BRPI0720826A2 - Método aperfeiçoado para a recuperação de óleo de sementes vegetais - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO APERFEIÇOADO PARA A RECUPERAÇÃO DE ÓLEO DE SEMENTES VEGETAIS".

A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para a 5 recuperação de óleo de sementes vegetais com o uso de enzimas. A inven- ção se refere particularmente a um método no qual as enzimas são borrifa- das sobre as sementes oleaginosas secas sem aumentar significativamente o teor de umidade da semente oleaginosa e no qual as sementes oleagino- sas podem ser prensadas imediatamente após.

Sementes oleaginosas tais como a soja, o amendoim, sementes

de algodão, sementes de girassol, germe de trigo e sementes de colza (in- cluindo a canola) são as principais fontes de óleos comestíveis. Elas cobrem mais de 70% da produção mundial de gorduras e óleos de matérias-primas vegetais. A soja representa 20% das mesmas. Essas sementes oleaginosas 15 são não apenas as maiores fontes de óleo, mas são também fontes muito boas de proteínas de alta qualidade e são também muito usadas para fins de ração animal.

A necessidade de óleos vegetais para substituir combustíveis fósseis aumentou nos últimos anos. De particular importância são o óleo de 20 soja nas Américas do Norte e do Sul, assim como o óleo de colza (tipos du- plo zero; colza 00 da qual o ácido erúcico e os glicosinolatos foram removi- dos por cruzamento) na Europa e no Canadá. Os tipos duplo zero de colza, que foram desenvolvidos no Canadá e cultivados em toda a América do Nor- te, foram originalmente designados Canola (Canadian Oil, Iow acid - óleo 25 canadense, baixo teor ácido) por razões de marketing. A Canola é hoje ge- ralmente entendida como designação da colza (na verdade semente de col- za) na maior parte da América e da Austrália. De fato, a colza Canola ou "colza canadense" difere dos tipos 00 espalhados pela Europa. Muitos dos tipos atuais de Canola também são transgênicos.

Além do seu uso como óleo comestível e matéria-prima para

gorduras comestíveis, a colza é cultivada principalmente para a produção de produtos técnicos na Alemanha. O cultivo da colza de inverno na Alemanha para a colheita de 2004 soma 1,23 milhões de hectares, o que corresponde a um quantidade de semente de colza de cerca de 3,5 milhões de toneladas. Muito mais da metade do óleo vegetal produzido na Alemanha é agora óleo de colza. No mundo inteiro, a quantidade colhida de colza em 2004/5 foi de 5 46 milhões de toneladas, sendo Europa, Canadá, EUA, Austrália, China e índia as principais áreas cultivadas. O cultivo de colza foi o terceiro maior entre as sementes oleaginosa depois da soja e do óleo de palma e ela é cul- tivada em cerca de 13% da terra arável utilizada. A área cultivada usada pa- ra o cultivo de colza aumenta continuamente em todo o mundo.

A maior parte da colza é usada para a produção de metil éster

de óleo de colza (rape oil methyl ester, RME), que é também conhecido pelo termo biodiesel. O glicerol é nesse caso recuperado como subproduto.

Uma vez que o biodiesel, particularmente o da colza, enquanto matéria-prima renovável, apresenta um equilíbrio de CO2 mais favorável que 15 os combustíveis fósseis, é biodegradável e mais estável do que, por exem- plo, o metil éster de girassol (sunflower methyl ester, SME) e produz menos negro-de-fumo do que o combustível diesel quando queimado, a sua produ- ção recebe intenso apoio na economia mundial. Em 2005, a quantidade pro- duzida de biodiesel foi de 4 milhões de toneladas na Europa, 50% das quais 20 foram produzidas na Alemanha. Em 2005, cerca de 10 milhões de toneladas de biodiesel foram produzidas em todo o mundo. As quantidades anuais de cultivo de colza estão em crescimento contínuo.

A recuperação do óleo de sementes vegetais pode ser realizada de acordo com diferentes métodos. O óleo é geralmente espremido da se- 25 mente ou extraído com o uso de solventes orgânicos após a trituração das sementes. Também são usados métodos combinados nos quais o compo- nente oleoso remanescente no bagaço é extraído com o uso de solventes orgânicos após uma etapa de prensagem. O método usado depende inten- samente do uso posterior do bagaço. Para poder ser usado como ração, ne- 30 nhum solvente orgânico pode estar presente e o conteúdo oleoso residual deve ser baixo para proporcionar um valor energético ótimo no bagaço rico em proteínas para mistura na ração. O método de extração tem a desvantagem de altos custos de aquisição no que diz respeito ao equipamento e alto custo corrente. Além disso, os solventes (por exemplo, o hexano) são arriscados não apenas no que se refere ao manuseio, mas também no que se refere à saúde conside- 5 rando-se os resíduos contidos no bagaço. Uma outra desvantagem do mé- todo de extração é que a qualidade do óleo obtido é muito baixa. O óleo con- tém grandes quantidades de fosfolipídios (100 - 600 ppm P) que precisam ser removidos antes do processamento em óleo comestível assim como em biodiesel. Os valores-limite permitidos estão abaixo de 10 ppm P para a in- 10 dústria de óleos comestíveis, preferivelmente abaixo de 5 ppm P, e, para a indústria de combustíveis, abaixo de 14 ppm P, em cada caso calculados como fósforo. Na indústria de óleos comestíveis, a redução dos fosfolipídios conduz ao aumento da estabilidade do armazenamento, uma vez que os fosfolipídios são higroscópicos, e assim, atraem água, o que resulta na tur- 15 vação do óleo. Na indústria de combustíveis, os ácidos fosfóricos liberados são agressivos durante a queima e levam a um desgaste mais rápido dos motores. Outra desvantagem do método de extração para a aplicação do óleo extraído na indústria de alimentos é a alta densidade de cor do óleo extraído, que precisa ser reduzida por métodos de adsorção.

