BRPI0801480A2 - método para detectar cada um dentre uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos, método multiplex para detectar uma pluralidade de dnas alvos, e, composição - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DETECTAR CADA UM DENTRE UMA PLURALIDADE DE áCIDOS NUCLEICOS ALVOS, MéTODO MULTIPLEX PARA DETECTAR UMA PLURALIDADE DE DNAS ALVOS, E, COMPOSIçãO. Captura de híbrido específico do alvo (TSHC) provê um método de detecção de ácido nucleico que não é somente rápido e sensível, mas é também altamente especifico e capaz de discriminar seqUências de ácido nucleico altamente homólogas. O método produz híbridos DNA: RNA que podem ser detectados por vários métodos.

Description

"MÉTODO PARA DETECTAR CADA UM DENTRE UMAPLURALIDADE DE ÁCIDOS NUCLEICOS ALVOS, MÉTODOMULTIPLEX PARA DETECTAR UMA PLURALIDADE DE DNAS ALVOS, E, COMPOSIÇÃO"

Este pedido é um pedido em continuação em parte do sob 35U.S.C. parágrafo 120 de pedido de patente US no. de série 11/005 617,depositado em 6 de dezembro de 2004, intitulado "Detection of NucleicAcides by Target Specific Hybrid Capture Method", que é uma continuaçãoem parte do pedido de patente US no. de série 10/971 251, depositado em 20de outubro de 2004, agora abandonado, que é uma continuação em parte dopedido de patente US no. de série 09/ 594 839, depositado em 15 de junho de200, todos sendo aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao campo de métodos de detecção deácidos nucleicos geralmente e mais particularmente refere-se à detecção deácidos nucleicos por método de captura de híbrido específico do alvo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A detecção de seqüências de ácido nucleico específicaspresentes em uma amostra biológica é importante para a identificação eclassificação de microorganismos, diagnóstico de doenças infecciosas,detecção e caracterização de anormalidades genéticas, identificação demudanças genéticas associadas com câncer, estudo da susceptibilidadegenética a doença, e medida da reposta aos vários tipos de tratamento. Astécnicas comuns para detectar e quantificar seqüências de ácido nucleicoespecíficas são hibridização de ácido nucleico e amplificação do alvo.

Vários métodos de hibridização são disponíveis para adetecção e estudo de ácidos nucleicos. Em um método de hibridizaçãotradicional, os ácidos nucleicos a serem identificados estão ou em solução oufixados em um suporte sólido. Os ácidos nucleicos são detectados usandosondas de ácido nucleico rotuladas que são capazes de hibridizar nos ácidosnucleicos. Recentemente, novos métodos de hibridização foramdesenvolvidos para aumentar a sensibilidade e especificidade de detecção.Um exemplo é o método de Hybrid Capture ® descrito no pedido US no. desérie 07/792 585 e patente US 6 228 578. Apesar de novos métodos dehibridização oferecerem melhoras significantes sobre os métodos tradicionais,eles ainda faltam a capacidade de descriminar completamente entreseqüências de ácido nucleico altamente homólogas.

A reação de cadeia polimerase (PCR) é o método deamplificação de ácido nucleico alvo mais comumente usado. No entanto, PCRé limitado em alguma extensão quando um grande número de diferentes alvosdevem ser amplificados simultaneamente, isto é, reações multiplex, quepodem causar não somente artefatos de PCR, como iniciadores-dímeros, mastambém a amplificação espúria de alvos. Em uma tentativa para superar estalimitação, os iniciadores de consenso podem ser usados quando um númerode alvos tem regiões homólogas. No entanto, a homologia entre espéciesnunca é de 100%, e como resultado, os iniciadores terão váriosdesalinhamentos com diferentes alvos, causando amplificação não uniforme.Quando quantidades diferentes de alvos estão presentes em uma amostra, aeficiência de amplificação de diferentes PCRs também varia, levando a umaamplificação não uniforme e não específica de diferentes alvos.

Assim, é um objeto da presente invenção prover um métodopara detectar seqüências de ácido nucleico alvo que não somente prove umaaumentada rapidez e sensibilidade, mas também que é altamente específico ecapaz de discriminar entre seqüências alvos de ácido nucleico altamentehomólogas e múltiplas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção prove um novo método de detecção deácido nucleico, referido aqui como HYBRID CAPTURE, específico do alvo("TSHC"). TSHC é um método rápido, altamente específico, e sensível dediscriminar entre e detectar seqüências alvos de ácido nucleico altamentehomólogas.

Uma forma de realização da invenção refere-se a um métodode detecção e/ou quantificação de um ou mais ácidos nucleicos alvos,compreendendo as etapas de enriquecer, amplificar e detectar o alvo para umadetecção rápida e sensível das seqüências de ácido nucleico alvo.

Em uma forma de realização do método reivindicado, um oumais ácidos nucleicos alvo são detectados por: captura dos ácidos nucleicosalvos em um suporte sólido misturando os ácidos nucleicos alvos, sondas deácido nucleico complementares aos ácidos nucleicos alvos, em que um é RNAe o outro é DNA, e um suporte sólido, remover os ácidos nucleicos alvos nãoligados e as sondas de ácido nucleico, amplificar os ácidos nucleicos alvoscapturados ou sondas de ácido nucleico, formar uma pluralidade deamplicons, em que a presença dos amplicons é indicativa da presença dosácidos nucleicos alvos, e detectar os ácidos nucleicos alvos por misturaçãodos ácidos nucleicos alvos com oligonucleotídeos selecionáveis edistinguíveis que hibridizam em uma porção dos ácidos nucleicos alvos, (istoé, sondas de seqüência de captura, CSPs), e sondas de ácido nucleicocomplementares a uma porção diferente dos ácidos nucleicos alvos, (isto é,sondas de seqüência de sinal, SSPs), em que ou a sonda ou o alvo é um RNAe o outro é um DNA, onde os híbridos DNA: RNA são detectados por agentesde ligação específicos dos híbridos DNA: RNA, que são diretamente ouindiretamente rotulados, assim detectando os ácidos nucleicos alvos. Os SSPsnão são limitados a servir como somente um meio para produzir um sinal paradetecção, mas podem ser usados na etapa de enriquecimento do alvo porhibridização do ácido nucleico alvo, permitindo a captura com um agente deligação específico dos híbridos DNA: RNA.

Em ainda outra forma de realização, uma pluralidade de ácidosnucleicos alvos são detectados por: hibridização de uma pluralidade de ácidosnucleicos alvos em sondas de ácido nucleico que são complementares aosácidos nucleicos alvos, formando híbridos DNA: RNA, captura dos híbridosDNA: RNA com anticorpos específicos dos híbridos DNA: RNA, conjugadosa suportes sólidos, remoção dos ácidos nucleicos alvos não ligados e sondasde ácido nucleico, amplificação dos ácidos nucleicos alvos capturados ousondas de ácido nucleico, formando uma pluralidade de amplicons, usandoiniciadores aleatórios e DNA polimerase, em que a presença da pluralidade deamplicons é indicativa da presença dos ácidos nucleicos alvos; hibridizaçãodas sondas de ácido nucleico complementares a uma porção das seqüências deácidos nucleicos alvos, formando híbridos DNA: RNA entre alvos e sondas;hibridização dos oligonucleotídeos conjugados a um suporte sólido em umaporção diferente ácidos nucleicos alvos, em que o suporte sólido éselecionável, seleção dos complexos de oligonucleotídeos, e detecção dapluralidade de ácidos nucleicos alvos por ligação dos agentes de ligaçãoespecíficos dos híbridos DNA: RNA para os híbridos DNA: RNA.

Em outra forma de realização, um ou mais DNAs sãodetectados por um método multiplex tendo as etapas de: hibridização de umapluralidade de DNAs alvos em sondas de RNA que são complementares aosDNAs alvos, formar híbridos DNA: RNA, captura dos híbridos DNA: RNAcom anticorpos específicos para híbridos DNA: RNA que são conjugados acontas, remover os ácidos nucleicos não ligadas e sondas de ácido nucleicopor lavagem dos ácidos nucleicos e sondas em excesso, amplificaçãoisotermicamente dos DNAs alvos usando iniciadores aleatórios e DNApolimerase, formar uma pluralidade de amplicons, hibridização de sondas deRNA complementares a uma porção dos DNAs alvos (isto é, SSPs), formaçãode híbridos DNA: RNA, hibridização de oligonucleotídeos de DNAespecíficos para uma porção diferente dos DNAs alvos, em que osoligonucleotídeos de DNA são conjugados a contas selecionáveis, e detecçãode pluralidade de DNAs alvos por ligação de anticorpos específicos parahíbridos DNA: RNA rotulados detectavelmente para os híbridos DNA: RNAe seleção do DNA alvo usando contas conjugadas a oligonucleotídeosselecionáveis (isto é, CSPs), em que os anticorpos específicos para híbridosDNA: RNA são rotulados de modo detectável e distinguível. A presença decada alvo é detectada pelo anticorpo DNA: RNA rotulado através de SSPsque forma híbridos DNA: RNA com o alvo, enquanto os vários alvos sãoseparados ou selecionados com base em conta conjugada a oligonucleotídeo(isto é CSP). A presença de amplicon e híbridos DNA: RNA é indicativa dapresença dos DNAs alvos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção prove um método para enriquecer, amplificar edetectar a presença de ácido nucleico ou uma pluralidade de ácidos nucleicosnas amostras de teste. Mais especificamente, a invenção prove um métodoaltamente específico e sensível que é capaz de discriminar entre e detectarseqüências de ácido nucleico altamente homólogas.

Uma forma de realização da invenção é dirigida a métodossensíveis, rápidos, para a detecção multiplex de seqüências de ácidosnucleicos alvos, em que uma pluralidade de diferentes seqüências de ácidonucleico alvo podem ser detectadas simultaneamente. Este método pode serautomatizado. O método essencialmente compreende três etapas:enriquecimento do alvo, amplificação do alvo, e detecção do alvo, queapresenta uma abordagem semiquantitativa ou qualitativa para diagnóstico deácido nucleico. Esta forma de realização da invenção pode ser realizada emformato multiplex detectando as seqüências de ácido nucleico alvo emamostras purificadas ou não purificadas, onde uma concentração do alvo podeser tão baixa como cerca de 50 cópias ou menos por mililitro de amostra acerca de 100 cópias do alvo, a tão alto como IO8 cópias por mililitro. Adetecção de patógenos individuais ou alvos em amostra biológica, como masnão limitado aos tipos HSV e HPV, pode ser realizada em multiplex,preferivelmente mas não limitado a 50 -plexes.

Como é benéfico, este método multiplex de detecção de umapluralidade de seqüências de ácidos nucleicos alvos é um métodorelativamente rápido, sensível e preciso, tendo dois níveis de especificidadeque é um aspecto vantajoso de testes clínicos. Os dois níveis de especificidadesão obtidos nas etapas de enriquecimento e de detecção do alvo usandoseqüências específicas para o alvo.

O enriquecimento do alvo é a primeira etapa que prepara aamostra para amplificação por separação de ácidos nucleicos não específicose contaminantes do alvo específico. A presença de seqüências de ácidonucleico não específicas ou indesejáveis diminui a sensibilidade deamplificação do alvo por interferência com amplificação e detecção. A etapado enriquecimento do alvo purifica a amostra de possíveis inibidores eelimina os ácidos nucleicos não específicos assim provendo o primeiro nívelde especificidade. A eliminação de ácidos nucleicos não específicos permiteuma amplificação eficiente na etapa de amplificação isotérmica e assimminimiza a competição entre alvos homólogos. O enriquecimento do alvotambém desnatura alvos de filamento duplo, criando DNA de filamento únicopara uma amplificação eficiente. Vários reagentes pode ser usados na etapa deenriquecimento do alvo a fim de melhorar a captura do alvo. Por exemplo,subtilisinas podem ser usadas para melhorar a captura do alvo, especialmenteem amostras clínicas que tem sangue. As subtilisinas ou carbonil hidrolases,são proteases alcalinas que são secretadas por membros do gênero Bacillus

Quando ácidos nucleicos alvos são capturados por contas, a presença desubtilisina leva as contas a formar grânulos firmes, assim melhorando afacilidade de lavar os materiais não ligados ou indesejáveis. Além disso, aetapa de enriquecimento do alvo igualmente concentra ácido nucleico alvo emum volume pequeno.O enriquecimento do alvo é obtido por misturação de um ácidonucleico alvo, um agente de ligação específico para híbridos DNA: RNA,como sonda de ácido nucleico que é complementar ao ácido nucleico alvo,por exemplo uma sonda de seqüência sinal, e um suporte sólido, onde o ácidonucleico alvo com o agente de ligação específico dos híbridos DNA: RNAhibridiza para formar um híbrido DNA: RNA em um suporte sólido, eremovendo quaisquer ácidos nucleicos que não formam um híbrido DNA:RNA ou não são capturados em um suporte sólido.

Particularmente, a separação do ácido nucleico alvo desejado eo ácido nucleico não específico é obtida pela formação de híbridos DNA:RNA que são capturados em um suporte sólido ou fase sólida, como, porexemplo, contas paramagnéticas modificadas com agentes de ligaçãoespecíficos de híbridos DNA: RNA como, mas não limitados a anticorposespecíficos para híbridos DNA: RNA (por exemplo anticorpo HYBRIDCAPTURE, HC-Ab) anticorpos monoclonais ou policlonais, ou fragmentosdos mesmos, proteínas, RNase H cataliticamente inativo, ácidos nucleicos,aptâmeros de ácido nucleico, ou oligonucleotídeos tendo a capacidade de ligare formar uma estrutura triplex. A afinidade de ligação de RNase H parahíbridos DNA: RNA na ausência de Mg2+ e catalise via ressonância deplasmon de superfície é relatada por Haruki et al ["Kinetic and stoichiometricanalysis for the binding of Escherichia coli ribonuclease HI to RNA-DNAhydrids using surface plasmon resonance", J. Biol. Chem. 272: 22015-22022,1997, incorporado aqui por referência]. Esta etapa de enriquecimento do alvopode ser realizada em qualquer suporte sólido, como placas de microtitulação,microchips, contas, contas paramagnéticas / não paramagnéticas, ou qualqueruma das fases sólidas previamente mencionadas. Por exemplo, DNA alvo,sonda de RNA, ou conjunto de diferentes sondas de RNA (se em uma reaçãomultiplex) e contas ligadas com anticorpos - HC DNA: RNA conjugados sãomisturados. Os DNAs alvos e sondas de RNA forma os híbridos DNA: RNA.Os anticorpos HC DNA: RNA são conjugados a suportes sólidos, comocontas paramagnéticas. Uma vez que os híbridos DNA: RNA são capturadossobre os suportes sólidos, todas as seqüências de ácido nucleico não ligado econtaminantes são lavados, preferivelmente por lavagens repetidas usandotampões que não degradam ou afetam os híbridos.

Como uma alternativa ou adição ao uso de anticorposespecíficos para híbridos DNA: RNA, oligonucleotídeos ou polinucleotídeosde qualquer comprimento que são complementares para os alvos conjugados auma fase sólida podem ser usados para capturar as seqüências de ácidosnucleicos alvos. Por exemplo, os oligonucleotídeos ou sondas quereconhecem um tipo de HPV específico podem ser conjugados a uma fasesólida, como uma placa, lâmina ou conta. Várias contas conjugadas a sondasespecíficas e conhecidas formam um conjunto de contas. Por exemplo, cadaconjunto de contas é específico para um tipo de HPV. Em um formatomultiplex, os conjuntos de contas múltiplas que identificam vários tipos deHPV, um tipo de HPV por conjunto de conta, pode ser usado. Osoligonucleotídeos utilizáveis na captura do ácido nucleico alvo podem serácidos nucleicos travados parciais ou completos (LNA), ácidos nucleicospeptídeo (PNA), ou ter outras modificações [Current Protocols in NucleicAcid Chemistry, Ed. Serge L. Beaucage, et al, John Wiley & Sons 2004]. Asonda de ácido nucleico pode ter um comprimento de até cerca de 100% docomprimento do ácido nucleico alvo, e estar na faixa de cerca de 50 bases acerca de 10 quilobases em comprimento. O ácido nucleico alvo pode ser ouDNA ou RNA. Se o ácido nucleico alvo for RNA, então cDNA pode sergerado do RNA alvo por qualquer método bem conhecido, ou o RNA alvopode ser capturado por uma sonda de DNA, onde a sonda de DNAhibridizado será amplificada e detectada.

A etapa de enriquecimento do alvo não é limitada pelas formasde realização descritas aqui. Um versado na técnica irá entender comopurificar um ácido nucleico alvo em uma amostra de modo quecontaminantes, inibidores e outros ácidos nucleicos não específicos sãoremovidos ou eliminados da amostra baseada nos princípios aqui descritos.

As preparações de amostra são conhecidas e entendidas na técnica através demétodos comercialmente disponíveis e kits, como os kits de preparação miniou maxi de plasmídeos, kits de extração de géis, kits de purificação de DNA eRNA. Estes podem ser usados para facilitar a etapa de enriquecimento de alvoem algumas circunstâncias onde uma sensibilidade menor é aceitável.

Após o enriquecimento do alvo, a amostra sofre amplificaçãode ácido nucleico. A amplificação do alvo isotérmica de ácidos nucleicosusando iniciadores de oligonucleotídeos de seqüências aleatórias e uma DNApolimerase com atividade de deslocamento do filamento se dirige a muitaslimitações como, mas não inclusive, de capacidades multiplex limitadas eamplificação não uniforme de PCR multiplex. As seqüências amplificadas, ouamplicons, são identificados através de hibridização para os oligonucleotídeosespecíficos da seqüência. A amplificação igualmente pode ser realizada comos alvos individuais em vez de em um formato multiplex e amplicons podemser combinados para o teste de hibridização.

DNA polimerase pode ser usada para estender os iniciadores eativar o deslocamento do filamento. Alternativamente, se uma sonda de DNAfor usada para capturar o RNA alvo, então a sonda de DNA hibridizada éamplificada e detectada. Outra forma de realização refere-se a RNA alvo detranscrição reversa para produzir cDNA, como o alvo de DNA, que pode sercapturado como descrito acima. Esta segunda etapa preferivelmente usaamplificação isotérmica de um ácido nucleico alvo. Especificamente, osiniciadores de oligonucleotídeos de seqüência aleatória e uma DNApolimerase tendo atividade de deslocamento de filamento podem ser usadosna amplificação isotérmica. Em uma forma de realização, um suporte sólidoou fase como, mas não limitado a contas magnéticas, que tem um ácidonucleico alvo capturado pode ser usado diretamente em uma mistura deamplificação. Os alvos de DNA podem ser amplificados usando quaisquerDNA polimerases (incluindo mas não limitados a phi29 DNA polimerase, BstDNA polimerase, T4 DNA polimerase, T7 DNA polimerase, e DNApolimerase I), que são iniciadas com iniciadores aleatórios.

