BRPI0720427A2

BRPI0720427A2 - Lacases, composições e métodos de utilização

Info

Publication number: BRPI0720427A2
Application number: BRPI0720427-2A
Authority: BR
Inventors: Joseph C Mcauliffe; Huaming Wang
Original assignee: Danisco Us Inc Genencor Div
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2013-12-31
Also published as: WO2008076322A3; DK2094842T3; US20120151682A1; WO2008076323A2; US8105812B2; EP2094842B1; US8772005B2; HK1139191A1; MX2009005733A; WO2008076323A3; EP2092113A2; US20080196173A1; HK1138616A1; CA2672609A1; WO2008076322A2; US8282688B2; MX2009005734A; EP2094842A2; US20080189871A1; ES2386991T3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LACASES, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

O presente Pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente 5 Provisório U.S. N- de Série 60/875.518, intitulado "Lacases, Composições e Métodos de Utilização", depositado em 18 de Dezembro de 2006, e para o Pedido de Patente Provisório U.S. N2 de Série 60/875.454, intitulado "Medi- adores de Lacase e Métodos de Utilização", depositado em 18 de Dezembro de 2006.

Campo da Invenção

\ A presente invenção refere-se a lacases e a seqüências de áci-

dos nucleicos codificadores de lacases, e a métodos enzimáticos para bran- queamento de materiais.

Antecedentes da Invenção As lacases são enzimas contendo cobre que são conhecidas

como satisfatórios agentes oxidantes na presença de oxigênio. As lacases são encontradas em micróbios, fungos e organismos superiores. Enzimas de Iacase são usadas para muitas aplicações, incluindo branqueamento de pol- pa e tecidos, tratamento de água de resíduo de polpa, descoloração, remo- 20 ção de cor industrial, detergentes branqueadores para lavanderia, branque- adores orais para dentes e como catalisadores ou facilitadores para reações de polimerização e oxidação.

As lacases podem ser utilizadas para uma grande variedade de aplicações em determinadas indústrias, incluindo a indústria de sabão, a in- 25 dústria de papel e polpa, a indústria têxtil e a indústria alimentícia. Em uma aplicação são usadas enzimas de oxidação de fenois como um meio auxiliar na remoção de manchas, tais como, manchas de comida nas roupas durante a lavagem com detergente.

A maioria das lacases exibe um pH ideal na faixa de pH acídico, ao passo que são inativas em pHs neutros ou alcalinos.

As lacases são conhecidas por serem produzidas por uma grande variedade de fungos, incluindo espécies do gênero Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytisl Pleurotus, Fornes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Sta- chybotrys, Rhizoctonia, Bipolaris, Curvularia1 Amerosporium e Lentinus. En- tretanto, permanece a necessidade das lacases de apresentarem diferentes perfis de atividade em diversas aplicações.

5 Para muitas aplicações, a eficiência da oxidação de uma Iacase

pode ser melhorada pelo uso de um mediador, também conhecido como a- gente intensificador. Os sistemas que incluem uma Iacase e um mediador são conhecidos na técnica como sistemas mediadores de lacases (LMS). Os mesmos compostos também podem ser usados para ativar ou iniciar a ação da lacase.

Existem diversos mediadores conhecidos para uso em um sis- tema mediador de lacase. Esses, incluem HBT (1-hidroxibenzotriazol), ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfínico)], NHA (N-hidroxiaceta- nilida), NEIAA (N-acetil-N-fenil-hidroxilamina), HBTO (3-hidróxi 1,2,3-benzo- 15 triazin-4(3H)-ona), e VIO (ácido violúrico). Além disso, existem diversos compostos contendo NH-OH ou N-O que foram considerados úteis como mediadores.

Grupos funcionais e substituintes têm grandes efeitos sobre a eficiência do mediador. Até mesmo com a mesma classe de compostos, um 20 substituinte pode alterar a especificidade da lacase perante um substrato, desse modo aumentando ou reduzindo fortemente a eficiência do mediador. Além disso, um mediador pode ser eficaz para uma aplicação específica, porém, inadequado para outra aplicação. Outro inconveniente para os atuais mediadores é a tendência de polimerização durante o uso. Assim sendo, 25 existe uma necessidade para descobrir mediadores eficazes para aplicações específicas. Uma dessas aplicações é o branqueamento de tecidos, onde também é importante que os mediadores não sejam indevidamente caros e perigosos. Outras aplicações do sistema mediador de lacase são fornecidas abaixo.

Assim sendo, existe a necessidade de se identificar outros me-

diadores que ativem a lacase e/ou melhorem a atividade das enzimas que exibem a atividade de lacase. Sumário da Invenção

No presente documento estão descritas novas lacases, seqüên- cias de ácido nucleico codificando tais lacases e vetores e células hospedei- ras para expressar as referidas lacases.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um esquema do plasmídio de expressão de Tricho- derma, pTrex3g-lacaseA, usado no Exemplo 7. O gene da lacase A pode ser substituído por outros genes de lacase aqui descritos.

A figura 2 é um esquema do plasmídio de expressão de Asper- gillus, pKB401, usado no Exemplo 8a. O gene da lacase B pode ser substitu- ído por outros genes de lacase aqui descritos.

A figura 3 é um esquema do plasmídio de expressão de Asper- gillus pKB403, usado no Exemplo 8b. O gene da lacase B se fundiu ao gene codificador do domínio catalítico de glicoamilase. O gene da lacase B pode ser substituído por outros genes de lacase aqui descritos.

A figura 4 é um esquema do plasmídio de expressão de Tricho- derma, pTrex4-lacaseB, usada no Exemplo 8d. O gene da lacase B se fun- diu ao gene codificador do domínio catalítico de CBH1. O gene da lacase B pode ser substituído por outros genes de lacase aqui descritos.

A figura 5 é um esquema do plasmídio de expressão Streptomy-

ces (pKB251) para o códon otimizado do gene da lacase B, usado no Exem- plo 9.

A figura 6 é um esquema do plasmídio de expressão Bacillus (p2JMagk103lnk2E-lacase) para o códon otimizado do gene da lacase D, fundido com o gene codificador BCE103, usado no Exemplo 13.

A figura 7 é um gráfico de barra apresentando os resultados do branqueamento de indigo solúvel, usando uma lacase Thielavia sp. e uma variedade de mediadores em concentrações de 50 e 500 uM.

A figura 8 é um gráfico de barra apresentando os resultados do branqueamento de índigo solúvel, usando uma lacase de Thielavia, Mycelio- phthora e Cerrena sp. e uma variedade de mediadores com pH 5.

A figura 9 é um gráfico de barra apresentando os resultados do branqueamento de índigo solúvel, usando uma lacase de Thielavia, Mycelio- phthora e Cerrena sp. e uma variedade de mediadores com pH 7.

A figura 10 é um gráfico da diferença de cor total para a lacase D recombinante e o mediador de siringamida, em uma função da concentração do mediador e da concentração da enzima, à temperatura de 60°C e pH 6.

A figura 11 é um gráfico da diferença de cor total para a lacase D recombinante e o mediador de siringonitrila, em uma função da concentração do mediador e da concentração da enzima, à temperatura de 60°C e pH 6. Descrição Detalhada da Invenção Exceto em caso de definição em contrário, todos os termos téc-

nicos e científicos aqui empregados têm o mesmo significado, conforme é normalmente entendido pelos especialistas versados na técnica da qual es- sa invenção faz parte. Singleton, et ai, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York 15 (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIO- LOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) oferecem a um especialista um dicio- nário geral de muitos dos termos usados nessa invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e 20 materiais preferidos são descritos. Variações numéricas são inclusive dos números que definem a variação. Deve ser entendido que essa invenção não está limitada à metodologia, a protocolos e a reagentes específicos des- critos, uma vez que esses podem variar.

Os títulos aqui estabelecidos não representam limitações aos diversos aspectos ou modalidades da invenção, a qual pode ser aqui incor- porada por essa especificação como um todo. Do mesmo modo, os termos imediatamente definidos abaixo são inteiramente definidos por referência a essa especificação como um todo.

Todas as publicações aqui citadas estão expressamente aqui incorporadas por essas referências para fins de descrição e divulgação de composições e metodologias que podem ser usadas em conexão com a in- venção. I. Lacase e Enzimas Relacionadas à Lacase

No contexto da presente invenção, as lacases e quaisquer enzi- mas correlacionadas à lacase contemplam qualquer enzima de lacase com- preendida pela classificação de enzima (EC 1.10.3.2). As enzimas de lacase são conhecidas como sendo de origem microbiana e de origem de planta. A enzima de lacase microbiana pode ser derivada de bactéria ou fungo (inclu- indo fungos filamentosos e leveduras) e os exemplos apropriados incluem uma lacase derivável de uma cepa de Aspergillus, Neurospora, por exemplo, N. crassa. Podospora, Botrytis, Collybia1 Cerrena, Stachybotrys, Partus, por exemplo, Partus rudis, Theiiava, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametest por exemplo, T. villosa e T. versicolor, Rhizoctonia, por exemplo, R. soiarti, Co- prinus, por exemplo, C. plicatilis e C. cinereus, Psatyrella, Myceliophthora, por exemplo, M. thermonhila, Schytalidium, Phlebia, por exemplo, P. radita (WO 92/01046), ou Coriolus, por exemplo, C.hirsutus (JP 2-238885), Spon- gipellis sp., Polyporus, Ceriporiopsis subvermispora, Gartoderma tsunodae e Trichoderma.

A lacase ou as enzimas relacionadas à lacase podem, além dis- so, ser produzidas por um método que compreende a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante, que transpor- 20 ta uma seqüência de DNA codificando a referida lacase, bem como seqüên- cias de DNA que permitem a expressão da seqüência do DNA que codifica a lacase, em um meio de cultura sob condições que permitem a expressão da enzima de lacase e recuperando a lacase da cultura.

O vetor de expressão pode ser transformado em uma adequada 25 célula hospedeira, tal como, uma célula fungosa, cujos exemplos preferidos são das espécies de Aspergillus, mais preferivelmente Aspergillus oryzae e Aspergillus niger, e das espécies de Fusarium, mais preferivelmente Fusari- um venenatum. As células fungosas podem ser transformadas por um pro- cesso que envolve a formação de protoplasto e transformação dos proto- 30 plastos, seguida pela regeneração da parede da célula em um modo conhe- cido por si. O uso de Aspergillus como um micro-organismo hospedeiro está descrito no documento de patente EP 238.023. O uso de Fusarium como um micro-organismo hospedeiro está descrito nos documentos de patentes WO 96/00787 e WO 97/08325.

Alternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma bacté- ria, em cepas específicas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, ou E.

coli. A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, conforme descrito em T. Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982. Uma seleção das seqüências adequadas de DNA e a construção de vetores também podem ser realizadas por processos-padrão, cf. T. Maniatis et al., 10 op. cit.

O meio usado para cultivar as células hospedeiras transforma- das pode ser qualquer meio convencional adequado para o crescimento das células hospedeiras em questão. A enzima expressa pode ser conveniente- mente secretada no meio de cultura e pode ser recuperada a partir do mes- 15 mo, por meio de processos bem conhecidos, incluindo a separação de célu- las do meio, através de centrifugação ou filtração, precipitação de compo- nentes proteináceos do meio, através de um sal, como o sulfato de amônio, seguido de processos cromatográficos, tais como, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou similar.

Em uma modalidade, a expressão hospedeiro pode ser uma Tri-

choderma reesei com a região de codificação da lacase sob o controle de um promotor e terminador de CBH1 (ver, por exemplo, Patente US No. 5.861.271). A expressão do vetor pode ser pTrex3g, conforme divulgado no Pedido de Patente US No. 11/245.628, depositado em 7 de outubro de 2005 (Protocolo No. GC886).

Desse modo, os seguintes novos genes e lacases foram prepa- rados:

A. Gene da Lacase A1, Cerrena, da cepa CBS115.075 (SEQ ID No. 1) tendo a seqüência:

ATGAGCTCAA AGCTACTTGC TCTTATCACT GTCGCTCTCG TCTTGCCACT 50 AGGCACCGAC GCCGGCATCG GTCCTGTTAC CGACTTGCGC ATCACCAACC 100 AGGATATCGC TCCAGATGGC TTCACCCGAC CAGCGGTACT AGCTGGGGGC 150 ACATTCCCTG GAGCACTTAT TACCGGTCAG AAGGTATGGG AGATCAACTT 200 GGTTGAATAG AG AAATAAAA GTGACAACAA ATCCTTATAG GGAGACAGCT 250 TCCAAATCAA TGTCATCGAC GAGCTTACCG ATGCCAGCAT GTTGACCCAG 300 ACATCCATTG TG AGTAT AAT TTAGGTCCGC TCTTCTGGCT ATCCTTTCTA 350 ACTCTTACCG TCTAGCATTG GCACGGCTTC TTTCAGAAGG GATCTGCGTG 400 GGCCGATGGT CCTGCCTTCG TTACTCAATG CCCTATCGTC ACCGGAAATT 450 CCTTCCTGTA CG ACTTTG AT GTTCCCGACC AACCTGGTAC TTTCTGGTAC 500 CATAGTCACT TGTCTACTCA ATATTGCG AT GGTCTTCGTG GCCCGTTCGT 550 TGTATACG AT CCAAAGGATC CTAATAAACG GTTGTACGAC ATTGACAATG 600 GTATGTGCAT CATCATAGAG AT AT AATTC A TGCAGCTACT GACCGTGACT 650 GATGCTGCCA G ATCATACGG TTATTACCCT GGCAGACTGG TACCACGTTC 700 TCGCAAGAAC TGTTGTCGGA GTCGCGTAAG TACAGTCTCA CTTATAGTGG 750 TCTTCTTACT C ATTTTG AC A TAGGACACCC GACGCAACCT TGATCAACGG 800 TTTGGGCCGT TCTCCAGACG GGCCAGCAGA TGCTGAGTTG GCTGTCATCA 850 ACGTTAAACG CGGCAAACGG TATGTTATTG AACTCCCGAT TTCTCCATAC 900 ACAGTGAAAT GACTGTCTGG TCTAGTTATC GATTTCGTCT GGTCTCCATC 950 TCATGTGACC CT AATT AC AT CllllCTATC GACAACCATT CTATGACTGT 1000 CATCGAAGTC GATGGTGTCA ACACCCAAT C CCTGACCGTC GATTCTATTC 1050 AAATCTTCGC AGGCCAACGA TACTCGTTCG TCGTAAGTCT CTTTGCACGA 1100 TTACTGCTTC TTTGTCCATT CTCTGACCTG TTTAAAC AGC TCCATGCCAA 1150 CCGTCCTGAA AACAACT ATT GGATCAGGGC CAAACCTAAT ATCGGTACGG 1200 ATACTACCAC AGACAACGGC ATGAACTCTG CC ATTCTG CG ATACAACGGC 1250 GCACCTGTTG CGGAACCGCA AACTGTTCAA TCTCCCAGTC TCACCCCTTT 1300 GCTCGAACAG AACCTT CGCC CTCTCGTGTA CACTCCTGTG GTATGTTTCA 1350 AAGCGTTGTA ATTTGATTGT GGTCATTCTA ACGTTACTGC GTTTGCATAG 1400 CCTGGAAACC CTACGCCTGG CGGCGCCGAT ATTGTCCATA CTCTTGACTT 1450 GAG I I I I GTG CGGAGTCAAC ATTCGTAAAG ATAAGAGTGT TTCTAATTTC 1500 TTCAATAATA GGATGCTGGT CGCTTCAGTA TCAACGGTGC CTCGTTCCTT 1550 GATCCTACCG TCCCCGTTCT CCTGCAAATT CTCAGCGGCA CGCAGAATGC 1600 ACAAGATCTA CTCCCTCCTG GAAGTGTGAT TCCTCTCGAA TTAGGCAAGG 1650 TCGTCGAATT AGTCATACCT GCAGGTGTCG TCGGTGGACC TCATCCGTTC 1700 CATCTCCATG GGGTACGTAA CCCGAACTTA TAACAGTCTT GGACTTACCC 1750 GCTGACAAGT GCATAGCATA ACTTCTGGGT CGTGCGAAGT GCCGGAACCG 1800 ACCAGTAC AA CTTTAACG AT GCCATTCTCC GAGACGTCGT CAGTATAG GA 1850 GGAACCGGGG ATCAAGTCAC CATTCGTTTC GTGGTATGTT TCATTCTTGT 1900 GGATGTATGT GCTCTAGGAT ACTAACCGGC TTGCGCGTAT AGACCGATAA 1950 CCCCGGACCG TGGTTCCTCC ATTGCCATAT CGACTGGCAC TTGGAAGCGG 2000 GTCTCGCTAT CGTATTTGCA GAGGGAATTG AAAATACTGC TGCGTCTAAT 2050 TTAACCCCCC GTACGCGGTT TCCCTCACAT CCTGGAGCTA AGCAGCTTAC 2100 TAACATACAT TTGCAGAGGC TTGGGATGAG CTTTGCCCGA AGTATAACGC 2150 GCTCAGCGCA CAAAAGAAGG TTGCATCTAA GAAAG G CACT GCCATCTAAT 2200 TTTTGTAACA AACAAGGAGG GTCTCTTGTA CTTTTATTGG GATTT CTTT C 2250 TTGGGGTTTA TTGTTAAACT TG ACTCTACT ATGTTTGGAA GACGAAAGGG 2300 GCTCGCGCAT TTATATACTA TCTCTCTTGG CAT CACCT GC AGCTCAATCC 2350 TTCAACCACC TAA 2363 codificador da enzima lacase A1, tendo a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID No. 2):

MSSKLLALIT VALVLPLGTD AGIGPVTDLR ITNQDIAPDG FT RP AVL AGG 50 TFPGALITGQ KGDSFQINVI DELTDASMLT QTSIHWHGFF QKGSAWADGP 100 AFVTQCPIVT GNSFLYDFDV PDQPGTFWYH SHLSTQYCDG LRGPFWYDP 150 KDPNKRLYDI DNDHTVITLA DWYHVLARTV VGVATPDATL INGLGRSPDG 200 PADAELAVIN VKRGKRYRFR LVSISCDPNY IFSIDNHSMT VIEVDGVNTQ 250 SLTVDSIQIF AGQRYSFVLH ANRPENNYWI RAKPNIGTDT TTDSGMNSAI 300 LRYNGAPVAE PQTVQSPSLT PLLEQNLRPL VYTPVPGNPT PGGADIVHTL 350 DLSFDAGRFS INGASFLDPT VPVLLQILSG TQNAQDLLPP GSVIPLELGK 400 WELVIPAGV VGGPHPFHLH GHNFWWRSA GTDQYNFNDA ILRDWSIGG 450 TGDQVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIE NTAASNLTPQ 500 AWDELCPKYN ALSAQKKLNP STT 523

B. Gene da Lacase A2, Cerrena, da cepa CBS154.29 (SEQ ID

No. 3):

