BRPI0807506B1 - Uso de uma proteína de fusão actriia-fc para a fabricação de um medicamento para tratar ou previnir mieloma múltiplo - Google Patents

Abstract

antagonistas de activina-actriia e usos para a promoção de crescimento ósseo em pacientes com câncer. em determinados aspectos, a presente invenção propõe composições e métodos para a promoção do crescimento ósseo e do aumento da densidade óssea, assim como para o tratamento de mieloma múltiplo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS

[001]Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios U.S. Nos. de Série 60/900.580, depositado em 9 de fevereiro de 2007; 60/932.762, depositado em 31 de maio de 2007; 60/937.365, depositado em 26 de junho de 2007; e 61/000.528, depositado em 25 de outubro de 2007. Todas as instruções contidas nos pedidos citados acima são incorporadas à presente invenção a título de referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]Os transtornos ósseos, que variam da osteoporose a fraturas, representam um conjunto de estados patológicos para os quais existem poucos agentes farmacêuticos efetivos. O tratamento em vez disso se concentra em intervenções físicas e comportamentais, que incluem a imobilização, exercício e alterações na dieta. Seria benéfico ter-se agentes terapêuticos que promovessem o crescimento ósseo e que aumentassem a densidade óssea com a finalidade de tratamento de uma variedade de transtornos ósseos.

[003]O crescimento e a mineralização ósseos são dependentes das atividades de dois tipos de células, osteoclastos e osteoblastos, embora condrócitos e células da massa vascular também participem em aspectos críticos destes processos. Do ponto de vista do desenvolvimento, a formação óssea ocorre através de dois mecanismos, ossificação endocondral e ossificação intramembranosa, sendo a primeira responsável pela formação de ossos longitudinais e a segunda responsável pela formação de ossos topologicamente chatos, tais como os ossos do crânio. A ossificação endocondral exige a formação e degradação em sequência de estruturas cartilaginosas nas placas de crescimento que servem como gabaritos para a formação de osteoblastos, osteoclastos, da massa vascular e para a mineralização subsequente. Durante a ossificação intramembranosa, o osso é formado diretamente nos tecidos conjuntivos. Os dois processos exigem a infiltração de osteoblastos e a subsequente deposição na matriz.

[004]As fraturas e outras lesões estruturais ósseas são curadas através de um processo que, pelo menos superficialmente, se assemelha à sequência de eventos de desenvolvimento da osteogênese, incluindo a formação de tecido cartilaginoso e a subsequente mineralização. O processo de cura da fratura pode ocorrer de dois modos. A cura primária do osso ocorre sem a formação de calo. A cura indireta ou secundária do osso ocorre com um estágio precursor de calo. A cura primária de fraturas envolve a reforma de continuidade mecânica através de uma destruição finamente ajustada. Em condições adequadas, células reabsorventes de osso envolvendo a lesão apresentam uma resposta reabsorvente de formação de túneis e estabelecem trajetos para a penetração de vasos sanguíneos e a cura subsequente. A cura secundária de ossos segue um processo de inflamação, formação de calo mole, mineralização do calo e remodelagem do calo. NO estágio de inflamação, resulta a formação de hematoma e hemorragia da destruição dos vasos sanguíneos periósticos e endoósticos no local da lesão. Células inflamatórias invadem a área. NO estágio de formação de calo mole, as células produzem novos vasos, fibroblastos, material intracelular e células de suporte, formando tecido de granulação no espaço entre os fragmentos da fratura. A união clínica através da destruição é estabelecida pelo tecido fibroso ou cartilaginoso (calo mole). Os osteoblastos são formados e medeiam a mineralização do calo mole, que é em seguida substituído por osso lamelar e submetido aos processos de remodelagem normal.

[005]Além de fraturas e outras destruições físicas da estrutura óssea, a perda de conteúdo mineral ósseo e de massa óssea pode ser causada por uma ampla variedade de condições e pode resultar em problemas médicos significativos. Alterações na massa óssea ocorrem de um modo relativamente previsível durante a vida de um indivíduo. Até aproximadamente a idade de 30 anos, os ossos tanto de homens como de mulheres crescem até atingir a massa máxima por meio do crescimento linear das placas de crescimento endocondral e do crescimento radial. Depois da idade de aproximadamente 30 anos (para o osso trabecular, tal como para os ossos chatos, por exemplo, tais como as vértebras e a pelve) e depois da idade de aproximadamente 40 anos (para o osso cortical, tal como os ossos longos encontrados nos membros, por exemplo), ocorre uma lenta perda óssea, tanto em homens como em mulheres. Em mulheres, uma fase final de uma perda óssea substancial também ocorre, provavelmente devida a deficiências de estrogênio na pós-menopausa. Durante esta fase, as mulheres podem perder 10% adicionais de massa óssea do osso cortical e 25% do compartimento trabecular. Se a perda óssea progressiva resulta de uma condição patológica tal como osteoporose depende muito da massa óssea inicial do individual e se existem condições exacerbantes.

[006]A perda óssea é às vezes caracterizada como um desequilíbrio no processo de remodelagem normal óssea. O osso sadio é constantemente submetido a remodelagem. A remodelagem começa com a reabsorção do osso por osteoclastos. O osso reabsorvido é então substituído por novo tecido ósseo, que é caracterizado pela formação de colágeno por osteoblastos e uma subsequente calcificação. Em indivíduos sadios, as taxas de reabsorção e de formação estão equilibradas. A osteoporose é uma condição crônica progressiva, marcada por um desvio na direção da reabsorção, resultando em uma redução geral em massa óssea e mineralização óssea. A osteoporose em seres humanos é precedida por ostopenia clínica (densidade mineral óssea que é superior a uma desvio padrão, mas inferior a 2,5 desvios padrão abaixo do valor médio para osso de jovens adultos). Em todo o mundo aproximadamente 75 milhões de pessoas correm o risco de apresentar osteoporose.

[007]Assim, métodos para o controle do equilíbrio entre a atividade de osteoclastos e osteoblastos podem ser úteis para a promoção da cura de fraturas e de outros danos ao osso assim como tratamento de transtornos, tais como osteoporose, associados com a perda de massa óssea e mineração óssea.

[008]No tocante à osteoporose, estrogênio, calcitonina, osteocalcina com vitamina K, ou altas doses de cálcio dietético são todos usados como intervenções terapêuticas. Outras abordagens terapêuticas a osteoporose incluem bisfosfonatos, hormônio da paratireóide, calcimiméticos, estatinas, esteróides anabólicos, sais de lantanídeo e de estrôncio e fluoreto de sódio. Tais terapêuticos, no entanto são frequentemente associados com efeitos secundários indesejáveis.

[009]Assim, um objetivo da presente invenção consiste em propor composições e métodos para a promoção do crescimento ósseo e a mineralização.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010]Em parte, a presente invenção demonstra que moléculas que têm uma atividade de antagonistas de ativina ou de ActRIIa (“antagonistas de ativina ” e “antagonistas de ActRIIa”, a que se refere coletivamente como “antagonistas de ativina-ActRIIa) podem ser usadas para aumentar a densidade óssea, promover o crescimento ósseo e/ou aumentar a resistência do osso. Mais especificamente a presente invenção demonstra que uma forma solúvel de ActRIIa atua como um inibidor da sinalização de ativina-ActRIIa e promove um aumento na densidade óssea, crescimento ósseo e resistência óssea in vivo. Embora a maioria dos agentes farmacêuticos que promovem o crescimento ósseo, ou inibem a perda óssea, atuem ou como agentes anti-catabólicos (também denominados habitualmente “agentes catabólicos”) (os bisfosfonatos, por exemplo) ou agentes anabólicos (hormônio da paratireóide, PTH, por exemplo, quando adequadamente dosado), a proteína ActRIIa solúvel apresenta uma atividade dupla, tendo tanto efeito anti-catabólico como anabólico. Assim, a presente invenção estabelece que os antagonistas do trajeto de sinalização de ativina-ActRIIa podem ser usados para aumentar a densidade óssea e promover o crescimento ósseo. Embora ActRIIa solúvel possa afetar o osso através de um mecanismo diferente do antagonismo a ativina, a presente invenção demonstra mesmo assim que agentes terapêuticos desejáveis podem ser selecionados com base em uma atividade antagonista de ativina-ActRIIa. Portanto, em determinadas modalidades, a presente invenção propõe métodos para o uso de antagonistas de ativina-ActRIIa incluindo, por exemplo, polipeptídeos ActRIIa que se ligam a ativina, anticorpos anti- ativina, anticorpos anti-ActRIIa, moléculas pequenas e aptâmeros dirigidos a ativina ou a ActRIIa, e ácidos nucleicos que reduzem a expressão de ativina e de ActRIIa, para o tratamento de transtornos associados com baixa densidade óssea ou com baixa resistência óssea, tal como osteoporose, ou para promover o crescimento do osso em pacientes que tenham necessidade deles, tais como em pacientes que tenham uma fratura óssea. A presente invenção demonstra ainda que antagonistas de ativina -ActRIIa são eficazes na prevenção e/ou reparo de dano a osso, causados por tumores de mieloma múltiplo e tumores da mama, e, além disso, que os antagonistas de ativina -ActRIIa reduzem a carga tumoral no mieloma múltiplo. O polipeptídeo ActRIIa solúvel promove o crescimento ósseo sem causar um aumento consistentemente mensurável na massa muscular.

[0011]Em determinados aspectos, a presente invenção propõe polipeptídeos que compreendem um polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga a ativina. Os polipeptídeos ActRIIa podem ser formulados em forma de uma preparação farmacêutica que compreende um polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina e um veículo farmaceuticamente aceitável. É preferível que o polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina se ligue à ativina com uma KD inferior a 1 micromolar ou menos de 100, 10 ou 1 nanomolar. Opcionalmente, o polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina se liga seletivamente a ativina de preferência a GDF-11 e/ou GDF-8 e de preferência com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes mais baixo no tocante a ativina do que no tocante a GDF-11 e/ou GDF-8. Embora não se deseje ser cerceado por qualquer mecanismo de ação específico, espera-se que este grau de seletividade para a inibição de ativina de preferência à inibição de GDF-11/GDF-8 será responsável pelo efeito seletivo no osso, sem um efeito consistentemente mensurável sobre a musculatura. Em muitas modalidades, o polipeptídeo ActRIIa será selecionado por causar menos de 15%, menos de 10% ou menos de 5% de aumento em musculatura a doses que atingem os efeitos desejáveis sobre o osso. É preferível que a composição tenha um grau de pureza de pelo menos 95%, no tocante a outros componentes do polipeptídeo, conforme avaliado por cromatografia de exclusão por tamanho, e ainda mais preferível que a composição tenha um grau de pureza de pelo menos 98%. Um polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina para uso em uma tal preparação pode ser qualquer um dos divulgados no presente documento, tal como um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12, ou tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12, 13. Um polipeptídeo ActRIIa que se liga a ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptídeo ActRIIa natural tal como um que compreende pelo menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-3 ou uma sequência de SEQ ID NO: 2 desprovida de 10 a 15 aminoácidos de terminal C (a “cauda”).

[0012]Um polipeptídeo ActRIIa que se liga ativina solúvel pode incluir uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos (no domínio de ligação a ligante, por exemplo) em relação a um polipeptídeo ActRIIa que ocorre naturalmente. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa alterados são dados em WO 2006/012627, pp. 59-60, incorporadas a título de referência a este documento. A alteração na sequência de aminoácidos pode, por exemplo, alterar a glicosilação do polipeptídeo quando produzida em um mamífero, inseto ou outra célula eucariótica ou alterar a clivagem do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo ActRIIa que ocorre naturalmente.

[0013]Um polipeptídeo ActRIIa que se liga a ativina pode consistir em uma proteína de fusão que tem, como um domínio, um polipeptídeo ActRIIa (uma porção de um ActRIIa que se liga a ligante, por exemplo) e um ou mais domínios adicionais que proporcionam uma propriedade desejável, tal como um comportamento farmacocinético melhorado, uma purificação mais fácil, o direcionamento a tecidos específicos etc. Um domínio de uma proteína de fusão, por exemplo, pode aumentar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição no tecido, formação de complexos de proteínas, multimerização da proteína de fusão e/ou purificação. A dimerização ou a multimerização pode proporcionar uma maior afinidade de ligação a ligante. Uma proteína de fusão de ActRIIa que se liga a ativina pode incluir um domínio fc de imunoglobulina (do tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica ou outra porção de polipeptídeo que proporciona propriedades desejáveis tal como um comportamento farmacocinético melhorado, uma melhor solubilidade ou uma maior estabilidade. Tipicamente uma proteína de fusão ActRIIa-Fc será produzida em forma de um complexo homodimérico. Opcionalmente, uma fusão de ActRIIa-Fc compreende um ligante relativamente não estruturado posicionado entre o domínio Fc e o domínio extracelular de ActRIIa. Este ligante sem estruturação pode correspondem a aproximadamente à região sem estruturação de 15 aminoácidos na extremidade de terminal c do domínio extracelular de ActRIIa (a “cauda”) ou pode consistir em uma sequência artificial de 1, 2, 3 4 ou 5 aminoácidos ou a um segmento tendo entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que estão relativamente livres de estrutura secundária ou uma mistura dos dois. Um ligante pode ser rico em resíduos de glicina e prolina e pode, por exemplo, conter uma única sequência de treonina/serina e glicinas ou sequências repetidas de treonina/serina e glicinas (singletos ou repetições de TG4 ou SG4, por exemplo). Uma proteína de fusão pode incluir uma subsequência de purificação, tal como um identificador de epítopo, um identificador FLAG, uma sequência de poli-histidina, e uma fusão de GST. Opcionalmente, um polipeptídeo ActRIIa solúvel inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração lipídio, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânica. Uma preparação farmacêutica pode também incluir um ou mais compostos adicionais tais como um composto que é usado para tratar um transtorno ósseo. É preferível que a preparação farmacêutica seja essencialmente isenta de pirógenos. Em geral é preferível que uma proteína ActRIIa seja expressa em uma linhagem de células de mamíferos que medeie uma glicosilação adequadamente natural da proteína ActRIIa para reduzir a probabilidade de uma resposta imune desfavorável em um paciente. Linhagens de células humanas e CHO forma usadas com sucesso e espera-se que outros sistemas de expressão de mamíferos comuns serão úteis.

[0014]Conforme foi descrito no presente documento, as proteínas ActRIIa designadas ActRIIa-Fc têm propriedades desejáveis incluindo a ligação seletiva a ativina de preferência a GDF-8 e/ou GDF-11, uma ligação a ligante com alta afinidade e uma meia-vida séria acima de duas semanas em modelos animais. Em determinadas modalidades, a invenção propõe polipeptídeos ActRIIa-Fc e preparações farmacêuticas que compreendem tais polipeptídeos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0015]Em determinados aspectos, a presente invenção propõe ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina solúvel. Um polinucleotídeo isolado pode compreender uma sequência de codificação para um polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga a ativina , tal como foi descrito acima. Um ácido nucleico isolado, por exemplo, pode incluir uma sequência que codifica para um domínio extracelular (domínio de ligação a ligante, por exemplo) de um ActRIIa e uma sequência que codificaria para uma parte ou o todo do domínio de transmembrana e/ou o domínio citoplasmático de um ActRIIa, exceto para um códon de parada posicionado no interior do domínio de transmembrana ou o domínio citoplasmático, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio de transmembrana ou domínio citoplasmático. Um polinucleotídeo isolado pode compreender, por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos de ActRIIa de comprimento total tal como a SEQ ID NO: 4 ou 5, ou uma versão parcialmente truncada, compreendendo ainda o polinucleotídeo isolado um códon de terminação de transcrição pelo menos seiscentos nucleotídeos antes do terminal 3’ ou posicionado de outro modo qualquer de modo tal que a tradução do polinucleotídeo dê origem a um domínio extracelular opcionalmente fundido a uma porção truncada de um ActRIIa de comprimento total. Uma sequência preferida de ácidos nucleicos é a SEQ ID NO: 14. Os ácidos nucleicos divulgados no presente documento podem ser operativamente ligados a um promotor para expressão, e a presente invenção propõe células transformadas com tais polinucleotídeos recombinantes. É preferível que a célula seja uma célula de mamífero tal como uma célula CHO.

[0016]Em determinados aspectos, a presente invenção propõe métodos para a produção de um polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga a ActRIIa. Tal método pode incluir a expressão de qualquer um dos ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 4, 5 ou 14, por exemplo) divulgados no presente documento em uma célula adequada, tal como células ovarianas de hamster chinês (CHO). Tal método pode compreender: a) a cultura de uma célula em condições adequadas para a expressão de um polipeptídeo solúvel ActRIIa, sendo a célula transformada com uma construção de expressão de ActRIIa solúvel; e b) a recuperação do polipeptídeo ActRIIa solúvel deste modo expresso. Os polipeptídeos ActRIIa solúveis podem ser recuperados em forma de frações brutas, parcialmente purificadas ou extremamente purificadas. A purificação pode ser obtida por uma série de etapas de purificação, incluindo, por exemplo, uma, duas ou três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de troca de ânions (Q sefarose, por exemplo), cromatografia por interação hidrofóbica (fenilsefarose, por exemplo), cromatografia de exclusão por tamanho e cromatografia de troca de cátions.

[0017]Em determinados aspectos, um antagonista de ativina -ActRIIa divulgado no presente documento, tal como um polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga a ativina , pode ser usado em um método para a promoção do crescimento ósseo ou para aumentar a densidade óssea em um paciente. Em determinadas modalidades, a presente invenção propõe métodos para o tratamento de um transtorno associado com densidade óssea baixa ou para promover o crescimento ósseo em pacientes que tenham necessidade dele. Um método pode compreender a administração a um paciente que tenha necessidade dele de uma quantidade efetiva de um antagonista de ativina -ActRIIa. Em determinados aspectos, a presente invenção propõe usos de antagonista de ativina -ActRIIa para a produção de um medicamento para o tratamento de um transtorno ou condição conforme descrito no presente.

[0018]Em determinados aspectos, a presente invenção propõe um método para a identificação de um agente que estimula o crescimento do osso, ou a mineralização aumentada de osso. O método compreende: a) a identificação de um agente de teste que se ligue a ativina ou a um domínio de ligação a ligante de um polipeptídeo ActRIIa; e b) a avaliação do efeito do agente sobre o crescimento ósseo, ou sobre a mineralização óssea.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

[0019]A Figura 1 mostra a purificação de ActRIIa-hFc expressa em células CHO. A proteína se purifica em forma de um pico único bem-definido.

[0020]A Figura 2 mostra a ligação de ActRIIa-hFc a ativina e a GDF-11, conforme medida por ensaio BiaCoreTM.

