BRPI0720826B1

BRPI0720826B1 - Método para recuperar óleo de sementes de plantas, bem como uso do referido método na produção de óleo comestível e de biodiesel

Info

Publication number: BRPI0720826B1
Application number: BRPI0720826-0A
Authority: BR
Inventors: Köhler Jörg; Marschner Volker; Winter Bruno
Original assignee: Ab Enzymes Gmbh
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2018-07-31
Also published as: BRPI0720826A2; EP2118247B2; CA2673926A1; DK2118247T3; DE102006062045A1; US8822201B2; AU2007341696A1; US20100041125A1; ES2391309T5; AU2007341696B2; PL2118247T3; DK2118247T4; CA2673926C; ES2391309T3; EP2118247A1; EP2118247B1; PL2118247T6; WO2008080495A1

Description

(54) Título: MÉTODO PARA RECUPERAR ÓLEO DE SEMENTES DE PLANTAS, BEM COMO USO DO REFERIDO MÉTODO NA PRODUÇÃO DE ÓLEO COMESTÍVEL E DE BIODIESEL (51) Int.CI.: C11B 1/02 (30) Prioridade Unionista: 29/12/2006 DE 10 2006 062 045.3 (73) Titular(es): AB ENZYMES GMBH (72) Inventor(es): JÕRG KÕHLER; VOLKER MARSCHNER; BRUNO WINTER (85) Data do Início da Fase Nacional: 29/06/2009

1/21

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA RECUPERAR ÓLEO DE SEMENTES DE PLANTAS, BEM COMO USO DO REFERIDO MÉTODO NA PRODUÇÃO DE ÓLEO COMESTÍVEL E DE BIODIESEL.

[001] A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para a recuperação de óleo de sementes de plantas com o uso de enzimas. A invenção se refere particularmente a um método no qual as enzimas são borrifadas sobre as sementes oleaginosas secas sem aumentar significativamente o teor de umidade da semente oleaginosa e no qual as sementes oleaginosas podem ser prensadas imediatamente após.

[002] Sementes oleaginosas tais como a soja, o amendoim, sementes de algodão, sementes de girassol, germe de trigo e sementes de colza (incluindo a canola) são as principais fontes de óleos comestíveis. Elas cobrem mais de 70% da produção mundial de gorduras e óleos de matérias-primas vegetais. A soja representa 20% das mesmas. Essas sementes oleaginosas são não apenas as maiores fontes de óleo, mas são também fontes muito boas de proteínas de alta qualidade e são também muito usadas para fins de ração animal.

[003] A necessidade de óleos vegetais para substituir combustíveis fósseis aumentou nos últimos anos. De particular importância são o óleo de soja nas Américas do Norte e do Sul, assim como o óleo de colza (tipos duplo zero; colza 00 da qual o ácido erúcico e os glicosinolatos foram removidos por cruzamento) na Europa e no Canadá. Os tipos duplo zero de colza, que foram desenvolvidos no Canadá e cultivados em toda a América do Norte, foram originalmente designados Canola (Canadian Oil, low acid - óleo canadense, baixo teor ácido) por razões de marketing. A Canola é hoje geralmente entendida como designação da colza (na verdade semente de colza) na maior parte da América e da Austrália. De fato, a colza Canola ou colza canadense

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 11/38

2/21 difere dos tipos 00 espalhados pela Europa. Muitos dos tipos atuais de Canola também são transgênicos.

[004] Além do seu uso como óleo comestível e matéria-prima para gorduras comestíveis, a colza é cultivada principalmente para a produção de produtos técnicos na Alemanha. O cultivo da colza de inverno na Alemanha para a colheita de 2004 soma 1,23 milhões de hectares, o que corresponde a um quantidade de semente de colza de cerca de 3,5 milhões de toneladas. Muito mais da metade do óleo vegetal produzido na Alemanha é agora óleo de colza. No mundo inteiro, a quantidade colhida de colza em 2004/5 foi de 46 milhões de toneladas, sendo Europa, Canadá, EUA, Austrália, China e Índia as principais áreas cultivadas. O cultivo de colza foi o terceiro maior entre as sementes oleaginosa depois da soja e do óleo de palma e ela é cultivada em cerca de 13% da terra arável utilizada. A área cultivada usada para o cultivo de colza aumenta continuamente em todo o mundo.

[005] A maior parte da colza é usada para a produção de metil éster de óleo de colza (rape oil methyl ester, RME), que é também conhecido pelo termo biodiesel. O glicerol é nesse caso recuperado como subproduto.

[006] Uma vez que o biodiesel, particularmente o da colza, enquanto matéria-prima renovável, apresenta um equilíbrio de CO2 mais favorável que os combustíveis fósseis, é biodegradável e mais estável do que, por exemplo, o metil éster de girassol (sunflower methyl ester, SME) e produz menos negro-de-fumo do que o combustível diesel quando queimado, a sua produção recebe intenso apoio na economia mundial. Em 2005, a quantidade produzida de biodiesel foi de 4 milhões de toneladas na Europa, 50% das quais foram produzidas na Alemanha. Em 2005, cerca de 10 milhões de toneladas de biodiesel foram produzidas em todo o mundo. As quantidades anuais de cultivo de colza estão em crescimento contínuo.

