BRPI0721285A2 - Mediadores de lacase e métodos de uso - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEDIADO- RES DE LACASE E MÉTODOS DE USO".

Referência Cruzada Com Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido de Paten- 5 te Provisório N0 de Série U.S. 60/875.518, designado "Novel Laccases, Compositions and Methods of Use", depositado em 18 de Dezembro de 2006 e Pedido de Patente Provisório N0 de Série U.S. 60/875.454, designa- do "Laccase Mediators and Methods of Use", depositado em 18 de Dezem- bro de 2006.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a mediadores de Iacase hidroliti- camente estáveis e a métodos enzimáticos para materiais de alvejamento. Antecedente da Invenção

Lacases são enzimas que contém cobre que são conhecidas 15 serem ótimos agentes oxidantes na presença de oxigênio. Lacases são en- contradas em micróbios, fungos e organismos superiores. As enzimas Iaca- se são usadas em muitas aplicações, que incluem alvejamento de polpa e tecidos, tratamento de resíduo de polpa, descoloração, remoção industrial de cor, detergentes para alvejamento de roupas, branqueadores dentais para 20 higiene oral e como catalisadoras e facilitadoras para reações de polimeriza- ção e oxidação.

Lacases podem ser utilizadas em uma grande variedade de apli- cações em várias indústrias, incluindo a indústria de detergente, a indústria de papel e polpa, a indústria têxtil e a indústria alimentícia. Em uma aplica- 25 ção, enzimas que oxidam o fenol são usadas como um auxiliar na remoção de manchas, tais como manchas de alimentos, de roupas durante a lavagem com detergente.

A maioria das Iacases exibe pH ótimo na faixa de pH ácido embora sejam inativas em pHs neutro ou alcalino.

Lacases são conhecidas por serem produzidas por uma grande

variedade de fungos, incluindo espécies dos gêneros AspergiUus, Neurospo- ra, Podospora, Botrytis, Pleurotus, Fornes, Phlebia, Trametes, Polyporus, Stachybotrys, Rhizoctonia, Bipolaris, Curvularia, Amerosporium e Lentinus. Entretanto, permanece uma necessidade por Iacases que têm perfis de de- sempenho diferentes em várias aplicações.

Para muitas aplicações, a eficiência de oxidação de uma Iacase 5 pode ser melhorada através do uso de um agente mediador, também conhe- cido como agente intensificador. Sistemas que incluem uma Iacase e um mediador são conhecidos na técnica como sistemas lacase-mediador (LMS). Os mesmos compostos também podem ser usados para ativar ou iniciar a ação de lacase.

Existem vários mediadores conhecidos para uso em um sistema

lacase-mediador. Esses incluem HBT (1-hidroxibenzotriazol), ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfínico)], NHA (N-hidroxiacetanilida), NEIAA (N-acetil-N-fenilhidroxilamina), HBTO (3-hidróxi-1,2,3-benzotriazin- 4(3H)-ona) e VIO (ácido violúrico). Além disso, existem vários compostos 15 que contém NH-OH ou N-O que têm sido encontrados serem úteis como mediadores.

Grupos funcionais e substituintes têm grandes efeitos sobre a eficiência do mediador. Até dentro da mesma classe de compostos um subs- tituinte pode alterar a especificidade da lacase frente ao substrato, dessa 20 forma aumentando ou diminuindo grandemente a eficiência do mediador. Além disso, um mediador pode ser eficiente para uma aplicação em particu- lar, mas inadequado para outra aplicação. Outra desvantagem dos mediado- res atuais e sua tendência a polimerizar durante o uso. Assim, há uma ne- cessidade de descobrir mediadores eficientes para aplicações específicas. 25 Uma de tais aplicações é o alvejamento de tecidos, em que é importante que os mediadores não sejam desnecessariamente caros e perigosos. Outras aplicações para o sistema lacase-mediador são dadas abaixo.

Assim, há uma necessidade de identificar mediadores adicionais que ativem a lacase e/ou intensifiquem a atividade de enzimas que exibam atividade de lacase.

Sumário da Invenção

Aqui são descritos novos mediadores de lacase, incluindo deri- vados de 4-carboxamido e 4-ciano de 2,6-dimetoxifenol que exibem estabili- dade melhorada e bom desempenho de alvejamento.

Em uma modalidade as novas enzimas lacase são empregadas em conjunto com derivados 4-substituídos de 2,6-dimetoxifenol dessa inven- ção para fornecer um método aperfeiçoado para o alvejamento de tecidos de brim.

Descrição Resumida das Figuras

Figura 1 é um esquema do plasmídeo de expressão em Bacillus (p2JMagk1031nk2E-lacase) para o códon otimizado do gene D de lacase fundido com o gene que codifica BCE103 usado no Exemplo 1.

Figura 2 é um gráfico de barras que mostra os resultados do al- vejamento de índigo solúvel usando uma lacase de Thielavia sp. e uma vari- edade de mediadores em concentrações de 50 e 500 uM.

Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os resultados do al- vejamento de índigo solúvel usando uma lacase de Thielavia, Myceliophtho- ra e Cerrena sp e uma variedade de mediadores em pH 5.

Figura 4 é um gráfico de barras que mostra os resultados do al- vejamento de índigo solúvel usando uma lacase de Thielavia, Myceliophtho- ra e Cerrena sp e uma variedade de mediadores em pH 7.

Figura 5 é um gráfico de barras que mostra a diferença total de

cor (E) de retalhos de brim (lado direito) tratadas com lacase de C. unicolor (20 ppm) e 3 mediadores em várias concentrações.

Figura 6 é um gráfico de barras que mostra a diferença total de cor (E) de retalhos de brim (lado do avesso) tratadas com lacase de C. uni- color (20 ppm) e 3 mediadores em várias concentrações.

Figura 7 é um gráfico de barras que mostra as diferenças totais de cor de discos de brim branqueados (lado direito) como uma função de combinações lacase/mediador usando lacase D de C. unicolor.

Figura 8 é um gráfico de barras que mostra as diferenças totais de cor de discos de brim branqueados (lado do avesso) como uma função de combinações lacase/mediador usando lacase D de C. unicolor.

Figura 9 é um gráfico da diferença total de cor para a lacase D recombinante e o mediador siringamida como uma função da concentração do mediador e da concentração da enzima a 60°C e pH 6.

Figura 10 é um gráfico da diferença total de cor para a lacase D recombinante e o mediador siringonitrila como uma função da concentração do mediador e da concentração da enzima a 60°C e pH 6.

Descrição Detalhada da Invenção

Todos os termos técnicos e científicos usados aqui, a menos que definidos aqui de outra maneira, têm o mesmo significado como comu- mente compreendidos por aquele versado na técnica a qual essa invenção 10 pertence. Singleton1 et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLE- CULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, New York (1994) e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Pe- rennial, N.Y. (1991) suprem o perito com um dicionário geral de muitos dos termos usados nessa invenção. Embora quaisquer métodos ou materiais 15 similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prá- tica ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos estão descritos. Faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. Deve ser compreendido que essa invenção não é limitada à metodologia, protoco- los e reagentes particulares descritos, já que esses podem variar.

Os tópicos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspec-

tos ou modalidades da invenção que podem ser tidos pela referência à es- pecificação como um todo.

Todas as publicações citadas aqui estão expressamente incor- poradas aqui por referência com o propósito de descrever e divulgar compo- sições e metodologias que poderão ser usadas em conexão com a invenção.

I. Lacase e Enzimas Relacionadas à Lacase

No contexto dessa invenção, Iacases e enzimas relacionadas à lacase contemplam qualquer enzima lacase compreendida pela classificação de enzima (EC 1.10.3.2). As enzimas lacase são conhecidas a partir da ori- 30 gem microbiana e de planta. A enzima lacase microbiana pode ser derivada de bactérias ou fungos (incluindo fungos filamentosos e leveduras) e exem- plos adequados incluem uma lacase derivável de uma cepa de Aspergillus, Neurospora, por exemplo, N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Cerrena, Stachybotrys, Panus, por exemplo, Panus rudis, Theilava, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, por exemplo, T. villosa e T. versicolor, Rhizoctonia, por exemplo, R. solani, Coprinus, por exemplo, C. plicatilis e C. cinereus, Psat- 5 yrella, Myceliophthrora, por exemplo, M. thermonhila, Schytalidum, Phlebia, por exemplo, P. radita (WO 92/01046), ou Coriolus, e.g. C. hirsutus (JP 2— 238885), Spongipellis sp. Polyporus, Ceriporiopsis subvermispora, Gano- derma tsunodae e Trichoderma.

A lacase ou a enzima relacionada à lacase pode adicionalmente 10 ser produzida por um método que compreende cultivar uma célula hospedei- ra transformada com um vetor de DNA recombinante que carrega uma se- qüência de DNA que codifica a dita lacase assim como seqüências de DNA que permitem a expressão da seqüência da DNA que codifica a lacase, em um meio de cultura sob condições que permitem a expressão da enzima Ia- 15 case e recuperar a lacase da cultura.

O vetor de expressão pode ser transformado em uma célula hospedeira adequada, tal como uma célula fúngica, cujos exemplos preferi- dos são espécies de Aspergillus, o mais preferivelmente Aspergillus oryzae e Aspergillus niger e espécies de Fusarium, o mais preferivelmente Fusarium 20 venenatum. Células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto e transformação dos protoplastos seguida pela regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por si mes- ma. O uso de Aspergillus como um microrganismo hospedeiro está descrito em EP 238.023. O uso de Fusarium como um microrganismo hospedeiro 25 está descrito em WO 96/00787 e WO 97/08325.

Alternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma bacté- ria, em particular cepas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces ou E.coli. A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, como descrito em T. Maniatis et al., 30 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982. O ras- treamento apropriado de seqüências de DNA e construção de vetores tam- bém podem ser realizados por procedimentos padronizados, cf. T. Maniatis et al., op. cit.

O meio usado para cultivar as células hospedeiras transforma- das pode ser qualquer meio convencional adequado para o crescimento da célula hospedeira em questão. A enzima expressa pode ser conveniente- 5 mente secretada no meio de cultura e pode ser recuperada a partir dele por procedimentos bem conhecidos que incluem separar as células do meio de cultura pela centrifugação ou filtração, precipitação de componentes protei- náceos do meio através de um sal tal como sulfato de amônia, seguida por procedimentos cromatográficos tais como cromatografia por troca de íon, 10 cromatografia de afinidade ou similares.

