz de UV, tamanho estimado por comparação com escada de DNA de 1 Kbp, foram extirpados por gel e subseqüentemente foram purificados de acordo com as direções do fabricante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGENu Inc., Valencia, CA).
Esse fragmento de vetor foi então combinado com um fragmento de Not I de 2,274 Kbp contendo elementos de tecnologia Gateway® attR1, ccdB, Cm®, e attR2 em uma reação de ligação realizada sob as seguintes condições: razão 1:5de vetor/inserto e 500 unidades de T4 DNA Ligase (Invi- > 20 trogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em um volume de reação de 20 μΙ sob condições de 16 h de incubação em banho-maria de 16°C. Cinco μΙ de uma reação de ligação foram subseqüentemente transformados em 50 μΙ de células quimicamente competentes de E. coli One Shot® ccdB Survival®, (In- - vitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e foram colocados sob condições de seleção descritas pelo fabricante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton- Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de cloranfenicol e foram incubadas por 16 h a 37°C de agitação a 200 rpm. Após a incubação, 1,5 ml de células foi trans- ferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobre- nadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μς de DNA de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades de EcoRI I (New England BioLabs1 Inc., Beverly, MA) e foram incubados por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletro- foretizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplemen- tado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 kbp. Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1,448 Kbp, 1,946 Kbp, e 6,197 Kbp para o doador HR na posição 1 de PAT PTU autônomo e 5,807 Kbp e 2,438 Kbp para o doador de H na posição 1 de PAT não-autônomo. Os plasmídios re- sultantes foram chamados pDAB7424 (Gateway® de doador autônomo adap- tado na posição 1) (FIGURA 78) e pDAB7425 (doador Gateway®não- autônomo adaptado na posição 1) (FIGURA 79), respectivamente.
Como um resultado dessas manipulações de clonagem, os plasmídios pDAB7424 & pDAB7425 foram designados como vetores de des- tino Gateway®. pDAB7412 tinha funcionalidade como um vetor de entrada Gateway® contendo os seguintes elementos:
ZwUbilv.2/ZFN12/Zm Per5 3' UTR. Para transferir um cassete de expressão de ZFN (vetor de entrada de Gateway®) ou na molécula de doador autônomo ou não-autônomo (vetor de destino Gateway®), uma rea- ção de LR Clonase® Il (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) foi reali- zada como delineado pelo fabricante a uma razão de 50 ng (vetor de entra- da): 150 ng de (vetor de destino). Os plasmídios de combinação positivos resultantes foram chamados pDAB7426 (ZFN12/doador de H autônomo na posição 1) (FIGURA 80) & pDAB7427 (ZFN12/doador de H não-autônomo na posição 1) (FIGURA 81).
Exemplo 19: fornecimento de ZFN e DNA de doador em células
de planta
A fim de permitir integração mediada por ZFN de DNA de doa- dor no genoma de planta através da integração direcionada, é entendido que fornecimento de DNA de codificação de ZFN seguido por expressão de pro- teína de ZFN funcional na célula de planta é exigido. Também necessário é fornecimento de DNA de doador concomitante na dita célula de planta, tal que proteína de ZFN funcional pode induzir rupturas de fita dupla no DNA alvo que são então reparadas através da integração dirigida de homologia do DNA de doador para dentro do local-alvo. Aquele versado na técnica po- de prever que a expressão de proteína de ZFN funcional pode ser alcançada por vários métodos, incluindo, mas não limitados a transgenese da constru- ção de codificação de ZFN, ou expressão transitória da construção de codifi- cação de ZFN. Em ambos esses casos, expressão de proteína de ZFN fun- cional e fornecimento de DNA de doador na célula de planta é simultanea- mente alcançada a fim de dirigir integração direcionada.
Nos exemplos citados aqui, demonsta-se métodos para o forne- cimento concomitante de DNA de doador de codificação de ZFN em células de planta. Aquele versado na técnica deve usar qualquer uma de uma varie- dade de métodos de fornecimento de DNA apropriados para células de plan- ta, incluindo, mas não limitadas a, transformação mediada por Agrobacteri- um, fornecimento de DNA com base de biolísticas ou fornecimento de DNA mediado por Whiskers®. Em uma concretização descrita aqui, experiências de fornecimento de DNA mediados por Whiskers® foram realizados usando- se várias combinações de DNA de doador com construções de DNA de codi- ficação de DNA. Essas combinações incluem 1) um único plasmídio conten- do tanto seqüência de codificação de ZFN quanto DNA de doador e 2) dois plasmídios distintos, um contendo seqüência de codificação de ZFN e o ou- tro contendo DNA de doador. Em uma outra concretização, fornecimento de DNA com base em biolísticos foi realizado usando-se várias combinações de DNA de doador com construções de DNA de codificação de DNA. Aquele versado na técnica pode deduzir que essas combinações devem incluir 1) um único plasmídio contendo tanto seqüência de codificação de ZFN quanto DNA de doador e 2) dois plasmídios distintos, um contendo seqüência de codificação de ZFN e o outro contendo DNA de doador.
A. Fornecimento de DNA mediado por Whiskers®
Como descrito anteriormente aqui, culturas de célula Hi-Il em- briogênica de milho foram produzidas, e foram usadas como a fonte de célu- las de planta viva em que integração direcionada é demonstrada. Aquele versado na técnica pode prever a utilização de culturas de célula derivadas de uma variedade de espécies de planta, ou tecidos de planta diferenciados derivados de uma variedade de espécies de planta, como a fonte de células de planta viva em que a integração direcionada é demonstrada.
Nesse exemplo, 12 ml de PCV oriundo de uma linha de célula crioconservada anteriormente mais 28 ml de meio condicionado foram sub- cultivados em 80 ml de meio líquido de GN6 (meio de N6 (Chu e outros, 1975), 2,0 mg/L 2, 4-D, 30 g/L de sacarose, pH 5,8) em um frasco Erlenme- yer de 500 ml, e foram colocados em um agitador a 125 rpm a 28°C. Essa etapa foi repetida 2 vezes usando-se a mesma linha de célula tal que um total de 36 ml de PCV foram distribuídos através de 3 frascos. Depois de 24 horas o meio líquido de GN6 foi removido e foi substituído com 72 ml de meio osmótico de GN6 S/M (meio de N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de saca- rose, 45,5 g/L de sorbitol, 45,5 g/L de manitol, 100 mg/L de mioinositol, pH 6,0), O frasco foi incubado no escuro por 30-35 minutos a 28°C com agita- ção moderada (125 rpm). Durante o período de incubação, uma suspensão de 50 mg/mL de whiskers de carbeto de silício (Advanced Composite Mate- rials, LLC, Greer, SC) foi preparada por adição de 8,1 ml de meio líquido de GN6 S/M a 405 mg de whiskers de carbeto de silício, estéril.
Após a incubação no meio osmótico de GN6 S/M, o teor de cada frasco foi combinado em uma garrafa de centrífuga de 250 ml. Depois que todas as células no frasco depositadas no fundo, volume de teor em excesso de cerca de 14 ml de líquido de GN6 S/M foi removido e foi coletado em um frasco de 1 L estéril para o uso futuro. A suspensão pré-molhada de whis- kers foi misturada à velocidade máxima em um turbilhonamento por 60 se- gundos, e então adicionada à garrafa de centrífuga.
Em um exemplo, em que um único plasmídio contendo tanto a seqüência de codificação de ZFN quanto o DNA de doador estão sendo for- necidos nas células de planta, 170 μg de DNA de plasmídio circular purifica- do foi adicionado à garrafa. Em um exemplo alternativo, em que dois pias- mídios distintos estavam sendo cofornecidos, uma ZFN contendo seqüência de codificação e o outro contendo DNA de doador, múltiplas estratégias para quantidades de DNA foram analisadas. Uma estratégia utilizada a 85 μg de DNA de doador e 85 μg de DNA de codificação de dedo de zinco. Outras modificações utilizaram razões molares de DNA de doador de 10, 5 ou 1 vez para DNA de dedo de zinco uma vez, com base no tamanho (em pares de quilo base) dos plasmídios individuais tal que um total de 170 μg de DNA foram adicionados por garrafa. Em todos os casos de cofornecimento, DNA foi pré-combinado em um tubo antes de ser adicionado à garrafa de centrí- fuga. Uma vez que DNA foi adicionado, a garrafa foi imediatamente colocada em um misturador de tinta comercial Red Devil 5400 modificado (Red Devil Equipment Co., Plymouth, MN) e foi agitado por 10 segundos. Após a agita- ção, o coquetel de células, meios, whiskers e DNA foram adicionados ao teor de um frasco de 1 L juntamente com 125 ml de meio líquido de GN6 fresco para reduzir o osmoticante. As células foram deixadas recuperar em um conjunto de agitador a 125 rpm por 2 horas. Seis mL de suspensão dis- persas foram filtrados sobre papel de filtro Whatman N0 4 (5,5 cm) usando- se uma unidade coletora de célula de vidro ligada a uma linha de vácuo do- méstica tal que 60 filtros foram obtidos por garrafa. Filtros foram colocados sobre 60 χ 20 mm de placas de meio sólido de GN6 (mesmo que o meio lí- quido de GN6 exceto com 2,5 g/L de agente de gelificação Gelrite) e foram cultivados a 28°C sob condições escuras por 1 semana.
