BRPI0812178A2 - método para detecção e discriminação simultânea de infecções bacterianas, fúngicas, parasitárias e virais no olho e sistema nervoso central - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA DETECÇÃO E DISCRIMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE INFECÇÕES BACTERIANAS, FÚNGICAS, PARASITÁRIAS E VIRAIS NO OLHO E SISTEMA NERVOSO CENTRAL. A presente invenção refere-se aos métodos de diagnóstico do agente causador simples ou mais de um agente causador de infecções oculares e no sistema nervoso dentre muitos patógenos prováveis, os que podem causar a infecção. Todos os patógenos que afetam uma área distinta do olho ou do sistema nervoso central geralmente causam manifestações ou síndromes clínicas. A presente invenção refere-se à detecção e discriminação do patógeno dentre o grupo de patógenos prováveis em um teste simples sem recorrer a uma bateria de testes, sendo cada um direcionado à detecção de um patógeno. A presente invenção almeja o diagnóstico com base " na síndrome, o qual substitui os diagnósticos com base na detecção de patógenos individuais.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO
PARA DETECÇÃO E DISCRIMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE INFECÇÕES BACTERIANAS, FÚNGICAS, PARASITÁRIAS E VIRAIS NO OLHO E SISTE- MA NERVOSO CENTRAL". 5 CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos diagnósticos para a identificação do agente causador simples ou mais de um agente c ausador de infecções oculares e do sistema nervoso dentre muitos patógenos prová- veis, os quais podem causar a infecção. Todos os patógenos que afetam 10 uma área distinta do olho ou do sistema nervoso geralmente causam as mesmas síndromes ou manifestações clínicas. A presente invenção se refe- re à detecção e à discriminação do patógeno dentre o grupo de patógenos prováveis em um único teste, sem se recorrer a uma bateria de testes, cada um direcionado à detecção de um patógeno. A presente invenção objetiva 15 substituir os diagnósticos baseados na detecção de patógenos individuais pelo diagnóstico baseado na síndrome.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Infecções do olho podem ser clinicamente classificadas de acor- do com o compartimento anatômico que as hospeda e assim é afetado pela 20 infecção. Existem muitos organismos que podem causar infecções oculares e tais são descritos em detalhes em "Principles and practice of infectious disea- ses, 6a edição, Gerald Mandell et al. (eds) Elsevier Churchill Livingston, PP. 1387 – 1418 (2005), cuja descrição é aqui incorporada a título de referência. Infecções oftálmicas podem ser classificadas nas seguintes ca- 25 tegorias baseadas no diagnóstico inicial do clínico:
1. Infecções oculares externas como a ceratite e a conjuntivite
2. Endoftalmite infecciosa
3. Uveíte
4. Retinite 30 Existem muitas infecções oculares externas causadas por diver- sas bactérias e fungos. O fato de a conjuntiva e a córnea abrigarem muitas bactérias e fungos não patogênicos como passageiros devido à exposição ao meio ambiente vicia a detecção de patógenos específicos (bactérias e fungos) em raspagens ou esfregaços conjuntivaos ou da córnea.
Na presen- ça de supuração ou ulceração com pus, clínicos fazem diagnósticos provisó- rios de infecção bacteriana e tratam os pacientes com antibióticos de amplo 5 espectro aplicados topicamente.
Entretanto, infecções cruciais de difícil di- agnóstico, mas eminentemente curáveis são: Herpes simples (que causa ceratite) ● Conjuntivite cerato adenoviral (às vezes em proporções epidêmicas) ● Chlamydia trachomatis (que causa conjuntivite folicular que leva ao traco- 10 ma e conjuntivite de inclusão adulta) ● Conjuntivite de varicela (também chamada de conjuntivite de Herpes zoster) ● Micobactéria de crescimento rápido como a M. chelanoe e M. fortuitum (causam infecções após LASIK, uma cirurgia conduzida para reduzir os er- ros refrativos) 15 Endoftalmite infecciosa pode geralmente ser causada por ● Bactéria gram-positiva ● Bactéria gram-negativa ● Organismos anaeróbicos, a saber, Propionobacterium acnes ● Fungos 20 Muito frequentemente, a infecção é pós-operatória e se alastra muito rapidamente, resultando em cegueira.
A informação mais importante exigida para o tratamento é se o agente causador é bactéria ou fungo e, se é bactéria, se é aeróbica ou anaeróbica.
Infecções endógenas causadas por espalhamento hematógeno são raras. 25 Uveíte é normalmente causada por ● Mycobacterium tuberculosis, ● M. fhelonae, ● M. fortuitum, ● Toxoplasma gondii 30 Retinite é normalmente encontrada em indivíduos imunocom- prometidos e é causada por ● Citomegalovírus
● Vírus do herpes simples ● Vírus da Varicela zoster Perda significativa de visão ocorre em todos esses pacientes e o diagnóstico rápido e oportuno destes organismos é um componente impor- 5 tante na prevenção de cegueiras ao redor do mundo.
A incidência real des- sas infecções pode ser relativamente maior em países em desenvolvimento.
Muitas técnicas de diagnóstico são para o diagnóstico de infecções oculares conforme detalhado na técnica anterior.
Infecções do sistema nervoso central podem ser classificadas 10 nas seguintes categorias: Meningite piogênica aguda: geralmente encontrada em crianças e causada por organismos tais como: ● Hemophilus influenza ● Neisseria meningitides e 15 ● Streptococcus pneumoniae.
Culturas bacterianas ou manchas microscópicas dos sedimentos de fluido cérebro-espinhal (CSF) não possuem sensibilidade.
Um fator com- plicador adicional é que o tratamento anterior do paciente com antibióticos pode levar a um resultado falso-negativo tanto gram-coloração e cultura do 20 CSF.
Por essas razões, médicos hesitam em confiar nos resultados das cul- turas e optam por completar um período inteiro de 10 a 14 dias de antibióti- cos intravenosos, o qual é, na maioria das vezes, desnecessário.
Uma vez parcialmente tratados, esses casos são indistinguíveis de meningite crônica causada por: 25 ● Mycobacterium tuberculosis ● Fungos diversos ● Encefalite viral causada por uma série de vírus são terapeuticamente amenizáveis como HSV, CMV e VZV.
A encefalite é, em geral, causada por diversos vírus tanto endê- 30 micos como epidêmicos.
Entretanto, Herpes simples, Citomegalovírus e Va- ricela zoster são vírus para os quais terapias antivirais específicas estão dis- poníveis.
Outro agente de encefalite tratável é Toxoplasma gondii.
TÉCNICA ANTERIOR O método clássico para a detecção de um patógeno (bactéria, levedura e outros fungos, parasitas e vírus) em uma amostra clínica envolve a cultura de uma amostra para expandir o número de patógenos presentes 5 até colônias de tamanho observável, as quais podem então ser identificadas e enumeradas por testes laboratoriais padrão.
Se desejado, as culturas tam- bém podem ser submetidas a testes adicionais para que se determine a suscetibilidade de um patógeno ao tratamento com um fármaco.
Para identi- ficação precisa das espécies infectantes, o médico deve confiar nos resulta- 10 dos das culturas que podem exigir de 3 dias (como no caso da maioria das bactérias incluindo-se micobactéria de crescimento rápido) até 8 semanas no caso de Mycobacterium tuberculosis.
Para uma identificação precisa das espécies de bactérias, o cultivo é seguido por testes bioquímicos extensivos que podem exigir dias adicionais ou até mesmo semanais.
Mais frequente- 15 mente, é importante fazer esta determinação rapidamente devido à gravida- de da doença e a necessidade de intervenção imediata por fármacos.
As técnicas de cultura aqui referidas são mais úteis no diagnóstico de infecções bacterianas e infecções por fungos e não são normalmente empregadas pa- ra propósitos de diagnósticos no caso de infecções virais, especialmente já 20 que a frequência de isolamento de vírus através do cultivo de uma amostra clínica é menor que 15%. A amostra apropriada para o diagnóstico de infecções como in- fecções oculares e infecções do sistema nervoso é um problema crítico adi- cional no sucesso do diagnóstico na detecção do agente etiológico da sín- 25 drome subjacente, como a cerato conjuntivite, endoftalmite, uveíte, retinite, meningite e encefalite.
Nesses casos, a infecção é altamente localizada e é, assim, confinada ao olho ou ao sistema nervoso central.
Fluidos corporais tais como sangue, plasma ou soro não contêm o agente infeccioso.
Infec- ções oculares externas exigem um espécime como raspagens de córnea ou 30 esfregaços conjuntivais enquanto endoftalmite infecciosa exige ou aspiração vítrea no consultório do oftalmologista ou, preferivelmente, uma amostra de vitrectomia, e em tal caso, 20 mL de lavagem vítrea pela solução salina ba-
lanceada de Hank deve ser tomada em uma sala de operações.
Aspirado do vítreo simples muito frequentemente é inadequada para diagnosticar endof- talmite bacteriana ou por fungo por exame e esfregaço de cultura.
A amostra preferível no caso de uveíte e retinite é de 0,2 a 0,3 mL de fluido vítreo cole- 5 tado em uma agulha de calibre 27. O melhor fluido diagnóstico usado para diagnosticar infecções do sistema nervoso central é o fluido cerebroespinhal.
Em uma modalidade da presente invenção, humor aquoso ou fluido vítreo no caso de endoftalmite será suficiente para a detecção e discriminação do agente infeccioso.
Isso torna óbvia a necessidade de que um procedimento 10 cirúrgico como vitrectomia seja realizado em uma sala de operações.
Métodos baseados em DNA para a identificação de um patóge- no oferecem alternativas simples robustas e à prova de erros a métodos clássicos, os quais são demorados e exigem pessoal com habilidades e trei- namentos especializados.
É possível introduzir erros que às vezes levam à 15 identificação ambígua de patógenos, e assim resultam em um diagnósti- co/tratamento errôneo durante a realização dos métodos clássicos.
Identifi- cação de patógenos baseada em DNA, por outro lado, oferece a vantagem de identificar o patógeno em uma etapa prematura, às vezes antes da de- tecção dos sintomas clínicos (etapa subclínica). Uma vez que as condições 20 são padronizadas, a identificação dos patógenos é à prova de erros e pode ser feita por uma pessoa semiespecializada.
Procedimentos baseados em DNA também podem ser usados para avaliar os resultados de intervenções médicas (valores prognósticos). A triagem de amostras clínicas para patóge- nos humanos usando métodos baseados em DNA como o PCR oferece di- 25 agnósticos sensíveis e definitivos e iniciação de tratamento eficaz, mesmo a partir de um volume pequeno de amostra clínica (humor aquoso, fluido ví- treo, lágrimas, saliva, sangue, fluido cerebroespinhal, raspagens de mucosa ou epitélio como a raspagem de córnea, esfregaço conjuntival, espécime tecidual, etc.) contendo muito poucos (aproximadamente 20 a 50) organis- 30 mos patogênicos por amostra.
Os benefícios potenciais do emprego da téc- nica de reação em cadeia de polimerase (PCR) são identificar um patógeno viral ou bacteriano específico em um período de tempo relativamente curto.
Um ensaio de PCR viável tem o potencial de influenciar as decisões do mé- dico de como instituir o tratamento enquanto o paciente ainda está na sala de emergência.
Como um método baseado em PCR de detecção não de- pende da presença de organismos viáveis, mas em vez disso se baseia em 5 material genético, uma técnica baseada em PCR é aplicável em todos os casos de pacientes, mesmo quando antibióticos são administrados antes da retirada da coleta de espécimes clínicos.
Algumas dificuldades, entretanto, são associadas aos métodos baseados em PCR, como resultados falso- positivos devido a ácidos nucleicos contaminados e inibição da reação PCR 10 devido a amostras complexas.
Os seguintes ensaios de PCR foram descritos para os organismos causadores de infecções oculares e do sistema nervoso central.
Herpes simples 1 e 2: Mostrou-se que a detecção de DNA base- ada em PCR de HSV é de 4 a 5 vezes mais sensível que a cultura viral e 15 não é sensível a condições de transporte conforme mencionado por Wald A., et al. em "Polymerase chain reaction for detection of herpes simplex virus (HSV) on mucosal surface: Comparison with HSV isolation in cell culture". J.