Em uma modalidade, o hospedeiro de expressão pode ser um Trichoderma reesei com a região codificante de lacase sob o controle de um promotor e terminador CBH1. (Veja, por exemplo, Patente U.S. N0 5.861.271). O vetor de expressão pode ser pTrex3g, como descrito no Pedi- 15 do de Patente U.S. N0 11/245.628 depositado em 07 de Outubro de 2005 (Protocolo N0 GC886).

Dessa maneira, os seguintes novos genes e Iacases foram pre- parados:

A. Gene de lacase D1 de Cerrena da cepa CBS154.29 (SEQ ID N0 13)

20

25

30

GATTCTAATA GACCAGGCAT ACCAAGAGAT CTACAGGTTG ACAGACCATT 50 CTTCTAGGCG GCATTTATGC TGTAGCGTCA GAAATTATCT CTCCATTTGT 100 ATCCCACAGG TCCTGTAATA ACACGGAGAC AGTCCAAACT GGGATGCCTT 150 TTTTCTCAAC TATGGGCGCA CATAGTCTGG ACGATGGTAT ATAAGACGAT 200 GGTATGAGAC CCATGAAGTC AGAACACTTT TGCTCTCTGA CATTTCATGG 250 TTCACACTCT CGAGATGGGA TTGAACTCGG CTATTACATC GCTTGCTATC 300 TTAGCTCTGT CAGTCGGAAG CTATGCTGCA ATTGGGCCCG TGGCCGACAT 350 ACACATTGTC AACAAAGACC TTGCTCCAGA TGGCGTACAA CGTCCAACCG 400 TGCTTGCCGG AGGCACTTTT CCTGGGACGT TGATCACCGG T CAGAAAG TA 450 AGGGATATTA GTTTGCGTCA AAGAGCCAAC CAAAACTAAC CGTCCCGTAC 500 TATAGGGTGA CAACTTCCAG CTCAATGTCA TCGATGATCT TACCGACGAT 550 CGGATGTTGA CGCCAACTTC CATTGTGAGC CTATTATTGT ATGATTTATC 600 CGAATAGTTT CGCAGTCTGA TCATTGGATC TCTATCGCTA GCATTGGCAC 650 GGTTTCTTCC AGAAGGGAAC CGCTTGGGCC GACGGTCCCG CCTTCGTAAC 700

TCAGTGCCCT ATAATAGCAG ATAACTCTTT TCTGTATGAC TTCGACGTCC 750

CAGACCAAGC TGGTACTTTC TGGTATCATA GTCATCTATC CACTCAGTAC 800

TGTGACGGTT TACGTGGTGC CTTCGTTGTG TACGATCCTA ACGATCCTCA 850

5 CAAAGACCTA TACGATGTTG ATGACGGTGG GTTCCAAATA TTTGTTCTGC 900

AGACATTGTA TTGACGGTGT TCATTATAAT TTCAGAGAGC ACCGTGATTA 950

CCCTTGCGGA TTGGTACCAT GTTCTCGCCC AGACCGTTGT CGGCGCTGCG 1000

TGAGTAACAC ATACACGCGC TCCGGCACAC TGATACTAAT TTTTTTTTAT 1050

TGTAGCACTC CTGATTCTAC CTTGATCAAC GGGTTAGGCC GTTCACAGAC 1100

CGGACCCGCT GATGCTGAGC TGGCTGTTAT CAGCGTTGAA CATAACAAAC 1150

GGTATGTCAT CTCTACCCAG TATCTTCTCT CCTGCTCTAA TTCGCTGTTT 1200

CACCATAGAT ACCGTTTCCG TTTGGTTTCG ATTTCGTGCG ACCCCAACTT 1250

TACCTTCTCC GTTGATGGTC ATAATATGAC TGTCATCGAA GTCGATGGTG 1300

TCAACACACG ACCCCTGACC GTTGACTCTA TTCAAATCTT CGCCGGACAG 1350

AGGTATTCCT TTGTCGTAAG TTAATCGATA TATTCTCCTT ATTACCCCTG 1400

TGTAATTGAT GTCAATAGCT CAATGCTAAC CAACCCGAAG ACAATTACTG 14 50

GATCCGTGCT ATGCCAAACA TCGGTAGAAA TACAACAACA CTGGACGGAA 1500

AGAATGCCGC TATCCTTCGA TACAAGAATG CTTCTGTAGA AGAGCCCAAG 1550

ACCGTTGGGG GCCCCGCTCA ATCCCCGTTG AATGAAGCGG ACCTGCGTCC 1600

ACTCGTACCT GCTCCTGTGG TATGTCTTGT CGCGCTGTTC CATCGCTATT 1650

TCATATTAAC GTTTTGTTTT TGTCAAGCCT GGAAACGCTG TTCCAGGTGG 1700

CGCAGACATC AATCACAGGC TTAACTTAAC TTTCGTACGT ACACCTGGTT 1750

GAAACATTAT ATTTCCAGTC TAACCTCTCT TGTAGAGTAA CGGCCTCTTC 1800

AGCATCAACA ACGCCTCCTT CACTaATCCT TCGGTCCCCG CCTTATTACA 1850

AATTCTGAGC GGTGCTCAGA ACGCTCAAGA TTTACTTCCA ACGGGTAGTT 1900

ACATTGGCCT TGAACTAGGC AAGGTTGTGG AGCTCGTTAT ACCTCCTCTG 1950

GCAGTTGGAG GACCGCACCC TTTCCATCTT CATGGCGTAA GCATACCACA 2000

CTCCCGCAGC CAGAATGACG CAAACTAATC ATGATATGCA GCACAATTTC 2 050

TGGGTCGTCC GTAGTGCAGG TAGCGATGAG TATAACTTTG ACGATGCTAT 2100

CCTCAGGGAC GTCGTRAGCA TTGGAGCGGG GACTGATGAA GTCACAATCC 2150

GTTTCGTGGT ATGTCTCACC CCTCGCATTT TGAGACGCAA GAGCTGATAT 2200

ATTTTAACAT AGACCGACAA TCCGGGCCCG TGGTTCCTCC ATTGCCATAT 2250 TGATTGGCAT TTGGAGGCAG GCCTTGCCAT CGTCTTCGCT GAGGGCATCA 2300 ATCAGACCGC TGCAGCCAAC CCAACACCCC GTACGTGACA CTGAGGGTTT 2350 CTTTATAGTG CTGGATTACT GAATCGAGAT TTCTCCACAG AAGCATGGGA 2400 TGAGCTTTGC CCCAAATATA ACGGGTTGAG TGCGAGCCAG AAGGTCAAGC 2450 CTAAGAAAGG AACTGCTATT TAAACGTGGT CCTAGACTAC GGGCATATAA 2500 GTATTCGGGT AGCGCGTGTG AGCAATGTTC CGATACACGT AGATTCATCA 2550 CCGGACACGC TGGGACAATT TGTGTATAAT GGCTAGTAAC GTATCTGAGT 2600 TCTGGTGTGT AGTTCAAAGA GACAGCCCTT CCTGAGACAG CCCTTCCTGA 2650 GACAGCCCTT CCTGAGACGT GACCTCCGTA GTCTGCACAC GATACTYCTA 2700 AATACGTATG GCAAGATGAC AAAGAGGAGG ATGTGAGTTA CTACGAACAG 2750 AAATAGTGCC CGGCCTCGGA GAGATGTTCT TGAATATGGG ACTGGGACCA 2800 ACATCCGGA 2809 que codifica a enzima lacase D1, que tem a seqüência de proteína traduzida (SEQ ID N0 14)

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50 TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100 AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFVVYDP 150 NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200 PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VIEVDGVNTR 250 PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPEDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300 LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350 NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400 VVELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWVVRSA GSDEYNFDDA ILRDVVSIGA 450 GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500 AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526 B. Gene de lacase D2 de Cerrena da cepa CBS115.075 (SEQ ID N0 15)