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 12/38

3/21 [007] A recuperação do óleo de sementes de plantas pode ser realizada de acordo com diferentes métodos. O óleo é geralmente espremido da semente ou extraído com o uso de solventes orgânicos após a trituração das sementes. Também são usados métodos combinados nos quais o componente oleoso remanescente no bagaço é extraído com o uso de solventes orgânicos após uma etapa de prensagem. O método usado depende intensamente do uso posterior do bagaço. Para poder ser usado como ração, nenhum solvente orgânico pode estar presente e o conteúdo oleoso residual deve ser baixo para proporcionar um valor energético ótimo no bagaço rico em proteínas para mistura na ração.

[008] O método de extração tem a desvantagem de altos custos de aquisição no que diz respeito ao equipamento e alto custo corrente. Além disso, os solventes (por exemplo, o hexano) são arriscados não apenas no que se refere ao manuseio, mas também no que se refere à saúde considerando-se os resíduos contidos no bagaço. Uma outra desvantagem do método de extração é que a qualidade do óleo obtido é muito baixa. O óleo contém grandes quantidades de fosfolipídios (100 600 ppm P) que precisam ser removidos antes do processamento em óleo comestível assim como em biodiesel. Os valores-limite permitidos estão abaixo de 10 ppm P para a indústria de óleos comestíveis, preferivelmente abaixo de 5 ppm P, e, para a indústria de combustíveis, abaixo de 14 ppm P, em cada caso calculados como fósforo. Na indústria de óleos comestíveis, a redução dos fosfolipídios conduz ao aumento da estabilidade do armazenamento, uma vez que os fosfolipídios são higroscópicos, e assim, atraem água, o que resulta na turvação do óleo. Na indústria de combustíveis, os ácidos fosfóricos liberados são agressivos durante a queima e levam a um desgaste mais rápido dos motores. Outra desvantagem do método de extração para a aplicação do óleo extraído na indústria de alimentos é a alta densidade de cor do

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 13/38

4/21 óleo extraído, que precisa ser reduzida por métodos de adsorção.

[009] Além disso, enzimas foram usadas para digerir o material da planta para melhorar o rendimento das sementes oleaginosas (conforme, por exemplo, WO 1991/013956 A1 ou EP 0 113 165 A1). Todos esses métodos se baseiam nas etapas a) esmagamento da semente oleaginosa por moagem ou prensagem; b) adição de água e da enzima, com o que o teor de umidade sobe para 20%-35% ou mais; c) incubação por 6-24h a temperatura elevada; d) prensagem ou centrifugação do óleo ou secagem até a obtenção de uma umidade residual inferior a 10% e extração do óleo ou uma combinação de prensagem e extração (conforme, por exemplo, Domínguez e outros, 1995, Food Chem. 54: 223-231; Domínguez e outros, 1994, Food Chem. 49, 271-286). Faz-se particular referência ao trabalho de Domínguez e outros, 1995, que foi realizado com soja. Eles fazem referência à importância de um maior teor de água na etapa de reação enzimática, assim como ao menor teor de água para a extração subsequente.

[0010] O documento J Am Oil Chem Soc 1993, 70 (9), 825-829 descreve de maneira esquemática o uso de um tratamento enzimático antes da prensagem das sementes oleaginosas, assim como a influência deste tratamento enzimático sobre a qualidade do óleo assim obtido, sem mencionar o equilíbrio energético do método. O tratamento enzimático é, assim, realizado a um teor de umidade de 30% e a 50°C por seis horas. As sementes assim tratadas são secadas até atingir um teor de umidade de 6% antes da prensagem.

[0011] Apenas com o uso de um alto teor de água durante a reação enzimática, celulases, hemicelulases, proteases ou misturas enzimáticas de celulases, pectinases e proteases, dependendo da semente oleaginosa, se mostraram enzimas eficazes. Os objetivos do tratamento enzimático são o enfraquecimento e a decomposição parcial das paredes celulares (paredes celulares primária e secundária), assim como a

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 14/38

5/21 destruição do envelope membranoso ao redor do óleo. O uso de celulases, hemicelulases e pectinases é possível para o primeiro objetivo; o uso de proteases para a hidrólise das oleosinas é possível para o segundo. O objetivo do tratamento enzimático é o enfraquecimento das paredes celulares e das membranas envolvendo o óleo de maneira a facilitar a sua recuperação.

[0012] Esse métodos são muito demorados e exigem muita energia, particularmente para reduzir o alto teor de água necessário para a reação enzimática antes das etapas de processamento ou de extração. O espaço que tem que ser disponibilizado para a incubação também é muito grande caso seja baseado na produção média diária de um moinho de óleo de 200-1.000 t de óleo recuperado por dia.

[0013] Assim, há necessidade de métodos aperfeiçoados para a recuperação do óleo de sementes de plantas nos quais as desvantagens da técnica mais atual descritas acima não ocorram.

[0014] É, portanto, objetivo da presente invenção proporcionar um método aperfeiçoado para a recuperação do óleo de sementes de plantas. O método não apresentará as desvantagens da técnica mais atual mencionadas acima. Particularmente, um método que resulta em alto rendimento de óleo assim como em um baixo teor de fosfatídeos e de umidade no óleo será proporcionado de acordo com a invenção. Além disso, o método é para ser aplicado em uma forma de economia de energia e economia de tempo e é para resultar em elevados rendimentos do óleo. Além disso, deve ser possível usar o método universalmente, isto é, deve ser apropriado, por exemplo, para a recuperação de óleo, por exemplo, para a produção de biodiesel e também para a recuperação de óleo comestível. Ademais, deve ser possível administrar este método de maneira simples e com boa relação custo-benefício e ele deve ser apropriado para uma ampla variedade de sementes oleaginosas.