[0021]A Figura 3 mostra uma visão esquemática para o Ensaio de gene repórter A-204. A figura mostra o vetor Repórter: pGL3(CAGA)12 (descrito em Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-2100). o motivo CAGA12 está presente nos genes que respondem a TGF-Beta (gene PAI-1), de modo que este vetor é de uso geral para fatores que sinalizam através de Smad 2 e 3.

[0022]A Figura 4 mostra os efeitos de ActRIIa-hFc (losangos) e ActRIIa-mFc (quadrados) sobre a sinalização de GDF-8 no ensaio de Gene repórter A-204. As duas proteínas apresentaram uma inibição substancial de sinalização mediada por GDF-8 a concentrações picomolares.

[0023]A Figura 5 mostra os efeitos de três preparações diferentes de ActRIIa- hFc com sinalização de GDF-11 no Ensaio de Gene Repórter A-204.

[0024]A Figura 6 mostra exemplos de imagens DEXA de camundongos Balb/c de controle e tratados com ActRIIa-mFc antes (painéis superiores) e depois (painéis inferiores) do período de tratamento de 12 semanas. O sombreamento mais pálido indica uma densidade óssea aumentada.

[0025]A Figura 7 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc sobre a densidade mineral óssea em camundongos BALB/c durante um período de 12 semanas. Os tratamentos foram controle (losangos), doses de 2 mg/kg de ActRIIa- mFc (quadrados), doses de 6 mg/kg de ActRIIa-mFc (triângulos) e doses de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (círculos).

[0026]A Figura 8 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc sobre o teor mineral ósseo em camundongos BALB/c durante um período de 12 semanas. Os tratamentos foram controle (losangos), doses de 2 mg/kg de ActRIIa-mFc (quadrados), doses de 6 mg/kg de ActRIIa-mFc (triângulos) e doses de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (círculos).

[0027]A Figura 9 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc sobre a densidade mineral óssea do osso trabecular em camundongos C57BL6 submetidas a ovarietomia (OVX) ou a simulação de ovarietomia simulada (SHAM) depois de um período de 6 semanas. Os tratamentos consistiram em controle (PBS) ou dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (ActRIIa).

[0028]A Figura 10 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc sobre o osso trabecular em camundongos C57BL6 submetidos a ovarietomia durante um período de 12 semanas. Os tratamentos consistiram em controle (PBS; barras pálidas) ou dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (ActRIIa; barras escuras).

[0029]A Figura 11 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc sobre o osso trabecular em camundongos C57BL6 submetidos a ovarietomia simulada depois de um período de 6 a 12 semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle (PBS; barras pálidas) ou dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (ActRIIa; barras escuras).

[0030]A Figura 12 mostra os resultados da análise pQCT de densidade óssea em camundongos submetidos a ovarietomia durante 12 semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle (PBS; barras pálidas) ou ActRIIa-mFc (barras escuras). Eixo de y: mg/ccm.

[0031]A Figura 13 ilustra os resultados da análise pQCT da densidade óssea em camundongos submetidos a simulação de cirurgia durante 12 semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle (PBS; barras pálidas) ou ActRIIa- mFc (barras escuras). Eixo de y; mg/ccm.

[0032]As Figuras 14A e 14B mostram a análise DEXA do corpo todo depois de 12 semanas de tratamento (A) e análise ex vivo de fêmures (B). As áreas claras ilustram áreas de densidade óssea alta.

[0033]A Figura 15 mostra análise pQCT ex vivo da diáfise média femoral depois de doze semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle de veículo (PBS, barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As quatro barras à esquerda mostram uma densidade óssea total ao passo que as quatro barras à direita mostram a densidade óssea cortical. O primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representam dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia ao passo que o segundo par de barras representa dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia simulada.

[0034]A Figura 16 mostra a análise pQCT ex vivo e o conteúdo ósseo diafisário da diáfise média femoral depois de doze semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle veículo (PBS, barras escuras) ou ActRIIa-mFc (barras pálidas). As quatro barras à esquerda mostram o teor ósseo total ao passo que as quatro barras à direita mostram o teor ósseo cortical. O primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representa dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia ao passo que o segundo par de barras representa dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia simulada.

[0035]A Figura 17 mostra a análise pQCT ex vivo da diáfise média femoral e a espessura femoral cortical. Os tratamentos consistiram em controle (PBS, barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As quatro barras à esquerda mostram a circunferência endoóstica ao passo que as quatro barras à direita mostram a circunferência perióstica. O primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representa dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia ao passo que o segundo par de barras representa dados de camundongos submetidos a ovarietomia simulada.

[0036]A Figura 18 ilustra os resultados do teste mecânico de fêmures depois de doze semanas de tratamento. Os tratamentos consistiram em controle (PBS, barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As duas barras à esquerda representam dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia ao passo que as duas últimas barras representam dados provenientes de camundongos submetidos a ovarietomia simulada.

[0037]A Figura 19 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc sobre o volume do osso trabecular.

[0038]A Figura 20 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc sobre a arquitetura trabecular no fêmur distal.

[0039]A Figura 21 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc sobre o osso cortical.

[0040]A Figura 22 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc sobre a resistência mecânica do osso.

[0041]A Figura 23 mostra os efeitos de doses diferentes de ActRIIa-mFc sobre características ósseas a três dosagens diferentes.

[0042]A Figura 24 mostra a histomorfometria óssea indicando que ActRIIa- mFc tem uma atividade dupla anabólica e de antirressortiva.

[0043]A Figura 25 mostra dados histomorfométricos adicionais.

[0044]A figura 26 mostra imagens de fêmures murinos provenientes de camundongos não portadores e portadores de tumores, e os efeitos do tratamento com ActRIIa-mFc sobre as morfologia óssea no modelo de mieloma múltiplo. Os camundongos portadores de tumores do mieloma múltiplo (5T2) apresentam uma erosão e uma degradação acentuadas no osso em comparação com camundongos normais (não portadores de tumores). O tratamento com ActRIIa-mFc elimina este efeito.

[0045]A Figura 27 mostra os resultados do teste humano clínico descrito no Exemplo 5, em que a área sob a curva (AUC) e a dose administrada de ActRIIa-hFc têm uma correlação linear, independentemente do ActRIIa-hFc ter sido administrada por via intravenosa (IV) ou subcutânea (SC).

[0046]A Figura 28 mostra uma comparação dos níveis séricos em ActRIIa-hFc em pacientes que receberam a administração por via IV ou SC.

[0047]A Figura 29 mostra os níveis de fosfatase alcalina óssea (BAP) em resposta a níveis de dosagem diferentes de ActRIIa-hFc. BAP é um marcador para o crescimento anabólico do osso.

[0048]A Figura 30 mostra os efeitos cooperativos de ActRIIa-mFc (RAP-011) e de um agente bisfosfonato (zoledronato) em camundongos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. Visão Geral

[0049]A superfamília do fator de crescimento-beta de transformação (TGF- beta) contém uma variedade de fatores de crescimento que compartilham elementos de sequência e motivos estruturais comuns. Estas proteínas são conhecidas como exercendo efeitos biológicos sobre uma ampla variedade de tipos de células tanto em vertebrados como em invertebrados. Os membros da superfamília executam funções importante durante o desenvolvimento embrionário em formação de padrões e especificação tecidual e podem influenciar uma variedade de processos de diferenciação, incluindo lipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogênese, hematopoiese, neurogênese e diferenciação de células epiteliais. A família é dividida em dois ramos principais: os ramos BMP/GDF e TGF-beta/ ativina /BMP10, cujos membros têm efeitos diversos, frequentemente complementares. Manipulando-se a atividade de um membro da família TGF-beta, é frequentemente possível se produzir alterações fisiológicas significativas em um organismo. As raças de gado Piemontês e Azul belga são portadores de uma mutação de perda de função no gene de GDF-8 (também denominado miostatina) que produz um aumento acentuado em massa muscular. Grobet et al., Nat. Genet. 1997, 17(1)"71-4. Além disso, em seres humanos alelos inativos de GDF-8 são associados com massa muscular aumentada e, conforme relatado, resistência excepcional. Schuelke et al., N. Eng. J. Med. 2004, 350: 2682-8.

[0050]As ativinas são fatores de crescimento polipeptídeos diméricos que pertencem à superfamília TGF-beta. Há três formas principais de ativina (A, B e AB) que são homo/heterodímeros de duas subunidades β proximamente relacionadas (βAβA, βBβB, e βAβB). O genoma humano também codifica uma ativina C e uma ativina E, que são primariamente expressas no fígado. Na superfamília TGF-beta, as ativina s são fatores específicos e multifuncionais que podem estimular a produção de hormônio em células ovarianas e placentárias, sustentar a sobrevivência de células neuronais, influenciar positivamente ou negativamente, dependendo do tipo de célula, o progresso do ciclo celular e induzir a diferenciação mesodérmica pelo menos em embriões anfíbios (DePaolo et al., 1991, Proc. Soc. Ep. Biol. Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr. Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem. Pharmacol. 55:953-963). Além disso, foi constatado que o fator de diferenciação eritróide (EDF) isolado das células leucêmicas monocíticas humanas estimuladas eras idêntico à ativina a (Murata et al., 1988, PNAS, 85: 2435). Foi sugerido que a ativina A atua como um regulador natural positivo de eritropoiese na medula óssea. Em diversos tecidos, a sinalização de ativina é antagonizada por seu heterodímero relacionado, a inibina. Durante a liberação do hormônio estimulador de folículos (FSH) da pituitária, por exemplo, a ativina promove a secreção e síntese de FSH, ao passo que a inibina impede a secreção e a síntese de FSH. Outras proteínas que podem regular a bioatividade da ativina e/ou se ligar à ativina incluem folistatina (FS), proteína relacionada com folistatina (FSRP), e α2-macroglobulina.

[0051]Os sinais de TGF-β são mediados por complexos heteroméricos de receptores de serina/treonina quinase do tipo Ii e do tipo II, que fosforilam e ativam a jusante proteínas Smad por estimulação de ligante (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 169-178). Estes receptores do tipo I e do tipo II são proteínas de transmembrana, compostas de um domínio extracelular que se liga a ligante com uma região rica em cisteína, um domínio de transmembrana, e um domínio citoplasmático com uma especificidade prevista a serina/treonina. Os receptores do tipo I são essenciais para a sinalização; e os receptores do tipo II são necessários para a ligação a ligantes e para a expressão dos receptores do tipo I. Os receptores de ativina do tipo I e do tipo II formam um complexo estável depois da ligação a ligante, resultando na fosforilação dos receptores do tipo I pelos receptores do tipo II.

[0052]Dois receptores do tipo II relacionados, ActRIIa e ActRIIb já foram identificados como receptores do tipo II para ativinas (Mathews e Vale, 1991, Cell 65: 973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, ActRIIa e ActRIIb podem interagir bioquimicamente com diversas outras proteínas da família de TGF-β, incluindo BMP7, Nodal, GDF-8, e GDF-11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130: 217-226; Lee e McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 9306-9311; Yeo e Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16: 2749- 54). ALK- 4 é o receptor do tipo I primário para ativinas, especialmente para ativina A, e ALK-7 pode servir como um receptor para ativinas também, especialmente para ativina B.

[0053]Conforme demonstrado no presente documento, um polipeptídeo ActRIIa solúvel (sActRIIa), que apresenta uma preferência substancial a ligação a ativina A ao contrário dos outros membros da família TGF-beta, tais como GDF-8 ou GDF-11, é eficaz na promoção de crescimento ósseo e no aumento da densidade óssea in vivo. Embora não se deseje ser cerceado por qualquer mecanismo específico, espera-se que o efeito de sActRIIa é causado principalmente por um efeito antagonista de ativina , devido à ligação muito intensa a ativina (constante de dissociação a nível picomolar) apresentada pela construção sActRIIa específica usada nestes estudos. Independentemente do mecanismo, é aparente dos dados apresentados no presente documento que os antagonistas de ActRIIa- ativina realmente aumentam a densidade óssea em camundongos normais, em modelos murinos para a osteoporose e em um modelo murino de mieloma múltiplo. Deve ser observado que o osso é um tecido dinâmico com crescimento e atrofia e densidade crescente ou decrescente, dependendo de um equilíbrio de fatores que produzem osso e estimulam a mineralização (principalmente osteoblastos) e fatores que destroem e desmineralizam o osso (principalmente osteoclastos). O crescimento e a mineralização do osso podem ser aumentados aumentando-se os fatores produtivos, reduzindo-se os fatores destrutivos, ou ambos. Os termo “promovem o crescimento ósseo” e “aumentam a mineralização óssea” se referem a alterações físicas observáveis no osso e se destinam a ser neutras no tocante ao mecanismo pelo qual ocorrem as alterações no osso.

[0054]Os modelos murinos para a osteoporose e crescimento/densidade óssea que foram usados nos estudos descritos no presente documento são considerados como sendo extremamente previsível em eficácia em seres humanos e esta invenção propõe, portanto, métodos para se usar polipeptídeos ActRIIa e outros antagonistas de ativina -ActRIIa para promover o crescimento do osso e aumentar a densidade óssea em seres humanos. Os antagonistas de ativina -ActRIIa incluem, por exemplo, os polipeptídeos ActRIIa solúveis que se ligam a ativina , anticorpos que se ligam a ativina (especialmente as subunidades ativina A ou B, a que se refere também como βA ou βB) e impedem a ligação a ActRIIa, anticorpos que se ligam a ActRIIa e impedem a ligação de ativina , proteínas não anticorpos selecionadas para a ligação a ativina ou ActRIIa (veja, por exemplo, WO/2002/088171, WO/2006/055689, e WO/2002/032925 para exemplos de tais proteínas e métodos para a construção e seleção de tais reagentes de ligação por afinidade que não são anticorpos), e peptídeos aleatorizados selecionados para ligação a ativina ou ActRIIa, frequentemente fixados a um domínio Fc. Duas proteínas diferentes (ou outras frações) com atividade de ligação a ativina ou ActRIIa, especialmente aquelas que se ligam a ativina e que bloqueiam os sítios de ligação do tipo I (um receptor de ativina do tipo I solúvel, por exemplo) e do tipo II (um receptor de ativina do tipo II solúvel, por exemplo), respectivamente, podem ser ligados entre si para criar uma molécula de ligação bifuncional. Os aptâmeros de ácidos nucleicos, pequenas moléculas e outros agentes que inibem o eixo de sinalização de ativina -ActRIIa. Diversas proteínas têm uma atividade antagonista de ativina -ActRIIa, incluindo inibina (isto é, a subunidade α de inibina), embora a inibina não antagonize universalmente a ativina em todos os tecidos, folistatina (folistatina-288 e folistatina-315, por exemplo), FSRP, ativina C, alfa(2)-macroglobulina e uma ativina A mutante M108A (alteração de metionina em alanina na posição 108). Geralmente formas alternativas de ativina , especialmente aquelas com alterações no domínio de ligação ao receptor do tipo I, podem se ligar aos receptores do tipo II e deixam de formar um complexo ternário ativo, atuando assim como antagonistas. Além disso, os ácidos nucleicos, tais como moléculas anti-sentido, siRNAs ou ribozimas que inibem a ativina A, B, C ou E, ou, especialmente, a expressão de ActRIIa, podem ser usados como antagonistas de ativina -ActRIIa. É preferível que o antagonista de ativina -ActRIIa a ser usado apresente seletividade para a inibição da sinalização mediada por ativina em relação a outros membros da família TGF-beta, e especialmente no tocante a GDF-8 e GDF- 11. As proteínas ActRIIa solúveis realmente se ligam a ativina , no entanto a proteína do tipo selvagem não apresenta uma seletividade significativa na ligação a ativina em comparação com GDF-8/11, e experimentos preliminares sugerem que esta proteína não produz os efeitos desejados sobre o osso, produzindo simultaneamente um aumento substancial muscular. No entanto, foram identificadas formas alteradas de ActRIIb com diferentes propriedades de ligação (veja, por exemplo, WO 2006/012627, pp. 55-59, incorporada ao presente documento a título de referência) e estas proteínas podem atingir os efeitos desejados sobre o osso. A ActRIIb nativa ou alterada pode receber uma especificidade acrescentada para ativina por acoplamento com um segundo agente que se liga seletivamente a ativina .

[0055]Os termos usados neste relatório geralmente têm os seus significados habituais na técnica, dentro do contexto da presente invenção e do contexto específico em que cada termo é usado. Determinados termos serão discutidos abaixo ou em outro ponto no relatório, para fornecer instruções adicionais ao técnico na descrição das composições e métodos da presente invenção e na maneira de se preparar as mesmas e usá-las. O âmbito ou significado de qualquer uso de um termo se tornará aparente do contexto específico em que o termo é usado.

[0056]“Aproximadamente” geralmente significará um grau aceitável de erro para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus exemplares de erro se encontram dentro de 20 por cento (%), de preferência dentro de 10% e mais preferível dentro de 5% de um valor dado ou faixa de valores.

[0057]Alternativamente e especialmente em sistemas biológicos, o termo “aproximadamente” pode significar valores que se encontram dentro de uma ordem de grandeza, de preferência dentro de 5 vezes e mais preferível dentro de 2 vezes um valor dado. As quantidades numéricas dadas no presente documento são aproximadas a não ser que seja declarado em contrário, significando que o termo “aproximadamente” pode ser inferido quando não expressamente declarado.

[0058]Os métodos da presente invenção podem incluir etapas de comparação de sequências, incluindo a sequência do tipo selvagem a uma ou mais mutantes (variantes de sequência). Tais comparações tipicamente compreendem alinhamentos de sequências de polímeros, usando-se programas de alinhamento de sequências, por exemplo, e/ou algoritmos que são conhecidos na técnica (BLAST, por exemplo, FASTA e MEGALIGN, para citar algumas). O perito na técnica poderá facilmente observar que em tais alinhamentos em que uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o alinhamento de sequências introduzirá um “intervalo” (tipicamente representado por um traço, ou “A”) na sequência de polímero que não contém o resíduo inserido ou deletado.

[0059]“Homólogo” em todas as suas formas gramaticais e variações se refere à relação entre duas proteínas que possuem uma “origem evolucionária comum” incluindo proteínas provenientes de superfamílias na mesma espécie de organismo, assim com proteínas homólogas provenientes de espécies diferentes de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucleicos codificadores) têm homologia entre sequências, conforme refletido pela sua similaridade entre sequências, quer em termos de porcentagem de identidade, quer pela presença de resíduos específicos ou motivos e posições conservadas.

[0060]O termo “similaridade entre sequências” em todas as suas formas gramaticais, se refere ao grau de identidade ou correspondência entre sequências de ácido nucleico ou aminoácidos que possam compartilhar ou não uma origem evolucionária comum

[0061]No entanto, em uso comum e no presente pedido, o termo “homólogo” quando modificado com um advérbio tal como “extremamente” pode se referir a uma similaridade entre sequências e pode se referir ou não a uma origem evolucionária comum.