Os iniciadores aleatórios podem ter uma relação específica demonômeros dG, dC, dT e dA para eficiência ótima. Uma ou duas bases denucleotídeos podem ser completamente omitidas para desempenho ótimo. Areunião de iniciadores aleatórios não precisa incluir todas as seqüênciaspossíveis. As seqüências incluídas na reunião também não precisam estar emconcentrações equimolares. De fato, as reuniões de iniciador aleatório podemincluir um subconjunto de seqüências de iniciadores seletivos para doençasparticulares. O comprimento pode variar de cerca de 4 a cerca de 20nucleotídeos, e preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8 nucleotídeos. Ocomprimento pode depender da relação de monômero dentro do iniciador.Uma temperatura de amplificação ótima varia entre cerca de 25 °C e cerca de70°C, preferivelmente cerca de 28 °C a cerca de 40°C, dependendo docomprimento dos iniciadores que podem ser determinados por um versado natécnica e sem indevida experimentação. A temperatura ótima pode serestimada por uso de software comercialmente disponível que prevê atemperatura de andamento dos oligonucleotídeos. Um exemplo desteprograma comercialmente disponível é OLIGO ™ versão 6.0 ou 6.41(Molecular Biology Insights, Cascade, CO). Por exemplo, o DNA alvo podeser amplificado durante 2 h com iniciadores pentâmeros em combinação comphi29 DNA polimerase.

Os iniciadores pentâmeros, por exemplo, são protegidos dadegradação de exonuclease por modificações. As ligações fosforotioato ougrupos 2' -O-metila podem ser incluídos na estrutura dos iniciadores. Areação de amplificação preferivelmente ocorre durante 1-3 h dependendo dasensibilidade requerida, que é substancialmente mais curta do que a duraçãodos protocolos publicados para as reações de phi29 DNA polimerase. [Gary J.Vora, et al, Applied and Enviromental Microbiology, 70(5), 3047- 3054,2004, incorporado aqui por referência). Uma fórmula única de reagentescombinados com a etapa de enriquecimento de alvo selecionada e a etapa dedetecção de alvo permite o tempo de amplificação relativamente curto.

A etapa de amplificação de alvo da invenção preferivelmenteusa amplificação isotérmica que permite: a amplificação de um númeroilimitado de alvos com uma eficiência uniforme, amplificação da seqüênciacompleta, não um fragmento como é o caso da reação de cadeia polimerase(PCR), e permite a detecção do alvo mesmo se uma parte da seqüência alvona amostra biológica for removida. Por exemplo, a região LI é comfreqüência deletada em HPV, no entanto, usando uma sonda de hibridizaçãopara as regiões LI e E (MH Einstein e GN Goldberg, Câncer Invest. 20:1080- 1085, 2002), as seqüências deletadas podem ser ainda detectadas com omesmo nível de sensibilidade, assim permitindo a detecção do alvo mesmo separte da seqüência estiver ausente. A amplificação isotérmica multiplex podeser realizada em uma temperatura na faixa de cerca de 25 °C a cerca de 40°Ccom um tempo de reação na faixa de 1 a 3 h. Os exemplos não limitativos deamplificação isotérmica incluem amplificação do círculo rolante ([Lizardi P.,Huang X., Zhu Z., Bray- Ward P., Thomas D., Ward D. "Mutation detectionand single molecule counting using isothermal rolling circle amplification"Nat. Genet. 1998, 19:225-232]; amplificação com deslocamento múltiplo[Little M., et al. "Strand displacement amplification and homogenous real-time detection incorporated in a second generation probe system" Chn. Chem.1999, 45:777-784]; and protein-primed DNA amplification [Blanco M.,Lázaro J., de Vega M., Bonnin A., Salas M. "Terminal protein-primed DNAamplification" Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1994, 91:12198-12202]. Outrasformas de realização de amplificação de alvo incluem as onde o alvo éliberado do suporte sólido antes de sua adição à mistura de amplificação. Osmodos não limitativos para liberar o ácido nucleico alvo incluem tratamentoalcalino, incubação em alta temperatura, e tratamento com RNaseH. Afórmula singular de reagentes combinada com a etapa de enriquecimento dealvo e a etapa de detecção de alvo selecionadas permite o uso do tempo deamplificação relativamente curto. Os reagentes para amplificação isotérmicapodem ser realizadas simultaneamente com amplificação do alvo,opcionalmente incluindo RNaseH, que deveria aumentar o número de sítiosde iniciação no DNA alvo. Estes métodos permitem a desnaturação assimcomo a liberação do suporte sólido permitindo uma amplificação do alvo maiseficiente.

A próxima etapa envolve a detecção de seqüências de ácidonucleico alvo individuais dentro do ácido nucleico amplificado. Asensibilidade e especificidade desta etapa geralmente depende da eficiência deamplificação. A detecção e elucidação do ácido nucleico alvo é realizada porhibridização de porções diferentes do produto alvo amplificado, ouamplicons, para sondas de seqüência de captura individuais que sãoconjugadas a um suporte sólido e sondas específicas complementares àseqüência alvo formando um complexo alvo. A hibridização de diferentesporções da seqüência de ácido nucleico de alvo com duas sondas prove doisníveis de especificidade, assegurando a detecção e a identificação de um alvoespecífico em uma amostra.

Os oligonucleotídeos ou sondas de seqüência de capturaconjugadas a um suporte sólido, preferivelmente contas, que sãoselecionáveis, são utilizáveis na obtenção de um nível de especificidade. Ahibridização dos CSPs para os ácidos nucleicos alvos amplificados seguidopor seleção subseqüente das contas, permite a separação do complexo alvodas entidades não ligadas ou parcialmente ligadas. Os CSPs são geralmenteadicionados em quantidades excessivas a fim de assegurar a ligação.Preferivelmente, os CSPs e SSPs não tem seqüências de sobreposição; noentanto, é possível realizar o método em uma forma de realização onde osCSPs e SSPs tem seqüências de sobreposição complementares à seqüência deácido nucleico alvo.

As sondas de seqüência de captura (CSP) ou oligonucleotídeospodem ser conjugadas ou fixadas em uma fase sólida, suporte sólido, oumatriz sólida que inclui, por exemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno,policarbonato ou qualquer material plástico sólido na forma de placas,lâminas, discos, contas, partículas, porções, filamentos, chips, tiras,microplacas, e microarranjos. Uma fase sólida igualmente inclui contas devidro, tubos de teste de vidro, e qualquer outro produto de vidro apropriado.Uma fase sólida funcionalizada como plástico ou vidro que foi modificado demodo que a superfície contém grupos carboxila, amino, hidrazida, aldeído,ácido nucleico ou derivados de nucleotídeos, também podem ser usados.

Qualquer fase sólida, como plástico, metal, micropartículas magnéticas ou devidro, contas, tiras, tubos de teste, lâminas, filamentos, chips, microchips, ouplacas de microtitulação podem ser usados.

As sondas de seqüência de captura ou oligonucleotídeos sãosondas de ácido nucleico que compreendem pelo menos 8 bases,preferivelmente 15 a 100 bases, e mais preferivelmente 20 a 40 bases. Assondas de seqüência de captura são preferivelmente identificáveis, ou por seuslocais conhecidos em um suporte sólido, como uma placa de subcavidade, ouquando, por exemplo, conjugadas a sondas, por um corante colorido distinto.

Os meios para a identificação das sondas de seqüência de captura são bemconhecidos na técnica, e são exemplificados no presente relatório.

A hibridização para as sondas específicas de seqüência quepodem ser fixadas ao suporte sólido não somente permite a identificação dosalvos específicos, mas também prove um segundo nível de especificidadepara o teste, tornando-o um teste clínico mais confiável. Se se requerer umamenor sensibilidade, a amplificação do sinal não é necessária e a detecçãousando oligonucleotídeos (sinal) ou polinucleotídeos fixados no repórter(biotina, fluoróforo, enzima, etc), podem ser usados. Pode-se ter mais de umoligonucleotídeo de detecção por alvo. Tanto os oligonucleotídeos de capturacomo de detecção podem ser adicionalmente modificados, por exemplo PNA,LNA, etc. As sondas de oligonucleotídeos ou ácido nucleico podem ter umcomprimento na faixa de cerca de 15 bases a cerca de 10 quilobases, ou até100% do comprimento do alvo.

Uma sonda de seqüência de sinal (SSP) pode ser um RNA nãorotulado, que é usado para formar um híbrido DNA: RNA reconhecido por,por exemplo, um agente de ligação específico para híbrido rotulado durante aetapa de detecção. Porque SSP não é rotulado, ele não cria um ruído de fundoquando não ligado ao alvo, assim resultando em maior especificidade. Umsinal amplificado por aproximadamente 400 vezes pode ser obtido se, porexemplo, o tamanho da sonda de RNA sinal for de 8 quilobases (kb) e cadaanticorpo liga a 20 bases. Como previamente descrito, geralmente, a sonda deseqüência de sinal compreende pelo menos 15 bases, mas pode ser até oumaior do que cerca de 1000 bases, preferivelmente entre cerca de 15 a 100bases. Outros exemplos não limitativos de uma sonda de seqüência de sinalincluem sonda de RNA rotulado e sonda de DNA rotulado. A hibridizaçãonão é limitada a regiões de não sobreposição, mas pode de fato incluir regiõesde sobreposição. A detecção do complexo híbrido DNA: RNA ligado a umsuporte sólido pode ser realizada em um formato multiplex usando, porexemplo, um anticorpo rotulado PE, contas distinguíveis carboxiladas, edetectadas por citometria de fluxo.

Uma forma de realização para a detecção do alvo (ouamplicon) utiliza um arranjo à base de líquido. Os arranjos de contas sãocomercialmente disponíveis e nesta forma de realização são preferíveis osarranjos de contas de poliestireno carboxilado. Cada cavidade de uma placade 96 cavidades, por exemplo, tem uma mistura de conjuntos de contas. Um13-plex tem 13 conjuntos de contas onde cada conjunto de contas tem uma"assinatura" específica e a assinatura é provida por corantes que estão dentrode cada conta. A relação destes corantes é específica para cada conjunto deconta, e permite a diferenciação entre cada conjunto de contas. As sondas deseqüência de captura (CSPs) ou oligonucleotídeos específicos para um ácidonucleico alvo são aplicados ou conjugados a um conjunto de contas particular.Quando o alvo é hibridizado para os CSPs conjugados a contas ouoligonucleotídeos, a seleção de um conjunto de contas particular e então adetecção ocorre usando a sonda de ácido nucleico complementar e o agente deligação específico do híbrido DNA: RNA rotulado. A seleção ou separaçãopode ser realizada em um citômetro de fluxo onde as contas prosseguem umaa uma através de dois laseres: uma das mesmas seleciona a assinatura sobre aconta, enquanto a outra detecta o alvo como identificado pelos agentes deligação específicos do híbrido DNA: RNA rotulado. Deste modo, os alvosmúltiplos podem ser diferenciados e detectados. Adicionalmente, o reagenteDNA: RNA rotulado permite uma detecção de sinal melhorada, assimaumentando tanto a especificidade como a sensibilidade do teste.

Uma outra forma de realização do arranjo de contas à base delíquido da presente invenção usa placas de subcavidade. Uma placa desubcavidade é uma placa de microtitulação, tendo, por exemplo, 96 cavidadesprimárias, onde cada cavidade primária individual é subdividida de em umnúmero de subcavidades. A placa de subcavidade como uma plataforma paramultiplex foi previamente descrita (A. Roda et al, Clin Chem. 46: 1654- 1660,2002, incorporado aqui por referência). No entanto, a plataforma desubcavidade, como previamente usada e descrita, tem uso limitado devido aoproblema de "interferência cruzada" entre diferentes subcavidades. Noentanto, a plataforma de subcavidade modificada descrita aqui essencialmenteelimina o problema de "interferência cruzada" entre diferentes subcavidadespelo uso de máscaras. Cada subcavidade preferivelmente tem uma sonda deseqüência de captura específica do alvo conhecida fixada à cavidade. Osácidos nucleicos alvos podem ser adicionados à cavidade primária, onde oácido nucleico alvo hibridiza para sua sonda de ácido nucleico complementar,isto é, sonda de seqüência de sinal. Os híbridos DNA: RNA são formadosentre uma porção do ácido nucleico alvo e a sonda de seqüência de sinal. Asonda de seqüência de captura liga a uma porção diferente do ácido nucleicoalvo, assim capturando o híbrido DNA: RNA na fase sólida. A detecção doácido nucleico alvo ocorre como previamente descrito usando sondas de ácidonucleico complementares que hibridizam para o ácido nucleico alvo, e osanticorpos específicos do híbrido DNA: RNA rotulado, por exemplo e pelasonda de seqüência de captura conhecida. A amplificação de sinal e o uso deuma máscara que atua como uma tampa para eliminar a "interferênciacruzada" entre as subcavidades permitem, ambos, a detecção específica esensível de ácidos nucleicos alvos com um ruído de fundo mínimo.

Uma ampla variedade de métodos estão disponíveis quepodem se usados para a detecção e identificação da seqüência alvo incluindo,mas não limitados a hibridização dot blot, hibridização de blot reverso, emmembrana de náilon, hibridização de arranjos de lâminas, arranjos de chips,arranjos de contas, arranjos no fundo de placas de múltiplas cavidades, ououtros. Os exemplos não limitativos de suportes sólidos para hibridizaçãoincluem arranjos de contas (por exemplo, produtos de arranjos de contas defontes comercialmente disponíveis), arranjos de lâminas, arranjos de placas(por exemplo arranjos no fundo de cada cavidade de uma placa demicrotitulação), placas de sub- cavidades, (placa de microtitulação que tem16-64 subcavidades pequenas dentro de cada cavidade), e arranjos deeletrodos como o sistema GenOHM (GeneHom Sciences, Inc.). Drummond etal, Nature Biotech, 21: 1192 - 1199 (2003). Os tipos diferentes de repórterespodem ser implementados para gerar sinais para detecção através de, porexemplo, fluorescência, quimioluminescência, e nanopartículas de ouro.Como previamente discutido, os meios de detector podem incluirfluorescência, qualquer sinal com base em enzima, sinais quimiluminescentesou colorimétricos, difusão de luz com partículas de ouro, e outros.

Em uma forma de realização, um repórter pode ser fixado aum agente de ligação específica de híbrido, como mas não limitado aanticorpos específicos para híbridos DNA: RNA (HC-Ab), proteínas, RNAseH cataliticamente inativo, ácidos nucleicos, aptâmeros de ácido nucleico ouoligonucleotídeos tendo a capacidade de ligar e formar uma estrutura triplex.

Cada agente de ligação rotulado liga a um segmento de nucleotídeo para ohíbrido DNA: RNA, por exemplo pelo menos 20 nucleotídeos emcomprimento, provendo uma amplificação de sinal.

Uma outra forma de realização da invenção para a detecçãomultiplex de uma pluralidade de DNA alvo em uma amostra não purificadacompreende as seguintes etapas: 1) desnaturar o DNA alvo para criar umaseqüência alvo de filamento único, 2) adicionar as sondas de RNA e contasmagnéticas, onde as contas foram previamente conjugadas a anticorpos quesão específicos para híbridos, 3) remover quaisquer alvos não ligados econtaminantes por lavagem, 4) realizar a amplificação isotérmica dos alvoscapturados durante um período de tempo relativamente curto, como porexemplo 1-3 h, na presença de DNA polimerase e outros reagentes parainiciar a amplificação e formação de amplicons, 4) desnaturar os ampliconspara criar seqüências de filamento único, 5) hibridizar o alvo amplificado paraoligonucleotídeos conjugados a um suporte sólido (sondas de captura) comocontas ou uma placa de microtitulação, e para uma sonda de seqüência desinal, e 6) detectar a presença ou ausência de cada DNA alvo pordiferenciação dos alvos com base em aspectos de sonda de captura e detectaro complexo da sonda de seqüência de sinal.

Em uma forma de realização da invenção, a hibridização deum alvo e sonda pode ocorrer simultaneamente com a etapa de captura porum agente de ligação de híbrido enquanto na mesma mistura e em umatemperatura elevada. A temperatura elevada durante o processo completopode permitir um aumento na especificidade da captura do alvo, enquantodiminuindo o tempo de reação. Deve-se entender que condições dehibridização / lavagem de estringência alta, moderada e elevada podem servariadas usando uma variedade de ingredientes, tampões e temperaturas bemconhecidos e praticados pelo versado na técnica. Para condições deestringência adicionais, ver, T. Maniatis et al, Molecular Cloning, ALaboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982). A hibridização e captura em uma etapa podem ser mais eficientes doque realizar a hibridização e a captura seqüencialmente, dependendo dascondições globais do teste.

Um método de detecção dos ácidos nucleicos alvos deinteresse na presença de outros ácidos nucleico, por enriquecimento do alvo,amplificação do alvo e detecção do alvo, prove um método rápido e sensívelpara simultaneamente detectar os alvos múltiplos na mesma amostra dereação. Este método é utilizável em aplicações diagnosticas clínicas para aidentificação, muitos estados doentios, por exemplo, seja um pacienteinfectado com o papilomavírus humanos (HPV) e determinar qual tipo outipos de HPV específicos o paciente tem, a fim de melhor diagnosticar e trataro paciente. Outras doenças relacionadas com os ácidos nucleicos específicossão prontamente bem conhecidas na técnica e podem ser identificáveis usandoo método de detecção descrito na invenção.

Qualquer fonte de ácido nucleico, em forma purificada ou nãopurificada, pode ser usada como a amostra de teste. Por exemplo, a amostrade teste pode ser um alimento ou produto agrícola, ou uma amostra clínicahumana ou veterinária. Tipicamente, a amostra de teste é um fluido biológicocomo urina, sangue, plasma, soro, esputo ou outro. Alternativamente, aamostra de teste pode ser uma amostra de tecido que se suspeita transporte umácido nucleico de interesse. O ácido nucleico alvo na amostra de teste podeestar presente inicialmente como uma molécula discreta de modo que aseqüência a ser detectada constitui o ácido nucleico completo, ou podesomente ser um componente de uma molécula maior. Não é necessário que aseqüência de ácido nucleico seja detectada como presente inicialmente emforma pura. A amostra de teste pode conter uma mistura complexa de ácidosnucleicos, dos quais o ácido nucleico alvo pode corresponder a um gene deinteresse contido em DNA ou RNA genômico humano total ou uma porção daseqüência de ácido nucleico de um organismo patogênico cujo organismo éum componente menor de uma amostra clínica.