GATCTGGACG ATGGTATATA AGACGATGGT ATGAGACCCA TGAAGTCTGA 50

ACACTTTTGC TCTCTGACAT TTCATGGTTC ATACTCTCGA GATGGGATTG 100

AACTCGGCTA TTACATCGCT TGCTATCTTA GCTCTGTCAG TCGGAAGCTA 150

TGCTGCAATT GGGCCCGTGG CCGACATACA CATTGTCAAC AAAGACCTTG 200

CTCCAGATGG TGTACAACGT CCAACCGTGC TCGCCGGAGG CACTTTTCCT 250

GGGACGTTGA TCACCGGTCA GAAAGTAAGG AATATTAGTT TGCGTCAAAG 300 AGCCAACCAA AATTAACCGT CCCGTCCCAT AGGGTGACAA CTTCCAGCTC 350

AATGTCATTG ATGATCTTAC CGACGATCGG ATGTTGACAC CAACTTCCAT 4 00

TGTGAGCCTA TTATTGTATG ATTTATCCGT ATAGTTTCTC AGTCTGATCA 4 50

TTGGCTCTCT ATCGCTAGCA TTGGCACGGT TTCTTCCAGA AGGGAACCGC 500

5 TTGGGCCGAC GGTCCCGCCT TCGTAACTCA GTGCCCTATA ATAGCAGATA 550

ACTCTTTTCT GTATGACTTC GACGTCCCCG ACCAAGCTGG TACTTTCTGG 600

TATCATAGTC ATCTATCCAC TCAGTACTGT GACGGTTTAC GTGGTGCCTT 650

CGTTGTGTAC GATCCTAACG ATCCTCACAA AGACCTATAC GATGTTGATG 7 00

ACGGTGGGTT CCAAATACTT GACCAAGAAA CATTATATTG ATAGTATCCA 7 50

CTCTGATTTT CAGAGAGCAC CGTGATTACC CTTGCGGATT GGTACCATGT 8 00

TCTCGCCCAG ACCGTTGTCG GCGCTGCGTG AGTAACACAT ACACGCGCTC 850

CGGCACACTG ATACTAATTT TTTATTGTAG CACTCCTGAT TCTACCTTGA 900

TCAACGGGTT AGGCCGTTCA CAGACCGGAC CCGCTGATGC TGAGCTGGCT 950

GTTATCAGCG TTGAACATAA CAAACGGTAT GTCATCTCTA CCCATTATCT 1000

TCTCTCCTGC TTTAATTCGC TGTTTCACCA TAGATACCGA TTCCGTTTGG 1050

TTTCGATTTC GTGCGACCCC AACTTTACCT TCTCCGTTGA TGGTCATAAT 1100

ATGACTGTCA TCGAAGTCGA CGGTGTCAAC ACACGACCCC TGACCGTTGA 1150

CTCTATTCAA ATCTTCGCCG GACAGAGGTA TTCCTTTGTC GTAAGTTAAT 1200

CGATATATTC TCCCTATTAC CCCTGTGTAA TTGATGTCAA CAGCTCAATG 12 50

CTAACCAACC CGACGACAAT TACTGGATCC GTGCTATGCC AAACATCGGT 1300

AGAAATACAA CAACACTGGA CGGAAAGAAT GCCGCTATCC TTCGATACAA 1350

GAATGCTTCT GTAGAAGAGC CCAAGACCGT TGGGGGCCCC GCTCAATCCC 14 00

CGTTGAATGA AGCGGACCTG CGTCCACTCG TACCTGCTCC TGTGGTATGT 1450

CTTGTCGTGC TGTTCCATCG CTATTTCATA TTAACGTTTT GTTTTTGTCA 1500

AGCCTGGAAA CGCTGTTCCA GGTGGCGCAG ACATCAATCA CAGGCTTAAC 1550

TTAACTTTCG TACGTACACC TGGTTGAAAC ATTATATTTC CAGTCTAACC 1600

TCTTGTAGAG TAACGGCCTT TTCAGCATCA ACAACGCCTC CTTCACTAAT 1650

CCTTCGGTCC CCGCCTTATT ACAAATTCTG AGCGGTGCTC AGAACGCTCA 17 00

AGATTTACTT CCAACGGGTA GTTACATTGG CCTTGAACTA GGCAAGGTTG 1750

TGGAGCTCGT TATACCTCCT CTGGCAGTTG GAGGACCGCA CCCTTTCCAT 1800

CTTCATGGCG TAAGCATACC ACACTCCCGC AGCCAGAATG ACGCATiACTA 1850

ATCATGATAT GCAGCACAAT TTCTGGGTCG TCCGTAGTGC AGGTAGCGAT 1900 GAGTATAACT TTGACGATGC TATCCTCAGG GACGTCGTGA GCATTGGAGC 1950

GGGGACTGAT GAAGTCACAA TCCGTTTCGT GGTATGTCTC ACCCCTCGCA 2000

TTTTGAGACG CAAGAGCTGA TATATTTTAA CATAGACCGA CAATCCGGGC 2050

CCGTGGTTCC TCCATTGCCA TATTGATTGG CATTTGGAGG CAGGCCTTGC 2100

CATCGTCTTC GCTGAGGGCA TCAATCAGAC CGCTGCAGCC AACCCAACAC 2150

CCCGTACGTG ACACTGAGGG TTTCTTTATA GTGCTGGATT ACTGAATCGA 2200

GATTTCTCCA CAGAAGCATG GGATGAGCTT TGCCCCAAAT ATAACGGGTT 2250

GAGTGCGAGC CAGAAGGTCA AGCCTAAGAA AGGAACTGCT ATTTAAACG 22 99

que codifica a enzima lacase D2, que tem a seqüência da proteína traduzida (SEQ ID N0 16)

MGLNSAITSL AILALSVGSY AAIGPVADIH IVNKDLAPDG VQRPTVLAGG 50 TFPGTLITGQ KGDNFQLNVI DDLTDDRMLT PTSIHWHGFF QKGTAWADGP 100 AFVTQCPIIA DNSFLYDFDV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGAFVVYDP 150 NDPHKDLYDV DDGGTVITLA DWYHVLAQTV VGAATPDSTL INGLGRSQTG 200 PADAELAVIS VEHNKRYRFR LVSISCDPNF TFSVDGHNMT VIEVDGVNTR 250 PLTVDSIQIF AGQRYSFVLN ANQPDDNYWI RAMPNIGRNT TTLDGKNAAI 300 LRYKNASVEE PKTVGGPAQS PLNEADLRPL VPAPVPGNAV PGGADINHRL 350 NLTFSNGLFS INNASFTNPS VPALLQILSG AQNAQDLLPT GSYIGLELGK 400 VVELVIPPLA VGGPHPFHLH GHNFWVVRSA GSDEYNFDDA ILRDVVSIGA 450 GTDEVTIRFV TDNPGPWFLH CHIDWHLEAG LAIVFAEGIN QTAAANPTPQ 500 AWDELCPKYN GLSASQKVKP KKGTAI 526 A expressão "% de identidade" refere-se aqui ao nível de identi- dade de seqüência de ácido nucléico ou aminoácidos entre a seqüência de ácido nucléico que codifica a lacase descrita aqui ou a seqüência de amino- ácidos da lacase, quando alinhadas usando um programa de alinhamento de seqüência.

Por exemplo, como usado aqui, 80% de identidade de seqüência é determinado por um algoritmo e, consequentemente, um homólogo de uma dada seqüência tem mais do que 80% de identidade de seqüência so- 30 bre a extensão da seqüência dada. Níveis exemplares de identidade de se- qüência incluem, mas não são limitados a 80, 85, 90, 95, 98% ou mais de identidade de seqüência com uma dada seqüência, por exemplo, a sequên- cia codificante de uma lacase, como aqui descrito.

Programas de computador exemplares que podem ser usados para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas não são limitados ao grupo de programas BLAST, por exemplo, BLASTN, BLASTX e 5 TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, disponíveis publicamente na Internet em www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Veja também, Altschul, et ai, 1990 e Altschul, et ai, 1997.

Pesquisas de seqüências são tipicamente realizadas usando o programa BLASTN quando se avalia uma dada seqüência de ácido nucléico 10 em relação à seqüências de ácido nucléico no GenBank DNA Sequences e outros bancos de dados públicos. O programa BLASTX é preferido para pesquisar seqüências de ácido nucléico que tenham sido traduzidas em to- das as fases de leitura contra seqüências de aminoácidos do GenBank Pro- tein Sequences e outros bancos de dados públicos. Ambos, BLASTN e 15 BLASTX, são executados usando parâmetros de default de um open gap penalty de 11,0 e um extended gap penalty de 1,0 e utilizam a matriz BLO- SUM-62. (Veja, por exemplo, Altschul, et ai, 1997).

Um alinhamento de seqüências selecionadas a fim de determi- nar o "% de identidade" entre duas ou mais seqüências pode ser realizado 20 usando, por exemplo, o programa CLUSTAL-W na versão MacVector 6.5, operado com parâmetros de default, que incluem um espaço aberto "open gap penalty" de 10,0, um espaço extendido "extended gap penalt" de 0,1 e uma matriz de similaridade BLOSUM 30.

II. Mediadores

Em uma modalidade, o sistema de oxidação enzimática compre-

ende ainda um ou mais gentes mediadores químicos que intensificam a ati- vidade da enzima lacase. A expressão "mediador químico" (ou "mediador" pode ser usado alternativamente aqui) é aqui definida como um composto químico que age como um mediador redox para efetivamente transferir elé- 30 trons entre a enzima que exibe atividade de oxidase e o corante. Mediadores químicos também são conhecidos como intensificadores e aceleradores na técnica. O mediador químico pode ser um composto fenólico, por exem- plo, siringato de metila e compostos relacionados, como descrito em WO 95/01426 e 96/12845. O mediador químico pode ser também um composto de N-hidróxi, um composto de N-oxima ou um composto de N-óxido, por e- 5 xemplo, N-hidroxibenzotriazol, ácido volúrico ou N-hidroxiacetanilida. O me- diador químico também pode ser um composto de fenoxazina/fenotiazina, por exemplo, fenotiazina-10-propionato. O mediador químico pode ser ainda o ácido 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico) (ABTS). Outros medi- adores químicos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os compos- 10 tos descritos em WO 95/01246 são conhecidos por intensificar a atividade de uma lacase. Em modalidades particulares, o mediador pode ser acetosirin- gona, siringato de metila, siringato de etila, siringato de propila, siringato de butila, siringato de hexila ou siringato de octila.

Preferivelmente, o mediador é 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, 4- carboxamido-2,6- dimetoxifenol ou um derivado A/-substituído desses tais como, por exemplo, 4-(A/-metil carboxamido)- 2,6-dimetoxifenol, 4-[Λ/-(2- hidroxietil)carboxamido]- 2,6-dimetoxifenol ou 4-[A/,A/-dimetil-carboxamido]- 2,6-dimetoxifenol.

O mediador usado na presente invenção pode ser descrito pela seguinte fórmula:

A

em cuja fórmula A é um grupo tal como -R, -D, -CH=CH-D, -CH=CH- CH=CH-D, -CH=N-D, -N=N-D ou -N=CH-D, no qual D é selecionado do gru- po que consiste em -CO-E, -SO2-E, -CN, -NXY e N+XYZ, no qual E pode ser -H, -OH, -R, -OR ou -NXY e X, Y e Z podem ser idênticos ou diferentes e selecionados entre -H, -OH, e -R; R sendo C1-C16 alquila, preferivelmente CrC8 alquila, cuja alquila pode ser saturada ou insaturada, ramificada ou não-ramificada e opcionalmente substituída por um grupo carbóxi, sulfo ou amino; e B e C podem ser iguais ou diferentes e selecionados a partir de CmH2m-M; 1*m<5.

-CO-E, em que E pode ser -H, -OH, -R ou -NXY1 onde XeY podem ser idênticos ou diferentes e selecionados a partir de -H1 -OH1 -OR e -R1 sendo R um C1-C16 alquila, preferivelmente CrCs alquila, cuja alquila pode ser sa- turada ou insaturada, ramificada ou não-ramificada e opcionalmente substi- 10 tuída por um grupo carbóxi, sulfo ou amino; e B e C podem ser iguais ou di- ferentes e selecionados a partir de CmH2m+1; 1< m < 5.

No acima mencionado, a fórmula A pode ser colocada meta ao grupo hidróxi ao invés de ser colocada na posição para como mostrado.

5

Em uma modalidade, A na fórmula acima mencionada é -CN ou

Em uma modalidade, o mediador é

OH

CN

4-Ciano-2.6-dimetoxifenol

15

Em uma modalidade, o mediador é

OH

O NH2

4-Ciano-2.6-dimetoxifenol Em uma modalidade, o mediador é OH

MeO

OMe

y\

0 NHMe

4-(A/-metil carboxamido)-2,6-dimetoxifenol

Em uma modalidade, o mediador é

OH

u NMe2

4-(/V,A/-dimetil carboxamido)-2,6-dimetoxifenol Em modalidades particulares, o mediador pode ser acetosiringo-

na, siringato de metila, siringato de etila, siringato de propila, siringato de butila, siringato de hexila ou siringato de octila. Preferivelmente, o mediador é 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol ou um deriva- do N-substituído desses tais como 4-(A/-metil carboxamido)- 2,6- dimetoxifenol, 4-[A/-(2-hidroxietil)carboxamido]- 2,6-dimetoxifenol ou 4-[N,N- 10 dimetil-carboxamido]- 2,6-dimetoxifenol ou combinações desses.