B: fornecimento de DNA mediado por biolístico
Nos exemplos citados aqui, suspensões de gene de embriogê- nicas de milho foram subcultivadas em meio líquido de GN6 cerca de 24 ho- ras antes da experimentação como descrito anteriormente aqui. O meio lí- quido em excesso foi removido e cerca de 0,4 PCV de células foi finamente espalhado em um círculo de 2,5 cm de diâmetro sobre o centro de uma pla- ca de petri de 100x15 mm contendo meios de GN6 S/M solidificados com 2,5 g/L de gelrite. As células foram cultivadas sob condições escuras por 4 ho- ras. Para revestir as partículas biolísticas com DNA1 3 mg de 1,0 mícron de diâmetro de partículas de ouro foram lavados uma vez que com 100% de etanol, duas vezes com água destilada estéril e foram ressuspensos em 50 μΙ de água em um tubo Eppendorf siliconizado. Um total de 5 μg de DNA de plasmídio, 20 μΙ de espermidina (0,1 M) e 50 μΙ de cloreto de cálcio (2,5 M) foram adicionados separadamente à suspensão de ouro e foram misturados em um turbilhonamento. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por min, foi transformada em péletes a 10.000 rpm em uma microcentrífuga de bancada por 10 segundos, foi ressuspensa em 60 μΙ de 100% de etanol frio, e 8-9 μΙ foram distribuídos sobre cada macroveículo.
Bombardeamento ocorreu usando-se o sistema biolístico PDS- 1000/He® (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA). Placas contendo as células foram colocadas na prateleira do meio sob condições de 77 kg /cm2 (1100 psi) e 68,58 cm (27 polegadas) de vácuo de Hg, e foram bombardeadas a- pós o manual operacional. Dezesseis horas pós-bombardeamento, o tecido foi transferido em pequenos grupos para o meio de GN6 (1H) e foi cultivado por 2-3 semanas a 28°C sob condições escuras. Transferência continuou a cada 2-4 semanas até isolados transgênicos putativos que resultam da inte- gração de DNA de doador aparecer. Identificação, isolamento e regeração de eventos de integração de DNA de doador putativos gerados através da fornecimento de DNA mediado por biolístico é idêntico ao processo utilizado para os eventos de integração de DNA de doador putativos gerados através da fornecimento de DNA mediado por Whiskers® e descritos abaixo.
C. Identificação e isolamento de eventos transgênicos de inte- gração direcionados putativos
Uma semana pós-fornecimento de DNA, papéis de filtro foram transferidos para 60x20 mm de placas de meio de seleção GN6 (1H) (meio de GN6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 100 mg/L de mioinositol, 1,0 mg/L de bialaphos oriundos de Herbiace (Meiji Seika, Japão), 2,5 g/L de Gel- rite, pH 5,8). Essas placas de seleção foram incubadas a 28°C por uma se- mana no escuro.
Após 1 semana de seleção no escuro, o tecido foi implantado sobre meio fresco por raspamento da metade das células de cada placa pa- ra dentro de um tubo contendo 3,0 mL de Meio de agarose de GN6 mantido a 37-38°C (meio de N6, 2,0 mg/L de 2,4-D, 30 g/L de sacarose, 100 mg/L de mioinositol, 7 g/L de agarose SeaPlaque®, pH 5,8, foi submetido à autoclave por apenas 10 minutos a 1210C) e 1 mg/L de bialaphos oriundo de Herbiace.
A mistura de agarose/tecido foi rompida com uma espátula, e subseqüentemente 3 mL de mistura de agarose/tecido foram igualmente despejados sobre a superfíce de uma placa de petri de 100 χ 15 mm con- tendo meio de GN6 (1H). Esse processo foi repetido para ambas as metades de cada placa. Uma vez que a totalidade do tecido foi implantado, placas foram individualmente seladas com Nescofilm® ou Parafilm M®, e foram cul- tivadas a 28°C sob condições escuras por até 10 semanas. Isolados putati- vamente transformados que se tornam cinzentos sob essas condições de seleção foram removidos a patir das placas implantadas e transferidas para meio de seleção fresco em placas de 60 χ 20 mm. Se crescimento sustenta- do fosse evidente depois de cerca de 2 semanas, um evento foi considerado ser resistente ao herbicida aplicado (bialophos) e uma alíquota de células foi subseqüentemente coletada em tubos Eppendorf de 2 ml para análise de genótipo.
Aquele versado na técnica deve utilizar um gene que codifica qualquer marcador selecionável apropriado no DNA de doador e se aplica condições de seleção comparáveis com células vivas. Por exemplo, um mar- cador de gene selecionável alternativo tal como AAD-I, como descrito na WO 2005/107437 A2, poderia ser implementado como um donor para a seleção e recuperação dos eventos integrados em células de milho como descrito aqui.
Exemplo 20: Triagem para eventos de integração direcionados através da genotipagem de PCR
Nesse exemplo, genotipagem de PCR é entendida incluindo, mas não limitada a, ampliação de reação de cadeia de polimerase (PCR) de DNA genômico derivados de tecido de calo de milho isolado previtos conter DNA de doador implantado no genoma, seguido por clonagem-padrão e análise de seqüência de produtos de ampliação de PCR. Métodos de geno- tipagem de PCR eram bem descritos (por exemplo, Rios, G. e outros (2002) Plant J. 32:243-253) e podem ser aplicados a derivados de DNA genômico de quaisquer espécies de planta ou tipo de tecido, incluindo culturas de célu- la.
Aquele versado na técnica pode planejar estratégias para geno- tipagem por PCR que incluem (mas não são limitadas a) ampliação de se- qüências específicas no genoma de planta, ampliação de múltiplas seqüên- cias específicas no genoma de planta, ampliação de seqüências não especí- ficas no genoma de planta, ou suas combinações. Ampliação pode ser se- guida por clonagem e sequenciação, como descrito nesse exemplo, ou por análise de seqüência direta de produtos de ampliação. Aquele versado na técnica poderia prever métodos alternativos para a análise do produtos de ampliação gerados aqui.
Em uma concretização descrita aqui, iniciadores de oligonucieo- tídeo específicos para o gene-alvo são empregados nas ampliações por PCR. Em uma outra concretização descrita aqui, iniciadores de oligonucleo- tídeo específicos para seqüências de DNA de doador são empregados nas ampliações por PCR. Uma outra concretização inclui uma combinação de iniciadores de oligonucleotídeo que se ligam tanto à seqüência de gene-alvo quanto seqüência de DNA de doador. Aquele versado na técnica pode pla- nejar combinações adicionais de iniciadores e reações de ampliação para interrogar o genoma.
A. Extração genômica de DNA
DNA genômico (gDNA) foi extraído a partir de células de milho, tolerantes a herbicida, isoladas descritas no exemplo 19 e utilizadas como modelo para as experiências de genotipagem de PCR. gDNA foi extraído a partir de cerca de 100-300 μΙ de volume de célula embalada (PCV) de calo de Hill tolerante a herbicida foi isolado como descrito acima de acordo com os protocolos do fabricante detalhados no kit de planta DNeasy® 96 (QIA- GEN Inc., Valencia, CA). DNA genômico foi eluído em 100 μΙ de tampão de eluição fornecido por kit que fornece concentrações finais de 20-200 ng/μΙ e subseqüentemente analisadas através da métodos de genotipagem à base de PCR delineado abaixo. Β. Projeto de iniciador para a genotipagem de PCR Aquele versado na técnica deve usar uma variedade de estraté- gias para o projeto e implementação de genotipagem à base de PCR. Inicia- dores de oligonucleotídeo projetados para anelar para o alvo de gene, se- qüências de DNA de doador e/ou combinações dos dois são viáveis. A fim de projetar iniciadores de oligonucleotídeo que podem anelar para o alvo de gene de IPP2K em regiões não incluídas pelos flancos de homologia cons- truídos nas moléculas de DNA de doador, clones de plasmídio contendo da- dos de sequência-alvo de gene adicionais foram caracterizados através da sequenciação de DNA. Reações de sequenciação de fita dupla de clones de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ(TM) DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-se cartuchos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de seqüência foram analisadas em um sistema de aná- lise de DNA Beckman-Coulter CEQ® 2000 XL e caracterização de nucleotí- deo realizada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporati- on, Ann Arbor, Ml). Essas seqüências correspem quem a regiões do gene de IPP2K a montante (5'-) e a jusante (3'-) das regiões direcionadas de ZFN e são descritas na Figura 91 (SEQ ID NO: 141) e Figura 92 (SEQ ID NO: 142).
