BRPI0720437A2

BRPI0720437A2 - Anticorpos antafonísticos contra ephb3

Info

Publication number: BRPI0720437A2
Application number: BRPI0720437-0A
Authority: BR
Inventors: Linda Masat; Ssucheng Jeff Hsu
Original assignee: Novartis Ag; Xoma Technology Ltd
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2014-01-07
Also published as: EP2494988A1; AU2007329307A1; EA200900767A1; EP2101816A1; EP2494988B1; KR101519672B1; KR20140119831A; JP5485696B2; CA2672120A1; JP2014159422A; US8961969B2; JP2010512152A; WO2008070780A9; EP2101816B1; US9541004B2; MX2009006034A; US20130108638A1; CN101687032A; US8377439B2; ES2435437T3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTAGONÍSTICOS CONTRA EPHB3".

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a métodos para prevenir e tratar doen- ças ou distúrbios relacionados com EphB3 administrando anticorpos antago- nistas de EphB3.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

EphB3 é um receptor na família de tirosina cinase receptora de efrina. Atualmente existem 14 receptores de Eph e 9 Iigantes de efrina co- nhecidos em humanos. Os receptores de efrina (Ephs) e seus ligantes, as efrinas, mediam numerosos processos de desenvolvimento, particularmente no sistema nervoso e sistemas vasculares. As efrinas são também conheci- das desempenharem um papel em desenvolvimento de tumor, angiogênese, crescimento metastático e sobrevivência celular. Com base em suas estrutu- ras e ligações de seqüência, as efrinas são divididas na classe de efrina-A (EFNA), que é ancorada à membrana por uma ligação de glicosilfosfatilinosi- tol, e a classe de efrina-B (EFNB), que são proteínas de transmembrana. A família Eph de receptores é dividida em 2 grupos com base na similaridade de suas seqüências de domínio extracelular e suas afinidades para ligantes de efrina-A e efrina-B de ligação. Receptores de Eph compõem o maior sub- grupo da família tirosina cinase receptora (RTK).

Ephs parecem funcionar por sinalização na ativação. A ligação de efrina induz a oligomerização do receptor de Eph causando a fosforilação de resíduos de justamembrana de Ephs. As Ephs ativadas têm múltiplas ti- rosinas fosforiladas que agem como sítios de redução para proteínas de si- nalização (por exemplo, proteínas contendo RasGAP, Src, LMW-PTP, pLCg, pl3-cinase, Grb2, e PDZ).

Superexpressão de receptores de Eph (EphA1, EphA2, EphB2) causa a transformação na ausência de hiperfosforilação de receptor. Recep- tores de EphB fosforilados regulam negativamente a série de reação de Ras- MAP-cinase e sinalização de FAK, prejudicando o crescimento celular.

EphB3 foi implicada como desempenhando um papel em uma variedade de estados de doença. Por exemplo, a expressão de EphB3 está associada com a hiperplasia característica e atrofia vilosa observada em do- ença celíaca (Diasdado e outro, Gut, 53(7): 944-951(2004)). EphB3 também foi também sugerida ser neuroprotetora em acidente vascular cerebral e do- 5 ença neurodegenerativa. A superregulação de expressão de EphB3 após o dano pode também contribuir para um ambiente na coluna espinhal que seja inibitória para regeneração axonal (Willson e outro, Cell Transplant, 12(3):279-90(2003)). Um Iigante de EphB3, Efrina B2, é observado ser su- perregulado em doença angiogênica ocular (Ozaki e outro, Am. J. Opthal- 10 mol., 138(2):270-9(2004)).

Desse modo, existe uma necessidade de identificar composi- ções e métodos que modulam a EphB3 e seu papel em tais doenças. A pre- sente invenção é direcionada a estas, bem como outras, necessidades im- portantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A seqüência de nucleotídeo para EphB3 é apresentada na SEQ ID NO: 1, e a sequencia de aminoácido é apresentada na SEQ ID NO: 2. O domínio extracelular (ECD) consiste em aminoácidos 1 a 559 da SEQ ID NO: 2. Alternativamente, o ECD consiste em 34 a 555 de SEQ ID NO: 2 20 (Observe que existem dois números de loco correspondendo à EphB3 hu- mana na base de dados NCBI Entrez de seqüências de proteína. Em ambos os casos, as predições foram feitas pelos pesquisadores submetendo as seqüências como (a) o número de aminoácidos codificados pela região de codificação do códon de partida ATG para o códon de terminação; (b) aquele 25 estiramento de aminoácidos em que a seqüência precursora representa a secreção de seqüência sinal (esta sequencia seria presa durante o processo de maturação para criar a proteína madura); e (c) aquele estiramento de re- síduos que representa a região de transmembrana. Visto que o domínio "ex- tracelular" de uma proteína madura é qualquer que se situe entre a sequên- 30 cia sinal e o domínio de transmembrana, a extensão predita do ECD depen- de de onde você coloca as regiões sinais e TM. Ambas as submissões de local (NP_004434 e P54753) predizem que o precursor é de 998 aminoáci- dos de comprimento, e que o sinal de secreção abrange os resíduos 1 a 33. Desse modo, ambos concordam que o início do ECD é o resíduo 34. Entre- tanto, discordam do início da região TM: NP_004434, predizem que o início é o resíduo 556 (estabelecendo o término do ECD o aminoácido número 5 555), enquanto que P54753 prediz o início da TM no resíduo 560 (estabele- cendo o término do ECD no aminoácido número 559)). Como descrito nos exemplos inclusos, um ECD consistindo nos aminoácidos 37-558 foi usado para imunizações para geração de anticorpo.

Os materiais e métodos da presente invenção atendem às ne- 10 cessidades anteriormente mencionadas e outras relacionadas na técnica. A invenção geralmente refere-se a anticorpos de antagonista de EphB3 que reduz a atividade de receptor de EphB3, métodos de preparação de tais an- ticorpos, e métodos de uso de anticorpos antagonistas de EphB3 para tratar uma doença ou distúrbio relacionada com EphB3.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo antagonista que

se liga ao domínio extracelular de EphB3 com uma afinidade (KD) de 10"6 M ou menos e compete com qualquer dos anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019 para ligar-se ao E- phB3 por mais do que 75% é fornecido. Pelo termo "afinidade (KD) de 10-6M ou menos" entende-se uma afinidade de, por exemplo, 10'6 Μ, 10'7 Μ, 10'8 Μ, 10~9 Μ, 10'10 M , 10"11 M ou 10'12 M (isto é, um número menor do que 10 6 M). Em outra modalidade, o anticorpo antagonista liga-se ao mesmo epítopo de EphB3 como qualquer dos anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019. Em ainda outra modalidade, um anticorpo antagonista é fornecido que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de qualquer dos anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019. Em ainda outra modalidade, um anticorpo an- teriormente mencionado é um anticorpo quimérico, um anticorpo humaniza- do, um anticorpo construído humano, um anticorpo humano, um anticorpo de cadeia única ou um fragmento de anticorpo.

Em outra modalidade da invenção, um anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido em que pelo menos um aminoácido dentro de uma CDR é substituído por um resíduo correspondente de uma CDR correspondente de outro anticorpo anti-EphB3. Em outra modalidade, um anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido em que um ou dois aminoácidos dentro de uma CDR foi modificado. Em ainda outra 5 modalidade, o anticorpo antagonista retem pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% identidade sobre a região leve ou pesada variável para os anticorpos de XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019. Em ainda outra modalidade, o anticorpo antagonista compreende uma região constante de uma sequencia 10 de anticorpo humano e uma ou mais regiões de estrutura variável de cadeia pesada e leve de uma sequencia de anticorpo humano. Em ainda outra mo- dalidade, o anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido, no qual a sequencia de anticorpo humana é uma sequencia humana individual, uma sequencia de consenso humana, uma sequencia de linha germinativa 15 humana individual, ou uma sequencia de linha germinativa de consenso hu- mana.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo antagonista anteriormente mencionado em que região constante de cadeia pesada é uma modificada ou não modificada IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, um fragmento das mesmas, ou combinações das mesmas. Em outra modalida- de, o anticorpo antagonista tem uma afinidade de ligação de 10"7, 10"8, 10"9, 10"10 ou 10'11 M ou menos a EphB3. Em ainda outra modalidade, um anti- corpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido compreendendo uma substituição conservativa nas CDRs. Em ainda outra modalidade, um anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido compreenden- do mudanças conservativas ou não-conservativas nos resíduos e risco baixo e moderado. Em outra modalidade, um anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido onde a região constante de cadeia leve é uma regi- ão constante de cadeia leve Iambda modificada ou não-modificada, uma re- gião constante de cadeia leve kapa, um fragmento das mesmas, ou combi- nações das mesmas.

Ensaios in vitro para medir a inibição de atividade de EphB3 são conhecidos na técnica. Por exemplo, ensaios de migração celular (ex. ensai- os de migração HUVEC para angiogênese, migração de célula intestinal pa- ra doença Celíaca, células inflamatórias em acidente vascular cerebral) e ensaios de adesão de matriz (ex. Laminina, fibronectina) são contemplados 5 (Miao, H. e outro, J. Biol. Chem., 280(2): 923-931 (2005); Wang, Y. e outro, Angiogenesis, 7:335-345 (2004); Nakada, M e outro, Cancer Res., 66(17):8492-8500 (2006); e Gupta, S.K. e outro, J. Leuko. Biol. 66(1): 135- 143 (1999)).

Em todavia outras modalidades exemplares, um anticorpo anta- 10 gonista anteriormente mencionado é fornecido que realça a proliferação ce- lular, por exemplo, proliferação celular neural e/ou regeneração. Em outras modalidades exemplares, um anticorpo antagonista que inibem a prolifera- ção celular, por exemplo, associada com células intestinais, por exemplo, em doença celíaca, ou vascular ou células endoteliais, por exemplo, em angio- 15 gênese é útil.

Numerosos métodos são contemplados pela presente invenção. Em uma modalidade da invenção, um método de avaliar quanto a um anti- corpo antagonista para o domínio extracelular de uma proteína EphB3 útil para o tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com EphB3 é for- 20 necido compreendendo as etapas de: contatar um polipeptídeo compreen- dendo o ECD de EphB3 com um anticorpo candidato que contém pelo me- nos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019; detectar a afinidade de ligação do anticorpo candidato para o polipeptídeo, e identificar o anticorpo candidato 25 como um anticorpo antagonista útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3 se uma afinidade de ligação de pelo menos 10'6 M for detectada. Em ainda outra modalidade, um método de sistemati- camente alterar anticorpos e analisar quanto a um anticorpo antagonista pa- ra o domínio extracelular de uma proteína EphB3 útil para o tratamento de 30 uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3 é fornecido compreenden- do as etapas de: preparar um anticorpo candidato que contenha modifica- ções para um ou dois aminoácidos dentro das CDRs de anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019; conta- tar um polipeptídeo compreendendo o ECD de EphB3 com o anticorpo can- didato; detectar a afinidade de ligação do anticorpo candidato para o polipep- tídeo, e identificar o anticorpo candidato como um anticorpo antagonista útil 5 para o tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com EphB3 se uma afinidade de ligação de pelo menos 10'6 M for detectada.

Em ainda outra modalidade, um método de avaliar quanto a um anticorpo antagonista para o domínio extracelular de uma proteína EphB3 útil para o tratamento de Doenças ou distúrbios relacionados com EphB3 é fornecido compreendendo as etapas de: contatar uma célula intestinal, endo- telial ou neural com um anticorpo candidato que contenha pelo menos 1, 2,

3, 4, 5 ou 6 CDRs de anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019 ou um anticorpo que contenha uma modificação de um ou dois aminoácidos dentro de uma ou mais CDRs; detectar a prolife- 15 ração ou sobrevivência da célula; e identificar o anticorpo candidato como um anticorpo antagonista útil para o tratamento de doença ou distúrbio rela- cionado com EphB3 se uma alteração na proliferação ou sobrevivência celu- lar for detectada.

Em ainda outra modalidade, um método de tratar um indivíduo sofrendo de doença celíaca ou outras doenças associada com proliferação celular intestinal patológica é fornecido compreendendo a etapa de adminis- trar um dos anticorpos anteriormente mencionados em uma quantidade te- rapeuticamente eficaz. Em ainda outras modalidades, um método de tratar neurodegenerative doenças, ou para estimular regeneração neuronal axonal ou outra após danos isquêmicos ou traumáticos ou outros aos nervos ou coluna espinhal, é fornecido. Doenças neuronais exemplares incluem dano aos neurônios por dano traumático, por isquemia vascular local ou cerebral, por toxinas, ou por infecção incluindo infecção viral, bacteriana, fúngica ou parasítica, bem como doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer, demência senil, Esclerose Lateral Amiloide (ALS), Esclerose Múltipla (MS), neuropatia periférica, atrofia muscular espinhal, doença de Creutzfeldt-Jakob, ou demência de AIDS. Em outra modalidade, um método de tratar doenças angiogênicas ou outras doenças associada com prolifera- ção celular vascular patológica é fornecido compreendendo a etapa de ad- ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dos anticorpos an- teriormente mencionados. Doenças angiogênicas exemplares incluem ocular 5 doenças tais como retinopatia diabética ou retinopatia de prematuridade, ou degeneração macular relacionada com a idade, bem como psoríase, artrite reumatóide, ateroma, restenose arterial, hemangioma, doenças autoimunes, angiogênese associada com outra inflamação aguda ou crônica, formação de cicatrização ou adesão, ou endometriose. Em ainda outra modalidade, 10 um segundo agente terapêutico é administrado. Em ainda outra modalidade, o paciente é também tratado com outros agentes terapêuticos ou cirurgia.

Em ainda outra modalidade da invenção, um método de alvejar uma célula expressando EphB3 é fornecido compreendendo a etapa de ad- ministrar um anticorpo antagonista anteriormente mencionado, conjugado a 15 um radionuclídeo ou outra toxina. Em ainda outra modalidade, um método anteriormente mencionado é fornecido no qual o paciente é um mamífero. Em ainda outra modalidade, o paciente é um humano.

Em outra modalidade da invenção, uma molécula de ácido nu- cléico isolada é fornecida compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo antagonista anteriormente mencionado. Em ainda outra modalidade, um vetor de ex- pressão é fornecido compreendendo a molécula de ácido nucléico anterior- mente mencionada operavelmente ligada a uma seqüência de controle regu- latório. Em ainda outra modalidade, uma célula hospedeira é fornecida com- preendendo o vetor anteriormente mencionado ou a molécula de ácido nu- cléico anteriormente mencionada. Em ainda outra modalidade, um método de usar a célula hospedeira anteriormente mencionada para produzir um anticorpo antagonista é fornecido, compreendendo cultivar a célula hospe- deira sob condições adequadas e recuperar o anticorpo. Em outra modalida- de, o anticorpo antagonista produzido pelo método anteriormente menciona- do é fornecido.

Em outra modalidade da invenção, um anticorpo antagonista anteriormente mencionado é fornecido, o qual é purificado para pelo menos 95% de homogeneidade em peso. Em ainda outra modalidade, uma compo- sição farmacêutica compreendendo o anticorpo antagonista anteriormente mencionado e um veículo farmaceuticamente aceitável é fornecido. Em ain- 5 da outra modalidade, a kit é fornecido compreendendo um anticorpo antago- nista anteriormente mencionado compreendendo uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo da invenção, embalado em um recipiente, em que o kit opcionalmente contém um segundo agente terapêutico, e tam- bém compreendendo um rótulo ligado a ou embalado com o recipiente, o 10 rótulo descrevendo os conteúdos do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções considerando o uso dos conteúdos do recipiente para tratar uma doença ou distúrbio relacionado por EphB3. Em outra modalidade, o kit ante- riormente mencionado é fornecido onde o recipiente é um frasconete ou frasco ou seringa pré-carregada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a linha de risco para a cadeia leve e cadeia pesada XPA.04.017, XPA.04.031, e XPA.04.019 (H = risco elevado, M = ris- co moderado, L = baixo risco), a seqüência de aminoácido de região variável de cadeia leve e cadeia pesada XPA.04.017, XPA.04.031, e XPA.04.019 20 (SEQ ID NOs: 3-8), e a localização de CDR H1, H2 e H3 dentro da seqüên- cia de aminoácido.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção fornece anticorpos antagonistas específicos de EphB3, formulações farmacêuticas contendo tais anticorpos antagonistas, 25 métodos de preparar os anticorpos antagonistas e formulações farmacêuti- cas, e métodos de tratar pacientes com as formulações e compostos farma- cêuticos. Tais anticorpos antagonistas podem inibir a ligação de um Iigante (por exemplo, Efrina B2, Efrina B1, Efrina B3) a EphB3, inibir dimerização de EphB3, inibir Fosforilação de EphB3, inibir ativação de receptor de EphB3 30 induzida por ligante, e/ou modular adesão de célula-célula mediada por E- phB3. Uma classe de anticorpos antagonistas fornecida aqui inibem a liga- ção de Efrina B2 ao receptor de EphB3 e pode agir como um inibidor compe- titivo. Outra classe de anticorpos antagonistas fornecida aqui não inibem A ligação de Efrina B2 ao receptor de EphB3 porém todavia reduz o nível de fosforilação e/ou dimerização de EphB3, uma medida de ativação de recep- tor. Similarmente, outra classe de anticorpos antagonistas fornecida aqui 5 inibem a ligação de Efrina B1 e/ou Efrina B3 ao receptor de EphB3 e pode agir como um inibidor competitivo. Still Outra classe de anticorpos antagonis- tas fornecida aqui não inibem a ligação de Efrina B1 e/ou Efrina B3 ao recep- tor de EphB3, porém todavia reduz o nível de fosforilação e/ou dimerização de EphB3.

Em algumas modalidades anticorpos antagonistas da presente

invenção ligam um epítopo descrito aqui, ou uma porção do mesmo. Em al- gumas modalidades, ligação do anticorpo antagonista ao receptor inibem a fosforilação do receptor. Em algumas modalidades, ligação do anticorpo an- tagonista ao receptor inibem a ligação de um Iigante a EphB3. Em algumas 15 modalidades, ligação do anticorpo antagonista ao receptor inibem dimeriza- ção de EphB3. Em algumas modalidades, ligação do anticorpo antagonista ao receptor inibem ativação de receptor induzida por ligante. A ativação de receptor (isto é, sinalização) pode ser determinada por técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, a ativação de receptor pode ser determinada detec- 20 tando-se a fosforilação (por exemplo, tirosina ou serina/treonina) do receptor ou seu substrato por imunoprecipitação seguido por análise de mancha do Oeste. Em algumas modalidades, anticorpos antagonistas são fornecidos que inibem a atividade de ligante ou atividade de receptor em pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 25 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50% da atividade na ausência do anticorpo.

Em algumas modalidades os anticorpos de EphB3 inibem a liga- ção de EphB3 às proteínas adaptoras intracelulares.

Como aqui usado, o termo "proteínas adaptoras intracelulares" refere-se a uma proteína que conecta diferentes segmentos de um complexo de sinalização. O adaptor pode ou não ter atividade enzimática. Exemplos de proteínas adaptoras são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, Grb2 é uma proteína adaptora que não tem atividade enzimáti- ca intrínsica, enquanto que a RasGAP é uma proteína adaptora que tem ati- vidade enzimática.

Diversos anticorpos de murino ou quiméridos preferidos com alta afinidade e potência quando avaliados por ensaios in vitro são modificados para ficarem menos imunogênicos em humanos com base no método Hu- man Engineering™ de Studnicka e outro. Em síntese, os resíduos de amino- ácido expostos na superfície de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve são modificados para resíduos humanos em posições determinadas serem improváveis de adversamente realizarem ou a ligação de antígeno ou duplicação da proteína, ao mesmo tempo que reduzindo sua imunogenicidae com respeito a um ambiente humano. Genes sintéticos codificando regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve modificada são construídos e ligados à seqüências de codificação para as regiões constantes de cadeia pesada gama humana e/ou cadeia leve kapas. Quaisquer regiões constantes de ca- deia pesada e cadeia leve humanas podem ser usadas em combinação com as regiões variáveis de anticorpo Human Engineered™. Os genes de cadeia pesada e leve humanos são introduzidos em células mamíferas e os produ- tos de imunoglobulina recombinante resultantes são obtidos e caracteriza- dos.

Antagonistas de anticorpos exemplares de acordo com a inven- ção incluem XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019. Os seguintes hibridomas de secreção de anticorpo foram depo- sitados com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University 25 Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (USA), de acordo com as provisões do Budapest Treaty, de 17 de novembro de 2006:

NOME DO HYBRIDOMA NÚMERO DE DEPÓSITO ATCC XHA.05.172 XHA.05.849 As definições abaixo são fornecidas como um auxílio no enten- dimento da invenção mais completamente.

Definições Gerais O "EphB3" humano de antígeno alvo, como aqui usado, refere- se a um polipeptídeo humano tendo substancialmente a mesma seqüência de aminoácido como SEQ ID NO: 2 e variantes alélicas de ocorrência natural do mesmo. "ECD de EphB3" como aqui usado refere-se à porção extracelu- 5 Iar de EphB3 representada pelos aminoácidos 37 - 558 da SEQ ID NO: 2.

"Uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3" como aqui usado refere-se a doença celíaca ou outras doenças associada com prolife- ração celular intestinal patológica; doença angiogênica ou outras doenças associada com pathological vascular a proliferação celular, por exemplo, o- 10 cular doenças angiogênicas tais como retinopatia diabética ou retinopatia de prematuridade, ou degeneração macular relacionada com a idade, bem co- mo psoríase, artrite reumatóide, ateroma, restenose arterial, hemangioma, doenças autoimunes, angiogênese associada com outra inflamação aguda ou crônica, formação de cicatrização ou adesão, ou endometriose; dano 15 neuronal, por exemplo, por dano traumático, por isquemia vascular local ou cerebral, por toxinas, ou por infecção incluindo infecção viral, bacteriana, fúngica ou parasítica; neurodegenerative doenças, por exemplo, doença de Parkinson, Doença de Huntington, Doença de Alzheimer, demência senil, Esclerose Lateral Amiloide (ALS)1 Esclerose Múltipla (MS), neuropatia perifé- 20 rica, atrofia muscular espinhal, doença de Creutzfeldt-Jakob, ou demência de AIDS; ou câncer, por exemplo, câncer de pulmão, ovário, esofágico, có- lon ou mama.

"Tratamento" é uma intervenção realizada com a intenção de peenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio. Consequen- 25 temente, "tratamento" refere-se tnto a tratamento terapêutico quant profiláti- co ou medidas preservativas. Aqueles em necessidade de tratamento inclu- em aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles em que o distúrbio deve ser prevenido. Tratamento de pacientes sofrendo de sintomas clínicos, bio- químicos, radiológicos ou subjetivos da doença podem incluir aliviar alguns 30 ou todos os tais sintomas ou reduzir a predisposição à doença.

"Mamífero" paa os propósitos de tratamento refere-se a quasl- quer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esportes, ou de estima- ção, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.

Como aqui usada, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" 5 é entendidas referir-se a uma quantidade de anticorpo terapêutico ou profilá- tico que seria apropriada para uma modalidade da presente invenção, que eliciará o efeito ou resposta terapêutica ou profilática desejada, incluindo aliviar alguns ou todos os tais sintomas de doença ou reuzir a predisposição à doença, quando administrada de acordo com o regime de tratamento de- 10 sejado.

Antibodies

O termo "imunoespecífico" ou "especificamente ligando" significa que o anticorpo liga-se a EphB3 ou seu ECD com um Ka maior do que ou igual a cerca de 104 M'1, preferivelmente maior do que ou igual a cerca de 15 105 M'1, mais preferivelmente maior do que ou igual a cerca de 106 Μ-1. O anticorpo pode ter afinidade substancialmente maior para o antígeno alvo em comparação à outrs moléculas não relacionadas. O anticorpo pode also ter afinidade substancialmente maior para o antígeno alvo em comparação à ortólogos ou homólogos, por exemplo, pelo menos 1,5-vezes, 2-vezes, 5- 20 vezes, 10-vezes, 100-vezes, 103-vezes, 104-Vezes1 105-vezes, 106-vezes ou maior afinidade relativa para o antígeno alvo. Alternativamente, pode ser útil para o anticorpo interagir com um homólogo ou ortólogo conhecido.

Anticorpos da invenção podem também ser caracterizados por uma afinidade (K0) de pelo menos 10'4 M, preferivelmente pelo menos cerca 25 de IO4Ma cerca de 10'12 M, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10'5 Μ, 10'6 M, IO'7 M ou 10‘8 Μ, 10'9 Μ, 10'10 M, ou 10'11 M. A afinidade apropria- da para os anticorpos pode variar dependendo da aplicação terapêutica. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas con- vencionais, tais como por diálise de equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 30 2000, usando procedimentos gerais delineados pelo fabricante; por radioi- munoensaio usando antígeno alvo radiorrotulado; ou por outro método co- nhecido pelo técnico versado. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard e outro, Ann N.Y. Aead. Sei., 51:660 (1949).

Por "anticorpo antagonista" entende-se uma molécula de anti- corpo que é capaz de inibir a ativação de EphB3. Consequentemente, um 5 anticorpo anti-EphB3 "antagonista" é capaz de inibir a ligação a EphB3, di- minuindo a atividade de fosforilação, diminuindo a oligomerização de EphB3, diminuindo a internalização de EphB3, e/ou diminuindo a sinalização a ju- sante de EphB3. O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos totalmente montados, anticorpos monoclonais, anticorpos policlo- 10 nais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpo que podem se ligar a antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv1 diacorpos, anticorpos de cadeia única), e peptídeos recombinan- tes compreendendo os anteriores, contanto que eles exibem a atividade bio- lógica desejada. Fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por técni- 15 cas de DNA recombinantes ou por clivagem enzimática ou química de anti- corpos intactos e são descritos também abaixo. Exemplos não Iimitantes de anticorpos monoclonais incluem de murino, quiméricos, humanizados, hu- manos, e imunoglobulinas Human Engineered™, anticorpos, proteínas de fusão quiméricas tendo seqüências derivadas de imunoglobulinas, ou muteí- 20 nas ou derivados dos mesmos, cada qual descrito também abaixo. Multíme- ros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos, incluindo anticor- pos quimicamente derivados, são contemplados. Anticorpos de qualquer classe ou subclasse de isótipo são contemplados de acordo com a presente invenção.

O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado refere-se a um

anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homo- gêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idêntidos exceto para mutações de ocorrência natural possíveis ou modifica- ções pós-translacionais alternativas que podem estar presente em menores 30 quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos; ao contrá- rio das preparações dse anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamen- te incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinan- tes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra uma única determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos mono- clonais são vantajosos pelo fato de que eles são sintetizados pela cultura homogênea, não contaminada por outras imunoglobulinas com diferentes 5 especificidades e características.

O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos , e não deve ser construído como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a se- 10 rem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo mé- todo de hibridoma primeiro descrito por Kohler e outro, 1975 Nature, 256:495, ou pode ser feito por métodos de DNA recombinante (veja, por e- xemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567). Os "anticorpos mono- clonais" podem também ser recombinantes, quiméricos, humanizados, hu- 15 manos, Human Engineered™, ou fragmentos de anticorpo, por exemplo.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contamínantes de seu ambiente natural são materiais que interferem com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, 20 hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modasli- dades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de anticorpo, como determinado pelo método Lowry, e mais preferivel- mente mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido de terminal N ou inter- 25 na pelo uso de um seqüenciador de xícara giratória, ou (3) para homogenei- dasde por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul Coomassie ou, preferivelmente, mancha prata. O anticorpo isoladi inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinari- 30 amente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado em pelo menos uma etapa de purificação.

Uma "imunoglobulina" ou "anticorpo nativo" é uma glicoproteína tetramérica. Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par ten- do uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção de terminal amino de cada cadeia inclui uma região "variável" ("V") de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsá- vel por reconhecimento de antígeno. A porção de terminal carbóxi de cadas cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. As imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas ca- deias pesadas. As cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ), gama (γ), alfa (a), e épsilon (ε), e definem os isótipos do anticorpo como IgM1 IgD, IgG1 IgA, e IgE, respectivamente. Diversos destes podem ser tam- bém divididos em subclasses ou isótipos, por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Diferentes isótipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, os isótipos IgGI e lgG3 têm atividade de citotoxicidade celular de- pendente de anticorpo (ADCC). As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa (k) e Iambda (λ). Dentro de cadeias leves e pesa- das, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Veja geralmente, Fun- damental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

Para uma descrição detalhada da estrutura e geração de anti- corpos , veja Roth, D.B., e Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade. Em síntese, o processo para gerar DNA codificando as seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada e leve ocorre primariamente no desenvolvimento de células B. Antes da redisposi- ção e ligação de vários segmentos de gene de imunoglobulina, os segmen- tos de gene V, D, J e constante (C) são encontrados geralmente em proxi- midade relativamente íntima sobre um único cromossoma. Durante a dife- renciação de célula B, um de cada dos membros da família apropriada dos segmentos de gene V, D, J (ou apenas V e J no caso de genes de cadeia leve) são combinados para formar regiões variáveis funcionalmente redis- postas dos genes de imunoglobulina pesada e leve. Este processo de redis- posição de segmento de gene parece ser seqüencial. Primeiro, ligações D-a- J de cadeia pesada são feitas, seguidas por ligações de V-a-DJ de cadeia 5 pesada e ligações V-a-J de cadeia leve. Além da redisposição de segmentos V, D e J, outra diversidade é gerada no repertório primário de cadeias pesa- das e leves de imunoglobulina por meio de recombinação variável nas locali- zações onde os segmentos V e J na cadeia leve são ligados e onde os seg- mentos D e J de uma cadeia pesada são ligados. Tal variação na cadeia 10 leve tipicamente ocorre dentro do último códon do segmento de gene Veo primeiro códon do segmento J. Imprecisão similar em ligação ocorre no cro- mossoma de cadeia pesada entre os segmentos D e Jh e pode estender-se além de tanto quanto 10 nucleotídeos. Além disso, diversos nucleotídeos podem ser inseridos entre os segmentos de gene DeJne entre o Vh e D 15 que não são codificados por DNA genômico. A adição destes nucleotídeos é conhecida como diversidade de região N. O efeito puro de tais redisposições nos segmentos de gene de região variável e a recombinação variável que pode ocorrer durante tais ligações é a produção de um repertório de anticor- po primário.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um

anticorpo de tamanho natural intacto, preferivelmente a ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto, e incluem anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Exemplos não-limitantes de fragmen- tos de anticorpo incluem Fab1 Fab', F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio (dAb), 25 fragmentos de região de determinação de complementaridade (CDR), anti- corpos de cadeia única (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos lineares (Zapata e outro, protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); anticorpos recombinantes que- lantes, tricorpos ou bicorpos, intracorpos, nanocorpos, imunofarmacêuticos 30 modulares pequenos (SMIPs), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação de antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo con- tendo VHH, ou muteínas ou derivados dos mesmos, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente pa- ra conferir ligação de antígeno específico ao polipeptídeo, tal como uma se- qüência de CDR1 contanto que o anticorpo retenha a atividade biológica de- sejada.