O mediador da invenção pode estar presente em concentrações

entre 0,005 a 1000 pmols por grama de brim, preferivelmente 0,05 a 500 pmols por grama de brim, mais preferivelmente 0,5 a 100 pmols por grama de brim.

pelo versado na técnica, tais como aqueles descritos em WO 97/11217, WO 96/12845 e US 5752980.

Ill- Utilidade

15

Os mediadores podem ser preparados por métodos conhecidos As aplicações industriais de Iacases incluem o alvejamento de polpa e papel e alvejamento de têxtil, por exemplo, tecidos de brim tingidos com índigo. Lacases também foram descobertas serem úteis para a colora- ção de cabelo (veja, por exemplo, WO 95/33836 e WO 95/33837). A Patente 5 Européia N0 0504005 descreve que Iacases podem ser usadas para a colo- ração de lã.

As Iacases aqui descritas encontram uso na coloração e alveja- mento de têxteis, fibras, fios e similares. As Iacases também encontram uso no tratamento de efluentes, a deslignificação de polpa, a despolimerização 10 de agregados de alto peso molecular, descoloração de resíduo de papel, a polimerização de compostos aromáticos, reações de polimerização mediada por radical e reticulação (por exemplo, tintas, revestimentos, biomateriais), e a ativação de corantes e para acoplar compostos orgânicos. As Iacases po- dem ser usadas em composição para limpeza ou componente dessa ou em 15 um detergente.

Como aqui descrito, as Iacases são capazes de oxidar uma grande variedade de compostos coloridos que têm estruturas químicas dife- rentes, usando o oxigênio como aceptor de elétron. Consequentemente, as Iacases aqui apresentadas podem ser usadas em aplicações onde é desejá- 20 vel modificara cor associada aos compostos coloridos, tal como na limpeza, por exemplo, para remoção de manchas de alimentos sobre o tecido. Em certas situações, um mediador ou intensificador pode ser usado para se ob- ter os efeitos desejados.

As Iacases aqui apresentadas podem ser usadas no campo dos 25 têxteis. Por exemplo, as Iacases aqui descritas podem ser usadas no trata- mento, processamento, finalização, polimento ou produção de fibras ou ou- tros artigos de manufaturação. As enzimas podem ser úteis, por exemplo, no tratamento de brim (processos de desenvolvimento de alvejamento); na des- coloração de resíduo de índigo; no tingimento de tecido; em processos de 30 alvejamento de têxtil; na modificação de fibra; na obtenção de propriedades aprimoradas de fibra ou tecido; etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas na indústria do cou- ro. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas no processamento de peles de animais incluindo, mas não limitado à depilação, caleiro, descalcinação e/ou curtimento de peles.

Também é descrito aqui um processo para remoção de Iignina 5 de material que contém lignocelulose, o alvejamento de material que contém Iignocelulose (isto é, a descoloração enzimática de papel reciclado) e/ou o tratamento de efluentes que surgem a partir da produção de papel ou celulo- se. O processo usa enzimas lacase obtidas de Cerrena sp., ao mesmo tem- po adicionando ou medindo em agentes redox não-aromáticos mais compos- 10 tos redox aromáticos fenólicos e/ou não-fenólicos, as unidades fenólicas e não-fenólicas da Iignina sendo tanto oxidadas diretamente pela ação desses compostos aromáticos fenólicos e não-fenólicos quanto à Iignina sendo oxi- dada por outros compostos fenólicos e/ou não-fenólicos produzidos pela a- ção oxidante desses compostos.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de polpa e

papel. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na produção de polpas de papel e polpas em pasta a partir de materiais brutos tais como madeira, bambu e palha de cereal; produção de papel e papelão para impressão e escrita, embalagem, higiene e outros usos técnicos; reciclagem de fibra de 20 celulose com o propósito de fazer papel e papelão; e o tratamento de produ- tos residuais gerados por e tratados em moinhos de polpa ou papel e outras instalações dedicadas à manufatura de papel, polpa ou pasta. As enzimas aqui apresentadas podem ser úteis, por exemplo, no processamento da ma- deira; no alvejamento da polpa; na modificação de fibra de madeira; adesivo 25 tecidual (ativação de lignina) para produção de MDF; para papel com propri- edades melhoradas; na remoção de tinta; no tingimento de papel; em adesi- vos (por exemplo, cola baseada em lignina para partículas ou fibras de pape- lão), etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de ração. Por exemplo, as Iacases apresentadas aqui podem ser usadas como aditivo para ração sozinhas ou como parte de um aditivo para ração com o objetivo de aumentar o valor nutricional da ração para quaisquer tipos de animais tais como frangos, vacas, porcos, peixes e animais de estimação; e/ou como um auxiliar de processamento para processar subprodutos de materiais de plan- ta e da indústria alimentícia com o objetivo de produzir materiais/produtos adequados como materiais brutos para ração.

5 As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor da limpeza

de lentes de contato. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na limpe- za, armazenamento, desinfecção e/ou conservação de lentes de contato.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de amido. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas no processamento de um subs- 10 trato que inclui amido e/ou grão para xarope de glicose (dextrose), xarope de frutose ou qualquer outro xarope, álcool (uso doméstico ou combustível) ou açúcar. Tal processamento de amido pode incluir etapas de processamento tais como liquefação, sacarificação, isomerização e desramificação de um substrato.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor da alimen-

tação. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na preparação, no pro- cessamento ou como um ingrediente ativo em alimentos tais como gordura amarela, bebidas baseadas em chá, produtos culinários, para panificação e alimentos congelados para consumo humano. As Iacases podem ser usa- 20 das, por exemplo, como beneficiadoras para pão, na conservação de alimen- to, como sequestrante de oxigênio, etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de higiene pessoal. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na preparação de pro- dutos para cuidados pessoais para humanos tais como fragrâncias e produ- 25 tos para higiene da pele, higiene oral, para o banho e desodorante e/ou anti- transpirantes para humanos. As enzimas aqui apresentadas podem ser ú- teis, por exemplo, no tingimento e/ou clareamento de cabelo, tingimento e/ou clareamento de unhas; tingimento e/ou clareamento de pele; modificação de superfície (por exemplo, como agente de acoplamento); como um agente 30 antimicrobiano; na remoção de odor; clareamento de dentes; etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de limpe- za. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na limpeza, tratamento ou higiene de itens de lavanderia tais como roupas e tecido; na limpeza de su- perfícies domésticas difíceis; na lavagem de louça, incluindo aplicações em máquina de lavar louça; e em sabões em barra e líquidos e/ou tensoativos sintéticos em barra ou líquidos. As enzimas aqui apresentadas podem ser 5 úteis, por exemplo, na remoção/descoloração de mancha e/ou na remoção de odores e/ou desinfecção, etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de trata- mento de efluentes. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas na descolo- ração de compostos coloridos; na purificação de componentes fenólicos; para atividade antimicrobiana (por exemplo, na reciclagem de água); na bior- remediação; etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de bioma- teriais. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas como biocatalisadoras para várias reações orgânicas; e/ou em conjunto com biopolímeros; em con- 15 junto com empacotamento; em conjunto com adesivos; na modificação de superfície (agente de ativação e acoplamento); na produção de alcoóis pri- mários; em conjunto com biosensores e/ou sínteses orgânicas; etc.

As Iacases aqui descritas podem ser usadas no setor de antimi- crobianos. Por exemplo, as Iacases podem ser usadas como um agente an- timicrobiano em composições de limpeza ou para reduzir ou eliminar a carga microbiana de vários alimentos (por exemplo, carne) ou ração.

Os mediadores de lacase podem ser usados como agentes de desinfecção e antimicrobiano (por exemplo, proteção de madeiras, detergente). Os media- dores podem ser usados independentemente ou em conjunto com as enzi- mas.

Como usado aqui, "composições de limpeza" e "formulações de limpeza" referem-se a composições que encontram uso na remoção de compostos indesejados de itens a ser limpos, tais como tecido, etc. O termo abrange quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo particular 30 de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, lí- quido, gel, grânulo ou composição em spray, desde que a composição seja compatível com a lacase e outra(s) enzimas(s) usadas na composição. A seleção específica de materiais de composição de limpeza pode ser pronta- mente feita pela consideração da superfície, item ou tecido a ser limpo e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante o uso.

As expressões referem-se ainda a qualquer composição ade- 5 quada para limpeza e/ou alvejamento de qualquer objeto e/ou superfície. Pretende-se que as expressões incluam, mas não se limitem a composições detergentes (por exemplo, detergentes líquido e/ou sólido para lavanderia e detergentes para tecidos delicados; formulações de limpeza para superfícies difíceis, tais como para vidros, madeira, cerâmica e balcões e janelas de me- 10 tal; limpadores de carpete; limpadores de forno; e pré-lavagem de têxtil e lavanderia, assim como detergentes para louças).

De fato, a expressão "composição de limpeza" como usada aqui, inclui a menos que indicado de outra maneira, agentes de lavagem em forma granular ou em pó para todos os propósitos ou limpeza pesada, especial- mente detergentes de limpeza; agentes de lavagem em forma líquida, de gel ou de pasta para todos os propósitos, especialmente os tipos assim chama- dos de líquido para limpeza pesada (HDL); detergentes líquidos para tecido delicado; agentes para lavagem manual de louça ou agentes para lavagem leve de louça, especialmente aqueles do tipo muito espumante; agentes pa- ra máquina de lavar louça incluindo os vários tipos em pastilhas, granular, líquido e auxiliar de enxágüe para uso doméstico e institucional; agentes lí- quidos para limpeza e desinfecção, xampus de carro ou carpete, limpadores de banheiro; xampus e condicionadores capilares; géis de banho e espumas de banho e limpadores de metal; assim como auxiliares de limpeza tais co- mo aditivos para alvejamento e os tipos "removedores de manchas" ou para pré-tratamento.