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 15/38

6/21 [0015] Descobriu-se, surpreendentemente, que borrifando-se enzimas sobre as sementes oleaginosas secas pode-se obter um método para a recuperação de óleo de sementes de plantas acompanhado por uma maior produção de óleo, de um menor tempo de prensagem e de um teor menor de fosfatídeos em comparação com os óleos de prensagens convencionais. Ademais, o teor de umidade da semente oleaginosa não é significativamente aumentado em qualquer etapa de processamento pelo método de acordo com a invenção.

[0016] Dessa maneira, a invenção se refere a um método para a recuperação de óleo de sementes oleaginosas que é caracterizado pelos fatos de: a) uma solução aquosa contendo uma ou mais enzimas celulolíticas e/ou lipolíticas e/ou pectinolíticas e/ou proteolíticas e/ou fitase ser borrifada sobre as sementes; b) as sementes assim obtidas são diretamente enviadas para prensagem de etapa única ou de etapas múltiplas de uma maneira por si mesma conhecida, opcionalmente conjugada com uma extração e c) o óleo é recuperado de uma maneira conhecida por si mesma e, opcionalmente, sofre processamento posterior. [0017] A invenção também se refere ao uso deste método na produção de óleo comestível e na recuperação de óleo, por exemplo, para a produção de biodiesel.

[0018] No método de acordo com a invenção, a solução enzimática é aplicada diretamente às sementes ou, no caso de sementes maiores, às sementes amassadas ou trituradas sem que o teor de água natural da semente oleaginosa seja com isso significativamente aumentado. A surpreendente descoberta foi feita de que a solução enzimática pode ser diretamente borrifada sobre as sementes secas sem haver necessidade de uma incubação das sementes sobre as quais a enzima foi pulverizada. A solução enzimática pode ser borrifada sobre as sementes como tais ou após a moagem. Uma solução aquosa contendo a enzima ou enzimas selecionadas é, portanto, borrifada sobre as sementes de

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 16/38

7/21 uma maneira por si conhecida. A solução enzimática aquosa pode ser uma solução enzimática recuperada do sobrenadante da cultura de micro-organismos de uma maneira por si conhecida (por exemplo, consistindo nas seguintes etapas: separação da biomassa do líquido da cultura, concentração da solução obtida por ultrafiltração e filtração por desinfecção o que pode também compreender agentes estabilizantes. Entretanto, enzimas de plantas tais como, por exemplo, a papaína, podem também estar contidas na solução enzimática. A quantidade de solução enzimática normalmente aplicada é da ordem de 1.000 ppm com base no peso das sementes oleaginosas. A água aplicada pelo borrifo da solução enzimática aumenta o teor de água natural das sementes (4-8% p/p) apenas em cerca de 0,1 até no máximo 2% (p/p) com base na massa das sementes. As sementes preparadas dessa maneira podem então ser diretamente enviadas para prensagem sem um período posterior de incubação e sem necessidade adicional de água e o óleo pode então ser recuperado. Em contraste com os métodos conhecidos da técnica atual, que usam grandes quantidades de água, por exemplo, para evitar a inibição das enzimas pelo produto ou para aumentar a difusão das enzimas para os substratos, no método de acordo com a invenção é suficiente usar o teor de água natural de semente oleaginosa. As enzimas provocam uma alteração das paredes celulares mediante que melhora, por sua vez, o fluxo do óleo durante a prensagem. Neste caso, não é necessária a degradação completa das paredes celulares pelas celulases, hemicelulases ou pectinases. As proteases dão apoio à destruição da membrana contendo proteína que circunda o corpo oleaginoso. A fitase dá apoio à redução das interações das proteínas via pontes de ácido fítico, particularmente no que diz respeito a sementes ricas em ácido fítico, tais como a soja, e, assim, à melhoria do fluxo de óleo na prensagem. O procedimento de prensagem também é aperfeiPetição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 17/38

8/21 çoado pelo baixo teor de água, uma vez que ele contribui para a progressão do bagaço na prensa e pelo fato de que não se consegue pressão de prensagem sobre as sementes e o bagaço, devido a grandes quantidades de água.

[0019] Uma vez que a temperatura pode se elevar intensamente durante a prensagem, às vezes acima de 100°C no bagaço, dependendo da pressão de prensagem, enzimas termoestáveis devem ser preferencialmente usadas no método. O uso de enzimas mesofílicas e/ou termotolerantes também é, contudo, possível. De acordo com a invenção, uma ou mais enzimas são usadas que são capazes de lisar paredes celulares ou membranas celulares de células vegetais ou de perfurá-las pelo menos parcialmente ou de afrouxar a membrana das oleosinas. Enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas, lipolíticas, pectinolíticas e/ou proteolíticas são particularmente usadas. Essas enzimas podem ser usadas individualmente ou também em combinação, dependendo da composição das sementes por exemplo, adição de proteases a sementes ricas em proteínas, tais como a soja, é razoável. A adição de enzimas hemicelulolíticas e pectinolíticas é mais razoável no caso de sementes que contêm uma maior quantidade dessas substâncias de armazenamento nas paredes celulares, uma vez que o uso de celulases apenas não causaria um efeito suficiente de afrouxamento ou perfuração da parede celular. O uso de pectinases que atacam a protopectina das lamelas intermediárias pode resultar em uma melhor formação de pasta para a prensagem e, dessa maneira, em uma liberação melhor de óleo. O uso de galactomananases pode ser vantajoso, por exemplo, no que diz respeito à soja. Essas enzimas existem em diferentes quantidades em produtos de pectinase comercialmente disponíveis. A enzima é particularmente selecionada dentre celulases, endoglicanases, celobiohidrolases, hemicelulases, peptidases, fosfolipases, pectionases ou fiPetição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 18/38

9/21 tases de produção natural ou recombinante. Além disso, variantes derivadas das enzimas acima podem ser usadas como, por exemplo, enzimas recombinantes produzidas com base nas enzimas acima e que contêm partes delas e têm sua atividade modificada pela adição ou remoção de sítios de ligação de substrato. As enzimas respectivas podem ser comercialmente disponíveis ou podem ser produzidas por uma pessoa versada na técnica. As enzimas podem ser usadas individualmente ou em combinação.

