BRPI0808943A2 - Método de tratamento do câncer por administração de combinações de il-18 humano - Google Patents

Description

"MÉTODOS DE TRATAMENTO DO CÂNCER POR ADMINISTRAÇÃO DE COMBINAÇÕES DE IL-18 HUMANO"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade a dois pedidos provisórios dos Estados Unidos anteriores, Pedido N° US 60/952.002, depositado em 26 de julho de 2007 e Pedido N° US 60/896.855, depositado em 23 de março de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral, ao uso de IL-18, também conhecido como fator de indução e interferon γ (IGIF) em combinação com um anticorpo monoclonal que é expresso na superfície de uma célula cancerosa, ou em combinação com um agente quimioterapêutico, no tratamento do câncer. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

lnterleucina-18 (IL-18) é uma potente citocina que desempenha um papel em ambas as respostas imune: congênita e adquirida. Em testes pré-clínicos, IL-18 induz a síntese de IFN-γ em células T e células aniquiladoras naturais (NK), aumenta a atividade citolítica de células NK e linfócitos T citotóxicos (CTL), promove a diferenciação de células T CD4 ativadas em células efetoras auxiliares e induz memória imunológica. Com base em um amplo espectro de propriedades imunoestimulantes, IL-18 foi testado em uma série de modelos de tumor pré-clínicos. A atividade antitumoral de IL-18 usada como uma monoterapia foi observada em tumores que eram imunogênicos. Os efeitos antitumorais mais potentes foram observados em um tumor avançado (>100 cm3 de plasmacitoma MOPC-315 (tumor altamente imunogênico), Como os tumores são, normalmente, não imunogênicos. o foco dos testes pré-clínicos localizava-se em terapias combinadas de IL-18 com anticorpos monoclonais ou agentes quimioterapêuticos. Esses testes demonstraram o benefício de se combinar dois diferentes agentes, cada qual com diferentes mecanismos de morte tumoral, resultando em atividade antitumoral sinergística.

IL-18 humano ativo contém 157 resíduos de aminoácido. Possui potente atividade biológica, incluindo indução de produção de interferon-γ por células T e esplenócitos, intensificação da atividade aniquiladora de células NK e promoção da diferenciação de células T CD4+ naturais em células Th1. Além disso, IL-18 humano aumenta a produção de GM-CSF e diminui a produção de IL-10. Células T CD4+ são os elementos reguladores centrais de todas as respostas imunológicas. Elas estão divididas em duos subconjuntos, Th1 e Th2. Casa subconjunto é definida por sua capacidade em secretar diferentes citocinas. Note-se que, os indutores mais potentes para a diferenciação são as próprias citocinas. O desenvolvimento de células Th2 de precursores simples é induzido por IL-4. Antes da descoberta de IL-18, pensava-se que IL-12 era a principal citocina indutora de Th1.

As células Th1 secretam IL-2, inteferon-γ e TNF-β. Interferon-γ a assinatura de citocina Th1, age diretamente em macrófagos para incrementar suas atividades microbiocidas e fagocíticas. Como resultado, os macrófagos ativados podem destruir de modo eficiente, os patógenos intracelulares e células tumorais. AS células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, que agem auxiliando as células B a desenvolver-se em células produtora de anticorpo. Consideradas juntas, as células Th1 são principalmente responsáveis pela imunidade mediada por célula, enquanto as células Th2 são responsáveis pela imunidade humoral.

Com base em um amplo espectro de propriedades imunoestimuladores, IL-18 foi testada em uma série de modelos de tumores pré-clínicos. A atividade antitumoral de IL-18, usada como uma monoterapia foi observada em tumores, que, eram imunogênicos. Os efeitos mais potentes e antitumorais foram observados no modelo de tumor avançado (>100 cm3) de plasmacitoma MOPC-3156 (tumor altamente imunogênico). Neste modelo, a administração diária de IL-18 de IL-18 de murino (5 mg/kg) por aproximadamente 30 dias resultou em regressões reproduzíveis do tumor e cura. O novo desafio com tumor de origem resultou em rejeição de tumor, sugerindo indução de memória imunológica. Evidencia adicional para envolvimento de imunidade celular neste modelo originou-se de experimentos realizados em camundongos imunodeficientes combinados graves (SCIDs), portanto tumores MOPC-315 avançados que falharam em regredir, quando se usou um programa similar de IL-18. Um apoio adicional para imunidade celular mediada por IL-18 também adveio de imuno-histoquímica realizada em tumores MOPC-315 fixados em camundongos de controle e tratados com IL-18. Isto demonstrou infiltrados celulares aumentados consistindo de linfócitos T CD8+' células NK, macrófagos ativados, e células dendríticas nos animais tratados com IL-18 em relação aos controles. PBMCS in vitro, de células de baço de animais tratados com IL-18 demonstraram citotoxicidade NK e CTL contra o tumor. Além disso, parece que, um trajeto de Iigante Fas/Fas é benéfico para a resposta antitumoral.

Rituximab é um anticorpo monoclonal quimérico consistindo de um sítio de ligação

ao antígeno de murídeo que reconhece o antígeno CD20 humano fundido na região constante de ILG1 humana. Rituximab, como um agente simples, possui significante atividade em NHL indolente. No teste clínico de ramificação simples essencial de 166 pacientes com NHL indolente recorrente ou contumaz, o coeficiente de resposta geral foi 48% e o coeficiente de resposta completa (CR) foi 6%. McLaugIhin et al., J. Clin. OncoL16:2825-2833 (1998). Em pacientes não tratados previamente, com NHL indolente, a terapia com Rituximab teve um coeficiente de resposta global de 64 a 73% e coeficiente cR de 15 a 26%. Hainsworth et al., Blood 95:3052-3056 (2000); Colombat t al., Blodd 97:101-106 (2001). Além disso, testes múltiplos aleatorizados de Fase Ill demonstraram que a adição de Rituximab à quimioterapia convencional melhora a sobrevivência de pacientes com NHL. Marcus et al Blood105:1417-1423 (2005); Marcus et al., Blood 104-3064-3071 (2004); Hiddermann, et al., Blood106:3725-3732 (2005); Feugier et al., J. clin OncoL 23:4117-4126 (2005). Contudo, devido à maior toxicidade com quimioterapia, a monoterapia com Rituximab é ainda considerada uma opção em pacientes com Iinfoma indolente.

A pesquisa se desenvolve no sentido determinar maneiras de intensificar a atividade antitumoral e melhorar a eficácia de Rituximab. Vários mecanismos podem contribuir para a eficácia de Rituximab in vivo. A ligação de Rituximab a CD20 na superfície de células de Iinfoma pode acionar passos de sinalização intracelulares levando a apoptose ou morte celular programada. Shan1 et al., Blood 91:1644-1652 (1998); Pedersen et al., Blood 99: 1314-1319 (2002) Além disso, Rituximab pode ativar espécies complementares causando citólise dependente de complemento. Cragg et al, Blood 101:1045-1052 (2003); Manches et al., Blood 101:949-954 (2003). Contudo, numerosas evidencias sugerem que, ADCC desempenha um papel dominante na eliminação de células tumorais após administração de Rituximab. Manches et al., supra; Golay et al., Haematologica 88:1002-1012 (2003); Clynes et al., Nat. Med. 6:443-446 (2000). A ADCC é acionada quando a região constante (Fe) de um anticorpo liga-se aos receptores FC na superfície de células efetoras, tais como células NK ou células de linhagem monocítica/macrofágica.

Em um modelo de murídeo de Iinfoma de célula B humana, a eficácia de Rituximab foi anulada em camundongos carecendo de ativação de receptores Fe. Em contraste, a terapia com anticorpo monoclonal foi intensificada em camundongos carecendo de inibição de receptores Fe. Células efetoras portando receptor Fc foram críticas para eficácia de Rituximab neste modelo. Um receptor Fc de ativação principal em humanos é CD16 (FeyRIIIA)1 que é expressa por células NK e monócitos Um polimorfismo no gene FcyRIIIA humano na posição 158 (fenilalanina versus valina) demonstrou correlacionar-se com a resposta a Rituximab O genótipo homozigoto 158W está associado com ligação a IgG mais robusta e disparo de ADCC em células NK humanas in vitro (Koene, et al., Blood 90:1109-1114 (1997)Dall'Ozo et al., Câncer Res. 64:4664-4669 (2004) e também está associado com uma taxa maior de resposta após terapia com Rituximab. Weng et al., J. Clin. Oncol. 21:3940- 3947 (2003); Cartron et al, Blood 104:2635-2642 (2004). Esses dados apóiam a hipótese que ADCC mediada por célula NK é importante para a eficácia da terapia de Rituximab em pacientes com linfoma.

Uma estratégia para melhorar a eficácia de Rituximab é administrar citocinas que

podem ocasionar a expansão e/ou ativação de células efetoras, portanto receptor Fe, incluindo célula NK e células de linhagem monocítica/macrofágica. Testes clínicos de Fase I demonstraram que Rituximab pode ser administrado com segurança em combinação com IL-2, IL-12 ou GM-CSF a pacientes com linfoma. Rossi et al., Blood 106;760 (abst 2432) (2005); McLaugIin et Ia., Ann Oncol. 16 (Suppl 5):v68 (abstr 104) (2005); Ansell et al., Blood 99:67- 74 (2002); Eisenbeis, et al., Clin. Cancer Res. 10:2253-2264 (2004); Friedberg et al., Br. J. Haematol. 117:828-834 (2002). Coeficientes responsivos objetivos globais de 22 a 79% e coeficientes responsivos totais de 5-45% foram observados nesses testes. Além disso, biomarcadores como contagens NK absolutas e atividade ADCC ex vivo correlacionaram-se com os coeficientes responsivos. A maioria desses testes incluíram pacientes doentes, predominantemente, contumazes e recorrentes com subtipos de linfoma agressivo (DLBCL e linfoma de célula oculta). Coeficientes responsivos com alta objetividade nessas populações de pacientes desfavoráveis indicam que, as combinações de citocinas e Rituximab são merecedores de mais investigação em linfoma de célula B.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de: administração separada, ou simultânea ou seqüencial a um paciente de uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), em combinação com um veículo e; (ii) um anticorpo monoclonal contra um antígeno que é expressado na superfície de uma célula cancerosa, em que o anticorpo possui uma função efetora de citoxicidade mediada por céluIa dependente de anticorpo (ADCC), e ainda que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20.

O primeiro método pode envolver a administração de uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal contra um antígeno escolhido do grupo de: CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR (Erbitux) e IGF-1R, AXL-1, FGFR, receptores de integrina, CEA, CD44, VEGFR. Em um outro aspecto, o antígeno é HER-2 e o anticorpo monoclonal é HERCEPTIN(R). Adicionalmente, este método envolve o tratamento de um câncer escolhido dentre o grupo de: linfoma de Hodgkin, linfoma de célula B que não de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma d e célula T que não de Hodgkin, AML, CÉLULAS, MM, outras leucemias, câncer ovariano, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma de Wilms, glioblastoma e outros tumores cerebrais, câncer de cólon, câncer retal, câncer da próstata, melanoma, carcinoma de célula renal, e cânceres de pele.