Como usado aqui, as expressões "composição detergente" e "formulação detergente" são usadas com referência a misturas que são pre- tendidas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. 30 Em algumas modalidades, a expressão é usada com referência a lavagem de tecidos e/ou vestuário (por exemplo, "detergentes para lavanderia". Em modalidades alternativas, a expressão refere-se a outros detergentes, tais como aqueles usados para limpar pratos, talheres, etc. (por exemplo, "deter- gentes para lavar louça"). Não se pretende que as composições presente- mente contempladas sejam limitadas a qualquer formulação ou composição detergente em particular. De fato, pretende-se que além da lacase, a ex- pressão abranja detergentes que contém tensoativos, transferase(s), enzi- mas hidrolíticas, auxiliares de detergência, agentes branqueadores, ativado- res de alvejamento, agentes anilados e corantes fluorescentes, inibidores de compactação, agentes adesivos, ativadores de enzima, antioxidantes e so- lubilizantes.

Como usada aqui, a expressão "composição para limpeza de superfície difícil" refere-se a composições detergentes para limpeza de su- perfícies difíceis tais como pisos, paredes, azulejo, vasos de aço inoxidável (por exemplo, tanques de fermentação), metais de banheiro e cozinha, e similares. Tais composições são fornecidas em qualquer forma, incluindo, mas não limitado a sólidos, líquidos, emulsões, etc.

Exemplos

Exemplo 1. Expressão do gene de lacase D em Bacillus como gene de fusão sintético BCE103 usando códon otimizado.

DNA (SEQ ID NO:71):

GGATCCTGAA GCTATCGGTC CGGTTGCAGA TTTACACATC GTAAACAAAG 50 ATCTTGCACC TGACGGCGTT CAACGTCCAA CTGTACTTGC TGGTGGAACA 100 TTCCCTGGTA CACTTATTAC TGGTCAAAAA GGTGACAACT TCCAATTAAA 150 CGTAATTGAC GATCTTACAG ATGACCGTAT GCTTACACCG ACTTCAATTC 200 ACTGGCACGG TTTCTTTCAA AAAGGAACAG CATGGGCTGA TGGTCCTGCA 250 TTCGTTACAC AATGTCCAAT CATTGCTGAT AACTCTTTCC TTTACGATTT 300 TGACGTTCCT GATCAAGCTG GTACATTCTG GTATCACTCA CACTTATCCA 350 CACAATACTG CGATGGACTT CGCGGAGCTT TCGTAGTTTA CGACCCAAAC 400 GATCCTCATA AAGACCTTTA CGATGTAGAT GATGGTGGAA CAGTTATCAC 450 ATTAGCTGAT TGGTACCATG TACTTGCTCA AACAGTTGTA GGTGCAGCTA 500 CACCAGATTC AACACTTATC AATGGATTAG GACGTTCTCA AACTGGTCCT 550 GCTGACGCAG AACTTGCTGT AATCTCTGTT GAACATAACA AACGTTACAG 600 ATTCCGTCTT GTTAGCATTT CTTGCGATCC AAACTTCACA TTTTCAGTTG 650 ACGGACATAA CATGACAGTT ATCGAAGTAG ATGGTGTAAA CACACGTCCA 700 CTTACTGTAG ACTCTATCCA AATCTTCGCA GGACAACGTT ACTCATTCGT 750 ATTAAACGCA AATCAACCAG AAGATAACTA CTGGATTCGT GCAATGCCAA 800 ACATCGGACG TAACACTACA ACTCTTGACG GCAAAAACGC AGCTATTCTT 850 CGTTACAAAA ACGCTTCTGT TGAAGAACCT AAAACAGTTG GTGGACCAGC 900 ACAAT CACCA CTTAACGAAG CTGACTTACG TCCACTGGTT CCAGCACCTG 950 TACCTGGAAA CGCTGTACCA GGAGGTGCTG ATATTAATCA T AGAC T T AAC 100 CTTACTTTCT CTAACGGTCT GTTCTCAATC AACAACGCTT CATTCACAAA 1050 TCCTTCAGTT CCAGCACTTT TACAAATTCT TAGCGGTGCA CAAAATGCTC 1100 AGGATCTTTT ACCAACTGGA TCTTACATTG GTCTTGAACT GGGTAAAGTA 1150 GTTGAATTAG TAATTCCTCC GCTTGCTGTA GGTGGACCAC ATCCTTTCCA 1200 TCTTCACGGT CATAACTTCT GGGTTGTACG TTCTGCTGGT TCAGATGAAT 1250 ACAACTTCGA TGACGCAATT CTTCGTGATG TTGTATCTAT TGGTGCTGGA 1300 ACAGATGAAG TAACTATTCG TTTCGTAACA GATAACCCTG GTCCTTGGTT 1350 CTTACATTGT CATATCGATT GGCATCTTGA AGCTGGACTT GCTATTGTTT 1400 TCGCTGAAGG AAT CAAT CAA ACAGCTGCAG CTAACCCAAC ACCTCAAGCA 1450 TGGGACGAAT TATGTCCAAA ATACAACGCA CTTTCTCCAG GAGATACTTA 1500 AAAGCTT iscnque codifica o gene da lacase D foi sintetizada por DNA2.0 Inc. (1355 Adams Drive, Menlo Park, CA94025). O plasmídeo de DNA sinté- tico foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Hindlll e o fragmento de DNA de 1,5 kb foi isolado de um gel e ligado no vetor p2JMagk1031nk2 (veja US20050202535A1) digerido com as mesmas duas enzimas para criar o plasmídeo de expressão p2JMagk1031nk2E-lacase (figura 1). O plasmí- deo foi transformado em uma cepa de B. subtilis (degUHy32, oppA, DspollE, DaprE, Depr, DispA, Dbpr, Dvpr, DwprA, Dmpr-ybfJ, DnprB, am- yE::xylRPxylAcomK-ermC) (veja US20050202535A1). Dois transformantes foram selecionados em placas de Agar Luria Broth com 5 mg/ml de cloranfe- nicol e depois para selecionar clones com o maior número de cópias, as co- lônias foram repicadas sobre placas de Agar Luria Broth com 25 mg/ml de cloranfenicol até que fosse obtido o crescimento rápido da colônia. Os trans- formantes amplificados foram inoculados em 30 ml de meio MBD (veja US20050202535A1) contendo cobre 0,5 mM. As culturas foram incubadas por 60 h a 37°C. Os caldos de cultura foram centrifugados e os sobrenadan- tes foram usados para ensaio ABTS.

Exemplo 2. Alvejamento de índigo solubilizado com diferentes Iacases

Um ensaio para o alvejamento do substrato de índigo solubiliza- 5 do pelas combinações de lacase/mediador foi realizado em uma placa de microtitulação de 96 poços como se segue.

Uma solução saturada de índigo em A/-metilpirrolidona (NMP) foi preparada pela agitação de índigo (30 mg) em NMP (10 ml) em temperatura ambiente por 5 horas. A solução de NMP foi diluída 10 vezes em uma solu- 10 ção aquosa de tampão resultando em uma solução azul. Por exemplo, dilui- ção em tampão de acetato de sódio 50 mM em pH 5 ou fosfato de sódio 50 mM em pH 7. As soluções foram bem agitadas imediatamente antes do uso.

O ensaio para o alvejamento do substrato de índigo solubilizado foi realizado em uma placa de microtitulação de 96 poços de forma que cada poço recebeu a solução de índigo solúvel em tampão de acetato de sódio 50 mM em pH 5 (180 uL), lacase (10 ppm de enzima) e solução de mediador (de uma solução-estoque 20 mM em metanol). O volume total de cada poço foi ajustado para 200 uL com água deionizada. Um controle contendo ape- nas lacase foi corrido em duplicata. A placa foi lacrada e incubada a 50°C por 2 horas a 800 rpm em um agitador aquecido (Thermomixer, Eppendorf). Após esse período, as placas foram abertas e uma solução de ácido ascór- bico (20 uL de uma solução aquosa 10%) foi adicionada a cada poço a fim de reduzir as formas oxidadas dos mediadores. O nível de alvejamento de índigo foi então avaliada pela determinação da absorbância de cada poço em 600 nm usando um leitor de placa de microtitulação. Quanto menor a absorbância lida, maior o nível de alvejamento de índigo.

A figura 2 mostra os resultados para uma lacase de Thielavia sp. (Ecostone LCC10, AB enzymes, Darmstadt, Alemanha). Os mediadores u- sados foram ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfônico (ABTS), 30 ácido siríngico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA)1 siringato de metila (MS), 4-(A/-metil carboxamido)- 2,6-dimetoxifenol (MSA), 10-(carboxipropil)- fenotiazina (PTP) e siringaldeído. As alterações na absorbância em 600 nm relativas ao controle estão listadas na Tabela 1 onde a maior alteração na absorbância corresponde à maior extensão de alvejamento de índigo.

Com um mediador na concentração de 500 nm, o mediador mais eficaz para o alvejamento de índigo foi ABTS, seguido pela N-metil amida (MSA) e pela amida não-substituída, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA). Na menor concentração de mediador de 50 uM, ABTS foi ainda o mediador mais eficaz, com os mediadores restantes sendo mais ou menos equivalen- tes. A exceção foi o ácido siríngico, que branqueou o indigo solúvel não mais eficazmente que a condição de controle.

Tabela 1. Alteração na absorbância em 600 nm após alvejamento de índigo solúvel usando uma lacase de Thielavia sp. e uma variedade de mediadores em concentrações de 500 e 50 uM (n=2).

Mediador Concentração de 500 mM Concentração de 50 mM ΔΑ600 Desvio-padrão ΔΑ600 Desvio-padrão Controle 0 0,008 0 0,010 ABTS 0,235 0,019 0,174 0,032 Ácido Siringico 0,024 0,017 0,005 0,009 AS 0,170 0,018 0,088 0,014 Siringato de 0,062 0,035 0,090 0,012 metila MSA 0,181 0,013 0,103 0,018 PTP 0,044 0,009 0,132 0,020 Siringaldeido 0,132 0,012 0,092 0,017 Exemplo 3. Ensaio de alvejamento de índigo solúvel com diferentes Iacases em dois valores de pH

Lacases derivadas de Myceliophtora (Denilite® II, Novozymes, Bagsvaerd, Dinamarca), Thielavia (Ecostone LCC10, AB enzymes, Darms- tadt, Alemanha) e Cerrena sp. foram avaliadas quanto à sua habilidade de branquear índigo solubilizado em conjunto com mediadores de baixo peso molecular em dois valores de pH.

