BRPI0720116A2 - Métodos para determinar e avaliar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, para identificar um marcador, para genotipar uma amostra de ácido nucléico, para avaliar um indivíduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapêutico, pra predizer o prognóstico de um indivíduo, para monitorar o progresso de um tratamento de um indivíduo, kit para avaliar a suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, uso de uma sonda de oligonucleotídeo, meio legível por computador, e, aparelho para determinar um indicador genético para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano. - Google Patents

Métodos para determinar e avaliar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, para identificar um marcador, para genotipar uma amostra de ácido nucléico, para avaliar um indivíduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapêutico, pra predizer o prognóstico de um indivíduo, para monitorar o progresso de um tratamento de um indivíduo, kit para avaliar a suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, uso de uma sonda de oligonucleotídeo, meio legível por computador, e, aparelho para determinar um indicador genético para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano. Download PDF

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Description

I “MÉTODOS PARA DETERMINAR E AVALIAR UMA SUSCETffiILIDADE À ARRITMIA CARDÍACA OU ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL EM UM INDIVÍDUO HUMANO, PARA IDENTIFICAR UM MARCADOR, PARA GENOTEPAR UMA AMOSTRA DE ÁCIDO NUCLEICO, PARA 5 AVALIAR UM INDIVÍDUO QUANTO A PROBABILIDADE DE RESPOSTA A UM AGENTE TERAPÊUTICO, PARA PREDIZER O PROGNÓSTICO DE UM INDIVÍDUO, PARA MONITORAR O PROGRESSO DE UM TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO, KIT PARA AVALIAR A SUSCETIBILIDADE À ARRITMIA CARDÍACA E/OU ACIDENTE 10 VASCULAR CEREBRAL EM UM INDIVÍDUO HUMANO, USO DE UM SONDA DE OLIGONUCLEOTÍDEO, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR, E, APARELHO PARA DETERMINAR UM INDICADOR GENÉTICO PARA A ARRITMIA CARDÍACA E/OU ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL EM UM INDIVÍDUO HUMANO”
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A arritmia cardíaca é um grupo de condições médicas, em que a atividade elétrica do coração é irregular ou é mais lenta ou mais rápida do que o normal. Algumas arritmias são ameaçadoras da vida e podem causar parada cardíaca ou morte súbita. Outras causam ou predispõem a outros 20 sintomas ou doença agravantes, incluindo o acidente vascular cerebral. A fibrilação é uma forma séria de arritmia, em que o músculo cardíaco se apresenta com movimento irregular ou tremor devido à falta de unidade na função das células contráteis. A fibrilação pode afetar o átrio (Fibrilação atrial (AF) ou Flúter atrial (AFI)) ou o ventrículo (Fibrilação Ventricular (VF)).
A fibrilação atrial (AF) é um ritmo cardíaco anormal (arritmia
cardíaca) que envolve as duas câmaras cardíacas pequenas, superiores (os átrios). As batidas cardíacas em um coração normal começam depois que a eletricidade gerada nos átrios pelo nodo sinoatrial se espalha através do coração e causa a contração do músculo cardíaco e bombeamento do sangue. Na AF, os impulsos elétricos regulares do nodo sinoatrial são substituídos pelos impulsos elétricos desorganizados, rápidos que resultam em batimentos cardíacos irregulares.
A fibrilação atrial é a arritmia cardíaca mais comum. O risco de desenvolver a fibrilação atrial aumenta com a idade - a AF afeta quatro por cento de indivíduos nos anos 80. Um indivíduo pode espontaneamente alternar entre AF e um ritmo normal (fibrilação atrial paroxismal) ou pode continuar com AF como o ritmo cardíaco dominante sem reversão para o ritmo normal (fibrilação atrial crônica). A fibrilação atrial é frequentemente assintomática, mas pode resultar em sintomas de palpitações, desmaio, dor no peito ou mesmo insuficiência cardíaca. Estes sintomas são especialmente comuns quando a fibrilação atrial resulta em uma frequência cardíaca que é muito rápida ou muito lenta. Além disso, o movimento errático dos átrios leva à estagnação do sangue (estase) que aumenta o risco de coágulos sanguíneos que podem viajar do coração para o cérebro e outras áreas. Assim, a AF é um fator de risco importante para o acidente vascular cerebral, a complicação mais temida da fibrilação atrial.
Os sintomas da fibrilação atrial podem ser tratados com medicações que diminuem a frequência cardíaca. Diversas medicações assim 20 como a cardioversão elétrica podem ser usados para converter a AF em um ritmo cardíaco normal. As terapias com base em cirurgia e cateter também podem ser usadas para prevenir a fibrilação atrial em certos indivíduos. Pessoas com AF são frequentemente administradas afinadores do sangue tais como varfarina para protegê-los de acidentes vasculares cerebrais.
Qualquer paciente com 2 ou mais episódios identificados de
fibrilação atrial é dito ter fibrilação atrial recorrente. Isto é ainda classificado em paroxísmico e persistente com base em quando o episódio termina sem terapia. A fibrilação atrial é dita ser paroxísmica quando ela termina espontaneamente dentro de 7 dias, mais habitualmente dentro de 24 horas. A fibrilação atrial persistente ou crônica é a AF estabelecida por mais do que sete dias. A diferenciação de AF paroxísmica de crônica ou estabelecida está fundamentada na história de episódios recorrentes e da duração do episódio corrente de AF (Levy S., J Cardiovasc Electrophysiol. 8 Supl, S78-82 (1998)).
5 A fibrilação atrial isolada (LAF) é definida como a fibrilação
atrial na ausência de descobertas clínicas ou ecocardiográficas de doença cardiopulmonar.
A fibrilação atrial é usualmente acompanhada por sintomas relacionados com a frequência cardíaca rápida ou embolização. As frequências cardíacas rápidas e irregulares podem ser percebidas como palpitações, intolerância a exercício e ocasionalmente produz angina e sintomas congestivos de encurtamento da respiração ou edema. Algumas vezes a arritmia será identificada com o início de um acidente vascular cerebral ou um ataque isquêmico transitório (TIA). Não é incomum identificar a fibrilação atrial em um exame físico de rotina ou eletrocardiograma (ECG/EKG), visto que a mesma pode ser assintomática em alguns casos. A fibrilação atrial paroxísmica é a ocorrência episódica da arritmia e pode ser difícil de diagnosticar. Os episódios podem ocorrer com o sono ou com exercícios e a sua natureza episódica pode requerer monitoramento de ECG prolongados (por exemplo, um monitor Holter) para diagnóstico.
A fibrilação atrial é diagnosticada em um eletrocardiograma, uma investigação realizada rotineiramente sempre que a batida cardíaca irregular é suspeitada. As descobertas características incluem a ausência de 25 ondas P, atividade elétrica desorganizada em seu lugar e irregularidade do intervalo R-R devido à condução irregular de impulsos para os ventrículos. Se AF paroxísmica é suspeitada, episódios podem ser documentados com o uso de monitoramento de Holter (registros de ECG contínuos por 24 horas ou mais longos). Embora muitos casos de AF não têm nenhuma causa definida, estes podem ser o resultado de vários outros problemas (ver abaixo). Por este motivo, a função renal e eletrólitos são rotineiramente determinados, assim como hormônio que estimula a tireóide e uma contagem sanguínea. Um raio X do tórax é em uma maneira geral realizado. Na AF de início agudo associada com dor no peito, troponinas cardíacas ou outros marcadores de dano ao músculo cardíaco podem ser receitados. Estudos de coagulação (INR/aPTT) são usualmente realizados, visto que medicação anticoagulante pode ser começada. Um ecocardiograma transesofágico pode ser indicado para identificar qualquer trombo intracardíaco (Fuster V., et al., Circulation.; 104,2118-2150 (2001)).
Flúter atrial (AFI) é caracterizado por um ritmo cardíaco rápido anormal nos átrios. Os pacientes que se apresentam com flúter atrial habitualmente também experienciam fibrilação atrial e vice versa (Waldo, A., Progr Cardiovasc Disease, 48: 41-56 (2005)). Mecanística e biologicamente, AF e AFI são assim prováveis de serem altamente relacionados.
AF (e AFI) é ligada a diversas causas cardíacas, mas podem ocorrer de outro modo em corações normais. As associações conhecidas incluem: Pressão sanguínea alta, Estenose mitral (por exemplo, devido à doença cardíaca reumática ou prolapso de válvula mitral), Regurgitação mitral, Cirurgia cardíaca, Doença da artéria coronária, Cardiomiopatia hipertrófica, Consumo de álcool excessivo (“consumo desenfreado de álcool” ou “coração em festa”), Hipertireoidismo, Hiperestimulação do nervo vago, usualmente por ter refeições grandes (“compulsão por comida”), Patologia pulmonar (tal como pneumonia, câncer pulmonar, embolismo pulmonar, Sarcoidose), Pericardite, Distúrbio emocional intenso e Doença cardíaca congênita.
O sistema de condução elétrica normal do coração permite que o impulso que é gerado pelo nodo sinoatrial (nodo SA) do coração seja propagado e estimula o miocárdio (músculo do coração). Quando o miocárdio é estimulado, este se contrai. É a estimulação ordenada do miocárdio que permite a contração eficiente do coração, permitindo deste modo que o sangue seja bombeado para o corpo. Na fibrilação atrial, os impulsos regulares produzidos pelo nó sinusal para fornecer a contração rítmica do coração são subjugados pelas descargas rápidas aleatoriamente geradas produzidas pelas áreas maiores do tecido atrial. Um impulso elétrico organizado no átrio produz a contração atrial; a falta de um tal impulso, como na fibrilação atrial, produz fluxo sanguíneo estagnado, especialmente no apêndice atrial e predispõe à coagulação. O deslocamento de um coágulo do átrio resulta em um êmbolo e o dano produzido está relacionado a onde a circulação o leva. Um êmbolo para o cérebro produz a complicação mais temida da fibrilação atrial, o acidente vascular cerebral, enquanto que um êmbolo também pode alojar-se na circulação mesentérica (a circulação que abastece os órgãos abdominais) ou dedo, produzindo o dano específico de órgão.
O tratamento da fibrilação atrial é direcionado por dois objetivos principais: (i) prevenir a instabilidade circulatória temporária; (ii) prevenir o acidente vascular cerebral. Os métodos mais comuns para se obter o primeiro inclui o controle da frequência e ritmo, enquanto que a anticoagulação é usualmente o método desejado para o último (Prystowsky E. N., Am J Cardiol.; 85, 3D-11D (2000); van Walraven C, et al., Jama. 288, 2441-2448 (2002)). Os métodos comuns para o controle da frequência, isto é, para reduzir a frequência cardíaca ao normal, incluem bloqueadores beta (por exemplo, metotprolol), glicosídeos cardíacos (por exemplo, digoxina) e bloqueadores do canal de cálcio (por exemplo, verapamil). Todas estas medicações trabalham pela diminuição da geração de pulsos a partir dos átrios e da condução a partir dos átrios para os ventrículos. Outros medicamentos habitualmente usados incluem quinidina, flecainida, propafenona, disopiramida, sotalol e amiodarona. O controle do ritmo pode ser obtido pela cardioversão elétrica, isto é, pela aplicação de choque elétrico DC ou pela cardioversão química, usando medicamentos tais como amiodariona, propafenona e flecainida.
Medidas preventivas para o acidente vascular cerebral incluem anticoagulantes. Os exemplos representativos de agentes anticoagulantes são Dalteparina (por exemplo, Fragmin), Danaparoid (por exemplo, Orgaran), Enoxaparina (por exemplo, Lovenox), Heparina (várias), Tinzaparina (por exemplo, Innohep), Varfarina (por exemplo, Coumadin). Alguns pacientes com fibrilação atrial isolada são algumas vezes tratados com aspirina ou clopidogrel. Existe evidência de que a aspirina e o clopidogrel sejam eficazes quando usados juntos, mas a combinação é ainda inferior à varfarina (Connolly S., et al. Lancet.; 367, 1903-1912 (2006)).(2) O novo anticoagulante ximelagatran mostrou prevenir o acidente vascular cerebral com eficácia igual como a varfarina, sem o processo de monitoração difícil associado com a varfarina e possivelmente com menos eventos hemorrágicos adversos. Infelizmente, ximegalatran e outros medicamentos anticoagulantes similares (habitualmente aludido como inibidores diretos de trombina), têm que ser ainda amplamente licenciados.
Determinar quem deve receber anti-coagulação ou não com varfarina não está óbvio. A contagem de CHADS2 é o melhor método validado de determinar o risco de acidente vascular cerebral (e portanto quem deve ser anticoagulado). A diretrizes da UK NICE têm ao contrário optado por um método de algoritmo. O problema subjacente é que se um paciente tem um risco anual de acidente vascular cerebral que é menor do que 2%, então os riscos associados com o uso de varfarina sobrepuja o risco de se ter um acidente vascular cerebral (Gage B. F. et al. Stroke 29, 1083-1091 (1998))
A fibrilação atrial pode algumas vezes ser controlada com tratamento. A tendência natural da fibrilação atrial, entretanto, é tomar-se uma condição crônica. A AF crônica leva a um risco aumentado de morte. Pacientes com fibrilação atrial estão em chance significantemente aumentada de acidente vascular cerebral.
A fibrilação atrial é comum entre adultos mais velhos. Nos países desenvolvidos, o número de pacientes com fibrilação atrial provavelmente deve aumentar durante os 50 anos seguintes, devido à proporção crescente de indivíduos idosos (Go A.S. et al., Jama., 285, 2370- 2375 (2001))(3). No estudo de Framingham o risco durante a vida para o desenvolvimento de AF é de 1 em 4 para homens e mulheres de 40 anos de idade e mais velhos. Os riscos durante a vida quanto a AF são altos (1 em 6). DE acordo com os dados do National Hospital Discharge Survey (1996-2001) em casos que incluíram AF como um diagnóstico de alta primário descoberto que 45% dos pacientes são do sexo masculino e que a idade média para os homens foi de 66,8 anos e 74,6 para as mulheres. A relação racial para as admissões foi descoberto ser de 71,2% de brancos, 5,6% de negros, 2% de outras raças e 20% não especificado. Além disso, os pacientes afro- americanos foram, em média, muito mais jovens do que as outras raças. A incidência nos homens variou de 20,58/100.000 pessoas por ano para as idades dos pacientes de 15 a 44 anos para 1203/100.000 pessoas por ano para aquelas idades de 85 e mais velhos. De 1996 a 2001, as hospitalizações com AF como o primeiro diagnóstico listado, aumentaram em 34%.
O acidente vascular cerebral é uma doença comum e séria. A cada ano nos Estados Unidos mais do que 600.000 indivíduos sofrem de um acidente vascular cerebral e mais do que 160.000 morrem de causas relacionadas com o acidente vascular cerebral (Sacco, R. L. et al., Stroke 28, 1507-17 (1997)). Além disso, mais de 300.000 indivíduos se apresentam com Ataque Isquêmico Transitório, uma forma branda de acidente vascular cerebral, a cada ano nos US. Nos países ocidentais o acidente vascular cerebral brando é a causa principal de incapacidade grave e a terceira causa principal de morte (Bonita, R., Lancet 339, 342-4 (1992)). O risco por toda a vida daqueles que atingem a idade de 40 anos excede 10%.
O fenótipo clínico de acidente vascular cerebral é complexo mas é amplamente dividido em isquêmico (responsável por 80 a 90%) e acidente vascular cerebral hemorrágico (10 a 20%) (Caplan, L.R. Caplants Stroke: A Clinicai Approach, 1-556 (Butterworth-Heinemann, 2000)). O acidente vascular cerebral isquêmico é ainda subdividido em doença oclusiva de vaso grande (aqui aludida como acidente vascular cerebral da carótida), usualmente devido ao envolvimento aterosclerótico das artérias carótidas comuns e internas, doença oclusivas de vaso pequeno, considerada ser um estreitamento não aterosclerótico de artérias finais pequenas dentro do cérebro e o acidente vascular cerebral cardiogênico devido aos coágulos sanguíneos que surgem do coração usualmente no cenário da doença cardíaca da fibrilação atrial ou isquêmica (aterosclerótica) (Adams, H. P., Jr. et al., Stroke 24, 35-41 (1993)). Portanto, parece que o acidente vascular cerebral não é uma doença mas um grupo heterogêneo de distúrbios que refletem diferenças nos mecanismos patogênicos (Alberts, M. J. Genetics of Cerebrovascular Disease, 386 (Futura Publishing Company, Inc., Nova Iorque, 1999); Hassan, A. & Markus, H. S. Brain 123, 1784-812 (2000)). Entretanto, todas as formas de acidente vascular cerebral compartilham fatores de risco tais como hipertensão, diabete, hiperlipidemia e o ato de fumar (Sacco, R. L. et al., Stroke 28, 1507-17 (1997); Leys, D. et al., J. Neurol. 249, 507-17 (2002)). A história familiar de acidente vascular cerebral é também um fator de risco independente que sugere a existência de fatores genéticos que podem interagir com fatores ambientais (Hassan, A. & Markus, H. S. Brain 123, 1784-812 (2000); Brass, L. M. & Alberts, M. J. Baillieres Clin. Neurol. 4, 221-45 (1995)).
Os determinantes genéticos das formas comuns de acidente vascular cerebral são ainda amplamente desconhecidos. Existem exemplos de mutações em genes específicos que causam formas Mendelianas raras de acidente vascular cerebral tais como o gene Notch3 em CADASIL (arteriopatia dominante autossômica cerebral com infartações subcorticais e leucoencefalopatia) (Toumier-Lasserve, E. et al., Nat. Genet. 3, 256-9 (1993); Joutel, A. et al., Nature 383, 707-10 (1996)), A Cistatina C no tipo islandês de 5 hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (Palsdottir, A. et al., Lancet 2, 603-4 (1988)), APP no tipo holandês de hemorragia cerebral hereditária (Levy, E. et al., Science 248, 1124-6 (1990)) e o gene KRITl em pacientes com angioma cavernoso hereditário (Gunel, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 6620-4 (1995); Sahoo, T. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 2325-33 10 (1999)). Nenhuma destas formas raras de acidente vascular cerebral ocorre no cenário da aterosclerose e portanto, os genes correspondentes não são prováveis de desempenhar papéis nas formas comuns de acidente vascular cerebral que mais frequentemente ocorrem com a aterosclerose.
E muito importante para o sistema de cuidado de saúde 15 desenvolver estratégias para prevenir o acidente vascular cerebral. Uma vez que um acidente vascular cerebral acontece, a morte celular irreversível ocorre em uma porção significante do cérebro abastecido pelos vasos sanguíneos afetados pelo acidente vascular cerebral. Infelizmente, os neurônios que morrem não podem ser revividos ou substituídos a partir de 20 uma população de célula tronco. Portanto, existe uma necessidade para prevenir os acidentes vasculares cerebrais de acontecer em primeiro lugar. Embora já conheçamos certos fatores de risco clínicos que aumentam o risco de acidente vascular cerebral (listados acima), existe uma necessidade médica não atingida para definir os fatores genéticos envolvidos no acidente vascular 25 cerebral para definir mais precisamente o risco de acidente vascular cerebral. Além disso, se alelos predispostos são comuns na população geral e a especificidade de prognosticar uma doença com base na sua presença é baixa, locais adicionais tais como locais protetores são necessários para o prognóstico significativo da disposição do estado de doença. Existe também uma necessidade enorme quanto a agentes terapêuticos para prevenir o primeiro acidente vascular cerebral ou acidentes vasculares cerebrais adicionais em indivíduos que sofreram de um acidente vascular cerebral anterior ou ataque isquêmico transitório.
5 A AF é um fator de risco independente para o acidente
vascular cerebral, aumentando o risco em cerca de 5 vezes. O risco para o acidente vascular cerebral atribuível ao AF aumenta com a idade. A AF é responsável por cerca de 15 a 20% de todos os acidentes vasculares cerebrais. A AF também é um fator de risco independente para a recorrência do acidente 10 vascular cerebral e severidade do acidente vascular cerebral. Um relato recente mostrou pessoas que tiveram AF e não foram tratados com anticoagulantes tiveram um aumento de 2,1 vezes no risco para acidente vascular cerebral recorrente e um aumento de 2,4 vezes no risco para acidente vascular cerebral grave recorrente. Pessoas que têm acidente vascular cerebral 15 causado pela AF foram relatados como 2,23 vezes mais prováveis de estar acamados comparado com aqueles que tiveram acidentes vasculares cerebrais a partir de outras causas.
Existe uma necessidade quanto a um entendimento dos fatores de suscetibilidade que levam à predisposição aumentada para AF e acidente 20 vascular cerebral. A identificação de variantes em risco para AF pode, por exemplo, ser útil para avaliar quais indivíduos estão particularmente em alto risco para AF e acidente vascular cerebral subsequente. Além disso, o tratamento preventivo pode ser administrado aos indivíduos que sofrem de AF e que são portadores de variantes de suscetibilidade em risco para AF e/ou 25 acidente vascular cerebral. Finalmente, a identificação de variantes em risco para AF e/ou acidente vascular cerebral pode levar à identificação de novos alvos para a terapia medicamentosa, assim como o desenvolvimento de novas medidas terapêuticas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à descoberta de que certos marcadores genéticos têm sido mostrado estar associados com a arritmia cardíaca, em particular a fibrilação atrial e flúter atrial e acidente vascular cerebral. Esta descoberta pode ser utilizada em uma variedade de métodos, procedimentos, aparelhos, meios e kits, como aqui descrito, com respeito aos métodos e procedimentos de diagnose e/ou determinação de uma suscetibilidade, métodos de genotipar variantes associadas, métodos de prognosticar resposta aos agentes terapêuticos, métodos de prognosticar prognóstico, métodos de monitorar o progresso de tratamento e sistemas e kits para o uso em tais métodos.
Um aspecto da invenção diz respeito a um método de determinar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, o método compreendendo determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença ou ausência do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo. Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico está localizado dentro do bloco LD C04, apresentado na SEQ ID NO: 50 aqui contida. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador é selecionado do marcador rs2220427 (SEQ ID NO: 1) e marcador rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 19. Em uma forma de realização, o método compreende ainda uma etapa de avaliar pelo menos um haplótipo que compreende pelo menos dois marcadores polimórficos no indivíduo.
Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de determinar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, que compreende determinar se pelo menos um alelo em risco em pelo menos um marcador polimórfico está presente em um conjunto de dados de genótipo derivado do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a determinação da presença do pelo menos um alelo em risco é indicativa de suscetibilidade aumentada para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
O conjunto de dados de genótipo compreende em uma forma de realização informação a cerca da identidade de marcador e o status alélico do indivíduo para o pelo menos um marcador polimórfico, isto é, informação a cerca da identidade dos dois alelos carregados pelo indivíduo para o marcador e/ou informação a cerca de se um indivíduo é um carregador de um alelo em risco particular para o pelo menos um marcador polimórfico. O conjunto de dados de genótipo pode compreender informação alélica a cerca de um ou mais marcadores, incluindo dois ou mais marcadores, três ou mais marcadores, cinco ou mais marcadores, cem ou mais marcadores, etc. Em algumas formas de realização, o conjunto de dados de genótipo compreende informação de genótipo de uma avaliação genômica inteira do indivíduo incluindo centenas de milhares de marcadores ou ainda um milhão ou mais de marcadores.
A invenção, em um outro aspecto, diz respeito a um procedimento que compreende uma etapa de analisar um ácido nucleico de um indivíduo humano para determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo associados com a seqüência genômica com a seqüência como apresentada na SEQ ID NO: 50; e uma etapa de determinar o status de um indicador genético de arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo a partir da 5 presença ou ausência do pelo menos um marcador ou haplótipo. Assim o status do genótipo e/ou haplótipo do indivíduo é usado como um indicador de arritmia cardíaca, incluindo fibrilação atrial e flúter atrial, assim como acidente vascular cerebral, no indivíduo.
A invenção também diz respeito a um método de avaliar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, que compreende triar um ácido nucleico do indivíduo quanto a pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo na SEQ ID NO: 50 que se correlacione com a ocorrência aumentada de arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em uma população humana; em que a determinação da presença de um alelo marcador em risco no pelo menos um polimorfismo ou um haplótipo em risco no ácido nucleico identifica o indivíduo como tendo suscetibilidade elevada para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral e em que a ausência do pelo menos um alelo marcador em risco ou haplótipo em risco no ácido nucleico identifica o indivíduo como não tendo a suscetibilidade elevada.
O procedimento ou métodos da invenção em uma forma de realização envolve pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo que compreendem um fragmento de ácido nucleico contíguo de bloco LD C04 como apresentado na SEQ ID NO: 50 ou o complemento deste, em que o 25 fragmento é menor do que 500 nucleotídeos no tamanho e especificamente hibridiza a um segmento complementar de bloco LD C04. Em uma forma de realização, o fragmento é maior do que 15 nucleotídeos e menor do que 400 nucleotídeos no tamanho e em que o fragmento especificamente hibridiza a um segmento complementar do bloco LD C04 como apresentado na SEQ ID NO: 50.
Em formas de realização alternativas, a suscetibilidade conferida pelos marcadores polimórficos ou haplótipos é a suscetibilidade diminuída, isto é, os marcadores e haplótipos da invenção conferem risco 5 diminuído de um indivíduo desenvolver arritmia cardíaca, incluindo fibrilação atrial e flúter atrial, e/ou acidente vascular cerebral. Em uma tal forma de realização, a suscetibilidade diminuída é caracterizada por uma razão de chances (OR) ou Risco Relativo (RR) de menos do que 0,8.
Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade diminuída 10 é caracterizada por uma razão de chances (OR) de menos do que 0,7. Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade diminuída é caracterizada por uma OR ou RR de menos do que 0,6. Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade diminuída é caracterizada pela OR ou RR de menos do que 0,5. Outras formas de realização dizem respeito a outros valores para OR ou 15 RR incluindo valores de 0,9, 0,85, 0,75, 0,65, 0,55, etc.
Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método de identificação de um marcador para o uso na avaliação da suscetibilidade aos sintomas associados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, o método compreendendo pelo menos um 20 marcador polimórfico dentro da SEQ ID NO: 50 ou pelo menos um marcador polimórfico em desequilíbrio de ligação com pelo menos um marcador dentro da SEQ ID NO: 50, determinar o status genotípico de uma amostra de indivíduos diagnosticados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral e o status genotípico de uma amostra de indivíduos de controle, em 25 que uma diferença significante na frequência de pelo menos um alelo em pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral quando comparada com a frequência do pelo menos um alelo na amostra de controle é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral. Em uma forma de realização, um aumento na frequência do pelo menos um alelo no pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, quando comparada com a frequência do pelo menos um alelo na 5 amostra de controle, é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade aumentada para a arritmia cardíaca. Em uma outra forma de realização, uma diminuição na frequência do pelo menos um alelo no pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, quando comparada com a 10 frequência do pelo menos um alelo na amostra de controle, é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade diminuída para ou proteção contra, a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral. Em formas de realização preferidas, a diferença significante na frequência é caracterizada por uma medida estatística. Em uma forma de 15 realização, a medida estatística é um valor P. em formas de realização particulares, um valor P significante é menor do que 0,05, menor do que 0,01, menor do que 0,001, menor do que 0,0001, menor do que 0,00001, menor do que 0,000001, menor do que 0,0000001 ou menor do que 0,00000001. Em outras formas de realização, a diferença significante é caracterizada por uma 20 razão de chances (OR) ou Risco Relativo (RR) com valores de intervalo de confidência particular (CE).
Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de genotipar uma amostra de ácido nucleico obtida de um indivíduo humano, que compreende determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de 25 pelo menos um marcador polimórfico preditivo de risco aumentado de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral na amostra, em que o pelo menos um marcador é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a determinação da presença ou ausência do pelo menos um alelo do pelo menos um marcador polimórfico é preditiva de risco aumentado de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral no indivíduo. Em uma forma de realização, a genotipagem é realizada usando um processo selecionado de hibridização de sonda específica de alelo, extensão de iniciador específico de alelo, amplificação específica de 5 alelo, sequenciamento de ácido nucleico, digestão de 5’-exonuclease, ensaio de marca molecular, ensaio de ligação de oligonucleotídeo, análise de tamanho e análise conformacional de filamento simples. Em uma forma de realização preferida, o processo compreende a hibridização de sonda específica de alelo. O processo de genotipagem preferivelmente compreende 10 amplificar um segmento de um ácido nucleico que compreende o pelo menos um marcador polimórfico, pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), usando um par iniciador de nucleotídeo que flanqueia o pelo menos um marcador polimórfico. Em um método de genotipagem preferido, as seguintes etapas são realizadas:
1. contatar cópias do ácido nucleico com uma sonda de
oligonucleotídeo de detecção e uma sonda de oligonucleotídeo realçadora sob condições para a hibridização específica da sonda de oligonucleotídeo com o ácido nucleico; em que
a) a sonda de oligonucleotídeo de detecção tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e especificamente hibridiza a um primeiro
segmento do ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 50 que compreende pelo menos um sítio polimórfico;
b) a sonda de oligonucleotídeo de detecção compreende um rótulo detectável no seu terminal 3’ e uma porção de extinção no seu terminal
5’;
c) o oligonucleotídeo realçador tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e é complementar a um segundo segmento da seqüência de nucleotídeo que está a 5’ em relação à sonda de oligonucleotídeo, tal que o oligonucleotídeo realçador está localizado 3’ em relação à sonda de oligonucleotídeo de detecção quando ambos oligonucleotídeos são hibridizados ao ácido nucleico; e
d) um intervalo de base única existe entre o primeiro segmento e o segundo segmento, tal que quando a sonda de oligonucleotídeo e a sonda 5 de oligonucleotídeo realçador são ambas hibridizadas ao ácido nucleico, um intervalo de base única existe entre os oligonucleotídeos;
2. tratar o ácido nucleico com uma endonuclease que clivará o rótulo detectável do terminal 3’ da sonda de detecção para liberar rótulo detectável livre quando a sonda de detecção é hibridizada ao ácido nucleico; e medir o rótulo detectável livre, em que a presença do rótulo
detectável livre indica que a sonda de detecção especificamente hibridiza ao primeiro segmento do ácido nucleico e indica a seqüência do sítio polimórfico como o complemento da sonda de detecção.
Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método de 15 determinar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, o método compreendendo determinar a identidade de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador é selecionado do grupo de marcadores associados com o gene 20 PITX2, em que a presença do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
Algumas formas de realização da invenção dizem respeito a uma outra etapa de avaliar pelo menos um biomarcador adicional para a 25 fibrilação atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral, em que combinar a informação genética dos marcadores fornece avaliação de risco para a fibrilação atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral. Em algumas destas formas de realização, o biomarcador é um marcador ou haplótipo genéticos, isto é, fatores de risco genético mostram estar ou considerados estar, relacionados com o risco aumentado ou diminuído de fibrilação atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral. Em outras formas de realização o biomarcador é um biomarcador de proteína. O biomarcador de proteína é em algumas formas de realização selecionado de dímero D da fibrina, fragmento 5 de ativação da protrombina 1,2 (Fl,2), complexos de trombina-antitrombina III (TAT), fibrinopeptídeo A (FPA), fosfolipase associada à lipoproteína A2 (Ip-PLA2), beta-tromboglobulina, fator de plaqueta 4, P-selectina, Fator de von Willebrand, peptídeo pró-natriurético (BNP), metaloproteinase de matriz-
9 (MMP-9), PARK7, difosfato cinase de nucleosídeo (NDKA), tau, enolase 10 específica de neurônio, fator de crescimento neurotrófico tipo B, proteína astroglial S-100b, proteína ácida fibrilar glial, proteína reativa C, amilóide A sérico, metaloproteinase de matriz-9, moléculas de adesão celular vascular e intracelular, fator alfa de necrose de tumor e interleucinas, incluindo interleucina-1, -6 e -8). Em uma forma de realização, o pelo menos um 15 biomarcador inclui células progenitoras. Em formas de realização particulares, mais do que um biomarcador é determinado. Em uma forma de realização preferida, o biomarcador é medido no plasma do indivíduo. Outras formas de realização dizem respeito ainda a combinar informação não genética para fazer a avaliação de risco, diagnose ou prognóstico de fibrilação 20 atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral no indivíduo. A informação não genética pode compreender idade, idade no início da doença, gênero, etinicidade, diagnose de doença anterior, por exemplo, diagnose de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial) e acidente vascular cerebral, história médica do indivíduo, história familiar de doença, medições bioquímicas e 25 medições clínicas (por exemplo, pressão sanguínea, níveis lipídicos séricos). A análise de tal informação combinada a partir de vários marcadores genéticos ou marcadores genéticos mais marcadores não genéticos é possível pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em uma forma de realização, a análise é realizada calculando o risco global pela regressão logística.
A invenção diz respeito ainda a um método de diagnosticar a suscetibilidade aumentada de acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, que compreende as etapas de (a) determinar se o indivíduo tem 5 experienciado sintomas associados com a Fibrilação atrial, Flúter atrial ou um Ataque Isquêmico Transitório; (b) determinar se uma amostra de ácido nucleico do indivíduo compreende pelo menos uma cópia de um alelo em risco de pelo menos um marcador polimórfico selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes; 10 em que a presença de sintomas associados com a Fibrilação atrial, Flúter atrial e/ou Ataque Isquêmico Transitório e a presença da pelo menos uma cópia do alelo em risco é indicativa de suscetibilidade aumentada de acidente vascular cerebral.
A invenção em um outro aspecto diz respeito a um método de 15 avaliar um indivíduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapêutico para prevenir e/ou melhorar sintomas associados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, que compreende: determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o 20 pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo do pelo menos um marcador é indicativa de uma probabilidade de uma resposta positiva ao agente terapêutico para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
Em uma forma de realização, o agente terapêutico é um
anticoagulante, um agente anti-arrítmico, um agente de controle da frequência cardíaca, um agente de cardioversão ou um agente de controle do ritmo cardíaco. Em uma outra forma de realização, o agente terapêutico é selecionado de varfarina, heparina, heparinas de peso molecular baixo, inibidores do fator Xa e inibidores de trombina, bloqueadores do canal de sódio, bloqueadores beta, bloqueadores do canal de potássio e bloqueadores do canal de cálcio.
Em uma outra forma de realização, o agente terapêutico é selecionado de varfarinag, ximelagatran, heparina, enoxaparina, dalteparina, tinzaparina, ardeparina, nadroparina, reviparina, fondaparinux, idraparinux, lepirudina, bivalirudina, argatroban, danaparóide, disopiramida, moricizina, procainamida, quinidina, lidocaína, mexiletino, tocainida, fenitoína, encainida, flecainida, propafenona, aimalina, cibenzolina, detaímio, esmolol, propranolol, metoprolol, alprenolol, atenolol, carvedilol, bisoprolol, acebutolol, nadolol, pindololol, labetalol, oxprenotol, penbutolol, timolol, betaxolol, cartelol, sotalol, levobunolol, amiodarono, azimilida, bretílio, dofetilida, tedisamil, ibutilida, sematilida, N-acetil procainamida, cloridreto de nifecalant, vemacalant, ambasilida, verpamil, mibefradil, diltiazem, digoxin, adenosina, ibutilida, amiodarona, procainamida, profafenona e flecainida.
Já um outro aspecto da invenção diz respeito a um método de prognosticar prognóstico de um indivíduo diagnosticado com, arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, o método compreendendo 20 determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo é indicativa de 25 um prognóstico pior da arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
Os métodos de monitorar o progresso de um tratamento de um indivíduo que passa por tratamento para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral também estão dentro do escopo da invenção, os métodos compreendendo determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo é indicativa do resultado do tratamento do indivíduo.
Em formas de realização particulares da invenção, por exemplo nos vários métodos, usos, procedimentos, aparelho e kits da invenção, o fenótipo de arritmia cardíaca é caracterizado ainda como sendo fibrilação atrial ou flúter atrial. Os inventores determinaram que o risco conferido pelas variantes em risco de AF aqui descritas é maior para indivíduo com idade precoce no início do que para os indivíduos com idade avançada no início. Assim em uma forma de realização, a fibrilação atrial ou flúter atrial são caracterizados ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 80 anos. Em uma outra forma de realização, a fibrilação atrial ou flúter atrial são caracterizados ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 70 anos. Ainda em uma outra forma de realização, a fibrilação atrial ou flúter atrial são caracterizados ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 60 anos. Outros cortes de idade são possíveis em formas de realização alternativas da invenção e também são consideradas, incluindo, mas não limitadas a, corte de idade de menos do que 75 anos, menos do que 65 anos e menos do que 55 anos. Além disso, a idade no início ou diagnose acima da idade de 55, 60, 65, 70, 75 ou 80 também são consideradas e dentro do escopo da invenção, como o são as faixas de idade dentro das quais a diagnose ou sintomas ou início da doença ocorrem, incluindo, mas não limitadas a, idade de 50 a 80, idade de 55 a 75, idade de 60 a 80, idade de 65 a 75, etc.
Em certas formas de realização da invenção, o acidente vascular cerebral é caracterizado ainda como acidente vascular cerebral isquêmico. Em outras formas de realização, o fenótipo de acidente vascular cerebral pode ser caracterizado como um ou mais dos sub-fenótipos de acidente vascular cerebral isquêmico a aterosclerose de artéria grande (LAA), acidente vascular cerebral cardioembólico (CES) e doença de vaso pequeno 5 (SVD).
Em formas de realização particulares da invenção, o desequilíbrio de ligação (LD) é definido por um corte quantitativo específico. Como descrito aqui em detalhes, o desequilíbrio de ligação pode ser quantitativamente determinado pelas medidas tais como r e |D’|. Como uma 10 conseqüência, certas formas de realização da invenção dizem respeito a marcadores em desequilíbrio de ligação por uma medida dentro de uma certa faixa especificada pelos valores particulares de r e/ou |D’|. Em uma tal forma de realização, o LD é caracterizado pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,1. Em uma outra forma de realização, o LD é caracterizado pelos 15 valores numéricos para r2 maiores do que 0,1. Em uma outra forma de realização, o LD é caracterizado pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,5. Ainda em uma outra forma de realização, o LD é caracterizado pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,8. Outros valores de corte para r também são considerados, como aqui descrito em mais detalhes. Em certas 20 formas de realização, o LD é caracterizado por certos valores de corte para r e/ou |D’|. Em uma tal forma de realização, o LD é caracterizado pelos valores para r e/ou |D | de mais do que 0,2 e 0,8, respectivamente. Outra combinação e permutas destas ou outras medidas de LD são possíveis para praticar a invenção e também são consideradas dentro do escopo da invenção.
Os procedimentos, usos ou métodos da invenção em algumas
formas de realização compreendem ainda uma etapa de administrar a um indivíduo determinado estar em risco aumentado para desenvolver arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral uma composição que compreende pelo menos um agente terapêutico eficaz para tratar ou prevenir a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral ou prevenir sintomas associados com a arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral. Assim, a invenção pode ser usada para determinar se um indivíduo é adequado para um módulo de tratamento particular.
5 Kits para o uso nos vários métodos e procedimentos aqui
descritos também estão dentro do escopo da invenção. Assim, em um aspecto, a invenção diz respeito a um kit para avaliar a suscetibilidade para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, o kit compreendendo reagentes para detectar seletivamente pelo menos um alelo de 10 pelo menos um marcador polimórfico no genoma do indivíduo, em que o marcador polimórfico é selecionado do grupo que consiste dos marcadores polimórficos dentro do segmento cuja seqüência é apresentada na SEQ ID NO: 50 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a presença do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade para a 15 arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado do grupo de marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores 20 em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado do marcador rs2220427 (SEQ ID NO: 1) e rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma forma de realização preferida, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores 25 apresentados na Tabela 19. Em uma outra forma de realização preferida, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51). Em uma forma de realização, os reagentes compreendem pelo menos um oligonucleotídeo contíguo que hibridiza a um fragmento do genoma do indivíduo que compreende o pelo menos um marcador polimórfico, um tampão e um rótulo detectável.
Em uma outra forma de realização, os reagentes compreendem pelo menos um par de oligonucleotídeos que hibridizam aos filamentos opostos de um segmento de ácido nucleico genômico obtido do paciente, em que cada par iniciador de oligonucleotídeo é planejado para amplificar seletivamente um fragmento do genoma do indivíduo que inclui um marcador polimórfico e em que o fragmento tem pelo menos 30 pares de base no tamanho. O pelo menos um oligonucleotídeo é, em formas de realização preferidas, completamente complementar ao genoma do indivíduo. Em uma forma de realização, o oligonucleotídeo tem cerca de 18 a cerca de 50 nucleotídeos no comprimento. Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeo tem de 20 a 30 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização preferida, o kit compreende:
a. uma sonda de oligonucleotídeo de detecção que tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento;
b. uma sonda de oligonucleotídeo realçadora que tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento; e
c. uma enzima de endonuclease;
em que a sonda de oligonucleotídeo de detecção especificamente hibridiza a um primeiro segmento do ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 2 que compreende pelo menos um sítio polimórfico; em que a sonda de oligonucleotídeo de detecção compreende um rótulo 25 detectável no seu terminal 3’ e uma porção de extinção no seu terminal 5’; em que o oligonucleotídeo realçador tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e é complementar a um segundo segmento da seqüência de nucleotídeo que é 5’ em relação à sonda de oligonucleotídeo, tal que o oligonucleotídeo realçador está localizado 3’ em relação à sonda de oligonucleotídeo de detecção quando ambos oligonucleotídeos são hibridizados ao ácido nucleico; em que um intervalo de base única existe entre o primeiro segmento e o segundo segmento, tal que quando a sonda de oligonucleotídeo e a sonda de oligonucleotídeo realçador são ambas 5 hibridizadas ao ácido nucleico, um intervalo de base única existe entre os oligonucleotídeos; e em que tratar o ácido nucleico com a endonuclease clivará o rótulo detectável do terminal 3 ’ da sonda de detecção para liberar o rótulo detectável livre quando a sonda de detecção é hibridizada ao ácido nucleico.