ATGAGCTCAA AGCTACTTGC TCTTATTACT GTCGCTCTCG TCTTGCCACT 50 AGGCACTGAC gccggcatcg GTCCTGTTAC CGACTTGCGC ATCACCAACC 100 AGGATATCGC TCCAGATGGC TTCACCCGAC CAGCTGTACT GGCTGGGGGC 150 ACATTCCCCG GAGCACTGAT TACCGGTCAG AAGGTATGGG AGATCGATTT 200 CGTTGAATAG AGAAAT ACAA CTGAAAACAA ATTCTTATAG GGAGACAGCT 250 TCCAAATCAA TGTCATCGAC GAGCTTACCG ATGCCAGCAT GTTGACCCAG 300 ACATCCATTG TG AGTATAAT ATGGGTCCGC TCTTCTAGCT ATCCTTTCTA 350 ACTCTTACCC TCTAGCATTG GCACGGCTTC TTTCAGAAGG GATCTGCGTG 400 GGCCGATGGT CCTGCCTTCG TTACTCAATG TCCTATCGTC ACCGGAAATT 450 CCTTCCTGTA CGACTTTGAT GTCCCCGACC AACCTGGTAC TTTCTGGTAC 500 CATAGTCACT TGTCTACTCA ATATTGCGAT GGTCTTCGGG GCCCGTTCGT 550 TGTATACGAT CCAAAGGATC CTAATAAACG GTTGTACGAC ATTGACAATG 600 GTATGTGCAT CATCATAAAA ATATAATTCA TGCAGCTACT GACCGCGACT 650 GATGCTGCCA GATCATACGG TTATTACCCT GGCAGACTGG TACCACGTTC 700 TCGCACGAAC TGTTGTCGGA GTCGCGTAAG TACAGTCTGA CTTATAGTGG 750 TCTTCTTACT CA I I I IGACA TAGGACACCC GACGCAACCT TGATCAACGG 800 TTTGGGCCGT TCTCCAGACG GGCCAGCAGA TGCTGAGTTG GCTGTCATCA 850 ACGTTAAACG CGGCAAACGG TATGTCATTG AACTCCCGAT TTCTCCATTC 900 ACATTGAAAT GACTGTCTGG TCTAGTTATC GATTCCGTCT GGTCTCCATC 950 TCATGTGACC CTAATTACAT CTTTTCTATC GACAACCATT CTATGACTGT 1000 CATCGAAGTC GATGGTGTCA ACACCCAATC CCTGACCGTC GATTCTATCC 1050 AAATCTTCGC AGGCCAACGC TACTCGTTCG TCGTAAGTCT CTTTGAATGG 1100 TTGGTGCTTT TTCTGTCCAT TCTCTAACCT GTTTAT AC AG CTCCATGCCA 1150 ACCGTCCTGA AAACAACTAT TGGATCAGGG CCAAACCTAA TATCGGTACG 1200 GATACTACCA CAGACAACGG CATGAACTCT GCCATTCTGC G ATACAACGG 1250 CGCACCTGTT GCGGAACCGC AAACTGTTCA ATCTCCCAGT CT CACCCCTT 1300 TGCTCGAACA GAACCTTCGC CCTCTCGTGT ACACTCCTGT GGTATGTTTC 1350 AAAGCGTTGT AATTTG ATTG TG GTCATTCT AACGTTACTG CCTTTGCACA 1400 GCCTGGAAAT CCTACGCCTG GCGGGGCCGA TATTGTCCAT ACTCTTGACT 1450 TGAGTTTTGT GCGGAGTCAA CATTCGTAAA G ATAAGAGTG TTT CT AATTT 1500 CTT CAAT AAT AGGATGCTGG TCGCTTCAGT ATCAACGGTG CCTCGTTCCT 1550 TGATCCTACC GTCCCTGTTC TCCTGCAAAT TCTCAGCGGC ACGCAGAATG 1600 CACAAGATCT ACTCCCTCCT GGAAGTGTGA TTCCTCTCGA ATTAGGCAAG 1650 GTCGTCGAAT TAGTCATACC TGCAGGTGTT GTCGGTGGAC CTCATCCGTT 1700 CCAT CT CCAT GGGGTACGTA ACCCGAACTT ATAACAGTCT TG G ACTT ACC 1750 CGCTGACAAG TGT ATAGCAT AACTTCTGGG TCGTGCGAAG TGCCGGAACC 1800 GACCAGTACA ACTTT AACGA TGCCATTCTC CGAGACGTCG TCAGTATAGG 1850 AGGAACCGAG GATCAAGTCA CCATTCG ATT CGTGGTATAT ACTTCATTCT 1900 TGTGGATGTA TGTGCTCTAG GATACTAACT GGCTTGCGCG TATAGACCGA 1950 TAACCCCGGA CCGTGGTTCC TCCATTGCCA TATCGACTGG CACTTGGAAG 2000 CGGGTCTCGC TATCGTATTT G CAGAG G GAA TT GAAAAT AC TGCTGCGTCT 2050 AAT CCAACCC CCCGTATGCG GTTTCCCACA CATTCTGAAT CTAAGCAGCT 2100 TACTAATATA CATTTGCAGA GGCTTGGGAT GAGCTTTGCC CGAAGTATAA 2150 CGCGCTCAAC GCACAAAAGA AGGTTGCATC TAAGAAAGGC ACTGCCATCT 2200 AATCCTTGTA ACAAACAAGG AGGGTCTCTT GTACI I I I AT TGGGATTTAT 2250 TTCTTGGGGT TT ATT GTT CA ACTTGATTCT ACTATGTTTG GAAGTAGCGA 2300 TTACGAAAGG GGCTTGCGCA TTTATATACC ATCTTTCTTG GCACCACCT G 2350 CAGCTCAATC CTTCAACCAC CTAA 2374 codificador da enzima lacase A2, tendo a seqüência de proteína traduzida apresentada na (SEQ ID No. 4):

MSSKLLALIT VALVLPLGTD AGIGPVTDLR ITNQDIAPDG FTRPA VLAGG 50 TFPGALITGQ KGDSFQINVI DELTDASMLT QTSIHWHGFF QKGSAWADGP 100 AFVTQCPIVT GNSFLYDFDV PDQPGTFWYH SHLSTQYCDG LRGPFWYDP 150 KDPNKRLYDI DNDHTVITLA DWYHVLARTV VGVATPDATL INGLGRSPDG 200 PADAELAVIN VKRGKRYRFR LVSISCDPNY IFSIDNHSMT VIEVDGVNTQ 250 SLTVDSIQIF AGQRYSFVLH ANRPENNYWI RAKPNIGTDT TTDNGMNSAI 300 LRYNGAPVAE PQTVQSPSLT PLLEQNLRPL VYTPVPGNPT PGGADIVHTL 350 DLSFDAGRFS INGASFLDPT VPVLLQILSG TQNAQDLLPP GSVIPLELGK 400 WELVIPAGV VGGPHPFHLH GHNFWWRSA GTDQYNFNDA ILRDWSIGG 450 TEDQVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIE NTAASNPTPQ 500 AWDELCPKYN ALNAQKKLNP STT 523

C. Gene da Lacase B1, Cerrena, da cepa CBS115.075 (SEQ ID

No. 5):

ATGTCTCTTC TTCGTAGCTT GACCTCCCTC ATCGTACTAG TCATTGGTGC 50 ATTTGCTGCA ATCGGTCCAG TCACTGACCT AC ATATAGTG AACCAGAATC 100 TCGACCCAGA TGGTTTCAAC CGCCCCACTG TACTCGCAGG TGGTACTTTC 150 CCCGGTCCTC TGATTCGTGG TAACAAGGTA CGCTTCATAA CCGCCCTCCG 200 TAGACGTAGG CTTCGGCTGA C ATG ACC ATC ATCTGTAGGG AG ATAACTTT 250 AAAATTAATG TG ATTG ACG A CTTGACAGAG CACAGTATGC TCAAGGCTAC 300 GTCCATCGTA AGTCCCTGAT TAACGTTTCA CCTGGTCATA TCGCTCAACG 350 TCTCGAAGCA CTGGCATGGG TTCTTCCAGA AGGGAACCAA CTGGGCCGAT 400 GGCCCCGCCT TTGTCACCCA ATGTCCTATC ACATCAG GAA ACGCCTTCCT 450 GTATGATTTC AACGTTCCGG ACCAAGCTGG TACTTTCTGG TACCACAGCC 500 ATCTCTCTAC ACAGTATTGT GACGGTCTTC GTGGTGCCTT TGTCGTCTAT 550 GATCCTAATG ATCCCAACAA GCAACTCTAT GATGTTGATA ACGGCAAGTT 600 CCTTGCATAT TTCATTTCTA TCATATCCTC ACCTGTATTG GCACAGAAAG 650 CACCGTGATT ACCTTGGCTG ATTG GTATCA TGCCCTTGCT CAGACTGTCA 700 CTGGTGTCGC GTGAGTGACA AATGGCCCTC AATTGTTCAC ATAI I I I CCT 750 G ATTATC ATA TGATAGAGTA TCTGATGCAA CGTTGATCAA CGGATTGGGA 800 CGTTCGGCCA CCGGCCCCGC AAATGCCCCT CTGGCGGTCA TCAGTGTCGA 850 GCGGAATAAG AGGTCAGTTC CATAATTATG ATTATTTCCC GCGTTACTTC 900 CT AACAATT A TTTTTGTATC CCTCCACAGA TATCGTTTCC GATTG GTTTC 950 TATTTCTTGC GACCCTAACT TTAI I I ICTC AATTGACCAC CACCCAATGA 1000 CCGTAATTGA GATG GACG GT GTTAATACCC AATCTATG AC CGTAGATTCG 1050 ATCCAAATAT TCGCAGGTCA ACG ATATTC A TTTGTCGTAG GTTATTATAA 1100 ACTGCCCACC GATCATCTCT CACGTAACTG TTATAGATGC AAGCCAACCA 1150 ACCAGTTGGA AATTATTGG A TCCGCGCTAA ACCTAATGTT GGGAACACAA 1200 CTTTCCTTGG AGGCCTGAAC TCCGCTATAT TACGATATGT GGGAGCCCCT 1250 GACCAAGAAC CGACCACTGA CCAAACACCC AACTCTACAC CGCTCGTTGA 1300 GGCGAACCTA CGACCCCTCG TCTATACTCC TGTGGTATGT TGTTCTCGTT 1350 AC AT AT ACCA AACCTAATAT GAAGACTGAA CGG ATCTACT AGCCGGGACA 1400 GCCATTCCCT GGCGGTGCTG ATATCGTCAA GAACTTAG CT TTGGGTTTCG 1450 TACGTGTATT TCACTTCCCT TTTGGCAGTA ACTG AGGTGG AATGT AT AT A 1500 GAATGCCGGG CGTTTCACAA TCAATGG AGC GTCCCTCACA CCTCCTACAG 1550 TCCCTGTACT ACTCCAGATC CTCAGTGGTA CTCACAATGC ACAGGATCTT 1600 CTCCCAGCAG GAAGCGTGAT CGAACTT GAA C AG AATAAAG TTGTCGAAAT 1650 CG I I I IGCCC GCTGCGGGCG CCGTTGGCGG TCCTCATCCT TTTCACTTAC 1700 ATGGTGTAAG TATCAGACGT CCTCATGCCC ATATTGCTCC GAACCTTACA 1750 CACCTGATTT CAG CACAATT TCTGGGTGGT TCGTAGCGCC GGTCAAACCA 1800 CATACAATTT CAATGATGCT CCTATCCGTG ATGTTGTCAG TATTGGCGGT 1850 GCAAACGATC AAGTCACGAT CCGATTTGTG GTATGTATCT CGTGCCTTGC 1900 ATTCATTCCA CGAGTAATGA TCCTTACACT TCGGGTTCTC AGACCGATAA 1950 CCCTGGCCCA TGGTTCCTTC ACTGTCACAT TGACTGGCAT TTGGAGGCTG 2000 GGTTCGCTGT AGTCTTTGCG GAGGGAATCA ATGGTACTGC AGCTGCTAAT 2050 CCAGTCCCAG GTAAGACTCT CGCTGCTTTG CGTAATATCT ATGAATTTAA 2100 ATCATATCAA TTTGCAGCGG CTTGGAATCA ATTGTGCCCA TTGTATGATG 2150 CCTTGAGCCC AGGTGATACA TGA 2173

codificador da enzima lacase B1, tendo a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID No. 6):

MSLLRSLTSL IVLVIGAFAA IGPVTDLHIV NQNLDPDGFN RPTVLAGGTF 50 PGPLIRGNKG DNFKINVIDD LTEHSMLKAT SIHWHGFFQK GTNWADGPAF 100 VTQCPITSGN AFLYDFNVPD QAGTFWYHSH LSTQYCDGLR GAFWYDPND 150 PNKQLYDVDN GNTVITLADW YHALAQTVTG VAVSDATLIN GLGRSATGPA 200 NAPLAVISVE RNKRYRFRLV SISCDPNFIF SIDHHPMTVI EMDGVNTQSM 250 TVDSIQIFAG QRYSFVMQAN QPVGNYWIRA KPNVGNTTFL GGLNSAILRY 300 VGAPDQEPTT DQTPNSTPLV EANLRPLVYT PVPGQPFPGG ADIVKNLALG 350 FNAGRFTING ASLTPPTVPV LLQILSGTHN AQDLLPAGSV IELEQNKWE 400 IVLPAAGAVG GPHPFHLHGH NFWWRSAGQ TTYNFNDAPI RDWSIGGAN 450 DQVTIRFVTD NPGPWFLHCH IDWHLEAGFA WFAEGINGT AAANPVPAAW 500 NQLCPLYDAL SPGDT 515

D. Gene da Lacase B2, Cerrena, da cepa CBS154.29 (SEQ ID

No. 7):

CACCGCGATG TCTCTTCTTC GTAGCTTGAC CTCCCTCATC GTACTAGCCA 50 CTGGTGCATT TGCTGCAATC GGTCCAGTCA CCGACCTACA TATAGTGAAC 100 CAGAATCTCG CCCCAGATGG TTTAAACCGC CCCACTGTAC TCGCAGGTGG 150 TACTTTCCCC GGTCCTCTGA TTCGTGGTAA CAAGGTACGC TTCATAACCG 200 CCCTCCGTAG ACGTAGGCTT CGGCTGACAT GACCATCATC TGTAGGGAGA 250 TAACTTTAAA ATTAATGTGA TTGACGACTT GACAGAACAC AGTATGCTCA 300 AGGCTACGTC CATTGTAAGT CCCTGATTAA CGTTTCACCT GGTCATATCG 350 CTCAACGTCT CGAAGCACTG GCATGGGTTC TTCCAGAAGG GAACCAACTG 400 GGCCGATGGC CCCGCCTTTG TCACCCAATG TCCTATCACA TCAGGAAACG 450 CCTTCTTGTA TGATTTCAAC GTTCCGGACC AAGCTGGTAC TTTCTGGTAC 500 CACAGCCATC TCTCYACACA GTATTGTGAC GGTCTTCGTG GTGCCTTTGT 550 CGTCTATGAT CCTAATGATC CCAACAAGCA ACTCTATGAT GTTGATAACG 600 GCAAGTCCCT TGCATATTTC AGTTCTATCA TATCCTCACC TGTATTGGCA 650 CAGAAAGCAC CGTGATTACC TTGGCTGATT GGTATCATGC CCTTGCTCAG 700 ACTGTCACTG GTGTCGCGTG AGTGACAAAT GGCCCTTAAT TGTTCACATA 750 TTTTCCTGAT TATCATATGA TAGAGTATCT GATGCAACGT TGATCAACGG 800 ATTGGGACGT TCGGCCACCG GCCCCGCAAA TGCCCCTCTG GCGGTCATCA 850 GTGTCGAGCG GAATAAGAGG TCAGTTCCAT AATTATGATT ATTTCCCGCG 900 TTACTTCCTA ACGATTATTT TTGTATCCCT CCACAGATAT CGTTTCCGAT 950 TGGTTTCTAT TTCTTGCGAC CCTAACTTTA TTTTCTCAAT TGACCACCAC 1000 CCAATGACCG TAATTG AG AT GGACGGTGTT AATACCCAAT CTATG ACCGT 1050 AGATTCGATC CAAATATTCG CAGGTCAACG ATATTCATTT GTCGTAGGTT 1100 ATTATAAACT GCCCACCGAT CATCTCTCAC GTAACTGTTA TAGATGCAAG 1150 CCAACCAACC AGTTGGAAAT TATTGGATCC GYGCTAAACC TAATGTTGGG 1200 AACACAACTT TCCTTGGAGG CCTGAACTCC G CT AT ATT AC GATATGTGGG 1250 AGCCCCTGAC CAAGAACCGA CCACTGACCA AACACCCAAC TCTACACCGC 1300 TCGTCGAGGC GAACCTACGT CCCCTCGTCT ATACTCCTGT GGTATGTTGT 1350 TCTCGTTACA TATACCAAAC CTAATATGAG GACTGAACGG ATCTACTAGC 1400 CGGGACAGCC ATTCCCTGGC GGTGCTGATA TCGTCAAGAA CTTAGCTTTG 1450 GGTTTCGTAC GTGTATTTCA CTTCCCTTTT GGCAGTAACT GAGGTGGAAT 1500 GT AT AT AGAA TGCCGGGCGT TTCACAATCA ATG G AAC ATC CTTCACACCT 1550 CCTACAGTCC CTGTACTACT CCAGATCCTC AGTGGTACTC ACAATGCACA 1600 GGATCTTCTT CCAGCAGGAA GCGTGATCGA ACTTGAACAG AATAAAGTTG 1650 TCGAAATCGT TCTGCCCGCT GCGGGCGCCG TTGGCGGTCC TCATCCTTTC 1700 CACTTACATG GTGTAAGTAT CAGACGTCCT CATGCCTATA TTGCTCCGAA 1750 CCTTACACAC CTGATTTCAG CACAATTTCT GGGTGGTTCG TAGCGCCGGT 1800 CAAACCACAT ACAATTTCAA TGATGCTCCT ATCCGTGATG TTGTCAGTAT 1850 TGGCGGTGCA AACGATCAAG TCACGATCCG ATTTGTGGTA TGTATCTCGT 1900 GCCTTGCATT CATTCCACGA GTAATGATCC TTACACTTCG GGTTCTCAGA 1950 CCGATAACCC TGGCCCATGG TTCCTTCACT GTCACATTGA CTGGCATTTG 2000 GAGGCTGGGT TCGCTGTAGT CTTTGCGGAG GGAATCAATG GCACTGCAGC 2050 TGCTAATCCA GTCCCAGGTA AGACTCTCGC TGCTTTGCGT AATATCTATG 2100 AATTT AAAGC ATATCAATTT GCAGCGGCTT G G AATC AATT GTGCCCGTTG 2150 TATGATGCCT TGAGCCCAGG TGATACATGA TTACTCGTAG CTGTGCTTTC 2200 TTATACATAT TCTATGGGTA TATCGGAGTA GCTGTACTAT AGTATGTACT 2250 ATACTAG GTG GGATATGYTG ATGTTGATTT AT AT AATTTT GTTTGAAGAG 2300 TG ACTTTATC GACTTGGGAT TTAGCCGAGT ACATACTGAT CTCTCACTAC 2350 AGGCTTGTTT TGTCTTTGGG CGCTTACTCA ACAGTTGACT GTTTTTGCTA 2400 TTACGCATTG AACCGCATTC CGGTCYGACT CGTGTCCTCT ACTGTGACTT 2450 GTATTGGCAT TCTAGCACAT ATGTCTCTTA CCTATAGG AA CAATATGTCT 2500 CAACACTGTT CCAAAACCTG CGTAAACCAA ATATCGTCCA TCAGATCAGA 2550 TCATTAAC AG TGCCGCACTA ACCTAATACA CTGGCARGGA CTGTGGAAAT 2600 CCCTATAAAT GACCTCTAGA CCGTGAGGTC ATTGCAAGGT CGCTCTCCTT 2650 GTCAAGATGA CCC 2663 codificador da enzima lacase B2, tendo a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID No. 8):

MSLLRSLTSL IVLATGAFAA IGPVTDLHIV NQNLAPDGLN RPTVLAGGTF 50 PGPLIRGNKG DNFKINVIDD LTEHSMLKAT SIHWHGFFQK GTNWADGPAF 100 VTQCPITSGN AFLYDFNVPD QAGTFWYHSH LSTQYCDGLR GAFWYDPND 150 PNKQLYDVDN GNTVITLADW YHALAQTVTG VAVSDATLIN GLGRSATGPA 200 NAPLAVISVE RNKRYRFRLV SISCDPNFIF SIDHHPMTVI EMDGVNTQSM 250 TVDSIQIFAG QRYSFVMQAN QPVGNYWIRA KPNVGNTTFL GGLNSAILRY 300 VGAPDQEPTT DQTPNSTPLV EANLRPLVYT PVPGQPFPGG ADIVKNLALG 350 FNAGRFTING TSFTPPTVPV LLQILSGTHN AQDLLPAGSV IELEQNKWE 400 IVLPAAGAVG GPHPFHLHGH NFWWRSAGQ TTYNFNDAPI RDWSIGGAN 450 DQVTIRFVTD NPGPWFLHCH IDWHLEAGFA WFAEGINGT AAANPVPAAW 500 NQLCPLYDAL SPGDT 515