O alvejamento de índigo solubilizado em placas de microtitula- ção de 96 poços foi realizado como descrito no Exemplo 1, usando 3 Iacases diferentes em valores de pH de 5 e 7. Os mediadores usados foram ácido sinapínico, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), siringato de metil 4-acetila (AMS)1 siringato de metila (MS) e ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6- sulfônico) (ABTS). As figuras 3 e 4 mostram os resultados do alvejamento de 5 índigo solúvel em valores de pH de 5 e 7 usando três Iacases derivadas de Myceliophtora, Thielavia e Cerrena sp., respectivamente, Esses dados estão tabulados nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2. Alteração na absorbância em 600 nm em relação a um controle após alvejamento de índigo solúvel usando Iacases de Thielavia, Mycelioph- tora e Cerrena sp. em pH 5 com uma concentração de mediador de 250 uM.

Lacase Thielavia Myceliophtora Cerrena ΔΑ60ο Desvio- ΔΑ6οο Desvio- ΔΑ600 Desvio- padrão padrão padrão Controle 1 0 0,016 0 0,010 0 0,005 Ácido sina- 0,068 0,019 0,157 0,020 0,240 0,007 pinico SA 0,170 0,011 0,254 0,013 0,142 0,005 AMS 0,100 0,012 0,117 0,007 0,028 0,003 MS (AB) 0,048 0,011 0,057 0,007 0,005 0,011 MS (DeniIite) 0,050 0,013 0,061 0,007 0,043 0,013 ABTS 0,234 0,012 0,267 0,008 0,329 0,031 Controle 2 -0,007 0,017 -0,011 0,007 -0,006 0,005 Tabela 3. Alteração na absorbância em 600 nm em relação a um controle após alvejamento de índigo solúvel usando Iacases de Thielavia, Mycelioph- tora e Cerrena sp. em pH 7 com uma concentração de mediador de 250 uM.

Lacase Thielavia Myceliophtora Cerrena ΔΑ600 Desvio- ΔΑ600 Desvio- ΔΑ600 Desvio- padrão padrão padrão Controle 1 0 0,008 0 0,001 0 0,006 Lacase Thielavia Myceliophtora Cerrena ΔΑ600 Desvio- ΔΑ600 Desvio- ΔΑ600 Desvio- padrão padrão padrão Ácido si- 0,112 0,015 0,204 0,020 0,257 0,005 napínico SA 0,162 0,006 0,220 0,009 0,128 0,010 AMS 0,087 0,006 0,078 0,005 0,077 0,007 MS (AB) 0,053 0,010 0,076 0,006 0,000 0,006 MS (Deni- 0,069 0,017 0,086 0,001 0,008 0,018 lite) ABTS 0,145 0,006 0,155 0,014 0,215 0,056 Controle 2 0,007 0,006 -0,004 0,001 0 0,005 Exemplo 4. Alvejamento de Retalhos de Brim com lacase de C. unicolor.

Calças de brim (feitas de tecido de brim tingido de verde- amarelado/índigo de Cone MilI, modelo número 1662P) foram pré-tratadas com IndiAge® 2XL na dose de 1 grama por litro em uma lavadora com tam- 5 bor de 50 Ib em escala laboratorial. A proporção de líquido era de 6 para 1 (5 kg de substrato em 30 litros de água) e o tratamento foi realizado a 55°C em pH 4.5 por 1 hora. O tratamento com celulase foi seguido por um enxágüe morno, após o que o tecido foi seco em uma secadora com tambor. Uma prensa perfuradora foi usada para cortar discos de brim de 5/8 de polegada 10 das calças de brim pré-tratadas com IndiAge® 2XL. Cada disco de brim é pré-lido com um Chroma Meter CR-200 da Minolta a fim de determinar os valores de CIE L*a*b* de ambos os lados, direito e avesso, do disco de teci- do.

Um disco de brim é colocado em cada poço de duas placas de 15 microtilulação de 12 poços em duplicata. Cada poço recebeu lacase de C. unicolor (20 uL de uma diluição de 1/20, aproximadamente 20 ppm), media- dor 200, 100, 50 ou 20 uL de uma solução-estoque 20 mM em metanol) e tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6 para um volume total de 2 mL/poço. Os mediadores foram siringato de metila (MS), 4-ciano-2,6-dimetoxifenol 20 (SN) e 3,4,5-trimetoxifenol (TMP). As placas foram seladas e incubadas a 50°C por 2 horas a 150 rpm em uma incubadora padronizada. Após esse período, os retalhos foram removidos das placas e cuidadosamente coloca- dos sobre um papel de filtro em um funil de Buchner e lavados com quanti- dades abundantes de água, seguida pela secagem da água residual sob alto 5 vácuo durante a noite. Os retalhos foram então relidos com o colorímetro a fim de determinar os valores de CIE L*a*b* de ambos os lados, direito e a- vesso, do disco após o alvejamento. A diferença total de cor (ΔΕ) é calcula- da a partir da diferença entre os valores inicial e final de CIE L*a*b* de acor- do com a fórmula 10 ΔΕ = (AL2 + Aa2 + AbY2

As diferenças totais de cor (ΔΕ) como uma função da concentra- ção de mediador estão plotadas nas figuras 5 e 6. O mediador mais eficaz foi 4-ciano-2,6-dimetoxifenol (SN), seguido por siringato de metila (MS). A relação dose/resposta foi vista para ambos os compostos de acordo com o 15 que concentrações mais baixas forneceram menos alvejamento. O terceiro mediador, 3,4,5-trimetoxifenol (TMP), não foi um mediador eficaz sob essas condições. Esses dados estão tabulados na Tabela 4.

Tabela 4. Alterações em L, a, b e diferença total de cor (E) de ambos os la- dos, frente e avesso, de retalhos de brim tratados com lacase de C. unicolor (20 ppm) e 3 mediadores em várias concentrações.

Mediador Lado direito do retalho de brim Lado do avesso do retalho de brim AL Aa Ab AE AL Aa Ab AE MS 2000 11,13 -2,23 4,32 12,15 11,92 -0,61 9,39 15,19 uM 12,26 -2,35 4,76 13,54 12,01 -0,42 9,88 15,56 1000 11,55 -2,53 3,27 12,27 8,42 -0,12 6,4 10,58 uM 9,58 -2,23 3,03 10,29 9,22 -0,49 7,0 11,59 500 uM 6,5 -1,18 1,65 6,81 7,53 0,09 5,68 9,43 8,22 -1,48 2,38 8,68 8,54 -0,23 5,75 10,30 200 uM 4,67 -0,99 1,25 4,93 5,83 0,14 4,35 7,28 5,29 -0,94 1,1 5,48 6,36 0,06 4,34 7,70 SN 2000 14,79 -2,11 5,8 16,03 12,34 0,01 9,06 15,31 uM 13,23 -1,87 5,58 14,48 13,58 0,37 9,52 16,59 1000 13,54 -2,05 5,47 14,75 11,45 0,07 8,02 13,98 uM 13,84 -2,49 4,98 14,92 12,1 0,14 9,19 15,19 500 uM 14,46 -1,9 5,51 15,59 10,71 0,35 8,1 13,43 12,06 -1,97 4,92 13,17 11,6 0,38 8,03 14,11 200 uM 6,63 -1,35 2,57 7,24 8,38 0,54 6,12 10,39 7,98 -1,28 2,67 8,51 8,67 0,38 5,67 10,37 TMP 2000 -0,06 0,15 0,1 0,19 0,26 -0,12 0,19 0,34 uM -0,23 0,05 -0,32 0,40 -0,3 0,06 -0,14 0,34 1000 0,47 -0,2 0,04 0,51 0,36 0,22 0,15 0,45 uM -0,07 0,18 -0,42 0,46 -0,49 0,12 -0,07 0,51 500 uM -0,61 -0,06 0,18 0,64 -0,43 0,2 -0,19 0,51 -0,61 0,14 -0,06 0,63 0,29 0,09 -0,01 0,30 200 uM -0,91 0,29 0,01 0,96 -0,1 -0,14 0,3 0,35 -0,68 0,33 -0,12 0,77 -0,49 0,14 -0,26 0,57 1 MS = siringato de metila, SN = 4-ciano-2,6-dimetóxifenol,

TMP = 3,4,5-trimetóxifenol

2 Diferença nos valores de L, a e b foi determinada subtraindo as leituras inicial da final.

Exemplo 5. Branqueamento de retalhos de brim com lacase D recombinante de C. unicolor.

Um ensaio de branqueamento de retalho de brim foi realizado como descrito no Exemplo 16, desta vez usando uma forma recombinante da proteína lacase D derivada de C. unicolor.

Duas duplicatas de placas de 12 poços foram carregadas com

discos de brim. A solução-estoque de lacase D (5,5 unidades ABTS por mL) foi dosada tanto em 25 quanto em 50 uL por poço. Os mediadores usados foram siringato de metila (MS), 4-ciano-2,6-dimetóxifenol (SN) e 4- carboxamido-2,6-dimetóxifenol (SA) e foram usados em concentrações de 15 0,5 ou 1 mM. Os resultados são mostrados nas figuras 7 e 8. As alterações nos valores de L, a e b e as diferenças totais de cor (ΔΕ) estão listadas na Tabela 5. Os resultados indicam que 4-ciano-2,6-dimetóxifenol (SN) foi o mediador mais eficaz para o branqueamento de retalho de brim sob essas condições.