5 A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de

ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada qual com um sítio de ligação de antígeno único, e um fragmento residual "Fe", cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar-se facilmente. O tratamento de pepsina produz um fragmento de F(ab')2 que tem dois fragmentos "Fv". Um 10 fragmento "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e uma leve em associação não covalente estreita. Está nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interage para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a 15 superfície do dímero VH VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especi- ficidade de ligação a antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de uma Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar-se a antígeno.

Os fragmentos de anticorpo "Cadeia única Fv" ou "sFv" ou

"scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, onde estes domí- nios estão presente em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv também compreende uma ligação de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilitam a Fv formar a estrutura desejada para 25 ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv veja Pluckthun in The Phar- macology of Monoclonal Antibodies, vol. I 13, Rosenburg e Moore eds., S- pringer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab1 pela adição de alguns resíduos na termi- nação carbóxi de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo. Fab1-SH é a designação in- clusa para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes transportam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 original- mente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de articulação entre eles.

5 O termo região "hipervariável" refere-se aos resíduos de amino-

ácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou CDR [isto é, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50- 10 65 (H2) e 95-102 (H3) em um domínio variável de cadeia pesada como des- crito por Kabat e outro, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (isto é, resíduos 26- 32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 15 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) em um domínio variável de cadeia pesada como descrito por [Chothia e outro, J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)].

"Estrutura" ou resíduos FR são aqueles resíduos de domínio va- riável exceto os resíduos de região hipervariável.

A frase "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras.

A frase "anticorpo quimérico," como aqui usada, refere-se a um anticorpo contendo seqüência derivada de dois anticorpos diferentes (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567) que tipicamente origina-se de diferentes espécies. Mais tipicamente, anticorpos quiméricos 25 compreendem fragmentos de anticorpo humano e de murino, geralmente regiões constantes humanas e variáveis de camundongo.

O termo "muteína" refere-se à seqüência de polipeptídeo de um anticorpo que contenha pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido na região variável ou na porção equivalente à região variável, 30 contanto que a muteína retenha a afinidade de ligação desejada ou atividade biológica. As muteínas podem ser substancialmente homólogas ou substan- cialmente idênticas ao anticorpo origem. O termo "derivado" quando usado com relação aos anticorpos da invenção refere-se a anticorpos covalentemente modificados por tais téc- nicas como ubiquitinação, conjugação aos agentes terapêuticos ou diagnós- ticos, rotulagem (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), Iiga- 5 ção de polímero covalente tal como pegilação (derivatização com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos não- naturais. Os derivados da invenção reterão as propriedades de ligação de moléculas não derivatizadas da invenção .

Quando usado aqui, o termo "anticorpo" especificamente inclui

qualquer um dos seguintes que retém a capacidade de ligar-se à porção ex- tracelular de EphB3:

1) uma muteína de aminoácio de um anticorpo origem tendo uma seqüência de aminoácido representada na Figura 1, incluindo muteínas compreendendo uma seqüência de aminoácido pesada de cadeia variável

que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido origem, e/ou compreendendo uma seqüência de aminoácido leve de cadeia variável que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido origem, levando em consideração aminoácidos

similares para a determinação de homologia;

2) polipeptídeos de ligação de EphB3 compreendendo uma ou mais regiões de determinação complementar (CDRs) de um anticorpo ori- gem tendo uma seqüência de aminoácido representada na Figura 1, preferi- velmente compreendendo pelo menos a CDR3 da cadeia pesada, e preferi-

velmente compreendendo duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, ou todas as seis CDRs;

3) anticorpos Human Engineered™ gerados alterando-se a se- qüência origem de acordo com os métodos representados em Studnicka e outro, Patente dos Estados Unidos n° 5.766.886 e Exemplo 8 incluso, usan-

do a numeração Kabat para identificar resíduos de baixo, moderado e alto risco; tais anticorpos compreendendo pelo menos uma das seguintes cadei- as pesadas e pelo menos uma das seguintes cadeias leves: (a) a cadeia pesada em que todos os resíduos de roedor de baixo risco que diferem dos resíduos correspondentes em uma seqüência de imunoglobulina de referên- cia humana foi modificada para ficar igual ao resíduo humano na seqüência de imunoglobulina de referência humana ou (b) a cadeia pesada em que todos os resíduos de roedor de baixo e moderado risco foram modificados, se necessário, para ficar iguais aos resíduos como na seqüência de imuno- globulina de referência humana, (c) uma cadeia leve em que todos os resí- duos de baixo risco foram modificados, se necessário, para ficar resíduos iguais à seqüência de imunoglobulina de referência humana ou (b) a cadeia leve em que todos os resíduos de baixo e moderado risco foram modifica- dos, se necessário, para os mesmos resíduos de uma seqüência de imuno- globulina humana

4) muteínas dos anticorpos anteriormente mencionados em pa- rágrafo precedente (3) compreendendo uma cadeia pesada ou leve tendo pelo menos 60% de identidade de seqüência de aminoácido com a cadeia leve de roedor original, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferi- velmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e o mais preferivelmente pelo menos 95%, incluindo por exemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100% identical;

5) polipeptídeos de ligação de EphB3 compreendendo os resí- duos de alto risco de uma ou mais CDRs do anticorpo de roedor, e preferi- velmente compreendendo resíduos de alto risco de duas ou mais, ou três ou mais, ou quatro ou mais, ou cinco ou mais, de todas as seis CDRs, e opcio- nalmente compreendendo uma ou mais mudanças nos resíduos de baixo ou moderado risco;

Por exemplo, compreendendo uma ou mais mudanças em um resíduo de baixo risco e substituições conservativas em um resíduo de risco moderado, ou

Por exemplo, retendo os resíduos de aminoácido de moderado e aslto risco e compreendendo uma ou mais mudanças em um resíduo de bai- Onde as mudanças incluem inserções, deleções ou substitui- ções e podem ser substituições conservativas ou podem causar o anticorpo construído estar mais próximo em seqüência a uma seqüência de cadeia leve ou cadeia pesada humana, uma seqüência de cadeia leve ou cadeia 5 pesada de linha germinativa humana, uma seqüência de cadeia leve ou ca- deia pesada humana de consenso, ou uma seqüência de cadeia leve ou ca- deia pesada de linha germinativa humana de consenso. Tais mudanças con- templadas podem também ser exibidass em forma de seqüência como se- gue. Em uma seqüência hipotética de AKKLVHTPYSFKEDF, onde o risco 10 respectivo repartido para cada resíduo de acordo com Studnicka e outro, Patente dos Estados Unidos n° 5.766.886, é HMLHMLHMLHMLHML (H = elevado, M = médio, L = baixo), mudanças exemplares aos resíduos de bai- xo risco da seqüência hipotética podem ser exibidas como: AKXLVXTPXSF- XEDX onde X é qualquer aminoácido, ou alternativamente, onde X é uma 15 substituição conservativa do resíduo original naquela posição, e mudanças exemplares aos resíduos de baixo e moderado risco podem ser exibidas si- milarmente, por exemplo, AYXLYXTYXSYXEYX, onde X é qualquer aminoá- cido e Y é uma substituição conservativa do resíduo original naquela posi- ção.

O termo "anticorpo de competição" inclui

1) um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo de EphB3 como o anticorpo XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019, por exemplo, como determinado por meio de cristalografia de raio-X; e 2) um anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo

XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019 by mais do que 75%, mais do que 80%, ou mais do que 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%.

Anticorpos da invenção preferivelmente ligam-se ao ECD de E- phB3 com uma afinidade Kd de pelo menos 10'6, 10'7, 10"8,10"9, 10'10ou 10'11 M ou menos e preferivelmente inibem a fosforilação de receptor, sinalização, ligação de ligante, dimerização de EphB3, ativação de receptor induzida por ligante, e/ou adesão de célula-célula mediada por EphB3.

Opcionalmente, qualquer anticorpo quimérico, humano ou hu- manizado publicamente descrito antes da data de depósito do mesmo, ou descrito em um pedido depositado antes da data de depósito do mesmo, é 5 excluído do escopo da invenção .

Anticorpo monoclonal de "não-roedor" é qualquer anticorpo, co- mo amplamente definido aqui, que não é um anticorpo monoclonal de roedor intacto completo gerado por um hibridoma de roedor. Desse modo, anticor- pos de não-roedor especificamente incluem, porém não estão limitados a, 10 muteínas de anticorpos de roedor, fragmentos de anticorpo de roedor, anti- corpos lineares, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos Human Engineered™ e anticorpos humanos, incluindo anticorpos humanos produzidos de animais transgênicos ou por meio de tecnologia de exibição de fago. Similarmente, anticorpos não-murinos incluem porém não estão 15 limitados à muteínas de anticorpos de murino, fragmentos de anticorpo de murino, anticorpos lineares, quiméricos, humanizados, Human Engineered™ e anticorpos humanos.

Antígeno Alvo

O antígeno alvo a ser usado para a produção de anticorpos pode 20 ser, por exemplo, as porção extracelular de EphB3, ou um fragmento das mesmas que retém o epítopo desejado, opcionalmente fundido a outro poli- peptídeo que permiute o epítopo ser exibido em sua conformação nativa. Alternativamente, o EphB3 intacto expresso na superfície de células pode ser usado para gerar anticorpos. Tais células podem ser transformadas para 25 expressar o EphB3 ou podem ser outras células de ocorrência natural que expressam EphB3. Outras formas de polipeptídeos de EphB3 úteis para ge- rar anticorpos serão evidentes para aqueles versados na técnica.

Vários domínios de EphB3 incluem o domínio de ligação de li- gante (resíduos de aminoácido 39-212 de SEQ ID NO: 2), o domínio TNFR (resíduos de aminoácido 256-331 de SEQ ID NO: 2), o primeiro domínio de fibronectina (resíduos de aminoácido 340-435 de SEQ ID NO: 2), e o segun- do domínio de fibronectina (resíduos de aminoácido 453-535 de SEQ ID NO: 2). Epítopos exemplares do domínio de ligação de ligante de EphB3 são se- lecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOS:9-143. Epítopos exem- plares do domínio TNFR de EphB3 são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 159-257. Epítopos exemplares do primeiro domínio de fi- bronectina de EphB3 são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOS:257-299. Epítopos exemplares do segundo domínio de fibronectina de EphB3 são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOS:378-419.

A Tabela 1 abaixo fornece regiões de EphB3 (SEQ ID NO:2) que foram identificadas como epítopos lineares adequados para reconhecimento por anticorpos anti EphB3.

Tabela 1

Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO. (aa) seq. aa 98-115 8-mer WRRDVQRV 98-105 1 9 98-115 8-mer RRDVQ RVY 99-106 2 10 98-115 8-mer RDVQRVYV 100-107 3 11 98-115 8-mer DVQ RVYVE 101-108 4 12 98-115 8-mer VQRVYVEL 102-109 5 13 98-115 8-mer QRVYVELK 103-110 6 14 98-115 8-mer RVYVELKF 104-111 7 15 98-115 8-mer VYVELKFT 105-112 8 16 98-115 8-mer YVELKFTV 106-113 9 17 98-115 8-mer VELKFTVR 107-114 10 18 98-115 8-mer ELKFTVRD 108-115 11 19 98-115 9-mer WRRDVQ RVY 98-106 12 20 98-115 9-mer RRDVQRVYV 99-107 13 21 98-115 9-mer RDVQRVYVE 100-108 14 22 98-115 9-mer DVQRVYVEL 101-109 15 23 98-115 9-mer VQRVYVELK 102-110 16 24 98-115 9-mer QRVYVELKF 103-111 17 25 98-115 9-mer RVYVELKFT 104-112 18 26 98-115 9-mer VYVELKFTV 105-113 19 27 98-115 9-mer YVELKFTVR 106-114 20 28 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 98-115 9-mer VELKFTVRD 107-115 21 29 98-115 10-mer WRRDVQRVYV 98-107 22 30 98-115 10-mer RRDVQ RVYVE 99-108 23 31 98-115 10-mer RDVQRVYVEL 100-109 24 32 98-115 10-mer DVQRVYVELK 101-110 25 33 98-115 10-mer VQRVYVELKF 102-111 26 34 98-115 10-mer QRVYVELKFT 103-112 27 35 98-115 10-mer RVYVELKFTV 104-113 28 36 98-115 10-mer VYVELKFTVR 105-114 29 37 98-115 10-mer YVELKFTVRD 106-115 30 38 152-194 8-mer NPYVKVDT 152-159 1 39 152-194 8-mer PYVKVDTI 153-160 2 40 152-194 8-mer YVKVDTIA 154-161 3 41 152-194 8-mer VKVDTIAP 155-162 4 42 152-194 8-mer KVDTIAPD 156-163 5 43 152-194 8-mer VDTIAPDE 157-164 6 44 152-194 8-mer DTIAPDES 158-165 7 45 152-194 8-mer TIAPDESF 159-166 8 46 152-194 8-mer IAPDESFS 160-167 9 47 152-194 8-mer APDESFSR 161-168 10 48 152-194 8-mer PDESFSRL 162-169 11 49 152-194 8-mer DESFSRLD 163-170 12 50 152-194 8-mer ESFSRLDA 164-171 13 51 152-194 8-mer SFSRLDAG 165-172 14 52 152-194 8-mer FSRLDAGR 166-173 15 53 152-194 8-mer SRLDAGRV 167-174 16 54 152-194 8-mer R LDAGRVN 168-175 17 55 152-194 8-mer LDAGRVNT 169-176 18 56 152-194 8-mer DAG RVNTK 170-177 19 57 152-194 8-mer AGRVNTKV 171-178 20 58 152-194 8-mer GRVNTKVR 172-179 21 59 152-194 8-mer RVNTKVRS 173-180 22 60 152-194 8-mer VNTKVRSF 174-181 23 61 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 152-194 8-mer NTKVRSFG 175-182 24 62 152-194 8-mer TKVRSFGP 176-183 25 63 152-194 8-mer KVRSFGPL 177-184 26 64 152-194 8-mer VRSFGPLS 178-185 27 65 152-194 8-mer RSFGPLSK 179-186 28 66 152-194 8-mer SFGPLSKA 180-187 29 67 152-194 8-mer FGPLSKAG 181-188 30 68 152-194 8-mer GPLSKAGF 182-189 31 69 152-194 8-mer PLSKAGFY 183-190 32 70 152-194 8-mer LSKAGFYL 184-191 33 71 152-194 8-mer SKAGFYLA 185-192 34 72 152-194 8-mer KAGFYLAF 186-193 35 73 152-194 8-mer AGFYLAFQ 187-194 36 74 152-194 9-mer N P YVKVDTI 152-160 37 75 152-194 9-mer PYVKVDTIA 153-161 38 76 152-194 9-mer YVKVDTIAP 154-162 39 77 152-194 9-mer VKVDTIAPD 155-163 40 78 152-194 9-mer KVDTIAPDE 156-164 41 79 152-194 9-mer VDTIAPDES 157-165 42 80 152-194 9-mer DTIAPDESF 158-166 43 81 152-194 9-mer TIAPDESFS 159-167 44 82 152-194 9-mer IAPDESFSR 160-168 45 83 152-194 9-mer APDESFSRL 161-169 46 84 152-194 9-mer PDESFSRLD 162-170 47 85 152-194 9-mer DESFSRLDA 163-171 48 86 152-194 9-mer ESFSRLDAG 164-172 49 87 152-194 9-mer SFSRLDAGR 165-173 50 88 152-194 9-mer FSRLDAGRV 166-174 51 89 152-194 9-mer SRLDAGRVN 167-175 52 90 152-194 9-mer RLDAGRVNT 168-176 53 91 152-194 9-mer LDAGRVNTK 169-177 54 92 152-194 9-mer DAGRVNTKV 170-178 55 93 152-194 9-mer AGRVNTKVR 171-179 56 94 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 152-194 9-mer GRVNTKVRS 172-180 57 95 152-194 9-mer RVNTKVRSF 173-181 58 96 152-194 9-mer VNTKVRSFG 174-182 59 97 152-194 9-mer NTKVRSFGP 175-183 60 98 152-194 9-mer TKVRSFGPL 176-184 61 99 152-194 9-mer KVRSFGPLS 177-185 62 100 152-194 9-mer VRSFGPLSK 178-186 63 101 152-194 9-mer RSFGPLSKA 179-187 64 102 152-194 9-mer SFGPLSKAG 180-188 65 103 152-194 9-mer FGPLSKAGF 181-189 66 104 152-194 9-mer GPLSKAGFY 182-190 67 105 152-194 9-mer P LSKAGFYL 183-191 68 106 152-194 9-mer LSKAGFYLA 184-192 69 107 152-194 9-mer SKAGFYLAF 185-193 70 108 152-194 9-mer KAGFYLAFQ 186-194 71 109 152-194 10-mer NPYVKVDTIA 152-161 72 110 152-194 10-mer PYVKVDTIAP 153-162 73 111 152-194 10-mer YVKVDTIAPD 154-163 74 112 152-194 10-mer VKVDTIAPDE 155-164 75 113 152-194 10-mer KVDTIAPDES 156-165 76 114 152-194 10-mer VDTIAPDESF 157-166 77 115 152-194 10-mer DTIAPDESFS 158-167 78 116 152-194 10-mer TIAPDESFSR 159-168 79 117 152-194 10-mer IAPDESFSRL 160-169 80 118 152-194 10-mer APDESFSRLD 161-170 81 119 152-194 10-mer PDESFSRLDA 162-171 82 120 152-194 10-mer DESFSRLDAG 163-172 83 121 152-194 10-mer ESFSRLDAGR 164-173 84 122 152-194 10-mer SFSRLDAGRV 165-174 85 123 152-194 10-mer FSRLDAGRVN 166-175 86 124 152-194 10-mer SRLDAGRVNT 167-176 87 125 152-194 10-mer RLDAGRVNTK 168-177 88 126 152-194 10-mer LDAGRVNTKV 169-178 89 127 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 152-194 10-mer DAGRVNTKVR 170-179 90 128 152-194 10-mer AGRVNTKVRS 171-180 91 129 152-194 10-mer GRVNTKVRSF 172-181 92 130 152-194 10-mer RVNTKVRSFG 173-182 93 131 152-194 10-mer VNTKVRSFGP 174-183 94 132 152-194 10-mer NTKVRSFGPL 175-184 95 133 152-194 10-mer TKVRSFGPLS 176-185 96 134 152-194 10-mer KVRSFGPLSK 177-186 97 135 152-194 10-mer VRSFGPLSKA 178-187 98 136 152-194 10-mer RSFGPLSKAG 179-188 99 137 152-194 10-mer SFGPLSKAGF 180-189 100 138 152-194 10-mer FGPLSKAGFY 181-190 101 139 152-194 10-mer GPLSKAGFYL 182-191 102 140 152-194 10-mer PLSKAGFYLA 183-192 103 141 152-194 10-mer LSKAGFYLAF 184-193 104 142 152-194 10-mer SKAGFYLAFQ 185-194 105 143 244-256 8-mer NAVEVSVP 244-251 1 144 244-256 8-mer AVEVSVPL 245-252 2 145 244-256 8-mer VEVSVPLK 246-253 3 146 244-256 8-mer EVSVPLKL 247-254 4 147 244-256 8-mer VSVPLKLY 248-255 5 148 244-256 8-mer SVPLKLYC 249-256 6 149 244-256 9-mer NAVEVSVPL 244-252 7 150 244-256 9-mer AVEVSVPLK 245-253 8 151 244-256 9-mer VEVSVPLKL 246-254 9 152 244-256 9-mer EVSVPLKLY 247-255 10 153 244-256 9-mer VSVPLKLYC 248-256 11 154 244-256 10-mer NAVEVSVPLK 244-253 12 155 244-256 10-mer AVEVSVP LKL 245-254 13 156 244-256 10-mer VEVSVPLKLY 246-255 14 157 244-256 10-mer EVSVPLKLYC 247-256 15 158 274-298 8-mer GHEPAAKE 274-281 1 159 274-298 8-mer HEPAAKES 275-282 2 160 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 274-298 8-mer EPAAKESQ 276-283 3 161 274-298 8-mer PAAKESQC 277-284 4 162 274-298 8-mer AAKESQCR 278-285 5 163 274-298 8-mer AKESQCRP 279-286 6 164 274-298 8-mer KESQCRPC 280-287 7 165 274-298 8-mer ESQCRPCP 281-288 8 166 274-298 8-mer SQCRPCPP 282-289 9 167 274-298 8-mer QCRPCPPG 283-290 10 168 274-298 8-mer CRPCPPGS 284-291 11 169 274-298 8-mer RPCPPGSY 285-292 12 170 274-298 8-mer PCPPGSYK 286-293 13 171 274-298 8-mer CPPGSYKA 287-294 14 172 274-298 8-mer PPGSYKAK 288-295 15 173 274-298 8-mer PGSYKAKQ 289-296 16 174 274-298 8-mer GSYKAKQG 290-297 17 175 274-298 8-mer SYKAKQGE 291-298 18 176 274-298 9-mer GHEPAAKES 274-282 19 177 274-298 9-mer HEPAAKESQ 275-283 20 178 274-298 9-mer EPAAKESQC 276-284 21 179 274-298 9-mer PAAKESQCR 277-285 22 180 274-298 9-mer AAKESQCRP 278-286 23 181 274-298 9-mer AKESQCRPC 279-287 24 182 274-298 9-mer KESQCRPCP 280-288 25 183 274-298 9-mer ESQCRPCPP 281-289 26 184 274-298 9-mer SQCRPCPPG 282-290 27 185 274-298 9-mer QCRPCPPGS 283-291 28 186 274-298 9-mer CRPCPPGSY 284-292 29 187 274-298 9-mer RPCPPGSYK 285-293 30 188 274-298 9-mer PCPPGSYKA 286-294 31 189 274-298 9-mer CPPGSYKAK 287-295 32 190 274-298 9-mer PPGSYKAKQ 288-296 33 191 274-298 9-mer PGSYKAKQG 289-297 34 192 274-298 9-mer GSYKAKQGE 290-298 35 193 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 274-298 10-mer GHEPAAKESQ 274-283 36 194 274-298 10-mer HEPAAKESQC 275-284 37 195 274-298 10-mer EPAAKESQCR 276-285 38 196 274-298 10-mer PAAKESQCRP 277-286 39 197 274-298 10-mer AAKESQCRPC 278-287 40 198 274-298 10-mer AKESQCRPCP 279-288 41 199 274-298 10-mer KESQCRPCPP 280-289 42 200 274-298 10-mer ESQCRPCPPG 281-290 43 201 274-298 10-mer SQCRPCPPGS 282-291 44 202 274-298 10-mer QCRPCPPGSY 283-292 45 203 274-298 10-mer CRPCPPGSYK 284-293 46 204 274-298 10-mer RPCPPGSYKA 285-294 47 205 274-298 10-mer PCPPGSYKAK 286-295 48 206 274-298 10-mer CPPGSYKAKQ 287-296 49 207 274-298 10-mer PPGSYKAKQG 288-297 50 208 274-298 10-mer PGSYKAKQGE 289-298 51 209 313-336 8-mer PAASICTC 313-320 1 210 313-336 8-mer AASICTCH 314-321 2 211 313-336 8-mer ASICTCHN 315-322 3 212 313-336 8-mer SICTCHNN 316-323 4 213 313-336 8-mer ICTCHNNF 317-324 5 214 313-336 8-mer CTCHNNFY 318-325 6 215 313-336 8-mer TCHNNFYR 319-326 7 216 313-336 8-mer CHNNFYRA 320-327 8 217 313-336 8-mer HNNFYRAD 321-328 9 218 313-336 8-mer NNFYRADS 322-329 10 219 313-336 8-mer NFYRADSD 323-330 11 220 313-336 8-mer FYRADSDS 324-331 12 221 313-336 8-mer YRADSDSA 325-332 13 222 313-336 8-mer RADSDSAD 326-333 14 223 313-336 8-mer ADSDSADS 327-334 15 224 313-336 8-mer DSDSADSA 328-335 16 225 313-336 8-mer SDSADSAC 329-336 17 226 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 313-336 9-mer PAASICTCH 313-321 18 227 313-336 9-mer AASICTCHN 314-322 19 228 313-336 9-mer ASICTCHNN 315-323 20 229 313-336 9-mer SICTCHNNF 316-324 21 230 313-336 9-mer ICTCHNNFY 317-325 22 231 313-336 9-mer CTCHNNFYR 318-326 23 232 313-336 9-mer TCHNNFYRA 319-327 24 233 313-336 9-mer CHNNFYRAD 320-328 25 234 313-336 9-mer HNNFYRADS 321-329 26 235 313-336 9-mer NNFYRADSD 322-330 27 236 313-336 9-mer NFYRADSDS 323-331 28 237 313-336 9-mer FYRADSDSA 324-332 29 238 313-336 9-mer YRADSDSAD 325-333 30 239 313-336 9-mer RADSDSADS 326-334 31 240 313-336 9-mer ADSDSADSA 327-335 32 241 313-336 9-mer DSDSADSAC 328-336 33 242 313-336 10-mer PAASICTCHN 313-322 34 243 313-336 10-mer AASICTCHNN 314-323 35 244 313-336 10-mer ASICTCHNNF 315-324 36 245 313-336 10-mer SICTCHNNFY 316-325 37 246 313-336 10-mer ICTCHNNFYR 317-326 38 247 313-336 10-mer CTCHNNFYRA 318-327 39 248 313-336 10-mer TCHNNFYRAD 319-328 40 249 313-336 10-mer CHNNFYRADS 320-329 41 250 313-336 10-mer HNNFYRADSD 321-330 42 251 313-336 10-mer NNFYRADSDS 322-331 43 252 313-336 10-mer N FYRADSDSA 323-332 44 253 313-336 10-mer FYRADSDSAD 324-333 45 254 313-336 10-mer YRADSDSADS 325-334 46 255 313-336 10-mer RADSDSADSA 326-335 47 256 313-336 10-mer ADSDSADSAC 327-336 48 257 362-383 8-mer PRDLGGRD 362-369 1 258 362-383 8-mer RDLGGRDD 363-370 2 259 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 362-383 8-mer DLGGRDDL 364-371 3 260 362-383 8-mer LGGRDDLL 365-372 4 261 362-383 8-mer GGRDDLLY 366-373 5 262 362-383 8-mer GRDDLLYN 367-374 6 263 362-383 8-mer RDDLLYNV 368-375 7 264 362-383 8-mer DDLLYNVI 369-376 8 265 362-383 8-mer DLLYNVIC 370-377 9 266 362-383 8-mer LLYNVICK 371-378 10 267 362-383 8-mer LYNVICKK 372-379 11 268 362-383 8-mer YNVICKKC 373-380 12 269 362-383 8-mer NVICKKCH 374-381 13 270 362-383 8-mer VICKKCHG 375-382 14 271 362-383 8-mer ICKKCHGA 376-383 15 272 362-383 9-mer PRDLGGRDD 362-370 16 273 362-383 9-mer RDLGGRDDL 363-371 17 274 362-383 9-mer DLGGRDDLL 364-372 18 275 362-383 9-mer LGGRDDLLY 365-373 19 276 362-383 9-mer GGRDDLLYN 366-374 20 277 362-383 9-mer GRDDLLYNV 367-375 21 278 362-383 9-mer RDDLLYNVI 368-376 22 279 362-383 9-mer DDLLYNVIC 369-377 23 280 362-383 9-mer DLLYNVICK 370-378 24 281 362-383 9-mer LLYNVICKK 371-379 25 282 362-383 9-mer LYNVICKKC 372-380 26 283 362-383 9-mer YNVICKKCH 373-381 27 284 362-383 9-mer NVICKKCHG 374-382 28 285 362-383 9-mer VICKKCHGA 375-383 29 286 362-383 10-mer PRDLGGRDDL 362-371 30 287 362-383 10-mer RDLGGRDDLL 363-372 31 288 362-383 10-mer DLGGRDDLLY 364-373 32 289 362-383 10-mer LGGRDDLLYN 365-374 33 290 362-383 10-mer GGRDDLLYNV 366-375 34 291 362-383 10-mer GRDDLLYNVI 367-376 35 292 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 362-383 10-mer RDDLLYNVIC 368-377 36 293 362-383 10-mer DDLLYNVICK 369-378 37 294 362-383 10-mer DLLYNVICKK 370-379 38 295 362-383 10-mer LLYNVICKKC 371-380 39 296 362-383 10-mer LYNVICKKCH 372-381 40 297 362-383 10-mer YNVICKKCHG 373-382 41 298 362-383 10-mer NVICKKCHGA 374-383 42 299 436-469 8-mer PLPPRYAA 436-443 1 300 436-469 8-mer LP PRYAAV 437-444 2 301 436-469 8-mer PPRYAAVN 438-445 3 302 436-469 8-mer PRYAAVNI 439-446 4 303 436-469 8-mer RYAAVNIT 440-447 5 304 436-469 8-mer YAAVN ITT 441-448 6 305 436-469 8-mer AAVNITTN 442-449 7 306 436-469 8-mer AVNITTNQ 443-450 8 307 436-469 8-mer VNITTNQA 444-451 9 308 436-469 8-mer NITTNQAA 445-452 10 309 436-469 8-mer ITTNQAAP 446-453 11 310 436-469 8-mer TTNQAAPS 447-454 12 311 436-469 8-mer TNQAAPSE 448-455 13 312 436-469 8-mer NQAAPSEV 449-456 14 313 436-469 8-mer QAAPSEVP 450-457 15 314 436-469 8-mer AAPSEVPT 451-458 16 315 436-469 8-mer APSEVPTL 452-459 17 316 436-469 8-mer PSEVPTLR 453-460 18 317 436-469 8-mer SEVPTLRL 454-461 19 318 436-469 8-mer EVPTLRLH 455-462 20 319 436-469 8-mer VPTLRLHS 456-463 21 320 436-469 8-mer PTLRLHSS 457-464 22 321 436-469 8-mer TLRLHSSS 458-465 23 322 436-469 8-mer LRLHSSSG 459-466 24 323 436-469 8-mer RLHSSSGS 460-467 25 324 436-469 8-mer LHSSSGSS 461-468 26 325 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 436-469 8-mer HSSSGSSL 462-469 27 326 436-469 9-mer PLPPRYAAV 436-444 28 327 436-469 9-mer LPPRYAAVN 437-445 29 328 436-469 9-mer PPRYAAVNI 438-446 30 329 436-469 9-mer P RYAAVNIT 439-447 31 330 436-469 9-mer RYAAVN ITT 440-448 32 331 436-469 9-mer YAAVNITTN 441-449 33 332 436-469 9-mer AAVNITTNQ 442-450 34 333 436-469 9-mer AVNITTNQA 443-451 35 334 436-469 9-mer VNITTNQAA 444-452 36 335 436-469 9-mer NITTNQAAP 445-453 37 336 436-469 9-mer ITTNQAAPS 446-454 38 337 436-469 9-mer TTNQAAPSE 447-455 39 338 436-469 9-mer TNQAAPSEV 448-456 40 339 436-469 9-mer NQAAPSEVP 449-457 41 340 436-469 9-mer QAAPSEVPT 450-458 42 341 436-469 9-mer AAPSEVPTL 451-459 43 342 436-469 9-mer APSEVPTLR 452-460 44 343 436-469 9-mer PSEVPTLRL 453-461 45 344 436-469 9-mer SEVPTLRLH 454-462 46 345 436-469 9-mer EVPTLRLHS 455-463 47 346 436-469 9-mer VPTLRLHSS 456-464 48 347 436-469 9-mer PTLRLHSSS 457-465 49 348 436-469 9-mer TLRLHSSSG 458-466 50 349 436-469 9-mer LRLHSSSGS 459-467 51 350 436-469 9-mer RLHSSSGSS 460-468 52 351 436-469 9-mer LHSSSGSSL 461-469 53 352 436-469 10-mer PLPPRYAAVN 436-445 54 353 436-469 10-mer LPPRYAAVN I 437-446 55 354 436-469 10-mer PPRYAAVNIT 438-447 56 355 436-469 10-mer PRYAAVN ITT 439-448 57 356 436-469 10-mer RYAAVNITTN 440-449 58 357 436-469 10-mer YAAVNITTNQ 441-450 59 358 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 436-469 10-mer AAVNITTNQA 442-451 60 359 436-469 10-mer AVNITTNQAA 443-452 61 360 436-469 10-mer VNITTNQAAP 444-453 62 361 436-469 10-mer NITTNQAAPS 445-454 63 362 436-469 10-mer ITTNQAAPSE 446-455 64 363 436-469 10-mer TTNQAAPSEV 447-456 65 364 436-469 10-mer TNQAAPSEVP 448-457 66 365 436-469 10-mer NQAAPSEVPT 449-458 67 366 436-469 10-mer QAAPSEVPTL 450-459 68 367 436-469 10-mer AAPSEVPTLR 451-460 69 368 436-469 10-mer APSEVPTLRL 452-461 70 369 436-469 10-mer PSEVPTLRLH 453-462 71 370 436-469 10-mer SEVPTLRLHS 454-463 72 371 436-469 10-mer EVPTLRLHSS 455-464 73 372 436-469 10-mer VPTLRLHSSS 456-465 74 373 436-469 10-mer PTLRLHSSSG 457-466 75 374 436-469 10-mer TLRLHSSSGS 458-467 76 375 436-469 10-mer LRLHSSSGSS 459-468 77 376 436-469 10-mer RLHSSSGSSL 460-469 78 377 509-530 8-mer QLDGLRPD 509-516 1 378 509-530 8-mer LDGLRPDA 510-517 2 379 509-530 8-mer DGLRPDAR 511-518 3 380 509-530 8-mer GLRPDARY 512-519 4 381 509-530 8-mer LRPDARYV 513-520 5 382 509-530 8-mer RPDARYW 514-521 6 383 509-530 8-mer PDARYWQ 515-522 7 384 509-530 8-mer darywqv 516-523 8 385 509-530 8-mer arywqvr 517-524 9 386 509-530 8-mer rywqvra 518-525 10 387 509-530 8-mer ywqvrar 519-526 11 388 509-530 8-mer WQVRART 520-527 12 389 509-530 8-mer VQVRARTV 521-528 13 390 509-530 8-mer QVRARTVA 522-529 14 391 Região Compr. do epítopo Localiza¬ Epíto¬ SEQ ID Mapeada epítopo ção de po # NO: (aa) seq. aa 509-530 8-mer VRARTVAG 523-530 15 392 509-530 9-mer QLDGLRPDA 509-517 16 393 509-530 9-mer LDGLRPDAR 510-518 17 394 509-530 9-mer DGLRPDARY 511-519 18 395 509-530 9-mer GLRPDARYV 512-520 19 396 509-530 9-mer LRPDARYW 513-521 20 397 509-530 9-mer RPDARYWQ 514-522 21 398 509-530 9-mer PDARYWQV 515-523 22 399 509-530 9-mer DARYWQVR 516-524 23 400 509-530 9-mer ARYWQVRA 517-525 24 401 509-530 9-mer RYWQVRAR 518-526 25 402 509-530 9-mer YWQVRART 519-527 26 403 509-530 9-mer WQVRARTV 520-528 27 404 509-530 9-mer VQVRARTVA 521-529 28 405 509-530 9-mer QVRARTVAG 522-530 29 406 509-530 10-mer QLDGLRPDAR 509-518 30 407 509-530 10-mer LDGLRPDARY 510-519 31 408 509-530 10-mer DGLRPDARYV 511-520 32 409 509-530 10-mer GLRPDARYW 512-521 33 410 509-530 10-mer LRPDARYWQ 513-522 34 411 509-530 10-mer RPDARYWQV 514-523 35 412 509-530 10-mer P DARYWQVR 515-524 36 413 509-530 10-mer DARYWQVRA 516-525 37 414 509-530 10-mer ARYWQVRAR 517-526 38 415 509-530 10-mer RYWQVRART 518-527 39 416 509-530 10-mer YWQVRARTV 519-528 40 417 509-530 10-mer WQVRARTVA 520-529 41 418 509-530 10-mer VQVRARTVAG 521-530 42 419 Polvclonal Antibodies