Inf.
Dis. 188: 1345-1351 (2003). PCR foi utilizada para detectar HSV em es- pécimes oculares como humor aquoso, raspagens de córnea, aspirados de 20 lentes, material capsular de lentes e fluido vítreo e outros espécimes clínicos como CSF, esfregaços genitais e cervicais por Madhavan HN et al. em "De- tection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples: Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV". J.
Clin.
Virol. 14:145-151 (1999). Aqui, uma PCR po- 25 dia detectar de 1 a 3 partículas de HSV em uma amostra clínica.
PCR tam- bém foi eficazmente utilizada para identificar serótipos do vírus do herpes combinando-se PCR e polimorfismos de restrição de comprimento do ampli- con, conforme mencionado na publicação de um dos inventores, cujas des- crições são aqui incorporadas a título de referência: Madhavan HN et al. 30 "Phenotypic and Genotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes". J.
Virol.
Methods, 108: 97-102 (2003). Vírus da Varicela zoster: PCR foi aplicada para detectar infec-
ções com Varicela (Burke DG, et al. "Polymerase chain reaction detection and clinical significance of varicella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virus infected patients". J.Inf.
Dis, 176: 1080 (1996)). De- tecção, tanto de HSV quanto de VZV no sistema nervoso central, também foi 5 conseguida utilizando-se PCR (Sauerbrei A and Wutzler P. "Laboratory di- agnosis of central nervous system infection caused by herpes viruses". J.
Clin.
Virol, 25 s45-s51, (2002)), em que se concluiu que PCR é o melhor pa- drão para a detecção de VZV, exposições aqui incorporadas a título de refe- rência. 10 Citomegalovírus A: Um teste de PCR comercialmente disponível chamado COBAS Amplicor CMV Monitor da Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, EUA usa região de 365 regiões de pares de base do gene de polimerase de DNA de CMV para detecção por amplificação.
Utilizando- se genes do antígeno prematuro imediato e DNA polimerase, muitos ensaios 15 foram descritos para detectar a presença de CMV em diversos fluidos corpo- rais (Stanier P, et al. "Detection of human cytomegalovirus in peripheral mo- nonuclear cells and urine samples using PCR". Mol.
Cell Probes, 6: 51 - 58 (1992) e Gerna G, et al. "Monitoring human cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in heart transplant recipients by determination of vira- 20 emia, antigenemia and DNAemia". J.
Inf.
Dis., 164, 488-498 (1991)), cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência.
Infecções de CMV dos pacientes também foram detectadas por uma nested PCR em diversas amostras como sangue, fluido amniótico, aspirações nasais, lavagem bron- coalveolar, urina, material placentário e aspirações de brônquios. 25 Infecções oculares causadas por todos os três tipos de vírus do herpes, HSV, VZV e CMV foram detectadas por PCR conforme descrito por um dos inventores em uma publicação, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência Priya K et al. "Association of herpes viruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymerase chain reaction 30 based study". Ocular Immunology and Inflammation 9: 1-9 (2003). Nested PCR foi realizada para detectar VZV neste estudo para que se obtivesse a sensibilidade desejada.
Entretanto, a PCR aninhada tem o problema de in-
troduzir a contaminação do amplicon no laboratório, já que o produto de PCR da primeira etapa de amplificação tem que ser transferido para um se- gundo tubo de PCR contendo um segundo grupo de iniciadores que amplifi- cam uma região menor do gene amplificado na primeira etapa de PCR. 5 A detecção de Mycobacterium tuberculosis por PCR é o esque- ma de dois testes aprovados pelo FDA.
Esses são: Teste Direto de Myco- bacterium tuberculosis Amplificado da Gen- Probe San Diego, EUA e teste para M. tuberculosis de Amplicor de Roche Diagnostic Systems, Basel, Suí- ça.
Muitos outros testes são conhecidos pela técnica.
Entretanto, utilizando- 10 se PCR, tuberculose ocular foi detectada por Madhavan HN et al. "Polyme- rase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in epiretinal membrane in Eales'". Disease.
Invest.
Ophthalmol.
Vis.
Sci. 41: 822-825 (2000). A detecção de Chlamydia trachomatis por amplificação de áci- 15 dos nucleicos tem sido utilizada em configurações clínicas e é descrita em detalhes por Black CM, em "Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infection". Clin.
Microbiol.
Rev.10: 160-184 (1997). Conjuntivite por clamídia foi detectada utilizando-se PCR em esfregaços conjuntivais e uns poucos 30 organismos foram detectados em uma amostra 20 clínica conforme detalhado por Malathi.
Jet al. "A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis". Ind.
Med.
Res., 117:71-75 (2003). Conjuntivite por adenovírus foi diagnosticada por neste PCR em esfregaços conjuntivais conforme descrito anteriormente.
Dalapathy S et al. 25 "Development and use of nested polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Adenoviruses from conjunctivitis specimen". J.
Clin.
Virol. 11:77- 84 (1998). Toxoplasma gondii causa uveíte e encefalite severa caso o paci- ente possua imunodeficiência.
Muitos protocolos de testes de PCR tem sido 30 utilizados para estudar os vários tecidos e fluidos corporais, e todos os tes- tes de PCR dependem da amplificação do gene B1 (Danise A, et al. "Use of polymerase chain reaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differential diagnosis of retinitis in patients infected with human immunodefi- ciency virus". Clin.
Infect.
Dis 24: 1100- 1106 (1997), Montoyo. et al. "Use of polymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis.
Ophthalmo- logy", 106: 1554-1563 (1999). 5 Endoftalmite infecciosa resultante de infecção pós-operatória do olho é investigada utilizando-se reações de PCR para genes de eubactéria e discriminação por sonda em Gram + ve e Gram - ve conforme descrição em detalhes em Anand AR et al. "Use of polymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of the interacting 10 bacterium in the intraocular fluids of patients with endophthalmitis". J.
Infec- tion, 41:221-226 (2000). Esse estudo foi capaz de detectar umas poucas 6 bactérias em uma amostra clínica.
As infecções oculares causadas por or- ganismos anaeróbicos como Propionibacterium acnes foram rapidamente detectadas utilizando-se PCR conforme descrito em detalhes em Therese KL et 15 al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis", Brit.
Opthal. 82:1078-1082 (1998). Endoftalmite fúngica também pode ser rapidamente diagnosticada utilizando-se PCR conforme descrito em detalhes por Anand AR et al. "Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperi- gillus endophthalmitis". Ind.
Med.
Res. 114: 133-140 (2001) e Anand AR et 20 al. "Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis". Ophthalmo- logy 108: 326-330 (2001). Em ambos os estudos cerca de 0,4 pgs de DNA fúngico pode ser detectado.
Diversos ensaios de PCR aqui descritos empregam perfis térmi- cos diferentes da reação, uma vez que os grupos de iniciadores e os genes 25 sendo testados em cada PCR individual são diferentes.
Ademais, as concen- trações de reagentes para cada PCR descrita acima foram ajustadas de mo- do a otimizar a PCR para a maior sensibilidade para aquele grupo de rea- gentes que está sendo utilizado.
As condições ótimas de reação variam de acordo com a sequência da cadeia de nucleotídeos que está sendo amplifi- 30 cada, seu tamanho e complexidade do DNA alvo inteiro do organismo ou patógeno a ser detectado.
Entretanto, permanece a necessidade, por um ensaio baseado em PCR que pode, simultaneamente, detectar e discriminar os patógenos que causam infecções bacterianas, fúngicas, parasíticas ou virais do olho e do sistema nervoso central, o qual além de ser rápido, não seja propenso à contaminação e que tenha uma sensibilidade e especificidade aumentada 5 em relação aos outros métodos.
Deve ser de fácil utilização em configura- ções clínicas em que a identificação do agente de infecção em entre 24 e 48 horas é importante para salvar vidas.
O problema crítico no diagnóstico pre- ciso de infecções do olho e cérebro pode ser resumido da seguinte maneira: ● As infecções do olho e cérebro são altamente localizadas.
Não 10 há registro do agente causador em fluidos biológicos facilmente obteníveis como sangue, soro, plasma, saliva ou pus ou descargas purulentas de um ferimento ou úlcera externa. ● Os biomarcadores putativos de quaisquer infecções agudas como a proteína reativa C são gerais e comuns a todas as infecções que 15 afligem o corpo humano.
Assim são não específicos. ● De modo a identificar o agente causador específico, uma amostra do olho ou de CSF é necessária.
As amostras obteníveis são ras- pagens da córnea para infecções na córnea; esfregaços conjuntivais para conjuntivite; humor aquoso para endoftalmite; humor vítreo para uveíte e 20 retinite.
Em caso de infecção no cérebro, a amostra preferível é sempre CSF.
Em todas essas amostras, há uma limitação da quantidade de amostra que pode ser obtida de um paciente em uma única sessão.
Geralmente, consegue-se poucos milhares de células e provavelmente 2 ou 3 miligramas de amostra em um esfregaço ou raspagem da córnea.
O humor aquoso que 25 pode ser retirado do olho de um paciente a qualquer momento é cerca de 100 μL, enquanto a amostra por vitrectomia pode ter até 200 μL.
Uma amos- tra de CSF de até 5 mL pode ser retirada mas o volume da amostra de CSF necessária para a PCR é de menos de 0,5 mL. ● Como consequência da limitação do volume da amostra, tem- 30 se o número limitado de bactérias / vírus / parasitas presentes na amostra.
Ademais, a dose do agente infeccioso é menor do que a dose observada em muitos outros compartimentos do corpo tal como sangue.
● O número total de partículas infecciosas presentes na amostra é diretamente proporcional ao sucesso da detecção.
Abaixo de uma massa crítica, os agentes infecciosos, bactérias e fungos, não crescem na cultura e assim são de difícil diagnóstico.
O número de partículas virais presentes em 5 um espécime ocular está geralmente abaixo dos limites de detecção de tes- tes de detecção de anticorpos fluorescentes bem como de culturas virais, assim fazendo com que a sensibilidade de detecção seja menor que 25%. Não há sistemas fáceis de detecção para parasitas como Toxoplasma gondii e o número de parasitas também é muito pequeno para ser detectado.
Os 10 testes tais como de detecção IgM ou IgG para HSV, CMV, VZV, adenovírus, clamídia e toxoplasma são muito não-específicos e não possuem significân- cia diagnóstica. ● Outra grande dificuldade no diagnóstico é que todas as afli- ções do olho descritas acima são de natureza aguda e exigem um diagnósti- 15 co preciso e imediato para a instituição da terapia apropriada.
Atraso de mais de 48 horas resulta em cegueira no caso de endoftalmite infecciosa, e retinite necrosante causada por infecções virais precisa ser tratada dentro de 96 horas do surgimento do primeiro sintoma.
PCR multiplex também foi realizada para alguns dos patógenos 20 em uma dada situação clínica e os produtos amplificados foram identificados pela determinação do peso molecular por espectrometria de massa, confor- me detalhado em Detection and identification of pathogens by mass spec- trometric determination of the base composition of PCR products. (Ecker, David J.: Griffey Richard 11.: Sampath, Rangarajan; Ho- 25 fstandler, Steven A.: Meneil, John; Crooke, Sstanley T. (USA). U.S.
Pat.
Appl.
Publ. (2004), 168 pp.
Continuação em parte do US 323,233. Pedido: US 2003-660122 20030911. Prioridade: US 2001-798007 20010302; US 2002-431319 20021206; US 2002-323233 20021218; US 2002-326051 20021218; US 2002-325526 20021218; US 2002-325527 20021218; US 30 2003-443443 20030129; US 2003-443788 20030130; US 2003-447529 20030214). Ensaio de PCR multiplex seguido por eletroforese em gel do produto para identificação foi tentado para infecções do sistema nervoso central conforme descrito por Read, SJ. e Kurtz, JB. "Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single mul- tiplex PCR screening assay". J.
Clin.