2. Polipeptídeos ActRIIa

[0062]Em determinados aspectos a presente invenção se refere a polipeptídeos ActRIIa. Conforme usado no presente documento, o termo “ActRIIa” se refere a uma família de proteínas de receptores de ativina do tipo IIa (ActRIIa) provenientes de qualquer espécie e variantes derivadas de tais proteínas ActRIIa por mutagênese ou por outra modificação. Por referência a ActRIIa compreende-se uma referência a uma das formas atualmente identificadas. Os membros da família de ActRIIa são geralmente proteínas de transmembrana, compostas de um domínio extracelular que se liga a ligante com uma região rica em cisteína, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático com uma atividade prevista de serina/treonina quinase.

[0063]O termo “polipeptídeo ActRIIa” inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo que ocorre naturalmente de um membro da família de ActRIIa assim como quaisquer variantes suas (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas peptidomiméticas) que conservam uma atividade útil. Os polipeptídeos ActRIIa incluem, por exemplo, polipeptídeos derivados da sequência de qualquer ActRIIa conhecido que tem uma sequência com pelo menos aproximadamente 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo ActRIIa, e de preferência pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais idêntica., Um polipeptídeo ActRIIa da presente invenção pode se ligar a uma proteína ActRIIa e/ou ativina e inibir a sua função. É preferível que um polipeptídeo ActRIIa promova crescimento ósseo e mineralização óssea. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa incluem polipeptídeos precursores de ActRIIa humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeo ActRIIa humana solúveis (SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 122, por exemplo). A sequência da proteína precursora de ActRIIa humana é a seguinte: MGAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFF NANWE KD RTNQTGVEPCY GDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG NMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHK MAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIF PIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDF LKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTA CIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGL VLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQK HAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNV DFPPKESSL (SEQ ID NO: 1).

[0064]O peptídeo de sinal é sublinhado uma vez; o domínio extracelular é em negrito e os sítios potenciais de glicosilação ligados a N são sublinhados duas vezes.

[0065]A sequência de polipeptídeo processado humano solúvel ActRIIa (extracelular) é a seguinte: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGS IEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQ.PT SNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)

[0066]A “cauda” de terminal c do domínio extracelular é sublinhada. A sequência com a “cauda” deletada (uma sequência Δ15) é a seguinte: iLGRsETQEcLFFNANWEKDRTNQTGvEpcYGDKDKRRHcFATWKNisGs iEivKQGcWLDDiNcYDRTDcvEKKDspEvYFcccEGNMcNEKFsYFpEM (sEQ iD NO:3)

[0067]A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína precursora de ActRIIa humana é a seguinte (nucleotídeos 164-1705 do GenBank inscrição NM_001616):ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTT CTTCAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGC TAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGA CAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATT GAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACT GATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCA ATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCAC TTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACATCCTGCTCTATTCCTTG GTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGTGCATTTTGGGTGTACAGG CATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTCCAACTCAAGACCCAGGACCA CCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACCACTGCAGTTATTAGAAGTGAAA GCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAAGCCCAGTTGCTTAACGAATATGTG GCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACAAACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAG TCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCATGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGA AAAACGAGGCACCAGTGTTGATGTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGA AAAGGGTTCACTATCAGACTTTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTG TGTCATATTGCAGAAACCATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATAC CTGGCCTAAAAGATGGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTA AAAATGTGCTGTTGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGG CCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTA CCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGG GATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTG GCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTT GAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTG CATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATG GCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAG GTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAA TATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGAC TTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ID NO: 4).

[0068]A sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo humano solúvel ActRIIa (extracelular) é a seguinte:ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTG GGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGA TAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATA GTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGT GTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGT GTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAA TCCAGTTACACCTAAGCCACCC (SEQ ID NO: 5).

[0069]Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a polipeptídeos ActRIIa solúveis. Conforme descrito no presente documento, o termo”polipeptídeo ActRIIa solúvel” se refere em linhas gerais a polipeptídeos que compreendem um domínio extracelular de uma proteína ActRIIa. O termo “polipeptídeo ActRIIa solúvel”, conforme usado no presente documento, inclui qualquer domínio extracelular que ocorre naturalmente de uma proteína ActRIIa assim como a quaisquer variantes suas (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticas). Um polipeptídeo ActRIIa que se liga a ativina é aquele que conserva a capacidade de se ligar a ativina , especialmente a ativina AA, AB ou BB. É preferível que o polipeptídeo ActRIIa que se liga à ativina se ligue a ativina AA com uma constante de dissociação de 1 nM ou menos. As sequências de aminoácidos da proteína precursora de ActRIIa humana são dadas abaixo. O domínio extracelular de uma proteína ActRIIa se liga à ativina e é geralmente solúvel, e deste modo pode ser denominado polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga a ativina . Exemplos de polipeptídeo ActRIIa solúvel que se liga à ativina incluem o polipeptídeo solúvel ilustrado nas SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. Refere-se à SEQ ID NO: 7 como ActRIIa- hFc e é descrita com mais detalhes nos exemplos. Outros exemplos de polipeptídeos ActRIIa solúveis que se ligam a ativina compreendem uma sequência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActRIIa, tal como a sequência líder de melitina da abelha melífera, por exemplo (SEQ ID NO: 8), a líder do ativador de plasminogênio tecidual (TPA) (SEQ ID NO: 9) ou a líder ActRIIa nativa (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActRIIa-hFc ilustrado em SEQ ID NO: 13 usa um líder de TPA.

[0070]Os fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidos selecionando-se polipeptídeos recombinantemente produzidos a partir do fragmento correspondente do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ActRIIa. Além disso, os fragmentos podem ser quimicamente sintetizados usando-se técnicas conhecidas na técnica tais como a química de f-Moc ou t-Boc em fase sólida convencional de Merrifield. Os fragmentos podem ser produzidos (recombinantemente ou por síntese química) e testados para se identificar aqueles fragmentos de peptidila que podem funcionar como antagonistas (inibidores) da proteína ActRIIa ou como sinalização mediada por ativina .

[0071]As variantes funcionalmente ativas de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidas testando-se bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidas recombinantemente a partir dos ácidos nucleicos mutagenizados correspondentes que codificam um polipeptídeo ActRIIa. As variantes podem ser produzidas e testadas para se identificar aquelas que podem funcionar como antagonistas (inibidoras) de proteína ActRIIa ou como sinalização mediada por ativina . Em determinadas modalidades, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIIa compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em determinados casos, a variante funcional tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3.

[0072]As variantes funcionais podem ser geradas por modificação da estrutura de um polipeptídeo ActRIIa para tais fins como o aumento das eficácia terapêutica, ou da estabilidade (do tempo de armazenamento ex vivo, por exemplo, e da resistência a degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos ActRIIa modificados, quando selecionados para conservar a ligação a ativina , são considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos ActRIIa que ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos ActRIIa modificados podem também ser produzidos por substituição, deleção ou adição de aminoácidos, por exemplo. É razoável se esperar, por exemplo, que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado (mutações conservadoras, por exemplo) não terá um efeito importante sobre a atividade biológica da molécula resultante. As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados nas suas cadeias secundárias. A possibilidade de uma alteração na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ActRIIa resultar em um homólogo funcional pode ser facilmente determinada avaliando-se a capacidade do polipeptídeo ActRIIa variante de produzir uma resposta nas células de um modo similar ao do polipeptídeo ActRIIa do tipo selvagem.

[0073]Em determinadas modalidades, a presente invenção visa mutações específicas dos polipeptídeos ActRIIa, de modo a alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem ser selecionadas de modo a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tais como os sítios de glicosilação ligados à O ou ligados a N. Os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina geralmente compreendem uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina (ou asparagina-X-serina) (em que “X” é qualquer aminoácido) que é especificamente reconhecida pelas enzimas de glicosilação celular adequadas. A alteração pode também ser introduzida pela adição ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou de treonina na sequência do polipeptídeo ActRIIa do tipo selvagem (para os sítios de glicosilação ligados à O). Uma variedade de substituições ou deleções de aminoácidos em uma das primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosilação ou em ambas (e/ou a deleção de aminoácido na segunda posição) resulta em uma ausência de glicosilação na sequência de tripeptídeo modificada. Um outro meio de se aumentar o número de frações carboidrato em um polipeptídeo ActRIIa é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo ActRIIa. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(s) pode(m) ser fixado(s) a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfidrila livres tais como os de cisteína; (d) grupos hidroxila livres, tais como os de serina, treonina ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos tais como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicada em 11 de setembro de 1987 e em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, incorporados ao presente documento a título de referência. A remoção de um ou mais frações carboidrato presentes no polipeptídeo ActRIIa pode ser obtida quimicamente e/ou enzimaticamente. A desglicosilação química pode envolver, por exemplo, a exposição do polipeptídeo ActRIIa ao composto ácido trifluormetano sulfônico, ou a um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares exceto pelo açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina) deixando-se a sequência de aminoácido intacta. A desglicosilação química é descrita com mais detalhes por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophs. 259: 52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. A clivagem enzimática de frações carboidrato nos polipeptídeos ActRIIa pode ser obtida usando-se uma variedade de endo-glicosidases e de exo-glicosidases conforme descrito por Thotakura et al. 91987) Meth. Enzymol. 138: 350. A sequência de um polipeptídeo ActRIIa pode ser ajustada, conforme for adequado, dependendo do tipo de sistema de expressão suado, uma vez que células de mamíferos, leveduras, insetos e plantas podem todas introduzir padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetadas pela sequência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, as proteínas ActRIIa para uso em seres humanos serão expressas em uma linhagem de células de mamíferos que proporcionam uma glicosilação adequada, tais como as linhagens de células HEK 293 ou CHO, embora se espere que outras linhagens de células de expressão de mamíferos, linhagens de células de leveduras com enzimas de glicosilação e células de insetos geneticamente modificadas sejam também úteis.

[0074]A presente invenção visa ainda um método de geração de mutantes, especialmente de conjuntos de mutantes combinatórios de um polipeptídeo ActRIIa, assim como mutantes truncados; conjuntos de mutantes combinatórios são especialmente úteis para a identificação de sequências de variantes funcionais. A finalidade de se testar tais bibliotecas combinatórias pode ser a de gerar, por exemplo, variantes de polipeptídeos ActRIIa que possam agir ou como agonistas ou como antagonistas, ou alternativamente, que possuam atividades totalmente inéditas. Uma variedade de ensaios de teste é dada abaixo, e tais ensaios podem ser usados para se avaliar as variantes. Uma variante de polipeptídeo ActRIIa, por exemplo, pode ter testada a sua capacidade de se ligar a um ligante de ActRIIa, para prevenir a ligação de um ligante de ActRIIa a um polipeptídeo ActRIIa ou para interferir na sinalização produzida por um ligante de ActRIIa.

[0075]A atividade de um polipeptídeo ActRIIa ou de suas variantes pode também ser testada em um ensaio à base de células ou in vivo. O efeito de uma variante de polipeptídeo ActRIIa sobre a expressão de genes envolvidos na produção óssea ou na destruição óssea pode ser avaliado. Isto pode, se for necessário, ser conduzido na presença de uma ou mais proteínas recombinantes ligantes a ActRIIa (ativina , por exemplo) e as células podem ser transfectadas de modo a produzir um polipeptídeo ActRIIa e/ou variantes suas, e opcionalmente, um ligante a ActRIIa. De modo análogo, um polipeptídeo ActRIIa pode ser administrado a um camundongo ou a um outro animal e uma ou mais propriedades do osso, tais como a densidade ou o volume podem ser avaliadas. A taxa de cura para fraturas ósseas pode também ser avaliada.

[0076]A absorciometria de raios X de energia dupla (DEXA) é uma técnica quantitativa não invasiva bem estabelecida para se avaliar a densidade óssea em um animal. Em seres humanos podem ser usados sistemas DEXA centrais para se avaliar a densidade óssea na espinha e na pelve. Estes são os melhores previsores da densidade geral óssea. Os sistemas DEXA periféricos podem ser usados para se avaliar a densidade óssea em ossos periféricos, incluindo, por exemplo, os ossos da mão, pulso, tornozelo e pé. Os sistemas de imageamento de raios X tradicionais, incluindo tomografias computadorizadas, podem ser usados para se avaliar o crescimento ósseo e a cura da fratura. A resistência mecânica do osso pode também ser avaliada.

[0077]Podem ser geradas variantes derivadas de modo combinatório que têm uma potência seletiva ou em geral aumentada em relação a de um polipeptídeo ActRIIa que ocorre naturalmente. De modo análogo, a mutagênese pode dar origem a variantes que têm as suas meias-vidas intracelulares dramaticamente diferentes das que correspondem a um polipeptídeo ActRIIa do tipo selvagem. Pede-se tornar, por exemplo, a proteína alterada mais estável ou menos estável a degradação proteolítica ou a outros processos celulares que resultam na destruição ou de outro modo qualquer na inativação de um polipeptídeo ActRIIa nativo. Tais variantes e os genes que os codificam, podem ser utilizadas para alterar níveis de polipeptídeo ActRIIa, modulando a meia-vida dos polipeptídeos ActRIIa. Uma meia-vida curta, por exemplo, pode dar origem a efeitos biológicos mais transitórios e pode permitir um controle mais rígido de níveis de polipeptídeo ActRIIa recombinante no interior do paciente. Em uma proteína de fusão de Fc, as mutações podem ser introduzidas no ligante (se houver) e/ou na porção Fc para alterar a meia-vida da proteína.

[0078]Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca degenerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos incluindo cada um deles pelo menos uma porção de sequências de polipeptídeos ActRIIa potenciais. Uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos, por exemplo, pode se enzimaticamente ligada dentro de sequências genéticas de modo tal, que o conjunto degenerado de sequências de nucleotídeos de polipeptídeos ActRIIa potenciais possa ser expresso em forma de polipeptídeos individuais, ou alternativamente, em forma de um conjunto de proteínas de fusão maiores (para apresentação a fagos, por exemplo).

[0079]Existem muitos modos pelos quais a biblioteca de homólogos potenciais pode ser gerada a partir de uma sequência de oligonucleotídeos degenerados. A síntese química de uma sequência genética degenerada pode ser conduzida em um sintetizador de DNA automático, e os genes sintéticos são então ligados para dentro de um vetor apropriado para expressão. A síntese de oligonucleotídeos degenerados é bem conhecida na técnica (veja, por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outras proteínas (veja, por exemplo, Scott et al., (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (199O) PNAS USA 87: 6378-6382; assim como as patentes U.S. Nos. 5.223.409, 5.198.346, e 5.096.815).

[0080]Alternativamente, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para gerar uma biblioteca combinatória. Variantes de polipeptídeos ActRIIa, por exemplo, podem ser geradas e isoladas de uma biblioteca por teste empregando-se, por exemplo mutagênese de varredura de alanina e semelhantes (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137: 109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218: 597601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30: 10832-10838; e Cunningham et al., (1989) Science 244: 1081-1085), por mutagênese de varredura de ligante (Gustin et al., (1993) Virology 193: 653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagênese de saturação (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagênese de PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol. Biol. 1: 11-19); ou por mutagênese aleatória incluindo mutagênese química etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; e Greener et al., (1994) Strategies in Mol. Biol. 7:32-34). A mutagênese por varredura de ligante, especialmente em um ambiente combinatório, é um método atraente para a identificação de formas truncadas (bioativas de polipeptídeos ActRIIa.

[0081]Uma ampla faixa de técnicas é conhecida na técnica para se testar produtos gênicos de bibliotecas combinatórias produzidas por mutações por pontos e truncagens, e também para se testar bibliotecas de DNAc para produtos gênicos tendo uma determinada propriedade. Tais técnicas serão geralmente adaptáveis para teste rápido de bibliotecas genéticas geradas por mutagênese combinatória de polipeptídeos ActRIIa. As técnicas mais amplamente usadas para se testar grandes bibliotecas genéticas tipicamente compreende a clonagem da biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, a transformação de células adequadas om a biblioteca de vetores resultante e a expressão dos genes combinatórios em condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita um isolamento relativamente fácil do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Os ensaios preferidos incluem ensaios de ligação a ativina e ensaios de sinalização celular mediada por ativina .

[0082]Em determinadas modalidades, os polipeptídeos ActRIIa da presente invenção podem ainda compreender modificações pós-traducionais além de qualquer um que estivesse naturalmente presente nos polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações incluem, sem limitação, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Consequentemente, os polipeptídeos ActRIIa modificados podem conter elementos diferentes de aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipídios, polissacarídeos ou monossacarídeos e fosfatos. Os efeitos destes elementos diferentes de aminoácidos sobre a funcionalidade de um polipeptídeo ActRIIa podem ser testados conforme descrito no presente documento para outras variantes de polipeptídeos ActRIIa. Quando um polipeptídeo ActRIIa é produzido em células por clivagem de uma forma nascente do polipeptídeo ActRIIa, o processamento pós- traducional pode também ser importante para um dobramento correto e/ou uma função correta da proteína. Células diferentes (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 ou HEK-293) têm maquinaria celular e mecanismos característicos celulares específicos para tais atividades pós-traducionais e podem ser escolhidas para assegura a modificação e processamento corretos dos polipeptídeos ActRIIa.

[0083]Em determinados aspectos, variantes funcionais ou formas modificadas funcionais dos polipeptídeos ActRIIa incluem proteínas de fusão que têm pelo menos uma porção dos polipeptídeos ActRIIa e um ou mais domínios de fusão. Exemplos conhecidos de tais domínios de fusão incluem, sem limitação, poli-histidina Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação a maltose (MBP) ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma preparação desejada. Alguns domínios de fusão, por exemplo, são especialmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Para os fins de purificação de afinidade, são usadas matrizes relevantes para a cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas a glutationa, amilases, e níquel ou cobalto. Muitas de tais matrizes são disponíveis em forma de “kit”, tais como o sistema de purificação GST de Pharmacia e o sistema QIAexpressTM (Qiagen) úteis com parceiros de fusão (HIS6). Como um outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a facilitar a detecção dos polipeptídeos Actriia. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as diversas proteínas fluorescentes (GFP, por exemplo) assim como os “identificadores de epítopos” que são geralmente sequências peptídicas curtas para as quais é disponível um anticorpo específico. Os identificadores de epítopos conhecidos para os quais são disponíveis anticorpos monoclonais específicos incluem FLAG, a hemaglutinina do vírus da gripo (HA) e os identificadores c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem de protease, tal como para o Fator Xa ou Trombina, que permite que a protease relevante digira parcialmente as proteínas de fusão e deste modo libere as proteínas recombinantes dele. As proteínas liberadas podem então ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em determinadas modalidades preferidas, um polipeptídeo ActRIIa é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActRIIa in vivo (um domínio “estabilizador”). “Estabilização” significa qualquer coisa que aumenta a meia-vida sérica, independentemente disso ser devido a uma redução da destruição, redução da eliminação pelos rins, ou outro efeito farmacocinético. As fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas como conferindo propriedades farmacocinéticas desejáveis sobre uma ampla faixa de proteínas. De modo análogo, as fusões a albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (de dimerização, tetramerização, por exemplo) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tais como a estimulação adicional do crescimento ósseo ou do crescimento muscular, se for desejado).