O ácido nucleico alvo em uma amostra de teste pode ser DNAou RNA como RNA mensageiro, de qualquer fonte, incluindo bactérias,levedura, vírus e as células ou tecidos de organismos superiores como plantasou animais. O alvo também pode ser um cDNA sintetizado do RNA portranscrição reversa. Os métodos para a extração e/ou purificação destes ácidosnucleicos são bem conhecidos na técnica. Os ácidos nucleicos alvos podemser de filamento duplo ou filamento único. Em uma forma de realização dopresente método, os ácidos nucleicos alvos são de filamento único outornados de filamento único por técnicas de desnaturação convencionais antesdas etapas de hibridização e amplificação do método. Em uma forma derealização, uma técnica de desnaturação de base ou temperaturas elevadas sãousadas para desnaturar o DNA alvo de filamento duplo.

O termo "oligonucleotídeo " como o termo é usado aqui refere-se a uma molécula de ácido nucleico composta de dois ou maisdeoxiribonucleotídeos ou ribonucleotídeos. Um oligonucleotídeo desejadopode ser preparado por qualquer método apropriado, como purificação de umácido nucleico de ocorrência natural, por meio biológico molecular, ou porsíntese de novo. Os exemplos não limitativos de oligonucleotídeos e sondasde ácido nucleico são descritos aqui.

As sondas de ácido nucleico são seqüências de ácido nucleicoque hibridizam para seqüências de DNA ou RNA complementares em umaamostra de teste. A detecção da sonda indica a presença de uma seqüência deácido nucleico particular na amostra de teste. As sondas de ácido nucleicopodem ser detectadas diretamente ou indiretamente. Em uma forma derealização, o método HYBRID CAPTURE específico de alvo emprega doistipos de sondas de seqüência de ácido nucleico: sonda de seqüência de captura(CSP) e sonda de seqüência de sinal (SSP).

Uma sonda de seqüência de captura ou oligonucleotídeocompreende uma seqüência de ácido nucleico que é capaz de hibridizar emuma região (ões) única(s) de um ácido nucleico alvo e sendo capturada emuma fase sólida ou que permite a captura da seqüência de ácido nucleico alvo.

O CSP usado no método de detecção pode ser DNA, RNA, ácidos nucleicosde peptídeo (PNAs) ou outros análogos de ácido nucleico. PNAs sãooligonucleotídeos em que a estrutura dorsal do açúcar-fosfato é substituídacom uma estrutura dorsal de poliamida ou "pseudopeptídeo". Em uma formade realização preferida, o CSP é DNA. O CSP tem um comprimento mínimode pelo menos 8 bases, preferivelmente entre 15 e 100 bases, e maispreferivelmente entre 20 e 40 bases. O CSP é substancialmente complementara uma seqüência de ácido nucleico alvo em que CSP hibridiza. A seqüênciade um CSP é preferivelmente pelo menos 75% complementar à região dehibridização alvo, mais preferivelmente 100% complementar a esta seqüência.

Também prefere-se que CSP contenha menos do que ou igual a 75% deidentidade de seqüência, mais preferivelmente menos que 50% de identidadede seqüência, para seqüências não alvo indesejáveis que se acredita estejampresentes em uma amostra de teste. A seqüência dentro de um ácido nucleicoalvo ao qual um CSP liga é preferivelmente pelo menos cerca de 12 bases,mais preferivelmente 20-40 bases. As seqüências de ácido nucleico alvo emque CSP hibridiza são preferivelmente seqüências únicas ou seqüênciasespecíficas de grupo. As seqüências específicas de grupo são seqüênciasrelacionadas múltiplas que formam grupos discretos. Por exemplo, os CSPspodem conter seqüências que reconhecem tipos de papilomavírus específicoscomo, mas não limitados a HPV-16, HPV-18 e HPV-31.

Em uma forma de realização, o CSP usado no método dedetecção pode conter uma ou mais modificações no ácido nucleico quepermite a captura específica da sonda sobre uma fase sólida. Por exemplo, oCSP pode ser modificado por etiquetagem do mesmo com pelo menos umligando por métodos bem conhecidos do versado na técnica incluindo, porexemplo, translação -nick, incorporação fotoquímica ou química. Além disso,o CSP pode ser etiquetado em posições múltiplas com um ou tipos múltiplosde rótulos. Por exemplo, o CSP pode ser etiquetado com biotina, que liga aestreptavidina; ou digoxigenina, que liga a uma anti-digoxigenina; ou 2,4-dinitrofenol (DNP), que liga a anti-DNP. Os fluorogênios podem ser tambémusados para modificar as sondas. Os exemplos de fluorogênios incluemfluoresceína e derivados, ficoeritrina, alo- ficocianina, ficocianina, rodamina,Vermelho Texas ou outros fluorogênios registrados. Os fluorogênios sãogeralmente fixados por modificação química e ligam a um anticorpoespecífico de fluorogênio, como anti- fluoresceína. Será entendido peloversado na técnica que o CSP também pode ser etiquetado por incorporaçãode uma base modificada contendo qualquer grupo químico reconhecível poranticorpos específicos. Outras etiqueta e métodos de etiquetar seqüências denucleotídeo para captura em uma fase sólida revestida com substrato são bemconhecidas do versado na técnica. Um estudo de rótulos de ácido nucleicopode ser encontrado em artigo por Landegren et al, "DNA DiagnosticsMolecular Techniques and Automation", Science, 242: 229-237 (1988),incorporado aqui por referência. Em outra forma de realização, o CSP éetiquetado com biotina em ambas as extremidades 5' e 3' de seqüência denucleotídeos. Em outra forma de realização, o CSP não é modificado, mas écapturado em uma matriz sólida devido às seqüências contidas no CSPcapazes de hibridização na matriz.

O SSP usado no método de detecção pode ser DNA ou RN A.

Uma sonda de seqüência de sinal compreende uma seqüência de ácidonucleico que é capaz de hibridizar em regiões de um ácido nucleico alvo quesão adjacentes a regiões únicas reconhecidas pelo CSP. Em uma forma derealização particular da invenção, o SSP e o ácido nucleico alvo formam umhíbrido DNA: RNA. Assim, nesta forma de realização, se o ácido nucleicoalvo for um DNA, então o SSP preferido é um RNA. Similarmente, se o ácidonucleico alvo for RNA, então o SSP preferido é um DNA. O SSP égeralmente pelo menos 15 bases de comprimento. No entanto, o SSP pode teraté ou mais do que 1000 bases de comprimento. Os SSPs mais longos sãopreferidos. O SSP pode compreender um fragmento de ácido nucleico único,ou fragmentos de ácidos nucleicos menores múltiplos cada tendopreferivelmente entre 15 a 100 bases de comprimento.

As seqüências de CSP e SSP são selecionadas de modo quenão hibridizam na mesma região de um ácido nucleico alvo ou para cada uma.

A seqüência de SSP e a seqüência de CSP que correspondem às regiões deuma seqüência de ácido nucleico alvo, podem ser modificadas a fim deeliminar a competição entre CSP e SSP. Por exemplo, o SSP pode terdeleções de que o CSP não inclui. Além disso, os CSPs e os SSPs sãoselecionados para hibridizar em regiões do alvo dentro, por exemplo, de50.000 bases um para o outro. A distância entre a seqüência para a qual CSPhibridiza dentro do ácido nucleico alvo e a seqüência à qual o SSP hibridizaestá preferivelmente entre cerca de 1 e 50.000 bases. Mais preferivelmente, adistância entre CSP e SSP em um ácido nucleico alvo é menor que 3000bases, e mais preferivelmente a distância é menor que 1000 bases.

Em outra forma de realização, uma porção do SSP usado nométodo de detecção forma um híbrido DNA: RNA com uma seqüência deácido nucleico alvo de filamento único, que é detectada por agentes de ligaçãoespecíficos para híbrido DNA: RNA, e outra porção do SSP é capaz dehibridizar para o ácido nucleico alvo. O SSP pode ser preparado por primeiroclonagem de uma seqüência de DNA de filamento único complementar aseqüências dentro do ácido nucleico alvo em um vetor de DNA de filamentoúnico, então hibridizando RNA complementar à seqüência de vetor de DNApara gerar um híbrido DNA: RNA. Por exemplo, se Ml3 for usado como ovetor de DNA, Ml3 RNA é hibridizado na seqüência Ml3 DNA no vetor paragerar um híbrido DNA: RNA. O SSP resultante forma uma porção de híbridoDNA: RNA assim como uma porção de filamento único capaz de hibridizarem seqüências dentro do ácido nucleico alvo. O DNA de filamento únicodeve ter pelo menos 10 bases de comprimento, e pode ter até ou mais do que1000 bases de comprimento. Alternativamente, a porção de híbrido DNA:RNA do SSP pode ser formada durante ou após a reação em que a porção defilamento único do SSP é hibridizada no ácido nucleico alvo. O SSP pode serlinear, circular ou uma combinação de duas ou mais formas. A porção dehíbrido DNA: RNA do SSP prove sinais amplificados para a detecção dehíbridos capturados usando, por exemplo, anticorpos específicos de híbridoDNA: RNA, que são rotulados ou são reconhecidos por uma entidaderotulada, como aqui descrito.

Em ainda outra forma de realização, o SSP usado no métodode detecção é uma molécula que não contém seqüências que são capaz dehibridizar para o ácido nucleico alvo. Nesta forma de realização, as sondas deponte, compreendendo seqüências capazes de hibridização para o ácidonucleico alvo, assim como as seqüências capazes de hibridizar para o SSP,são usadas. As sondas de ponte podem ser DNA, RNA, ácidos nucleicospeptídeo (PNAs) ou outros análogos de ácido nucleico.

Em uma outra forma de realização, uma porção do SSP e umasonda de ácido nucleico complementar formam um híbrido DNA: RNA e umaporção de filamento único do SSP contém seqüências complementares paraseqüências dentro de uma sonda de ponte. A sonda de ponte, que é capaz dehibridizar para tanto o ácido nucleico alvo como o SSP, serve como umintermediário para conectar o SSP ao ácido nucleico alvo. O híbrido DNA:RNA é detectado por um agente de ligação específica do híbrido DNA: RNAque pode ser rotulado ou é detectado por uma entidade rotulada. O CSPhibridiza em uma porção diferente da seqüência de ácido nucleico alvo, assimcapturando o alvo, sonda de ponte, e complexo de híbrido DNA: RNA em umsuporte sólido ou fase. O SSP pode ser preparado como descrito acima.

Em outra forma de realização, o SSP usado em um método dedetecção de ácido nucleico alvo compreende conjuntos múltiplos deseqüências de repetição que são complementares a uma seqüência de RNA defilamento único capaz de hibridizar em uma sonda de ponte. Uma sonda deoligonucleotídeo de DNA contendo seqüências complementares à seqüênciasde repetição pode ser usada para hibridizar no SSP para gerar o duplex DNA:RNA necessário para a amplificação do sinal.

Em ainda outra forma de realização, a sonda de ponte contémuma cauda poli(A) além das seqüências que são capazes de hibridizar noácido nucleico alvo. O SSP usado neste exemplo compreende seqüências deDNA poli(dT). A sonda de ponte é assim capaz de hibridização em SSP viasua cauda poli(A). Uma sonda de RNA compreendendo seqüências poli(A)pode ser usada para hibridizar nas seqüências de DNA poli(dT) restantesdentro de SSP para formar um híbrido DNA: RNA. O SSP compreendendoseqüências poli (dT) e a sonda de RNA compreendendo seqüências poli (A)são preferivelmente de 100 a 5000 bases de comprimento.

O SSP usado nos métodos de detecção de seqüências de ácidonucleico alvo da presente invenção pode ser não modificado ou modificadocomo com o CSP usando métodos descritos acima e/ou bem conhecidos natécnica. Em uma forma de realização preferida, o SSP é uma sondacovalentemente não modificada.

Entende-se que CSPs e/ou SSPs múltiplos podem serempregados no método de detecção da invenção.

Em outra forma de realização, uma sonda de oligonucleotídeoscompreendendo seqüências complementares de duas ou mais regiões distintasdo ácido nucleico alvo são fusionadas juntas e usadas como a sonda deseqüência de captura no método da invenção. Alternativamente, uma únicasonda pode ser projetada e produzida que contém seqüências complementaresa ácidos nucleicos alvos únicos ou múltiplos. Este tipo de sonda é tambémreferido aqui com CSP fusionado". A sonda de seqüência de capturafusionada trabalha tão efetivamente como a combinação de dois CSPs nãofusionados quando usados na mesma concentração.

As sondas de ácido nucleico da invenção podem serproduzidas por qualquer método apropriado bem conhecido na técnica,incluindo, por exemplo, síntese química, isolamento de uma fonte deocorrência natural, produção recombinante e PCR assimétrico. (McCabe,1990, in PCR Protocols: A guide to methods and applications. San Diego,CA, Academic Press, 76-83). Pode ser preferido quimicamente sintetizar assondas em um ou mais segmentos e subseqüentemente ligar os segmentos,como pode ser o caso para preparar um microarranjo de oligonucleotídeos emum microchip. Vários métodos de síntese química são descritos por Narang etal (1979 Meth. Enzymol. 68:90), Brown et al (1979 Meth. Enzymol. 68 109) eCaruthers et al (1985 Meth. Enzymol. 154: 287), todos incorporados aqui porreferência. Alternativamente, os métodos de clonagem podem prover umfragmento de ácido nucleico conveniente que pode ser isolado para uso comoum iniciador de promotor. Uma sonda de DNA de filamento duplo é primeirotornada de filamento único usando, por exemplo, métodos de desnaturaçãoconvencionais antes da hibridização para os ácidos nucleicos alvos.A hibridização é conduzida sob condições de hibridizaçãopadrões bem conhecidas do versado na técnica. As condições de reação parahibridização de uma sonda para uma seqüência de ácido nucleico variam desonda a sonda, dependendo de fatores como o comprimento da sonda, onúmero de nucleotídeos G e C na seqüência, e a composição do tampão usadona reação de hibridização. As condições de hibridização moderadamenteestringentes são geralmente entendidas pelos versados na técnica comocondições de aproximadamente 25 °C abaixo da temperatura de fusão de umDNA de filamento duplo de pares de bases perfeitos. Uma maiorespecificidade é geralmente obtida por emprego de condições de incubaçãotendo maiores temperaturas, em outras palavras, condições mais estringentes.O Capítulo 11 do manual de laboratório bem conhecido de Sambrook et al,Molecular Cloning, A Laboratov Manual, 2a. ed. Cold Spring HarborLaboratory Press, NY (1990), incorporado aqui por referência) descrevecondições de hibridização para sondas de oligonucleotídeos em maioresdetalhes, incluindo uma descrição dos fatores envolvidos e o nível deestringência necessário para garantir a hidrogênio com especificidade. Ahibridização é tipicamente realizada em uma solução aquosa tamponada, paraa qual condições como temperatura, concentração de sal, e pH, sãoselecionadas para prover estringência suficiente como que as sondashibridizam especificamente para suas seqüências de ácido nucleico alvorespectivas mas não para qualquer outra seqüência.

Geralmente, a eficiência de hibridização entre a sonda e o alvomelhora sob condições onde a quantidade de sonda adicionada é um excessomolar para o gabarito, preferivelmente um excesso molar de 2 a IO6, maispreferivelmente um excesso molar de 103 a IO6. A concentração de cada CSPprovida para uma captura eficiente é pelo menos 25 fmols/ ml (25 pM) nasolução de hibridização final, preferivelmente entre 25 fmols para IO4 fmols/ml (10 nM). A concentração de cada SSP é pelo menos 15 ng/ml na soluçãode hibridização final, preferivelmente 150 ng/ ml. A tabela A mostra aconversão de concentrações de SSP expressas em ng/ml para a base molar.

Tabela A

<table>table see original document page 28</column></row><table>

A hibridização do CSP e SSP para o ácido nucleico alvo naetapa de detecção pode ser realizada simultaneamente ou seqüencialmente eme qualquer ordem. Em uma forma de realização, a hibridização do CSP ehibridização do SSP para o ácido nucleico alvo são realizadassimultaneamente. Em uma forma de realização, o híbrido DNA: RNAformado pode ser então capturado em uma fase sólida. A fase sólida pode serrevestida com um substrato ao qual o ligando fixado ao CSP liga comespecificidade. Uma proteína da seqüência de ácido nucleico alvo e o SSPformam um híbrido DNA: RNA, enquanto outra proporção da seqüência deácido nucleico alvo hibridiza a um CSP que é fixado a uma fase sólida. Emoutra forma de realização, a hibridização do SSP para o ácido nucleico alvo érealizada após a hibridização do CSP para o ácido nucleico alvo. Neste caso,o CSP pode ser imobilizado em uma fase sólida antes ou após a hibridização.Tanto o CSP como a seqüência de ácido nucleico alvo podem ser ligados àfase sólida durante a reação de hibridização de SSP.

Será entendido pelo versado na técnica que uma fase sólida,suporte sólido, ou matriz sólida, pode ser usado de modo interpermutável einclui, por exemplo, vidro, silicone, metal, nitrocelulose, poliestireno,polietileno, polipropileno, policarbonato ou qualquer material plástico sólidona forma de placas, lâminas, discos, contas, microcontas, partículas,micropartículas, porções, tubos de teste, lâminas, filamentos, chips,microchips, tiras, membranas, microplacas, placas de microtitulação comsubcavidades e microarranjos. Uma fase sólida também inclui contas de vidro,tubos de teste de vidro e qualquer outro produto de vidro apropriado. Umafase sólida funcionalizada como plástico ou vidro que pode ser modificada demodo que a superfície contém grupos carboxila, amino, hidrazida, aldeído,derivados de ácido nucleico ou de nucleotídeos também podem ser usada.

Em uma forma de realização, o CSP é rotulado com biotina, efase sólida revestida com estreptavidina ou revestida com avidina éempregada para capturar o híbrido. Em outra forma de realização, as placas demicrotitulação revestidas com estreptavidina ou microplacas são usadas. Estasplacas podem ser revestidas de modo passivo ou covalente. Uma outra formade realização usa placas de microtitulação onde cada cavidade individual temvárias subcavidades, onde um CSP é individualmente fixado em cadasubcavidade. Outra forma de realização emprega CSPs ligados a contas porqualquer um dos métodos bem conhecidos e comumente usados de ligação,como espaçadores e ligadores. Quando o CSP é conjugado a um suportesólido, o CSP pode ser usado para capturar e/ou selecionar para o ácidonucleico alvo ao qual ele é complementar.

O híbrido DNA: RNA capturado pode ser detectado por meiosconvencionais bem conhecidos na técnica. O híbrido DNA: RNA pode serdetectado diretamente ou indiretamente usando um agente de ligaçãoespecífica para híbrido DNA: RNA rotulado ou distinguível, como umanticorpo monoclonal ou policlonal rotulado, ou fragmento do mesmo,específico para o híbrido DNA: RNA, um anticorpo específico para um oumais ligandos fixados no SSP, um anticorpo rotulado ou uma modificaçãodetectável no próprio SSP.