E. Gene da Lacase B3, Cerrena (parcial), da cepa ATCC20013 (SEQ ID No. 9):

GTGGGGGCGG ATCCCTAACT GTTTCGAATC GGCACCGAAG TATGCAGGTG 50 TGACGGAGAT GAGGCGTTTT TTCATCTTCC ACTGCAGTAT AAAATGTCTC 100 AGGTAACGTC CAGCTTTlTG TACCAGAGCT ACCTCCAAAT ACCTTTACTC 150 GCAAAGGTTT CGCGATGTCT CTTCTTCGTA GCTTGACCTC CCTCATCGTA 200 CTAGCCACTG GTGCATTTGC TGCAATCGGT CCAGTCACTG ACCTACATAT 250 AGTGAACCAG AATCTCGCCC CAGATGGTTT CAACCGCCCC ACTGTACTCG 300 CAG GTG GTAC TTTCCCCGGT CCTCTGATTC GTGGTAACAA GGTACGCTTC 350 ATAACCGCCC TCCGTAGACG TAGGCTTCGG CTGACATGAC CATCATCTGT 400 AGGGAGATAA CTTTAAAATT AATGTGATTG ACGACTTGAC AGAACACAGT 450 ATGCTCAAGG CCACGTCCAT TGTAAGTCCC TG ATTAACGT TTCACCTG GT 500 CATATCGCTC AACGTCTCGA AGCACTGGCA TGGGTTCTTC CAGAAG G GAA 550 CCAACTGGGC CGATGGCCCC GCCTTTGTCA CCCAATGTCC TATCACATCA 600 GGAAACTCCT TCCTGTATGA TTT CAACGTT CCGGACCAAG CTGGTACTTT 650 CTGGTACCAC AGCCATCTCT CTACACAGTA TTGTGACGGT CTTCGTGGTG 700 CCTTTGTCGT CTATGATCCT AATGATCCCA ACAAGCAACT CTATGATGTT 750 GATAACGGCA AGTCCCTTGC ATATTTCATT TCTATCATAT CCTCACCTGT 800 ATTGGCACAG AAAGCACCGT G ATTACCTTG G CTGATTG GT ATCATGCCCT 850 TGCTCAGACT GTCACTGGTG TCGCGTGAGT GACAAATGGC CCTCAATTGT 900 TC ACATATTT TCCTG ATTAT CATATGATAG AGTATCTGAT GCAACGTTGA 950 TCAACGGATT GGGACGTTCG GCCACCGGCC CCGCAAATGC CCCTCTGGCG 1000 GTCATCAGTG TCGAGCGGAA TAAGAGGTCA GTTCCATAAT TATGATTATT 1050 TCCCGCGTTA CTTCCTAACA ATTATTCTTG TATCCCTCCA CAG ATATCGC 1100 TTCCG ATTGG TGTCTATTTC TTGCGACCCT AACTTT ATTT TCTCAATTGA 1150 TCACCACCCA ATGACCGTAA TTGAGATGGA CGGTGTTAAT ACCCAATCTA 1200 TGACCGTAGA TTCGATCCAA ATATTCG CAG GTCAACGATA TTCATTTGTC 1250 GTAG GTTATT ATAAACTGCC CACCGATCAT CTCTCACGTA ACTGTTATAG 1300 ATGCAAGCCA ACCAACCRGT TGG AAATTAT TGGATCC 1337 codificador da enzima lacase B3, tendo a seqüência parcial de proteína tra¬ duzida (SEQ ID No. 10): MSLLRSLTSL IVLATG AFAA IGPVTDLHIV NQNLAPDGFN RPTVLAGGTF 50 PGPLIRGNKG DNFKINVIDD LTEHSMLKAT SIHWHGFFQK GTNW ADGPAF 100 VTQCPITSGN SFLYDFNVPD QAGTFWYHSH LSTQYCDGLR GAFWYDPND 150 PNKQLYDVDN GKTVITLADW YHALAQTVTG VAVSDATLIN GLGRSATGPA 200 NAPLAVISVE RNKRYRFRLV SISCDPNFIF SIDHHPMTVI EMDGVNTQSM 250

TVDSIQIFAG QRYSFVMQAN QPVGNYWI 278

F. Gene da lacase C1 Cerrena (parcial), da cepa CBS154.29 (SEQ ID No. 11): TGCAATCGGA CCGGTBGCTG ACCTTCACAT TACGGACGAT ACC ATTGCCC 50 CCG ATGGTTT CTCTCGTCCT GCTGTTCTCG CTGGCGGGGG TTTCCCTGGC 100 CCTCTCATCA CCGGAAACAA GGTAATGCCT AATGGTTGCG TCTTTGTTGG 150 TGCTCTCATT CAT CCACGAC Allll GTACC AGGGCGACGC : CTTTAAACTC 200 AATGTCATCG ATGAACTAAC GGACGCATCC ATGCTGAAGY CGACTTCCAT 250 CGTAAGTCTC GCTGTATTGC TCCTTGAGCC ATTTCATTGA CTATAACTAC 300 AACCAGCACT GGCATGG ATT CTT CCAAAAG GGTACTAATT GGGCAGATGG 350 TCCCGCI I I I GTGAACCAAT GCCCCATCAC CACGGGAAAC TCCTTCTTGT 400 ACGACTTCCA GGTTCCTGAT CAAGCTGGTA AGCATGAGAT TACACTAGGA 450 AAG I I IAATT TAATAACTAT TCAATCAGGA ACCTACTGGT ATCATAGTCA 500 TTTGTCTACG CAATACTGTG ATGGTCTCAG AG GTG CATTC GTTGTCTACG 550 ACCCTTCAGA TCCTCACAAG GATCTCTACG ACGTCGACGA CGGTGAGCTT 600 TGCTTT1 I TC ATTGGT ATCC ATTATCGCTC ACGTGTCATT ACT GCGCCAC 650 AGAAAGTACC GTCATCACTT TGGCTGATTG GTATCATACT TTGGCTCGTC 700 AGATTGTTGG CGTTGCGTGA GTAGTCTTGT ACCGACTGAA ACATATTCCA 750 GTTGCTGACT TCCCCACAGC ATTTCTGATA CTACCTTGAT AAACGGTTTG 800 GGCCGCAATA CCAATGGTCC GGCTGATGCT GCTCTTGCTG TGATCAATGT 850 TGACGCTGGC AAACGGTGTG TCCAG ATTAC TATACTCCCC ATGACGTCTC 900 AATGCTGATG TGTACTACTT CCAGGTACCG TTTCCGTCTT GTTTCCATAT 950 CCTGTGACCC CAATTGGGTA TTCTCGATTG ACAACCATGA CTTTACG GTC 1000 ATTGAAGTCG ATGGTGTTAA CAGTCAACCT CTCAACGTCG ATTCTGTTCA 1050 GATCTTCGCC GGACAACGTT ACTCGTTCGT 1080 codificador da enzima lacase C, tendo a seqüência parcial de proteína tradu¬ zida (SEQ ID No. 12): AIGPVADLHI TDDTIAPDGF SRPAVLAGGG FPGPLITGNK GDAFKLNVID 50 ELTDASMLKX TSIHWHGFFQ KGTNWADGPA FVNQCPITTG NSFLYDFQVP 100 DQAGTYWYHS HLSTQYCDGL RGAFWYDPS DPHKDLYDVD DESTVITLAD 150 WYHTLARQIV GVAISDTTLI NGLGRNTNGP AD AAL AVINV DAGKRYRFRL 200 VSISCDPNWV FSIDNHDFTV IEVDGVNSQP LNVDSVQIFA GQRYSF 246 G . Gene da Lacase D1, Cerrena, da cepa CBS154.29 (SEQ ID No. 13): GATTCTAATA GACCAGGCAT ACCAAGAGAT CTACAGGTTG ACAGACCATT 50 CTTCTAGGCG GCATTTATGC TGTAGCGTCA GAAATTATCT CTCC ATTTGT 100 ATCCCACAGG TCCTGTAATA ACACGGAGAC AGTCCAAACT GGG ATGCCTT 150 I I I I CTCAAC TATGGGCGCA CATAGTCTGG ACGATGGTAT ATAAGACGAT 200 GGTATGAGAC CCATGAAGTC AGAACACTTT TGCTCTCTGA CATTTCATGG 250 TTCACACTCT CGAGATGGGA TTGAACTCGG CTATTACATC GCTTGCTATC 300 TTAGCTCTGT CAGTCGGAAG CTATGCTGCA ATTGGGCCCG TGGCCGACAT 350 ACACATTGTC AACAAAGACC TTGCTCCAGA TG G CGTACAA CGT CCAACCG 400 TGCTTGCCGG AGGCACTTTT CCTGGGACGT TG ATCACCGG TCAGAAAGTA 450 AGGG ATATTA GTTTGCGTCA AAGAGCCAAC CAAAACTAAC CGTCCCGTAC 500 TATAGGGTGA CAACTTCCAG CTCAATGTCA TCGATGATCT TACCGACGAT 550 CGGATGTTGA CGCCAACTTC CATTGTGAGC CT ATTATTGT ATG ATTTATC 600 CGAATAGTTT CGCAGTCTGA TCATTG GATC TCTATCGCTA GCATTGGCAC 650 GGTTTCTTCC AGAAGGGAAC CGCTTGGGCC GACGGTCCCG CCTTCGTAAC 700 TCAGTGCCCT ATAATAG CAG ATAACTCTTT TCTGTATGAC TTCGACGTCC 750 CAGACCAAGC TGGTACTTTC TGGTATCATA GTCATCTATC CACTCAGTAC 800 TGTGACGGTT TACGTGGTGC CTTCGTTGTG TACGATCCTA ACGATCCTCA 850 CAAAGACCTA TACGATGTTG ATGACGGTGG GTTCCAAATA TTTGTTCTGC 900 AGACATTGTA TTGACGGTGT TCATTATAAT TTCAGAGAGC ACCGTGATTA 950 CCCTTGCGGA TTGGT ACCAT GTT CT CGCCC AGACCGTTGT CGGCGCTGCG 1000 TGAGTAACAC ATACACGCGC TCCGGCACAC TGATACTAAT TTTTTTTTAT 1050 TGTAGCACTC CTGATTCTAC CTTGATCAAC GGGTTAGGCC GTTCACAGAC 1100 CGGACCCGCT GATGCTGAGC TGGCTGTTAT CAGCGTTGAA C ATAACAAAC 1150 GGTATGTCAT CTCTACCCAG TATCTTCTCT CCTGCTCTAA TTCGCTGTTT 1200 CACCATAGAT ACCGTTTCCG TTTGGTTTCG ATTTCGTGCG ACCCCAACTT 1250 TACCTTCTCC GTTGATGGTC ATAATATGAC TGTCATCGAA GTCGATGGTG 1300 TCAACACACG ACCCCTGACC GTTGACTCTA TT CAAAT CTT CGCCGGACAG 1350 AG GT ATTCCT TTGTCGTAAG TTAATCGATA TATTCTCCTT ATTACCCCTG 1400 TGT AATTG AT GTCAATAGCT CAATGCTAAC CAACCCGAAG ACAATTACTG 1450 GATCCGTGCT ATGCCAAACA TCGGTAGAAA TACAACAACA CTGGACGGAA 1500 AGAATGCCGC TATCCTTCGA TACAAGAATG CTTCTGTAGA AGAGCCCAAG 1550 ACCGTTGGGG GCCCCGCTCA ATCCCCGTTG AATGAAGCGG ACCTGCGTCC 1600 ACTCGTACCT GCTCCTGTGG TATGTCTTGT CGCGCTGTTC CATCGCTATT 1650 TCATATTAAC GTTTTGTTTT TGTCAAGCCT GGAAACGCTG TTCCAGGTGG 1700 CGCAGACATC AATCACAGGC TTAACTTAAC TTTCGTACGT ACACCTGGTT 1750 GAAACATTAT ATTTCCAGTC TAACCTCTCT TGTAGAGTAA CGGCCTCTTC 1800 AGCATCAACA ACGCCTCCTT CACTaATCCT TCGGTCCCCG CCTTATTACA 1850 AATTCTG AGC GGTGCTCAGA ACGCTCAAGA TTTACTTCCA ACGGGTAGTT 1900 ACATTGGCCT TGAACTAGGC AAGGTTGTGG AG CTCGTTAT ACCTCCTCTG 1950 GCAGTTGGAG GACCGCACCC TTTCCATCTT CATGGCGTAA GCATACCACA 2000 CTCCCGCAGC CAGAATGACG CAAACTAATC ATGATATGCA GCACAATTTC 2050 TGGGTCGTCC GTAGTGCAGG TAGCGATGAG TATAACI I IG ACGATGCTAT 2100 CCTCAGGGAC GTCGTRAGCA TTGGAGCGGG GACTGATGAA GTCACAATCC 2150 GTTTCGTGGT ATGTCTCACC CCTCGCATTT TGAGACGCAA GAGCTGATAT 2200 ATTTT AACAT AGACCGACAA TCCGGGCCCG TGGTTCCTCC ATTGCCATAT 2250 TGATTGGCAT TTGGAGGCAG GCCTTGCCAT CGTCTTCGCT GAGGGCATCA 2300 ATCAGACCGC TGCAGCCAAC CCAACACCCC GTACGTGACA CTGAGGGTTT 2350 CTTTATAGTG CTGG ATTACT GAATCGAGAT TTCTCCACAG AAGCATGGGA 2400 TGAGCTTTGC CCCAAATATA ACGGGTTGAG TGCGAGCCAG AAGGTCAAGC 2450 CTAAG AAAGG AACTGCTATT TAAACGTGGT CCTAGACTAC GGGCATAT AA 2500 GTATTCGGGT AGCGCGTGTG AGCAATGTTC CGATACACGT AGATTCATCA 2550 CCGGACACGC TGGG ACAATT TGTGTATAAT GGCTAGTAAC GTATCTG AGT 2600 TCTGGTGTGT AGTTCAAAGA GACAGCCCTT CCTGAGACAG CCCTTCCTGA 2650 GACAGCCCTT CCTGAGACGT GACCTCCGTA GTCTGCACAC G AT ACTYCTA 2700 AATACGTATG GCAAGATGAC AAAGAGGAGG ATGTGAGTTA CTACGAACAG 2750 AAATAGTGCC CGGCCTCGGA GAGATGTTCT TG AATATGGG ACTGGGACCA 2800 ACATCCGGA 2809 codificador da enzima lacase D1, tendo a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID No. 14):

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50

TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100

AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFWYDP 150

NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200

PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VlEVDGVNTR 250

PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPEDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300 LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350

NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400

WELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWWRSA GSDEYNFDDA ILRDWSIGA 450

GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500

AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526

H. Gene da Lacase D2, Cerrena, da cepa CBS115.075 (SEQ ID

No. 15):

GATCTGGACG ATGGTATATA AGACGATGGT ATGAGACCCA TGAAGTCTGA 50 ACACI I I I GC TCTCTGACAT TTCATGGTTC ATACTCTCGA GATGGGATTG 100 AACTCGGCTA TTACATCGCT TGCTATCTTA GCTCTGTCAG TCGGAAGCTA 150 TGCTGCAATT GGGCCCGTGG CCGACATACA CATTGTCAAC AAAGACCTTG 200 CTCCAGATGG TGTACAACGT CCAACCGT GC TCGCCGGAGG CACTTTTCCT 250 GGGACGTTGA TCACCGGTCA GAAAGTAAGG AAT ATT AG TT TGCGTCAAAG 300 AGCCAACCAA AATT AACCGT CCCGT CCCAT AGGGTGACAA CTTCCAGCTC 350 AATGTCATTG ATGATCTTAC CGACGATCGG ATGTTGACAC CAACTTCCAT 400 TGTGAGCCTA TTATTGTATG ATTTATCCGT ATAGTTTCTC AGTCTGATCA 450 TTGGCTCTCT ATCGCTAGCA TTGGCACGGT TTCTTCCAGA AGGGAACCGC 500 TTGGGCCGAC GGTCCCGCCT TCGTAACTCA GTGCCCTATA ATAGCAGATA 550 ACTCIl I I CT GTATGACTTC GACGT CCCCG ACCAAGCTGG TACTTTCTGG 600 TATCATAGTC ATCTATCCAC TCAGTACTGT GACGGTTTAC GTGGTGCCTT 650 CGTTGTGTAC GATCCTAACG ATCCTCACAA AGACCTATAC GATGTTGATG 700 ACGGTGGGTT CCAAATACTT GACCAAGAAA CATTATATTG ATAGTATCCA 750 CTCTGAI I I I CAGAGAGCAC CGTGATTACC CTTGCGG ATT GGTACCATGT 800 TCTCGCCCAG ACCGTTGTCG GCGCTGCGTG AGTAACACAT ACACGCGCTC 850 CGGCACACTG ATACTAATTT TTT ATTGT AG CACTCCTGAT TCTACCTTGA 900 TCAACGGGTT AGGCCGTTCA CAGACCGGAC CCGCTGATGC TGAGCTGGCT 950 GTTATCAGCG TTGAACATAA CAAACG GTAT GTCATCTCTA CCCATTATCT 1000 TCTCTCCTGC TTTAATTCGC TGTTTCACCA TAGATACCGA TTCCGTTTGG 1050 TTTCG ATTTC GTGCGACCCC AACTTTACCT TCTCCGTTGA TGGTC ATAAT 1100 ATGACTGTCA TCGAAGTCGA CGGTGTCAAC ACACGACCCC TGACCGTTGA 1150 CTCTATTCAA ATCTTCGCCG GACAGAGGTA TTCCTTTGTC GTAAGTTAAT 1200 CG ATATATTC TCCCTATTAC CCCTGTGTAA TTGATGTCAA CAGCTCAATG 1250 CTAACCAACC CGACGACAAT TACTGGATCC GTGCTATGCC AAACATCGGT 1300 AGAAATACAA CAACACTGGA CGGAAAGAAT GCCGCTATCC TTCGATACAA 1350 GAATGCTTCT GTAGAAGAGC CCAAGACCGT TGGGGGCCCC GCTCAATCCC 1400 CGTTGAATGA AGCGGACCTG CGTCCACTCG TACCTGCTCC TGTGGTATGT 1450 CTTGTCGTGC TGTTCCATCG CTATTTCATA TTAACGTTTT GTTTTTGTCA 1500 AGCCTGGAAA CGCTGTTCCA GGTGGCGCAG ACATCAATCA CAG G CTTAAC 1550 TTAACTTTCG TACGTACACC TGGTTGAAAC ATTATATTTC CAGTCTAACC 1600 TCTTGTAGAG TAACGGCCTT TTCAGCATCA ACAACGCCTC CTTCACTAAT 1650 CCTTCGGTCC CCGCCTTATT ACAAATTCTG AGCGGTGCTC AGAACGCTCA 1700 AGAI I IACTT CCAACGGGTA GTTACATTGG CCTTGAACTA GGCAAGGTTG 1750 TGGAGCTCGT TATACCTCCT CTGGCAGTTG GAGGACCGCA CCCTTTCCAT 1800 CTTCATGGCG TAAGCATACC ACACTCCCGC AGCCAGAATG ACGCAAACTA 1850 ATCATGATAT GCAGCACAAT TTCTGGGTCG TCCGTAGTGC AGGTAGCGAT 1900 GAGTATAACT TTGACGATGC TATCCTCAGG GACGTCGTGA GCATTGGAGC 1950 GGGGACTGAT GAAGTCACAA TCCGTTTCGT GGTATGTCTC ACCCCTCGCA 2000 I I IlGAGACG CAAGAGCTGA TATATTTTAA C ATAGACCGA CAATCCGGGC 2050 CCGTGGTTCC TCCATTGCCA TATTGATTGG CATTTGGAGG CAGGCCTTGC 2100 CATCGTCTTC GCTGAGGGCA TCAATCAGAC CGCTGCAGCC AACCCAACAC 2150 CCCGTACGTG ACACTGAGGG TTT CTTT AT A GTGCTGGATT ACTGAATCGA 2200 GATTTCTCCA CAGAAGCATG GGATGAGCTT TGCCCCAAAT ATAACGGGTT 2250 GAGTGCGAGC CAGAAGGTCA AGCCTAAGAA AGGAACTGCT ATTTAAACG 2299 codificador da enzima lacase D2, tendo a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID No. 16)