Anticorpos policlonais são preferivelmente construídos em ani- mais por injeções múltiplas subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antí- geno relevante e um adjuvante. Uma resposta de anticorpo melhorada pode ser obtida conjugando-se o antígeno relevante a uma proteína que é imuno- gênica nas espécies a ser imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa de buraco de fechadura, albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivatização, por e- 5 xemplo, éster de sulfossucinimida de maleimidobenzoíla (conjugação por meio de resíduos de cisteína), N-hidroxissucinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido sucínico ou outros agentes conhecidos na técnica.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imu- nogênicos, ou derivados combinando-se, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução in- tradermicamente em múltiplos sítios. Um mês depois, os animais são refor- çados com 1/5 a {fração (1/10)} a quantidade original de peptídeo ou conju- gado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos sítios. Nos dias 7-14 após a injeção de reforço, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao título de anticorpo. Os animaissão reforçados até o platô de título. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antígeno, porém conjugado a uma proteína diferente e/ou por meio de um diferente reagente de reticulação. Os conjugados também po- dem ser feitos em cultura celular recombinante como fusões de proteína. Além disso, agentes de agregação tal como alume são adequadamente u- sados para realçar a resposta imune.

Anticorpos Monoclonais Anticorpos Monoclonais podem ser feitos usando o método de

hibridoma primeiro descrito por Kohler e outro, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante.

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hos- pedeiro apropriado, tal como um hamster ou macaco de face vermelha, é imunizasdo como aqui descrito para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que especificamente se ligarão à proteína usada para a imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos então são fundidos com céluls de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célu- la de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies e Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

5 As células de hibridoma desse modo preparadas são semeadas

e desenvolvidas em um meio de cultura adequado que preferivelmente con- tém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parenterais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parenterais não possuem a enzima hipoxantina guanina fosfori- 10 bosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção de nível elevado estável de anticorpo 15 pelas células de produção de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio. Linhagens de célula de mieloma humano e heteromieloma humanas - de camundongo também foram descritas para a produçãso de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur e outro, Monoclonal Antibody Production Techniques e Applications, pp. 51-63 20 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). Linhagens de mieloma de murino exemplares incluem aquelas derivadas de tumores de camundongo MOP-21 e M.C.-11 disponibilizadas pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponibilizadas pela American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA.

O meio de cultua em que as células de hibridoma estão se de-

senvolvendo é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dire- cionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridona é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tais como radio- 30 imunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser deter- minada por análise Scatchard (Munson e outro, Anal. Biochem., 107:220 (1980)).

Após as células de hibridoma serem identificadas que produzem anticorpos da especificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição e desenvol- 5 vidos por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies e Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. A- lémdisso, as células de hibridoma podem ser desenvolvidas in vivo como tumores de ascite em um animal. Os anticorpos monoclonais secretados 10 pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluído de ascite, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina con- vencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografia de afinidade.

DNA codificando os anticorpos monoclonais podem ser isolados e sequenciados das células de hibridoma usando procedimentos convencio- nais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leve dos anticorpos monoclonais). A determinação de seqüência e modo geral reque- rirá o isolamento de pelo menos uma porção do gene ou cDNA de interesse. Geralmente isto requer a clonagem do DNA ou, preferivelmente, mRNA (isto é, cDNA) codificando os anticorpos monoclonais. A clonagem é realizada usando técnicas padrões (veja, por exemplo, Sambrook e outro, (1989) Mo- lecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que é incorporado aqui por referência). Por exemplo, uma biblioteca de cDNA pode ser construída por transcrição reversa de poliA+ mRNA, preferivelmen- te mRNA associado com membrana, e a biblioteca analisada usando sondas específicas para seqüências de gene de polipeptídeo de imunoblobulina hu- manas. Em uma modalidade preferida, entretanto, a reação de cadeia de polimerase (PCR) é usada para amplificar cDNAs (ou porções de cDNAs de tamanho natural) codificando um segmento de gene de imunoglobulina de interesse (por exemplo, o segmento variável de cadeia leve). As seqüências amplificadas podem ser facilmente clonadas em qualquer vetor adequado, por exemplo, vetores de expressão, vetores de minigene, ou vetores de exi- bição de fago. Será apreciado que o método particular de clonagem usasdo não crítico, contanto que seja possível determinar a seqüência de alguma porção do polipeptídeo de imunoglobulina de interesse. Como aqui usado, uma molécula de ácido nucléico "isolada" ou seqüência de ácido nucléico "isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é ou (1) identificada e sepa- rada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual está ordinariasmente associada na fonte natural do ácido nucléico ou

(2) clonada, amplificada, rotulada, ou de outro modo distinguida dos ácidos nucléicos de base de tal que a seqüência do ácido nucléico de interesse que pode ser determinada, seja considerada isolada. Uma molécula de ácido nucléico isolada é exceto na forma ou fixação em que ele é encontrada em natura. As moléculas de ácido nucléico isoladas, portanto, são distinguidas da molécula de ácido nucléico como ela existe em células naturais. Entretan- to, uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nu- cléico contida em células que ordinariamente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucléico está em uma localização cromos- sômica diferente daquela de células naturais.

Uma fonte para RNA usada para clonagem e sequenciamento é um hibridoma produzido obtendo-se uma célula B do camundongo transgê- nico e fundindo a célula B a uma célula imortal. Uma vantagem de usar os hibridomas é que eles podem ser facilmente analisados, e um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal humano de interesse selecionado. Alterna- tivamente, o RNA pode ser isolado de células B (ou baço total) do animal imunizado. Quando fontes exceto hibridomas são usadas, pode ser desejá- vel analisar quanto às seqüências codificando imunoglobulinas ou polipeptí- deos de imunoglobulina com características de ligação específicas. Um mé- todo para tal análise é o uso de tecnologia de exibição de fago. A exibição de fago é descrita, por exemplo, em Dower e outro, WO 91/17271, McCaf- ferty e outro, WO 92/01047, e Caton e Koprowski, proc. Natl. Acad. Sei. U- SA, 87:6450-6454 (1990), cada dos quais é incorporado aqui por referência. Em uma modalidade usando a tecnologia de exibição de fago, o cDNA de um camundongo transgênico imunizado (por exemplo, cDNA de baço total) é isolado, a reação de cadeia de polimerase é usada para amplificar as se- qüências de cDNA que codificam uma porção de um polipeptídeo de imuno- globulina, por exemplo, regiões CDR, e as seqüências amplificadas são in- 5 seridas em um vetor de fago. Os cDNAs codificando peptídeos de interesse, por exemplo, peptídeos de região variável com características de ligação desejadas, são identificadas por técnicas padrão tal como paniculação.

A seqüência do ácido nucléico amplificado ou clonado é então determinada. Tipicamente a seqüência codificando uma região variável intei- 10 ra do polipeptídeo de imunoglobulina é determinada, entretanto, algumas vezes por adequação à seqüência será apenas uma porção de uma região variável, por exemplo, a porção codificando a CDR. Tipicamente a porção sequenciada será de pelo menos 30 bases de comprimento, mais frequen- temente com base na codificação para pelo menos cerca de um terço ou 15 pelo menos cerca de metade do comprimento da região variável será se- quenciada.

O sequenciamento pode ser realizado em clones isolados de uma biblioteca de cDNA, ou, quando a PCR é usada, após clonagem da se- qüência amplificada ou por sequenciamento de PCR direto do segmento 20 amplificado. O sequenciamento é realizado usando técnicas padrão (veja, por exemplo, Sambrook e outro (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Gui- de, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, e Sanger, F. e outro (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, que é aqui incorporado por referência). Comparando-se a seqüência do ácido nucléico clonado com as seqüências 25 publicadas de genes de imunoglobulina humana e cDNAs, alguém versado facilmente será capaz de determinar, dependendo da região sequenciada, (i) o uso de segmento de linha germinativa do polipeptídeo de imunoglobulina de hibridoma (incluindo o isótipo da cadeia pesada) e (ii) a seqüência de re- giões variáveis de cadeia pesada e leve, incluindo seqüências que resultam 30 de adição de região Neo processo de mutação somática. Uma fonte de in- formação de seqüência de gene de imunoglobulina é o National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

Fragmentos de Anticorpo

Como observado acima, fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de um anticorpo de tamanho natural intacto, preferivelmente uma região variável ou de ligação de antígeno do anticorpo intacto, e inclu- em anticorpos lineares e anticorpos multiespecíficos formados de fragmen- tos de anticorpo. Exemplos não Iimitantes de fragmentos de anticorpo inclu- em Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, anticorpo de domínio (dAb), fragmentos de região de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos lineares, anticorpos recombinantes que- lantes, tricorpos ou bicorpos, intracorpos, nanocorpos, imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação de antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo con- tendo VHH1 ou muteínas ou derivados dos mesmos, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente pa- ra conferir ligação de antígeno específico ao polipeptídeo, tal como uma se- qüência de CDR, contanto que o anticorpo retenha a atividade biológica de- sejada. Tais fragmentos de antígeno podem ser produzidos pela modificação de anticorpos totais ou sintetizados de novo usando tecnologias de DNA re- combinante ou síntese de peptídeo.

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo peque- no com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variá- 25 vel de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL). Usando um Iigador que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domí- nios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais totalmente em, por exemplo, EP 404,097; WO 30 93/11161; e 30 Hollinger e outro, proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" com- preendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, onde estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única, e opcionalmente compre- endendo um Iigador de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que possibili- tam a Fv formar a estrutura desejada para ligação de antígeno (Bird e outro, 5 Science 242:423-426, 1988, e Huston e outro, proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988). Um fragmento de Fd consiste nos domínios Vh e Ch1.

Fragmento de anticorpo adicional inclui um fragmento de anti- corpo de domínio (dAb) (Ward e outro, Nature 341:544-546, 1989) que con- siste em um domínio Vh .

"Anticorpos lineares" compreendem um par de segmentos Fd

tandem (VH -ChI-Vh -Ch1) que forma um par de regiões de ligação de antí- geno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos (Za- pata e outro Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).

Um "minicorpo" consistindo em scFv fundida a CH3 por meio de um Iigador de peptídeo (sem articulação) ou por meio de uma articulação de IgG foi descrito em Olafsen, e outro, protein Eng Des Sei. 2004 A- pr;17(4):315-23.

Anticorpos de cadeia pesada funcionais destituídos de cadeias leves são de ocorrência natural em tubarões enfermeira (Greenberg e outro, Nature 374:168-73, 1995), tubarões wobbegong (Nuttall e outro, Mol Immu- nol. 38:313-26, 2001) e Camelidae (Hamers-Casterman e outro, Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen e outro, J. Mol. Bioi 275: 413, 1998), tais como came- los, dromedários, alpacas e llamas. O sítio de ligação de antígeno é reduzido para um omínio único, o domínio VHh, nestes animais. Estes anticorpos for- mam regiões de ligação de antígeno usano apenas região variável de cadeia pesada, isto é, estes anticorpos funcionais são homodímeros de cadeias pesadas apenas tendo a estrutura H2L2 (referidos como "anticorpos de ca- deia pesada" ou "HCAbs"). Vhh camelizado reportadamente recombina-se com as regiões constantes lgG2 e lgG3 que contêm articulação, domínios CH2, e CH3 e não têm um domínio CH1 (Hamers-Casterman e outro, su- pra). Por exemplo, IgGI de Ilama é um isótipo de anticorpo convencional (H2L2) em que Vh recombina-se com uma região constante que contém arti- culação, domínios CH1, CH2 e CH3, ao passo que lgG2 e lgG3 de Ilama são isótipos apenas de cadeia pesada que não têm domínios de CH1 e que não contêm nenhuma cadeia leve. Fragmentos apenas de Vh clássicos são difíceis de produzir em forma solúvel, porém melhoras em solubilidade e Ii- 5 gação específica podem ser obtidas quando resíduos de estrutura são alte- rados para ficarem mais semelhantes a VHh- (Veja, por exemplo, Reichman, e outro,

J Immunol métodos 1999, 231:25-38.) Domínios de Vhh camelizados foram descobertos ligarem-se a antígeno com alta afinidade (Desmyter e outro, J. 10 Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) e possessuem alta estabilidade em solu- ção (Ewert e outro, Biochemistry 41:3628-36, 2002). Métodos para gerar an- ticorpos tendo cadeias pesadas camelizadas são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos nos 20050136049 e 20050037421.

Por que o domínio variável dos anticorpos de cadeia pesada é o

menor fragmento de ligação de antígeno totalmente funcional com umas massa molecular de apenas 15 kDa, esta entidade é referida como um na- nocorpo (Cortez-Retamozo e outro, Cancer Research 64:2853-57, 2004). Uma biblioteca de nanocorpo pode ser gerada de um dromedário imunizado 20 como descrito em Conrath e outro, (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807- 12, 2001) ou usando métodos recombinantes como descrito em

Intracorpos são anticorpos de cadeia única que demonstram ex- pressão intracelular e podem manipular a função de proteína intracelular (Bi- occa, e outro, EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby e outro, proc Natl Aead Sci 25 USA. 101:17616-21, 2004). Intracorpos, que compreendem seqüências sinal celulares que retêm a construção de anticorpo em regiões intracelula- res, podem ser produzidas como descrito em Mhashilkar e outro (EMBO J 14:1542-51, 1995) e Wheeler e outro (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Trans- corpos são anticorpos permeáveis à célula em que um domínio de transdu- 30 ção de proteína (PTD) é fundido com anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) Heng e outro, (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

São também contemplados anticorpos que são SMIPs ou proteí- nas de fusão de imunoglobuloina de domínio de ligação específicas para proteína alvo. Estas construções são polipeptídeos de cadeia única compre- endendo domínios de ligação de antígeno fundidos aos domínios de imuno- globulina necessários para realizar funções efetoras de anticorpo. Veja por 5 exemplo, WO 03/041600, Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 20030133939 e Publicação de Patente dos Estados Unidos n° 20030118592.

Anticorpos Multivalentes

Em algumas modalidades, pode ser desejável gerar anticorpo monoclonal multivalente ou mesmo um multiespecífico (por exemplo, bies- pecífico, triespecífico, etc.). Tal anticorpo pode ter especificidades de ligação para pelo menos dois diferentes epítopos do antígeno alvo, ou alternativa- mente ele pode ligar-se a duas diferentes moléculas, por exemplo, ao antí- geno alvo e à proteína ou receptor de superfície celular. Por exemplo, um anticorpo biespecífico pode incluir uma ramificação que se liga ao alvo e ou- tra ramificação que se liga a uma molécula gatilho sobre um leucócito tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRI 11 (CD16) a fim de focar os mecanismos de defesa celular para a célula expressando o alvo. Como outro exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para as células que expressam o antígeno alvo. Estes anticorpos possuem uma ramificação de ligação ao alvo e uma ramificação que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, sapo- rina, anti-interferon-60, alcalóide vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos multiespecíficos podem ser pre- parados como anticorpos de tamanho natural ou fragmentos de anticorpo.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "hete- roconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Anticorpos heteroconjugados po- 30 dem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. A- gentes de reticulação adequada são bem conhecidos na técnica, e são des- critos na Patente dos Estados Unidos n° 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.

De acordo com outro método para preparar anticorpos biespecí- ficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser construí- da para maximizar a percentagem de de heterodímeros que são recupera- dos de cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anticor- po. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácido pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compen- satórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) laterais grandes são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo substituindo ca- deias laterais de aminoácido grandes com outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentar a produção do heterodímero sobre outros produtos acabados indesejados tais como homodímeros. Veja o WO 96/27011 publicado em 6 de setembro de 1996.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpo têm sido também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando usando ligação química. Bren- nan e outro, Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento onde anti- 20 corpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Estres fragmentos são reduzidos nas presença do agente de complexação de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a forma- ção de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos de Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de 25 Fab1-TNB é então novamente convertido no Fab'-tiol por redução com mer- captoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro deri- vado de Fabt-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos bies- pecíficos produzidos podem ser usados como asgentes para as imobilização seletiva de enzimas. Bettere outro, Science 240: 1041-1043 (1988) descre- 30 vem a secreção de fragmentos de anticorpo funcional de bactérias (veja, por exemplo, Better e outro, Skerra e outro Science 240: 1038-1041 (1988)). Por exemplo, fragmentos Fab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecíficos (Carter e outro, Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby e outro, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).

Shalaby e outro, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E.coli e submetido a acoplamento químico direto in vitro para formar o anticorpo bi- específico. O anticorpo biespecífico desse modo formado foi capaz de se ligar às células superexpressando o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos huma- nos contra alvos de tumor de mama humano.

Várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente de cultura de célula recombinante têm sido também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos têm sido produzidos usando fechos de leucina, por exemplo, GCN4. (Veja geralmente Kostelny e outro, J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992).) Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois diferentes anti- corpos por fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e em seguidas novamente oxidados para formasr os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo.

O termo "dicorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticor- po com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variá- vel de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH VL). Usando um Iigador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domí- nios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os do- mínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de an- tígeno. Veja, por exemplo, Hollinger e outro, proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecí- ficos pelo uso de dímeros de Fv (sFv) de cadeia única foram também repor- tados. Veja Grubere outro, J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um "anticor- po linear" produzido como descrito em Zapata e outro Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Em síntese, estes anticorpos compreendem um par 5 de segmentos Fd tandem (Vh -ChI-Vh -Ch1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou mo- noespecíficos.

Anticorpos com mais do que duas valências são também con- templados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. (Tutt e outro, J. Immunol. 147:60 (1991)).

Um "anticorpo recombinante quelante" é um anticorpo biespecí- fico que reconhece epítopos adjacentes e não sobrepostos do antígeno alvo, e é flexível o suficiente para ligar-se a ambos os epítopos simultaneamente (Neri e outro, J Mol Bioi 246:367-73, 1995).

Produção de Fab-scFv biespecífico ("bicorpo") e Fab-(scFv)(2)

triespecífico ("tricorpo") são descritos em Schoonjans e outro (J Immunol. 165:7050-57, 2000) e Willems e outro (J Chromatogr B Analyt Technol Bio- med Life Sei. 786:161-76, 2003). Para bicorpos ou tricorpos, uma molécula scFv é fundida a uma ou ambas as cadeias VL-CL (L) e VH-CHi (Fd), por 20 exemplo, para produzir um tricorpo duas scFvs são fundidass à terminação C de Fab, enquanto que em um bicorpo uma scFv é fundida à terminação C de Fab.

Produção Recombinante de Anticorpos

Anticorpos podem ser produzidos por metodologia de DNAS re- combinante usando um dos sistemas de expressão de anticorpo bem co- nhecidos na técnica (Veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

Anticorpos codificando DNA da invenção podem ser substituídos em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedei- ras tais como células de E. coli, células COS símias, células 293 de rim em- briônico humanas (por exemplo, células 293E), células de ovário hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outra maneira não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção de anticorpos recombi- nantes é bem conhecida na técnica. Fragmentos de anticorpo foram deriva- dos por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exem- 5 pio, Morimoto e outro, Journal of Biochemical e Biophysical métodos 24:1 ΟΤ- 117 (1992) e Brennan e outro, Science 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedei- ras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anti- corpo, incluindo síntese de peptídeo e ligação covalente, serão evidentes 10 para o prático experiente.

Seqüências de controle de expressão referem-se à seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüên- cias de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem 15 um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de liga- ção de ribossoma. Células eucarióticas são conhecidass utilizarem promoto- res, sinais de poliadenilação, e realçadores.

Ácido nucléico é operavelmente ligado quando ele é colocado em uma ligação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por e- xemplo, DNA para a pressequência ou líder secretora é operavelmente liga- da ao DNA para um polipeptídeo se ela for expressa como uma preproteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou realçador é ope- ravelmente ligado a uma seqüência de codificação se ela afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossoma é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ela for posicionada de modo a facilitar a translação. Geralmente, operavelmente ligada significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contínuas, e, no caso de uma líder se- cretora, contígua e em fase de leitura. Entretanto, realçadores não devem ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição con- venientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou Iigadores de oligo- nucleotídeo sintético são usados de acordo com prática convencional.

Célula, linhagem celular, e cultura celular são frequentemente usadas alternadamente e todass as tais designações aqui incluem progênie. Transformantes e células transformadas incluem a célula e culturas objeto primárias derivadas dos mesmos sem considerar o número de transferên- cias. Entende-setambém que toda progênie pode não ser precisamente i- 5 dêntica em conteúdo de DNA1 devido à mutações deliberadas ou negligen- tes. Progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como analisadas na célula originalmente transformada são incluídas. Onde desig- nações distintas são pretendidass, será claro a partir do contexto.

Em uma modalidade alternativa, a seqüência de aminoácido de uma imunoglobulina de interesse pode ser determinada por sequenciamento de proteína direto. Seqüências de nucleotídeo de codificação adequadas podem ser designadas de acordo com uma tabela de códon universal.

Muteínas de seqüência de aminoácido do anticorpo desejado podem ser preparadas introduzindo-se mudanças de nucleotídeo apropria- 15 das no DNA de codificação, ou por síntese de peptídeo. Tais muteínas inclu- em, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, re- síduos dentro das seqüências de aminoácido dos anticorpos. Qualquer com- binação de deleção, inserção, e substituição é feita para chegar à constru- ção final, contanto que a construção possua as características desejadas. As 20 mudanças de aminoácido também podem alterar processos pos- translacionais do anticorpo monoclonal, humano, humanizado, Human Engi- neered™ ou de muteína, tais como mudando o número ou a posição de sí- tios de glicosilação.

Moléculas de ácido nucléico codificando muteínas de seqüência 25 de aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, porém não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de muteínas de seqüência de ami- noácido de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao sítio), mutagênese de pCR, e mutagê- 30 nese de cassete de uma muteína anteriormente preparadas ou uma versão de não-muteína do anticorpo.

A invenção também fornece ácido nucléico isolado codificando anticorpos da invenção, opcionalmente operavelmente ligados à seqüências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira, vetores e células hos- pedeiras compreendendo os ácidos nucléicos, e técnicas recombinantes pa- ra a produção dos anticorpos, que podem compreender cultivar a célula 5 hospedeira de modo que o ácido nucléico seja expresso e, opcionalmente, recuperar o anticorpo da cultura de célula hospedeira ou meio de cultura.

Para a produção recombinante do anticorpo, a codificação do ácido nucléico é isolada e inseridas em um vetor replicável para outra clona- gem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo 10 monoclonal é facilmente isolado e seqüenciado usando procedimentos con- vencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capa- zes de se ligarem especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes de vetor geralmente incluem, porém não estão limitados a, um ou mais dos seguin- 15 tes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores seletivos, um elemento realçador, um promotor, e uma seqüên- cia de terminação de transcrição.

(1) Componente de seqüência sinal

O anticorpo desta invenção pode ser produzido recombinante- mente não apenas diretamente, porém também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma seqüên- cia sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico na ter- minação N de uma proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência sinal sele- cionada preferivelmente é aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Se células hospe- deiras procarióticas não reconhecem e processam a seqüência sinal de anti- corpo nativo, a seqüência sinal pode ser substituída por uma seqüência sinal selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina de Iiase de pectato (por exemplo, pelB), penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina Il estável ao aquecimento. Para secreção de levedura a seqüência sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, pela líder de invertase de levedura, uma líder de fator α (incluindo líderes de fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder de fosfatase de ácido, a líder de C. albicans glucoamilase, ou a sinal descrita no W090/13646. Em expressão de célula mamífera, seqüências sinal mamíferas, bem como líderes secretoras virais, por exemplo, a sinal gD de herpes simples, são disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado em estrutura de leitu- ra ao DNA codificando o anticorpo.

(2) Origem de componente de replicação

Tanto os vetores de expressão quanto de clonagem contêm uma seqüência de ácido nucléico que possibilita o vetor replicar-se em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clona- gem esta seqüência é aquela que possibilita o vetor replicar-se independen- temente do DNA cromossômico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüências de replicação autônoma. Tais seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, levedura e viroses. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram- negativas, a origem de plasmídeo 2 μ é adequada para levedura, e várias origens virais são úteis para clonar vetores em células mamíferas. Geral- mente, a origem de componente de replicação não é necessária para veto- res de expressão mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada apenas por que ela contém o promotor precoce).

(3) Componente marcador seletivo

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene seleti- vo, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típi- cos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, ou ácido micofenólico (b) deficiências auxotróficas complementares, ou (c) suprimento de nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase para Bacilos.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são bem sucedidamente transformadas com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência ao fármaco e desse modo sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os fárma- cos metotrexato, neomicina, histidinol, puromicina, ácido micofenólico e hi- gromicina.

5 Outros exemplos de marcadores selecionáveis adequados para

células mamíferas são aqueles que possibilitam a identificação de células competentes para apreender ácido nucléico codificando o anticorpo, tais como DHFR, timidina cinase, metalotioneína-l e -II, preferivelmente genes de metalotioneína primatas, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DH- FR são primeiro identificadass cultivando-se todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tipo selvagem 15 é empregado é a linhagem de célula de ovário de hamster chinês (CHO) de- ficiente em atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospe- deiras tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA codificando o anticorpo da invenção, 20 proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável tal como ami- noglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) pode ser selecionado por crescimen- to celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecio- nável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Veja a Patente dos Estados Unidos n° 4.965.199.

Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene

trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb e outro, Nature, 282: 39 (1979)). O gene trpl fornece um marcador de seleção para uma le- vedura mutante de não temdo a capacidade de desenolver-se em triptofano, por exemplo, ATCC n° 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). A 30 presença da lesão de trpl no genoma de célula hospedeira de levedura en- tão fornece um ambiente eficaz para detectar a transformação por cresci- mento na ausência de triptofano. Similarmente, linhagens de levedura defici- entes de Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmí- deos conhecidos transportando o gene Leu2. Linhagens de levedura defici- entes de UraZ são complementadas por plasmídeos transportando o gene ura2>.

5 Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 pm

pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga esca- la de quimosina de bezerro recombinante foi reportado para K. Iactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Vetores de expressão de múltiplas 10 cópias para a secreção de albumina de soro humano recombinante madura por linhagens industriais de Kluyveromyces foram também descritos. Fleer e outro, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(4) Componente Promotor

Vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um pro- 15 motor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavelmente li- gado ao ácido nucléico codificando o anticorpo. Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor de arabinose (por exemplo, araB) promotor phoA, sistemas de promotor de O-Iactamase e Iac- tose, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp), e promoto- 20 res híbridos tal como o promotor tac. Entretanto, outros promotores bacteria- nos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacteria- nos também conterão uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA codificando o anticorpo da invenção .

Seqüências promotoras são conhecidas para eucariotas. Virtu- 25 almente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é a região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma 30 seqüência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas estas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato de- sidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofructocinase, gluco- se-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfa- to isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucocinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isoci- tocromo C, ácido fosfatase, enzimas degradativas associadas com metabo- lismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são também descritos em EP 73,657. Realçadores de levedura também são vantajosa- mente usados com promotores de levedura.

Transcrição de anticorpo de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de viroses tais como vírus de leucemia Abelson1 polioma vírus, vírus do epiteli- oma contagioso, adenovírus (tal como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus aviário, o mais preferivelmente citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B virus, Vírus Símio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imuno- globulina, de promotores de choque térmico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.

Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são convenien- temente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem viral de SV40 de replicação. O promotor precoce imediato do cito- megalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de res- trição Hindlll E. Um sistema para expressar DNA em hospedeiros mamíferos usando o papiloma vírus bovino como um vetor é descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.419.446. Uma modificação deste sistemas é descrita na Patente dos Estados Unidos n° 4.601.978. Veja também Reyes e outro, Na- ture 297: 598-601 (1982) sobre expressão de cDNA de D-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina cina- se de vírus do herpes simples. Alternativamente, a repetição de terminal lon- go do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor.

5 (5) Componente de elemento realçador

A transcrição de um DNA codificando o anticorpo desta invenção por eucariotas maiores é frequentemente aumentada inserindo-se uma se- qüência realçadora no vetor. Muitas seqüências realçadoras são atualmente conhecidas de genes mamíferos (globina, elastase, albumina, alfa- 10 fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, alguém usará um realçador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o realçador SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o realçador de promotor precoce do citomegalovírus, o realçador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e os realçadores de adenovírus. Veja also Yaniv, Nature 297\ 15 17-18 (1982) sobre elementos de realce para ativação de promotores euca- rióticos. O realçador pode ser ligado no vetor em uma posição 5' ou 3' à se- qüência de codificação do anticorpo, porém é preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(6) Componente de terminação de transcrição

Os vetores de expressão usados em células hospedeiras euca-

rióticas (células de levedura, fungos, inseto, planta, animal, humanas, ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüên- cias necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar o mR- NA. Tais seqüências são comumente disponíveis das regiões não translada- 25 das 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poli- adenilados na porção não transladadas do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenila- ção de hormônio de crescimento bovino. Veja o WO 94/11026 e o vetor de 30 expressão descrito no mesmo. Outro é o terminador de transcrição de ca- deia leve de imunoglobulina de camundongo.

(7) Seleção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressãso do DNA nos vetores inclusos são as células procariotas, de levedura, ou eu- cariotas maiores descritas acima. Os procariotas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, En- terobacter, Erwinia, Klebsiella, proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iieheni- formis 41 P descritos em DD 266,710 publicado em 12 de abril de 1989), pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyees. Um hospeiro de clonagem do E. coli preferido é o E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras linhagens tais como E. co//'B, E. co//'X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

Além dos micróbios procariotas, os eucarióticos tais como fun- gos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificando o anticorpo. Saceharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comumente usado entre os micro- organismos hospedeiros eucarióticos menores. Entretanto, diversos outros gêneros, espécies, e linhagens são comumente disponíveis e úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe\ hospedeiros de Kluyveromyces tais as, por exemplo, K lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophi- Iarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida] Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis\ e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, pe- nicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de planta e inseto. Numerosas linhagens e variantes baculovirais e células hospedeiras de inseto permissivas corres- pondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), e Bombyx mori foram identificadas. Uma varidade de 5 linhagens virais para transfecção são publicamente disponíveis, por exem- plo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais viroses podem ser usadas como o vírus incluso de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de célu- las de Spodoptera frugiperda.

Culturas de célula de planta de algodão, milho, batata, soja, pe-

túnia, tomate, tabaco, lemna, e outras células de planta podem também ser utilizadas como hospedeiros.

Entretanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrado, e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tor- nou-se procedimento de rotina. Exemplos de linhagens hospedeiras de célu- la mamífera útil são células de ovário de hamster chinês, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, e células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e outro, proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216 (1980)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonada para crescimento em cultura de suspensão, [Graham e outro, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcino- ma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado huma- no (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e outro, Annals N.Y Acad. Sei. 383: 44- 68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma hu- mano (Hep G2). Células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção de anti- corpo e cultivadas em emios de nutriente convencionais modificados como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar 5 os genes codificando as seqüências desejadas. Além disso, novos vetores e linhagens de célula transformada com múltiplas cópias de unidades de transcrição separadas por um marcador seletivo são particularmente úteis e preferidas para a expressão de anticorpos .

(8) Cultivando as células hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo desta

invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comerci- almente disponíveis tais como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Médi- um ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Dulbecco's Modified EagIe1S Medium ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedei- 15 ras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham e outro, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes e outro, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes dos Estados Unidos nos 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, ou 5.122.469, WO 90103430; WO 87/00195; ou Patente dos Estados Unidos Re. n° 30.985 podem ser usadas como meios de cultura para as células 20 hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado quando neces- sário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco Gentamy- 25 cinD), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos geralmen- te presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podsem também ser incluídos em concentrações apropriadas que sejam conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais 30 como temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente usasdas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o téc- nico ordinariamente versado. (9) Purificação de anticorpo

Quando usando técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secre- tado no meio, inclusive de culturas microbianas. Se o anticorpo for produzido 5 intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, serão removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Better e outro Science 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10: 105 (1990); e Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 457-461 (1993) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são 10 secretados para o espaço periplásmico de E. coli. (Veja also, [Carter e outro, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)].

A composição de anticorpo preparada de células microbianas ou mamíferas pode ser purificada usando, por exemplo, cátion de cromatografia de hidroxilapatita ou cromatografia de permuta aviária, e cromatografia de 15 afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como um Iigante de afinidade de- pende das espécies e isótipo de qualquer domínio de Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humanas 20 (Lindmark e outro, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é reco- mendada para todos os isótipos de camundongo e para γ3 humano (Guss e outro, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz á qual o Iigante de afinidade está ligado é mais frequentemente agarose, porém outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vítreas de poro 25 controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno provêm taxas de fluxo mais rápi- das e tempos de processamento mais curtos do que pode ser obtido com a agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Baker- bond ABXD (J. T. Baker, phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento em uma colu- 30 na de permuta de íon, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, croma- tografia em sílica, cromatografia em cromatografia SEPHAROSED de hepa- rina em uma resina de permuta de ânion ou cátion (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio são também disponível dependendo do anticorpo a ser recupera- do.

Anticorpos Quiméricos 5 Anticorpo de roedor em administração in vivo repetida em ho-

mem ou sozinho oucomo um conjugado trará cerca de uma resposta imune no recipiente contra o anticorpo de roedor; a resposta de HAMA assim cha- mada (Anticorpo Anti-Camundongo Humano). A resposta de HAMA pode limitar a eficácia do produto farmacêutico se dosagem repetida for requerida. 10 A imunogenicidae do anticorpo pode ser reduzida por modificação química do anticorpo com um polímero hidrofílico tal como polietileno glicol ou usan- do métodos de engenharia genética para tornar a estrutura de anticorpo mais semelhante à humana, por exemplo, anticorpos quiméricos, humaniza- dos, humanos ou Human Engineered™. Por que tais anticorpos construídos 15 são menos imunogênicos em humanos do que os anticorpos monoclonais de camundongo parenterais, eles podem ser usados para o tratamento de hu- manos com muito menos risco de anafilaxia. Desse modo, estes anticorpos podem ser preferidos em aplicações terapêuticas que envolvem a adminis- tração in vivo a um humano.

Anticorpos monoclonais quiméricos, em que os domínios de Ig

variáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo são fundidos a domí- nios Ig constantes humanos, podem ser gerados usando procedimentos pa- drões conhecidos na técnica (Veja Morrison, S. L., e outro (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human 25 Constant Region Domains, proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6841-6855; and, Boulianne, G. L., e outro, Nature 312, 643-646 . (1984)). Por exemplo, as seqüências de gene para os domínios variáveis do anticorpo de roedor que ligam-se a CEA podem ser substituídas pelos domínios variáveis de uma proteína de mieloma humano, desse modo produzindo um anticorpo quimé- 30 rico recombinante. Estes procedimentos são detalhados nas EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 e WO 86/01533. Embora alguns anticorpos monoclonais quiméricos tenham se provado menos imu- nogênicos em humanos, os domínios Ig variáveis de camundongo podem também induzir a uma resposta anti-camundongo humana significante. Anticorpos Humanizados

Anticorpos humanizados podem ser obtidos por uma variedade 5 de métodos incluindo, por exemplo: (1) enxerto de regiões de determinação de complementariedade não-humanas (CDRs) sobre uma estrutura humana e região constante (um processo referido na técnica como humanizante por meio de "enxerto de CDR"), ou, alternativamente, (2) transplante dos domí- nios variáveis não-humanos inteiros, porém "disfarçando" os com uma su- 10 perfície semelhante à humana por substituição de resíduos de superfície (um processo referido na técnica como "polimento"). Na presente invenção, anti- corpos humanizados incluirão tanto anticorpos "humanizados" quanto "poli- dos". Estes métodos são descritos, por exemplo, em Jones e outro, Nature 321:522 525 (1986); Morrison e outro, proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 15 6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer e outro, Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3): 169 217 (1994); e Kettleborough, C.A. e outro, protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cada dos quais é incorporado aqui por referência.

Por exemplo, as seqüências de gene das CDRs do anticorpo de

roedor podem ser isoladas ou sintetizadas e substituídas pelas regiões de seqüência correspondentes de um gene de anticorpo humano homólogo, produzindo um anticorpo humano com a especificidasde do anticorpo de ro- edor original. Estes procedimentos são descritos nos EP 023940, WO 90/07861 e WO 91/09967.

O enxerto de CDR que envolve introduzir uma ou mais das seis CDRs dos domínios de Ig variáveis de cadeia pesada e leve de camundongo nas quatro regiões de estrutura apropriadas de domínios Ig variáveis huma- nos é chamado enxerto de CDR. Esta técnica (Riechmann, L., e outro, Natu- 30 re 332, 323 (1988)), utiliza as regiões de estrutura conservadas (FR1-FR4) como um andaime para sustentar as alças de CDR que são os contatos pri- mários com o antígeno. Uma desvantagem do enxerto de CDR, entretanto, é que ele pode resultar em um anticorpo humanizado que tem uma afinidade de ligação substancialmente menor do que o anticorpo de camundongo ori- ginal, por que os aminoácidos das regiões de estrutura podem contribuir pa- ra a ligação de antígeno, e por que os aminoácidos das alças de CDR po- dem influenciar a associação dos dois domínios de Ig variáveis. Para manter a afinidade do anticorpo monoclonan humanizado, a técnica de enxerto de CDR pode ser melhorada escolhendo-se regiões de estrutura humana que se pareçam mais intimamente com as regiões de estrutura do anticorpo de camundongo original, e por mutagênese direcionada ao sítio de aminoácidos individuais dentro da estrutura ou CDRs auxiliada por modelagem de compu- tador do sítio de ligação de antígeno (por exemplo, Co, M. S., e outro (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976).

Um método de humanizar anticorpos compreende alinhar as se- qüências de cadeia pesada e leve não-humanas às seqüências de cadeia pesada e leve humanas, selecionando e substituindo a estrutura não- humana com uma estrutura humanas com base em tal alinhamento, mode- lagem molecular para predizer a conformação da seqüência humanizada e comparando à conformação do anticorpo origem. Este processo é seguido por nova mutação repetida de resíduos na região de CDR que atrapalha a estrutura das CDRs até a conformação predita do modelo de seqüência hu- manizada aproximar-se intimamente da conformação das CDRs não- humanas do anticorpo não-humano origem. Tais anticorpos humanizados podem ser também derivatizados para facilitar a captação e depuração, por exemplo, por meio de receptores Ashwell (veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos nos 5.530.101 e 5.585.089 cujas patentes são incorpora- das asqui por referência).

Diversas humanizações de anticorpos monoclonais de camun- dongo por projeto racional foram reportadas (veja, por exemplo, 20020091240 publicado em 11 de julho de 2002, WO 92/11018 e Patente dos Estados Unidos n° 5.693.762, Patente dos Estados Unidos n° 5.766.866.

Anticorpos Human Enqineered™ A frase "anticorpo Human Engineered™" refere-se a um anticor- po derivado de um anticorpo não-humano, tipicamente um anticorpo mono- clonal de camundongo. Alternativamente, um anticorpo Human Enginee- red™ pode ser derivado de um anticorpo quimérico que retém ou substanci- almente retém as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo, não- humano, origem, porém que exibe imunogenicidade diminuída quando em comparação ao anticorpo origem quando administrado a humanos.

Human Engineering™ de domínios variáveis de anticorpo foi descrito por Studnicka [veja, por exemplo, Studnicka e outro, Patente dos Estados Unidos n° 5.766.886; Studnicka e outro Protein Engineering 7: 805- 814 (1994)] como um método para reduzir a imunogenicidade, ao mesmo tempo que mantendo a atividade de ligação de moléculas de anticorpo. De acordo com o método, cada aminoácido de região variável foi designado um risco de substituição. As substituições de aminoácido são distinguidas por uma das três categorias de risco : (1) mudanças de baixo risco são aquelas que têm o maior potencial para reduzir a imunogenicidade com a menor chance de romper a ligação de antígen; (2) mudanças de risco moderado são aquelas que também reduziriam a imunogenicidade, porém têm uma maior chance de afetar a ligação de antígeno ou duplicação da proteína; (3) resíduos de alto risco são aqueles que são importantes para ligação ou para manter a estrutura do anticorpo e transportam o maior risco de que a ligação de antígeno ou duplicação de proteína seja afetada. Devido ao papel estrutu- ral tri-dimensional das prolinas, modificações nas prolinas são geralmente consideradas ser alterções de risco pelo menos moderado, mesmo se a po- sição for tipicamente uma posição de baixo risco.

Regiões variáveis das cadeias leve e pesadas de um anticorpo de roedor são Human Engineered™ como segue para aminoácidos huma- nos substitutos em posições determinadas serem improváveis de adversa- mente afetarem qualquer ligação de antígeno ou duplicação de proteína, porém provavelmente reduzem a imunogenicidade em um ambiente huma- no. Resíduos de aminoácido que estão em posições de "baixo risco" e que são candidatos para modificação de acordo com o método são identificados por alinhamento das seqüências de aminoácido das regiões variáveis de roedor com uma seqüência de região variável humana. Qualquer região va- riável humaha pode ser usada, incluindo uma seqüência VH ou VL individual ou uma seqüência VH ou VL de consenso humana ou uma seqüência de linha germinativa humana individual ou de consenso. Os resíduos de amino- ácido em qualquer número das posições de baixo risco, ou em todas as po- siçõesde baixo risco, podem ser mudados. Por exemplo, em cada posição de baixo risco onde os resíduos de aminoácido murinos e humanos alinha- dos diferem, uma modificação de aminoácido é introduzida, que substitui o resíduo de roedor com o resíduo humano. Alternativamente, os resíduos de aminoácido em todas as posições de baixo risco e em qualquer número das posições de risco moderado podem ser mudados. Idealmente, para obter a mínima imunogenicidade todas as posições de baixo e moderado risco são mudadas de seqüência de roedor para humana.

Genes sintéticos contendo regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve modificadas são construídos e ligados à regiões constantes de ca- deia Y pesada e/ou capa leve humanas. Quaisquer regiões constantes de cadeia pesada e cadeia leve humanas podem ser usadas em combinação com as regiões variáveis de anticorpo Human Engineered™, incluindo IgA (de qualquer subclasse, tal como IgAI ou lgA2), IgD, IgE, IgG (de qualquer subclasse, tal como IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4), ou IgM. Os genes de cadeia pesada e leve humanos são introduzidos em células hospedeiras, tais como células mamíferas, e os produtos de imunoglobulina recombinante rsultantes são obtidos e caracterizados.

Anticorpos humanos para animais transqênicos

Anticorpos humanos para antígeno alvo podem também ser pro- duzidos usando animais transgênicos que não têm nenhuma produção de imunoglobulina endógena e são construídos para conter Iocos de imunoglo- bulina humana. Por exemplo, o WO 98/24893 descreve animais transgêni- cos tendo um loco Ig humano em que os animais não produzem imunoglobu- Iinas endógenas funcionais devido à inativação de Iocos de cadeia pesada e leve endógena. O WO 91/10741 também descreve hospedeiros mamíferos não-primatas transgênicos capazes de montar uma resposta imune para um imunógeno, onde os anticorpos têm regiões contantes e/ou variáveis de pri- mata, e onde os Iocos codificando imunoglobulina endógena são substituí- dos ou inativados. O WO 96/30498 descreve o uso do sistema Cre/Lox para 5 modificar o loco da imunoglobulina em um mamífero, tal como para substituir toda ou uma porção da região constante ou variável para formar uma molé- cula de anticorpoo modificada. O WO 94/02602 descreve hospedeiros mamí- feros não-humanos tendo Iocos de Ig endógenos inativados e Iocos de Ig humanos funcionais. A Patente dos Estados Unidos n° 5.939.598 descreve 10 métodos de preparar camundongos transgênicos em que os camundongos não possuem cadeias pesadas endógenas, e expressam um loco de imuno- globulina exógena compreendendo uma ou mais regiões constantes xeno- genéicas.

Usando um animal transgênico descrito acima, uma resposta imune pode ser produzidas para uma molécula antigênica selecionada, e células produtoras de anticorpo podem ser removidas do animal e usadas para produzir hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos. Protocolos de imunização, adjuvantes e similares são conhecidos na técnica, e são usados em imunização de, por exemplo, um camundongo transgênico como descrito no WO 96/33735. Esta publicação descreve anticorpos mono- clonais contra uma variedade de moléculas antigênicas incluindo IL 6, IL 8, TNFa, CD4 humana, L selectina, gp39, e toxina do tétano. Os anticorpos monoclonais podem ser testados quanto à capacidade de inibir ou neutrali- zar a atividade biológica ou efeito fisiológico da proteína correspondente. O WO 96/33735 descreve que anticorpos monoclonais contra a IL-8, derivados de células imunes de camundongos transgênicos imunizados com IL-8, blo- quearam as funções induzidas por IL-8 dos neutrófilos. Anticorpos monoclo- nais humanos com especificidade para o antígeno usados para imunizar a- nimais transgênicos são também descritos no WO 96/34096 e pedido de Patente dos Estados Unidos n° 20030194404; e pedido de Patente dos Es- tados Unidos n° 20030031667). veja also Jakobovits e outro, proc. Natl. A- cad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits e outro, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann e outro, Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patente dos Estados Unidos n° 5.591.669, Patente dos Estados Unidos n° 5.589.369, Patente dos Estados Unidos n° 5.545.807; e Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 20020199213, WO 96/34096 e Pedido de Patente dos Estados 5 Unidos n° 20030194404; e pedido de Patente dos Estados Unidos n° 20030031667.

Animais transgênicos adicionais úteis para preparar anticorpos monoclonais incluem o Medarex HuMAb-MOUSE®, descrito na Patente dos Estados Unidos n° 5.770.429 e Fishwild, e outro (Nat. Biotechnol. 14:845- 10 851, 1996), que contém seqüências de gene de genes de anticorpo humano não redispostos que codificam para as cadeias pesada e leve dos anticorpos humanos. Imunização de um HuMAb-MOUSE® possibilita a produção de anticorpoos monoclonais pra a proteína alvo.

Além disso, Ishida e outro (Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002) 15 descrevem o TransChromo Mouse (TCMOUSE™) que compreende seg- mentos de tamanho de megabase de DNA humano e que incorpora os Iocos de imunoglobulina humana inteiros (hlg). O TCMOUSE tem um repertório totalmente diverso de hlgs, incluindo todas as subclasses de IgGs (lgG1- G4). A imunização do TCMouse com vários antígenos humanos produz res- 20 postas de anticorpo compreendendo anticorpos humanos.

O Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 20030092125 des- creve métodos para influenciar a resposta imune de um animal para o epíto- po desejado. Anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (veja as Patentes dos Estados Unidos nos 5.567.610 e 5.229.275).

Anticorpos de tecnologia de exibição de fago

O desenvolvimento de tecnologias para preparar repertórios de genes de anticorpo humano recombinasnte, e a exibição dos fragmentos de anticorpo codificados sobre a superfície de bacteriófago filamentoso, forne- 30 ceu um método rrecombinante de diretamente preparar e selecionar anticor- pos humanos, que também podem ser aplicados a anticorpos humanizados, quiméricos, murinos ou muteína. Os anticorpos produzidos pela tecnologia de fago são produzidos como fragmentos de ligação a antígeno - geralmen- te fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e desse modo não possuem fun- ções efetoras. As funções efetoras podem ser introduzidas por uma das du- as estratégias: Os fragmentos podem ser construídos ou em anticorpos 5 completos para expressão em células mamíferas, ou em fragmentos de anti- corpo biespecífico com um segundo sítio de ligação capaz de disparar uma função efetora.

Tipicamente, o fragmento Fd (Vh-ChI) e cadeia leve (Vl-Cl) de anticorpos são separadamente clonados por PCR e recombinados randomi- 10 zadamente em bibliotecas de exibição de fato, que podem então ser selecio- nadas para ligação a um antígeno particular. Os fragmentos de Fab são ex- pressos sobre a superfície do fago, isto é, fisicamente ligados aos genes que codificam os mesmos. Desse modo, a seleção de Fab por ligação de antíge- no co-seleciona para seqüências codificando Fab, que podem ser amplifica- 15 das subsequentemente. Por diversos ciclos de ligação de antígeno e re- amplificação, um procedimento denominado paniculação, Fab específico para o antígeno é enriquecido e finalmente isolado.

Em 1994, um método para humanização de anticorpos , chama- do "seleção orientada", foi descrito. A seleção orientada utiliza a força da técnica de exibição de fago para a humanização de anticorpo monoclonal de camundongo (veja Jespers, L. S., e outro, Bio/Technology 12, 899-903

(1994)). Para isso, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de camundongo pode ser exibido em combinação com uma biblioteca de cadeia leve huma- na, e a biblioteca de Fab híbrida resultante pode então ser selecionada com 25 o antígeno. O fragmento de Fd de camundongo desse modo fornece um pa- drão para orientar a seleção. Subsequentemente, as cadeias leves humanas selecionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmento Fd humano. A seleção da biblioteca resultante produz Fab totalmente humano.

Uma variedade de procedimentos foi descrita para derivar anti- corpos humanos de bibliotecas de exibição de fago (veja, por exemplo, Hoo- genboom e outro, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks e outro, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Patentes dos Estados Unidos nos 5.565.332 e 5.573.905; Clackson, T., e Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Em particular, a seleção e evolução in vitro de anticorpos derivados de bibliote- cas de exigição de fago tornou-se uma poderosa ferramenta (veja Burton, D. R., e Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); e, Winter, G., e 5 outro, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); Pedido de Patente dos Es- tados Unidos n° 20020004215 e WO 92/01047; Pedido de Patente dos Es- tados Unidos n° 20030190317 publicado em 9 de outubro de 2003 e Patente dos Estados Unidos n° 6.054.287; Patente dos Estados Unidos n° 5.877.293.

Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by

Capture Lift," Methods in Molecular Biology1 Antibody Phage Display: Me- thods and Protocols 178: 187-193, e Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 200120030044772 publicado em 6 de março de 2003 descrevem méto- dos para analisar bibliotecas de anticorpo expresso por fago ou outras molé- 15 cuias de ligação por levantamento de captura, um método envolvendo a i- mobilização das moléculas de ligação candidatas sobre um suporte sólido.

Os produtos de anticorpo podem ser analisados quanto à ativi- dade e quanto à adequabilidade nos métodos de tratamento da invenção usando ensaios como descrito na seção entitula "Métodos de Avaliação" in- clusa ou usando quaisquer ensaios adequados conhecidos na técnica. Muteínas de seqüência de aminoácido

Anticorpos da invenção incluem muteínas de um anticorpo ori- gem onde a seqüência de polipeptídeo do anticorpo origem foi alterada em pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido na região 25 variável ou na porção equialente à região variável, incluindo dentro as CDRs, contanto que a muteína retenha a afinidade de ligação desejada ou a ativi- dade biológica. As muteínas podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas ao anticorpo origem, por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 30 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idênticas ou homólogas. A identidade ou homologia com respeito a esta seqüência é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos à seqüência origem, após alinhamento das se- qüências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a identidade de seqüência percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência. Nenhuma das exten- 5 sões de terminal N, terminal C, ou internas, deleções, ou inserções na se- qüência de anticorpo deve ser construída como afetando a identidade ou homologia da seqüência. Desse modo, a identidade de seqüência pode ser determinada por métodos padrões que são comumente usados para compa- rar a similaridade em posição dos aminoácidos de dois polipeptídeos. Usan- 10 do um programa de computador tal como BLAST ou FASTA, dois polipeptí- deos são alinhados para pareamento ideal de seus respectivos aminoácidos (ou longos ou de tamanho natural de uma ou ambas as seqüências, ou uma porção predeterminada longa de uma ou ambas as seqüências). Os progra- mas fornecem uma penalidade de abertura de referência e uma penalidade 15 lacuna de referência, e uma matriz de classificação tal como PAM 250 [uma matriz de classificação padrão; veja Dayhoff e outro, em Atlas of Protein Se- quence and Structure, vol. 5, supl. 3 (1978)] podem ser usados em conjunto com o programa de computador. Por exemplo, a identidade percentual pode então ser calculada como: o número total de pareamentos idênticos multipli- 20 cado por 100 e em seguida dividido pela Isoma do comprimento da seqüên- cia mais longa dentro do ciclo pareado e o número de lacunas introduzidas nas seqüências mais longas a fim de alinhar as duas seqüências.

Anticorpos da invenção podem também incluir alterações na se- qüência de polipeptídeo da região constante, que não afetará a afinidade de 25 ligação, porém pode alterar a função efetora, tal como toxicidade celular e- pendente do anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou depuração e captação (e o efeito resultante sobre a meia-vida). Inserções

As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de terminal amino- e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra- sequência de resíduos de aminoácido único ou múltiplos, por exemplo, 2, 3 ou mais. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de terminal N ou o anticorpo (incluindo fragmento de anticorpo) fundido a um rótulo de epítopo ou um epítopo de receptor de sal- vamento. Outras muteínas insercionais da molécula de anticorpo incluem a 5 adição de sítios de glicosilação, adição de cisteínas para ligação intramole- cular ou intermolecular, ou fusão a um polipeptídeo que aumenta a meia- vida de soro do anticorpo, por exemplo, na terminal N ou terminal C. Por e- xemplo, a(s) ligação(coes) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticor- po para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um 10 fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou ligada por N ou ligada por O. Ligada por N refere-se à ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido 15 exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para ligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. A presença de qualquer destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Desse modo, sítios de glicosilação ligados por N podem ser adicionados a um anticorpo alterando a seqüência de aminoácido 20 de modo que ela contenha uma ou mais destas seqüências de tripeptídeo. A glicosilação ligada por O refere-se à ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais co- mumente serina ou treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possa também ser usada. Os sítios de glicosilação ligados por O podem ser 25 adicionados a um anticorpo inserindo-se ou substituindo-se um ou mais re- síduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original.

O termo "rotulado por epítopo" refere-se ao anticorpo fundido a um rótulo de epítopo. 0 polipeptídeo de rótulo de epígopo tem resíduos sufi- cientes para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo neste contexto 30 pode ser preparado, todavia é suficientemente curto de modo que ele não interfira com a atividade do anticorpo. O rótulo de epítopo preferivelmente é suficientemente único de modo que o anticorpo neste contexto contra não interaja substancialmente com outros epítopos. Os polipeptídeos de rótulo adequados geralmente têm pelo menos 6 resíduos de aminoácido e geral- mente entre cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácido (preferivelmente entre cerca de 9 a 30 resíduos). Exemplos incluem o polipeptídeo rótulo flu HA e seu anticorpo 12CA5 [Field e outro, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; the c-myc tag e the 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 antibodies thereto [Evan e outro, Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; e o rótulo de glicoproteína D do vírus do Herpes Simples (gD) e seu anticorpo [Paborsky e outro, protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]. Outros rótulos exemplares são uma se- qüência de poli-histidina, geralmente em torno de seis resíduos de histidina, que permitem o isolamento de um composto desse modo rotuolado usando a quelação de níquel. Outras etiquetas e rótulos, tal como o rótulo FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), bem conhecidos e rotineiramente usados na técnica são abrangidos pela invenção.

Como usado aqui, o termo "epítopo de ligação de receptor de salvamento" se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida de soro in vivo da molécula de IgG.

Delecões

As deleções de sequencia de aminoácido incluem deleções de terminal de amino e/ou carboxila variando no comprimento de um a cem ou mais resíduos, resultando em fragmentos que retêm a afinidade de ligação para o antígeno alvo, bem como deleções de intra-sequencias de resíduos de aminoácido único ou múltiplo, por exemplo, 2, 3 ou mais. Por exemplo, os sítios de glicosilação podem ser deletados ou movidos para uma posição diferente por deleção de parte ou todos dos tripeptídeos ou outras sequenci- as de reconhecimento para glicosilação.

Substituições

Outro tipo de muteína é uma muteína de substituição de amino- ácido. Estas muteínas têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molé- cula de anticorpo removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. A mutagênese substitucional em qualquer das regiões hipervariáveis ou CDR 10

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ou regiões de esqueleto é contemplada. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 2. A substituição mais conservativa é encontrada sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em ne- nhuma alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou como também descrito abaixo em referência às classes de aminoácido, podem ser introdu- zidas e os produtos avaliados.