[0020] O tipo e a quantidade da enzima utilizada dependem em grande medida, portanto, do tipo e da quantidade das sementes a serem tratadas. Com base nos presentes produtos de sementes, as dosagens geralmente ficam entre 100 e 20.000 ppm (p/p), mais preferivelmente entre 200 e 15.000 ppm (p/p) e, ainda mais preferivelmente, entre 500 e 10.000 ppm (p/p). A dose pode ser maior no caso de enzimas mesofílicas de maneira a compensar a perda devida à desativação térmica ou à baixa atividade residual a altas temperaturas durante a prensagem. [0021] A prensagem pode ocorrer em etapa única ou em etapas múltiplas. No caso de prensagem múltiplas, a adição das enzimas também é possível entre as etapas de prensagem individuais. A prensagem pode ser seguida de uma etapa de extração sem que o material de prensagem (grãos para moagem) precise ter o seu teor de água reduzido. Os métodos para realizar uma prensagem de óleo são conhecidos daqueles versados na técnica. Após a prensagem, o óleo sofre processamento posterior de uma maneira conhecida por si mesma.

[0022] O método de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo processamento de maior quantidade de sementes por unidade temporal, assim como por uma prensagem com melhor desempenho e rendimento e por um menor teor de fosfolipídios ou de fosfatideos no óleo. Devido ao maior rendimento e à taxa de prensagem mais alta, a exigência de energia por t de óleo recuperada também diminui. Uma

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 19/38

10/21 vez que o teor de água é aumentado apenas de maneira insignificante pela adição da solução enzimática sobre as sementes secas, o método não exige secagem prévia caso agentes de extração sejam utilizados e, assim, claramente apresenta exigência energética mais baixa em comparação com os métodos enzimáticos desenvolvidos até hoje, que compreendem em sua totalidade etapas para a redução do teor de água de >25% para menos de 10% de maneira a não diminuir o rendimento durante a extração.

[0023] Ademais, o método de acordo com a presente invenção apresenta a vantagem de que o óleo recuperado tem um teor de fosfatídeos claramente reduzido em comparação com os métodos convencionais e, assim, a degomagem — isto é, a redução do teor de fosfatídeos — pode ser limitada a pequenas quantidades do óleo recuperado, por exemplo, em métodos de prensagem de múltiplas etapas.

[0024] O método de acordo com a invenção é muito adequado para a recuperação de óleo para a produção de óleo comestível ou biodiesel. [0025] A figura incluída explica a invenção em maior detalhe:

[0026] A figura 1 mostra a redução do tempo de prensagem pelo uso da celulase do Melanocarpus com um domínio de ligação para a CBH1 do Tríchodema reesei (representação de medições repetidas 3 vezes).

[0027] O método de acordo com a invenção pode geralmente ser realizado com qualquer uma das enzimas mencionadas acima.

[0028] As celulases, particularmente as endoglicanases, do Acremonium thermophilum, que pertencem à família de hidrolases 45 (para a classificação, vide http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/GH intro.html), celulases, particularmente endoglicanases, do Melanocarpus albomyces (família de hidrolases 45), ligadas a um domínio de ligação a celulases (CBD) da CBH1 do Trichoderma reesei, ou celulases, particularmente celobio-hidrolases, do Thermoascus aurantiacus (família de hidrolases

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 20/38

11/21

7), conectadas a um domínio de ligação de celulases (CBD) da CBH1 do Trichoderma reesei, endoglicanase II do Trichoderma reesei e betaglicosidase do Chaetomium thermophilium, demonstraram ser as enzimas preferidas. As hemicelulases preferidas são a xilanase II do Trichoderma reesei, xilanases xlnA da Actinomadura flexuosa e xilanase xylA do Chaetomium thermophilum. As pectinases preferidas são as pectinases do Aspergillus niger e do Trichoderma reesei. As fosfolipases preferidas são as fosfolipases de tipo C e/ou as fosfolipases de tipo A ou B, tais como, por exemplo, as fosfolipases do Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus ou Thermomyces lanuginosus. As fitases preferidas são a fitases da Aspergillus niger, E. coli, Peniophora lysii ou variantes derivadas das mesmas, tais como a Nov9X ou a fitase de consenso do Aspergillus.

[0029] Os exemplos abaixo explicam a invenção em maior detalhe. Exemplo de referência 1: determinação da atividade da celulase neutra [0030] A atividade da endo-1,4-p-glicanase é determinada pela hidrólise do substrato carboximetilcelulose a pH 7,5, 50°C e com um tempo de incubação de 10 min. A quantidade de açucares reduzidos liberada é medida com base na glicose após a reação com ácido dinitrossalicílico mediante detecção fotométrica do complexo de cor desenvolvido a 540 nm. Uma unidade NCU é definida como o equivalente que corresponde à liberação de um nanomol de glicose por segundo.