Além disso, enzimas foram usadas para digerir o material vege-

tal para melhorar o rendimento das sementes oleaginosas (conforme, por exemplo, WO 1991/013956 Al ou EP 0 113 165 Al). Todos esses métodos se baseiam nas etapas a) esmagamento da semente oleaginosa por moa- gem ou prensagem; b) adição de água e da enzima, com o que o teor de 25 umidade sobe para 20%-35% ou mais; c) incubação por 6-24h a temperatura elevada; d) prensagem ou centrifugação do óleo ou secagem até a obtenção de uma umidade residual inferior a 10% e extração do óleo ou uma combi- nação de prensagem e extração (conforme, por exemplo, Domínguez e ou- tros, 1995, Food Chem. 54: 223-231; Domínguez e outros, 1994, Food 30 Chem. 49, 271-286). Faz-se particular referência ao trabalho de Domínguez e outros, 1995, que foi realizado com soja. Eles fazem referência à impor- tância de um maior teor de água na etapa de reação enzimática, assim como ao menor teor de água para a extração subsequente.

O documento "J Am Oil Chem Soc 1993, 70 (9), 825-829" des- creve de maneira esquemática o uso de um tratamento enzimático antes da prensagem das sementes oleaginosas, assim como a influência deste trata- 5 mento enzimático sobre a qualidade do óleo assim obtido, sem mencionar o equilíbrio energético do método. O tratamento enzimático é, assim, realizado a um teor de umidade de 30% e a 50°C por seis horas. As sementes assim tratadas são secadas até atingir um teor de umidade de 6% antes da pren- sagem.

Apenas com o uso de um alto teor de água durante a reação

enzimática, celulases, hemicelulases, proteases ou misturas enzimáticas de celulases, pectinases e proteases, dependendo da semente oleaginosa, se mostraram enzimas eficazes. Os objetivos do tratamento enzimático são o enfraquecimento e a decomposição parcial das paredes celulares (paredes 15 celulares primária e secundária), assim como a destruição do envelope membranoso ao redor do óleo. O uso de celulases, hemicelulases e pectina- ses é possível para o primeiro objetivo; o uso de proteases para a hidrólise das oleosinas é possível para o segundo. O objetivo do tratamento enzimáti- co é o enfraquecimento das paredes celulares e das membranas envolvendo 20 o óleo de maneira a facilitar a sua recuperação.

Esse métodos são muito demorados e exigem muita energia, particularmente para reduzir o alto teor de água necessário para a reação enzimática antes das etapas de processamento ou de extração. O espaço que tem que ser disponibilizado para a incubação também é muito grande caso seja baseado na produção média diária de um moinho de óleo de 200-

1.000 t de óleo recuperado por dia.

Assim, há necessidade de métodos aperfeiçoados para a recu- peração do óleo de sementes vegetais nos quais as desvantagens da técni- ca mais atual descritas acima não ocorram.

É, portanto, objetivo da presente invenção proporcionar um mé-

todo aperfeiçoado para a recuperação do óleo de sementes vegetais. O mé- todo não apresentará as desvantagens da técnica mais atual mencionadas acima. Particularmente, um método que resulta em alto rendimento de óleo assim como em um baixo teor de fosfatídeos e de umidade no óleo será proporcionado de acordo com a invenção. Além disso, o método é para ser aplicado em uma forma de economia de energia e economia de tempo e é 5 para resultar em elevados rendimentos do óleo. Além disso, deve ser possí- vel usar o método universalmente, isto é, deve ser apropriado, por exemplo, para a recuperação de óleo, por exemplo, para a produção de biodiesel e também para a recuperação de óleo comestível. Ademais, deve ser possível administrar este método de maneira simples e com boa relação custo- 10 benefício e ele deve ser apropriado para uma ampla variedade de sementes oleaginosas.

Descobriu-se, surpreendentemente, que borrifando-se enzimas sobre as sementes oleaginosas secas pode-se obter um método para a re- cuperação de óleo de sementes vegetais acompanhado por uma maior pro- 15 dução de óleo, de um menor tempo de prensagem e de um teor menor de fosfatídeos em comparação com os óleos de prensagens convencionais. Ademais, o teor de umidade da semente oleaginosa não é significativamente aumentado em qualquer etapa de processamento pelo método de acordo com a invenção.

Dessa maneira, a invenção se refere a um método para a recu-

peração de óleo de sementes oleaginosas que é caracterizado pelos fatos de: a) uma solução aquosa contendo uma ou mais enzimas celulolíticas e/ou lipolíticas e/ou pectinolíticas e/ou proteolíticas e/ou fitase ser borrifada sobre as sementes; b) as sementes assim obtidas são diretamente enviadas para 25 prensagem de etapa única ou de etapas múltiplas de uma maneira por si mesma conhecida, opcionalmente conjugada com uma extração e c) o óleo é recuperado de uma maneira conhecida por si mesma e, opcionalmente, sofre processamento posterior.