TABELA 2

Exemplar

Original

Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) He (I) phe; Leu (L)

Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V)

vai; leu; ile lys; gin; asn gin; his; asp, lys; gin glu; asn ser; ala asn; glu asp; gin ala

asn; gin; lys; arg leu; vai; met; ala;

norleucine norleucine; ile; vai; met; ala; phe arg; gin; asn leu; phe; ile leu; vai; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; norleucina

Substituições de Resíduo Preferidas vai Iys arg glu ser asn asp

Ieu

ile

arg

Ieu

ser

tyr

phe

Ieu As modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são efetuadas selecionando-se substituições que diferem signifi- cantemente em seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto de poli- peptídeo na área da susbtituição, por exemplo, como uma conformação heli- 5 coidal ou folha, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são dividi- dos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral comuns:

(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile,;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr,;

(3) ácido: asp, glu,;

(4) básico: asn, gin, seu, lys, arg,;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

As substituições conservadoras envolvem substituir um aminoá- cido com outro membro de sua classe. As substituições não conservadoras envolvem substituir um membro de uma destas classes com um membro de outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na conservação da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geral- mente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e pre- venir a reticulação aberrante.

A maturação por afinidade geralmente envolve a preparação e avaliação de muteínas de anticorpo que têm substituições dentro dos CDRs de um anticorpo origem e selecionar muteínas que melhoraram propriedades 25 biológicas tal como afinidade de ligação relativo ao anticorpo origem. Um modo conveniente por gerar tais muteínas substitucionais é a maturação por afinidade usando exibição de fago. Brevemente, vários sítios de região hi- pervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas possíveis substituições de amino em cada sítio. As muteínas de anticorpo desse modo 30 geradas são exibidas de um modo monovalente de partículas de fago fila- mentosas como fusões ao produto de gene Ill de M13 embalado em cada partícula. As muteínas exibidas por fago são então avaliadas quanto a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). Veja por exemplo, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 e WO 93/19172.

Os métodos de maturação por afinidade de anticorpo atuais per- tencem a duas categorias de mutagênese: estocástica e não estocástica. PCR propenso a erro, cepas bacterianas mutadoras (Low e outros, J. Mol. Biol. 260, 359-68, 1996), e mutagênese de saturação (Nishimiya e outros J. Biol. Chem. 275:12813-20, 2000; Chowdhury, P., S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) são exemplos típicos de métodos de mutagênese estocástica (Rajpal e outros, Proc Natl Acad Sci U S o A. 102:8466-71, 2005). As técni- cas não estocásticas usam freqüentemente mutagênese de varredura de alanina ou direcionada ao sito para gerar coleções limitadas de muteínas específicas. Alguns métodos são descritos em detalhes adicionais abaixo.

Maturação por afinidade por métodos de paniculação - A matu- ração por afinidade de anticorpos recombinantes geralmente é realizada por várias rodadas de paniculação de anticorpos candidatos na presença de quantidades decrescentes de antígeno. A diminuição da quantidade de antí- geno por rodada seleciona os anticorpos com a afinidade mais elevada para o antígeno desse modo produzindo anticorpos de afinidade elevada de um grande grupo de material de partida. A maturação por afinidade por panicu- lação é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Huls e ou- tros (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001). Os métodos de matu- ração por afinidade que usam tecnologias de exibição de fago são descritos em outro lugar aqui e conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Daugherty e outros, Proc Natl Acad Sci U S o A. 97:2029-34, 2000).

Mutagênese Total - Uma mutagênese total (LTM) (Rajpal e ou- tros, Proc Natl Acad Sci U S o A. 102:8466-71, 2005) fornece um método para rapidamente traçar o sítio de ligação de anticorpo. Para LTM, nove a- minoácidos, representantes das químicas de cadeia lateral principais forne- cidos pelos 20 aminoácidos naturais, são selecionados para dissecar as con- tribuições de cadeia lateral funcionais para ligar a toda posição em todos o seis CDRs de um anticorpo. LTM gera uma série posicionai de mutações únicas em um CDR onde cada resíduo do "tipo selvagem" é sistematicamen- te substituído por um dos nove aminoácidos. Os CDRs mutados são combi- nados para gerar bibliotecas de fragmento variável de cadeia única combina- tória (scFv) de complexidade e tamanho crescentes sem ficar proibitivo à exibição quantitativa de todas as muteínas. Após seleção positiva, os clones 5 com ligação melhorada são seqüenciados, e as mutações benéficas são tra- çadas.

PCR propenso a erro - O PCR propenso a erro envolve a aleato- rização de ácidos nucléicos entre rodadas de seleção diferentes. A aleatori- zação ocorre em uma baixa taxa pela taxa de erro intrínseca da polimerase 10 usada porém pode ser aumentada por PCR propenso a erro (Zaccolo e ou- tros J. Mol. Biol. 285:775-783, 1999) usando um apolimerase que tem uma taxa de erro intrínseca elevada durante a transcrição (Hawkins e outros, J Mol Biol. 226:889-96, 1992). Depois das rodadas de mutação, os clones com afinidade melhorada para o antígeno são selecionados usando métodos roti- 15 neiros na técnica.

Embaralhamento de DNA - O embaralhamento de ácido nucléico é um método para recombinação homóloga in vitro ou in vivo de grupos de polinucleotídeos mais curtos ou menor para produzir polinucleotídeos varian- tes. O embaralhamento de DNA foi descrito na Patente US N0. 6.605.449, 20 Patente US 6.489.145, WO 02/092780 e Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:10747-51 (1994). Geralmente, o embaralhamento de DNA é com- preendido de 3 etapas: fragmentação dos genes a serem embaralhados com DNase I, hibridação aleatória de fragmentos e montagem ou carregamento no gene fragmentado por PCR na presença de DNA polimerase (PCR sexu- 25 al), e amplificação de produto montado por PCR convencional.

O embaralhamento de DNA difere de PCR propenso a erro pelo fato de que é uma reação de cadeia reversa. Em PCR propenso a erro, o número de sítios iniciais de polimerase e o número de moléculas crescem exponencialmente. Em contraste, na montagem ou embaralhamento de áci- 30 do nucléico de polinucleotídeos aleatórios o número de sítios iniciais e o nú- mero (porém não tamanho) dos polinucleotídeos aleatórios diminuem com o passar do tempo. No caso de um anticorpo, o embaralhamento de DNA permite a associação combinatória livre de todos os CDRIs com todos os CDR2s com todos os CDR3s, por exemplo. É contemplado que as múltiplas famílias de sequencias possam ser embaralhadas na mesma reação. Além disso, o em- 5 baralhamento geralmente conserva a ordem relativa, tal que, por exemplo, CDR1 não seja encontrado na posição de CDR2. Os embaralhamentos raros conterão um número grande dos melhores CDRs (por exemplo, afinidade mais elevada) e estes embaralhamentos raros podem ser selecionados com base em sua afinidade superior.

O polinucleotídeo modelo que pode ser usado no embaralha-

mento de DNA pode ser DNA ou RNA. Pode ser de vários comprimentos que dependem do tamanho do gene ou polinucleotídeo mais curto ou menor para ser recombinado ou montado. Preferivelmente, o polinucleotídeo mode- lo é de 50 bp a 50 kb. O polinucleotídeo modelo freqüentemente deveria ser de filamento duplo.

É contemplado que polinucleotídeos de ácido nucléico de fila- mento duplo ou filamento único que têm regiões de identidade com o polinu- cleotídeo modelo e regiões de heterologia com o polinucleotídeo modelo po- dem ser adicionados ao polinucleotídeo modelo, durante a etapa inicial de 20 seleção de gene. Também é contemplado que dois modelos de polinucleotí- deo diferentes, porém relacionados possam ser misturados durante a etapa inicial.

Varredura de alanina - A mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar os resíduos de região hipervariável que 25 contribuem significantemente com a ligação de antígeno. Cunningham e Wells, (Science 244:1081-1085, 1989). Um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tal como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação 30 dos aminoácidos com antígeno. Esses locais de aminoácido que demons- tram sensibilidade funcional às substituições então são refinados introduzin- do-se também ou outras mutações em, ou para, os sítios de substituição. Desse modo, ao mesmo tempo em que o sítio para introduzir uma mudança de sequencia de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempe- nho de uma mutação em um determinado sítio, a varredura de ala ou muta- gênese aleatória é conduzida para o códon ou região alvo e as muteínas de anticorpo expressas são avaliadas quanto à atividade desejada.

Desígnio auxiliado por computador- Alternativamente, ou além disso, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antí- geno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e antíge- no, ou usar software de computador para modelar tais pontos de contato. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são os candidatos para substi- tuição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que tais muteí- nas são geradas, o painel de muteínas é submetido à avaliação como des- crito aqui e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais en- saios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

A maturação por afinidade envolve a preparação e avaliação de muteínas de anticorpo que têm substituições nos CDRs de um anticorpo ori- gem e selecionar as muteínas que têm propriedades biológicas melhoradas tal como afinidade de ligação relativa ao anticorpo origem. Um modo conve- niente para gerar tais muteínas substitucionais é a maturação por afinidade que usa exibição de fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervari- áveis (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas possíveis subs- tituições de amino em cada sítio. As muteínas de anticorpo desse modo ge- radas são exibidas de um modo monovalente de partículas de fago filamen- tosas como fusões ao produto de gene Ill de M13 embalado em cada partí- cula. As muteínas exibidas por fago são então avaliadas quanto á sua ativi- dade biológica (por exemplo, afinidade de ligação).

A mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significante- mente com a ligação de antígeno. Alternativamente, ou além disso, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são os candidatos para substituição de acor- do com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez tais muteínas são geradas, o painel de muteínas é submetido à avaliação como descrito aqui e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes pode ser 5 selecionados para desenvolvimento adicional.

Função efetora alterada

Outras modificações do anticorpo são contempladas. Por exem- plo, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, para aumentar a efetividade do anticorpo no tratamento de

uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3-, por exemplo. Por exem- plo, o resíduo de cisteína pode ser introduzido na região de Fe, desse modo permitindo a formação de ligação de dissulfeto de intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico desse modo gerado pode ter capacidade de in- ternalização aumentada e/ou morte de célula mediada por complemento 15 aumentado e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Veja Caron e outros, J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immu- nol. 148: 2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com atividade aumentada também podem ser preparados usando reticuladores heterobi- funcionais como descrito em Wolff e outros, Câncer Research 53: 2560-2565 20 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser construído o qual tenha re- giões Fc duais e possa desse modo ter aumentado Iise de complemento re- alçada e capacidades de ADCC. Veja Stevenson e outros, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). Além disto, foi mostrado que sequencias dentro de CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue a Classe Il de MHC e 25 ative uma resposta de célula T auxiliadora não desejada. Uma substituição conservadora pode permitir que o anticorpo retenha a atividade de ligação, contudo perde sua capacidade de ativar uma resposta de célula T não dese- jada. Também veja Steplewski e outros, Proc Natl Acad Sei USA. 1988,85(13):4852-6, incorporado aqui por referência em sua totalidade, que 30 descreveu anticorpos quiméricos em que uma região variável de camundon- go foi unida com regiões constantes gama 1, gama 2, gama 3, e gama 4 humano. Em certas modalidades da invenção, pode ser desejável usar um fragmento de anticorpo, em lugar de um anticorpo intato. Neste caso, pode ser desejável modificar o fragmento de anticorpo para aumentar sua meia-vida de soro, por exemplo, adicionando moléculas como PEG ou ou- tros polímeros solúveis em água, incluindo polímero de polissacarídeo, para fragmentos de anticorpo para aumentar a meia-vida. Isto também pode ser obtido, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação de receptor de salvamento no fragmento de anticorpo (por exemplo, por mutação da re- gião apropriada no fragmento de anticorpo ou incorporando-se o epítopo em um rótulo de peptídeo que é então fundido ao fragmento de anticorpo no fi- nal ou no meio, por exemplo, por síntese de DNA ou de peptídeo) (veja, por exemplo, W096/32478).

O epítopo de ligação de receptor de salvamento preferivelmente constitui uma região em que qualquer um ou mais resíduos de aminoácido de uma ou duas alças de um domínio de Fc são transferidas para uma posi- ção análoga do fragmento de anticorpo. Ainda mais preferivelmente, três ou mais resíduos de uma ou duas alças do domínio de Fc são transferidas. Ain- da mais preferido, o epítopo é tomado do domínio de CH2 da região de Fc (por exemplo, de um IgG) e transferido para região de CH1, CH3, ou VH, ou mais do que uma tal região, do anticorpo. Alternativamente, o epítopo é to- mado do domínio de CH2 da região de Fc e transferido para região de Cl ou região de VL, ou ambos, do fragmento de anticorpo. Também veja, os pedi- dos Internacionais WO 97/34631 e WO 96/32478 que descrevem as varian- tes de Fc e a sua interação com o receptor de salvamento.

Desse modo, os anticorpos da invenção podem compreender uma porção de Fc humano, uma porção de Fc de consenso humano, ou uma muteína dos mesmos que retém a capacidade de interagir com o recep- tor de salvamento de Fe, incluindo muteínas nas quais as cisteínas envolvi- das em ligação de disulfeto são modificadas ou removidas, e/ou nas quais o met encontrado é adicionado ao terminal de N e/ou um ou mais dos 20 ami- noácidos de terminal de N são removidos, e/ou regiões que interagem com complemento, tal como o sítio de ligação de C1q, são removidos, e/ou o sítio ADCC é removido [veja, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]. Os anticorpos da classe de IgG também podem incluir uma região constante diferente, por exemplo, um anticorpo de lgG2 pode ser modificado para exi- bir uma região constante IgGI ou lgG4.

No caso de IgG 1, as modificações para a região constante, par- ticularmente a região de CH2 ou de dobradiça, pode aumentar ou diminuir a função efetora, incluindo a atividade de ADCC e/ou CDC. Em outras modali- dades, uma região constante de lgG2 é modificada para diminuir a formação de agregado de anticorpo-antígeno. No caso de lgG4, modificações para a região constante, particularmente a região de dobradiça, podem reduzir a formação de meio-anticorpos. Em modalidades exemplares específicas, a mutação da sequencia de dobradiça de lgG4 Cys-Pro-Ser-Cys para a se- quencia de dobradiça IgGI Cys-Pro-Pro-Cys é fornecida.

Estudos prévios traçaram o sítio de ligação em IgG humano e de camundongo para FcR principalmente para a região de dobradiça mais baixa composta de resíduos IgG 233-239. Outros estudos propuseram segmentos amplos adicionais, por exemplo, Gly316-Lys338 para receptor I de Fc huma- no, Lys274-Arg301 e Tyr407-Arg416 para receptor Ill de Fc humano, ou en- contraram alguns resíduos específicos fora da dobradiça inferior, por exem- plo, Asn297 e Glu318 para lgG2b de camundongo que interage com recep- tor Il de Fe de camundogo. O relato da estrutura cristalina de 3,2-A do frag- mento de Fe de IgGI humano com receptor IIIA de Fc humano delineou re- síduos de IgGI Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, e Ala327- Ile332 quando envolvido na ligação ao receptor IIIA de Fe. Foi sugerido com base na estrutura cristalina que além da dobradiça inferior (Leu234-Gly237), os resíduos em alças de domínio de CH2 de IgG FG (resíduos 326-330) e AC (resíduos 265-271) poderiam desempenhar um papel na ligação ao re- ceptor IIA de Fe. Veja, Shields e outros, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001), incorporados por referência aqui em sua totalidade. A mutação de resíduos em sítios de ligação de receptor de Fc pode resultar em função efe- tora alterada, tal como atividade de ADCC ou CDC alterada, ou meia-vida alterada. Como descrito acima, as mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos, incluindo substituição com alanina, uma substituição conservadora, uma substituição não conservadora, ou substituição com um resíduo de aminoácido correspondente na mesma posição de uma subclasse de IgG diferente (por exemplo, substituindo um 5 resíduo de IgGI com um resíduo de lgG2 correspondente naquela posição).

Shields e outros, reportaram que os resíduos de IgGI envolvidos na ligação a todos os receptores de Fc humanos ficam localizados no domí- nio de CH2 próximo a dobradiça e se incluem nas duas categorias como se- gue: 1) posições que podem interagir diretamente com todo o FcR incluem 10 Leu234-Pro238, Ala327, e Pro329 (e possivelmente Asp265); 2) posições que influenciam na natureza ou posição de carboidrato incluem Asp265 e Asn297. Os resíduos de IgGI adicionais que afetaram a ligação ao receptor

Il de Fc são como segue: (efeito maior) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, e (menos efeito) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, e Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A e D270A reduziram ligação. Além dos resíduos identificados acima para todo o FcR, resíduos de IgGI adicionais que reduziram a ligação ao receptor IIIA de Fc em 40% ou mais são como segue: Ser239, Ser267 (Gly somente), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, e Asp376. As muteínas que melhoraram a ligação ao FcRIlIA incluem T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, e A339T. Lys414 mostrou uma redução de 40% na ligação para FcRIIA e FcRIIB, Arg416 uma redução de 30% para FcRIIA e FcRIlIA, Gln419 uma redução de 30% para FcRIIA e uma redução de 40% para FcRIIB, e Lys360 uma melhoria de 23% para FcRIlIA. Também veja Presta e outros, Biochem. Soe. Trans. (2001) 30, 487-490.

Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N0. 6.194.551, in- corporada aqui por referência em sua totalidade, descreve muteínas com a função efetora alterada contendo mutações na região de Fe de IgG humano, 30 na posição de aminoácido 329, 331 ou 322 (usando a numeração Kabat), alguns dos quais exibem atividade de CDC ou ligação de C1q reduzida. Co- mo outro exemplo, a Patente dos Estados Unidos N0. 6.737.056, incorporada aqui por referência em sua totalidade, descrevem muteínas com ligação de Fc-gama-receptora ou efetora alterada contendo mutações na região de Fc de IgG humano, na posição de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 5 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 (usando numeração de Kabat), alguns dos quais exibem perfis de ligação de receptor associados com atividade de ADCC ou CDC reduzida. Destes, uma 10 mutação na posição de aminoácido 238, 265, 269, 270, é iniciada para redu- zir a ligação a FcRI 327 ou 329, uma mutação na posição de aminoácido 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ou 439 é iniciada para reduzir a ligação a FcRII, e uma mutação na posição de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 15 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ou 437 é iniciada para reduzir a ligação a FcRIII.

A Patente dos Estados Unidos N0. 5.624.821, incorporada aqui por referência em sua totalidade, relata que a atividade de ligação de Clq de um anticorpo de camundongo pode ser alterada mutando-se o resíduo de aminoácido 318, 320 ou 322 da cadeia pesada e que a substituição do resí- duo 297 (Asn) resulta na remoção da atividade lítica.

Publicação de Pedido dos Estados Unidos No. 20040132101, incorporada aqui por referência em sua totalidade, descreve as muteínas 25 com mutações nas posições de aminoácido 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ou 332 (usando numeração de Kabat) ou posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296 , 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 (usando nu- meração de Kabat), das quais as mutações nas posições 234, 235, 239, 30 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 podem reduzir a atividade de ADCC ou reduzir a ligação a um receptor de gama Fe. Chappel e outros, Proc Natl Aead Sei USA. 1991 ;88(20):9036- 40, incorporado aqui por referência em sua totalidade, relata que a atividade citofílica de IgGI é uma propriedade intrínseca de seu domínio de CH2 de cadeia pesada. As mutações de ponto único em qualquer dos resíduos de aminoácido 234-237 de IgGI significantemente reduziram ou aboliram sua atividade. A substituição de todos os resíduos de IgGI 234-237 (LLGG) em lgG2 e lgG4 foram requeridos para restabelecer a atividade de ligação com- pleta. Um anticorpo de lgG2 que contém a sequencia de ELLGGP inteira (resíduos 233-238) foi observado ser mais ativo do que IgGI tipo selvagem.

Isaacs e outros, J Immunol. 1998;161(8):3862-9, incorporados aqui por referência em sua totalidade, relata que as mutações em um motivo crítico para ligação de gammaR de Fc (glutamato 233 para prolina, Ieuci- na/fenilalanina 234 para valina, e Ieucina 235 para alanina) completamente preveniu a depleção de células alvos. O glutamato de mutação 318 para a- Ianina eliminou a função efetora de rato lgG2b e também reduziu a potência de lgG4 humano.

Armour e outros, Mol Immunol. 2003;40(9):585-93, incorporados aqui por referência em sua totalidade, identificaram muteínas de IgGI que reagem com o receptor de ativação, FcgammaRIIa1 pelo menos 10 vezes menos eficazmente do que IgGI do tipo selvagem porém cuja ligação ao receptor inibidor, FcgammaRIIb, é somente quatro vezes reduzido. As muta- ções foram feitas na região de aminoácidos 233-236 e/ou nas posições de aminoácido 327, 330 e 331. Também veja WO 99/58572, incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Xu e outros, J Biol Chem. 1994;269(5):3469-74, incorporados aqui por referência em sua totalidade, relata que a mutação de IgGI Pro331 para Ser notadamente a diminuiu a ligação de C1q e virtualmente eliminou a atividade lítica. Em contraste, a substituição de Pro por Ser331 em lgG4 deu atividade lítica parcial (40%) para a muteína de Pro331 de lgG4.

Schuurman e outros Mol Immunol. 2001 ;38(1): 1-8, incorporados aqui por referência em sua totalidade, relata que a mutação de uma das cis- teínas de dobradiça envolvida na formação de ligação de cadeia inter- pesada, Cys226, para serina resultou em uma ligação de cadeia inter- pesado mais estável. A mutação da sequencia de dobradiça de lgG4 Cys- Pro-Ser-Cys para a sequencia de dobradiça de IgGI Cys-Pro-Pro-Cys tam- bém notadamente estabiliza a interação covalente entre as cadeias pesadas.

5 Angal e outros, Mol Immunol. 1993;30(1): 105-8, incorporados

aqui por referência em sua totalidade, relata que a mutação da serina na posição de aminoácido 241 em lgG4 para prolina (encontrado naquela posi- ção em IgGI e lgG2) levou à produção de um anticorpo homogêneo, bem como prolongando a meia-vida de soro e melhorando a distribuição de tecido comparado com o lgG4 original quimérico.

A invenção também contempla a produção de moléculas de an- ticorpo com estrutura de carboidrato alterada que resulta em atividade efeto- ra alterada, incluindo moléculas de anticorpo com fucosilação ausente ou reduzida que exibe atividade de ADCC melhorada. Uma variedade de modos 15 é conhecida na técnica para realizar isto. Por exemplo, a atividade efetora de ADCC é mediada ligando-se a molécula de anticorpo ao receptor de FcyRIII, que foi mostrada ser dependente da estrutura de carboidrato da glicosilação ligada a N no Asn-297 do domínio de CH2. Os anticorpos não fucosilados ligam este receptor com afinidade aumentada e ativam funções efetoras me- 20 diadas por FcyRIII mais eficazmente do que anticorpos nativos, fucosilados. Por exemplo, a produção recombinante de anticorpo não fucosilado em célu- las CHO nas quais a enzima de alfa-1,6-fucosila transferase foi nocauteada resulta em anticorpo com atividade de ADCC 100 vezes aumentada [Yama- ne-Ohnuki e outros, Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5;87(5):614-22], Efeitos 25 semelhantes podem ser realizados por diminuição da atividade desta ou ou- tras enzimas na série de reações de fucosilação, por exemplo, por tratamen- to de RNA de antissentido ou siRNA, criando-se linhagens de célula para nocautear a enzima(s), ou cultivando-se com inibidores de glicosilação sele- tivos [Rothman e outros, Mol Immunol. 1989 Dec;26(12):1113-23]. Algumas 30 cepas de célula hospedeira, por exemplo, linhagem de célula YB2/0 de hibri- doma de rato ou Lecl3 naturalmente produzem anticorpos com níveis de fucosilação mais baixos. Shields, e outros, J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):26733-40; Shinkawa e outros, J Biol Chem. 2003 Jan 31;278(5):3466-73. Um aumento no nível de carboidrato bifurcado, por e- xemplo, por recombinantemente produção de anticorpo em células que su- perexpressam a enzima de GnTIII1 também foi determinado para aumentar a atividade de ADCC. Umana e outros, Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2): 176- 80. Foi predito que a ausência de somente um dos dois resíduos de fucose pode ser suficiente para aumentar a atividade de ADCC. [Ferrara e outros, J Biol Chem. 2005 5 de Dec]

Outras modificações covalentes

As modificações covalentes do anticorpo também são incluídas dentro do escopo desta invenção. Elas podem ser feitas através de síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula reagindo-se os resíduos de aminoácido alvos do anticorpo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com correntes laterais selecionadas ou os N resíduos de terminal de C.

Os resíduos de cisteinila mais geralmente são reagidos com a- haloacetatos (e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para produzir carboximetila ou derivados de carboxiamido- metila. Os resíduos de cisteinila também são derivados através de reação com bromotrifluoroacetona, ácido.alfa.-bromo-P-(-(5-imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, dissulfeto de N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de 2-piridila de metila, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4- nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Os resíduos de histidila são derivados por reação com dietilpiro- carbonato em pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidila. O brometo de para-bromofenacila também é útil; a reação é preferivelmente realizada em 0,1 M de cacodilato de sódio a pH 6,0.

Os resíduos de Iisinila e terminais de amino são reagidos com ácido sucínico ou outros ácidos de anidrido carboxílicos. A derivação com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos de lisinila. Ou- tros reagentes adequados para derivação de resíduos contendo .alfa.-amino incluem imidoésteres tal como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O-metilisouréia, 2,4-pentanodiona, e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginila são modificados através de reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-cicloexanodiona, e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por cau- sa do pKa elevado do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagen- tes podem reagir com os grupos de Iisina como também o grupo de epsilo- amino arginina.

A modificação específica de resíduos de tirosila pode ser feita, com interesse particular de introduzir rótulos espectrais em resíduos de tiro- sila através de reação com combinações de diazônio aromáticas ou tetrani- trometano. Geralmente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de tirosila de O-acetila e derivados de 3-nitro, respectiva- mente. Os resíduos de tirosila são iodadas usando 1251 ou 1311 para prepa- rar proteínas rotuladas para uso em radioimunoensaio.

Os grupos laterais de carboxila (aspartila ou glutamila) são sele- tivamente modificados por reação com carbodiimidas (R-N.dbd.C.dbd.N-R), onde ReR' são grupos alquila diferentes, tal como 1-cicloexil-3-(2-morfolinil- 4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartila e glutamila são convertidos para resíduos de asparaginila e glutaminila através de reação com íons de amônio.

Os resíduos de glutaminila e asparaginila freqüentemente são desamidados pelos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, res- pectivamente. Estes resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos se inclui o escopo desta in- venção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fos- forilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos .alfa.-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Protein: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)), a acetilação da amina de terminal de N, e amidação de qualquer grupo carboxila de terminal de C.

Outro tipo de modificação covalente envolve quimicamente ou enzimaticamente acoplar glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos pelo fato de que não requerem produção do anticorpo em uma célula hospedeira que tenha capacidades de glicosilação para glicosilação N- ou O-ligada. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar(s) pode ser preso (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livre, (c) grupos sulfidrila livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glu- tamina. Estes métodos são descritos em W087/05330 publicado em 11 de Sep. 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

A remoção de quaisquer porções de carboidrato presente no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A deglicosi- lação química requer a exposição do anticorpo ao ácido trifluorometanossul- fônico de composto, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta 20 na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N- acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), ao mesmo tempo em que dei- xando o anticorpo intato. A deglicosilação química é descrita por Hakimud- din, e outros Arco. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) e por Edge e outros, Anal. Biochem., 118: 131 (1981). A clivagem enzimática de porções de car- 25 boidrato em anticorpos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo - e exo-glicosidases como descrito por Thotakura e outros Meth. Enzymol. 138: 350(1987).

Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímero não proteináceo, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polióis polioxietilados, sorbitol polioxietilados, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilada, polioxial- quilenos, ou polímero de polissacarídeo tal como dextrana. Tais métodos são conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patentes US Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192. 4.179.337. 4.766.106. 4.179.337. 4.495.285. 4.609.546 ou EP 315 456.

Cada molécula de anticorpo pode ser presa a uma ou mais (ist é, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) moléculas de polímero. As moléculas de polímero são preferivelmente presas aos anticorpos através de moléculas ligadoras. O polímero pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, uma cadeia de polialceno opcionalmente substituído linear ou ramificada, polímero de polialcenileno ou polioxialquileno ou um polissacarí- deo ramificado ou não ramificado, por exemplo, homo- ou hetero- polissacarídeo. Os polímeros preferidos são polióis de polioxietileno e polieti- Ieno glicol (PEG). PEG é solúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmula geral: R(0--CH2--CH2) n O--R onde R pode ser hidrogênio, ou um grupo protetor tal como um grupo alquila ou alcanol. Preferivelmente, o gru- po protetor tem entre 1 e 8 carbonos, mais preferivelmente é metila. O sím- bolo n é um número inteiro positivo, preferivelmente entre 1 e 1,000, mais preferivelmente entre 2 e 500. A PEG tem um peso molecular médio preferi- do entre 1000 e 40.000, mais preferivelmente entre 2000 e 20.000, preferi- velmente entre 3.000 e 12.000. Preferivelmente, PEG tem pelo menos um grupo hidróxi, mais preferivelmente é um grupo hidróxi terminal. É este grupo hidróxi é preferivelmente ativado para reagir com um grupo amino livre no inibidor. Porém, será entendido que o tipo e quantidade dos grupos reativos possam ser variados para alcançar um PEG covalentemente conjuga- do/anticorpo da invenção presente. Os polímeros preferidos, e métodos para os prender aos peptídeos, são mostrados nas Pat. U. S. Nos. 4.766. 106; 4.179. 337; 4.495. 285; e 4.609. 546 que são todos desse modo incorpora- dos por referência em sua totalidade.

Terapia de Gene

A liberação de um anticorpo terapêutico para células apropriadas pode ser efetuada por terapia de gene ex vivo, in situ, ou in vivo por uso de qualquer abordagem adequada conhecida na técnica, incluindo por uso de métodos de transferência de DNA físicos (por exemplo, Iipossomas ou tra- tamentos químicos) ou por uso de vetores virais (por exemplo, adenovirus, vírus adeno-associado, ou um retrovírus). Por exemplo, para terapia in vivo, um ácido nucléico que codifica o anticorpo desejado, ou sozinho ou junto com um vetor, lipossoma, ou precipitado pode ser injetado diretamente no paciente, e em algumas modalidades, pode ser injetado no sítio onde a ex- pressão da combinação de anticorpo é desejada. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico é introduzido nestas células, e as células modificadas ou são devolvidas diretamente ao paciente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são im- plantadas no paciente. Veja, por exemplo, Pat. USA Nos. 4.892.538 e 5.283.187. Há uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam, dependendo se o ácido nucléico é transferido em células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucléico em células de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomas, ele- troporação, microinjeção, fusão de célula, DEAE-dextrana, e precipitação de fosfato de cálcio. Um vetor geralmente usado para liberação ex vivo de um ácido nucléico é um retrovírus.