Um método preferido detecta o híbrido capturado usando umanticorpo específico do híbrido DNA: RNA. Nesta forma de realização, oanticorpo específico do híbrido DNA: RNA é preferivelmente rotulado comuma enzima, uma molécula fluorescente, ou um conjugado biotina- avidina, eé preferivelmente não radioativo. O rótulo pode ser detectado diretamente ouindiretamente por meios convencionais bem conhecidos na técnica como umcolorímetro, um luminômetro, ou detector de fluorescência. Um rótulopreferido é, por exemplo, fosfatase alcalina. Outros rótulos bem conhecidosdo versado na técnica podem ser usados como um meio de detectar o híbridode filamento duplo ligado. A detecção é realizada por métodosconvencionalmente usados na técnica, por exemplo, colorimetria ouquimioluminescência como descrito em Coutlee et al,. Clin. Microbiol. 27:1002- 1007 (1989), incorporado aqui por referência. Preferivelmente, oconjugado de fosfatase alcalina ligado é detectado por quimioluminescênciapor adição de um substrato que podem ser ativados por fosfatase alcalina. Ossubstratos quimiluminescentes que são ativados por fosfatase alcalina sãobem conhecidos na técnica.

A detecção de híbridos DNA: RNA é preferivelmente obtidapor ligação do agente de ligação específico para o híbrido DNA: RNAconjugado, como mas não limitado a anticorpo específico para híbrido DNA:RNA, para o híbrido DNA: RNA durante uma etapa de incubação. Em umaforma de realização, o anticorpo específico para híbrido DNA: RNA éconjugado a uma fase sólida, pressão uma conta paramagnética. Porcolocação das contas paramagnéticas conjugadas aos anticorpos específicosdo híbrido DNA: RNA sob uma força magnética, assim capturando oshíbridos DNA: RNA, as superfícies podem ser então lavadas para removerquaisquer anticorpos em excesso e outros materiais não hibridizados. Estaetapa enriquece ou purifica a seqüência de ácido nucleico alvo. Estas técnicasde enriquecimento de alvo são bem conhecidas na técnica. Por exemplo,lavagens manuais podem ser realizadas usando ou pipetadores ou seringas derepetição, uma bomba simples regulada por um variostato, ou por fluxo porgravidade de um reservatório com uma tubulação fixada. Os sistemas delavagem com tubos comercialmente disponíveis também podem ser usados.

Os exemplos não limitativos de sondas de seqüência decaptura usadas na invenção incluem as tendo seqüências para HSV-1,seqüências para HSV-2. CSPs para HPV incluem as tendo SEQ ID NO: 1-64.Os tipos de HPV que são englobados por estas seqüências incluem HPV 16,HPV 18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52,HPV56, HPV58, 59, HPV66, HPV68, HPV73, e HPV82, vários sendo HPVsde alto risco.

Em ainda outra forma de realização, o método emprega sondasde bloqueador além de CSP e SSP. Uma sonda de bloqueador compreendeseqüências que são substancialmente complementares a seqüências de CSP. Aseqüência de uma sonda de bloqueador é preferivelmente pelo menos 75%complementar à seqüência de CSP, mais preferivelmente 100%$complementar à CSP. A adição de sondas de bloqueador para a mistura dereação de hibridização evita que CSP não hibridizado hibridize paraseqüências de ácido nucleico reativas cruzadas presentes no alvo e assimaumenta a especificidade da detecção. A sonda de bloqueador é geralmentepelo menos cerca de 5 bases a cerca de 12 bases. Em uma forma de realizaçãoda invenção, a concentração da sonda de bloqueador na reação dehibridização está preferivelmente em excesso da de CSP e SSP.

Preferivelmente, a sonda de bloqueador está presente em cerca de um excessomolar de 2 vezes, apesar de que pode estar presente em até um excesso molarde 10.000 vezes. As sondas de bloqueador podem ser DNA, RNA, peptídeo,ácidos nucleicos não específicos (PNAs), ou outros análogos de ácidonucleico.

Em uma forma de realização, as sondas de bloqueadorcomplementares ao comprimento completo ou comprimento quase completode CSP são usadas. Após a reação em que o híbrido entre CSP, SSP e o ácidonucleico alvo é formado, uma ou mais sondas de bloqueador pode seradicionada à reação e a hibridização é continuada durante um tempo desejado.

Os produtos de hibridização são então detectados como descrito acima.Em outra forma de realização, as sondas de bloqueador complementares a somente uma porção do CSP e mais curtas do que CSP são usadas. Estas sondas de bloqueador têm temperaturas de fusão mais baixas do que CSPs. Preferivelmente, a temperatura de fusão da sonda de bloqueador é de 10 graus menor do que a de CSP. Nesta forma de realização, a sonda de bloqueador é preferivelmente adicionada aos ácidos nucleicos alvos simultaneamente com o CSP e SSP. Porque a sonda de bloqueador tem uma temperatura de fusão menor do que o CSP, a temperatura inicial para a hibridização é selecionada de modo que a sonda de bloqueador não interfere com a hibridização dos CSP para suas seqüências de alvo. No entanto, quando a temperatura das misturas de hibridização é ajustada abaixo da temperatura usada para a hibridização do alvo, a sonda de bloqueador hibridiza para o CSP e efetivamente bloqueia o CSP da hibridização para as seqüências de ácido nucleico reativas cruzadas. Por exemplo, quando os produtos de hibridização são incubados em temperatura ambiente em uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina durante a captura do híbrido, as sondas de bloqueador podem ser adicionadas. Os exemplos não limitativos de sondas de bloqueador são encontrados na tabela 2.

Os seguintes exemplos ilustram o uso do presente método de amplificação e teste e kit de detecção. Estes exemplos são oferecidos a título de ilustração, e não se destinam a limitar o escopo da invenção de qualquer modo. Todas as referências descritas aqui são expressamente incorporadas in toto por referência.

EXEMPLO 1

Protocolo de teste HYBRID CAPTURE (TSHC) específico para alvo

As partículas virais de vírus de herpes simplex 1 (HSV-1) e vírus de herpes simples 2 (HSV-2) de concentração conhecida (Advanced Biotechnologies, Inc. Columbia, MD) ou amostras clínicas foram diluídas usando ou meio de controle negativo (Digene Corp. Gaithersburg, MD) ouamostras cervicais negativas (Digene Corp.). Várias diluições foram feitas e divididas em alíquotas em tubos de microcentrífuga individuais. Um meio-volume de reagente de desnaturação 5100- 0431 (Digene Corp.) foi adicionado. As amostras de teste foram incubadas a 65 °C durante 45 min para permitir a desnaturação de ácidos nucleicos nas amostras.

Após desnaturação, uma solução de hibridização contendo sondas de seqüência de sinal (SSPs) (600 ng/ml cada) e sondas de seqüência de captura (CSPs) (2,5 pmols/ml cada) foram adicionadas à amostras, e incubadas a 74 °C durante 1 h. As sondas de bloqueador em uma solução contendo um volume de 4 x diluente de sonda (Digene Corp.,), um volume de reagente de desnaturação e dois volumes de meio de controle negativo foram então adicionadas à mistura de hibridização e incubadas a 74 °C durante 15 minutos.

Em uma segunda série de experiências, após a desnaturação de ácidos nucleicos, uma mistura de hibridização contendo SSPs (600 ng/ml cada, CSPs (2,5 pmols/ ml cada) e sondas de bloqueador (250 pmols/ ml cada), foram adicionadas às amostras e incubadas a 74 °C durante 1 h.

Os tubos contendo mistura de reação foram resfriados a temperatura ambiente durante 5 min, e alíquotas foram tomadas de cada tubo e transferidas para cavidades individuais de uma placa de captura de estreptavidina de 96 cavidade (Digene Corp.) As placas foram agitadas a 1100 rpm a temperatura ambiente durante 1 h. Os sobrenadantes foram então decantados e as placas lavadas duas vezes com tampão de lavagem SNM (Digene Corp.) e invertidas brevemente para remover tampão de lavagem residual. O reagente DR-1 de anticorpo anti- RNA /DNA de fosfatase alcalina (Digene Corp.) foi então adicionado a cada cavidade e incubado a temperatura ambiente durante 30 min. As cavidades foram então submetidas a etapas de lavagem múltiplas que incluem: 1) três lavagens com tampão de lavagem Sharp (Digene Corp.) em temperatura ambiente, 2 ) incubação da placa com otampão de lavagem Sharp a 60°C durante 10 min em bloco quente, 3) duas lavagens com o tampão de lavagem Sharp em temperatura ambiente e 4) uma lavagem com o tampão de lavagem SNM (Digene Corp.) em temperatura ambiente. Após a remoção do líquido residual, o substrato luminescente 5100-0350 (Digene Corp.) foi adicionado a cada cavidade e incubado a temperatura ambiente durante 15 min. As cavidades individuais foram então lidas em um luminômetro de placa para obter o sinal de unidade de luz relativa (RLU).

As soluções contendo meios de controle negativo ou amostras cervicais negativas HSV conhecidas foram usadas como controles negativospara as amostras de teste. A relação de sinal para ruído (S/N) foi calculada como a relação de RLU médio obtido de uma amostra de teste para o RLU médio do controle negativo. A relação de sinal para ruído foi usada como a base para a determinação da eficiência de captura e a detecção de ácidos nucleicos alvos. Um valor S/N de 2 ou maior foi designado arbitrariamentecomo um sinal positivo enquanto que um valor S/N menor do que 2 foi considerado negativo. O coeficiente de variação (CV) que é uma determinação da variabilidade da experiência dentro de um conjunto de amostra foi calculado tomando-se o desvio padrão das réplicas, dividindo o mesmo pela média e multiplicando este valor por 100 para dar um valor percentual.

As sondas de seqüência de captura e as sondas de bloqueador usadas nas experiências foram sintetizadas usando o método descrito por Cook et al (1988, Nucl. Acid. Res. 16: 4077- 95). Salvo indicado em contrário, as sondas de seqüência de captura usadas nas experiências descritos aqui foram rotuladas com biotinas em suas extremidades 5' e 3*.

As sondas de seqüência de sinal usadas nas experiências são sondas de RNA. Estas sondas foram preparadas usando o método descrito por Yisraeli et al (1989, Methods in Enzymol. 180: 42-50).

Todos os CSPs foram testados para suas capacidadesespecíficas de tipo em testes HYBRID CAPTURE específica de tipo, aqui descritos. Os seguintes CSPs, isto é, SEQ ID NO: 36-56, não mostram propriedades reativas cruzadas com outros tipos e foram aceitos para uso no teste.

Tabela 1 - Sondas de seqüência de captura para HPV

<table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>Tabela 2 Sondas de bloqueador para HPV

<table>table see original document page 39</column></row><table>

EXEMPLO 2

Efeito da distância entre o CSP e os sítios de alvo de SSP em eficiência de captura

O efeito da distância entre os sítios de hibridização de sonda de seqüência de captura (CSP) e a sonda de seqüência de sinal (SSP) em um ácido nucleico de alvo de HSV-1 em eficiência de captura foi avaliado. CSPs que hibridizam para seqüências de ácido nucleico de HSV-1 que estão localizadas 0,2 kb, 3 kb, 18 kb, 36 kb e 46 kb do sítio de hibridização de SSP foram testados. O método TSHC geral descrito no exemplo 1 foi empregado. As eficiências de captura foram 100%, 50%, 30%, 19% e 7%, respectivamente (tabela 3). Um declínio uniforme nas eficiências de captura relativas foi observado como a distância aumentou de 0,2 Kb a 46 Kb.

Tabela 3: Efeito de distância entre sítios alvos em eficiência de captura

<table>table see original document page 39</column></row><table>EXEMPLO 3

Eficiência de captura de vários CSPS e SSPs em detecção de TSHC de HSV-1

A eficiência de captura de sondas de seqüência de captura (CSPs) para cada uma das quatro sondas de seqüência de sinal específicas para HSV-1 (SSPs), H19, RH5B, RH3 e RIO, na detecção de HSV-1 por TSHC foram avaliados. Os critérios usados para projetar as sondas de seqüência de captura foram: 1) sítio de hibridização de CSP está em 1 kb ou 5' ou 3' do sítio de hibridização de SSP na seqüência de ácido nucleico de HSV- 1, preferivelmente em 0,5 kb, e 2) os CSPs contém seqüências que são singulares para HSV-', sem extensões de homologia de seqüência para HSV-2 maiores do que 10 bases. Os CSPs foram projetados para marcar as regiões 5' e 3' adjacentes ao sítio de hibridização de SSP, preferivelmente com um 5' CSP e um 3' CSP para cada SSP. O software OMIGA comercialmente disponível (Oxford Molecular Group; Campbell, CA) foi útil na identificação de tais sítios. A temperatura de fusão (Tm) do CSPs foi projetada para estar entre 70°C a 85 °C. O método TSHC geral descrito no exemplo 1 foi empregado. Onze CSPs (que ligam a 6 sítios diferentes) para H19, seis CSPs (que ligam a três sítios singulares) para RH5B, seis CSPs (que ligam a seissítios singulares) para RH3, e dois CSPs para RIO foram testados. Como mostrado na tabela 4, as sondas de seqüência de captura eficientes foram encontrada para as sondas de seqüência de sinal H19, RH5B e RIO.

Tabela 4: CSPs e SSPs para detecção de TSHC de HSV-1

<table>table see original document page 40</column></row><table>

EXEMPLO 4

Testes de amostras clínicasUm painel de amostra clínica de 64 membros foi testado para HSV-1 e HSV-2 usando ambos TSHC e métodos de captura de híbridos (hc2™; Digene Corp.). O painel incluía 15 amostras contendo quantidades conhecidas de HSV-1 ou HSV-2, e 49 amostras conhecidas para serem negativas para HSV-1 e HSV-2 por teste PCR. Conseqüentemente, as 15 amostras positivas foram "esperadas" para testar positivo em ambos os testes HC2 e TSHC, e as 49 amostras negativas foram "esperadas" para testar negativo em ambos os testes HC2 e TSHC.

O método TSHC geral descrito no exemplo 1 foi empregado.

Os resultados usando o método HC2 e o método TSHC são mostrados nas tabelas 5 e 6, respectivamente. Dentre as 49 amostras "esperadas" para dar resultado negativo, 5 amostras testaram positivo e 44 amostras testaram positivo usando o método HC2. Em comparação, todas as 49 amostras testaram negativo usando o método TSHC. Assim, o método TSHC é superiorem especificidade ao método HC2 na detecção de HSV-1 e HSV-2.

Tabela 5: Resultados observados versus esperados para detecção de HC2 de

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tabela 6: Resultados observados versus esperados para detecção TSHC de HSV1 e HSV2

<table>table see original document page 41</column></row><table>

EXEMPLO 5

Efeito de combinar sondas em detecção de TSHC de HSV

O efeito de combinar sonda de sinal específica para HSV-1 e conjuntos de sonda de seqüência de captura em detecção de HSV-1 foiavaliado. A detecção de TSHC de reatividade cruzada de HSV-1 e HSV-2 foi realizada em separado com dois conjuntos diferentes de sonda de combinações de seqüência de sinal de RNA / sonda de seqüência de captura biotinilada (conjunto 1: H19 mais HZ-1; e conjunto 2: RH5b mais o TS-1 e TS-2). TSHC também foi realizado com ambos os conjuntos de seqüência de sinal de RNA / sonda de seqüência de captura biotinilada combinados para avaliar o efeito de combinar os dois conjuntos de sondas em sensibilidade e reatividade cruzada. O método TSHC geral descrito no exemplo 1 foi empregado. Os resultados mostrados na tabela 7 claramente demonstram um efeito aditivo de combinar os dois conjuntos de sonda para detecção de HSV-1 sem aumento aparente na reatividade cruzada de HSV-2. Tabela 7: A sensibilidade é melhorada por combinação de CSPs específicos

<table>table see original document page 42</column></row><table>

EXEMPLO 6

Detecção de tipos de HPV em formato multiplex

A detecção rápida, sensível e específica de 13 seqüências representando diferentes tipos de papilomavírus humano (HPV) em uma amostra biológica única foi realizada em formato multiplex. Este teste pode analisar até 96 amostras em um formato de microplaca de 96 cavidades em um período de tempo de 5 h. Pelo menos 500 cópias de um tipo de vírus podem ser detectadas em 5 após começar o teste.

As contas paramagnéticas de proteína G (Dynal Corp.; BrownDeer, WI) e contas de carboxilato de Luminex® 100™ (Luminex Corp., Austin, TX) foram usadas como suportes sólido. RNA de HPV foi preparado por transcrição in vitro de plasmídeos de HPV como comumente entendido na técnica e descritos por Ausubel, et al. [Current Protocols in Molecular Biology, New York, Wiley Publishing, 1993, incorporado aqui por referência]. O teste novo tem três etapas incluindo 1) enriquecimento de alvo; 2) amplificação de alvo; e 3) detecção de alvo.

Enriquecimento de alvo:

Uma amostra foi preparada para amplificação por separação deDNA indesejado ou não específico e contaminantes de alvos específicos pré-selecionados. Esta etapa remove o DNA não desejado, cuja presença substancialmente diminui a sensibilidade de amplificação do alvo. O enriquecimento do alvo foi realizada por captura de híbridos DNA: RNA específicos da seqüência sobre contas paramagnéticas. As contas foram inicialmente modificadas com anticorpos específicos para híbridos RNA:DNA ou anticorpos HYBRID CAPTURE (Digene, Corp.). Mais especificamente, as contas paramagnéticas HC-Ab foram preparadas por misturar 1 mL de contas magnéticas Protein G (2,7 X IO9 contas/mL; Dynal, Corp.) com 375 ug de HC-Ab e incubando em temperatura ambiente em PBS durante 40 minutos formando complexos conta- anticorpo (conta-Ab). Os complexos conta-Ab foram acumulados no fundo da cavidade por colocação da placa sobre uma grade magnética (Dynal, Corp.) e lavados uma vez com 0,2 M de trietanolamina, pH 8,2. Os anticorpos foram reticulados em Protein G em um reagente de 20 mM de DMP/0,2 M de trietanolamina, pH 8,2durante 30 minutos. Os complexos conta-Ab foram lavados 3X com 1 mL de PBS-0,05% de Tween 20. As contas foram então recolocadas em suspensão em 1 mL de PBS-Tween e armazenadas a 4 °C.