[0084]Como um exemplo específico, a presente invenção propõe uma proteína de fusão que compreende um domínio extracelular solúvel de ActRIIa fundido a um domínio Fc (SEQ ID NO: 6, por exemplo).THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VS NKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A) HYTQKSLSLSPGK*

[0085]Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações nos resíduos tais como Asp-265, lisina 322, e Asn-434. Em determinados casos, o domínio Fc mutante tendo uma ou mais destas mutações (a mutação Asp-265, por exemplo) tem uma capacidade menor de se ligar ao receptor FCY em comparação com o domínio Fc do tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante tem uma ou mais destas mutações (Asn-434 mutação de, por exemplo)tem uma capacidade maior de se ligar ao receptor de Fc relacionado com MHC de classe 1 (FcRn) quando comparado com um domínio Fc do tipo selvagem.

[0086]Deve ficar subentendido que os diferentes elementos de proteínas de fusão podem ser dispostos de qualquer modo que seja consistente com a funcionalidade desejada. Um polipeptídeo ActRIIa, por exemplo, pode ser aposto com o terminal C a um domínio heterólogo, ou alternativamente, um domínio heterólogo pode ser aposto com o terminal C a um polipeptídeo ActRIIa. O domínio de polipeptídeo ActRIIa e o seu domínio heterólogo não precisam estar adjacentes em uma proteína de fusão, podendo os domínios adicionais ou as sequências de aminoácidos adicionais incluídas com o terminal C ou N a qualquer um dos domínios ou incluídas entre os domínios.

[0087]Em determinadas modalidades, os polipeptídeos ActRIIa da presente invenção contêm uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações aumentam, por exemplo, a meia-vida in vitro dos polipeptídeos ActRIIa, aumentam a meia-vida circulatória dos polipeptídeos ActRIIa ou reduzem a degradação proteolítica dos polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações na estabilização incluem, sem limitação, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo ActRIIa e um domínio estabilizador), modificações de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, a adição de um sítio de glicosilação a um polipeptídeo ActRIIa) e modificações da fração carboidrato (incluindo, por exemplo a remoção das frações carboidrato de um polipeptídeo ActRIIa). No caso das proteínas de fusão, um polipeptídeo ActRIIa é fundido a um domínio estabilizador tal como uma molécula de IgG (um domínio Fc, por exemplo). Conforme usado no presente documento, o termo “domínio estabilizador” não somente se refere a um domínio de fusão (Fc, por exemplo) como no caso de proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceas tais como uma fração carboidrato ou polímero não proteináceo, tal como polietileno glicol.

[0088]Em determinadas modalidades, a presente invenção torna disponível formas isoladas e/ou purificadas dos polipeptídeos ActRIIa, que são isolados de outras proteínas, ou de um outro modo qualquer são substancialmente isentas delas. Os polipeptídeos ActRIIa geralmente serão produzidos para expressão a partir de ácidos nucleicos recombinantes.

3. Ácidos Nucleicos que Codificam Polipeptídeos ActRIIa

[0089]Em determinados aspectos a presente invenção propõe ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes codificando qualquer um dos polipeptídeos ActRIIa (polipeptídeo ActRIIa solúveis, por exemplo), incluindo fragmentos, variantes funcionais e proteínas de fusão descritas no presente documento. A SEQ ID NO: 4 codifica, por exemplo, o polipeptídeo precursor de ActRIIa humano que ocorre naturalmente ao passo que a SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular processado de ActRIIa. Os ácidos nucleicos objeto da presente invenção podem ser de um único filamento ou de filamento duplo. Tais ácidos nucleicos podem ser moléculas de DNA ou de RNA. Estes ácidos nucleicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para a preparação de polipeptídeos ActRIIa ou como agentes terapêuticos diretos (em uma abordagem de terapia gênica, por exemplo).

[0090]Em determinados aspectos, fica ainda subentendido que os ácidos nucleicos objeto da presente invenção que codificam os polipeptídeos ActRIIa incluem ainda ácidos nucleicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. As sequências de nucleotídeos variantes incluem as sequências que diferem de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos, tal como variantes alélicas.

[0091]Em determinadas modalidades, a invenção propõe sequências de ácidos nucleicos isolados ou recombinantes que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 4 ou 5. Os versados na técnica observarão que as sequências de ácidos nucleicos complementares às SEQ ID NO: 4 ou 5 e variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5 incidem também no âmbito da presente invenção. Em outras modalidades, as sequências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser isolados, recombinantes e/ou fundidos com uma sequência de nucleotídeos heteróloga, ou em uma biblioteca de DNA.

[0092]Em outras modalidades, os ácidos nucleicos da presente invenção também incluem sequências de nucleotídeos que se hibridizam em condições extremamente drásticas à sequência de nucleotídeos designada em SEQ ID NO: 4 ou 5, sequência complemento de SEQ ID NO: 4 ou 5, ou seus fragmentos. Conforme foi discutido acima, os versados na técnica compreenderão facilmente que pode se fazer variar as condições de drasticidade apropriada que promovem a hibridização de DNA. Os versados na técnica facilmente compreenderão que se pode fazer variar as condições de drasticidade adequadas que promovem a hibridização de DNA. Pode- se conduzir a hibridização, por exemplo, a 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, lavando-se em seguida com 2,0 x SSC a 50°C. A concentração, por exemplo, na etapa de lavagem pode ser selecionada desde uma drasticidade baixa de aproximadamente 2,0 x SSC a 50°C até uma drasticidade extrema de aproximadamente 0,1 x SSC a 50°C. Além disso, pode se aumentar a temperatura na etapa de lavagem das condições de drasticidade baixa à temperatura, de aproximadamente 22°C até condições extremamente drásticas a aproximadamente 65°C. Pode-se fazer variar tanto a temperatura como a concentração de sal, ou então pode-se manter constante ou a temperatura ou a concentração do sal, enquanto se altera a outra variável. Em uma modalidade, a invenção propõe ácidos nucleicos que se hibridizam em condições de baixa drasticidade de 6 x SSC à temperatura ambiente, lavando-se em seguida a 2 x SSC à temperatura ambiente.

[0093]Os ácidos nucleicos que diferem dos ácidos nucleicos conforme apresentados nas SEQ ID NOs: 4 ou 5 devido à degeneração no código genético também incidem no âmbito da invenção. Uma série de aminoácidos é designada por mais de um tripleto, por exemplo. Os códons que especificam o mesmo aminoácido, ou seus sinônimos, (CAU e CAC, por exemplo, são sinônimos para a histidina) podem resultar em mutações “silenciosas” que não afetam a sequência de aminoácidos da proteína. No entanto, espera-se que os polimorfismos das sequências de DNA que levam a alterações nas sequências de aminoácidos das proteínas objeto da presente invenção existirão no meio de células de mamíferos. Os versados na técnica observarão que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até aproximadamente 3-5% dos nucleotídeos) dos ácidos nucleicos que codificam uma proteína específica podem existir no meio de indivíduos de uma espécie dada devido à variação alélica natural. Toda e qualquer tal variação de nucleotídeos e os polimorfismos de aminoácidos resultantes incidem no âmbito da presente invenção.

[0094]Em determinadas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes da presente invenção podem ser ligados de modo operável a um ou mais das sequências de nucleotídeos reguladoras em uma construção de expressão. As sequências de nucleotídeos reguladoras geralmente será adequadas para a célula hospedeira usada para a expressão. Os numerosos tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente a uma ou mais sequências de nucleotídeos reguladoras podem incluir, sem limitação, sequências promotoras, sequências líderes ou de sinal, sítios de ligação ribossomal, sequências início e terminação de transcrição, sequências de início e terminação traducional e sequências intensificadora ou ativadoras. Os promotores constitutivos ou induzíveis conforme é conhecido na técnica são visados pela presente invenção. Os promotores podem ser ou promotores que ocorrem naturalmente ou promotores híbridos que combinam elementos de mais de um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente em uma célula sobre um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na técnica e variarão dependendo da célula hospedeira usada.

[0095]Em determinados aspectos da invenção, o ácido nucleico objeto da presente invenção é provido em um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ActRIIa e é ligado de modo operável a pelo menos uma sequência reguladora. As sequências reguladores são reconhecidas na técnica e são selecionadas para dirigir a expressão do polipeptídeo ActRIIa. Consequentemente, o termo sequência reguladora inclui promotores, intensificadores e outros elementos de controle da expressão. As sequências reguladoras exemplares são descritas em Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Qualquer uma de uma ampla variedade de sequências de controle da expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA quando ligada de modo operativo a ela pode ser usada nestes vetores para expressar as sequências de DNA que codificam um polipeptídeo ActRIIa. Tais sequências de controle da expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40, promotor tet, promotor precoce imediato de adenovírus ou citomegalovírus, promotores RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão é dirigida por T7 RNA polimerase, o principal operador e regiões promotoras do fago lambda, as regiões de controle da proteína de invólucro fd, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida, Pho5, por exemplo, os promotores dos fatores de conjugação α de levedura, o promotor poliedro do sistema de baculovírus e outras sequências que se conhece que controlam a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e diversas combinações suas. Deve ficar subentendido que a construção do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou do tipo de proteína que se deseja que seja expressa. Além disso, o número de cópias do vetor, a capacidade de se controlar tal número de cópias e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor tal como marcadores de antibióticos, devem também ser levadas em consideração.

[0096]Um ácido nucleico recombinante da presente invenção pode ser produzido ligando-se o gene clonado ou uma porção sua em um vetor adequado para expressão ou em células procarióticas, ou em células eucarióticas (levedura, aviárias, de insetos ou de mamíferos), ou ambas. Os veículos de expressão para a produção de um polipeptídeo ActRIIa recombinante incluem plasmídeos e outros vetores. Os vetores adequados incluem, por exemplo, plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tais como E. coli.

[0097]Alguns vetores de expressão de mamíferos contêm tanto sequências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactérias, e uma ou mais unidades de transcrição eucarióticas que são expressas em células eucarióticas. Os vetores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamíferos para transfecção de células eucarióticas. Alguns destes vetores são modificados com sequências provenientes de plasmídeos bacterianos tais como pBR322 para facilitar a replicação e à seleção de resistência a drogas tanto em células procarióticas como eucarióticas. Alternativamente, os derivados de vírus tais como papiloma vírus bovino (BPV-1) ou vírus de Epstein-Barr (derivados de HEBo, pREP e p205) podem ser usados para uma expressão transitória de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluindo retroviral) podem ser encontrados abaixo na descrição dos sistemas de fornecimento de terapia gênica. Os diversos métodos empregados na preparação dos plasmídeos e na transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas como eucarióticas, assim como para procedimentos gerais recombinantes, veja Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a. ed., ed. Por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns casos, pode ser desejável se expressar os polipeptídeos recombinantes pelo uso de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de VL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), os vetores derivados de pAcUW (tais como pAcUW1) e os vetores derivados de pBlueBac (tais como o pBlueBac III contendo β-gal).

[0098]Em uma modalidade preferida, um vetor será projetado para a produção dos polipeptídeos ActRIIa objeto da presente invenção em células CHO, tais como o vetor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores pC1-neo (Promega, Madison, Wisc.). Conforme se tornará evidente, as construções genéticas objeto da presente invenção podem ser usadas para produzir expressão dos polipeptídeos ActRIIa objeto da presente invenção em células propagadas em cultura, para produzir proteínas, por exemplo, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.

[0099]A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante incluindo uma sequência de codificação (SEQ ID NO: 4 ou 5, por exemplo) para uma ou mais dos polipeptídeos ActRIIa objeto da presente invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Um polipeptídeo ActRIIa da presente invenção pode ser expresso, por exemplo, em células bacterianas tais como de E. coli, em células de insetos (usando- se, por exemplo, um sistema de expressão de baculovírus), células de levedura ou de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos versados na técnica.

[00100]Consequentemente, a presente invenção se refere ainda a métodos de produção dos polipeptídeos ActRIIa objeto da presente invenção. Uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActRIIa, por exemplo, pode ser cultivada em condições apropriadas para permitir que ocorra a expressão do polipeptídeo ActRIIa. O polipeptídeo ActRIIa pode ser secretado e isolado de uma mistura de células e do meio que contém o polipeptídeo ActRIIa. Alternativamente, o polipeptídeo ActRIIa pode ser citoplasmaticamente conservado ou em uma fração de membrana e as células podem ser coletadas, submetidas a lise e a proteína pode ser isolada. Uma cultura de células inclui células hospedeiras, o meio de cultura e outros produtos secundários. O meio adequado para a cultura de células é bem conhecido na técnica. Os polipeptídeos ActRIIa objeto da presente invenção podem ser isolados do meio de cultura das células, das células hospedeiras ou de ambos, usando-se técnicas conhecidas na técnica para a purificação de proteínas, incluindo cromatografia de troca de íons, cromatografia de filtração por gel, ultrafiltração, eletroforese, purificação por imunoafinidade com anticorpos específicos para epítopos específicos dos polipeptídeos ActRIIa e purificação por afinidade com um agente que se liga a um domínio fundido ao polipeptídeo ActRIIa (uma coluna de proteína A, por exemplo, pode ser usada para purificar uma fusão ActRIIa-Fc). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ActRIIa é uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita a sua purificação. Em uma modalidade preferida, a purificação é produzida por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de sefarose Q, cromatografia de fenilsefarose, cromatografia de exclusão por tamanho, e cromatografia por troca de cátions. A purificação poderia ser completada com filtração viral e troca de tampão. Conforme foi demonstrado no presente documento, a proteína ActRIIa-hFc foi purificada até um grau de pureza de >98% conforme determinado por cromatografia de exclusão por tamanho e > 95% conforme foi determinado por SDS- PAGE. Este nível de pureza foi suficiente para se obter efeitos desejáveis sobre o osso em camundongos e um perfil de segurança aceitável em camundongos, ratos e primatas não humanos.

[00101]Em uma outra modalidade, um gene de fusão que codifica para uma sequência líder de purificação tal como uma sequência de sítio de clivagem de poli- (His)/enteroquinase no terminal N da porção desejada do polipeptídeo ActRIIa recombinante pode permitir a purificação da proteína de fusão expressa por cromatografia por afinidade usando-se uma resina de metal Ni2+. A sequência líder de purificação pode então ser removida subsequentemente por tratamento com enteroquinase para produzir o polipeptídeo ActRIIa purificado (veja, por exemplo, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; e J+anknecht et al., PNAS USA 88: 8972).

[00102]As técnicas para a preparação de genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente a junção de diversos fragmentos de DNA que codificam para diferentes sequências de polipeptídeos é conduzida de acordo com técnicas convencionais, empregando-se terminais de extremidade cega ou gradual para ligação, digestão por enzima de restrição para produzir terminais adequados, preenchimento de extremidades coesas conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar uma junção indesejável e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencional incluindo sintetizadores automatizados de DNA. Alternativamente, a amplificação de fragmentos de genes por PCR pode ser conduzida usando-se iniciadores de ancoragem que dão origem a pendentes complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem ser subsequentemente desnaturados para gerar uma sequência de gene quimérico (veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

4. Antagonistas Alternativos de ativina e de ActRIIa

[00103]Os dados apresentados no presente documento demonstram que os antagonistas de sinalização de ativina -ActRIIa podem ser usados para promover o crescimento ósseo e a mineralização óssea. Embora os polipeptídeos ActRIIa solúveis e especialmente ActRIIa-Fc sejam antagonistas preferidos, e embora tais antagonistas possam afetar o osso por meio de um mecanismo diferente de antagonismo a ativina (a inibição de ativina , por exemplo, pode ser um indicador da tendência de um agente de inibir as atividades de um espectro de moléculas que incluem, talvez, outros membros da superfamília TGF-beta, e tal inibição coletiva pode levar ao efeito desejado sobre o osso), espera-se que outros tipos de antagonistas de ativina -ActRIIa sejam úteis, incluindo anticorpos anti- ativina (A, B, C e E, por exemplo), anticorpos anti-ActRIIa, RNAi anti-sentido ou ácidos nucleicos de ribozima que inibem a produção de ActRIIa e outros inibidores de ativina ou de ActRIIa, especialmente aqueles que interferem na ligação ativina -ActRIIa.

[00104]Um anticorpo que reage especificamente com um polipeptídeo ActRIIa (com um polipeptídeo ActRIIa solúvel, por exemplo) e que ou se liga competitivamente ao ligante com o polipeptídeo ActRIIa ou inibe de outro modo qualquer a sinalização mediada por ActRIIa pode ser usado como um antagonista de atividades de polipeptídeos ActRIIa. De modo análogo, um anticorpo que reage especificamente com um polipeptídeo A de ativina e que interfere na ligação a ActRIIa pode ser usado como um antagonista.

[00105]Usando-se imunógenos derivados de um polipeptídeo ActRIIa ou de um polipeptídeo ativina , podem ser produzidos anti-soros anti-proteicos/anti- peptídicos ou anticorpos monoclonais por protocolos padrão (veja, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow e Lane (Cold Spirng Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tal como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com uma forma imunogênica do polipeptídeo ActRIIa, um fragmento antigênico que é capaz de obter uma resposta de anticorpo, ou uma proteína de fusão. As técnicas para conferir imunogenicidade a uma proteína ou peptídeo incluem a conjugação a portadores ou outras técnicas bem conhecidas na técnica. Uma porção imunogênica de um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina pode ser administrada na presença de adjuvante. O progresso da imunização pode ser monitorado pela detecção de títulos de anticorpos no plasma ou no soro. Pode ser usado um ELISA padrão ou outro imunoensaio, juntamente com o imunógeno como antígeno para se avaliar os níveis de anticorpos.

[00106]Depois da imunização de um animal com um preparado antigênico de um polipeptídeo ActRIIa, podem ser obtidos anti-soros e, se for desejado, anticorpos policlonais podem ser isolados do soro. Para se produzir anticorpos monoclonais as células produtoras de anticorpos (linfócitos) podem ser coletadas de um animal imunizado e fundidas por procedimentos padrão de fusão somática de célula com células imortalizantes tais como células de mieloma para produzir células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, a técnica de hibridoma (originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). As células de hibridomas podem ser imunoquimicamente testadas para a produção de anticorpos que reagem especificamente com um polipeptídeo ActRIIa e de anticorpos monoclonais isolados de uma cultura que compreende tais células de hibridoma.