Em um segundo aspecto, esta invenção é pertinente a um método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de: administração separada seja simultânea ou seqüencial a um paciente. De uma composição compreendendo: i) polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) em combinação com um veículo e (ii) um agente quimioterapêutico. O agente quimioterapêutico neste método pode ser escolhido dentre o grupo de: doxil, topotecan, fármacos que alteram o DNA (por exemplo, carboplatina), antimetabólitos (por exemplo, gencitabina), fármacos que previnem a divisão celular (por exemplo, vincristina), e agente antiangiogênicos (por exemplo, pazopanib). Neste método, o câncer a ser tratado é escolhido do grupo de: linfoma de Hodgkin, linfoma de célula B que não de Hodgkin, linfoma de célula T que não de Hodgkin, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma, tumor de Wilms, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer da próstata, melanoma e carcinoma de célula renal.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e um anticorpo monoclonal contra um antígeno que é expressado na superfície de uma célula cancerosa para emprego no tratamento do câncer, em que o anticorpo possui uma função efetora de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e em que o anticorpo não é um anticorpo antiCD20. A composição compreendendo o polipeptídeo hlL-18 (SEQ ID NO: 1) e o anticorpo podem ser para administração separada a um paciente, ou opcionalmente, simultânea ou seqüencialmente.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma composição compreendendo um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e um anticorpo monoclonal contra um antígeno que é expressado na superfície de uma célula cancerosa, na manufatura de um medicamento para o tratamento do câncer em um paciente, em que o anticorpo monoclonal possui uma função efetora de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e em que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20. O polipeptídeo hlL-18 e o anticorpo podem ser para administração separada a um paciente, ou opcionalmente, simultânea ou seqüencialmente.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma composição compreendendo um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) na manufatura de um medicamento para emprego, em combinação com um anticorpo monoclonal contra um antígeno expressado na superfície de uma célula cancerosa, para tratamento do câncer em um paciente, em que o anticorpo monoclonal possui uma função efetora de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e em que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso de um anticorpo monoclonal

contra um antígeno expressado na superfície de uma célula cancerosa, na manufatura de um medicamento para emprego na composição compreendendo a combinação com um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) para tratamento do câncer em um paciente, em que o anticorpo monoclonal possui uma função efetora de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e em que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), e (ii) um agente quimioterapêutico párea emprego no tratamento do câncer. A composição compreendendo o polipeptídeo hIL-18 (SEQ ID NO: 1) e o agente quimioterapêutico podem se prestar para administração separada ao paciente, e opcionalmente simultânea ou seqüencialmente.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o emprego de uma composição compreendendo um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), e um agente quimioterapêutico na manufatura de um medicamento para o tratamento do câncer. O polipeptídeo hlL18 (SEQ ID NO: 1) e o agente quimioterapêutico podem se prestar para administração separada ao paciente, e opcionalmente, simultânea ou seqüencialmente.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o emprego de um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), na manufatura de um medicamento para uso em combinação com um agente quimioterapêutico para uma composição no tratamento do câncer.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o emprego de um agente quimioterapêutico na manufatura de um medicamento para uso em uma composição compreendendo a combinação com um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) no tratamento do câncer.

Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento do câncer, em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo referido método a etapa de administração ao paciente de uma composição compreendendo: IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) em combinação com um agente quimioterapêutico ou um anticorpo monoclonal contra um antígeno que é expressado na superfície de uma célula cancerosa, em que o anticorpo possui função efetora de citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e ainda em que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20, pelo que o tratamento resulta em sobrevivência a longo prazo e/ou prevenção de recorrência de câncer e indução de memória imunológica no paciente.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS

A figura 1 mostra a seqüência de aminoácido natural de IL-18 humano (SEQ ID NO:

1)·

A figura 2 mostra a seqüência de aminoácido de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2).

A figura 3 mostra a atividade antitumoral de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) em combinação com RITUXAN(R) em um modelo de murino de linfoma de célula B humano.

A figura 4 mostra o significado estatístico quando os dados da Figura 3 são grafados e analisados usando GraphPadPrism(R). De modo específico, esta figura compara volumes de tumor no dia 19 pós-implante.

A figura 5 mostra o volume do tumor no dia 25 pós implante de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) e RITUXAN(R) combinados em um modelo de linfoma de célula B humano.

As figuras 6A e 6B mostram volume de crescimento tumoral mediano e médio da combinação de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) e RITUXAN(R) em um modelo de linfoma de célula B humano.

As figuras 7 e 8 mostram volume do tumor no dia 27 pós implante da combinação de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) e RITUXAN(R) em um modelo humano de linfoma de célula B versus apenas o agente.

A figura 9 mostra o pós-tratamento de sobrevivência de célula T de EL-4 de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) em combinação com doxorubicina, versus, apenas doxorubicina e apenas IL-18.

A figura 10 mostra o gráfico de probabilidade de sobrevivência dos dados demonstrados na Figura 9, que demonstra a relação entre a dose do fármaco dado e a atividade antitumoral no modelo de linfoma de célula T de EL-4.

As figuras 11A e 11B mostram a análise de Facs de PBLs (Figura 11 A) e esplenócitos (Figura 11B) no dia 13 após o implante da combinação de doxorubicina e IL-18 versus, tanto mlL-18 (SEQ ID NO: 2) como doxorubicina, separadamente, no modelo de linfoma de célula T de EL-4.

A figura 12 demonstra um ensaio de citotoxicidade de NK, 21 horas pós tratamento

da combinação de doxorubicina/mlL-18 (SEQ ID NO: 2) versus, tanto IL-18 sozinho e doxorubicina sozinho no modelo de linfoma de célula T de EL-4.

A figura 13 mostra o efeito da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(r) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315 em camundongos SCID no teste MOPC315.D3j005. (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 14 mostra o efeito da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315 em camundongos SCID no teste MOPC315.Dj005. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 15 mostra a diferença estatística no volume do tumor no dia24 pósimplante com uma terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(r) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315 em camundongos SCID. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 16 mostra o volume do tumor no dia 24 pós-implante com a terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315.D3j005 em camundongos SCID. (Os dados são expressos como média +/SD.).

A figura 17 mostra o efeito da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315 em camundongos SCID no teste MOPC315.D3j03. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 18 mostra o efeito da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e

HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino MOPC315 em camundongos SCID no teste MOPC315.D3j03. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 19 mostra o volume de plasmocitona de MOPC315 no dia 24 pós-implante em camundongos SCID da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) no teste MOPC315.D3j03. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 20 mostra o volume de plasmocitona de MOPC315 no dia 24 pós-implante em camundongos SCID da terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) no teste MOPC315.D3j03. (Os dados são expressos como média +/- SD.).

A figura 21 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5- fluoruracIL (5-FU) em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico no dia 24 pós-inoculacão (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 22 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5-FU

em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico no dia 24 pós-inoculacao. (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 23 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5-FU em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico no dia 24 pós-inoculacao e remoção do grupo de controle para melhor visualização da significância estatística entre IL18 sozinho e a combinação com 5-FU. (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 24 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5-FU em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico. (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 25 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5-FU

em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico. (os dados são expressos como média +/- SD.)

A figura 26 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 5-FU em um modelo de câncer de cólon Colo26 de murino singeneico. (os dados são expressos como curva de sobrevivência de Kaplan-Meyer).

A figura 27 mostra o efeito da terapia combinada de mIL-18 (SEQ ID NO: 2) e pazopanib (GW786034), um inibidor de VEGFR e PDGFR e tirosina quinases c-kit no crescimento tumoral no dia 32 pós-implante em um modelo singeneico avançado de carcinoma renal de camundongo. (O receptor c-kit pertence ao receptor de tirosina quinase do tipo III, que consiste de um domínio de ligação ao Iigante extracelular e um domínio quinase intracelular. O receptor c-Kit é expressado em uma série ampla de tecidos normais e neoplásicos).

A figura 28 mostra o efeito da terapia combinada de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e pazopanib (GW786034) no crescimento tumoral no dia 32 pós-implante em um modelo singeneico avançado de carcinoma renal de camundongo, porém exclui o grupo de controle. Este gráfico compara a significância estatística da combinação à monoterapia com IL-18 ou pazopanib, separadamente.

A figura 29 mostra o ganho de peso corpóreo de camundongos imunodeficientes tratados com IL-2 que receberam transferência adotiva de células de sobreviventes de tumor EL-4 ou de controles naturais.

A figura 30 mostra a sobrevivência percentual de camundongos receptores

Pfp/Rag2 com terapia de IL-2 após inoculação de tumor EL-4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Uma vez que os tumores são normalmente, não imunogênicos o foco dos testes pré-clínicos concentra-se nas terapias de combinação de IL-18 com agentes quimioterapêuticos ou com anticorpos monoclonais. A combinação de dois diferentes agentes em uma composição, cada qual com diferentes mecanismos de exterminação de tumor resultam em uma atividade antitumoral sinérgica. Apresentam-se abaixo quatro exemplos de terapias combinadas de IL-18.

O Exemplo 1 concentra-se o uso de IL-1 em combinação com RITUXAN(r) em um linfoma de célula B humana. O objetivo deste teste é investigar se a combinação de IL-18 e RITUXAN(R) no modelo de linfoma de célula B humano oferece um benefício sobre a monoterapia com IL-18, ou RITUXAN(R) separados. Rituximab é um anticorpo monoclona quimérico aprovado consistindo de um sítio de ligação ao antígeno de murino que reconhece o antígeno CD20 humano e uma região constante IgGI humana. O mecanismo de ação que contribui para a eficácia de Rituximab in vivo inclui indução de apoptose com a ligação às células de linfoma que são CD20 positivas, citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC). Evidências cumulativas sugerem que a ADCC desempenha um papel dominante na eliminação de células tumorais após administração de Rituximab. ADCC é acionada quando a região constante (Fe) de um anticorpo liga-se aos receptores Fc na superfície das células efetoras, tais como células exterminadoras naturais (NK), células T ou células da linhagem de monócitos/macrófagos. Visto IL-18 aumentar e ativar as células efetoras de ADCC espera-se que, a combinação desses dois reagentes demonstre um efeito sinérgico, que poderia resultar em atividade antitumoral superior.

Rituximab (RITUXAN(r) é um anticorpo monoclonal quimérico consistindo de um sítio de ligação ao antígeno de murino que reconhece o antígeno CD20 humano, fundido à região constante IgGI humana. O antígeno Cd20 é expressado em linfócitos B malignos e não malignos. Como um único agente, RITUXAN(R) possui atividade significativa em NHL. RITUXAN(r) é comercialmente disponível.

Doxorubicina (adriamicina) é um agente quimioterapêutico comercialmente disponível usado no tratamento de câncer de mama, linfomas, sarcoma, câncer de pulmão, câncer de bexiga, tireóide, hepatoma, câncer gástrico, tumor de Wilm, neuroblastoma, leucemia linfocítica aguda (ALL) e cânceres ovarianos.

O Exemplo 2 mostra a combinação de IL-18 com doxorubicina e um modelo de linfoma de célula T de EL-4. O objetivo deste teste foi investigar a combinação de IL-18 com doxorubicina em um modelo de tumor de linfoma de célula T de EL-4 e demonstrar o benefício da terapia combinada sobre a monoterapia com IL-18 ou doxorubicina separadamente. Este modelo singeneico revela benefícios completos da atividade imunoestimulante de IL-18nas células imunes do hospedeiro. Visto os dois reagentes terem diferentes mecanismos de ação, eles podem complementar-se entre si, resultando em uma atividade antitumoral incrementada. Sugere-se que, o agente quimioterapêutico proporcione a citotoxicidade direta, fragmentação e modulação dos antígenos tumorais, enquanto IL-18 aumenta e ativa as células efetoras, resultando em apresentação superior do antígeno e atividade antitumoral sinérgica.