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50 TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100 AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFWYDP 150 NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200 PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VlEVDGVNTR 250 PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPDDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300 LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350 NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400 WELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWWRSA GSDEYNFDDA ILRDWSIGA 450 GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500 AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526

I. Gene da lacase E, Cerrena (parcial), da cepa CBS154.29 (SEQ ID No. 17):

TGCAATCGGA CCGGTGGCCG ACCTCAAGAT CGTAAACCGA GACATTGCAC 50 CTGACGGTTT TATTCGTCCC GCCGTTCTCG CTGGAGGGTC GTTCCCTGGT 100 CCTCTCATTA CAGGGCAGAA AGTACGTTAC GCTATCTCGG TGCTTTGGCT 150 TAATTAAACT ATTTGACTTT GTGTTCTCTT AGGGGAACGA GTTCAAAATC 200 AATGTAGTCA ATCAACTGAC CGATGGTTCT ATGTTAAAAT CCACCTCAAT 250 CGTAAGCAGA ATGAGCCCTT TGCATCTCGT TTTATTGTTA ATGCGCCCAC 300 TATAGCATTG GCATGGATTC TTCCAGAAGG GAACAAACTG GGCAGACGGT 350 CCTGCGTTCG TGAACCAATG TCCAATCGCC ACGAACAATT CGTTCTTGTA 400 TCAGTTTACC TCACAGGAAC AGCCAGGTGA GTATGAGATG GAGTTCATCC 450 GAGCATGAAC TGATTTATTT GGAACCTAGG CACATTTTGG TACCATAGTC 500 ATCTTTCCAC ACAATACTGC GATGGTTTGC GAGGGCCACT CGTGGTGTAT 550 GACCCACAAG ACCCGCATGC TGTTCTCTAC GACGTCGACG ATGGTTCGTA 600 CTTCGCATAT CCACGCTCGC TTTCATACAA TGTAAACTTT GTTCCTCCAG 650 AAAGTACAAT CATCACGCTC GCGGATTGGT ATCATACCTT GGCTCGGCAA 700 GTGAAAGGCC CAGCGTAAGG CACTTTAGTG TTTCCTCATA GTCCAAGAAA 750 TTCTAACACG CCTTCTTCAT CAGGGTTCCT GGTACGACCT TGATCAACGG 800 GTTGGGGCGT CACAACAATG GTCCTCTAGA TGCTGAACTA GCGGTGATCA 850 GTGTTCAAGC CGGCAAACGG CAAGTTCAAT TCACACTTTT CACTCTGTAC 900 CTTCTTCCTG ACATTCTTTT CTTGTAGTTA CCGCTTCCGC CTGATTTCAA 950 TTTCATGCGA TCCCAACTAC GTATTCTCCA TTGATGGCCA TGATATGACT 1000 GTCATCGAAG TGGATAGTGT TAACAGTCAA CCTCTCAAGG TAGATTCTAT 1050 CCAAATATTT GCAGGTCAGA GATATTCGTT CGTGGTGAGT CAGATCAGGG 1100 CATATCCTTT TGTCGATACG TCATTGACCA TATAATGCTA CAAGCTGAAT 1150 GCCAACCAAC CAG 1163

codificador da enzima lacase E, tendo a seqüência parcial de proteína tradu- zida (SEQ ID No. 18):

AIGPVADLKI VNRDIAPDGF IRPAVLAGGS FPGPLITGQK GNEFKINWN 50 QLTDGSMLKS TSIHWHGFFQ KGTNWADGPA FVNQCPIATN NSFLYQFTSQ 100 EQPGTFWYHS HLSTQYCDGL RGPLWYDPQ DPHAVLYDVD DESTIITLAD 150 WYHTLARQVK GPAVPGTTLI NGLGRHNNGP LDAELAVISV QAGKRQVQFT 200 LFTLYRFRLI SISCDPNYVF SIDGHDMTVI EVDSVNSQPL KVDSIQIFAG 250 QRYSFVLNAN QP 262

O termo "% de identidade" aqui presente se refere ao nível de identidade de ácido nucleico ou da seqüência de aminoácido entre a se- qüência de ácido nucleico que codifica uma lacase aqui descrita ou a se- qüência da lacase de aminoácido, quando alinhada, usando um programa de 5 alinhamento de seqüência.

Por exemplo, conforme aqui usado, 80% de identidade da se- qüência é determinado por um algoritmo e, do mesmo modo, um homólogo de uma determinada seqüência tem acima de 80% de identidade de se- qüência sobre uma extensão de uma determinada seqüência. Exemplos de 10 níveis de identidade de seqüência incluem, sem que seja a isso limitado, 80, 85, 90, 95, 98% ou mais de identidade de seqüência para uma determinada seqüência, por exemplo, a seqüência de codificação para uma lacase, con- forme aqui descrito.

Exemplos de programas de computador que podem ser usados 15 para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, sem que seja a isso limitado, o conjunto de programas BLAST, por exemplo, BLASTN, BLASTX, e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, publicamente disponível na Internet no site www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Ver também, Altschul, et al, 1990 e Altschul, et al, 1997.

Pesquisas de seqüência são tipicamente realizadas usando o

programa BLASTN, ao avaliar uma determinada seqüência de ácido nucleico relativa às seqüências de ácido nucleico nas Seqüências GenBank DNA e outros bancos de dados públicos. O programa BLASTX é preferido para pesquisas de seqüências de ácido nucleico que foram traduzidas em todos 25 os esquemas de leitura contra seqüências de aminoácido nas Seqüências de Proteína do GenBank e outros bancos de dados públicos. Ambos os pro- gramas BLASTN e BLASTX são rodados usando parâmetros de falha de uma penalidade de afastamento aberto de 11.0, e uma penalidade de afas- tamento extendido de 1.0, e usam a matriz BLOSUM-62. (Ver, por exemplo, Altschul, etal, 1997).

Um alinhamento de seqüências selecionado de maneira a de- terminar o "% de identidade" entre duas ou mais seqüências, pode ser reali- 5 zado usando, por exemplo, o programa CLUSTAL-W em MacVector versão 6.5, operado com parâmetros de falha, incluindo uma penalidade de afasta- mento aberto de 10,0, uma penalidade de afastamento extendido de 0,1, e uma matriz de similaridade BLOSUM 30.

II. Mediadores

Em uma modalidade, o sistema de oxidação enzimática compre-

ende ainda um ou mais agentes mediadores químicos, os quais melhoram a atividade da enzima de lacase. O termo "mediador químico" (ou "mediador") pode ser usado aqui de modo intercambiável, sendo definido como um com- posto químico que atua como um mediador redox para lançar eficazmente 15 elétrons entre a enzima que exibe atividade de oxidase e o corante. Os me- diadores químicos também são conhecidos na técnica como intensificadores e aceleradores.

O mediador químico pode ser um composto fenólico, por exem- plo, siringato de metila, e compostos correlacionados, conforme descrito no documento de patente WO 95/01426 e WO 96/12845. O mediador químico também pode ser um composto de N-hidróxi, um composto de N-oxima ou um composto de N-óxido, por exemplo, N-hidroxibenzotriazol, ácido violúrico ou N-hidroxiacetanilida. O mediador químico também pode ser um composto de fenoxazina/fenotiazina, por exemplo, propionato de fenotiazina-10. O me- diador químico também pode ser um ácido 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolina -6-sulfônico) (ABTS). Outros mediadores químicos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os compostos divulgados no documento de patente WO 95/01426 são conhecidos por intensificar a atividade de uma lacase. Em uma modalidade particular, o mediador pode ser acetossringona, siringato de metila, siringato de etila, siringato de propila, siringato de butila, siringato de hexila, ou siringato de octila.

Preferivelmente, o mediador é 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, 4-car- boxamido-2,6-dimetoxifenol ou um derivado N-substituído dos mesmos, tal como, por exemplo, 4-(N-metil-carboxamido)-2,6-dimetoxifenol, 4-[N-(2-hidroxi- etil) carboxamido]-2,6-dimetoxifenol ou 4-(N,N-dimetilcarboxamido)-2,6-dime- toxifenol.

O mediador usado na presente invenção pode ser descrito pela seguinte fórmula:

em cuja fórmula, A é um grupo, tal como, -R, -D, -CH=CH-D, -CH=CH- CH=CH-D, -CH=N-D, -N=N-D, ou -N=CH-D, em que D é selecionado do 10 grupo constituído de -CO-E, -SO2-E, - CN, -NXY, e -N+XYZ1 onde E pode ser -H, -OH1-R1-OR1 ou -NXY, e X, Y e Z podem ser idênticos ou diferentes e selecionados dentre -H, -OH, -OR' e -R; R sendo C-|.Ci6-alquila, preferivel- mente C-i-C8-alquila, cuja alquila pode ser saturada ou insaturada, ramificada ou não-ramificada e opcionalmente substituída por um grupo carbóxi, sulfo 15 ou amino; e B e C podem ser idênticos ou diferentes e selecionados dentre Cm H2m+1; 1 < m < 5.

Em uma modalidade, A na fórmula acima mencionada é -CN ou -CO-E, onde E pode ser -H, -OH, -R, -OR, ou -NXY, onde XeY podem ser idênticos ou diferentes e selecionados dentre -H, -OH, -OR e -R, R sendo Ci- 20 Ci6-alquila, preferivelmente CrC8-alquila, cuja alquila pode ser saturada ou insaturada, ramificada ou não-ramificada e opcionalmente substituída por um grupo carbóxi, sulfo ou amino; e B e C podem ser idênticos ou diferentes e selecionados dentre Cm H2m+,; 1 < m < 5.

Na fórmula acima mencionada, A pode ser colocado na posição meta em relação ao grupo hidróxi, ao invés de ser colocado na posição para, conforme aqui apresentado.

Em modalidades específicas, o mediador pode ser acetossrin- gona, siringato de metila, siringato de etila, siringato de propila, siringato de butila, siringato de hexila, ou siringato de octila. Preferivelmente, o mediador é 4-ciano-2,6-dimetoxifenol1 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol ou um derivado N-substituído do mesmo, tal como, 4-(N-metilcarboxamido)-2,6-dimetoxife- nol, 4-[N-(2- hidroxietil)carboxamido]-2,6-dimetoxifenol, ou 4-(N,N-dimetilcar- boxamido)-2,6- dimetoxifenol.

O mediador da invenção pode estar presente em concentrações de 0,005-1000 pmols por g de tecido de algodão, preferivelmente, 0,05-500 pmols por g de tecido de algodão, mais preferivelmente, 0,5-100 Mmols por g de tecido de algodão.

Os mediadores podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica, tais como aqueles divulgados nos documentos de patentes WO 97/11217, WO 96/12845 e US 5752980.

III. Utilidade

As aplicações industriais das lacases incluem branqueamento de polpa e papel e branqueamento de tecido, por exemplo, tecidos de tecido de algodão tingidos de índigo. As lacases também foram consideradas úteis 15 para tingimento de cabelo (ver, por exemplo, os documentos de patentes WO 95/33836 e WO 95/33837). A Patente Européia No. 0504005 relata que as lacases podem ser usadas para tingir lã.

As lacases aqui descritas têm uso no tingimento e branquea- mento de tecidos, fibras, fios e similares. As lacases também têm uso no 20 tratamento de água servida, na deslignificação de polpa, na despolimeriza- ção de agregados de peso molecular elevado, na descoloração de papel usado, na polimerização de compostos aromáticos, na polimerização media- da por radicais e nas reações reticuladas (por exemplo, tintas, revestimen- tos, biomateriais), na ativação de corantes e no acoplamento de compostos 25 orgânicos. As lacases podem ser usadas em uma composição de limpeza ou componente da mesma ou em um detergente.

Conforme aqui descrito, as lacases são capazes de oxidar uma grande variedade de compostos coloridos tendo diferentes estruturas quími- cas, usando oxigênio como aceitador de elétron. Do mesmo modo, as Iaca- 30 ses aqui apresentadas podem ser usadas em aplicações onde se deseja modificar a cor associada a compostos coloridos, como na limpeza, por e- xemplo, para remover as manchas de comida no tecido. Em determinadas situações, um mediador ou intensificador pode ser usado para obter os efei- tos desejados.

As lacases aqui apresentadas podem ser usadas no campo de tecidos. Por exemplo, as lacases aqui descritas podem ser usadas no trata- 5 mento, processamento, acabamento, polimento ou produção de fibras, ou outros tecidos ou artigos de fabricação. As enzimas aqui apresentadas po- dem ser úteis, por exemplo, no tratamento de tecido de algodão (processa- mento de branqueamento); na descoloração de resíduo de índigo; no tingi- mento de tecido; em processos de branqueamento de tecido; na modificação 10 de fibra; para obter propriedade melhorada de fibra ou de tecido, etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas na indústria de cou- ro. Por exemplo, as lacases podem ser usadas no processamento de couros de animais, incluindo sem que seja a isso limitado, a retirada de pêlos, a e- tapa de adição de cal, a maceração e/ou o curtimento de couros.

Também é aqui divulgado um processo para a remoção de Iigni-

na do material contendo lignocelulose, o branqueamento do material conten- do Iignocelulose (isto é, descoloração enzimática de papel reciclado) e/ou o tratamento de água servida originária da fabricação de papel ou celulose. O processo usa enzimas de lacase obtidas a partir da Cerrena sp. e, ao mes- 20 mo tempo, adicionando ou aferindo em agentes redox não-aromáticos mais compostos redox aromáticos fenólicos e/ou não-fenólicos, as unidades fenó- Iicas e não-fenólicas da lignina, quer sendo oxidada diretamente pela ação desses compostos aromáticos fenólicos e/ou não-fenólicos, ou a lignina sen- do oxidada por outros compostos fenólicos e/ou não-fenólicos produzidos 25 pela ação oxidante desses compostos.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no segmento de polpa e papel. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na fabricação de polpas de papel e polpas felpudas, a partir de materiais brutos, tais como, madeira, bambú, e palha de cereal de arroz; fabricação de papel e papelão 30 para imprimir e escrever, para embalagens, uso sanitário e outros usos téc- nicos; reciclagem de fibras de celulose, com a finalidade de fabricar papel e papelão; e tratamento de produtos residuais oriundos de e tratados nas fá- bricas de polpa ou papel e outras instalações especificamente dedicadas à fabricação de papel, polpa, ou felpas. As enzimas aqui apresentadas podem ser úteis, por exemplo, no processamento de madeira; no branqueamento de polpa; na modificação de fibra de madeira; em biocola (ativação de lignina) 5 para fabricação de MDF; para proporcionar propriedades melhoradas do pa- pel; na remoção de tinta; em tingimento de papel; em adesivos (por exemplo, cola à base de lignina para compensados ou tábuas de fibras); etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo alimentí- cio. Por exemplo, as lacases aqui apresentadas podem ser usadas como 10 aditivos alimentares, isolados ou como parte de um aditivo alimentar, com o objetivo de aumentar o valor nutricional do alimento para qualquer tipo de animal, tal como galinhas, vacas, porcos, peixes e animais de estimação e/ou como auxiliar de processamento para processar materiais de plantas e subprodutos da indústria alimentícia, com o objetivo de produzir materi- 15 ais/produtos adequados para matéria-prima de produtos alimentícios.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo de lim- peza de lentes de contato. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na limpeza, armazenagem, desinfecção e/ou conservação de lentes de contato.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no segmento de 20 amidos. Por exemplo, as lacases podem ser usadas no processamento de um substrato incluindo amido e/ou grão para xarope de glicose (dextrose), xarope de frutose ou qualquer outro xarope, álcool (potável ou combustível) ou açúcar. Tal processamento de amido pode incluir etapas de processa- mento, tais como, liquefação, sacarificação, isomerização e desramificação 25 de um substrato.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no segmento dos alimentos. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na preparação, pro- cessamento ou como um ingrediente ativo em alimentos, tal como, gordura amarela, bebidas à base de chá, produtos de culinária, panificação, e comi- 30 das congeladas para consumo humano. As lacases podem ser usadas, por exemplo, como beneficiador de pão, na conservação de alimentos e como um sequestrante de oxigênio, etc. As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo de cui- dados pessoais. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na preparação de produtos de uso pessoal para seres humanos, tais como perfumes, e produtos para cuidado da pele, cuidado do cabelo, higiene oral, banho pes- 5 soai e desodorante e/ou antiperspirantes, para seres humanos. As enzimas aqui apresentadas podem ser úteis, por exemplo, na coloração e/ou descolo- ração de cabelo, coloração e/ou descoloração de unhas; coloração e/ou descoloração de pele; modificação de superfície (por exemplo, como reagen- te acoplador); como um agente antimicrobiano; na remoção de odor; bran- 10 queamento de dentes; etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo de lim- peza. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na limpeza, no tratamento ou no cuidado de itens de lavanderia, tal como, roupas ou tecidos; na limpe- za de superfícies duras domésticas; no trato de louça, incluindo aplicações 15 em máquina de lavar louça; e em sabão em barras e líquidos e/ou detergen- tes sintéticos em barras e líquidos. As enzimas aqui apresentadas podem ser úteis, por exemplo, na remoção/descoloração de manchas e/ou na re- moção de odores, e/ou na sanitarização, etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo do tra- tamento de água servida. Por exemplo, as lacases podem ser usadas na descoloração de compostos coloridos; na desintoxicação de componentes fenólicos; e ainda usadas para atividade antimicrobiana (por exemplo, na reciclagem de água); em biorremediação; etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo de bio- 25 materiais. Por exemplo, as lacases podem ser usadas como biocatalisadores para diversas reações orgânicas; e/ou em conexão com biopolímeros; em conexão com embalagem; em conexão com adesivos; na modificação de superfície (agente de ativação e acoplamento); na produção de álcoois pri- mários; em conexão com biossensores e/ou sínteses orgânicas; etc.

As lacases aqui descritas podem ser usadas no campo de agen-

tes antimicrobianos. Por exemplo, as lacases podem ser usadas como um agente antimicrobiano em composições de limpeza, ou para reduzir ou eli- minar a carga microbiana de diversos alimentos (por exemplo, carnes) ou rações.

Os mediadores de lacase podem ser usados como agentes de sanitarização e antimicrobianos (por exemplo, proteção de madeira, deter- 5 gentes). Os mediadores podem ser usados independentemente das enzimas ou em conjunto com as enzimas.

Conforme aqui usados, os termos "composições de limpeza" e "formulações de limpeza" referem-se a composições que encontram uso na remoção de compostos indesejáveis de itens a serem limpos, tal como, teci- 10 dos, etc. Os termos abrangem quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo específico de composição de limpeza desejada e a forma do pro- duto (por exemplo, composição líquida, gel, granulada, ou em vaporização), desde que a composição seja compatível com a lacase e outra(s) enzima(s) usada(s) na composição. A seleção específica dos materiais de composição 15 de limpeza é rapidamente feita ao se considerar a superfície, o item ou o tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante o uso.

Os termos referem-se ainda a qualquer composição que seja adequada para limpeza e/ou branqueamento de qualquer objeto e/ou super- 20 fície. Pretende-se que os termos incluam, sem que seja a isso limitado, as composições de detergente (por exemplo, detergentes para lavanderia, lí- quidos e/ou sólidos e detergentes para tecidos delicados; formulações para limpeza de superfície dura, tal como, tampos de balcões de vidro, madeira, cerâmica e metal e janelas; limpadores de tapete; limpadores de forno; e 25 pré-lavagens de tecido e lavanderia, bem como detergentes para louça).

Realmente, o termo "composição para limpeza" conforme aqui usado, inclui, exceto quando indicado em contrário, a forma granular ou em pó para todos os fins ou agentes para lavagem pesada, especialmente de- tergente para limpeza; agentes para todo tipo de lavagem na forma líquida, 30 gel ou pasta, especialmente aqueles do tipo chamado de líquido para limpe- za pesada (HDL); detergentes líquidos para tecidos delicados; agentes para lavagem de louça manual ou agente para lavagem de louça leve, especial- mente aqueles do tipo bem espumante; agentes para máquina de lavar lou- ça, incluindo os diversos tipos de tabletes, grãos, líquidos e enxaguantes para uso doméstico e institucional; agentes líquidos de limpeza e disinfetan- te, xampus para carro ou tapete, limpadores para banheiro; xampus para 5 cabelo e condicionadores para cabelo; gel para ducha e espuma para banho e limpadores para metal; bem como auxiliares para limpeza, tais como, aditi- vos alvejantes e "bastão para remover mancha" ou outros tipos de pré- tratamento.