[00107]O termo “anticorpo”, conforme usado no presente documento destina- se a incluir fragmentos seus que também reagem especificamente com um polipeptídeo da presente invenção. Os anticorpos podem ser fragmentados usando- se técnicas convencionais sendo os fragmentos testados para utilidade do mesmo modo como foi descrito acima para anticorpos integrais. Os fragmentos F(ab)2, por exemplo, podem ser gerados por tratamento de anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab)2 resultante pode ser tratado para se reduzir as pontes dissulfeto para produzir fragmentos Fab. O anticorpo da presente invenção é ainda destinado a incluir moléculas bi—específicas, de cadeia única, quimérica, humanizadas e totalmente humanas que têm afinidade para um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina conferido pelo menos por uma região CDR do anticorpo. Um anticorpo pode ainda compreender um rótulo afixado a ele e ser capaz de ser detectado (o rótulo pode ser um radioisótopo, composto fluorescente, enzima ou co-fator de enzima, por exemplo).

[00108]Em determinadas modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante, termo este que abrange qualquer anticorpo gerado em parte por técnicas de biologia molecular, incluindo anticorpos enxertados em CDR ou quiméricos, anticorpos humanos ou outros construídos a partir de domínios de anticorpos selecionados de bibliotecas, anticorpos de uma única cadeia e anticorpos de domínio único (proteínas VH humanas ou proteínas VHH de camelídeos, por exemplo). Em determinadas modalidades, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal e em determinadas modalidades, a presente invenção torna disponíveis métodos para a geração de anticorpos inéditos. Um método para a geração de um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipeptídeo ActRIIa ou a um polipeptídeo ativina pode compreender a administração a um camundongo de uma quantidade de uma composição imunogênica que compreende um polipeptídeo de antígeno efetivo para estimular uma resposta imune detectável, obtendo-se células produtoras de anticorpos (células provenientes do baço, por exemplo) a partir do camundongo e fundindo-se as células produtoras de anticorpos com células de mieloma para se obter hibridomas produtores de anticorpos, e testando-se os hibridomas produtores de anticorpos para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno. Uma vez obtido, um hibridoma pode ser propagado em uma cultura de células, opcionalmente em condições de cultura em que as células derivadas de hibridoma produzem o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno. O anticorpo monoclonal pode ser purificado da cultura de células.

[00109]A expressão “que reage especificamente com”, conforme usada com referência a um anticorpo, destina-se a significar, conforme é em geral compreendido na técnica, que o anticorpo é suficientemente seletivo entre o antígeno de interesse (um polipeptídeo ActRIIa, por exemplo) e outros antígenos que não são de interesse, para que o anticorpo seja útil, no mínimo, para a detecção da presença do antígeno de interesse em um tipo específico de amostra biológica. Em determinados métodos que empregam o anticorpo, tal como em aplicações terapêuticas, um grau mais alto de especificidade na ligação pode ser desejável. Os anticorpos monoclonais geralmente têm uma tendência maior (em comparação com anticorpos policlonais) para discriminar efetivamente entre os antígenos desejados e polipeptídeos em reação cruzada. Uma característica que influencia a especificidade de uma interação anticorpo:antígeno é a afinidade do anticorpo para o antígeno. Embora a especificidades desejada possa ser atingida com uma faixa de diferentes afinidades, os anticorpos em geral preferidos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de aproximadamente 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 ou menos. Dada a ligação extraordinariamente firme entre a ativina e ActRIIa, espera-se que um anticorpo anti- ativina ou anti-ActRIIa neutralizador teria geralmente uma constante de dissociação de 10-10 ou menos.

[00110]Além disso, as técnicas usadas para se testar anticorpos para se identificar um anticorpo desejável pode influenciar as propriedades do anticorpo obtido. Se um anticorpo está destinado a ser usado para se ligar a um antígeno em solução, por exemplo, pode ser desejável se testar a ligação em solução. Uma variedade de diferentes técnicas são disponíveis para se testar a interação entre os anticorpos e os antígenos para se identificar anticorpos especialmente desejáveis. Tais técnicas incluem ELISAs, ensaios de ligação de ressonância de plasmônio de superfície (tais como o ensaio de ligação BiaCoreTM, por exemplo, Biacore AB, Uppsala, Suécia) ensaios em sanduíche (o sistema de microesferas paramagnéticas, por exemplo, de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), western blots, ensaios de imunoprecipitação e imuno-histoquímica.

[00111]Exemplos de categorias de compostos de ácidos nucleicos que são antagonistas de ativina ou de ActRIIa incluem ácidos nucleicos anti-sentido, construções de RNAi e construções catalíticas de ácidos nucleicos. Um composto de ácido nucleico pode ser de um filamento ou de filamento duplo. Um composto de duplo filamento pode também incluir regiões de pendente ou não complementaridade, em que ou um ou o outro dos filamentos é de um único filamento. Um composto de um único filamento pode incluir regiões de auto-complementaridade, significando que o composto forma uma estrutura denominada “de grampo” ou “haste-alça” com uma região de estrutura de dupla hélice. Um composto de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma região que consiste em não mais de 1000, não mais de 500, não mais de 250, não mais de 100, não mais de 50, 35, 30, 25, 22 20 ou 18 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico de ActRIIa de comprimento total ou da sequência de acn de ativina βA ou de ativina βB. A região de complementaridade terá de preferência 8 nucleotídeos e opcionalmente pelo menos 10 ou pelo menos 15 nucleotídeos, e opcionalmente entre 15 e 25 nucleotídeos. Uma região de complementaridade pode incidir dentro de um íntron, uma sequência de codificação ou em uma sequência não codificadora da transcrição de alvo tal como a porção de sequência de codificação. Geralmente, um composto de ácido nucleico terá um comprimento de aproximadamente 8 a aproximadamente 500 nucleotídeos ou pares de base de comprimento e opcionalmente o comprimento será de aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleotídeos. Um ácido nucleico pode ser um DNA (especialmente para uso como um anti-sentido), RNA ou um híbrido de RNA;DNA. Qualquer um filamento pode incluir uma mistura de DNA e RNA, assim como formas modificadas que não podem ser facilmente classificadas como sendo DNA ou RNA. De modo análogo, um composto de dois filamentos pode ser DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA e qualquer um filamento pode também incluir uma mistura de DNA e RNA, assim como formas modificadas que não podem ser facilmente classificadas como sendo DNA ou RNA. Um composto de ácido nucleico pode incluir qualquer uma de uma variedade de modificações, incluindo uma ou mais modificações à espinha dorsal (a porção açúcar- fosfato em um ácido nucleico natural, incluindo ligações inter nucleotídeos) ou a porção base (a porção purina ou pirimidina de um ácido nucleico natural). Um composto de ácido nucleico anti-sentido terá, de preferência, um comprimento de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotídeos e frequentemente conterá uma ou mais modificações para melhorar as características tais como estabilidade no soro, em uma célula ou em um local em que o composto tem a probabilidade de ser fornecido, tal como o estômago no caso de compostos de administração oral e o pulmão para compostos inalados. No caso de uma construção de RNAi, a complementaridade de filamento à transcrição alvo, geralmente será RNA ou suas modificações. O outro filamento pode ser RNA, DNA ou qualquer outra variação. A porção duplex da construção RNAi em “grampo” de dois filamentos ou de um único filamento terá, de preferência, um comprimento de 18 a 40 nucleotídeos e opcionalmente de aproximadamente 21 a 23 nucleotídeos, desde que sirva como um substrato Dicer. Os ácidos nucleicos catalíticos ou enzimáticos podem ser ribozimas ou enzimas de DNA e podem também conter formas modificadas. Os compostos de ácidos nucleicos podem inibir a expressão do alvo de aproximadamente 50%, 75%, 90% ou mais quando colocadas em contato com células em condições fisiológicas e a uma concentração em que o controle não-sentido ou no sentido tem pouco ou nenhum efeito. As concentrações preferidas para se testar o efeito dos compostos de ácidos nucleicos são de 1,5 e 10 micromolar. Os compostos de ácidos nucleicos podem também ser testados para efeitos sobre o crescimento e mineralização ósseos, por exemplo.

5. Ensaios de Triagem

[00112]Em determinados aspectos, a presente invenção se refere ao uso de polipeptídeos ActRIIa (polipeptídeos ActRIIa solúveis, por exemplo) e de polipeptídeos ativina para a identificação de compostos (agentes) que são agonistas ou antagonistas do trajeto de sinalização de ativina -ActRIIa. Os compostos identificados pela seleção podem ser testados para avaliar a sua capacidade de modular o crescimento ósseo ou a mineralização óssea in vitro. Opcionalmente, estes compostos podem ainda ser testados em modelos animais para avaliar a sua capacidade de modular o crescimento tecidual in vivo.

[00113]Existem numerosas abordagens para a triagem para agentes terapêuticos para a modulação de crescimento tecidual tendo-se como alvo polipeptídeos ActRIIa e de ativina . Em determinadas modalidades, uma triagem de compostos de alto rendimento pode ser conduzida para identificar agentes que perturbam os efeitos mediados por ativina ou por ActRIIa sobre o osso. Em determinadas modalidades, o ensaio é conduzido para triar e identificar compostos que inibem especificam ou reduzem a ligação de um polipeptídeo ActRIIa a ativina . Alternativamente, o ensaio pode ser usado para a identificação de compostos que acentuam a ligação de um polipeptídeo ActRIIa a ativina . Em uma outra modalidade, os compostos podem ser identificados pela sua capacidade de interagir com um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina .

[00114]Uma variedade de formatos de ensaios será suficiente e à luz da presente invenção, aqueles que não tenham sido expressamente descritos no presente documento, serão mesmo assim compreendidos pelos versados na técnica. Conforme descrito no presente documento, os compostos de teste (agentes) da invenção podem ser criados por qualquer método químico combinatório. Alternativamente, os compostos da presente invenção podem ser biomoléculas que ocorrem naturalmente sintetizadas in vivo ou in vitro. Os compostos (agentes) a serem testados para a sua capacidade de agir como moduladores do crescimento ósseo podem ser produzidos, por exemplo, por bactérias, leveduras, plantas ou outros organismos (produtos naturais, por exemplo), produzidos quimicamente (pequenas moléculas, incluindo peptidomiméticos, por exemplo) ou produzidos de modo recombinante. Os compostos de teste visados pela presente invenção incluem moléculas orgânicas não peptidílicas, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios e moléculas de ácidos nucleicos. Em uma modalidade específica, o agente de teste é uma molécula orgânica pequena tendo um peso molecular inferior a aproximadamente 2.000 daltons.

[00115]Os compostos de teste da presente invenção podem ser providos em forma de entidades singulares descontínuas ou serem providos em bibliotecas de uma complexidade maior, tais como as produzidas pela química combinatória. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, álcoois, haletos de alquila, aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos orgânicos. A apresentação de compostos de teste ao sistema de teste pode ser ou na forma isolada ou em forma de misturas de compostos, especialmente nas etapas de triagem inicial. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivados com outros compostos e ter grupos derivadores que facilitam o isolamento dos compostos. Exemplos não limitantes de grupos derivadores incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, poli-histidina, microesferas magnéticas, glutationa S transferase (GST), reticuladores fotoativáveis ou qualquer combinação deles.

[00116]Em muitos programas de triagem de drogas que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, os ensaios de alto rendimento são desejáveis para se maximizar o número de compostos examinados em um dado período de tempo. Os ensaios que são conduzidos em sistemas isentos de células, tais como os que podem ser derivados com proteínas purificadas ou semi-purificadas, são frequentemente preferidos como testes “primários” pelo fato de que eles podem ser gerados para permitir um desenvolvimento rápido e uma detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto de teste. Além disso, os efeitos da toxicidade celular ou de biodisponibilidade do composto de teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, focalizando-se em vez disso com o ensaio principalmente sobre o efeito da droga sobre o alvo molecular, conforme pode ser manifestado m uma alteração da afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActRIIa e ativina .

[00117]Somente a título de exemplo, em um ensaio de triagem exemplar da presente invenção, o composto de interesse é colocado em contato com um polipeptídeo ActRIIa isolado e purificado que é ordinariamente capaz de se ligar a ativina . Acrescentou-se então à mistura do composto com o polipeptídeo ActRIIa uma composição contendo um ligante de ActRIIa. A detecção e a quantificação de complexos de ActRIIa/ ativina proporciona os meios para a determinação da eficácia do composto em inibir (ou em potencializar) a formação de complexos entre o polipeptídeo ActRIIa e a ativina . A eficácia do composto pode ser avaliada gerando- se curvas de resposta a dose a partir de dados obtidos usando-se diversas concentrações do composto de teste. Além disso, um ensaio de controle pode também ser conduzido para proporcionar uma linha de base para comparação. Em um ensaio de controle acrescenta-se ativina isolada e purificada a uma composição que contém o polipeptídeo ActRIIa e a formação do complexo de ActRIIa/ ativina é quantificada na ausência do composto de teste. Deve ficar subentendido que, em geral, pode-se fazer variar a ordem em que os reagentes possam ser misturados, podendo também ser misturados simultaneamente. Além disso, em vez de proteínas purificadas podem ser usados extratos celulares e lisados para produzir um sistema de ensaio adequado isento de células.

[00118]A formação de complexo entre o polipeptídeo ActRIIa e a ativina pode ser detectada por uma variedade de técnicas. A modulação da formação de complexos, por exemplo, pode ser quantificada usando-se, por exemplo, proteínas rotuladas de modo detectável tal como polipeptídeo ActRIIa ou ativina radio-rotulados (32P, 35P, 14C ou 3H, por exemplo), rotulados de modo fluorescente (FITC, por exemplo) ou rotulados enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica.

[00119]Em determinadas modalidades, a presente invenção visa o uso de ensaios de polarização de fluorescência e ensaios de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) na medição quer direta ou indireta do grau de interação entre um polipeptídeo ActRIIa e a sua proteína de ligação. Além disso, outros modos de detecção tais como os baseados em guias de ondas óticas (Publicação PCT WO 96/26432 e patente U.S. No. 5.677.196), ressonância plasmônica de superfície (SPR), sensores de carga de superfície, e sensores de força de superfície são compatíveis com muitas modalidades da presente invenção.

[00120]Além disso, a presente invenção visa o uso de um ensaio de aprisionamento por interação, também conhecido como um “ensaio de dois híbridos” para a identificação de agentes que prejudicam ou potencializam a interação entre o polipeptídeo ActRIIa e a sua proteína de ligação. vEja, por exemplo, patente U.S. No. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a presente invenção visa o uso de sistemas de dois híbridos reversos para identificar compostos (pequenas moléculas ou peptídeos, por exemplo) que dissociam as interações entre um polipeptídeo ActRIIa e a sua proteína de ligação. Veja, por exemplo, Vidal e Legrain, (1999) Nucleic Acids Res. 27:919-29; Vidal e Legrain, (1999) Trends Biotechnol. 17:374-81; e patentes U.S. Nos. 5.525.490; 5.955.280; e 5.965.368.

[00121]Em determinadas modalidades, os compostos da presente invenção são identificados pela sua capacidade de interagir com um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina da presente invenção. A interação entre o composto e o polipeptídeo ActRIIa ou de ativina pode ser covalente ou não covalente. Tal interação pode ser identificada a nível de proteína, por exemplo, usando-se métodos bioquímicos in vitro, incluindo foto-reticulação, ligação de ligantes radio-rotulados, e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). Em determinados casos, os compostos podem ser triados em um ensaio à base de mecanismo tal como um ensaio para detectar compostos que se liguem a um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina . Isto pode incluir um evento de ligação na fase sólida ou na fase fluida. Alternativamente, o gene que codifica um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina pode ser transfectado com um sistema repórter (β-galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde, por exemplo) em uma célula e testado contra a biblioteca de preferência por uma triagem de alto rendimento ou com membros individuais da biblioteca. Podem ser usados outros ensaios de ligação à base de mecanismo, tais como ensaios de ligação que detectam alterações em energia livre. Os ensaios de ligação podem ser conduzidos com o alvo fixado a um poço, microesfera ou chip ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capilar. O composto ligado pode ser detectado geralmente usando-se ressonância plasmônica de superfície, colorimétrica ou de fluorescência.

[00122]Em determinados aspectos a presente invenção propõe métodos e agentes para a modulação (estimulação ou inibição) de formação óssea e para aumentar a massa óssea. Portanto, qualquer composto identificado pode ser testado em células integrais ou em tecidos, in vitro ou in vivo, para confirmar a sua capacidade de modular o crescimento ósseo ou a mineralização óssea. Diversos métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados para tal fim.

[00123]O efeito de polipeptídeos ActRIIa ou de ativina ou de compostos de teste sobre o crescimento ósseo ou de cartilagem, por exemplo, pode ser determinado por medição da indução de Msx2 ou diferenciação de células osteoprogenitoras em osteoblastos em ensaios à base de células (veja, por exemplo, Daluiski et al., Nat. Genet. 2001, 27(1): 84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9: 1520-9). Um outro exemplo de ensaios à base de células inclui a análise da atividade osteogênica dos polipeptídeos ActRIIa ou de ativina da presente invenção e os compostos de teste em células de progenitor mesenquimal e osteoblástico. A título de ilustração, os adenovírus recombinantes que expressam um polipeptídeo ActRIIa ou de ativina pode ser construído para infectar as células progenitoras mesenquimais pluripotentes C3H10T1/2, células pré-osteoblásticas C2C12, e células osteoblásticas TE-85. A atividade osteogênica é então determinada pela medição da indução da fosfatase alcalina, osteocalcina e da mineralização da matriz (veja, por exemplo, Cheng et al., J. Bone Joint Surg. Am. 2003, 85-A(8): 1544-52).

[00124]A presente invenção também visa ensaios in vivo para medir o crescimento ósseo ou de cartilagem. Namkung-Matthai et al., Bone, 28: 80-86 (2001) descreve um modelo de osteoporose de rato em que o reparo ósseo durante o período inicial depois da fratura é estudado. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999) também descreve um modelo de osteoporose de rato em que o reparo ósseo durante o período tardio depois da fratura é estudado. Andersson et al., J. Endocrinol. 170: 529-537 descrevem um modelo de osteoporose murino em que os camundongos são submetidos a ovarietomia, o que faz com que os camundongos percam um teor mineral ósseo substancial e a densidade mineral óssea, com o osso trabecular perdendo aproximadamente 50% da densidade mineral óssea. A densidade óssea poderia ser aumentada nos camundongos submetidos a ovarietomia por administração de fatores tais como hormônio da paratireóide. Em determinados aspectos, a presente invenção utiliza os ensaios de cura de fratura que são conhecidos na técnica. Estes ensaios incluem a técnica de fratura, análise histológica e análise biomecânica, que são descritos, por exemplo, na patente U.S. No. 6.521.750, que é incorporado a título de referência integralmente para a sua descrição dos protocolos experimentais para causar assim como para medir a extensão de fraturas e o processo de reparo.