Os marcadores polimórficos aqui descritos como preditivo de
risco de arritmia cardíaca (por exemplo, AF e Flúter atrial) e acidente vascular cerebral são úteis como marcadores de diagnóstico. No aspecto, a invenção portanto diz respeito ao uso de uma sonda de oligonucleotídeo na fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar e/ou avaliar a suscetibilidade 15 para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, em que a sonda hibridiza a um segmento de um ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 50 que compreende pelo menos um sítio polimórfico, em que o fragmento tem 15 a 500 nucleotídeos no comprimento.
Em uma tal forma de realização, o sítio polimórfico é
selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 25 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51),
Meio legível por computador para armazenar informação a cerca de marcadores associados com doença como aqui descrito também estão dentro do escopo da presente invenção. Em um tal aspecto, a invenção diz respeito a um meio legível por computador no qual é armazenado um identificador quanto a pelo menos um marcador polimórfico; um indicador da frequência de pelo menos um alelo do dito pelo menos um marcador polimórfico em uma pluralidade de indivíduos diagnosticados com fibrilação 5 atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral; e um indicador da frequência do pelo menos um alelo do dito pelo menos um dos marcadores polimórficos em uma pluralidade de indivíduos de referência; em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com 10 estes. Em uma forma de realização preferida, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rs 10033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51).
A invenção também está relacionada com o um aparelho para 15 determinar um indicador genético para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, que compreende: uma memória legível por computador; e uma rotina armazenada na memória legível por computador; em que a rotina é adaptada para ser executada em um processador para analisar dados de genótipo e/ou haplótipo quanto a pelo 20 menos um indivíduo humano com respeito a pelo menos um marcador polimórfico selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e gerar um produto com base nos dados de marcador ou haplótipo, em que o produto compreende uma medição de risco do pelo menos um marcador ou haplótipo como um 25 indicador genético de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral para o indivíduo humano. Em uma forma de realização preferida, a rotina compreende ainda determinar um indicador da frequência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico e/ou pelo menos um haplótipo em um pluralidade de indivíduos diagnosticados com a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral e um indicador da frequência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico ou pelo menos um haplótipo em uma pluralidade de indivíduos de referência e calcular uma medição de risco para o pelo menos um alelo e/ou haplótipo com base neste; e em que 5 uma medição de risco para o indivíduo é calculada com base em uma comparação do pelo menos um status de marcador e/ou haplótipo para o indivíduo para o risco calculado para a pelo menos uma informação de marcador e/ou haplótipo para a pluralidade de indivíduos diagnosticados com a fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral. Em certas 10 formas de realização, a medição de risco é caracterizada por uma razão de chances (OR) ou um Risco Relativo (RR), como aqui descrito em mais detalhes.
Os marcadores polimórficos descobertos na presente invenção como preditivos de uma suscetibilidade de arritmia cardíaca e acidente 15 vascular cerebral, como descrito, assim como marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, são todos úteis para praticar os vários aspectos da presente invenção. Assim, embora marcadores polimórficos particulares fossem usados pelos presentes inventores para detectar uma associação de uma região particular do cromossoma 4 com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação 20 atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral, é igualmente útil avaliar marcadores em desequilíbrio de ligação forte com estes marcadores. Como uma conseqüência, em uma forma de realização dos métodos, usos, kits, procedimentos, aparelho e meios da invenção, o pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo útil nos métodos ou procedimentos da invenção 25 compreende pelo menos um dos marcadores apresentados na Tabela 5 (por exemplo, Tabela 5A e Tabela 5B) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo compreende pelo menos um dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo compreende pelo menos um dos marcadores apresentados na Tabela 5. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo compreende pelo menos um dos marcadores apresentados na 5 Tabela 9. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 4. Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador é selecionado do marcador rs2220427 (SEQ ID NO: 1) e marcador rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
IO Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador
polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 19.
Em uma forma de realização, o pelo menos um marcador ou haplótipo compreende pelo menos um dos marcadores D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2723296 (SEQ ID NO: 35), rs 16997168 (SEQ ID NO: 36), rs2723316 (SEQ ID NO: 37), rs6419178 (SEQ ID NO: 38), rsl448817 (SEQ ID NO: 39), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rs 13105878 (SEQ ID NO: 40), rs 10033464 (SEQ ID NO: 41), rsl3141190 (SEQ ID NO: 42), rs3853444 (SEQ ID NO: 43) e rs4576077 (SEQ ID NO: 44). Em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador ou haplótipo compreende pelo menos um dos marcadores D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51), Ainda em uma outra forma de realização, o pelo menos um marcador é selecionado de rsl0033464, rs2200733, rsl3143308 e rs2220427 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
Em uma outra forma de realização, a presença de alelos -2, -4 e/ou -8 do marcador D4S406, alelo G do marcador rs2723296, alelo T do marcador rs 16997168, alelo T do marcador rs2723316, alelo A do marcador rs6419178, alelo G do marcador rsl448817, alelo A do marcador rs2634073, alelo T do marcador rs2200733, alelo T do marcador rs2220427, alelo C do marcador rsl3105878, alelo T do marcador rsl0033464, alelo A do marcador rsl3141190, alelo A do marcador rs3853444, e/ou alelo T do marcador rs4576077 é indicativa de suscetibilidade aumentada de arritmia cardíaca ou 5 acidente vascular cerebral no indivíduo.
Em formas de realização particulares da invenção, a suscetibilidade conferida pela variante de risco (isto é, um alelo particular em um marcador polimórfico (por exemplo, um SNP) ou um haplótipo particular) é a suscetibilidade aumentada, isto é, os marcadores e haplótipos da invenção conferem risco aumentado de um indivíduo desenvolver arritmia cardíaca, incluindo fibrilação atrial e flúter atrial e acidente vascular cerebral. A suscetibilidade é tipicamente caracterizada pela medida da Razão de Chances (OR) ou, alternativamente, por um Risco Relativo (RR). Em uma forma de realização, a suscetibilidade aumentada é caracterizada por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,3. Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade aumentada é caracterizada por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,4. Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade aumentada é caracterizada por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,5. Em uma outra forma de realização, a suscetibilidade aumentada é caracterizada por uma razão de chances (OR) ou Risco Relativo (RR) de pelo menos 1,6. Ainda em uma outra forma de realização, a suscetibilidade aumentada é caracterizada por uma razão de chances (OR) ou Risco Relativo (RR) de pelo menos 1,8. Outras formas de realização dizem respeito a outros valores para OR ou valores comparáveis para RR incluindo valores de 1,25, 1,35, 1,45, 1,55, etc.
Certas formas de realização da invenção dizem respeito a indivíduos de uma etinicidade ou ancestralidade particular. Em uma tal forma de realização, o indivíduo humano tem ancestralidade selecionada da etinicidade negra, etinicidade asiática, etinicidade caucasiana, etinicidade hispânica e etinicidade arábica. Em formas de realização particulares, a etinicidade é auto-relatada. Em outras formas de realização, a ancestralidade é determinada pela avaliação de marcadores genéticos específicos de etinicidade particulares.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
O precedente e outros objetivos, características e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da seguinte descrição mais particular de formas de realização preferidas da invenção.
A FIG. 1 mostra uma plotagem de desequilíbrio de ligação 10 (LD) na região que compreende variantes da presente invenção para a população CEPH (dados HapMap). O bloco LD C04 (111.954.811 - 112.104.250 no Cromossoma 4, posições da Construção 35 da NCBI) é indicado na Figura por uma caixa preta. A plotagem mostra duas medidas de LD, isto é, D’ na parte superior e esquerda da Figure 1 e r na parte inferior e 15 direita da figura.
A FIG. 2 Mostra um esquemático da estrutura de haplótipo na região associada dentro do bloco LD. As áreas dos círculos escuros (esquerda) são proporcionais às frequências de haplótipo dos haplótipos na Islândia e as áreas dos círculos claros (direita) são proporcionais às frequências de 20 haplótipo em Hong Kong. O haplótipo intermediário, mostrado no centro do gráfico, certamente não mais existe em cada uma das duas populações (a sua frequência estimada é menor do que 0,2% que é indistinguível de erros de genotipagem).
A FIG. 3 É uma vista geral de uma vizinhança genômica de 200 kb de rs2200733 e rsl0033464. Isto inclui ESTs prognosticados, as localizações das três classes principais de SNPs equivalentes nas amostras de CEU HapMap e uma vista geral da estrutura LD da região nas várias amostras HapMap étnicas.
A FIG 4. Mostra a análise de Northern Blot da expressão de ΡΙΤΧ2 em coração e aorta humanos. O clone de cDNA de PITX2 HU3_p983E0327D foi usado como uma sonda e detectou transcritos de 1,8, 2 e 3 kb e transcritos de PITX2 de 2,2 e 3 kb no átrio esquerdo e aorta respectivamente. Linha 1: Coração fetal, linha 2: Coração inteiro, linha 3:
a r r
Aorta, linha 4: Apice do coração, linha 5: Atrio esquerdo, linha 6: Atrio direito, linha 7: Ventrículo esquerdo linha 8: Ventrículo direito. Mancha sondada com clone de cDNA PITX2 (HU3_p983E0327D).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Uma descrição de formas de realização preferidas da invenção
segue.
Definições
Os seguintes termos, no presente contexto, devem ter os significados como indicados:
Fibrilação atrial (AF), como aqui descrito, refere-se à AF como habitualmente defmida de acordo com critérios médicos estabelecidos. A AF é classificada por ICD-IO na classe 148 e por ICD-9 na classe 427,3
Flúter atrial (AFI), como aqui descrito, refere-se à AFI como habitualmente defmida de acordo com critérios médicos estabelecidos. A Afl é classificada por ICD-IO classe 148 e por ICD-9 na classe 427,32.
Um “marcador polimórfico”, algumas vezes aludido como um
“marcador”, como aqui descrito, refere-se a um sítio polimórfico genômico. Cada marcador polimórfico tem pelo menos duas variações de seqüência características de alelos particulares no sítio polimórfico. Assim, a associação genética a um marcador polimórfico implica que existe associação a pelo 25 menos um alelo específico daquele marcador polimórfico particular. O marcador pode compreender qualquer alelo de qualquer tipo de variante encontrado no genoma, incluindo SNPs, microssatélites, inserções, deleções, duplicações e translocações.
Um “alelo” refere-se à seqüência de nucleotídeo de um dado local (posição) em um cromossoma. Um alelo marcador polimórfico assim refere-se à composição (isto é, seqüência) do marcador em um cromossoma. O DNA genômico de um indivíduo contém dois alelos para qualquer marcador polimórfico dado, representativo de cada cópia do marcador em cada cromossoma.
Uma posição de nucleotídeo na qual mais do que uma seqüência é possível em uma população (uma população natural ou uma população sintética, por exemplo, uma biblioteca de moléculas sintéticas) é aqui aludida como um “sítio polimórfico”.
Um “Polimorfismo de Nucleotídeo Único” ou “SNP” é uma
variação de seqüência de DNA que ocorre quando um nucleotídeo único em um local específico no genoma difere entre membros de uma espécie ou entre cromossomas emparelhados em um indivíduo. A maioria dos polimorfismos SNP tem dois alelos. Cada indivíduo é neste caso homozigoto para um alelo 15 do polimorfismo (isto é, ambas as cópias cromossômicas do indivíduo têm o mesmo nucleotídeo na localização SNP) ou o indivíduo é heterozigoto (isto é, os duas cromátides irmãs do indivíduo contêm nucleotídeos diferentes). A nomenclatura SNP como aqui relatada refere-se ao rótulo de identificação ID da Referência oficial SNP (rs) como designado a cada SNP único pelo 20 National Center for Biotechnological Information (NCBI).
Uma “variante”, como aqui descrita, refere-se a um segmento de DNA que difere do DNA de referência. Um “marcador” ou um “marcador polimórfico”, como aqui definido, é uma variante. Alelos que diferem da referência são aludidos como alelos “variante”.
Um “microssatélite” é um marcador polimórfico que tem
repetições pequenas múltiplas de bases que têm 2 a 8 nucleotídeos no comprimento (tais como repetições CA) em um sítio particular, em que o número de comprimentos de repetições varia na população geral. Um “indel” é uma forma comum de polimorfismo que compreende uma inserção ou deleção pequenas que têm tipicamente apenas uns poucos nucleotídeos de comprimento.
Um “haplótipo,” como aqui descrito, refere-se a um segmento de DNA genômico que é caracterizado por uma combinação específica de 5 alelos dispostos ao longo do segmento. Para os organismos diplóides tais como humanos, um haplótipo compreende um membro do par de alelos para cada marcador ou local polimórfico. Em uma certa forma de realização, o haplótipo pode compreender dois ou mais alelos, três ou mais alelos, quatro ou mais alelos ou cinco ou mais alelos.
O termo “suscetibilidade”, como aqui descrito, abrange tanto a
suscetibilidade aumentada quanto a suscetibilidade diminuída. Assim, marcadores polimórficos e/ou haplótipos particulares da invenção podem ser característicos de suscetibilidade aumentada (isto é, risco aumentado) de fibrilação atrial ou acidente vascular cerebral, como caracterizado por um 15 Risco Relativo (RR) ou Razão de Chances (OR) de mais do que um. Alternativamente, os marcadores e/ou haplótipos da invenção são característicos de suscetibilidade diminuída (isto é, risco diminuído) de fibrilação atrial ou acidente vascular cerebral, como caracterizado por um Risco Relativo de menos do que um.
Uma “amostra de ácido nucleico” é uma amostra obtida de um
indivíduo que contém ácido nucleico. Em certas formas de realização, isto é, a detecção de marcadores polimórficos e/ou haplótipos específicos, a amostra de ácido nucleico compreende DNA genômico. Uma tal amostra de ácido nucleico pode ser obtida a partir de qualquer fonte que contenha DNA 25 genômico, incluindo como uma amostra de sangue, amostra de fluido amniótico, amostra de fluido cerebrospinal ou amostra de tecido da pele, músculo, mucosa bucal ou conjuntiva, placenta, trato gastrointestinal ou outros órgãos.
O termo “agente terapêutico da fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral” refere-se a um agente que pode ser usado para melhorar ou prevenir sintomas associados com a fibrilação atrial (AF), flúter atrial (AFI) ou acidente vascular cerebral, como aqui descrito em mais detalhes.
O termo “ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral”, como aqui descrito, refere-se a um ácido nucleico que foi descoberto estar associado com a arritmia cardíaca, por exemplo, fibrilação atrial (AF), flúter atrial (AFI) ou acidente vascular cerebral. Isto inclui, mas não é limitado aos marcadores e haplótipos aqui descritos e marcadores e haplótipos em forte desequilíbrio de ligação (LD) com estes. Em uma forma de realização, um ácido nucleico associado com a fibrilação atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral refere-se ao bloco LD C04 descoberto estar associado com a fibrilação atrial e acidente vascular cerebral. Em uma outra forma de realização, ácido nucleico associado com a fibrilação atrial, flúter atrial ou acidente vascular cerebral refere-se ao gene PITX2.
O termo “bloco LD C04”, como aqui descrito, refere-se ao bloco de Desequilíbrio de Ligação (LD) no Cromossoma 4 entre as posições 111.954.811 e 112.104.250 da Construção 35 da NCBI (National Center for Biotechnology Information), com a seqüência genômica como apresentada na SEQ ID NO: 50.
O termo “fragmento”, como aqui descrito, refere-se a um segmento de um ácido nucleico ou seqüência de proteína. Os fragmentos são de tamanho menor do que o seu ponto de referência, isto é, um fragmento de uma molécula de ácido nucleico de referência que tem 1000 nucleotídeos no 25 tamanho é menor do que 1000 nucleotídeos no tamanho. Os fragmentos de ácido nucleico da invenção são habitualmente maiores do que 5 nucleotídeos no tamanho e tipicamente maiores do que 15 nucleotídeos no tamanho, com um limite superior como definido pelo seu nucleotídeo de referência ou pela utilidade prática do fragmento de nucleotídeo. Por exemplo, fragmentos de nucleotídeo úteis como sondas de hibridização em algumas formas de realização da invenção são maiores do que 15 nucleotídeos e menores do que cerca de 500 nucleotídeos no tamanho. Outras faixas de tamanho aplicar-se- ão para outros fragmentos de nucleotídeo e proteína ou fragmentos de peptídeo da invenção.
O termo “PITX2”, como aqui descrito, refere-se ao gene do fator de transcrição 2 de homeodomínio emparelhado no cromossoma 4q25. Este gene também é aludido como homeobox 2 pituitário (PTX2), fator de transcrição 1 de homeobox relacionado a rieg bicoid (RIEG1), solurshin e gene 1 responsivo todo-1 (ARP1).
A presente invenção diz respeito à observação de que certos marcadores polimórficos no cromossoma 4q25 do genoma humano foram descobertos estar associados com a arritmia cardíaca e acidente vascular cerebral. Em formas de realização particulares da invenção, marcadores 15 polimórficos no cromossoma 4q25 estão associados com as arritmia cardíacas Fibrilação atrial (AF) e Flúter atrial (AFI) e acidente vascular cerebral. Esta observação tem implicações importantes e inesperadas para o desenvolvimento de métodos, usos, kits e sistemas de diagnóstico e terapêuticos, como aqui descrito em mais detalhes.
Em uma varredura ampla do genoma quanto a variantes
genéticas que conferem suscetibilidade à AF, diversos marcadores no cromossoma 4q25 foram descobertos estar associados com AF. A associação mais significante foi descoberta para os marcadores rs2220427 e rs2220733, ambos os quais deram valores p próximos a 10‘9 (Tabela 2) para AF e 25 menores, mas associação nominalmente significante ao acidente vascular cerebral (Tabela 3). Um número grande de marcadores foram identificados como substitutos perfeitos para estes marcadores, incluindo o marcador de microssatélite D4S406 (Tabela 1) e vários marcadores de SNP (Tabela 4).
Outro refinamento dos resultados revelaram que o sinal de associação parece centralizar, em termos genéticos, aos marcadores de rs2200733 e rs 10033464 (Tabela 7) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes marcadores (incluindo, mas não limitados aos marcadores de SNP listados na Tabela 9).
5 A observação original na população islandesa foi replicada em
um grupo AF/AFI islandês independente, em um grupo AF sueco e em um grupo AF US (Tabela 7). Quando combinado com as amostras islandesas, a associação ao rs2200733 foi inequívoca (OR = 1,72, P = 3,3 x 10’41) e a significância de rs 10033464 foi bem além do limiar de significância da 10 amplitude do genoma (OR = 1,39, P = 6,9 x IO'11). Assumindo o modelo multiplicativo, o risco atribuível à população (PAR) das duas variantes combinadas é de aproximadamente 20% em populações de ancestralidade européia. Além disso, a associação replicada em um grupo AF chinês de Hong Kong (Tabela 7).
Os inventores também descobriram que a idade no diagnóstico
de AF/AFI para as amostras islandesas correlacionam-se com os dois SNPs rs2200733 e rs 10033464. Assim, o diagnóstico ocorre 2,28 anos mais cedo para o alelo T de rs2200733 e 1,10 ano mais cedo para o alelo T de rs 10033464 (junta P = 1,29 x IO'6). Este efeito é manifestado pela associação 20 das duas variantes sendo mais forte naqueles diagnosticados em uma idade mais jovem, embora o risco permaneça significante mesmo naqueles diagnosticados depois de atingir 80 anos de idade (Tabela 8). Uma idade similar no início do efeito é observado no grupo US (Tabela 8).
Os inventores também observaram uma forte associação entre 25 as variantes e AFI, que parecem ser ainda mais forte do que para AF. Assim é revelado pela associação ao subconjunto (N= 116) dos pacientes islandeses que têm um diagnóstico de AFI (OR = 2,60, 95% de intervalo de confidência (CI) = 1,83-3,68, P = 7,5 x IO'8 para rs2200733 ou = 1,94, 95% de CI = 1,26- 3,00, P = 0,0028 para rsl0033464). De fato, para rs2200733, a OR para estes casos de AFI definidos é significantemente mais alta do que aquela para os casos com um fenótipo AF (P = 0,0026) e próximo a significantemente mais alto para rs 10033464 (P = 0,084). Estes resultam que tanto AF quanto AFI têm fatores de risco genético significantes que são ilustrados pela associação a 5 SNPs rs2200733 e rs 10033464.
Os inventores além disso estabeleceram que as variantes que se associam com AF/AFI também estão associados com acidente vascular cerebral, em particular acidente vascular cerebral isquêmico (Tabela 21). O marcador rs2200733 replicou significantemente no acidente vascular cerebral 10 isquêmico e no subfenótipo do acidente vascular cerebral isquêmico (IS), o acidente vascular cerebral cardioembólico (CES). Tanto este marcador quanto o marcador rs 10033464 foram descobertos, depois de genotipar casos de IS islandês adicionais e controles (total 1.943 casos/25.708 controles) e quatro conjuntos de replicação de caso IS/controle grandes (4.294 casos/3.709 15 controles), associarem-se mais firmemente com o CES, do que AF é a causa primária, (rs2200733: OR = 1,53, P = 1,5 x IO'12; rsl0033464: OR = 1,27, P = 5,9 x IO'4) (Tabela 21).
Não existe nenhum gene conhecido presente no bloco LD contendo rs2200733 e rsl0033464 (Figura 3). O bloco LD contém um EST 20 unido (DA725631) e dois exons EST isolados (DB324364 e AFO17091). A RT-PCR de bibliotecas de cDNA de vários tecidos não detectou a expressão destes ESTs (Tabela 16). O gene PITX2 localizado no bloco LD a montante adjacente é o gene mais próximo das variantes de risco. Diversos marcadores dentro do bloco LD contendo o gene PITX2 são correlacionados com os 25 marcadores que mostram a associação ao AF e Afl, como mostrado na Tabela 18. É portanto possível que as variantes dentro do gene PITX2 sejam as variantes causativas subjacentes. Alternativamente, é possível que as variantes da presente invenção, como aqui descritas, afetem a função, estabilidade, expressão, modificação pós-traducional, junção, estabilidade de mensagem de ΡΙΤΧ2 ou por outros meios afetam o gene de modo a predispor aos sintomas associados com a fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral. A proteína codificada por este gene, o fator de transcrição de homeodomínio no modo emparelhado 2, é um candidato interessante para AF/AFI visto que é 5 conhecido desempenhar um papel importante no desenvolvimento cardíaco pelo direcionamento da morfogênese assimétrica do coração (Franco, D., Trends Cardiovasc Med 13: 157-63 (2003)). Além disso, em um modelo de camundongo silenciado Pitx2 mostrou suprimir um caminho default para a formação do nodo sinoatrial no átrio esquerdo. Existe muito pouca expressão 10 de mRNA de PITX2 em todos os tecidos facilmente acessíveis, tais como sangue e tecido adiposo, dificultando o estudo de correlação entre genótipos e níveis de expressão. O gene seguinte a montante de PITX2 é ENPEP, uma aminopeptidase responsável pela ruptura da angiotensina II no endotélio vascular. Este gene é expressado mais amplamente, mas as variantes 15 associadas com AF não mostraram nenhuma correlação para a sua expressão no sangue ou tecido adiposo. Nenhum outro gene anotado está localizado dentro de uma região de 400 kb a montante e regiões 1,5 Mb a jusante das variantes associadas.
Avaliação quanto a marcadores e haplótipos
A seqüência genômica dentro de populações não é idêntica
quando os indivíduos são comparados. Ao invés, o genoma exibe variabilidade de seqüência entre indivíduos em muitas localizações no genoma. Tais variações na seqüência são habitualmente aludidas como polimorfismos e existem muitos de tais sítios dentro de cada genoma. Por 25 exemplo, o genoma humano exibe variações de seqüência que ocorrem em média a cada 500 pares de base. A variante de seqüência mais comum consiste de variações de base em uma única posição de base no genoma e tais variantes ou polimorfismos de seqüência, são habitualmente chamados Polimorfismos de Nucleotídeo Único (“SNPs”). Acredita-se que estes SNPs tenham ocorrido em um único evento mutacional e portanto existem usualmente dois alelos possíveis em cada sítio de SNP; o alelo original e o alelo mutado. Devido ao curso genético natural e possivelmente também pressão seletiva, a mutação original tem resultado em um polimorfismo 5 caracterizado por uma frequência particular de seus alelos em qualquer população dada. Muitos outros tipos de variantes de seqüência são encontrados no genoma humano, incluindo microssatélites, inserções, deleções, inversões e variações de número de cópia. Um microssatélite polimórfico tem repetições pequenas múltiplas de bases (tais como repetições 10 de CA, TG no filamento complementar) em um sítio particular em que o número de comprimentos de repetição varia na população geral. Em termos gerais, cada versão da seqüência com respeito ao sítio polimórfico representa um alelo específico do sítio polimórfico. Estas variantes de seqüência podem ser todas aludidas como polimorfismos, que ocorrem em sítios polimórficos 15 específicos característicos da variante de seqüência em questão. Em termos gerais, os polimorfismos podem compreender qualquer número de alelos específicos. Assim em uma forma de realização da invenção, o polimorfismo é caracterizado pela presença de dois ou mais alelos em qualquer população dada. Em uma outra forma de realização, o polimorfismo é caracterizado pela 20 presença de três ou mais alelos. Em outras formas de realização, o polimorfismo é caracterizado por quatro ou mais alelos, cinco ou mais alelos, seis ou mais alelos, sete ou mais alelos, nove ou mais alelos ou dez ou mais alelos. Todos de tais polimorfismos podem ser utilizados nos métodos e kits da presente invenção e estão assim dentro do escopo da invenção.
Em alguns casos, referência é feita a alelos diferentes em um
sítio polimórfico sem escolher um alelo de referência. Alternativamente, uma seqüência de referência pode ser aludida para um sítio polimórfico particular.
O alelo de referência é algumas vezes aludido como o alelo do “tipo selvagem” e usualmente é escolhido como o primeiro alelo sequenciado ou como o alelo de um indivíduo “não afetado” (por exemplo, um indivíduo que não demonstra um traço ou fenótipo de doença).
Alelos para marcadores de SNP como aqui aludidos referem- se às bases A, C, G ou T visto que eles ocorrem no sítio polimórfico no ensaio 5 de SNP utilizado. O alelo que codifica as SNPs aqui usadas são como segue:
1 = A, 2 = C, 3 = G, 4 = T. A pessoa habilitada na técnica entretanto constatará que ensaiando-se ou lendo-se o filamento de DNA oposto, o alelo complementar pode em cada caso ser medido. Assim, para um sítio polimórfico (marcador polimórfico) caracterizado por um polimorfismo A/G, 10 o ensaio utilizado pode ser planejado para detectar especificamente a presença de um ou ambas das duas bases possíveis, isto é, A e G. Alternativamente, pelo planejamento de um ensaio que é planejado para detectar o filamento oposto no padrão de DNA, a presença das bases complementares TeC pode ser medida. Quantitativamente (por exemplo, em termos de Risco Relativo), 15 resultados idênticos podem ser obtidos da medição do filamento de DNA (filamento + ou filamento -).
Tipicamente, uma seqüência de referência é aludida para uma seqüência particular. Os alelos que diferem da referência são algumas vezes aludidos como alelos “variante”. Uma seqüência variante, como aqui usada, 20 refere-se a uma seqüência que difere da seqüência de referência mas é de outro modo substancialmente similar. Os alelos nos marcadores genéticos polimórficos aqui descritos são variantes. As variantes adicionais podem incluir mudanças que afetam um polipeptídeo. As diferenças de seqüência, quando comparadas a uma seqüência de nucleotídeo de referência, pode 25 incluir a inserção ou deleção de um único nucleotídeo ou de mais do que um nucleotídeo, resultando em uma mudança de matriz; a mudança de pelo menos um nucleotídeo, resultando em uma mudança no aminoácido codificado; a mudança de pelo menos um nucleotídeo, que resulta na geração de um códon de parada prematuro; a deleção de diversos nucleotídeos, que resultam em uma deleção de um ou mais aminoácidos codificados pelos nucleotídeos; a inserção de um ou vários nucleotídeos, tal como pela recombinação desigual ou conversão de gene, que resulta em uma interrupção da seqüência codificadora de uma matriz de leitura; duplicação de toda ou 5 uma parte de uma seqüência; transposição; ou um rearranjo de uma seqüência de nucleotídeo,. Tais mudanças de seqüência podem alterar o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. Por exemplo, se a mudança na seqüência de ácido nucleico causa uma mudança de matriz, a mudança de matriz pode resultar em uma mudança nos aminoácidos codificados, e/ou pode resultar na 10 geração de um códon de parada prematura, causando a geração de um polipeptídeo truncado. Alternativamente, um polimorfismo associado com uma doença ou traço pode ser uma mudança sinônima em um ou mais nucleotídeos (isto é, uma mudança que não resulta em uma mudança na seqüência de aminoácido). Um tal polimorfismo pode, por exemplo, alterar 15 sítios de junção, afetar a estabilidade ou transporte de mRNA ou de outro modo afetar a transcrição ou tradução de um polipeptídeo codificado. O mesmo também pode alterar o DNA para aumentar a possibilidade de que as mudanças estruturais, tais como amplificações ou deleções, ocorram ao nível somático. O polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo de 20 referência é o polipeptídeo de “referência” com uma seqüência de aminoácido de referência particular e os polipeptídeos codificados pelos alelos variantes são aludidos como polipeptídeos “variantes” com seqüências de aminoácido variantes. Uma seqüência ou uma seqüência de referência pode representar a direção (+) ou (-) de DNA de filamento duplo. Tais seqüências estão 25 relacionadas como sendo o complemento reverso um do outro, como bem conhecido pela pessoa habilitada.
Um haplótipo refere-se a um segmento de DNA que é caracterizado por uma combinação específica de alelos dispostos ao longo do segmento. Para organismos diplóides tais como os seres humanos, um haplótipo compreende um membro do par de alelos para cada marcador ou local polimórficos. Em uma certa forma de realização, o haplótipo pode compreender dois ou mais alelos, três ou mais alelos, quatro ou mais alelos ou cinco ou mais alelos, cada alelo correspondendo a um marcador polimórfico 5 específico ao longo do segmento. Os haplótipos podem compreender uma combinação de vários marcadores polimórficos, por exemplo, SNPs e microssatélites, tendo alelos particulares nos sítios polimórficos. Os haplótipos assim compreendem uma combinação de alelos em vários marcadores genéticos.
A detecção de marcadores polimórficos e/ou haplótipos
específicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica para detectar seqüências nos sítios polimórficos. Por exemplo, as técnicas padrão para genotipar quanto a presença de SNPs e/ou marcadores de microssatélite podem ser usadas, tais como as técnicas com base na fluorescência (Chen, X. 15 et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999)), utilizando PCR, LCR, PCR Abrigada e outras técnicas para a amplificação de ácido nucleico. As metodologias específicas disponíveis para genotipar SNP incluem, mas não são limitadas aos ensaios de genotipagem TaqMan e plataformas SNPIex (Applied Biosystems), espectrometria de massa (por exemplo, o sistema 20 MassARRAY da Sequenom), métodos de mini-sequenciamento, PCR em tempo real, sistema Bio-Plex (BioRad), sistemas CEQ e SNPstream (Beckman), tecnologia de série de Sonda de Inversão Molecular (por exemplo, GeneChip da Affymetrix) e BeadArray Technologies (por exemplo, os ensaios Illumina GoldenGate e Infmium). Por estes ou outros métodos 25 disponíveis para a pessoa habilitada na técnica, um ou mais alelos em marcadores polimórficos, incluindo microssatélites, SNPs ou outros tipos de marcadores polimórficos, podem ser identificados.
Em certos métodos aqui descritos, um indivíduo que está em uma suscetibilidade aumentada (isto é, risco aumentado) para qualquer doença ou traço específicos sob estudo, é um indivíduo em quem pelo menos um alelo específico em um ou mais marcadores polimórficos ou haplótipo que conferem suscetibilidade aumentada para a doença ou traço são identificados (isto é, alelos marcadores ou haplótipos em risco). Em um aspecto, o 5 marcador ou haplótipo em risco é um que confere um risco aumentado (ou suscetibilidade) significante da doença ou traço. Em uma forma de realização, a significância associada com um marcador ou haplótipo é medida por um Risco Relativo (RR). Em uma outra forma de realização, a significância associada com um marcador ou haplotipo é medida por uma razão de chances 10 (OR). Em uma outra forma de realização, a significância é medida por uma porcentagem. Em uma forma de realização, um risco aumentado significante é medido como um risco (Risco Relativo e/ou Razão de Chances) de pelo menos 1,2, incluindo mas não limitado a: pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos 1,6, pelo menos 1,7, 1,8, pelo 15 menos 1,9, pelo menos 2,0, pelo menos 2,5, pelo menos 3,0, pelo menos 4,0 e pelo menos 5,0. Em uma forma de realização particular, um risco (Risco Relativo e/ou Razão de Chances) de pelo menos 1,2 é significante. Em uma outra forma de realização particular, um risco de pelo menos 1,3 é significante. Ainda em uma outra forma de realização, um risco de pelo 20 menos 1,4 é significante. Em uma outra forma de realização, um Risco Relativo de pelo menos cerca de 1,5 é significante. Em mais uma outra forma de realização, um aumento significante no risco de pelo menos cerca de 1,7 é significante. Entretanto, outros cortes também são considerados, por exemplo pelo menos 1,15, 1,25, 1,35 e assim por diante e tais cortes também estão 25 dentro do escopo da presente invenção. Em outras formas de realização, um aumento significante no risco é de pelo menos cerca de 20%, incluindo mas não limitado a cerca de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% e 500%. Em uma forma de realização particular, um aumento significante no risco é de pelo menos 20%. Em outras formas de realização, um aumento significante no risco é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 100%. Outros cortes ou faixas como julgados adequados pela pessoa 5 habilitada na técnica para caracterizar a invenção são entretanto também considerados e estes também estão dentro do escopo da presente invenção.
Um marcador polimórfico ou haplótipo em risco da presente invenção é um onde pelo menos um alelo de pelo menos um marcador ou haplótipo está mais frequentemente presente em um indivíduo em risco para a 10 doença ou traço (por exemplo, arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral) (afetado), comparado com a frequência da sua presença em um grupo de comparação (controle) e em que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de suscetibilidade para a doença ou traço. O grupo de controle em uma forma de realização pode ser uma amostra de população, isto 15 é, uma amostra aleatória da população geral. Em uma outra forma de realização, o grupo de controle é representado por um grupo de indivíduos que são isentos de doença. Tal controle isento de doença em uma forma de realização pode ser caracterizado pela ausência de um ou mais sintomas associados a doença específicos. Em uma outra forma de realização, o grupo 20 de controle isento de doença é caracterizado pela ausência de um ou mais fatores de risco específicos de doença. Tais fatores de risco são em uma forma de realização pelo menos um fator de risco ambiental. Os fatores ambientais representativos são produtos naturais, minerais ou outros produtos químicos que são conhecidos por afetar ou considerados afetar, o risco de desenvolver a 25 doença ou traço específicos. Outros fatores de risco ambientais são fatores de risco relacionados com o estilo de vida, incluindo mas não limitados aos hábitos alimentares e bebidas, localização geográfica do habitat principais e fatores de risco ocupacionais. Em uma outra forma de realização, os fatores de risco são pelo menos um fator de risco genético. Como um exemplo de um teste simples para a correlação seria um teste exato de Fisher em uma tabela de dois por dois. Dado um grupo de cromossomas, a tabela de dois por dois é construída do número de cromossomas que incluem ambos dos marcadores ou haplótipos, um dos 5 marcadores ou haplótipos mas não o outro e nenhum dos marcadores ou haplótipos.
Em outras formas de realização da invenção, um indivíduo que está em uma suscetibilidade diminuída (isto é, em uma risco diminuído) para a doença ou traço é um indivíduo no qual pelo menos um alelo específico em 10 um ou mais marcadores polimórficos ou haplótipos que conferem suscetibilidade diminuída para a doença ou traço é identificado. Os alelos e/ou haplótipos marcadores que conferem risco diminuído também são ditos serem protetores. Em um aspecto, o marcador ou haplótipo protetores é um que confere um risco diminuído (ou suscetibilidade) significante da doença ou 15 traço. Em uma forma de realização, o risco diminuído significante é medido como um Risco Relativo de menos do que 0,9, incluindo mas não limitado a menor do que 0,9, menor do que 0,8, menor do que 0,7, menor do que 0,6, menor do que 0,5, menor do que 0,4, menor do que 0,3, menor do que 0,2 e menor do que 0,1. Em uma forma de realização particular, o risco diminuído 20 significante é menor do que 0,7. Em uma outra forma de realização, o risco diminuído significante é menor do que 0,5. Ainda em uma outra forma de realização, o risco diminuído significante é menor do que 0,3. Em uma outra forma de realização, a diminuição no risco (ou suscetibilidade) é de pelo menos 20%, incluindo mas não limitada a pelo menos 25%, pelo menos 30%, 25 pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 98%. Em uma forma de realização particular, uma diminuição significante no risco é de pelo menos cerca de 30%. Em uma outra forma de realização, uma diminuição significante no risco é de pelo menos cerca de 50%. Em uma outra forma de realização, a diminuição no risco é de pelo menos cerca de 70%. Outros cortes ou faixas como julgados adequados pela pessoa habilitada na técnica para caracterizar a invenção são entretanto 5 também considerados e estes também estão dentro do escopo da presente invenção.
A pessoa habilitada na técnica avaliará que para os marcadores com dois alelos presentes na população que é estudada e em que um alelo é encontrado em frequência aumentada em um grupo de indivíduos com um 10 traço ou doença na população, comparado com controles, o outro alelo do marcador será descoberto na frequência diminuída no grupo de indivíduos com o traço ou doença, comparado com controles. Em um tal caso, um alelo do marcador (aquele encontrado em frequência aumentada em indivíduos com o traço ou doença) será o alelo em risco, enquanto que o outro alelo será um 15 alelo protetor.
Desequilíbrio de ligação
O fenômeno natural de recombinação, que ocorre em média uma vez para cada par de cromossoma durante cada evento ,meiótico, representa um modo em que a natureza fornece variações na seqüência (e 20 função biológica por conseqüência), foi descoberto que a recombinação não ocorre aleatoriamente no genoma; ao invés, existem variações grandes na frequência de taxas de recombinação, que resulta em regiões pequenas de alta frequência de recombinação (também chamada de ponto de recombinação) e regiões grandes de baixa frequência de recombinação, que são habitualmente 25 aludidas como blocos de desequilíbrio de ligação (LD) (Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34: 526-530 (2006); Jeffreys, A. J., et al., Nature Genet 29: 217-222 (2001); May, C. A., et al., Nature Genet 31: 272-275(2002)).
O desequilíbrio de ligação (LD) refere-se a uma seleção não aleatória de dois elementos genéticos. Por exemplo, se um elemento genético particular (por exemplo, um alelo de um marcador polimórfico ou um haplótipo) ocorre em uma população em uma frequência de 0,25 (25%) e um outro elemento ocorre em uma frequência de 0,25 (25%), então a ocorrência prognosticada de uma pessoa tendo ambos os elementos é de 0,125 (12,5%), assumindo uma distribuição aleatória dos elementos. Entretanto, se é descoberto que os dois elementos ocorrem juntos em uma frequência mais alta do que 0,125, então os elementos são ditos estar em desequilíbrio de ligação, visto que eles tendem a ser herdados juntos em uma taxa mais alta do que aquela que as suas frequências independentes de ocorrência (por exemplo, frequências de alelo ou haplótipo) prognosticariam. Em termos gerais, LD está em uma maneira geral correlacionado com a frequência de eventos de recombinação entre os dois elementos. As frequências de alelo ou haplótipo podem ser determinadas em uma população pela genotipagem de indivíduos em uma população e determinando a frequência da ocorrência de cada alelo ou haplótipo na população. Para as populações de diplóides, por exemplo, populações humanas, indivíduos tipicamente terão dois alelos para cada elemento genético (por exemplo, um marcador, haplótipo ou gene).
Muitas medidas diferentes foram propostas para avaliar a força de desequilíbrio de ligação (LD). A maioria captura a força de associação
entre pares de sítios bialélicos. Duas medidas aos pares importantes de LD
2 2 são r (algumas vezes denotada Δ ) e |D’|. Ambas as medidas variam de 0
(nenhum desequilíbrio) a 1 (desequilíbrio ‘completo’), mas a sua
interpretação é levemente diferente. |D’| é definido em um tal modo que seja
igual a 1 se apenas dois ou três dos haplótipos possíveis estão presentes e é <
1 se todos os quatro haplótipos possíveis estão presentes. Portanto, um valor
de |D’| que é < 1 indica que a recombinação histórica pode ter ocorrido entre
dois sítios (a mutação recorrente também pode fazer com que |D’| seja < 1,
mas para os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) isto é usualmente
considerado como sendo menos provável do que a recombinação). A medida r representa a correlação estatística entre dois sítios e assume o valor de 1 se apenas dois haplótipos estão presentes.
A medida r2 é discutivelmente a medida mais relevante para o mapeamento de associação, porque existe uma relação inversa simples entre r2 e o tamanho da amostra requerido para detectar a associação entre o local de suscetibilidade e SNPs. Estas medidas são definidas para pares de sítios, mas para algumas aplicações uma determinação de quão forte LD é através de uma região inteira que contém muitos sítios polimórficos seria desejável (por exemplo, testando se a força de LD difere significantemente entre populações locais ou cruzadas ou se existe mais ou menos LD em uma região do que prognosticado sob um modelo particular). Medir LD através de uma região não é direto, mas um método é usar a medida r, que foi desenvolvida nas populações genéticas. Em termos gerais, r mede quanta recombinação seria requerida sob um modelo de população particular para gerar o LD que é observado nos dados. Este tipo de método potencialmente também pode fornecer um método estatisticamente rigoroso para o problema de determinar
se os dados de LD fornecem evidência quanto a presença de pontos de
e 2
recombinação. Para os métodos e procedimentos aqui descritos, um valor r
significante pode ser de pelo menos 0,1 tal como pelo menos 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,91,
0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 ou 1,0. Em uma forma de
• · 2
realização preferida, o valor r significante pode ser de pelo menos 0,2.