Nos exemplos apresentados aqui, todos os iniciadores de oligo- nucleotídeo foram sintetizados por tecnologias de DNA integradas, Inc. (Co- ralville, IA) sob condições de dessalinização padrão e foram diluídos com água para dar uma concentração de 100 μΜ. O seguinte conjunto de inicia- dores de oligonucleotídeo forward e reverso foram projetados para anelar para seqüências de gDNA específicas para o alvo de gene de IPP2K que está do lado de fora dos limites das seqüências de DNA de doador. Esses oligonucleotídeos são como se segue: 5'-
TGGACGGAGCGAGAGCCAGAATTCGACGCT G-3' (SEQ ID NO: 153) 5'- GTGCAAGAATGTATTGGGAATCAACCTGAT G-3' (SEQ ID NO: 154)
Um segundo conjunto de iniciadores de oligonucleotídeo forward e reverso foram também projetados para anelar para seqüência de gDNA específica para o alvo de gene de IPP2K do lado de fora dos limites das se- qüências de DNA de doador, ainda aninhada dentro do primeiro par: 5'- CTGTGGTACCAGTACTAGTACCAGCATC-S' (SEQ ID NO:155)
5'-TCT TGGATCAAGGCATCAAGC ATTCCAATCT-3' (SEQ ID
NO: 156)
Iniciadores de oligonucleotídeo forward e reverso foram adicio- nalmente projetados para anelar especificamente para DNA de doador que correspem que a região de codificação ao gene de tolerância a herbicida: 5'- TGGGTAACTGGCCTAACTGG-S' (SEQ ID NO: 157) 5'- TGGAAGGCTAGGAACGCTTA-S' (SEQ ID NO:158) 5'- CCAGTTAGGCCAGTTACCCA-S' (SEQ ID NO: 159) 5' TAAGCGTTCC- TAGCCTTCCA -3' (SEQ ID NO: 160)
C. DNA de doador - ampliação de PCR específica Reações de ampliação por PCR primárias foram realizadas u- sando-se reagentes providos por TaKaRa Biotechnology Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japão e consistiam nas seguintes: 2,5 μΙ de tampão 10X Ex Taq PCR®, 40-200 ng de modelo de fita dupla genômico DNA, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo forward de 10 μΜ de iniciador de oligonu- cleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA Ex Taq®. Reações de PCR foram realizadas usando-se um Bio-Rad, 96-amostras DNA Engine Tetrad2, cicli- zador térmico Peltier (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 3 min/l ciclo; 94°C 30 s, 64°C 30 s, 72°C 5 min/35 ciclos; 72°C, 10 min/1 ciclo; 4°C/suporte.
Produtos de ampliação da reação de PCR primária foram sub- seqüentemente reampliados em uma reação de PCR secundária compreen- dida dos seguintes: 2,5 μΙ de tampão 10 EX Taq PCR®, 2 μΙ de modelo (dilu- ição de 1:100 de reação de PCR de 1o em H20), 10 μΜ de iniciador de oli- gonucleotídeo forward, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA Ex Taq® Reações de PCR foram realizadas usando-se Bio-Rad, 96-amostras de DNA Engine Tetrad2, ciclizador térmico Peltier (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 95°C, 1 min/1 ciclo; 94°C 15 s, 610C 30 s, 72°C 30 s/30 ciclos; 72°C, 1 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Dez μΙ de cada produto ampliado foram eletroforetizados a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA Plus de 1 Kbp (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Produtos de PCR contendo o fragmento esperado foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA de 0,317 Kbp, como mostrado na FIGURA 82. Exemplo 21: Detecção de Eventos de integração direcionados
Dos eventos tolerantes a herbicida contendo uma molécula de DNA de doador integrada que codifica um cassete de gene de tolerância a herbicida, é esperado que alguma proporção dos ditos eventos são o produ- to de integração direcionada de DNA de doador no sítio do rompimento de fita dupla induzido por ZFN. A fim de diferenciar esses eventos de integração direcionados àqueles derivados de integração aleatória do cassete de gene de tolerância a herbicida, uma estratégia de genotipagem à base de PCR usando-se uma combinação de iniciadores de PCR específicos de genoma e específicos de genoma subsequentes mais específicos de doador foi utiliza- da.
A. Ampliação Específica de doador/específica de genoma/e ge- noma subsequente
Nessa concretização, reações de PCR primárias utilizaram inici- adores de oligonucleotídeo específicos para as regiões do alvo de gene de
IPP2K 3 mnntsmtp <=> a il !«santo Ha rpniãn Hq intanrarãr* Ha HooHor fr\r\r ovQrv>_
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pio, Figs. 92 e 93). Reações de ampliação por PCR primárias foram realiza- das usando-se reagentes providos por TaKaRa Biotechnology Inc, Seta 3-4- 1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japão e consistiam nas seguintes: 2,5 μΙ de tam- pão 10 EX Taq PCR®, 40-200 ng de modelo de gDNA de milho de fita dupla, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo forward, 10 μΜ de iniciador de oligo- nucleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de Ex Taq®DNA. Reações de PCR fo- ram realizadas usando-se Bio-Rad, 96-amostra DNA Engine Tetrad2, um ciclizador térmico Peltier (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 3 min/1 ciclo; 94°C 30 s, 64°C 30 s, 72°C 5 min/35 ciclos; 72°C, 10 min/1 ciclo; 4°C/suporte.
O produto de reação de PCR primário foi subseqüentemente di-
luído de 1:100 em H20 e usado como DNA de modelo para duas reações de PCR secundárias distintas. Nessa concretização, as reações secundárias utilizam iniciadores que se ligam na região genômica de IPP2K e a molécula de doador, originando um amplicon que varia o limite de integração entre genoma e doador. A primeira reação focalizada no limite 5' entre genoma e doador. A segunda reação focalizou no limite 3' entre doador e genoma. Ambas as reações consistiam nas seguintes: 2,5 μΙ de tampão 10 EX Taq PCR®, 2 μΙ de modelo [diluição de 1:100 de reação de PCR de 1o], 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo forward, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA Ex Taq®. Reações de PCR foram realiza- das usando-se Bio-Rad, 96-amostra DNA Engine Tetrad2, Peltier ciclizador térmico (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 3 min/1 ciclo; 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 2 min/35 ciclos; 72°C, 10 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Vinte μΙ de cada reação de PCR de 2o foram eletroforetizados a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%.
Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e ta- manho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA Plus de
1 Kbn Hnvitronfin I ifo Tfirhnolnnipc; HarkhaH Pror!. Hr>o Ho DrxR HorL
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vados de integração direcionada do doador no gene de IPP2K foram diag- nosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1,65 Kbp (limite 5') (FI- GURA 83) ou 1,99 Kbp (limite 3') (FIGURA 84). Esses fragmentos foram pu- rificados e foram extirpados com gel de acordo com as direções do fabrican- te usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram subseqüentemente clonados em plasmídio de pCR2.1 usando-se kit de clonagem TOPO Ta cloning® (com vetor de p- CR®2.1) e Células de E. coli quimicamente competente Shot® TOPIO (Invi- trogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com protocolo do fabri- cante.
Colônias individuais foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transfe- rido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobre- nadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades Eco Rl (New England Biolabs, Beverly, MA). Todas as digestões de plasmídio foram incubadas por 1 ha 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visua- lizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA Plus de 1 Kbp (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).
Clones de plasmídio esperados foram diagnosticados pela pre- sença de fragmentos de DNA inseridos do tamanho apropriado além do ve- tor de pCR®2.1 de 3,9 Kbp. Sequenciações de fita dupla de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ® DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-
se oartur.hOR rifi filtrarão Hp n<=»l Porfnrma DTR fFHno Rio.Qv/ctomc naithorc.
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burg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de se- qüência foram analisadas em um sistema de análise de DNA Beckman- Coulter CEQ® 2000 XL e caracterização de nucleotídeo realizada usando-se Sequencher versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Alinha- mentos de nucleotídeo foram realizados usando-se Vetor NTi versão 10.1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Análise de dados de seqüência de um evento de integração di- recionado (evento N°073) foi conduzida como se segue. Produtos de PCR primários que variam o sítio de integração total do genoma foram submeti- dos à ampliação secundária focalizada ou no limite 5' ou no limite 3' entre genoma e doador. Alinhamento de fragmentos clonados que correspem que a esses produtos de ampliação secundários com a seqüência genômica de IPP2K de tipo selvagem bem como a seqüência esperada do evento de inte- gração direcionada claramente indicava que a integração de DNA de doador precisa no sítio-alvo ocorreu.