Outras técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo inclu- em transfecção com vetores virais (tal como adenovirus, vírus do Herpes simples I, ou vírus adeno-associado) e sistemas com base em lipídeos. O ácido nucléico e agente de transfecção são opcionalmente associados com uma micropartícula. Os agentes de transfecção exemplares incluem co- precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, DOTMA anfifila de amônio quaternário ((dioleoiloxipropi- la) brometo de trimetilamônio, comercializado como Lipofectin por GIBCO- BRL)) (Felgner e outros, (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 84, 7413-7417; Malone e outros (1989) Proc. Natl Acad. Sei. E.U.A. 86 6077-6081); diéste- res de glutamato lipofílico com cabeças de trimetilamônio pendentes (Ito e outros (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); os lipídios origem me- tabolizáveis tal como a glicilespermina de dioctadecilamido de lipídio catiôni- co (DOGS, Transfectam, Promega) e etanolamilespermina de dipalmitoilfos- fatidila (DPPES)(J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 86, 6982-6986); sal de amônio quaternário metabolizável (DOTB, metilsulfato de N-(1-[2,3- dioleoiloxi]propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP)(Boehringer Mannheim), polietilenoimina (PEI), ésteres de dioleoíla, ChoTB1 ChoSC, DOSC) (Leventis e outros (1990) Biochim. Enterre. 22, 235-241); 3beta[N-(N\ N'- dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), etanolamina de dioleoil- fosfatidila (DOPE)/3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-

carbamoil]colesterolDC-Chol em misturas de um para um (Gao e outros, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, Iipopoli- aminas (Behr e outros, Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas lipofílicas (LPLL) (Zhou e outros, (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), hidróxido de [[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cre- soxi] etóxijetil] dimetilbenzilamônio (hidróxido de DEBDA) com fosfatidilcolina/colesterol em excesso (Bailas e outros, (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), brometo de cetiltrimetila- mônio (misturas de CTAB)/DOPE (Pinnaduwage e outros, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diésteres lipofílcios de ácido glutâmico (TMAG) com DOPE, CTAB, DEBDA, brometo de didodecllamônio (DDAB), e esteari- Iamina em mistura com fosfatidiletanolamina (Rose e outros, (1991) Biotech- nique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), e lipídios de suporte de oligogalactose. Os agentes realçadores de transfecção exempla- res que aumentam a eficiência de transferência incluem, por exemplo, DE- AE-dextrana, polibreno, peptídeo disruptivo de Iisossoma (Ohmori N I e ou- tros, Biochem Biophys Res Commun Jun. 27, 1997;235(3):726-9), proteogli- canos com base em condroitano, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H e outros J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), CYG- GRGDTP de peptídeo de ligação de integrina, nonassacarídeo de dextrana linear, glicerol, grupos de colesterila presos na ligação de internucleosídeo de terminal de 3 de um oligonucleotídeo (Letsinger, R., L. 1989 Proc Natl Acad Sci E.U.A. 86: (17):6553-6), lisofosfatídeo, lisofosfatidileolina, Iisofosfa- tidiletanolamina, e lisofosfatidileolina de 1-oleoíla.

Em algumas situações pode ser desejável para liberar ácido nu- cléico com um agente que direciona o vetor contendo ácido nucléico para alvejar as células. Tais moléculas "alvejantes" incluem anticorpos específi- cos para uma proteína de membrana de superfície célula na célula alvo, ou um ligando para um receptor na célula alvo. Onde os Iipossomas são em- 5 pregados, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de super- fície de célula associadas com endocitose podem ser usadas para alvejar e/ou para facilitar a absorção. Os exemplos de tais proteínas incluem proteí- nas de capsídeo e fragmentos destes trópicos para um tipo de célula particu- lar, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclagem, e pro- 10 teínas que alvejam a localização intracelular e aumentam a meia-vida intra- cellular. Em outras modalidades, a endocitose mediada por receptor pode ser usada. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Wu e outros, 1987 ou Wagner e outros, 1990. Para revisão dos protocolos de terapia de gene e marcação de gene atualmente conhecidos, veja Anderson 1992. Também 15 veja WO 93/25673 e as referências citadas aqui. Para revisões adicionais de tecnologia de terapia de gene, veja Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, suplemento ao vol. 392, no 6679, pp. 25-30

(1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); e Miller, Nature, 357: 455460 (1992).

Métodos de avaliação

Outro aspecto da presente invenção está voltado aos métodos para identificar anticorpos que diminuem a atividade de um EphB3 compre- endendo contatar um EphB3 com um anticorpo, e determinar se o anticorpo modifica atividade do EphB3. A atividade na presença do anticorpo de teste 25 é comparada à atividade na ausência do anticorpo de teste. Onde a ativida- de da amostra que contém o anticorpo de teste é mais baixa do que a ativi- dade na amostra que falta o anticorpo de teste, o anticorpo terá atividade inativa ou diminuída. Os terapêuticos efetivos dependem de identificar os agentes eficazes destituídos de toxicidade significante. Os anticorpos podem 30 ser avaliados quanto à afinidade de ligação por métodos conhecidos na téc- nica. Por exemplo, os ensaios de troca de gel, manchas do Ocidente, ensaio de competição radiorrotulada, co-fracionamento através de cromatografia, co-precipitação, reticulação, ELISA, e outros podem ser usados, os quais são descritos em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology

(1999) John Wiley & Sons, NY que está aqui incorporado através de referên- cia em sua totalidade.

Para inicialmente avaliar quanto aos anticorpos que se ligam ao epítopo desejado no antígeno alvo, um ensaio de cross-blocking rotineiro tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado. Ensaios de ligação competitivos rotineiros também podem ser usados nos quais o anticorpo desconhecido é caracterizado por sua capacidade de inibir a ligação do alvo a um anticorpo de alvo específico da invenção. O antígeno intato, fragmento do mesmo, tal como o domínio extracelular, ou epítopos lineares podem ser usados. O traçado de epítopo é descrito em Champe e outros, J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

Em uma variação de um ensaio de ligação in vitro, a invenção fornece um método que compreende as etapas de (a) contatar um EphB3 imobilizado com um anticorpo candidato e (b) ligar o detector do anticorpo candidato ao EphB3. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo candidato é imobilizado e a ligação de EphB3 é detectada. A imobilização é realizada usando quaisquer dos métodos bem conhecido na técnica, incluindo ligação covalente a um suporte apoio, uma conta, ou uma resina cromatográfica, como também interação de alta afinidade, não covalente, tal como ligação de anticorpo, ou uso de ligação de estreptavidian/biotina em que os compos- tos imobilizados incluem uma porção de biotina. A detecção da ligação pode ser realizada (i) usando um rótulo radioativo no composto que não está imo- bilizado, (ii) usando um rótulo fluorescente no composto não imobilizado, (iii) usando um anticorpo imunoespecífico para o composto não imobilizado, (iv) usando um rótulo no composto não imobilizada que excita um suporte fluo- rescente ao qual o composto imobilizado é preso, como também outras téc- nicas bem conhecidas e habitualmente praticadas na técnica.

Os anticorpos que diminuem a atividade do antígeno alvo podem ser identificados incubando um anticorpo candidato com antígeno alvo (ou uma célula que expresse o antígeno designado) e determinando o efeito do anticorpo candidato na atividade ou expressão do antígeno alvo. A atividade na presença do anticorpo de teste é comparada à atividade na ausência do anticorpo de teste. Onde a atividade da amostra que contém o anticorpo de 5 teste é mais baixa do que a atividade na amostra que falta o anticorpo de teste, o anticorpo terá atividade diminuída. A seletividade de um anticorpo que modula a atividade de um polinucleotídeo ou polipeptídeo de antígeno alvo pode ser avaliada comparando seus efeitos no antígeno alvo com seu efeito em outros compsotos relacionados.

Em modalidades exemplares particulares, é contemplado que os

anticorpos são testados quanto ao seu efeito em um sistema de célula culti- vada para determinar sua capacidade de inibir a fosforilação de receptor, sinalização, ligação de ligando, dimerização de EphB3, ativação de receptor induzida por ligando, e/ou adesão de célula-célula mediada por EphB3. Adi- 15 cionalmente, ensaios celulares incluindo ensaios de proliferação, ensaios de agar macia, e/ou ensaios de citotoxicidade como descrito aqui podem ser usado para avaliar um anticorpo de EphB3 particular.

A atividade biológica de um anticorpo particular, ou combinação de anticorpos, pode ser avaliada in vivo usando um modelo de animal ade- quado. Por exemplo, a transfecção da espinha dorsal de rato adulto e moni- toramento da super-regulação de EphB3 e expressão de ligando são con- templados. (Cell Transplant. 2003;12(3):279-90).

A invenção também compreende os ensaios de avaliação de alta produtividade (HTS) para identificar anticorpos que interagem com ou inibem 25 a atividade biológica (isto é, inibem a fosforilação, dimerização, ativação in- duzida por receptor de ligando, ou sinalização intracelular, etc.) de antígeno alvo. Os ensaios de HTS permitem a avaliação de números grandes de compostos de uma maneira eficiente. Os sistemas de HTS com base em célula são contemplados para investigar a interação entre o antígeno alvo e 30 seus membros de ligação. Os ensaios de HTS são designados para identifi- car "hits" ou "compostos indutores" tendo a propriedade desejada da qual, modificações podem ser projetadas para melhorar a propriedade desejada. Em outra incorporação da invenção, a avaliação de alta produti- vidade para fragmentos de anticorpo ou CDRs com 1, 2, 3 ou mais modifica- ções para aminoácidos nos CDRs tendo afinidade de ligação adequada a um polipeptídeo de antígeno alvo é empregada.

Terapia de combinacão

Tendo identificado mais de um anticorpo que é efetivo em um modelo animal, pode ser também vantajoso misturar dois ou mais tais anti- corpos juntos (que se ligam aos mesmos ou diferentes antígenos alvos) para fornecer eficácia ainda melhorada. As composições que compreendem um ou mais anticorpos podem ser administradas a pessoas ou mamíferos que sofrem, ou estão predispostos a sofrer, uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3. A administração simultânea de dois agentes terapêuticos não requer que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mes- ma rotina, contanto que haja uma sobreposição no período de tempo duran- te o qual os agentes estão mostrando seu efeito terapêutico. A administra- ção simultânea ou seqüente é contemplada, quando é administração em dias ou semanas diferentes.

Os métodos da invenção contemplam a administração de únicos anticorpos, como também combinações, ou "coquetéis", de anticorpos dife- rentes. Tais coquetéis de anticorpo podem ter certas vantagens já que eles contêm anticorpos que exploram mecanismos efetores diferentes ou combi- nam anticorpos citotóxicos diretamente com anticorpos que confiam na fun- cionalidade efetora imune. Tais anticorpos em combinação podem exibir e- feitos terapêuticos sinérgicos.

Os métodos da invenção também contemplam a administração de anticorpos únicos ou coquetéis de anticorpo em combinação com o pa- drão medicinalmente reconhecido de cuidado para a doença ou distúrbio particular sendo tratado.

Um agente citotóxico se refere a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo é pre- tendido incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agen- tes quimioterapêuticos, e toxinas tal como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou toxinas sintéticas, ou fragmentos da mesma. Um agente não citotóxico se refere a uma substância que não inibe ou previne a função de células e/ou não cause destruição de células. Um agente não citotóxico pode incluir um agente que pode ser ati- vado para ser citotóxico. Um agente não citotóxico pode incluir uma conta, lipossoma, matriz ou partícula (veja, por exemplo, Publicações de Patentes dos Estados Unidos 2003/0028071 e 2003/0032995 que estão incorporadas aqui por referência). Tais agentes podem ser conjugados, acoplados, ligados ou associados com um anticorpo de acordo com a invenção.

Administração e preparação

Os anticorpos da invenção podem ser formulados em composi- ções farmacêuticas que compreendem um portador adequado para o méto- do de liberação desejado. Os portadores adequados incluem qualquer mate- rial que, quando combinado com anticorpos, retém a atividade desejada do anticorpo e é não reativo com os sistemas imunes do paciente. Os exemplos incluem, porém não estão limitados a, quaisquer dos vários portadores far- macêuticos padrões tal como soluções salinas tamponadas de fosfato esté- reis, água bacteriostática, e similares. Uma variedade de portadores aquo- sos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, 0,4% de salina,

0,3% de glicina e similares, e pode incluir outras proteínas para estabilidade aumentada, tal como albumina, lipoproteína, globulina, etc., submetida a modificações químicas moderadas ou similares.

As formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para armazenamento misturando-se o anticorpo tendo o grau desejado de pureza com portadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais, (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A., Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Os por- tadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos reci- pientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; os antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (como cloreto de amônio de oc- tadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butila ou álcool de benzila; parabenos de alquila tal como metila ou parabeno de propila; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos de a- proximadamente 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelati- 5 na, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo gli- cose, manose, ou dextrinas; os agentes de quelação tal como EDTA; açúca- res tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação 10 de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, Complexos de Zn- proteína); e/ou tensoativos não iônicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

A formulação neste aspecto pode conter também mais de um composto ativo quando necessário para a indicação particular que é tratada, preferivelmente aquelas com atividades complementares que não afetam um ao outro adversamente. Tais moléculas estão apropriadamente presentes nos composto em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos também podem estar em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou por poli- 20 merização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sis- temas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microes- feras de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington1S Pharmaceuti- 25 cal Sciences 16a edição, Osol, A., Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é facilmente realizado através de filtração por mem- branas de filtração estéreis.

O anticorpo é administrado por qualquer meio adequado, inclu- indo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejou para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é admi- nistrado adequadamente por infusão de pulso, particularmente com doses decrescente do anticorpo. Preferivelmente a dosagem é determinada por injeções, preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas. Outros mé- 5 todos de administração são contemplados, incluindo administração tópica, particularmente transdérmica, transmucosal, retal, oral ou local, por exemplo, por um cateter colocado perto do sítio desejado.

Para administração nasal, as formulações farmacêuticas e medi- camentos podem ser um spray ou aerossol que contém um solvente(s) a- propriado e opcionalmente outros compostos tais como, porém não limitado

a, estabilizadores, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores de pH, tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes. Um propulsor para uma formulação aerossol pode incluir ar comprimido, ni- trogênio, gás carbônico, ou um solvente de baixa ebulição com base em hi- drocarboneto.

As formas de dosagem injetáveis geralmente incluem suspen- sões aquosas ou suspensões de óleo que podem ser preparadas usando um dispersante adequado ou agente umectante e um agente de suspensão. As formas injetáveis podem estar em fase de solução ou na forma de uma sus- 20 pensão que é preparada com um solvente ou diluente. Os solventes ou veí- culos aceitáveis incluem água esterilizada, a solução de Ringer, ou uma so- lução salina aquosa isotônica.

Para injeção, a formulação farmacêutica e/ou medicamento po- dem ser um pó adequado para reconstituição com uma solução apropriada 25 para injeção, como descrito acima. Os exemplos destes incluem, porém não estão limitados a, liofilização, pós secos a giro ou secos por spray, pós a- morfos, grânulos, precipitados, ou particulados. Para injeção, as formulações podem opcionalmente conter estabilizadores, modificadores de pH, tensoati- vos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes.

As preparações liberação contínua podem ser preparadas. Os

exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matri- zes semipermeáveis de polímero hidrofóbicos sólidos que contêm o anticor- po, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, pelícu- las, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação contínua inclu- em poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(vinilálcool)), polilactídeos (Patente U.S. N0. 3.773.919), copolímeros de 5 ácido L-glutãmico e y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradá- vel, copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradáveis como Lupron Depot™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático - ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D - (-) -3-hidroxibutírico. Ao mesmo tempo em que os polímeros tal como acetato de etileno-vinila e 10 ácido lático - ácido glicólico permitem a liberação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem por muito tempo no corpo, eles podem desnaturar ou podem se agregar como resulta- do de exposição a umidade em 37°C, resultando em uma perda de atividade 15 biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser inventadas para estabilização que depende do mecanismo envol- vido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser a forma- ção de ligação de S-S intermolecular por permuta de tio-dissulfeto, a estabi- lização pode ser obtida modificando-se os resíduos de sulfidrila, Iiofilizando 20 as soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropri- ados, e desenvolvendo composições de matriz de polímero específicas. Ou- tras estratégias conhecidas na técnica podem ser usadas.

As formulações da invenção podem ser designadas serem de curta ação, rápida liberação, longa ação, ou liberação contínua como descri- to aqui. Desse modo, as formulações farmacêuticas também podem ser for- muladas para liberação controlada ou para liberação lenta.

As presentes composições também podem compreender, por exemplo, micelas ou lipossomas, ou alguma outra forma encapsulada, ou podem ser administradas em uma forma de liberação prolongada para for- 30 necer um efeito de armazenamento e/ou liberação prolongado. Então, as formulações e medicamentos farmacêuticos podem ser prensados em pelo- tas ou cilindros e implantadas intramuscularmente ou subcutaneamente co- mo injeções de depósito ou como implantes tal como stents. Tais implantes podem empregar materiais inertes conhecidos tais como silicones e políme- ros biodegradáveis.

Além dessas formas de dosagem representativas descritas aci- 5 ma, os excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são conhecidos por aqueles versados na técnica e são desse modo incluídos na presente invenção. Tais excipientes e portadores são descritos, por exem- plo, em " Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991) que está aqui incorporado através de referência.

Dosagens específicas podem ser ajustadas dependendo das

condições de doença, da idade, peso corpóreo, condições de saúde gerais, genótipo, sexo, e dieta do paciente, intervalos de dose, rotinas de adminis- tração, taxa de excreção, e combinações de fármacos. Quaisquer das for- mas de dosagem acima que contêm quantidades efetivas está bem dentro 15 dos limites de experimentação rotineira e então, bem dentro do escopo da presente invenção.

Os anticorpos da invenção geralmnte serão preparados subs- tancialmente livres de outras immunoglobulinas ou outras moléculas biológi- cas de ocorrência natural. Os anticorpos preferidos também exibirão toxici- dade mínima quando administrados a um mamífero afligido com, ou predis- posto a sofrer de uma doença ou distúrbio relacionado com EphB3.

As composições da invenção podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. As soluções resul- tantes podem ser embaladas para uso ou podem ser filtradas sob condições 25 assépticas e liofilizadas, a preparação Iiofilizada sendo combinada com uma solução estéril antes da administração. As composições podem conter subs- tâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis quando requerido para se aproximar das condições fisiológicas, tal como agentes de ajuste de pH e agentes de proteção, agentes de ajuste de tonicidade e similares, por exem- 30 pio, acetato de sódio, Iatato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e estabilizadores (por exemplo, 1 20% de maltose, etc.).

Os anticorpos da presente invenção também podem ser admi- nistrados por Iipossomas que são vesículas pequenas compostas de vários tipos de lipídios e/ou fosfolipídeos e/ou tensoativos que sejam úteis para li- beração de um fármaco (tal como os anticorpos descritos aqui e, opcional- mente, agente quimioterapêutico). Lipossomas incluem emulsões, espumas, 5 micelas, monocamadas insolúveis, dispersões de fosfolipídeos, camadas Iamelares e similares, e podem servir como veículos para alvejar os anticor- pos para um tecido particular como também aumentar a meia vida da com- posição. Uma variedade de métodos está disponível para preparar Iiposso- mas, como descrito em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N0. 10 4.837.028 e 5.019.369 cujas patentes estão aqui incorporadas através de referência.

Lipossomas que contêm o anticorpo são preparados por méto- dos conhecidos na técnica, como descrito em Epstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 82: 3688 (1985); Hwang e outros, Proc. Natl Acad. Sei. 15 E.U.A. 77: 4030 (1980); e Patentes dos Estados Unidos EUA Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são descritos na Patente dos Estados Unidos N0. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídio que compreende fosfatidileolina, fosfatidiletano- 20 lamina derivado de colesterol e PEG (PEG-PE). Lipossomas são extrusados por filtros de tamanho de poro definido para produzir Iipossomas com o diâ- metro desejado. Os fragmentos de Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados para os Iipossomas como descrito em Martin e ou- tros, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por uma reação de permuta de dis- 25 sulfeto. O agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) é opcionalmen- te contido dentro do Iipossoma [veja, por exemplo, Gabizon e outros, J. Nati- onal Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)].

A concentração de anticorpo nestas composições pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 10%, normalmente pelo menos cerca de 25% para tanto quanto 75% ou 90% em peso e será selecionada principalmente por volumes fluidos, viscosidades, etc., de acordo com um modo particular de administração selecionado. Os métodos atuais para pre- parar composições oralmente, topicamente e parenteralmente administráveis serão conhecidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são des- critos em detalhes em, por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Science, 19° ed., Mack Publishing Cia., Easton1 PA (1995) que está aqui incorporado por referência.

A determinação de uma quantidade efetiva de uma composição da invenção para tratar doença em um paciente pode ser realizada por mé- todos empíricos padrões que são bem conhecido na técnica. Uma quantida- de adequada para realizar isto é definida como uma "dose terapeuticamente efetiva". As quantidades efetivas de um anticorpo variarão e dependerão da severidade da doença e do peso e estado geral do paciente sendo tratado, mas geralmente varia de cerca de 1,0 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo. As doses exemplares podem variar de cerca de 10 Mg/kg a cerca de 30 mg/kg, ou de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg ou de cerca de

1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por aplicação. O anticorpo também pode ser dosado através de área de superfície de corpo (por exemplo, até 4,5 g/ me- tro quadrado). Outras doses exemplares de anticorpo incluem até 8g total em uma única administração (assumindo um peso corpóreo de 80 kg ou á- rea de superfície de corpo de 1,8 metros quadrados).

A administração pode ser por qualquer meio conhecido na técni- ca. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado por uma ou mais admi- nistrações de bolo separado, ou por infusão curta ou longa durante um perí- odo de, por exemplo, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 minutos ou mais. Seguinte um período de tratamento inicial, e dependendo da resposta do paciente e tolerância da terapia, doses de manutenção podem ser administradas, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, a cada 3 semanas, a cada 4 se- manas, mensalmente, bimestralmente, a cada 3 meses, ou a cada 6 meses, quando necessário para manter a resposta do paciente. Dosagens mais fre- qüentes podem ser necessárias até que uma supressão desejada de sinto- mas de doença ocorra, e as dosagens podem ser ajustadas quando neces- sário. O progresso desta terapia é monitorado facilmente por técnicas e en- saios convencionais. A terapia pode ser durante um período definido ou po- de ser crônica e pode continuar durante um período de anos até a progres- são da doença ou morte.

As administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis de dose e padrão sendo selecionados pelo mé- dico do tratamento. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da severidade e curso da doença, se o anticorpo for adminis- trado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e da discrição do médico aten- dente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.

Em todo caso, as formulações deveriam fornecer uma quantida- de de anticorpo terapêutico com o passar do tempo que fosse suficiente para mostrar a atividade biológica desejada, por exemplo, prevenir ou minimizar a severidade da doença ou distúrbio relacionado com EphB3. As composições da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou como uma tera- pia adjuntiva junto com outros terapêuticos conhecidos na técnica pelo tra- tamento de tal infecção.

A composição de anticorpo será formulada, será dosada, e será administrada de um modo de acordo com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo trata- do, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente indi- vidual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de ad- ministração, a programação de administração, e outros fatores conhecidos pelos médicos. A quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo a ser administrado será administrada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar, ou tratar a doença, condição ou distúrbio mediada pelo alvo. Tal quantidade está preferivelmente abaixo da quantidade que é tóxica ao hospedeiro ou torna o hospedeiro significante- mente mais suscetível a infecções.

O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúr- bio em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença, condi- ção ou distúrbio ou tratamento, e outros fatores descritos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotinas de administração 5 como usado aqui anteriormente ou acima de 1 a 99% das dosagens antes empregadas.

Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de fa- bricação contendo materiais úteis para o tratamento da condição desejada. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes 10 adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente segura uma composição que é efetiva para tratar a condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que 15 tem uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é o anticorpo da invenção. O rótulo em, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O artigo de fabricação pode também compreender um segundo re- cipiente contendo um segundo agente terapêutico (incluindo quaisquer dos 20 segundos agentes terapêuticos para doenças descritas aqui ou conhecidas na técnica). O artigo de fabricação pode também compreender outro recipi- ente que contém um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada por fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose pa- ra reconstituir uma formulação de anticorpo liofilizada. Pode também incluir 25 outros materiais desejável de um ponto de vista comercial e de usuário, in- cluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e inserções de embalagem com instruções para uso.

Imunoterapia

Os anticorpos úteis no tratamento de pacientes que têm doenças ou distúrbios relacionados com EphB3 podem incluir aqueles que são capa- zes de iniciar uma resposta imune potente contra, ou capaz de citotoxicidade contra, a célula que expressa EphB3. Os anticorpos conjugados para agen- tes citotóxicos podem ser usados para alvejar os agentes citotóxicos para tecidos que expressam EphB3. Alternativamente, os anticorpos podem ex- trair Iise de célula por mecanismos de citotoxicidade de célula dependente de anticorpo ou mediada por complemento (ADCC), ambos dos quais reque- 5 rem uma porção de Fc intata da molécula de imunoglobulina para interação com sítios de receptor de Fc de célula efetora ou proteínas de complemento. Além disso, os anticorpos que exercem um efeito biológico direto no cresci- mento de célula são úteis na prática da invenção.

Os anticorpos Anti-EphB3 podem ser administrados em sua for- ma "nua" ou não conjugada, ou podem ser conjugados diretamente para ou- tros agentes terapêuticos ou diagnóstico, ou podem ser conjugados indire- tamente para polímero portador que compreende tais outros agentes tera- pêuticos ou diagnóstico.

Os anticorpos podem ser detectavelmente rotulados pelo uso de 15 radioisótopos, rótulos de afinidade (tais como biotina, avidina, etc.), rótulos enzimáticos (tais como, rábano picante peroxidase, alcalino fosfatase, etc.), rótulos fluorescentes ou Iuminescentes ou bioluminescentes (tal como FITC ou rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, e similares. Os procedimentos para realizar tal rotulação são bem conhecidos na técnica; por exemplo, veja 20 (Sternberger, L.A. e outros, J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. e outros, Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E., e outros, Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. o J. Immunol. Meth. 13:215 (1976)).

Conjugação de porções de anticorpo é descrita na Patente U.S. N2 6.306.393. Técnicas gerais são da mesma forma descritas em Shih e ou- 25 tro, Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih e outro, Int. J. Cancer 46:1101- 1106 (1990); e Shih e outro, Patente U.S. N2 5.057.313. Este método geral envolve reagir um componente de anticorpo que tem uma porção de carboi- drato oxidada com um polímero de veículo que tem pelo menos uma função de amina livre e que é carregada com uma pluralidade de fármaco, toxina, 30 quelador, adendos de boro, ou outro agente terapêutico. Esta reação resulta em uma ligação de base de Schiff inicial (imina), que pode ser estabilizada por redução a uma amina secundária para formar o conjugado final. O polímero de veículo pode ser, por exemplo, um aminodextrana ou polipeptídeo de pelo menos 50 resíduos de aminoácido. Várias técnicas para conjugar um fármaco ou outro agente ao polímero de veículo são co- nhecidas na técnica. Um veículo de polipeptídeo pode ser usado em vez de aminodextrano, porém o veículo de polipeptídeo deve ter pelo menos 50 re- síduos de aminoácido na cadeia, preferivelmente 100-5000 resíduos de ami- noácido. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou glutamato ou resíduos de aspartato. As aminas pendentes de resíduos de lisina e carboxilatos pendente de glutamina e aspartato são convenientes para ligar um fármaco, toxina, imunomodulator, quelador, adendos de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de veículos de polipeptídeo adequa- dos incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, co-polímeros dos mesmos, e polímeros misturados destes aminoácidos e outros, por e- xemplo, serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejáveis sobre o conjugado e veículo carregado resultante.

Alternativamente, anticorpos conjugados podem ser preparados conjugando-se diretamente um componente de anticorpo com um agente terapêutico. O procedimento geral é análogo ao método indireto de conjuga- ção a não ser que um agente terapêutico seja ligado diretamente a um com- 20 ponente de anticorpo oxidado. Por exemplo, uma porção de carboidrato de um anticorpo pode ser ligada ao polietilenoglicol para prolongar a meia-vida.

Alternativamente, um agente terapêutico pode ser ligado na re- gião de articulação de um componente de anticorpo reduzido por formação de ligação de dissulfeto, ou usando um reticulador heterobifuncional, tal co- 25 mo N-sucinil 3-(2-piridilditio)proprionato (SPDP). Yu e outro, Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis e outro, "Modification of Antibod- ies by Chemical Methods," em Monoclonal Antibodies: Principples and Appli- 30 cations, Birch e outro, (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," em Monoclonal Antibodies: Production, Enineering and Clinicai Application, Ritter e outro (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995). Uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional é conhecida na técnica, tal como N-sucinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), imino- tiolano (IT), derivado bifuncional de imidoésteres (tal como HCL de dimetil 5 adipimidato), ésteres ativos (tal como dissucinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolieno 2,6-diisocianato), e compos- tos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

Finalmente, proteínas de fusão podem ser construídas as quais

compreendem uma ou mais porções de anticorpo anti-EphB3 e outro poli- peptídeo. Métodos de preparar proteínas de fusão de anticorpo são bem co- nhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. N2 6.306.393. Proteí- nas de fusão de anticorpo que compreendem um porção de interleucina-2 15 são descritas por Boleti e outro, Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet e outro, Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker e outro, Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 93:7826 (1996), Hank e outro, Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), e Hu e ou- tro, Cancer Res. 56:4998 (1996).

Os anticorpos da invenção podem ser administrados em sua forma "nua" ou não conjugada, ou podem ter os agentes terapêuticos conju- gados por eles.

A presente invenção também fornece os anticorpos acima des- critos em forma detectavelmente rotulada. Anticorpos podem ser detecta- velmente rotulados através do uso de radioisótopos, rótulos de afinidade 25 (tais como biotina, avidina, etc.), rótulos enzimáticos (tais como peroxidase de rábano picante, fosfatase alcalina, etc.) rótulos fluorescentes ou Iumines- centes ou bioluminescentes (tal como FITC ou rodamina, etc.), átomos pa- ramagnéticos, e similares. Procedimentos por realizar tal rotulagem são bem conhecidos na técnica; por exemplo, veja (Sternberger, L.A. e outro, J. His- 30 tochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. e outro, Meth. Enzym. 62:308

(1979); Engval, E. e outro, Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immu- nol. Meth. 13:215 (1976)). "Rótulo" refere-se a uma composição ou composto detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente ao anticorpo. O rótulo pode, por si próprio, ser detectável (por exemplo, rótulos de radioisótopo ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar a altera- 5 ção química de uma composição ou composto de substrato que é detectá- vel. Alternativamente, o rótulo pode não ser detectável isoladamente, porém, pode ser um elemento que é ligado por outro agente que é detectável (por exemplo, um rótulo de epítopo ou um dentre um oar de ligação tal como bio- tina-avidina, etc.) Desse modo, o anticorpo pode compreender um rótulo ou 10 etiqueta que facilita seu isolamento, e métodos da invenção para identificar os anticorpos incluem uma etapa de isolar o anticorpo através da interação com o rótulo ou etiqueta.