Alternativamente, o desequilíbrio de ligação como aqui descrito, refere-se ao desequilíbrio de ligação caracterizado pelos valores de |D’| de pelo menos 0,2, tal como 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99. Assim, o desequilíbrio de ligação representa uma correlação entre alelos de
marcadores distintos. O mesmo é medido pelo coeficiente de correlação ou
2 φ
|D’| (r até 1,0 e |D’| até 1,0). O desequilíbrio de ligação pode ser determinado
em uma única população humana, como aqui definido ou pode ser determinado em uma coleção de amostras que compreendem indivíduos de mais do que uma população humana. Em uma forma de realização da invenção, LD é determinado em uma amostra de uma ou mais das populações HapMap (caucasiana, africana, japonesa, chinesa), como definido (http: //www.hapmap.org). Em uma tal forma de realização, LD é determinado na população CEU das amostras de HapMap. Em uma outra forma de realização, LD é determinado na população YRL Ainda em uma outra forma de realização, LD é determinado em amostras da população islandesa.
Se todos os polimorfismos no genoma fossem idênticos ao nível de população, então cada um deles necessitaria ser investigado em estudos de associação. Entretanto, devido ao desequilíbrio de ligação entre polimorfismos, polimorfismos firmemente ligados são fortemente correlacionados, o que reduz o número de polimorfismos que precisam ser investigados em um estudo de associação para observar uma associação significante. Uma outra conseqüência de LD é que muitos polimorfismos podem dar um sinal de associação devido ao fato de que estes polimorfismos são fortemente correlacionados.
Os mapas LD genômicos foram gerados através do genoma e tais mapas LD foram propostos para servir como matriz para o mapeamento de doença-genes (Risch, N. & Merkiangas, K, Science 273: 1516-1517 (1996); Maniatis, N., et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 2228-2233 (2002); Reich, DE et al, Nature 411: 199-204 (2001)).
r
E agora estabelecido que muitas porções do genoma humano podem ser quebradas em séries de blocos de haplótipo separados contendo uns poucos haplótipos comuns; para este blocos, os dados de desequilíbrio de ligação fornecem pouca evidência indicando recombinação (ver, por exemplo, Wall., J. D. e Pritchard, J. K., Nature Reviews Genetics 4: 587-597 (2003); Daly, M. et al., Nature Genet. 29: 229-232 (2001); Gabriel, S. B. et al., Science 296: 2225-2229 (2002); Patil, N. et al., Science 294: 1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418: 544-548 (2002); Phillips, M. S. et al., Nature Genet. 33: 382-387 (2003)).
Existem dois métodos principais para definir estes blocos de haplótipo: Blocos podem ser definidos como regiões de DNA que têm diversidade de haplótipo limitada (ver, por exemplo, Daly, M. et al., Nature Genet. 29: 229-232 (2001); Patil, N. et al., Science 294: 1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418: 544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 7335-7339 (2002)) ou como regiões entre zonas de transição tendo recombinação histórica extensiva, identificado usando desequilíbrio de ligação (ver, por exemplo, Gabriel, S. B. et al., Science 296: 2225-2229 (2002); Phillips, M. S. et al., Nature Genet. 33: 382-387 (2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71: 1227-1234 (2002); Stumpf, Μ. P. e Goldstein, D. B., Curr. Biol. 13: 1-8 (2003)). Mais recentemente, um mapa de escala fina de taxas de recombinação e pontos correspondentes através do genoma humano foi gerado (Myers, S., et al., Science 310: 321-32324 (2005); Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34: 526-530 (2006)). O mapa revela a enorme variação na recombinação através do genoma, com taxas de recombinação tão altas quanto 10 a 60 cM/Mb nos pontos, embora mais próximo a 0 nas regiões intervenientes, que assim representam regiões de diversidade de haplótipo limitada e LD alta. O mapa portanto pode ser usado para definir blocos de haplótipo/Blocos LD como regiões flanqueadas pelos pontos de recombinação. Como aqui usado, os termos “bloco de haplótipo” ou “bloco LD” incluem blocos definidos por qualquer uma das características descritas acima ou outros métodos alternativos usados pelas pessoas habilitadas na técnica para definir tais regiões.
Os blocos de haplótipo podem ser usados para mapear associações entre a situação de fenótipo e haplótipo, usando marcadores únicos ou haplótipos que compreendem uma pluralidade de marcadores. Os haplótipos principais podem ser identificados em cada bloco de haplótipo e depois um conjunto de SNPs “rotuladores” ou marcadores (o conjunto menor de SNPs ou marcadores necessários para distinguir entre os haplótipos) podem ser depois identificados. Estes SNPs rotuladores ou marcadores podem ser depois usados na avaliação de amostras de grupos de indivíduos, de modo 5 a identificar a associação entre fenótipo e haplótipo. Se desejado, blocos de haplótipo vizinhos podem ser avaliados concorrentemente, visto que também pode existir desequilíbrio de ligação entre os blocos de haplótipo.
Assim tem se tomado evidente que para qualquer associação observada dada a um marcador polimórfico no genoma, é provável que 10 marcadores adicionais no genoma também mostrem associação. Isto é uma conseqüência natural da distribuição não uniforme de LD através do genoma, como observado pela grande variação em taxas de recombinação. Os marcadores usados para detectar a associação assim em um sentido representa “rótulos” para uma região genômica (isto é, um bloco de haplótipo ou bloco 15 LD) que esteja em associação com uma dada doença ou traço e como tais são úteis para o uso nos métodos e kits da presente invenção. Uma ou mais variantes ou mutações causativas (funcionais) podem residir dentro da região descoberta estar em associação com a doença ou traço. Tais variantes podem conferir um Risco Relativo (RR) ou Razão de Chances (OR) mais altos do 20 que os observados para os marcadores de rotulação usados para detectar a associação. A presente invenção refere-se assim ao marcadores usados para detectar a associação com a doença, como aqui descrito, assim como marcadores em desequilíbrio de ligação com os marcadores. Assim, em certas formas de realização da invenção, marcadores que estão em LD com os 25 marcadores e/ou haplótipos da invenção, como aqui descritos, podem ser usados como marcadores substitutos. Os marcadores substitutos têm em uma forma de realização valores de Risco Relativo (RR) e/ou Razão de Chances (OR) menores do que para os marcadores ou haplótipos inicialmente descobertos estar em associação com a doença, como aqui descrito. Em outras formas de realização, os marcadores substitutos têm valores RR ou OR maiores do que aqueles inicialmente determinados para os marcadores inicialmente descobertos estar em associação com a doença, como aqui descrito. Um exemplo de uma tal forma de realização seria uma variante rara 5 ou em relativamente rara (< 10% de frequência de população alélica) em LD com uma variante mais comum (> 10% de frequência de população) inicialmente descoberto estar em associação com a doença, tais como as variantes aqui descritas. A identificação e uso tais marcadores para detectar a associação descoberta pelos inventores como aqui descrita podem ser 10 realizados pelos métodos de rotina bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e estão portanto dentro do escopo da presente invenção.
É possível que certos marcadores polimórficos em desequilíbrio de ligação com os marcadores aqui mostrados estar associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral estão localizados fora dos limites físicos do bloco LD C04 como aqui definido pela seqüência apresentada na SEQ ID NO: 50. Isto é uma conseqüência das taxas de recombinação histórica na região em questão, que pode ter levado a uma região de LD forte (o bloco LD), com marcadores residuais fora do bloco em LD com marcadores dentro do bloco. Tais marcadores também estão dentro do escopo da presente invenção, visto que também são úteis para praticar a invenção em virtude de sua relação genética com os marcadores aqui mostrados estar associados com a arritmia cardíaca e acidente vascular cerebral. Os exemplos de tais marcadores são mostrados na Tabela 18 (rs7668322 (SEQ ID NO: 46), rs2197815 (SEQ ID NO: 47), rs6831623 (SEQ ID NO: 48), rs2595110 (SEQ ID NO: 49)) Determinação da frequência de haplótipo
As frequências de haplótipos em grupos de paciente e controle podem ser estimadas usando um algoritmo de expectativa-maximização (Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. 8, 39: 1-38 (1977)). Uma implementação deste algoritmo que pode manusear genótipos perdidos e inconstantes com a fase pode ser usada. Sob a hipótese nula, os pacientes e os controles são assumidos ter frequências idênticas. Usando um método de probabilidades, uma hipótese alternativa é testada, onde um haplótipo em risco candidato, que 5 pode incluir os marcadores aqui descritos, é deixado ter uma frequência mais alta em pacientes do que nos controles, enquanto que as razões das frequências de outros haplótipos são assumidos ser as mesmas em ambos os grupos. As probabilidades são maximizadas separadamente sob ambas as hipóteses e uma estatística da razão de probabilidade 1-df correspondente é IO usada para avaliar a significância estatística.
Para examinar quanto aos marcadores e haplótipos em risco e protetores dentro de uma região de ligação, por exemplo, a associação de todas as combinações possíveis de marcadores genotipados é estudada, contanto que estes marcadores transponham uma região prática. Os grupos de 15 paciente e controle combinados podem ser aleatoriamente divididos em dois conjuntos, iguais no tamanho ao grupo original de pacientes e controles. A análise de marcador e haplótipo é depois repetida e o valor p mais significante registrado é determinado, este esquema de randomização pode ser repetido, por exemplo, mais de 100 vezes para construir uma distribuição empírica de 20 valores p. Em uma forma de realização preferida, um valor p de < 0,05 é indicativo de uma associação de marcador e/ou haplótipo significante.
Análise de Haplótipo
Um método geral para a análise de haplótipo envolve o uso da inferência com base na probabilidade aplicada ao Modelos Abrigados 25 (Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet. 35: 131-38 (2003)). O método é implementado no programa NEMO, que permite muitos marcadores polimórficos, SNPs e microssatélites. O método e software são especificamente planejados para os estudos de controle de caso onde o propósito é identificar grupos de haplótipo que conferem riscos diferentes. Este também é uma ferramenta para estudar estruturas LD. Em NEMO, as estimativas de probabilidade máxima, as razões de probabilidade e os valores p são calculados diretamente, com a ajuda do algoritmo EM, para os dados observados tratando-os como um problema de dados perdidos.
5 Embora testes da razão de probabilidade com base nas
probabilidades computadas diretamente para os dados observados, que têm capturado a perda de informação devido à incerteza na fase e genótipos perdidos, podem ser confiado para dar valores p válidos, seria ainda de interesse saber quanta informação foi perdida devido à informação que está 10 incompleta. A medida de informação para a análise de haplótipo é descrita em Nicolae e Kong (Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, University of Chicago; Biometrics, 60(2): 368-75 (2004)) como uma extensão natural de medidas de informação definidas para a análise de ligação e é implementada em NEMO.
Para a associação de marcador único a uma doença, o teste
exato de Fisher pode ser usado para calcular valores p de dois lados para cada alelo individual. Usualmente, todos os valores p são apresentados não ajustados para comparações múltiplas a menos que especificamente indicado. As frequências apresentadas (para microssatélites, SNPs e haplótipos) são 20 frequências alélicas como oposto às frequências do carregador. Para minimizar qualquer tendência devido á relacionabilidade dos pacientes que foram recrutados como famílias para a análise de ligação, as relações de primeiro e segundo grau podem ser eliminadas da lista de paciente. Além disso, o teste pode ser repetido para associação corrigindo quanto a qualquer 25 relacionabilidade remanescente entre os pacientes, pela extensão de um procedimento de ajuste de variação descrito em Risch, N. & Teng, J. (Genome Res., 8: 1273-1288 (1998)), reunião de DNA (Jibid) para sibships de modo que possa ser aplicado às relações familiares gerais e apresenta valores p tanto ajustados quanto não ajustados para comparação. As diferenças são em uma maneira geral muito pequenas como esperado. Para avaliar a significância da associação de marcador único corrigido para teste múltiplo nós podemos realizar um teste de randomização usando os mesmos dados de genótipo. Os grupos de pacientes e controles podem ser randomizados e a 5 análise de associação refeita múltiplas vezes (por exemplo, até 500.000 vezes) e o valor p é a fração de replicações que produziu um valor p para algum alelo marcador que é mais baixo do que ou igual ao valor p que nós observamos usando os grupos de paciente e controle originais.
Para as análises tanto de marcador quanto de haplótipo únicos, 10 o Risco Relativo (RR) e o risco atribuível à população (PAR) podem ser calculados assumindo um modelo multiplicativo (modelo Risco Relativo de haplótipo) (Terwilliger, J. D. & Ott, J., Hum. Hered. 42: 337-46 (1992) e Falk, C. T. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3): 227-33 (1987)), isto é, que os riscos dos dois alelos/haplótipos que uma pessoa carrega 15 multiplicam-se. Por exemplo, se RR é o risco de um em relação a um, então o risco de uma pessoa homozigota AA será RR vezes aquele de um Aa heterozigoto e RR2 vezes aquele de um aa homozigoto. O modelo multiplicativo tem uma boa propriedade que simplifica a análise e computações — os haplótipos são independentes, isto é, em equilíbrio de 20 Hardy-Weinberg, dentro da população afetada assim como dentro da população de controle. Como uma conseqüência, as contagens de haplótipo dos afetados e controles cada um tem distribuições multinomiais, mas com frequências de haplótipo diferentes sob a hipótese alternativa. Especificamente, para dois haplótipos, Zz1 e Zz7, Hsco(Zz2)Zrisco(Zz7) = (fIpdKfJPj)> 25 onde f e p denotam, respectivamente, frequências na população afetada e na população de controle. Enquanto existe alguma perda de energia se o modelo verdadeiro não é multiplicativo, a perda tende a ser branda exceto para casos extremos. Mais importantemente, os valores p são sempre válidos visto que eles são computados com respeito à hipótese nula. Desequilíbrio de ligação Usando NEMO
LD entre pares de marcadores pode ser calculado usando a definição padrão de D’ e r2 (Lewontin, R., Genetics 49: 49-67 (1964); Hill9 W. G. & Robertson5 A. Theor. Appl. Genet. 22: 226-231 (1968)). Usando 5 NEMO, as frequências das duas combinações de alelo marcador são estimadas pela probabilidade máxima e o desvio de equilíbrio de ligação é avaliado por um teste de razão de probabilidade. As definições de D’ e r são prolongadas para incluir microssatélites pelo cálculo em média em relação aos valores para todas as combinações de alelo possíveis dos dois marcadores 10 pesados pelas probabilidades de alelo marginal. Quando da plotagem de todas as combinações de marcador para elucidar a estrutura LD em uma região particular, nós plotamos D’ no canto superior esquerdo e o valor p no canto inferior direito. Nas plotagens de LD os marcadores podem ser plotados equidistantes ao invés de acordo com a sua localização física, se desejado.
Avaliação de Risco e Diagnósticos
Como aqui descrito, certos marcadores polimórficos e haplótipos que compreendem tais marcadores são descobertos ser úteis para a avaliação de risco da arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral. A avaliação de risco pode envolver o uso 20 dos marcadores para diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral. Os alelos particulares de marcadores polimórficos são encontrados mais frequentemente em indivíduos com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral, do que em 25 indivíduos sem diagnose de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral. Portanto, estes alelos marcadores têm valor preditivo para detectar a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral, em um indivíduo. Os marcadores
de rotulação dentro dos blocos de haplótipo ou Blocos LD que compreendem
marcadores em risco, tais como os marcadores da presente invenção, podem
ser usados como substitutos para outros marcadores e/ou haplótipos dentro do
2 .
5 bloco de haplótipo ou bloco LD. Marcadores com valores de r iguais a 1 são substitutos perfeitos para as variantes em risco, isto é, genótipos para um marcador perfeitamente prognostica genótipos para o outro. Marcadores com valores de r menores do que 1 também podem ser substitutos para a variante de risco ou alternativamente representam variantes com valores de Risco 10 Relativo tão alto ou possivelmente ainda mais alto do que a variante de risco. A variante de risco identificada pode não ser a própria variante funcional, mas está neste caso em desequilíbrio de ligação com a variante funcional verdadeira. A presente invenção abrange a avaliação de tais marcadores substitutos para os marcadores como aqui divulgados. Tais marcadores são 15 anotados, mapeados e listados em bases de dados públicas, como bem conhecido pela pessoa habilitada ou alternativamente podem ser facilmente identificados pelo sequenciamento da região ou uma parte da região identificada pelos marcadores da presente invenção em um grupo de indivíduos e identificam polimorfismos no grupo resultante de seqüências. 20 Como uma conseqüência, a pessoa habilitada na técnica pode facilmente e sem experimentação indevida genotipar marcadores substitutos em desequilíbrio de ligação com os marcadores e/ou haplótipos como aqui descritos. A rotulação ou marcadores substitutos em LD com as variantes em risco detectadas, também têm valor preditivo para detectar a associação para a 25 arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral, em um indivíduo. Esta rotulação ou marcadores substitutos que estão em LD com os marcadores da presente invenção também podem incluir outros marcadores que distinguem entre haplótipos, visto que estes similarmente têm valor preditivo para detectar a suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Os marcadores e haplótipos da invenção, por exemplo, os 5 marcadores apresentados nas Tabelas 5 e 9, assim como marcadores em desequilíbrio de ligação com estes podem ser úteis para a avaliação de risco e propósitos de diagnóstico para, sozinho ou em combinação. Assim, mesmo em casos onde o aumento no risco pelas marcadores individuais é relativamente modesto, isto é, da ordem de 10 a 30%, a associação pode ter 10 implicações significantes. Assim, variantes relativamente comuns podem ter contribuição significante para o risco global (o Risco Atribuível à População é alto) ou a combinação de marcadores pode ser usada para definir grupos de indivíduos que, com base no risco combinado dos marcadores, está em risco combinado significante de desenvolver a doença.
Assim, em uma forma de realização da invenção, uma
pluralidade de variantes (marcadores e/ou haplótipos) é usada para a avaliação global de risco. Estas variantes estão em uma forma de realização selecionada das variantes como aqui divulgadas. Outras formas de realização incluem o uso das variantes da presente invenção em combinação com outras variantes 20 conhecidas serem úteis para diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em tais formas de realização, a situação genotípica de uma pluralidade de marcadores e/ou haplótipos é determinada em um indivíduo e a situação do indivíduo comparada com a frequência da população das variantes 25 associadas ou a frequência das variantes em pacientes clinicamente saudáveis, tais como pacientes igualados em idade e igualados em sexo. Métodos conhecidos na técnica, tais como a análise multivariada ou análise de risco em comum, podem ser subsequentemente usados para determinar o risco global conferido com base na situação genotípica nos locais múltiplos. A avaliação de risco com base em tal análise pode ser subsequentemente usada nos métodos e kits da invenção, como aqui descrito.
Como descrito no acima, a estrutura de bloco de haplótipo do genoma humano tem o efeito que um número grande de variantes 5 (marcadores e/ou haplótipos) em desequilíbrio de ligação com a variante originalmente associada com uma doença ou traço pode ser usado como marcadores substitutos para avaliar a associação com a doença ou traço. O número de tais marcadores substitutos dependerão de fatores tais como a taxa de recombinação histórica na região, a frequência mutacional na região (isto 10 é, o número de sítios polimórficos ou marcadores na região) e o grau de LD (tamanho do bloco LD) na região. Estes marcadores estão usualmente localizados dentro dos limites físicos do bloco LD ou bloco de haplótipo em questão como definido usando os métodos aqui descritos ou pelos outros métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Entretanto, algumas 15 vezes a associação de marcador e haplótipo é descoberta prolongar-se além dos limites físicos do bloco de haplótipo como definido. Tais marcadores e/ou haplótipos nestes casos também podem ser usados como marcadores e/ou haplótipos substitutos para os marcadores e/ou haplótipos que fisicamente residem dentro do bloco de haplótipo como definido. Como uma
conseqüência, marcadores e haplótipos em LD (tipicamente caracterizados
2 · 2 2 porr maior do que 0,1, tal com r maior do que 0,2, incluindo r maior do que
φ 2
0,3, também incluindo r maior do que 0,4) com os marcadores e haplótipos
da presente invenção também estão dentro do escopo da invenção, mesmo se
eles estão fisicamente localizados além dos limites do bloco de haplótipo
como definido. Isto inclui marcadores que são aqui descritos (por exemplo,
Tabelas 5 e 9), mas também podem incluir outros marcadores que estão em < 2
LD forte (caracterizados por r maior do que 0,1 ou 0,2 e/ou |D’| > 0,8) com um ou mais dos marcadores listados nas Tabelas 5 e 9.
Para os marcadores de SNP aqui descritos, o alelo oposto ao alelo descoberto estar em excesso em pacientes (alelo em risco) é descoberto em frequência diminuída em pacientes com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Estes marcadores e haplótipos em LD e/ou que compreendem tais marcadores, são 5 assim protetores para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Isto é, eles conferem um risco ou suscetibilidade diminuídos de indivíduos que carregam estes marcadores e/ou haplótipos desenvolverem arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Certas variantes da presente invenção, incluindo certos
haplótipos compreendem, em alguns casos, uma combinação de vários marcadores genéticos, por exemplo, SNPs e microssatélites. A detecção de haplótipos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica e/ou aqui descritos para detectar seqüências em sítios polimórficos. Além disso, a 15 correlação entre certos haplótipos ou conjuntos de marcadores e fenótipo de doença pode ser verificada usando técnicas padrão. Um exemplo representativo de um teste simples para a correlação seria um teste exato de Fisher em uma tabela dois por dois.
Em formas de realização específicas, um marcador ou 20 haplótipo descoberto estar associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, (por exemplo, marcadores como listados na Tabela 5 (Tabelas 5A e 5B), Tabela 9 e/ou Tabela 19 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes) é um em que o alelo ou haplótipo marcadores estão mais frequentemente presentes em um 25 indivíduo em risco para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (afetado), comparado com a frequência da sua presença em um indivíduo saudável (controle), em que a presença do alelo ou haplótipo marcadores é indicativa de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em outras formas de realização, marcadores em desequilíbrio de ligação em risco com um ou mais marcadores descobertos estar associados com a arritmia cardíaca (por 5 exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (por exemplo, alelos marcadores como listados nas Tabelas 5A e 5B e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes) são marcadores de rotulação que estão mais frequentemente presentes em um indivíduo em risco para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular 10 cerebral (afetado), comparado com a frequência da sua presença em um indivíduo saudável (controle), em que a presença dos marcadores de rotulação é indicativa de suscetibilidade aumentada para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em uma outra forma de realização, alelos marcadores em risco (isto é, que 15 conferem suscetibilidade aumentada) em desequilíbrio de ligação com um ou mais marcadores descobertos estar associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, (por exemplo, alelos marcadores como listados nas Tabelas 5A e 5B e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes), são marcadores que compreendem um 20 ou mais alelos que estão mais frequentemente presentes em um indivíduo em risco para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral comparado com a frequência da sua presença em um indivíduo saudável (controle), em que a presença dos marcadores é indicativa de suscetibilidade aumentada para a arritmia cardíaca (por 25 exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. População de estudo
Em um sentido geral, os métodos e kits da invenção podem ser utilizados de amostras contendo DNA genômico de qualquer fonte, isto é, qualquer indivíduo. Em formas de realização preferidas, o indivíduo é um indivíduo humano. O indivíduo pode ser um adulto, criança ou feto. A presente invenção também fornece a avaliação de marcadores e/ou haplótipos em indivíduos que são membros de uma população alvo. Uma tal população alvo é em uma forma de realização uma população ou grupo de indivíduos em 5 risco de desenvolver a doença, com base em outros fatores genéticos, biomarcadores, parâmetros biofísicos (por exemplo, peso, BMD, pressão sanguínea) ou saúde geral e/ou estilo de vida (por exemplo, história de doença ou doenças relacionadas, diagnóstico anterior de doença, história familiar de doença).
A invenção fornece formas de realização que incluem
indivíduos de subgrupos de idade específica, tais com aqueles acima da idade de 40, acima da idade de 45 ou acima da idade de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85. Outras formas de realização da invenção dizem respeito a outros grupos de idade, tais com indivíduos de idade menor do que 85, tal com menor do 15 que a idade de 80, menor do que a idade de 75 ou menor do que idade de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou idade de 30. Outras formas de realização dizem respeito a indivíduos com idade no início da doença em qualquer uma das faixas de idade descritas acima. Também é considerado que uma faixa de idades pode ser relevante em certas formas de realização, tal com a idade no 20 início maior do que a idade de 45 porém menor do que a idade de 60. Outras faixas de idade entretanto também são consideradas, incluindo todas as faixas de idade agrupadas pelos valores de idade listados acima.
Outras formas de realização relacionadas com os indivíduos com idade no início da doença na idade particular ou faixa de idade. Assim, é 25 conhecido que fatores de predisposição, genéticos e não genéticos, podem afetar em qual idade um indivíduo desenvolve uma doença. Para distúrbios cardiovasculares, incluindo arritmias cardíacas e acidente vascular cerebral, os fatores de risco comuns podem influenciar se e em qual idade, um indivíduo desenvolve a doença. Algumas formas de realização da invenção I 63
portanto dizem respeito à idade no início ou idade no diagnóstico de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e/ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral em uma certa faixa de idade. Em uma forma de realização, os indivíduos em risco para desenvolver arritmia cardíaca (por exemplo, 5 fibrilação atrial e/ou flúter atrial) ou acidente vascular cerebral têm a idade no início ou idade no diagnóstico acima da idade de 40. Em outras formas de realização, os indivíduos têm idade no início ou idade no diagnóstico acima da idade de 45 ou acima da idade de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85. Outras formas de realização da invenção dizem respeito aos indivíduos que têm uma 10 idade no início ou idade no diagnóstico em idade menor do que 85, tal com menor do que a idade de 80, menor do que a idade de 75 ou menor do que a idade de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ou a idade de 30. Uma forma de realização preferida inclui indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial ou flúter atrial ou acidente vascular cerebral abaixo da idade de 80. Uma outra 15 forma de realização preferida diz respeito a indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial ou flúter atrial ou acidente vascular cerebral abaixo da idade de 70. Uma outra forma de realização preferida, diz respeito a indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial ou flúter atrial ou acidente vascular cerebral abaixo da idade de 60. Ainda uma outra forma de realização 20 preferida diz respeito a indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial ou flúter atrial ou acidente vascular cerebral abaixo da idade de 50. Outras formas de realização dizem respeito a indivíduos com idade no início da doença em faixas de idade específicas, descritas acima. Também é considerado que uma faixa de idades pode ser relevante em certas formas de 25 realização, tal com a idade no início maior do que a idade de 45 porém menor do que a idade de 60, idade no início na idade maior do que 60 e menor do que a idade de 70, idade no início na idade maior do que 70 e menor do que 80 ou idade no início na idade maior do que 60 e menor do que 80. Outras faixas de idade entretanto também são consideradas, incluindo todas as faixas de idade agrupadas pelos valores de idade listados acima.
A invenção além disso diz respeito a indivíduos de qualquer sexo, masculino ou feminino. Esta também fornece formas de realização que dizem respeito a pacientes humanos que são de uma ou mais populações 5 humanas incluindo, mas não limitadas à, Banto, Mandenk, Yoruba, San, Mbuti, Pigméia, Órcades, Adygel, Russa, Sarda, Toscana, Mozabite, Beduína, Drusa, Palestina, Balochi, Brahui, Makrani, Sindi, Pathan, Burusho, Hazara, Uigur, Kalash, Han, Dai, Daur, Hezhen, Lahu, Miao, Orogen, She, Tujia, Tu, Xibo, Yi, Mongoliana, Naxi, Cambojana, Japonesa, Yakut, Melanésia, 10 Papuásia, Karitianan, Surui, Colombiana, Maia e Pima. A invenção também diz respeito às populações Européias, populações Americanas, populações Eurasianas, populações Asiáticas, populações Asiáticas Central/Meridional, populações Asiáticas Orientais, populações do oriente Médio, populações Africanas, populações Hispânicas e populações Oceânicas. As populações 15 Européias incluem, mas não são limitadas às populações Sueca, Norueguesa, Filandesa, Russa, Dinamarquesa, Islandesa, Irlandesa, Celta, Inglesa, Escocesa, Holandesa, Belga, Francesa, Alemã, Espanhola, Portuguesa, Italiana, Polonesa, Búlgara, Eslava, Sérvia, Bósnia, Checa, Grega e Turca.
Em uma forma de realização preferida, a invenção diz respeito 20 às populações que incluem a ancestralidade africana negra tais com populações que compreendem pessoas de descendência ou linhagem africana. A ancestralidade africana negra pode ser determinada pela auto denominação como Africano-Americanos, Afro-Americanos, Americanos Pretos, sendo um membro da raça preta ou sendo um membro da raça negra. Por exemplo, 25 Americanos Africanos ou Americanos Pretos são aquelas pessoas que vivem na América do Norte e tendo origens em qualquer um dos grupos raciais pretos da África. Em um outro exemplo, as pessoas auto-denominadas de ancestralidade africana preta podem ter pelo menos um parente de ancestralidade africana preta ou pelo menos um avô de ancestralidade africana preta.
A contribuição racial em pacientes individuais também pode ser determinada pela análise genética. A análise genética de ancestralidade pode ser realizada usando marcadores de microssatélite não ligados tais com 5 aqueles demonstrado em Smith et al. (Am J Hum Genet 74, 1001-13 (2004)).
Em certas formas de realização, a invenção diz respeito a marcadores e/ou haplótipos identificados em populações específicas, como descritos acima. A pessoa habilitada na técnica avaliará que as medidas de desequilíbrio de ligação (LD) podem dar resultados diferentes quando
aplicadas em populações diferentes. Isto é devido à história de população diferente de populações humanas diferentes assim como pressões seletivas diferenciais que podem ter levado às diferenças no LD em regiões genômicas específicas. Também é bem conhecido para a pessoa habilitada na técnica que certos marcadores, por exemplo marcadores de SNP, são polimórficos em 15 uma população mas não em uma outra. A pessoa habilitada na técnica entretanto aplicará os métodos disponíveis e como aqui divulgado ?? para praticar a presente invenção em qualquer população humana dada. Isto pode incluir a avaliação de marcadores polimórficos na região LD da presente invenção, de modo a identificar aqueles marcadores que dão associação mais 20 forte dentro da população específica. Assim, as variantes em risco da presente invenção podem residir em fundos de haplótipo diferentes e em frequências diferentes em várias populações humanas. Entretanto, utilizando os métodos conhecidos na técnica e os marcadores da presente invenção, a invenção pode ser praticada em qualquer população humana dada.
Utilidade do Teste Genético
A pessoa habilitada na técnica avaliará e entenderá que as variantes aqui descritas em uma maneira geral, por elas mesmas, não fornecem uma identificação absoluta de indivíduos que desenvolverão a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. As variantes aqui descritas entretanto indicam a probabilidade aumentada e/ou diminuída de que os indivíduos carreguem as variantes em risco ou protetoras da invenção desenvolverão sintomas associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter 5 atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Esta informação é entretanto extremamente valiosa por si só, como esboçado em mais detalhes abaixo, visto poder ser usada, por exemplo, para iniciar medidas preventivas em um estágio inicial, realizar exames físicos e/ou mentais regulares para monitorar a progressão e/ou aparecimento de sintomas ou para programar exames em um 10 intervalo regular para identificar a condição em questão, de modo a ser capaz de aplicar tratamento em um estágio inicial.
O conhecimento em tomo de uma variante genética que confere um risco de desenvolver arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral oferece a oportunidade de aplicar um teste genético para distinguir entre indivíduos com risco aumentado de desenvolver a doença (isto é, carregadores da variante de risco) e aqueles com risco diminuído de desenvolver a doença (isto é, carregadores da variante protetor). Os valores de núcleo de teste genético, para indivíduos que pertencem a ambos dos grupos mencionados acima, são as possibilidades de ser capaz de diagnosticar a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma predisposição para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral em um estágio inicial e fornecer informação para o médico a cerca do prognóstico de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral de modo a ser capaz de aplicar o tratamento mais apropriado.
Os indivíduos com uma história familiar de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e portadores de variantes em risco podem se beneficiar do teste genético visto que o conhecimento da presença de um fator de risco genético ou evidência para risco aumentado de ser um portador de um ou mais fatores de risco, pode fornecer incentivo aumentado para implementar um estilo de vida mais saudável, evitando-se ou minimizando-se fatores de risco ambientais 5 conhecidos para as doenças cardiovasculares relacionadas com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. O teste genético de pacientes com arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral além disso pode dar informação valiosa a cerca da causa primária da doença e pode 10 ajudar ao médico na seleção das melhores opções de tratamento e medicação para cada indivíduo.
A presente invenção além disso diz respeito à avaliação de risco para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, incluindo determinar se um indivíduo está em 15 risco para desenvolver arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Os marcadores polimórficos da presente invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação, assim como em combinação com outros fatores, incluindo outros fatores de risco genético ou biomarcadores, para a avaliação de risco de um indivíduo para a arritmia 20 cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Muitos fatores conhecidos afetar a predisposição de um indivíduo para desenvolver risco de doença cardiovascular são fatores de suscetibilidade para as arritmias cardíacas (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica 25 e podem ser utilizados em tal avaliação. Estes incluem, mas não são limitados a, idade, gênero, a situação do ato de fumar, atividade física, razão da circunferência da cintura para quadril, história familiar de arritmia cardíaca (em particular fibrilação atrial e/ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral anteriormente diagnosticado, obesidade, hipertrigliceridemia, colesterol HDL baixo, hipertensão, pressão sanguínea elevada, níveis de colesterol, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos, níveis da apolipoproteína Al e B, níveis de fibrinogênio, ferritina, proteína 5 reativa C e leucotrieno. Os biomarcadores particulares que foram associados com a Fibrilação atrial/Flúter atrial e acidente vascular cerebral são debatidos em Allard et al. (Clin Chem 51: 2043-2051 (2005) e Becker (J Thromb Trombolys 19: 71-75 (2005)). Estes incluem, mas não são limitados a, dímero D da fibrina, fragmento de ativação da protrombina 1,2 (F1,2), complexos de 10 trombina-antitrombina III (TAT), fibrinopeptídeo A (FPA), fosfolipase associada à lipoproteína A2 (lp-PLA2), beta-tromboglobulina, fator de plaqueta 4, P-selectina, Fator de von Willebrand, peptídeo pró-natriurético (BNP), metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9), PARK7, difosfato cinase de nucleosídeo (NDKA), tau, enolase específica de neurônio, fator de 15 crescimento neurotrófico tipo B, proteína astroglial S-100b, proteína ácida fibrilar glial, proteína reativa C, amilóide A sérico, metaloproteinase de matriz 9, moléculas de adesão celular vascular e intracelular, fator alfa de necrose de tumor e interleucinas, incluindo interleucina 1, 6 e 8). As células progenitoras circulantes também foram implicadas como sendo 20 biomarcadores úteis para o AF. Em formas de realização particulares, mais do que um biomarcador é determinado para um indivíduo e combinado com resultados de uma determinação de pelo menos um marcador polimórfico como aqui descrito. Preferivelmente, o biomarcador é medido no plasma ou soro do indivíduo. Alternativamente, o biomarcador é determinado em outros 25 tecidos adequados contendo quantidades mensuráveis do biomarcador e tais formas de realização também estão dentro do escopo da invenção.
Os métodos conhecidos na técnica podem ser usados para a avaliação de risco global, incluindo análises multivariadas ou logística de regressão. A fibrilação atrial é uma doença de enorme significância tanto para o paciente individual quanto para o sistema de saúde pública como um todo. Esta pode ser uma condição permanente mas também pode ser paroxísmica e recorrente caso este em que a mesma pode ser muito desafiadora para diagnosticar. A complicação mais devastadora da fibrilação atrial e flúter atrial é a ocorrência do acidente vascular cerebral debilitante. Importantemente o risco de acidente vascular cerebral é igual na fibrilação atrial permanente e paroxísmica. Foi repetidamente mostrado que a terapia com a anticoagulação com varfarina pode significantemente reduzir o risco do primeiro ou episódios adicionais de acidente vascular cerebral no cenário da fibrilação atrial. Por essa razão, a anticoagulação com varfarina é a terapia padrão para quase todos os pacientes com fibrilação atrial para a prevenção de acidente vascular cerebral, tenham eles a do tipo permanente ou paroxísmico. Os únicos pacientes para os quais a varfarina não é fortemente recomendada são aqueles mais jovens do que 65 anos de idade que são considerados de baixo risco, isto é, eles não têm nenhuma doença cardíaca orgânica, incluindo, nem hipertensão nem doença da artéria coronária, nenhuma história anterior de acidente vascular cerebral ou Ataques Isquêmicos Transitórios e nenhuma diabete. Este grupo tem um risco mais baixo de acidente vascular cerebral e a prevenção do acidente vascular cerebral com aspirina é recomendada.
Devido à natureza da fibrilação atrial paroxísmica pode ser muito difícil de diagnosticá-la. Quando o paciente procura atendimento médico devido aos sintomas relacionados com a doença, tais com palpitações, dor no peito, encurtamento da respiração, tontura, insuficiência cardíaca, 25 Ataques Isquêmicos Transitórios ou mesmo acidente vascular cerebral, o ritmo cardíaco normal pode ser prontamente restabelecido impedindo o diagnóstico da arritmia. Nestes casos o monitoramento do ritmo cardíaco é frequentemente aplicado na tentativa de diagnosticar a condição. O ritmo cardíaco é habitualmente monitorado continuamente por 24 a 48 horas. Infelizmente os episódios de fibrilação atrial são imprevisíveis e frequentemente perdidos por este método. A oportunidade para diagnosticar a arritmia, estabelecer a terapia recomendada e possivelmente prevenir um enfraquecer o primeiro acidente vascular cerebral ou recorrente pode ser 5 perdida com resultados devastadores para o paciente. Medidas de monitoramento do ritmo cardíaco prolongado e mais complexo são disponíveis e aplicados ocasionalmente quando a suspeita de fibrilação atrial é muito forte. Estes testes são caros, o rendimento de diagnóstico com método corrente é frequentemente baixo e eles são usados escassamente para esta 10 indicação. Nestas circunstâncias o risco adicional de estratificação com teste genético pode ser extremamente útil. Entendendo que o indivíduo em questão carrega uma variante genética em risco ou uma protetora pode ser uma contribuição inestimável para a motivação da decisão de diagnóstico e/ou tratamento. Deste modo, em alguns casos, teste e terapia desnecessárias 15 podem ser evitadas e em outros casos, com a ajuda de método de diagnóstico mais agressivo, a arritmia pode ser diagnosticada e/ou terapia apropriada iniciada e complicações posteriores de doença diminuídas.
MÉTODOS DA INVENÇÃO
Métodos para a avaliação de risco de arritmia cardíaca (por 20 exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral são aqui descritos e são abrangidos pela invenção. A invenção também abrange métodos de avaliar um indivíduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapêutico para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, assim como métodos para 25 prognosticar a eficácia de um agente terapêutico para tratar pacientes com arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Kits para ensaiar uma amostra de um paciente para detectar a suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral também são abrangidos pela invenção.
Diagnóstico e ensaios de triagem da invenção
Em certas formas de realização, a presente invenção diz respeito aos métodos de diagnosticar ou ajudar no diagnóstico de, arritmia 5 cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, pela detecção de alelos particulares em marcadores genéticos que aparecem mais frequentemente na arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter 10 atrial) e/ou pacientes de acidente vascular cerebral ou pacientes que são suscetíveis para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em uma forma de realização particular, a invenção é um método de diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular 15 cerebral pela detecção de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico (por exemplo, o marcadores aqui descrito). A presente invenção descreve métodos por meio dos quais a detecção de alelos particulares de marcadores ou haplótipos particulares é indicativa de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou 20 acidente vascular cerebral. Tais ensaios de prognóstico ou preditivos também podem ser usados para determinar tratamento profilático de um paciente antes do início dos sintomas de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
A presente invenção diz respeito em algumas formas de 25 realização aos métodos de aplicações clínicas de diagnóstico, por exemplo, diagnóstico realizado por um profissional médico, que pode incluir uma avaliação ou determinação de variantes de risco genético e a sua interpretação. Em outras formas de realização, a invenção diz respeito aos métodos de avaliação de risco (ou diagnóstico) realizados por um leigo ou um profissional não médico. Avanços tecnológicos recentes em tecnologias de genotipagem, incluindo a genotipagem de alto rendimento de marcadores de SNP, tal como a tecnologia de arranjo de Sonda de Inversão Molecular (por exemplo, Affymetrix GeneChip) e BeadArray Technologies (por exemplo, 5 ensaios Illumina GoldenGate e Infmium) têm tomado possível para os indivíduos ter seu próprio genoma avaliado por grande número de variações simultaneamente ou até um milhão de SNPs. A informação de genótipo resultante, tomada disponível para o indivíduo, pode ser comparada à informação da literatura científica pública a cerca dos riscos associados com a 10 doença ou traço com vários SNPs. A aplicação em diagnóstico de alelos associados com doença como aqui descrita, pode ser assim realizada por um profissional de saúde com base nos resultados de um teste clínico ou por um leigo ou profissional não médico, incluindo um indivíduo que fornece serviço para realizar uma avaliação de SNPs através da genotipagem de SNP, em uma 15 base de SNP individual ou pelos métodos de alto rendimento em escala grande tal com as tecnologias de série. Em outras palavras, o diagnóstico ou avaliação de uma suscetibilidade com base no risco genético pode ser feito pelos profissionais de saúde, conselheiro genético, fornecedores de serviços de genótipo ou pelo leigo, com base na informação a cerca de seu genótipo e 20 publicações em vários fatores de risco. No presente contexto, o termo “diagnosticar” e “diagnóstico de uma suscetibilidade”, é intencionado a se referir a qualquer método de diagnóstico disponível, incluindo aqueles mencionados acima.
Além disso, em certas outras formas de realização, a presente 25 invenção diz respeito aos métodos de diagnosticar ou auxiliar no diagnóstico de, uma suscetibilidade diminuída para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pela detecção de alelos marcadores ou haplótipos genéticos particulares que aparecem menos frequentemente em pacientes com arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral do que no indivíduo não diagnosticado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou na população geral.