Seqüência de nucleotídeos do local genômico de IPP2K, o limite de doador/genoma, a seqüência de nucleotídeos das regiões de doador que correspem que a flancos de homologia de IPPK2 e a seqüência de nucleotí- deos do cassete de tolerância a herbicida foram todos conservados em múl- tiplos produtos de PCR clonados derivados desse evento. Portanto, esse evento representou um genoma em que reparo dirigido por homologia de um rompimento de fita dupla mediado por ZFN e integração direcionada de um DNA de doador em um alvo de gene específico ocorreu. Eventos transfor- mados adicionais que representam ocorrências de integração direcionadas simples foram obtidas, demonstrando que os métodos ensinados aqui são reproduzíveis no calo de milho. Aquele versado na técnica deve aplicar es- ses métodos a qualquer alvo de gene em qualquer espécie de planta para a qual integração direcionada é julgada desejável.
B. Ampliação específica de doador/genoma aninhada
Nessa concretização, tanto reações de PCR subsequentes se- cundárias quanto primárias utilizaram Iniciadores de oligonucleotídeo especí- ficas para as regiões do alvo de gene de IPP2K a montante ou a jusante da região de integração de doador (apêndices V e VI) em combinação com ini- ciadores de oligonucleotídeo específicos para a seqüência de doador. Nesse exemplo, ampliação primária por reações de PCR foi realizada usando-se reagentes providos por TaKaRa Biotechnology Inc., Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japão que consistiam nos seguintes: 2,5 μΙ de tampão 10x Ex Taq PCR®, 40-200 ng de modelo de gDNA de milho de fita dupla, 10 μΜ de oligonucleotídeo forward, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA Ex Taq®. Reações de PCR foram incubadas usando-se a Bio-Rad, 96-amostras de DNA Engine Tetrad2, ciclizador térmico Peltier (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 3 min/1 ciclo; 94°C 30 s, 52°C ou 64°C 30 s, 72°C 2 min/35 ciclos; 72°C, 10 min/1 ciclo; 4°C/su porte.
A reação de PCR primária foi então diluída 1:100 em H20 e u- sada como DNA de modelo para uma reação de PCR secundária. Nessa concretização, as reações secundárias também utilizam iniciadores que li- gam na região genômica de IPP2K e a molécula de doador, surgindo um amplicon que varia o limite de integração entre genoma e doador. Os inicia- dores específicos usados determinam se a ampliação é focalizada ou no limite 5' ou 3' entre genoma e doador. Reagentes para essas reações con- sistiam nas seguintes: 2,5 μΙ de tampão 10x Ex Taq PCR®, 2 μΙ de modelo [diluição de 1:100 de reação de PCR de 1o], 10 μΜ de iniciador de oligonu- cleotídeo forward, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 2 μΙ de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16 μΙ de H20, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de po- limerase de DNA Ex Taq®. Reações de PCR foram realizadas usando-se um Bio-Rad, 96-amostra DNA Engine Tetrad2, ciclizador térmico Peltier (Hercu- les, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94°C, 3 min/1 ciclo; 94°C 30 s, 54°C ou 60°C 30 s, 72°C 2 min/35 ciclos; 72°C, 10 min/1 ciclo; 4°C/suporte. Vinte μΙ de cada reação de PCR de 2o forameletroforetizados a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%.
Fragmentos ampliados foram visualizados com luz de UV e ta- manho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 Kbp PIus (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Produtos de PCR derivados de integração direcionada do doador no gene de IPP2K foram di- agnosticados pela presença de fragmentos de DNA de 1,35 Kbp (limite 5') (FIGURA 85) ou 1,66 Kbp (limite 3') (FIGURA 86). Esses fragmentos foram purificados e foram extirpados com gel de acordo com as direções do fabri- cante usando-se Kit de extração de gel QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram subseqüentemente clonados em plasmí- dio de pCR2.1 usando-se kit TOPO Ta cloning(R) (com vetor de pCR(R)® 2.1) e Células de E. coli quimicamente competentes One® Shot® TOPIO (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com protocolo do fabricante.
C. Análise de seqüência de nucleotídeos de produtos de PCR de genotipagem
Colônias individuais descritas no exemplo 21B foram inoculadas para dentro de um tubo Falcon de 14 ml (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) contendo 2 ml de TB suplementado com 50 μΙ/ml de canamicina e foram incubadas por 16 h a 37°C com agitação a 200 rpm. Após incubação, 1,5 ml de células foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml de cos- tar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foi transformado em péletes a 16.000 χ g por 1 min. Sobrenadante foi removido e DNA de plasmídio foi isolado como descrito acima usando-se kit de plasmídio NucleoSpin® (BD Bioscien- ces/Clontech/Macherey-Nagel, Palo Alto, CA). Três μg de plasmídio isolado foram digeridos com 10 unidades Eco Rl (New England Biolabs, Beverly, MA). Todas as digestões de plasmídio foram incubadas por 1 h a 37°C. DNA restrito foi eletroforetizado a 100 V por 1 h em um gel de agarose de TAE a 1,0% suplementado com brometo de etílio a 0,5%. Fragmentos foram visua- lizados com luz de UV e tamanho de fragmento estimado por comparação com escada de DNA de 1 Kbp Plus (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).
Clones de plasmídio foram diagnosticados pela presença de
fragmentos de DNA inseridos além do vetor de pCR®2.1 de 3,9 Kbp. Rea- ções de sequenciação de fita dupla de plasmídio foram realizadas como descrito pelo fabricante usando-se kit CEQ® DTCS-Quick Start (Beckman- Coulter, Palo Alto, CA). Reações foram purificadas usando-se cartuchos de filtração de gel Performa DTR (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) como descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de seqüência foram anali- sadas em um sistema de análise de DNA Beckman- Coulter CEQ® 2000 XL e caracterização de nucleotídeo realizada usando-se Sequencher® versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Alinhamentos de nucleotí- deo foram realizados usando-se Vetor NTi versão 10.1 (Invitrogen Life Tech- nologies, Carlsbad, CA).
Dados de seqüência que incluem o limite entre seqüência ge-
nômica IPP2K a montante (5') e DNA de doador derivado de múltiplos even- tos de integração direcionados foi também obtido, incluindo dados de se- qüência que incluem o limite entre DNA de doador e seqüência genômica de IPP2K a jusante (3') derivada de múltiplos eventos de integração direciona- dos bem como dados de seqüência incluindo sequências-limites a montante (5') derivadas de um evento de calo transformado simples (N°114). O evento de integração direcionado transformado (N°114) era o resultado da integra- ção de um doador autônomo no alvo de gene de IPP2K.
Nessas análises, tanto reações de ampliação por PCR primárias quanto secundárias focalizadas no Iimte 5' ou no limite 3' entre genoma e doador. Alinhamento de fragmentos clonados que correspem que a esses produtos de ampliação secundários com a seqüência genômica de IPP2K de tipo selvagem bem como a seqüência esperada do evento de integração direcionado revelaram que a integração de DNA de doador no sítio-alvo o- corrido. Seqüência de nucleotídeos do local genômico de IPP2K, o limite de doador/genoma, seqüência de nucleotídeos das regiões de doador que cor- respem que a flancos de homologia de IPPK2 e seqüência de nucleotídeos do cassete de tolerância a herbicida foram todos conservados em múltiplos produtos de PCR clonados derivados desse evento. Portanto, esse evento representa um genoma em que reparo di-
rigido por homologia de um rompimento de fita dupla mediado por ZFN em um alvo de gene específico ocorreu. Eventos transformados adicionais que representam ocorrências de integração direcionadas simples foram obtidas, demonstrando que os métodos ensinados aqui são reproduzíveis no calo de milho. Aquele versado na técnica deve aplicar esses métodos a qualquer alvo de gene em qualquer espécie de planta para a qual integração direcio- nada é julgada desejável. Exemplo 22: Regeração de plantas fertéis, intactas a partir de tecido de calo de milho
Calos isolados de células de milho tolerantes a herbicida deriva- dos de cultura de célula de Hill podem ser regenerados para dentro de plan- tas de milho fertéis, intactas. Aquele versado na técnica deve regenerar plantas de milho fertéis, intactas a partir de uma variedade de culturas de células de milhos embriogênicas.