[0031] 1,8 ml de solução de substrato (CMC a 3% [Sigma C-56778, baixa viscosidade] em 10 mM de tampão HEPES pH 7,0 [Sigma H-3375] são misturados por 5 min a 50°C e então 200 pl de solução enzimática diluída são adicionados e incubados por 10 min. Então, 3 ml de solução reagente DNS (10 g l^-1 de ácido salicílico dissódico [Sigma D-0550], 16 g l^-1 de NaOH 300 g l^-1 de tartarato de K-Na [Merck 8087] são adicionados e incubados em banho com água fervente por 5 min. As medições

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 21/38

12/21 da absorção são realizadas contra um valor de branco de reação tratada igualmente usando-se água em vez de solução enzimática.

Exemplo de referência 2: determinação da atividade das celulases acídicas termoestáveis [0032] O método deriva do método do exemplo de referência 1 e usa uma temperatura de incubação de 60°C em vez de 50°C. A segunda variação diz respeito ao tampão. O tampão HEPES é substituído por um tampão de 10 mM de citrato, pH 4,8. A unidade da atividade enzimática é CMU g^-1.

Exemplo de referência 3: determinação da atividade da celobio-hidrolase [0033] A celobio-hidrolase (CBHI) e a endoglicanase (EGI) hidrolisam o substrato 4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo e, assim, libera 4-metilumbeliferona (7-hidróxi-4-metilcoumarina). Essa reação pode ser observada fotometricamente medindo-se a absorção da 4-metilumbeliferona em condições alcalinas a 370 nm. A atividade da β-glicosidase da amostra é inibida por 100 mM de glicose na mistura da reação. Uma unidade de PCU é definida como a quantidade de atividade enzimática que libera um nmol de 4-metilumbeliferon para 4-metilumbeliferil-e-Dlactosídeo por segundo (1 PCU = 1 nkat) sob as condições experimentais (pH 5,0, 50°C, tempo de incubação de 10 min).

[0034] A quantidade de endoglicanase presente pode ser medida individualmente mediante a adição de 5 mM de celobiose ao lote de reação, sendo que a reação da celobio-hidrolase é inibida pela 4-metilumbeliferil-e-D-lactosídeo.

[0035] 250 pl de solução de substrato (1 mM de 4-metilumbeliferilβ-D-lactosídeo [Sigma M-2405]) em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,0, e 50 pl de solução de glicose a 1M em 50 mM de tampão de acetato de sódio são misturados a 50°C por 10 min. Após a adição

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 22/38

13/21 de 200 μΙ de solução enzimática diluída, procede-se a mistura e incubação por 10 min a 50°C. Então, 1 ml de solução de carbonato de sódio a 1M é adicionado para interromper a reação enzimática e a absorção é medida contra um valor nulo tratado da mesma forma a 370 nm usando-se água em vez de solução enzimática.

[0036] 7-hidróxi-4-metilcoumarina [Aldrich 12,872-4] dissolvida em carbonato de sódio a 1 M é usada para calibração.

Exemplo de referência 4: determinação da atividade da β-glicosidase [0037] A β-glicosidase hidrolisa o substrato 4-nitrofenil-e-d-glicopiranosídeo em 4-nitrofenol e glicose. A reação é interrompida pela adição de álcali e o 4-nitrofenol, que com isso se torna amarelo, é detectado fotometricamente.

[0038] Uma unidade BGU é definida como o equivalente à liberação de um nanomol de 1-nitrofenol por segundo.

[0039] 1,8 ml de solução de substrato (1 mM de 4-nitrofenil-e-D-glicopiranosídeo [Merck 6793] em 50 mM de tampão de citrato [Merck 6448], pH 4,8) são misturados a 50°C por 5 min. Então, 200 pl de solução enzimática diluída são adicionados e incubados por 10 min a 50°C. Após 10 min, 1 ml de solução de Na2CÜ3 a 1 M é acrescentado e a absorção é medida contra um valor nulo de reação tratado da mesma forma a 400 nm usando-se água em vez de solução enzimática.

[0040] A curva de calibração é preparada com 4-nitrofenol [Sigma 104-8].

Exemplo de referência 5: determinação do teor de fosfatídeos do óleo [0041] O teor de fosfatídeos (também chamado teor de fosfolipídios) é expressado como ppm de fósforo no óleo. Após a incineração, ele é fotometricamente determinado a 830 nm quando óxido de magnésio é adicionado como complexo de fosfomolibdato a 850°C. K2HPO4 é usado

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 23/38

14/21 para calibração.

[0042] O teor de fosfatídeos pode também ser determinado mediante fotometria de chama diretamente no óleo por meio de um dispositivo AAS.

[0043] O teor de fosfatídeos no óleo de semente de colza integral dos exemplos 1 a 3, que foi extraído com n-hexano correspondendo ao método do exemplo de referência 6, foi de cerca de 93 ppm P. Exemplo de referência 6: determinação do conteúdo do óleo pelo método Soxhlet [0044] 15g de sementes de colza moídas ou 20-25 g de grãos prontos para moagem esmagados da extração são introduzidos em um dedal de extração [número de referência Sartorius FT-1210-033080] e extraídos com n-hexano de alto teor de pureza (Merck) por 4 h em um aparelho Soxhlet. A quantidade de óleo recuperado é pesada a vácuo após a evaporação do solvente.