Como aqui descrito e exemplificado, alelos marcadores ou 5 haplótipos particulares (por exemplo os marcadores e haplótipos como listados na Tabela 5 (Tabelas 5A e 5B) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, por exemplo, os marcadores listados nas Tabelas 4 e/ou 9 marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, por exemplo, os marcadores como apresentados na Tabela 19) são associados com a arritmia 10 cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em uma forma de realização, o alelo marcador ou haplótipo é um que confere um risco ou suscetibilidade significantes para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um método de 15 diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, o método compreendendo determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um 20 marcador polimórfico é selecionado do grupo que consiste dos marcadores polimórficos listados nas Tabelas 5A e 5B e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito aos métodos de diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral em 25 um indivíduo humano, pela triagem quanto a pelo menos um alelo marcador ou haplótipo como listados nas Tabelas 5A e 5B ou marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o alelo marcador ou haplótipo é mais frequentemente presentes em um paciente tendo ou que é suscetível à, arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (afetado), quando comparado com a frequência da sua presença em um paciente saudável (controle, tal com controle da população). Em certas formas de realização, a significância da associação do pelo menos um alelo marcador ou haplótipo é caracterizada por 5 um valor p < 0,05. Em outras formas de realização, a significância da associação é caracterizada pelos valores p menores, tais como < 0,01, < 0,001, < 0,0001, < 0,00001, < 0,000001, < 0,0000001, < 0,00000001 ou < 0,000000001.
Nestas formas de realização, a presença do pelo menos um 10 alelo marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Estes métodos de diagnóstico envolvem detectar a presença ou ausência de pelo menos um alelo marcador ou haplótipo que estejam associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter 15 atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Os haplótipos aqui descritos incluem combinações de alelos em vários marcadores genéticos (por exemplo, SNPs, microssatélites). A detecção dos alelos marcadores genéticos particulares que compõem os haplótipos particulares pode ser realizada por uma variedade de métodos aqui descritos e/ou conhecidos na técnica. Por exemplo, marcadores 20 genéticos podem ser detectados ao nível de ácido nucleico (por exemplo, pelo sequenciamento de nucleotídeo direto ou por outros meios conhecidos pelos habilitados na técnica) ou ao nível de aminoácido se o marcador genético afeta a seqüência codificadora de uma proteína codificada por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou 25 flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (por exemplo, pelo sequenciamento de proteína ou pelos imunoensaios usando anticorpos que reconhecem uma tal proteína). Os alelos marcadores ou haplótipos da presente invenção correspondem aos fragmentos de uma seqüência de DNA genômico associada com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Tais fragmentos abrangem a seqüência de DNA do marcador polimórfico ou haplótipo em questão, mas também podem incluir segmentos de DNA em forte LD (desequilíbrio de ligação) com o marcador ou haplótipo. Em uma forma de realização, tais 5 segmentos compreendem segmentos em LD com o marcador ou haplótipo como determinado por um valor de r2 maior do que 0,2 e/ou |D’| > 0,8.
Em uma forma de realização, o diagnóstico de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pode ser realizado usando 10 métodos de hibridização, tais como a análise de Southern, análise de Northern, e/ou hibridizações in situ (ver Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, incluindo todos os suplementos). Uma amostra biológica de um paciente ou indivíduo de teste (uma “amostra de teste”) de DNA genômico, RNA ou cDNA é obtida de um 15 paciente suspeito de ter, estando suscetível a ou predisposto para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (o “paciente de teste”). O paciente pode ser um adulto, criança ou feto. A amostra de teste pode ser de qualquer fonte que contenha DNA genômico, tal com uma amostra de sangue, amostra de fluido amniótico, 20 amostra de fluido cerebrospinal ou amostra de tecido da pele, músculo, mucosa bucal ou conjuntiva, placenta, trato gastrointestinal ou outros órgãos. Uma amostra de teste de DNA de células ou tecido fetais pode ser obtida pelos métodos apropriados, tal com pela amniocentese ou amostragem de vilo coriônico. As amostras de DNA, RNA ou cDNA são depois examinadas. A 25 presença de um alelo marcador específico pode ser indicada pela Hibridização específica de seqüência de uma sonda de ácido nucleico específica para o alelo particular. A presença de mais do que um alelo marcador específico ou um haplótipo específico pode ser indicada pelo uso de diversas sondas de ácido nucleico específicas de seqüência, cada uma sendo específica para um alelo particular. Em uma forma de realização, um haplótipo pode ser indicado por uma única sonda de ácido nucleico que é específica para o haplótipo específico (isto é, hibridiza especificamente a um filamento de DNA que compreende os alelos marcadores específicos característicos do haplótipo).
5 Uma sonda específica de seqüência pode ser direcionada para hibridizar ao DNA genômico, RNA ou cDNA. Uma “sonda de ácido nucleico”, como aqui usada, pode ser uma sonda de DNA ou uma sonda de RNA que hibridiza a uma seqüência complementar. Uma pessoa de habilidade na técnica saberia como planejar uma tal sonda de modo que a hibridização específica de 10 seqüência ocorrerá apenas se um alelo particular está presente em uma seqüência genômica de uma amostra de teste.
Para diagnosticar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, uma amostra de hibridização é formada contatando-se a amostra de teste 15 contendo um ácido nucleico associado com a fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral, tal com uma amostra de DNA genômico, com pelo menos uma sonda de ácido nucleico. Um exemplo não limitante de uma sonda para detectar mRNA ou DNA genômico é uma sonda de ácido nucleico rotulada que é capaz de hibridizar às seqüências de mRNA ou DNA genômico aqui 20 descritas. A sonda de ácido nucleico pode ser, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de tamanho natural ou uma porção desta, tal com um oligonucleotídeo de pelo menos 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos no comprimento que é suficiente para hibridizam especificamente sob condições severas ao mRNA ou DNA genômico apropriados. A sonda de ácido nucleico 25 pode ser de até 1000 ou mais nucleotídeos no comprimento, incluindo até 500 nucleotídeos, 400 nucleotídeo, 300 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou 100 nucleotídeos. Certas formas de realização incluem sondas de nucleotídeo que são de 15 a 1000 nucleotídeos no comprimento. Outras formas de realização dizem respeito ao uso de sondas de nucleotídeo que são de 15 a 500 nucleotídeos no comprimento ou de 15 a 400 nucleotídeos no comprimento ou de 20 a 400 nucleotídeos no comprimento. Outras faixas de tamanho das sondas de nucleotídeo da invenção são consideradas, como bem conhecidos pela pessoa habilitada. Em uma forma de realização, a sonda de ácido 5 nucleico pode compreender toda ou uma porção da seqüência de nucleotídeo de bloco LD C04, como aqui descrita, opcionalmente compreendendo pelo menos um alelo de um marcador aqui descrito ou pelo menos um haplótipo aqui descrito ou a sonda pode ser a seqüência complementar de uma tal seqüência. Em uma forma de realização particular, a sonda de ácido nucleico 10 é uma porção da seqüência de nucleotídeo de bloco LD C04 como apresentada na SEQ ID NO: 50 ou, como aqui descrita, opcionalmente compreendendo pelo menos um alelo de um marcador aqui descrito ou pelo menos um alelo de um marcador polimórfico ou haplótipo que compreende pelo menos um marcador polimórfico aqui descrito ou a sonda pode ser a 15 seqüência complementar de uma tal seqüência. Outras sondas adequadas para o uso nos ensaios de diagnóstico da invenção são aqui descritas. A hibridização pode ser realizada pelos métodos bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, incluindo todos os 20 suplementos). Em uma forma de realização, a hibridização refere-se à hibridização específica, isto é, hibridização sem nenhum desemparelhamento (hibridização exata). Em uma forma de realização, as condições de hibridização para a hibridização específica são severidade alta.
A hibridização específica, se presente, é detectada usando 25 métodos padrão. Se a hibridização específica ocorre entre a sonda de ácido nucleico e o ácido nucleico na amostra de teste, então a amostra contém o alelo que é complementar ao nucleotídeo que está presente na sonda de ácido nucleico. O processo pode ser repetido para quaisquer marcadores da presente invenção ou marcadores que compõem um haplótipo da presente invenção ou sondas múltiplas podem ser usadas concorrentemente para detectar mais do que um dos alelos marcadores ao mesmo tempo. Também é possível planejar uma única sonda contendo mais do que um dos alelos marcadores de um haplótipo particular (por exemplo, uma sonda contendo alelos 5 complementares a 2, 3, 4, 5 ou a todos os marcadores que compõem um haplótipo particular). A detecção dos marcadores particulares do haplótipo na amostra é indicativa de que a fonte da amostra tem o haplótipo particular (por exemplo, um haplótipo) e portanto é suscetível para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Em um outro método de hibridização, a análise de Northern
(ver Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, supra) é usada para identificar a presença de um polimorfismo associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Para a análise de Northern, uma 15 amostra de teste de RNA é obtida do paciente por meios apropriados. Como aqui descrito, a hibridização específica de uma sonda de ácido nucleico ao RNA do paciente é indicativa de um alelo particular complementar à sonda. Para exemplos representativos de uso de sondas de ácido nucleico, ver, por exemplo, Patente U.S. Nes 5.288.611 e 4.851.330.
Adicional ou alternativamente, uma sonda de ácido nucleico
peptídico (PNA) pode ser usada além ou invés de, uma sonda de ácido nucleico nos métodos de hibridização aqui descritos. Um PNA é uma imitação de DNA tendo uma cadeia principal como peptídeo, inorgânica, tal com unidades de N-(2-aminoetil)glicina, com uma base orgânica (A, G, C, T 25 ou U) ligada ao nitrogênio da glicina por intermédio de um ligador de metileno carbonila (ver, por exemplo, Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5: 3-7 (1994)). A sonda de PNA pode ser planejada para hibridizar especificamente a uma molécula em uma amostra suspeita de conter um ou mais dos alelos marcadores ou haplótipos que estão associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. A hibridização da sonda de PNA é assim diagnóstico para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, 5 fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Em uma forma de realização da invenção, uma amostra de teste contendo DNA genômico obtida do paciente é coletada e a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é usada para amplificar um fragmento que compreende um ou mais marcadores ou haplótipos da presente invenção. 10 Como aqui descrito, a identificação de um alelo marcador ou haplótipo particulares associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, pode ser realizada usando uma variedade de métodos (por exemplo, análise de seqüência, análise pela digestão de restrição, hibridização específica, ensaios de polimorfismo de 15 conformação de filamento simples (SSCP), análise eletroforética, etc.). Em uma outra forma de realização, o diagnóstico é realizado pela análise de expressão usando a PCR quantitativa (ciclagem térmica cinética). Esta técnica, por exemplo, pode utilizar tecnologias comercialmente disponíveis, tais com TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). A técnica pode 20 avaliar a presença de uma alteração na expressão ou composição de um polipeptídeo ou variante(s) de junção que é/são codificada(s) por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Além disso, a expressão da(s) variante(s) pode ser quantificada como física ou funcionalmente diferente.
Em um outro método da invenção, a análise pela digestão de
restrição pode ser usada para detectar um alelo particular se o alelo resulta na criação ou eliminação de um sítio de restrição em relação a uma seqüência de referência. A análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) pode ser conduzida, por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, supra. O padrão de digestão do fragmento de DNA relevante indica a presença ou ausência do alelo particular na amostra.
A análise de seqüência também pode ser usada para detectar alelos ou haplótipos específicos associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (por exemplo os marcadores polimórficos da Tabela 5 (Tabelas 5 A e 5B), Tabela 9 e/ou Tabela 19). Portanto, em uma forma de realização, a determinação da presença ou ausência de um alelo marcador ou haplótipo particulares compreende a análise de seqüência de uma amostra de teste de DNA ou RNA obtida de um paciente ou indivíduo. A PCR ou outro métodos apropriados podem ser usados para amplificar uma porção de um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e a presença de um alelo específico pode ser depois detectada diretamente pelo sequenciamento do sítio polimórfico (ou sítios polimórficos múltiplos em um haplótipo) do DNA genômico na amostra.
Os oligonucleotídeos específicos de alelo também podem ser usados para detectar a presença de um alelo particular em um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, (por exemplo os marcadores 20 polimórficos da Tabela 5 (Tabelas 5A e 5B), Tabela 9 e/ou Tabela 19), através do uso de hibridização de ponto-mancha de oligonucleotídeos amplificados com sondas de oligonucleotídeo específicas de alelo (ASO) (ver, por exemplo, Saiki, R. et al., Nature, 324: 163-166 (1986)). Um “oligonucleotídeo específico de alelo” (também aqui aludido como uma 25 “sonda de oligonucleotídeo específica de alelo”) é um oligonucleotídeo de aproximadamente IOa 500 pares de base, aproximadamente 15 a 400 pares de base, aproximadamente 15 a 200 pares de base, aproximadamente 15 a 100 pares de base, aproximadamente 15 a 50 pares de base ou aproximadamente 15 a 30 pares de base, que especificamente hibridizam a um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e que contém um alelo específico em um sítio polimórfico (por exemplo, um marcador ou haplótipo como aqui descrito). Uma sonda de oligonucleotídeo específica de alelo que é específica 5 para um ou mais ácidos nucleicos particulares associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pode ser preparada usando métodos padrão (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra). A PCR pode ser usada para amplificar a região desejada. O DNA contendo a região amplificada pode ser 10 submetida a ponto-mancha usando métodos padrão (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra) e a mancha pode ser contatada com a sonda de oligonucleotídeo. A presença de hibridização específica da sonda para a região amplificada pode ser depois detectada. A hibridização específica de uma sonda de oligonucleotídeo específica de alelo para DNA do 15 paciente é indicativa de um alelo específico em um sítio polimórfico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (ver, por exemplo, Gibbs, R. et al., Nucleic Acids Res., 17: 2437-2448 (1989) e WO 93/22456).
Com a adição de tais análogos como ácido nucleicos 20 bloqueados (LNAs), o tamanho de iniciadores e sondas pode ser reduzido a tanto quanto 8 bases. LNAs são uma nova classe de análogos de DNA bicíclicos em que as posições 2’ e 4’ no anel de furanose são unidos por intermédio de uma porção de O-metileno (óxi-LNA), S-metileno (tio-LNA) ou amino metileno (amino-LNA). Comum a todas destas variantes de LNA é 25 uma afinidade aos ácidos nucleicos complementares, que é de longe a mais alta relatada para um análogo de DNA. Por exemplo, todos os nonâmeros óxi- LNA particulares foram mostrados ter temperaturas de fusão (Tm) de 64°C e 74°C quando em complexo com DNA ou RNA complementares, respectivamente, como oposto a 28°C tanto para DNA quanto RNA para o nonâmero de DNA correspondente. Aumentos substanciais na Tm também são obtidos quando monômeros de LNA são usados em combinação com monômeros de DNA ou RNA padrão. Para iniciadores e sondas, dependendo de onde os monômeros de LNA são incluídos (por exemplo, na extremidade 5 3’, na extremidade 5’ ou no centro), a Tm pode ser consideravelmente aumentada.
Em uma outra forma de realização, arranjos de sondas de oligonucleotídeo que são complementares aos segmentos de seqüência de ácido nucleico alvo de um paciente, podem ser usados para identificar 10 polimorfismos em um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral (por exemplo os marcadores polimórficos das Tabelas 5A e 5B e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes). Por exemplo, um arranjo de oligonucleotídeo pode ser usado. Arranjos de oligonucleotídeo tipicamente 15 compreendendo uma pluralidade de sondas de oligonucleotídeo diferentes que são ligadas a uma superfície de um substrato em locais conhecidos diferentes. Estes arranjos de oligonucleotídeo, também descritos como “Genechips®,” foram em uma maneira geral descritos na técnica (ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 5.143.854, Publicações de Patente PCT Nes WO 90/15070 e 20 92/10092). Estes arranjos em uma maneira geral podem ser produzidos usando métodos de síntese mecânicas ou métodos de síntese direcionadas por luz que incorporam uma combinação de métodos fotolitográficos e métodos de síntese de oligonucleotídeo de fase sólida ou por outros métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Fodor, S. et 25 al., Science, 251: 767-773 (1991); Pirrung et al, Patente U.S. N2 5.143.854 (ver também Pedido PCT publicado N2 WO 90/15070); e Fodor. S. et al., Pedido PCT publicado N2 WO 92/10092 e Patente U.S. N2 5.424.186, as divulgações inteiras de cada um dos quais são aqui incorporadas por referência). As técnicas para a síntese destes arranjos usando métodos de síntese mecânicas são descritas, por exemplo, na Patente U.S. N- 5.384.261; as divulgações inteiras das quais são aqui incorporadas por referência. Em um outro exemplo, arranjos lineares podem ser utilizados. Descrições adicionais de uso de arranjos de oligonucleotídeo para a detecção de polimorfismos 5 podem ser encontradas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nsi 5.858.659 e 5.837.832, as divulgações inteiras de ambas das quais são aqui incorporadas por referência.
Outros métodos de análise de ácido nucleico que são disponíveis para aqueles habilitados na técnica podem ser usados para 10 detectar um alelo particular em um sítio polimórfico associado com a fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral (por exemplo os marcadores polimórficos da Tabela 5 (Tabelas 5A e 5B), Tabela 9 e/ou Tabela 19). Os métodos representativos incluem, por exemplo, o sequenciamento manual direto (Church e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1991-1995 (1988); 15 Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 74: 5463-5467 (1977); Beavis, et al., Patente U.S. N2 5.288.644); sequenciamento fluorescente automatizado; ensaios de polimorfismo de conformação de filamento simples (SSCP); eletroforese em gel desnaturante clampeado (CDGE); eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) (Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 20 USA, 86: 232-236 (1989)), análise de mudança de mobilidade (Orita, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86: 2766-2770 (1989)), análise de enzima de restrição (Flavell, R., et al., Cell, 15: 25-41 (1978); Geever, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 5081-5085 (1981)); análise de heteroduplex; clivagem de desemparelhamento químico (CMC) (Cotton, R., et al., Proc. 25 Natl. Acad. Sei. USA, 85: 4397-4401 (1985)); ensaios de proteção da RNase (Myers, R., et al., Science, 230: 1242-1246 (1985); uso de polipeptídeos que reconhecem desemparelhamentos de nucleotídeo, tais com a proteína mutS da E. coli; e PCR específica de alelo.
Em uma outra forma de realização da invenção, o diagnóstico de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pode ser feita pelo exame da expressão e/ou composição de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral nestes casos onde o(s) marcador(es) genético(s) ou haplótipo(s) da presente invenção resultam em uma mudança na composição ou expressão do polipeptídeo. Assim, o diagnóstico de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pode ser feito examinando-se a expressão e/ou composição de um destes polipeptídeos ou um outro polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, nestes casos onde o marcador ou haplótipo genéticos da presente invenção resulta em uma mudança na composição ou expressão do polipeptídeo. Os haplótipos e marcadores da presente invenção que mostram associação para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral podem desempenhar um papel através do seu efeito sobre um ou mais destes genes vizinhos (por exemplo, o gene PITX2). Mecanismos possíveis que afetam estes genes incluem, por exemplo, efeitos sobre a transcrição, efeitos sobre a união de RNA, alterações nas quantidades de relação de formas unidas alternativas de mRNA, efeitos sobre a estabilidade do RNA, efeitos sobre o transporte do núcleo para o citoplasma e efeitos sobre a eficiência e precisão da tradução.
Assim, em uma outra forma de realização, as variantes (marcadores ou haplótipos) da invenção que mostra a associação para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral afetam a expressão de um gene vizinho. É bem conhecido que a expressão de gene que afeta elemento regulatório pode estar localizado a dezenas ou mesmo centenas de quilobases longe da região promotora de um gene. Ensaiando-se quanto a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico da presente invenção, é assim possível
r
5 avaliar o nível de expressão de tais genes vizinhos. E assim considerado que a detecção dos marcadores ou haplótipos da presente invenção pode ser usada para avaliar a expressão quanto a um ou mais genes que são ligados à arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Uma variedade de métodos podem ser usados para detectar os
níveis de expressão de proteína, incluindo ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA), Western blots, imunoprecipitações e imunofluorescência. Uma amostra de teste de um paciente é avaliada quanto a presença de uma alteração na expressão e/ou uma alteração na composição do polipeptídeo 15 codificada por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Uma alteração na expressão de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral pode ser, por exemplo, uma 20 alteração na expressão de polipeptídeo quantitativa (isto é, a quantidade de polipeptídeo produzida). Uma alteração na composição de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral é uma alteração na expressão de polipeptídeo qualitativa (por exemplo, 25 expressão de um polipeptídeo mutante ou de uma variante de união diferente). Em uma forma de realização, o diagnóstico de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral é feita pela detecção de uma variante de junção particular codificada por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou um padrão particular de variantes de união.
Ambas de tais alterações (quantitativa e qualitativa) também podem estar presentes. Uma “alteração” na expressão ou composição de 5 polipeptídeo, como aqui usada, refere-se a uma alteração na expressão ou composição em uma amostra de teste, quando comparada à expressão ou composição do polipeptídeo em uma amostra de controle. Uma amostra de controle é uma amostra que corresponde à amostra de teste (por exemplo, é do mesmo tipo de células) e é de um paciente que não é afetado por, e/ou que 10 não tem uma suscetibilidade para, arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em uma forma de realização, a amostra de controle é de um paciente que não possui um alelo marcador ou haplótipo como aqui descrito. Similarmente, a presença de uma ou mais variantes de união diferentes na amostra de teste ou a presença de 15 quantidades significantemente diferentes de variantes de união diferentes na amostra de teste, quando comparado com a amostra de controle, pode ser indicativa de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Uma alteração na expressão ou composição do polipeptídeo na amostra de teste, quando 20 comparada com a amostra de controle, pode ser indicativa de um alelo específico no caso onde o alelo altera um sítio de união em relação à referência na amostra de controle. Vários meios de examinar a expressão ou composição de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica e podem ser usados, incluindo 25 espectroscopia, colorimetria, eletroforese, focalização isoelétrica e imunoensaios (por exemplo, David et al., Pat. U.S. N- 4.376.110) tal com imunomanchamento (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, particularmente o capítulo 10, supra).
Por exemplo, em uma forma de realização, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo com um rótulo detectável) que é capaz de ligar a um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral podem ser usados. Anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Um anticorpo intacto ou um fragmento deste (por exemplo, Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2) podem ser usados. O termo “rotulado”, com respeito à sonda ou anticorpo, é intencionado abranger a rotulação direta da sonda ou anticorpo pela ligação (isto é, ligando fisicamente) uma substância detectável à sonda ou anticorpo, assim como rotulação indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com um outro reagente que é diretamente rotulado. Os exemplos de rotulação indireta incluem detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário rotulado (por exemplo, um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado) e rotulação de extremidade de uma sonda de DNA com biotina tal que a mesma possa ser detectada com estreptavidina fluorescentemente rotulada.
Em uma forma de realização deste método, o nível ou a quantidade de polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral em uma amostra de teste são comparados com o nível ou 20 quantidade do polipeptídeo em uma amostra de controle. Um nível ou quantidade do polipeptídeo na amostra de teste que é mais alta ou mais baixa do que o nível ou quantidade do polipeptídeo na amostra de controle, tal que a diferença é estatisticamente significante, é indicativa de uma alteração na expressão do polipeptídeo codificada pelo ácido nucleico e é diagnóstico para 25 um alelo ou haplótipo particulares responsáveis por causar a diferença na expressão. Alternativamente, a composição do polipeptídeo em uma amostra de teste é comparada com a composição do polipeptídeo em uma amostra de controle. Em uma outra forma de realização, tanto o nível ou quantidade quanto a composição do polipeptídeo podem ser avaliados na amostra de teste e na amostra de controle.
Em uma outra forma de realização, o diagnóstico de uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral é feita pela detecção de pelo 5 menos um marcador ou haplótipos da presente invenção (por exemplo, alelos associados dos marcadores listados nas Tabelas 5A e 5B e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes), em combinação com um ensaio com base em proteína, com base em RNA ou com base em DNA adicionais. Os métodos da invenção também podem ser usados em combinação com uma 10 análise de uma história da família do paciente e fatores de risco (por exemplo, fatores de risco ambientais, fatores de risco do estilo de vida).
Kits
Os kits úteis nos métodos e procedimentos da invenção compreendem componentes úteis em qualquer um dos métodos aqui descritos, 15 incluindo por exemplo, sondas de hibridização, enzimas de restrição (por exemplo, para a análise de RFLP), oligonucleotídeos específico de alelos, anticorpos que se ligam a um polipeptídeo alterado codificado por um ácido nucleico da invenção como aqui descrita (por exemplo, um segmento genômico que compreende pelo menos um marcador polimórfico e/ou 20 haplótipo da presente invenção) ou a um polipeptídeo não alterado (nativo) codificado por um ácido nucleico da invenção como aqui descrita, meios para a amplificação de um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, meios para analisar a seqüência de ácido nucleico de um ácido nucleico 25 associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, meios para analisar a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico associado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral, etc. Os kits podem por exemplo incluir tampões necessários, iniciadores de ácido nucleico para amplificar ácidos nucleicos da invenção (por exemplo, um ou mais dos marcadores polimórficos como aqui descritos) e reagentes para a detecção específica de alelo dos fragmentos amplificados usando tais iniciadores e enzimas necessárias (por exemplo, 5 DNA polimerase). Adicionalmente, os kits podem fornecer reagentes para os ensaios a serem usados em combinação com os métodos da presente invenção, por exemplo, reagentes para o uso com ensaios de diagnóstico para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral.
Em uma forma de realização, a invenção é um kit para ensaiar
uma amostra de um paciente para detectar a presença de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral em um paciente, em que o kit 15 compreende reagentes necessários para detectar seletivamente pelo menos um alelo de pelo menos um polimorfismo da presente invenção no genoma do indivíduo. Em uma forma de realização particular, os reagentes compreendem pelo menos um oligonucleotídeo contíguo que hibridiza a um fragmento do genoma do indivíduo que compreende pelo menos um polimorfismo da 20 presente invenção. Em uma outra forma de realização, os reagentes compreendem pelo menos um par de oligonucleotídeos que hibridizam aos filamentos opostos de um segmento genômico obtido de um paciente, em que cada par de iniciador de oligonucleotídeo é planejado para amplificar seletivamente um fragmento do genoma do indivíduo que inclui pelo menos 25 um polimorfismo, em que o polimorfismo é selecionado do grupo que consiste dos polimorfismos como listados nas Tabelas 5A e 5B e marcadores polimórficos em desequilíbrio de ligação com estes. Ainda em uma outra forma de realização o fragmento tem pelo menos 20 pares de base no tamanho. Tais oligonucleotídeos ou ácidos nucleicos (por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo) podem ser planejados usando porções da seqüência de ácido nucleico que flanqueiam polimorfismos (por exemplo, SNPs ou microssatélites) que são indicativos de arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Em 5 uma outra forma de realização, o kit compreende um ou mais ácidos nucleicos rotulados capazes de detecção específica de alelo de um ou mais marcadores polimórficos ou haplótipos específicos associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e reagentes para detecção do rótulo. Os rótulos adequados incluem, por 10 exemplo, um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo de enzima, um rótulo de co-fator de enzima, um rótulo magnético, um rótulo de spin, um rótulo de epítopo.
Em formas de realização particulares, o marcador polimórfico ou haplótipo a serem detectados pelos reagentes do kit compreende um ou mais marcadores, dois ou mais marcadores, três ou mais marcadores, quatro ou mais marcadores ou cinco ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dos marcadores nas Tabelas 5A e 5B. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreendem os marcadores listados nas Tabelas 5A e 5B. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreende os marcadores listados nas Tabelas 4 e 9. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreendem pelo menos um marcador do grupo de marcadores em forte desequilíbrio de ligação, como definido pelos valores de r maiores do que 0,2, a pelo menos um do grupo de marcadores que consiste dos marcadores listados nas Tabelas 5 A e 5B. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreende
pelo menos um marcador dos marcadores em forte desequilíbrio de ligação,
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como definido pelos valores de r maiores do que 0,2, a pelo menos um do
grupo de marcadores que consiste dos marcadores listados nas Tabelas 4 e 9. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreendem o marcador rs2220427 (SEQ ID NO: 1) ou marcador rsl033464 (SEQ ID NO: 41) ou marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma outra forma de realização, o marcador ou 5 haplótipo a serem detectados compreendem pelo menos um dos marcadores apresentados na Tabela 19. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo a serem detectados compreendem os marcadores D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 10 (SEQ ID NO: 51) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Ainda em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo compreendem os alelos em risco 2, 4 e/ou 8 no marcador D4S406, alelo A do marcador rs2634073, alelo T do marcador rs2200733, alelo T do marcador rs2220427, alelo T do marcador rs 10033464, e/ou alelo G do marcador rsl3143308. Em 15 uma tal forma de realização, o desequilíbrio de ligação é definido pelos valores de r maiores do que 0,1. Em uma outra de tal forma de realização, o desequilíbrio de ligação é definido pelos valores de r2 maiores do que 0,2.
Em uma forma de realização preferida, o kit para detectar os marcadores da invenção compreende uma sonda de oligonucleotídeo de 20 detecção, que hibridiza a um segmento de DNA padrão contendo um polimorfismo de SNP a ser detectado, uma sonda de oligonucleotídeo realçadora e uma endonuclease. Como explicado no acima, a sonda de oligonucleotídeo de detecção compreende uma porção fluorescente ou grupo no seu terminal 3 ’ e um arrefecedor no seu término 5 ’ e um oligonucleotídeo 25 realçador, é utilizado, como descrito por Kutyavin et al. (Nucleic Acid Res. 34: el28 (2006)). A porção fluorescente pode ser Gig Harbor Green ou Yakima Yellow ou outras porções fluorescentes adequadas. A sonda de detecção é planejada para hibridizar a uma seqüência de nucleotídeo curta que inclui o polimorfismo SNP a ser detectado. Preferivelmente, o SNP está em qualquer lugar do resíduo terminal até 6 resíduos da extremidade 3 ’ da sonda de detecção. O realçador é uma sonda de oligonucleotídeo curta que hibridiza ao padrão de DNA 3’ em relação à sonda de detecção. As sondas são planejadas tal que um único intervalo de nucleotídeo existe entre a sonda de detecção e a sonda de nucleotídeo realçadora quando ambos são ligados ao padrão. O intervalo cria um sítio abásico sintético que é reconhecido por uma endonuclease, tal com Endonuclease IV. A enzima cliva o pigmento fora da sonda de detecção totalmente complementar, mas não pode clivar uma sonda de detecção contendo um desempearelhamento. Assim, medindo-se a fluorescência da porção fluorescente liberada, a avaliação da presença de um alelo particular definido pela seqüência de nucleotídeo da sonda de detecção pode ser realizada.
A sonda de detecção pode ser de qualquer tamanho adequado, embora preferivelmente a sonda seja relativamente curta. Em uma forma de realização, a sonda tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento. Em uma outra forma de realização, a sonda é de 10 a 50 nucleotídeos no comprimento e em uma outra forma de realização, a sonda é de 12 a 30 nucleotídeos no comprimento. Outros comprimentos da sonda são possíveis e dentro do escopo da habilidade da pessoa média habilitada na técnica.
Em uma forma de realização preferida, o padrão de DNA contendo o polimorfismo de SNP é amplificado pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) antes da detecção e iniciadores para tal amplificação são incluídos no kit de reagente. Em uma tal forma de realização, o DNA amplificado serve como o padrão para a sonda de detecção e a sonda realçadora.
Certas formas de realização da sonda de detecção, a sonda realçadora e/ou os iniciadores usados para a amplificação do padrão pela PCR incluem o uso de bases modificadas, incluindo A modificada e G modificada. O uso de bases modificadas pode ser útil para ajustar a temperatura de fusão da molécula de nucleotídeo (sonda e/ou iniciador) para o DNA padrão, por exemplo para aumentar a temperatura de fusão em regiões contendo uma porcentagem baixa de bases G ou C, em que A modificada com a capacidade de formar três ligações de hidrogênio ao seu T complementar pode ser usada 5 ou para diminuir a temperatura de fusão em regiões contendo uma alta porcentagem de bases G ou C, por exemplo pelo uso de bases G modificadas que formam apenas duas ligações de hidrogênio à sua base C complementar em uma molécula de DNA de filamento duplo. Em uma forma de realização preferida, as bases modificadas são usadas no planejamento da sonda de 10 detecção nucleotídica. Qualquer base modificada conhecida pela pessoa habilitada pode ser selecionada nestes métodos e a seleção de bases adequadas está bem dentro do escopo da pessoa habilitada com base nas divulgações aqui contidas e bases conhecidas disponíveis de fontes comerciais como conhecido pela pessoa habilitada.
Em uma de tais formas de realização, a presença do marcador
ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade (suscetibilidade aumentada ou suscetibilidade diminuída) para fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral. Em uma outra forma de realização, a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de resposta ao agente terapêutico para a fibrilação atrial 20 e/ou acidente vascular cerebral. Em uma outra forma de realização, a presença do marcador ou haplótipo é indicativa do prognóstico de fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral. Ainda em uma outra forma de realização, a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de progresso do tratamento da fibrilação atrial e/ou acidente vascular cerebral. Tal tratamento pode incluir a 25 intervenção pela cirurgia, medicação ou por outros meios (por exemplo, mudanças no estilo de vida).
Agentes terapêuticos
Variantes da presente invenção (por exemplo, os marcadores e/ou haplótipos da invenção, por exemplo, os marcadores listados nas Tabelas 5A e 5Β e/ou Tabela 19) podem ser usados para identificar novos alvos terapêuticos para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Por exemplo, genes contendo ou em desequilíbrio de ligação com, variantes (marcadores e/ou haplótipos) 5 associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou seus produtos, assim como genes ou seus produtos que são direta ou indiretamente regulados pela OR interagem com estes genes variantes ou seus produtos, podem ser alvejados para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para tratar arritmia cardíaca (por 10 exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou prevenir ou retardar o início de sintomas associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Os agentes terapêuticos podem compreender um ou mais de, por exemplo, moléculas pequenas que não de proteína e não de ácido nucleico, proteínas, 15 peptídeos, fragmentos de proteína, ácidos nucleicos (DNA, RNA), PNA (ácidos nucleicos peptídicos) ou seus derivados ou miméticos que podem modular a função e/ou níveis dos genes alvo ou seus produtos de gene.
Os ácidos nucleicos e/ou variantes da invenção ou ácidos nucleicos que compreendem a sua seqüência complementar, podem ser 20 usados como construções de anti-sentido para controlar a expressão de gene em células, tecidos ou órgãos. A metodologia associada com técnicas de anti- sentido é bem conhecida para o técnico habilitado e é descrito e revisado em Antisense Drug Technology: Principies, Strategies and Applications, Crooke, ed., Marcel Dekker Inc., Nova Iorque (2001). Em uma maneira geral, as 25 moléculas de ácido nucleico de anti-sentido são planejadas para serem complementares a uma região de mRNA expressada por um gene, de modo que a molécula de anti-sentido hibridiza ao mRNA, bloqueando assim a tradução do mRNA em proteína. Diversas classes de oligonucleotídeo de anti- sentido são conhecidos por aqueles habilitados na técnica, incluindo clivadores e bloqueadores. O primeiro liga-se aos sítios de RNA alvo, ativam nucleases intracelulares (por exemplo, RnaseH ou Rnase L), que clivam o RNA alvo. Os bloqueadores se ligam ao RNA alvo, inibem a tradução da proteína pelo impedimento estérico dos ribossomas. Os exemplos de bloqueadores incluem ácidos nucleicos, compostos de morfolino, ácido nucleicos bloqueados e metilfosfonatos (Thompson, Drug Discovery Today, 7: 912-917 (2002)). Oligonucleotídeos de anti-sentido são úteis diretamente como agentes terapêuticos e também são úteis para determinar e validar a função de gene, por exemplo pelo silenciamento de gene ou eliminação de gene. A tecnologia de anti-sentido é ainda descrita em Lavery et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devei. 6: 561-569 (2003), Stephens et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5: 118-122 (2003), Kurreck, Eur. J. Biochem. 270: 1628-44 (2003), Dias et al., Mol. Cancer Ter. 1: 347-55 (2002), Chem. Methods Mol. Med. 75: 621-636 (2003), Wang et al., Curr. Cancer Drug Targets 1: 177-96 (2001) e Bennett, Anti-sense Nucleic Acid Drug. Dev. 12: 215-24 (2002).
As variantes aqui descritas podem ser usadas para a seleção e planejamento de reagentes de anti-sentido que são específicos para as variantes particulares. Usando informação a cerca das variantes aqui descritas, oligonucleotídeos de anti-sentido ou outras moléculas de anti-sentido que 20 especificamente alvejam moléculas de mRNA que contêm uma ou mais variantes da invenção podem ser planejados. Desta maneira, a expressão de moléculas de mRNA que contém uma ou mais variantes da presente invenção (marcadores e/ou haplótipos) podem ser inibidos ou bloqueados. Em uma forma de realização, as moléculas de anti-sentido são planejadas para ligar 25 especificamente uma forma alélica particular (isto é, uma ou diversas variantes (alelos e/ou haplótipos)) do ácido nucleico alvo, inibindo deste modo a tradução de um produto que se origina deste alelo ou haplótipo específicos, mas que não se ligam a outras variantes ou variantes alternativas nos sítios polimórficos específicos da molécula de ácido nucleico alvo. Visto que as moléculas de anti-sentido podem ser usadas para inativar mRNA de modo a inibir a expressão de gene e assim a expressão de proteína, as moléculas podem ser usadas para tratar uma doença ou distúrbio, tal com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou 5 acidente vascular cerebral. A metodologia pode envolver a clivagem por meio de seqüências de nucleotídeo complementares contendo ribozimas a uma ou mais regiões no mRNA que atenuam a capacidade do mRNA para ser traduzido. Tais regiões de mRNA incluem, por exemplo, regiões que codificam proteína, em particular regiões que codificam proteína que 10 correspondem à atividade catalítica, substrato e/ou sítios de ligação de ligando ou outros domínios funcionais de uma proteína.
O fenômeno da interferência de RNA (RNAi) foi ativamente estudado na última década, visto que a sua descoberta original em C. elegans (Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998)) e em anos recentes o seu uso 15 potencial no tratamento de doença humana tem sido ativamente procurado (revisado em Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8: 173-204 (2007)). A interferência de RNA (RNAi), também chamada de silenciamento de gene, está fundamentada no uso de moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA) para desligar genes específicos. Na célula, as moléculas de RNA de filamento 20 duplo citoplásmicas (dsRNA) são processadas pelos complexos celulares em RNA interferente pequeno (siRNA). O siRNA guia o alvejamento de um complexo de RNA proteína aos sítios específicos em um mRNA alvo, levando à clivagem do mRNA (Thompson, Drug Discovery Today, 7: 912- 917 (2002)). As moléculas de siRNA são tipicamente de cerca de 20, 21, 22 25 ou 23 nucleotídeos no comprimento. Assim, um aspecto da invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico isoladas e ao uso destas moléculas para a interferência de RNA, isto é, como moléculas de RNA interferentes pequenas (siRNA). Em uma forma de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas têm 18 a 26 nucleotídeos no comprimento, preferivelmente 19 a 25 nucleotídeos no comprimento, mais preferivelmente 20 a 24 nucleotídeos no comprimento e mais preferivelmente 21, 22 ou 23 nucleotídeos no comprimento.
Um outro caminho para o silenciamento de gene mediado pelo 5 RNAi origina-se nos transcritos de microRNA primários endogenamente codificados (pri-miRNA), que são processados na célula para gerar miRNA precursor (pré-miRNA). Estas moléculas de miRNA são exportadas do núcleo para o citoplasma, onde elas passam pelo processamento para gerar moléculas de miRNA maduras (miRNA), que direcionam a inibição traducional pelo 10 reconhecimento de sítios alvo nas regiões 3’ não traduzidas de mRNAs e subsequente degradação de mRNA pelo processamento de corpos P (revisado em Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8: 173-204 (2007)).
As aplicações clínicas de RNAi incluem a incorporação de duplexes de siRNA sintéticos, que preferivelmente têm aproximadamente 20 15 a 23 nucleotídeos no tamanho e preferivelmente têm sobreposições em 3 ’ de 2 nucleotídeos. A eliminação da expressão de gene é estabelecida pelo planejamento específico de seqüência para o mRNA alvo. Diversos sítios comerciais para o planejamento ótimo e síntese de tais moléculas são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Outras aplicações fornecem moléculas de siRNA mais longas
(tipicamente de 25 a 30 nucleotídeos no comprimento, preferivelmente cerca de 27 nucleotídeos), assim como RNAs de grampo de cabelo pequenos (shRNAs; tipicamente de cerca de 29 nucleotídeos no comprimento). Os últimos são naturalmente expressados, como descrito em Amarzguioui et al. 25 (FEBS Lett 579: 5974-81 (2005)). siRNAs e shRNAs quimicamente sintéticos são substratos para o processamento in vivo e em alguns casos fornecem silenciamento de gene mais potente do que os projetos mais curtos (Kim et al., Nature Biotechnol. 23: 222-226 (2005); Siolas et al., Nature Biotechnol. 23: 227-231 (2005)). Em uma maneira geral siRNAs fornecem o silenciamento transitório de expressão de gene, porque a sua concentração intracelular é diluída pelas divisões celulares subsequentes. Ao contrário, shRNAs expressados medeiam a eliminação de longa duração, estável de transcritos alvo, contanto que a transcrição do shRNA ocorra (Marques et al., 5 Nature Biotechnol. 23: 559-565 (2006); Brummelkamp et al., Science 296: 550-553 (2002)).
Visto que as moléculas de RNAi, incluindo siRNA, miRNA e shRNA, atuam em uma maneira dependente de seqüência, as variantes da presente invenção (por exemplo, os marcadores e haplótipos associados com bloco LD C04, por exemplo, os marcadores listados nas Tabelas 5A e 5B) podem ser usados para planejar reagentes de RNAi que reconhecem moléculas de ácido nucleico específicas que compreendem alelos e/ou haplótipos específicos (por exemplo, os alelos e/ou haplótipos da presente invenção), enquanto que não reconhece as moléculas de ácido nucleico que compreendem outros alelos ou haplótipos. Estes reagentes de RNAi podem assim reconhecer e destruir as moléculas de ácido nucleico alvo. Como com reagentes de anti-sentido, os reagentes de RNAi podem ser úteis como agentes terapêuticos (isto é, para desligar genes associados com doença ou variantes de gene associados com doença), mas também podem ser úteis para caracterizar e validar a função de gene (por exemplo, pelos experimentos de silenciamento de gene ou eliminação de gene).