A combinação de IL-18 com anticorpos monoclonais em uma composição, por exemplo, IL-18 com Rituximab (RITUXAN(R), demonstrou atividade antitumoral sinérgica em um modelo de tumor no estágio avançado (xenoenxerto de camundongo SCID). Rituximab é um anticorpo monoclonal quimérico aprovado consistindo de um sítio de ligação ao antígeno de murino que reconhece o antígeno CD20 humano e a região constante IgGI humana. Rituximab é um agente único que tem atividade significativa em linfoma que não-Hodgkin indolente. O mecanismo de ação que contribui para a eficácia de Rituximab in vivo inclui indução de apoptose com a ligação a células de linfoma que são CD20 positivas, citotoxicidade dependente de complemento (DCD) e citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC). Os dados pré-clínicos mostrados no Exemplo 1 demonstram que, a combinação de IL-18 e Rituximab resulta em atividade antitumoral sinérgica. Visto Rituximab ligarse apenas a células tumorais humanas que expressam CD20, a avaliação da atividade antitumoral fica limitada a modelos de xenoenxerto de camundongo SCID. Acredita-se que, a atividade antitumoral e sinergia de IL-18 e Rituximab ser devida a células NK que são ativadas em camundongo SCID em resposta a IL-18 e a CDC de murídeo. Visto os SCIDS não terem capacidade de ativar células T, o reforço do aumento potencial de CTL e geração de memória não pode ser testado neste modelo.

A combinação de IL-18 com agentes quimioterapêuticos em uma composição terá, do mesmo modo, efeitos terapêuticos benéficos no tratamento de varias formas de câncer. Por exemplo, o Exemplo 2 mostra que, a combinação de IL-18 com doxorubicina tem atividade antitumoral sinérgica em um modelo de tumor de linfoma de célula T de EL4 avançado singeneico. Este dado sugere que, o mecanismo de ação de IL-18 inclui apresentação superior do antígeno, expansão de células CTLs e NK antitumorais que desempenham um papel chave na atividade antitumoral. Com base nesses resultados, a combinação de IL-18 com outros agentes quimioterapêuticos resultará, provavelmente, na regressão do tumor, cura do tumor e indução de memória imunológica.

Em testes clínicos, a monoterapia com IL-18 demonstrou ser segura, bem tolerada, e biologicamente ativa conforme medido por mudanças de biomarcadores. Em estudos préclínicos a monoterapia com IL-18 funcionou apenas em modelos de tumor imuno-sensíveis. Modelos não imunogênicos demonstraram atividade antitumoral apenas quando se combinou IL-18 com outros agentes anticancerígenos.

IL-18 de murino recombinante (SEQ ID NO: 2) demonstrou atividade antitumoral pré-clínico por meio de uma série de mecanismos, incluindo ativação de CD4+, CD8+ e células NK1 bem como o passo Fas/Fasl e citocinas/quimiocinas como INFy, GM-CSF1 IP-10, MCP-1 e infILtração de células efetoras em tumores e indução de memória imunológica. Os benefícios de IL-18, tais como indução de células T citolíticas, expansão de células NK ativadas e células que desempenham um papel chave na citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) foram demonstrados nos modelos pré-clinicos da requerente.

Os exemplos a seguir investigaram se a combinação de IL-18 com outros tratamentos de câncer relevantes do ponto de vista clínico resultaria em uma maior atividade antitumoral superior à monoterapia com IL-18 apenas. Esta aplicação exemplifica cinco exemplos de terapias combinadas com IL-18: (1) (a combinação de IL-18 e RITUXAN(R) no modelo de xenoenxerto de linfoma de célula B humano; (2) a combinação de IL-18 e doxorubicina no modelo de linfoma de Célula T singeneica; (3) a combinação de IL-18 e HERCEPTIN(r) em um modelo de plasmocitoma de murino; e (4) a combinação de IL-18 e 5-FU em um modelo de tumor de cólon de murino; e (5) a combinação de IL-18 e pazopanib, um inibidor de VEGFR, PDGFR e c-kit tirosina quinases em um modelo de murino de carcinoma renal. Todas essas combinações ofereceram benefícios sobre a monoterapia com IL-18, RITUXAN(r), doxorubicina, HERCEPTIN(r), 5-FU ou pazopanib, separadamente.

A combinação com anticorpos monoclonais oferece um potencial para intensificação do mecanismo de ADCC de exterminação de célula tumoral. Os dados pré-clínicos apresentados neste pedido apóiam este mecanismo e demonstram a intensificação da atividade antitumoral de RITUXAN(R) em combinação com mlL-18 (SEQ ID NO: 2). Vários mecanismos podem contribuir para a eficácia de RITUXAN(R), contudo evidencia cumulativa sugere que, a ADCC desempenha um papel preponderante na eliminação de células tumorais após administração de RITUXAN(R). A ADCC é disparada quando a região (Fe) constante de um anticorpo liga-se aos receptores FC na superfície de células efetoras, tais como células exterminadoras naturais (NK) ou células da linhagem monocítica/macrofágica. Em um modelo de murino de linfoma de célula B humana, a eficácia de RITUXAN(R) ficou anulada em camundongos carecendo da ativação dos receptores Fe. Cartron et al., Blood 99:754-758 (2002); DaIIOzzo et al. Câncer Res 64: 4664-4669 (2004); Koene et al., Blood90: 1109-30 1114 (1997)ç Weng et al., J Clin Oncol 21Ç3940-3947 (2003). Assim, células efetoras dotadas do receptor Fc foram críticas para a eficácia de RITUXAN(R) . CD16 (FcyRIIIA) é um receptor Fc importante em humanos, expressado por células NK e macrófagos. Id. Os dados no Exemplo 1 apóiam a hipótese de que a ADCC mediada por célula NK é importante para a eficácia de terapia com RITUXAN(R) m em pacientes com linfoma.

Uma estratégia promissora para aumentar a eficácia de RITUXAN(R) é administrar

citocinas tais como IL-18, que podem ocasionar a expansão e/ou ativação das células efetoras dotadas de receptor Fe, incluindo células NK e células da linhagem monocítica/macrofágica. Os testes pré-clínicos de modelo de tumor de camundongo com IL-18 em combinação com RITUXAN(R) no Exemplo 1 demonstrou benefício sobre as monoterapias. Neste modelo o benefício total de IL-18 não pode ser testado, visto o modelo ter exigido xenoenxerto humano no camundongo SCID imuno-comprometido que tem apenas células funcionais NK. Contudo, os dados no Exemplo 1 apóiam que a expansão dessas células efetoras NK de ADCC demonstraram benefício na combinação de IL-18 e RITUXAN(R). RITUXAN(R) (foi ativo como monoterapia na maior dose testada. Contudo, níveis similares de atividade puderam ser vistos quando menores doses de RITUXAN(r) foram usadas em combinação com mlL-18 (SEQ ID NO: 2), indicando, que, tanto o modelo era sensível ao mecanismo de RITUXAN(R) e que a resposta pode ser intensificada por IL-18. Acredita-se que, as combinações de IL-18 com outros anticorpos monoclonais contra antígenos tais como CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR (Erbitux), IGF-1R, IGR-1R, AXL-1, FGFR receptores de integrina, CEA, CDFR e VEGFR e outros agentes antiangiogênicos demonstrariam os mesmos efeitos sinérgicos. De fato, prefigura-se que combinações simILares de IL-18 com outros anticorpos monoclonais contra antígenos que são encontrados na superfície de células tumorais que expressam um receptor para o qual é gerado um anticorpo monoclonal, funcionariam do mesmo modo. De modo ideal, um receptor como esse poderia ligar-se a células NK, monócitos, macrófagos, células B, células T e quaisquer outras células que contenham receptores Fc e participem na atividade efetora da ADCC.

Os dados nos exemplos 1 e 2 sugerem que, a combinação dos agentes anticâncer

com IL-18 podem mostrar benefício clínico, visto essas combinações proporcionarem dois diferentes mecanismos de ação: um é um efeito direto nas células tumorais, enquanto IL-18 for capaz de aumentar as células imune do paciente. Esses dois mecanismos poderiam complementar-se entre si, e, resultar potencialmente em atividade duradoura, e antitumoral superior, devido à capacidade dos IL-18 em gerar memória imunológica. De modo geral, os Exemplos 1 e 2 demonstram que, a combinação de IL-18 com agentes antitumorais, sejam estes anticorpos monoclonais ou agentes quimioterapêuticos, resulta em sinergia e atividade superior.

Combinações de IL-18 com o agente quimioterapêutico, doxorubicina, demonstraram atividade antitumoral superior a, ou IL-18 ou doxorubicina separadamente. Digno de nota, o Exemplo 2 mostra que, a combinação de IL-18 com doxorubicina não destrói as células imunes ativadas que são expandidas em resposta ao tratamento com IL-18. De modo surpreendente, e contrariamente, o Exemplo 2 demonstra que, a combinação aumenta as células TeNK ativadas e mantém sua função citolítica.

O Exemplo 3 é um protocolo clínico de Fase I que é atualmente realizado para se

avaliar a segurança e atividade biológica de IL-18 em combinação com Rituximab em pacientes com linfoma não-Hodgkin de célula B CD20+ (NHL). Este teste utiliza um regime de tratamento padrão de Rituximab em combinação com doses crescentes de IL-18 a fim de identificar uma dose que seja segura e tolerável e confira um efeito biológico máximo, conforme demonstrado pelos biomarcadores selecionados (por exemplo, células NK ativadas). A dose selecionada deste teste será usada em um teste de Fase Il futuro avaliando-se a eficácia da combinação de IL-8 e Rituximab em pacientes com linfoma folicular recorrente. Dado o perfil de boa segurança e tolerabilidade de IL-18, quando administrado como monoterapia a pacientes com melanoma metastásico, não se pode prever que a dose máxima tolerada (MTD) da combinação será atingida no teste atual; contudo este teste é planejado para definir o MTD, caso as toxicidades Iimitantes de dose sejam identificadas em pacientes com linfoma de não-Hodgkin.

O Exemplo 4 obtém uma análise de dados para a terapia combinada de IL-18 humano com HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino (células MoPC315 transfectadas com ErbB2 (HER2)). Uma análise detalhada dos dados revelou que, a terapia combinada com IL-18 e HERCEPTIN(R) ultrapassa a monoterapia com HERCEPTIN(R) apenas. Com base nesses dados, acredita-se que, IL-18 humano será uma combinação terapêutica eficaz com outros anticorpos de antígenos que são expressos em células tumorais.

O Exemplo 5 avalia a eficácia da terapia combinada de IL-18 com 5-fluoruracil (5- FU), se comparado com a monoterapia com 5-FU ou mlL-18 sozinho. 5-FU é um análogo de pirimidina atualmente usado em clínicas como um dos agentes quimioterapêuticos de primeira linha no tratamento de câncer pancreático e colorretal. Este agente quimioterapêutico, contudo, possui múltiplos efeitos colaterais graves, e uma possibilidade de baixar sua dose usando uma terapia combinada com outros agentes é desejável. Este teste foi realizado em um modelo subcutâneo singeneico bem estabelecido de carcinoma de cólon de murino, Colo 26, em camundongos BALB/c. Uma análise detalhada dos dados do volume do tumor no Exemplo 5 revelou que, a terapia combinada com 10 μς de IL-18 e 75 μς de 5-FU é o único grupo de tratamento com o efeito significativo no crescimento tumoral, se comparado com o grupo de controle. Isto significa que, a terapia combinada (75 μg /10 μς) excedeu os grupos de monoterapia com apenas 5-FU, ou com apenas mlL-18, porque a monoterapia não mostrou um efeito terapêutico melhor do que o do controle. Outros agentes quimioterapêuticos em combinação com IL-18, tais como doxil, topotecan, fármacos que alteram o DNA (por exemplo, carboplatina), antimetabólitos (por exemplo, gemcitabina), fármacos que evitam a divisão celular (por exemplo, vincristina) e agentes antiangiogênicos (por exemplo, pazopanib).