A invenção também se refere ao uso deste método na produção de óleo comestível e na recuperação de óleo, por exemplo, para a produção de biodiesel.

No método de acordo com a invenção, a solução enzimática é aplicada diretamente às sementes ou, no caso de sementes maiores, às sementes amassadas ou trituradas sem que o teor de água natural da se- mente oleaginosa seja com isso significativamente aumentado. A surpreen- dente descoberta foi feita de que a solução enzimática pode ser diretamente 5 borrifada sobre as sementes secas sem haver necessidade de uma incuba- ção das sementes sobre as quais a enzima foi pulverizada. A solução enzi- mática pode ser borrifada sobre as sementes como tais ou após a moagem. Uma solução aquosa contendo a enzima ou enzimas selecionadas é, portan- to, borrifada sobre as sementes de uma maneira por si conhecida. A solução 10 enzimática aquosa pode ser uma solução enzimática recuperada do sobre- nadante da cultura de micro-organismos de uma maneira por si conhecida (por exemplo, consistindo nas seguintes etapas: separação da biomassa do líquido da cultura, concentração da solução obtida por ultrafiltração e filtra- ção por desinfecção o que pode também compreender agentes estabilizan- 15 tes. Entretanto, enzimas vegetais tais como, por exemplo, a papaína, podem também estar contidas na solução enzimática. A quantidade de solução en- zimática normalmente aplicada é da ordem de 1.000 ppm com base no peso das sementes oleaginosas. A água aplicada pelo borrifo da solução enzimá- tica aumenta o teor de água natural das sementes (4-8% p/p) apenas em 20 cerca de 0,1 até no máximo 2% (p/p) com base na massa das sementes. As sementes preparadas dessa maneira podem então ser diretamente enviadas para prensagem sem um período posterior de incubação e sem necessidade adicional de água e o óleo pode então ser recuperado. Em contraste com os métodos conhecidos da técnica atual, que usam grandes quantidades de 25 água, por exemplo, para evitar a inibição das enzimas pelo produto ou para aumentar a difusão das enzimas para os substratos, no método de acordo com a invenção é suficiente usar o teor de água natural de semente oleagi- nosa. As enzimas provocam uma alteração das paredes celulares mediante que melhora, por sua vez, o fluxo do óleo durante a prensagem. Neste caso, 30 não é necessária a degradação completa das paredes celulares pelas celu- lases, hemicelulases ou pectinases. As proteases dão apoio à destruição da membrana contendo proteína que circunda o corpo oleaginoso. A fitase dá apoio à redução das interações das proteínas via pontes de ácido fítico, par- ticularmente no que diz respeito a sementes ricas em ácido fítico, tais como a soja, e, assim, à melhoria do fluxo de óleo na prensagem. O procedimento de prensagem também é aperfeiçoado pelo baixo teor de água, uma vez que 5 ele contribui para a progressão do bagaço na prensa e pelo fato de que não se consegue pressão de prensagem sobre as sementes e o bagaço, devido a grandes quantidades de água.

Uma vez que a temperatura pode se elevar intensamente duran- te a prensagem, às vezes acima de IOO0C no bagaço, dependendo da pres- são de prensagem, enzimas termoestáveis devem ser preferencialmente usadas no método. O uso de enzimas mesofílicas e/ou termotolerantes tam- bém é, contudo, possível. De acordo com a invenção, uma ou mais enzimas são usadas que são capazes de Iisar paredes celulares ou membranas celu- lares de células vegetais ou de perfurá-las pelo menos parcialmente ou de afrouxar a membrana das oleosinas. Enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas, lipolíticas, pectinolíticas e/ou proteolíticas são particularmente usadas. Essas enzimas podem ser usadas individualmente ou também em combinação, dependendo da composição das sementes por exemplo, adição de protea- ses a sementes ricas em proteínas, tais como a soja, é razoável. A adição de enzimas hemicelulolíticas e pectinolíticas é mais razoável no caso de se- mentes que contêm uma maior quantidade dessas substâncias de armaze- namento nas paredes celulares, uma vez que o uso de celulases apenas não causaria um efeito suficiente de afrouxamento ou perfuração da parede celular. O uso de pectinases que atacam a protopectina das lamelas inter- mediárias pode resultar em uma melhor formação de pasta para a prensa- gem e, dessa maneira, em uma liberação melhor de óleo. O uso de galacto- mananases pode ser vantajoso, por exemplo, no que diz respeito à soja. Es- sas enzimas existem em diferentes quantidades em produtos de pectinase comercialmente disponíveis. A enzima é particularmente selecionada dentre celulases, endoglicanases, celobio-hidrolases, hemicelulases, peptidases, fosfolipases, pectionases ou fitases de produção natural ou recombinante. Além disso, variantes derivadas das enzimas acima podem ser usadas co- mo, por exemplo, enzimas recombinantes produzidas com base nas enzimas acima e que contêm partes delas e têm sua atividade modificada pela adição ou remoção de sítios de ligação de substrato. As enzimas respectivas po- dem ser comercialmente disponíveis ou podem ser produzidas por uma pes- 5 soa versada na técnica. As enzimas podem ser usadas individualmente ou em combinação.