A liberação de RNAi pode ser realizada por uma faixa de metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Os métodos de utilizar a liberação não viral incluem colesterol, partícula de ácido nucleico- 25 lipídeo estável (SNALP), fragmento de anticorpo de cadeia pesada (Fab), aptâmeros e nanopartículas. Os métodos de liberação viral incluem o uso de lentivírus, adenovírus e vírus adeno-associados. As moléculas de siRNA são em algumas formas de realização quimicamente modificadas para aumentar a sua estabilidade. Isto pode incluir modificações na posição 2’ da ribose, incluindo 2’-0-metilpurinas e 2’-fluoropirimidinas, que fornecem resistência à atividade de Rnase. Outras modificações químicas são possíveis e conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
As seguintes referências fornecem um outro resumo de RNAi e possibilidades para alvejar genes específicos usando RNAi: Kim & Rossi, Nat. Rev. Genet. 8: 173-184 (2007), Chen & Rajewsky, Nat. Rev. Genet. 8: 93-103 (2007), Reynolds, et al., Nat. Biotechnol. 22: 326-330 (2004), Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 6343-6346 (2003), Vickers et al., J. Biol. Chem. 278: 7108-7118 (2003), Agami, Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 829-834 (2002), Lavery, et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devei. 6: 561-569 (2003), Shi, Trends Genet. 19: 9-12 (2003), Shuey et al., Drug Discov. Today 7: 1040-46 (2002), McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3: 737-747 (2002), Xia et al., Nat. Biotechnol. 20: 1006-10 (2002), Plasterk et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 10: 562-7 (2000), Bosher et al., Nat. Cell Biol. 2: E31-6 (2000) e Hunter, Curr. Biol. 9: R440-442 (1999).
Um defeito genético que leva à predisposição ou risco aumentados para o desenvolvimento de uma doença, incluindo arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou um defeito que causa a doença, podem ser corrigidos 20 permanentemente pela administração a um paciente que carrega o defeito um fragmento de ácido nucleico que incorpora uma seqüência de reparo que fornece o(s) nucleotídeo(s) normal(is)/tipo selvagem no sítio do defeito genético. Tal seqüência de reparo específica de sítio pode concompass um oligonucleotídeo de RNA/DNA que opera para promover o reparo endógeno 25 de um DNA genômico do paciente. A administração da seqüência de reparo pode ser realizada por um veículo apropriado, tal com um complexo com polietilenimina, encapsulado em lipossomas aniônicos, um vetor viral tal com um vetor de adenovírus ou outras composições farmacêuticas adequadas para promover a captação intracelular do ácido nucleico administrado. O defeito genético pode ser depois superado, visto que os oligonucleotídeos quiméricos induzem a incorporação da seqüência normal no genoma do paciente, levando à expressão do produto de gene normal/tipo selvagem. A substituição é propagada, restituindo assim um reparo permanente e alívio dos sintomas 5 associados com a doença ou condição.
A presente invenção fornece métodos para identificar compostos ou agentes que podem ser usados para tratar arritmia cardíaca, por exemplo fibrilação atrial e flúter atrial e acidente vascular cerebral. Assim, as variantes da invenção são úteis como alvos para a identificação e/ou 10 desenvolvimento de agentes terapêuticos. Tais métodos podem incluir ensaiar a capacidade de um agente ou composto para modular a atividade e/ou expressão de um ácido nucleico que inclui pelo menos uma das variantes (marcadores e/ou haplótipos) da presente invenção ou o produto codificado do ácido nucleico. Este por sua vez pode ser usado para identificar agentes ou 15 compostos que inibem ou alteram a atividade ou expressão indesejadas do produto de ácido nucleico codificado. Os ensaios para realizar tais experimentos podem ser realizados em sistemas com base em célula ou em sistemas isentos de célula, como conhecidos pela pessoa habilitada. Os sistemas com base em célula incluem células que expressam naturalmente as 20 moléculas de ácido nucleico de interesse ou células recombinantes que foram geneticamente modificadas de modo a expressar uma certa molécula de ácido nucleico desejada.
A expressão de gene variante em um paciente pode ser avaliada pela expressão de uma seqüência de ácido nucleico contendo 25 variante (por exemplo, um gene contendo pelo menos uma variante da presente invenção, que pode ser transcrita no RNA contendo a pelo menos uma variante e por sua vez traduzida em proteína) ou pela expressão alterada de uma seqüência de ácido nucleico normal/tipo selvagem devido às variantes que afetam o nível ou padrão de expressão dos transcritos normais, por exemplo variantes na região regulatória ou de controle do gene. Ensaios para a expressão de gene incluem ensaios de ácido nucleico diretos (mRNA), ensaios quanto ao nível de proteína expressada ou ensaios de compostos colaterais envolvidos em um caminho, por exemplo um caminho de sinal. Além disso, a expressão de genes que são supra- ou infra-regulados em resposta ao caminho de sinal também podem ser ensaiados. Uma forma de realização inclui ligar operavelmente um gene repórter, tal com luciferase, à região reguladora do(s) gene(s) de interesse.
Moduladores da expressão de gene em uma forma de realização podem ser identificados quando uma célula é contatada com um composto candidato ou agente e a expressão de mRNA é determinada. O nível de expressão de mRNA na presença do composto ou agente candidatos é comparado com o nível de expressão na ausência do composto ou agente. Com base nesta comparação, compostos ou agentes candidatos para tratar distúrbios tais com a fibrilação atrial, flúter atrial e acidente vascular cerebral podem ser identificados como aqueles que modulam a expressão de gene do gene variante. Quando a expressão de mRNA ou a proteína codificada é de modo estatístico significantemente maior na presença do composto ou agente candidatos do que na sua ausência, então o composto ou agente candidatos são identificados como um estimulador ou supra-regulador da expressão do ácido nucleico. Quando a expressão de ácido nucleico ou nível de proteína é de modo estatístico significantemente menor na presença do composto ou agente candidatos do que na sua ausência, então o composto candidato é identificado como um inibidor ou infra-regulador da expressão de ácido nucleico.
A invenção fornece ainda métodos de tratamento usando um composto identificado através da triagem de medicamento (composto e/ou agente) como um gene modulador (isto é, estimulador e/ou inibidor da expressão de gene). Em um outro aspecto da presente invenção, um pacote farmacêutico (kit) é fornecido, o pacote compreendendo um agente terapêutico e um conjunto de instruções para a administração do agente terapêutico aos seres humanos diagnosticamente testado quanto a uma ou 5 mais variantes da presente invenção, como aqui divulgadas. O agente terapêutico pode ser um medicamento de molécula pequena, um anticorpo, um peptídeo, uma molécula de anti-sentido ou RNAi ou outras moléculas terapêuticas. Em uma forma de realização, um indivíduo identificado como um portador de pelo menos uma variante da presente invenção é instruído 10 tomar uma dose prescrita do agente terapêutico. Em uma tal forma de realização, um indivíduo identificado como um portador homozigoto de pelo menos uma variante da presente invenção é instruído tomar uma dose prescrita do agente terapêutico. Em uma outra forma de realização, um indivíduo identificado como um não portador de pelo menos uma variante da 15 presente invenção é instruído tomar uma dose prescrita do agente terapêutico. Métodos de avaliar a probabilidade de resposta aos agentes terapêuticos, métodos de monitorar o progresso de tratamento e métodos de tratamento
Como é conhecido na técnica, indivíduos podem ter respostas diferenciais a uma terapia particular (por exemplo, um agente terapêutico ou 20 método terapêutico). Farmacogenômicos tratam o problema de como variações genéticas (por exemplo, as variantes (marcadores e/ou haplótipos) da presente invenção) afetam a resposta ao medicamento, devido à disposição de medicamento alterada e/ou ação anormal ou alterada do medicamento. Assim, a base da resposta diferencial pode ser geneticamente determinada em 25 parte. Resultados clínicos devido às variações genéticas que afetam a resposta a medicamento podem resultar em toxicidade do medicamento em certos indivíduos (por exemplo, carregadores ou não carregadores das variantes genéticas da presente invenção) ou insuficiência terapêutica do medicamento. Portanto, as variantes da presente invenção podem determinar a maneira em que um agente terapêutico e/ou método atuam sobre o corpo ou o modo em que o corpo metaboliza o agente terapêutico.
Consequentemente, em uma forma de realização, a presença de um alelo particular em um sítio polimórfico ou haplótipo é indicativa de 5 um diferente, por exemplo uma taxa de resposta diferente, a uma modalidade de tratamento particular. Isto significa que um paciente diagnosticado com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e que carrega um certo alelo em um polimórfico ou haplótipo da presente invenção (por exemplo, os alelos em risco e protetores 10 e/ou haplótipos da invenção) responderiam melhor ou pior a um produto terapêutico, medicamento e/ou outra terapia específicos usados para tratar a doença. Portanto, a presença ou ausência do alelo marcador ou haplótipo poderia ajudar na decisão de qual tratamento deva ser usado para um paciente. Por exemplo, para um paciente recém diagnosticado, a presença de um 15 marcador ou haplótipo da presente invenção pode ser avaliada (por exemplo, através de teste de derivado de DNA a partir de uma amostra de sangue, como aqui descrito). Se o paciente é positivo para um alelo marcador ou haplótipo (isto é, pelo menos um alelo específico do marcador ou haplótipo, está presente), então o médico recomenda uma terapia particular, enquanto se o 20 paciente for negativo para o pelo menos um alelo de um marcador ou um haplótipo, então um curso diferente de terapia pode ser recomendada (que pode incluir recomendar que nenhuma terapia imediata, outra que não o monitoramento em série quanto a progressão da doença, seja realizada). Assim, a situação de portador do paciente seria usada para ajudar a determinar 25 se uma modalidade de tratamento particular deve ser administrada. O valor reside dentro das possibilidades de ser capaz de diagnosticar a doença em um estágio inicial, para selecionar o tratamento mais apropriado e fornecer informação ao médico a cerca do prognóstico/agressividade da doença de modo a ser capaz de aplicar o tratamento mais apropriado. Tratamento da Fibrilação atrial e Flúter atrial é em uma maneira geral direcionado por dois objetivos principais: (T) prevenir o acidente vascular cerebral e (n) tratar os sintomas.
(i) Prevenção do Acidente Vascular Cerebral Anticoagulação é a terapia de escolha para a prevenção do
acidente vascular cerebral na fibrilação atrial e é indicada para a maioria dos pacientes com esta arritmia. Os únicos pacientes para os quais a anticoagulação não é fortemente recomendada são aqueles mais jovens do que 65 anos de idade que são considerados de risco baixo, isto é, eles não têm 10 nenhuma doença de coração orgânica, nenhuma hipertensão, nenhuma história anterior de acidente vascular cerebral ou Ataques Isquêmicos Transitórios e nenhuma diabete. Este grupo como um todo tem um risco mais baixo de acidente vascular cerebral e a prevenção do acidente vascular cerebral com aspirina é em uma maneira geral recomendada. Para todos os 15 outros pacientes, a anticoagulação é indicada se a fibrilação atrial é permanente, paroxísmicos recorrentes ou recorrente persistente. Não pode ser generalizado como os pacientes que se apresentam com o seu primeiro episódio de fibrilação atrial paroxísmica deve ser tratado e a decisão precisa ser individualizado para cada paciente. A anticoagulação também é indicada 20 mesmo quando o paciente com fibrilação atrial está sentindo ser mantido em ritmo sinusal com a terapia antiarrítmica (ritmo controlado) visto que este tipo de terapia não afeta o risco de acidente vascular cerebral.
Anticoagulantes. A anticoagulação é recomendada na fibrilação atrial, como detalhado acima, para a prevenção de cardioembolismo 25 e acidente vascular cerebral. O anticoagulante oral mais amplamente estudado é a varfarina e esta medicação é universalmente recomendada para a anticoagulação oral crônica na fibrilação atrial. A varfarina tem poucos efeitos colaterais com a exceção do risco de hemorragia mas requer monitoramento regular e cuidadoso de valores sanguíneos durante a terapia (para medir o efeito da anticoagulação). O anticoagulante oral ximelagatran mostrou-se promissor na prevenção do acidente vascular cerebral em pacientes com fibrilação atrial e teve a vantagem de não requerer o monitoramento regular como a varfarina. Ximelagatran foi descoberto 5 entretanto causar lesão hepática inexplicada e foi retirado do mercado em 2006. Vários agentes estão disponíveis para a terapia intravenosa e/ou subcutânea, incluindo heparina e as heparinas de peso molecular baixo (por exemplo enoxaparina, dalteparina, tinzaparina, ardeparina, nadroparina e reviparina). Estas medicações são recomendadas quando o início rápido da 10 anticoagulação é necessário ou se a terapia de anticoagulação oral tem que ser interrompida em pacientes de alto risco ou por tempo mais longo do que uma semana em outros pacientes por exemplo devido a uma série de procedimentos. Outros anticoagulantes parenterais são disponíveis mas não especificamente recomendados como terapia na fibrilação atrial; por exemplo, 15 os inibidores do fator Xa fondaparinux e idraparinux, os inibidores de trombina lepirudin, bivalirudin e argatroban assim como danaparoid.
(U) Controle de Sintoma. A terapia médica e cirúrgica aplicada ao controle dos sintomas de fibrilação atrial é feita de encomenda para o paciente individual e consiste do controle da frequência e/ou ritmos cardíacos com medicações, remoção por radiofreqüência e/ou cirurgia.
Medicações Antiarritmicas. Em termos gerais, os agentes antiarritmicos são usados para suprimir ritmos anormais do coração que são característicos de arritmias cardíacas, incluindo fibrilação atrial e flúter atrial. Uma classificação de agentes antiarritmicos é a classificação de Vaughan 25 Williams, em que cinco categorias principais de agentes antiarritmicos são definidas. Os agentes de Classe I são bloqueadores rápidos do canal de sódio e são subclassificados com base nas cinéticas e força de bloqueio assim como seu efeito na repolarização. A Classe Ia inclui disopiramida, moricizina, procainamida e quinidina. Os agentes da Classe Ib são lidocaína, mexiletina, tocainida e fenitoina. Os agentes da Classe Ie são encainida, flecainida, propafenona, aimalina, cibenzolina e detaímio. Os agentes de Classe II são bloqueadores beta, eles bloqueiam os efeitos de catecolaminas nos receptores beta-adrenérgicos. Os exemplos de bloqueadores beta são esmolol, 5 propranolol, metoprolol, alprenolol, atenolol, carvedilol, bisoprolol, acebutolol, nadolol, pindolol, labetalol, oxprenotol, penbutolol, timolol, betaxolol, cartelol, sotalol e levobunolol. Os agentes de Classe III têm propriedades mistas mas são coletivamente bloqueadores do canal de potássio e prolongam a repolarização. As medicações nesta categoria são amiodarona, 10 azimilida, bretílio, dofetilida, tedisamil, ibutilida, sematilida, sotalol, N-acetil procainamida, cloridreto de nifecalante, vemacalante e ambasilida. Os agentes de Classe IV são bloqueadores do canal de cálcio e incluem verapamil, mibefradil e diltiazem.
Finalmente, a classe V consiste de antiarritmicos mistos e inclui digoxina e adenosina.
Controle da Frequência Cardíaca. Medidas farmacológicas para a manutenção do controle da frequência cardíaca incluem bloqueadores beta, bloqueadores do canal de cálcio e digoxina. Todas estas medicações diminuem a condução elétrica através do nodo atrioventricular e diminuem a 20 resposta da frequência ventricular para a fibrilação atrial rápida. Alguns antiarritmicos usados primariamente para controle do ritmo (ver abaixo) também diminuem a frequência de condução do nodo atrioventricular e assim a resposta cardíaca à frequência ventricular. Estes incluem algumas medicações da classe III e Ic tais com amiodarona, sotalol e flecainida.
Cardioversão. A cardioversão do ritmo cardíaco da fibrilação
atrial ou flúter atrial para ritmo sinusal pode ser obtido eletricamente, com cardioversão de corrente direta sincronizada ou com medicações tais como ibutilida, amiodarona, procainamida, propafenona e flecainida. Controle do ritmo cardíaco
As medicações usadas para a manutenção do ritmo sinusal, isto é, controle de ritmo, incluem principalmente medicações antiarrítmicas das classes III, Ia e Ic. Os exemplos são sotalol, amiodarona e dofetilida da 5 classe III, disopiramida, procainamida e quinidina da classe Ia e flecinida e propafenona da classe Ic. O tratamento com estas medicações antiarrítmicas é complicada, pode ser perigosa e deve ser direcionado pelos médicos especificamente treinados para o uso destas medicações. Muitos dos antiarritmicos têm efeitos colaterais sérios e devem ser usados apenas em 10 populações específicas. Por exemplo, as medicações de classe Ic não devem ser usadas em pacientes com doença da artéria coronária e mesmo se eles pudessem suprimir a fibrilação atrial, eles poderiam realmente promover a resposta ventricular rápida no flúter atrial. As medicações de Classe Ia podem ser usados como último recurso em pacientes sem doenças do coração 15 estruturais. Sotalol (como a maioria dos antiarritmicos de classe III) pode causar prolongação significante do intervalo QT, especificamente em pacientes com insuficiência renal e promover arritmias ventriculares sérias. Tanto o sotalol quanto a dofetilida assim como as medicações Ia precisam ser iniciadas em uma base de paciente internado para monitorar o intervalo QT. 20 Embora a amiodarona seja usualmente bem tolerada e seja amplamente usada, a amiodarona tem muitos efeitos colaterais sérios com a terapia de longa duração.
Como o teste genético pode afetar diretamente a escolha de tratamento
Quando indivíduos presentes com o seu primeiro episódio 25 (diagnosticado) de fibrilação atrial paroxísmica e converte espontaneamente para ritmo sinusal ou passa pela cardioversão elétrica ou química em menos do que 48 horas no episódio, a decisão para iniciar ou não, a terapia de anticoagulação, é individualizada com base no perfil de risco do paciente em questão e a preferência dos médicos administradores. Esta pode ser uma escolha difícil a fazer visto que comprometer o paciente com a terapia de anticoagulação tem um impacto maior sobre a vida do paciente. Frequentemente a escolha é feita para impedir a anticoagulação em uma tal situação e isto pode ser de nenhuma conseqüência significante para o 5 paciente. Por outro lado o paciente pode mais tarde desenvolver um acidente vascular cerebral e a oportunidade de prevenção pode assim ter sido perdida. Em tais circunstâncias, saber que o paciente é um portador da variante de risco pode ser de enorme significância e sustenta o início do tratamento de anticoagulação.
Indivíduos que são diagnosticados com fibrilação atrial sob a
idade de 65 e são de outro modo considerados de risco baixo para o acidente vascular cerebral, isto é, não tem nenhuma doença cardíaca orgânica, nenhuma hipertensão, nenhuma diabete e nenhuma história anterior de acidente vascular cerebral, são em uma maneira geral tratados com apenas 15 com aspirina para a prevenção do acidente vascular cerebral e não anticoagulação. Se um tal paciente é descoberto ser portador para as variantes de risco aqui descritas, isto pode ser considerado suporte para iniciar a anticoagulação mais cedo do que de outro modo recomendado. Isto seria uma consideração razoável visto que os resultados de acidente vascular cerebral a 20 partir da fibrilação atrial pode ser devastadora.
O acidente vascular cerebral isquêmico é em uma maneira geral classificado em cinco subtipos com base na causa suspeita; aterosclerose de artéria grande, oclusão de artéria pequena, cardioembolismo (a maioria devido à fibrilação atrial), acidente vascular cerebral de outra causa 25 determinada e acidente vascular cerebral de causa não determinada (nenhuma causa descoberta ou mais do que 1 causa plausível). De maneira importante, os acidentes vasculares cerebrais devido ao cardioembolismo têm a recorrência mais alta, são mais incapacitantes e estão associados com a
r
sobrevivência mais baixa. E portanto imperativo não examinar a fibrilação atrial como a causa principal do acidente vascular cerebral, particularmente visto que as medidas de tratamento variam com base no subtipo. Portanto, se um indivíduo é diagnosticado com acidente vascular cerebral ou um Ataque Isquêmico Transitório e uma causa plausível não é identificada a despeito do 5 trabalho padrão, saber que o paciente é um portador da variante de risco pode ser de enorme valor e sustenta o início do tratamento de anticoagulação ou teste de diagnóstico mais agressivo na tentativa de diagnosticar a fibrilação atrial.
Além disso, os marcadores da presente invenção podem ser 10 usados para aumentar o poder e a eficácia de testes clínicos. Assim, indivíduos que são portadores de pelo menos uma variante de risco da presente invenção, isto é, indivíduos que são portadores de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico que confere risco aumentado de desenvolver arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter 15 atrial) e/ou acidente vascular cerebral podem ser mais prováveis de responder a uma modalidade de tratamento particular, por exemplo, como descrito acima. Em uma forma de realização, indivíduos que portam variantes de risco para o(s) gene(s) em um caminho e/ou rede metabólica para os quais um tratamento particular (por exemplo, medicamento de molécula pequena) é 20 alvejado, são mais prováveis de serem respondedores para o tratamento. Em uma outra forma de realização, indivíduos que portam variantes de risco para um gene, cuja expressão e/ou função são alteradas pela variante de risco, são mais prováveis de serem respondedores a uma modalidade de tratamento que alveja este gene, a sua expressão ou seu produto de gene. Esta aplicação pode 25 melhorar a segurança de testes clínicos, mas também pode realçar a chance de que um teste clínico demonstrará eficácia estatisticamente significante, que pode ser limitada a um certo subgrupo da população. Assim, um resultado possível de um tal teste é que carregadores de certas variantes genéticas, por exemplo, os marcadores e haplótipos da presente invenção, são de modo estatisticamente significante prováveis de mostrar resposta positiva ao agente terapêutico, isto é, experimentar alívio de sintomas associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral quando tomar o agente terapêutico ou medicamento como prescritos.
5 Em um outro aspecto, os marcadores e haplótipos da presente
invenção podem ser usados para alvejar a seleção de agentes farmacêuticos para indivíduos específicos. A seleção personalizada de modalidades de tratamento, mudanças de estilo de vida ou combinação dos dois, pode ser realizada pela utilização das variantes de risco da presente invenção. Assim, o 10 conhecimento de uma situação do indivíduo quanto aos marcadores particulares da presente invenção, pode ser útil para a seleção de opções de tratamento que alvejam genes ou produtos de gene afetados pelas variantes de risco da invenção. Certas combinações de variantes podem ser adequadas para uma seleção de opções de tratamento, enquanto que outras combinações de 15 variante de gene podem alvejar outras opções de tratamento. Tal combinação de variante pode incluir uma variante, duas variantes, três variantes ou quatro ou mais variantes, como necessário para determinar com precisão clinicamente confiável a seleção do módulo de tratamento.
Aplicações implementadas por computador A presente invenção também diz respeito a aplicações
implementadas por computador dos marcadores polimórficos e haplótipos aqui descrito a serem associados com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral. Tais aplicações podem ser úteis para armazenar, manipular ou de outro modo analisar dados 25 genotípicos que são úteis nos métodos da invenção. Um exemplo diz respeito a armazenar informação de derivado de genótipo de um indivíduo em meio legível, de modo a ser capaz de fornecer a informação de genótipo a um terceiro interessado (por exemplo, o indivíduo) ou para derivar informação a partir dos dados genotípicos, por exemplo, pela comparação dos dados genotípicos para informação a cerca de fatores de risco genético que contribuem para a suscetibilidade aumentada para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral e relatar os resultados com base em tal comparação.
5 Um tal aspecto diz respeito a meios legíveis por computador.
Em termos gerais, tal meio tem capacidades de armazenar (i) informação identificadora quanto a pelo menos um marcador polimórfico ou um haplótipo; (ii) um indicador da frequência de pelo menos um alelo do dito pelo menos um marcador ou a frequência de um haplótipo, em indivíduos 10 com a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral; e um indicador da frequência de pelo menos um alelo do dito pelo menos um marcador ou a frequência de um haplótipo, em uma população de referência. A população de referência pode ser uma população livre de doença de indivíduos. Alternativamente, a população de 15 referência é uma amostra aleatória da população geral e é assim representativa da população como um todo. O indicador de frequência pode ser uma frequência calculada, uma contagem de cópias de alelos e/ou haplótipo ou valores normalizados ou de outro modo manipulados das frequências reais que são adequadas para o meio particular.
Informação adicional a cerca do indivíduo pode ser
armazenada no meio, tal com informação de ancestralidade, informação a cerca do sexo, atributos ou características físicos (incluindo altura e peso), medições bioquímicas (tais com pressão sanguínea, níveis de lipídeos do sangue, níveis de glicose no jejum, medições de resposta à insulina), 25 resultados de biomarcador ou outra informação útil que seja desejável para armazenar ou manipular no contexto da situação genotípica de um indivíduo particular.
A invenção além disso diz respeito a um aparelho que é adequado para a determinação ou manipulação de dados genéticos úteis para determinar uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral em um indivíduo humano. Um tal aparelho pode incluir uma memória legível por computador, uma rotina para manipular os dados armazenados na memória legível por 5 computador e uma rotina para gerar um produto que inclui uma medida dos dados genéticos. Tal medida pode incluir valores tais com frequências alélicas ou haplótipo, contagens genotípicas, sexo, idade, informação de fenótipo, valores para Razão de Chances (OR) ou Risco Relativo (RR), risco atribuível à população (PAR) ou outra informação útil que seja uma estatística direta IO dos dados genotípicos originais ou com base nos cálculos com base nos dados genéticos.
As aplicações descritas acima podem ser todas praticadas com os marcadores e haplótipos da invenção que foram descritas em mais detalhes com respeito aos métodos de avaliar a suscetibilidade para a arritmia cardíaca 15 (por exemplo, fibrilação atrial e flúter atrial) e acidente vascular cerebral. Assim, estas aplicações em uma maneira geral podem ser reduzidas para praticar o uso dos marcadores listados nas Tabelas 5, Tabela 4, Tabela 9 e Tabela 19 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma forma de realização, os marcadores ou haplótipos estão presentes dentro do 20 segmento genômico cujas seqüências são apresentadas na SEQ ID NO: 50. Em uma outra forma de realização, os marcadores ou haplótipos compreendem pelo menos um marcador selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 19. Em uma outra forma de realização, os marcadores e haplótipos compreendem pelo menos um marcador selecionado de D4S406 25 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51), opcionalmente incluindo os marcadores em desequilíbrio de ligação com estes. Em uma tal forma de realização, o desequilíbrio de ligação é definido pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,1. Em uma outra tal forma de realização, o desequilíbrio de ligação é definido pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,2. Em uma outra forma de realização, o marcador ou haplótipo compreende pelo menos um alelo selecionado dos alelos 2, 4 e/ou 8 no marcador D4S406, alelo A do marcador 5 rs2634073, alelo T do marcador rs2200733, alelo T do marcador rs2220427, alelo T do marcador rsl0033464, e/ou alelo G do marcador rsl3143308
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Acidos nucleicos epolipeptídeos
Os ácidos nucleicos e polipeptídeos aqui descritos podem ser usados em métodos e kits da presente invenção, como descrito acima.
Uma molécula de ácido nucleico “isolada”, como aqui usada, é
uma que é separada de ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam o gene ou seqüência de nucleotídeo (como em seqüências genômicas) e/ou foi completa ou parcialmente purificado de outras seqüências transcritas (por exemplo, como em uma biblioteca de RNA). Por exemplo, um ácido nucleico 15 isolado da invenção pode ser substancialmente isolado com respeito ao meio celular complexo em que o mesmo naturalmente ocorre ou meio de cultura quando produzidos pelas técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados, em alguns casos, o material isolado formará parte de uma composição (por exemplo, um 20 extrato bruto contendo outras substâncias), sistema de tampão ou mistura de reagente. Em outras circunstâncias, o material pode ser purificado essencialmente até a homogeneidade, por exemplo como determinado pela eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) ou cromatografia de coluna (por exemplo, HPLC). Uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção 25 pode compreender pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Com respeito ao DNA genômico, o termo “isolado” também pode referir-se às moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossoma com que o DNA genômico está naturalmente associado. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos do que cerca de 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb dos nucleotídeos que flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir 5 da qual a molécula de ácido nucleico é derivada.
A molécula de ácido nucleico pode ser fundida a outras seqüências codificadoras ou reguladoras e ainda ser considerada isolada. Assim, o DNA recombinante contido em um vetor é incluído na definição de “isolado” como aqui usada. Também, moléculas de ácido nucleico isoladas 10 incluem moléculas de DNA recombinante em células hospedeiras heterólogas ou organismos heterólogos, assim como moléculas de DNA parcial ou substancialmente purificadas em solução. As moléculas de ácido nucleico “isoladas” também abrangem transcritos de RNA in vivo e in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico ou 15 seqüência de nucleotídeo isoladas podem incluir uma molécula de ácido nucleico ou seqüência de nucleotídeo que é quimicamente sintetizada ou por meios recombinantes. Tais seqüências de nucleotídeo isoladas são úteis, por exemplo, na fabricação do polipeptídeo codificado, como sondas para isolar seqüências homólogas (por exemplo, de outra espécie de mamífero), para o
mapeamento de gene (por exemplo, pela hibridização in situ com cromossomas) ou para detectar a expressão do gene no tecido (por exemplo, tecido humano), tal com pela análise de Northern blot ou outras técnicas de hibridização.
A invenção também diz respeito às moléculas de ácido 25 nucleico que hibridizam sob condições de hibridização de severidade alta, tais com para hibridização seletiva, a uma seqüência de nucleotídeo aqui descrita (por exemplo, moléculas de ácido nucleico que especificamente hibridizam a uma seqüência de nucleotídeo contendo um sítio polimórfico associado com um marcador ou haplótipo aqui descritos). Em uma forma de realização, a invenção inclui variantes que hibridizam sob condições de hibridização e lavagem de severidade alta (por exemplo, para a hibridização seletiva) a uma seqüência de nucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeo do bloco LD C04 (SEQ ID NO: 50). Tais moléculas de ácido nucleico podem ser 5 detectadas e/ou isoladas pela hibridização específica de alelo ou seqüência (por exemplo, sob condições de severidade alta). As condições de severidade e os métodos para as hibridizações de ácido nucleico são bem conhecidos pela pessoa habilitada (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, John Wiley & Sons, (1998) e Kraus, M. e Aaronson, S., 10 Methods Enzymol., 200: 546-556 (1991), as divulgações inteiras da qual são aqui incorporadas por referência.
A identidade percentual de dois nucleotídeo ou seqüências de aminoácido pode ser determinada alinhando-se as seqüências com propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na 15 seqüência de uma primeira seqüência). Os nucleotídeos ou aminoácidos nas posições correspondentes são depois comparados e a identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é,% de identidade = # de posições idênticas/ # total de posições x 100). Em certas formas de realização, o 20 comprimento de uma seqüência alinhada com propósitos de comparação é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%, do comprimento da seqüência de referência. A comparação real das duas seqüências pode ser realizada por métodos bem conhecidos, por exemplo, 25 usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um tal algoritmo matemático é descrito em Karlin, S. e Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 5873-5877 (1993). Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0), como descrito em Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997). Quando da utilização de programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, NBLAST) podem ser usados. Ver o sítio da web na world wide web em ncbi.nlm.nih.gov. Em uma forma de realização, os parâmetros para comparação de seqüência podem ser ajustados 5 na contagem = 100, comprimento de palavra = 12 ou podem ser variados (por exemplo, W = 5 ou W = 20).
Outros exemplos incluem o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989), ADVANCE e ADAM como descrito em Torellis, A. e Robotti, C., Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5 (1994); e FASTA descrito em 10 Pearson, W. e Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 2444-48 (1988). Em uma outra forma de realização, a identidade percentual entre duas seqüências de aminoácido pode ser realizada usando o programa GAP no pacote de software GCG (Accelrys, Cambridge, UK).
A presente invenção também fornece moléculas de ácido 15 nucleico isoladas que contém um fragmento ou porção que hibridiza sob condições altamente severas a um ácido nucleico que compreende ou consiste da seqüência de nucleotídeo de bloco LD C04 (SEQ ID NO: 50) ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende ou que consiste do complemento da seqüência de nucleotídeo de bloco LD C04 (SEQ ID NO: 50), em que a 20 seqüência de nucleotídeo compreende pelo menos um alelo polimórfico contido nos marcadores e haplótipos aqui descritos. Os fragmentos de ácido nucleico da invenção têm pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 18, 20, 23 ou 25 nucleotídeos e podem ter 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 10,000 ou mais nucleotídeos no comprimento.
Os fragmentos de ácido nucleico da invenção são usados como
sondas ou iniciadores em ensaios tais com aqueles aqui descritos. “Sondas” ou “iniciadores” são oligonucleotídeos que hibridizam em uma maneira específica de base a um filamento complementar de uma molécula de ácido nucleico. Além do DNA e RNA, tais sondas e iniciadores incluem ácidos nucleicos polipeptídicos (PNA), como descrito em Nielsen, P. et al., Science 254: 1497-1500 (1991). Uma sonda ou iniciador compreende uma região de seqüência de nucleotídeo que hibridiza a pelo menos cerca de 15, tipicamente cerca de 20 a 25 e em certas formas de realização cerca de 40, 50 ou 75, nucleotídeos consecutivos de uma molécula de ácido nucleico. Em uma forma de realização, a sonda ou iniciador compreende pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico ou pelo menos um haplótipo aqui descrito ou o complemento destes. Em formas de realização particulares, uma sonda ou iniciador pode compreender 100 ou menos nucleotídeos; por exemplo, em certas formas de realização de 6 a 50 nucleotídeos, ou, por exemplo, de 12 a nucleotídeos. Em outras formas de realização, a sonda ou iniciador é pelo menos 70% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico ou pelo menos 95% idêntico, à seqüência de nucleotídeo contígua ou ao complemento da seqüência de nucleotídeo contígua. Em uma outra forma de realização, a sonda ou iniciador são capazes de hibridizar seletivamente à seqüência de nucleotídeo contígua ou ao complemento da seqüência de nucleotídeo contígua. Frequentemente, a sonda ou iniciador compreende ainda um rótulo, por exemplo, um radioisótopo, um rótulo fluorescente, um rótulo de enzima, um rótulo de co-fator de enzima, um rótulo magnético, um rótulo de spin, um rótulo de epítopo.
As moléculas de ácido nucleico da invenção, tais com aquelas descritas acima, podem ser identificadas e isoladas usando técnicas da biologia molecular padrão bem conhecidas pela pessoa habilitada. O DNA amplificado pode ser rotulado (por exemplo, radiorrotulado) e usado como 25 uma sonda para triar uma biblioteca de cDNA derivada de células humanas. O cDNA pode ser derivado de mRNA e contido em um vetor adequado. Os clones correspondentes podem ser isolados, o DNA pode obtido a seguir da excisão in vivo e o inserto clonado pode ser sequenciado em cada uma ou ambas as orientações pelos métodos reconhecidos na técnica para identificar a matriz de leitura correta que codifica um polipeptídeo do peso molecular apropriado. Usando estes ou métodos similares, o polipeptídeo e o DNA que codifica o polipeptídeo podem ser isolados, sequenciados e ainda caracterizados.
Em uma maneira geral, as seqüências de ácido nucleico isoladas da invenção podem ser usadas como marcadores de peso molecular em géis de Southern e como marcadores de cromossoma que são rotulados para mapear posições de gene relacionadas. As seqüências de ácido nucleico também podem ser usadas para comparar com seqüências de DNA endógenas em pacientes para identificar arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral ou uma suscetibilidade para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral e como sondas, tal com para hibridizar e descobrir seqüências de DNA relacionadas ou para subtrair seqüências conhecidas de uma amostra (por exemplo, hibridização subtrativa). As seqüências de ácido nucleico podem ser usadas ainda para derivar iniciadores para a impressão digital genética, para incitar anticorpos anti-polipeptídeo usando técnicas de imunização, e/ou como um antígeno para incitar anticorpos anti-DNA ou evocar respostas imunes.
Anticorpos
Os anticorpos policlonais e/ou anticorpos monoclonais que especificamente se ligam a uma forma do produto de gene mas não à outra forma do produto de gene também são fornecidos. Os anticorpos também são fornecidos que se ligam a uma porção da variante ou do produto de gene de referência que contém o sítio ou sítios polimórficos. O termo “anticorpo” como aqui usado refere-se às moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm sítios de ligação de antígeno que especificamente se ligam a um antígeno. Uma molécula que especificamente se liga a um polipeptídeo da invenção é uma molécula que se liga àquele polipeptídeo ou um fragmento deste, mas não se ligam substancialmente a outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica, que naturalmente contém o polipeptídeo. Os exemplos de porções imunologicamente ativos de moléculas 5 de imunoglobulina incluem fragmentos de F(ab) e F(ab’)2 que podem ser gerados tratando-se o anticorpo com uma enzima tal com pepsina. A invenção fornece anticorpos policlonais e monoclonais que se ligam a um polipeptídeo da invenção. O termo “anticorpo monoclonaP’ ou “composição de anticorpo monoclonal”, como aqui usado, refere-se a uma população de moléculas de 10 anticorpo que contêm apenas uma espécie de um sítio de ligação de antígeno capaz de imunorreagir com um epítopo particular de um polipeptídeo da invenção. Uma composição de anticorpo monoclonal assim tipicamente demonstra uma única afinidade de ligação para um polipeptídeo particular da invenção com que o mesmo imunorreage.
Os anticorpos policlonais podem ser preparados como descrito
acima pela imunização de um paciente adequado com um imunógeno desejado, por exemplo, polipeptídeo da invenção ou um fragmento deste. O título de anticorpo no paciente imunizado pode ser monitorado com o tempo pelas técnicas padrão, tal como com um ensaio imunossorvente ligado à 20 enzima (ELISA) usando polipeptídeo imobilizado. Se desejado, as moléculas de anticorpo direcionadas contra o polipeptídeo podem ser isoladas do mamífero (por exemplo, a partir do sangue) e purificado ainda pelas técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia em proteína A para obter a fração IgG. Em um tempo apropriado depois da imunização, por exemplo, quando os 25 títulos de anticorpo são mais altos, as células que produzem anticorpo podem ser obtidas do paciente e usadas para preparar anticorpos monoclonais pelas técnicas padrão, tais com a técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), a técnica de EBY-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, Inc., pp. 77-96) ou técnicas de trioma. A tecnologia para produzir hibridomas é bem conhecida (ver em uma maneira geral Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al., (eds.) John Wiley & Sons, 5 Inc., Nova Iorque, NY). Em resumo, uma linhagem de célula imortal (tipicamente um mieloma) é fundido aos linfócitos (tipicamente esplenócitos) de um mamífero imunizado com um imunógeno como descrito acima e os sobrenadantes da cultura da qual as células de hibridoma resultantes são triados para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal 10 que liga um polipeptídeo da invenção.
Qualquer um dos muitos protocolos bem conhecidos usados para fundir linfócitos e linhagens de célula imortalizadas podem ser aplicados para o propósito de gerar um anticorpo monoclonal para um polipeptídeo da invenção (ver, por exemplo, Current Protocols in Immunology, supra; Gaifre 15 et al., Nature 266: 55052 (1977); R. H. Kenneth, em Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nova Iorque, Nova Iorque (1980); e Lemer, Yale J. Biol. Med. 54: 387-402 (1981)). Além disso, o técnico ordinariamente habilitado avaliará que existem muitas variações de tais métodos que também podem ser úteis.
Alternativa para preparar hibridomas que secretam anticorpo
monoclonal, um anticorpo monoclonal para um polipeptídeo da invenção pode ser identificado e isolado pela triagem de uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante (por exemplo, uma biblioteca de demonstração de fago de anticorpo) com o polipeptídeo para isolar deste 25 modo os membros da biblioteca de imunoglobulina que se ligam ao polipeptídeo. Kits para gerar e triar bibliotecas de demonstração de fago são comercialmente disponíveis (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo Ns 27-940001; e o Kit de Demonstração de Fago SurfLAP® da Stratagene, Catálogo N2 240612). Adicionalmente, os exemplos de métodos e reagentes particularmente acessíveis para o uso na geração e triagem de biblioteca de demonstração de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. N- 5.223.409; Publicação PCT N2 WO 92/18619; Publicação PCT N2 WO 91/17271; Publicação PCT Ne WO 5 92/20791; Publicação PCT N2 WO 92/15679; Publicação PCT N2 WO 93/01288; Publicação PCT N2 WO 92/01047; Publicação PCT N2 WO 92/09690; Publicação PCT N2 WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse et al, Science 246: 1275-1281 (1989); e Griffiths et al., EMBO J. 12: 10 725-734(1993).
Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais com anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados, que compreendem tanto porções humanas quanto não humanas, que podem ser fabricados usando as técnicas de DNA recombinante padrão, estão dentro do escopo da invenção. 15 Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos pelas técnicas de DNA recombinantes conhecidas no ramo.
Em uma maneira geral, os anticorpos da invenção (por exemplo, um anticorpo monoclonal) podem ser usados para isolar um polipeptídeo da invenção pelas técnicas padrão, tais com cromatografia de 20 afinidade ou imunoprecipitação. Um anticorpo específico de polipeptídeo pode facilitar a purificação de polipeptídeo natural das células e de polipeptídeo recombinantemente produzido expressado nas células hospedeiras. Além disso, um anticorpo específico para um polipeptídeo da invenção pode ser usado para detectar o polipeptídeo (por exemplo, em um 25 lisado celular, sobrenadante de célula ou amostra de tecido) de modo a avaliar a abundância e padrão de expressão do polipeptídeo. Anticorpos podem ser usados em diagnóstico para monitorar os níveis de proteína em tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar, por exemplo, a eficácia de um dado regime de tratamento. O anticorpo pode ser ligado a uma substância detectável para facilitar a sua detecção. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase 5 de rábano, fosfatase alcalina, betagalactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinil-amina fluoresceína, cloreto de dansila 10 ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina e os exemplos de material radioativo adequados incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.
Anticorpos também podem ser úteis na análise 15 farmacogenômica. Em tais formas de realização, os anticorpos contra proteínas variantes codificadas pelos ácidos nucleicos de acordo com a invenção, tais como proteínas variantes que são codificadas pelos ácidos nucleicos que contém pelo menos um marcador polimórfico da invenção, podem ser usados para identificar indivíduos que requerem modalidades de 20 tratamento modificadas.