Microbiol. 37: 1352-1355 (1999). 5 PCR multiplex seguida de microarranjo para a detecção do pa- tógeno foi descrita para a detecção de patógenos causadores de doenças respiratórias. (Wang D et al. "Microarranjo based detection and genotyping of viral pathogens". Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA 99: 15687-15692 (2002)). A de- tecção de amplicons também foi tentada utilizando-se o sistema de ensaio 10 de placas de microtítulo colorimétricas, em que o amplicon é marcado com digoxigenina 11-dUTP e sondas biotinilatadas são usadas para capturar o amplicon na placa.
O produto é revelado utilizando-se antidigoxigenina mar- cada com enzimas (Smalling TW et al. "Molecular approaches to detecting herpes simplex virus and enteroviruses in the central nervous system". J. 15 Clin.
Microbiol. 40:2317-2322 (2002)). Ensaios de PCR multiplex de três genes diferentes do mesmo organismo, a saber, região transformadora morfológica II, UL 83 e genes de glicoproteína O de citomegalovírus foram tentados para que se quantificasse o vírus em amostras clínicas, conforme detalhado por Madhavan HN et al., 20 "Development and application of a novel multiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of human cytomegalovirus in clinical specimen", J Virol Methods. 141:166-72 (2007). Ensaio de sonda em linha também foi utilizado para detectar e discriminar os genótipos de vírus do papiloma em amostras cervicais de mu- 25 lheres após o ensaio de PCR multiplex que amplifica a região L1 de todos os 19 genótipos de alto risco (Bauer HM et al. "Detection of human papilloma viruses by polymerase chain reaction" US Patent No 5639871). Os métodos como a espectrometria de massa não são praticá- veis mesmo em centros de tratamento médico, terciário, avançados e detec- 30 ção por microarranjos com bases em scanners são onerosos demais para configurações clínicas.
Um ensaio por sonda em linha é propenso à conta- minação do amplicon.
DEFINIÇÕES "Nucleotídeo" significa um bloco construtor de DNA ou RNA, consistindo em uma base de nitrogênio, uma molécula de fosfato e uma mo- lécula de açúcar (desoxirribose no DNA e ribose no RNA) 5 "Oligonucleotídeo" significa uma corrente curta de nucleotídeos.
Oligonucleotídeos são frequentemente usados como sondas para encontrar uma sequência de DNA ou RNA correspondente e podem ser marcados com diversos marcadores, tais como radioisótopos e partes fluorescentes e qui- mioluminescentes. 10 "Iniciador" significa uma fita curta de oligonucleotídeos comple- mentares a uma sequência alvo específica de DNA, que é utilizada para for- necer síntese de DNA. "Uniplex" significa um ensaio baseado em PCR que utiliza um único grupo de iniciadores em cada reação que amplifica uma única sequên- 15 cia de DNA específica do patógeno. "Multiplex" significa um ensaio baseado em PCR que utiliza múl- tiplos grupos de iniciadores em uma única reação, em que cada iniciador pode amplificar uma única sequência de DNA específica do patógeno.
O termo "sonda" se refere ao produto de DNA (amplicon) resul- 20 tante de uma amplificação baseada em PCR do DNA alvo.
O termo "alvo" se refere à sequência de DNA, específica para o patógeno individual, a qual é imobilizada em uma matriz inerte como náilon. "Hibridização" se refere ao processo de junção de duas fitas com- plementares de DNA para formar uma molécula de fita dupla; mais especifica- 25 mente mencionado aqui, entre as sequências de DNA "alvo" e "sonda". O termo "sistema de detecção" conforme utilizado aqui se refere a um método que permite a visualização de produtos de DNA amplificados por PCR.
Exemplos de sistemas de detecção adequados incluem sistemas que dependem da detecção de cor, radioatividade, fluorescência ou quimio- 30 luminescência.
Panfungal significa uma sequência gênica comum encontrada em todos os fungos patogênicos como Cryptococcus, Candida, Mucormyco-
sis, Asperigillus e Rhizopus etc. E usada para identificação de qualquer uma / todas as espécies de fungos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um grupo de iniciadores de avanço e 5 reversos específicos para patógenos quimicamente marcado que foi unica- mente projetado para amplificar especificamente sequências alvo a partir de um patógeno em uma reação em cadeia de polimerase multiplex em uma temperatura de desnaturação de 95oC, temperatura de recozimento de 58 a 65oC e extensão a 72oC. A invenção também proporciona um grupo de se- 10 quências de DNA alvo derivadas do gene específico do patógeno que é imo- bilizado em um apoio inerte e hibridiza especificamente com o produto ampli- ficado por PCR obtido utilizando-se os iniciadores de PCR de avanço e re- versos específicos do patógeno. A invenção proporciona um ensaio rápido para detecção simul- 15 tânea dos patógenos responsáveis por infecções do olho e do sistema ner- voso central para as quais parâmetros imunológicos não são indicativos de uma infecção ativa, mas somente indicativos de exposição ao patógeno e para as quais ensaios microbiológicos clássicos com culturas fúngicas e bac- terianas não são nem sensíveis o suficiente para detectar o patógeno, nem 20 rápido o suficiente para identificar o patógeno em 48 horas. A presente invenção combina a alta sensibilidade do ensaio PCR e a alta especificidade da identificação por hibridização em um macro- arranjo com a detecção da hibridização por métodos de detecção por cor, cujo resultado final pode ser monitorado a olho nu. Entretanto, marcadores 25 fluorescentes com Quantum Dots, Cy3, Cy5 e FITC também podem ser utili- zados e o produto poderia ser visualizado por microscopia fluorescente. A invenção apresenta um ensaio multiplex para detecção e dis- criminação simultâneas de patógenos que causam infecções no olho e sis- tema nervoso central compreendendo: 30 i) Processar as amostras clínicas tais como raspagens da córnea ou esfregaços conjuntivais ou humor aquoso ou fluido vítreo ou lavagem por vitrectomia coletada ou aspirada de fluido cerebroespinhal ou pus coletado de um abscesso cerebral ou uma membrana epirretiniana de um paciente com suspeita de possuir uma infecção no olho ou sistema nervoso central, para isolar o DNA por métodos padrão. ii) Amplificar uma região específica do DNA de um gene que é 5 específico para cada um dos patógenos por uma técnica de PCR de tubo único, usando iniciadores de amplificação marcados para cada um dos patógenos conhecidos por causarem infecções nos olhos e sistema nervoso central. Iii) Detectar e discriminar os patógenos utilizando uma hibridiza- ção de DNA em que as sequências alvo imobilizadas específicas para cada 10 um dos patógenos reagem com sondas de DNA amplificadas, geradas pela reação PCR e monitorar a hibridização por revelação em cores usando um grupo específico de reagentes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Desenho de iniciadores de PCR únicaq adequados para PCR 15 multiplex do DNA do(s) patógeno(s) de amostras clínicas de pacientes so- frendo de infecções no olho. Os seguintes genes dos diversos patógenos conhecidos que causam infecções oculares foram escolhidos baseados em informações co- nhecidas disponíveis na literatura. 20 1. Glicoproteína D do vírus do herpes simples 1 & 2
2. Gene UL 44 do vírus do herpes simples 1 & 2 UL 44
3. Gene de polimerase de DNA do vírus do herpes simplex 1 & 2
4. Gene da glicoproteína O de Citomegalovírus
5. Gene de transformação morfológica de citomegalovírus 25 6. Gene UL 88 de citomegalovírus
7. Varicela zoster ORF 29
8. Gene de DNA polimerase de Varicela zoster
9. Gene hexon de adenovírus
10. Gene I de RNA ribossômico 16 de eubactérias 30 11. Região II do gene de RNA ribossômico 16s de eubactérias
12. Parte específica bacteriana Gram +ve do gene de RNA ri- bossômico 16
13. Gene 64 MPB de Mycobacterium tuberculosis
14. Gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium fortuitum
15. Gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium chelonei
16. Gene B 1 de Toxoplasma gondii 5 17. Proteína II polimórfica de Chlamydia trachomatis
18. Parte específica fúngica do gene de RNA ribossômico 28s
19. Parte específica de Propionibacterium acnes do gene de RNA ribossômico 16s a 23s
20. Parte específica bacteriana Gram -ve do gene gyr B 10 21. Gene de aconitato hidratase bacteriano Gram -ve
22. Gene de ribonuclease 1 Gram - ve Para ainda aperfeiçoar a detecção de alguns dos organismos como Herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, Varicela zoster e bactérias Gram-negativas, mais do que um gene de cada organismo foram escolhidos 15 para fins de amplificação. No caso de Herpes simples 1 e 2 e Citomegaloví- rus, três genes diferentes de cada organismo foram escolhidos, enquanto dois genes de Varicela zoster foram escolhidos. O gene de DNA polimerase do vírus do Herpes é um gene que confere sensibilidade à PCR e foi usado em diferentes estudos. No primeiro 20 estudo, o produto de 179 bp foi amplificado utilizando condições de ciclo térmico de desnaturação a 95oC por 45 segundos, recozimento a 45oC por 45 segundos e extensão a 72oC por 45 segundos. Madhavan HN et al, De- tection of herpes simplex virus (HSV) using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with standard laboratory methods for 25 the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999). Em outro estudo, a região 469 e 391 bp do mesmo gene foi amplificada utilizando um grupo de iniciadores diferentes e condições de ciclo térmico de desnaturação de 95oC por 45 segundos, recozimento a 60oC por 45 segundos e extensão a 72 oC por 45 segundos. Madhavan HN et al, Phenotypic and Genotypic methods 30 for the detection of herpes simplex virus serotypes. J. Virol. Methods, 108: 97-102. (2003). Durante a detecção de vírus diferentes, condições térmicas diferentes são usadas, como no caso de PCR para HSV e CMV e VZV para identificação de infecções oculares.
Priya K et al, Association of herpes viru- ses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditis: a polymera- se chain reaction based study, Ocular Immunology and Inflammation 9:1-9 (2003). Nesse estudo, as condições reacionais e as concentrações dos inici- 5 adores foram diferentes para vírus diferentes.
É, portanto, óbvio que é difícil projetar iniciadores e as sequências alvo específicas para um grupo de pa- tógenos conhecidos de modo a se conseguir realizar uma reação PCR mul- tiplex em um único tubo capaz de rapidamente detectar e discriminar um ou mais patógenos na amostra clínica dada. 10 Assim, foi considerado necessário explorar a possibilidade de projetar iniciadores de PCR adequados e sequências de DNA alvo, adequa- das, que são complementares ao produto da amplificação PCR usando mé- todos bioinformáticos conhecidos.
Para se atingir este objetivo, os inventores primeiramente esta- 15 beleceram as seguintes condições, que foram preferidas para a realização de reações PCR multiplex para a detecção de HSV, CMV e VZV, isto é, des- naturação a 95oC, seguido por recozimento a 58oC a 65oC, seguido por ex- tensão a 72oC.
A temperatura ótima de hibridização do produto amplificado PCR assim obtido da sequência DNA alvo específica para cada patógeno 20 imobilizado em uma matriz de fase sólida foi fixada entre 48 oC e 55oC.
As- sim, considerou-se necessário projetar um grupo de sequências de DNA al- vo para cada patógeno em questão, de modo que o produto amplificado por PCR específica é hibridizado em sua sequência de DNA alvo complementar em uma temperatura uniforme sem resultar em ligamento não específico de 25 sequências de DNA.
O elemento mais difícil no desenho dos iniciadores para uma reação PCR multiplex é desenhar os iniciadores de modo que todos eles possuam as mesmas temperaturas de fusão, para permitir amplificação de todos os genes sob as mesmas condições de ciclo térmico. 30 Os grupos de iniciadores para amplificação foram escolhidos das sequências de gene supramencionadas de tal modo que todos os iniciadores tivessem temperatura de recozimento na faixa de 58 oC a 65oC, para que to-
dos os 23 genes pudessem ser amplificados usando PCR no mesmo tubo e estivessem presentes invariavelmente em todas as cepas ou sorotipos do patógeno específico em questão.
Amplicons de tamanhos diferentes podem interferir na eficácia 5 da amplificação multiplex pelo método PCR.
Assim, o segundo critério para escolha dos iniciadores foi o tamanho uniforme dos amplicons em uma faixa que ia de 66 a 90 nucleotídeos.