A produção de imunconjugados é descrita na Patente U.S. Ns

6.306.393. Imunoconjugados podem ser preparados conjugando-se indire- 15 tamente um agente terapêutico a um componente de anticorpo. Técnicas gerais são descritas em Shih e outro, Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih e outro, Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); e Shih e outro, Patente U.S. N2 5.057.313. O método geral envolve reagir um componente de anticorpo que tem uma porção de carboidrato oxidada com um polímero de veículo que 20 tem pelo menos uma função de amina livre e que é carregado com uma plu- ralidade de fármaco, toxina, quelador, adendos de boro, ou outro agente te- rapêutico. Esta reação resulta em uma ligação de base de Schiff inicial (imi- na) que pode ser estabilizada por redução em uma amina secundária para formar o conjugado final.

O polímero de veículo é preferivelmente uma aminodextrana ou

polipeptídeo de pelo menos 50 resíduos de aminoácido, embora outros veí- culos de polímero substancialmente equivalentes possam ser usados. Prefe- rivelmente, o imunoconjugado final é solúvel em uma solução aquosa, tal como soro mamífero, para facilidade de administração e alvejamento eficaz 30 para uso em terapia. Desse modo, funções de solubilização no polímero de veículo realçarão a solubilidade de soro do imunoconjugado final. Em parti- cular, uma aminodextrana será preferida. O processo para preparar um imunoconjugado com um com um veículo de aminodextrana tipicamente começa com um polímero de dextra- na, vantajosamente uma dextrana de peso molecular médio de cerca de 10.000-100.000. A dextrana é reagida com um agente de oxidação para afe- tar uma oxidação controlada de uma porção de seus anéis de carboidrato para gerar os grupos de aldeído. A oxidação é convenientemente realizada com reagentes químicos glicolíticos tal como Nal04, de acordo com proce- dimentos convencionais.

A dextrana oxidada é em seguida reagida com uma poliamina, preferivelmente uma diamina, e mais preferivelmente, uma mono- ou polii- dróxi diamina. Aminas adequadas incluem etileno diamina, propileno diami- ne, ou outras polimetileno diaminas similares, dietileno triamina ou poliami- nas similares, 1,3-diamino-2-hidroxipropano, ou outras poliaminas ou diami- nas hidroxiladas similares. Um excesso da amina relativo aos grupos aldeído da dextrana é usado para garantir a conversão substancialmente completa das funções de aldeído em grupos de base de Schiff.

Um agente de redução, tal como NaBH4, NaBH3 CN ou simila- res, é usado para realizar a estabilização redutiva do intermediário de base de Schiff resultante. O aduto resultante pode ser purificado por passagem através de uma coluna de delimitação convencional para remover as dextra- nas reticuladas.

Outros métodos convencionais de derivação de uma dextrana para introduzir as funções de amina podem da mesma forma ser usados, por exemplo, reação com brometo de cianogênio, seguido por reação com uma diamina.

A amninodextrana é em seguida reagida com um derivado do fármaco particular, toxina, quelador, imunomodulador, adendo de boro, ou outro agente terapêutico a ser carregado, em uma forma ativada, preferivel- mente, um derivado ativado por carboxila, preparado por meios convencio- nais, por exemplo, usando dicicloexilcarbodiimida (DCC) ou uma variante solúvel em água dos mesmos, para formar um aduto intermediário.

Alternativamente, polipeptídeos podem ser acoplados em ami- nodextrana por condensação de glutaraldeído ou por reação de grupos car- boxila ativados na proteína com aminas na aminodextrana.

Queladores para radiometais ou realçadores de ressonância magnética são bem conhecidos na técnica. Típicos são derivados de ácido 5 etilenodiaminatetraacético (EDTA) e ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA). Estes queladores tipicamente têm grupos na cadeia lateral pela qual o quelador pode ser ligado a um veículo. Tais grupos incluem, por exemplo, benzilisotiocianato, pelo qual o DTPA ou EDTA pode ser acoplado ao grupo amina de um veículo. Alternativamente, grupos carboxila ou grupos amina 10 em um quelador podem ser acoplados a um veículo por ativação ou deriva- ção anterior e em seguida acoplando, todos por meios bem conhecidos.

Adendos de boro, tais como carboranos, podem ser ligados aos componentes de anticorpo apor métodos convencionais. Por exemplo, car- boranos podem ser preparados com funções de carboxila em cadeias Iate- 15 rais pendentes, como é bem conhecido na técnica. A ligação de tais carbo- ranos a um veículo, por exemplo, aminodextrana, pode ser obtida por ativa- ção dos grupos carboxilas dos carboranos e condensação com aminas no veículo para produzir um conjugado intermediário. Tais conjugados interme- diários são em seguida ligados aos componentes de anticorpo para produzir 20 imunoconjugados terapeuticamente úteis, como descrito abaixo.

Um veículo de polipeptídeo pode ser usado em vez de amino- dextrana, porém o veículo de polipeptídeo deve ter pelo menos 50 resíduos de aminoácido na cadeia, preferivelmente 100-5000 resíduos de aminoácido. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou gluta- 25 mato ou resíduos de aspartato. As aminas pendentes de resíduos de lisina e carboxilatos pendentes de glutamina e aspartato são convenientes para ligar um fármaco, toxina, imunomodulador, quelador, adendos de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de veículos de polipeptídeo adequados inclu- em polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, co-polímeros dos 30 mesmos, e polímeros misturados destes aminoácidos e outros, por exemplo, serinas, para conferir as propriedades de solubilidade desejáveis no imuno- conjugado e veículo carregado resultante. Conjugação do intermediário conjuga com o componente de an- ticorpo é efetuado oxidando a porção de carboidrato do componente de anti- corpo e reagindo o aldeído resultante (e cetona) carbonilas com grupos ami- na permanecendo no veículo depois de carregar com um fármaco, toxina, 5 quelador, imunomodulador, adendo de boro, ou outro agente terapêutico. Alternativamente, um conjugado intermediário pode ser ligado a um compo- nente de anticorpo oxidado por grupos amina que foram introduzidos no con- jugado intermediário depois de carregar com o agente terapêutico. Oxidação é realizada convenientemente quimicamente, por exemplo, com NaIO4 ou 10 outro reagente glicolítico, ou enzimaticamente, por exemplo, com neuramini- dase e galactose oxidase. No caso de um veículo de aminodextrana, nem todas as aminas da aminodextrana são tipicamente usados para carregar um agente terapêutico. As aminas restantes de aminodextrana condensam com o componente de anticorpo oxidado para formar adutos de base de S- 15 chiff, que são em seguida redutivamente estabilizadas, normalmente com um agente de redução de boroidreto.

Procedimentos análogos são usados para produzir outros imu- noconjugados de acordo com a invenção. Veículos de polipeptídeo carrega- dos preferivelmente têm resíduos de lisina livre que permanecem para con- 20 densação com a porção de carboidrato oxidada de um componente de anti- corpo. Carboxilas no veículo de polipeptídeo podem, se necessário, ser con- vertidos em aminas, por exemplo, por ativação com DCC e reação com um excesso de uma diamina.

O imunoconjugado final é purificado usando técnicas convencio- nais, tal como cromatografia de delimitação em Sephacryl S-300 ou croma- tografia de afinidade usando um ou mais epítopos de CD84Hy.

Alternativamente, imunoconjugados podem ser preparados dire- tamente conjugando um componente de anticorpo com um agente terapêuti- co. O procedimento geral é análogo ao método indireto de conjugação a não ser que um agente terapêutico seja ligado diretamente a um componente de anticorpo oxidado.

Como uma ilustração adicional, um agente terapêutico pode ser ligado na região de articulação de um componente de anticorpo reduzido por formação de ligação de dissulfeto. Por exemplo, os peptídeos toxóides de tétano podem ser construídos com um único resíduo de cisteína que é usado para ligar o peptídeo a um componente de anticorpo. Como uma alternativa, tais peptídeos podem ser ligados ao componente de anticorpo usando um reticulador heterobifuncional, tal como N-sucinil 3-(2-piridilditio)proprionato (SPDP). Yu e outro, Int. J. Cancer 56:244 (1994). Técnicas gerais para tal conjugação são conhecidas na técnica. Por exemplo, veja Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis e outro, "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Anti- bodies: Principies and Applications, Birch e outro (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Enineer- ing and Clinicai Application, Ritter e outro (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995).

Conjugados do anticorpo e o agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional tais como N-sucinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivado bifuncional de imidoésteres (tal como HCL de dimetil adipimidato), ésteres 20 ativos (tal como dissucinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), deri- vados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), dii- socianatos (tal como 2,6-diisocianato tolieno), e compostos de flúor bis- ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, um conjugado 25 de peptídeo pode ser preparado como descrito em Vitetta e outro, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta- acético carbono-14-rotulado (MX-DTPA) é um conjugado de agente de que- lação exemplar (veja, por exemplo, W094/11026).

Como descrito acima, porções de carboidrato na região de Fc de um anticorpo podem ser usadas para conjugar um agente terapêutico. Po- rém, a região de Fc pode ser ausente se um fragmento de anticorpo for usa- do como o componente de anticorpo do imunoconjugado. Não obstante, é possível introduzir um porção de carboidrato na região variável de cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Por exemplo, veja Leung e outro, J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen e outro, Patente U.S. N2 5.443.953. A porção de carboidrato criada é usada em seguida para ligar um agente terapêutico.

Além disso, aqueles de experiência na técnica reconhecerão numerosas possíveis variações dos métodos de conjugação. Por exemplo, a porção de carboidrato pode ser usada para ligar polietilenoglicol para pro- longar a meia-vida de um anticorpo intacto, ou fragmento de ligação de antí- 10 geno dos mesmos, no sangue, linfa, ou outros fluidos extracelulares. Além disso, é possível construir um "imunoconjugado divalente" ligando-se os a- gentes terapêuticos a um porção de carboidrato e a um grupo sulfidrila livre. Um tal grupo sulfidrila livre pode estar localizado na região de articulação do componente de anticorpo.

Proteínas de Fusão de Anticorpo

A presente invenção considera o uso de proteínas de fusão compreendendo uma ou mais porções de anticorpo e outro polipeptídeo, tal como um imunomodulador ou outro agente terapêutico. Métodos de preparar proteínas de fusão de anticorpo são bem conhecidos na técnica. Veja, por 20 exemplo, Patente U.S. Ns 6.306.393. Proteínas de fusão de anticorpo com- preendendo uma porção de interleucina-2 são descritas por Boleti e outro, Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet e outro, Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker e outro, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 93:7826 (1996), Hank e outro, Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), e Hu e outro, Cancer Res. 56:4998 (1996). 25 Além disso, Yang e outro, Hum. Antibodies Hibridomas 6:129 (1995), des- creve uma proteína de fusão que inclui um fragmento de F(ab')2 e uma por- ção alfa de fator de necrose de tumor.

Métodos de preparar proteínas de fusão em que uma molécula recombinante compreende um ou mais componentes de anticorpo e outro agente terapêutico da mesma forma são conhecidos por aqueles de experi- ência na técnica. Por exemplo, veja Chaudhary e outro, Nature 339:394 (1989), Brinkmann e outro, Proc. Nat1I Acad. Sei. USA 88:8616 (1991), Batra e outro, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 89:5867 (1992), Friedman e outro, J. Im- munol. 150:3054 (1993), Welse outro, Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya e outro, J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan e outro, Biochemistry 35:2872 (1996), e Schmidt e outro, Int. J. Can. 65:538 (1996); Kreitman e 5 outro, Leukemia 7:553 (1993), Nicholls e outro, J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson e outro, J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), e Vallera e ou- tro, Blood 88:2342 (1996); Deonarain e outro, Tumortargeting 1:177 (1995), Linardou e outro, Cell Biophys. 24-25:243 (1994), Wang e outro, Resumos do 209a ACS Nacional Meeting, Anaheim, Calif., 2-6 de abril de 1995, Parte 10 1, BIOT005; Dohlsten e outro, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 91:8945 (1994).

Enzimas que são útil no método desta invenção incluem, porém não são limitadas a, fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos con- tendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró- fármacos contendo sulfato em fármacos livres; proteases, tal como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo pep- tídeo em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contém substituintes de D-aminoácido; enzimas de cliva- gem de carboidrato tal como β-galactosidase e neuraminidase úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil pa- ra converter fármacos derivados com β-lactams em fármacos livres; e ami- dases de penicilina, tal como amidase de penicilina V ou amidase de penici- lina G, útil para converter fármacos derivados em seus nitrogênios de amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos Ii- vres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, da mesma for- ma conhecidos na técnica como abzimas, podem ser usados para converter os pró-fármacos da invenção em fármacos ativos livres (Veja, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticorpo-abzima po- dem ser preparados como descrito aqui para liberação da abzima a uma po- pulação de célula desejada.

As enzimas desta invenção podem ser covalentemente ligadas aos anticorpos por técnicas bem conhecidas na arte tal como o uso dos rea- gentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção ligado a pelo menos uma porção fun- cionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídas usan- 5 do técnicas de DNA recombinantes conhecidas na técnica (Veja, por exem- plo, Neuberger e outro, Nature 312: 604-608 (1984))

Usos Não terapêuticos

Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação de afinidade para antígeno alvo ou em ensaios diagnósticos para 10 antígeno alvo, por exemplo, detectando sua expressão em células específi- cas, tecidos, ou soro. Os anticorpos podem da mesma forma ser usados pa- ra ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, para estes propósitos o anticor- po é rotulado com um radionuclídeo (tal como 111In, "Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de forma que o local possa estar localizado usando imunocintio- 15 grafia.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação compe- titivos, ensaios sanduíche direto e indireto, tais como ELISAs, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 20 pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Os anticorpos podem da mesma forma ser usados para imunoistoquímica, para rotular amostras de célula usando métodos conhecidos na técnica.

Como uma matéria de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser fornecido em um kit, isto é, uma combinação empacotada 25 de reagentes em quantidades pré-determinadas com instruções para realizar o ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo é rotulado com uma enzima, o kit incluirá substratos e co-fatores requeridos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que fornecer o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizadores, 30 tampões (por exemplo, um tampão de bloco ou tampão de lise) e similares. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas ampla- mente para fornecer concentrações em solução dos reagentes que substan- cialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes que na dissolução fornecerão uma solução de reagente que tem a concentração apropriada.

EXEMPLOS

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos, que não são destinados a se Iimitantes de qualquer maneira.

EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE DOMÍNIO EXTRACELULAR DE EPHB3 (ECD)

Para expressão recombinante do ECD de EphB3, um método de

PCR aninhado foi primeiro empreendido para incorporar etiquetas e criar as extremidades da região de codificação na preparação para incorporação em um vetor de expressão. Iniciadores usados foram como segue (todos são escritos como seqüências de 5' a 3'):

Dianteiro #1:

TCGT AT ACATTT CTT ACAT CTATGCGCT GGAAGAGACCCT CAT GGACAC AAA

(SEQ ID NO: 420)

Dianteiro #2:

GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGA AATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACA TCTATGCG (SEQ ID NO: 421)

Reverso #1:

CGGGTCGTCGAGGTCCTCGTCGAAGGGCCTCGTGTAGTGGTAGTGGTA GTGCCT (SEQ ID NO: 422)

Reverso #2:

CCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCTCGAATTTGGGTCGAAAGAACAT GTTT CACCAGGG (SEQ ID NO: 423)

Amplificação de PCR foi realizada usando Mistura PfuUltra™ Hotstart PCR Master (Stratagene) de acordo com a recomendação do fabri- cante. O padrão usado para a amplificação foi um fragmento de ECD de E- phB3 clonado em pDONOR201. O produto de PCR de ECD foi clonado em pBlueBac4.5GW usando a estratégia de clonagem de topoisomerase. Os 5 clones selecionados finais foram confirmados por sequenciamento de fila- mento duplo. 10-20 μg de DNA que representa cada clone foi preparado pa- ra transfecção de inseto.

As construções recombinantes foram usadas para expressar o ECD de EphB3 em células de inseto como segue. Baculovírus foi isolado por purificação de placa de uma co-transfecção de DNA de plasmídeo que codi- fica o domínio extracelular de EphB3 com DNA Autographa californica ge- nômico Sapphire™. Vírus recombinante foi amplificado e usado para infectar células de inseto Tn5 em densidades que variam de 1 - 1,5 x 10® de células por ml, multiplicidade de infecção (moi) varia de 2-10 em um biorreator de onda de 10L (volume de preparação). Seguindo 48 horas de infecção, as células e o sobrenadante foram coletados w centrifugados, e o sobrenadante foi preparado para concentração. O sobrenadante foi clarificado em um car- tucho de fibre oco de 0,45 μηι depois da concentração de 8x com uma membrana de corte de IOkDa MW de fluxo tangencial. Antes da purificação de proteína, o sobrenadante foi esterilizado por filtro com um frasco à vácuo de poro de 0,2um, de 1L.

ECD de EphB3 foi purificado como segue. O sobrenadante de cultura de célula de inseto que contém ECD de EphB3 foi passado em uma taxa de fluxo de 13ml/min em uma coluna de Quelação de Ni de 25mL (Nú- 25 mero de Catálogo da Resina G.E. 17-5318-03) equilibrada no Tampão A (PBS / 0,35M de NaCI / 5mM de Imidazol). A proteína ligada contendo ECD de EphB3 foi eluída usando um gradiente de 30-coluna-volume de Tampão A para Tampão B (PBS / 0,35M de NaCI / 250mM de Imidazol). As frações foram examinadas por SDS-PAGE, e aquelas contendo ECD de EphB3 na 30 pureza desejada foram agrupados. O pool foi dializado vs. Tampão A e pas- sado sobre as colunas HisTrap (G.E.) de 2x5mL. As colunas HisTrap foram eluídas no mesmo aspecto como a primeira coluna de Quelação de Ni. As frações foram examinadas por SDS-PAGE, e aquelas contendo proteína de ECD de EphB3 na pureza desejada foram agrupadas. O pool final foi diali- zado vs. PBS / 0,1 M de Arginina. O material final foi analisado para identida- de e pureza por sequenciamento de N-terminal bem como SDS-PAGE redu- 5 zido e não reduzido (manchamento de Coomassie e análise do Oeste). EXEMPLO 2

IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE ALVO SEGREGA- DOS POR HIBRIDOMAS DE MURINO

O imunógeno usado para geração de hibridoma foi uma forma recombinante do domínio extracelular (ECD) (correspondente aos aminoáci- dos 37 - 558 de SEQ ID NO: 2) de EphB3 humano, que foi gerado usando o sistema de expressão de célula de inseto / baculovírus. Para as imuniza- ções, o ECD foi misturado com um volume igual de adjuvante, e a mistura foi subcutaneamente injetada na superfície ventral das almofadas das patas do membro traseiro. Os ratos foram injetados com o imunógeno cada 3-14 dias de acordo com vários horários de imunização, para produzir uma res- posta imune forte. Os camundongos que mostram uma resposta imune boa foram em seguida sacrificados, os Iinfonodos foram colhidos, e as células B nos Iinfonodos foram coletadas. As células B foram em seguida fundidas em células de mieloma para produzir hibridomas de acordo com as técnicas bem conhecidas na arte, e os hibridomas foram avaliados e para produzir aqueles anticorpos que reconhecem a proteína de EphB3 em ensaios ELISA e FACS.

EXEMPLO 3

IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE ALVO POR EXIBI- ÇÃO DE FAGO Avaliação de Anticorpos.

Para isolar um painel de anticorpos anti-EphB3, uma biblioteca de exibição de fago Omniclonal (Buechler e outro, Número de Patente 6057098) foi avaliada a qual foi gerada a partir de camundongos hiperimuni- zados com o domínio extracelular (ECD) de EphB3.

Colônias únicas, obtidas da biblioteca Omniclonal de acordo com o protocolo na Patente U.S. N2 6.057.098, foram avaliadas quanto a ativida- de de ligação em um ensaio ELISA. Brevemente, microculturas foram culti- vadas em uma OD6oo=0,6 em que a expressão pontual do fragmento de an- ticorpo solúvel foi induzida por adição de 0,2% em p/v de arabinose seguido por cultura durante a noite em uma incubadora agitadora a 30°C. As bacté- rias foram centrifugadas e o extrato periplásmico foi preparado e usado para detectar a atividade de ligação de anticorpo em EphB3-ECD imobilizado em microplacas Nunc MaxiSorp™ seguindo o protocolo de ELISA padrão forne- cido pelo fabricante de microplaca. A ligação de anticorpo foi da mesma for- ma avaliada medindo-se a ligação em células de expressão de EphB3 de CHO-K1 usando análise de Classificação de Célula Ativada por Fluorescên- cia (FACS).

Conversão de Candidatos de Anticorpo Identificados Por Exibição de Faqo em IqG Completo

Para converter os aglutinantes candidatos de chumbo da avalia- ção inicial em anticorpos que compreendem regiões constantes de cadeia leve e pesada de anticorpo, as seqüências de codificação para as regiões variáveis de ambas as cadeias pesada e leve de aglutinantes foram clona- das em um vetor de expressão de mamífero proprietário (WO 2004/033693) codificando para os genes de região constante de capa (□) e gama-1 (ü1).

Anticorpos foram transitoriamente expressos em células 293E como descrito em Handa e outro (2004 American Society of Cancer Biology Poster #1937). O sobrenadante de células transfectadas foram colhidos no dia 6 de cultura e IgG foi purificado usando Proteína A Sepharose (GE HEaI- thcare) seguindo o protocolo dos fabricantes.

EXEMPLO 4

BINNING DE EPÍTOPO DE ANTICORPO DE EPHB3

Os anticorpos anti-EphB3 foram nomeados em compartimentos de epítopo por uma estratégia de ensaio de competição serial usando tecno- logias de ressonância de plasmônio de superfície (SPR). Neste método, um anticorpo foi imobilizado sobre um chip de sensor, diretamente ou através de um agente de captura, e permitido ligar o Iigante (ECD de EphB3) quando foi injetado sobre o anticorpo imobilizado. Um segundo anticorpo teste foi sub- seqüentemente injetado, e sua capacidade de ligar o Iigante capturado pelo primeiro anticorpo foi determinada. Se os anticorpos ligam-se em epítopos espacialmente separados no ligante, o segundo anticorpo deve da mesma forma poder ligar o complexo de anticorpo do ligante/primeiro anticorpo. A capacidade de dois anticorpos diferentes ligar simultaneamente a mesma molécula de ligante é referida como emparelhamento.

1. As primeiras séries de experiências utilizaram um chip sensor CM5 revestido com uma alta densidade de anticorpo específico de Fc anti- Camundongo de Coelho (RAM-Fc) em todas as células de fluxo.

a. O tampão de funcionamento foi HBS-EP (Biacore®, Inc.), a temperatura foi fixada a 25°C, e a taxa de fluxo foi 10 pL/min.

b. Um anticorpo diferente foi capturado em cada célula de fluxo injetando uma diluição de 1-10 Mg/mL durante 1-3 minutos resultando em um nível de captura de 200-1000 RU.

c. A superfície foi em seguida bloqueada injetando 100pg/mL de IgG de camundongo em HBS-EP durante 30 minutos.

d. O anticorpo a ser testado por emparelhar foi injetado em 1 pg/mL para verificar que o chip foi bloqueado eficazmente e determinar o nível de ligação da base do anticorpo.

e. O ligante foi injetado em 2-10 pg/mL durante 2-4 minutos.

f. O anticorpo a ser emparelhado foi novamente injetado como na etapa 1d acima. Se o anticorpo ligou-se durante esta injeção, os dois an- ticorpos formam um par, e portanto são colocados em compartimentos de epítopo separados. Se o segundo anticorpo não ligou, ele compete com o primeiro anticorpo para ligação, e eles são colocados no mesmo, ou em compartimentos de epítopo sobrepostos.

g. Como um controle para auto-emparelhar, cada um dos anti- corpos capturados foi testado para emparelhar com si mesmo.

2. Logo que vários compartimentos de epítopo, ou conjuntos pu- nicos de anticorpos não emparelhados, foram elucidados, esses anticorpos foram usados para também investigar mais os anticorpos. Quatro anticorpos de cada vez foram usados para interrogar os anticorpos de uma maneira consecutiva. Capturando-se um anticorpo de hibridoma de um compartimen- to de epítopo diferente em cada dentre as quatro células de fluxo, seguido realizando-se o protocolo de emparelhamento acima descrito através de to- dos os todos de uma vez, um conjunto de amostra maior foi interrogado.

3. Este processo foi usado para avaliar o fragmento Fab de anti- corpo humano também, com a modificação que a etapa de bloqueio usando 100 pg/mL de IgG de camundongo não foi usada, visto que a superfície de RAM-Fc não captura os Fabs humanos.

EXEMPLO 5

SELEÇÃO DE ANTICORPOS DE EPHB3 DE ANTAGONISTA USANDO ENSAIOS COM BASE EM CITOMETRIA E DETECÇÃO DE DEGRADAÇÃO E FOSFORILAÇÃO DE EPHB3

Para identificar os anticorpos antagonistas alvejados em EphB3, um ensaio com base em citometria de fluxo (FACS) foi desenvolvido para monitorar efeitos a jusantes de ativação de receptor (por exemplo, um en- saio de fosfo-tirosina (pY) celular total, como uma medida da ativação de séries de reação de sinalização).

Fosforilação de tirosina celular total O ensaio de pY celular total empregou uma linhagem celular de

CHO estavelmente transfectada, adaptada à suspensão expressando níveis altos do receptor. Este ensaio foi usado para avaliar os sobrenadantes de hibridoma, anticorpos derivados de hibridoma purificados, e anticorpos deri- vados de exibição de fago reformatados de IgG completo purificados.

Células CHO-K1 adaptadas à suspensão super-expressnado

EphB3 foram semeadas em uma placa de 96 cavidades de base redonda em 2 x 105 células/cavidade. Anticorpo contra EphB3 foi em seguida diluído 1:10 diretamente em cada cavidade de amostra. As amostras foram incuba- das durante 40 - 45 minutos a 37°C. Depois da incubação, as células foram 30 fixadas com formaldeído a 2% durante 20 minutos em temperatura ambien- te. As células foram em seguida lavadas 2X com tampão de permeabilização e ressuspensas em tampão de permeabilização que contém anticorpo anti- fosfotirosina de camundongo conjugado de PE (PY20). As células foram in- cubadas durante 1 hora a 4°C, lavadas 2X com tampão de permeabilização, e analisadas por citometria de fluxo.

Aproximadamente 24% dos anticorpos testados mostraram ativi- 5 dade agonística no ensaio de pY. Três anticorpos (XPA.04.017, XHA.05.172, e XHA.05.849) causaram uma redução no manchamento de fosfotirosina de FACS na ordem de 1,5 vez e dois destes anticorpos (XPA.04.017 e XHA.05.172) mapeados em um compatimento de epítopo separado relativo aos anticorpos de agonista, indicando que estes dois anticorpos identificam 10 um único epítopo associado com efeitos antagonísticos de EphB3. Dois anti- corpos (XPA.04.019 E XPA.04.031) que mostrou atividade de agonista mí- nima impediu a ligação de EphrinB2 (descrito também abaixo).

EXEMPLO 6

ENSAIO DE COMPETIÇÃO DE LIGAÇÃO DE EPHRINB2 E ENSAIO DE COMPETICÃO DE EPÍTOPO

A. Preparação de Chip de Sensor Flexchip

A plataforma de ensaio de Flexchip (Biacore, Uppsala Sweden) foi usada para rapidamente testar os três anticorpos antagonísticos anti- EphB3 identificados para competição de ligação com representantes de ou- 20 tros sete compartimentos de epítopo identificados e da mesma forma deter- minar se ou não os antagonistas, bem como anticorpos de agonista dos ou- tros sete compartimentos competem com o ligante de EphrinB2 para ligação ao EphB3-ECD.

Os anticorpos purificados foram manchados em duplicata sem 25 diluição sobre uma lâmina Flexchip dourada simples, usando uma ponta de pipeta de 25 μί. EphB3-ECD recombinante e Proteína A/G foram mancha- das em triplicata. As concentrações de proteína são resumidas na Tabela 4. Depois do manchamento, o chip foi colocado em uma câmara de umidade a 85% durante 1,5 hora, em seguida colocado durante a noite a 4°C. Tabela 4. Reagentes manchados sobre a superfície do chip de sensor Flex- chip.

Amostra Concentração (mg/mL) EphB3-ECD 1,8 Quimera de Ephrin-B2/Fc de Ca¬ 0,5 mundongo Recombinante XHA.05.849 1,1 XHA.05.172 4,4 XPA.04.017-lgG 0,5 XPA.04.031-lgG 1,4 XPA.04.019-lgG 2,1 Proteína A/G 0,5 Depois que o chip foi manchado, o Flexchip foi equilibrado com tampão de funcionamento PBST (Solução salina tamponada de fosfato com Tween 20 a 0,05%). O chip foi acoplado e o bloqueio foi realizado usando solução de bloqueio 1X Flexchip (Biacore).

B. Ensaio de competição de EphrinB2

EphrinB2 em 2 pg/mL em tampão de funcionamento foi injetado durante 5 minutos em 500 uL/minuto para verificar que não houve nenhuma ligação não específica aos anticorpos imobilizados e da mesma forma para verificar que é ligado ao EphB3-ECD manchado. Isto foi seguido por uma injeção de cinco minutos de EphB3-ECD em 2pg/mL em tampão de funcio- namento, seguido imediatamente por outra injeção de cinco minutos de Ep- hrinB2. XHA.05.849 não ligou quantidades suficientes de ECD a ser avalia- das eficazmente neste teste. Todos os outros anticorpos ligaram níveis signi- ficantes de EphB3-ECD e todos menos XPA.04.031 e XPA.04.019 permiti- ram ligação de EphrinB2 ao ECD capturado pelos anticorpos (veja Tabela 5, abaixo). Nenhuma ligação de EphrinB2 ao EphB3-ECD recombinante captu- rado por XPA.04.031 e XPA.04.019 foi detectada. Tabela 5. Ligação de EphrinB2 e EphB3-ECD aos anticorpos manchados

Ligação de EphrinB2 ao ECD de EphB3 Capturado Valores calculados em média Anticorpo ECD Capturado EphrinB2 Capturado XPA.04.017 225,32 214,75 XHA.05.172 508,36 511,88 XHA.05.849 -2,11 -5,74 XPA.04.031 461,77 7,68 XPA.04.019 129,94 -0,47 C. Ensaios de Competição de Epítopo

Todas as injeções foram 5 minutos em 500 pL/min a menos que de outra maneira notado, e todas as amostras foram diluídas com tampão de 5 funcionamento PBST. EphB3-ECD foi injetado em 1 pg/mL, imediatamente seguido por injeção de um anticorpo teste em 2 pg/mL. Subseqüente a cada teste de competição de anticorpo, o chip foi regenerado por uma injeção de 30 ° segundos de 10 mM de glicina, pH 2,5, seguido por um fluxo de tampão de cinco minutos, e em seguida uma etapa de fluxo de tampão bloqueio de 10 dez minutos, seguida por outro fluxo de tampão de cinco minutos. Os dados de competição de epítopo foram analisados usando o aspecto de ponto de relato do software de avaliação Flexchip onde uma região designada Come- ço, Meio, e Fim é selecionada e a resposta média sobre a área selecionada é posta em uma tabela.