6. Usos Terapêuticos Exemplares

[00125]Em determinadas modalidades, os antagonistas de ativina -ActRIIa (polipeptídeos ActRIIa, por exemplo) da presente invenção podem ser usados para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição que é associada com dano ósseo, quer por quebra, perda ou desmineralização, por exemplo. Conforme demonstrado no presente documento, os antagonistas de ativina -ActRIIa, e especialmente construções de ActRIIa-Fc, são eficazes no tratamento ou prevenção de perda óssea relacionada com câncer. Em determinadas modalidades, a presente invenção propõe métodos de tratamento ou prevenção de danos ósseo em um indivíduo que tenha necessidade deles por administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um antagonista de ativina -ActRIIa, especialmente um polipeptídeo ActRIIa. Em determinadas modalidades, a presente invenção propõe métodos de promoção de crescimento ou mineralização óssea em um indivíduo que tenha necessidade deles por administração ao indivíduo de uma quantidade efetiva terapeuticamente de um antagonista de ativina -ActRIIa, especialmente um polipeptídeo ActRIIa. Estes métodos são dirigidos, de preferência, a tratamentos terapêuticos e profiláticos de animais e sendo mais preferível, seres humanos. Em determinadas modalidades, a descrição propõe o uso de antagonistas de ativina -ActRIIa (especialmente polipeptídeos ActRIIa solúveis e anticorpos neutralizantes dirigidos para ativina ou ActRIIa) para o tratamento de transtornos associados com uma baixa densidade óssea ou resistência óssea reduzida.

[00126]Conforme empregado no presente, um terapêutico que “previne” uma transtorno ou condição se refere a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do transtorno ou condição na amostra tratada em relação a uma amostra de controle sem tratamento, ou retarda o aparecimento ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do transtorno ou condição quando comparado com a amostra de controle sem tratamento. O termo “tratamento”, conforme empregado no presente inclui profilaxia da condição citada ou a melhora ou eliminação da condição quando ela tiver se estabelecido. Qualquer que seja o caso, a prevenção ou o tratamento podem ser percebidos no diagnóstico fornecido por um clínico e o resultado pretendido da administração do agente terapêutico.

[00127]A presente invenção propõe métodos de se induzir a formação de osso e/ou cartilagem, de prevenir perda óssea, aumentar a mineralização óssea ou prevenir a desmineralização do osso. Os antagonistas de ativina -ActRIIa da presente invenção, por exemplo, têm aplicação no tratamento de osteoporose e a cura de fraturas ósseas e defeitos da cartilagem em seres humanos e outros animais. Os polipeptídeos ActRIIa ou de ativina podem ser úteis em pacientes que são diagnosticados com a densidade óssea subclínica baixa, como um medida protetora contra o desenvolvimento de osteoporose.

[00128]Em uma modalidade específica, os métodos e composições da presente invenção podem encontrar utilidade médica na cura de fraturas ósseas e defeitos em cartilagens em seres humanos e outros animais. Os métodos e composições da presente invenção podem também ter uso profilático na redução de uma fratura fechada e também aberta e também numa melhor fixação de juntas artificiais. A formação óssea de novo induzida por um agente osteogênico contribui para o reparo de defeitos craniofaciais congênitos, induzidos por trauma ou induzidos por resseção oncológica, e também é útil na cirurgia plástica cosmética. Em determinados casos, os antagonistas de ativina -ActRIIa da presente invenção podem proporcionar um ambiente para atrair células formadoras de osso, estimular o crescimento de células formadoras de osso ou par induzir a diferenciação de progenitoras de células formadoras de osso. Os antagonistas de ativina -ActRIIa da presente invenção podem também ser úteis no tratamento de osteoporose.

[00129]Os métodos e composições da presente invenção podem ser aplicados a condições caracterizadas por perda óssea ou que a causa, tal como osteoporose (incluindo osteoporose secundária), hiperparatireoidismo, doença de Cushing, doença de Paget, tirotóxicos, estado diarréico crônico ou má absorção, acidose tubular renal, ou anorexia nervosa.

[00130]A osteoporose pode ser causada ou associada com diversos fatores. O fato de ser do sexo feminino, especialmente se for uma mulher na pós-menopausa, tendo um peso corporal baixo e levando um tipo de vida sedentário, constituem todos fatores de risco para osteoporose (perda de densidade mineral óssea, levando a um risco de fratura). As pessoas que têm qualquer um dos perfis abaixo podem ser candidatas para tratamento com um antagonista de ActRIIa: uma mulher na pós- menopausa que não estiver ingerindo estrogênio ou submetida a terapia de reposição hormonal; uma pessoa com uma história pessoal ou materna de fratura do quadril ou tabagismo; uma mulher na pós-menopausa que é alta (acima de 5 pés 7 polegadas [1,7018 m]) ou magra (menos de 125 libras [56,7 kg]); um homem com condições clínicas associadas com perda óssea; uma pessoa que estiver usando medicamentos que se sabe que causam perda óssea, incluindo corticosteróides tais como PrednisonaTM, diversos medicamento anticonvulsivantes tais como DilatinTM e determinados barbitúricos, ou drogas de reposição da tireóide a alta dosagem; uma pessoa que tem diabetes do tipo I, doença hepática, doença renal ou um histórico familiar de osteoporose; uma pessoa que tem uma taxa de conversão óssea alta (quantidade excessiva de colágeno nas amostras de urina, por exemplo); uma pessoa que tem uma condição da tireóide, tal como hipertireoidismo; uma pessoa que sofreu uma fratura depois de um trauma leve; uma pessoa que tem prova por raios x de fratura vertebral ou de outros sinais de osteoporose.

[00131]Conforme foi observado acima, a osteoporose pode também resultar como uma condição associada com um outro transtorno ou devido ao uso de determinados medicamentos. A osteoporose que resulta de drogas ou de uma outra condição médica é conhecida como osteoporose secundária. Em uma condição conhecida como doença de Cushing, a quantidade excessiva de cortisol produzido pelo corpo resulta em osteoporose e fraturas. Os medicamentos mais comuns associados com osteoporose secundária são os corticosteróides, uma classe de drogas que agem como cortinou, um hormônio produzido naturalmente pelas glândulas adrenais. Embora níveis adequados de hormônios da tireóide (que são produzidos pela glândula tireóide) sejam necessários para o desenvolvimento do esqueleto, uma quantidade excessiva de hormônio da tireóide pode reduzir com o tempo a massa óssea. Antiácidos que contêm alumínio podem levar a uma perda óssea quando tomados em altas doses por pessoas com problemas renais, especialmente os que são submetidos a diálise. Outros medicamentos que podem causar osteoporose secundária incluem fenitoína (Dilantin) e barbitúricos que são usados para prevenir convulsões; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), uma droga par algumas formas de artrite, câncer e transtornos imunes; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), uma droga usada para o tratamento de algumas doenças autoimunes e para suprimir o sistema imune em pacientes com transplante de órgão; agonistas de hormônios liberadores de hormônio luteinizante (Lupron, Zoladex), usados para o tratamento de câncer da próstata e endometriose; heparina (Calciparine, Liquaemin), um medicamento anticoagulante; e colestiramina (Questran) e colestipol (Colestid) usado para o tratamento de alto nível de colesterol. A perda óssea que resulta da terapia para câncer é amplamente reconhecida e denominada perda óssea induzida por terapia para câncer (CTIBL). As metástases ósseas podem criar cavidades no osso que pode ser corrigido por tratamento com antagonistas de ativina -ActRIIa.

[00132]Em uma modalidade preferida, os antagonistas de ativina -ActRIIa, especialmente um ActRIIa solúvel, divulgados no presente documento, podem ser usados em pacientes com câncer. Os pacientes que têm determinados tumores (próstata, mama, mieloma múltiplo, por exemplo, ou qualquer hiperparatireoidismo causador de formação de tumores) correm um grande risco de perda óssea devido à perda óssea induzida por tumor, assim como metástases e agentes terapêuticos. Tais pacientes podem ser tratados com antagonistas de ativina -ActRIIa mesmo na ausência de prova de perda óssea ou metástases ósseas Os pacientes podem também ser monitorados para se obter uma prova de perda óssea ou de metástases ósseas, e podem ser tratados com antagonistas de ativina -ActRIIa no caso em que indicadores sugerem um risco aumentado. Geralmente, as tomografias DEXA são empregadas para avaliar as alterações na densidade óssea, ao passo que indicadores de remodelagem óssea podem ser usados para se avaliar a probabilidade de metástases ósseas. Os marcadores séricos podem ser monitorados. A fosfatase alcalina específica a osso (BSAP) é uma enzima que está presente em osteoblastos. Os níveis sanguíneos de BSAP são aumentados em pacientes com metástase óssea e outras condições que resultam em uma remodelagem óssea aumentada. Os peptídeos osteocalcina e procolágeno são também associados com a formação óssea e metástases ósseas. Aumentos em BSAP foram detectados em pacientes com metástase óssea causada por câncer da próstata, e até um ponto menor, em metástases ósseas resultantes do câncer da mama. Os níveis de Proteína-7 Morfogenética Óssea (BMP-7) eram altos no câncer de próstata que tinha se metastasizado para o osso, mas não em metástases ósseas devidas a câncer da bexiga, pele, fígado ou pulmão. O telopeptídeo de terminal carbóxi do tipo I (ICTP) é um reticulador encontrado no colágeno que se forma durante a reabsorção do osso. Como o osso está sendo constantemente desfeito e reformado, ICTP será encontrado em todo o corpo. No entanto, no sítio de metástase óssea, o nível estará significativamente mais elevado do que na área de osso normal. ICTP foi encontrado em níveis altos na metástase óssea devido a câncer da próstata, pulmão e mama.l Um outro reticulador de colágeno, telopeptídeo de terminal N do tipo I (NTx) é produzido juntamente com ICTP durante a conversão óssea. A quantidade de NTx é aumentada em metástase óssea causada por muitos tipos diferentes de câncer incluindo câncer do pulmão, próstata e mama. Além disso, os níveis de NTx aumentam com o progresso da metástase óssea. Portanto, este marcador pode ser usado tanto para detectar a metástase como para medir a extensão da doença. Outros marcadores de reabsorção incluem piridinolina de desóxi piridinolina. Qualquer aumento em marcadores de reabsorção ou de marcadores de metástases ósseas indica a necessidade de terapia com antagonista de ativina -ActRIIa em um paciente.]

[00133]Os antagonistas de ativina -ActRIIa podem ser administrados em conjunto com outros agentes farmacêuticos. A administração conjunta pode ser efetuada por administração de uma única co-formulação, por administração simultânea ou por administração em ocasiões separadas. Os antagonistas de ativina -ActRIIa podem ser especialmente vantajosos se forem administrados juntamente com outros agentes ativos para osso. Um paciente pode se beneficiar de receber em conjunto antagonista de ativina -ActRIIa e suplementos de cálcio, vitamina D, exercício adequado e/ou, em alguns casos, um outro medicamento. Exemplos de outros medicamentos incluem, bisfosfonatos (alendronato, ibandronato e risedronato), calcitonina, estrógenos, hormônio da paratireóide e raloxifeno. Os bisfosfonatos (alendronato, ibandronato e risedronato), calcitonina, estrógenos e raloxifeno afetam o ciclo de remodelagem óssea e são classificados como medicamentos anti- reabsorventes. A remodelagem óssea consiste em dois estágios distintos: a reabsorção óssea e a formação óssea. Os medicamentos anti-reabsorventes retardam ou interrompem a porção de reabsorção do osso do ciclo de remodelagem óssea, mas não retardam a porção de formação de osso do ciclo. Disso resulta que a nova formação continua a uma velocidade maior do que a reabsorção óssea e a densidade óssea pode aumentar com o tempo. Teriparatídeo, uma forma de hormônio da paratireóide, aumenta a velocidade de formação óssea no ciclo de remodelagem óssea. Alendronato é aprovado tanto para a prevenção (5 mg por dia ou 35 mg uma vez por semana) e para o tratamento (10 mg por dia ou 70 mg uma vez por semana) da osteoporose da pós-menopausa. O alendronato reduz a perda óssea, aumenta a densidade óssea e reduz o risco de fraturas da espinha, pulso e quadril. O alendronato também é aprovado para o tratamento de osteoporose induzida por glicocorticóides em homens e mulheres como resultado do uso prolongado destes medicamentos (isto é, de prednisona e cortisona|) e para o tratamento de osteoporose em homens. O alendronato em conjunto com a vitamina D é aprovado para o tratamento de osteoporose em mulheres na pós-menopausa (70 mg uma vez por semana em conjunto com a vitamina D) e para o tratamento para aumentar a massa óssea em homens com osteoporose. O ibandronato é aprovado para a prevenção e o tratamento de osteoporose na pós-menopausa. Tomado em forma de uma pílula mensal (150 mg), o ibandronato deve ser tomado no mesmo dia cada mes. O ibandronato reduz a perda óssea, aumenta a densidade óssea e reduz o risco de fraturas da espinha. O risedronato é aprovado para a prevenção e tratamento de osteoporose na pós- menopausa. Tomado diariamente (dose de 5 mg) ou semanalmente (dose de 35 mg ou dose de 35 acrescida de cálcio), o risedronato retarda a perda óssea, aumenta a densidade óssea e reduz o risco de fraturas da espinha e outras. O risedronato também é aprovado para uso por homens e mulheres para prevenir e/ou tratar osteoporose induzida por glicocorticóides que resulta de uso prolongado destes medicamentos (isto é, de prednisona ou de cortisona). A calcitonina é um hormônio que ocorre naturalmente envolvido na regulagem do cálcio e no metabolismo ósseo. Em mulheres que estão a mais de 5 anos pós menopausa, a calcitonina retarda a perda óssea, aumenta a densidade óssea espinhal, e pode aliviar a dor associada com fraturas ósseas. A calcitonina reduz o risco de fraturas espinhais. A calcitonina é disponível em forma de injeção (50-100 IU diariamente) ou pulverização nasal (200 IU diariamente). A terapia com estrogênio (ET)/terapia hormonal (HT) é aprovada para a prevenção da osteoporose. ET mostrou reduzir a perda óssea, aumentar a densidade óssea tanto na espinha como no quadril e reduzir o risco de fraturas do quadril e da espinha em mulheres na pós-menopausa. ET é administrada mais habitualmente na forma de uma pílula ou de adesivo cutâneo que fornece uma dose baixa de aproximadamente 0,3 mg por dia ou uma dose padrão de aproximadamente 0,625 mg por dia e é eficaz mesmo quando iniciada depois da idade de 70 anos. Quando o estrogênio é administrado sozinho, ele pode aumentar o risco que uma mulher corre de desenvolver um câncer do revestimento uterino (câncer endometrial). Para se eliminar este risco, os funcionários da saúde prescrevem o hormônio progestina em combinação com o estrogênio (terapia de reposição hormonal ou HT) para aquelas mulheres que têm um útero intacto. ET/HT alivia os sintomas da menopausa e mostraram ter um efeito benéfico sobre a saúde óssea. Os efeitos secundários podem incluir sangramento vaginal, sensibilidade das mamas, perturbações de humor e doença da vesícula biliar. O raloxifeno, 60 mg por dia, é aprovado para a prevenção e tratamento de osteoporose na pós-menopausa. Ele pertence a uma classe de drogas denominadas Moduladores de Receptor de Seletivo de Estrogênio (SERMs) que foram desenvolvidos para proporcionar os efeitos benéficos dos estrógenos sem as suas desvantagens potenciais. O raloxifeno aumenta a massa óssea e reduz o risco de fraturas da espinha. Os dados ainda não estão disponíveis para demonstrar que o raloxifeno pode reduzir o risco de fraturas do quadril e de outras fraturas que não da espinha. O teriparatídeo, uma forma de hormônio da paratireóide é aprovado para o tratamento de osteoporose em mulheres na pós-menopausa e em homens que correm um grande risco de fratura. Este medicamento estimula nova formação óssea e aumenta significativamente a densidade mineral óssea. Em mulheres na pós- menopausa, foi observada uma redução de fraturas na espinha, quadril, pé, costelas e pulso. Em homens, a redução de fraturas foi observada na espinha, mas os dados foram insuficientes para se avaliar a redução de fraturas em outros locais. O teriparatídeo é auto-administrado em forma de uma injeção diária durante um período de até 24 meses.

7. Composições Farmacêuticas

[00134]Em determinadas modalidades, os antagonistas de ativina -ActRIIa (polipeptídeos ActRIIa, por exemplo) da presente invenção são formulados juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Um polipeptídeo ActRIIa, por exemplo, pode ser administrado isoladamente ou em forma de um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os compostos da presente invenção podem ser formulados para administração de qualquer modo conveniente para uso na medicina humana ou veterinária.

[00135]Em determinadas modalidades, o método terapêutico da presente invenção inclui a administração da composição sistemicamente, ou localmente em forma de um implante ou dispositivo. Quando administrada, a composição terapêutica para uso na presente invenção se encontra na forma isenta de pirógenos, fisiologicamente aceitável. Os agentes terapeuticamente úteis diferentes dos antagonistas de ActRIIa que podem também ser opcionalmente incluídos na composição conforme descrita acima, podem ser administrados simultaneamente ou em sequência com os compostos da presente invenção (polipeptídeos ActRIIa, por exemplo) nos métodos da presente invenção.

[00136]Tipicamente os antagonistas de ActRIIa serão administrados por via parenteral, e especialmente por via intravenosa ou subcutânea. As composições farmacêuticas adequadas para a administração parenteral podem compreender um ou mais polipeptídeos ActRIIa em combinação com uma ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis isotônicas farmaceuticamente aceitáveis, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões estéreis injetáveis imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, solutos que tornem a formulação isotônica com o sangue daquele que se destina a receber a composição ou agentes de suspensão ou espessantes. Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol polietileno glicol e semelhantes) e misturas adequadas deles, óleos vegetais, tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida com o uso de materiais de revestimento tais como lecitina, por exemplo, mantendo-se a granulometria necessária no caso de dispersões e com o uso de tensoativos.

[00137]Além disso, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma para fornecimento a um sítio no tecido alvo (osso, por exemplo). Em determinadas modalidades, as composições da presente invenção podem incluir uma matriz capaz de fornecer um ou mais compostos terapêuticos (polipeptídeos ActRIIa, por exemplo) a um sítio no tecido alvo (osso, por exemplo), proporcionando uma estrutura para o tecido em desenvolvimento e capazes otimamente de serem reabsorvidos pelo corpo. A matriz pode proporcionar uma liberação lenta de polipeptídeos ActRIIa, por exemplo. Tais matrizes podem ser formadas de materiais atualmente usados para outras aplicações médicas implantadas.