Todos os genes mencionados na seção acima foram selecionados para uma região contendo de 66 a 90 bp de com- primento (incluindo-se as sequências de iniciadores). 10 Para que a temperatura de fusão fosse mantida uniforme, os comprimentos dos iniciadores foram variados entre 17 e 29 pares base.
Ademais, em uma reação multiplex, a formação de laços nos iniciadores ou hibridização cruzada, devido à presença de regiões comple- mentares, também pode interferir com a própria amplificação por PCR.
Para 15 evitar tais complicações, todos os iniciadores foram cuidadosamente proje- tados para eliminar completamente a formação de laços ou hibridização cru- zada dos iniciadores entre eles mesmos.
Tomou-se cuidado para que se evitasse qualquer amplificação cruzada não específica pelos grupos de inici- adores, ou seja, os iniciadores de um organismo / genes não deverão reagir 20 com genes de qualquer outro organismo / genes na mistura reacional.
Todos os iniciadores foram projetados de modo que eles se combinassem com todas as bases de nucleotídeos do gene do patógeno em geral.
Entretanto, se há um desencontro em algumas das cepas ou espécies como no caso de iniciadores projetados para amplificar bactérias Gram- 25 positivas, Gram-negativas e fungos, o desencontro é limitado a um máximo de dois nucleotídeos no meio do iniciador.
Garantiu-se que a extremidade 3' de cada iniciador tivesse sempre uma combinação perfeita com todas as cepas das espécies que estavam sendo diagnosticadas.
Os critérios descritos acima, são além dos critérios padrão des- 30 critos na técnica, para selecionar as sequências de iniciadores mencionados em detalhes e aqui revelados a título de referência.
Molecular cloning: A la- boratory manual, Vol. 2, Sambrook.
J, Russell DW (Eds) Cold Spring Harbor
Laboratory Press NY (2001). Esses critérios sendo a extremidade 3' que é G ou C, evitando-se repetições GC tandem e não se terminando qualquer inici- ador com T, etc. Após o desenho, os iniciadores foram utilizados individualmente 5 e em formato multiplex para verificar a sensibilidade e a especificidade usando sequências (genes) de DNA padrão de todos os patógenos listados. Sempre que a sensibilidade for menor que o relatado na técnica, a saber, Madhavan HN, et al, Detection of herpes simplex virus (HSV) using polyme- rase chain reaction (PCR) in clinical samples Comparison of PCR with stan- 10 dard laboratory methods for the detection of HSV, J. Clin. Virol. 14:145-151 (1999); Malathi. Jet al. A hospital based study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis Ind. J. Medical research, 117:71-75 (2003); Anand ARet al Use of polymerase chain reaction (PCR) and DNA probe hybri- dization to determine the gram reaction of the interacting bacterium in the 15 intraocular fluids of patients with endophthalmitis. Journal of Infection, 41:221-226 (2000); Anand AR et al. Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitis Ophthalmology 108: 326-330 (2001) ao se reconhe- cer umas poucas partículas virais ou organismos, um grupo diferente de ini- ciadores foi selecionado usando o mesmo critério. Ainda que alguns dos ini- 20 ciadores sofram recozimento a 58oC, garantiu-se experimentalmente que todos os iniciadores tivessem boa amplificação a 60oC. Na presente modalidade, após uma avaliação cuidadosa, os se- guintes iniciadores únicos foram selecionados e utilizados para a detecção e discriminação dos patógenos. Essas sequências são únicas e desconheci- 25 das de técnica.
1. Gene da glicoproteína D do vírus do herpes simples 1 & 2 amplificado pelo grupo de primers 1 compreendendo SEQ ID No 1 e 2 FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (SEQ ID No.l) & RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (SEQ ID No.2) 30 2. Gene UL 44 do vírus do herpes simples 1 & 2 amplificado pelo grupo de iniciadores 2 compreendendo SEQ ID No 3 e 4 FP: 5' ggcaatcgtg- tacgtcgtccg 3' (SEQ ID No.3) & RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (SEQ ID No.4)
3. Gene da DNA polimerase do vírus do herpes simples 1 & 2 DNA amplificado pelo grupo de iniciadores 3 compreendendo SEQ ID No 5 e 6 FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5) & RP: 5' gtcccacacg- cgaaacacg 3'(SEQ ID No.6) 5 4. Gene da glicoproteína O de citomegalovírus amplificado pelo grupo de iniciadores 4 compreendendo SEQ ID No 7 e 8 FP: 5' ttccggct- catggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7) & RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8)
5. Gene de transformação morfológica de citomegalovírus ampli- 10 ficado pelo grupo de iniciadores 5 compreendendo SEQ ID No 9 e 10 FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9) & RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10)
6. Gene UL 8 do citomegalovírus amplificado pelo grupo de inici- adores 6 compreendendo SEQ ID No 11 e 12 FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 15 3'(SEQ ID No.l 1) & RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'(SEQ ID No.12)
7. Varicela zoster ORF 29 amplificado pelo grupo de iniciadores 7 compreendendo SEQ ID No 13 e 14 FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13) & RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID No.l4)
8. Gene da DNA polimerase de Varicela zoster amplificado pelo 20 grupo de iniciadores 8 compreendendo SEQ ID No 15 e 16 FP: 5' tccatt- taacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15) & RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID No.16)
9. Gene Hexon do Adenovírus amplificado pelo grupo de inicia- dores 9 compreendendo SEQ ID No 17 e 18 FP: 5' cgccgccaacatgctctacc 25 3'(SEQ ID No.17) & RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)
10. Região I do gene de RNA ribossômico de eubactéria 16 ampli- ficad pelo grupo de iniciadores 10 compreendendo SEQ ID No 19 e 20 FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (SEQ ID No.19) & RP: 5' cggactacgatcggttttg- tgaga 3'(SEQ ID No.20). 30 11. Região II do gene do RNA ribossômico de eubactéria 16 am- plificado pelo grupo de iniciadores 11 compreendendo SEQ ID No 21 e 22 FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID No.21) & RP: 5' ggcagattcctagg-
cattactcacc 3(SEQ ID No.22)
12. Porção específica bacteriana Gram + ve do gene do RNA ribossômico 16 amplificado pelo grupo de iniciadores 12 compreendendo SEQ ID No 23 e 24 FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23) & RP: 5 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24)
13. Gene MPB 64 de Mycobacterium tuberculosis amplificado pelo grupo de iniciadores 13 compreendendo SEQ ID No 25 e 26 FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25) & RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3'(SEQ ID No.26) 10 14. Gene de RNA 16 a 23 de Mycobacterium fortuitum amplifica- do pelo grupo de iniciadores 14 compreendendo SEQ ID No 27 e 28 FP: 5' aacrtttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27) & RP: 5' ggatgccac- cccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)
15. Gene de RNA 16 a 23 de Mycobacterium chelonae amplifi- 15 cado pelo grupo de iniciadores 15 compreendendo SEQ ID No 29 e 30 FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29) & RP: 5' gacgtrttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30)
16. Gene B 1 de Toxoplasma gondii amplificado pelo grupo de iniciadores 17 compreendendo SEQ ID No 31 e 32 FP: 5' cccctctgctgg- 20 cgaaaagtg 3' (SEQ ID No.31) & RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32)
17. Proteína II polimórfica de Chlamydia trachomatis amplificada pelo grupo de iniciadores 18 compreendendo SEQ ID No 33 e 34 FP:5' aa- tcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33) & RP:5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' 25 (SEQ ID No.34)
18. Porção específica fungíca do gene de RNA ribossômico 28s amplificado pelo grupo de iniciadores 19 compreendendo SEQ ID No 35 e 36 FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35) & RP: 5' ttcaagacgggcggca- tataac 3(SEQ ID No.36) 30 19. Porção específica de Propionibacterium acnes de o gene de RNA ribossômico 16s a 23s amplificado pelo grupo de iniciadores 20 com- preendendo SEQ ID No 37 e 38 FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (SEQ ID
No.37) & RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (SEQ ID No.38)
20. Parte específica de bactérias Gram -ve do gene B gyr ampli- ficado pelo grupo de iniciadores 21 compreendendo SEQ ID No 39 e 40 FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (SEQ ID No.39) & RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' 5 (SEQ ID No.40)
21. Gene de aconitato hidratase aconitato de bactérias Gram -ve amplificado pelo grupo de iniciadores 22 compreendendo SEQ ID No 41 e 42 FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (SEQ ID No.41) & RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID No.42) 10 22. Gene de ribonuclease 1 Gram - ve amplificado pelo grupo de iniciadores 23 compreendendo SEQ ID No 43 e 44 FP: 5' gccgccctgaccac- cttc 3' (SEQ ID No.43) & RP: 5<?> gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID No.44) Em outra modalidade desta invenção as sequências de sonda com SEQ ID NOs: 45-67 foram obtidas por programas de computador utili- 15 zados para projetar os iniciadores para identificação dos segmentos de gene específicos que são únicos para os patógenos mencionados. As sequências de sonda variam em comprimento de 66 a 90 nucleotídeos. As sondas não formam grampos entre elas mesmas. Elas não possuem homologia em rela- ção a outros amplicons. As sondas podem ser amplificadas a partir de qual- 20 quer das cepas do DNA do patógeno. As sequências de sonda são detalhadas a seguir:
1. Sequência de DNA sonda "cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaa- tgctcctacaacaagtctctggg ggc" (SEQ ID No. 45) do gene de glicoproteína D do 25 vírus do herpes simples 1 & 2 (amplificado pelo grupo de iniciadores 1 com- preendendo FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (SEQ ID No.l) & RP: 5' gccccca- gagacttgttgtagg 3' (SEQ ID No.2))
2. Sequência de DNA de sonda "ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaaga- 30 cccccccg" (SEQ ID No. 46) do gene UL 44 do vírus do herpes simples 1 & 2 UL (amplificado pelo grupo de iniciadores 2 compreendendo FP: 5' ggcaa- tcgtgtacgtcgtccg 3' (SEQ ID No.3) & RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (SEQ ID
No.4)
3. Sequência de DNA de sonda "caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcg- tgtttcgcgtgtgggac" (SEQ ID No. 47) do gene de DNA polimerase do vírus do 5 herpes simples 1 & 2 (amplificado pelo grupo de iniciadores 3 compreenden- do FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5) & RP: 5' gtcccacacg- cgaaacacg 3'(SEQ ID No.6))
4. Sequência de DNA de sonda "ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacg- 10 taaaag[sigma]agggcg" (SEQ ID No. 48) do gene de glicoproteína O de cito- megalovírus (amplificado pelo grupo de iniciadores 4 compreendendo FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID No.7) & RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID No.8))
5. Sequência de DNA de sonda 15 "cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg" (SEQ ID No.49) do gene da região II de transformação morfológica de cito- megalovírus amplificado pelo grupo de iniciadores 5 compreendendo FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID No.9) & RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.10) 20 6. Sequência de DNA de sonda "gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg" (SEQ ID No.50) do gene UL 88 de citomegalovírus (amplificado pelo grupo de iniciadores 6 compreendendo FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.l 1) & RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3'(SEQ ID No.12)) 25 7. Sequência de DNA de sonda "ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctg- tctttgtctttcacggaggca'' (SEQ ID No. 51) de Varicela zoster ORF 29 (amplifi- cado pelo grupo de iniciadores 7 compreendendo FP: 5' ggtcttgccggagctgg- tattac 3'(SEQ ID No.13) & RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID 30 No.14))
8. Sequência de DNA de sonda "tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata-