Anticorpos além disso podem ser úteis para avaliar a expressão de proteínas variantes em estados de doença, tais com em estágios ativos de uma doença ou em um indivíduo com uma predisposição para uma doença relacionada com a função da proteína, em particular arritmia cardíaca (por 25 exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral. Anticorpos específicos para uma proteína variante da presente invenção que é codificada por um ácido nucleico que compreende pelo menos um marcador polimórfico ou haplótipo como aqui descritos podem ser usados para triar quanto a presença da proteína variante, por exemplo para triar quanto uma pré disposição para a arritmia cardíaca (por exemplo, fibrilação atrial ou flúter atrial) e/ou acidente vascular cerebral como indicado pela presença da proteína variante.
Anticorpos podem ser usados em outros métodos. Assim, os 5 anticorpos são úteis como ferramentas de diagnóstico para a avaliação de proteínas, tais com proteínas variantes da invenção, em conjunção com a análise pela mobilidade eletroforética, ponto isoelétrico, digestão tríptica ou outra protease ou para o uso em outros ensaios físicos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Anticorpos também podem ser usados na tipagem de 10 tecido. Em uma tal forma de realização, uma proteína variante específica foi correlacionada com a expressão em um tipo de tecido específico e anticorpos específicos para a proteína variante podem ser depois usados para identificar o tipo de tecido específico.
A localização subcelular de proteínas, incluindo proteínas 15 variantes, também pode ser determinada usando anticorpos e podem ser aplicados para avaliar a localização subcelular aberrante da proteína em células em vários tecidos. Tal uso pode ser aplicado em teste genético, mas também na monitoração de uma modalidade de tratamento particular. No caso onde o tratamento é almejado na correção do nível de expressão ou a presença 20 da proteína variante ou distribuição em tecido aberrrante ou expressão desenvolvimental da proteína variante, anticorpos específicos para a proteína variante ou fragmentos destes podem ser usados para monitorar a eficácia terapêutica.
Anticorpos são ainda úteis para inibir a função da proteína 25 variante, por exemplo pelo bloqueio da ligação de uma proteína variante a uma molécula ou parceiro de ligação. Tais usos também podem ser aplicados em um contexto terapêutico em que o tratamento envolve inibir uma função da proteína variante. Um anticorpo pode ser por exemplo usado para bloquear ou competitivamente inibir a ligação, modulando deste modo (isto é, agonizando ou antagonizando) a atividade da proteína. Anticorpos podem ser preparados contra fragmentos de proteína específicos contendo sítios requeridos para a função específica ou contra uma proteína intacta que está associada com uma célula ou membrana de célula. Para a administração in 5 vivo, um anticorpo pode ser ligado com uma carga adicional de produto terapêutico, tal com radionuclídeo, uma enzima, um epítopo imunogênico ou um agente citotóxico, incluindo toxinas bacterianas (toxinas da difteria ou vegetais, tais com ricina). A meia vida in vivo de um anticorpo ou um fragmento deste pode ser aumentada pela peguilação através da conjugação ao 10 polietileno glicol.
A presente invenção diz respeito ainda a kits para usar anticorpos nos métodos aqui descritos. Isto inclui, mas não é limitado a, kits para detectar a presença de uma proteína variante em uma amostra de teste. Uma forma de realização preferida compreende anticorpos tais com um 15 anticorpo rotulado ou rotulável e um composto ou agente para detectar proteínas variantes em uma amostra biológica, meios para determinar a quantidade ou a presença e/ou ausência de proteína variante na amostra e meios para comparar a quantidade de proteína variante na amostra com um padrão, assim como instruções para o uso do kit.
A presente invenção será agora exemplificada pelo seguinte
exemplo não limitante.
EXEMPLIFICAÇÃO
Exemplo 1. Identificação de variantes de risco para a fibrilação atrial no cromossoma 4.
O que segue contém a descrição da identificação de fatores de
suscetibilidade descobertos estar associados com a fibrilação atrial e acidente vascular cerebral através da análise de ponto único de marcadores de SNP.
Métodos. O estudo foi aprovado pelo Data Protection Commission of Iceland e pelo National Bioethics Committee. Grupo AF islandês. Os pacientes foram todos diagnosticados com AF no Landspitali University Hospital em Reykjavik, Islândia, de 1987 a 2003. Os diagnósticos foram confirmados por um eletrocardiograma de 12 fios condutores elétricos não demonstrando nenhuma onda P e intervalos R-R 5 irregularmente irregulares. Todos os ECGs foram manualmente lidos por uma cardiologista.
Grupo de Acidente Vascular Cerebral Islandês. O grupo do acidente vascular cerebral foi derivado de dois hospitais principais na Islândia e da Icelandic Heart Association. Pacientes com acidente vascular cerebral 10 hemorrágico representaram 6% de todos os pacientes (pacientes com o tipo islandês de hemorragia cerebral hereditária com amiloidose e pacientes com hemorragia subaracnóide foram excluídos). O acidente vascular cerebral isquêmico é responsável por 67% dos pacientes totais e TIAs 27%. A distribuição de suptipos de acidente vascular cerebral neste estudo é similar 15 àquele relatado em outras populações Caucasianas (Mohr, J. P., et al., Neurology, 28: 754-762 (1978); L. R. Caplan, Em Stroke, A Clinicai Approach (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, ed 3, (1993)).
Genotipagem. Uma varredura ampla de genoma de 437 indivíduos islandeses diagnosticados com Fibrilação Atrial (AF) e 7406 20 controles da população foi realizada usando chips de SNP Infinium HumanHap300 da Illumina para ensaiar aproximadamente 317.000 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em um único chip (Illumina, San Diego, CA, USA). A genotipagem de SNP para replicação em outros grupos de controle de caso foi realizada usando a plataforma Centaurus (Nanogen). 25 Um total de 347 indivíduos diagnosticados com Acidente Vascular Cerebral e 7497 controles também foi realizado para SNPs dentro do bloco LD descobertos estar associados com a Fibrilação Atrial.
Métodos Estatísticos para a Análise de Associação. Para a associação de marcador único para a fibrilação atrial ou acidente vascular cerebral, nós usamos um teste de razão de probabilidade para calcular um valor p de lado duplo para cada alelo. Nós calculamos o Risco Relativo (RR) e o risco atribuível à população (PAR) assumindo um modelo multiplicativo (C. T. Falk, P. Rubinstein, Ann Hum Genet 51 (Pt 3), 227 (1987); J. D.
5 Terwilliger, J. Ott, Hum Hered 42, 337 (1992)). Para os dados de CEPH Caucasian HapMap, nós calculamos LD entre pares de SNPs usando a definição padrão de D5 (R. C. Lewontin, Genetics 50, 757 (1964)) e R2 W. G. Hill, A. Robertson, Genetics 60, 615 (Nov, 1968). Quando da plotagem de todas as combinações de SNP para elucidar a estrutura LD em uma região 10 particular, nós plotamos D’ no canto esquerdo superior e os valores p no canto direito inferior. Nas plotagens de LD que nós apresentamos, os marcadores são plotados equidistantemente ao invés de acordo com as suas posições físicas.
RESULTADOS
Estudo de associação ampla de genoma
Nós genotipamos com êxito 437 pacientes islandeses com fibrilação atrial e 7406 indivíduos de controle da população usando o chip Illumina 330K. A análise de associação foi realizada para SNPs únicos. A associação mais significante foi descoberta para os marcadores rs2220427 e 20 rs2220733, ambos os quais dão valores p próximos a IO'9. O valor para rs2220427 é significante depois de corrigir quanto ao número de testes realizados, isto é, a associação é significante ao nível amplo de genoma.
Existe um excesso evidente de homozigotos em indivíduos afetados. Nós rejeitamos tanto o modelo multiplicativo (P = 0,002) quanto o 25 modelo recessivo (P = 0,001). O modelo de melhor ajuste dá risco de 1,46 para portadores heterozigotos e 5,17 para portadores homozigotos. O valor P (não corrigido) comparando este modelo completo com o modelo nulo de nenhuma associação é de 5,43'n. Estes dados mostram que indivíduos com duas cópias do alelo em risco estão em risco maior do que o esperado com base em um modelo multiplicativo simples.
O ajuste de uma idade no modelo inicial para todos os genótipos dá um valor P de 4,84'5. Heterozigotos são estimados ter início 1,4090 anos mais cedo do que os não portadores e portadores homozigotos 5 são estimados ter início 9,6126 anos mais cedo do que os não portadores. Isto mostra um efeito significante de idade no início - indivíduos que carregam a variante de risco estão em risco significante de desenvolver AF em uma idade mais jovem do que os indivíduos que não são portadores do alelo em risco.
Investigando marcadores na vicinidade de rs2220427, nós constatamos que o marcador de microssatélite D4S406 pode ser usado como um marcador substituto para rs2220427. Em particular, os alelos 2, 4 e 8 (com respeito à referência CEPH) foram descobertos ser suficientes para rotular o SNP com base nas frequências de haplótipo:
Tabel
a 1. Relações entre rs2220427 e D4S406
Frequência Ha plótipo Alelo MS Alelo SNP 7,55E-05 -2 D4S406 2 rs2220427 0,0000109727 16 D4S406 4 rs2220427 0,000148065 -6 D4S406 4 rs2220427 0,000149685 20 D4S406 2 rs2220427 0,000149756 -4 D4S406 2 rs2220427 0,000210154 8 D4S406 4 rs2220427 0,000225802 -8 D4S406 2 rs2220427 0,000227036 4 D4S406 4 rs2220427 0,000299371 18 D4S406 2 rs2220427 0,000899281 0 D4S406 4 rs2220427 0,00203518 -4 D4S406 4 rs2220427 0,00673851 -6 D4S406 2 rs2220427 0,0245484 2 D4S406 2 rs2220427 0,0394983 -2 D4S406 4 rs2220427 0,0422112 14 D4S406 2 rs2220427 0,0594303 0 D4S406 2 rs2220427 0,0762831 -8 D4S406 4 rs2220427 0,0855451 6 D4S406 2 rs2220427 0,0949753 12 D4S406 2 rs2220427 0,100105 16 D4S406 2 rs2220427 0,145942 4 D4S406 2 rs2220427 0,155838 8 D4S406 2 rs2220427 0,164354 10 D4S406 2 rs2220427 Assim, para indivíduos tipados quanto ao marcador D4S406 mas não rs222047, que fundem os alelos 2, 4 e 8 levam a uma estimativa muito boa da frequência do alelo 4 do SNP. Nós analisamos um grupo de replicação islandês para AF, compreendido de 1269 casos e 69.070 controles, nesta maneira. Os resultados são bastante dramáticos em que a associação é acompanhada por um valor p de 2,94'14 e um Risco Relativo (modelo 5 multiplicativo) de 1,53. Assim, nossa descoberta inicial foi replicada em um grupo islandês independente.
Tabela 2. Associação de pacientes AF ao Cromossoma 4 (bloco LD C04).
São mostrados os valores para RR sob o modelo multiplicativo.
Valor P Risco Freq. Aff Freq. Con AIelo Marcador relativo 0,16839039 0,8473 0,902746 0,916352 3 rsl0033464 0,16839039 1,1802 0,097254 0,083648 4 rs 10033464 0,24275346 0,8746 0,098398 0,110939 1 rsl3105878 0,24275346 1,1433 0,901602 0,889061 2 rsl3105878 4,89E-06 1,3816 0,441648 0,364078 1 rsl3141190 4,89E-06 0,7238 0,558352 0,635922 3 rsl3141190 l,25E-06 0,6905 0,677346 0,752498 1 rsl448817 1.25E-06 1,4483 0,322654 0,247502 3 rs 1448817 0,00995996 0,7903 0,811213 0,844653 2 rs 16997168 0,00995996 1,2654 0,188787 0,155347 4 rs 16997168 l,07E-09 0,5601 0,811213 0,88688 2 rs2200733 l,07E-09 1,7855 0,188787 0,115312 4 rs2200733 7,78E-10 0,557 0,810345 0,884673 2 rs2220427 7,78E-10 1,7953 0,189655 0,115327 4 rs2220427 9,75E-08 1,5803 0,236239 0,163692 1 rs2634073 9,75E-08 0,6328 0,763761 0,836308 3 rs2634073 0,96927011 0,9968 0,768879 0,769444 1 rs2723296 0,96927011 1,0032 0,231121 0,230556 3 rs2723296 0,03281713 0,8529 0,665904 0,700311 2 rs2723316 0,03281713 1,1724 0,334096 0,299689 4 rs2723316 0,01803327 1,1855 0,635632 0,595393 1 rs3 853444 0,01803327 0,8435 0,364368 0,404607 3 rs3 853444 0,40105752 0,9214 0,146789 0,15734 2 rs4576077 0,40105752 1,0853 0,853211 0,84266 4 rs4576077 0,93269621 1,0084 0,145309 0,144275 1 rs6419178 0,93269621 0,9917 0,854691 0,855725 3 rs6419178 10 Tabela 3. Associação de Acidente Vascular Cerebral com marcadores dentro
do bloco LD C04 (SEQ ID NO: 50)
Valor P Risco Freq. Aff Freq. Con Alelo Marcador relativo 0,37701852 0,8872 0,90634 0,916011 3 rs 10033464 0,37701852 1,1272 0,09366 0,083978 4 rsl0033464 0,2838194 0,8717 0,097983 0,110807 1 rsl3105878 0,2838194 1,1472 0,902017 0,889193 2 rsl3105878 0,01534596 1,2123 0,412104 0,366378 1 rsl3141190 0,01534596 0,8249 0,587896 0,633622 3 rsl3141190 0,048556224 0,8418 0,716138 0,7498 1 rsl448817 0,048556224 1,1879 0,283862 0,2502 3 rs 1448817 0,14450185 0,8599 0,822767 0,843717 2 rsl6997168 0,14450185 1,1629 0,177233 0,156283 4 rs 16997168 0,00374992 0,724 0,84438 0,882271 2 rs2200733 0,00374992 1,3812 0,15562 0,117729 4 rs2200733 0,0025713 0,7141 0,842566 0,882274 2 rs2220427 0,0025713 1,4003 0,157434 0,117726 4 rs2220427 0,01664881 1,2682 0,201729 0,166154 1 rs2634073 0,01664881 0,7885 0,798271 0,833846 3 rs2634073 0,58350156 0,9511 0,760807 0,769811 1 rs2723296 0,58350156 1,0514 0,239193 0,230189 3 rs2723296 0,03150475 0,8367 0,661383 0,700107 2 rs2723316 0,03150475 1,1952 0,338617 0,299893 4 rs2723316 0,16517516 1,1172 0,622832 0,596462 1 rs3853444 0,16517516 0,8951 0,377168 0,403538 3 rs3853444 0,24301926 0,8797 0,14121 0,157473 2 rs4576077 0,24301926 1,1367 0,85879 0,842527 4 rs4576077 0,19773377 1,1482 0,161383 0,143543 1 rs6419178 0,19773377 0,8709 0,83867 0,856457 3 rs6419178 ^ ♦ · ♦ 2
Tabela 4. Marcadores em perfeito desequilíbrio de ligação (r = 1,0) com
rs2220427 na população CEU no conjunto de dados International HapMap
(Indivíduos de descendência européia). Também são mostradas a correlação
com amostras de Yuroba (Nigéria) e Ásia (China e Japão) - a descrição do
grupo está documentado ainda no http://www.hapmap.org.
SNP Alelo CEU R2 CEU frq YRI R2 YRI frq ASIA R2 ASIA frq rs 17042059 1 1 0,117647 0,500382 0,117647 0,473183 0,30814 rs4529121 1 1 0,116667 0,604601 0,1 0,539766 0,337079 rs4543199 2 1 0,116667 0,502036 0,116667 0,539766 0,337079 rs 10019689 1 1 0,116667 0,128175 0,341667 0,664071 0,388889 rs4626276 2 1 0,116667 0,603474 0,10084 0,537439 0,333333 rs 17042076 2 1 0,117647 0,128175 0,341667 0,664071 0,388889 rs 11098089 2 1 0,117647 0,549368 0,108333 0,539766 0,337079 rs 11939528 4 1 0,11017 0,120773 0,321429 0,662926 0,377907 rs 17042098 1 1 0,116667 0,669219 0,092437 0,64297 0,355556 rs 17042102 1 1 0,091743 NA NA 0,580822 0,302632 rsl7042121 3 1 0,116667 0,736119 0,141667 0,639142 0,353933 rs 10516563 3 1 0,109244 0,846743 0,128205 0,636329 0,364706 rs4605724 1 1 0,116667 0,748252 0,083333 0,645257 0,359551 rs2350269 4 1 0,11017 0,495806 0,098214 0,628257 0,346154 rs6533527 1 1 0,116667 0,525151 0,133333 0,804123 0,421348 rsl7042144 2 1 0,119658 0,727891 0,077586 NA NA rs 1906618 2 1 0,115044 NA NA NA NA rs 1906617 2 1 0,116667 0,541206 0,183333 0,977348 0,454545 rs 12646447 2 1 0,119658 1 0,108333 1 0,444444 rsl2646754 4 1 0,119658 0,681842 0,11017 1 0,425 rs2129981 1 1 0,116667 1 0,108333 1 0,444444 rs 12639654 4 1 0,116667 0,139505 0,016667 1 0,438202 rs6817105 2 1 0,117647 0,27862 0,299145 1 0,440476 rsl7042171 1 1 0,109244 0,281063 0,302521 1 0,425287 rs 1906591 1 1 0,116667 1 0,108333 1 0,444444 rsl906592 3 1 0,109244 0,283489 0,3 1 0,446429 rs2200732 2 1 0,112069 0,272544 0,308334 1 0,449438 rs2200733 4 1 0,116667 0,276161 0,301724 1 0,445783 rs4611994 2 1 0,116667 0,272544 0,308334 1 0,449438 rs4540107 1 1 0,116667 0,27862 0,305085 1 0,44382 rs 1906593 4 1 0,117647 0,285134 0,301724 1 0,438202 rs 1906596 2 1 0,121739 0,255864 0,330275 0,97478 0,448718 Tabela 5.
A. Marcadores SNP dentro do bloco LD C04 (Entre 111.954.811 e
112.104.250 em C04; Construção NCBI 35; SEQ ID NO: 50).
Marcador ID Pós-construção 35 Pós na SEQ Tipo Filamento ID N0:50 rs1448824 1119S4811 1 A/G - rsl947189 111955221 411 A/G - rsl947188 111955479 669 C/G rsl992927 111956353 1543 C/T - 131470619 111957122 2312 A/G - rs!448823 111958436 3676 A/G - rs4834327 111958676 3866 A/T rsl44SS22 111958702 3892 C/T - rs2044674 111959075 4265 A/G - Γ528445748 111959470 4660 A/T Hp rs2595116 111959591 4781 C/T - rs2595115 111959725 4915 A/C - rsl3120244 111961948 7138 A/G Ημ rs2723296 111962087 7277 A/G 4* rs2723297 111962201 7391 A/T 4* «10021211 111962246 7436 CTT 4. rs170420H 111962331 7521 C/T rs2595114 111962791 7981 C/G - rs2595113 111962792 7982 C/G - rs2595112 111963368 8558 q/G - rs6831623 111964677 9867 C/T rs6854883 111964919 10109 c/r Hh rs22S5793 111965457 10647 A/G + rs2723298 111966089 11279 C/T + rsl2505886 111966218 11408 A/T + rs28718263 111966220 11410 A/T 4. rs!2S019l3 111966355 11545 A/C + rsl3l26974 111966385 11575 A/T + rs36194761 111966385 11575 A/T rs28473341 111966486 11676 C/T + ra36160675 111967780 12970 G/T + rst3147139 111968764 13954 A/G + rsl3l47489 · 111968795 13985 C/T rsl3147299 111968812 14002 A/C + rsl3147726 111968923 14113 C/T + rsl3147730 111968926 14116 c/t + rs13147552 111968949 14139 A/G rsl3l23918 111968996 14186 A/T + rs35610510 111970561 15751 C/T + rs36162200 111971480 16670 G/T + rsl1098086 111971997 17187 C/T + fS4034950 111972120 17310 A/G - rsll724067 111972144 17334 A/G rs2723299 111972436 17626 A/G •f rs2723300 111972512 17702 A/G rsl3138211 111972606 17796 A/G rs2595075 111973312 18502 C/T - rs2723301 111973731 18921 C/G + rs2595074 111974709 19899 A/T - rs2723302 111974736 19926 C/G + rs2723303 111974741 19931 A/G rs2218698 111975356 20546 G/T - rs2218697 111975357 20547 C/T - rs2595073 111975436 20626 A/G - rs2723307 111975800 20990 A/T •f rsl584430 111976043 21233 C/G - Marcador Π> Póscons tração 3$ Pós iva SEQ Tqio Filamento IP N0:50 rs1584429 111976151 21341 C/G - fsi900828 111976526 21716 CfT - rs7672226 111976785 21975 CfT 4* - rsl839l89 111976971 22161 C/T . - Γ51579946 111977724 22914 A/G rs12509115 111977892 23082 A/G + «1579945 111978096 23286 A/T - rs76613S3 111979181 24371 A/C •f rs2122078 111979201 24391 A/G - rs2122077 111979254 24444 C/T rs2723311 111979626 24816 A/G + ns7667461 111979738 24928 A/G rs1448799 111980386 25576 C/T - rs!448798 111980789 25979 C/T rsl2650829 111980880 26070 A/G + rs2723312 111980956 26Í46 A/G rs1900827 111981343 26533 A/G * rs6815628 1!1981980 27170 Cfl rs6838131 111981993 27183 A/G *4“ rs6838139 111982000 27190 A/C rs6838295 111982012 27202 C/T -f rs4582211 111982043 27233 A/G 4*. rs43S3966 111982088 27278 A/T 4. rs6838536 111982144 27334 CfT + rs1375302 111983068 28258 C/T + rs!3753G3 111983069 28259 A/G + rs7699114 111983094 28284 CfT 4" rs2l97814 111983098 28288 A/C rs2218700 111983340 28530 A/G + rs969642 111983529 28719 C/T + rsl7042020 111984067 29257 A/C 4* rs2595099 111984371 29561 A/C Hh rs437l683 111984371 29561 A/C 4* r§2595093 111984960 30150 C/T rs17625509 111984998 30188 A/G 4. 1-S2723313 111985093 30283 A/G 4. rs2723314 111985111 30301 G/T 4* rs259S092 111985112 30302 A/G « rs2595091 111985223 30413 C/G -T ' rsl375301 11198S458 30648 A/G - rs2245595 111985715 30905 C/T 4* rs2595088 111985958 31148 C/T - rs981150 111986232 31422 C/T rsl6997168 111986643 31833 C/T ■f rsS812840 111986654 31844 A/T •f rsl6997169 111986685 31875 C/T 4. 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e 112.104.250 em C04; Construção NCBI 35; SEQ ID NO: 50).
Marcador Posição de Posição Iniciador Iniciador partida ... final dianteiro reverso D4S103 112062811 112062Ô11 ACAACCCCATTTGTGAAGAC TTTATAGAAAATTrAGCATGGA D4S2940 112070055 112070207 CnTAAeTrGnrGGACCCATeAA TGGAACCACTTTTGCAGTAA D4S406 11 »76047 112070292 CTGGTTTTAAGGCATGTTT G TCCTCAGGGAGGTCTAATCA ’ Tabela 6. Chave para as seqüências apresentadas na Listagem de Seqüência
SEQ ID NQ Marcador ED
1 rs222Q427 2 rs17042059 3 rs4529121 4 rs4543199 S rsl00196S9 6 rs4626276 7 rsl7042076 8 rs11098089 9 rsll930S28 rsl7D42Q98 U nsl7042l02 12 rsl7042121 13 rsl05l6563 14 rs4605724 rs235Q269 16 rs6533527 17 rsl7042144 18 rsl9066ÍS 19 rsl906517 rsl2546447 21 rs12646754 22 rs212998i 23 1^12639654 24 ns6817105 rsl704217l 26 rsl906591 27 rs2200732 28 rs2200733 29 rs4611994 rs4540107 31 Γ&1906593 32 rs1906596 33 rs2634073 34 rc1906592 rs2723296 36 rsl6997168 37 rs2723316 38 rs6419178 39 fSl448817 40 rsl3105878 41 rsl0033464 42 rsl3l41I90 43 rs3853444 44 Γ54576077 45 D4S406 46 rs7668322 47 Γ52197815 48 ms6831623 49 rs2595110 50 LD Blodc C04 Sl rs13143308 Exemplo 2. Caracterização de variantes de risco de AF
O que segue contém descrição adicional da identificação de variantes que conferem risco para a fibrilação atrial no cromossoma 4q25 A fibrilação atrial (AF) é a arritmia cardíaca prolongada mais comum no ser humano e é caracterizada pela atividade elétrica caótica do átrio. Ela afeta um em dez indivíduos acima dos oitenta, causa morbidez significante e é um prognosticador independente de mortalidade2. Estudos
• 3 5
recentes têm fornecido evidência de uma contribuição genética para AF ' .
Mutações nos genes do canal de potássio foram associados com a AF
familiar610 mas responsável apenas por uma fração pequena de todos os casos
11 12
de AF ’ . Nós constatamos uma varredura de associação ampla de genoma, seguida pelos estudos de replicação em três populações de descendência européia e uma população chinesa de Hong Kong e descobrimos uma forte 10 associação entre as duas variantes de seqüência no cromossoma 4q25 para AF. Aproximadamente 35% dos indivíduos de descendência européia têm pelo menos uma das variantes e o risco de AF aumenta em 1,72 e 1,39 por cópia. A associação para a variante mais forte foi replicada na população chinesa, onde a mesma é carregada por 75% dos indivíduos e o risco de AF é 15 aumentado em 1,42 por cópia. Uma associação mais forte foi observada em indivíduos com flúter atrial típico (AFI). Ambas as variantes são adjacentes ao PITX2, que é conhecido desempenhar um papel crítico na assimetria esquerda-direita do coração13"15. Nós conduzimos um estudo de associação ampla de genoma usando o Illumina Hap300 BeadChip em uma população 20 islandesa com AF e/ou AFI. 316.515 SNPs que satisfizeram nossos critérios de qualidade foram testados individualmente quanto a associação para AF/AFI em uma amostra de 550 pacientes e 4.476 controles da Islândia. Três SNPs fortemente correlacionados, todos localizados dentro de um único bloco de desequilíbrio de ligação (LD) no cromossoma 4q25, foram os únicos SNPs 25 descobertos ser significantes de amplo genoma depois de considerar os 316.515 SNPs testados (P < 0,05/316,515 = 1,58 xlO'7): rs2200733 (OR = 1,75; P = 1,6 x IO'10), rs2220427 (OR = 1,75; P = 1,9 x 10‘10) e rs2634073 (OR = 1,60; P = 2,1 x 10‘9). Estes resultados e todos os outros resultados com base na população islandesa foram ajustados quanto a relacionabilidade de indivíduos. Os dois SNPs mais significantes, rs2200733 e rs2220427, são substitutos perfeitos um do outro no conjunto de dados de CEPH CEU HapMap16 e são próximos a serem substitutos perfeitos um do outro no conjunto de dados islandês (D’ = 1, r2 = 0,999), portanto, apenas rs2200733 5 será aludido no debate seguinte. A correlação de rs2634073 para rs2200733 é mais fraca no conjunto de dados islandês (D’ = 0,95, r2 = 0,605). No outro estudo dos SNPs Illumina Hap300 na vicinidade dos primeiros três SNPs e condicionando a associação para rs2200733, uma associação a um novo SNP, rs 10033464, foi identificada (OR = 1,42; P = 0,0024). Depois de considerar a 10 associação para rs2200733 e rsl0033464, a associação para rs2634073 não foi mais significante (P = 0,30). Daqui em diante, todos os resultados de associação para rs2200733 T e rsl0033464 T, incluindo aqueles apresentados na Tabela 7, são com base na comparação com o haplótipo do tipo selvagem que não carrega nenhum dos dois alelos em risco, ao invés da comparação 15 com os alelos principais de cada SNP separadamente. Especificamente, razões ímpares para rs2200733 T e rsl0033464 T são cada uma computadas condicionalmente e seriam interpretadas como o Risco Relativo estimado de cada variante comparado com o tipo selvagem. Nos alelos de risco T de rs2200733 e T de rs 10033464 têm frequências alélicas de população estimada 20 de 12,05% e 8,53% na Islândia, respectivamente e nunca são observados juntos no mesmo cromossoma, no conjunto de dados islandês ou no conjunto de dados de CEU HapMap. Um terceiro SNP, rs 13143308, que tem um alelo menor que corresponde completamente aos cromossomas que carregam o alelo T de rs2200733 ou o alelo T de rsl0033464, foi identificado através do 25 conjunto de dado de CEU HapMap. A Figura 2 demonstra a estrutura de haplótipo em relação aos SNPs chave da região associada. Os conjuntos de
λ
SNPs, que são substitutos perfeitos (isto é, substitutos perfeitos, r = 1,0 para o SNP de rotulação) de cada um destes três SNPs chave nas amostras de CEU HapMap, são fornecidos na Tabela 9 e em locais relacionados demonstrados na Figura 3. Nós enfatizamos que os SNPs indicados devem ser considerados representativos dos haplótipos definidos pelos SNPs que eles são equivalentes e são primariamente escolhidos por questão de conveniência.
Um marcador de microssatélite, D4S406, localizado no mesmo 5 bloco LD como os dois SNPs foi identificado. Na Islândia, três dos quatro alelos mais curtos de D4S406 (8, 4 e 2) combinam para formar um substituto quase perfeito para o alelo T de rs2200733 (D’ = 0,995, r2 = 0,98) e os dois alelos mais curtos remanescentes (6 e 0) formam um bom substituto do alelo T de rs 10033464 (D’ = 0,98, r2 = 0,75) (Tabela 10). Nenhum dos alelos 10 remanescentes (mais longos) de D4S406 estão associados ao AF/AFI depois de levar em conta o efeito dos alelos curtos. Para a replicação da observação original na Islândia os genótipos D4S406 foram usados para fornecer informação quando genótipos SNP não foram disponíveis.
Em uma tentativa para duplicar a nossa descoberta original nós analisamos uma amostra islandesa adicional que consiste de 2.251 pacientes AF/AFI e 13.238 controles (Tabela 7). A associação de ambos os SNPs para AF/AFI foi replicada nestas amostras (OR = 1,64, P = 2,7 x IO'23 para rs2200733, OR = 1,40, P = 8,2 x 10‘8 para rsl0033464) e ambas alcançam significância ampla de genoma nas amostras islandesa combinadas (OR = 1,68, P = 1,9 x IO'30 para rs2200733, OR = 1,38, P = 9,4 x IO'9 para rs 10033464). Nós também tipamos todos os 18 SNPs Hap300 da Illumina na região em tomo do nosso sinal em 404 dos casos de AF adicionais e 2.036 dos controles adicionais. Nenhum destes SNPs permaneceram significantes depois de levar em consideração a associação ao rs2200733 e rsl0033464 (Tabela 11).
Em outras tentativas para duplicar nossos resultados, nós testamos estas variantes quanto a uma associação para AF em duas populações de ancestralidade européia, uma da Suécia, que consiste de 143 casos e 738 controles e a outra dos Estados Unidos (U.S.), que consiste de 636 casos e 804 controles (Tabela 7). A associação para rs2200733 foi fortemente duplicada em ambas as populações (OR = 2,01, P = 0,00027 na Suécia ou = 1,84, P = 9,8 x IO10 nos U.S.). A associação ao rsl0033464 é mais fraca, mas não obstante foi duplicada na população Sueca (OR = 1,65, P 5 = 0,0087) e foi quase significante na população U.S. (OR = 1,30, P = 0,052). Quando combinado com as amostras islandesas, a associação a rs2200733 foi inequívoca (OR = 1,72, P = 3,3 x IO"41) e a significância de rs 10033464 foi bem além do limiar de significância ampla de genoma (OR = 1,39, P = 6,9 x IO"11). Assumindo o modelo multiplicativo, o risco atribuível à população 10 (PAR) das duas variantes combinadas é de aproximadamente 20% em populações de ancestralidade européia.
Finalmente, nós tentamos replicar estes sinais em uma população Han Chinesa de Hong Kong que consiste de 333 casos e 2.836 controles. A associação ao rs2200733 T foi significantemente duplicada (OR 15 = 1,42, P = 0,00064), mas a associação ao rs 10033464 T não foi significante, embora na direção certa (OR = 1,08, P = 0,55) (Tabela 7). De maneira interessante, o alelo T de rs2200733 é muito mais freqüente nos chineses (frequência alélica nos controles: 0,528) do que naqueles de descendência européia (frequência alélica nos controles: 0,098 a 0,139) (Figura 2) que é 20 refletida em um PAR de união maior de aproximadamente 35%, embora o risco estimado seja menor. O bloco LD contendo as duas variantes é mais fragmentado nas amostras HapMap de CHB Chinês e JPT Japonês do que nas amostras HapMap de CEU (Figura 3). Nós portanto analisamos diversos marcadores na população de Hong Kong que foram em LD perfeito com 25 rs2200733 nas amostra de CEU, mas em LD imperfeito nas amostras CHB e JPT (Tabela 12). Estes marcadores tiveram associação evidente mais fraca para AF do que rs2200733, sugerindo que as variantes funcionais que dirigem a associação estão localizadas na região de aproximadamente 20 kb em tomo da variante rs2200733 original e definido pelo SNPs que permanece equivalente a rs2200733 nas amostras CHB e JPT (de cor vermelha na figura
3)·
Para as amostras da descoberta islandesa inicial, rs2200733 teve um OR significantemente mais alto do que rs 10033464 (P = 0,041). Isto confirmou-se nas amostras de duplicação e de ponta a ponta existe uma diferença significante nos riscos associados com as duas variantes (P = 0,00019 nas amostras européias combinadas e P = 0,0099 nas de Hong Kong). Quando as Razões de Chance específicas de genótipo foram estudadas, algum desvio fora do modelo multiplicativo é detectável no conjunto de dados combinados (P = 0,018 para as amostras européias, ver a Tabela 13). Os riscos estimados de carregadores heterozigotos em relação aos não carregadores foram similares, mas os carregadores homozigotos de rs2200733 T e rsl0033464 T têm riscos estimados que foram, respectivamente, mais altos e mais baixos do que aquele prognosticado por um modelo multiplicativo. Uma tendência similar foi observada nas amostras de Hong Kong; embora o tamanho da amostra fosse muito pequeno para ter força para detectar tais desvios com significância. Nas populações combinadas de descendência européia o OR observado para indivíduos homozigotos para rs2200733 T foi 3,64 quando comparado aos indivíduos homozigotos para o haplótipo do tipo selvagem e 1,77 para a população chinesa demonstrando que estas variantes são componentes importantes em qualquer modelagem preditiva de AF.
A idade no diagnóstico de AF/AFI para as amostras islandesas correlaciona-se com os dois SNPs (o diagnóstico ocorre 2,28 anos mais cedo 25 para o alelo T de rs2200733 e 1,10 anos mais cedo para o alelo T de rs 10033464, P da união = 1,29 x IO'6). O efeito da idade no diagnóstico também foi avaliado medindo-se a força de associação enquanto estratificando pela idade no diagnóstico. A associação das duas variantes é mais forte naqueles diagnosticados em uma idade mais jovem, embora o risco permaneça significante mesmo naqueles diagnosticados depois de atingir 80 anos de idade (Tabela 8). A informação sobre a idade no diagnóstico de AF não foi disponível para as amostras suecas. As amostras U.S. foram compreendidas de dois grupos principais, pacientes mais jovens com AF 5 sozinho ou AF e hipertensão (HTN) e casos de AF mais velhos que são a maioria das vezes hemorrágicos e pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico. Em ambas as populações existe uma tendência clara para uma associação mais forte em casos de AF mais novos do que em casos mais velhos. Nossa análise dos dados não sugere qualquer associação diferencial 10 pelo sexo (Tabela 8).
AFl frequentemente acompanha AF, mas pode ocorrer em isolação17. De maneira interessante nós observamos uma forte associação entre as variantes e o subconjunto pequeno (N= 116) dos pacientes AFl islandeses (OR = 2,60, 95% de intervalo de confidência (CI) = 1,83 a 3,68, P 15 = 7,5 x 10‘8 para rs2200733 ou = 1,94, 95% de CI = 1,26 a 3,00, P = 0,0028 para rsl0033464). De fato, para rs2200733, a OR para estes casos AFI definidos é significantemente mais alta do que aquela para os casos com um fenótipo AF (P = 0,0026) e próximo a significantemente mais alta para rs 10033464 (P = 0,084). Nossos resultados sugerem que embora estes traços 20 compartilhem fatores de risco genético, AFI é menos influenciado pelas fenocópias do que AF.
Nenhuma variante mostrou uma associação com a obesidade, hipertensão ou infartação do miocárdio nas amostras islandesas, todos fatores de risco conhecidos para AF (observado OR <1,1 em todos os casos, Tabela 25 14). Embora estes resultados negativos não excluam a possibilidade de que as novas variantes associem-se com estes fenótipos, eles sugerem, junto com o alto risco nos U.S. AF sozinho e idade mais cedo no início em carregadores, que as novas variantes não estão afetando o risco de AF através destes fatores de risco conhecidos. Não existe nenhum gene conhecido presente no bloco LD contendo rs2200733 e rsl0033464 (Figura 3). O bloco LD contém um EST unido (DA725631) e dois ESTs de exon único (DB324364 e AF017091). A RT-PCR de bibliotecas de cDNA de vários tecidos não detectaram a 5 expressão destes ESTs (Tabela 16). O gene PITX2 localizado no bloco LD adjacente a montante é o gene mais próximo às variantes de risco. Diversos marcadores dentro do bloco LD contendo o gene PITX2 são correlacionados com os marcadores que mostram a associação ao AF e Afl, como mostrado na Tabela 18. A proteína codificada por este gene, o fator de transcrição 2 de 10 homodomínio emparelhado, é um candidato interessante para AF/AFI visto que é conhecido desempenhar um papel importante no desenvolvimento
1 Λ
cardíaco pela direção da morfogênese assimétrica do coração . Em um modelo de camundongo silenciado Pitx2 foi mostrado suprimir um caminho de default para a formação do nodo sinoatrial no átrio esquerdo14,15. Existe 15 muito pouca expressão de mRNA de PITX2 em todos os tecidos facilmente acessíveis, tais com sangue e tecido adiposo, dificultando o estudo de correlação entre genótipos e níveis de expressão. O gene seguinte a montante de PITX2 é ENPEP, uma aminopeptidase responsável pela ruptura da angiotensina II no endotélio vascular18. Este gene é expressado mais 20 amplamente, mas as variantes associadas com AF não mostraram nenhuma correlação para a sua expressão no sangue ou tecido adiposo. Nenhum outro dos genes anotados está localizado dentro de uma região de 400 kb a montante e regiões de 1,5 Mb a jusante das variantes associadas.
Em resumo, nós identificamos duas variantes no cromossoma 25 4q25 que estão fortemente associados com AF em três populações distintas de descendência européia. A variante mais forte também duplica bem em uma população chinesa onde a mesma é muito mais comum e tem PAR mais alta do que em populações de descendência européia. Esta associação é particularmente obrigatória em pacientes mais jovens e naqueles com AF sozinha, mas também está presente em pacientes mais velhos com formas mais habitualmente encontradas de AF. Embora o mecanismo para esta associação seja desconhecido, nossos resultados fornecem um alicerce para mais estudos nos suportes molecular de AF.
MÉTODOS
Pacientes
Os casos islandeses consistiram de todos os pacientes diagnosticados com AF e/ou AFI nos dois maiores hospitais no pais de 1987 a 2005. Os casos suecos foram recrutados de 1996 a 2002 como uma parte de um estudo de epidemiologia genética em andamento, o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico do Sul de Stockholm. Os casos U.S. foram uma mistura de pacientes com acidente vascular cerebral com um diagnóstico de AF e pacientes consecutivos mais jovens com AF sozinho ou AF com um diagnóstico co-existente de hipertensão. Os casos de Hong Kong foram uma coleção de pacientes com acidente vascular cerebral e diabete com um diagnóstico AF. O diagnóstico AF foi confirmado por um eletrocardiograma de doze fios condutores elétricos em todas as populações de estudo.
Os controles islandeses foram escolhidos aleatoriamente de indivíduos que têm participado em outros estudos genéticos no deCODE, excluindo primeiro grau em relação de pacientes e controles (Tabela 15). Os controles suecos foram recrutados da mesma região como pacientes de doadores de sangue (em 2001) e voluntários saudáveis (1990-1994). Os controles U.S. foram recrutados de uma prática de primeiros socorros grande e de pacientes que participam em um estudo de acidente vascular cerebral hemorrágico. Os controles de Hong Kong foram indivíduos sem um diagnóstico de AF.
População de estudo islandesa
Este estudo inicialmente incluiu o consentimento de todos os pacientes para participação, que foram diagnosticados com AF e/ou AFI (ICD 10 diagnóstico 148 e ICD 9 diagnóstico 427,3) no Landspitali University Hospital em Reykjavik, o único centro de referência terciária na Islândia e no Akureyri Regional Hospital, o segundo maior hospital no pais, de 1987 a 2005. Todos os diagnósticos foram confirmados por um eletrocardiograma de 5 doze fios condutores elétricos (EKG) que foi manualmente lido por um cardiologista. Todos os casos foram incluídos, independente se os pacientes tiveram sintomas clínicos ou não, exceto aqueles diagnosticados apenas imediatamente depois de cirurgia cardíaca aberta.
Um conjunto de 550 casos foram genotipados com êxito de 10 acordo com nossos critérios de controle de qualidade em um esforço de genotipar SNP de genoma amplo, usando o método de ensaio Infinium II e o Sentrix HumanHap300 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA). A idade média no diagnóstico para este grupo inicial de 550 pacientes (370 homens e 180 mulheres) foi de 72,5 (SD = 11,0) anos e a faixa foi de 34,7 a 96,2 anos. 15 O grupo de validação de 2.273 pacientes (1.359 homens e 913 mulheres) teve uma idade média no diagnóstico de 70,5 (SD = 13,0) e a faixa foi de 16,8 a 100,6. Os controles livres de AF/AFI (2.201 homens e 2.275 mulheres na triagem de genoma amplo inicial com idade média de 61,5 (SD = 15,8) e 5.654 homens e 7.597 mulheres no estágio de validação com idade média de 20 61,9 (SD = 18,4)) usados neste estudo consistiram de controles aleatoriamente selecionados da base de dados genealógica islandesa e indivíduos de outros estudos genéticos relacionados em andamento no deCODE. Os controles tendo primeiro grau em relação (irmãos, pais ou progênie) com AF/AFI ou um controle de primeiro grau em relação, foram excluídos da análise.