[00138]A escolha de material de matriz é baseada na biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e propriedades de interface. A aplicação específica das composições da presente invenção definirá a formulação adequada. As matrizes potenciais para as composições podem ser biodegradáveis e quimicamente definidas, tais como sulfato de cálcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido polilático e polianidridos. Outros materiais potenciais são biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tais como osso ou colágeno dermal. Outras matrizes são constituídas por proteínas puras ou componentes de matriz extracelular. Outras matrizes potenciais são não biodegradáveis e quimicamente definidas, tais como hidroxiapatita sinterizada, biovidro, aluminatos e outras cerâmicas. As matrizes podem ser constituídas por combinações de quaisquer dos tipos de material citados acima, tais como ácido polilático e hidroxiapatita ou colágeno e fosfato tricálcico. As biocerâmicas podem ter alterada a sua composição, tal como em aluminato-fosfato de cálcio e processamento para alterar o tamanho de poro, tamanho de partícula, formato de partícula, e biodegradabilidade.

[00139]Em determinadas modalidades, os métodos da presente invenção podem consistir na administração oral, tal como na forma de cápsulas, cachês, pílulas, comprimidos, pastilhas (usando-se uma base aromatizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto), pós, grânulos ou em forma de uma solução ou de uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou em forma de uma emulsão líquida de óleo em água ou de água em óleo, ou na forma de um elixir ou xarope, ou em forma de pastilhas (usando-se uma base inerte, tal como gelatina ou glicerina ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguante bucal e semelhantes, contendo cada um deles uma quantidade predeterminada de um agente como um ingrediente ativo. Um agente pode também ser administrado em forma de um bolo, eletuário ou pasta.

[00140]Nas formas de dosagem sólida para a administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos e semelhantes) um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou qualquer um dos seguintes: (1) cargas ou diluentes sólidos, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico; (2) aglutinantes, tais como, por exemplo, carbóxi metil celulose, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, tais como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tais como agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, e carbonato de sódio; (5) agentes retardantes de solução, tais como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umedecedores, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerila; (8) absorventes, tais como caulim e argila de bentonita; (9) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e suas misturas; e (10) agentes colorantes. No caso de cápsulas, comprimidos, e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes tampão. As composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina mole e dura, usando-se tais excipientes como lactose ou açúcares do leite, assim como polietileno glicóis de alto peso molecular, e semelhantes.

[00141]As formas de dosagem líquidas para a administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes habitualmente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, óleos (especialmente óleos de caroço de algodão, de amendoim, milho, germe de trigo, oliva, mamona e gergelim), álcool tetraidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitano, e suas misturas. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem incluir adjuvantes tais como agentes umedecedores, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes, aromatizantes, colorante, perfumantes e conservantes.

[00142]As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão tais como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, agaragar e tragacanto, e suas misturas.

[00143]As composições da presente invenção podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umedecedores, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, parabeno, por exemplo, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode ser também desejável se incluir agentes isotônicos tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser produzida pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[00144]Deve ficar subentendido que o regime de dosagem será determinado pelo clínico encarregado, levando em consideração diversos fatores que modificam a ação dos compostos da presente invenção (polipeptídeos ActRIIa, por exemplo). Os diversos fatores incluem, sem limitação, a quantidade de peso ósseo que se deseja formar, o grau da perda de densidade óssea, o sítio do dano ósseo, a condição do osso danificado, a idade do paciente, o seu sexo e dieta, a gravidade de qualquer doença que possa estar contribuindo para a perda óssea, o momento da administração e outros fatores clínicos. Opcionalmente, a dosagem pode variar com o tipo de matriz usado na reconstituição e com os tipos de compostos na composição. A adição de outros fatores de crescimento conhecidos à composição final pode também afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica do crescimento e/ou do reparo ósseo, por raios X, por exemplo (incluindo DEXA), determinações histomorfométricas e marcação com tetraciclina.

[00145]Os experimentos com primatas e seres humanos demonstraram que os efeitos de ActRIIa-Fc sobre o osso são detectáveis quando o composto é administrado a intervalos e quantidades suficientes para atingir concentrações séricas de aproximadamente 200 ng/mL, com efeitos de metade dos máximos sobre marcadores anabólicos ósseos ocorrendo a uma dosagem de 0,3 mg/kg ou o equivalente em termos de área sob a curva. Em seres humanos, os níveis séricos de 200 ng/mL podem ser atingidos com uma única dose de 0,1 mg/kg ou mais e níveis séricos de 1000 ng/mL podem ser atingidos com uma única dose de 0,3 mg/kg ou mais. A meia-vida sérica observada da molécula varia entre aproximadamente 25 e 35 dias, substancialmente mais tempo do que a maioria de proteínas de fusão de Fc e portanto, pode ser obtido um nível sérico efetivo sustentado administrando-se de aproximadamente 0,05 a 0,5 mg/kg, por exemplo, numa base semanal ou bi-semanal, ou então podem ser doses mais elevadas com intervalos maiores entre as dosagens. Doses de 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,2 ou 3 mg/kg, por exemplo, ou valores entre eles, poderiam ser usadas numa base mensal ou bimensal e o efeito sobre o osso pode ser suficientemente durável para que a dosagem seja necessária somente uma vez a cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 ou mais meses. Intervalos maiores entre doses são ainda sustentados pela duração do efeito farmacodinâmico que é mais prolongado do que a duração da droga no soro. Os efeito PD são observados durante pelo menos 120 dias em pacientes humanos.

[00146]Em determinadas modalidades, a presente invenção também propõe uma terapia gênica para a produção in vivo de polipeptídeos ActRIIa. Tal terapia atingiria o seu efeito terapêutico por introdução das sequências de polipeptídeos ActRIIa em células ou tecidos que apresentam os transtornos relacionados acima. O fornecimento de sequências de polipeptídeos ActRIIa pode ser obtida usando-se um vetor de expressão recombinante tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. O preferido para o fornecimento terapêutico de sequências de polipeptídeos ActRIIa é o uso de lipossomas direcionados a alvo.

[00147]Diversos vetores virais que podem ser utilizados para a terapia gênica conforme instruções do presente documento incluem adenovírus, vírus do herpes, vaccínia, ou, de preferência, um vírus de RNA tal como um retrovírus. É preferível que o vetor retroviral seja derivado de um retrovírus murino ou aviário. Exemplos de vetores retrovirais em que um único gene estranho pode ser inserido incluem, sem limitação: vírus de leucemia murina de Moloney (MoMuLV), vírus de sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário murino (MuMTV), e vírus de Sarcoma Rous (RSVa). Uma série de vetores retrovirais adicionais podem incorporar genes múltiplos. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável de modo que as células transduzidas possam ser identificadas e geradas. Os vetores retrovirais podem ser específicos a alvo por fixação, por exemplo, de um açúcar, um glicolipídio ou uma proteína. O direcionamento preferido a alvo é obtido usando-se um anticorpo. Os versados na técnica reconhecerão que sequências específicas de polinucleotídeos podem ser inseridas no genoma retroviral ou fixadas a um envoltório viral para permitir um fornecimento específico a alvo do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo de ActRIIa. Em uma modalidade preferida, o vetor é direcionado a osso ou a cartilagem.

[00148]Alternativamente, as células de cultura tecidual podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol, e env, por transfecção convencional por fosfato de cálcio. Estas células são então transfectadas com o plasmídeo de vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura.

[00149]Um outro sistema de fornecimento direcionado a alvo para polinucleotídeos de ActRIIa é um sistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, e sistemas à base de lipídios que incluem emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. O sistema coloidal preferido da presente invenção é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas com membrana artificial que são úteis como veículos de fornecimento in vitro e in vivo. RNA, DNA e viriões intactos podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e ser fornecidos a células em uma forma biologicamente ativa (veja, por exemplo, Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Os métodos para uma transferência eficiente de gene usando-se um veículo lipossômico são conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Mannino et al., Biotechniques, 6: 682, 1988. A composição do lipossoma é geralmente uma combinação de fosfolipídios, geralmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolipídios ou outros lipídios podem também ser usados. As características físicas de lipossomas dependem do pH, da resistência iônica e da presença de cátions divalente.

[00150]Exemplos de lipídios úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidila, tais como fosfatidil glicerol, fosfatidil colina, fosfatidil serina, fosfatidil etanolamina, esfingolipídios, cerebrosídeos e gangliosídeos. Os fosfolipídios ilustrativos incluem fosfatidil colina do ovo, dipalmitoil fosfatidil colina e diestearoil fosfatidil colina. O direcionamento a alvo com lipossomas é também possível com base, por exemplo, na especificidade a órgão, especificidade a célula, e especificidade a organela e é conhecido na técnica.

EXEMPLIFICAÇÃO

[00151]A presente invenção que está agora sendo descrita em linhas gerais será mais facilmente compreendida fazendo referência aos exemplos que seguem, que são incluídos para fins de ilustração somente, de determinadas modalidades e de modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção.

Exemplo 1: Proteínas de fusão ActRIIa-Fc

[00152]Os requerentes construíram uma proteína de fusão de ActRIIa solúvel que tem o domínio extracelular de ActRIIa humana fundido a um domínio Fc humano ou murino com um ligante mínimo entre eles. Refere-se às construções como ActRIIa- hFc e ActRIIa-mFc, respectivamente.

[00153]ActRIIa-hFc é mostrada abaixo conforme purificada a partir de linhagens de células CHO (SEQ ID NO: 7):ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGS IEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPT S N PVTPKP PTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYK CKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEA LHNHYTOKSLSLSPGK

[00154]As proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram expressas em linhagens de células CHO. Três diferentes sequências líder foram consideradas; (i) melitina de abelha melífera (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii) Ativador de Plasminogênio Tecidual (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9) (iii) Nativa: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10).

[00155]A forma selecionada emprega a líder TPA e tem a seguinte sequência de aminoácidos não processada: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQT GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVY FCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)

[00156]Este polipeptídeo é codificado pela sequência de ácidos nucleicos seguinte:ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGA GCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAG TGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGA ACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAA TATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACT GCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTG TTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAA GTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT CTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCA GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTG GCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)

[00157]Tanto ActRIIa-hFc como ActRIIa-mFc se prestaram notavelmente bem à expressão recombinante. Conforme mostrado na Figura 1, a proteína foi purificada em forma de um único pico bem definido de proteína. O sequenciamento do terminal N revelou uma única sequência de -ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11). A purificação pode ser obtida por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de sefarose Q, cromatografia de fenil sefarose, cromatografia de exclusão por tamanho e cromatografia de troca de cátions. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. A proteína ActRIIa-hFc foi purificada até um grau de pureza de >98% conforme determinado por cromatografia de exclusão por tamanho e > 95% conforme determinado por SDS-PAGE.

[00158]ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc apresentaram um alta afinidade para ligante, especialmente para ativina A. GDF-11 ou ativina A (“ActA”) forma imobilizados sobre um chip CM5 de Biacore usando-se procedimento de acoplamento padrão a amina. As proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram carregadas no sistema e a ligação foi medida. A ActRIIa-hFc se ligou a ativina com uma constante de dissociação (KD) de 5 x 10-12, e a proteína se ligou a GDF-11 com uma KD de 9,96 x 10-9. Veja a Figura 2. ActRIIa-mFc se comportou de modo análogo.

[00159]Um ensaio de Gene repórter A-204 foi usado para avaliar os efeitos de proteínas ActRIIa-hFc sobre a sinalização por GDF-11 e ativina A. Linhagem celular: Rabdomiossarcoma Humano (derivado de músculo). Vetor repórter: pGL3(CAGA) 12 (Descrito em Dennler et al., 1998, EMBO 17: 3091-3100). Veja a Figura 3. O motivo CAGA 12 está presente nos genes que respondem a TGF-Beta (gene PAI-1), de modo que este vetor é de uso geral para fatores que sinalizam através Smad2 e 3. Dia 1: Dividir células A-204 em placa de 48 poços. Dia 2: Células A-204 transfectadas com 10 μg de pGL3(CAGA) 12 ou pGL3(CAGA) 12 (10 μg) + pRLCMV (1 μg) e Fugene. Dia 3: Acrescentar fatores (diluídos no meio + 0,1% BSA). Os inibidores precisam ser pré-incubados com Fatores durante 1 hora antes de serem acrescentados às células. 6 horas mais tardes, enxaguar as células com PBS, e submeter as células a lise.

[00160]Em seguida procede-se a um ensaio com Luciferase. Tipicamente neste ensaio, na ausência de qualquer inibidor, ativina A apresenta uma estimulação de aproximadamente 10 vezes da expressão do gene repórter e um ED50 ~2 ng/mL. Uma estimulação de 16 vezes de GDF-11, ED50: ~1,5 ng/mL. GDF-8 apresenta um efeito análogo a GDF-11.

[00161]Conforme mostrado na Figura 4, ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc inibem a sinalização mediada por GDF-8 a concentrações picomolares. Conforme mostrado na Figura 5 três diferentes preparados de ActRIIa-hFc inibiram a sinalização de GDF-11 com um IC50 de aproximadamente 200 pM.

[00162]A ActRIIa-hFc foi muito estável em estudos farmacocinéticos. Os ratos receberam administrações de 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg de proteína ActRIIa-hFc e os níveis plasmáticos da proteína foram medidos a 24, 48, 72, 144 e 168 horas. Em um estudo separado os ratos receberam doses de 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg. Nos ratos ActRIIa-hFc tinha uma meia-vida sérica de 11-14 dias e níveis circulantes da droga eram bastante altos depois de duas semanas (11 μg/mL, 110 μg/mL ou 304 μg/mL para administrações iniciais de 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg, respectivamente). Em macacos cinomolgos, a meia vida plasmática era substancialmente superior a 14 dias e níveis circulantes da droga foram de 25 μg/mL, 304 μg/mL ou 1440 μg/mL para administrações iniciais de 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg, respectivamente. Os resultados preliminares em seres humanos sugerem que a meia vida sérica se encontra entre aproximadamente 20 e 30 dias.

Exemplo 2: ActRIIa-mFc Promove Crescimento Ósseo in vivo

[00163]Administrou-se a camundongos normais fêmeas (BALB/c) ActRIIa- mFc a um nível de 1 mg/kg/dose, 3 mg/kg/dose e 10 mg/kg/dose, sendo as doses administradas duas vezes por semana. A densidade mineral óssea e o teor mineral ósseo foram determinados por DEXA, veja Figura 6.

[00164]Em camundongos fêmeas BALB/c, as varreduras DEXA mostraram um aumento significativo (> 20%) em densidade e teor mineral ósseo como resultado do tratamento com ActRIIa-mFc. Veja Figuras 7 e 8.

[00165]Portanto, o antagonismo de ActRIIa causou um aumento da densidade e teor ósseo em camundongos fêmeas normais. Como uma etapa adicional foi testado o efeito de ActRIIa-mFc sobre o osso em um modelo murino para osteoporose.

[00166]Andersson et al. (2001), estabeleceram que os camundongos submetidos a ovarietomia sofreram uma perda óssea substancial (aproximadamente 50% de perda de osso trabecular seis semanas após a operação), e que a perda óssea nestes camundongos poderia ser corrigida com agentes terapêuticos candidatos, tais como o hormônio da paratireóide.

[00167]Os requerentes usaram camundongos fêmeas C57BL6 que foram submetidas a ovarietomia (OVX) ou a ovarietomia simulada com 4-5 semanas de idade. Oito semanas depois da cirurgia foi iniciado o tratamento com ActRIIa-mFc 910 mg/kg, duas vezes por semana) ou controle (PBS). A densidade óssea foi medida por tomografia.

[00168]Conforme mostrado na Figura 9, os camundongos submetidos a ovarietomia e sem tratamento apresentaram, depois de seis semanas, uma perda substancial da densidade óssea trabecular quando comparados com os controles submetidos as ovarietomia simulada. O tratamento com ActRIIa-mFc restaurou a densidade óssea ao nível dos camundongos submetidos a ovarietomia simulada. Com 6 e 12 semanas de tratamento, ActRIIa-mFc causou um aumento substancial em osso trabecular de camundongos OVX. Veja a Figura 10. Depois de 6 semanas de tratamento, as densidade óssea aumentou de 24% em relação aos controles de PBS. Depois de 12 semanas, o aumento foi de 27%.

[00169]Nos camundongos submetidos a ovarietomia simulada, a ActRIIa-mFc também causou um aumento substancial em osso trabecular. Veja Figura 11. Depois de 6 e de 12 semanas, o tratamento produziu um aumento de 35% em relação aos controles.

[00170]Em um conjunto adicional de experimentos, os camundongos submetidos a ovarietomia (OVX) ou a ovarietomia simulada, conforme descrito acima foram tratados com ActRIIa-mFc (10 mg/kg, duas vezes por semana) ou controle (PBS) durante doe semanas. Tal como aconteceu com os resultados descritos acima para ActRIIa-mFc, os camundongos OVX que receberam ActRIIa-mFc apresentaram um aumento em densidade óssea trabecular de 15% e isso já com quatro semanas e 25% depois de 12 semanas de tratamento (Figura 12). Os camundongos submetidos a ovarietomia simulada e que receberam ActRIIa-mFc mostraram de modo análogo um aumento em densidade óssea trabecular de 22% e isso já com quatro semanas e de 32% depois de 12 semanas de tratamento (Figura 13).

[00171]Depois de 12 semanas de tratamento com ActRIIa-mFc, uma análise DEXA do corpo integral e do fêmur ex vivo mostrou que o tratamento induz um aumento em densidade óssea tanto nos camundongos submetidos a ovarietomia como a ovarietomia simulada (Figuras 14A e 14B, respectivamente). Estes resultados recebem também o respaldo da análise pQCT ex vivo da diáfise média femoral que demonstrou um aumento significativo tanto na densidade óssea total como cortical depois de doze semanas de tratamento com ActRIIa-mFc. Os camundongos submetidos a ovarietomia de controle tratados com veículo apresentaram densidades ósseas que eram comparáveis às dos camundongos de controle submetidas a ovarietomia simulada e tratadas com veículo (Figura 15). Além da densidade óssea, o teor ósseo aumentou depois do tratamento com ActRIIa-mFc. A análise pQCT ex vivo da diáfise média femoral demonstrou um aumento significativo tanto no teor ósseo total como cortical depois de doze semanas de tratamento com ActRIIa-mFc ao passo que tanto os camundongos de controle tratados com veículo submetidos a ovarietomia como a ovarietomia simulada apresentaram um teor ósseo comparável (Figura 16). A análise pQCT ex vivo da diáfise média femoral também mostrou que os camundongos tratados com ActRIIa-mFc não apresentaram uma alteração na circunferência periósticas; no entanto o tratamento com ActRIIa-mFc resultou em uma redução da circunferência endoóstica indicando um aumento na espessura cortical devido ao crescimento na superfície interna do fêmur (Figura 17).

[00172]O teste mecânico dos fêmures determinou que ActRIIa-mFc foi capaz de aumentar as características extrínsecas do osso (carga máxima, rigidez e energia à ruptura) que contribuíram para um aumento significativo nas propriedades intrínsecas (resistência final) dos ossos. Os camundongos submetidos a ovarietomia tratados com ActRIIa-mFc apresentaram um aumento da resistência óssea a níveis além dos controles submetidos à ovarietomia simulada, tratados com veículo, indicando uma reversão completa do fenótipo osteoporótico (Figura 18).