cagataactcgctaccggaacgt" (SEQ ID No. 52) do gene de DNA polimerase de Varicela zoster (amplificado pelo grupo de iniciadores 8 compreendendo FP: 5' tccatttaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15) & RP: 5' acgttccggtagcgagtta- tctg 3'(SEQ ID No.16)) 5 9. Sequência de DNA de sonda "cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccata- tccatcccctcccgcaac" (SEQ ID No. 53) do gene hexon de adenovírus (amplifi- cado pelo grupo de iniciadores 9 compreendendo FP: 5' cgccgccaacatgctc- tacc 3'(SEQ ID No.17) & RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID No.18)) 10 10. Sequência de DNA de sonda "tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa- tctcacaaaaccgatcgtagtccg" (SEQ ID No. 54) da região do gene de RNA ri- bossômico de eubactéria 16 I (amplificado pelo grupo de iniciadores 10 compreendendo FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (SEQ ID No.19) & RP: 5' 15 cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID No.20))
11. Sequência de DNA de sonda "ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcgga- cgggtgagtaatgcctaggaat ctgcc" (SEQ ID No. 55) da região do gene de RNA ribossômico de eubactéria 16 II (amplificado pelo grupo de iniciadores 11 20 compreendendo FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3 (SEQ ID No.21) & RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22))
12. Sequência de DNA de sonda "acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggta- caaagggctgca" (SEQ ID No. 56) da porção específica de bactéria Gram + ve 25 do gene de RNA ribossômico 16 (amplificado pelo grupo de iniciadores 12 compreendendo FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID No.23) & RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID No.24))
13. Sequência de DNA de sonda "gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccggg- 30 ttgaagaagaaaatcacccc gtcg" (SEQ ID No. 57) do gene MPB 64 de Mycobac- terium tuberculosis (amplificado pelo grupo de iniciadores 13 compreenden- do FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25) & RP: 5' cgacggggtgatttt-
cttcttc 3'(SEQ ID No.26))
14. Sequência de DNA de sonda "aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtg- ccccttttggggggtggcatcc" (SEQ ID No. 58) do gene de RNA 16s a 23s de 5 Mycobacterium fortuitum (amplificado pelo grupo de iniciadores 14 compre- endendo FP: 5' aacttttttgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID No.27) & RP: 5' gga- tgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28))
5. Sequência de DNA de sonda "tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc" 10 (SEQ ID No. 59) do gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium chelonae (amplificado pelo grupo de iniciadores 15 compreendendo FP: 5' tggttactcg- cttggtgaatatgt 3'(SEQ ID No.29) & RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30))
16. Sequência de DNA de sonda 15 "cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc" (SEQ ID No. 60) do gene B 1 de Toxoplasma gondii (amplificado pelo grupo de iniciadores 16 compreendendo FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (SEQ ID No.31) & RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32))
17. Sequência de DNA de sonda 20 "aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttct- catacggttttcctcga" (SEQ ID No. 61) da proteína II polimórfica de Chlamydia trachomatis (amplificada pelo grupo de iniciadores 17 compreendendo FP:5' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3'(SEQ ID No.33) & RP:5' tcgaggaaaaccgta- tgagaaac 3' (SEQ ID No.34)) 25 18. Sequência de DNA de sonda "gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa" (SEQ ID No. 62) da porção específica fúngica do gene de RNA ribossômico 28 (amplificado pelo grupo de iniciadores 18 compreendendo FP: 5' gctgg- gactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35) & RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 30 3(SEQ ID No.36))
19. Sequência de DNA de sonda "tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaac-
tggggctaataccgg" (SEQ ID No. 63) da porção específica de Propionibacte- rium acnes do gene de RNA ribossômico 16s a 23s (amplificado pelo grupo de iniciadores 19 compreendendo FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (SEQ ID No.37) & RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (SEQ ID No.38)) 5 20. Sequência de DNA de sonda "cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg" (SEQ ID No. 64) da parte específica de bactérias gram -ve do gene B gyr (amplificado pelo grupo de primers 20 compreendendo FP: 5' cggcggcaagtt- cgacgac 3' (SEQ ID No.39) & RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (SEQ ID 10 No.40))
21. Sequência de DNA de sonda "ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg" (SEQ ID No. 65) do gene de aconitato hidratase de bactérias Gram -ve (am- plificado pelo grupo de iniciadores 21 compreendendo FP: 5' ccaggtcggcg- 15 gagaagc 3' (SEQ ID No.41) & RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID No.42))
22. Sequência de DNA de sonda "gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc" (SEQ ID No. 66) de ribonuclease 1 de Gram - ve (gene amplificado pelo gru- po de primers 22 compreendendo FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (SEQ ID 20 No.43) & RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID No.44)) Parece ser repetição Em outra modalidade desta invenção, sequências alvo com SEQ ID Nos 67 a 88 foram geradas a partir das sequências de sonda utilizando- se programas de computador. Esses alvos foram utilizados para imobiliza- 25 ção nas matrizes inertes como náilon e reticulada através de radiação UV ou fixação química. Os alvos foram escolhidos de acordo com os seguintes cri- térios:
1. Todas as sequências alvo são específicas do patógeno e não se sobrepõem a qualquer outra sequência de outro patógeno 30 2. Todas as sequências alvo estão na faixa de tamanho que vai de 23 a 28 bases de comprimento.
3. Todas os alvos têm temperaturas de fusão uniformes na faixa que vai de 58,9oC a 88oC.
4. As sequências alvo residem na região de amplicons e não contêm sequências de avanço ou reversas, de modo que sondas marcadas (com as SEQ ID Nos 67 a 91) não se ligam não especificamente a tais alvos. 5 5. Todos os alvos são desenhados de tal forma que eles se combinam com todas as bases de nucleotídeos, em geral. Entretanto, se há um desencontro em algumas sondas, o desencontro é limitado a um máximo de dois nucleotídeos no meio da sonda, de modo a garantir a hibridização. As sequências alvo são descritas em detalhes a seguir: 10 1. 5'gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3' (SEQ ID No. 67) o alvo para a glicoproteína D de HSV amplificada pelo grupo de ini- ciadores 1
2. 5'cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3' (SEQ ID No. 68) o alvo para HSV UL 44 amplificado pelo grupo de iniciadores 2 15 3. 5'tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3' (SEQ ID No. 69) o alvo para o gene de HSV polimerase amplificado pelo grupo de inicia- dores 3
4. 5'aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3'(SEQ ID No. 70) o alvo para glicoproteína O de CMV amplificada pelo grupo de iniciadores 4 20 5. 5'aatacaaagccgcagtgtcgtc 3'(SEQ ID No. 71) o alvo para o gene II de transformação morfológica de citomegalovírus amplificado pelo grupo de iniciadores 5
6. 5'gactccaggtacaccttgacgtactg 3'(SEQ ID No. 72) o alvo para o gene UL 88 de citomegalovírus amplificado pelo grupo de iniciadores 6 25 7. 5'cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3'(SEQ ID No. 73) o alvo para o gene ORF 29 do vírus de Varicela zoster amplificado pelo grupo de iniciadores 7
8. 5'ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3'(SEQ ID No. 74) o alvo para o gene de polimerase de DNA do vírus de Varicela zoster amplifi- 30 cado pelo grupo de iniciadores 8
9. 5' ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3'(SEQ ID No. 75) o alvo para o gene hexon de adenovírus amplificado pelo grupo de iniciadores 9
10. 5'tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3'(SEQ ID No. 76) o alvo para a região I do gene ribossômico 16 de eubactéria I amplificado pelo grupo de iniciadores 10
11. 5'ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3'(SEQ ID No. 5 77) o alvo para a região II do gene ribossômico 16 de eubactéria amplificado pelo grupo de iniciadores 11
12. 5' gacctgggctacacacgtgctaca 3'(SEQ ID No. 78) o alvo para o gene ribossômico 16 de organismos gram-positivos amplificado pelo grupo de iniciadores 12 10 13. 5'ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3'(SEQ ID No. 79) o alvo para o gene MPB 64 de Mycobacterium tuberculosis amplifi- cado pelo grupo de iniciadores 13
14. 5' ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3'(SEQ ID No. 80) o alvo pa- ra o gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium fortuitum amplificado pelo 15 grupo de iniciadores 14
15. 5' tttataaatcctgtccaccccgt 3'(SEQ ID No. 81) o alvo para o gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium chelonae amplificado pelo grupo de iniciadores 15
16. 5' aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3'(SEQ ID No. 82) o alvo para 20 o gene Bl de Toxoplasma gondii amplificado pelo grupo de iniciadores 16
17. 5' atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3'(SEQ ID No. 83) o alvo para a proteína II polimórfica de Chlamydia trachomatis amplificada pelo grupo de iniciadores 17
18. 5' gtaagtcaaggatgctggcataatg 3'(SEQ ID No. 84) o alvo para 25 o gene de RNA ribossômico 28 de todos os fungos amplificados pelo grupo de iniciadores 18
19. 5' gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3'(SEQ ID No. 85) o alvo pa- ra o gene de RNA ribossômico 16 de Propionibacterium acnes amplificado pelo grupo de iniciadores 19 30 20. 5' aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3'(SEQ ID No. 86) o alvo para o gene de girase de organismos Gram -ve amplificado pelo grupo de iniciadores 20
21. 5' cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3'(SEQ ID No. 87) o al- vo para o gene de aconitato hidratase de organismos Gram -ve amplificado pelo grupo de iniciadores 21
22. 5' atcagcctggccggccgttacctggtg 3'(SEQ ID No. 88) o alvo pa- 5 ra o gene de ribonuclease de organismos Gram -ve amplificado pelo grupo de iniciadores 22 Esses oligonucleotídeos relatados acima e usados para imobili- zação em matriz inerte foram confirmados (por análise de sequências) usan- do-se produtos gerados a partir de DNA padrão bem como amostras clíni- 10 cas. Estas sequências são únicas e não são conhecidas nem descritas para PCR multiplex ou uniplex. Em outra modalidade da presente invenção, um ensaio PCR é proporcionado usando todos ou uns poucos grupos de iniciadores conforme mencionado acima, em que todos os iniciadores podem ser utilizados juntos 15 em um único tubo usando-se condições de ciclo térmico uniformes, compre- endendo uma etapa de desnaturação de 94 oC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60oC – 64oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC, seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC. Em outra modalidade, o grupo de iniciadores é marcado na ex- 20 tremidade 5' usando a fração de biotina, que permite a detecção do produto colorido. Em ainda outra modalidade, tais iniciadores são marcados por marcadores fluorescentes como marcadores fluorescentes orgânicos, por exemplo, isotiocionato FITC fluorescente ou nanopartículas fluorescentes 25 inorgânicas como Quantum Dots® ou Cy3 ou Cy5, permitindo a detecção por qualquer dispositivo de monitoramento por fluorescência ou por micros- copia. Em outra modalidade, a invenção proprciona o uso de tal grupo de iniciadores e sondas, em que o ensaio é uma PCR em tempo real para a 30 detecção dos patógenos. Em outra modalidade, a presente invenção fornece o uso de tal grupo de iniciadores e sondas, em que o ensaio é uma PCR em tempo real para a quantificação do patógeno em uma amostra clínica para prognóstico ou terapia da doença.
Em outra modalidade, a presente invenção proporciona o uso de tal grupo de iniciadores, em que a detecção do produto amplificado pode 5 estar na forma de ensaio de macroarranjo ou slot blot ou sonda em linha.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um macroarranjo que consiste em tais sondas fixadas a uma fase sólida que compreende nitrocelulose, náilon, náilon carregado, vidro ou poliestireno.
Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um mé- 10 todo para a detecção e discriminação de patógenos que causam síndromes como meningite ou retinite ou uveíte ou ceratite ou endoftalmite infecciosa, em que os patógenos a serem detectados são os vírus do herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, vírus de Varicela zoster, adenovírus, eubactérias, or- ganismos Gram-positivos, bactérias Gram-negativas, fungos, Mycobacterium 15 tuberculosis, Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum, Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a detecção de um patógeno individual dentre um grupo de prováveis patógenos que causam doenças oculares ou do sistema nervoso 20 com manifestações similares.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona qualquer ensaio PCR multiplex usando uns poucos ou todos os iniciadores mencionados anteriormente, em que qualquer síndrome clínica causada por uns poucos ou por todos os organismos está sendo investigada para a de- 25 tecção de qualquer patógeno individual ou grupos de patógeno presentes no espécime clínico.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a detecção simultânea de todos os patógenos que causam infecção ocular externa, endoftalmite ou uveíte ou retinite ou meningoencefa- 30 lite, compreendendo: [a] obter uma amostra clínica de um paciente que sofre de tais infecções;
[b] extrair DNA de uma parte ou do total da amostra obtida na etapa [a]; [c] conduzir PCR multiplex para o DNA obtido na reivindicação [b], usando uma reunião de iniciadores conforme reivindicado na reivindica- 5 ção 1, marcado com marcadores fluorescentes ou biotina e reagentes pa- drão de PCR; [d] desnaturar o produto de PCR obtido na etapa [c]; [e] hibridizar os produtos de PCR obtidos na etapa [d] com os alvos imobilizados em uma matriz sólida; 10 [f] detectar os híbridos de DNA na matriz sólida obtida na etapa [e] por métodos enzimáticos ou fluorescentes Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um kit para a detecção simultânea de todos os patógenos que causam infecção ocular externa, endoftalmite ou uveíte ou retinite ou meningoencefalite, com- 15 preendendo: a) um grupo de iniciadores de avanço e reversos conforme men- cionado anteriormente; b) uma matriz de alvos de DNA conforme mencionado anterior- mente imobilizada em um suporte sólido adequado; 20 c) reagentes padrão necessários para a amplificação do DNA por reação em cadeia de polimerase; d) reagentes padrão necessários para hibridizar os produtos amplificados por PCR à matriz imobilizada de sondas de DNA; e) reagentes padrão necessários para detectar os produtos hi- 25 bridizados finais para a detecção e discriminação de o(s) patógeno(s) cau- sador(es) específico(s). Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para a detecção simultânea de todos os patógenos causadores de infecção ocular externa, endoftalmite ou uveíte ou retinite ou meningoencefalite, com- 30 preendendo: [a] obter uma amostra clínica de um paciente que sofre de tais infecções;
[b] extrair DNA de uma parte ou do total da amostra obtida na etapa [a]; [c] conduzir PCR multiplex para o DNA obtido na reivindicação [b], usando um grupo de iniciadores conforme referido acima, marcado com 5 marcadores fluorescentes ou biotina e reagentes padrão de PCR; [d] desnaturar o produto PCR obtido na etapa [c]; [e] hibridizar os produtos de PCR obtidos na etapa [d] com os alvos imobilizados em uma 3 matriz sólida; [f] detectar híbridos de DNA na matriz sólida obtida na etapa [e] 10 por métodos enzimáticos ou fluorescentes.
EXEMPLOS Os exemplos a seguir são dados a título de ilustração da presen- te invenção e, assim, não têm por intenção limitar o escopo da presente in- venção. 15 EXEMPLO 1: Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 9 e 18, que podem amplificar o gene hexon de adenovírus e gene II de proteí- na polimórfica de Chlamydia trachomatis, respectivamente. A mistura para PCR continha 10 a 20 pmols de cada um dos iniciadores de avanço e rever- 20 sos, 200μM de cada d-ATP, d-UTP, d-CTP e d-GTP, 2 unidades de Taq po- limerase em 10mM de Tris-HCl pH 9,0, 1,5mM de MgCl2, 5mM de KCl, gela- tina a 0,01% , 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosilase UDP para prevenir a contaminação do amplicon. As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de qualquer amplicon contaminante, 2 25 minutos a 50oC, uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC. O produto foi analisado por gel de agarose a 6%. Como pode ser visto na Figura 1 ambos os genes foram amplificados. DNA padrão de 1 pg de adenovírus e 10 fg de 30 DNA de clamídia foram utilizados para a amplificação. Figura 1: Eletroforetograma em gel de agarose a 6% mostrando os produtos amplificados de PCR uniplex e multiplex para o gene hexon de adenovírus & genoma de C. trachomatis
Faixas: NC- Controle negativo 1- Controle positivo - Adenovírus 5 2 - Controle positivo - C. trachomatis 3 - Controle positivo - PCR multiplex (adenovírus & C. trachomatis) p.m. - 100 bp de graduação de DNA EXEMPLO 2: Uma PCR multiplex foi realizada com grupos de iniciadores 1, 2 10 e 3, que podem amplificar os genes UL 44 de polimerase de DNA, e glico- proteína D respectivamente.
A mistura para PCR continha 10 pmols cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200 μM de cada um de d-ATP, d-UTP, d-CTP e d- GTP, 2 unidades de Taq polimerase em 10mM de Tris-HCl pH 7,5, 1,5mM de MgCl2, 5mM de KCl, gelatina a 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unidade de 15 glicosilase UDP para prevenir a contaminação do amplicon.
As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer contaminantes de amplicon, 2 minutos a 50oC de uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de 20 extensão da reação a 72oC.
O produto foi analisado por gel de agarose a 6%. Como pode ser visto na figura 2 todos os três genes foram amplificados Figura 2. Eletroforetograma em gel de agarose a 4% mostrando os produtos amplificados de glicoproteína D, DNA polimerase e regiões UL -44 do vírus do herpes simples (HSV)
Faixas: NC - Controle negativo 1- Região de glicoproteína D de controle positivo 5 2- Região de DNA de polimerase de controle positivo 3- Controle positivo região UL 44 100 bp de graduação EXEMPLO 3 Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 1, 10 2, 3, 9 e 17 que podem amplificar o gene de glicoproteína D, gene UL 44 e gene de DNA polimerase de HSV, gene hexon de adenovírus e gene de pro- teína II polimórfica de Chlamydia trachomatis, respectivamente.
A mistura para PCR continha 10 pmols cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200μM de cada uma de d-ATP, d-UTP, d-CTP e d-GTP, 2 unidades de Taq 15 polimerase em 10mM de Tris-HCl pH 9,0, 1,5 mM de MgCl2, 5mM de KCl, gelatina a 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosilase UDO para pre- venir a contaminação do amplicon.
As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de qualquer contaminante de amplicon, 2 minutos a 50oC e uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 mi- 20 nutos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60 oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC.
Cinco tubos da mistura para PCR mencionada acima foram incubados com as seguintes preparações de DNA, em que o tubo NC não recebeu nenhum DNA, o tubo 1 recebeu 1 picograma de DNA de HSV, o tubo 2 recebeu 4 25 fentogramas de C.
Trachomatis, o tubo 3 recebeu 10 picogramas de DNA adenoviral e o tubo 4 recebeu todos os três DNAs nas quantidades mencio- nadas.
O produto foi analisado por gel de agarose a 6%. Como pode ser vis-
to na figura 3 todos os genes foram amplificados.
Figura 3. Eletroforetograma em gel de agarose a 6% mostrando os produtos amplificados de PCR multiplex para infecções oculares externas
5 Faixas: NC – Controle negativo 1- Controle positivo (HSV) 2- Controle positivo (C. trachomatis) 3- Controle positivo (adenovírus) 10 4- Controle positivo (Todos os três genomas) p.m. – Digestão Hinf I de membranas de náilon ΦX 174 DNA, cada uma marcada com 100 pmols de alvos com SEQ ID Nos. 67, 68, 69, 75 e 83 em 0,26 N NaOH (Figura 4). A membrana foi então bloqueada utilizan- do-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1% de BSA por uma hora a 15 37oC.
Os amplicons foram aquecidos até 95oC por 10 minutos e misturados em 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizados por 2 horas a 52oC.
Após a hibridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez em 1X de SSPE contendo 0,1% de SDS.
A membrana foi incubada com um conjugado de estreptavidina peroxidase em 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 con- 20 tendo 1% de BSA, 150mM de NaCl e 0,3% de Tween-20. Após 30 minutos a 37oC, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez, com o mesmo tampão.
Para a revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 minutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminobenzidina HCl por mL de sal tampo- nado de fosfato.
A aparição de pontos marrons indica a presença do patóge- 25 no específico.
Figura 4. Fotografia do macroarranjo encontrado nas membranas de náilon hibridizadas com amplicons de PCR multiplex para a identificação de infec- ções oculares externas identificando especificamente os genomas de HSV,
C. trachomatis, Adenovírus
Disposições de DNA (Esquerda para direita): Modelo da colora- ção da sonda de DNA em membranas de náilon.
HSV – Vírus do Herpes 5 Simples mostrando pontos marcados como HGD = glicoproteína D de HSV; HDP = polimerase de DNA de HSV; HUL = gene UL 44; 1o Comp.= sonda de cepa complementar de HGD, CT - C. trachomatis AV - adenovírus.
NC- Contro- le negativo, HSV- membrana hibridizada com amplicon do tubo 1. CT- Mem- brana hibridizada com amplicon do tubo 2; AV- membrana hibridizada com 10 amplicon do tubo 3 Exemplo 4: Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 13,14,15 e 16 que podem amplificar o gene MPB 64 de Mycobacterium tu- berculosis,o gene de RNA 16s - 23s de Mycobacterium fortuitum, gene de 15 RNA 16s -23 de Mycobacterium chelonae e gene B1 de Toxoplasma gondii.
A mistura para PCR continha 10 pmols cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200μM de cada uma de d-ATP, d-UTP, d-CTP e d-GTP, 2 unida- des de Taq polimerase em 50mM de Tris-HCl pH 9,0, 1,5mM de MgCl2, 5mM de KCl, gelatina a 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosilase UDP 20 para prevenir a contaminação do amplicon.
As condições do ciclo são incu- bação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer conta- minantes de amplicon, 2 minutos a 50oC e uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 45 segundos a 60 oC, 45 se- gundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão 25 da reação a 72oC.
Cinco tubos da mistura PCR mencionada acima foram incubados com as seguintes preparações de DNA em que o tubo NC não recebeu nenhum DNA, o tubo 1 recebeu 1 fentograma de DNA de M. tuber- culosis, o tubo 2 recebeu 100 fentogramas de DNA de M.
Fortuitum, o tubo 3 recebeu 100 fentogramas de DNA de M.chelonae, o tubo 4 recebeu l fento-
grama de DNA de Toxoplasma gondii.
A Fig 5 mostra cinco membranas de náilon cada uma marcada com 100pmols de alvos com SEQ ID No 79, 80, 81 e 82 em 0,26N de NaOH.
A membrana foi então bloqueada utilizando-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1% de BSA por uma hora a 37 oC.
Os 5 amplicons foram aquecidos até 95oC por 10 minutos e misturados em um mL de 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizados por 2 horas a 52oC.
Após a hibridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez em IX SSPE contendo 0,1% SDS.
A membrana foi incubada com um conjugado de estreptavidina peroxidase em 0,1M de Tris-HCl pH 7,4 conten- 10 do 1% de BSA, 150mM de NaCl e 0,3% de Tween-20. Após 30 minutos a 37oC, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez com o mesmo tampão.
Para revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 mi- nutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminobenzidina HCl por mL de sal tampona- do de fosfato.
A aparição de pontos marrons indica a presença do patógeno 15 específico.
Figura 5: Fotografia da macroarranjo encontrada em membranas de náilon hibridizadas com amplicons de PCR multiplex para detecção de uveíte e ou- tras infecções micobacterianas suspeitas, identificando especificamente os genomas de X gondii, M. tuberculosis M. fortuitum e M. chelonae
20 Da esquerda para direita, primeiramente está o modelo mos- trando como os alvos foram encontrados na membrana.
MBT - M. tuberculo- sis MBF - M. fortuitum MBC - M.
Chelonae TG - T. gondii.
A seguir está o NC hibridizado com o tubo de controle negativo rotulado como NC.
As membra- 25 nas de náilon hibridizadas com amplicons obtidas dos tubos 1, 2, 3 e 4 foram rotuladas MBT, MBF, MBC e TG, respectivamente.
EXEMPLO 5 Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 1,2,3,4,5,6,7 e 8 que podem amplificar o gene da glicoproteína D, o gene UL 44 e os genes de DNA polimerase de HSV, gene de glicoproteína O, genes 5 de transformação morfológica e UL 88 de CMV e gene ORF29 e gene de DNA polimerase de DNA de VZV respectivamente.
A mistura para PCR con- tinha 10 pmols de cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200μM de cada uma de d-ATP, d-UTP, d-CTP e d-GTP, 2 unidades de Taq polimerase em 10mM de Tris-HCl pH 9,0, 1,5mM de MgCl2, 5mM de KCl, gelatina a 10 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosilase UDP para prevenir a con- taminação do amplicon.