[0045] A semente de colza dos exemplos 1 a 3 contém 41% de óleo. Exemplo de referência 7: determinação da cor do óleo [0046] O óleo recuperado pela prensagem ou pela extração de uma semente oleaginosa é centrifugado a 12.000 x g por 5 min para separação das partículas suspensas e então a cor é determinada em uma cuveta de 1 cm a 508 nm contra água no fotômetro.

[0047] O óleo total extraído com hexano de acordo com o exemplo de referência 6 da semente de colza moída em um moinho de impacto dos exemplos 1 e 3 tinha uma absorção de 1,2 AU e, assim, uma cor básica mais forte.

Exemplo 1: uso de enzimas para aumentar a taxa de prensagem Experimento 1:

[0048] Uma endoglicanase do Acremonium thermophilum produzida por recombinação com Trichoderma reesei com um peso molecular de cerca de 28,6 kDa e com uma temperatura ótima de cerca de 75°CPetição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 24/38

15/21

80°C foi usada no seguinte experimento tal como descrito, por exemplo, em Fl 20051318. A solução enzimática (endoglicanase), um concentrado esterilmente filtrado por ultrafiltração com uma massa seca de cerca de 15%, foi finamente nebulizada e borrifada nas sementes de colza preta da empresa DKSH, Holanda, colheita de 2005, usando-se um cilindro bico pulverizador (0,1% p/p) e a semente de colza foi então misturada por 30 s. A dosagem de endoglicanase foi de 64.400 CMC por kg de semente de colza. A colza assim preparada foi submetida a prensagem de etapa única em um prensa de óleo, por exemplo, do tipo Õlprinz da empresa Kernkraft (www.oelpresse.de), Alemanha. A prensa funcionava com uma velocidade de 25 upm e estava equipada com uma cabeça de compressão com abertura de 12 mm e ajustada para uma folga de 1,5 mm. O tempo de permanência da colza na cabeça de prensagem foi de cerca de 1-2 min. Um termossensor com um dispositivo de medição acoplado da companhia Roth foi inserido na cabeça de prensagem para determinar a temperatura da mesma. O óleo foi coletado em uma tigela de vidro em uma balança e a quantidade e a taxa de prensagem assim como a temperatura do óleo foram determinados. O bagaço foi então recolhido em outra tigela colocada em uma balança separada e foi então esmagado em um moinho de café com um mecanismo de martelo para determinação do teor de óleo residual por extração, de acordo com o exemplo de referência 6.

[0049] O efeito da endoglicanase do Acremonium sobre a taxa de prensagem está representado na figura 1. O experimento foi repetido três vezes com e sem a adição da enzima. Usou-se sempre a mesma quantidade de semente de colza, de maneira que a quantidade de óleo prensado obtido foi de cerca de 600 g em cada. Como representado na figura 1, há uma reprodutibilidade muito alta no intervalo de prensagem utilizado de cerca de 22 min. Não há variações significativas entre as

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 25/38

16/21 repetições individuais da medição. O aumento da capacidade de produção da colza pelo moinho de óleo e, assim, uma redução do tempo de prensagem para se obter um rendimento de óleo constante foi conseguido em todas as três rodadas. A melhoria do desempenho de prensagem do moinho de óleo resultou em um aumento do óleo obtido de 6,6% por hora.

[0050] Os teores de fosfatídeo no óleo prensado foram muito baixos a 6,5-8 ppm P e permitem um processamento posterior direto do óleo na indústria de óleos comestíveis e também na produção de biodiesel. Os valores dos teores de fosfatídeos ficaram 5%-10% abaixo dos da prensagem sem a adição da enzima. Isso era de se esperar no que se refere aos teores de fosfatídeos absolutamente baixos.

[0051] A temperatura da cabeça de compressão sem a adição da enzima foi em média de 77,0°C em todos as três medições, enquanto que com a utilização de endoglicanase a temperatura no valor médio cresceu apenas até valores de 75,4°C em todas as três medições a despeito da maior produção de colza por unidade temporal e, portanto, da fricção potencialmente maior na cabeça de prensagem. Isso demonstra de maneira clara que houve um processamento mais eficiente e mais gentil para com o óleo com a adição das enzimas.

[0052] Com a adição de enzimas, a cor do óleo prensado melhorou de uma absorção na média de 0,801 AU para 0,776 AU. Esses valores são claramente melhores do que a cor do óleo de semente de colza simplesmente extraído com hexano de 1,2 AU e, portanto, permitem uma redução do uso de agentes alvejantes/bentonita no processamento posterior em óleo comestível e menor gasto de dinheiro.

Experimento 2 [0053] Neste experimento, uma celobio-hidrolase do Thermoascus aurantiacus, que carrega o domínio de ligação à celulose CBH1 da Trichodema reesei na extremidade C-terminal (por exemplo, produzida de

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 26/38

17/21 acordo com WO 2006/117432 A1), foi usada em uma dosagem de 180 PCU por kg de semente de colza tendo a mesma estrutura experimental. A celobio-hidrolase tem um peso molecular de cerca de 46,2 kDa e o reticulador CBH1 e o domínio de ligação CBH1 acoplados têm um peso molecular de cerca 6,8 kDa. A enzima tem uma temperatura ótima de cerca de 65°C. Assim como na celulase do experimento 1, um aumento da capacidade de produção e, assim, na quantidade de óleo por unidade temporal que foi 10,8% mais alto pode ser obtido.