O tipo e a quantidade da enzima utilizada dependem em grande medida, portanto, do tipo e da quantidade das sementes a serem tratadas. Com base nos presentes produtos de sementes, as dosagens geralmente

ficam entre 100 e 20.000 ppm (p/p), mais preferivelmente entre 200 e 15.000 ppm (p/p) e, ainda mais preferivelmente, entre 500 e 10.000 ppm (p/p). A dose pode ser maior no caso de enzimas mesofílicas de maneira a compen- sar a perda devida à desativação térmica ou à baixa atividade residual a al- tas temperaturas durante a prensagem.

A prensagem pode ocorrer em etapa única ou em etapas múlti-

plas. No caso de prensagem múltiplas, a adição das enzimas também é possível entre as etapas de prensagem individuais. A prensagem pode ser seguida de uma etapa de extração sem que o material de prensagem (grãos para moagem) precise ter o seu teor de água reduzido. Os métodos para 20 realizar uma prensagem de óleo são conhecidos daqueles versados na téc- nica. Após a prensagem, o óleo sofre processamento posterior de uma ma- neira conhecida por si mesma.

O método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo processamento de maior quantidade de sementes por unidade tempo- 25 ral, assim como por uma prensagem com melhor desempenho e rendimento e por um menor teor de fosfolipídios ou de fosfatídeos no óleo. Devido ao maior rendimento e à taxa de prensagem mais alta, a exigência de energia por t de óleo recuperada também diminui. Uma vez que o teor de água é aumentado apenas de maneira insignificante pela adição da solução enzimá- 30 tica sobre as sementes secas, o método não exige secagem prévia caso agentes de extração sejam utilizados e, assim, claramente apresenta exi- gência energética mais baixa em comparação com os métodos enzimáticos desenvolvidos até hoje, que compreendem em sua totalidade etapas para a redução do teor de água de >25% para menos de 10% de maneira a não diminuir o rendimento durante a extração.

Ademais, o método de acordo com a presente invenção apre- 5 senta a vantagem de que o óleo recuperado tem um teor de fosfatídeos cla- ramente reduzido em comparação com os métodos convencionais e, assim, a degomagem — isto é, a redução do teor de fosfatídeos — pode ser limita- da a pequenas quantidades do óleo recuperado, por exemplo, em métodos de prensagem de múltiplas etapas.

O método de acordo com a invenção é muito adequado para a

recuperação de óleo para a produção de óleo comestível ou biodiesel.

A figura incluída explica a invenção em maior detalhe:

A figura 1 mostra a redução do tempo de prensagem pelo uso da celulase do Melanocarpus com um domínio de ligação para a CBH1 do Tri- chodema reesei (representação de medições repetidas 3 vezes).

O método de acordo com a invenção pode geralmente ser reali- zado com qualquer uma das enzimas mencionadas acima.

As celulases, particularmente as endoglicanases, do Acremoni- um thermophilum, que pertencem à família de hidrolases 45 (para a classifi- 20 cação, vide http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/GH intro.html), celulases, particu- larmente endoglicanases, do Melanocarpus albomyces (família de hidrolases 45), ligadas a um domínio de ligação a celulases (CBD) da CBH1 do Tricho- derma reesei, ou celulases, particularmente celobio-hidrolases, do Thermo- ascus aurantiacus (família de hidrolases 7), conectadas a um domínio de 25 ligação de celulases (CBD) da CBH1 do Triehoderma reesei, endoglicanase

Il do Triehoderma reesei e betaglicosidase do Chaetomium thermophilium, demonstraram ser as enzimas preferidas. As hemicelulases preferidas são a xilanase Il do Triehoderma reesei, xilanases xlnA da Aetinomadura flexuosa e xilanase xylA do Chaetomium thermophilum. As pectinases preferidas são 30 as pectinases do Aspergillus niger e do Triehoderma reesei. As fosfolipases preferidas são as fosfolipases de tipo C e/ou as fosfolipases de tipo A ou B, tais como, por exemplo, as fosfolipases do Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus ou Thermomyces lanuginosus. As fitases preferidas são a fitases da Aspergillus niger, E. coli, Peniophora Iysii ou variantes derivadas das mes- mas, tais como a Nov9X ou a fitase de consenso do Aspergillus.

Os exemplos abaixo explicam a invenção em maior detalhe.

Exemplo de referência 1: determinação da atividade da celu-

Iase neutra

A atividade da endo-1,4-p-glicanase é determinada pela hidrólise do substrato carboximetilcelulose a pH 7,5, 50°C e com um tempo de incu- bação de 10 min. A quantidade de açúcares reduzidos liberada é medida 10 com base na glicose após a reação com ácido dinitrossalicílico mediante detecção fotométrica do complexo de cor desenvolvido a 540 nm. Uma uni- dade NCU é definida como o equivalente que corresponde à liberação de um nanomol de glicose por segundo.