Condições Lado direito do retalho de Lado do avesso do retalho de brim brim Mediador1 Lacase2 AL Aa Ab AE AL Aa Ab AE MS 1 mM 50 uL 11,77 -2,20 4,67 12,85 11,16 0,34 8,52 14,04 11,57 -2,15 4,51 12,60 10,30 0,50 8,26 13,21 MS 0,5 50 uL 7,74 -1,92 2,45 8,34 7,93 0,33 6,29 10,13 mM 7,12 -1,70 2,21 7,65 8,34 0,17 6,47 10,56 MS 1 mM 25 uL 10,74 -1,90 4,82 11,92 9,44 0,16 7,99 12,37 11,15 -2,46 3,93 12,08 10,25 0,26 7,89 12,94 MS 0,5 25 uL 8,55 -1,90 3,12 9,30 9,35 0,00 6,36 11,31 mM 9,53 -1,91 3,43 10,31 9,10 0,03 6,70 11,30 SN 1 mM 50 uL 12,98 -2,04 5,33 14,18 11,25 0,29 8,41 14,05 12,85 -2,23 5,50 14,15 10,98 0,48 8,91 14,15 SN 0,5 50 uL 8,20 -1,70 2,34 8,70 8,87 0,26 5,93 10,67 mM 8,67 -1,76 2,90 9,31 8,45 0,33 6,19 10,48 SN 1 mM 25 uL 12,31 -2,17 4,36 13,24 11,36 0,01 7,93 13,85 12,85 -2,02 4,85 13,88 10,64 0,13 7,59 13,07 SN 0,5 25 uL 9,23 -2,17 3,12 9,98 9,69 -0,15 6,41 11,62 mM 9,73 -1,91 3,39 10,48 9,31 0,36 6,81 11,54 SA 1 mM 50 uL 6,23 -1,83 1,73 6,72 6,52 0,15 5,79 8,72 7,37 -2,01 2,11 7,93 6,82 0,10 6,12 9,16 SA 0,5 50 uL 3,66 -1,23 0,87 3,96 4,64 -0,10 4,04 6,15 mM 4,46 -1,38 0,88 4,75 5,25 -0,19 4,17 6,71 SA 1 mM 25 uL 7,07 -1,97 1,76 7,55 7,02 0,09 5,51 8,92 7,19 -2,18 1,68 7,70 6,53 -0,45 5,22 8,37 SA 0,5 25 uL 4,73 -1,41 1,16 5,07 4,94 -0,16 4,51 6,69 mM 5,28 -1,56 1,47 5,70 4,93 -0,33 4,05 6,39 1 MS = siringato de metila, SN = 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, AS = 4-

carboxamido-2,6-dimetoxifenol 2 Lacase de estoque era um concentrado com uma atividade de 5,5 U/ml contra ABTS

Exemplo 6. Estabilidade de mediadores na presença de lacase de C. unico- lor

Alíquotas de sobrenadante foram analisadas por LC/MS após o

protocolo de alvejamento de disco de brim descrito no Exemplo 5 a fim de determinar as concentrações finais de mediador no sobrenadante após um período de incubação de 2 horas.

Soluções padronizadas dos mediadores foram preparadas pela 10 diluição das soluções-estoque metanólicas (20 mM) em água deionizada, tal que as concentrações finais eram de 1 mM, respectivamente, para cada um dos três mediadores, siringato de metila (MS), 4-ciano-2,6-dimetoxifenol (SN) e 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA). As amostras foram analisadas usando um sistema Thermo Finnegan Quantum TSQ LC/MS (Thermo Fin- 15 negan, San Jose, CA) que opera em modo de ionização positiva por elec- trospray. As condições da cromatografia líquida foram as seguintes:

Coluna: Agilent Zorbax SB-Aq, 2,1 mm x 100 mm, sílica 3,5 uM Solvente A; Formato de amônia 20 mM, pH 5.0 Solvente B; 90% de Metanol + 10% de solvente A Taxa de fluxo; 250 uL/min

Volume de injeção; 5 uL

Programa de eluição: 70% de solvente A entre 0 a 1 minuto, pa- ra 30% de A entre 3 a 4 minutos, novamente 70% de A com 4,5 minutos, manter em 70% de A até os 8 minutos totais.

As condições de espectrometria de massa foram as seguintes:

Ionização por electrospray em modo positivo (+ve ESI) em modo de rastre- amento completo, rastreando entre 175 a 240 Da em 0,5 segundos.

Voltagem do spray era de 4200 V, taxa de fluxo coaxial de gás 41 mL/min, taxa de fluxo de gás suplementar em 15 mL/min.

Voltagem da lente do tubo era de 190 V e a temperatura capilar

era de 270°C.

Os resultados do experimento são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Estabilidade de mediadores como determinada pelas concentra- ções inicial e final no sobrenadante usado para branquear discos de brim.

Mediador Área de Pico Inicial Área de Pico Final % Remanescente MS 133x107 40,2 x 107 30,2% SN 35,6 x 107 35,2 x 107 98,9% AS 122 x 107 0,94 x 107 7,8% 1 MS = siringato de metila, SN = 4-ciano-2,6-dimetoxifenol, AS = 4- carboxamido-2,6-dimetoxifenol

5 Os resultados indicam que a estabilidade dos mediadores difere

amplamente após o contato com a lacase e o substrato para as condições de incubação padronizadas de 2 horas a 50°C. Nesse exemplo, 4-ciano-2,6- dimetoxifenol (SN) foi, com uma grande margem, o composto mais estável, cuja concentração essencialmente não se alterou (restaram 98,9%), seguido 10 por siringato de metila (restaram 30,2%). O composto mediador menos está- vel foi 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol (SA), com apenas 7,8% restantes no final do experimento.

Exemplo 7. Purificação e determinação de atividade específica

O gene otimizado da lacase D (veja SEQ ID NO: 70 do pedido copendente Protocolo N0 GC942 e 60/875.518) foi expresso usando o siste- ma de expressão descrito no pedido copendente US 60/984.430 (Protocolo N0 GC993P designado "Signal Sequences and co-expressed chaperones for improved heterologous protein production in a host cell" depositado em 1 de Novembro de 2007) em fermentadores de 14 litros. O caldo de fermentação foi coletado em 184 horas e concentrado por ultra-filtração (UFC 20070245). O concentrado foi diafiltrado em tampão acetato de sódio 25 mM, pH 4.0. Então, a amostra de diafiltrado de UFC foi carregada em uma coluna de tro- ca de íon contendo a resina Poros HS-20 (Applied Biosystems, coluna de 20 x 275 mm) equilibrada com tampão acetato de sódio 25 mM, pH 4.0. A colu- na foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão acetato de sódio 25 mM, pH 4.0. A proteína lacase D foi eluída da coluna usando um gradiente de sal (12 volumes de coluna) de 40 mm para 80 mM de cloreto de sódio em tam- pão acetato de sódio 25 mM, pH 4.0. As frações contendo atividade de laca- se foram agrupadas e concentradas posteriormente usando um agitador de célula de 400 ml_ Amicon com uma membrana de 10K. A proteína total foi medida por gel de proteína SDS usando BSA como padrão em 4 mg/ml (>90% puro). A amostra de lacase foi diluída 10.000 vezes com água e ar- mazenada em temperatura ambiente por 18 horas e a 4°C por mais do que

24 horas. A atividade ABTS foi medida como 8570 unidades/ml. A atividade específica da lacase D recombinante foi então calculadapela divisão de 8570 unidades/ml por 4 mg/ml resultando em 2140 unidades/mg de proteína o que representa 100 vezes mais atividade do que a lacase de Stachybotrys (16 10 u/mg) (veja Mander et al., Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72:5020-5026). Assim1 essa enzima resulta em menor descarga de cobre no meio ambiente do que as outras lacases, por exemplo, a lacase de Stachybotrys, em virtude da alta atividade específica.

Exemplo 8. Procedimento para alvejamento de brim Mediadores

4-hidróxi-3,5-dimetoxibenzamida (siringamida, SA) foi adquirida de Punjab Chemicals & Crop Protection Limited (Mumbai, India). 4-hidróxi- 3,5-dimetoxibenzonitrila (siringonitrila, SN) foi adquirida de StereoChemicaI, Inc., (Newark, DE) ou Punjab Chemicals & Crop Protection Limited (Mumbai, India).

Enzima

Enzima lacase, derivada de Cerrena unicolor (Exemplo 7, 8570 U/ml, 4 mg de proteína/ml) foi usada nos experimentos.

Procedimento

As incubações da enzima foram feitas em um ATLAS LP 2

Launder-O-meter em diferentes condições em relação ao pH, temperatura, concentração de enzima e concentração de mediador.

As reações foram realizadas em vasos de reação de aço inoxidável de 500 ml contendo 100 ml de líquido. A cada vaso, cinco retalhos de brim lavados com abrasivos (7x7 cm) (brim ACG modelo 80270) e 6 esferas de aço com

6 mm de diâmetro foram adicionados. Os vasos de reação foram fechados e colocados no laund-O-meter que foi pré-aquecida até a temperatura deseja- da. A incubação foi realizada por 30 minutos após o que os retalhos foram lavados com água morna "corrente", centrifugadas em uma centrífuga AEG IPX4 e secos com um ferro Elna Press Electronic no programa algodão e avaliados.

Lavagem de brim com abrasivos

Brim, 12 calças pesando aproximadamente 3 kg, foi degomado em uma máquina de lavar Unimac UF 50 sob as seguintes condições:

• Degomação por 15 minutos em uma proporção de solução de 10:1, 50°C com 0,5 g/l (15 g) de amilase Optisize (Genencor) e 0,5 g/l (15 g)

de um tensoativo não-iônico (por exemplo, Rucogen BFA, (Rudolf Chemie) ou Ultravon GPN (Huntsman))

• 2 enxágues a frio por 5 minutos em uma proporção de solução

de 30:1.

Após a degomagem, o brim foi lavado com abrasivos em uma máquina de lavar Unimac UF 50 sob as seguintes condições:

• Enxágüe a frio por 5 minutos em uma proporção de solução de

10:1

• Lavagem com abrasivos por 60 minutos em uma proporção de solução de 10:1, 55°C com 1 kg de pedra-pomes, tampão citrato (30 g de

citrato di-hdratado tri-sódico e 30 g de mono-hidrato de ácido cítrico) e 35 g de celulase IndiAge 2XL (Genencor).

• 2 enxagues a frio por 5 minutos em uma proporção de solução

de 30:1.

O brim foi seco em um secador de tecido doméstico Miele Novo- tronic T494C. Foram cortados retalhos de 7 x 7 cm das calças de brim. Avaliação de retalhos de brim

A cor de cinco retalhos de brim é medida com um Minolta Chro- mameter CR 310 no CIE Lab color space com uma fonte de Iuz D 65. As medidas foram feitas antes e depois do tratamento com lacase e os resulta- 30 dos dos cinco retalhos foi calculado. A diferença total de cor (TCD) é calcu- lada, A diferença total de cor pode ser calculada com a fórmula : TCD = V (AL)2 + (Aa)2 + (Ab)2. Avaliação das calças de brim

As calças de brim foram avaliadas com um Minolta Chromame- ter CR 310 no CIE Lab color space com uma fonte de Iuz D 65. As medidas foram feitas apenas depois do tratamento com lacase. Para cada calça de brim foram tomadas 8 medidas e do resultado das 12 calças (96 medidas) foi calculada a média.