Conforme aqui usado, os termos "composição detergente" e "formulação detergente" são usados como referência a misturas que têm por objetivo o uso em um meio de lavagem para limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado como referência para lavagem de tecidos e/ou roupas (por exemplo, "detergentes de lavanderia"). Em modali- dades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, tais como aque- Ies usados para lavar louças, talheres, etc. (por exemplo, "detergentes para máquina de lavar louça"). Não se pretende que as composições presente- mente contempladas sejam limitadas a qualquer formulação ou composição de detergente específico. Realmente, se pretende que além da lacase, o termo abranja detergentes que contém tensoativos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, agentes reforçadores, agentes alvejantes, ativadores para alve- jar, agentes do tipo anil e corantes fluorescentes, inibidores de espessamen- to, agentes de demascaramento, ativadores de enzima, antioxidantes e so- lubilizantes.

Conforme aqui usado, "composição Iimpadora de superfície du- 25 ra," se refere a composições de detergente para limpeza de superfícies du- ras tais como assoalhos, paredes, azulejos, vasilhas de aço inoxidável (por exemplo, tanques de fermentação), artigos de banheiro e cozinha, e simila- res. Tais composições são proporcionadas em qualquer forma, incluindo sem que seja a isso limitado, sólidos, líquidos, emulsões, etc.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Análise da Seqüência de Aminoácido da lacase Cerrena unicolor

Quatro seqüências de peptídeos foram obtidas usando uma Ia- case comercialmente disponível:

AIGPVADLHI (SEQ ID NO. 19), MLTPTSI (SEQ ID No. 20), TVGGPA (SEQ ID No. 21) e YSFVLNANQP (SEQ ID NO. 22). Uma lacase comercialmente disponível foi purificada. O sequenciamento de terminal-N 5 resultou em SEQ ID No. 19. Em seguida, foi realizada a digestão proteolítica com tripsina da amostra purificada. Os fragmentos foram separados por ele- troforese de gel com 3 faixas selecionadas e coletadas manualmente. O se- quenciamento de peptídeo foi realizado para cada faixa e resultou nas SEQ ID Nos. 20, 21 e 22.

Exemplo 2

a) Clonagem do gene da lacase A, Cerrena unicolor, da cepa ATCC20013

Para clonar o gene da lacase A de cepa ATCC 20013, dois iniciado- res foram designados e obtidos da Invitrogen: TTCGCAGGTCAACGATATTC (SEQ ID No. 35), baseado na seqüência do DNA do gene da lacase B obtida da cepa ATCC20013 (Ver Exemplo 3a) e GTTAGGTGGTTGAAGGATTG (SEQ ID NO. 36) baseado no gene da lacase A obtida da cepa CBS115.075 (Ver Exemplo 2c). Os iniciadores foram usados em uma reação de PCR de elevada T, contendo DNA genômico obtido da cepa ATCC 20013 como pa- drão (Ver Exemplo 3). O fragmento de PCR foi purificado usando uma colu- na rotativa QIAquick da Qiagen e clonado em um plasmídio pTOPO usando um kit de clonagem TOPO (Invitrogen). Vinte e dois clones foram amplifica- dos usando contas de pronto uso pelo método PCR (GE Healthcare) e três fragmentos PCR (2-1, 2-3 e 2-6) foram sequenciados. 1316 bps da sequên- cia de DNA do gene da lacase A, da cepa ATCC20013 estão relacionados na SEQ ID No 37.

b) Clonagem do gene da lacase A, Cerrena unicolor, da cepa

CBS 154.29

Para clonar o gene da lacase A da cepa CBS 154.29, dois iniciado- res foram designados e obtidos da Invitrogen: CACCAGCATGAGCTCAAAGC- TAC (SEQ ID No. 45) baseado no gene da lacase A obtida da cepa CBS 115.075 (Ver Exemplo 2c) e o iniciador da SEQ ID No. 36. Os iniciadores foram usados em uma reação de PCR Herculase contendo o modelo de DNA genômico obtido da cepa de CBS154.29, dNTPs, o iniciador e 4% de DMSO em tampão 1x. A mistura de PCR foi aquecida para 98°C durante 4 minutos para desnaturar o modelo de DNA. A enzima Herculase® Il (Strata- 5 gene) foi adicionada ao tubo e a reação de PCR foi realizada em 30 ciclos de 98°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos. A execução final foi realizada à temperatura de 72°C durante 5 mi- nutos e a reação foi resfriada para 4°C. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e clonado para o vetor pENTR/D- 10 TOPO (Invitrogen). Quinze clones foram amplificados usando contas de pronto uso pelo método PCR e os plasmídios foram isolados a partir de dois clones (pENTR15-24 e pENTR15-30) e os padrões de DNA foram sequenci- ados. Em seguida, 2374 bps da seqüência de DNA do gene da lacase A, da cepa CBS 154.29 foram obtidos e a seqüência de DNA está listada como 15 SEQ ID No. 3; a seqüência de proteína traduzida está listada como SEQ ID No. 4.

c) Clonagem do gene da lacase A, Cerrena unicolor, da cepa CBS 115.075

O iniciador CAATCTATGACCGTAGATTC (SEQ ID No. 39) ba- 20 seado no gene da lacase B da cepa ATCC20013 (Ver Exemplo 3a) e o inici- ador NNNNNNNNNNCGATCG (SEQ ID No. 38) onde N representa uma mistura de todos os quatro nucleotídeos (A, T, C e G) foram usados em rea- ção de PCR de baixa T (Ver Exemplo 3a). O DNA genômico foi extraído da cepa de Cerrena unicolor (CBS 115.075) e foi usado como padrão na primei- 25 ra etapa da reação de PCR de baixa T. Os fragmentos de PCR foram purifi- cados com uma coluna de rotação QIAquick e usados como padrão na se- gunda etapa da reação de PCR de baixa T, com iniciadores da SEQ ID No.35 baseado no gene da lacase B da cepa ATCC20013 (Ver Exemplo 3a) e iniciador da SEQ ID No. 38. Os fragmentos de PCR foram clonados em um

plasmídio pTOPO usando kit de clonagem TOPO. Dezesseis clones foram amplificados usando contas de pronto uso pelo método PCR e três fragmen- tos clonados de PCR (B2 N-1, B2 N- 4 e B2 Na I 1) foram sequenciados. Para clonar o terminal 3' do gene da lacase A, o iniciador ACCGTGGTTCCTCCATTGCC (SEQ ID No.40) e iniciador da SEQ ID No.

31 foram usados na reação de PCR de baixa T, com o DNA genômico extra- ído da cepa Cerrena unicolor (CBS 115.075) como padrão na primeira etapa 5 da reação de PCR de baixa T. Os fragmentos de PCR foram purificados por meio de uma coluna rotativa QIAquick e usados como padrão na segunda etapa da reação PCR de baixa T, com os iniciadores GACTGGCACTTGGA- AGCGGG (SEQ ID No.41) e o iniciador da SEQ ID No. 31. Os fragmentos de PCR foram clonados no plasmídio pTOPO usando kit de clonagem TOPO. 10 Vinte e dois clones foram ampliados usando contas de pronto uso pelo mé- todo PCR e um fragmento clonado de PCR (D2 N- 2) foi sequenciado.

Para clonar o terminal 5' do gene da lacase A, um iniciador GGACCAAGCTGGTACTTTC (SEQ ID No. 42), foi designado, baseado na seqüência do gene da lacase B. Esse iniciador foi usado para amplificar um 15 fragmento de DNA com o iniciador da SEQ ID No. 36. O DNA genômico ex- traído da cepa Cerrena unicolor (CBS 115.075) foi usado como padrão de PCR. O fragmento de PCR de 1,7 kb foi obtido, purificado por meio de uma coluna rotativa QIAquick e clonado em um plasmídio pTOPO usando um kit de clonagem TOPO.

Vinte e dois clones foram analisados usando as contas de pronto

uso pelo método PCR. O DNA de plasmídio do clone (C5 N- 20) foi sequen- ciado. Para posterior clonagem do terminal 5' do gene da lacase A, o inicia- dor CGTGGTACCAGTCTGCCAGGG (SEQ ID NO. 43) e o iniciador da SEQ ID No. 31 foram usados em uma reação de PCR de baixa T, com o DNA ge- 25 nômico extraído da cepa CBS 115.075 da Cerrena unicolor como padrão. A partir da primeira etapa da reação de PCR de baixa T, o fragmento de PCR foi purificado por meio de uma coluna rotativa QIAquick e usado como pa- drão na segunda etapa da reação de PCR de baixa T, com os iniciadores GGCAGCATCAGTCACGGTCAG (SEQ ID No. 44) e o iniciador da SEQ ID 30 No. 31. O fragmento de PCR (a3) foi novamente amplificado e usado como padrão em uma terceira etapa da reação de PCR de baixa T, com os inicia- dores GGCAGCATCAGTCACGGTCAG (SEQ ID No. 44) e o iniciador da SEQ ID No. No. 31. O fragmento de PCT (a3-2) foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Onze clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e dois fragmentos de PCR clonados (a3-2 Ne 10 e a3-2 Ns 11) foram sequenciados. A seqüência 5 de DNA do gene da lacase A, da cepa CBS 115.075, incluindo a seqüência de 5'e 3' da região de codificação se encontra relacionada na SEQ ID No. 1 e a seqüência de proteína traduzida está relacionada como a SEQ ID No.2. Exemolo 3

a) Clonagem e Sequenciamento do Gene da lacase B, Cerrena unicolor, da cepa ATCC20013

Para clonar o fragmento de DNA codificador do gene da lacase Cerrena, quatro iniciadores degenerados foram designados, baseado na se- qüência de peptídeo AIGPVADLHI (SEQ ID No. 19) obtido da Invitrogen. Eles são identificados como:

Iniciador A: GCAATCGGACCNGTNGCAGA (SEQ ID No. 23);

Iniciador B: GCAATCGGACCNGTNGCTGA (SEQ ID No. 24); Iniciador C: GCAATCGGACCNGTNGCGGA (SEQ ID No. 25) e Iniciador D: GCAATCGGACCNGTNGCCGA (SEQ ID No. 26). Dois iniciadores degenerados foram designados, baseados na seqüência de peptídeo YSFVLNANQP (SEQ ID No. 22), obtida da Invitro- gen. Eles são identificados como:

Iniciador E: GGTTGATTTGCATTNAGNAC (SEQ ID No. 27) e Iniciador F: GGTTGATTTGCGTTNAGNAC (SEQ ID No. 28) Onde N representa uma mistura de todos os quatro nucleotídeos (A, T, C e G). O DNA genômico que foi extraído da cepa ATCC20013 e usa- do como padrão na reação de PCR de baixa T1 contém a seguinte combina- ção de iniciadores: reação de PCR 1 não contém DNA e nem iniciador; rea- ção de PCR 2 contém iniciador A e iniciador E; reação de PCR 3 contém iniciador B e iniciador E; reação de PCR 4 contém iniciador C e iniciador E; reação de PCR 5 contém iniciador D e iniciador E; reação de PCR 6 contém iniciador A e iniciador F; reação de PCR 7 contém iniciador B e iniciador F; reação de PCR 8 contém iniciador C e iniciador F e reação de PCR 9 con- tém iniciador D e iniciador F. A mistura reacional de PCR continha modelo de DNA1 iniciadores, tampão 1x, dNTP a 0,2 mM e 1 unidade de Taq DNA polimerase. A reação de PCR foi realizada em 30 ciclos de 95°C por 1 minu- to, 45°C por 1 minuto e 68°C por 1 minuto. A parte final sob temperatura de 5 72°C foi feita por 7 minutos e a reação foi congelada para 4°C. Os fragmen- tos de PCR das reações 4, 5 e 8 foram retirados de um gel de agarose a

1,2% e agrupados. Os fragmentos de PCR foram extraídos do gel mediante uma coluna rotativa Qiagen e clonados em um plasmídio pTOPO, usando o kit de clonagem TOPO. Trinta e dois fragmentos de PCR clonados foram 10 selecionados e sequenciados usando contas de pronto uso pelo método PCR e a seqüência de DNA do clone N2 A30 foi identificada como o gene da lacase B.

Para clonar o terminal 5' do gene da lacase, foi designado um iniciador obtido da Invitrogen: GGACGTGGCCTTGAGCATAC (SEQ ID No. 29). Ele foi usado na primeira etapa de uma reação de PCR de baixa T com um oligo degenerado INTNNNNNNNNNGGATCC (SEQ ID No. 31), onde N representa uma mistura de todos os quatro nucleotídeos (A, T, C e G). O produto de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e utiliza- do como padrão em uma segunda reação de PCR de baixa T, contendo um polímero TCTGTCAAGTCGTCAATCAC (SEQ ID No. 30) e o iniciador da SEQ ID No. 31. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rota- tiva QIAquick, diluído de 1:10 e 1:100 e usado como padrão na primeira eta- pa da reação de PCR de alta T, executada em 30 ciclos de 95°C por 1 minu- to, 50°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto, com dois iniciadores (SEQ ID No.30 e SEQ ID No. 31). A extensão final em temperatura de 72°C foi feita por 7 minutos e a reação foi congelada para a temperatura de 4°C. O frag- mento de PCR foi purificado com uma coluna rotativa QIAquick e usado na segunda etapa da reação de PCR de alta T com os iniciadores de TTAC- CACGAATCAGAGGACC (SEQ ID No. 32) e da SEQ ID No. 31. O fragmento de PCR (D 13) foi sequenciado.

Para clonar o terminal 3' do gene da lacase B, foi designado um iniciador obtido da Invitrogen: CCTCACCTGTATTGGCACAG (SEQ ID No. 33) e usado com o iniciador da seqüência SEQ ID No. 31 em uma primeira etapa da reação de PCR de baixa T. O fragmento de PCR foi purificado em uma coluna rotativa QIAquick e usado como padrão na segunda etapa da reação de PCR de baixa T, com o iniciador TTGGTATCATGCCCTTGCTC 5 (SEQ ID NO. 34) e o iniciador da SEQ ID No. 31. O fragmento de PCR foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezes- seis clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e quatro fragmentos de PCR clonados (C3, C4, C5 e C7) foram se- quenciados.

1337 bps de fragemento de DNA foram obtidos. A seqüência de

DNA é referida como a SEQ ID No. 9 e a seqüência de proteína traduzida é referenciada como a SEQ ID No. 10.

b) Clonagem do Gene da lacase B, Cerrena unicolor, da cepa CBS 154.29.

Dois iniciadores foram designados, obtidos da Invitrogen:

CACCGCGATGTCTCTTCTTCGTAG (SEQ ID NO. 46) e TGRAGRTGGA- ASGGATGWGGTCC (SEQ ID N0.47),

onde R representa a mistura de nucleotídeos A e G, S representa a mistura de nucleotídeos C e G1 e W representa a mistura de nucleotídeos A e T. Os dois 20 iniciadores foram usados na reação de PCR de alta T. O fragmento de PCR (A3) foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick. O fragmento de PCR foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezesseis clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e dois fragmentos de PCR (A3 N2 I e A3 Ns 5) foram sequenci- 25 ados.

Para clonar o terminal 3' do gene da lacase B da cepa CBS 154.29, foi designado um iniciador obtido da Invitrogen: GTCCCTGTACTACTCCA- GATCC (SEQ ID No. 48) e utilizado com um iniciador tendo a SEQ ID No. 31 na primeira etapa da reação de PCR de baixa T. O fragmento de PCR foi purifi- 30 cado em uma coluna ortativa QIAquick e usado como padrão na segunda etapa da reação de PCR de baixa T com o iniciador CCAGCAGGAAGCGT- GATCGAAC (SEQ ID No. 49) e iniciador da SEQ ID No. 31. O fragmento de PCR foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezesseis clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e três fragmentos de PCR (7 N- 6, 7 N- 7 e 7 N2 8) foram se- quenciados. 2663 bps da seqüência de DNA B de Iacase da cepa CBS 5 154.29 são referenciados como a SEQ ID No. 7 e a seqüência de proteína traduzida é referida como a SEQ ID No. 8.

c) Clonagem do Gene da Iacase B, Cerrena unicolor, da cepa CBS 115.075

Um iniciador foi designado, tendo sido obtido da Invitrogen: GTAATCATGTATCACCTGGGCTCAAGG (SEQ ID NO. 50). O iniciador foi utilizado na reação de PCR de Herculase (Ver Exemplo 2b) com o iniciador da SEQ ID No. 46. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick. O fragmento de PCR foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezessete clones foram analisados usan- do as contas de pronto uso pelo método PCR e os fragmentos de PCR de quatro clones (N2 1, N- 2, N- 4 e N2 5) foram sequenciados. O DNA do plas- mídio foi preparado a partir de dois clones (pENTR-lacaseB CBSI 15075 N2 I e pENTR-lacaseB CBS1 15075 N2 3) e ambos os plasmídios foram sequen- ciados. 2173 bps da sequencia de DNA B da Iacase da cepa CBS 115.075 são relacionados como SEQ ID No. 5 e a seqüência de proteína traduzida é referida como a SEQ ID No. 6.

Exemplo 4

Clonagem do Gene da Iacase C, Cerrena unicolor, da cepa CBS 154.29

Um iniciador, ACGAACGAGTANCGTTGNCC (SEQ ID No. 51), 25 onde N representa uma mistura de todos os quatro nucleotídeos (isto é, A, T, C e G), foi designado baseado da seqüência de peptídeo traduzida G- QRYSFV (SEQ ID No. 52). Esse peptídeo é conservado entre o gene da Ia- case Aeo gene da Iacase B (Ver Exemplos 2 e 3). O iniciador foi obtido da Invitrogen e foi usado na reação de PCR de baixa T com o iniciador da se- 30 quência SEQ ID No. 24. O fragmento de PCR foi purificado usando uma co- luna rotativa QIAquick. O fragmento de PCR foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Vinte e três clones foram analisa- dos usando as contas de pronto uso pelo método PCR e os fragmentos de PCR de quatro clones (N2 12, N- 5a, N2 19a e Na 2 1a) foram sequenciados. 1080 bps da seqüência do gene da Iacase C da cepa CBS 154.29 são refe- renciados como a SEQ ID No. 11 e a seqüência de proteína traduzida é refe- rida como a SEQ ID No. 12.

Exemplo 5

a) Clonagem do Gene da Iacase D, Cerrena unicolor, da cepa CBS 115.075

Para clonar o terminal 5' do gene da Iacase D da cepa CBS 10 115.075, foi designado um iniciador baseado no gene da Iacase D, da cepa CBS 154.29 (Ver Exemplo 5b) (AACACGGAGACAGTCCAAAC, SEQ ID NO. 62). Esse iniciador foi usado na reação de PCR de alta T com o iniciador da SEQ ID No. 56. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rota- tiva QIAquick e depois sequenciado.

Para clonar o gene da Iacase D de cepa CBS 115.075, foram

designados dois iniciadores (CACCTCTCGAGATGGGATTGAAC, SEQ ID No. 63 e CGTTTAAATAGCAGTTCCTTTC, SEQ ID No. 64), baseados no gene da Iacase D de cepa CBS 154.29 (Ver Exemplo 5b). Os iniciadores foram usados em uma reação de PCR de Herculase (Ver Exemplo 2b) com 20 modelo de DNA do DNA genômico da cepa CBS 115.075. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e clonado em um vetor pENTR/D-TOPO. Dezesseis clones foram amplificados usando as con- tas de pronto uso pelo método PCR e os fragmentos de PCR gerados a par- tir de quatro clones foram sequenciados. Os plasmídios foram isolados a 25 partir de clone N2 2 (pENTRE-lacaseD N2 2) e foram sequenciados. 2809 bps da seqüência de DNA do gene da Iacase D, de CBS 115.075 foram obti- dos. A seqüência de DNA é referida como SEQ ID No. 15 e a seqüência de proteína traduzida é referida como SEQ ID No. 16.

b) Clonagem do Gene da Iacase D, Cerrena unicolor, da cepa

CBS 154.29

Um iniciador, CTGGTTGGTTNGCATTNAG (SEQ ID No. 53), foi designado baseado na seqüência de peptídeo LNANQP (SEQ ID No. 54). O iniciador foi obtido da Invitrogen e usado na reação de PCR em baixa T com o iniciador da SEQ ID No. 26. O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezoito clones foram analisados usando as contas 5 de pronto uso pelo método PCR e o fragmento de PCR de um clone foi se- quenciado.