1,8 ml de solução de substrato (CMC a 3% [Sigma C-56778, 15 baixa viscosidade] em 10 mM de tampão HEPES pH 7,0 [Sigma H-3375] são misturados por 5 min a 50°C e então 200 μΙ de solução enzimática diluída são adicionados e incubados por 10 min. Então, 3 ml de solução reagente DNS (10 g Γ1 de ácido salicílico dissódico [Sigma D-0550], 16 g I'1 de NaOH 300 g Γ1 de tartarato de K-Na [Merck 8087] são adicionados e incubados em 20 banho com água fervente por 5 min. As medições da absorção são realiza- das contra um valor de branco de reação tratada igualmente usando-se água em vez de solução enzimática.

Exemplo de referência 2: determinação da atividade das ce- lulases acídicas termoestáveis O método deriva do método do exemplo de referência 1 e usa

uma temperatura de incubação de 60°C em vez de 50°C. A segunda varia- ção diz respeito ao tampão. O tampão HEPES é substituído por um tampão de 10 mM de citrato, pH 4,8. A unidade da atividade enzimática é CMU g'1.

Exemplo de referência 3: determinação da atividade da ce- lobio-hidrolase

A celobio-hidrolase (CBHI) e a endoglicanase (EGI) hidrolisam o substrato 4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo e, assim, libera 4- metilumbeliferona (7-hidróxi-4-metilcoumarina). Essa reação pode ser obser- vada fotometricamente medindo-se a absorção da 4-metilumbeliferona em condições alcalinas a 370 nm. A atividade da β-glicosidase da amostra é inibida por 100 mM de glicose na mistura da reação. Uma unidade de PCU é 5 definida como a quantidade de atividade enzimática que libera um nmol de 4-metilumbeliferon para 4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo por segundo (1 PCU = 1 nkat) sob as condições experimentais (pH 5,0, 50°C, tempo de in- cubação de 10 min).

A quantidade de endoglicanase presente pode ser medida indi- vidualmente mediante a adição de 5 mM de celobiose ao lote de reação, sendo que a reação da celobio-hidrolase é inibida pela 4-metilumbeliferil^- D-lactosídeo.

250 μΙ de solução de substrato (1 mM de 4-metilumbeliferil-p-D- lactosídeo [Sigma M-2405]) em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 15 5,0, e 50 μΙ de solução de glicose a 1M em 50 mM de tampão de acetato de sódio são misturados a 50°C por 10 min. Após a adição de 200 μΙ de solução enzimática diluída, procede-se a mistura e incubação por 10 min a 50°C. En- tão, 1 ml de solução de carbonato de sódio a 1M é adicionado para inter- romper a reação enzimática e a absorção é medida contra um valor nulo tra- 20 tado da mesma forma a 370 nm usando-se água em vez de solução enzimá- tica.

7-hidróxi-4-metilcoumarina [Aldrich 12,872-4] dissolvida em car- bonato de sódio a 1 M é usada para calibração.

Exemplo de referência 4: determinação da atividade da β- glicosidase

A β-glicosidase hidrolisa o substrato 4-nitrofenil-p-d- glicopiranosídeo em 4-nitrofenol e glicose. A reação é interrompida pela adi- ção de álcali e o 4-nitrofenol, que com isso se torna amarelo, é detectado fotometricamente.

Uma unidade BGU é definida como o equivalente à liberação de

um nanomol de 1-nitrofenol por segundo.

1,8 ml de solução de substrato (1 mM de 4-nitrofenil-p-D- glicopiranosídeo [Merck 6793] em 50 mM de tampão de citrato [Merck 6448], pH 4,8) são misturados a 50°C por 5 min. Então, 200 μΙ de solução enzimáti- ca diluída são adicionados e incubados por 10 min a 50°C. Após 10 min, 1 ml de solução de Na2C03 a 1 M é acrescentado e a absorção é medida con- 5 tra um valor nulo de reação tratado da mesma forma a 400 nm usando-se água em vez de solução enzimática.

A curva de calibração é preparada com 4-nitrofenol [Sigma 104-

8],

Exemplo de referência 5: determinação do teor de fosfatí- deos do óleo

O teor de fosfatídeos (também chamado teor de fosfolipídios) é expressado como ppm de fósforo no óleo. Após a incineração, ele é fotome- tricamente determinado a 830 nm quando óxido de magnésio é adicionado como complexo de fosfomolibdato a 850°C. K2HPO4 é usado para calibra- ção.

O teor de fosfatídeos pode também ser determinado mediante fotometria de chama diretamente no óleo por meio de um dispositivo AAS.

O teor de fosfatídeos no óleo de semente de colza integral dos exemplos 1 a 3, que foi extraído com n-hexano correspondendo ao método do exemplo de referência 6, foi de cerca de 93 ppm P.

Exemplo de referência 6: determinação do conteúdo do óleo pelo método Soxhlet

15g de sementes de colza moídas ou 20-25 g de grãos prontos para moagem esmagados da extração são introduzidos em um dedal de ex- 25 tração [número de referência Sartorius FT-1210-033080] e extraídos com n- hexano de alto teor de pureza (Merck) por 4 h em um aparelho Soxhlet. A quantidade de óleo recuperado é pesada a vácuo após a evaporação do sol- vente.

A semente de colza dos exemplos 1 a 3 contém 41% de óleo.

Exemplo de referência 7: determinação da cor do óleo

O óleo recuperado pela prensagem ou pela extração de uma semente oleaginosa é centrifugado a 12.000 x g por 5 min para separação das partículas suspensas e então a cor é determinada em uma cuveta de 1 cm a 508 nm contra água no fotômetro.