[00173]Estes dados demonstram que um antagonista de ativina-ActRIIa pode aumentar a densidade óssea em camundongos fêmeas normais e, além disso, corrigir defeitos em densidade óssea, teor ósseo, e eventualmente a resistência óssea, em um modelo murino de osteoporose.

[00174]Em um conjunto adicional de experimentos, os camundongos foram submetidos a ovarietomia ou a ovarietomia simulada com 4 semanas, e a partir de 12 semanas receberam ou placebo ou ActRIIa-mFc (2 vezes/semana, 10 mg/kg) (a que se refere também como RAP-11 nas Figuras 19-24) durante um período adicional de 122 semanas. Uma variedade de parâmetros ósseos foram avaliados. Conforme mostrado na Figura 19 ActRIIa-mFc aumentou as relações do volume ósseo trabecular vertebral para o volume total (BV/TV) tanto nos camundongos OVX como nos simulados SHAM. ActRIIa-mFc também melhorou a arquitetura trabecular (Figura 20), aumentou a espessura cortical (Figura 21) e aumentou a resistência óssea (Figura 22). Conforme mostrado na Figura 23, ActRIIa-mFc produziu efeitos desejáveis numa faixa de doses de 1 mg/kg a 10 mg/kg.

[00175]A histomorfometria óssea foi conduzida em um ponto no tempo de 2 semanas em camundongos submetidos a ovarietomia simulada. Estes dados, apresentados na Figura 24, demonstram que ActRIIa-mFc tem um efeito duplo, tanto inibindo a reabsorção óssea como promovendo o crescimento ósseo. Assim ActRIIa- mFc estimula tanto crescimento ósseo (efeito anabólico) como inibe a reabsorção do osso (efeito anti-catabólico). BV = volume ósseo; TV = volume tecidual total. BV/TV é uma medida da porcentagem do volume ósseo que é mineralizada. ES = superfície erodida; BS = superfície óssea. ES/BS é uma medida de erosão óssea, e a redução causada por RAP-011 demonstra um efeito anti-reabsorvente ou anti-catabólico. Ms/Bs é relação entre a superfície de mineralização e a superfície óssea, que é um indicador de crescimento ósseo, ou efeito anabólico. De modo análogo a taxa de aposição mineral (MAR) e a taxa de formação óssea por superfície óssea por dia (BFR/BSd) indica o crescimento ósseo. As medidas de osteoblastos (Nob/BPm) e dos osteoclastos (Noc/BPm) são tomada para se sondar o mecanismo de ação.

[00176]Um segundo experimento de histomorfometria óssea foi conduzido em camundongos C57BL/6 fêmeas, a partir da idade de doze semanas. Os camundongos receberam por vis intraperitonial duas vezes por semana 10 mg/kg de ActRIIa-mFc durante duas semanas, quatro semanas,s oito semanas ou doze semanas.

[00177]Cada grupo foi sacrificado cinco dias depois da última dose e os ossos foram tomados para análise. Os camundongos foram rotulados com calceína nove dias e dois dias antes da eutanásia. Conforme mostrado na Figura 25, as medida mostram que ActRIIa-mFc promove o crescimento ósseo e a mineralização e tem efeitos tanto anabólico como anti-catabólico. Veja, por exemplo, a relação BV/TV, a relação ES/BS e a relação MS/BS. Os efeitos anabólicos parecem persistir durante todo o regime de dosagem, ao passo que os efeitos anti-reabsorventes parecem de curta duração nos camundongos.

Exemplo 3; ActRIIa-mFc melhora ou previne dano ósseo em um modelo murino de mieloma múltiplo.

[00178]Os pacientes de mieloma múltiplo apresentam um transtorno de perda óssea caracterizado por uma atividade aumentada de osteoclastos e uma redução da formação óssea por osteoblastos. O modelo 5T2MM de mieloma em camundongos é baseado no uso de células tumorais (células 5T2MM) provenientes de um tipo de tumor espontâneo que se desenvolve em camundongos idosos e produz efeitos em camundongos que são similares aos observados em pacientes humanos com mieloma múltiplo. Veja, por exemplo, Vanderkerken et al., Methods Mol. Med. 2005: 113: 191-205. ActRIIa-mFc foi testado para efeitos neste modelo.

[00179]Células 5T2MM injetadas em camundongos C57B1/KaLwRij promoveram um aumento na superfície de osteoclastos, a formação de lesões osteolíticas e produziram uma redução em área óssea. A doença óssea foi associada com uma redução em número de osteoblastos, na superfície de osteoblastos e uma redução na mineralização.

[00180]Os camundongos portadores de células 5T2MM foram tratados com ActRIIa-mFc (RAP-011) (10 mg/kg, i.p. duas vezes por semana), ou com um veículo, desde o momento da injeção com 5T2MM, durante um total de 12 semanas. A análise por microtomografia computadorizada da tíbia proximal e das vértebras lombares demonstrou uma redução de 39% e de 21% no volume ósseo canceloso (p<0,001 e p<0,01) e uma redução de 37% e de 15% em número trabecular (p<0,01 e p<0,05) em camundongos portadores de 5T2MM quando comparados com os camundongos não contaminados. RAP-011 preveniu completamente as reduções induzidas por 5T2MM em volume trabecular e número trabecular tanto na tíbia (p<0,001 e p<0,05) como nas vértebras (p<0,01 e p<0,05) quando comparados com camundongos tratados com veículo. O volume ósseo foi 19% maior na tíbia (p = 168) e 12% maior em vértebras (p<0,05) de camundongos tratados com RAP-011 quando comparados com camundongos não contaminados. RAP-011 preveniu o desenvolvimento de lesões ósseas osteolíticas (p<0,05). Este efeito é ilustrado na Figura 26. Embora uma avaliação preliminar dos dados tenha deixado de identificar os efeitos significativos sobre a paraproteína sérica (um biomarcador de células tumorais de mieloma múltiplo) ou a carga de mieloma neste estudo, uma análise subsequente indicou que a paraproteína sérica tinha substancialmente se reduzido em todos exceto um dos animais tratados e ainda que o volume de medula óssea sadia foi substancialmente aumentado, indicando uma redução na carga de células tumorais de mieloma.

[00181]Portanto, ActRIIa-mFc pode ser usado para reduzir os efeitos da doença óssea que resultam de mieloma múltiplo e para tratar as células tumorais propriamente ditas.

Exemplo 4: Caracterização de uma proteína ActRIla-hFc

[00182]A proteína de fusão ActRIIa-hFc foi expressa estavelmente em células CHO-DUKXB11 proveniente de um vetor pAID4 (SV40 ou/intensificador, promotor de CMV), usando uma sequência líder de plasminogênio tecidual da SEQ ID NO: 9. A proteína purificada conforme foi descrito acima no exemplo 1, tinha uma sequência de SEQ ID NO: 7. A porção Fc é uma sequência Fc de IgG1 humana, conforme mostrado na SEQ ID NO: 7. A análise com ácido siálico mostrou que a proteína continha, em média, entre aproximadamente 1,5 e 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusão ActRIIa-hFc.

[00183]Esta proteína purificada apresentava uma meia-vida sérica notavelmente longa em todos os animais testados, incluindo uma meia-vida de 25-32 dias em pacientes humanos (veja Exemplo 5, abaixo). Além disso o material que expressava a célula CHO tem uma afinidade maior para ligante de ativina B do que foi relatado para uma proteína de fusão ActRIIa-hFc expressa em células 293 humanas (del Re et al., J. Biol. Chem. 17 de dezembro de 2004; 279 (51): 53126-35). Além disso, o uso da sequência líder tPa proporcionou uma produção maior do que outras sequências líderes e, ao contrário de ActRIIa-Fc expressa com um líder nativo, proporcionou uma sequência de terminal N extremamente pura. O uso da sequência líder nativa resultou em dois espécies principais de ActRIIa-Fc, tendo cada uma delas uma sequência de terminal N diferente.

Exemplo 5: Teste Clínico Humano

[00184]A proteína descrita no Exemplo 4 foi administrada a pacientes humanos em um estudo aleatorizado, duplo cego, controlado por placebo que foi conduzido para se avaliar, em primeiro lugar, a segurança da proteína em mulheres sadias na pós-menopausa. Quarenta e oito indivíduos foram distribuídos aleatoriamente em coortes de 6 para receber ou uma dose única de ActRIIa-hFc ou placebo (5 ingrediente ativo: 1 placebo). Os níveis de dosagem variaram de 0,01 a 3,0 mg/kg por via intravenosa (IV) e 0,03 a 0,1 mg/kg por via subcutânea (SC). Todas as pacientes foram acompanhadas durante 120 dias. As pacientes que tivessem tomado medicamentos que afetassem o metabolismo ósseo dentro de um período de 6 meses antes de entrarem no estudo, foram excluídas de participação no estudo. As avaliações de segurança foram conduzidas depois de cada coorte para determinar a escalação da dose. ]além das análises farmacocinéticas (PK), a atividade biológica de ActRIIa-hFc foi também avaliada por medição dos marcadores bioquímicos de formação e reabsorção ósseas, e níveis de FSH.

[00185]Nenhum evento adverso de gravidade foi relatado neste estudo. Os eventos adversos (AEs) foram geralmente leves e transitórios. A análise preliminar de AEs incluiu dor de cabeça, valores laboratoriais elevados, sintomas de resfriado, êmese ou vômitos, infiltração intravenosa e hematoma no local da injeção.

[00186]A análise PK de ActRIIa-hFc apresentou um perfil linear com a dose, e uma meia-vida média de aproximadamente 25-32 dias. A área sob a curva (AUC) para ActRIIa-hFc era linearmente correlacionada com a dose, e a absorção de pois da dosagem com SC era essencialmente completa (veja Figuras 27 e 28). Estes dados indicam que SC é uma abordagem desejável a dosagem pois ele proporciona uma biodisponibilidade e meia vida sérica equivalentes para a droga, evitando o pico em concentrações séricas da droga associada com os primeiros poucos dias da dosagem por IV (veja Figura 28). ActRIIa-hFc produziu um aumento rápido, sustentado, dependente de dose nos níveis séricos de fosfatase alcalina específica a osso (BAP), que é um marcador para o crescimento ósseo anabólico e uma redução dependente de dose em níveis de telopeptídeo de colágeno do tipo 1 do terminal C e de fosfatase ácida 5b resistente a tartarato, que são marcadores para a reabsorção óssea. Outros marcadores, tais como P1NP apresentaram resultados inconclusivos. Os níveis de BAP mostraram efeitos próximos da saturação a dosagem máxima da droga, indicando que efeitos de metade dos máximos neste biomarcador ósseo anabólico poderiam ser atingidos com uma dosagem de 0,3 mg/kg, com aumentos chegando até 3 mg/kg. Calculado como uma relação de efeito farmacodinâmico para AUC para a droga, o EC50 é de 51,465 (dia*ng/mL). Veja a Figura 29. Estas alterações no biomarcador ósseo ocorreram durante aproximadamente 120 dias aos níveis de dose máximos. Houve também uma redução dependente de dose em níveis de FSH sérico consistentes com a inibição de ativina.

[00187]Uma única dose de ActRIIa-hFc dada a mulheres sadias na pós- menopausa foi segura e bem tolerada dentro dos limites dos níveis de dosagem testados. Os efeitos prolongados PK e farmacodinâmicos sugerem que a dosagem intermitente seria adequada para estudos futuros. A dosagem na base de meia-vida sérica, por exemplo, poderia ser conduzida numa base mensal, ou da ordem de uma vez a cada duas, três, quatro, cinco ou seis semanas. Além disso, como o efeito farmacodinâmico se estende muito além do tempo de residência sérica da droga, a dosagem poderia ser conduzida na base do efeito farmacodinâmico significando que uma dosagem a cada três meses ou a cada dois, três, quatro, cinco, seis ou mesmo doze meses poderia ser efetiva para produzir o efeito desejado nos pacientes. Este teste clínico demonstra que em seres humanos ActRIIa-hFc é um agente osteoanabólico com uma evidência biológica tanto de um aumento na formação óssea como de uma redução de reabsorção óssea.

Exemplo 6: Co-administração de ActRIIa-mFc e um Bisfosfonato

[00188]Os bisfosfonatos são uma classe de drogas que são amplamente usadas para o tratamento de transtornos associados com baixa densidade mineral óssea, incluindo osteoporose e perda óssea relacionada com câncer. Os bisfosfonatos têm uma atividade anti-reabsorvente potente, inibindo osteoclastos. Talvez devido ao fato dos osteoclastos serem necessários tanto para a desintegração óssea como para o crescimento ósseo, os bisfosfonatos parecem diminuir os efeitos do hormônio da paratireóide (PTH), um dos únicos conhecidos agentes anabólicos de crescimento ósseo (Black et al., N. Engl. J. Med. 25 de setembro de 2003; 349 (13): 1207-15; Samadfan et al., Endocrinology. Junho de 2007; 148 (6): 2778-87.)

[00189]Para se testar a utilidade do tratamento com ActRIIa-Fc em pacientes que tinham anteriormente recebido ou estavam concomitantemente recebendo bisfosfonato ou outra terapia anti-reabsorvente, camundongos foram testados com ActRIIa-mFc combinado com zoledronato, um composto bisfosfonato. Camundongos C57BL/6N de 122 semanas de idade foram tratados do seguinte modo: Grupo 1 PBS Grupo 2 ActRIIa-mFc (RAP-011) (10 mg/kg) duas vezes por semana (com Grupo 3 e 4) Grupo 3 Ad zoledrônico (ZOL) dose única (20 mg/kg. Grupo 4 ZOL (1 dose), 3 dias mais tarde ActRIIa-mFc (RAP-11) (e mg/kg) duas vezes por semana Grupo 5 ZOL (1 dose), 3 dias mais tarde ActRIIa-mFc (RAP 011) (10 mg/kg) duas vezes por semana

[00190]BMD total foi determinado por varredura DEXA (PIXI) antes da dosagem e com 3 e 8 semanas de tratamento

[00191]Conforme mostrado na figura 30, o BMD total aumentou nitidamente em todos os grupos de tratamento, com a combinação de ZOL e ActRIIa-mFc produzindo os maiores efeitos. Estes resultados indicam que as proteínas ActRIIa-Fc podem ser usadas para se aumentar a densidade óssea, mesmo em pacientes que receberam terapia com bisfosfonato.

Exemplo 7: ActRIIa-Fc Melhora ou Previne a Perda Óssea Causada por Metástases no Câncer da Mama

[00192]Estima-se que 65 a 75 por cento de cânceres da mama apresentam metástase no osso, produzindo um dano substancial à estrutura óssea, aumentando o risco de fratura e causando dor e outros efeitos secundários. Testamos os efeitos de ActRIIa-Fc em um modelo murino de câncer da mama que tinha desenvolvido metástase no osso.

[00193]Uma sublinhagem da linhagem de células cancerígenas da mama humanas MDA-MB-231 (clone 2287) foi cultivada in vitro e as células coletadas a uma densidade de 5 x 106 células/mL. MDA-MB-231 é uma linhagem de células que é extremamente competente para semeadura em osso e causando dano ósseo análogo ao causado por metástases ósseas. 10 mL de células foram injetados na tíbia de camundongos nus atímicos fêmeas de 6 semanas no dia 0 do estudo. No dia 10 do estudo os camundongos receberam ActRIIa-mFc (10 mg/kg/duas vezes por semana/subcutâneos) (n = 8) ou veículo PBS (n = 7). O progresso da doença foi avaliada por absorciometria de raios x de energia dupla (PIXIMus) a intervalo semanais. Os camundongos foram tratados com ActRIIa-mFc durante 4 semanas, sendo então sacrificados e sendo as tíbias (tanto as com o tumor injetado com as desprovidas de tumores) coletadas de cada animal. As tíbias foram então processadas e preparadas para microtomografia computadorizada e análise histológica.

[00194]A injeção intratibial de células MDA-MB-231 em camundongos nus atímicos promoveu o desenvolvimento de lesões ósseas osteolíticas na tíbia injetada com comparação com a perna contralateral. A análise por microtomografia computadorizada da tíbia proximal demonstrou uma redução de 62% em volume ósseo canceloso nas tíbias portadoras de MDA-MB-231 em comparação com as tíbias sem tumores nos camundongos tratados com veículo PBS. O tratamento com ActRIIa- mFc levou a um aumento de 70% ou 147% nas tíbias sem tumores ou na tíbia portadora de tumores respectivamente quando comparadas com o tratamento com veículo (P<0,01 para ambos). As tíbias portadoras de tumores de camundongos tratados com ActRIIa-mFc tinham uma densidade óssea cancelosa análoga à das tíbias desprovidas de tumores dos camundongos tratados com VEH (p = 0,39).

[00195]Portanto, ActRIIa-mFc foi capaz de eliminar o dano ósseo associado com a presença de células tumorais da mama no osso.

Exemplo 8: Proteínas ActRIIa-Fc Alternativas

[00196]Uma construção alternativa pode ter uma deleção da cauda de terminal C (os últimos 15 aminoácidos do domínio extracelular de ActRIIa. A sequência para tal construção é apresentada abaixo (a porção Fc sublinhada) (SEQ ID NO: 12):ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGS IEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKT ISKAKGQPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG K INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[00197]Todas as publicações e patentes mencionadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência integralmente como se cada publicação ou patente individual tenha sido específica e individualmente indicada como sendo incorporada a título de referência.

[00198]Embora tenham sido discutidas modalidades específicas do objeto da presente invenção, o relatório acima é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações ocorrerão aos versados na técnica por exame deste relatório e das reivindicações que seguem. O âmbito total da presente invenção deve ser determinado por referência às reivindicações, juntamente com o âmbito total dos equivalentes, e do relatório, juntamente com tais variações.

Claims (9)

1. Uso de uma proteína de fusão ActRIIa-Fc CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir mieloma múltiplo em um paciente humano, em que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é expressa a partir de células CHO, em que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é um dímero formado de dois polipeptídeos, cada qual compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 unidos por ligação dissulfeto, e em que o dímero tem entre 3 e 5 frações de ácido siálico, em que um ou ambos os polipeptídeos opcionalmente possuem número menor de aminoácidos no terminal amino ou carbóxi do que é apresentado na SEQ ID NO: 7.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dímero tem 4 frações de ácido siálico.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração de lipídio e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânica.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um agente bisfosfonato.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente bisfosfonato é selecionado a partir de aldendronato, ibandronato e risedronato.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc se liga à ativina.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem uma meia vida sérica de 25 a 32 dias em média em seres humanos normais e sadios e uma biodisponibilidade equivalente quando administrada por via intravenosa ou subcutânea.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a preparação farmacêutica é adequada para a administração subcutânea.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é pelo menos 90% pura em relação aos demais componentes de proteína.

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