O Exemplo 6 propicia um teste da eficácia da terapia combinada com IL-18 e pazopanib (GW786034), um inibidor de VEGFR e PDCFR e c-kit de tirosina quinases, em um modelo de carcinoma de célula renal de camundongo. O receptor c-Kit pertence ao receptor de tirosina quinase tipo III, que consiste de um domínio de ligação ao Iigante extracelular e um domínio de quinase intracelular. O receptor cKit é expressado em uma série de tecidos normais e neoplásicos. Esses dados mostram que, a combinação de pazopanib com IL-18 resulta em atividade antitumoral (sinergia) estatisticamente significativa, quando comparado a cada monoterapia separada. Exemplo 7 é um estudo que coloca o papel de IL-18 como um indutor de memó

ria que resultaria em sobrevivência em longo prazo e prevenção de recorrência de tumor.

Este exemplo testa a eficácia em um modelo de tumor EL-4, onde os camundongos foram tratados por combinação de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) e doxorubicina. Os camundongos receptores de EL-4 que receberam células linfáticas sobreviventes sobreviveram significativamente mais do que os camundongos de controle que receberam células linfáticas de doadores nativos normais. Os dados implicam no fato de que a transferência adotiva de camundongos sobreviventes teve um efeito protetor nos receptores do tumor EL

4. Esses dados oferecem uma demonstração indireta de célula T de memória nos sobreviventes de tumor EL-4. (Figura 29 e Figura 30). Isto é uma importante descoberta que poderia fazer da combinação de qualquer agente quimioterapêutico ou mAb com IL-18, um tratamento do câncer superior a qualquer monoterapia. A indução de células T de memória que reconheceriam tumores como "estranhos" e previnem o reaparecimento seria altamente benéfica, e IL-18 com seu bom perfil de segurança um fármaco para qualquer terapia combinada em potencial.

Polipeptídeos IL-18 humanos são apresentados em EP 0692536A2, EP0712931A2, EP0767178A1 e WO 97/2441. A seqüência de aminoácido de IL-18 humano natural ("hlL-18) é dada na SEQ ID NO: 1. Polipeptídeos IL-18 humanos são polipeptídeo indutores de interferon γ. Eles desempenham um papel principal na indução de imunidade mediada por célula, incluindo indução da produção de interferon-γ por células T e esplenócitos, intensificação da atividade exterminadora de células NK, e promoção da diferenciação de células T CD4+ nativas em células Th1.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser recuperados e purificados de culturas celulares recombinantes por métodos bem conhecidos, incluindo sulfato de amônia ou precipitação com etanol, extração com ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de lectina, e cromatografia líquida de alto desempenho. Técnicas bem conhecida para redobramento de proteínas podem ser empregadas para regenerar a conformação ativa quando o polipeptídeo for desnaturado durante a síntese intracelular, isolamento e/ou purificação. Métodos para purificar e produzir IL-18 humano ativo são dados em WO 01/098455.

A presente invenção também propicia composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeo IL-18 humanos (SEQ ID NO: 1) e suas combinações. Essas composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, e pode compreender ainda, um veículo, diluente o excipiente farmaceuticamente aceitável. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis como água e óleos incluindo os de petróleo, óleos animais, vegetais ou de origem sintética, tais com óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, ou óleo de gergelim. A água pode ser empregada como um veículo quando a composição farmacêutica for administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas também podem ser empregadas como veículos líquidos, por exemplo, para soluções injetáveis.

Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, etanol, água e similar. A composição caso se deseje, também pode conter quantidades inferiores de agentes de umectação ou emulsificação, ou agentes de tamponamento de pH. Essas composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsuIas, pós, formulações de liberação controlada e similar. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tais como triglicérides. As formulações orais podem incluir veículos padrão, tais como os de grau farmacêutico de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis estão descritos em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES por E. W. Martin. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada do veículo, de modo a obter a forma para administração adequada ao paciente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração.

Em uma modalidade da invenção, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa, são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde for adequada, a composição também pode incluir uma agente solubilizante e um anestésico local, como lignocaína, para diminuir a dor no local da injeção. Em geral, os ingredientes são fornecidos sema em separado ou misturados juntos em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó Iiofilizado, ou concentrado isento de água, em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sache indicando a quantidade do ingrediente ativo. Quando a composição for administrada por infusão, ela pode ser fornecida com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Onde a composição for administrada por injeção, uma ampola ou água esterilizada para injeção ou solução salina pode ser providenciada de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Portanto, o polipeptídeo pode ser empregado na manufatura de um medicamento. As composições farmacêuticas da invenção podem ser formulada como soluções ou como pós Iiofilizados para administração parenteral. Pós podem ser reconstituídos por adição de um diluente adequado ou outro veículo farmaceuticamente aceitável antes do uso. A formulação líquida pode ser uma solução aquosa isotônica tamponada. Exemplos de diluentes adequados são soluções salinas isotônicas normais, dextrose a 5% padrão, em água ou solução de acetato de sódio ou amônio tamponado. Uma formulação como essa é especialmente adequada para administração parenteral, porém também podem ser empregada para administração oral, ou encerrada em um inalador ou nebulizador com dose medida para insuflação. Pode ser conveniente adicionar-se excipientes, tais como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulose, acácia, polietileno glicol, manitol, cloreto de sódio, ou citrato de sódio, para essas composições farmacêuticas.

Alternativamente, o polipeptídeo pode ser encapsulado, formado em comprimido ou preparado em uma emulsão ou xarope para administração oral. Veículos líquidos ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para incrementar ou estabilizar a composição, ou para facilitar a preparação da composição. Veículos sólidos incluem amido, lactose, sulfato de cálcio diidratado, caulim, estearato de magnésio ou ácido esteárico, talco, pectina, acácia, agar-agar ou gelatina. Veículos líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, óleo de oliva, solução salina e água. O veículo também pode incluir um material de liberação controlada tal como monoestearato de glicerila, ou diestearato de glicerina sozinho ou com uma cera. A quantidade do veículo sólido varia, porém ficará entre cerca de 20 mg a cerca de 1 g por unidade de dose. As preparações farmacêuticas são feitas seguindo as técnicas convencionais de farmácia que envolve trituração, misturação, granulação e compressão, quando for adequado, para formas de comprimido, ou trituração, misturação e enchimento para formas de cápsula de gelatina dura. Quando for usado um veículo líquido, a preparação estará na forma de um xarope, elixir, emulsão ou uma suspensão aquosa ou não aquosa. Uma formulação líquida como essa, pode ser administrada diretamente pela boca (via oral) ou enchida em uma cápsula de gelatina mole.

Polipeptídeos IL-18 humanos podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do polipeptídeo como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. Nas composições da invenção, pode ser empregada uma suspensão aquosa ou solução contendo o polipeptídeo, tamponado a um pH fisiológico, em uma forma pronta para injeção. As composições para administração parenteral compreenderão normalmente uma solução do polipeptídeo da invenção ou um coquetel dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um veículo aquoso. Uma série de veículos aquosos pode ser empregada, por exemplo, solução salina a 0,%, glicina a 0,3% e sim I Lares. Essas soluções são estéreis e, em geral isentas de matéria particulada. Essas soluções podem ser esterilizadas por técnicas de esterILização convencionais, bem conhecidas (por exemplo, fILtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximar-se de condições fisiológicas como ajuste do pH e agentes de tamponamento, etc. A concentração do polipeptídeo da invenção nessa formulação farmacêutica pode variar, muitíssimo, ou seja, de menos que cerca de0,5%, normalmente em ou pelo menos cerca de 1% a no máximo 15 ou 20% em peso e será selecionada principalmente com base nos volumes do fluido, viscosidade, etc, de acordo com o modo particular de administração selecionado.

Assim, uma composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 mL de água tamponada estérIL, e entre cerca de1 ng a cerca de 100 mg, por exemplo, cerca de 50 ng a cerca de 30 mg, ou de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um polipeptídeo da invenção. Similarmente, uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa poderia ser composta para ter cerca de 250 mL de solução de Ringer estéril, e cerca de 1 mg a cerca de 30 mg, ou de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg de um polipeptídeo da invenção. Métodos consagrados para preparar composições por administração parenteral são do conhecimento da técnica ou evidenciar-se-ão aos versados na técnica, estando descritos em mais detalhe, por exemplo, em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15 ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Os polipeptídeos da invenção, quando preparados em uma preparação farmacêutica, podem ser apresentar em formas de dose unitária. A dose terapeuticamente eficaz apropriada pode ser determinada prontamente pelo habilitado na técnica. Esta dose pode caso necessário, ser repetida a intervalos de tempo apropriados selecionados como apropriado pelo médico durante o período de resposta. Além disso, ensaios in vitro podem ser empregados, opcionalmente, para ajudar a identificar faixas ótimas de dosagem. A dose precisa para emprego na formulação irá depender da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, sendo decidida de acordo com o julgamento médico e circunstancias de cada paciente. Doses eficazes podem ser extrapoladas das curvas dose-resposta derivadas in vitro ou de sistemas de teste com modelo animal.

Para os polipeptídeos a dosagem administrada a um paciente fica tipicamente, em0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corpóreo do paciente. A dosagem administrada a um paciente pode ficar entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corpóreo do paciente ou alternativamente, 1 mg/kg a 10 mg/kg do peso corpóreo do paciente. Em geral, os polipeptídeos humanos têm uma media-vida mais longa dentro do corpo humano do que polipeptídeos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estranhos. Assim, dosagens menores de polipeptídeos humanos e administração menos freqüente é sempre possível. Além disso, a dosagem e freqüência de administração dos polipeptídeos da invenção pode ficar reduzida intensificando a absorção e penetração ao tecido (por exemplo, ao cérebro) dos polipeptídeos por modificações tais como por exemplo, lipidação. A invenção também proporciona uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente, associado com esses recipientes pode haver uma observação na forma prescrita por uma agencia governamental regulando a produção, uso ou venda dos produtos farmacêuticos ou biológicos, cuja observação reflete a aprovação pela agência de manufatura, uso ou venda para administração a humanos. Em uma outra modalidade da invenção, pode ser proporcionado um kit com o número certo de recipientes necessários para preencher os requisitos de dosagem para tratamento de uma indicação particular.

Em uma outra modalidade o composto ou composição podem ser fornecidos em

uma bolha, em particular um Iipossoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat, et al., em LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopes-Berestein and Fidler (Eds). Liss, N.Y, págs. 353-365 (1989); Lopes-Berestein, ibid, pp, 317-327; ver genericamente, ibid). Em uma outra modalidade ainda, o composto ou composição podem ser fornecidos

em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode-se empregar uma bomba (ver Langer, supra; Sefton CRC Crit. REf. Biomed Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al, Surgeri 88:507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). Em uma outra modalidade, pode-se empregar materiais poliméricos (ver MEDICAL APLICATIONS OF >0 CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds. CRC Pres. Boca Raton, FLA, (974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds), WILey, N.Y (1984): Ranger et al., J. Macromol, Sei. Rev. Macromol, Chem. 23:61 (1983) ver também Levy et Ia., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol. 25:351 (1989); Howard et al, J. Neurosurg 71:105 (1989)). Em uma outra modalidade ainda, um sistema de liberação controlado pode ser colocado próximo ao alvo terapêutico, ou seja, o cérebro, necessitando assim, apenas uma fração da dose sistêmica (ver por exemplo, Goodson em MEDICAL APLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE supra, vol 2 págs. 115-138 (1984)). Outros sistemas de liberação controlada descrevem-se na análise retrospectiva por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Polipeptídeos IL-18 humanos (SEQ ID NO: 1), podem ser administrados por qual

quer via interna apropriada, e podem repetir-se conforme necessário, por exemplo, tão frementemente, como uma a três vezes diariamente a entre 1 dia a cerca de três semanas a uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas. Alternativamente, o peptídeo pode ser alterado para reduzir a densidade de carga e assim permitir biodisponibilidade oral. A dose e duração do tratamento referem-se à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana, podendo ser ajustada pelo de prática comum na técnica, dependendo das condições em tratamento, e da saúde geral do paciente. A invenção propicia métodos de tratamento, inibição e profilaxia por administração a um paciente humano, de uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da presente invenção compreendendo polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade da invenção, o composto é substancialmente purificado (por exemplo, substancialmente isento de substâncias que limitam seu efeito ou que produzem efeitos colaterais indesejados). As formulações e métodos de administração podem ser empregados quando o composto compreender um polipeptídeo conforme supracitado. Formulações adicionais apropriadas e vias de administração podem ser selecionadas dentre aquelas descritas a seguir.