Nesse exemplo, regeração de calos de Hill resistentes a bialo- phos foi iniciada por transferência de tecido de calo isolado para um meio de indução de base de citocinina, 28 (1H), contendo sais de MS e vitaminas, 30,0 g/L de sacarose, 5 mg/L de benzilaminopurina, 0,25 mg/L de 2,4-D, 1 mg/L de bialaphos, e 2,5 g/L de Gelrite; pH 5,7. Células foram deixadas se desenvolver em pouca luz (13 μΕιη-25-Ι) por uma semana seguido por trans- ferência para condições de luz mais alta (40 ^Em-2s-l) por uma semana. Células foram então transferidas para o meio de regeneração, 36 (1H), que é idêntico ao meio de indução exceto que ele carece de reguladores de cres- cimento de planta. Plantinhas pequenas (3-5 cm) foram extirpadas com fer- ramentas manuais e foram colocadas em tubos de cultura de vidro 150 χ 25- mm estéreis contendo meio de SHGA (Schenk e Hildebrandt basal salts and vitamins, 1972, Can. J. Bot 50:199-204; 1 g/L de mioinositol, 10 g/L de saca- rose, 2,0 g/L de Gelrite, pH 5,8).
Uma vez que plantinhas de desenvolveram um sistema de broto ou raiz diferenciado e suficientemente grande, elas foram transplantadas em potes de 10,16 cm (4 polegada) contendo meio de desenvolvimento de Me- tro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture Canada Ltd.) e foram colocados em uma estufa. As plantinhas foram totalmente ou parcialmente cobertas com xícaras de plástico claras por 2-7 dias, então foram transplantas para potes de 18.925L (5 galões) contendo uma mistura que consiste em 95% de meio de crescimento de Metro-Mix 360 e 5% de solo de argila/marga e desenvolvida até maturidade. Plantas podem ser autopolinizadas ou cruzadamente polini- zadas com uma linha congênita a fim de produzir semente de T1 ou F1, res- pectivamente. Aquele versado na técnica poderia auto-polinizar plantas re- generadas ou cruzadamente polininzar plantas regeneradas com uma varie- dade de gimnospermas a fim de permitir que milho se produza.
Informação adicional relacionada à clivagem direcionada, re- combinação direcionada e integração direcionada podem ser encontradas nas publicações de patente US-2003-0232410; US-2005-0026157; US-2005- 0064474; US-2005- 0208489; e US-2006-0188987; e nos pedidos de patente U.S. No. de série 11/493.423, depositado em 26 de julho de 2006, cujas descrições são incorporadas por referência em suas totalidades para todas as finalidades.
Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencio- nados aqui são incorporados por referência, em sua totalidade, para todas as finalidades.
Embora descrição fosse provida em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para as finalidades de claridade de entendimento, esta- rá evidente por aqueles versados na técnica que várias mudanças e modifi- cações podem ser praticadas sem se afastar do espírito ou escopo da des- crição. Correspem quentemente, os exemplos e descrições expostos acima não seriam interpretados como limitantes. Listagem de Seqüência
<110> "Cai, Qi hua C
Mil ler, Deffrey Urnov, Fyodor shukla, vipula κ petolino, Joseph F Baker, Lisa w Garrison, Robbi 3 Blue, Ryan C Mitchell, Jon C Arnold, Nicole L Worden, Sarah E
<120> Proteínas de dedo de zinco não-cônicas otimizadas
<130> 8325-4002.40
<140> PCT/US2007/025455 <141> 2007-12-13
<150> 60/874,911 <151> 2006-12-14
<150> 60/932,497 <151> 2007-05-30
<160> 199
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa = qualquer aminoácido xaa pode estar presente ou ausente
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(18)
<223> xaa = qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20).. (22)
<223> xaa = qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(24)
<223> Xaa = qualquer aminoácido
Xaa pode estar presente ou ausente
<400> 1
cys Xaa Xaa xaa xaa Cys Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa 10 15
xaa xaa His xaa xaa xaa xaa xaa His 20 25
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<22Β> Motivo de dedo de zinco
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = qualquer aminoácido Ca, k, ou T são preferidos) <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = qualquer aminoácido (Q, E, ou R são preferidos) <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> xaa = qualquer aminoácido (G is preferred)
<400> 2
His Xaa Xaa Arg Cys Xaa 1 5
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> Xaa = qualquer aminoácido xaa pode estar presente ou ausente
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(18)
<223> xaa = qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(22)
<223> xaa = qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(24)
<223> xaa = qualquer aminoácido xaa pode estar presente ou ausente
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> xaa = qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (27).. (35)
<223> Xaa = qualquer aminoácido Xaa pode estar presente ou ausente
<400> 3
Cys xaa xaa Xaa xaa Cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa 10 15
Xaa xaa His xaa xaa xaa xaa xaa Cys Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30
Xaa Xaa xaa 35
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<22 3> Ligante de ZC
<400> 4
Gly Leu Arg Gly Ser 1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Ligante de ZC
<400> 5
Gly Gly Leu Arg Gly Ser 1 5
<210> 6
<211> 1199
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 6
atggagatgg atggggttct gcaagccgcg gatgccaagg actgggttta caagggggaa 60 ggcgccgcga atctcatcct cagctacacc ggctcgtcgc cctccatggt aagcgctgag 120 taggttctta ctgagcgtgc acgcatcgat cacttgactt taggggctca atgtgtgatt 180 cacgggtgcc gcggcgccat tcgagctcca gatccagtac cgctcgagca agtgataaaa 240 catggagcag ggacgatcac gtggtcactt gaaaattacg tgaggtccgg ggcgacgatg 300 tacggcgcgg cgaactctca aacactcaca caaccaaaac cgcttcgtgt tcgtctttgt 360 tccaagcgac tgtgtgagtg tttgagagtt cgccagcgcg acatcgcccg atctgacaaa 420 ttaagctttc gttgcttttc catgattgtg cattttgtga gcatgcactg aatactatga 480 tggatatgtt tggaggaagc attattccaa tttgatgata agggtgttat ttacacttgt 540 tttcagcttg gcaaggtact gcggctcaag aagattctaa aaaacaagtc gcagcgggca 600 ccgagttgta ttgtattctc aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cccagaactg 660 gttgagtcgg tcaaacaaga ttgcttggct caagcctatg cagtgcatgt tatgagccaa 720 cacctgggtg ccaatcatgt cgatggtggg gtatggttca gattcagttc atttatgtcc 780 tgttattgtg attttgattg gtaacatatt gacaacctcg acacttggga tcagattcag 840 ttcacttatg gaagaaattg gagaattgtt ataatttatc tataatcacc cctactgaaa 900 tagaaataac atggcatcaa tgtgcatgct attggatttt gacacgaata tgctttattc 960 tatcatatgt tggtaattcc agcaggcagc aggcactact ctttggatcc acgtgacttg 1020 acaaagaaat catgccatct ttccacaatg caggtccgtg tacgtgtttc tagggatttt 1080 ctggagcttg tcgaaaagaa tgttcttagc agccgtcctg ctgggagagt aaatgcaagt 1140 tcaattgata acactgctga tgccgctctt ctaatagcag accactcttt attttctgg 1199 <210> 7 mays <211> 50 <212> DNA <213> zea <400> 7 ggggccatat cccagaactg gttgagtcgg tcaaacaaga 50 caactcctgt <210> 8 mays <211> 12 <212> DNA <213> zea <400> 8 at 12 ctgtggggcc <210> 9 mays <211> 18 <212> DNA <213> zea <400> 9 tcagccag 18 cttgaccaac <210> 10 mays <211> 59 <212> DNA <213> zea <400> 10 caactcctgt ggggccatat cccagaactg gttgagtcgg tcaaacaag 59 aagtcatgag <210> 11 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> ZNF <223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por <400> 11 caactcctgt ggggccaaga actggttgag tcggtcaaac aag 53 aagtcatgag <210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 12
His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai ίο
<210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> Motivo de dedo <400> 13 His Thr Lys Ile Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val I 5 10
<210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 14 His Thr Lys Gly Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val I 5 10
<210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 15 His Thr Lys Ala Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 16 His Thr Lys Val Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 17 His Thr Lys Leu Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 18
His Thr Lys Ser Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 19 His Thr Lys Asn cys Leu Arg Gly ser Gln Leu vai
10
1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo de zinco <400> 20 His Thr Lys Lys Cys Leu Arg Gly 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> Motivo de dedo de zinco <400> 21 His Thr Lys Arg Cys Leu Arg Gly 1 5 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo de zinco <400> 22 His Thr Lys Ile Gly Gly Cys Leu 1 5 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo de zinco 10
10
10
<400> 23 His Thr Lys Ile Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai
I 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 24
His Thr Lys Ile Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai 10
<210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 25 His Thr Lys Ile Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai 1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 26
His Thr Lys Ile Gly Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 27
His Leu Lys Gly Asn Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 28 His Leu Lys Gly Asn Cys Pro Ala Gly Ser Gln Leu vai 10
<210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 29
His Ser Glu Gly Gly Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 30
His Ser Glu Gly Gly Cys Pro Gly Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 31
His Ser Ser Ser Asn Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 32
His ser Ser Ser Asn Cys Thr Ile Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 33 His Thr Lys Ile Cys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 34
DH
His Thr Lys Ile Gly Cys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val
10 15
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 35
His Thr Lys Ile Gly Gly Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 36
His Thr Lys Ile Gly Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 37
His Thr Lys Ile Gly Gly Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 38
His Thr Lys Arg Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 39
His Thr Lys Arg Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 <210> 40 -