Anticorpos XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.017, e um anticor-

po de agonista foram usados como as amostras injetadas testadas contra todos os anticorpos manchados. Os dados de cada um dos ciclos de ensaio de competição de epítopo são mostrados abaixo nas Tabelas 6-8.

Tabela 6. Testando XHA.05.172 para competição de ligação de EphB3-ECD com anticorpos manchados em Ensaio de Flexchip.

Emparelhamento de Flexchip de EphB3 versus XHA.05.172 Valores calculados em média Anticorpo ECD Capturado XHA.05.172 Capturado XPA.04.017 96,00 -4,10 XHA.05.172 143,78 -39,09 Emparelhamento de Flexchip de EphB3 versus XHA.05.172 Valores calculados em média Anticorpo ECD Capturado XHA.05.172 Capturado XHA.05.849 5,77 -12,31 XPA.04.031 161,67 456,86 XPA.04.019 48,27 112,56 Tabela 7. Testando XPA.04.017 para competição de ligação de EphB3-ECD

Tabela 8. Testando XHA.05.849 para competição de ligação de EphB3-ECD

Os anticorpos antagonísticos bem como representantes de cada compatimento de agonista foram testados para determinar se sua ligação ao domínio extracelular de EphB3 (ECD) previne a ligação do ligante de Ep- hrinB2 ao ECD. Como mostrado acima, dois dos anticorpos antagonísticos 10 de EphB3, XPA.04.017 e XHA.05.172, prepararam um compartimento único que foi diferente a partir de qualquer dos compartimentos de agonista. Este compartimento foi definido pela capacidade de dois anticorpos competirem

com anticorpos manchados em Ensaio de Flexchip.

Emparelhamento de Flexchip de EphB3 versus XHA.05.849 Valores calculados em média Anticorpo ECD Capturado XHA.05.849 Capturado XPA.04.017 174,85 -3,79 XHA.05.172 352,48 -33,51 XHA.05.849 11,80 -9,29 XPA.04.031 343,22 -17,20 XPA.04.019 81,29 -8,81 D. Conclusão

com anticorpos manchados em Ensaio de Flexchip.

Emparelhamento de Flexchip de EphB3 versus XHA.04.017 Valores calculados em média Anticorpo ECD Capturado XHA.04.017 Capturado XPA.04.017 168.61 -0.99 XHA.05.172 307.26 -42.69 XHA.05.849 1.76 -5.78 XPA.04.031 316.07 397.40 XPA.04.019 57.51 99.72 entre si e nenhum dos outros anticorpos dos outros sete compartimentos. Os dois anticorpos, XPA.04.017 e XHA.05.172, da mesma forma não impediram o ECD capturado de ligar-se ao ligante de EphrinB2. Estes dados confirmam que os anticorpos identificados e descritos aqui têm atividade antagonística, 5 ligam-se a um epítopo distinto daqueles dos anticorpos de agonista e têm um mecanismo de ação diferente de competição direta de ligante de Ep- hrinB2. Dois anticorpos, XPA.04.019 e XPA.04.031, tiveram atividade de a- gonista mínima porém impediram a ligação de EphrinB2 ao ECD capturado (isto é, competidores de ligante) e desse modo podem ser caracterizados 10 como antagonistas. Nenhum dos anticorpos agonísticos demonstrou tal competição de ligação de ligante.

EXEMPLO 7

HUMANIZACÃO DE ANTICORPOS DE MURINO

Este exemplo apresenta um procedimento para humanização de um anticorpo anti-EphB3 de murino.

Planejamento de genes para cadeias pesada e leve de XPA.04.017. XPA.04.031 e XPA.04.019 humanizadas

As seqüências de aminoácido de região variável de cadeia leve e cadeia pesada para anticorpos de murino XPA.04.017, XPA.04.031 e 20 XPA.04.019 são mencionadas na Figura 1. A seqüência de um anticorpo humano identificado usando a National Biomedical Foundation Protein Identi- fication Resource ou base de dados similar é usada para fornecer a estrutura do anticorpo humanizado. Para selecionar a seqüência da cadeia pesada humanizada, a seqüência de cadeia pesada de murino é alinhada com a se- 25 qüência da cadeia pesada de anticorpo humano. Em cada posição, o amino- ácido de anticorpo humano é selecionado para a seqüência humanizada, a menos que a posição inclua-se em qualquer uma das quatro categorias defi- nidas abaixo, caso em que o aminoácido de murino é selecionado:

(1) A posição inclui-se em uma região de determinação de com- plementaridade (CDR), como definido por Kabat, J. Immunol., 125, 961-969

(1980);

(2) O aminoácido de anticorpo humano é raro para cadeias pe- sadas humanas nesta posição, considerando que o aminoácido de murino é comum para cadeias pesadas humanas nesta posição;

(3) A posição é imediatamente adjacente a uma CDR na se- qüência de aminoácido de cadeia pesada de murino; ou

(4) Modelagem tri-dimensional do anticorpo de murino sugere que o aminoácido esteja fisicamente próximo à região de ligação de antíge- no.

Para selecionar a seqüência da cadeia leve humanizada, a se- qüência de cadeia leve de murino está alinhada com a seqüência da cadeia leve de anticorpo humano. O aminoácido de anticorpo humano é seleciona- do em cada posição para a seqüência humanizada, a menos que a posição novamente inclua-se em uma das categorias descritas acima e repetidas abaixo:

(1) CDR's;

(2) aminoácido de murino mais típico do que o anticorpo huma- no;

(3) adjacente a CDR's; ou

(4) Proximidade tri-dimensional possível para região de ligação.

A seqüência de nucleotídeo atual dos genes de cadeia pesada e

leve é selecionada como segue:

(1) O código de seqüências de nucleotídeo para as seqüências de aminoácido escolhidas como descrito acima;

(2) 5' destas seqüências de codificação, o código de seqüências de nucleotídeo para uma seqüência líder (sinal). Estas seqüências líder fo- ram escolhidas como típicas de anticorpos;

(3) 3' das seqüências de codificação, as seqüências de nucleotí- deo são as seqüências que seguem o segmento J5 de cadeia leve de ca- mundongo e o segmento J2 de cadeia pesada de camundongo, que são par- te da seqüência de murino. Estas seqüências estão incluídas porque elas contêm sinais doador de união; e

(4) em cada extremidade da seqüência é um sítio de Xba I para permitir cortar nos sítios Xba I e clonar de no sítio Xba I de um vetor. Construção de genes de cadeia leve e pesada humanizados

Para sintetizar a cadeia pesada, quatro oligonucleotídeos são sintetizados usando um sintetizador de DNA Applied Biosystems 380B. Dois dos oligonucleotídeos fazem parte de cada filamento da cadeia pesada, e 5 cada oligonucleotídeo sobrepõe o próximo por cerca de 20 nucleotídeos pa- ra permitir o recozimento. Juntamente, os oligonucleotídeos revestem a regi- ão variável de cadeia pesada humanizada total com alguns nucleotídeos extras em cada extremidade para permitir o corte nos sítios Xba I. Os oligo- nucleotídeos são purificados a partir de géis de poliacrilamida.

Cada oligonucleotídeo é fosforilado usando ATP e T4 polinucleo-

tídeo cinase por procedimentos padrões (Maniatis e outros, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S- pring Harbor, N.Y. (1989)). Para recozer os oligonucleotídeos fosforilados, eles são suspensos juntamente em 40 ul de TA (33 mM de Tris acetato, pH 15 7,9, 66 mM de acetato de potássio, 10 mM de acetato de magnésio) em uma concentração de cerca de 3,75 μΜ cada, aquecido a 95°C durante 4 minutos e resfriados lentamente a 4°C. Para sintetizar o gene completo a partir dos oligonucleotídeos sintetizando-se o filamento oposto de cada oligonucleotí- deo, os seguintes componentes são adicionados em um volume final de 100

20 ul:

φ 10 ul oligonucleotídeos recozidos

0,16 mM cada desoxirribonucleotídeo

0,5 mM ATP

0,5 mM DTT

25 100ug/ml BSA

3,5 ug/ml proteína T4 g43 (DNA polimerase)

25 ug/ml proteína T4 g44/62 (proteína auxiliar de polimerase)

25 ug/ml proteína 45 (proteína auxiliar de polimerase)

A mistura é incubada a 37°C durante 30 minutos. Em seguida, 30 10 u de T4 DNA Iigase são adicionados e a incubação a 37°C é recomeçada durante 30 minutos. A polimerase e Iigase são inativadas por incubação da reação a 70°C durante 15 minutos. Para digerir o gene com Xba I, 50 ul de 2 X TA contendo BSA a 200 ug/ml e DTT a 1 mM, 43 ul de água, e 50 u de Xba I em 5 ul são adicionados à reação. A reação é incubada durante 3 ho- ras a 37°C, e em seguida purificada em um gel. O fragmento Xba I é purifi- cado a partir de um gel e clonado no sítio Xba I do plasmídeo pUC19 por 5 métodos padrões. Plasmídeos são purificados usando técnicas padrões e seqüenciados usando o método de didesóxi.

Construção de plasmídeos para expressar cadeias leve e pesa- da humanizadas é realizada isolando-se os fragmentos de Xba I de cadeia leve e pesada a partir do plasmídeo pUC19 em que foi inserido e em segui- 10 da inserindo no sítio Xba I de um vetor de expressão apropriado que expres- sará níveis altos de uma cadeia pesada completa quando transfectada em uma célula hospedeira apropriada.

Síntese e afinidade de anticorpo humanizado

Os vetores de expressão são transfectados em células Sp2/0 de 15 camundongo, e células que integram os plasmídeos são selecionadas na base do(s) marcador(es) selecionável(eis) conferidos pelos vetores de ex- pressão por métodos padrões. Para verificar que este anticorpo segregado de células que liga-se a EfB3, sobrenadantes das células são incubados com células que são conhecidas por expressar EfB3. Depois de lavar, as 20 células são incubadas com anticorpo anti-humano de cabra conjugado de fluoresceína, lavadas, e analisadas quanto à fluorescência em um citofluo- rômetro de FACSCAN.

Para as próximas experiências, as células que produzem o anti- corpo humanizado são injetadas em camundongos, e o ascite resultante é 25 coletado. Anticorpo humanizado é purificado à omogeneidade substancial a partir do ascite por passagem através de uma coluna de afinidade de anti- corpo de imunoglobulina anti-humano de cabra, preparado em um suporte de Affigel-10 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.) de acordo com técnicas padrões. A afinidade do anticorpo humanizado relativo ao anticorpo 30 de murino original é determinada de acordo com técnicas conhecidas na técnica.

EXEMPLO 8 ENGENHARIA HUMANA DE ANTICORPOS DE MURINO Este exemplo descreve a clonagem e expressão de anticorpos Engineered™ Humanos, bem como purificação de tais anticorpos e teste quanto à atividade de ligação.

Projeto de seqüências Human Engineered™

Human Engineering™ de domínios variáveis de anticorpo foi descrito por Studnicka [Veja, por exemplo, Studnicka e outro Patente US No. 5.766.886; Studnicka e outro Protein Engineering 7: 805-814 (1994)] como um método para reduzir a humunogenicidade enquanto mantendo a ativida- de de ligação de moléculas de anticorpo. De acordo com o método, cada aminoácido de região variável determinou um risco de substituição. Substitu- ições de aminoácido são distintas por uma de três categorias de risco: (1) mudanças de risco baixo são aquelas que têm o maior potencial de reduzir a imunogenicidade com a menor chance de romper a ligação de antígeno; (2) mudanças de risco moderado são aquelas que também reduziriam a imuno- genicidade, porém tem uma maior chance de afetar a ligação de antígeno ou duplicação de proteína; (3) resíduos de risco alto são aqueles que são im- portantes para ligar ou manter a estrutura de anticorpo e leva ao risco mais alto em que a ligação de antígeno ou duplicação de proteína será afetada. Devido ao papel estrutural tri-dimensional de prolinas, modificações em pro- Iinas são geralmente consideradas ser pelo menos mudanças de risco mo- derado, ainda se a posição for tipicamente uma posição de baixo risco. Mu- danças subtitucionais são realizadas, porém, inserções e deleções são da mesma forma possíveis. A Figura 7 mostra a determinação de risco para cada resíduo de aminoácido de cadeias leve e pesada XPA.04.017.XPA.04.031 e XPA.04.019, categorizadas como uma mudança de risco alto, moderado ou baixo.

Regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo de murino são Human Engineered™ usando este método. Resíduos de amino- ácido que são os candidatos para modificação de acordo com o método em posições de baixo risco são identificados alinhando-se as seqüências de a- minoácido das regiões variáveis de murino com uma seqüência de região variável humana. Qualquer região variável humana pode ser utilizada, inclu- indo uma seqüência de VL ou VH individual ou uma seqüência de VL ou VH de consenso humano. Os resíduos de aminoácido em qualquer número das posições de risco baixo, ou em todas as posições de risco de baixo, podem ser mudados.

Similarmente, resíduos de aminoácido que são os candidatos para modificação de acordo com o método em todas as posições de risco moderado e baixo são identificados alinhando-se as seqüências de aminoá- cido das regiões variáveis de murino com uma seqüência de região variável 10 humana. Os resíduos de aminoácido em qualquer número das posições de risco baixo ou moderado, ou em todas as posições de risco baixo e modera- do, podem ser mudados.

Preparação de Vetores de Expressão para Desenvolvimento de Linhagem Celular Permanente

Fragmentos de DNA codificando uma das seqüências de região

V de cadeia pesada e leve descrita acima juntamente com seqüências de sinal derivadas de anticorpo são construídos usando síntese de nucleotídeo sintética. DNA codificando cada uma das seqüências de aminoácido de regi- ão V de cadeia leve descrita acima é inserido em vetor pMXPIO contendo a 20 região constante de cadeia leve de Capa humana. DNA codificando cada uma das seqüências de aminoácido de região V de cadeia pesada descritas acima é inserido em vetor pMXP6 contendo a região constante de cadeia pesada Gama-1, 2, 3 ou 4 humana. Todos estes vetores contêm um promo- tor de hCMV e uma região não trasladada 3' de cadeia leve de capa bem 25 como genes marcadores selecionáveis tal como neo ou his para seleção de transfectantes resistentes a G418 - ou histidinol, respectivamente.

Preparação de Vetores de Expressão para Expressão Transitória

Vetores contendo genes de cadeia leve ou pesada descritos a- cima da mesma forma são construídos para transfecção transitória. Estes vetores são similares àqueles descritos acima para transfecções permanen- tes exceto no lugar de genes neo ou his, eles contêm o vírus Epstein-Barr oriP para replicação em células HEK293 que expressam o antígeno nuclear de vírus Epstein-Barr.

Expressão Transitória de Anticorpo anti-EfB3 Criado Humano em Células HEK293E

Vetores separados cada qual contendo oriP a partir do Vírus 5 Epstein-Barr e genes de cadeia leve ou cadeia pesada descritos acima são transfectados transitoriamente em células HEK293E. Células transitoriamen- te transfectadas são permitidas incubar durante até 10 dias depois que o sobrenadante é recuperado e anticorpo purificado usando cromatografia de Proteína A.

Desenvolvimento de Células CHO-K1 Permanentemente Transfectadas

Os vetores descritos acima contendo uma cópia cada dos genes leve e pesado são transfectados em células CHO-K1 adaptadas por Ex-Cell 302. Células CHO-K1 adaptadas ao crescimento de suspensão em meio de Ex-Cell 302 são tipicamente eletroporadas com 40 ug de vetor de Iineariza- 15 do. Alternativamente, DNA Iinearizado pode ser complexado com polietileno- imina linear (PEI) e utilizado para transfecção. As células são semeadas em placas de 96 cavidades contendo meio de Ex-cell 302 suplementado com 1% de FBS e G418. Clones são avaliados em placas de 96 cavidades e o topo ~10% de clones de cada transfecção são transferidos em placas de 24 20 cavidades contendo meio de Ex-cell 302.

Um teste de produtividade é realizado em placas de 24 cavida- des em meio de Ex-cell 302 para crescimento de culturas durante 7 e 14 di- as, tempo no qual os sobrenadantes de cultura são testados quanto aos ní- veis de anticorpo segregado por um ensaio de ELISA de imunoglobulina pa- ra IgG.

Os clones do topo são transferidos para agitar frascos contendo meio de Ex-cell 302. Assim que as células são adaptadas em crescimento de suspensão, um teste em frasco de agitação é realizado com estes clones em meio de Ex-cell 302. As células são crescidas durante até 10 dias em 30 125 ml de frascos de Erlenmeyer contendo 25 ml de meios. Os frascos são abertos pelo menos a cada dois dias do período de incubação para permitir a troca de gás e os níveis de polipeptídeo de imunoglobulina no meio de cul- tura são determinados por IgG ELISA ao término do período de incubação. Transfecções seqüenciais múltiplas da mesma linhagem celular com dois ou três vetores de transcrição de multi-unidade resulta em clones e linhagens celulares que exibem outros aumentos em níveis de produção de imunoglo- bulina, preferivelmente para 300 pg/ml ou mais.

Purificação

Um processo para a purificação de polipeptídeos de imunoglobu- lina a partir de vetores e todas as linhagens de acordo com a invenção pode ser designado. Por exemplo, de acordo com métodos bem conhecidos na 10 técnica, células são removidas por filtração depois do término. O filtrado é carregado em uma coluna de Proteína A (em passagens múltiplas, se ne- cessário). A coluna é lavada e em seguida os polipeptídeos de imunoglobuli- na expressos e segregados são eluídos a partir da coluna. Para preparação de produto de anticorpo, o pool de Proteína A é mantido em um pH baixo 15 (pH 3 durante um mínimo de 30 minutos e um máximo de uma hora) como uma etapa de inativação viral. Uma etapa de troca catiônica absorvente é logo utilizada para também purificar o produto. O eluído da coluna de sepa- ração absorvente é passado através de um vírus que retém o filtro para for- necer outra liberação de partículas virais potenciais. O filtrado é também pu- 20 rificado passando-se através de uma coluna de troca de ânion em que o produto não liga. Finalmente, o processo de purificação é concluído transfe- rindo-se o produto no tampão de formulação através de diafiltração. O reten- tado é ajustado em uma concentração de proteína de pelo menos 1 mg/mL e um estabilizador é adicionado.

Atividade de ligação

A atividade de ligação de EphB3 dos anticorpos Human Engine- ered™ recombinantes. Proteína é purificada a partir de sobrenadantes de cultura de frasco de agitação por passagem durante uma coluna de proteína. A coluna seguida por determinação de concentração por A28o- Ensaios de ligação são realizados como descrito em outros exemplos.

EXEMPLO 9 SEQÜÊNCIAS SEQ ID N0:1 (seqüência nt de EphB3)

cgtgagcggcgcagcaagatcccagctcggaccccggacggcgcgcgcccccgaagccccggatcc cagtcgggcccgcagctgaccgccagattactgtgcatcccgaatcacgaccacctgcaccctcctgccc cggcccgccccccaagtcctcaggcacccagctccccggcgccccggatcctcctggaccggtccgtcc 5 agattcccgcgggaccgacctgtccgcatccccaggaccgccgggctcggtgcaccgcctcggtcccgg agccgcccgcctggattgcattccctcctctcctggatctcctgggacccgacgcgagcctgccccggagc ccgccgagcgcaccctctctcgggtgcctgcagccccgccggcgcggcccggcccggcgcggcccgg ctcggctcctagagctgccacggccatggccagagcccgcccgccgccgccgccgtcgccgccgccgg ggcttctgccgctgctccctccgctgctgctgctgccgctgctgctgctgcccgccggctgccgggcgctgg 10 aagagaccctcatggacacaaaatgggtaacatctgagttggcgtggacatctcatccagaaagtgggtg ggaagaggtgagtggctacgatgaggccatgaatcccatccgcacataccaggtgtgtaatgtgcgcga gtcaagccagaacaactggcttcgcacggggttcatctggcggcgggatgtgcagcgggtctacgtgga gctcaagttcactgtgcgtgactgcaacagcatccccaacatccccggctcctgcaaggagaccttcaac ctcttctactacgaggctgacagcgatgtggcctcagcctcctcccccttctggatggagaacccctacgtg 15 aaagtggacaccattgcacccgatgagagcttctcgcggctggatgccggccgtgtcaacaccaaggtg cgcagctttgggccactttccaaggctggcttctacctggccttccaggaccagggcgcctgcatgtcgctc atctccgtgcgcgccttctacaagaagtgtgcatccaccaccgcaggcttcgcactcttccccgagaccctc actggggcggagcccacctcgctggtcattgctcctggcacctgcatccctaacgccgtggaggtgtcggt gccactcaagctctactgcaacggcgatggggagtggatggtgcctgtgggtgcctgcacctgtgccacc 20 ggccatgagccagctgccaaggagtcccagtgccgcccctgtccccctgggagctacaaggcgaagca gggagaggggccctgcctcccatgtccccccaacagccgtaccacctccccagccgccagcatctgca cctgccacaataacttctaccgtgcagactcggactctgcggacagtgcctgtaccaccgtgccatctcca ccccgaggtgtgatctccaatgtgaatgaaacctcactgatcctcgagtggagtgagccccgggacctgg gtggccgggatgacctcctgtacaatgtcatctgcaagaagtgccatggggctggaggggcctcagcctg 25 ctcacgctgtgatgacaacgtggagtttgtgcctcggcagctgggcctgacggagcgccgggtccacatc agccatctgctggcccacacgcgctacacctttgaggtgcaggcggtcaacggtgtctcgggcaagagc cctctgccgcctcgttatgcggccgtgaatatcaccacaaaccaggctgccccgtctgaagtgcccacact acgcctgcacagcagctcaggcagcagcctcaccctatcctgggcacccccagagcggcccaacgga gtcatcctggactacgagatgaagtactttgagaagagcgagggcatcgcctccacagtgaccagccag 30 atgaactccgtgcagctggacgggcttcggcctgacgcccgctatgtggtccaggtccgtgcccgcacagt agctggctatgggcagtacagccgccctgccgagtttgagaccacaagtgagagaggctctggggccca gcagctccaggagcagcttcccctcatcgtgggctccgctacagctgggcttgtcttcgtggtggctgtcgtg gtcatcgctatcgtctgcctcaggaagcagcgacacggctctgattcggagtacacggagaagctgcagc agtacattgctcctggaatgaaggtttatattgacccttttacctacgaggaccctaatgaggctgttcgggag

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SEQ ID NO:2 (seqüência de proteína de EphB3)

MARARPPPPPSPPPGLLPLLPPLLLLPLLLLPAGCRALEETLMDTKVWTSEL AWTSHPESGWEEVSGYDEAMNPIRTYQVCNVRESSQNNWLRTGFIWRRD VQRVYVELKFTVRDCNSIPNIPGSCKETFNLFYYEADSDVASASSPFWMEN

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PPNSRTTSPAASICTCHNNFYRADSDSADSACTTVPSPPRGVISNVN ETSLI

LEWSEPRDLGGRDDLLYNVICKKCHGAGGASACSRCDDNVEFVPRQLGLT

ERRVHISHLLAHTRYTFEVQAVNGVSGKSPLPPRYAAVNITTNQAAPSEVPT

LRLHSSSGSSLTLSWAPPERPNGVILDYEMKYFEKSEGIASTVTSQMNSVQ

LDGLRPDARYWQVRARTVAGYGQYSRPAEFETTSERGSGAQQLQEQLPL

IVGSATAGLVFWAVWIAIVCLRKQRHGSDSEYTEKLQQYIAPGMKVYIDPF

TYEDPNEAVREFAKEIDVSCVKIEEVIGAGEFGEVCRGRLKQPGRREVFVAI

KTLKVGYTERQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIRLEGWTKSRPVMILTEFMEN

CALDSFLRLNDGQFTVIQLVGMLRGIAAGMKYLSEMNYVHRDLAARNILVN

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TVPDYTTFTTVGDWLDAIKMGRYKESFVSAGFASFDLVAQMTAEDLLRIGV

TLAGHQKKILSSIQDMRLQMNQTLPVQV

Todas as patentes U.S. acima, publicações de pedido de patente U.S., pedidos de patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeira e publicações de não patente referidas nesta especificação e/ou listadas na Folha de Dados de Pedido, estão incorporados aqui por referên- cia, em sua totalidade.

A partir das anteriores será evidenciado que, embora as modali- dades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para propósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem divergir-se do espíri- to e escopo da invenção.

Claims

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo de an- tagonista que liga o domínio extracelular de EphB3 com uma afinidade (Kd) de 10'6 M ou menor e compete com quaisquer dos anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019 para ligar-se em E- phB3 por mais de 75%.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que liga-se ao mesmo epítopo de EphB3 como quaisquer dos anti- corpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019.

3. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo de an- tagonista que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de quaisquer dos anticor- pos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo construído humano, um anticorpo hu- mano, um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento de anticorpo.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido dentro de uma CDR é substituído por um resíduo correspondente de uma CDR correspon- dente de outro anticorpo anti-EphB3.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um ou dois aminoácidos dentro de uma CDR foram modificados.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, caracterizado pelo fato de que mantém pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade sobre a região pe- sada ou leve variável para os anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019.

8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de uma seqüência de anticorpo humana e uma ou mais regiões de estrutura variável de cadeia pesada e leve de uma seqüência de anticorpo humana.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a seqüência de anticorpo humana é uma seqüência humana in- dividual, uma seqüência de consenso humana, uma seqüência de linha ger- minativa humana individual, ou uma seqüência de linha germinativa de con- senso humana.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é um IgG, IgM, IgA, IgD, IgE modificado ou não modificado, um fragmento dos mesmos, ou combinações dos mesmos.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que têm uma afinidade de ligação de 10'7, 10'8 ou 10"9 M ou menor para EphB3.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma substituição conser- vadora nas CDRs.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende uma mudança conservado- ra ou não conservadora nos resíduos de risco baixo e moderado.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia leve é uma região constante de cadeia leve de Iambda modificada ou não modificada, uma região constante de cadeia leve de capa, um fragmento dos mesmos, ou combinações dos mesmos.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que inibe a fosforilação de EphB3.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que inibe a dimerização de EphB3.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que inibe ativação de receptor induzida por Iigante de EphB3.

18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que inibe a sinalização de EphB3.

19. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de ephrinB2 a EphB3.

20. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de ephrinBI a EphB3.

21. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de ephrinB3 a EphB3.

22. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que inibe a proliferação de uma célula intes- tinal.

23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que inibe a proliferação de uma célula vas- cular.

24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que promove a proliferação de uma célula neuronal.

25. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é conjugado a outro agente diagnóstico ou terapêutico.

26. Método de avaliar um anticorpo de antagonista ao domínio extracelular de uma proteína de EphB3 útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionada a EphB3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: contatar um polipeptídeo que compreende o ECD de EphB3 com um anticorpo candidato que contém pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de anticorpos XPA.04.017, XPA.04.031, ou XPA.04.019; detectar a afinidade de ligação do anticorpo candidato ao poli- peptídeo, e identificar o referido anticorpo candidato como um anticorpo útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionado a EphB3 se uma afinidade de ligação de pelo menos 10‘6 M for detectada.

27. Método de alterar anticorpos de antagonista sistematicamen- te e avaliar um anticorpo de antagonista ao domínio extracelular de uma pro- teína de EphB3 útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionado a EphB3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: preparar um anticorpo candidato que contém modificações em um ou dois aminoácidos dentro das CDRs de anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019, contatar um polipeptídeo que compreende o ECD de EphB3 com o referido anticorpo candidato detectar a afinidade de ligação do anticorpo candidato ao poli- peptídeo, e identificar o referido anticorpo candidato como um anticorpo útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionado a EphB3 se uma afinidade de ligação de pelo menos 10'6 M for detectada.

28. Método de avaliar um anticorpo de antagonista ao domínio extracelular de uma proteína de EphB3 útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionado a EphB3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de. contatar uma célula com um anticorpo candidato que contém pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de anticorpos XPA.04.017, XHA.05.172, XHA.05.849, XPA.04.031, ou XPA.04.019 ou um anticorpo que contêm uma modificação de um ou dois aminoácidos dentro de uma ou mais CDRs; detectar a proliferação ou sobrevivência da referida célula; e identificar o referido anticorpo candidato como um anticorpo útil para o tratamento de um distúrbio ou doença relacionado a EphB3 se uma diminuição ou aumento na proliferação de célula ou sobrevivência for detec- tada.

29. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracteri- zado pelo fato de ser para preparação de uma composição farmacêutica uti- lizável no tratamento de um indivíduo sofrendo de uma doença coelíaca.

30. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracteri- zado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica utili- zável no tratamento de indivíduo sofrendo de uma doença angiogênica.

31. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracteri- zado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica utili- zável no tratamento de um indivíduo sofrendo de uma lesão neuronal.

32. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracteri- zado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica utili- zável no tratamento de indivíduo sofrendo de uma doença neurodegenerati- va.

33. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, conjugado a outro agente terapêutico, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição farmacêutica utilizável para alvejar uma célula que ex- pressa EphB3.

34. Uso de acordo com as reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

35. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

36. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo, como definido em qualquer uma reivindicações 1 a 23.

37. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compre- ende a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 34, ope- ravelmente ligada a uma seqüência de controle reguladora.

38. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende o vetor, como definido na reivindicação 35, ou uma molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 48.

39. Método de usar a célula hospedeira, como definida na rei- vindicação 36, para produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 36, sob condições adequadas e recuperar o referido anticorpo.

40. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo mé- todo como definido na reivindicação 37.

41. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou 38, caracterizado pelo fato de que é purificado em pelo menos 95% de homogeneidade em peso.

42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido na reivindicação 39, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

43. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um anticor- po, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, 38 e 39, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção, empacotado em um recipiente, o referido kit opcionalmente contendo um segundo agente terapêutico, e também compreendendo um rótulo ligado a ou empacotado com o recipiente, o rótulo descrevendo os teores do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções com respeito ao uso dos teores do recipiente para tratar um distúrbio ou doença relacio- nado a EphB3.

44. Kit de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um frasconete ou frasco ou seringa preenchida.