Vários sistemas de fornecimento são do conhecimento podendo ser usados para

administrar um composto da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (ver por exemplo, Wu, et al, J. Biol. Chem. 262;4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucléico com parte de um retrovírus ou outro vetor, etc. Métodos de introdução incluem, sem limitação, a intradérmico, intramuscular, intraperitonial, intravenoso, subcutâneo, intranasal, epidural, e vias orais. Os compostos ou composições podem ser administrados por qualquer via convencional, por exemplo, por infusão ou injeção de bolo, por absorção através do epitélio ou revestimentos mucocutaneos (por exemplo, mucosa oral, retal e mucosa intestinal etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser de conveniência introduzir-se os compostos ou composições farmacêuticos da invenção ano sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; injeção intraventricular pode ser facILitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório como um reservatório Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, mediante emprego de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossol.

A presente invenção pode ser corporificada em outras formas específicas, sem se afastar do espírito ou de seus atributos essenciais, e, portanto, deve ser feita referência às reivindicações apensas, ao invés do relatório descritivo precedente ou exemplos a seguir, conforme indicado pelo escopo da invenção.

GLOSSÁRIO

As seguintes definições são dadas com a finalidade de facilitar o entendimento de alguns termos usados freqüentemente acima.

"Citotoxicidade Mediada por Célula Dependente de Anticorpo (ADCC)" e "função efetora da Citotoxicidade Mediada por Célula Dependente de Anticorpo" (ADCC), conforme aqui empregado, são ambos pertinentes a um mecanismo de imunidade mediada por célula, pelo que, uma célula efetora do sistema imune, lisa ativamente, uma célula alvo que foi ligada por anticorpos específicos. ADCC é um dos mecanismos através do qual, os anticorpos como parte da resposta imune humoral, pode agir para limitar e conter a infecção. ADCC clássico é mediado por células aniquiladoras naturais (NK)1 porém um ADCC alternativo é empregado por eosinófilos para exterminar alguns vermes parasíticos conhecidos como helmintos. ADCC é parte da resposta imune adaptativa devido a sua dependência em uma resposta do anticorpo anterior. A ADCC típica envolve a ativação de células NK e é dependente do reconhecimento de células infectadas revestida de anticorpo por receptores Fc na superfície da célula NK. Os receptores Fc reconhecem a parte FC (constante) dos anticorpos tal como IgG1 que se liga à superfície de uma célula alvo infectada por patógeno. O receptor Fc que existe na superfície da Célula NK é denominado CD16 ou FcyRIII. Uma vez que se liga ao receptor Fe de IgG a célula AniquILadora Natural libera citocinas tais como IFn-γ, e grânulos citotóxicos, tais como perforina e granzima, que ingressam na célula alvo e promovem a morte celular disparando apoptose. Esta função efetora de ADCC é semelhante a, porém independente de respostas por células T citotóxicas (CTLs).

Conforme aqui empregado, o termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante,

excipiente ou veículo com o qual se administra o agente quimioterapêutico.

O termo "resposta completa' conforme aqui empregado, significa o desaparecimento de todos os sinais de câncer em resposta ao tratamento. Os versados na técnica também chamam uma "resposta completa" de uma "remissão completa". Nos modelos empregados nos exemplos a seguir, um animal que consegue uma "resposta completa" significa que os tumores mensuráveis regrediram ao estágio que não poderia ser medido. Em outras palavras, significa que, os animais foram "curados" e pareceram saudáveis.

"isolado" significa alterado "pela mão do homem" de seu estado natural, ou seja, caso ocorra na natureza. Foi alterado ou removido de seu meio original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que está naturalmente presente em um organismo vivo, não é "isolado", porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado de pelo menos um de seus materiais celulares coexistentes de seu estado natural é "isolado", conforme o termo é aqui empregado. Além disso, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que é introduzido em um organismo por transformação, manipulação genética ou por qualquer outro método recombinante é "isolado" mesmo se ele estiver ainda presente naquele organismo, cujo organismo pode estar vivo ou não.

Conforme aqui empregado, o termo "farmacêutico" inclui aplicações veterinárias da invenção. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade do agente terapêutico, que é útil para alívio de uma dada condição.

Conforme aqui empregado, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprova

do por uma agência reguladora do governo Federal ou estatal ou relacionado na Farmacopéia dos E.U.A, ou outra farmacopéia em geral reconhecida para uso em animais, e mais particularmente, o homem.

"Polipeptídeo" refere-se a qualquer polipeptídeo compreendendo dois u mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, ou seja, isósteres peptídicos. "Polipeptídeo" refere-se a, tanto cadeias curtas, normalmente referidas como peptídeos, oligopeptídeos ou oligômeros e a cadeias maiores, geralmente referidas como proteínas, Os polipeptídeos podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por gene. "Polipeptídeos" incluem seqüências de aminoácido modificadas seja por processos naturais, tais como processamento pós-traducional, ou por modificação química que são do conhecimento da técnica. Essas modificações estão bem documentadas em textos básicos e em mais detalhes monografias, bem como na volumosa literatura de pesquisa. As modificações podem ocorrer algures em um polipeptídeo, incluindo a estrutura peptídica, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais carboxila ou amino. Será considerado que, o mesmo tipo de modificação pode ser apresentar em graus iguais ou variados em vários pontos em uma adição de polipeptídeo. Ainda, um dado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Os polipeptídeos podem ser ramificados como resultado de ubiquitinação, podendo ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos ramificados cíclicos podem resultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação por ADP, amidação, biotinilação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma fração hemi, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado lipídicos, ligação covalente de fosfotidIL inositol, reticulação, ciclização, formação de ponte dissulfeto, desmetILação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato formILação, carboxILação gama, glicosILação, formação de âncora GPI, hidroxILação, iodinação metILação, miristolLação, oxidação, processamento proteolítico, fosforILação, prenILação, racemização, selenoILação, sulfatação, adição de aminoácidos a proteínas mediada por RNA transferidor, tais como arginlLação e ubiquitinação, (ver por exemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES 2as. Ed. T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Wold, F. Póst-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects,1-12 in POSTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed. Academic Press. New York, 1983; Seifter et al, Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990; Rattan, et al., Ann NYAcad Sci., 663:48-62 1990, Rattan et al., Ann. NY Acad. Sei, 663:48-62 (1992)).

Conforme aqui empregado, o termo "animais sobreviventes" significa o(s) animal(ais) que não pereceram de morte relacionada a tumor espontânea, ou não foram eutanizados devido ao volume do tumor que atingiu o tamanho muito grande predeterminado em humanos, ou não foram eutanizados devido a motivo relacionado com toxicidade de fármaco. Métodos/Exemplos Biológicos

Exemplo 1: Protocolo Experimental para terapia combinada de IL-18 com RITUXAN(R) em um modelo murino de Iinfoma de célula G humana

IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) é uma forma madura recombinante de interleucina18 humana expressada em uma cepa não patogênica de Escherichia coli. IL-18 é um monômero não glicosilado de 18 Kd com uma estrutura primária relacionada muito proximamente a IL-1 β e a subfamília trifólio de IL-1. cDNA de IL-18 de murino e humano codifica uma proteína precursora consistindo de 192 e 193 aminoácidos (SEQ ID NO: 2 e 1, respectivamente,). Pro-IL-18 exige processamento por caspases em proteína madura bioativa (157 aminoácidos) de modo a mediar sua atividade biológica. A homologia entre IL-18 de humano e de murino é de 65%. Em testes pré-clínicos esboçados abaixo, IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) foi usado, de modo a proporcionar um sistema singeneico in vivo, onde o potencial imunológico total de IL-18 pode ser analisado.

O teste foi realizado em camundongos SCID homozigotos fêmeas de cruzamento sem parentesco (ICR-Prkdcsad) que careciam tanto de células T e B. A vantagem de usar-se o estoque de cruzamento sem parentesco sobre as linhagens de cruzamento consangüíneo é que a linhagem SCID ICR do cruzamento sem parentesco não apresenta defeitos (mesmo em camundongos de 10 a 12 meses de idade).

Injetou-se aos camundongos da linha de Iinfoma de célula B Ramos humana que foi originalmente derivada de um paciente de 3 anos de idade com Iinfoma de Burkitt (catálogo ATCC1 CRL 1596). O homogenado 1:10 de tumor foi inoculado em camundongos de 6 a 8 semanas a dose de 0,5 mL por camundongo. O volume tumoral foi medido 2 a 3 vezes por semana, e os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento, de modo que, os grupos tiveram distribuição igual de volumes de tumor.

A terapia foi iniciada quando o volume médio do tumor por grupo atingiu 80 a 150

mm3 (no dia 12 pós inoculação do tumor). Além disso, os camundongos que desenvolveram um tumor com um volume fora dos limites estabelecidos foram excluídos do teste.

No primeiro teste, os grupos de tratamento (n = 6) incluíram um grupo de controle (sem terapia (três grupos de monoterapia i.v. com RITUXAN(R), (12,5, 25 e 50 μg/camundongos, BIW, respectivamente, (um grupo de monoterapia s. c com mlL-18 (100 μg/camundongo q.d) e três grupos da terapia combinada recebendo cada qual 100 μg/camundongo de IL-18 s.c. q.d mais 12,5, 25 ou 50 μg/camundongo de RITUXAN(R), intravenosamente, respectivamente.

No segundo teste, a dosagem consistiu de MIL-18 (SEQ ID NO: 2) a 100 μg/camundongo no programa SID, e RITUXAN(r) a 25 e 12,5 μ9 no programa qd4/3. O número de animais aumentou em n = 12, de modo a ter-se uma visão melhor para medição da significância estatística. O volume tumoral foi medido usando-se calibres competidores duas a três vezes por semana.

A terapia combinada com IL-18 e RITUXAN(R) no modelo de Iinfoma de célula B humana oferece um benefício sobre a monoterapia com, ou IL-18 ou RITUXAN(R) separadamente. Dois experimentos, abaixo descritos, mostram um benefício de significância estatística da terapia combinada neste modelo.

No primeiro experimento, visto na Figura 3, a alta dose de RITUXAN(R) (100 μg/dose) demonstrou forte atividade antitumoral, como uma terapia com único agente, enquanto a uma dose menor (12,5g/dose), RITUXAN(R) não teve nenhuma atividade. IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) não teve nenhuma atividade como um único agente (100 μg/dose). Contudo, quando combinado com uma dose menor de RITUXAN(r) , mlL-18 (SEQ ID NO: 2) demonstrou atividade adicional/sinergística (12,5 μg/dose de RITUXAN(R) combinado com 100 μg de mlL-18 (SEQ ID NO: 2).