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 40
His Thr Lys Arg Cys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 41 His Thr Lys Arg Gly Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 42 His Thr Lys Arg Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 43 His Thr Lys Arg Gly Cj 1 5 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 44 His Thr Lys Arg Gly Cj 1 5 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial 15
15 <220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 45
His Thr Lys Arg Gly Gly Cys Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 15 10
<210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 46 His Thr Lys Arg Gly Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 15 10 15
<210> 47 <211> 16 <212> PRT • <213> Artificial <220> ' <22 3> Motivo de dedo <400> 47 His Thr Lys Arg Gly Gly Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 15 10 15
<210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 48 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai 15 10
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 49
His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 15 10 15
<210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 50 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Gly Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 15
<210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artifi ci al <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 51 His Lys Glu Arg Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artifi ci al <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 52 His Thr Arg Arg Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> Motivo de dedo <400> 53 His Ala Gln Arg Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 54 His Lys Lys Phe Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 55 His Lys Lys His Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 56
His Lys Lys Tyr Thr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 57
His Lys Lys Tyr Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 58 His Lys Gln Tyr Tyr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 59
His Leu Leu Lys Lys Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10
<210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 60 His Gln Lys Phe Pro Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 61 His Gln Lys Lys Leu Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val
10
<210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> Motivo de dedo <400> 62 His Gln Ile Arg Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 63 His Ile Lys Arg Gln Ser Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 64 His Ile Arg Arg Tyr Thr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 65
His Ile Ser Ser Lys Lys Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 66 His Lys Ile Gln Lys Ala Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> '67
His Lys Arg Ile Tyr Thr Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 68 His Leu Lys Gly Gln Asn Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 69 His Leu Lys Lys Asp Gly Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10 15
<210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> Motivo de dedo <400> 70 His Leu Lys Tyr Thr Pro Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu vai 10 15
<210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo de zinco <400> 71 His Thr Lys Arg Cys Gly Arg Gly Ser Gln 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo de zinco <400> 72
His Thr Lys Ile Gly Cys Gly Gly Arg Gly Ser Gln Leu Val
10
<210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 73 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 74 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val I 5 10
<210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo <400> 75 His Ile Arg Thr Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro I 5 10
<210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 76 His Ile Arg Thr Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 77 His Ile Arg Thr Gly Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10 <210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 78
His Ile Arg Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 79 His Ile Arg Arg Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 80 His Ile Arg Arg Gly Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo <400> 81 His Thr Lys Ile His Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10
<210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <22 3> Motivo de dedo <400> 82 His Thr Lys Ile Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<22Β> Motivo de dedo de zinco <400> 83
His Thr Lys Arg Cys Thr Gly ser Gln Lys Pro 10
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 84
His Ala Gln Arg Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 85
His Thr Lys Ile Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 86
His Thr Lys Arg Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 87
<211> 12
<212> prt
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 87
His Ala Gln Arg Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 88
His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<21-3> Arti f i ci al
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 89
His Ala Gln Arg Cys Gly Gly 1 5
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 90
His Ala Gln Arg Cys Gly Gly Gly 1 5
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 91
His Thr Lys Ile Cys Gly Gly Gly 1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 92
His Thr Lys Arg Cys Gly Gly Gly 1 5
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 93
His Ala Gln Arg Cys Gly 1 5
<210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 94
Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 95
Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5
<210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo de zinco <400> 96 Cys Cys ; His Thr Lys Ile Cys 1 5 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Motivo de dedo de zinco <400> 97 Cys Cys ; His Thr Lys Arg Cys Gly 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artifi ciai <220> <22 3> Motivo de dedo de zinco <400> 98 Cys Cys His Ala Gln Arg Cys Gly 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <2 2 3> Motivo de dedo de zinco 10
<400> 99 Gys Gys His Ile Arg Thr Gly Cys I 5
<210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> -Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco <400> 100
Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 101
Cys Cys His Ile Arg Thr Gly Cys 1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 102
Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Motivo de dedo de zinco
<400> 103
Cys Cys His Ala Gln Arg Cys Gly Gly 1 5
<210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador <400> 104 atggagatgg atggggttct gcaagccgc 29
<210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco <400> 105
Asp Arg ser Ala Leu Ser Arg 1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 106
Arg Asn Asp Asp Arg Lys Lys 1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 107
Arg Ser Asp Asn Leu Ser Thr 1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 108
His Ser His Ala Arg Ile Lys 1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 109
Arg Ser Asp vai Leu Ser Glu 1 5
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 110 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg I 5
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 111
Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 112
Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 113
Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 114
Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 115
Gln Ser Ala Thr Arg Lys Lys 1 5
<210> 116 <211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 116
Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg 1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 117
Arg Ser Asp Ala Leu Thr Gln 1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 118
Arg Ser Asp Ser Leu Ser Ala 1 5
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<22B> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 119
Arg Ser Ala Ala Leu Ala Arg 1 5
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 120
Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco <400> 121
Ala Ser Lys Thr Arg Thr Asn I 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 122
Asp Arg Ser His Leu Ala Arg
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 123
Arg ser Asp His Leu Ser Thr 1 5
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 124
Gln ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 125
Gln Asn His His Arg Ile Asn 1 5
<210> 126
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> domínio de ligação de dedo de zinco
<400> 126
Thr Gly Ser Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 127
<211> 7
<212> ERT
<213> Artificial
<220>
<223> dominio de ligação de dedo de zinco
<400> 127
Asp Arg Ser Ala Leu Ala Arg 1 5
<210> 128 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> sequência-alvo de dedo de zinco de IPP2K <223> <400> 128 18 gaactggttg agtcggtc <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> sequência-alvo de dedo de zi nco de IPP2K <223> <400> 129 18 gaactggttg agtcggtc <210> 130 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> Sequência-alvo de dedo de zi nco de IPP2K <223> <400> 130 12 atggccccac ag <210> 131 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> Sequência-alvo de dedo de zinco de IPP2K <223> <400> 131 15 ggcacccagg tgttg <210> 132 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> Sequência-alvo de dedo de zinco de IPP2K <223> <400> 132 18 gtcgatggtg gggtatgg <210> 133 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> NLS derivado de milho ορ-2 <400> 133
Arg Lys Arg Lys Glu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Tyr 10 15
Arg Lys
<210> 134
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de 2α oriunda do vírus Thosea asigna <400> 134
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 10 15
Gly Pro
<210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 135 ggaagcatta ttccaatttg <210> 136 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> i ni ci ador <400> 136 cccaagtgtc gaggttgtca <210> 137 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador <400> 137 30