O óleo total extraído com hexano de acordo com o exemplo de referência 6 da semente de colza moída em um moinho de impacto dos e- 5 xemplos 1 e 3 tinha uma absorção de 1,2 AU e, assim, uma cor básica mais forte.

Exemplo 1: uso de enzimas para aumentar a taxa de pren- sagem

Experimento 1:

Uma endoglicanase do Acremonium thermophilum produzida por

recombinação com Trichoderma reesei com um peso molecular de cerca de 28,6 kDa e com uma temperatura ótima de cerca de 75°C-80°C foi usada no seguinte experimento tal como descrito, por exemplo, em Fl 20051318. A solução enzimática (endoglicanase), um concentrado esterilmente filtrado 15 por ultrafiltração com uma massa seca de cerca de 15%, foi finamente nebu- Iizada e borrifada nas sementes de colza preta da empresa DKSH, Holanda, colheita de 2005, usando-se um cilindro bico pulverizador (0,1% p/p) e a se- mente de colza foi então misturada por 30 s. A dosagem de endoglicanase foi de 64.400 CMC por kg de semente de colza. A colza assim preparada foi 20 submetida a prensagem de etapa única em um prensa de óleo, por exemplo, do tipo Õlprinz da empresa Kernkraft (www.oelpresse.de), Alemanha. A prensa funcionava com uma velocidade de 25 upm e estava equipada com uma cabeça de compressão com abertura de 12 mm e ajustada para uma folga de 1,5 mm. O tempo de permanência da colza na cabeça de prensa- 25 gem foi de cerca de 1-2 min. Um termossensor com um dispositivo de medi- ção acoplado da companhia Roth foi inserido na cabeça de prensagem para determinar a temperatura da mesma. O óleo foi coletado em uma tigela de vidro em uma balança e a quantidade e a taxa de prensagem assim como a temperatura do óleo foram determinados. O bagaço foi então recolhido em 30 outra tigela colocada em uma balança separada e foi então esmagado em um moinho de café com um mecanismo de martelo para determinação do teor de óleo residual por extração, de acordo com o exemplo de referência 6. O efeito da endoglicanase do Acremonium sobre a taxa de pren- sagem está representado na figura 1. O experimento foi repetido três vezes com e sem a adição da enzima. Usou-se sempre a mesma quantidade de semente de colza, de maneira que a quantidade de óleo prensado obtido foi 5 de cerca de 600 g em cada. Como representado na figura 1, há uma repro- dutibilidade muito alta no intervalo de prensagem utilizado de cerca de 22 min. Não há variações significativas entre as repetições individuais da medi- ção. O aumento da capacidade de produção da colza pelo moinho de óleo e, assim, uma redução do tempo de prensagem para se obter um rendimento 10 de óleo constante foi conseguido em todas as três rodadas. A melhoria do desempenho de prensagem do moinho de óleo resultou em um aumento do óleo obtido de 6,6% por hora.

Os teores de fosfatídeo no óleo prensado foram muito baixos a 6,5-8 ppm P e permitem um processamento posterior direto do óleo na in- 15 dústria de óleos comestíveis e também na produção de biodiesel. Os valores dos teores de fosfatídeos ficaram 5%-10% abaixo dos da prensagem sem a adição da enzima. Isso era de se esperar no que se refere aos teores de fosfatídeos absolutamente baixos.

A temperatura da cabeça de compressão sem a adição da enzi- 20 ma foi em média de 77,00C em todos as três medições, enquanto que com a utilização de endoglicanase a temperatura no valor médio cresceu apenas até valores de 75,4°C em todas as três medições a despeito da maior produ- ção de colza por unidade temporal e, portanto, da fricção potencialmente maior na cabeça de prensagem. Isso demonstra de maneira clara que houve 25 um processamento mais eficiente e mais gentil para com o óleo com a adi- ção das enzimas.

Com a adição de enzimas, a cor do óleo prensado melhorou de uma absorção na média de 0,801 AU para 0,776 AU. Esses valores são cla- ramente melhores do que a cor do óleo de semente de colza simplesmente 30 extraído com hexano de 1,2 AU e, portanto, permitem uma redução do uso de agentes alvejantes/bentonita no processamento posterior em óleo comes- tível e menor gasto de dinheiro. Experimento 2

Neste experimento, uma celobio-hidrolase do Thermoascus au- rantiacus, que carrega o domínio de ligação à celulose CBH1 da Trichodema reesei na extremidade C-terminal (por exemplo, produzida de acordo com 5 WO 2006/117432 A1), foi usada em uma dosagem de 180 PCU por kg de semente de colza tendo a mesma estrutura experimental. A celobio- hidrolase tem um peso molecular de cerca de 46,2 kDa e o reticulador CBH1 e o domínio de ligação CBH1 acoplados têm um peso molecular de cerca

6,8 kDa. A enzima tem uma temperatura ótima de cerca de 65°C. Assim co- mo na celulase do experimento 1, um aumento da capacidade de produção e, assim, na quantidade de óleo por unidade temporal que foi 10,8% mais alto pode ser obtido.