Populações MI islandesa, obesidade e hipertensão
Indivíduos que sofreram um MI foram identificados de um registro de mais de 10.000 indivíduos que: a) tiveram um MI antes da idade de 75 na Islândia nos anos de 1981 a 2002 e satisfazem o critério MONICA 9 (REF II) ou tiveram diagnóstico de descarga de MI dos maiores hospitais em Reykjavik nos anos 2003 e 2005. Os diagnósticos de MI de todos os indivíduos no registro seguem critérios de diagnóstico estritos com base nos sinais, sintomas, eletrocardiogramas, enzimas cardíacas e observações de necrópsia. A informação de genótipo foi disponível para 2.462 homens e 1.114 mulheres, idade média 72,6 (SD = 11,7). O índice de massa corporal (BMI) foi medido para indivíduos que participam nos programas genéticos de fibrilação atrial cardiovascular e/ou acidente vascular cerebral (CVD) no deCODE (pacientes com CVD, seu primeiro grau em relação ou esposos). Para o propósito deste estudo pacientes com BMI >35 foram definidos como obeso. Informação de genótipo foi disponível para 555 homens e 1.046 mulheres, idade média 53,2 (SD = 16,1). Pacientes hipertensivos incluíram aqueles que foram atendidos na clínica de hipertensão ambulatorial no Landspitali, University Hospital na Islândia e/ou foram diagnosticados na descarga do hospital. O diagnóstico foi verificado pela confirmação de que eles estavam tomando medicações anti-hipertensivas como um tratamento para a hipertensão. A informação de genótipo foi disponível para 1.293 homens e 1.327 mulheres, idade média 71,5 (SD = 12,5). O estudo foi aprovado pela Data Protection Commission of Iceland e pelo National Bioethics Committee of Iceland. Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes, em parentes e controles.
População de estudo sueca
Pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico ou TIA tratando na unidade de acidente vascular cerebral ou a clínica de paciente externo com acidente vascular cerebral no Karolinska University Hospital, 25 unidade de Huddinge em Stockholm, Suécia foram recrutados de 1996 a 2002 como parte de um estudo de epidemiologia genética em andamento, o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico no Sul de Stockholm (SSISS). O estudo foi aprovado pelo Bioethics Committee of Karolinska Institutet (Dnr 286/96 e 08/02). O diagnóstico de AF nas amostras suecas foi com base em um EKG de doze fios condutores elétricos. A fração de homens nos casos de AF suecos foi de 46,2% e a idade média no diagnóstico de acidente vascular cerebral para os casos de AF suecos foi de 74,4 (SD = 8,7).
Os controles suecos usados neste estudo são controles com 5 base na população recrutados da mesma região na Suécia central como os pacientes, representando a população geral nesta área. Os indivíduos foram doadores de sangue (recrutados em 2001) ou voluntários saudáveis (coletados em 1990-1994) recrutados pelo departamento químico clínico no Karolinska University Hospital para representar uma população de referência normal. A 10 fração de controles de homens na Suécia foi de 59,7% e a idade média no recrutamento para os controles suecos foi de 43,1 (SD = 12,3).
População de estudo dos U.S.
Os pacientes U.S. foram alistados em estudos de controle e grupos de casos em andamento no Massachusetts General Hospital (MGH) 15 entre Janeiro de 1998 e Julho de 2006. Todos os aspectos destes estudos foram aprovados pelo Institutional Review Board local. Pacientes alistados no estudo de controle de caso consistiu de pacientes hospitalizados com acidente vascular cerebral isquêmico ou hemorrágico agudo confirmado pela CT ou MRI, admitidos em um único hospital de cuidado agudo. Dos 328 pacientes 20 de acidente vascular cerebral hemorrágico recrutados 78 foram diagnosticados com AF e foram usados como casos para o estudo corrente, os 250 remanescentes foram usados como controles. 170 pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico tiveram um diagnóstico de AF e foram tratados como casos mas nenhum paciente com acidente vascular cerebral isquêmico 25 foi tratado como controle. Pacientes foram excluídos para hemorragia subaracnóide primária e para hemorragia intracerebral secundária para trauma de cabeça, tumor, má formação vascular ou vasculite. 624 controles livres de acidente vascular cerebral foram recrutados de uma prática de primeiros socorros grande (> 18.000 pacientes) servindo a área de captação do hospital assim como o Serviço de Controle Anticoagulação do hospital. 70 dos 624 indivíduos coletados como controles foram diagnosticados com AF e casos tratados com o propósito do estudo corrente. 50,9% de todos os indivíduos usados como controles foram homens e a sua idade média foi de 67,4 (SD = 5 12,3). Todos os pacientes ou um informante acompanhante forneceram consentimento informado para a participação em estudos genéticos e foram entrevistadas de forma previdente com respeito à história médica, medicações, história social e familiar. A presença ou ausência de fibrilação atrial foram documentadas de forma previdente através de entrevista e de 10 revisões de registros médicos.
A segunda parte dos pacientes U.S. consistiu de pacientes consecutivos só com AF ou AF com diagnóstico coexistente de hipertensão encaminhados ao serviço de arritmia que forneceram consentimento informado por escrito para a participação em estudos genéticos. Os critérios de inclusão foram AF documentado pelo EKG e uma idade menor do que ou igual a 65 anos. Os critérios de exclusão foram fibrilação atrial cardíaca estrutural e/ou acidente vascular cerebral como avaliado pela ecocardiografia, fibrilação atrial cardíaca reumática e/ou acidente vascular cerebral, hipertireoidismo, infartação do miocárdio ou insuficiência cardíaca congestiva. Cada paciente passou por uma examinação física e uma entrevista padronizada para identificar condições médicas passadas, medicações, sintomas e deflagradores possíveis para o início da AF. Todos os pacientes foram avaliados pelo EKG de doze fios condutores elétricos, ecocardiograma e estudos de laboratório. EKGs e ecocardiogramas foram interpretados usando critérios padrão.
População de estudo de Hong Kong
Todos os pacientes na população de estudo de Hong Kong foram de ancestralidade chinesa Han do sul residindo em Hong Kong. Os casos consistiram de 217 indivíduos (49,1% homens, idade média 68,1 (SD = 9,6)) selecionados do Prince of Wales Hospital Diabetes Registry23 e 116 pacientes (30,2% homens, idade média 76,1 (SD = 10,9)) do Stroke Registry24. Todos os pacientes foram diagnosticados ter fibrilação atrial pelo EKG. Os controles consistiram de 2.836 pacientes sem evidência de AF. O 5 consentimento informado foi obtido para cada paciente participante. Este estudo foi aprovado pelo Clinicai Research Ethics Committee of the Chinese University of Hong Kong.
Genotipagem de genoma amplo Illumina
Todas as amostras de caso e controle islandesas foram ensaiadas com os chips de SNP Infinium HumanHap300 (Illumina, SanDiego, CA, USA), contendo 317 503 SNPs que rotulam haplótipo derivados da fase I do projeto International HapMap. Dos SNPs ensaiados no chip, 162 SNPs gerados nos genótipos e um adicional de 178 SNPs produziram mais baixo do que 90%. Quarenta e oito SNPs foram monomórficos e 107 outros quase monomórficos (isto é, a menor frequência de alelo no grupo combinado de pacientes e controles foi menor do que 0,001). Um adicional de 475 SNPs mostraram distorção muito significante do equilíbrio de Hardy-Weinberg nos controles (p < 1 x IO'10). Por último, uns poucos marcadores (n = 18) foram determinados ter problemas de genotipagem depois da investigação de regiões particulares e sinais possíveis em diversos estudos de associação de genoma amplo em andamento diferentes internos. Assim, as análises finais apresentadas no texto utiliza 316.515 SNPs. Quaisquer amostras com uma taxa chamada abaixo de 98% foram excluídas da análise.
Genotipagem de SNP único e Microssatélite.
A genotipagem de SNP foi realizada pela plataforma
25
Centaurus (Nanogen) . A qualidade de cada ensaio de SNP da Centaurus foi avaliada pela genotipagem de cada ensaio nas amostras CEU e/ou YRI HapMap e comparando os resultados com os dados de HapMap. Os ensaios com >1,5% de taxa de desemparelhamento não foram usados e um teste de desequilíbrio de ligação (LD) foi usado para marcadores conhecidos estar em LD.
Análise de Associação
Uma tentativa foi feita para genotipar todos os indivíduos 5 participantes quanto a rs2200733, rs4611994 (um substituto perfeito para rs2200733), rsl3143308 e rs6843082 (um substituto perfeito para rs 13143308). Para cada um dos SNPs, o rendimento foi mais alto do que 90% em cada grupo. Além dos genótipos para o microssatélite D4S406 foram disponíveis para todos os pacientes islandeses e suecos. Por causa da 10 redundância na genotipagem, genótipos observados reduziram a quantidade de informação perdida devido aos genótipos perdidos através de um método de probabilidade que nós usamos antes26. Isto garantiu que os resultados apresentados nas tabelas foram sempre com base no mesmo número de indivíduos, permitindo comparações significativas de resultados. Como os 15 dados em rsl0033464 foram apenas diretamente disponíveis nas amostras de descoberta islandesa iniciais e no projeto HapMap os haplótipos rs2200733 C rs 13143308 T foram usados para rotular este SNP. Esta rotulação foi perfeita tanto nas amostras da descoberta inicial quanto nas amostras CEPH CEU HapMap.
Um procedimento de probabilidade descrito em um anterior e
implementado no software NEMO, foi usado para a análise de associação. Nós testamos a associação de um alelo para cada fenótipo usando uma estatística de razão de probabilidade padrão, que, se os pacientes não fossem relacionados, teriam assintoticamente uma distribuição de qui quadrado, com 25 um grau de liberdade, sob a hipótese nula. A OR específica de alelo foi calculada assumindo um modelo multiplicativo para os dois cromossomas de um indivíduo4. Resultados de grupos de controle de caso múltiplos foram combinados usando um modelo de Mantel-Haenszel5 em que os grupos foram deixados ter frequências de população alélica diferentes, haplótipos e genótipos mas foram assumidos ter Riscos Relativos comuns. Não houve nenhum desvio significante do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) em nenhum grupo de controle.
Nas Tabelas 7 e 8, os valores P tanto para rs2200733 quanto rs 10033464 foram computados com base nas comparações com haplótipos do tipo selvagem rs2200733 C5 rsl3143308 G, rsl0033464 G que não carregam nenhum dos alelos em risco. A Razão de Chances condicionais correspondentes para rs2200733 T é definida como [f(rs2200733 T)/f(WT)]/[p(rs2200733 T)/p(WT)] onde WT denota o haplótipo tipo selvagem e f(.) e p(.) denotam frequências em casos e controles respectivamente. Sob o modelo multiplicativo e quando os controles puderam ser considerados como controles de população, esta Razão de Chances condicional é a estimativa apropriada do Risco Relativo de rs2200733 T versus o tipo selvagem. A razão impar condicional para rsl3143308 T é similarmente definido e tem uma interpretação similar.
Correção para a relacionabilidade e Controle Genômico.
Alguns dos indivíduos nos grupos de caso-controle islandeses foram relacionados entre si, fazendo com que a estatística do teste de qui quadrado anteriormente mencionado tivesse uma média >1 e intermediário >
'yfs
0,675 . Nós estimamos o fator de inflação pelo uso de um procedimento anteriormente descrito onde nós simulamos genótipos através da genealogia
• 30
de 731.175 islandeses . Para as amostras da descoberta inicial, onde genótipos para os 316.515 SNPs de varredura de genoma amplo foram disponíveis, nós também estimamos o fator de inflação pelo uso de controles genômicos e calculando a média das 316.515 estatísticas qui quadrado e pela computação da média das estatísticas de qui quadrado 316.515 e dividindo-a
26 31 32
por 0,675 como descrito anteriormente ’ . Para estas amostras iniciais os fatores de inflação, estimados pelo método da genealogia ORr e os dois métodos de controle genômico deram estimativas de fator de inflação similares; 1,047, 1,058 e 1,054 respectivamente. Os valores P e intervalo de confidências apresentadas são fundamentados no ajuste pelo fator de inflação estimado pelo método da genealogia.
Triagem por PCR de bibliotecas de cDNA.
Para confirmar a expressão das ESTs unidas (DA725631,
DB324364 e AFO17091) dentro do bloco LD nós triamos bibliotecas de cDNA comercialmente disponíveis e bibliotecas geradas no deCODE. As bibliotecas comerciais tríadas foram bibliotecas de cDNA Marathon Ready de coração (Clontech-639304), aorta (Clontech-639325) medula óssea (Clontech 10 7416-1), testículo (Clontech 7414-1) e cérebro integral (BD 50598). Além disso as bibliotecas de cDNA foram construídas para sangue integral e células de linfoblastóide humano transformadas com EBV. O RNA total foi isolado das linhagens de célula de linfoblastóide e sangue integral, usando o kit de isolação de RNA RNeasy da Qiagen (Cat. 75144) e a isolação de RNA 15 RNeasy do kit sangue integral (Cat. 52304), respectivamente. As bibliotecas de cDNA foram preparadas na deCODE usando o Kit High Capacity cDNA Archive com iniciadores aleatórios (Applied Biosystems PN 4322171).
A triagem pela PCR foi realizada usando o Advantage® 2 PCR Enzyme RT PCR System (Clontech) de acordo com as instruções dos 20 fabricantes e usando iniciadores de PCR da Operon Biotechnologies. As reações de PCR foram feitas em volume de 10 μΐ a uma concentração final de 3,5 μΜ de iniciadores avançados e reversos (Tabela 16), 2 mM de dNTP, tampão de PCR Ix Advantage 2 e 0,5 μΐ de biblioteca de cDNA.
Análise de Northern Blot.
Northern blots poli-A de tecido múltiplo comercial foram
obtidos da Clontech (Sistema Cardiovascular Humano, Cat. 636825).
Sondas usadas:
i) o clone de cDNA PITX2 (HU3_p983E0327D), obtido da RZPD Deutsches Resfontenzentrum fur Genomforschung GmbH, Alemanha http://www.rzpd.de/products/genomecube.shtml) (seqüência verificada, dados não mostrados);
ii) Clone de cDNA que correspondeu aos exons 1 a 12 dos transcritos ENPEP obtidos de experimentos de RT-PCR. O clone ENPEP foi
verificado na seqüência:
TCCTGCTCCAGCTTGTGGATATmGCAAAAAAGCTCTCCATCTGCCACAGTTGCAGTTCAGTGTTG AATGGCTCTGCTATTGTGACAATTCGGCCAAGGTTTCTGTTATTGAGTGTATATCTGTTGACTAGAT AGTCCCAGTTGAGTrGTATCCAATTCCAGGCCATGTTCTTCCCATAGCTGTTATATGAGATATATCG AATGACTGTAAACACATCCTGAG11 I t AATAAGGTTCGTGTCCTTGAGCAAATCCAAATACCTTGAC AAAAGAGTAACGTTCTTCACTGATGCTAATCCATACAGCAGI miCIIIliCI IGAGCTAATGAAGT
tttctggtattgctcaagagtgtagttccatgaaatctcattgccagagttctgcatcccataccga
TACACCAGAAGCCrGAGATTTACGGGAAGGCrrACAGTCCCATTTAGCCACTGCTCAAATAACGAG
GAAGCATrGrrCAAGGCTTCTCTGTCTCCCATCTTGCACGCAAACCCTAACACGGAGGAACGGAGT
AACTTTGTGACATGGTCTCCAGCATCATTCCATCCCAGAGAATCTGCAATAGGCTTCACTTGACCTT
GGAAGTATTCCTCAATCATAGGATATAGCTCTTTATCATCTTCAAACATGCTAATGATGTAGGTTACA
GCTGAAATTACTCTCTGCCATGGTAAAAAATTCTCTTCCCTTTTGAGATACTTGGTCAAGTTCAAAG
ccaccttataatctagaagttgagctcttgccaaggcaaaagcatcatcaataagacttgcacgatc
TGCTGAAGAAAATGTCrTGTGGTTCAAGGAGAGCGCTGrrAGCTATCGAGTCCCAAGTTGCTACTTC ATAATTTACACGATAAAACCCAATATGATCTGGGTTrATTTTGAGAAAAGCATTTCCACTAGGATFA GAGGAGTTCAAAGTGATTCCfTCi mTCTGACCTATTAAATAACACACTGCTrGTTATATTATCTTC
agtccatttàactgggatattccatgtataaccaagatctgaagggggctgagáagggttagctct
TGGGTC CAACAA AAAGCGTTTCTGTGTGATGTTCTTGACACCGTTCACGTTAAGCACAGGÂTAACC CATCTgGnrCTGGTCCAGGTGTCCATTACÍÍCIllCACTGGTAGCCTACTTGCCTCTTCCAGTGCTGC CCAAAAAT
Os fragmentos de cDNA foram radiorrotulados com [a-
32
P]dCTP (atividade específica 6000 Ci/mmol), usando o kit de rotulação Megaprime (GE Healthcare Cat. RPN 1607) e os nucleotídeos não incorporados removidos da reação usando microcolunas ProbeQuant G-50 (GE Healthcare Cat. 275335-01). As membranas foram pré-hibridizadas em tampão Rapid-hyb (GE Healthcare Cat. RPN 1635) por pelo menos 30 minutos e subsequentemente hibridizados com 100 a 300 ng da sonda de cDNA rotulada. As hibridizações foram realizadas em tampão Rapid-hyb a 65°C durante a noite. As sondas rotuladas foram aquecidas por 5 minutos a 95°C antes da adição aos filtros na solução de pré hibridização. Depois da hibridização, as membranas foram lavadas em baixa severidade em 2x SSC, 0,05% de SDS na temperatura ambiente por 30 a 40 minutos seguido por duas lavagens de alta severidade em 0,lx SSC, 0,1% de SDS a 50°C por 40 minutos. As manchas foram imediatamente seladas e expostas à película de raio X BioMax MR da Kodak (Cat. 8715187). Avaliação para variantes reguladoras candidatas na região AF
O browser UCSC foi usado para posições extraídas de SNPs e sítios de ligação de fator de transcrição conservados (TFBS) para uma região de 172,5 kb em tomo dos SNPs associados com AF (hg libera 17, cromossoma 4, 111.942.401-112.114.901). As duas tabelas foram de referência cruzada e SNPs que acabaram nos sítios de ligação foram ainda interrogados quanto a LD com rs2220427 ou rs6843082 nos dados HapMap. Isto foi feito para as liberações 16, 17 e 18 do genoma humano, mas os resultados são relatados nas coordenadas hg 17. Isto produziu 3 SNPs que acabam nos sítios de ligação conservados para fatores de transcrição conhecidos (Tabela 17). Nota, esta análise detecta apenas uma amostra limitada de candidatos funcionais como i) os haplótipos AF não foram totalmente sequenciados, ii) diversos SNPs candidatos não são tipados em Hapmap e é desconhecido se eles estão nos haplótipos AF, iii) os polimorfismos em regiões menos conservadas podem ser funcionais. Conservação evolucionária de três TFBS
A utilização do alinhamento Multiz no genoma UCSC permitiu uma avaliação da conservação evolucionária das regiões afetadas por estes SNPs. Em todos os três casos é a parte de núcleo dos sítios de ligação 20 TF intactos, mas as posições afetadas são preservadas a um grau diferente. O SOX5 afetado pelo rs 12510087 é o menos conservado em mamíferos mas o segundo (afetado pelo rs2220427) é estritamente preservado (com a exceção de Opossum é mantido em todas as espécies para a galinha). A mutação rsl7042171 está na última posição no motivo GGAAAA de núcleo do sítio de 25 ligação NFAT. A conservação indica que um G é preferido nesta localização, que resulta em um motivo GGAAAG.
Correlação entre o genótipo e expressão de ENPEP
Os sangue foi coletado pela manhã, entre 8 e 10 am, depois durante a noite jejum (a partir das 9 pm) e o RNA extraído dentro de 2 horas da flebotomia de 1.002 indivíduos. A isolação de RNA foi realizada usando o Kit RNeasy Midi (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). Amostras de gordura subcutâneas (5 a 10 cm3) foram removidas através de uma incisão de 3 cm na linha do biquini (sempre do mesmo sítio para evitar a variação específica de 5 sítio) depois da anestesia local usando 10 ml de lidocaína-adrenalina (1%) de 673 indivíduos. Purificação do RNA total foi realizada com o Kit RNeasy Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).
A integridade do RNA total foi avaliado através da análise no
Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, U.S., CA).
Cada amostra de RNA rotulado incluiu grupos de referência, 1.765 amostras
no total, foi hibridizada a um arranjo Human 25K fabricado pela Agilent
Technologies. As imagens de arranjo foram processadas como anteriormente
descrito para obter o ruído de fundo, intensidade de canal único e estimativas
de erro associadas com a medição11. As mudanças na expressão entre duas
amostras foram quantificadas como logaritmo médio (Iogio) da razão de
expressão (MLR), isto é, as razões de expressão comparadas com os valores
de intensidade corrigidos com o fundo para os dois canais para cada ponto no
12
arranjo . As hibridizações foram através do processo QC padrão, isto é, razão de sinal para ruído, reprodutibilidade e precisão nos compostos injetados, comparando as intensidades Cy3 a Cy5.
Nenhum SNP associado foi correlacionado com a expressão de ENPEP ajustada para a idade e sexo no sangue (P = 0,90 e P = 0,82 para rs2200733 e rs 10033464, respectivamente) ou tecido adiposo (P = 0,23 e P = 0,37 para rs2200733 e rsl0033464, respectivamente)
25 Tabela 7. Análise da associação de rs2200733 e rs 10033464 no cromossoma
4q25 para AF/AFI.
Amostra Rs2200733 Ta rsl0033464 Ta b (N casos/ Freq.c OR P Freq.c OR P Comparação União N controles) (95% Cl) (95% Cl) pd PAR Descoberta 0,191 1,84 2,0x10" 0,110 1,42 0,0024 0,041 0,216 Islandiae 0,114 (1-54-2.21) 0,080 (1,13-1,77) (550/4.476) Replicaçâo 0,166 1,64 2,7xl0"23 0,108 1,40 8,2x10'5 0,028 0,176 (2.251/13.238) 0,108 (1,49-1,81) 0,080 (1,24-1,58) Combinado 0,171 1,68 l,9xlO*30 0,108 1,40 9,4x10‘9) 0,0025 0,180 (2.801/17.714) 0,110 (1,53-1,83) 0,080 (1,25-1,55) Outras 0,179 2,01 0,00027 0,172 1,65 0,0087 0,41 0,272 ancestralidades 0,098 (1,38-2,93) 0,111 (1,14-2,41) eropéias Suécia (143/738) U.S. 0,229 1,84 9,8x10-'° 0,105 1,30 0,052 0,026 0,232 (636/804) 0,139 (1,151-2,23) 0,083 (1,00-1,69) Combinadof - 1,88 l,2xl0'12 - 1,41 0,0019 0,027 0,237 (1,58-2,23) (1,13-1,75) Todas as - 1,72 3,3x1o-41 - 1,39 6,9x10" 0,00019 0,206 ancestralidades (1,59-1,86) (1,26-1,53) européias Combinadof Hong Hong 0,605 1,42 0,00064 0,190 1,08 0,55 0,0099 0,346 Homg Hong 0,528 (1,16-1,73) 0,218 (0,84-1,39) (333/2.836) Cada linha contém os resultados de uma análise conjunta de duas variantes, rs2200733 T e rs 10033464 Tb. Os números de casos e controles (N) são
mostrados para cada estudo de caso-controle e para cada variante as frequências alélicas da variante em casos e controles, a OR com um 95% CI e valores P de lado duplo, são mostrados. Além disso, um Valor p para comparar o efeito das duas variantes e seu risco atribuível à população (PAR) conjunto são relatados. Por exemplo, a primeira linha indica que, para as 10 amostras da descoberta islandesa inicial, rs2200733 T tem uma Razão de Chances (OR) estimada de 1,84 (95% CI (1,54-2,21), P = 4,1 x IO'11) vs o tipo selvagem (rs2200733 C, rsl3143308 G, rsl0033464 G haplótipo) e rsl0033464 T tem uma OR estimada de 1,42 (95% CI (1,13-1,77), P = 0,0024) vs o tipo selvagem. a Resultados de comparar rs2200733 T e rsl0033464 T aos haplótipos rs2200733 C, rs 13143308 G, rs 10033464 G do tipo selvagem. bNas amostras suecas e nas U.S. rs 10033464 T foi rotulado pelos haplótipos rs2200733 C, rsl3143308 T
c A frequência nos casos (acima) e controles (abaixo)
dValor p para comparar as ORs de rs2200733 T e rsl0033464 T.
eA análise de associação foi ajustada quanto a relacionabilidade de alguns dos
indivíduos.
r*
Para as populações de estudo combinadas de descendência européia, o PAR foi calculado pelo uso da frequência de controle média, não ponderada das populações, enquanto que a OR e o Valor p foram estimados usando o modelo de Mantel-Haenszel.
Tabela 8. Associação pela idade no diagnóstico na Islândia e pelo sub-
fenótipo de AF no U.S.
Amostra Rs220073 Rs10033464a’ 3a b (N casos) Sexo Idade OR OR P Sexo P N controles masculino ±SD (95% Cl) (95% Cl) % Islândia0 Diagn. <!60 77,8 50,7 2,12 1,69 6,3xl0"18‘ 0,82 (1,77-2,54) (1,34-2,12) (510/17.714) ±8,4 Diagn. 60-70 66,2 65,6 1,88 1,44 6,7xl0'15 0,58 (1,60-2,21_ (1,18-1,77) (654/17.714) ±2,9 Diagn. 70-80 58,9 75,0 1,60 1,23 7,5x10·" 0,96 (1,39-1,84) (1,03-1,47) (958/17.714) ±2,8 Diagn. >80 47,4 85,6 1,20 1,31 0,0044 0,36 (1,01-1,43) (1,08-1,60) (679/17.714) ±4,2 U.S. AF sozinho 81,7 46,1 2,32 1,68 l,2xlO"10 0,46 (1,80-2,99) (1,19-2,37) (251/804) ±11,5 AF/HTN 74,6 54,5 2,23 1,66 0,0010 0,54 (1,43-3,48) (0,90-3,04) (67/804) ±10,2 Outro AF 52,8 75,2 1,44 0,97 0,015 0,85 (1,12-1,64) (0,69-1,37) (318/804) ±1,3 Cada linha contém os resultados de uma análise conjunta de duas variantes, rs2200733 T e rs 10033464 Ta. Os números de casos e controles (N), a porcentagem de casos masculinos e a idade média (± SD) para os casos, são mostrados para cada estudo de caso-controle. A OR, com um 95% CI e valores P são mostrados para cada variante. Além disso, um Valor p conjunto para o efeito combinado das duas variantes e um Valor p conjunto para testar 5 se existe uma diferença da frequência alélica das variantes entre os sexos dentro de cada subgrupo de pacientes.
a Resultados de comparação de rs2200733 T e rsl0033464 T com os haplótipos rs2200733 C, rsl3143308 G, rsl0033464 G do tipo selvagem. Tabela 9. Equivalente de SNPs para rsl0033464, rsl3143308 e rs2200733 nos dados CEU HapMap
SNT Mhfto SNT LocaI ccmrtr. 35 Locai SEQ IDNo. 50 rsl2603217 rs10033464 112063765 108955 rsl2510087 rsl0033464 112068632 111822 rs68523S7 rsl0033464 112071939 117129 rs440005B rs10033464 112074277 119467 rsl 0033464 rs10033464 112078365 123555 rs2171592 rsl0033464 112078392 123582 rs2350S39 rsl 0033464 112078814 124004 rs1906606 rsl0033464 112080996 126186 rs723364 rsl0033464 112082075 127265 rs2220429 rsl0033464 112085089 130279 rs4032976 FS10033464 112086371 131561 rs3853440 rsl0033464 112087213 132403 rs3653441 rs10033464 112087344 132534 rs3853442 rsl 0033464 112087632 132822 m3353443 rsl 0033464 112087733 132923 rs4124158 rsi0033464 112087798 132988 fs4124150 rsi0033464 112087847 133037 rs12506083 rs10033464 112088016 133206 rs4032975 rs10033464 1120S9842 135032 r$4Q32974 rsl0033464 112090140 135330 rs2634074 rs13143308 112034645 79835 rs2466455 rsl3143308 112043219 88409 rs2723334 rsl3143308 112046356 91546 rs19Q6616 ra13143308 112055172 100362 rs1806615 rsl 3143308 112059402 104592 rs2129983 rsl 3143308 112061684 106874 rs212S982 rsl 3143308 112061747 106937 rsl906599 rsl 3143308 112070290 115480 rsl 3143308 rsl3143308 112072023 117213 rs6843082 ns131433GS 112075671 120861 rsl7042059 rs2200733 111998790 43980 r§4529121 rs220Ó733 112003159 48349 rs4543199 rs2200733 112005744 50934 rsl2647316 rs2200733 112006855 52045 rsl0019689 rs22ÕÓ733 112007473 52663 rs4626276 rs2200733 112007593 52783 ís17042076 rs2200733 112009942 55132 rsl1098089 rs2200733 112011830 57020 rsl7042088 rs2200733 112012418 57608 r$ 11930528 rs2200733 112017798 62988 SNI RtrtuJeijsíci SNT Lotal <eiiítr35 LocalSSQ.lD.No.50 rsl 7042093 »2200733 112021762 66952 rsl7042102 »2200733 112026230 71420 rsl 7042121 »2200733 112034705 79895 rsl0516563 »2200733 112035326 80516 rs4605724 »2200733 112042685 87875 »2350269 »2200733 112044728 89918 »2200753 112045118 90308 »17042144 »2200733 112047270 92460 »1908618 »2200733 112053026 98216 »1906617 »2200733 112053418 98608 rs Ί2646447 »2200733 112050930 102120 rs12646754 »2200733 112061178 106366 rs2129981 »2200733 112061803 106993 rsl 2639654 »2200733 112062889 108089 »6817105 »2200733 112063372 108562 rsl 7042171 rs2200733 112065891 111081 »1906591 »2200733 112066493 111683 »1906592 »2200733 112066808 111798 »2200732 »2200733 112067646 112836 »2200733 »2200733 112067773 112963 »4611994 »2200733 112068845 113835 »4540107 »2200733 112068706 113896 »1906593 »2200733 112069526 114718 »1906596 »2200733 112069840 115030 »2220427 »2200733 112072493 117683 Tabela 10. Estrutura de haplótipo (haplótipos com frequência estimada >
0,1%) em relação aos SNPs chave e o microssatélite D4S406 na Islândia
Frequência D4S406 Rs2200733 rsl3143308 rsl0033464 0,0800 -8 T T G 0,00647 -6 C T T 0,00225 -4 T T G 0,0415 -2 T T G 0,00108 0 T T G 0,0592 0 C T T 0,00679 2 C T T 0,0169 2 C G G 0,00923 4 C T T 0,135 4 C G G 0,0853 6 C G G 0,1587 8 C G G 0,163 10 C G G 0,0928 12 C G G 0,0398 14 C G G 0,101 16 C G G Tabela 11. Associação a todos os SNPs Illumina Hap300 em uma região de 200 kb em tomo de rs2200733 e rs 10033464 em um conjunto prolongado de casos AF/AFI islândicos e controles. Os resultados não foram ajustados
quanto a relacionabilidade de indivíduos.
Ajuste para Ajuste também rs2220427 para rs!0033464 SNP Local Ali. Freq. OR Valor P OR Valor P OR Valor P rs4834295 111892810 G 0,817 1,0 0,27 1,0 0,39 1,03 0,63 rs2278782 111899758 C 0,883 1,0 0,79 0,9 0,70 0,99 0,93 rs2595110 111902927 T 0,637 1,0 0,13 1,0 1,0 1,01 0,89 rs976568 111908325 A 0,743 1,0 0,83 0,62 0,62 0,97 0,58 rs2197815 111924481 T 0,030 1,1 0,34 0,34 0,34 0,97 0,84 rs2723286 111940938 A 0,231 1,0 0,26 0,50 0,50 1,03 0,59 es2723296 111962087 G 0,229 1,0 0,38 0,60 0,60 1,03 0,67 rs 1699716 111986643 T 0,153 13 4,7xl0"5 0,59 0,59 0,95 0,53 rs2723316 111991891 T 0,297 1,2 l,9xl05 0,59 0,59 0,95 0,40 rs6419178 111993104 A 0,143 1,1 0,17 0,25 0,25 0,98 0,77 rs1448817 111998657 G 0,252 1,4 4,2x10' 0,035 0,035 1,06 0,46 rs2634073 112023387 A 0,167 1,6 2,4x10' 0,039 0,039 0,90 0,48 rs2200733 112067773 T 0,119 1,7 7,6x10' - - - rs2220427 112072493 T 0,120 1,7 5,6x10' - - - rsl310587 112075751 C 0,888 1,0 0,33 0,89 0,89 0,95 0,56 rs 1003346 112078365 T 0,082 1,2 0,013 5,1x1o-4 5,1x10^ - rsl314119 112086218 A 0,368 1,3 2,0x10' 0,0067 0,0067 1,08 0,29 rs3853444 112091740 A 0,604 1,1 0,053 0,45 0,45 1,06 0,24 Tabela 12. Estudo de associação de SNPs que são equivalentes a rs2200733 em amostras CEU HapMap na amostras Chinesas de Hong Kong. SNP LocaI Ali. Freq. OR Valor P HapMap D’ HapMap R2 rsl 1930528 112017798 T 0,472 1,27 0,011 0,91 0,66 rsl7042121 112034705 G 0,418 1,32 0,0029 0,97 0,64 rs6533527 112045118 A 0,518 1,37 0,0014 0,95 0,79 rs 1906617 112053418 C 0,524 1,35 0,0026 1,00 0,98 rs 12639654 112062899 T 0,519 1,39 0,0012 1,00 1,00 rs2200733 112067773 T 0,516 1,42 6,4x10'4 - - rs4611994 112068645 C 0,518 1,39 0,0012 1,00 1,00 Os valores LD relatados são para rs2200733 nas amostras de HapMap CHB e
JPT combinadas
Tabela 13. Associação para AF/AFI pelo genótipo
RR alélico_Genótipo RR
1 2 00 01 02 11 12 22 Valor P Islândia 1,68 1,38 1 1,55 1,36 3,42 2,47 1,58 0,12 Suécia 2,01 1,65 1 1,66 1,72 5,86 3,10 2,04 0,68 U.S. 1,84 1,30 1 1,63 1,40 4,86 2,31 0,90 0,25 Combinado 1,71 1,38 1 1,56 1,37 3,64 2,44 1,43 0,018 Hong Kong 1,42 1,07 1 1,15 0,95 1,77 1,34 0,97 0,87 Os três haplótipos possíveis são codificados como
0 = rs2200733 C, rsl3143308 G, rsl0033464 G
1 = rs2200733 T, rsl3143308 T, rsl0033464 G
2 = rs2200733 C, rs 13143308 T, rs 10033464 T Tabela 14. Associação de vários fenótipos, considerados fatores de risco para
AF para variantes de risco.
Fenótipo T rs2200733 T rsl0033464 (N casos/N controles) OR Valor P OR Valor P Hipertensão 1,08 0,11 1,05 0,37 (2.620/19.862) Infarto do miocárcio 1,05 0,26 1,04 0,49 (3.576/19.542) Obesidade - BMI >35 0,96 0,51 1,00 1,00 (1.601/21.593) Tabela 15. Um resumo da fonte dos controles islândicos. Observe que os indivíduos podem vir de múltiplos projetos e que alguns indivíduos podem ter sido coletados como parentes de probands.
Projeto Fonte Contagem Frequência de Frequência de _T rs2200733_T rs!0033464
Controles de Descoberta
Dependência 376 0,096 0,082 Ansiedade 337 0,110 0,088 Câncer de bexiga 876 0,116 0,085 Câncer de Cólon 370 0,119 0,070 Doença Infecciosa 297 0,109 0,096 MI 454 0,104 0,076 Controles de População 389 0,099 0,077 Câncer da Próstata 713 0,123 0,081 Esquizofrenia 291 0,110 0,091 Diabete Tipo II 551 0,102 0,078 Controles de Replicação Câncer de Mama 228 0,122 0,074 Diabete Tipo II 340 0,097 0,082 Alzheimer 459 0,107 0,061 Osteoartrite 1,175 0,107 0,081 PAD 479 0,096 0,083 Doença pulmonar obstrutiva crônica 326 0,125 0,082 Acidente vascular cerebral 414 0,092 0,069 Osteoporose 1,155 0,109 0,072 MI 390 0,112 0,075 Hipertensão 210 0,118 0,101 Depressão 152 0,128 0,061 Asma 538 0,106 0,076 Parkinson 173 0,102 0,058 Controles de População 305 0,105 0,097 Espondilite Ancilosante 155 0,095 0,077 Apnéia do Sono 422 0,118 0,074 AMD 442 0,101 0,067 Artrite Reumatóide 430 0,100 0,094 Câncer Pulmonar 237 0,106 0,084 FCH 265 0,112 0,057 Longevidade 392 0,09 0,077 Hiperplasia Prostática Benigna 245 0,101 0,058 Pré-eclampsia 262 0,129 0,083 Enurese 249 0,104 0,087 Enxaqueca 590 0,112 0,085 Miopia 353 0,123 0,085 Câncer da Tireóide 104 0,121 0,097 ADHD 123 0,119 0,089 Câncer da Próstata 580 0,117 0,073 Ansiedade 546 0,121 0,096 Obesidade 162 0,081 0,092 Endometriose 258 0,106 0,084 Câncer Renal 174 0,099 0,100 Melanoma 283 0,088 0,089 Dependência 201 0,138 0,098 Psoríase 392 0,136 0,079 IBD 356 0,093 0,102
Tabela 16. Iniciadores usados para triar ESTs de bibliotecas de cDNA
ESTs* Iniciador avançado Imciador reverso DAT25631 DS324364 AF017091 AGTGGAGGCTGCCAGACTTC CCGAGGATeTCTTTAGTCTGQAA TGAGATTCCACATCCAACATCTTT TGCACCACTCÃfCACCAACÁ ATCATACAGCAGGÃATGCAAACA TGGCAÂACTTGATATTGTTCTTG
*Os nomes EST são da NCBIBUILD 35
Tabela 17. SNPs que acabam em TFBS conservados na região associada com AF.
SNP Local Filamento Ancestral Polim. ITBS Inicio de TF Fim de TF rsl 7042171 112Ü6S89Q C AfC NFAT 112065689 112065900 rs12510087 112066631 + A A/G SOXS 112060032 112066641 rs2220427 112072492 + C CTT SOX5 112072483 112072493
Filamento indica o filamento no alinhamento de genoma que a mutação aporta.
Polim. é os dois alelos do polimorfismo neste sítio.
Tabela 18. Marcadores no ou próximo ao gene PITX2 em LD com marcadores no bloco LD C04. São mostrados marcadores em ou próximos ao PITX2 (marcador 1) e sua correlação com os marcadores no bloco LD C04
(marcador 2).
Marcador 1 Marcador 2 0* r2 ValorP rs7668322 rsl0033464 0,46201 0.133423 0.000053 rs2197815 rs10033484 0.660377 0.300172 2.5SE-06 rs 6831623 fs22Q0733 1 0.02834 0,025473 rs2595110 rs2200733 0.699643 0.02996 0.067245 Tabela 19. Marcadores em desequilíbrio de ligação com marcador rs2220427 e marcador rs 10033464 pelos valores para r2 maiores do que 0,1. LD foi calculado com base na amostra da população HapMap CEU.