29
ssscaccaag ttgtattgcc ttctca 26
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> iniciador
<400> 138
sssataggct tgagccaagc aatctt 26
<210> 139
<211> 855
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de flanco de homologia 2' na posição 1
<400> 139
gcggccgcta gatagcagat gcagattgct tgcttctctg gtttgatttt tggagtcacc 60 atttctgttt ggttcgtgtg cctcagtgtc tgacagcagc agatcctcga tggagatgga 120 tggggttctg caagccgcgg atgccaagga ctgggtttac aagggggaag gcgccgcgaa 180 tctcatcctc agctacaccg gcacgtcgcc ctccatggta agcgctgagt aggttcttac 240 tgagtgtgca cgcatcgatc acttgacttt aggggctcaa tgtgtgattc acgggtgccg 300 ccattcgagc tccagatcca gtatcgctcg agcaagtgat aaaacatgga gcagggacga 360 tcacgtggtc acttgaaaat tatgtgaggt ccggggcgac gatgtacggc gcggcgaact 420 ctcaaacact cacacagcca aaaccgcttc gtgttcgtct ttgttccaag cgaccgtgtg 480 gtgtgtttgt agtagttcgc cggcgccgca catcgtcgcc ccggatctga caaattaagc 540 tttcgttgct tttccacgat tgtgcatttt ctgagcatgc actgaatact atgatggata 600 tgtttggagg aagcattatt ccaatttgat gataatggtg ttatttacac ttgttttcag 660 cttggcaagg tactgcggct caagaagatt ctaaaaaaca agttgcagcg ggcaccaagt 720 tgtattgcct tctcaagtca tgagcaactc ctgtggggcc atatcccaga actggttgag 780 tcggtcaaac aagattgctt ggctcaagcc tatgcagtgc atgttatgag ccaacacctg 840 ggtgccaata ctagt 855 <210> 140
<211> 845
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de flanco de homologia 3' na posição 2 <400> 140
actagtcatg tcgatggtgg ggtatggttc agattcagtt catttatgtc ctgttattgt 60
gattttgatt ggtaacatat tgacaacctc gacacttggg atcagattca gttcacttat 120
ggaagaaatt ggagaattgt gataatttat ctataatcac ccctactgaa atagaaataa 180
catgacatca atgtgcatgc tattggattt tgacacgaat atgctttatt ctatcatatg 240
ttggtaattc cagcaggcag caggcactac tctttggatc cacgtgactt gacaaagaaa 300
tcatgccatc tttccacaat gcaggtccgt gtacgtgttt ctagggattt tctggagctt 360
gtcgaaaaga atgttcttag cagccgtcct gctgggagag taaatgcaag ttcaattgat 420
aacactgctg atgccgctct tctaatagca gaccactctt tattttctgg tacgtactct 480
atccctcttc ttaccataat ctgaatcttg ttaaggttta aaatatacga ttgattaagt 540
aaaatccaga gctctattca tatctcacgc actgatgttt tgatgaaacg cttgcagcaa 600 gacggttgcc tgttatttct atttgcatta gacaaacagt cacctttgtt tataaaggtc 660 tttgaatttg cagttcttat aggtttaagt ttgcaactgt tacttacaac agcccaatgg 720 gtagcatcaa gattgttttt ttcagtgatt cataacttaa ctcttggtta aaccgctaga 780 acatggttgg tgtcttaaaa tgcaactggt cctgaggccg taacctgaaa tcattgtacg 840 tcgac 845 <210> 141 <211> 484 <212> DNA <213> Artificial <220> <22Β> Seqüência genômica de IPP2L 5' a montante das regiões <400> 141 gagagccaga attcgacgct ggcggcggcg cgtcgccaat acgcagcgcg 60 tggacggagc gatgtggagc cacatgcaaa cgtgtgtccg cccgcgtggc gtccactctc cctccacgtt 120 tcggcgtcct cgtcgccttc ctgggaaatc tccagctact gcccactgcc CCttCCCttC 180 agtccctttc cccgggctgt ggtaccagta ctagtaccag catctcttca ggctccacca 240 agcgcagaca ccgcagcagc ggcagcagca cgatccggtg accccccgcc gcgtccagcc 300 tgctcctccg gtgatcgccg gactggcggg gtaggaacca gcggagcgca gcccgcctcc 360 ttccgctggt aagagtgacg cccgcccgct cctcccttcg ctcgcttcct tgctcttccg 420 attctggcgt accagtctca ccgcggcttg gggatttgat gcggagctag ttaaccagca 480 gagc 484 <210> 142 i fi ci al <211> 729 <212> DNA <213> Arti <220> <223> Sequencia genômica de IPP2K 3' a jusante das regiões direcionadas ( ZNF <400> 142 tcagtgattc ataacttaac tcttggttaa accgctagaa catggttggt 60 attgtttttt gtcttaaaat gcaactggtc ctgaggccgt aacctgaaat cattgtactt ttctctcatt 120 tctttagata tttccaaaac tctacattag atgatttatg tttgcttact tagtctttct 180 taatctcagg caatcctaag ggtagcagct gcatagctgt agagataaag gtactttgca 240 agcttcctct tttattctta tttttcattt cttatgtata tttctcctca accatttgac 300 ttcttttcgg catgctctac cttgcaggcc aaatgtgggt ttctgccatc atcagaatat 360 atatcagaag ataatactat caagaaacta gtaacgagat ataagatgca tcagcacctc 420 aaattttatc agggtgaggt gtgtagattg gaatgcttga tgccttgatc caagataaaa 480 ttccactctc ttttgcgcac ttaaaaaaca tccatcgatg atacaaactt gatcaaaata 540 ccttaaggct tgttatttac ggcactgttg taatattata ccgtctcttg ctttttgaca 600 tcaggttgat tcccaataca ttcttgcaca catttcagat atcgaagact agtgagtaca 660 atcctcttga tctattttct gggtcaaaag agagaatatg catggccatc aagtcccttt 720 tctcaactc 729 <210> 143 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> i ni ci ador <400> 143 gcggccgcgt ctcaccgcgg cttggggatt ggatacggag ct 42
<210> 144 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 144 actagtgata tggccccaca ggagttgctc atgacttg 38
<210> 145 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> i ni ci ador <400> 145 actagtccag aactggttga gtcggtcaaa caagattgct 40
<210> 146 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> i ni ci ador <400> 146 gtcgaccttg atgctaccca <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Arti fici al <220> <22 3> iniciador <400> 147 gcggccgcta gatagcagat <210> 148 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador 32
30
<400> 148
actagtattg gcacccaggt gttggctca 29
<210> 149
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> iniciador <400> 149
actagtcatg tcgatggtgg ggtatggttc agattcag 38
<210> 150 <211> 37 <212> DNA <213> Arti fici al <220> <223> i ni ci ador <400> 150 gtcgacgtac aatgatttca ggttacggcc tcaggac 37
<210> 151 <211> 41 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <223> iniciador <400> 151 actagttaac tgacctcact cgaggtcatt catatgcttg a 41
<210> 152 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador <400> 152 actagtgtga attcagcact taaagatct 29
<210> 153 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 153 actagtggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta ggatggcttc tccggagagg agaccagttg a 101
<210> 154 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> i ni ci ador <400> 154 actagtatgc atgtgaattc agcacttaaa gatct 35
<210> 155
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220> <223> iniciador <400> 155
ctgtggtacc agtactagta ccagcatc 28
<210> 156 <211> 31 * <212> DNA <213> Artificial <220> <2 2 3> i ni ci ador <400> 156 tcttggatca aggcatcaag <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 157 tgggtaactg gcctaactgg <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador <400> 158 tggaaggcta ggaacgctta <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <2 2 3> i ni ci ador <400> 159 ccagttaggc cagttaccca <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador 31
20
20
20
<400> 160
taagcgttcc tagccttcca 20
<210> 161
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador <400> 161
cttggcaagg tactgcggct caagaagatt c 31 <210> 162 <21*1> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> i ni ci ador <22 3> <400> 162 aaggac 26 atgaagaaag acagggaatg <210> 163 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> iniciador <223> <400> 163 aaggaccgcc ac 32 atgaagaaag acagggaatg <210> 164 <211> 28 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> i ni ci ador <223> <400> 164 tgtagctg 28 catggagggc gacgagccgg <210> 165 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> iniciador <223> <400> 165 ggtgttg ' 27 atcgacatga ttggcaccca <210> 166 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> iniciador <22 3> <400> 166 tccctagaaa c 31 tttcgacaag ctccagaaaa <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> iniciador <22 3> <400> 167 acaagctcca gaaaatccct agaaacac 28
<210> 168 <211> 32 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <2 2 3> i ni ci ador <400> 168 ttcgacaagc tccagaaaat <210> 169 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador <400> 169 tgctaagaac attcttttcg <210> 170 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> i ni ci ador <400> 170 gaacattctt ttcgacaagc <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <22 3> iniciador <400> 171 32
29
32
tggacggagc gagagccaga attcgacgct 30
<210> 172 <211> 31 <212> DNA <213> Arti fi ci al <220> <2 2 3> i ni ci ador <400> 172 gtgcaagaat gtattgggaa tcaacctgat g 31
<210> 173
<211> 59
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 173
aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cccagaactg gttgagtcgg tcaaacaag 59
<210> 174
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 174 aagtcatgag caactcctgt ggggccaaga actggttgag tcggtcaaac aag 53
<210> 175
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 175
aagtcatgag caactcctgt ggggccataa gaactggttg agtcggtcaa acaag 55
<210> 176
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 176
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 177
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 177
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56
<210> 178
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 178
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 179
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 179
aagtcatgag caactcctgt ggggccagaa ctggttgagt cggtcaaaca ag 52
<210> 180
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 180
aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 181 <211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 181
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 182
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 182
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 183
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 183
aagtcatgag caactcctgg tggggccata cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 184
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 184
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 185
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 185
aagcatgagc aactcctgtg gggccataga actggttgag tcggtcaaac aag 53
<210> 186
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 186
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56
<210> 187
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> seqüência de gene de ΠΡΡ2Κ de milho com mutuação mediada por znf <400> 187
aagtcatgag caactcctgt ggggccstait cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 188
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de 3PP’2k de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 188
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 189
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de ΙΡΡ,2ε de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 189