A amostra foi diluída em série com vários plasmídeos de HPV (10 kb) preparados em uma solução composta de 100 ug/ml DNA de espermade arenque, 1 M de guanidina - HC1, 10 mM de Tris - HC1 (pH 8,0), 10 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio em água deionizada. Cada uma das amostras diluídas (50 ul) foi misturada em uma microplaca de 96 cavidades contendo 25 ul de 1,75 M de NaOH por cavidade e incubada a 50°C durante 15 minutos para desnaturar a amostra. Um coquetel de 13 tipos de RNA de HPV selecionado dentre a tabela 1 (15 ng cada por teste) foi adicionado nas amostras desnaturadas em solução neutralizante: 25 uL de 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6 BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácido poliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio, e 0,4% de Tween-20 (pH 3,6 - 4,1). As contas paramagnéticas conjugadas ao anticorpo HYBRID CAPTURE (HC-ab) (5,4 x IO6 contas por teste) foram então imediatamente adicionadas na amostra neutralizada. O RNA de HPV e os conjugados de contas paramagnéticas -anticorpo foram hibridizados nas seqüências alvo de amostra durante 30 minutos a 65 °C com agitação a 1100 rpm. Os complexos de contas paramagnéticas - alvo foram acumulados no fundo da cavidade por colocação da placa sobre uma grade magnética (Dynal, Corp.). O sobrenadante foi aspirado por pipeta e as contas foram lavadas três vezes usando um tampão de lavagem (40 mM de Tris pH 8,2, 100 mM de cloreto de sódio, 0,05% de azida de sódio e 0,05% de Tween-20), assim removendo quaisquer contaminantes.

Amplifícação de alvo:

Amplificação isotérmica do DNA alvo de amostra foi realizada usando iniciadores aleatórios e DNA polimerase tendo atividade de deslocamento de filamento. Os alvos de DNA foram amplificados usando phi29 DNA polimerase iniciadas com pentâmeros aleatórios. Os iniciadores pentâmeros foram sintetizados com duas ligações de fosforotioato na extremidade 3' para evitar a degradação por nuclease. Outras modificações podem incluir, mas não são limitadas para, grupos 2'O-metila que são incorporados na estrutura dos iniciadores. O DNA alvo foi amplificadodurante 2 horas, contas paramagnéticas com ácido nucleico alvo capturado, obtido na etapa de enriquecimento do alvo, foram recolocadas em suspensão em 20 ul de reação composta de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 10 mM de (NH^ S04, 4 mM de DTT, 200 ug/ml BSA acetilado, 400 uM de cada dNTP, 125 uM de pentâmeros aleatórios e 1U de phi29 DNA polimerase (New England Biolabs, Inc) e incubadas durante 2 horas a 30°C.

Iniciadores que podem ser utilizáveis na etapa de amplificação são listados abaixo.

Sonda HPV16 5'-\FAM\ TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAG-3'\BHQ (SEQIDNO: 125)

Iniciador dianteiro 5 '-GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT-3' (SEQ ID NO: 126)

Iniciador reverso 5'-CATATACCTCACGTCGCAGTAACT-3' (SEQ ID NO: 127)sonda de rótulo duplo e iniciadores (Integrated DNA Technologies, Inc.; Salt Lake City, UT)

* repórter FAM- fluorescente, BHQ- "black hole quencher"

Detecção de alvo:

Seqüências amplificadas foram detectadas usando um sistemade arranjo de contas à base de líquido que integra o processamento óptico, de fluidos, e sinal permitindo as capacidades multiplex. tecnologia Luminex). A tecnologia Luminex usa um sistema de teste altamente sensível com base em microcontas fluorescentes e moléculas de repórter que pode detectar alvos múltiplos na mesma cavidade de teste (ver, patente U.S. números 5.981.180; 6.524.793; 5.736.330; 6.449.562; 6.592.822; 6.632.526; 6.514.295; 6.599.331; 6.046.807?; e 6.366.354). O instrumento de detecção Luminex usa dois laseres: um para a detecção da própria conta fluorescente e a outra para o repórter fluorescente. As contas fluorescentes bi-coloridas permitindo a detecção multiplex de até cerca de 100 diferentes alvos. A tecnologiaLuminex foi aplicada a tipificação de HPV neste exemplo. Este método aumentou a sensibilidade e a robustez da plataforma.

Duas seqüências de oligonucleotídeos complementares às regiões tardia (L) e prematura (E) [MH Einstein and GN Goldberg, Câncer Invest. 20: 1080 - 1085, 2002, incorporado por referência] sobre o tipo de HPV específico foram conjugadas nas contas carboxiladas Luminex, coloridas de modo diferente, comercialmente disponíveis, usando o protocolo do fabricante. As seqüências de oligonucleotídeos de captura foram apresentadas na tabela 1. Dois oligonucleotídeos de um tipo de HPVespecífico foram fixados ao mesmo conjunto de contas, assim eliminando os resultados falsos negativos causados pela deleção da região L do HPV que pode ocorrer em células de câncer. Uma etapa de purificação de amplicon não foi requerida antes da etapa de detecção porque a hibridização pode ser realizada no mesmo tubo que mantém as contas paramagnéticas introduzidas durante a primeira etapa de enriquecimento do alvo.

A etapa de detecção do teste começa com a desnaturação do amplicon em 75 ul de 438 mM de NaOH a 70°C durante 15 minutos. Um coquetel de 13 tipos diferentes de HPV RNA (15 ng cada por teste) foi adicionado na amostra desnaturada em 25 ul de 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6 BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácido poliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% de Tween-20 (pH 3,6 - 4,1). Então, os 13 tipos de oligonucleotídeos são cada conjugados a contas de poliestireno Luminex carboxiladas (5 x 103 contas por teste) e imediatamente adicionados na amostra neutralizada. O RNA e os conjugados de contas - oligonucleotídeos foram hibridizados no alvo durante 30 minutos a 65°C enquanto agitando a 1100 rpm. As amostras foram então filtradas através de uma placa de filtro de 96 cavidades (Whatman) e as contas foram recolocadas em suspensão em 100 ul de lx solução salina tamponada com fosfato (PBS), 0,05%) de Tween-20,10% soro de cabra e 10 ng de anticorpos monoclonais de camundongo específicos de híbrido DNA: RNA rotulados com ficoeritrina (PE-HC-Ab). As amostras foram incubadas por 30 min a temperatura ambiente (18-25 °C) enquanto agitando a 1100 rpm. O anticorpo em excesso foi removido por filtração a vácuo e as contas com os complexos de alvo foram recolocadas em suspensão em 100 uL PBS com 0,05% Tween -20. As amostras foram então analisadas por citômetro de fluxo Luminex após ajustar o ganho do tubo fotomultiplicador a 700 volts.

A sensibilidade melhorada desta etapa resultou de sondas de seqüência de sinal de RNA longas (6500 bp, comprimento aproximado) que permitem a ligação de anticorpos de ficoeritrina múltiplos (PE-Ab), que assim resultaram em uma amplificação de cerca de 500 vezes de sinal comparado com outras técnicas de detecção, como as que usam fluoróforos conjugados a sondas de hibridização curtas. As sondas de seqüência de sinal de RNApodem ter um comprimento na faixa de cerca de 500 bases a cerca de 10 quilobases, ou até apenas menos que 100% do comprimento do ácido nucleico alvo.

Os resultados mostrados na tabela 8 demonstram a sensibilidade da detecção de HPV16 na presença de todos os 13 conjuntos decontas de tipo de HPV. A sensibilidade de detecção para plasmídeos foi maior do que 500 cópias por teste como indicado pela relação robusta de sinal para ruído. O volume de amostra inicial foi de 50 ul, mas pode ser aumentado a 500 ul ou mesmo a amostra completa (para uso em teste à base de tubos, não mostrados), que irão aumentar a sensibilidade do teste a um grau ainda maior.

Os resultados também demonstraram a especificidade para detecção de HPV 16. Não foi detectado essencialmente nenhum sinal em conjuntos de contas específicos para os alvos de HPV em vez de HPV 16. Os sinais da tabela 8 (média, n = 4 réplicas, % CV entre 3 e 31%) são as intensidades fluorescentes medianas (MFI) para 100 contas (eventos) por amostra contada pelo citômetrode fluxo. O valor dos antecedentes ou ruído é o MFI das amostras nãocontendo alvo.

A tabela 9 demonstra a sensibilidade e especificidade dedetecção de todos os 13 tipos de HPV. Os tipos de HPV alvo são listados aolongo do eixo x e as sondas de ácido nucleico são listadas ao longo do eixo y.

O mesmo alvo de HPV e sonda de HPV para cada tipo é destacadodiagonalmente através da tabela (resultado positivo). Estas caixas demonstramo nível elevado de especificidade da sonda para seu alvo de HPV. Esta experiênciaconfirma que as sondas são específicas para alvos de tipo de HPVcorrespondentes. Os resultados na tabela 9 mostram que, por exemplo, o alvo deHPV 16 se liga somente à sonda de HPV 16 correspondente (resultado positivo) enão liga as sondas para outros tipos de HPV (resultado negativo).

Tabela 8- Sensibilidade da detecção de HPV 16

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Tabela 9: Especificidade de tipos de HPV

<table>table see original document page 48</column></row><table>EXEMPLO 7

Detecção de HPV 16, HPV58 e HPV33

Amostras cervicais infectadas com tipos múltiplos de HPVforam modeladas por misturação de três plasmídeos cada inserido com umtipo diferente de seqüência de HPV (10 kb) no tampão da amostra indicado noexemplo 6. Este exemplo demonstra a capacidade do teste de detectarinfecções múltiplas, quando mais do que um tipo de HPV está presente naamostra.

O teste de amostras de alvos múltiplos foi realizado comoilustrado no exemplo 21. As amostras consistiram de 1 x IO2 cópias de HPV16, 1 x IO4 cópias de HPV 58 e 1 x IO6 cópias de HPV 33. Resultados nafigura 7 demonstraram que o alvo de HPV 16 em baixa abundância foidetectado mesmo na presença altamente abundante de outros tipos de HPV.Figura 7 demonstra que HPV 16 tem uma relação de sinal para ruído baixa,onde os sinais (médio, n=4 replica, % CV (coeficiente de variação) entre 3% e31%) são as intensidades fluorescentes medianas (MFI) para 100 contas(eventos) por amostra contados pelo citômetro de fluxo. O valor de ruído é oMFI de amostras não contendo os plasmídeos alvos.

EXEMPLO 8

Detecção de HPV em amostras clínicas

HPV foi detectado em amostras cervicais, onde as amostrascervicais foram coletadas em meios de transporte de amostras (STM; DigeneCorp., Gaithersburg, MD) e inicialmente tríadas para os tipos de HPV de altorisco usando o teste HC2 High-Risk HPV DNA Test ™ (Digene Corp.). Osresultados de teste HC2 foram comparados com os do teste de tipificação deHPV descrito na invenção.

Amostras cervicais foram coletadas usando uma escova emantidas em um meio de armazenamento (1 M de guanidina - HC1, 10 mM deTris - HC1 (pH 8,0), 10 mM de EDTA, e 0,05% de azida de sódio e águadeionizada) até uso. Alíquotas (50 ul) de amostras cervicais foram analisadaspor HC2 (Digene Corp) de acordo com as instruções do fabricante ou pelométodo descrito no exemplo 6. A fim de comparar a sensibilidade dos doistestes, a amostra positiva foi serialmente diluída em uma amostra cervical seminfecção de HPV.

Tabela 10: Comparação de sensibilidade detecção de amostras clínicas

<table>table see original document page 50</column></row><table>

A sensibilidade de HC2 em amostras clínicas é registrada natabela 10 e mostra um sinal/ corte de 2,3 (100 vezes de amostra diluída) quecorresponde aproximadamente a 10.000 HPV alvos por teste.

Conseqüentemente, quando comparada com a sensibilidade do teste detipificação de HPV da invenção, a invenção é pelo menos 100 vezes maior eigual a 100 cópias por teste com uma relação de sinal para ruído (S/N) decerca de 43.

EXEMPLO 9

Detecção de formas circular, linear e integrada de DNA de HPV

O teste da invenção pode detectar seqüências de DNA que sãolineares, assim como, circulares. Assim, a amplificação que ocorre no testeinventivo não ocorre necessariamente pelo fenômeno de "círculo rolante".Assim, os alvos do teste inventivo não precisam ser circulares. Eles podem serlineares, ou porque o DNA patogênico circular sofre uma incisão pordesnaturação, ou porque os alvos de DNA patogênico (viral) são integradosno genoma hospedeiro linear (humano), ou porque o DNA patogênico é umgenoma linear.

Amostras incluindo diluições em série de plasmídeo de HPV16 que são ou diluições lineares ou circulares ou em série de DNA purificadode células CaSki foram diluídas em tampão de TE. Plasmídeos lineares foramcriados por digestão de endonuclease de restrição dos plasmídeos circularesusando técnicas padrões. DNA de células CaSki é DNA genômico humanoque contém 500 cópias de genomas virais de HPV 16 integradas por genomahumano. A concentração de cópias HPV 16 por teste para o DNA das célulasCaSki foi calculada a partir dos tamanhos e relações dos dois genomas,humano e HPV, e as medidas de densidade óptica do DNA de CaSkipurificado.

Alvos foram desnaturados por calor a 95 °C durante 3 minutosna presença de iniciadores aleatórios imediatamente antes da amplificação em50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM de EDTA e 50 uM de iniciador dehexâmero (fosforotioado em ligações 3' finais). Os alvos de filamento únicoforam então amplificados durante 120 minutos a 30°C em 20 ul de reaçõescompostas de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 10 mM de(NH4)2S04, 4 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA acetilado, 400 uM de cadadNTPs, 0,13 mM de hexâmeros aleatórios e 10 U de phi29 DNA polimerase(Epicentre, Inc).

Os alvos amplificados foram detectados como descrito noexemplo 6 com a seguinte exceção. Os complexos híbridos de RNA:DNAforam etiquetados primeiro com um anticorpo primário anti-RNA: DNAmonoclonal de camundongo (10 }ig/teste) e então com um anticorposecundário IgG anti-camundongo de cabra conjugado com ficoeritrina (1,6ug/teste).

Os resultados na tabela 11 demonstram que o teste da invençãodetectou DNA circular, linear e integrado com relações robustas sinal/ ruído,assim demonstrando que a eficácia do teste não foi dependente do mecanismode "círculo rolante". No entanto, o mecanismo de "círculo rolante" pode teracelerado a reação, porque o alvo circular foi amplificado mais eficientementedo que o alvo linear.

Tabela 11: Detecção de alvos lineares, circulares e integrados com o método<table>table see original document page 52</column></row><table>

Os sinais foram médias (n=2) das intensidades fluorescentesmedianas (MFI) para 100 contas (eventos) por amostra contados pelocitômetro de fluxo. O valor do ruído é o MFI médio de amostras não contendoplasmídeos alvos.

EXEMPLO 10

Amplifícação isotérmica catalisada por phi29 DNA polimerase usandooligonucleotídeos aleatórios

Outra forma de realização da etapa de amplifícação do alvoutiliza oligonucleotídeos modificados otimizado no comprimento dosiniciadores aleatórios. Os pentâmeros aleatórios, 5'-NpNpNpsNpsN-3' foramfeitos por IDT, Inc. Para os dados gerados neste exemplo o plasmídeo deHPV 16 foi amplificado em um volume de reação total de 20 uL comamplifícação isotérmica durante 2 horas a 30°C. O alvo de DNA foidesnaturado com calor durante 3 minutos a 95 °C em 10 ul de 50 mM de Tris-HC1, pH 8,0, 0,5 mM de EDTA, 50 uM de iniciadores. A amplifícaçãoisotérmica foi realizada em 20 ul de 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM deMgCl2, 10 mM de (NHO2 S04, 4 mM de DTT, 200 ug/ml de BSA acetilado,400 uM de cada dNTP, 125 uM de pentâmeros aleatórios e 1 U de phi29DNA polimerase (New England Biolabs, Inc) durante 2 horas a 30°C.Seguindo a amplifícação, metade dos volumes (10 uL) dos amplicons foidetectada no sistema de citometria de fluxo Luminex usando o protocolode detecção de anticorpo "primário/ secundário" como descrito no exemplo 11.

Tabela 12: Pentâmeros de DNA aleatórios são o comprimento de iniciadorótimo. Todos os iniciadores tem duas modificações de fosforotioato naextremidade 3'<table>table see original document page 53</column></row><table>

* Valores = MFI médio Luminex

Tabela 13: Comparação de diferentes comprimentos e modificações deiniciador aleatório

<table>table see original document page 53</column></row><table>

* Valores = MFI médio Luminex

Tabelas 12 e 13 mostram que iniciadores de hexâmero deDNA aleatório foram ótimos com uma modificação de fosforotioato einiciadores que foram pentâmeros de DNA aleatório foram ótimos com duasmodificações de fosforotioato.

EXEMPLO 11

Métodos diferentes de detecção de alvo amplificado

Três protocolos diferentes de detecção de alvos amplificadosforam comparados. Um meio utilizou sondas biotiniladas que sãooligodeoxinucleotídeos rotulados com biotina na extremidade 5'. Estesoligonucleotídeos foram preparados pela síntese química por Integrated DNATechnology, Inc.; Salt Lake City, UT. As duas outras abordagens usaram HC-Ab primário rotulado (Digene Corp.) e seqüencialmente usaram HC-Abprimário e anticorpo secundário rotulado (Digene Corp.), representando duasformas de realização da invenção. A combinação de detecção de citometria defluxo de contas rotuladas com anticorpo ou coloridas, e a amplificação dosinal resultou em um sinal aumentado e, assim, a sensibilidade do testeaumentou mais do que 10 vezes. A amplificação do sinal deve normalmenteaumentar o fundo do teste como seria a presença de um complexo grandesobre as contas, assim diminuindo ou eliminando a sensibilidade. No entanto,o método da invenção descrito prove um aumento no sinal e sensibilidade. Ocomplexo grande nas contas pode interferir com o modo de detecção que sebaseia em um determinado tamanho das contas no sistema de citometria defluxo Luminex. Ambos os problemas citados são superados pelo método dainvenção.