Para clonar o terminal 3’ do gene da Iacase D foi designado um iniciador (CACACGACCCCTGACCGTTG, SEQ ID No. 55). O iniciador foi usado na reação de PCR de baixa T, com o iniciador da SEQ ID No. 31. O 10 fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e foi clonado em um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Vinte e quatro clones foram analisados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e os fragmentos de PCR de um clone foram sequenciados.

Para clonar mais dos terminais 3' e 5' do gene da Iacase D, foi 15 usado o PCR reverso. 0,4 ug do DNA genômico de Cerrena da cepa CBS 154.29 cepa foi digerido com a enzima de restrição EcoRV sob temperatura de 37°C por 1,5 hora. Os fragmentos digeridos de DNA genômico foram pre- cipitados com etanol. Os fragmentos lineares de DNA foram ligados com a T4 DNa ligase, em um volume de 100 ul, durante mais de 5 horas. Os frag- 20 mentos de DNA ligados foram aquecidos à temperatura de IOO0C por 3 mi- nutos e foram usados como modelo de DNA em uma primeira etapa da rea- ção de PCR de alta T1 usando dois iniciadores: (TG ACCGGTG ATCA- ACGTCCC, SEQ ID No. 56, e GGCGCAGACATCAATCACAG, SEQ ID No. 57). Os fragmentos de PCR foram purificados usando uma coluna rotativa 25 QIAquick e foram usados como modelo de DNA em uma segunda etapa da reação de PCR de alta T, usando dois iniciadores (TCTTCAGCATCAACA- ACGCC, SEQ ID No. 58 e TCCGGCAAGCACGGTTGG, SEQ ID No. 59). Os segmentos de PCR da segunda etapa da reação de PCR foram purificados usando uma coluna rotativa QIAquick e foram sequenciados.

Para clonar mais do terminal 3' do gene da Iaease D de cepa

CBS 154.29, foi usado o procedimento de PCR reverso. 0,4 ug do DNA ge- nômico da Cerrena de cepa CBS 154.29 foram digeridos com enzima de restrição Smal1 sob temperatura de 37°C por 1,5 hora. Os fragmentos de DNA genômico digeridos foram precipitados com etanol. Os fragmentos line- ares de DNA foram ligados com a T4 DNa ligase, em um volume de 100 ul, durante mais de 5 horas. Os fragmentos de DNA ligados foram aquecidos à temperatura de IOO0C por 3 minutos e foram usados como modelo de DNA em uma primeira etapa da reação de PCR de alta T, com o iniciador TCGTCTTCGCTGAGGGCATC, SEQ ID NO. 60, e iniciador da SEQ ID No. 56. Os fragmentos de PCR foram purificados usando uma coluna rotativa QIAquick e foram usados como modelo de DNA na segunda etapa da rea- ção de PCR de alta T, usando o iniciador (CAGACCGCTGCAGCCAACCC, SEQ ID No. 61) e o iniciador da SEQ ID No. 59. Os fragmentos de PCR da segunda etapa da reação de PCR foram purificados usando uma coluna ro- tativa QIAquick e clonados em um plasmídio pTOPO, usando o kit de clona- gem TOPO. Vinte e um clones foram analisados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e o fragmento de PCR dos clones Ne Ce 11 e N- Ce

14 foram sequenciados. 2809 bps do gene D da seqüência de Iacase da ce- pa CBS 154.29.49 são referidos como a SEQ ID No. 13 e seqüência de pro- teína traduzida é referida como a SEQ ID No. 14.

Exemplo 6

Clonagem do Gene da Iacase E Cerrena Unicolor, a partir de Cepa CBS 154.29.

O iniciador da SEQ ID No. 53 foi utilizado na reação de PCR de baixa T, com o iniciador da SEQ ID No. 26 (Ver Exemplo 5b). O fragmento de PCR foi purificado usando uma coluna rotativa QIAquick e clonado em 25 um plasmídio pTOPO usando o kit de clonagem TOPO. Dezoito clones fo- ram analisados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e o frag- mento de PCR do clone N2 Ael7 foi sequenciado. 1163 bps da seqüência do gene da Iacase E, da cepa CBS 154.29.49 são referidos como a SEQ ID No.

17 e a seqüência de proteína traduzida é referida como a SEQ ID No. 18.

Exemplo 7

Expressão do Gene da Iaease A em Trichoderma

Para construção do plasmídio de expressão para o gene da Ia- case A da cepa CBS 115075, foram usados dois iniciadores (SEQ ID No. 45 e SEQ ID No. 36) na reação de PCR de Herculase contendo o modelo de DNA genômico obtido da cepa 115.075, dNTPs, e DMSO a 4% em um tam- pão 1x. A mistura de PCR foi aquecida à temperatura de 98°C por 4 minutos para desnaturar o modelo de DNA. A enzima Herculase® Il (Stratagene) foi adicionada ao tubo e a reação de PCR foi formada em 30 ciclos de 98°C por segundos, 50°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos. A duração final na temperatura de 72°C foi feita por 5 minutos e a reação foi congelada para a temperatura de 4°C. O fragmento de PCR foi purificado usando a coluna rotativa QIAquick e clonado no vetor pENTR/D-TOPO. Quinze clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e o DNA de plasmídio foi isolado a partir do clone pENTR-lacaseA-CBS115.075 N- 11. O gene A da porção de Iacase foi sequenciado para confirmar a fidelidade da amplificação por PCR do gene da Iacase A. O plasmídio de pENTR-lacaseA- CBS115.075 N2 11 (50 ng) foi convertido à expressão plasmídica pTrex3g- IacaseA (figura 1) em uma reação de 10 ul de LB clonase Il (Invitrogen), con- tendo 6,5 ul de TE, 1 ul do vetor de pTrex3g (0,1 mg/ml) e 2 ul de Clonasell. A expressão do plasmídio foi confirmada pelo sequenciamento de DNA e transformação biolística em uma cepa de Trichoderma. A transformação da cepa de Trichoderma pelo método de transformação biolística foi conseguida usando um Sistema de Liberação de Partículas mediante o Software Biolis- tic® PDS-1000/he da Bio-Rad (Hercules, CA), seguindo as instruções do fabricante (Ver o documento de patente WO 05/001036 e Patente US 2006/0003408). Sessenta e seis transformantes foram selecionados e trans- feridos para novas placas. Um total de 15 transformantes estáveis foi culti- vado em 30 mL do meio Proflo, durante 2 dias, à temperatura de 30°C. Cin- co mililitros da cultura antiga de 2 dias do meio Proflo foram transferidos pa- ra 50 mL do meio definido contendo cobre a 1 mM. As culturas foram cultiva- das durante 5 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifu- gados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

Exemplo 8

a) Expressão do Gene da Iacase B em Aspergillus Para construção da expressão plasmídica para o gene da Iacase B da cepa CBS115.075, foram usados dois iniciadores GCAGATCTGC- GATGTCTCTTCTTCGTAGCTTGAC (SEQ ID No. 72) e GAGGTCACCTC- TAGATCATGTATCACCTGGGCTCAAGGCATC (SEQ ID NO. 73) na reação 5 de PCR de Herculase contendo o modelo de DNA genômico obtido da cepa

115.075 (Ver Exemplo 2b). O fragmento de PCR foi purificado usando a co- luna rotativa QIAquick e digerido com enzima de restrição Bglll e Xbal. O fragmento de DNA foi purificado novamente com a coluna rotativa QIAquick e foi clonado em Bglll e Xbal, digerido pelo vetor pGAPT. A fidelidade do

plasmídio foi confirmada por sequenciamento do DNA. O plasmídio resultan- te pKB401 (figura 2) foi transformado em um A. Niger 2445 para verificar a expressão do gene da Iacase B. Trinta e quatro transformantes foram sele- cionados e foram transferidos para placas de MM e cultivados por 4 dias à temperatura de 30°C. Um pequeno plugue de colônia única, incluindo espo- 15 ros e micélio, foi inoculado sobre uma placa de CMA e cultivado por 4 dias à temperatura de 30°C. Um tampão de placa de CMA contendo esporos con- fluentes e micélia foi transferido dentro de 30 mL de caldo especial Promo- soy (pH 6,2) contendo cobre 1 mM. As culturas foram cultivadas durante 5 dias à temperatura de 30°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram 20 usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

b) Expressão do Gene da Iacase B em Aspergillus, como Fusão para o Domínio Catalítico de Glicoamilase.

Para construção da expressão plasmídica para o gene da Iaease B da cepa CBS115.075, foram usados dois iniciadores TTGCTAGCAACGT GAT CT CCAAG CGTG CAAT CGGT CCAGT CACT GACCTAC (51mer, SEQ ID No. 74) e o iniciador da SEQ ID No. 73 na reação de PCR de Herculase contendo o modelo de DNA genômico obtido da cepa CBS

115.075 (Ver Exemplo 2b). O fragmento de PCR foi purificado usando a co- luna rotativa QIAquick e digerido com Nhel e BstEII, tendo sido novamente

purificado com a coluna rotativa QIAquick. Esse fragmento purificado foi clo- nado no vetor digerido por Nhel e BstEI, pGAMpR2-GV (Ver Pedido de Pa- tente US 2005/0153399). O plasmídio resultante pKB403 (figura 3) foi con- firmado por análise de sequenciamento e transformado em um A. Niger 2445. Vinte e oito transformantes foram selecionados e transferidos sobre placas de MM e cultivados durante 4 dias à temperatura de 30°C. Um pe- queno plugue de colônia única, incluindo esporos e micélio, foi inoculado 5 sobre uma placa de CMA e cultivado por 4 dias à temperatura de 30°C. Um tampão de placa de CMA contendo esporos confluentes e micélia foi transfe- rido dentro de 30 mL de caldo especial Promosoy (pH 6,2) (Ver Pedido de Patente US 2005/0153399) contendo cobre a 1 mM. As culturas foram culti- vadas durante 5 dias à temperatura de 30°C. Caldos de cultura foram centri- 10 fugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

c) Expressão do Gene da Iacase B em Trichoderma Para construção do plasmídio de expressão para o gene da Ia- case B da cepa CBS 115.075, (ver o Exemplo 2b). Um iniciador foi designa- do e obtido da Invitrogen: GTAATCATGTATCACCTGGGCTCAAGG (SEQ ID NO. 50). O iniciador foi usado na reação de PCR de Herculase (Ver E- xemplo 2b) com o iniciador da SEQ ID No. 46. O fragmento de PCR foi puri- ficado usando a coluna rotativa QIAquick e clonado em um vetor pENTR/D- TOPO (Invitrogen). Dezessete clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e o DNA do plasmídio foi isolado do clone pENTR-CBS 115.075 N- I (Ver Exemplo 3c). Uma porção do gene da Iacase B foi sequenciada para confirmar a fidelidade da amplificação por PCR. O plasmídio de pENTR-lacaseB-CBS115.075 N- 1 (50 ng) foi convertido ao plasmídio de expressão pTrex3g-lacaseB (Ver figura 1, com o gene da Iaca- se A substituído pelo gene da Iacase B) em uma reação de 10 ul de LB clo- nase Il (Invitrogen) contendo 6,5 ul de TE, 1 ul de vetor pTrex3g (0,1 mg/ml) e 2 ul de Clonasell. O plasmídio de expressão foi confirmado pelo sequenci- amento de DNA e transformado de modo biolístico em uma cepa de Tricho- derma. Sessenta transformantes foram selecionados e transferidos para pla- cas novas. Um total de 20 transformantes estáveis foi cultivado em 30 mL do meio Proflo, durante 2 dias à temperatura de 30°C. Três mL de cultura antiga de dois dias do meio Proflo foram transferidos para 30 mL do meio definido (ver o Pedido de Patente US 2005/0153399) contendo cobre a 1 mM. As culturas foram cultivadas durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para o ensaio ABTS.

d) Expressão do Gene da Iacase B em Trichoderma, como fusão

de CBH1

Para construir o plasmídio de expressão para o gene da Iacase B da cepa CBS 115.075, um iniciador foi designado e obtido da Invitrogen: (GGACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCAATCGGTCCAGTCACTGACC, SEQ ID NO. 65). O iniciador foi usado em combinação com o iniciador rever- 10 so (obtido do New Ertgland Biolab) na reação de PCR de Herculase, conten- do pENTR-lacaseB CBS 115075 Ns 1 (Ver Exemplo 3c) como modelo de DNA. O fragmento de PCR (SEQ ID No. 66):

ACTAGTGTCG CCGTTTACAA ACGCGCAATC GGTCCAGTCA CTGACCTACA 50 TATAGTGAAC CAGAATCTCG ACCCAGATGG TTTCAACCGC CCCACT GT AC 100 TCGCAGGTGG TACTTTCCCC GGTCCTCTGA TTCGTGGTAA CAAGGTACGC 150 TTCATAACCG CCCT CCGT AG ACGTAGGCTT CGGCTGACAT GACCATCATC 200 TGTAGGGAGA TAACTTTAAA ATTAATGTG A TTGACGACTT GACAGAGCAC 250 AGTATGCTCA AGGCTACGTC CATCGTAAGT CCCTGATTAA CGTTTCACCT 300 GGTCATATCG CTCAACGTCT CGAAGCACTG GCATGGGTTC TTCCAGAAGG 350 GAACCAACTG GGCCGATGGC CCCGCCI I I G TCACCCAATG TCCTATCACA 400 TCAGGAAACG CCTTCCTGTA T GATTT CAAC GTTCCGGACC AAGCTGGTAC 450 TTTCTGGTAC CACAGCCAT C TCTCTACACA GTATTGTGAC GGTCTTCGTG 500 GTGCCTTTGT CGTCTATGAT CCTAATGATC CCAACAAGCA ACTCTATGAT 550 GTTGATAACG GCAAGTTCCT TGCATATTTC ATTTCTATCA TATCCTCACC 600 TGTATTGGCA CAGAAAGCAC CGTGATTACC TTGGCTG ATT GGTATCATGC 650 CCTTGCTCAG ACTGTCACTG GTGTCGCGTG AGTGACAAAT GGCCCTCAAT 700 TGTTCACATA I I I I CCTGAT TATCATATGA TAGAGTATCT GATGCAACGT 750 TGATCAACGG ATTGGGACGT TCGGCCACCG GCCCCGCAAA TGCCCCTCTG 800 GCGGTCATCA GTGTCGAGCG G AATAAG AGG TCAGTTCCAT AATTATG ATT 850 ATTTCCCGCG TTACTTCCTA ACAATTATTT TTGTATCCCT CCACAGATAT 900 CGTTTCCGAT TGGTTTCTAT TTCTTGCGAC CCTAACTTTA I I I I CTCAAT 950 TGACCACCAC CCAATGACCG TAATTG AG AT GGACGGTGTT AATACCCAAT 1000 CTATGACCGT AGATTCGATC CAAATATTCG CAGGTCAACG ATATTCATTT 1050 GTCGTAGGTT ATTATAAACT GCCCACCGAT CATCTCTCAC GTAACTGTTA 1100 TAGATGCAAG CCAACCAACC AGTTGGAAAT TATTGG ATCC GCGCTAAACC 1150 TAATGTTGGG AACACAACTT TCCTTGGAGG CCTGAACTCC GCTATATTAC 1200 GATATGTGGG AGCCCCT GAC CAAGAACCGA CCACT GACCA AACACCCAAC 1250 TCTACACCGC TCGTTGAGGC GAACCTACGA CCCCTCGTCT AT ACTCCTGT 1300 GGTATGTTGT TCTCGTTACA TATACCAAAC CTAATATGAA GACTGAACGG 1350 ATCTACTAGC CGGGACAGCC ATTCCCTGGC GGTGCTGATA TCGTCAAGAA 1400 CTTAGCTTTG GGTTTCGTAC GTGTATTTCA CTTCCCI I I I GGCAGTAACT 1450 GAGGTGGAAT GTATATAGAA TGCCGGGCGT TTCACAATCA ATGGAGCGTC 1500 CCT CACACCT CCTACAGTCC CTGTACTACT CCAGAT CCT C AGTGGTACTC 1550 ACAATGCACA GGATCTTCTC CCAGCAGGAA GCGTGATCGA ACTTGAACAG 1600 AAT AAAGTT G TCGAAATCGT TTTGCCCGCT GCGGGCGCCG TTGGCGGTCC 1650 TCATCCI I I I CACTTACATG GTGTAAGTAT CAGACGTCCT CATGCCCATA 1700 TTGCTCCGAA CCTTACACAC CTG ATTTCAG CACAAI I I CT GGGTGGTTCG 1750 TAGCGCCGGT CAAACCACAT ACAATTTCAA TGATGCTCCT ATCCGTGATG 1800 TTGTCAGTAT TGGCGGTGCA AACGATCAAG TCACGATCCG ATTTGTGGTA 1850 TGTATCTCGT GCCTTGCATT CATTCCACGA GTAATGATCC TTACACTTCG 1900 GGTTCTCAGA CCGATAACCC TGGCCCATGG TTCCTTCACT GTCACATTGA 1950 CTGGCATTTG GAGGCTGGGT TCGCTGTAGT CTTTGCGGAG GGAATCAATG 2000 GTACTGCAGC TGCTAATCCA GTCCCAGGTA AGACTCTCGC TGCTTTGCGT 2050 AATATCTATG AAI I IAAATC ATATCAATTT GCAGCGGCTT GGAATCAATT 2100 GTGCCCATTG TATGATGCCT TGAGCCCAGG TGATACATGA TTACAAGGGT 2150 GGGCGCGCC 2159

foi purificado usando a coluna rotativa QIAquick e digerido com enzimas de restrição Spel e Ascl. Esse fragmento (SEQ ID No. 66) foi depois clonado no vetor pTrex4, o qual foi tb digerido com Spel e Ascl para criar o plasmídio de expressão (pTrex4-lacaseB, figura 4). A fidelidade do plasmídio de expres- 5 são foi confirmada pelo sequenciamento de DNA e transformada de modo biolístico em uma cepa de Trichoderma. Mais de 100 transformantes foram gerados e sessenta transformantes foram transferidos para placas novas. Um total de 20 transformantes estáveis foi cultivado em 30 mL do meio Pro- fio, durante 2 dias à temperatura de 30°C. Cinco mL de cultura antiga de dois dias do meio Proflo foram transferidos para 50 mL do meio definido con- tendo cobre 1 mM. As culturas foram cultivadas durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadan- 5 tes para o ensaio ABTS.