A significância estatística é demonstrada abaixo nas Figuras 4 e 5, quando os dados são grafados e analisados usando-se GraphPadPrism(R). No primeiro desses gráficos, a Figura 4, os volumes de tumor são comparados no dia 19 pós-implante. A análise estatística demonstrou uma redução significativa de crescimento tumoral em todos os grupos de tratamento, se comparado ao grupo de controle não tratado (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). O segundo gráfico, Figura 5, mostra que a terapia combinada teve significância estatística mais eficaz, *p<0,05, **p<0,01) do que as monoterapias separadas.

No segundo experimento o aumento do número de animais (n = 12) proporcionou

melhor significância estatística da atividade antitumoral aditiva/sinergística em resposta à terapia combinada. Os gráficos nas Figuras 6a e 6B representam volume de crescimento de tumor mediano e médio. O teste foi analisado no dia 27 pós 9plante do tumor. Este teste está em andamento, e será terminado quando o volume do tumor mediano atingir 2000 cu mm (protocolo ACUC). Contudo, a análise de dados no dia 27 pós implante, Figuras 7 e 8 demonstram que há uma redução estatisticamente significativa do volume tumoral em camundongos tratados com terapia combinada (25/100 μg/camundongo) se comparado com apenas RITUXAN(R) (25 μg/camundongo) ou com monoterapia de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) (100 μg/camundongo).

Estes dados pré-clínicos demonstram que, a combinação de IL-18 e Rituximab re

sultam em atividade antitumoral sinérgica. Rituximab foi ativo como monoterapia na mais alta dose testada. Contudo, níveis similares de atividade poderiam ser esperados, quando doses menores de Rituximab fossem usados em combinação com IL-18 de murino ("mlL18"), indicando que, o modelo era sensível a Rituximab e que a resposta pode ser melhorada com IL-18. IL-18 de murino incrementou a atividade de Rituximab, presumivelmente, aumentando a atividade da ADCC em células NK. Visto os camundongos SCID carecerem de respostas tanto de célula B como T, IL-18 aumenta as respostas anti-tumor através da ativação de célula NK.

Além disso, a administração de IL-18 a primatas não humanos produziu a ativação de células NK e monócitos in vivo conduzindo a uma supra-regulação de receptores Fc (FcyRI) em monócitos. Herzyk et ai, Cytokine 20:38-48 (2002). A atividade antitumoral sinergística também foi observada, quando IL-1 é empregado em combinação com HERCEPTIN™em um modelo de camundongo SCID, apoiando a hipótese de que IL-18 aumenta a atividade de ADCC através da ativação de células NK.

Exemplo 2: Protocolo Experimental para combinação de IL-18 com doxorubicina em Iinfoma de célula T EL-4

Os testes foram realizados em camundongos C57/BL/6 fêmeas. Como um segundo

protocolo, camundongos C57/BL foram injetados i.p com 0,2 cc de células EL-4 de estoque. Células de Iinfoma T de murino EL-4 forma expandidas em RPMI w/10% de FCS. Todos os animais foram escolhidos aleatoriamente em seis ou sete camundongos por grupo de teste, com alimento e água a vontade. Células EL-4 foram colhidas no dia 0, contadas e implantadas i.p com células de Iin

foma de EL-4 5 x 105. Os animais foram escolhidos aleatoriamente para os grupos de tratamento de 6 a 7 animais no Dia 3. Administrou-se doxorubicina intravenosamente nos Dias 3 e 10, pós 9mplante, Administrou-se mlL-18 (SEQ ID NO: 2) subcutaneamente nos dias 3 a

16. Observaram-se os animais diariamente quanto à toxicidade e mortalidade.

Todos os animais toleraram bem o programa de dosagem e os níveis por observa

ção comum. No dia 16, dota a dosagem estava terminada, ocorrendo a morte do veículo intermediário nos dias 17 e 5. Todos os camundongos do veículo expiraram entre os dias 16 e 18 pós implante. O aumento de vida foi calculado pelo grupo de teste / grupo veículo = 1 x 100%. Para a terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) com doxorubicina em Iinfoma de célula T de EL-4, os dados foram analisados com relação ao tempo de sobrevivência médio e aumento na duração de vida.

O prolongamento de duração de vida em resposta à terapia combinada com mlL-8 (SEQ ID NO: 2 ) e doxorubicina foi avaliado no modelo de tumor singeneico de camundongos C57B1/6 fêmeas com Iinfoma de célula T de EL-4. O benefício da terapia combinada sobre a monoterapia com, ou mlL-18 (SEQ ID NO: 2) apenas, ou doxorubicina apenas, foi demonstrado em vários experimentos abaixo. Os exemplos da atividade antitumoral e prolongamento da duração de vida estão demonstrados na Figura 9. Como abaixo, quando os animais do veículo expiraram (no dia 16) toda a dopagem estava terminada. A morte do veículo intermediário ocorreu nos dias 17 e 5 e todos os camundongos do veículo expiraram entre os dias 16 e 18 pós implante.

Esses resultados demonstram que, a combinação de doxorubicina e mIL-18 (SEQ ID NO: 2) em Iinfoma de célula T de EL-4 resulta em atividade antitumoral sinérgica com uma sobrevivência maior. A monoterapia com doxorubicina mostrou um aumento mínimo na duração de vida a uma dose de 12 mg/kg. A monoterapia com IL-18 a doses de 1,5 e 25 ug/dose não mostrou qualquer aumento na duração de vida. Quando se combinou 12 mg/kg de doxorubicina com 25 μg/dose de IL-18, houve uma alteração no sentido de maior sobrevivência e cura aumentada. Quando esses animais foram novamente desafiados com tumor, demonstraram uma proteção.

Os inventores então examinaram o prognostico de sobrevivência, par uma terapia combinada de IL-18 e doxorubicina, reconhecendo que, seria vantajoso identificar-se a melhor dose para ambos os reagentes que resultaria em uma atividade antitumoral sinergística. O gráfico de probabilidade de sobrevivência dos dados mostrados na Figura 9 está Ilustrado na Figura 10.

Para esta análise, utilizou-se os dados de ou um teste da combinação ou monoterapia usando-se doxorubicina a doses de 0, 4,2, 7,2, 12 mg/kg e/ou mlL-18 (SEQ ID NO: 2) a doses de 0, 1, 5, 25 μg/camundongo. O gráfico usa o valor máximo da probabilidade superficial que corresponde à combinação de tratamento que minimiza o risco de morte. Esta superfície confere a probabilidade previsível de sobrevivência por pelo menos 30 dias, em cada combinação de tratamento.

O efeito de células imune em resposta à terapia combinada de IL-18 e doxorubicina foi enviado em um conjunto de experimentos que analisaram a viabilidade, expansão, ativação e funcionalidade dos linfócitos. O perfil do fenótipo dos linfócitos foi medido em animais que foram tratados com ou doxorubicina (12 mg/kg), m mlL-18 (SEQ ID NO: 2) (25 μg/dose) ou por combinação de ambos. O perfil de células T positivas para cD8 ativadas, NKs e NKs ativadas foi testado sendo os dados mostrados nas Figuras 11A e 11B.

A combinação de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e doxorubicina aumentou/manteve o mesmo número de células T positiva para CD8 ativadas (CTLs) células NK e células NK ativadas como doxorubicina apenas. Essas células podem desempenhar um papel chave na citoxicidade mediada por célula (exterminação específica de tumor). O incremento de células T positivas para CD8 ativadas e células NK, em resposta ao conjunto doxorubicina / IL- 18, foi ainda maior em PBLs circulantes, se comparado com esplenócitos.

Foi importante trabalhar um experimento para demonstrar que, doxorubicina não

reduz a atividade celular de NK aumentada por IL-18 (aniquilamento de tumor não específico). A figura 12 demonstra que, a citotoxicidade de NK fica prejudicada em animais tratados apenas com doxorubicina, enquanto os animais que receberam mlL-18 (SEQ ID NO: 2) apenas, ou combinação com doxorubicina, demonstraram ambos, uma forte citotoxicidade de células NK.

Exemplo 3: Protocolo para Teste Clínico de Fase I ou combinação de IL-18 com Ri

tuximab Este Fase I é um teste de escalonamento de dose de rótulo aberto, de IL-18 humano em combinação com terapia de Rituximab padrão, que investia a segurança e tolerabilidade de doses crescentes em 12 semanas (1 a 100 μg/kg) de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) em indivíduos com NHL de célula B CD20+.

A dosagem de Rituximab e IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) é oscilante. Portanto, os

indivíduos recebem infusões i.v de Rituximab semanalmente (375 mg/m2) no Dia 1 de Semanas 1 a 4. IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) é administrado como infusões i.v. semanais no Dia 2 das Semanas 1 a 4 e no Dia 2 (+ / -1 dia) das Semanas 5 a 12. A dose inicial de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) é 1 μg/kg e a escalação de dose é planejada para prosseguir até uma dose nominal máxima de 100 μg/kg.

A dosagem dentro de cada conjunto é escalonada com um indivíduo recebendo a primeira dose de Rituximab no Dia 1 e IL-18 humano (SEQ ID NO: 1 no Dia 2 e a seguir monitorado em ambiente interno, por pelo menos 24 horas. Caso não haja problemas de segurança ou tolerabilidade, os próximos indivíduos dentro do conjunto é dosado pelo menos 24 horas depois e também será monitorado em ambiente interno por 24 horas após sua primeira dose de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1). Nas semanas seguintes (semanas 2 a 12), os indivíduos são monitorados por 6 horas após a dose de IL-18 humano e a seguir podem ser liberados da clínica. A todos os indivíduos foram dadas doses com intervalo de pelo menos duas horas. A não mais que dois indivíduos por dia em qualquer grupo podem ser dadas as doses.

Três indivíduos são tratados no primeiro nível de dose (1 μ9^ semana), Caso não haja evidencia de toxicidade maior do que Grau 2 com relação "suspeita" ou "provável" para

0 fármaco de teste após o término da dosagem no grupo (ou seja, todos os três indivíduos completaram as semanas 1 a 6 do teste), três indivíduos são tratados em cada grupo sub

seqüente nos seguintes níveis de dosagem: 3 μg/kg/semana, 10 μg/kg/semana, 20 μg/kg/semana, 30 μg/kg/semana e 200 μg/kg/semana.

Para todas as infusões de Rituximab, a distribuição total da dose, do inicio da infusão ao término da infusão não pode ser menor do que 4 horas. A infusão de IL-18 humano ocorre em um período de duas horas. O objetivo deste teste é determinar a dose biologicamente eficaz de IL-1 humano

que seja segura, quando usada em combinação com tratamento de Rituximab padrão em indivíduos com Iinfoma de célula B CD20+. De modo a se avaliar a relação de dose-resposta para IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), que foi vista serem em forma de sino em testes de Fase

1 antecedentes, a faixa de dose de 1 a 100 μ9^ irá ser empregada para se examinar a extremidade inferior (baixa dose) e superior (faixa média ou dose alta) da faixa biologicamente

ativa em indivíduos com Iinfoma de célula B CD20+.

A dose de Rituximab é o regime padrão recomendado no rótulo aprovado para pacientes com NHL de célula B CD20+. Doses de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) são selecionadas com base na segurança prévia de Fase I, dados farmacocinéticos, e farmacodinâmicos dos testes envolvendo pacientes com carcinoma de célula renal e melanoma metastásico. A dose de rituximab para emprego neste teste é o regime padrão recomendado no rótula aprovado para pacientes com NHL de célula B CD20+.