A. Em um método, uma sonda biotinilada complementar aoácido nucleico alvo foi aplicada a estreptavidina conjugada a ficoetitrina (SA-PE; Pierce). O plasmídeo de HPV 16 amplificado foi desnaturado em 75 ul de438 mM de NaOH a 70°C durante 15 minutos. Dois nanogramas cada de duassondas 5'-biotiniladas (5'- Biotina-TATTTTATATGACACAATGT-3' (SEQID NO: 128); 5'- Biotina- GGTTTGTGCTAACAATAAATGTATCCATAG-3' (SEQ ID NO: 129)) foram adicionados à amostra de ácido nucleico alvodesnaturada em 25 ul de 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfato desódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6 BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3%de ácido poliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% deTween-20 (pH 3,6 - 4,1). Aproximadamente 1000 contas de poliestirenoforam conjugadas para oligonucleotídeos específicos para regiões de HPV 16L- e E- (ver tabela 1) e imediatamente adicionadas na amostra neutralizada. Ahibridização foi realizada durante 30 minutos a 50°C enquanto agitando a1100 rpm. SA-PE (100 ng) em 100 ul de 438 mM de NaOH, 0,125 M decitrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácido poliacrílico, 5 mM deEDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% de Tween-20 foram adicionados emcada reação e incubados em temperatura ambiente durante 5 minutos. Asamostras foram então transferidas para uma placa de filtro onde os materiaisnão ligados foram removidos por filtração a vácuo. As contas foramrecolocadas em suspensão em 100 ul de PBS-0,05% de Tween-20 eanalisadas por citometria de fluxo Luminex após ajustar o ganho do tubofotomultiplicador a 700 volts.

B. No segundo método, o plasmídeo de HPV 16 amplificadofoi desnaturado em 75 ul de 438 mM de NaOH a 70°C durante 15 minutos.Um coquetel de 13 tipos diferentes de RNA de HPV (cada 15 ng por teste,obtidos como descrito no exemplo 6) foi adicionado na amostra desnaturadaem 25 ul de 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 Mde trietanolamina, 0,6 BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácidopoliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% de Tween-20(pH 3,6 - 4,1). Treze conjuntos de contas de poliestireno conjugadas aoligonucleotídeos (5 x IO3 contas por teste) foram imediatamente adicionadosna amostra neutralizada. Cada conjunto de conta tem duas seqüências deoligonucleotídeo complementares às regiões tardia (L) e prematura (E) sobreo tipo de HPV específico. As seqüências de oligonucleotídeos de capturaforam apresentadas na tabela 1. O RNA e o conjugados de contas-oligonucleotídeos foram hibridizados no ácido nucleico alvo durante 30minutos a 65 °C com agitação a 1100 rpm. As amostras foram então filtradasem uma placa de filtro de 96 cavidades (Whatman) e 1 ug de HC-Ab primárioem 100 ul de PBS- 0,05% de Tween-20 foi adicionado. Após agitar emtemperatura ambiente durante 5 minutos, as reações foram filtradas e 8 ug deanticorpo secundário rotulado PE (anti-camundongo de cabra) em 100 ul dePBS, 0,05%o de Tween-20, e 10% de soro de cabra foram adicionados. Aincubação continuou durante 20 minutos enquanto agitando em temperaturaambiente. O anticorpo em excesso foi removido por filtração a vácuo e ascontas com complexos de alvos foram recolocadas em suspensão em 100 ulde PBS com 0,05% de Tween-20. As amostras foram então analisadas porcitometria de fluxo Luminex após ajustar o ganho do tubo dofotomultiplicador a 700 volts.

C. No terceiro método, o plasmídeo de HPV 16 amplificadofoi desnaturado em 75 ul de 438 mM de NaOH a 70°C durante 15 minutos.Um coquetel de 13 tipos diferentes de HPV RNA (cada 15 ng por teste,obtido como descrito no exemplo 6) foi adicionado na amostra desnaturadaem 25 ul de 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 Mde trietanolamina, 0,6 BES, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácidopoliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% de Tween-20(pH 3,6 - 4,1). Treze conjuntos de contas de poliestireno conjugadas aoligonucleotídeos (5 x 103 contas por teste) foram imediatamente adicionadosna amostra neutralizada. Cada conjunto de conta tem duas seqüências deoligonucleotídeo complementares para as regiões tardia (L) e prematura (E)do tipo de HPV específico. As seqüências de oligonucleotídeos de capturaforam apresentadas na tabela 1. Os conjugados de RNA e conta- oligo foramhibridizados para o alvo durante 30 min a 65 °C com agitação a 1100 rpm. Asamostras foram então filtradas através de uma placa de filtro de 96 cavidades(Whatman) e as contas foram recolocadas em suspensão em 100 ul de PBS,0,05% de Tween-20, 10% de soro de cabra e 10 ng de anticorpos específicospara RNA: DNA monoclonais de camundongo rotulados com ficoeritrina(PE-HC- Ab). As amostras foram então incubadas durante 30 minutos emtemperatura ambiente (18°-25°C) enquanto agitando a 1100 rpm. O excessode anticorpo foi removido por filtração a vácuo e as contas com complexosalvos foram recolocadas em suspensão em 100 ul de PBS com 0,05% deTween-20. As amostras foram então analisadas por citometria de fluxoLuminex após ajustar o ganho do tubo do fotomultiplicador a 700 volts.

A amplificação isotérmica de alvo de HPV 16 foi realizadacomo descrito no exemplo 6. O alvo amplificado foi detectado usando um detrês protocolos como descrito nos protocolos A, B ou C acima. Os resultadossão apresentados na tabela 14. Dentre estes três protocolos descritos, adetecção das sondas biotiniladas (protocolo A) envolveu a menor quantidadede tempo para realizar o método. No entanto, este método de detecçãotambém produziu a menor intensidade de sinal. A maior intensidade de sinal ea relação S/N foi obtida usando o esquema de detecção de anticorpo primáriorotulado (tabela 14) que implementou a amplificação de sinal HC-AB(protocolos B e C). Protocolo C utiliza uma etapa a menos do que o protocoloB e será assim preferível.

Tabela 14: Comparação de detecção de HPV 16 após amplificação isotérmica

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EXEMPLO 12

Tipificação de HPV em uma placa Nucleolink de 96 cavidades

Em uma forma de realização alternativa, uma placa demicrotitulação pode ser usada em vez de contas como um suporte sólido paraa detecção da seqüência. Os oligonucleotídeos específicos para tipos de HPVindividuais foram conjugados no fundo das cavidades. O ácido nucleico alvofoi hibridizado para os oligonucleotídeos de captura e então detectado porquimioluminescência.

Na preparação da placa de múltiplas cavidades NucleoLink™(Nalge Nunc International; New York), duas seqüências de oligonucleotídeocomplementares para as regiões tardia (L) e prematura (E) sobre o tipo deHPV específico foram conjugadas para a placa Nucleolink usando o protocolodescrito abaixo. Seqüências de oligonucleotídeos de captura são apresentadasna tabela 1. Ao substituir os dois oligonucleotídeos em cada cavidade,resultados negativos falsos causados pela deleção da região L de HPV comumem células de câncer podem ser eliminados. Os oligonucleotídeos de capturaespecíficos para o tipo (dois por cada tipo de HPV) contendo um ligador 5'-C12-amino foram preparados em uma concentração final 100 nM de (0,1pmole/uL) em uma solução recentemente preparada de 10 mM de cloridratode l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida contendo 10 mM de 1-metilimidizol, pH 7. Esta solução foi adicionada em 100 uL por cavidade (umtipo por cavidade) para uma placa de 96 cavidades Nucleolink, selada comfita termoestável e incubada a 50°C durante 4 horas. A solução foi entãodecantada e as cavidades foram lavadas três vezes, embebidas durante 5minutos e lavadas três vezes, todas com 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150mM de cloreto de sódio, e 0,1% de Tween-20 em temperatura ambiente. Ascavidades foram então lavadas três vezes, embebidas durante 5 minutos elavadas três vezes com água de tipo biologia molecular. As placas foramentão deixadas secar durante 30 minutos em temperatura ambiente. As placasforam armazenadas a 4 °C em um saco de etileno com dessecante aténecessário.

A placa NucleoLink com oligonucleotídeos covalentementeligados foi levada a temperatura ambiente após armazenagem. A placa foibloqueada com 290 uL por cavidade de 6% de caseína em 100 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0,05% de azida de sódio, durante 30 minutos em temperaturaambiente. Amostras de modelo (100 pg/mL) de diluições de plasmídeos deHPV (10 kb) preparadas em uma solução composta de 100 lag/mL DNA deesperma de arenque, 1 M de guanidina-HCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio em água deionizada. As amostras (50ul) foram misturadas em uma microplaca de 96 cavidades com 25 uL de1,75M de NaOH e incubadas a 70°C durante 30 minutos. Sonda de RNA nãorotulado (15 ng por teste) em 0,125 M de citrato de sódio, 0,125 M de fosfatode sódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6 de ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfônico, 0,83 M de ácido acético glacial, 3% de ácidopoliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida de sódio e 0,4% de Tween-20(pH 3,6 - 4,1) foi adicionada em cada cavidade na placa de hibridização. Asolução se tornou límpida ou levemente amarela. Os conteúdos de cadacavidade foram transferidos em suas respectivas cavidades na placaNucleolink. A placa foi incubada a 65 °C enquanto agitando a 1150 rpmdurante 1 hora. A placa foi resfriada em temperatura ambiente e a solução foidecantada. Uma solução (100 uL/cavidade) de anticorpo monoclonal anti-RNA - DNA de camundongo conjugado a fosfatase alcalina em 0,1 mM deTris-pH 7,4, 0,6 M de cloreto de sódio, 0,1 mM de cloreto de zinco, 1 mM decloreto de magnésio, 0,05% de azida de sódio, 0,25% de tween-20, 0,2mg/mL RNase, 4% de hidroxipropil-p-ciclodextrina, 0,05% IgG de cabra,0,0008%o de sulforhodamina B, com 30% de solução de bloqueio (6% decaseína em 100 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0,05%> de azida de sódio) foiadicionada em cada cavidade e a placa foi incubada a 37 °C durante 30minutos. A solução foi decantada e a placa foi lavada duas vezes com 128mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloreto de sódio; 0,05% de azida de sódio;0,24% de Tween e então 250 uL de 128 mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloretode sódio; 0,05% de azida de sódio; 0,24% de Tween foi adicionado em cadacavidade. A placa foi vedada com fita termoestável e incubada a 60°C durante10 minutos. A solução foi decantada e a placa foi lavada duas vezes mais com128 mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloreto de sódio; 0,05% de azida de sódio.

A placa foi então lavada duas vezes com 40 mM de Tris pH 8,2, 100 mM decloreto de sódio, 0,05% de azida de sódio. A solução foi decantada e 100 uLde substrato CPD-Star foram adicionados em cada cavidade. A placa foiincubada durante 20 minutos no escuro e lida no luminômetro DML. Tabela15 mostra as relações de sinal para ruído resultantes de 100 pg/mL de 7 alvosclonados de HPV diferentes como detectado pelo método descrito acima.

Tabela 15: Tipificação de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 e 52 em uma placa de96 cavidades

<table>table see original document page 59</column></row><table>

EXEMPLO 13

Efeitos de usar uma máscara em conjunto com uma placa de subcavidades

Uma solução de fosfatase alcalina foi adicionada no substratoCPD-Star. Esta solução (20 uL) foi adicionada nas subcavidades indicadas deuma placa de 384 cavidades (Digene Corp.) e incubada durante 20 minutos. Aplaca foi então lida no luminômetro de placa de 384 cavidades a cerca de 450nm com e sem a adição de uma máscara (Digene Corp.). Tabela 16 mostraque uma máscara que cobre cada cavidade / sub- cavidade aumenta a relaçãoS/N por mais que 100 vezes. A placa de subcavidade com a máscara évantajosa para superar a interferência cruzada previamente conhecida entre assubcavidades. Cada caixa de tabela 16 representa uma subcavidade única.Somente duas subcavidades tem substrato quimiluminescente, que sãorepresentadas em tipo de face negrito

Tabela 16: Interferência cruzada entre subcavidades vizinhas

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Subcavidades com substrato quimiluminescente adicionado são mostradasem negrito.

EXEMPLO 14

Tipificação de HPV em uma placa de 384 subcavidades

A detecção de tipos individuais assim como de tipos múltiplosde HPV em um formato de placa de subcavidade foi realizada. Nesteexemplo, amostra foi adicionada em cada cavidade e os alvos individuaismigraram e hibridizaram nas sondas de seqüência de capturacorrespondentes. O reagente de detecção foi adicionado na cavidade, onde éligado no alvo nas subcavidades positivas. A quimiluminescência foi usadapara detecção.

Os oligonucleotídeos de captura específicos para tipo (doisoligonucleotídeos por cada tipo de HPV) contendo um ligador 5'-C12-aminoforam preparados em uma concentração final de 5 uM de (5 pmole/uL) emuma solução de 500 mM de fosfato de hidrogênio de sódio, pH 8,5 contendo 1mM de sal dissódico de ácido etilenodiaminatetraacético. Esta solução foiadicionada a 20 uL por cavidade em cada subcavidade na placa desubcavidade (um tipo por subcavidade), vedada com fita termoestável eincubada a 42 °C durante 4 horas. A solução foi decantada e as cavidadesforam lavadas três vezes com TBS. A placa foi então imediatamente usada noteste de tipificação de HPV.

A placa foi bloqueada com 6% de caseína em 100 mM de Tris-HC1, pH 7,2, 0,05% de azida de sódio (1 mL por cavidade grande), durante 30minutos em temperatura ambiente. Amostras de modelo (100 pg/mL)consistem de diluição de plasmídeos de HPV (10 kb) preparadas em umasolução composta de 100 |ag/rnL de DNA de esperma de arenque, 1 M deguanidina-HCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de EDTA, 0,05% deazida de sódio em água deionizada. As amostras (500 ul) são misturadas emum tubo eppendorf com 250 uL de 1,75M de NaOH e incubadas a 70°Cdurante 30 minutos. A seguir, a sonda de RNA (15 ng por teste) em 0,125 Mde citrato de sódio, 0,125 M de fosfato de sódio, 0,6 M de trietanolamina, 0,6de ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfônico, 0,83 M de ácidoacético glacial, 3% de ácido poliacrílico, 5 mM de EDTA, 0,05% de azida desódio e 0,4% de Tween-20 (pH 3,6 - 4,1) foi adicionada em cada tubo. Asolução está agora límpida ou de tom amarelo claro. Os conteúdos de cadatubo (1 mL) foram transferidos para a respectiva cavidade na placa desubcavidade. A placa foi incubada a 65 °C com agitação a 1150 rpm durante 1hora. A placa foi resfriada em temperatura ambiente e a solução foidecantada. Uma solução (1 mL por cavidade grande) de anticorpo monoclonalanti- RNA: DNA de camundongo conjugado a fosfatase alcalina em 100 mMde Tris-pH 7,4, 0,6 M de cloreto de sódio, 0,1 mM de cloreto de zinco, 1 mMde cloreto de magnésio, 0,05% de azida de sódio, 0,25% de tween-20, 0,2mg/niL RNase, 4% de hidroxipropil-p-ciclodextrina, 0,05% IgG de cabra,0,0008% de sulforhodamina B, com 30% de solução de bloqueio (6% decaseína em 100 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 0,05% de azida de sódio) foiadicionado em cada cavidade e a placa foi incubada a 37 °C durante 30minutos. A solução foi decantada e a placa foi lavada duas vezes com 128mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloreto de sódio; 0,05% de azida de sódio;0,24% de Tween e então 1 mL de 128 mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloretode sódio; 0,05% de azida de sódio; 0,24% de Tween foi adicionado em cadacavidade. A placa foi vedada com fita termoestável e incubada a 60°C durante10 minutos. A solução foi decantada e a placa foi lavada duas vezes mais com128 mM de Tris pH 7,2; 0,6 M de cloreto de sódio; 0,05% de azida de sódio;0,24% de Tween. A placa foi então lavada duas vezes com 40 mM de Tris pH8,2, 100 mM de cloreto de sódio, 0,05% de azida de sódio. A solução foidecantada e 20 uL de substrato CPD-Star (Applera Corp.) foi adicionado emcada cavidade. A placa foi incubada durante 20 minutos no escuro e lida no384-luminômetro com uma máscara a cerca de 450 nm como descrito noexemplo 13.

Os resultados na tabela 17 demonstram a especificidade dadetecção de tipos de HPV individual e múltiplo na placa de subcavidade.Sinais mostrados em tipo de face negrito demonstram a especificidade dadetecção. Por exemplo, alvo de HPV 16 deu um sinal positivo quandoapresentado com sonda de HPV 16 somente e não dá nenhum sinal comsondas para outros tipos de HPV. No entanto, infecções múltiplas deramsinais múltiplos.

Tabela 17: Tipificação de HPV usando ligação passiva na placa de 384<table>table see original document page 63</column></row><table>

EXEMPLO 15

Comparação de método de detecção de HPV usando uma placa demicrotitulação e contas

Dois formatos de teste da invenção foram comparados onde aetapa de detecção é realizada em uma placa de microtitulação (comodetectado por quimiluminescência) ou nas contas carboxiladas Luminex(como detectado por fluorescência).

As etapas de enriquecimento do alvo e amplificação do alvoforam realizadas como descrito no exemplo 6. A terceira etapa, envolvendohibridização e detecção, foi realizada em dois formatos: uma em contascarboxiladas Luminex como descrito no exemplo 6, e a outra em uma placade microtitulação como descrito no exemplo 14.

Os resultados na tabela 18 mostram que o teste de placa pode detectar 500 cópias de entrada em 30 minutos de amplificação com umarelação S/N de 9. A 1 hora de amplificação, o teste de placa é pelo menos deuma ordem de grandeza mais sensível do que o formato Luminex.Tabela 18. Detecção de HPV usando contas e formato de detecção de placa.

<table>table see original document page 64</column></row><table>

EXEMPLO 16

Efeito de relação nucleotídeo em iniciadores aleatórios sobre a eficiência deamplificação isotérmica

Os iniciadores aleatórios foram quimicamente sintetizados usandocombinações e relações diferentes de nucleotídeos na etapa de amplificação de alvo dométodo descrito no exemplo 6. Os resultados na tabela 19 mostram que dG e Tdesempenham um papel principal na obtenção de uma amplificação eficiente. A omissão dedA tem um efeito menos pronunciado e a omissão de dC não tem efeito de todo. Aamplificação isotérmica foi realizada durante 2 horas com iniciadores de pentâmeros. O testecompleto foi realizado como descrito no exemplo 6. A eficiência relativa foi calculada comosinal para ruído, onde a eficiência da composição de iniciador padrão foi de (1,0).

Tabela 19: Eficiência relativa de detecção de alvo dependendo da composiçãode iniciadores aleatórios

<table>table see original document page 64</column></row><table>EXEMPLO 17

Tipificação de HPV em um arranjo de microchip

Detecção de tipos de HPV, individual assim como tiposmúltiplos de HPV, em um arranjo de microchip pode ser realizada. A capturade ácido nucleico alvo e amplificação foram realizadas de acordo com oexemplo 6. Reagentes e protocolos de lavagem são realizados de acordo comos produtos comercialmente disponíveis e instruções para a lavagem daslâminas, membranas, chips, etc. A etapa de detecção de alvo compreendedesnaturação de alvo e hibridização para as sondas de RNA, ou sondas deseqüência de sinal, ambas de acordo com o exemplo 6.