Exemplo 9. Efeito da temperatura sobre o desempenho de alvejamento da lacase D recombinante (Unimac)

Alvejamento com lacase de brim lavado com abrasivos: Brim1 12 calças com

aproximadamente 3 kg, foi degomado e lavado com abrasivos como descrito no Exemplo 8. Após a lavagem com abrasivos, um tratamento com lacase foi feito em uma máquina de lavar Unimac UF 50 de acordo com o seguinte processo:

• 30 minutos em solução na proporção de 10:1,

· pH 6 (21 g de fosfato monossódico e 5 g de ácido adípico, la-

case D recombinante) ou pH 4,8 (8,6 g de fosfato monossódico e 16,8 g de ácido adípico, lacase Novoprime Base 268)

• lacase (lacase D recombinante ou Novoprime Base 268)

• mediador (siringamida (SA) e siringonitrila (SN))

· Após o tratamento com lacase o brim foi lavado duas vezes em

água fria por 5 minutos em uma proporção de solução de 30:1.

Os experimentos com lacase foram realizados e os resultados são apresentados nas tabelas 7 e 8.

Tabela 7

Concentração de Mediador Concentração Temperatura Nível de alve¬ lacase de Cerrena de mediador (0C) jamento (CIE unicolor L) 0,05 g/l / 0,4 U/ml SA 0,33 mM 60 35,6 0,05 g/l / 0,4 U/ml SN 0,47 mM 60 35,9 0,05 g/l / 0,4 U/ml SA 0,33 mM 40 35,6 0,05 g/l / 0,4 U/ml SN 0,47 mM 40 35,7 25

Tabela 8 Concentração de Concentração de Temperatura Nível de alveja¬ Novoprime base 268 mediador (0C) mento (CIE L) 0,05 g/l 0,023 g/l 60 35,9 0,05 g/l 0,023 g/l 40 33,7 A lacase D recombinante teve um desempenho melhor em tem-

peraturas menores do que as Iacases comerciais atualmente disponíveis. A lacase (na presença de mediador) fornece um efeito de alvejamento em temperaturas abaixo de 60°C, preferivelmente entre 40°C e 60°C. Assim, a lacase fornece economia de energia ao processo têxtil.

Exemplo 10. Efeito da enzima lacase D recombinante e a concentração de mediador sobre desempenho no alvejamento (Laund-O-meter)

O efeito da lacase e da concentração de mediador foi avaliado executando os experimentos nas tabelas abaixo em pH 6 (tampão fosfato monossódico 50 mM pH ajustado com solução de hidróxido de sódio 4N) e temperatura de 60°C.

Os experimentos foram feitos com os mediadores siringamida (SA) e siringonitrila (SN).

100 ml de tampão foram adicionados a um béquer com cinco retalhos, 7x7 cm. O total pesa 12 g (proporção brinrsolução = 1:8). As concentrações de lacase e mediador foram usadas como indicado na tabela abaixo.

Tabela 9

Concentração de enzima lacase (μΙ/Ι) Correspondência de atividade (unidade de lacase/g de brim) 10 0,67 33 2,17 55 3,67 78 5,17 100 6,67 Tabela 10

Concentração de mediador (nM) 0,10 0,33 Õ55 Concentração de mediador (nM)

0,78

_1^00_

As quantidades de mediador siringamida ou siringonitrila como indicadas nas tabelas abaixo foram adicionadas em cada béquer como uma diluição de solução-estoque de SA ou SN 275 mM em 98% de metanol. A lacase foi adicionada a cada béquer como indicado nas tabelas abaixo, co- 5 mo uma diluição de uma solução-estoque de 400 unidades de lacase/ml. Os béqueres foram fechados e processados a 60°C como descrito no Exemplo

8. Os retalhos foram avaliados como descrito no Exemplo 8.

Tabela 11

LACASE + SA a 60°C pH 6 Lacase (μί/Ι) Mediador siringamida (mM) TCD 100 1,00 5,6 100 1,00 6,0 100 0,10 2,9 78 0,33 4,4 55 1,00 6,2 55 0,55 5,3 33 0,78 5,5 33 0,33 4,6 10 1,00 3,2 10 0,10 2,5 55 0,55 5,8 100 0,55 5,3 78 0,78 5,9 100 0,10 3,2 55 0,10 3,1 10 0,55 3,6 TCD = Diferença total de cor Tabela 12

LACASE + SN a 60°C pH 6 Lacase (μί/Ι) Mediador siringonitrila (mM) TCD 100 1,00 7,6 LACASE + SN a 60°C pH 6 100 1,00 8,1 100 0,10 4,1 78 0,33 5,6 55 1,00 7,0 55 0,55 6,0 33 0,78 5,5 33 0,33 4,4 1,00 3,8 0,10 2,7 55 0,55 6,3 100 0,55 7,1 78 0,78 7,1 100 0,10 4,0 55 0,10 3,5 0,55 3,4 TCD = Diferença total de cor

As tabelas acima e as figuras 9 e 10 mostram que é necessário ambos, a enzima e o mediador, para se obter o alvejamento. Também mos- tra que há um pouco de flexibilidade na proporção enzima/mediador para a obtenção de um certo nível de alvejamento.

Exemplo 11 - Efeito dose-resposta de lacase D recombinante sobre o de- sempenho no alvejamento (Unimac)

Alvejamento com lacase de brim lavado com abrasivos - Brim, 12 calças pesando aproximadamente 3 kg, foi degomado e lavado com abrasivos co- 10 mo descrito no Exemplo 8. Após a lavagem com abrasivos, foi feito um tra- tamento com lacase de acordo com o seguinte processo: 30 minutos em uma solução na proporção de 10:1 e pH 6 (21 g de fosfato monossódico e 5 g de ácido adípico) e 60°C com lacase e mediador. Após o tratamento com lacase, o brim foi enxaguado duas vezes em água fria por 5 minutos em uma 15 solução na proporção de 30:1.

Os seguintes experimentos foram realizados:

• Siringamida 0,33 mM: Concentração de lacase de Cerrena Nível de alvejamento (CIE L) unicolor (g/l) 0,010 34,6 0,05 36,2 0,25 36,2 • Siringonitrila 0,39 mM:

Concentração de lacase de Cerrena Nível de alvejamento (CIE L) unicolor (g/l) 0,25 37,7 0,4 39,5 0,53 38,8 Os resultados são mostrados nas tabelas acima. Isso mostra

que com a lacase D recombinante e o mediador de amida, o nível de alve- jamento se estabiliza muito rapidamente. Com uma concentração de enzima 5 de 0,05 e 0,25 é obtido o mesmo nível de alvejamento. Para a lacase D re- combinante e o mediador de nitrila o nível de alvejamento aumenta até 0,4 g/l, onde parece ser um ótimo.

É entendido que os exemplos e modalidades aqui descritos têm apenas propósito ilustrativo e que várias modificações à Iuz desses serão 10 sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas no espírito e no escopo desse pedido e no escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui estão por meio des- se incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (17)

1. Processo para fornecimento de aspecto de alvejamento na densidade da cor da superfície de tecido tingido, o processo compreendendo contatar, em um meio aquoso, um tecido tingido com sistema de enzima que oxida fenol e um agente intensificador da seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 39</formula> em cuja fórmula A é um grupo tal como -Cn ou -CO-E, no qual E pode ser - H, -OH, -R, -OR ou -NXY, onde X, Y e Z podem ser idênticos ou diferentes e selecionados entre -H, -OH, e -R; R sendo C1-C16 alquila, preferivelmente Ci-C8 alquila, cuja alquila pode ser saturada ou insaturada, ramificada ou não-ramificada e opcionalmente substituída por um grupo carbóxi, sulfo ou amino; e B e C podem ser iguais ou diferentes e selecionados a partir de CmH2m+ii 1— m ^ 5.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o tecido é tingido com um corante de tina tal como índigo ou tioindigo.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o te- cido é um tecido celulósico ou uma mistura de fibras celulósicas ou uma mis- tura de fibras celulósicas e fibras sintéticas.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o tecido é brim, preferivelmente brim tingido com índigo ou tio- índigo.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o sistema de enzima que oxida o fenol é uma peroxidase ou uma fonte de peróxido de hidrogênio.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a peroxi- dase é peroxidase de rábano-silvestre, peroxidase de soja ou uma enzima peroxidase derivada de Coprinus. por exemplo, C. cinereus ou C. macrorhi- zus ou de Bacillus. por exemplo, B. pumilus ou Mvxococcus. por exemplo, M. virescens.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a fon- te de peróxido de hidrogênio é o peróxido de hidrogênio ou um precursor de peróxido de hidrogênio, por exemplo, perborato ou percarbonato, ou um sis- tema de enzima que gere peróxido, por exemplo, uma oxidase e seu subs- trato ou um ácido peroxicarboxílico ou um sal do mesmo.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a7, em que o meio aquoso contém H2O2 ou um precursor de H2O2 em uma concentração que corresponde a 0,001-25 mM de H2O2.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o sistema de enzima que oxida o fenol é uma lacase ou uma enzima relacionada à la- case junto com oxigênio.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a lacase é derivada de Aspergillus, Neurospora, por exemplo, N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Cerrena, Stachybotrys, Panus, por exemplo, Panus rudis, Theilava, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, por exemplo, T. villosa e T. versicolor, Rhizoctonia, por exemplo, R. solani, Coprinus, por exemplo C. plicatilis e C. cinereus, PsatyreHa, Myceliophthrora, por exemplo M. thermo- nhila, Schytalidum, Phlebia, por exemplo P. radita, ou Coriolus, por exemplo, C. hirsutus, Spongipellis sp., Polyporus, Ceriporiopsis subvermispora, Gano- derma tsunodae e Trichoderma.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o tecido é brim e a concentração da enzima que oxida fenol corresponde a 0,001 a 10000 pg de proteína de enzima por g de brim.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que 0 agente intensificador pertence ao grupo que consiste em 4- ciano-2,6-dimetoxifenol, 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol, 4-(A/-metil carbo- xamido)- 2,6-dimetoxifenol, e 4-[/V,/V-dimetil-carboxamido]- 2,6-dimetoxifenol.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que 0 tecido é brim e 0 agente intensificador em meio aquoso está presente em concentrações entre 0,005 a 1000 pmols por g de brim.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o mediador é <formula>formula see original document page 41</formula>

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o mediador é <formula>formula see original document page 41</formula> 4-carboxamido-2,6-dimetoxifenol

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o mediador é <formula>formula see original document page 41</formula> 4-(A/-metil carboxamido)-2,6-dimetoxifenol

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o mediador é <formula>formula see original document page 22</formula>