Marcador 1 âncora
rs9894891 rs11568905 rs4898804 1*721413 rsl0488883 rs6854S83 rs2255793 rs2?23298 rs2723300 rs27233Q7 1^1584429 JS1448799 rs1448798 rs1900827 r$2197814 rs969642 rs259S093 rs2245595 rs2595088 rs981150 rs16997l68 rs16997169 rs4527540 rsl7042026 ra2723316 r«2595081 rs259S085 FS2723318 rs1448Ô17 rsl 7042059 «4529121· fs10032150 rs45431Ô9 rei2647316 rsl2647393 r$10019689 rs462627$ rs17042076 rs11098089 rsl7042088 rsl 1944778 TS4307025 rsl1930528 rs17042098 rs2634073 rsl7042102 rs2634071 rs2634074 7042121 ral0516563 rs4605724 rs2466455 rs2350269 r$6533527
Γ52220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs222G427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
«2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
r§2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
ΓΒ2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs222Q427
rs222Ô427
rs2220427
re2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
rs2220427
1 1 1 1 1
0.788889 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.830131 1 1 1
0.819277
1 1
0,833488 1
0.832621 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.91509 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
r2
0.128329 0.128329 0.128329 0.128329 0.128329 0.510189 0.245283 0.274924 0.236507 0,176558 0,245283 0.245283 0.245283 0.246741 0.240506 0.245283 0,513828 0,252078 0.254302 0.245283 0.5074S1 0,245283 0,245283 0,554106 0.245283 0.549261 0.242283 0.236507 0.296277 1 1
0.296277 1
1
0.917379 1 1 1
1
1
0^11642 0,296277 1 1
0.523052 1
0.528302 0.433962 1 1 1
0.491856 1 1
ValorP
0.002914 0,002914 0.002914 0.002914 0.002914 4,17E-09 9.27E-09 8.39E-09 1.40&Ό8 2.98E-07 9.27E-09 &.27E-W 9.27E-CI9 S.60E-08 1.20E-08 9.27E-09 1.59E-10 6.90E-09 1.99E-08 9.27Ê-09 2.11E-10 9.27E-09 9.27E-09 1.23E-11 9.27E-09 3.07E-11 1,16Ê-€8 140E-08 9.75E-10 1.62E-20 1.43E-20 9.75E-10 1.43E-20 1.43E-20 1.57E-15 1.43E-20 1.43E-20 1.62E-20 1.62E-20 1.62E-20 4.20Ε-Ί2 9.75Ε-1Ό 1.42E-19 1.43E-20 1.42E-12 2.07E-16 2.16E-13 5.12E-12 1.43E-20 1.43E-20 1.43E-2Ü 5.72E-12 1.42E-19 1.43E-20
Pós em B35
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rs2220427
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rs2220427
Γ52220427
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rs2220427
!«2220427
rs10033464
Fã10033464
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rsl0033464
rs10033464
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rsl 0033464
rsl 0033464
rs10033464
rs10033464
rsl 0033464
rs100334S4
rsl0033464
rsl0033464
r$10033464
rsl0033464
rsl0033464
rs10033464
rs10033464
rs10033464
D*
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.857992 0,407276 0,365905 0.433962 0,46291 0.660377 1
0,637611 0.637611 0.735008 0.635887 0.719793 0.60232 0.496308 0.5S10&3 0,640189 0.637611 1 1 1 1 1
r2
0.433962 1 1
1
0.921053 0.433962 1
0.433962 1
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-1 1 1 1 1 1 1 1 1
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ValorP
5.12E-12 1.43E-20 2.67E-19 1.43E-20 1.10E-18 5.12E-12 1.84E-20 5.12E-12 2.08E-20 6.61 E-12 5.12E-12 1.43E-20 1.43E-20 1.62E-20 1.43E-20 143E-20 1,261-19 1.85E-19 1.43E-20 1.43E-20 1.43E-20 1.62E-20 2.68E-20 5.12E-12 5.36E-12 5.12E-12 7.85E-09 9.36E-07 5.78E-09 Θ.36Ε-07 1.07E-06 9.36E-07 9.36E-07 9.36E-07 9.36E-07 0,000186 0,00205 0.003321 0.004763 0.000953 2.55E-06 3.33E-10 0.000011 0.000011 0.000368 0.000014 0,000191 0.000097 0.005455 0.000104 a.3se-06 0.000011 5.12Ε-12 1.77E-09 5.12E-12 5.12E-12 5.12E-12
Pós em Q 35
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Pós na SEQ ID N0:5Q
91546 92460 98216
99445 100362 102120 104592 106366 106874 106937 106993 108089 108562 111081 111683 111788 112836 112963 113835 113896 114716 115030 115460 117213 120861 122479 123613 123791 127295 128612 131408 134730 1347® 134908 136494
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REFERÊNCIAS
ValorP Pós em. Fós na SEQ ID 835 6,61 E-12 112061684 100874 5-12E-12 112061747 10S937 1.43P-2Q 112063765 108955 1.4ot-20 112066632 111822 5.12E-12 112070290 115480 1.43E-20 112071939 117129 2.22E-11 112072023 117213 6.67E-19 112073911 119101 1,43E-20 112074277 119467 5.12E-12 112076671 120861 1.431-20 112078392 123562 9.36E-07 112078423 123613 1-43E-20 112078814 124004 1.43E-20 112080996 126186 1.43E-20 11208207$ 127265 9.36E-07 1'12082105 127295 1.07E-06 112083422 128612 1.43E-20 112085089 130279 9.36E-07 112086218 131408 1 62E-20 112086371 131561 1.62E-20 112087213 132403 1.43E-20 112067344 132534 1.43E-20 112087632 132822 1 »436-20 112087733 132923 1.10E-17 112087796 132988 1.43E-20 112087847 133037 1.43E-20 112088016 133206 9.36E-07 112089540 134730 9.36E-07 112089569 134759 9.36E-07 112089718 134908 7.06E-20 112089842 135032 1.43E-20 112090140 135330 1.44E-06 112091304 136494 0.002495 112585323
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Exemplo 3. Associação de variantes do Cromossoma 4 ao Acidente Vascular Cerebral Isquêmico
O acidente vascular cerebral é uma causa comum de morte e a causa condutora da incapacidade do adulto nas sociedades Ocidentais. Está agora também começando um problema de saúde maior em países de baixa renda e renda intermediária devido ao envelhecimento da população e mudanças nos fatores de risco modificáveis para as doenças cardiovasculares1. O acidente vascular cerebral não é uma doença isolada mas uma síndrome altamente complexa que consiste de um grupo de distúrbios heterogêneos com muitos fatores de risco genéticos e ambientais23. Estudos de gêmeos, historia familiar e modelos de animal4"8 fornecem evidência para a contribuição genética para as formas comuns de acidente vascular cerebral mas nenhuma variante de risco principal foi ainda identificada mostrando resultados compatíveis através de populações.
Os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos (IS), responsáveis pela maioria dos insultos cerebrais (>80%), resultam de trombose ou embolismo que levam à obstrução das artérias cerebrais. Vários mecanismos fisiopatológicos podem causar IS mas aqueles mais comuns são aterosclerose de artéria grande (LAA), acidente vascular cerebral cardioembólico (CES) e doença de vaso pequeno (SVD)9. Métodos
Populações de estudo.
Islândia: Os pacientes com acidente vascular cerebral islandeses foram recrutados de um registro de mais de 4.000 indivíduos diagnosticados com acidente vascular cerebral isquêmico ou TIA no único hospital universitário em Reykjavik, the Landspitali University Hospital, durante os anos de 1993 a 2006. Os pacientes com acidente vascular cerebral foram alistados durante os últimos nove anos através do programa genético de doença cardiovascular (CVD) no deCODE. O diagnóstico de acidente vascular cerebral foi clinicamente confirmado pelos neurologistas (ver abaixo). O grupo de descoberta incluiu 1.661 pacientes e quando da análise dos SNPs em 4q25 nós usamos um conjunto adicional de 282 pacientes (idade média ± SD: 77,2 ±11,3 anos, 45% mulheres). Nós usamos 25.708 controles (idade média ± SD: 59,2 ±21,1 anos, 59% mulheres) de vários programas genéticos sob estudo no Decode, incluindo: aneurisma abdominal (250), fibrilação atrial (1.150), adicção (750), Alzheimer (350), ansiedade (200), asma (1300), COPD (850), câncer de cólon (200), trombose de veia profunda (550), dislexia (200), doenças infecciosas (250), longevidade (400), câncer pulmonar (750), infartação do miocárdio (2.400), enxaqueca (1.100), doença da artéria periférica (1.200), síndrome do ovário policístico (1.200), pré- eclampsia (700), câncer prostático (400), psoríase (750), artrite reumática (550), síndrome das pernas inquietas (350) e diabetes tipo 2 (400).
O estudo foi aprovado pelo Data Protection Commission of
Iceland (DPC) e pelo National Bioethics Committee of Iceland. Todos os participantes deram consentimento informado.
Suécia: Os pacientes suecos com acidente vascular cerebral isquêmico atendidos na unidade de acidente vascular cerebral ou na clínica de paciente externo de acidente vascular cerebral no Karolinska University Hospital, unidade Huddinge em Stockholm, Suécia, foram recrutados de 1996 a 2002 como parte de um estudo de epidemiologia genética em andamento, o Estudo de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico de Stockholm do Sul (SSISS) (idade média ± SD: 67,3 ±11,8 anos, 44% mulheres). Os controles suecos usados neste estudo são controles com base na população recrutados da mesma região na Suécia central como os pacientes, representando a população geral nesta área. Os indivíduos foram doadores de sangue recrutados no Huddinge ou Karolinska University Hospitais ou voluntários saudáveis (recrutados em 1990-1994) recrutados pelo Clinicai Chemistry Department no Karolinska University Hospital para representar uma população de referência normal (idade média ± SD: 46,8 ± 15,9 anos para controles do hospital Huddinge, 41% mulheres, informação de idade não disponível para os doadores de sangue recrutados no hospital Karolinska). O estudo foi aprovado pelo Bioethics Committee of Karolinska Institutet. Sul da Alemanha: A população germânica, aqui contida
aludida como Alemanha-S, consistiu de pacientes IS consecutivamente recrutados durante o período de 2001 a 2006 na unidade de acidente vascular cerebral do Department of Neurology, Klinikum Glosshadern, University of Munich, Alemanha (idade média ± SD: 65,3 ±13,7 anos, 38% mulheres). O grupo de controle consistiu de indivíduos igualados em idade e gênero sem uma história de doença cardiovascular (idade média ± SD: 62,7 ± 10,9 anos, 38% mulheres). Estes foram selecionados do estudo KORA S4, um projeto epidemiológico com base na comunidade próximo a Munich23. O estudo foi aprovado pelo comitê de éticas local e o consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos (ou parentes ou guardiões legais).
Região de Westphalia, Alemanha: A segunda população alemã, aludida como Alemanha-W, recrutou pacientes de acidente vascular cerebral isquêmico através de hospitais que participam no Registro de Acidente Vascular Cerebral Regional de Westphalian, localizado no oeste do país, durante o período de 2000-2003 (idade média ± SD: 70,4 ± 12,6 anos, 53% mulheres). Os controles de população sem uma história auto-relatada de acidente vascular cerebral foram tirados da população de seção cruzada, prospectiva, com base no Dortmund Health Study24, conduzido na mesma região e a freqüência subseqüentemente emparelhada para os casos (idade média ± SD: 52,3 ± 13,7 anos, 53% mulheres). Ambos os estudos foram aprovados pelos comitês de éticas da University of Munster. Todos os participantes deram seu consentimento informado.
SE-Inglaterra, Reino Unido. Pacientes de acidente vascular cerebral isquêmico de descendência européia que compareceram a um serviço cerebrovascular foram recrutados de 1995 a 2002. Todos os casos foram fenotipado por um neurologista experimentado em acidente vascular cerebral com revisão de formação de imagem original (idade média ± SD: 64,6 ± 12,7 anos, 41% mulheres). Os controles da comunidade livres de doença cerebrovascular sintomática foram também recrutados pela amostragem na lista do médico familiar da mesma região geográfica como os pacientes. A amostragem foi estratificada para fornecer uma distribuição similar de idade e gênero como no grupo de paciente (idade média ± SD: 64,8 ± 8,6 anos, 41% mulheres). O estudo foi aprovado pelos comitês de éticas de pesquisa locais e o consentimento informado foi obtido de todos os participantes.
Fenotipagem. Apenas pacientes com acidentes vasculares cerebrais isquêmicos mas não com hemorrágicos foram incluídos no estudo. Todos os pacientes tiveram trabalho de diagnóstico clinicamente relevante realizado, incluindo formação de imagem do cérebro com tomografia computadorizada (CT) e/ou formação de imagem pela ressonância magnética (MRI) assim como investigações de diagnóstico subordinadas incluindo ultrassonografia duplex das artérias carótidas e vertebrais, ecocardiografia, monitoramento Holter, MR-angiografia, CT-angiografia e testes de sangue. Pacientes com Ataque Isquêmico Transitório (TIA) clinicamente confirmado foram incluídos no grupo de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico da Islândia, Alemanha-S e Suécia. Os pacientes foram classificados em subtipos etiológicos de acordo com o Teste de Org 10172 no Tratamento de Acidente Vascular Cerebral Agudo (TOAST)25. Esta classificação inclui seis categorias: (1) doença oclusiva de artéria grande (doença de vaso grande), (2) cardioembolismo (acidente vascular cerebral cardiogênico), (3) doença de vaso pequeno (acidente vascular cerebral lacunar), (4) outra etiologia determinada, (5) etiologia desconhecidas a despeito dos esforços de diagnóstico ou (6) mais do que uma etiologia. Pacientes classificados nas categorias TOAST 4 a 6 foram excluídos da população de acidente vascular cerebral da Alemanha-W. Na Islândia, os pacientes foram classificados como tendo doença oclusiva de artéria grande se estenose foi 70% que é um critério mais rigoroso do que habitualmente usado isto é, 50%. A classificação de pacientes com acidente vascular cerebral em subtipos de acordo com o Teste de Org 10172 no sistema de classificação do Tratamento de Acidente Vascular Cerebral Agudo (TOAST)25 na descoberta islandesa e os quatro conjuntos de amostra de replicação está listada na Tabela 1.
Genotipagem de genoma amplo Illumina. Todos os casos islandeses e as amostras de controle foram ensaiados com os chips de SNP Infinium HumanHap300 (Illumina), contendo 317.503 SNPs de rotulação derivados da fase 1 do projeto International HapMap. Dos SNPs ensaiados no chip, 6.622 SNPs foram excluídos porque apresentaram (i) uma taxa de chamada mais baixa do que 95% em casos ou controles, (ii) freqüência de alelo menor do que 1% na população ou (iii) distorção significante do equilíbrio de Hardy-Weinberg nos controles (Ρ < 1 χ IO"10). Qualquer amostra com rendimento <98% foi excluída da análise. Na análise final 310.881 SNPs foram usados.
Genotipasem de SNP Único. A genotipagem de SNP único para todos os 121 SNP foi realizada na deCODE genetics em Reykjavik, Islândia usando a plataforma Centaurus (Nanogen)26. A qualidade de cada ensaio de SNP foi avaliada pela comparação da genotipagem das amostras CEU HapMap com os dados de HapMap publicamente disponíveis. Todos os SNPs passaram no teste de desemparelhamento, testes de desequilíbrio de ligação (LD) e foram em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Análise de Associação. Para a análise de associação uma estatística de razão de probabilidade padrão foi usada, como implementado no software NEMO criado na deCODE27, para calcular valores P de lado duplo e Razão de Chances (OR) para cada alelo individual, assumindo um modelo multiplicativo para o risco, isto é, qual o risco dos dois alelos uma pessoa carrega multiplica-se. As freqüências alélicas, ao invés das freqüências de portador são apresentadas para os marcadores.
No local no cromossoma 4q25, nós analisamos 3 SNPs, rs2200733, rsl0033464 e rsl3143308. O terceiro SNP, rsl3143308, está em LD alto tanto com rs2200733 quanto com rs 10033464 (D' = 0,99 para ambos) e tem um alelo menor que corresponde completamente aos cromossomas que carregam rs2200733 alelo T ou rs 10033464 alelo T. Este foi genotipado em todas as populações usando um ensaio Centaurus e foi usado para inferir genótipos para aqueles indivíduos que tiveram dados perdidos para rs2200733 ou rs 10033464 na plataforma Illumina Infinium. Na Tabela 21 e Tabela Suplementar 22, os valores P e OR para ambos os alelos de risco rs2200733-T e rsl0033464-T foram computados com base na comparação com os haplótipos rs2200733 alelo C, rsl3143308 alelo G, rsl0033464 alelo G do tipo selvagem, que não contém nenhum dos alelos em risco.
Para os grupos de estudo islandeses, os valores P são dados depois do ajuste quanto a relacionabilidade dos pacientes e outra estratificação da população possível usando o método de controle genômico10. Os fatores de inflação para as estatísticas de qui quadrado são estimados ser 1,07, 1,04, 1,06 e 1,02 para a análise de associação de genoma amplo dos grupos de paciente IS, CES, LAA ou SVD respectivamente. Com os casos adicionais e controles tipados quanto ao local 4q, nós estimamos os fatores de inflação usando simulações como anteriormente descrito28. Os fatores de inflação resultantes são 1,09, 1,03, 1,06, 1,05, 1,01, 1,00, 1,01 e 1,00, para os grupos IS, CES, IS excl CES, LVD, SVD, outros, desconhecidos e mais do que uma causa, respectivamente.
Devido ao número grande de controles usados, o tamanho de amostras eficaz depois de ajustar quanto a relacionabilidade dos casos e controles corresponde a testar 2.690 pacientes IS e 2.690 controles. Os tamanhos de amostra eficazes correspondentes para os pacientes CES, LAA e SVD são 710, 417 e 467, respectivamente.
Os resultados de grupos de caso-controle múltiplos foram combinados usando um modelo de Mantel-Haenszel em que os grupos foram deixados ter freqüências de população diferentes para os alelos, haplótipos e genótipos mas foram assumidos ter um Risco Relativo comum29 Resultados
A associação de variantes dentro da região do bloco LD C04 para o Acidente vascular cerebral isquêmico foi investigada. De modo a investigar ainda mais a contribuição das duas variantes de risco de AF no 4q25, rs2200733 e rs 10033464, para o risco de desenvolver Acidente vascular cerebral isquêmico e seus subtipos, aterosclerose de artéria grande (LAA), acidente vascular cerebral cardioembólico (CES) e doença de vaso pequeno (SVD), nós genotipamos o marcador rs2200733 e o marcador rs 10033464 em amostras islandesas e para propósitos de replicação nós também analisamos conjuntos de dados de replicação em grupos da Alemanha do Sul (1.181 casos e 1.189 controles, Alemanha-S), Suécia (1.032 casos e 1.387 controles), região de Westphalia na Alemanha (1.388 casos e 1.106 controles, Alemanha- W) e Reino Unido (654 casos/676 controles, UK). A classificação de fenótipo dos grupos de estudo é mostrada na Tabela 20.
Tabela 20. TOAST subclassificação de casos de acidente vascular cerebral genotipados, η (%)
Grupo de descoberta Grupos de replicação Islândia Alemanha-S Suécia Alemanha-W Reino Unido Derrame isquêmico 1943 1183 1066 1391 654 Subtipagem TOAST 1443 1183 1061 1389 654 Cardioembolismo 385 (45) 297 (38) 185 (37) 554 (40) 78(18) Ateroesclerose de artéria 229 (27) 372 (47) 230 (46) 560 (40) 232 (55) grande Doença de vasos pequenos 246 (29) 118(15) 82 (16) 275 (20) 114 (27) Outra causa 42 67 56 não recrutado 3 Mia do que uma causa 34 42 não recrutado 40 Causa desconhecida 507 329 466 não recrutado 187
TOAST = Teste de Org 10172 no Tratamento do Acidente vascular cerebral Agudo.
Pacientes (282) e controles (14.893) adicionais da Islândia
também foram genotipados quanto a estes SNPs particulares. O teste de associação foi feito pela comparação de cada SNP com o haplótipo do tipo selvagem (ver Métodos). Como mostrado na Tabela 21, rs2200733 conferiu um risco aumentado de Acidente vascular cerebral isquêmico em todos os conjuntos de amostra e a associação com Acidente vascular cerebral isquêmico foi altamente significante com um OR combinado = 1,26 (P = 8,8 χ IO"11)· Para rs 10033464, a associação com Acidente vascular cerebral isquêmico não foi significante (OR = 1,03, P = 0,45). Ambos SNPs entretanto, associaram significantemente com o Acidente vascular cerebral cardioembólico e este risco foi significantemente maior do que no grupo do acidente vascular cerebral isquêmico como um todo (rs2200733: OR = 1,53, P = 1,5 χ IO"12; rsl0033464: OR = 1,27, P = 5,9 χ IO-4). Isto é como esperado dada a contribuição conhecida da Fibrilação atrial para este subfenótipo. Removendo-se os pacientes com acidente vascular cerebral cardioembólico do grupo de acidente vascular cerebral isquêmico, o efeito observado para ambos os SNPs foi mais fraco nos pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico remanescentes, mas permaneceu significante para a variante mais forte (rs2200733: OR = 1,18, P = 1,5 χ IO'5, rsl0033464: OR = 0,96, P =
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0,39). A parte do acidente vascular cerebral cardioembólico, a aterosclerose de artéria grande e o acidente vascular cerebral de causa não determinada foram os únicos subfenótipos que mostraram associação significante com rs2200733 (OR = 1,22, P = 1,5 χ IO-3, Tabela 2 e OR = 1,18, P = 0,01). Estes resultados sugerem que uma porção significante de acidentes vasculares cerebrais classificados como acidente vascular cerebral criptogênico ou aterosclerose de artéria grande pode ser devido a AF não diagnosticada, intermitente. Ctf
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IO Como debatido no acima (Exemplo 2), os alelos de risco de rs2200733 e rs 10033464 correlacionam-se significantemente com a idade de diagnóstico de Fibrilação atrial. Uma tendência não significante na mesma direção foi observada em nosso estudo para a idade no diagnóstico de acidente vascular cerebral cardioembólico (0,62 anos por cópia de T rs2200733, P = 0,33 e 0,29 anos por cópia de T rsl0033464, P = 0,71, Tabela 23), sugerindo que o efeito da idade observada sobre a AF pode se aplicar também ao acidente vascular cerebral cardioembólico, embora seja um efeito mais fraco.
Tabela 23. Regressão linear da idade no diagnóstico no número de alelos de risco de rs2200733 alelo T e rs 10033464 alelo T. São mostrados os coeficientes de regressão e os valores P de lado duplo correspondentes obtidos usando a idade nos diagnósticos como uma resposta (em anos) e o número de alelos em risco como variáveis prognosticadoras. O sexo foi incluído como um fator covariado em todos os testes e também a população no teste para todos os grupos combinados. Os números de casos usados na
análise são mostrados em parênteses (n).
rs2200733-t rs2200733-t rsl0033464-t rsl0033464-t Isquêmico reg. coef. P reg.coef. P Islândia (1830) 0,11 0,85 -0,35 0,62 Alemanha-S (114) 0,29 0,73 0,85 0,43 Suécia (780) 0,56 0,56 1,11 0,23 Alemanha-W (1352) 0,17 0,80 1,21 0,14 Reino Unido (654) 0,24 0,83 0,47 0,71 Todos os grupos (5790) 0,40 0,25 0,68 0,10 Cardioembólico reg. coef. P reg.coef. P Islândia (356) -1,52 0,16 -0,29 0,85 Alemanha-S (296) -1,72 0,21 -2,53 0,18 Suécia (173) -2,09 0,20 0,81 0,62 Alemanha-W (1352) -0,04 1,00 0,82 0,53 Reino Unido (78) 7,11 0,084 -5,29 0,16 Todos os grupos (1441) -0,62 0,33 -0,29 0,71
Debate
Através deste estudo nos 1.661 pacientes IS islandeses e 10.815 controles e o seguimento da replicação nos conjuntos de caso/amostra de controle de acidente vascular cerebral isquêmico europeu grande e bem caracterizado nós identificamos e validamos uma variante de risco no cromossoma 4q25, rotulado por rs2200733, que associa com acidente vascular cerebral isquêmico. Em nosso estudo, como esperado, estas variantes associaram-se mais fortemente com o subfenótipo de acidente vascular cerebral cardioembólico, que é uma complicação principal da Fibrilação atrial. O risco que é observado em pacientes de acidente vascular cerebral isquêmico sem acidente vascular cerebral cardioembólico é possivelmente devido a um sub-diagnóstico de Fibrilação atrial e deste modo acidente vascular cerebral cardioembólico, visto que a fibrilação atrial é freqüentemente assintomática ou intermitente e pode ser consequentemente difícil para detectar em pacientes com acidente vascular cerebral.
Até 30% do acidente vascular cerebral isquêmico são causados pelo cardioembolismo (5, 6) dos quais uma proporção grande ocorre na presença de fibrilação atrial (7, 8). A fibrilação atrial é a arritmia cardíaca prolongada mais comum do ser humano e a sua prevalência aumenta com a idade, afetando aproximadamente 10% daqueles acima dos 80 anos de idade (3, 9). Como tal, AF é um dos fatores de risco independentes mais poderosos para o acidente vascular cerebral e em um nível de população, a AF está associada com um aumento de quatro a cinco vezes no risco de acidente vascular cerebral (3, 7, 8, 10). Além disso, o acidente vascular cerebral cardioembólico é em uma maneira geral grave, refletido pela incapaciadade maior, taxas mais altas de recorrência de acidente vascular cerebral e mortalidade mais alta do que em outros subtipos de acidentes vasculares cerebrais (6, 11). A detecção precoce daqueles em risco para AF é importante de modo a reduzir o risco de sofrer um acidente vascular cerebral futuro. Os testes clínicos sobre a prevenção do acidente vascular cerebral em pacientes com AF têm mostrado que as medicações anticoagulantes (por exemplo varfarina) reduzem o risco de acidente vascular cerebral substancialmente (7, 12) e é muito mais eficaz do que os agentes anti-plaqueta tais com aspirina e clopidogrel. Nossos resultados fortemente sugerem que uma porção significante de pacientes com acidente vascular cerebral tem fibrilação atrial não diagnosticada e são classificados como acidente vascular cerebral criptogênico ou como acidente vascular cerebral de vaso grande. Tais pacientes podem ter AF assintomática, intermitente que não é detectada durante o trabalho de rotina de 24 a 48 horas de monitoramento cardíaco. Isto é sustentado por dois estudos de pacientes pós-acidente vascular cerebral que passaram por mais 4 a 7 dias de monitoramento cardíaco em ambulatório; as taxas de AF intermitente anteriormente não diagnosticadas foram de 5,6 e 14,3% (13, 14). Os pacientes de acidente vascular cerebral com AF assintomática ou intermitente seriam inadequadamente tratados se mal diagnosticados ao invés como por exemplo de acidente vascular cerebral criptogênico ou acidente vascular cerebral de vaso grande visto que tais pacientes são colocados em um agente anti-plaqueta ao invés de varfarina. Portanto, estes marcadores para AF pode ajudar a determinar qual paciente beneficiar-se-ia de monitoramento cardíaco prolongado como um paciente externo para documentar a presença ou ausência de AF. Estudos prospectivos são necessários para determinar se estas descobertas podem ser traduzidas em melhor prevenção ou tratamento para o acidente vascular cerebral. Referências
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Claims (79)

1. Método para determinar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, e em que a determinação da presença ou ausência do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
2. Método para determinar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende determinar se pelo menos um alelo em risco em pelo menos um marcador polimórfico está presente em um conjunto de dados de genótipo derivado do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a determinação da presença do pelo menos um alelo em risco é indicativa de suscetibilidade aumentada à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rs 10033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a presença de alelos -2, -4 e/ou -8 no marcador D4S406, alelo A do marcador rs2634073, alelo T do marcador rs2200733, alelo T do marcador rs2220427, alelo T do marcador rsl0033464, e/ou alelo G do marcador rs 13143308 é indicativa de suscetibilidade aumentada de arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada distinguida por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,3.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada distinguida por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,4.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada distinguida por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,5.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada distinguida por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,6.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada distinguida por uma razão de chances (OR) de pelo menos 1,8.
11. Método para avaliar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende triar um ácido nucleico do indivíduo quanto a pelo menos um alelo marcador polimórfico ou haplótipo na SEQ ID NO: 50 que se correlacione com a ocorrência aumentada de arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em uma população humana; em que a determinação da presença de um alelo marcador em risco no pelo menos um polimorfismo ou um haplótipo em risco no ácido nucleico identifica o indivíduo como tendo suscetibilidade elevada à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, e em que a ausência do pelo menos um alelo marcador em risco ou haplótipo em risco no ácido nucleico identifica o indivíduo como não tendo a suscetibilidade elevada.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de11 a 13, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rs 10033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51),
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de11 a 14, caracterizado pelo fato de que a presença dos alelos -2, -4 e/ou -8 no marcador D4S406, alelo A do marcador rs2634073, alelo T do marcador rs2200733, alelo T do marcador rs2220427, alelo T do marcador rsl0033464, e/ou alelo G do marcador rsl3143308 é indicativa de suscetibilidade aumentada de arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
16. Método para identificar um marcador para uso na avaliação da suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em indivíduos humanos, caracterizado pelo fato de que compreende a. identificar pelo menos um marcador polimórfico dentro da SEQ ID NO: 50 ou pelo menos um marcador polimórfico em desequilíbrio de ligação com pelo menos um marcador dentro da SEQ ID NO: 50; b. determinar o status genotípico de uma amostra de indivíduos diagnosticados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral; e c. determinar o status genotípico de uma amostra de indivíduos de controle; em que uma diferença significante na freqüência de pelo menos um alelo em pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral quando comparada com a freqüência do pelo menos um alelo na amostra de controle é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que um aumento na freqüência do pelo menos um alelo no pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, quando comparada com a freqüência do pelo menos um alelo na amostra de controle, é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade aumentada à arritmia cardíaca.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que uma diminuição na freqüência do pelo menos um alelo no pelo menos um polimorfismo em indivíduos diagnosticados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, quando comparada com a freqüência do pelo menos um alelo na amostra de controle, é indicativa do pelo menos um polimorfismo sendo útil para avaliar a suscetibilidade diminuída para ou proteção contra, a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a diferença significante na freqüência é distinguida por uma medida estatística.
20. Método para genotipar uma amostra de ácido nucleico obtida de um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico preditivo de risco aumentado de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral na amostra, em que o pelo menos um marcador é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a determinação da presença ou ausência do pelo menos um alelo do pelo menos um marcador polimórfico é preditivo de risco aumentado de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a genotipagem compreende amplificar um segmento de um ácido nucleico que compreende o pelo menos um marcador polimórfico, pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), usando um par iniciador de nucleotídeo que flanqueia o pelo menos um marcador polimórfico.
22. Método de acordo com as reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a genotipagem é realizada usando um processo selecionado de hibridização de sonda específica de alelo, extensão de iniciador específico de alelo, amplificação específica de alelo, sequenciamento de ácido nucleico, digestão de 5'-exonuclease, ensaio de marca molecular, ensaio de ligação de oligonucleotídeo, análise de tamanho e análise conformacional de filamento simples.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a hibridização de sonda específica de alelo.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de20 ã 23, caracterizado pelo fato de que compreende:1. contatar cópias do ácido nucleico com uma sonda de oligonucleotídeo de detecção e uma sonda de oligonucleotídeo realçadora sob condições para a hibridização específica da sonda de oligonucleotídeo com o ácido nucleico; em que e) a sonda de oligonucleotídeo de detecção tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e especificamente hibridiza a um primeiro segmento do ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 50 que compreende pelo menos um sítio polimórfico; f) a sonda de oligonucleotídeo de detecção compreende um rótulo detectável no seu terminal 3' e uma porção de extinção no seu terminal5'; g) o oligonucleotídeo realçador tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e é complementar a um segundo segmento da seqüência de nucleotídeo que está a 5' em relação à sonda de oligonucleotídeo, tal que o oligonucleotídeo realçador esteja localizado 3' em relação à sonda de oligonucleotídeo de detecção quando ambos os oligonucleotídeos são hibridizados ao ácido nucleico; e h) um intervalo de base única existe entre o primeiro segmento e o segundo segmento, tal que quando a sonda de oligonucleotídeo e a sonda de oligonucleotídeo realçador são ambas hibridizadas ao ácido nucleico, um intervalo de base única existe entre os oligonucleotídeos;2. tratar o ácido nucleico com uma endonuclease que clivará o rótulo detectável do terminal 3' da sonda de detecção para liberar o rótulo detectável livre quando a sonda de detecção é hibridizada ao ácido nucleico; e 3. medir o rótulo detectável livre, em que a presença do rótulo detectável livre indica que a sonda de detecção especificamente hibridiza ao primeiro segmento do ácido nucleico e indica a seqüência do sítio polimórfico como o complemento da sonda de detecção.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as cópias do ácido nucleico são fornecidas pela amplificação pela Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).
26. Método para determinar uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a identidade de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador é selecionado do grupo de marcadores associados com o gene PITX2, em que a presença do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade à arritmia cardíaca ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
27. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador é selecionado de rs7668322 (SEQ ID NO: 46), rs2197815 (SEQ ID NO: 47), rs6831623 (SEQ ID NO: 48) e rs259110 (SEQ ID NO: 49) e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
28. Método de acordo com as reivindicações 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade aumentada.
29. Método de acordo com as reivindicações 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a suscetibilidade é a suscetibilidade diminuída.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a arritmia cardíaca é a fibrilação atrial ou flúter atrial.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são distinguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 80 anos.
32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são disitnguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 70 anos.
33. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são disitnguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 60 anos.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o acidente vascular cerebral é o acidente vascular cerebral isquêmico.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o desequilíbrio de ligação é dsiitnguido pelos valores numéricos para r2 maiores do que 0,2.
36. Método para avaliar um indivíduo quanto a probabilidade de resposta a um agente terapêutico para prevenir e/ou melhorar sintomas associados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, caracterizado pelo fato de que compreende: determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo do pelo menos um marcador é indicativa de uma probabilidade de uma resposta positiva ao agente terapêutico para arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um anticoagulante, um agente anti- arrítmico, um agente de controle da freqüência cardíaca, um agente de cardioversão ou um agente de controle do ritmo cardíaco.
38. Método de acordo com as reivindicações 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é selecionado de varfarina, heparina, heparinas de peso molecular baixo, inibidores do fator Xa, inibidores de trombina, bloqueadores do canal de sódio, bloqueadores beta, bloqueadores do canal de potássio e bloqueadores do canal de cálcio.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é selecionado de varfarina, ximelagatran, heparina, enoxaparina, dalteparina, tinzaparina, ardeparina, nadroparina, reviparina, fondaparinux, idraparinux, lepirudina, bivalirudina, argatroban, danaparoid, disopiramide, moricizina, procainamida, quinidina, lidocaína, mexiletina, tocalnida, fenitoína, encainida, flecainida, propafenona, aimalina, cibenzolina, detaimium, esmolol, propranolol, metoprolol, alprenolol, atenolol, carvedilol, bisoprolol, acebutolol, nadolol, pindololol, labetalol, oxprenotol, penbutolol, timolol, betaxolol, carteloi, sotalol, levobunolol, amiodarona, azimilida, bretílio, dofetilida, tedisamil, sematilida, N-acetil procainamida, cloridreto de nifecalant, vernacalant, ambasilida, verpamil, mibefradil, diltiazem, digoxina, adenosina, ibutilida, amiodarona, procainamida, profafenona e flecainida.
40. Método para predizer o prognóstico de um indivíduo diagnosticado com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo é indicativa de um prognóstico pior da arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral no indivíduo.
41. Método para monitorar o progresso de um tratamento de um indivíduo que passa pelo tratamento para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral, caracterizado pelo fato de que compreende determinar a presença ou ausência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico em uma amostra de ácido nucleico obtida do indivíduo, em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes, em que a determinação da presença do pelo menos um alelo é indicativa do resultado de tratamento do indivíduo.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 41, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51).
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 41, caracterizado pelo fato de que o desequilíbrio de ligação é disitnguido pelos valores numéricos de r2 de pelo menos 0,2.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 43, caracterizado pelo fato de que a arritmia cardíaca é a fibrilação atrial ou flúter atrial.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 44, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são distinguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 80 anos.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 44, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são distinguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 70 anos.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de36 a 44, caracterizado pelo fato de que a fibrilação atrial ou flúter atrial são disitnguidos ainda por uma idade de início no indivíduo de menos do que 60 anos.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 36 a 44, caracterizado pelo fato de que o acidente vascular cerebral é o acidente vascular cerebral isquêmico.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar pelo menos um biomarcador para a fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral em uma amostra do indivíduo.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda analisar informação não genética para elaborar a avaliação de risco, diagnóstico ou prognóstico do indivíduo.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a informação não genética é selecionada de idade, idade no início da doença, gênero, etinicidade, status socioeconômico, diagnóstico de doença anterior, história médica do indivíduo, história familiar de fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral, medições bioquímicas e medições clínicas.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 49 a 51, caracterizado pelo fato de que compreende ainda calcular o risco global pela regressão logística.
53. Kit para avaliar a suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende reagentes para detectar seletivamente pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico no genoma do indivíduo, em que o marcador polimórfico é selecionado do grupo que consiste dos marcadores polimórficos dentro do segmento cuja seqüência é apresentada na SEQ ID NO: 50 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e em que a presença do pelo menos um alelo é indicativa de uma suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral.
54. Kit de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5.
55. Kit de acordo com as reivindicações 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado do grupo de marcadores apresentados na Tabela 9 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes.
56. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 55, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D45406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), ml0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51).
57. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 56, caracterizado pelo fato de que a arritmia cardíaca é a fibrilação atrial ou flúter atrial.
58. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 57, caracterizado pelo fato de que o acidente vascular cerebral é acidente vascular cerebral isquêmico.
59. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 58, caracterizado pelo fato de que o desequilíbrio de ligação é disitnguido pelos valores numéricos de r2 maiores do que 0,2.
60. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 59, caracterizado pelo fato de que os reagentes compreendem pelo menos um oligonucleotídeo contíguo que hibridiza a um fragmento do genoma do indivíduo que compreende o pelo menos um marcador polimórfico, um tampão e um rótulo detectável.
61. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 60, caracterizado pelo fato de que os reagentes compreendem pelo menos um par de oligonucleotídeos que hibridizam ao filamentos opostos de um segmento de ácido nucleico genômico obtido do paciente, em que cada par iniciador de oligonucleotídeo é planejado para amplificar seletivamente um fragmento do genoma do indivíduo que inclui um marcador polimórfico e em que o fragmento tem pelo menos 30 pares de base no tamanho.
62. Kit de acordo com as reivindicações 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligonucleotídeo é completamente complementar ao genoma do indivíduo.
63. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 60 a 62, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo tem cerca de 18 a cerca de 50 nucleotídeos no comprimento.
64. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 60 a 63, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo tem 20 a 30 nucleotídeos no comprimento.
65. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 64, caracterizado pelo fato de que o kit compreende: a. uma sonda de oligonucleotídeo de detecção que tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento; b. uma sonda de oligonucleotídeo realçadora que tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento; e c. uma enzima de endonuclease; em que a sonda de oligonucleotídeo de detecção especificamente hibridiza a um primeiro segmento do ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 50 que compreende pelo menos um sítio polimórfico; e em que a sonda de oligonucleotídeo de detecção compreende um rótulo detectável no seu terminal 3' e uma porção de extinção no seu terminal 5'; em que o oligonucleotídeo realçador tem de 5 a 100 nucleotídeos no comprimento e é complementar a um segundo segmento da seqüência de nucleotídeo que está a 5' em relação à sonda de oligonucleotídeo, tal que o oligonucleotídeo realçador esteja localizado 3' em relação à sonda de oligonucleotídeo de detecção quando ambos os oligonucleotídeos são hibridizados ao ácido nucleico; em que um intervalo de base única existe entre o primeiro segmento e o segundo segmento, tal que quando a sonda de oligonucleotídeo e a sonda de oligonucleotídeo realçadora são ambas hibridizadas ao ácido nucleico, um intervalo de base única existe entre os oligonucleotídeos; e em que tratar o ácido nucleico com a endonuclease cliva o rótulo detectável do terminal 3' da sonda de detecção para liberar o rótulo detectável livre quando a sonda de detecção é hibridizada ao ácido nucleico.
66. Uso de uma sonda de oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um reagente de diagnóstico para diagnosticar e/ou avaliar a suscetibilidade à arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, em que a sonda hibridiza a um segmento de um ácido nucleico cuja seqüência de nucleotídeo é dada pela SEQ ID NO: 50 que compreende pelo menos um sítio polimórfico, em que o fragmento tem de 15 a 500 nucleotídeos no comprimento.
67. Uso de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o sítio polimórfico é selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes.
68. Uso de acordo com as reivindicações 66 ou 67, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um sítio polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rs 13143308 (SEQ ID NO: 51).
69. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 66 a 68, caracterizado pelo fato de que a arritmia cardíaca é a fibrilação atrial ou flúter atrial.
70. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 66 a 69, caracterizado pelo fato de que o acidente vascular cerebral é o acidente 5 vascular cerebral isquêmico.
71. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 66 a 70, caracterizado pelo fato de que o desequilíbrio de ligação é definido pelos valores numéricos de r2 de pelo menos 0,2 e/ou valores de |D'| de pelo menos0,8.
72. Meio legível por computador, caracterizado pelo fato de que nele são armazenados: a. um identificador quanto a pelo menos um marcador polimórfico; b. um indicador da freqüência de pelo menos um alelo do dito pelo menos um marcador polimórfico em uma pluralidade de indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral; e c. um indicador da freqüência do pelo menos um alelo do dito pelo menos um dos marcadores polimórficos em uma pluralidade de indivíduos de referência; em que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado dos marcadores polimórficos apresentados na Tabela 5 e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes.
73. Meio de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO:28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rsl0033464 (SEQ ID NO: 41) e rsl3143308 (SEQ ID NO: 51),
74. Meio de acordo com as reivindicações 72 ou 73, caracterizado pelo fato de que o acidente vascular cerebral é o acidente vascular cerebral isquêmico.
75. Aparelho para determinar um indicador genético para a arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende: uma memória legível por computador; e uma rotina armazenada na memória legível por computador; em que a rotina é adaptada para ser executada em um processador para analisar dados de genótipo e/ou haplótipo quanto a pelo menos um indivíduo humano com respeito a pelo menos um marcador polimórfico selecionado dos marcadores apresentados na Tabela 5 e marcadores em desequilíbrio de ligação com estes e gerar um produto com base nos dados de marcador ou haplótipo, em que o produto compreende uma medição de risco do pelo menos um marcador ou haplótipo como um indicador genético de arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral para o indivíduo humano.
76. Aparelho de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a rotina compreende ainda determinar um indicador da freqüência de pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico e/ou pelo menos um haplótipo em uma pluralidade de indivíduos diagnosticados com arritmia cardíaca e/ou acidente vascular cerebral e um indicador da freqüência do pelo menos um alelo de pelo menos um marcador polimórfico ou pelo menos um haplótipo em uma pluralidade de indivíduos de referência e calcular uma medição de risco para o pelo menos um alelo e/ou haplótipo com base em seguida; e em que uma medição de risco para o indivíduo é calculado com base em uma comparação do pelo menos um status do marcador e/ou haplótipo para o indivíduo para o risco calculado quanto a pelo menos uma informação de marcador e/ou haplótipo para a pluralidade de indivíduos diagnosticados com fibrilação atrial, flúter atrial e/ou acidente vascular cerebral.
77. Aparelho de acordo com as reivindicações 75 ou 76, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador polimórfico é selecionado de D4S406 (SEQ ID NO: 45), rs2634073 (SEQ ID NO: 33), rs2200733 (SEQ ID NO: 28), rs2220427 (SEQ ID NO: 1), rs 10033464 (SEQ ID NO: 41) ersl3143308 (SEQ ID NO: 51).
78. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 77, caracterizado pelo fato de que a medição de risco é distinguida por uma Razão de Chances (OR) ou um Risco Relativo (RR).
79. Aparelho ou meio de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 78, caracterizados pelo fato de que o desequilíbrio de ligação é distinguido pelos valores de r2 maiores do que 0,2.
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