Neste exemplo, a hibridização de alvo para a sonda deoligonucleotídeo de seqüência de captura específica para a seqüência ocorreem um arranjo de oligonucleotídeos com pontos em vez de em contas, comodescrito no exemplo 6. O termo "arranjo com pontos" se refere a uma série bi-dimensional de elementos na superfície de um suporte sólido, onde cadaelemento é uma alíquota de oligonucleotídeo depositado em um localespecífico. Suportes sólidos para este formato incluem: uma lâmina de vidro,membro de náilon, ou um microchip (vidro ou silício). Outros exemplos edescrição são encontrados em "Microarrays And Câncer Research" Ed. J.Warrington, Eaton Publishing, 2002.

As sondas de oligonucleotídeos de seqüência de capturaespecíficas para tipo (dois oligonucleotídeos por cada tipo de HPV)modificado com um ligador 5'-C12-amino é colocadas em pontos em umsuporte sólido, como um microarranjo, cada ponto correspondendo a um tipode HPV específico. Os oligonucleotídeos são fixados através de, por exemplo,o grupo amino primário. O suporte sólido é equilibrado com tampão 2X SSC(cloreto de sódio e citrato de sódio) em temperatura ambiente durante 10minutos, seguido por 30 minutos de incubação a 37 °C em tampão de pré-hibridização (2X SSC/0,05% reagente de bloqueio 15% sulfato dextrano/0,1%SDS) com 50 microgramas por mL de DNA de esperma de salmãodesnaturado. A hibridização é então realizada no mesmo tampão de pré-hibridização com a adição de ácidos nucleicos alvos amplificados e sondas deseqüência de sinal de RNA. A hibridização dos ácidos nucleicos alvos, sondasde seqüência de sinal de RNA, e sondas de oligonucleotídeos de seqüência decaptura específicos do tipo ocorre enquanto incubando a 37 °C com agitaçãodurante 3 horas em solução de re-hibridização.

Detecção dos pontos contendo amplicon pode ser realizada emdois modos: a) usando anticorpos HYBRID CAPTURE (HC-Ab) rotuladoscom corante Cy-fluorescente com subseqüente varredura usando aparelhoscomercialmente disponíveis, ou b) usando HC-Ab rotulado com fosfatasealcalina com aplicação subseqüente de substrato de precipitação (porexemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato e tetrazólio de nitroazul: NBT /BCIP). No último caso, o sinal é detectável sem auxílio instrumental.

A descrição acima de várias formas de realização foiapresentada para fins de ilustração e descrição. Não se pretende que ela sejaexaustiva ou limitada às formas precisas descritas. Modificações ou variaçõesóbvias são possíveis à luz dos ensinamentos acima. As formas de realizaçãodiscutidas foram selecionadas e descritas para prover ilustrações de suaaplicação prática para assim permitir ao versado na técnica utilizar as váriasformas de realização e com várias modificações como são apropriadas para ouso particular contemplado. Todas estas modificações e variações estãodentro do sistema como determinado pelas reivindicações anexas quandointerpretadas de acordo com o escopo para o qual elas foram designadas demodo satisfatório, legal e imparcial.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Nazarenko, IrinaLorincz, AttilaEder, PaulLowe, BrianMallonee, RichardThai, Ha

<120> DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR MÉTODO DE CAPTURA DE HÍBRIDOSESPECÍFICOS DA MARCAÇÃO.

<130> 2629-4066

<140> TBD

<141> 2005-11-07

<150> US 11/005,617

<151> 2004-12-06

<150> US 10/971,251

<151> 2004-10-20

<150> US 09/594,839

<151> 2000-06-15

<160> 129

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 1

gtacagatgg taccggggtt gtagaagtat

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 2

ctgcaacaag acatacatcg accggtccac

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 3

gaagtaggtg aggctgcatg tgaagtggta

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 4

cagctctgtg cataactgtg gtaactttct

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 5

gaggtcttct ccaacatgct atgcaacgtc

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 6

gtgtaggtgc atgctctata ggtacatcag

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 7

33

31

31

33

33

33caatgccgag cttagttcat gcaatttccg agg

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 8

gaagtagtag ttgcagacgc ccctaaaggt tgc

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 9

gaacgcgatg gtacaggcac tgcagggtcc

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> HPV

<400> 10

gaacgcgatg gtacaggcac tgca

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> HPV

<400> 11

acgcccaccc aatggaatgt accc

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 12

tctgcgtcgt tggagtcgtt cctgtcgtgc tc

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> HPV

<400> 13

ttattattac tacatacatt gccgccatgt tcgcca

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> HPV

<400> 14

ttattattat gttgccctct gtgcccccgt tgtctatagc ctccgt

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> HPV

<400> 15

ttattattag gagcagtgcc caaaagatta aagtttgc

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> HPV

<400> 16

ttattattac acggtgctgg aatacggtga gggggtg

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 17ttattattaa cgcccaccca atggaatgta ccc

<210> 18

<211> 35<212> DNA<213> HPV<400> 18ttattattaa tagtattgtg gtgtgtttct cacat

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 19

ttattattag ttggagtcgt tcctgtcgtg

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 20

ttattattac ggaatttcat tttggggctc t

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 21

gctcgaaggt cgtctgctga gctttctact act

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 22

gcgccatcct gtaatgcact tttccacaaa gc

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 23

tagtgctagg tgtagtggac gcaggaggtg g

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 24

ggtcacaaca tgtattacac tgccctcggt ac

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 25

cctacgtctg cgaagtcttt cttgccgtgc c

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> HPV

<400> 26

ctgcattgtc actactatcc ccaccactac tttg

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 27

ccacaaggca cattcataca tacacgcacg ca

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 28gttctaaggt cctctgccga gctctctact gta 33

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> HPV

<400> ' 29

ttattattat gcggttttgg gggtcgacgt ggaggc 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> HPV

<400> 30

ttattattaa gacctgcccc ctaagggtac atagcc 36

<210> 31

<211> 49

<212> DNA

<213> HPV

<400> 31

ttattattac agcattgcag cctttttgtt acttgcttgt aatagctcc 49

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> HPV

<400> 32

ttattattaa tcctgtaatg cacttttcca caaa 34

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 33

ttattattag cctggtcaca acatgtatta c 31

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 34

ttattattac aggatctaat tcattctgag gtt 33

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> HPV

<400> 35

tgcggttttg ggggtcgacg tggaggc 27

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 36

ggcgcaacca cataacacac agaaccacaa aac 33

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 37

gttctacacg ggtttgcagc acgatcaaca acg 33

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 38

cgctgcttgt ggtggtcggt tatcgttgtc tg 32<210> 39<211> 32<212> DNA<213> HPV<400> 39

gacgtagtgt cgcctcacat ttacaacagg ac 32

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 40

ctcgcttggt ggggttgtag gggagctcgg 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 41

gctgtagttg tcgcagagta tcccgtgagg 30

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 42

gtgagcctgt gttatatgta gtgcccgaat ccc 33

<210> 43

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 43

ccacctcctg cgtccactac acctagcact a 31

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 44

tgcgtgcgtg tatgtatgaa tgtgccttgt gg 32

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 45

aattagcgca ttgccccgtc caacgtcccg 30

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 46

cgccgtgcac gtgtagccac catatttaat cac 33

<210> 47

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 47

cgaattgtgt gaggtgctgg aagaatcggt gc 32

<210> 48

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 48

gatcgttcac aacttttacc tgcaccggat cc 32

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 49ctaggttctc tagatgtttg tctccagcac ccc

<210> 50

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 50

ctgtcggtat tgtctgtgtc gctgatgtgt g

<210> 51

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 51

gatacacaca catttgcagc ccggtccaca ca

<210> 52

<211> 32

<212> DNA

<213> HPV

<400> 52

ggtggcaaag gacgtatgtg agtgcagagg ac

<210> 53

<211> 33

<212> DNA

<213> HPV

<400> 53

gcgttgcgga ggggtatgat agttgctcag aag

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 54

gtctaggcgt gtaggaggaa acaagatggg g

<210> 55

<211> 38

<212> DNA

<213> HPV

<400> 55

ctgaacacag cagttctcta taccaatggc gctatttc

<210> 56

<211> 34

<212> DNA

<213> HPV

<400> 56

ttggttgccc ctgagcagtc ggaccctatg gata

<210> 57

<211> 42

<212> DNA

<213> HPV

<400> 57

gcgccgcatt gctgcacctc gtttatatag cagggcattt

<210> 58

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 58

cctggcgcat gtcatacaca ccacattact c

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 59

cacgaagtgt cagtgcacag tatgccttgc<210> 60<211> 40<212> DNA<213> HPV<400> 60

gccatgtact tcacaaactg ttaatactgg tgattgtccc 40

<210> 61

<211> 31

<212> DNA

<213> HPV

<400> 61

cctacacagt acaagtggag gccatcaccc g 31

<210> 62

<211> 39

<212> DNA

<213> HPV

<400> 62

gtctgacaca tactgttgta acccatagtt aaacacagg 39

<210> 63

<211> 41

<212> DNA

<213> HPV

<400> 63

gctgtctccc tgtcttcctg tgtattgttt ataagtgtat t 41

<210> 64

<211> 44

<212> DNA

<213> HPV

<400> 64

gtacagcact aaaatggagt ttggtgtgtt actatagtgc atac 44

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 65

actccaacga cgcaga 16

<210> 66

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 66

ttttgtggtt ctgtgtg 17

<210> 67

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 67

ttatgtggtt gcgc 14

<210> 68

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 68

cgttgttgat cgtgc 15

<210> 69

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 69

tgcaaacccg tgtag 15

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 70cagacaacga taaccg

<210> 71

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 71

accaccacaa gcagc

<210> 72

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 72

gtcctgttgt aaatgtg

<210> 73

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 73

aggcgacact acgtc

<210> 74

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 74

cgagctcccc tacaa

<210> 75

<211> 13

<212> DNA

<213> HPV

<400> 75

ccccaccaag cga

<210> 76

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 76

cctcacggga tactc

<210> 77

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 77

tgcgacaact acagc

<210> 78

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 78

ggattcgggc acta

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 79

catataacac aggctcac

<210> 80

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 80tagtgctagg tgtagtgg

<210> 81

<211> 13<212> DNA

<213> HPV

<400> 81

acgcaggagg tgg <210> 82

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 82

tacatacacg cacgca <210> 83

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 83

ccacaaggca cattca <210> 84

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 84

gctacacgtg cacggcg <210> 85

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 85

gtgattaaat atggtgg <210> 86

<211> 13

<212> DNA

<213> HPV

<400> 86

gggacgttgg acg <210> 87

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 87

ggcaatgcgc taat <210> 88

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 88

caccgattct tccag <210> 89

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 89

cacctcacac aattcg <210> 90

<211> 13

<212> DNA

<213> HPV

<400> 90

ggatccggtg cag <210> 91

<211> 19

<212> DNA

<213> HPV

<400> 91gtaaaagttg tgaacgatc

<210> 92

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 92

ggtgctggag acaa

<210> 93

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 93

acatctagag aacctag

<210> 94

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 94

cacacatcag cgaca

<210> 95

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 95

cagacaatac cgacag

<210> 96

<211> 13

<212> DNA

<213> HPV

<400> 96

tgtgtggacc ggg

<210> 97

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 97

ctgcaaatgt gtgtgtat

<210> 98

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV

<400> 98

gtcctctgca ctcacat

<210> 99

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 99

acgtcctttg ccac

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> HPV

<400> 100

ttctgagcaa ctatcatac

<210> 101

<211> 12

<212> DNA

<213> HPV

<400> 101

ccctccgcaa cg

<210> 102

<211> 15<212> DNA<213> HPV<400> 102ccccatcttg tttcc<210> 103<211> 16<212> DNA<213> HPV<400> 103

tcctacacgc ctagac<210> 104<211> 20<212> DNA<213> HPV<400> 104

tatagagaac tgctgtgttc

<210> 105

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 105

gaaatagcgc cattg

<210> 106

<211> 14

<212> DNA

<213> HPV

<400> 106

ctcaggggca acca

<210> 107

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 107

atccataggg tccgac

<210> 108

<211> 11

<212> DNA

<213> HPV

<400> 108

caatgcggcg c

<210> 109

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 109

tataaacgag gtgcag

<210> 110

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 110

gaaaatgccc tgcta

<210> 111

<211> 12

<212> DNA

<213> HPV

<400> 111

acatgcgcca gg

<210> 112

<211> 19

<212> DNA

<213> HPV

<400> 112gagtaatgtg gtgtgtatg

<210> 113

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 113

gcaaggcata ctgtg

<210> 114

<211> 15

<212> DNA

<213> HPV

<400> 114

cactgacacttcgtg

<210> 115

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 115

ggacaatcac cagtatta

<210> 116

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 116

agtttgtgaa gtacatgg

<210> 117

<211> 12

<212> DNA

<213> HPV

<400> 117

cgggtgatgg cc

<210> 118

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 118

ccacttgtac tgtgtagg

<210> 119

<211> 18

<212> DNA

<213> HPV

<400> 119

ctgtgtttaa ctatgggt

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> HPV

<400> 120

tacaacagta tgtgtcagac

<210> 121

<211> 16

<212> DNA

<213> HPV

<400> 121

aagacaggga gacagc

<210> 122

<211> 19

<212> DNA

<213> HPV

<400> 122

cttataaaca atacacagg

<210> 123

<211> 20<212> DNA

<213> HPV

<400> 123

atgcactata gtaacacacc

<210> 124

<211> 19

<212> DNA

<213> HPV

<400> 124

actccatttt agtgctgta

<210> 125

<211> 24

<212> DNA

<213> HPV

<400> 125

tcaggaccca caggagcgac ccag

<210> 126

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Iniciador sintético<400> 126

gcaccaaaag agaactgcaa tgt

<210> 127

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Iniciador sintético<400> 127

catatacctc acgtcgcagt aact

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> HPV

<400> 128

tattttatat gacacaatgt

<210> 129

<211> 30

<212> DNA

<213> HPV

<400> 129

ggtttgtgct aacaataaat gtatccatag

Claims (24)

1. Método para detectar cada um dentre uma pluralidade deácidos nucleicos alvos, caracterizado pelo fato de compreender:a) capturar uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos em umsuporte sólido por misturação: referida pluralidade de ácidos nucleicos alvos,sondas de ácido nucleico complementares a pelo menos uma porção dosácidos nucleicos alvos, em que um é RNA e o outro é DNA, e um suportesólido, formando uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos enriquecidos;b) amplificar os ácidos nucleicos ou sondas de ácido nucleicoenriquecidos, formando uma pluralidade de alvos amplificados; ec) detectar os ácidos nucleicos alvos por detecção dapluralidade de alvos amplificados por misturação de: a pluralidade de alvosamplificados; oligonucleotídeos selecionáveis que hibridizam em umaprimeira porção dos alvos amplificados; e sondas de ácido nucleicocomplementares a uma segunda porção dos alvos amplificados, formando umcomplexo de oligonucleotídeo híbrido DNA: RNA, em que os híbridos DNA:RNA são detectáveis pelos agentes de ligação específicos para híbrido DNA:RNA, e selecionáveis pela separação do complexo de oligonucleotídeos,assim detectando cada um dentre a pluralidade de ácidos nucleicos alvos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que, na etapa de captura, o suporte sólido é conjugado a um agente deligação específico de híbrido DNA: RNA, assim capturando os ácidosnucleicos alvos a um suporte sólido.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente de ligação específico do híbrido DNA: RNA éselecionado dentre o grupo consistindo de: anticorpos específicos para híbridoDNA: RNA, anticorpos monoclonais ou policlonais, ou fragmentos dosmesmos, proteínas, RNase H cataliticamente inativa, e ácidos nucleicos,aptâmeros de ácido nucleico ou oligonucleotídeos que ligam e formam umaestrutura triplex.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o agente de ligação específico do híbrido DNA: RNA é umanticorpo específico do híbrido DNA: RNA.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o agente de ligação específico do híbrido DNA: RNA é uma sondade ácido nucleico complementar ao ácido nucleico alvo.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o agente de ligação específico do híbrido DNA: RNA é rotuladode modo detectável.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o rótulo é detectado por: métodos de colorimetria,quimioluminescência, fluorescência, e de difusão de luz.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os ácidos nucleicos alvos capturados ou sondas de ácido nucleicosão amplificados por ampliflcação isotérmica.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a DNA polimerase é usada na ampliflcação isotérmica.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que os iniciadores aleatórios são usados em ampliflcaçãoisotérmica.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que os iniciadores aleatórios são pentâmeros.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que os iniciadores aleatórios contém um subconjunto deseqüências de iniciador específicas para uma doença.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que os oligonucleotídeos selecionáveis são ligados a um suportesólido.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o suporte sólido é selecionado dentre o grupo consistindo de:placas, microplacas, placas de microtitulação, lâminas, discos, contas, chips,micropartículas, porções, filamentos, chips, microchips, tiras, membranas,microarranjos, e tubos de teste.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o suporte sólido é feito de um material selecionado dentre ogrupo consistindo de: vidro, silicone, plástico, poliestireno, polietileno,polipropileno e policarbonato.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o suporte sólido é modificado para conter: foi modificado demodo que a superfície contém grupos carboxila, amino, hidrazida, aldeído,derivados de ácido nucleico ou nucleotídeo, grupos amino primário, ecorantes.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ainda compreender adicionar sondas de bloqueador.

18. Método para detectar cada um dentre uma pluralidade deácidos nucleicos alvos caracterizado pelo fato de compreender:a) hibridizar uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos emsondas de ácido nucleico que são complementares a pelo menos uma porçãodos ácidos nucleicos alvos, formando híbridos DNA: RNA;b) capturar os híbridos DNA: RNA com anticorpos específicospara híbrido DNA: RNA conjugados a suportes sólidos;c) separar os ácidos nucleicos alvos não ligados dos híbridosDNA: RNA;d) amplificar os ácidos nucleicos alvos capturados ou sondasde ácido nucleico, formando uma pluralidade de alvos amplificados, usandoiniciadores aleatórios e DNA polimerase;e) hibridizar as sondas de ácido nucleico complementares auma primeira porção dos alvos amplificados, formando híbridos DNA: RNA;f) hibridizar oligonucleotídeos conjugados a uma pluralidadede suportes sólidos para uma segunda porção dos alvos amplificados, em queo suporte sólido é selecionável; eg) selecionar cada um dentre uma pluralidade de alvosamplificados pelo suporte sólido selecionável; eh) detectar cada um dentre uma pluralidade de alvosamplificados por ligação dos agentes de ligação específicos de híbrido DNA:RNA para os híbridos DNA: RNA, em que a presença de uma pluralidade deamplicons é indicativa da presença de ácidos nucleicos alvos.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o suporte sólido conjugado a oligonucleotídeos são contasdistinguíveis.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que as contas distinguíveis são selecionadas dentre o grupoconsistindo de rótulos detectáveis: um rótulo fluorescente, um rótulo de ouro,e um rótulo de enzima.