Experimento 3 [0054] Outras enzimas mesofílicas além daquelas usadas nos experimentos 1 e 2 ou 2, tais como a endoglicanase I da Trichodema reesei com uma temperatura ótima de cerca de 50°C (por exemplo, como descrito em EP 0 137 280 A1) poderia também contribuir para um menor tempo de prensagem relativo em dosagens maiores e, assim, a um aumento da capacidade de produção. Em uma dosagem de 376.000 BU por kg de semente de colza pôde ser obtido um aumento da capacidade de produção de 2,1% e a uma dosagem de 752.000 BU por kg de semente de colza pôde ser obtido um aumento de 6,3% da capacidade de produção.

Exemplo 2: uso de misturas enzimáticas para aumentar a taxa de prensagem e para melhorar o rendimento do óleo processado [0055] Outra enzima que não a do exemplo 1 foi usada nos experimentos, mais especificamente uma celulase neutra recombinante produzida com a Trichodema reesei a partir do Melanocarpus albomyces, que compreende um domínio de ligação de celulose CH1 da Trichoderma reesei, como descrito em WO 2006/117432 A1, assim como a endoglicanase recombinante produzida com a Trichodema reesei a partir do Acremonium do exemplo 1, experimento 1. A celulase do Melanocarpus tem um peso molecular de cerca de 20,2 kDa e o reticulador acoplado com o CBD da celobio-hidrolase 1 da Trichodema reesei tem

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 27/38

18/21 um peso molecular de cerca de 6,8 kDa. A enzima tem uma temperatura ótima de cerca de 75°C. As dosagens foram de 64.400 CMC por kg de semente de colza para a endoglicanase do Acremonium e de 130.000 NCU por kg de semente de colza para a celulase neutra do Melanocarpus. As quantidades de solução enzimática borrifada tinham cada uma 0,1% (p/p) com base na massa da semente de colza. As soluções enzimáticas eram filtrados por ultrafiltrações estéreis com uma massa seca de cerca de 15% (p/p). A estrutura experimental foi a mesma que no exemplo 1, com a exceção de que a abertura do bico foi de apenas 10 mm em vez de 12 mm. Melhores resultados de prensagem podem assim ser obtidos. A mesma colza (mesmo carregamento) que a do exemplo 1 foi utilizada, de maneira que os resultados são diretamente comparáveis. Os resultados estão representados na tabela 1.

TABELA 1: uso de celulase ou endoglicanase para a melhoria do rendimento do óleo em uma prensagem de colza e para a redução do tempo de prensagem para obtenção da mesma quantidade de óleo. Na água do lote foi usada a mesma quantidade de água (0,1% (p/p) com base na massa de semente de colza) como aplicada nas soluções enzimáticas.

enzima	Temperatura da cabeça de compressão [°C]	Tempo de prensagem relativo * [%]	Rendimento do óleo [%] **	Teor de óleo residual no bagaço [%]	Teor de fosfatídeos no óleo prensado [ppm P]
Nenhuma	83,0	100,0	34,7	16,6	11
Somente água	86,5	100,2	34,5	16,4	14
Endoglica- nase	82,5	86,9	35,3	16,1	9
Celulase neutra	81,8	85,4	35,1	16,1	8

* O tempo de prensagem relativo é o tempo necessário para obter a mesma quantidade de óleo.

** O rendimento do óleo indica o rendimento de óleo absoluto obtido da

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 28/38

19/21 semente de colza independentemente do tempo total do procedimento de prensagem.

[0056] Como os resultados mostram, o rendimento do óleo na prensagem pode ser aumentado por meio das enzimas correspondentes se os parâmetros de prensagem forem corretamente selecionados, particularmente no que se refere à seleção das aberturas dos bicos da prensa. A vantagem desse óleo é o baixo teor de fosfatídeos, que permite processamento posterior direto sem degomagem. Isso também se aplica a despeito de a temperatura de prensagem ser cerca de 10°C mais alta em comparação com as condições no experimento do exemplo 1. O aumento da temperatura é causado pelo estreitamento do diâmetro da abertura da prensa e pela maior pressão daí resultante.

[0057] No valor nulo e no experimento com água no lugar da enzima, que foi realizado para fins de comparação, o teor de fosfatídeos no óleo prensado em comparação com as condições com bico maior (exemplo 4) aumentaram, como esperado, de 8 para 14 ppm P e se encontra, assim, acima do valor-limite aplicável para óleos comestíveis e na margem do teor permitido para a produção de biodiesel. Contudo, os teores de fosfatídeos no óleo prensado com a adição de enzima, assim como no exemplo 4, ficaram em um nível baixo de apenas 8-9 ppm P. Portanto, a adição de enzimas também tem efeitos positivos na redução dos teores de fosfatídeos no óleo prensado em comparação com o óleo obtido sem a adição da enzimas. Isso permite o processamento posterior do óleo assim recuperado em óleo comestível e em biodiesel sem degomagem.

[0058] Ademais, o tempo necessário para se obter a mesma quantidade de óleo prensado (tempo de prensagem relativo) poderia claramente ser reduzido mais uma vez e, dessa maneira, a capacidade de produção dos moinhos de óleo poderia ser elevado. Os tempos de funPetição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 29/38

20/21 cionamento relativos ou tempos de prensagem foram não apenas reduzidos em 6%, mas foram até mesmo reduzidos em até 14,6%.

[0059] Resultados similares foram alcançados também por uma beta-glicanase recombinante produzida com a T. reesei a partir do Chaetomium thermophilum com um peso molecular de cerca de 76,4 kDa e uma temperatura ótima de 65°C, produzida como descrito em FI20051318, por exemplo. A dosagem foi de 17.840 BGUs por kg de semente de colza. Não apenas o rendimento espaço-tempo (óleo obtido por dispositivo, kg de semente de colza e unidade temporal) aumentou em 3%, mas também o rendimento de óleo absoluto por prensagem aumentou em um total de 2%.