As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer contaminantes de amplicon, 2 minutos a 50oC e uma etapa de desnaturação a 94 oC por 5 minutos, se- guida por 40 ciclos de 45 segundos a 60 oC, 45 segundos a 72oC e 45 se- 15 gundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC.
Quatro tubos da mistura PCR mencionada acima foram incuba- dos com as seguintes preparações de DNA em que o tubo NC não recebeu nenhum DNA, o tubo 1 recebeu 1 picograma de DNA de HSV.
O tubo 2 re- cebeu 10 picogramas de DNA de CMV e o tubo 3 recebeu 1 picograma de 20 DNA de VZV.
A Figura 6 mostra quatro membranas de náilon, cada uma marcada com 100 pmols de alvos com SEQ ID No. 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 e 74 em 0,26 N de NaOH.
A membrana foi então bloqueada utilizando-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1% de BSA por uma hora a 37oC.
O am- plicon foi então aquecido a 95oC por 10 minutos e misturado em 2X de 25 SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizado por 2 horas a 52 oC.
Após a hi- bridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez em 1X de SSPE contendo 0,1% de SDS.
A membrana foi incubada com um conju- gado de estreptavidina peroxidase em 0,1M de Tris-HCl pH 7,4 contendo 1% de BSA, 150mM de NaCl e 0,3% de Tween-20. Após 30 minutos a 37oC , a 30 membrana foi lavada 5 vezes por três minutos, cada vez com o mesmo tam- pão.
Para a revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 minutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminobenzidina HCl por mL de sal tamponado de fosfato.
A aparição de pontos marrons indica a presença do patógeno específico.
Figura 6. Fotografia do macroarranjo encontrado nas membra- nas de náilon hibridizadas com amplicons de PCR multiplex para a identifi- cação de retinite viral, identificando especificamente os genomas de HSV, 5 CMV, e VZV
Esquerda para direita modelo de como as sondas são encontra- das em cada membrana de náilon.
HSV – vírus do Herpes Simples mostran- do HGD = glicoproteína D de HSV, HDP = DNA polimerase de HS, HUL = 10 gene UL 44, 1o Comp.= sonda de cepa complementar de HGD CMV - Citomegalovírus mostrando CMT = gene II de transforma- ção morfológica, CGO = glicoproteína O de Citomegalovírus CUL = gene UL 83 5o Comp = sonda de cepa complementar de CMT VZV – vírus da Varicela Zoster mostrando VO = gene da Varicela zoster ORF 29 VDP = DNA polime- 15 rase de Varicela zoster : membrana NC hibridizada com o conteúdo do tubo marcado como NC.
HSV- Membrana de náilon hibridizada com amplicon obtido do tubo No. 1; CMV- Membrana de náilon hibridizada com amplicon obtido do tubo No 2 e VZV- Membrana de náilon hibridizada com amplicon obtido do tubo No 3 20 EXEMPLO 6 Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21 e 22 que podem amplificar o grupo de genes I e II do RNA ribossômico 16s do genoma de eubactérias, gene do RNA ribossômico 16s de Gram-positiva, gene de RNA 28s de todos os fungos, gene de RNA ri- 25 bossômico 16s de Propionibacterium acnes, gene B gyr, gene de aconitato hidratase e gene de ribonuclease de bactérias gram-negativas.
A mistura para PCR continha de 10 to 20pmols cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200μM de cada uma de d-ATP, d-UTP, d-CTP e d-GTP, 2 unida- des de Taq polimerase em 50mM de Tris-HCl pH 7,5, 5mM de MgCl2, 5mM de KCl, 1% albumina bovina sérica, 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosila- 5 se UDP para prevenir a contaminação do amplicon.
As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer contaminantes de amplicon, uma etapa de desnaturação a 94 oC por 5 minu- tos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC. 10 Cinco tubos da mistura PCR mencionada acima foram incubados com as seguintes preparações de DNA em que o tubo NC não recebeu nenhum DNA, o tubo no 1 recebeu 5 fg de DNA de E.coli, o tubo 2 recebeu 10 fg de DNA de S.
Aureus, o tubo 3 recebeu 10 fg de DNA de P. acnes e o tubo 4 recebeu l fg de DNA de C.albicans.
A figura 7 mostra cinco membranas de 15 náilon, cada uma marcada com 100 pmols de alvos com SEQ ID No. 76, 77, 78, 84, 85, 86, 87 e 88 em 0,26 N NaOH.
A membrana foi então bloqueada utilizando-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1%de BSA por uma hora a 37oC.
Os amplicons foram aquecidos até 95oC por 10 minutos e mis- turados em 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizados por 2 horas a 20 52oC.
Após a hibridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez em 1X de SSPE contendo 0,1% de SDS.
A membrana foi incubada com um conjugado de estreptavidina peroxidase em 0,1M de Tris-HCl pH 7,4 contendo 1% de BSA, 150mM de NaCl e 0,3% de Tween-20. Após 30 minu- tos a 37oC , a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos, cada vez com 25 o mesmo tampão.
Para a revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 minutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminobenzidina HCl por ml de sal tampo- nado de fosfato.
A aparição de pontos marrons indica a presença do patóge- no específico.
Figura 7. Fotografia do macroarranjo encontrada em membranas 30 de náilon hibridizadas com amplicons a partir de PCR multiplex para identifi- cação de endoftalmite infecciosa identificando especificamente os genomas de eubactérias, Gram +ve, Gram - ve, P. acnes e fungos.
NC = Controle negativo, GN mostrando ERR= grupo I de gene de RNA ri- bossômico 16s de eubactéria ERW = grupo II de gene de RNA ribossômico 16s de eubactéria GN 31= gene gyrB de Gram -ve GN 67= gene de aconita- 5 to hidratase de Gram -ve GN 87= gene de ribonuclease de Gram -ve GP = gene de RNA ribossômico 16s de Gram +ve PA = gene de RNA ribossômico 16s de P.
Acnes PF = Gene de RNA ribossômico 28s fúngico.
Canto superi- or esquerdo é o modelo para encontrar as sondas.
NC é a membrana de náilon com o tubo de controle negativo.
GN GP, PA e PF são as membranas 10 hibridizadas como os amplicons dos tubos 1, 2 e 3 respectivamente.
EXEMPLO 7 Fluido vítreo coletado na autópsia de 11 pacientes com AIDS que possuíam uveíte / retinite antes da morte foram submetidos ao teste de PCR multiplex seguido por identificação do amplicon em macroarranjo.
O 15 DNA foi extraído usando kits de purificação QIAGEN DNA com 100 μL de cada amostra de fluido vítreo.
O DNA foi reconstituído em 50 μL do tampão de eluição.
Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 1 a 23, que são capazes de amplificar todos os 23 genes da glicoproteína D do vírus do Herpes simples 1 & 2, gene UL 44 do vírus da Herpes simples 1 & 20 2, gene de DNA polimerase do vírus do Herpes simples 1 & 2 , gene da gli- coproteína O de Citomegalovírus, gene de transformação morfológica de Citomegalovírus, gene UL 88 de Citomegalovírus, Varicela zoster ORF 29,
gene de DNA polimerase de Varicela zoster, Gene Hexon de Adenovírus, gene de RNA ribossômico 16s de eubactérias I, gene de RNA ribossômico 16 de eubactérias da região II, porção específica bacteriana Gram + ve do gene de RNA ribossômico 16s, gene MPB 64 de Mycobacterium tuberculo- 5 sis, gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium fortuitum, gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium chelonae, gene B 1 de Toxoplasma gondii, proteína polimórfica II de Chlamydia trachomatis, porção específica fúngica do gene de RNA ribossômico 28s, porção específica de Propionibacterium acnes do gene de RNA ribossômico 16s- 23s, porção específica bacteriana Gram -ve 10 do gene B gyr, gene bacteriano Gram -ve de aconitato hidratase, gene de ribonuclease I Gram – ve A mistura para PCR continha 10 to 20 pmols de cada um dos iniciadores avanbço e reversos, 200 M de cada uma de d-ATP, d-UTP, d- CTP e d-GTP, 2 unidades de Taq polimerase em 10mM de Tris-HCl pH 9,0, 15 1,5mM de MgCl2, 5 mM de KCl, gelatina a 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unida- de de glicosilase UDP para prevenir a contaminação do amplicon e 10 μL do DNA extraído da amostra.
As condições do ciclo são incubação a 37oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer contaminantes de ampli- con, dois minutos a 50oC e uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 minu- 20 tos, seguida por 40 ciclos de 45 segundos a 60 oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC.
A PCR foi conduzida conforme descrição acima com 23 grupos de iniciadores compreendendo as sequências ID No 1-46 a uma concentra- ção de 10-20 pmols / 50 μL da mistura reacional.
Os produtos de PCR de 25 todas as amostras foram submetidos à hibridização em membranas de nái- lon marcadas com as sondas de SEQ ID No. 47-71. As membranas de nái- lon foram, cada uma, marcadas com 100 pmols de alvos com SEQ ID No. 67-88 em 0,26N de NaOH.
As membranas foram então bloqueadas utilizan- do-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1% de BSA por uma hora a 30 37oC.
Os amplicons foram aquecidos até 95oC por 10 minutos e misturados em 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizados por 2 horas a 52oC.
Após a hibridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos cada vez em 1X de SSPE contendo 0,1% de SDS. A membrana foi incubada com um conjugado de estreptavidina peroxidase em 0,1M de Tris-HCl pH 7,4 contendo 1% de BSA, 150mM de NaCl e 0,3% Tween-20. Após 30 minutos a 37oC, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos, cada vez com o 5 mesmo tampão. Para a revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 minutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminobenzidina HCl por mL de sal tampo- nado de fosfato. A aparição de pontos marrons indica a presença do patóge- no específico. Os resultados obtidos são resumidos na Tabela 1. Todas as 11 10 amostras foram identificadas como uveíte e retinite de HSV por Mycobacte- rium tuberculosis, enquanto 10 delas também continham Toxoplasma gondii no vítreo, a PCR multiplex e o macroarranjo de DNA identificaram precisa- mente todas as amostras. Tabela 1: Resultados da detecção e discriminação simultânea de patógenos 15 usando PCR multiplex e hibridização em macroarranjo realizada em 11 amostras de autópsia de fluido vítreo coletadas de pacientes com AIDS.
No de identificação da amostra Organismos positivos A / 39 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 40 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 05 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 12 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 36 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 38 / 05 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 14 / 06 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 42 / 05 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 43 / 05 HSV, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma A / 49 / 05 HSV, TB Exemplo 8: Seis amostras de CSF coletadas em autópsias de pacientes com AIDS foram testadas em PCR multiplex seguido por macroarranjo. Desco- 20 briu-se que a causa da morte havia sido infecção no sistema nervoso cen-
tral.
O DNA foi extraído de 200 μL das amostras utilizando-se kits de extra- ção de DNA QIAGEN, comercialmente disponíveis.
O DNA foi reconstituído em 50 μL de tampão de eluição.
Uma PCR multiplex foi realizada com os grupos de iniciadores 1 a 23, que são capazes de amplificar todos os 23 ge- 5 nes da glicoproteína D do vírus do Herpes simples 1 & 2, gene UL 44 do ví- rus do Herpes simples 1 & 2, gene de DNA polimerase do vírus do Herpes simples 1 & 2 , gene da glicoproteína O de Citomegalovírus, gene de trans- formação morfológica de Citomegalovírus, gene UL 88 de Citomegalovírus, Varicela zoster ORF 29, gene de DNA polimerase de Varicela zoster, Gene 10 Hexon de Adenovírus, gene de RNA ribossômico 16s de eubactérias I, gene de RNA ribossômico 16s de eubactérias da região II, porção específica bac- teriana Gram + ve do gene de RNA ribossômico 16s, gene MPB 64 de Mycobacterium tuberculosis, gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium for- tuitum, gene de RNA 16s a 23s de Mycobacterium chelonae, gene B 1 de 15 Toxoplasma gondii, proteína polimórfica II de Chlamydia trachomatis, porção específica fúngica do gene de RNA ribossômico 28, porção específica de Propionibacterium acnes do gene de RNA ribossômico 16s- 23s, porção es- pecífica bacteriana Gram -ve do gene B gyr, gene bacteriano Gram -ve de aconitato hidratase, gene de ribonuclease I Gram – ve. 20 A mistura para PCR continha de 10 a 20 pmols de cada um dos iniciadores de avanço e reversos, 200μM de cada uma de d-ATP, d-UTP, d- CTP e d-GTP, 2 unidades de Taq polimerase em 10mM de Tris-HCl pH 9,0, 1,5mM de MgCl2, 5mM de KCl, gelatina a 0,01%, 1mM de EDTA e 1 unidade de glicosilase UDP para prevenir a contaminação do amplicon e 10 μL do 25 DNA extraído da amostra.