21. Método multiplex para detectar uma pluralidade de DNAsalvos, caracterizado pelo fato de compreender:a) hibridizar uma pluralidade de DNAs alvos em sondas deRNA que são complementares a pelo menos uma porção dos DNAs alvos,formar híbridos DNA: RNA;b) capturar os híbridos DNA: RNA com anticorpos específicospara híbrido DNA: RNA conjugados a contas;c) separar os ácidos nucleicos não ligados a partir dos híbridosDNA: RNA, formando alvos enriquecidos;d) amplificar os DNAs alvos enriquecidos, formando umapluralidade de alvos amplificados, usando iniciadores aleatórios e DNApolimerase;e) hibridizar as sondas de RNA complementares a umaprimeira porção dos DNAs alvos amplificados, formando híbridos DNA:RNA;f) hibridizar os oligonucleotídeos de DNA em uma segundaporção dos DNAs alvos, em que os oligonucleotídeos de DNA sãoconjugados a uma pluralidade de contas selecionáveis; eg) detectar a pluralidade DNAs alvos amplificados por ligaçãode anticorpos específicos de híbridos DNA: RNA para os híbridos DNA:RNA e selecionar cada um dos alvos amplificados com base na contaselecionável particular.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que as sondas de ácido nucleico complementares a pelo menosuma porção dos ácidos nucleicos alvos e seqüências de oligonucleotídeos sãoselecionadas dentre o grupo consistindo deGTACAGATGGTACCGGGGTTGTAGAAGTATCTG [SEQ ID NO: 1];CTGCAACAAGACATACATCGACCGGTCCACC [SEQ ID NO: 2];GAAGTAGGTGAGGCTGCATGTGAAGTGGTAG [SEQ ID NO: 3];CAGCTCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGG [SEQ ID NO: 4];GAGGTCTTCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTG [SEQ ID NO: 5];GTGTAGGTGCATGCTCTATAGGTACATCAGGCC [SEQ ID NO: 6];CAATGCCGAGCTTAGTTCATGCAATTTCCGAGG [SEQ ID NO: 7];GAAGTAGTAGTTGCAGACGCCCCTAAAGGTTGC [SEQ ID NO: 8];GAACGCGATGGTACAGGCACTGCAGGGTCC [SEQ ID NO: 9];GAACGCGATGGTACAGGCACTGCA [SEQ ID NO: 10];ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC [SEQ ID NO: 11];TCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTC [SEQ IDNO: 12];TTATTATTA)CTACATACATTGCCGCCATGTTCGCCA [SEQ IDNO: 13];(TTATTATTA)TGTTGCCCTCTGTGCCCCCGTTGTCTATAGCCTCCGT[SEQ IDNO: 14];(TTATTATTA)GGAGCAGTGCCCAAAAGATTAAAGTTTGC [SEQIDNO: 15];(TTATTATTA)CACGGTGCTGGAATACGGTGAGGGGGTG [SEQ ID NO: 16];(TTATTATTA)ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC [SEQIDNO: 17];(TTATTATTA)ATAGTATTGTGGTGTGTTTCTCACAT [SEQ ID NO: 18];(TTATTATTA)GTTGGAGTCGTTCCTGTCGTG [SEQ ID NO: 19];(TTATTATTA)CGGAATTTCATTTTGGGGCTCT [SEQ ID NO: 20];GCTCGAAGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTACTACT [SEQ ID NO: 21];GCGCCATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAAGC [SEQ ID NO: 22];TAGTGCTAGGTGTAGTGGACGCAGGAGGTGG [SEQ ID NO: 23];GGTCACAACATGTATTACACTGCCCTCGGTAC [SEQ ID NO: 24];CCTACGTCTGCGAAGTCTTTCTTGCCGTGCC [SEQ ID NO: 25];CTGCATTGTCACTACTATCCCCACCACTACTTTG [SEQ ID NO: 26];CCACAAGGCACATTCATACATACACGCACGCA [SEQ IDNO: 27];GTTCTAAGGTCCTCTGCCGAGCTCTCTACTGTA [SEQ ID NO: 28];(TTATTATTA)TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC [SEQ ID NO: 29];(TTATTATTA)AGACCTGCCCCCTAAGGGTACATAGCC [SEQ ID NO: 30];(TTATTATTA)CAGCATTGCAGCCTTTTTGTTACTTGCTTGTAATAGCTCC [SEQIDNO: 31];(TTATTATTA)ATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAA [SEQ ID NO: 32];(TTATTATTA)GCCTGGTCACAACATGTATTAC [SEQ ID NO: 33];(TTATTATTA)CAGGATCTAATTCATTCTGAGGTT [SEQ ID NO: 34];TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC [SEQ ID NO: 35];GGCGCAACCACATAACACACAGAACCACAAAAC [SEQ IDNO: 36];GTTCTACACGGGTTTGCAGCACGATCAACAACG [SEQ IDNO: 37];CGCTGCTTGTGGTGGTCGGTTATCGTTGTCTG [SEQ ID NO: 38];GACGTAGTGTCGCCTCACATTTACAACAGGAC [SEQ IDNO: 39];CTCGCTTGGTGGGGTTGTAGGGGAGCTCGG [SEQ ID NO: 40];GCTGTAGTTGTCGCAGAGTATCCCGTGAGG [SEQ ID NO: 41];GTGAGCCTGTGTTATATGTAGTGCCCGAATCCC [SEQ IDNO: 42];CCACCTCCTGCGTCCACTACACCTAGCACTA [SEQ ID NO: 43];TGCGTGCGTGTATGTATGAATGTGCCTTGTGG [SEQ ID NO: 44];AATTAGCGCATTGCCCCGTCCAACGTCCCG [SEQ ID NO: 45];CGCCGTGCACGTGTAGCCACCATATTTAATCAC [SEQ ID NO: 46];CGAATTGTGTGAGGTGCTGGAAGAATCGGTGC [SEQ DD NO: 47];GATCGTTCACAACTTTTACCTGCACCGGATCC [SEQ ED NO: 48];CTAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAGCACCCC [SEQ ID NO: 49];CTGTCGGTATTGTCTGTGTCGCTGATGTGTG [SEQ ID NO: 50];GATACACACACATTTGCAGCCCGGTCCACACA [SEQ IDNO: 51];GGTGGCAAAGGACGTATGTGAGTGCAGAGGAC [SEQ ID NO: 52];GCGTTGCGGAGGGGTATGATAGTTGCTCAGAAG [SEQ ID NO: 53];GTCTAGGCGTGTAGGAGGAAACAAGATGGGG [SEQ ID NO: 54];CTGAACACAGCAGTTCTCTATACCAATGGCGCTATTTC [SEQ ID NO: 55];TTGGTTGCCCCTGAGCAGTCGGACCCTATGGATA [SEQ ID NO: 56];GCGCCGCATTGCTGCACCTCGTTTATATAGCAGGGCATTTTC [SEQ ID NO: 57];CCTGGCGCATGTCATACACACCACATTACTC [SEQ ID NO: 58];CACGAAGTGTCAGTGCACAGTATGCCTTGC [SEQ ID NO: 59];GCCATGTACTTCACAAACTGTTAATACTGGTGATTGTCCC [SEQ ID NO: 60];CCTACACAGTACAAGTGGAGGCCATCACCCG [SEQ DD NO: 61];GTCTGACACATACTGTTGTAACCCATAGTTAAACACAGG [SEQ ID NO: 62];GCTGTCTCCCTGTCTTCCTGTGTATTGTTTAT AAGTGTATT [SEQ ID NO: 63]; eGTACAGCACTAAAATGGAGTTTGGTGTGTTACTATAGTGCATAC[SEQ IDNO: 64].

23. Composição, caracterizada pelo fato de ser para uso nométodo definido na reivindicação 17, em que as sondas de ácido nucleicocomplementares a pelo menos uma porção dos ácidos nucleicos alvos,seqüências de oligonucleotídeos, e sondas de bloqueador são selecionadosdentre o grupo consistindo de:GTACAGATGGTACCGGGGTTGTAGAAGTATCTG [SEQ IDNO: 1];CTGCAACAAGACATACATCGACCGGTCCACC [SEQ ID NO: 2];GAAGTAGGTGAGGCTGCATGTGAAGTGGTAG [SEQ ID NO: 3];CAGCTCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGG [SEQ ID NO: 4];GAGGTCTTCTCCAACATGCTATGCAACGTCCTG [SEQ ID NO: 5];GTGTAGGTGCATGCTCTATAGGTACATCAGGCC [SEQ ID NO: 6];CAATGCCGAGCTTAGTTCATGCAATTTCCGAGG [SEQ ID NO: 7];GAAGTAGTAGTTGCAGACGCCCCTAAAGGTTGC [SEQ DD NO: 8];GAACGCGATGGTACAGGCACTGCAGGGTCC [SEQ ID NO: 9];GAACGCGATGGTACAGGCACTGCA [SEQ IDNO: 10];ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC [SEQ ID NO: 11];TCTGCGTCGTTGGAGTCGTTCCTGTCGTGCTC [SEQ IDNO: 12];*(TTATTATTA)CTACATACATTGCCGCCATGTTCGCCA [SEQ ID NO: 13];(TTATTATTA)TGTTGCCCTCTGTGCCCCCGTTGTCTATAGCCTCCGT[SEQ IDNO: 14];(TTATTATTA)GGAGCAGTGCCCAAAAGATTAAAGTTTGC [SEQ ID NO: 15];(TTATTATTA)CACGGTGCTGGAATACGGTGAGGGGGTG [SEQ ID NO: 16];(TTATTATTA)ACGCCCACCCAATGGAATGTACCC [SEQ IDNO: 17];(TTATTATTA)ATAGTATTGTGGTGTGTTTCTCACAT [SEQ IDNO: 18];(TTATTATTA)GTTGGAGTCGTTCCTGTCGTG [SEQ ID NO: 19];(TTATTATTA)CGGAATTTCATTTTGGGGCTCT [SEQ ID NO: 20];GCTCGAAGGTCGTCTGCTGAGCTTTCTACTACT [SEQ ID NO: 21];GCGCCATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAAGC [SEQ ID NO: 22];TAGTGCTAGGTGTAGTGGACGCAGGAGGTGG [SEQ ID NO: 23];GGTCACAACATGTATTACACTGCCCTCGGTAC [SEQ ID NO: 24];CCTACGTCTGCGAAGTCTTTCTTGCCGTGCC [SEQ ID NO: 25];CTGCATTGTCACTACTATCCCCACCACTACTTTG [SEQ IDNO: 26];CCACAAGGCACATTCATACATACACGCACGCA [SEQ ID NO: 27];GTTCTAAGGTCCTCTGCCGAGCTCTCTACTGTA [SEQ ID NO: 28];(TTATTATTA)TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC [SEQ ID NO: 29];(TTATTATTA)AGACCTGCCCCCTAAGGGTACATAGCC [SEQ ID NO: 30];(TTATTATTA)CAGCATTGCAGCCTTTTTGTTACTTGCTTGTAATAGCTCC [SEQ DD NO: 31];(TTATTATTA)ATCCTGTAATGCACTTTTCCACAAA [SEQ ID NO: 32];(TTATTATTA)GCCTGGTCACAACATGTATTAC [SEQ ID NO: 33];(TTATTATTA)CAGGATCTAATTCATTCTGAGGTT [SEQ ID NO: 34];TGCGGTTTTGGGGGTCGACGTGGAGGC [SEQ ID NO: 35];GGCGCAACCACATAACACACAGAACCACAAAAC [SEQ ID NO: 36];GTTCTACACGGGTTTGCAGCACGATCAACAACG [SEQ IDNO: 37];CGCTGCTTGTGGTGGTCGGTTATCGTTGTCTG [SEQ ID NO: 38];GACGTAGTGTCGCCTCACATTTACAACAGGAC [SEQ IDNO: 39];CTCGCTTGGTGGGGTTGTAGGGGAGCTCGG [SEQ ID NO: 40];GCTGTAGTTGTCGCAGAGTATCCCGTGAGG [SEQ IDNO: 41];GTGAGCCTGTGTTATATGTAGTGCCCGAATCCC [SEQ ID NO: 42];CCACCTCCTGCGTCCACTACACCTAGCACTA [SEQ ID NO: 43];TGCGTGCGTGTATGTATGAATGTGCCTTGTGG [SEQ ID NO: 44];AATTAGCGCATTGCCCCGTCCAACGTCCCG [SEQ ID NO: 45];CGCCGTGCACGTGTAGCCACCATATTTAATCAC [SEQ ID NO: 46];CGAATTGTGTGAGGTGCTGGAAGAATCGGTGC [SEQ ID NO: 47];GATCGTTCACAACTTTTACCTGCACCGGATCC [SEQ ID NO: 48];CTAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAGCACCCC [SEQ IDNO: 49];CTGTCGGTATTGTCTGTGTCGCTGATGTGTG [SEQ ID NO: 50];GATACACACACATTTGCAGCCCGGTCCACACA [SEQ ID NO: 51];GGTGGCAAAGGACGTATGTGAGTGCAGAGGAC [SEQ IDNO: 52];GCGTTGCGGAGGGGTATGATAGTTGCTCAGAAG [SEQ ID NO: 53];GTCTAGGCGTGTAGGAGGAAACAAGATGGGG [SEQ ID NO: 54];CTGAACACAGCAGTTCTCTATACCAATGGCGCTATTTC [SEQ ID NO: 55];TTGGTTGCCCCTGAGCAGTCGGACCCTATGGATA [SEQ ID NO: 56];GCGCCGCATTGCTGCACCTCGTTTATATAGCAGGGCATTTTC [SEQ ID NO: 57];CCTGGCGCATGTCATACACACCACATTACTC [SEQ ID NO: 581;CACGAAGTGTCAGTGCACAGTATGCCTTGC [SEQ ID NO: 59];GCCATGTACTTCACAAACTGTTAATACTGGTGATTGTCCC [SEQ ID NO: 60];CCTACACAGTACAAGTGGAGGCCATCACCCG [SEQ ID NO: 61];GTCTGACACATACTGTTGTAACCCATAGTTAAACACAGG [SEQ ID NO: 62];GCTGTCTCCCTGTCTTCCTGTGTATTGTTTATAAGTGTATT [SEQ ID NO: 63];GTACAGCACTAAAATGGAGTTTGGTGTGTTACTATAGTGCATAC[SEQ ID NO: 64];e ACTCCAACGACGCAGA [SEQ ID NO: 65];TTTTGTGGTTCTGTGTG [SEQ ID NO: 66];TTATGTGGTTGCGC [SEQ ID NO: 67];CGTTGTTGATCGTGC [SEQ ID NO: 68];TGCAAACCCGTGTAG [SEQ ID NO: 69];CAGACAACGATAACCG [SEQ ID NO: 70];ACCACCACAAGCAGC [SEQ ID NO: 71];GTCCTGTTGTAAATGTG [SEQ ID NO: 72];AGGCGACACTACGTC [SEQ ID NO: 73];CGAGCTCCCCTACAA [SEQ ID NO: 74];CCCCACCAAGCGA [SEQ ID NO: 75];CCTCACGGGATACTC [SEQ ID NO: 76];TGCGACAACTACAGC [SEQ ID NO: 77];GGATTCGGGCACTA [SEQ ID NO: 78];CATATAACACAGGCTCAC [SEQ ID NO: 79];TAGTGCTAGGTGTAGTGG [SEQ ID NO: 80];ACGCAGGAGGTGG [SEQ ID NO: 81];TACATACACGCACGCA [SEQ ID NO: 82];CCACAAGGCACATTCA [SEQ ID NO: 83];GCTACACGTGCACGGCG [SEQ ID NO: 84];GTGATTAAATATGGTGG [SEQ ID NO: 85];GGGACGTTGGACG [SEQ ID NO: 86];GGCAATGCGCTAAT [SEQ ID NO: 87];CACCGATTCTTCCAG [SEQ ID NO: 88];CACCTCACACAATTCG [SEQ ID NO: 89];GGATCCGGTGCAG [SEQ ID NO: 90];GTAAAAGTTGTGAACGATC [SEQ ID NO: 91];GGTGCTGGAGACAA [SEQ ID NO: 92];ACATCTAGAGAACCTAG [SEQ ID NO: 93];CACACATCAGCGACA [SEQ ID NO: 94];CAGACAATACCGACAG [SEQ ID NO: 95];TGTGTGGACCGGG [SEQ ID NO: 96];CTGCAAATGTGTGTGTAT [SEQ ID NO: 97];GTCCTCTGCACTCACAT [SEQ ID NO: 98];ACGTCCTTTGCCAC [SEQ ID NO: 99];TTCTGAGCAACTATCATAC [SEQ ID NO: 100];CCCTCCGCAACG [SEQ IDNO: 101];CCCCATCTTGTTTCC [SEQ ID NO: 102];TCCTACACGCCTAGAC [SEQ ID NO: 103];TATAGAGAACTGCTGTGTTC [SEQ ID NO: 104];GAAATAGCGCCATTG [SEQ ID NO: 105];CTCAGGGGCAACCA [SEQ ID NO: 106];ATCCATAGGGTCCGAC [SEQ IDNO: 107];CAATGCGGCGC [SEQ IDNO: 108];TATAAAC GAGGTGCAG [SEQ ID NO: 109];GAAAATGCCCTGCTA [SEQ ID NO: 110];ACATGCGCCAGG [SEQ ID NO: 111];GAGTAATGTGGTGTGTATG [SEQ ID NO: 112];GCAAGGCATACTGTG [SEQ ID NO: 113];CACTGACACTTCGTG [SEQ ID NO: 114];GGACAATCACCAGTATTA [SEQ ID NO: 115];AGTTTGTGAAGTACATGG [SEQ ID NO: 116];CGGGTGATGGCC [SEQ IDNO: 117];CCACTTGTACTGTGTAGG [SEQ ID NO: 118];CTGTGTTTAACT ATGGGT [SEQ ID NO: 119];TACAACAGTATGTGTCAGAC [SEQ IDNO: 120];AAGACAGGGAGACAGC [SEQ ID NO: 121];CTTATAAACAATACACAGG [SEQ ID NO: 122];ATGCACTATAGTAACACACC [SEQ ID NO: 123]; e ACTCCATTTTAGTGCTGTA [SEQ ID NO: 124].

24. Composição de matéria, caracterizada pelo fato decompreender uma seqüência de ácido nucleico selecionada dentre o grupoconsistindo de: SEQ ID NOs: 1-124.