Exemplo 9

a) Expressão do Gene da Iacase B da Cepa CBS115.075 em Streptomyces

A seqüência de proteína B da Iacase foi usada para otimização do códon, de acordo com o uso do códon de Streptomyces Hvidans. Para construção do plasmídio de expressão para o gene da Iacase B sintetizada da cepa CBS115.075 em Streptomyces, foram usados dois iniciadores ACG- CAGCCTGAACTAGTTGCGATCCTCTAGAG (SEQ ID No. 75) e CTCT- GATCAAGGTCATCAGGTGTCGCCCGGGGACAGG (SEQ ID No. 76) na reação de PCR de Herculase contendo o modelo de DNA otimizado (ver E- xemplo 2b). O fragmento de PCR foi purificado usando a coluna rotativa QI- Aquick e foi digerido com Xbal e Bell. O fragmento digerido foi purificado pe- la coluna rotativa QIAquick e foi clonado em Xbal e BamHI, digerido por pKB105 (ver a Patente US 2006/0154843). A correção de um plasmídio re- sultante pKB251 (figura 5) foi confirmada por sequenciamento de DNA. O DNA do plasmídio pKB251 foi transromado na cepa de Streptomyces Iivi- dans g3s3 (ver a Patente US 2006/0154843). Doze transformantes resisten- tes à tioestreptona foram colhidos e transferidos para um frasco de semea- dura agitado (20 ml do meio TSG contendo 50 ug/ml de tioestreptona em DMSO), sendo cultivados por 2 dias à temperatura de 30°C. Três mL da cul- tura antiga de dois dias do frasco ade semeadura agitado foram transferidos para 30 mL do meio Il de produção de Streptomyces modificado contendo cobre a 1 mM. As culturas foram cultivadas por 4 dias à temperatura de 30°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS. Exemplo 10

Expressão do Gene da lacase B em Trichoderma como Fusão de CBH1, usando Gene Sintético de Códon Otimizado

O gene da lacase B sintética otimizada (SEQ ID NO: 67):

ACTAGTGTCG CCGTTTACAA ACGCGCAATC GGTCCCGTCA CTGACCTGCA 50 TATTGTGAAC CAGAATCTCG ACCCCGATGG TTTCAACCGC CCCACTGTCC 100 TCGCAGGTGG TACTTTCCCC GGTCCTCTGA TTCGTGGTAA CAAGGGAGAT 150 AACTTTAAAA TTAATGTGAT TGACGACTTG ACAGAGCACA GCATGCTCAA 200 GGCTACGTCC ATCCACTGGC ATGGCTTCTT CCAGAAGGGA ACCAACTGGG 250 CCGATGGCCC CGCCTTTGTC ACCCAATGTC CTATCACATC AGGAAACGCC 300 TTCCTGTACG ATTTCAACGT TCCGGACCAA GCTGGTACTT TCTGGTACCA 350 CAGCCATCTC TCTACACAGT ACTGTGACGG TCTTCGTGGT GCCTTTGTCG 400 TCTACGATCC TAATGATCCC AACAAGCAAC TCTACGATGT TGATAACGGC 450 AACACCGTGA TTACCTTGGC TGATTGGTAC CATGCCCTTG CTCAGACTGT 500 CACTGGTGTC GCAGTCTCTG ATGCAACGTT GATCAACGGA TTGGGACGTT 550 CGGCCACCGG CCCCGCAAAT GCCCCTCTGG CGGTCATCAG CGTCGAGCGC 600 AATAAGCGCT ATCGTTTCCG ATTGGTTTCT ATTTCTTGCG ACCCTAACTT 650 TATTTTCTCA ATTGACCACC ACCCCATGAC CGTCATTGAG ATGGACGGTG 700 TTAATACCCA ATCTATGACC GTAGATTCGA TCCAAATCTT CGCAGGTCAA 750 CGATACTCAT TTGTCATGCA AGCCAACCAA CCAGTTGGAA ATTACTGGAT 800 CCGCGCTAAA CCTAATGTTG GCAACACAAC TTTCCTTGGA GGCCTGAACT 850 CCGCTATCTT GCGATACGTG GGAGCCCCTG ACCAAGAACC GACCACTGAC 900 CAAACACCCA ACTCTACACC GCTCGTTGAG GCGAACCTGC GACCCCTCGT 950 CTACACTCCT GTGCCGGGAC AGCCATTCCC TGGCGGTGCT GATATCGTCA 1000 AGAACTTGGC TTTGGGTTTC AATGCCGGGC GTTTCACAAT CAATGGAGCG 1050 TCCCTCACAC CTCCTACAGT CCCTGTCCTG CTCCAGATCC TCAGCGGTAC 1100 TC AC AATG CA CAGG ATCTTC TCCCGGCAGG AAGCGTGATC G AACTTG AAC 1150 AGAATAAAGT TGTCGAAATC GTTTTGCCCG CTGCGGGCGC CGTTGGCGGT 1200 CCTCATCCTT TTCACTTGCA TGGTCACAAT TTCTGGGTGG TTCGTAGCGC 1250 CGGTCAAACC ACATACAATT TCAATGATGC TCCTATCCGT GATGTTGTCA 1300 GCATTGGCGG TGCAAACGAT CAAGTCACGA TCCGATTTGT GACCGATAAC 1350 CCTGGCCCAT GGTTCCTTCA CTGTC AC ATT GACTGGCATT TGGAGGCTGG 1400 ATTCGCTGTC GTCTTTGCGG AGGGAATCAA TGGTACTGCA GCTGCTAATC 1450 CCGTCCCGGC GGCTTGGAAT CAATTGTGCC CGTTGTACGA TGCCTTGAGC 1500 CCGGGTGATA CATGAGGCGC GCC 1523

codificador do gene da lacase B1 foi sintetizado por McLab Inc. (Molecular Cloning Laboratories, 384 Oyster Point Blvd, Suite 15, South San Francisco, CA94080). O plasmídio de DNA sintético foi digerido com enzimas de restri- ção Spel e Ascl e o fragmento de DNA de 1,5 kb foi isolado a partir do gel e clonado no vetor pTrex4, que também foi digerido por Spel e Ascl para criar o plasmídio de expressão (pTrex4-lacaseBopt), o qual é similar ao plasmídio de expressão mostrado na figura 4, exceto em que o gene da lacase B de códon otimizado substituiu o gene da lacase B (não-otimizado). O plasmídio foi transformado de modo biolístico em uma cepa de Trichoderma. Mais de 30 transformantes foram gerados e foram transferidos para placas novas. Um total de 20 transformantes estáveis foi selecionado, incluindo micélia, sendo depois transferidos para 30 mL do meio definido contendo cobre 1 mM. As culturas foram cultivadas durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

Exemplo 11

a) Expressão do gene da lacase D em Trichoderma Para a construção do plasmídio de expressão para o gene da lacase D de cepa CBS 115.075, foram usados dois iniciadores (SEQ ID No. 63 e SEQ ID No. 64) na reação de PCR de Herculase contendo o modelo de DNA genômico obtido da cepa CBS 115.075 (ver Exemplo 2b). O fragmento de PCR foi purificado usando a coluna rotativa QIAquick e clonado no vetor pENTR/D-TOPO. Dezesseis clones foram amplificados usando as contas de pronto uso pelo método PCR e quatro DNAs de plasmídio foram sequencia- dos. O clone pENTR-lacase-D CBS 115.075 N- 2 foi selecionado. O plasmí- dio pENTR-lacaseD CBS 115.075 Ns 2 (50 ng) foi convertido ao plasmídio de expressão pTrex3g-lacaseD, o qual é similar ao plasmídio de expressão mostrado na figura 1, exceto em que o gene da lacase D de códon otimizado substituiu o gene da lacase A, em uma reação de 10 ul LB de clonase Il con- tendo 6,5 ul de TE, 1 ul de vetor pTrex3g (0,1 mg/ml) e 2 ul de Clonasell. O plasmídio de expressão foi confirmado novamente por sequenciamento de DNA e transformado de modo biolístico em uma cepa de Trichoderma. Qua- renta e cinco transformantes foram selecionados e transferidos para placas 5 novas. Os micélios de 28 transformantes estáveis foram transferidos para 30 mL de um meio definido contendo cobre a 0,5 mM. As culturas foram culti- vadas durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centri- fugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

b) Expressão do Gene da lacase D em Trichoderma, como Fu- são de CBH1

Para construção do plasmídio de expressão para o gene da la- case D de cepa CBS115.075, foram designados dois iniciadores: (GGACTAGTGTCGCCGTTTACAAACGCGCAATTGGGCCCGTGGCCGAC, SEQ ID No. 68) e (AAGGCGCGCCTTAAATAGCAGTTCCTTTCTTAG, SEQ 15 ID No. 69), obtidos da Invitrogen. Os iniciadores foram usados na reação de PCR de Herculase contendo o DNA genômico da cepa CBS 115.075 como modelo de DNA. O fragmento de PCR foi purificado usando a coluna rotativa QIAquick, digerido com enzimas de restrição Spel e Ascl e clonado em um vetor pTrex4 (vero Pedido de Patente US 10/590.956; documento de paten- 20 te WO 05/093050), o qual também foi digerido com Spel e Ascl para criar o plasmídio de expressão (pTrex4-lacaseD). A fidelidade do plasmídio de ex- pressão foi confirmada por sequenciamento de DNA e transformada de mo- do biolístico na cepa de Trichoderma. Mais de 300 transformantes foram ge- rados e sessenta transformantes foram transferidos para placas novas. Os 25 micélios de 25 transformantes foram transferidos para 30 mL de um meio definido contendo cobre a 0,5 mM. As culturas foram cultivadas durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

Exemplo 12

Expressão do Gene da lacase D em Trichoderma como Fusão de CBH1, usando Gene Sintético de Códon Otimizado DNA (SEQ ID No.70): ACTAGTGTCG CCGTTTACAA ACGCGCTATT GGACCAGTTG CTGATCTGCA 50 CATCGTTAAC AAGGATTTGG CCCCAGACGG CGTCCAGCGC CCAACTGTTC 100 TGGCCGGTGG AACTTTTCCG GGCACGCTGA TTACCGGTCA AAAGGGCGAC 150 AACTTCCAGC TGAACGTGAT TGATGACCTG ACCGACGATC GCATGTTGAC 200 CCCTACTTCG ATCCATTGGC ATGGTTTCTT CCAGAAGGGA ACCGCCTGGG 250 CCGACGGT CC GGCTTTCGTT ACACAGTGCC CTATTATCGC AGACAACTCC 300 TTCCTCTACG ATTTCG ACGT T CCCGACCAG GCGGGCACCT TCTGGTACCA 350 CTCACACTTG TCTACACAGT ACTGCGACGG TCTGCGCGGT GCCTTCGTTG 400 TTTACGACCC CAACGACCCT CACAAGGACC TTTATGATGT CGATGACGGT 450 GGCACAGTTA TCACATTGGC TGACTGGTAT CACGT CCT CG CTCAGACCGT 500 TGTCGGAGCT GCTACACCCG ACTCTACGCT GATTAACGGC TTGGGACGCA 550 GCCAGACTGG CCCCGCCGAC GCTGAGCTGG CCGTTATCTC TGTTGAACAC 600 AACAAGAGAT ACCGTTTCAG ACTCGTCTCC ATCTCGTGCG ATCCCAACTT 650 CACI I I IAGC GTCGACGGTC ACAACATGAC G GTT ATCG AG GTTGATGGCG 700 TGAATACCCG CCCTCTCACC GTCGATTCCA TTCAAATTTT CGCCGGCCAG 750 CGATACTCCT TTGTGCTGAA TGCCAATCAG CCCGAGGATA ACTACTGG AT 800 CCGCGCTATG CCTAACATCG GACGAAACAC CACTACCCTT GATGGCAAGA 850 ATGCCGCTAT CCTGCGATAC AAGAACGCCA GCGTTGAGGA G CCCAAAACC 900 GTCGGAGGAC CCGCGCAGAG CCCATTGAAC GAGGCCGACC TGCGACCTCT 950 GGTGCCCGCT CCTGTCCCTG GCAACGCAGT TCCTGGTGGT GCGGACATCA 1000 ACCACCGCCT GAACCTGACA TTCAGCAACG GCCTCTTCTC TATCAATAAC 1050 GCATCATTTA CAAACCCCAG CGT CCCT GCC TTGTTGCAGA TTCTTTCCGG 1100 CGCACAAAAC GCTCAGGATC TGCTTCCCAC CGGTTCTTAT ATCGGCTTGG 1150 AGTTGGGCAA GGTCGTTGAA CTCGTGATCC CTCCCTTGGC CGTTGGTGGC 1200 CCCCATCCAT TCCACTTGCA CGGCCACAAC I I I IGGGTCG TCCGAAGCGC 1250 TGGTTCTGAC GAGTATAATT TCGACGATGC AAI I I IGCGC GACGTGGTCA 1300 GCATTGGCGC GGG AACTG AC GAGGTTACTA TCCGTTTTGT CACTGATAAC 1350 CCAGGCCCTT GGTTCCTCCA TTGCCACATC GACTGGCACC TCGAAGCCGG 1400 CCTCGCCATT GTTTTCGCCG AAGGCATCAA TCAAACCGCA GCCGCCAACC 1450 CGACTCCACA GGCCTGGGAC GAACTCTGCC CCAAGTATAA CGGACTCTCC 1500 GCTTCCCAGA AAGTGAAGCC CAAGAAGGGA ACAGCCATCT AAGGCGCGCC 1550 codificadora do gene da lacase D (baseado no gene da cepa CBS 115.075) foi sintetizada pela DNA2.0 Inc. (1455 Adams Drive, Menlo Park, CA94025). O plasmídio de DNA sintético foi digerido com enzimas de restrição Spel e Ascl e o fragmento de DNA de 1,5 kb foi isolado a partir de gel e clonado no vetor pTrex4 vector, que foi também digerido com Spel e Ascl para criar o 5 plasmídio de expressão (pTrex4-lacase-Dopt). O plasmídio foi transformado de modo biolístico em uma cepa de Trichoderma. Quarenta transformantes foram transferidos para placas novas. Um total de 24 transformantes está- veis foi selecionado, incluindo micélios, e foram transferidos para 30 mL de um meio definido contendo cobre a 0,5 mM. As culturas foram cultivadas 10 durante 4 dias à temperatura de 28°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

Exemplo 13

Expressão do Gene da lacase D em Bacillus, como Fusão de BCE103, u- sando Gene Sintético de Códon Otimizado DNA (SEQ ID NO:71):

GGATCCTGAA GCTATCGGTC OGGTlTGCfcGft TTTfcCACATC GTmACAAAG

KTCTTOCfcCG TfSftCQGOCTT CMCGTCCAA QifMSWC 100

TTOCCTQQfA CftCTTftTTAC TOStmftAAA GGTGACAACT TCGWiTTAAfc ISO

CSTAjRTTMSAC! GATÇTTACAG ATSllCOSTfcT GCTTACACOS ACTTCAATTC iííó

AiTTGGCfcOSG TlTCTTTCftA RAAGGAACA© CATOSOCTOA 2SO

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TGACGTTCCT GTACATTCTG GTATCACTCA CACTTATCCA 3 SO

CAOiATfcCTG OGATGGAGTF CGCÍJGASCTT TCGTAGTTTA CGACOCAAftC 4Ô0

ΟΚΓΟΟΚΗΓΑ. ÃftOftCCffTfc OttTOTMftT SATGSTGGAA CftGTTATCAC 450

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CACCASATTC AACACTTATC AATGGATTAiQ- GACGTTCFCft AACTGGTOCT 550

GCTGAeGCAG AAjCTTSCTGT AATCTGKyrri GAACA1TAACA AAOSTTACAG 600

ATTCCGTCTT GTTAGCATTT CTTGCGATCC AAACTTCACA TTTTCiRCTTG 6 50

ACGGACATAA CATGACAGTT ArKGRMTTm ATGGTffTASA CACACGTCCA 700

CfTfcCTGTfciS- ACTCTATCCft AATCTT03Cft GGACAACGTT fcCTCATTCGT Τ5Φ

ATTAAACGCA AATCftA-CCAiS AAGATftACfA CTGGATTCO-T OCfcAtGCCAft, 900

MAT CGSAOG TÃACftCTACft At3CTTSJM35 íiCAAftAACGC AGCTftTTCTT &S-Q

CGTTACAAAA ftCGCTTCTGT TGAftGAfcDCT AAAACAGTTTG GTGGACCAGC 9QD

ACAftTCACCA CTTAAQEftAG CTGACTTACG TCCACTGGTT CCAGC&CCTG 950

TACCTOSAAA OGCTGTftCCA GGAGGTGCTG ATATTAATCA TAGACTTifyiC IOO

CTTftCTFFCT CTAACGCTCT GTTCTCAfcTC AfcCAACGCTF CATTCACAAA 1050

TCCTTCAGTT CCAGCftCrfT TACA^ATtCT TAGCGOTeCA CÁAAÁfÜCTC 3,10 Q

MaftfCfWf AOCAftCT-SQft TCiTftCftTTS ST<^,TGAAÇT GQGTiiAftSTA IlSfl

errswwrafta taattcctcc gottgctgta ggtggaccac atccittcca 1200

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TOSOPSftMS ftftTÇAATCftA ACM^mCAG CTftftCCCftAC MCTCAAGCA. 1450 TSGGftCGAaT mtEGTCCAAA .ATAiGAACGCA CTTTCTCCfcS GAGfcTACTTA 1500 JUSAGCTT ISO? codificadora do gene da lacase D (baseado no gene CBS 115.075) foi sinte- tizada pela DNA2.0 Inc. (1455 Adams Drive, Menlo Park1 CA94025). O plasmídio de DNA sintético foi digerido com enzimas de restrição BamHI e Hindlll e o fragmento de DNA de 1,5 kb foi isolado de um gel e ligado no ve- 5 tor p2JMagk103lnk2 (ver o Pedido de Patente US 2005/0202535A1), digeri- do com as mesmas duas enzimas de restrição para criar o plasmídio de ex- pressão p2JMagk103lnk2E-lacase (figura 6). O plasmídio foi transformado em uma cepa B. subtilis (degUHy32, oppA, DspollE, DaprE, DnprE, Depr, DispA, Dbpr, Dvpr, DwprA, Dmpr-ybfJ, DnprB, amyEwxyIRPxylAcomK-ermC) 10 (ver o Pedido de Patente US 2005/0202535A1). Dois transformantes foram selecionados em placas de ágar de Caldo Luria, com 5 mg/ml de cloranfeni- col, e depois, para seleção de clones com números maiores de cópia de ge- nes, colônias foram serialmente riscadas nas placas de ágar de Caldo Luria com 25 mg/ml de cloranfenicol, até um rápido crescimento da colônia ser 15 obtido. Os transformantes amplificados foram inoculados em 30 mL de um meio MBD (ver o Pedido de Patente US 2005/0202535A1) contendo cobre a

0,5 mM. As culturas foram cultivadas durante 60 horas à temperatura de 37°C. Caldos de cultura foram centrifugados e foram usados sobrenadantes para ensaio ABTS.

Exemplo 14

Branqueamento de índigo Solubilizado com Diferentes Lacases

Um ensaio para branqueamento do substrato de índigo solubili- zado pelas misturas de lacase/mediador foi executado em uma placa de mi- crotitulação de 96 poços, conforme descrito a seguir.

Uma solução saturada de corante azul em N-metilpirrolidona

(NMP) foi preparada mediante agitação do índigo (30 mg) em NMP (10 mL) à temperatura ambiente durante 5 horas. A solução de NMP foi diluída 10 vezes em uma solução de tampão aquoso, resultando em uma solução azul. Por exemplo, a diluição em um tampão 50 mM de acetato de sódio em pH 5 30 ou tampão de fosfato de sódio a 50 mM em pH 7. As soluções foram inten- samente agitadas imediatamente antes do uso.

O ensaio para o branqueamento do substrato de índigo solubili- zado foi executado em uma placa de microtitulação de 96 poços, em que cada poço recebeu a solução de índigo solúvel em um tampão de acetato de sódio a 50 mM, em um pH 5 (180 uL), lacase (10 ppm de enzima) e solução de mediator (de uma solução de estoque 20 mM, em metanol). O volume 5 total de cada poço foi ajustado para 200 uL com água deionizada. Um con- trole contendo lacase somente foi processado em duplicata. A placa foi ve- dada e incubada à temperatura de 50°C por 2 horas, sob 800 rpm, em um agitador aquecido (Thermomixer, Eppendorf). Após esse período, as placas perderam a vedação e foi adicionada uma solução de ácido ascórbico (20 uL 10 de uma solução aquosa a 10%) em cada poço, a fim de reduzir as formas oxidadas dos mediadores. O grau de branqueamento do índigo foi depois examinado mediante determinação da absorbância para cada poço em 600 nm, usando uma leitora de placa de microtitulação. Quanto menor for a leitu- ra da absorbância, maior será o grau de branqueamento do índigo.

A figura 7 apresenta os resultados para uma lacase de Thielavia

sp. (Ecostone LCC10, AB Enzymes, Darmstadt, Germany). Os mediadores usados foram ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfônico (ABTS), ácido siríngico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), siringato de metila (MS), 4-(N-metil carboxamido)-2,6-dimetoxifenol (MSA), 10-(carboxipropil)- 20 fenotiazina (PTP) e siringaldeído. As mudanças na absorbância em 600 nm relativas ao controle são relacionadas na Tabela 1, onde a maior mudança na absorbância corresponde ao maior grau de branqueamento de índigo.