Experimento 3

Outras enzimas mesofílicas além daquelas usadas nos experi- 15 mentos 1 e 2 ou 2, tais como a endoglicanase I da Trichodema reesei com uma temperatura ótima de cerca de 50°C (por exemplo, como descrito em EP 0 137 280 A1) poderia também contribuir para um menor tempo de pren- sagem relativo em dosagens maiores e, assim, a um aumento da capacida- de de produção. Em uma dosagem de 376.000 BU por kg de semente de 20 colza pôde ser obtido um aumento da capacidade de produção de 2,1% e a uma dosagem de 752.000 BU por kg de semente de colza pôde ser obtido um aumento de 6,3% da capacidade de produção.

Exemplo 2: uso de misturas enzimáticas para aumentar a taxa de prensagem e para melhorar o rendimento do óleo processado Outra enzima que não a do exemplo 1 foi usada nos experimen-

tos, mais especificamente uma celulase neutra recombinante produzida com a Triehodema reesei a partir do Melanocarpus albomyees, que compreende um domínio de ligação de celulose CH1 da Triehoderma reesei, como descri- to em WO 2006/117432 A1, assim como a endoglicanase recombinante pro- 30 duzida com a Triehodema reesei a partir do Aeremonium do exemplo 1, ex- perimento 1. A celulase do Melanocarpus tem um peso molecular de cerca de 20,2 kDa e o reticulador acoplado com o CBD da celobio-hidrolase 1 da 10

15

Trichodema reesei tem um peso molecular de cerca de 6,8 kDa. A enzima tem uma temperatura ótima de cerca de 75°C. As dosagens foram de 64.400 CMC por kg de semente de colza para a endoglicanase do Acremonium e de

130.000 NCU por kg de semente de colza para a celulase neutra do Meiano- carpus. As quantidades de solução enzimática borrifada tinham cada uma

0,1% (p/p) com base na massa da semente de colza. As soluções enzimáti- cas eram filtrados por ultrafiltrações estéreis com uma massa seca de cerca de 15% (p/p). A estrutura experimental foi a mesma que no exemplo 1, com a exceção de que a abertura do bico foi de apenas 10 mm em vez de 12 mm. Melhores resultados de prensagem podem assim ser obtidos. A mesma colza (mesmo carregamento) que a do exemplo 1 foi utilizada, de maneira que os resultados são diretamente comparáveis. Os resultados estão repre- sentados na tabela 1.

Tabela 1: uso de celulase ou endoglicanase para a melhoria do rendimento do óleo em uma prensagem de colza e para a redução do tempo de prensagem para obtenção da mesma quantidade de óleo. Na água do lote foi usada a mesma quantidade de água (0,1% (p/p) com base na massa

enzima Temperatu¬ Tempo de Rendimen¬ Teorde Teor de ra da cabe¬ prensa¬ to do óleo óleo fosfatí¬ ça de com¬ gem relati¬ [%] ** residu¬ deos no pressão [°C] vo * [%] al no óleo pren¬ bagaço sado [ppm [%] P] Nenhuma 83,0 100,0 34,7 16,6 11 Somente 86,5 100,2 34,5 16,4 14 água Endogli¬ 82,5 86,9 35,3 16,1 9 canase Celulase 81,8 85,4 35,1 16,1 8 neutra * O tempo de prensagem relativo é o tempo necessário para obter a mesma quantidade de óleo.

** O rendimento do óleo indica o rendimento de óleo absoluto obtido da se- mente de colza independentemente do tempo total do procedimento de prensagem.

Como os resultados mostram, o rendimento do óleo na prensa- gem pode ser aumentado por meio das enzimas correspondentes se os pa- 5 râmetros de prensagem forem corretamente selecionados, particularmente no que se refere à seleção das aberturas dos bicos da prensa. A vantagem desse óleo é o baixo teor de fosfatídeos, que permite processamento poste- rior direto sem degomagem. Isso também se aplica a despeito de a tempera- tura de prensagem ser cerca de IO0C mais alta em comparação com as 10 condições no experimento do exemplo 1. O aumento da temperatura é cau- sado pelo estreitamento do diâmetro da abertura da prensa e pela maior pressão daí resultante.

No valor nulo e no experimento com água no lugar da enzima, que foi realizado para fins de comparação, o teor de fosfatídeos no óleo 15 prensado em comparação com as condições com bico maior (exemplo 4) aumentaram, como esperado, de 8 para 14 ppm P e se encontra, assim, a- cima do valor-limite aplicável para óleos comestíveis e na margem do teor permitido para a produção de biodiesel. Contudo, os teores de fosfatídeos no óleo prensado com a adição de enzima, assim como no exemplo 4, ficaram 20 em um nível baixo de apenas 8-9 ppm P. Portanto, a adição de enzimas também tem efeitos positivos na redução dos teores de fosfatídeos no óleo prensado em comparação com o óleo obtido sem a adição da enzimas. Isso permite o processamento posterior do óleo assim recuperado em óleo co- mestível e em biodiesel sem degomagem.

Ademais, o tempo necessário para se obter a mesma quantida-

de de óleo prensado (tempo de prensagem relativo) poderia claramente ser reduzido mais uma vez e, dessa maneira, a capacidade de produção dos moinhos de óleo poderia ser elevado. Os tempos de funcionamento relativos ou tempos de prensagem foram não apenas reduzidos em 6%, mas foram até mesmo reduzidos em até 14,6%.