Doses de IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) foram selecionadas com base na segurança prévia de Fase I, dados farmacocinéticos e farmacodinâmicos de testes envolvendo pacientes com carcinoma de célula renal e melanoma metastásico. Robertson, et Ia., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 178 (resumo 713 (2003); Robertosn et ai, J. Clin. Oncol.22:176s 10 (resumo 2553) (2004): Robertson et al., J. Clin. Oncol. 23:169s (resumo2513), (2005); Koch et al., J. Clin. Oncol. 23:174 s( resumo 2535) (2005); Koch et al., Eur. J. Cancer 4(12):865 (270) (2006). A maior dose testada, 2000 μg/kg administrada semanalmente por até 24 semanas não produziu toxicidade significativa de modo que, uma dose máxima tolerada não foi identificada, portanto os dados farmacodinâmicos foram usados para selecionar o limite superior da faixa de dose para este teste.

A maior dose testada, 2000 μg/kg administrada semanalmente por até 24 semanas não produziu toxicidade significativa, de modo que, uma dose máxima tolerada não foi identificada; portanto os dados farmacodinâmicos são usados para selecionar o limite superior da faixa de dose para este teste.

Exemplo 4: Combinação de IL-18 e HERCEPTIN(R)em modelo de plasmacitoma de

camundonao

Ambos os testes MOPC315. D3j005 e MOPC.D3j03 foram analisados para se avaliar o efeito da terapia combinada de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) com HERCEPTIN(R) no crescimento de plasmocitoma de murino. Para este experimento teve-se que transfectar células MoPC315 com ErbB2 (HER2). Para a transfecção usou-se 1,5 ug do vetor de expressão ErbB2 (BioCat - 108912 - pedna3.1 MErbB2) em um disco de 6 poços, conforme descrito usando transfecção Iipossomal com meio Lipofectamine™ e Optimen™ da Gibco. Neomicina de pressão seletiva (450 ug/ml G418 Sigma G6816) foi adicionado para as culturas após 2 dias. As populações positivas iniciais foram selecionadas por inspeção microscópica fluorescente das culturas in situ manchadas com anticorpo monoclonal HERCEPTIN(R) rotulado com Alexafluor488 e clonadas por diluição Iimitante (206434 p 70-72). A expressão D3 ErbB2 testada com citometria de fluxo HERCEPTIN(R) rotulada com Alexafluor488. A linha de célula MOPC.D3 foi selecionada e usada para avaliação de HERCEPTIN(R) e eficácia antitumoral de IL-18.

A atividade antitumoral foi medida e a análise detalhada dos dados revelou que a

terapia combinada com IL-18 e HERCEPTIN(R) suplanta a monoterapia com HERCEPTIN(R) separada. De modo notável, esta diferença é estatisticamente significativa e forte; foi determinada usando testes sem parâmetro que são menos sensíveis, e menos poderosos na determinação da diferença estatística.

Uma análise detalhada dos dados revelou que, a terapia combinada com IL-18 e HERCEPTIN(R) suplantam a monoterapia com HERCEPTIN(r) apenas. De modo notável esta diferença é estatisticamente significativa e forte; sendo determinada usando testes se parâmetros, que são menos sensíveis e menos poderosos na determinação da diferença estatística.

a. Teste n° MQPC315.D3Í005

Este teste empregou a combinação de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R), um anticorpo do receptor anti-Her2/neu, com objetivo de uso desta terapia no câncer de mama em um teste clínico. A terapia combinada foi testada na linha de célula de plasmocitona de murídeo bem documentada, MOPC315. A linha de tumor foi obtida de ATCC e transduzida com o receptor Her2 internamente. Esta linha de tumor é uma linha de célula singeneica BALB/c. A administração foi como segue: IL-18 de murino (SEQ ID NO:2) (100 μg/camundongo q.d., s.c), HERCEPTIN(R) (200, 100 ou 50 μg/camundongo, duas vezes na semana, i.v). O tratamento no teste MOPC315.D3jOOõ iniciou-se após os tumores começarem a crescer, o que se deu no dia 14 após o implante.

Os resultados deste teste são mostrados nas Figuras 13 e 14, expressando os dados como média +/- SD (Figura 13) e como faixa média+/- (Figura 14). Verificou-se primeiramente, se os dados seguem a distribuição normal (aproximação de Gauss), comparandose os valores do desvio padrão para certificar-se de que há uma variância igual (ver Figuras14 e 15). Descobriu-se que, há uma distribuição normal dos dados primitivos, contudo o desvio padrão entre os grupos de tratamento é altamente variável (>3x) e, portanto, não se pode utilizar o teste paramétrico (por exemplo, ANOVA) para análise. Transformou-se os

dados usando IogIO e 1n para verificar se os dados transformados passam pelos testes de normalidade e variância equivalente (análise da amostra mostrada abaixo - para grupos selecionados no dia 24). Os dados transformados não passaram pelo teste de normalidade. Portando, escolheu-se um teste não paramétrico (análise de Kruskal-Wallis) para a avaliação estatística. Os dados detalhados e valores p estão apresentados nas Figuras 13 e 14.

A análise estatística revelou que, a terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2)

e HERCEPTIN(R) é melhor do que a monoterapia com HERCEPTIN(R) APENAS, a FIGURA

MOSTRA A DIFERENÇA ESTATÍSTICA (ANÁLISE Kruskal-Wallis p<0,05) entre o grupo dosado com HERCEPTIN(R) 200 μg/camundongo apenas, e o grupo tratado com, ambos HERCEPTIN(R) 200 μg/camundongo e IL-18 humano na dose de 100 μg/camundongo. A

figura 16 mostra que, o tratamento combinado com HERCEPTIN(R) e IL-18 demonstrou a melhor visão de atividade antitumoral, se comparado com HERCEPTIN(R) e IL-18 separados.

b. Teste N° MOPC.D3JQ3 Este teste foi idêntico ao teste MOPC315.D3J005 supra (Exemplo 4a.) exceto que, a terapia iniciou-se antes dos tumores tornarem-se macroscopicamente evidentes, no dia 7 pós-implante. Além disso, a dose máxima de HERCEPTIN neste teste foi de 100 μg/camundongo, e a dose mínima foi 25 μg/camundongo.

Os dados são expressos como média +/-SD (Figura 17) e como uma faixa interme

diária +/- (Figura 18). Primeiro, verificou-se se os dados seguem a distribuição normal (aproximação de Gauss) comparando-se os valores do desvio padrão para se ter certeza de que o teste de variância equivalente passou. Descobriu-se que, os dados primários não seguem a distribuição normal; e ainda, que os dados transformados (log 10 ou 1n) não seguem a distribuição de Gauss, tampouco passam por um teste de variância equivalente. Portanto, não se pode utilizar um teste paramétrico (como ANOVA) e escolheu-se um teste não paramétrico (análise de Kriskal-Wallis) para avaliação estatística. Os dados detalhados e valores p estão apresentados abaixo nas Figuras 19 e 20.

Concluindo, a análise estatística deste teste revelou que, a terapia combinada com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e HERCEPTIN(R) é melhor do que a monoterapia com HERCEPTIN(R) apenas. Os gráficos nas Figuras 19 e 20 mostram a regressão significativamente melhor do tumor no grupo de terapia combinada (mIL-18 (SEQ ID NO: 2) 100 μg/camundongo e HERCEPTIN(R) 100 μg/camundongo) se comparado com a monoterapia com apenas HERCEPTIN (100 μg/camundongo). HERCEPTIN(R) como monoterapia possui atividade mínima, ou seja, contudo, potencializada por tratamento combinado com IL-18. Visto HER2 ser transfectado para as células, HERCEPTIN(R) pode apenas proporcionar ligação a HER2, porém nenhuma indução de apoptose (morte celular do tumor). Portanto, a atividade antitumoral é um resultado da terapia conjunta, onde IL-18 aumenta as células que desempenham papel chave na atividade ADCC e CDC (células que são aumentadas pelo tratamento com IL-18). e HERCEPTIN(R) fornece a ligação específica a HER2 prestando-se como um alvo para ADCC/CDC.

Exemplo 5: Análise da terapia combinada de IL-18 e 5-fluoruracil (5-FU) no modelo sinaeneico de câncer de cólon de murino. Colo26

Este teste objetiva avaliar a eficácia de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) na terapia combinada com 5-fluoruracil (5-FU), quando se compara com a monoterapia com 5-FU, ou mlL-18 (SEQ ID NO: 2) em separado. O teste foi realizado em um modelo subcutâneo singeneico bem documentado de carcinoma de cólon de murino, Colo26, em camundongos BALB/c. A dosagem com mlL-18 (SEQ ID NO: 2) foi realizada diariamente com 10 μg/camundongo s.c nos dias 10-30 após inoculação do tumor. A dosagem com 5-FU foi realizada i.p. duas vezes na semana na dose ascendente: 27, 45 e 74 μg/camundongo.

Uma análise detalhada dos dados do volume do tumor revelou que, a terapia combinada com 10 μg/ de mlL-18(SEQ ID NO: 2) e 75 μg de 5-FU é o único grupo de tratamento com efeito significativo no crescimento tumoral, se comparado com o grupo de controle. Isso quer dizer que, a terapia combinada (75 μg/10 μg) excedeu os grupos de monoterapia com apenas 5-FU, ou com apenas mlL18 (SEQ ID NO: 2), porque a monoterapia não mostrou um efeito terapêutico melhor do que o do controle. É importante saber que, esta diferença é estatisticamente significativa e persistente - determinou-se usando testes não paramétricos que são menos sensíveis e menos poderosos na determinação de diferenças estatísticas. Além disso, a análise de sobrevivência demonstrou que, a terapia combinada (75 μg/10 μg) foi significativamente melhor do que o grupo de monoterapia (75 μg). A significância foi extremamente forte com p<0,0001.

Os dados que comparam os volumes do tumor em diferentes grupos de tratamento

foram avaliados em um ponto de tempo representativo selecionado e foram expressos como média +/- sD (Figura 21) e como faixa intermediária +/- (Figura 22). Os dados foram primeiramente verificados para distribuição normal (aproximação de Gauss) e valores de desvio padrão foram comparados para certificar-se que há uma variância equivalente. Contudo, a distribuição de alguns dados primários não seguiram a curva de Gauss, e ainda o desvio padrão entre os grupo de tratamento foi altamente variável (>3xc) portanto o teste paramétrico não pode ser usado para a análise. Os dados foram transformados usando Iog10, e eles ainda não assaram os testes de normalidade e variância equivalente (análise da amostra apresentada abaixo - para os grupos selecionados). Assim um teste não paramétrico (análise de Kruskal-Wallis e teste de comparação de Dunn) foi usado párea a avaliação estatística. Os dados detalhados e valores de p estão apresentados nos gráficos abaixo na Figura 3. A figura 24 (faixa intermediaria +/-SD) e a Figura 25 (média +/-SD) mostram o efeito da terapia combinada de IL-18 e 5-FU no mesmo modelo de tumor de cólon singeneico Colo26. Fica claro que, os animais foram tratados quando o volume do tumor atingiu entre80-100 cu mm de tamanho (modelo de tumor avançado), ou com apenas IL-18, apenas 5- FU ou em combinação de ambos os fármacos. A melhor visão da atividade antitumoral e sinergia para tratamento combinado estão apresentados na Figura 26.

A sobrevivência dos camundongos com Colo26 em diferentes grupos de tratamento foi grafada em uma análise de curva de sobrevivência de Kaplan-Meyer sendo avaliada pelo teste de Logram, e está mostrada na Figura 26. Houve uma diferença estatística na sobrevivência entre os grupos de tratamento com o melhor grupo sendo a terapia combinada com μg de mlL-18 (SEQ ID NO: 2) e 75 μg de 5-FU.