Em uma concentração do mediador de 500 uM, o mediador mais efetivo para o branqueamento de índigo foi o ABTS, seguido de N- 25 metilamida (MSA) e 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA) de amida não- substituída. Na concentração mais baixa de mediador (50 mM), o ABTS foi ainda o mediador mais efetivo, com os mediadores restantes sendo mais ou menos equivalentes. A exceção foi o ácido siríngico, o qual alvejou o índigo solúvel não mais eficaz do que a condição de controle.

Tabela 1. Mudança na absorção em 600 nm, seguinte ao branqueamento de índigo solúvel, usando uma lacase Thielavia sp. e uma variedade de media- dores em concentrações a 500 e 50 uM (n = 2). Mediador Concentração a 500mM Concentração a 50mM ΔΑβοο Desv. Padrão ΔΑβοο Desv. Padrão Controle 0 0,008 0 0,010 ABTS 0,235 0,019 0,174 0,032 Ácido siríngico 0,024 0,017 0,005 0,009 SA 0,170 0,018 0,088 0,014 Siringato de metila 0,062 0,035 0,090 0,012 MSA 0,181 0,013 0,103 0,018 PTP 0,044 0,009 0,132 0,020 Siringaldeído 0,132 0,012 0,092 0,017 Exemplo 15

Ensaio de branqueamento de índigo solúvel com Iacases diferentes, com dois valores de pH

Lacases derivadas de Myceliophtora (Denilite® II, Novozymes, 5 Bagsvaerd, Dinamarca), Thielavia (Ecostone LCC10, AB Enzymes, Darms- tadt, Germany) e Cerrena sp. foram examinadas quanto as suas capacida- des em branquear índigo solubilizado, em conjunto com mediadores de peso molecular baixo, com dois valores de pH.

O branqueamento de índigo solubilizado em placas de microtitu- 10 lação com 96-poços foi realizado conforme descrito no Exemplo 14, usando 3 Iacases diferentes, com valores de pH 5 e 7. Os mediadores usados foram ácido sinapínico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), siringato de metil-4- acetila (AMS), siringato de metila (MS) e ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazo- lina-6-sulfônico (ABTS). As figuras 8 e 9 apresentam os resultados do bran- 15 queamento de índigo solúvel com valores de pH 5 e 7 usando três Iacases derivadas de Myceliophtora, Thielavia e Cerrena sp., respectivamente. Es- ses dados estão colocados nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2. Mudança na absorbância em 600 nm, relativa a um controle após branqueamento de índigo solúvel, usando Iacases de Thielavia, Myceliophto- ra e Cerrena sp. em pH 5, em uma concentração do mediador de 250 uM. Mediador Lacase Thielavia Mycelk jphtora Cerrena ΔΑβοο Desv. ΔΑ6οο Desv. ΔΑβοο Desv. Padrão Padrão Padrão Controle 1 0 0,016 0 0,010 0 0,005 Ácido sinapínico 0,068 0,019 0,157 0,020 0,240 0,007 SA 0,170 0,011 0,254 0,013 0,142 0,005 AMS 0,100 0,012 0,117 0,007 0,028 0,003 MS (AB) 0,048 0,011 0,057 0,007 0,005 0,011 MS (DeniIite) 0,050 0,013 0,061 0,007 0,043 0,013 ABTS 0,234 0,012 0,267 0,008 0,329 0,031 Controle 2 -0,007 0,017 -0,011 0,007 -0,006 0,005 Tabela 3. Mudança na absorbância em 600 nm, relativa a um controle após branqueamento de índigo solúvel, usando Iacases de Thielavia, Myceliophto- ra e Cerrena sp. em pH 7, em uma concentração do mediador de 250 uM.

Mediador Lacase Thielavia Mycelic jphtora Cerrena ΔΑβοο Desv. ΔΑβοο Desv. ΔΑβοο Desv. Padrão Padrão Padrão Controle 1 0 0,008 0 0,001 0 0,006 Ácido Sinapínico 0,112 0,015 0,204 0,020 0,257 0,005 SA 0,162 0,006 0,220 0,009 0,128 0,010 AMS 0,087 0,006 0,078 0,005 0,077 0,007 MS (AB) 0,053 0,010 0,076 0,006 0,000 0,006 MS (DeniIite) 0,069 0,017 0,086 0,001 0,008 0,018 ABTS 0,145 0,006 0,155 0,014 0,215 0,056 Controle 2 0,007 0,006 -0,004 0,001 0 0,005 Exemplo 16

Purificação e Determinação de Atividade Específica

O gene D otimizado de lacase (SEQ ID No.70) foi expresso u- sando o sistema de expressão descrito no Pedido de Patente copendente US 60/984.430 (documento No. GC993P, intitulado "Signal Sequences e co- expressed chaperones for improved heterologous protein production in a host cell" depositado em 01 de Novembro de 2007), em dispositivos fermen- tadores de 14 litros. O caldo de fermentação foi colhido em 184 horas e con- centrado mediante uItrafiItração (UFC 20070245). O concentrado foi filtrado 5 por diálise em um tampão de acetato de sódio a, 25mM, com pH 4,0. De- pois, 500 mL da amostra de UFC filtrada por diálise foram introduzidos em uma coluna trocadora de íons contendo resina Poros HS-20 (Applied Biosys- tems, coluna de 20 x 275mm), neutralizada com tampão de acetato de sódio, 25mM, pH 4,0. A coluna foi lavada com um volume de 10 colunas, com tam- 10 pão de acetato de sódio 25 mM, pH 4,0. A proteína D de lacase foi eluída da coluna usando um gradiente de sal (volume de 12 colunas) de cloreto de sódio a 40 mM até 80 mM em tampão de acetato de sódio, pH 4,0. As fra- ções contendo atividade de lacase foram agrupadas e posteriormente con- centradas usando uma célula de agitação Amicon, de 400mL, com uma 15 membrana 10K. A proteína total foi medida por gel de proteína de SDS, u- sando BSA como padrão 4mg/ml (>90% de pureza). A amostra de lacase foi diluída 10.000 vezes com água e armazenada à temperatura ambiente du- rante 18 horas, depois sob temperatura de 4°C por mais de 24 horas. A ati- vidade de ABTS foi medida como 8570 unidades/mL. A atividade específica 20 da lacase D recombinante é depois calculada mediante divisão das 8570 unidades/mL por 4 mg/mL, resultando em 2140 unidades/mg de proteína, o que é 100 vezes maior que a atividade da lacase de Stachybotrys (16 u/mg), ver Mander et al, Appl. Environ. MicrobioL (2006) 72:5020-5026). Assim, es- sa enzima resulta em uma menor descarga de cobre no ambiente, em rela- 25 ção às outras lacases, por exemplo, a lacase Stachybotrys, em virtude da alta atividade específica.

Exemplo 17

Processo para branqueamento de tecido de algodão Mediadores

4-hidróxi-3,5-dimetoxibenzamida (siringamida, SA) foi adquirida

da Punjab Chemicals & Crop Protection Limited (Mumbai, índia). 4-hidróxi- 3,5-dimetoxibenzonitrila (siringonitrila, SN) foi adquirida da StereoChemicaI1 Inc., (Newark, Dinamarca) ou da Punjab Chemicals & Crop Protection Limi- ted (Mumbai, índia).

Enzima

Enzima Lacase, derivada da Cerrena unicolor (Exemplo 16, 8570 U/ml, 4 mg de proteína/mL) foi utilizada nos experimentos. Procedimento

As incubações de enzima foram feitas em um dispositivo ATLAS LP 2, Lavador-Medidor de O, em diferentes condições com relação ao pH, temperatura, concentração da enzima e concentração do mediador.

As reações foram realizadas em vasos de aço inoxidável de 500

mL, contendo 100 mL de líquido. Em cada vaso, cinco amostras de tecido de algodão (7x7 cm) lavados com meios de descoloração (tecido de algodão ACG, estilo 80270) e 6 bilhas de aço de 6 mm de diâmetro foram adiciona- dos. Os vasos das reações foram fechados e introduzidos no dispositivo Ia-

vador-medidor de O, o qual foi previamente aquecido na desejada tempera- tura. A incubação foi realizada durante 30 minutos, após o que as amostras foram lavadas com água corrente, secas por rotação em uma centrífuga AEG IPX4 e secas com um ferro-prensa Elna em programa de algodão e avaliadas.

Lavagem com Meios de Descoloração de Tecido de Algodão

Tecido de algodão, de 12 filamentos, pesando aproximadamente

3 kg, foi desengomado em uma máquina de lavar Unimac UF 50, sob as se- guintes condições:

• Desengomagem por 15 minutos, em uma proporção de licor de

10:1, à temperatura de 50°C com 0,5 g/L (15 g) de amilase Optisize 160

(Genencor) e 0,5 g/L (15 g) de um tensoativo não-iônico (por exemplo, Ru- cogen BFA, (Rudolf Chemie) ou Ultravon GPN, (Huntsman));

• 2 lavagens a frio por 5 minutos, em uma proporção de 30:1 de

licor.

Após a desengomagem, o tecido de algodão foi lavado com

meios de descoloração em uma máquina de lavar Unimac UF 50, sob as seguintes condições: • lavagem a frio por 5 minutos, com uma proporção de 10:1 de

licor;

• lavagem com meios de descoloração por 60 minutos, em uma proporção de licor de 10:1, sob temperatura de 55°C, com 1 kg de pedra

pome, tampão de citrato (30 g de citrato trissódico desidratado, e 30 g de ácido cítrico monoidratado) e 35 g de IndiAge 2XL cellulase (Genencor).

• 2 enxagues frios durante 5 minutos, na proporção de 30:1 de

licor.

O tecido de algodão foi seco em um secador de tecido domésti- co, modelo Miele Novotronic T494C. A partir dos filamentos de tecido de al- godão, foram cortadas amostras de 7 x 7 cm.

Avaliação das Amostras do Tecido de Algodão

A cor de cinco amostras de tecido de algodão é medida com um Minolta Chromameter CR 310, no espaço de cor do Laboratório CIE, com 15 uma fonte de Iuz D 65. As medições foram feitas antes e depois do trata- mento da lacase, e os resultados das cinco amostras foram avaliados. A di- ferença de cor total (TCD) é calculada. A diferença de cor total pode ser cal- culada com a fórmula:

TCD = λ/ (AL)2 + (Aa)2 + (Ab)2.

Avaliação dos Filamentos do Tecido de Algodão

Os filamentos de tecido de algodão foram avaliados com um Mi- nolta Chromameter CR 310, no espaço de cor do Laboratório CIE, com uma fonte de Iuz D 65. As medições foram feitas somente depois do tratamento da lacase. Para cada tecido de algodão, são tomadas medições de 8 fila- 25 mentos, e o resultado de 12 filamentos (96 medições) foi aferido. A diferença de cor total (ΔΕ) é calculada a partir da diferença entre os valores inicial e final de CIE L*a*b*, de acordo com a fórmula:

ΔΕ = (AL2 + Aa2 + Ab2)1'2 Exemplo 18 - Efeito da temperatura na performance de branqueamento de lacase D recombinante (Unimac)

Branqueamento por lacase de tecido de algodão lavado com meios de descoloração: Tecido de algodão: 12 filamentos com aproximada- mente 3 kg, foi desengomado e lavado com meios de descoloração, confor- me descrito no Exemplo 17. Após lavagem com meios de descoloração, foi realizado um tratamento de lacase em uma máquina de lavar Unimac UF 50, de acordo com o seguinte processo:

· 30 minutos na proporção de 10:1 de licor,

• pH 6 (21 g de fosfato monossódico e 5 g de ácido adípico, la- case D) ou pH 4,8 (8,6 g de fosfato monossódico e 16,8 g de ácido adípico, Lacase Novoprime, Base 268)

• lacase (lacase D or Novoprime Base 268)

· mediador (siringamida (SA) e siringonitrila (SN))

• Após o uso do tratamento de lacase, o tecido de algodão foi enxaguado duas vezes em água fria durante 5 minutos, na proporção de 30:1 de licor.

As experiências de lacase foram realizadas e os resultados são apresentados nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4

Concentração de Mediador Concentração Temperatura Nível de branquea¬ Laccase D de mediador (0C) mento (CIE L) 0,05 g/l / 0,4 U/ml SA 0,33 mM 60 35,6 0,05 g/l / 0,4 U/ml SN 0,47 mM 60 35,9 0,05 g/l / 0,4 U/ml SA 0,33 mM 40 35,6 0,05 g/l / 0,4 U/ml SN 0,47 mM 40 35,7 Tabela 5

Concentração de Concentração de Temperatura Nível de branqueamento Novoprime base 268 mediador (0C) (CIE L) 0,05 g/l 0,023g/l 60 35,9 0,05 g/l 0,023g/l 40 33,7 A lacase D recombinante apresenta um melhor desempenho em temperaturas mais baixas dos que as Iacases comerciais disponíveis atual- mente. A lacase D (na presença do mediador) proporciona um efeito de branqueamento em temperaturas abaixo de 60°C, preferivelmente entre 40°C e 60°C. Assim, a lacase pode proporcionar um benefício de energia para o processador de tecido.

Exemplo 19 - Efeito da enzima de lacase recombinante e con- centração de mediador na performance de branqueamento (Lavadora- Medidora de O)

O efeito da lacase e da concentração de mediador foi avaliado realizando as experiências mostradas na tabela abaixo, em um pH de 6,0 (tampão de fosfato monossódico a 50 mM, pH ajustado com solução de hi- dróxido de sódio a 4N) e sob temperatura de 60°C.

As experiências foram realizadas com mediador de siringamida

(SA) e siringonitrila (SN).

100 mL de tampão foram adicionados a um béquer com cinco amostras, 7x7 cm. Peso total de 12 g, (tecido de algodão:proporção de licor = 1:8). A lacase e concentrações dos mediadores foram usadas conforme indicado nas tabelas abaixo.

Tabela 6

Concentração de enzima de lacase Correspondência de Atividade (unidade (μΐ/ΐ) de lacase I g de tecido de algodão) 0,67 33 2,17 55 3,67 78 5,17 100 6,67 Tabela 7

Concentração de mediador (mM)

_O1IO_

_033_

_055_

_0J8_

_IiOO_

As quantidades de mediador siringamida ou mediador siringoni- trila, conforme indicado nas tabelas abaixo, foram adicionadas a cada bé- quer com uma diluição de SA de 275 mM - ou solução de matéria-prima SN em metanol a 98 %. A lacase foi adicionada a cada béquer, conforme indi- cado nas tabelas abaixo, com diluição de uma solução de matéria-prima de 5 lacase de 400 unidades/ml. Os béqueres foram fechados e processados a 60°C, conforme descrito no Exemplo 17. As amostras foram avaliadas con- forme descrito no Exemplo 17.

Tabela 8

LACASE + SA a 60°C, pH 6 Lacase (μL/L) Mediadora siringamida (mM) TCD 100 1,00 5,6 100 1,00 6,0 100 0,10 2,9 78 0,33 4,4 55 1,00 6,2 55 0,55 5,3 33 0,78 5,5 33 0,33 4,6 10 1,00 3,2 10 0,10 2,5 55 0,55 5,8 100 0,55 5,3 78 0,78 5,9 100 0,10 3,2 55 0,10 3,1 10 0,55 3,6 TCD = = Diferença de Cor Total Tabela 9

LACASE + SN a 60°C pH 6 Lacase (uM) Mediadora siringonitrila (mM) TCD 100 1,00 7,6 100 1,00 8,1 100 0,10 4,1 78 0,33 5,6 55 1,00 7,0 55 0,55 6,0 33 0,78 5,5 33 0,33 4,4 10 1,00 3,8 10 0,10 2,7 55 0,55 6,3 100 0,55 7,1 78 0,78 7,1 100 0,10 4,0 55 0,10 3,5 10 0,55 3,4 TCD = diferença de cor total

As Tabelas acima e as figuras 10 e 11 demonstram que há ne- cessidade de se ter ambos os elementos, isto é, a enzima e o mediador, pa- ra se obter o branqueamento. Também demonstra que existe alguma flexibi- lidade na proporção de enzima / mediador para alcançar um determinado nível de branqueamento.

Exemplo 20

Efeito da Resposta de Dose de Lacase D Recombinante sobre a Performan- ce de Branqueamento (Unimac)

Branqueamento por lacase de tecido de algodão lavado com meios de descoloração - Tecido de algodão, 12 filamentos, pesando aproxi- madamente 3 kg, foi desengomado e lavado com meios de descoloração, conforme descrito no Exemplo 17. Após lavagem com meios de descolora- ção, foi realizado um tratamento de lacase de acordo com o seguinte pro- cesso: 30 minutos na proporção de 10:1 de licor e pH 6 (21 g de fosfato monos- sódico e 5 g de ácido adípico) e sob temperatura de 60 0C com lacase e media- 5 dor. Após o tratamento com uso de lacase, o tecido de algodão foi enxaguado duas vezes em água fria durante 5 minutos, na proporção de 30:1 de licor.

As seguintes experiências foram realizadas. • Siringamida 0,33mM:

Concentração de lacase Cerrena unicolor Nível de Branqueamento (CIE L) (g/L) 0,010 34,6 0,05 36,2 0,25 36,2 Siringonitrila 0,39 mM:

Concentração de Lacase D (g/L) Nível de Branqueamento (CIE L) 0,25 37,7 0,4 39,5 0,53 38,8 Os resultados são apresentados nas tabelas acima. Isso de-

monstra que com a lacase D recombinante e a amida mediadora o nível de branqueamento é achatado rapidamente. Com uma concentração de enzima de 0,05 e 0,25, o mesmo nível de branqueamento é obtido. Para a lacase D recombinante e a nitrila mediadora, o nível de branqueamento aumenta até 0,4 g/L, o que parece ser o ideal.

Deve ser entendido que os exemplos e as modalidades aqui descri- tas têm apenas finalidade ilustrativa e que diversas modificações ou alterações à Iuz das mesmas serão sugeridas aos versados na técnica e deverão ser incluí- das no espírito, no texto desse pedido de patente e no escopo das reivindicações 20 anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui menciona- dos, são integralmente incorporados por essas referências.

Claims

1. Lacase, selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS.2,4, 6, 8, 10 , 12, 14, 16, 18 e uma lacase tendo uma identidade de pelo me- nos 90% com quaisquer das SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18.

2. Seqüência de ácido nucleico codificadora de uma lacase, em que a dita lacase é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS. 2 , 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e uma lacase tendo uma identidade de pelo menos 90% com quaisquer das SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18.

3. Sequencia de ácido nucleico codificadora de uma lacase, em que a dita lacase é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS. 1, 3,5, 7 , 9, 11, 13, 15 e 17.

4. Vetor de expressão, compreendendo uma seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 2.

5. Vetor de expressão, compreendendo uma seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 3.

6. Célula hospedeira, compreendendo um vetor como definida na reivindicação 4.

7. Célula hospedeira, compreendendo um vetor como definido na reivindicação 5.

8. Processo para branqueamento de corantes em uma solução, cujo processo compreende o tratamento dos corantes na solução com uma lacase como definida na reivindicação 1, e um efetivo mediador.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, no qual o media- dor é selecionado do grupo que consiste em acetossringona, siringaldeído, siringamida, metil siringamida, 2-hidroxietil siringamida, siringato de metila, siringonitrila, dimetilsiringamida, e ácido siríngico.

10. Processo para branqueamento de tecido mediante uso de lacases, em que a melhoria compreende a utilização de uma lacase como definida na reivindicação 1.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, compreendendo ainda um mediador selecionado do grupo que consiste em acetossringona, si- ringaldeído, siringamida, metil siringamida, 2-hidroxietil siringamida, siringato de metila, siringonitrila, dimetilsiringamida, e ácido siríngico.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 10, em que o teci- do é tingido com um corante vat.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 10, em que o teci- do é um tecido celulósico, uma mistura de fibras celulósicas ou uma mistura de fibras celulósicas e fibras sintéticas.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 10, em que o teci- do é um tecido de algodão.