aagtcatgag caactcctgt ggggccaca<g aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 190
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de EPP2IC de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 190
aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 191
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de EPP2IC de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 191
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 192
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de EPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 192
aagtcatgag caactcctgt ggggccaitag ;aactggttga gtcggtcaaa caag 54
<210> 193
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> seqüência de gene de lí»p2k de milho com mutuação mediada por znf
<400> 193 aagtcatgag caactcctgt ggggccataa gaactggttg agtcggtcaa acaag 55
<210> 194
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de ipp2k de milho com mutuação mediada por znf
<400> 194
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56
<210> 195
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 195
aagtcatgag caactcctgt ggggccatat agaactggtt gagtcggtca aacaag 56
<210> 196
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 196
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56
<210> 197
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de gene de IPP2K de milho com mutuação mediada por ZNF
<400> 197
aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57
<210> 198
<211> 821
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de flanco de homologia 5' na posição 1
<400> 198
gcggccgcgt ctcaccgcgg cttggggatt ggatacggag ctagttaacc agcagagcta 60
gatagcagac gcagatcgct tgcttctctg gtttgatttt tggagtcacc atttctgttt 120
ggttcgtgtg cctcagtgtc tgacagcagc agatcctcga tggagatgga tggggttctg 180
caagccgcgg atgccaagga ctgggtttac aagggggaag gcgccgcgaa tctcatcctc 240
agctacaccg gcacgtcgcc ctccatggta agcgctgagt aggttcttac tgagtgtgca 300
cgcatcgatc acttgacttt aggggctcaa tgtgtgattc acgggtgccg ccattcgagc 360
tccagatcca gtatcgctcg agcaagtgat aaaacatgga gcagggacga tcacgtggtc 420
acttgaaaat tatgtgaggt ccggggcgac gatgtacggc gcggcgaact ctcaaacact 480 cacacagcca aaaccgcttc gtgttcgtct ttgttccaag cgaccgtgtg gtgtgtttgt 540 agtagttcgc cggcgccgca catcgtcgcc ccggatctga caaattaagc tttcgttgct 600 tttccacgat tgtgcatttt ctgagcatgc actgaatact atgatggata tgtttggagg 660 aagcattatt ccaatttgat gataatggtg ttatttacac ttgttttcag cttggcaagg 720 tactgcggct caagaagatt ctaaaaaaca agttgcagcg ggcaccaagt tgtattgcct 780 tctcaagtca tgagcaactc ctgtggggcc atatcactag t 821 <210> 199
<211> 821
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de flanco de homologia 2' na posição 1
<400> 199
actagtccag aactggttga gtcggtcaaa caagattgct tggctcaagc ctatgcagtg 60 catgttatga gccaacacct gggtgccaat catgtcgatg gtggggtatg gttcagattc 120 agttcattta tgtcctgtta ttgtgatttt gattggtaac atattgacaa cctcgacact 180 tgggatcaga ttcagttcac ttatggaaga aattggagaa ttgtgataat ttatctataa 240 tcacccctac tgaaatagaa ataacatgac atcaatgtgc atgctattgg attttgacac 300 gaatatgctt tattctatca tatgttggta attccagcag gcagcaggca ctactctttg 360 gatccacgtg acttgacaaa gaaatcatgc catctttcca caatgcaggt ccgtgtacgt 420 gtttctaggg attttctgga gcttgtcgaa aagaatgttc ttagcagccg tcctgctggg 480 agagtaaatg caagttcaat tgataacact gctgatgccg ctcttctaat agcagaccac 540 tctttatttt ctggtacgta ctctatccct cttcttacca taatctgaat cttgttaagg 600 tttaaaatat atgattgatt aagtaaaatc cagagctcta ttcatatctc acgcactgat 660 gttttgatga aacgcttgca gcaagacggt tgcctgttat ttctatttgc attagacaaa 720 cagtcacctt tgtttataaa ggtctttgaa tttgcagttc ttataggttt aagtttgcaa 780 ctgttactta caacagccca atgggtagca tcaaggtcga C 821

Claims (38)

1. Proteína de dedo de zinco compreendendo um dedo de zinco de não-canônico não-C2H2, em que o dedo de zinco não-canônico tem uma porção helicoidal envolvida na ligação de DNA e em que a região de coorde- nação de zinco da porção helicoidal compreende a seqüência de aminoáci- dos HX1X2RCXL (SEQ ID NO: 2); e em que a proteína de dedo de zinco é engenheirada para se ligar a uma sequência-alvo.
2. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 1, em que Xl é A e X2 é Q.
3. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 1, em que Xl é K e X2 é E.
4. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 1, em que Xl é T e X2 é R.
5. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que XL é G.
6. Uma proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que pelo menos um dedo de zinco compre- ende a seqüência Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-( XC)3-5-Cys-(XD)l-10 (SEQ ID NO:3), em que XA1 XB, XC e XD podem ser qualquer aminoácido.
7. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, compreendendo qualquer uma das seqüências mos- tradas em qualquer uma das tabelas 1, 2, 3 ou 4.
8. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer reivindi- cação 6 ou reivindicação 7, em que XD compreende a seqüência QLV ou QKP.
9. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 8, em que a seqüência QLV ou QKP são os 3 resíduos de aminoácidos C- terminais do dedo de zinco.
10. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, em que XD compreende 1, 2 ou 3 resíduos de Gly (G).
11. Proteína de dedo de zinco compreendendo uma pluralidade de dedos de zinco, em que pelo menos um dos dedos de zinco compreende um dedo de zinco de CCHC de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
12. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 11, em que a proteína de dedo de zinco compreende 3, 4, 5 ou 6 dedos de zinco
13. Proteína de dedo de zinco de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que dedo 2 compreende o dedo de zinco de CCHC.
14. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 13, em que o dedo de zinco C-terminal compreende o dedo de CCHC.
15. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 14, em que pelo menos dois dedos de zinco compre- endem o dedo de zinco de CCHC.
16. Proteína de dedo de zinco de acordo com qualquer uma das reivindicações de 11 a 15, em que a proteína de dedo de zinco compreende qualquer uma das seqüências mostradas na tabela 8 e é engenheirada para se ligar a uma sequência-alvo em um gene de IPP2-K.
17. Proteína de fusão compreendendo uma proteína de dedo de zinco como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, e um ou mais domínios funcionais.
18. Proteína de fusão compreendendo: (a) um semidomínio de clivagem, (b) a proteína de dedo de zinco como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, e (c) um Iigante de ZC interposto entre o semi- domínio de clivagem e a proteína de dedo de zinco.
19. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 18, em que o comprimento do Iigante de KC é 5 aminoácidos.
20. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 19, em que a seqüência de aminoácidos do Iigante de KC é GLRGS (SEQ ID NO: 4).
21. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 18, em que o comprimento do Iigante de KC é 6 aminoácidos.
22. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 21, em que a seqüência de aminoácidos do Iigante de KC é GGLRGS (SEQ ID NO: 5).
23. Polinucleotídeo que codifica uma proteína de dedo de zinco como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, ou uma prote- ína de fusão como definida em uma das reivindicações de 17 a 22.
24. Método para a clivagem direcionada de cromatina celular em uma célula de planta, o método compreendendo expressão, na célula, de um par de proteínas de fusão como definidas em qualquer uma das reivindica- ções de 18 a 22; em que: (a) as sequências-alvo das proteínas de fusão estão dentro de dez nucleotídeos entre si; e (b) as proteínas de fusão dimerizam e clivam DNA localizado en- tre as sequências-alvo.
25. Método de recombinação genética direcionada em uma célu- Ia de planta hospedeira, o método compreendendo: (a) expressão, na célula hospedeira, de um par de proteínas de fusão como definidas em qualquer uma das reivindicações de 18 a 22, em que as sequências-alvo das proteínas de fusão estão presentes em um Io- cal-alvo de hospedeiro escolhido; e (b) identificação de uma célula hospedei- ra recombinante que exibe uma alteração de seqüência no local-alvo do hospedeiro.
26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a alteração de seqüência é uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma deleção de material genético, uma inserção de material genético, uma substituição de material genético e qualquer sua combinação do mes- mo.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 26, ulteriormente compreendendo a introdução de um polinucleotídeo exógeno para dentro da célula hospedeira.
28.Método de acordo com a reivindicação 27, em que o polinu- cleotídeo exógeno compreende seqüências homólogas ao local-alvo do hos- pedeiro.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 28, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em um mono- cotiledônea, um dicotiledônea, gimnospermas e algas eucarióticas.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, batata, soja, toma- te, tabaco, membros da família de Brassica, e Arabidopsis.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 29, em que a planta é uma árvore.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 31, em que as sequências-alvo estão em um gene de IPP2K.
33. Método para a redução do nível de ácido fítico em sementes, o método compreendendo inativação ou alteração de um gene de IPP2-K como definido na reivindicação 32.
34. Método para a produção de fósforo mais metabolicamente disponível em semente, o método compreendendo inativação ou alteração de um gene de IPP2-K como definido na reivindicação 32.
35. Célula de planta compreendendo uma proteína de dedo de zinco como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações de 17 a 22, ou um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 23.
36. Célula de planta de acordo com a reivindicação 35, em que a célula é uma semente.
37. Célula de planta de acordo com a reivindicação 36, em que semente é uma semente de milho.
38. Célula de planta de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 35 a 37, em que IPP2-K é parcialmente ou totalmente inativado.
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