Exemplo 3: efeito do uso de enzima sobre o teor de fosfatídeos no extrato de óleo residual [0060] Nos experimentos dos exemplos 1 e 2, o bagaço coletado foi homogeneizado e esmagado. O óleo que ainda estava contido no bagaço, também chamado óleo residual, foi extraído de porções de alíquotas do bagaço esmagado de acordo com o exemplo de referência 6 e o teor de fosfatídeos do mesmo foi determinado de acordo com o exemplo de referência 5. Os resultados estão resumidos na tabela a seguir.

TABELA 2: determinação do teor de fosfatídeos do óleo residual extraído do bagaço

enzima	Quantidade de óleo prensado * no óleo total ** [%]	Teor de fosfatí- deos no óleo prensado [ppm P]	Teor de fosfatídeos no óleo extraído [ppm P]
Apenas extração *	n.a.	n.a.	85-99
Nenhuma **	83,7	9	73,6
Endoglicanase	83,6	8	70,5

* Neste lote, a semente de colza foi apenas esmagada e então diretamente extraída com n-hexano sem prensagem prévia.

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 30/38

21/21 ** Neste lote não houve adição de enzima e a semente de colza foi prensada diretamente.

*** Óleo prensado: óleo obtido por prensagem.

**** Óleo total: quantidade de óleo obtida por extração da semente de colza desintegrada. n. a.: não se aplica [0061] Como os resultados acima demonstram, a liberação dos fosfatídeos residuais é intensamente inibida na extração do óleo residual remanescente do bagaço (óleo total menos óleo prensado; cerca de 1617% do óleo total) pelo uso de enzimas. Caso o óleo completo seja extraído, cerca de 3,5 a 4,0 mg P de fosfolipídios também são extraídos (quantidade total de óleo * teor de fosfolipídios do óleo obtido por extração). O óleo prensado contém apenas 0,274 a 0,309 mg P (óleo prensado * teor de fosfatídeos do óleo prensado) e o óleo residual extraído subsequentemente mais uma vez 0,474 a 0,492 mg P (óleo residual * teor de fosfatídeos no óleo residual). Assim, 2,7 a 3,3 mg P de fosfolipídios permanecem no bagaço pelo uso de enzimas após extração em seguida à prensagem, o que corresponde a mais de 3/4 a 4/5 dos fosfolipídios totais da colza que são obtidos apenas por extração. Dessa maneira, aqui o uso de enzimas também resulta em uma melhoria do óleo residual extraído pela redução do teor de fosfolipídios em comparação com a extração sozinha e, assim, em uma redução do trabalho de degomagem a ser realizado subsequentemente.

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 31/38

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para recuperar óleo de sementes de plantas, caracterizado pelo fato de que

a) uma solução aquosa contendo uma ou mais enzimas celulolíticas e/ou lipolíticas e/ou pectinolíticas e/ou proteolíticas e/ou fitase é borrifada sobre a semente seca;

b) a semente assim obtida é diretamente enviada sem um período posterior de incubação e sem a adição posterior de água para uma prensagem de estágio único ou de múltiplos estágios de uma maneira por si conhecida, opcionalmente acompanhada de uma extração, e

c) o óleo é recuperado de uma maneira por si conhecida e opcionalmente submetido a processamento posterior, em que a água aplicada pelo borrifo da solução enzimática aumenta o teor de água natural das sementes por cerca de 0,1 até no máximo 2% (p/p) com base na massa das sementes.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada entre celulases, endoglicanases, celobio-hidrolases, hemicelulases, pectinases, fosfolipases, proteases ou fitases naturais ou recombinantes.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada entre as endoglicanases do Acremonium thermophilium, as endoglicanases do Melanocarpus albomyces, opcionalmente conectadas com um domínio de ligação de celulase de CBH1 da Trichoderma reesei, celobio-hidrolases do Thermoascus aurantiacus, opcionalmente ligadas com um domínio de ligação de celulase de CBH1 da Trichoderma reesei, endoglicanase II da Trichoderma reesei e beta-glicosidase do Chaetomium thermophilum, xilanase II da Trichoderma reesei, xilanase xlnA da Actinomadura flexuose, xilanase xylA do Chaetomium thermophilum, pectinases do Aspergillus

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 32/38

2/2 niger e Trichoderma reesei, fosfolipases tipo A, tipo B ou tipo C do Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus ou Thermomyces lanuginosus.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a semente é descascada e/ou triturada antes de ser borrifada com a enzima.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a enzima é adicionalmente borrifada sobre as sementes já prensadas entre as prensagens individuais.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma etapa de extração é realizada após a prensagem.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as sementes de plantas são selecionadas dentre sementes oleaginosas.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as sementes oleaginosas são selecionadas entre soja, amendoim, sementes de algodão, semente de girassol, germe de trigo e sementes de colza.
9. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na produção de óleo comestível.
10. Uso do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na produção de biodiesel.

Petição 870180036976, de 04/05/2018, pág. 33/38

1/1

Influência da celulase sobre o tempo de prensagem o

Ό ro w

c

Φ ίΟ.

o _φ ‘O

Φ

D

Φ

Ό ro '4—1 c

ro =3 σ

—·<— com celulase, medição 1 —-γ— com celulase, medição 2 —-W— com celulase, medição 3 sem enzimas, medição 1 sem enzimas, medição 2 -g— sem enzimas, medição 3