Exemplo 6: Eficácia da terapia combinada com IL-18 e pazopanib (GW786034) no modelo de carcinoma de célula renal de camundonao Este teste, o teste RENJ02, testou a eficácia da terapia combinada com mlL-18

(SEQ ID NO: 2) e pazopanib um inibidor de VEGFR & PDGFR & tirosina quinases c-kit no modelo singeneico avançado de carcinoma renal de camundongo. Este modelo animal é um 10

15

modelo de carcinoma renal sólido subcutâneo de murino. A linha de célula RENCA de murino singeneica com camundongo BALB/c foi implantada em receptores BALB/c. O programa de dosagem empregado está Ilustrado abaixo na Tabela 1. IL-18 foi dosado uma vez ao dia nos dias 14 a 42 s.c. Pazopanib foi dosado uma vez ao dia nos dias 14 a 42 p.o.

Primeiramente, para a analise estatística, determinou-se um ponto de tempo ideal para comparação entre os grupos. A seguir os dados foram submetidos ao teste de normalidade para se determinar um teste estatístico adequado par análise. O Dia 32 foi escolhido como um ponto de tempo representativo (alguns camundongos tiveram de ser eutanizados devido à toxicidade ou tamanho de tumor neste ponto de tempo, portanto, os grupos mostraram 5-7 camundongos, embora originalmente, cada grupo tenha iniciado com 7 camundongos). Os dados não mostraram uma distribuição de Gauss (normal) e portanto, usou-se um teste não paramétrico. Uma diferença estatística entre a monoterapia e a terapia combinada foi determinada, sendo mostrada na Figura 28, mesmo se um teste não paramétrico tivesse de ser usado (tem menor poder em detectar a diferença do que o paramétrico) Usou-se software estatístico para avaliação que incluiu PrismGraphPad e SigmaStat.

Tabela 1

Grupo n° de camundongos pazopanib( μg) IL-18 (μ9) 1 7 10 0 2 7 30 0 3 7 100 0 4 7 10 100 5 7 30 100 6 7 100 100 7 7 0 100 8 7 0 0 20

25

A Figura 28 analisa os mesmos dados como a Figura 27. Contudo, na Figura 28, o grupo de controle não está incluído. Este gráfico adicional foi feito para realizar uma análise "mais clara" comparando-se unicamente os grupos de monoterapia e terapia combinada. Esses dados mostram que, o tratamento combinado com pazopanib (GB786034) e IL-18 resulta em atividade antitumoral estatisticamente significativo.

Exemplo 7: Colocando o papel de IL-18 como um indutor de memória aue resultaria em sobrevivência a longo prazo e prevenção de recorrência

Destinou-se esta questão a testar a eficácia em modelo de tumor EL-4, onde os camundongos foram tratados por combinação de IL-18 de murino (SEQ ID NO: 2) e doxorubicina. Os camundongos que foram curados, quando novamente desfiados com o tumor, ficaram resistentes a novo tumor/crescimento, sugerindo que, eles têm mecanismo de memória induzida pelo tratamento com IL-18 + doxorubicina. A presença de células de memória T em camundongo com tumor EL-4 que sobreviveram, e seus tumores foram curados por tratamento com IL-18 e doxorubicina está apresentada no experimento abaixo (Figura 29 e Figura 30).

Este plano experimental foi como segue: camundongos Pfp/Rag2 (haplótipo H2b 5 com grave depleção em célula NK e atividade CTL) receberam transferência adotiva de células de baço e Iinfonodo 2,5 x 107 dos sobreviventes tratados com IL-2 (3000 U por camundongo q.d., s.c) durante 3 dias após transferência adotiva (iniciando no dia da transferência adotiva) A linhagem receptora foi selecionada propositalmente para ter a mesma estrutura genética do tumor inoculado. Registrou-se o peso e a sobrevivência dos camundongos para 10 fixar uma linha de tempo de perda/ganho de peso, sendo a cavidade abdominal apalpada para verificar a presença de massa tumoral palpável durante as semanas após inoculação de EL-4.

Os camundongos Pfp/Rag2 foram adquiridos em quantidades máximas disponíveis = 4 machos e 4 fêmeas. Dispunha-se ainda de dois camundongos mais velhos deixados do 15 teste anterior. De modo a aumentar o número de amostras por grupo, tanto quanto possível, decidiu-se utILizar todos esses camundongos: para se evitar os efeitos de sexo e idade nos resultados, os sexos e idade foram distribuídos uniformemente entre os dois grupos: um recebeu as células linfáticas de sobreviventes de EL-4, e o outro recebeu células de camundongos normais B6 do controle.

Os resultados indicam que, não houve diferença significativa no peso entre os dois

grupos de camundongos durante a primeira semana aos desafio com EL-4, e o ganho de peso em todos os camundongos não variou (Figura 29). Este resultado pode ser devido ao fato de que todos os camundongos receberam IL-2 s.c para reforçar sua resposta imune durante os primeiros três dias. Durante a segunda e terceira semana após desafio com EL25 4, observou-se um rápido ganho de peso e tumor palpável e/ou formação de ascites no grupo de controle. Todos os camundongos de controle morreram em duas semanas, contudo todos os receptores de célula sobreviventes sobreviveram, embora dois (dentre 5) tiveram um tumor palpável no abdômen. Um camundongo teve de ser eutanizado, devido ao rápido crescimento do tumor, por motivos éticos.

Tabela 2

Transferência adoti¬ Número de células Receptores tratados SusceptibILidade a va de (IL-2 s.c 3000 com IL-2 s.c. 3000 EL-4 IU/m3 em dias) IU/m / 3 dias IL-18 & sobreviven¬ 2,5 x 10e7 sim protegido tes C57BL/6 tratados com doxorubicina camundongos 2,5x 10e7 sim não protegido C57BL/6 normais A Tabela 2 mostra o resumo das descobertas com relação à proteção contra desafio de tumor em camundongos tratados co IL-18/doxorubicina, versus animais normais do controle. Os camundongos que receberam células linfáticas de animais tratados com IL18/doxorubicina foram protegidos, enquanto as células linfáticas dos animais de controle mostraram retomada de tumor/crescimento.

Os camundongos receptores de EL-4 que receberam células linfáticas de sobrevivente sobreviveram um tempo significativamente maior do que os camundongos de controle que receberam células linfáticas de doadores naturais normais. Os dados implicam no fato de que a transferência adotiva de camundongos sobreviventes teve um efeito protetor nos 10 receptores de tumor EL-4. Esses dados conferem uma demonstração indireta de células T de memória nos sobreviventes de tumor EL-4 (Figura 29 e Figura 30.

Isto é um fato importante que poderia fazer da combinação de qualquer agente quimioterapêutico ou mAB com IL-18, um tratamento de câncer superior a qualquer monoterapia. A indução de células T de memória que reconheceriam o tumor como "estranho" prevenindo a recorrência seria altamente benéfica; fazendo de IL-18 com seu ótimo perfIL de segurança, um fármaco para qualquer terapia de combinação potencial.

Claims (20)

1. Método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de: administrar separadamente ao paciente uma composição compreendendo: (i) um polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO:1) em combinação com um veículo, e (ii) um anticorpo monoclonal contra um antígeno expressado na superfície de uma célula de câncer, em que o anticorpo possui função efetora de citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), sendo que o anticorpo não é um anticorpo anti-CD20.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o anticorpo monoclonal ser simultânea.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o anticorpo monoclonal ser seqüencial, sendo que o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO:1) é administrado em primeiro lugar.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o anticorpo ser seqüencial, sendo que o anticorpo monoclonal é administrado em primeiro lugar.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do antígeno ser escolhido dentre o grupo consistindo de: CE22, CD19, HER2, HER3, EGFR, IGR-1R, AXL-1, FGFR, receptores de integrina, CEA, CD44 e VEGFR.

6. missing in original document.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato do antígeno ser HER-2 e o anticorpo monoclonal ser HERCEPTIN(R).

8. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do câncer ser escolhido dentre o grupo de: Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de célula B não-Hodgkin, Iinfoma de Burkitt, Iinfoma de célula T não-Hodgkin, AML1 CLL, MM, outras leucemias, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma de WILm, glioblastoma e outros tumores cerebrais, câncer de cólon, câncer retal, câncer da próstata, melanoma, carcinoma de célula renal e cânceres de pele.

9. Método para tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de: administração separada ao paciente, de uma composição compreendendo: (i) polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) em combinação com um veículo e (ii) um agente quimioterapêutico.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e ministração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o agente quimioterapêutico ser simultânea.

11.Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o agente quimioterapêutico ser separada, sendo que o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) ser administrado em primeiro lugar.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da administração da composição compreendendo o polipeptídeo IL-18 humano (SEQ ID NO: 1) e o agente quimioterapêutico ser seqüencial sendo que o agente quimioterapêutico é administrado em primeiro lugar.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato do agente quimioterapêutico ser escolhido do grupo de: doxIL, topotecan, fármacos que alteram o DNA1 carboplatina, antimetabólitos, gencitabina, fármacos que evitam a divisão celular, vincristina, agentes antiangiogênicos, e pazopanib.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato do câncer ser escolhido do grupo de: Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de célula B não-Hodgkin, Iinfoma de Burkitt, Iinfoma de célula T não-Hodgkin, AML, CLL, MM, outras leucemias, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma de WILm, glioblastoma e outros tumores cerebrais, câncer de cólon, câncer retal, câncer da próstata, melanoma, carcinoma de célula renal e cânceres de pele.

15. Método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo CARACTERIZADO por compreender a etapa de administração ao paciente de uma composição compreendendo: IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), em combinação com um agente quimioterapêutico, pelo que o tratamento resulta em uma sobrevivência a longo prazo e/ou prevenção de recorrência do câncer e indução de memória imunológica no paciente.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do agente quimioterapêutico ser escolhido do grupo de: doxIL, topotecan, fármacos de alteração do DNA, carboplatina, antimetabólitos, gemcitabina, fármacos que previnem a divisão celular, vincristina, agentes antiangiogênicos e pazopanib.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do câncer ser escolhido do grupo de: Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de célula B não-Hodgkin, Iinfoma de Burkitt, Iinfoma de célula T não-Hodgkin, AML, CLL, MM, outras leucemias, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma de WILm, glioblastoma e outros tumores cerebrais, câncer de cólon, câncer retal, câncer da próstata, melanoma, carcinoma de célula renal e cânceres de pele.

18. Método de tratamento do câncer em um paciente em necessidade do mesmo, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de administração ao paciente de uma composição compreendendo: IL-18 humano (SEQ ID NO: 1), em combinação com um anticorpo monoclonal contra um antígeno que é expresso na superfície de uma célula de câncer, pelo que o anticorpo é dotado de função efetora de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e em que o anticorpo não é um anticorpo antiCD20, sendo que o tratamento resulta em sobrevivência a longo prazo e/ou prevenção de recorrência do câncer e indução de memória imunológica no paciente.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato do antígeno ser escolhido do grupo de: CD22, CD19, HER2, HER3, EGFR, IGF-1R, AXL-1, FGFR, receptores de integrina, CEA, CD44 e VEGFR.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato do câncer ser escolhido do grupo de: Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de célula B não-Hodgkin, Iinfoma de Burkitt, Iinfoma de célula T não-Hodgkin, AML, CLL, MM, outras leucemias, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de pulmão, sarcoma, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer da tireóide, hepatoma, câncer gástrico, neuroblastoma de WILm, glioblastoma e outros tumores cerebrais, câncer de cólon, câncer retal, câncer da próstata, melanoma, carcinoma de célula renal e cânceres de pele.