Resultados similares foram alcançados também por uma beta- glicanase recombinante produzida com a T. reesei a partir do Chaetomium 10

15

thermophilum com um peso molecular de cerca de 76,4 kDa e uma tempera- tura ótima de 65°C, produzida como descrito em FI20051318, por exemplo. A dosagem foi de 17.840 BGUs por kg de semente de colza. Não apenas o rendimento espaço-tempo (óleo obtido por dispositivo, kg de semente de colza e unidade temporal) aumentou em 3%, mas também o rendimento de óleo absoluto por prensagem aumentou em um total de 2%.

Exemplo 3: efeito do uso de enzima sobre o teor de fosfatí- deos no extrato de óleo residual

Nos experimentos dos exemplos 1 e 2, o bagaço coletado foi homogeneizado e esmagado. O óleo que ainda estava contido no bagaço, também chamado óleo residual, foi extraído de porções de alíquotas do ba- gaço esmagado de acordo com o exemplo de referência 6 e o teor de fosfa- tídeos do mesmo foi determinado de acordo com o exemplo de referência 5. Os resultados estão resumidos na tabela a seguir.

Tabela 2: determinação do teor de fosfatídeos do óleo residual extraído do bagaço

enzima Quantidade Teor de fosfatí¬ Teor de fosfatídeos de óleo pren¬ deos no óleo no óleo extraído sado *** no prensado [ppm P] [ppm P] óleo total **** [%] Apenas extração n.a. n.a. 85-99 * Nenhuma ** 83,7 9 73,6 Endoglicanase 83,6 8 70,5 20

25

* Neste lote, a semente de colza foi apenas esmagada e então diretamente extraída com n-hexano sem prensagem prévia.

** Neste lote não houve adição de enzima e a semente de colza foi prensada diretamente.

*** Óleo prensado: óleo obtido por prensagem.

**** Óleo total: quantidade de óleo obtida por extração da semente de colza

desintegrada.

n. a.: não se aplica

Como os resultados acima demonstram, a liberação dos fosfatí- deos residuais é intensamente inibida na extração do óleo residual remanes- cente do bagaço (óleo total menos óleo prensado; cerca de 16-17% do óleo total) pelo uso de enzimas. Caso o óleo completo seja extraído, cerca de 3,5 a 4,0 mg P de fosfolipídios também são extraídos (quantidade total de óleo * teor de fosfolipídios do óleo obtido por extração). O óleo prensado contém apenas 0,274 a 0,309 mg P (óleo prensado * teor de fosfatídeos do óleo prensado) e o óleo residual extraído subsequentemente mais uma vez 0,474 a 0,492 mg P (óleo residual * teor de fosfatídeos no óleo residual). Assim, 2,7 a 3,3 mg P de fosfolipídios permanecem no bagaço pelo uso de enzimas após extração em seguida à prensagem, o que corresponde a mais de 3/4 a 4/5 dos fosfolipídios totais da colza que são obtidos apenas por extração. Dessa maneira, aqui o uso de enzimas também resulta em uma melhoria do óleo residual extraído pela redução do teor de fosfolipídios em comparação com a extração sozinha e, assim, em uma redução do trabalho de degoma- gem a ser realizado subsequentemente.

Claims (10)

1. Método para recuperar óleo de sementes vegetais caracteri- zado pelo fato de que a) uma solução aquosa contendo uma ou mais enzimas celulolí- ticas e/ou lipolíticas e/ou pectinolíticas e/ou proteolíticas e/ou fitase é borrifa- da sobre a semente; b) a semente assim obtida é diretamente enviada para prensa- gem de estágio único ou de múltiplos estágios de uma maneira por si conhe- cida, opcionalmente acompanhada de extração, e c) o óleo é recuperado de uma maneira por si conhecida e op- cionalmente submetido a processamento posterior.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a enzima ser selecionada entre celulases, endoglicanases, celobio- hidrolases, hemicelulases, pectinases, fosfolipases, proteases ou fitases na- turais ou recombinantes.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a enzima ser selecionada entre as endoglicanases do Acremonium thermophilium, as endoglicanases do Melanocarpus albomyces, opcional- mente conectadas com um domínio de ligação de celulase de CBH1 da Tri- ehoderma reesei, celobio-hidrolases do Thermoaseus aurantiaeus, opcio- nalmente ligadas com um domínio de ligação de celulase de CBH1 da Tri- ehoderma reesei, endoglicanase Il da Triehoderma reesei e beta-glicosidase do Chaetomium thermophilum, xilanase Il da Triehoderma reesei, xilanase xlnA da Aetinomadura flexuose, xilanase xylA do Chaetomium thermophilum, pectinases do Aspergillus niger e Triehoderma reesei, fosfolipases tipo A, tipo B ou tipo C do Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus ou Thermomy- ees lanuginosus.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo fato de a semente ser descascada e/ou triturada antes de ser borrifada com a enzima.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de a enzima ser adicionalmente borrifada sobre as sementes já prensadas entre as prensagens individuais.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de uma etapa de extração ser realizada após a prensagem.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de as sementes serem selecionadas a partir de sementes oleaginosas.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de as sementes oleaginosas serem selecionadas entre soja, amendoim, sementes de algodão, semente de girassol, germe de trigo e sementes de colza.

9. Uso do método como definido nas reivindicações 1 a 8, na produção de óleo comestível.

10. Uso do método como definido nas reivindicações 1 a 8, na produção de biodiesel.