As condições do ciclo são incubação a 37 oC por 30 minutos para a completa digestão de quaisquer contaminantes de ampli- con, dois minutos a 50oC e uma etapa de desnaturação a 94oC por 5 minu- tos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos a 60oC, 45 segundos a 72oC e 45 segundos a 94oC seguido por 10 minutos de extensão da reação a 72oC.
A 30 PCR foi conduzida conforme descrito acima com 23 grupos de iniciadores compreendendo as sequências ID No 1-46 a uma concentração de 10-20 pmols / 50 μL da mistura reacional.
Os produtos de PCR de todas as amos-
tras foram submetidos à hibridização em membranas de náilon marcadas com 100 pmols dos alvos SEQ ID No. 67-88 em 0,26 N NaOH.
As membra- nas foram então bloqueadas utilizando-se 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e 1% BSA por uma hora a 37oC.
Os amplicons foram aquecidos até 5 95oC por 10 minutos e misturados em 2X de SSPE contendo 0,1% de SDS e hibridizados por 2 horas a 52oC.
Após a hibridização, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos, cada vez em 1X de SSPE contendo 0,1% de SDS.
A membrana foi incubada com um conjugado de estreptavidina peroxidase em 0,1M de Tris-HCl pH 7,4 contendo 1% de BSA, 15 mM de NaCl e 0,3% 10 de Tween-20. Após 30 minutos a 37oC, a membrana foi lavada 5 vezes por três minutos, cada vez com o mesmo tampão.
Para a revelação da cor, a membrana foi incubada por 10 minutos a 37oC com 0,5 mg de Diaminoben- zidina HCl por ml de sal tamponado de fosfato.
A aparição de pontos mar- rons indica a presença do patógeno específico. 15 Tabela 2: Resultados da detecção e discriminação simultânea de patógenos usando PCR multiplex e hibridização em macroarranjo realizada em amos- tras de autópsia CSF coletadas de pacientes com AIDS
Diagnóstico da amostra Número testado Número positivo
Encefalite de HSV 4 4
Encefalite CMV 2 2
Encefalite de VZV 2 2
Encefalite por toxoplasma 3 3
Meningite tuberculosa 3 3
EXEMPLO 9: Uma série de 19 espécimes oculares de humor aquoso ou fluido 20 vítreo foi obtida de diversos diagnósticos clínicos.
Amostras de DNA de cer- ca de 50 a 100 μL foram extraídas utilizando-se kits de extração de DNA comercialmente disponíveis e o DNA foi reconstituído em 50 μL de água, e 10 μL foram utilizados para PCR multiplex contendo de 10 a 20 pmols de cada um dos grupos de 1 a 23 de SEQ ID NO 1 a 46. A composição do rea- 25 gente PCR e as condições de ciclo térmico são as mesmas dos exemplos 6 e 7, acima. Os resultados são resumidos a seguir e demonstram a utilidade clínica das sondas e grupos de iniciadores e sondas; Tabela 3: Resultados da detecção e discriminação simultânea de patógenos usando PCR multiplex e hibridização em macroarranjo realizada em amos- 5 tras oculares de humor aquoso e fluido vítreo coletadas de pacientes.
Número da Diagnóstico clínico Resultado amostra 1 Retinite viral CMV 2 Uveíte e retinite viral M. tuberculosis, M. chelonae e VZV 3 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 4 Retinite viral HSV 5 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 6 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 7 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 8 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 9 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 10 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 11 Uveíte e endoftalmite infecciosa Infecção fungal 12 Uveíte e endoftalmite infecciosa Negativo 13 Endoftalmite infecciosa Propionibacterium acnes 14 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 15 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 16 Uveíte e endoftalmite infecciosa Eubactéria & M. tuberculosis 17 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva 18 Endoftalmite infecciosa Negativo 19 Endoftalmite infecciosa Eubactéria & Gram-positiva VANTAGENS:
1. Kit altamente eficaz e rápido.
2. Identificação do patógeno em uma etapa muito prematura da infecção ajudará o médico a escolher o regime de tratamento apropriado para a ex- tensão da doença e sua cura.
3. Identificação de múltiplas infecções a partir da mesma amostra também 5 será útil para um tratamento que utiliza combinação de fármacos para tera- pia eficaz.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES1. Grupos de iniciadores úteis para detecção e discriminação de patógenos causadores de sÍndromes em uma amostra, caracterizado "pelo fato de que o grupo é selecionado de: 5 Grupo 1 FP: 5' cgcttggtttcggatgggag 3' (SEQ ID No.l) RP: 5' gcccccagagacttgttgtagg 3' (SEQ ID NO.2) Grupo 2 FP: 5' ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3' (SEQ ID NO.3) 10 RP: 5' cgggggggtcttgcgttac 3' (SEQ ID No.4) Grupo 3 FP: 5' caagctgacggacatttacaagg 3'(SEQ ID No.5) RP: 5' gtcccacacgcgaaacacg 3'(SEQ ID NO.6) Grupo 4 b- 15 FP: 5' ttccggctcatggcgttaacc 3'(SEQ ID NO.7) RP: 5' cgccctgcttttacgttacgc 3'(SEQ ID NO.8) Grupo 5 FP: 5' cggcgacgacgacgataaag 3'(SEQ ID NO.9) RP: 5' caatctggtcgcgtaatcctctg 3'(SEQ ID No.lO) 20 Grupo 6 FP: 5' gggcacgtcctcgcagaag 3'(SEQ ID No.l 1) RP: 5' ccaagatgcaggtgataggtgac 3' (SEQ ID NO.12) Grupo 7 FP: 5' ggtcttgccggagctggtattac 3'(SEQ ID No.13) 25 RP: 5' tgcctccgtgaaagacaaagaca 3'(SEQ ID NO.14) Grupo 8 FP: 5' tccaWaacgttgcatcattttgtg 3'(SEQ ID No.15) RP: 5' acgttccggtagcgagttatctg 3'(SEQ ID NO.16) Grupo 9 30 FP : 5' cgccgccaacatgctctacc 3 '(SEQ ID No.17) RP: 5' gttgcgggaggggatggata 3'(SEQ ID NO.18)Grupo 10 FP: 5' tgggctacacacgtgctacaatgg 3' (SEQ ID No.19) RP: 5' cggactacgatcggttttgtgaga 3'(SEQ ID NO.20) Grupo 11 5 FP: 5' ggcctaacacatgcaagtcgagc 3(SEQ ID NO.21) RP: 5' ggcagattcctaggcattactcacc 3(SEQ ID No.22) Grupo 12 FP: 5' acgtcaaatcatcatgcccccttat 3'(SEQ ID NO.23) RP: 5' tgcagccctttgtaccgtccat 3'(SEQ ID NO.24) 10 Grupo 13 FP: 5' gcggaacgtgggaccaatac 3'(SEQ ID No.25) RP: 5' cgacggggtgattttcttcttc 3' (SEQ ID No.26) Grupo 14 FP: 5' aactmgactgccagacacactattg 3'(SEQ ID NO.27) 15 RP: 5' ggatgccaccccccaaaag 3'(SEQ ID No.28)- . Grupo 15 FP: 5' tggttactcgcttggtgaatatgt 3'(SEQ ID NO.29) RP: 5' gacgttttgccgactacctatcc 3(SEQ ID No.30) Grupo 16 20 FP: 5' cccctctgctggcgaaaagtg 3' (SEQ ID NO.31) RP: 5' ggcgaccaatctgcgaatacac 3'(SEQ ID No.32) Grupo 17 FP: 5 ' aatcgtatctcgggttaatgttgc 3 '(SEQ ID NO.33) RP: 5' tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3' (SEQ ID No.34) 25 Grupo 18 FP: 5' gctgggactgaggactgcgac 3'(SEQ ID No.35) RP: 5' ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36) Grupo 19 FP: 5' tggcgaacgggtgagtaaca 3' (SEQ ID NO.37) 30 RP: 5' ccggtattagccccagtttcc 3' (SEQ ID No.38) Grupo 20 FP: 5' cggcggcaagttcgacgac 3' (SEQ ID NO.39)RP: 5' ccaccgagacgcccacacc 3' (SEQ ID NO.40) Grupo 21 FP: 5' ccaggtcggcggagaagc 3' (.qÊQ ID NO.41) RP: 5' ccaccggcccgatgacc 3' (SEQ ID NO.42) 5 Grupo 22 FP: 5' gccgccctgaccaccttc 3' (SEQ ID No.43) RP: 5' gcgggttgttcggcatcag 3' (SEQ ID No.44), em que os ditos iniciadores são usados sozinhos ou em combinação.2. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, caracteri- lO zado pelo fato de que o patógeno é selecionado de um grupo que consiste em vÍrus do herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, vÍrus varicela zoster, adeno- vÍrus, Eubactéria, organismos Gram-negativos, bactérias Gram-positivas, Fungos, Mycobacterium tubercu/osis, Mycobacterium che/onei, Mycobacteri- um fortuitum, Toxop/asma gondii Ch/amydia trachomatis e propinibacteriu acnes.3. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID NO.4), (SEQ ID No.5) e (SEQ ID NO.6), grupo 4 (SEQ ID NO.7) e (SEQ ID NO.8), grupo 5 (SEQ ID NO.9) e (SEQ ID No.lO), grupo 6 (SEQ ID No.11) e (SEQ ID NO.12), grupo 7 (SEQ ID NO.13) e (SEQ ID NO.14), e grupo 8 (SEQ ID No.15) e (SEQ ID No.16) em combinação de- tecta retinite viral em uma amostra.4. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 1 (SEQ ID NO.I) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID NO.4), grupo 3 (SEQ ID No.5) e (SEQ ID NO.6), grupo 9 (SEQ ID No.17) e (SEQ ID NO.18), e grupo 17 (SEQ ID NO.33) e (SEQ ID NO.34), em combinação detecta ceratoconjuntivite.5. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID NO.26), gru- po 14 (SEQ ID NO.27) e (SEQ ID NO.28), grupo 15 (SEQ ID NO.29) e (SEQ ID No.30), grupo 16 (SEQ ID No.31) e (SEQ ID NO.32) em combinação de- tecta uveite em uma amostra.6. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 10 (SEQ ID NO.19) e (SEQ ID NO.20), gru- po 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID NO.22), grupo 12 (SEQ ID NO.23) e (SEQ - ID NO.24), grupo 18 (SEQ ID No.35) e (SEQ ID No.36), grupo 19 (SEQ ID 5 NO.37) e (SEQ ID NO.38), grupo 20 (SEQ ID NO.39) e (SEQ ID No.40). grupo 21 (SEQ ID No.41) e (SEQ ID NO.42), e grupo 22 (SEQ ID No.43) e (SEQ ID NO.44), em combinação detecta endoftalmite infecciosa em uma amostra.7. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 10 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID No.4 ), grupo 3 (SEQ ID NO.5) e (SEQ ID NO.6 ), grupo 4 (SEQ ID No.7) e (SEQ ID NO.8), grupo 5 (SEQ ID NO.9) e (SEQ ID No.lO), grupo 6 (SEQ ID NO.11) e (SEQ ID NO.12), grupo 7 (SEQ ID NO.13) e (SEQ ID NO.14), grupo 8 (SEQ ID NO.15) e (SEQ ID No.16), grupo 13 (SEQ ID No.25) e (SEQ ID No.26), grupo 16 (SEQ ID No.31) e (SEQ ID 15 No.32), e grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID NO.36) detecta meningoence- falite em uma amostra. . .8. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o grupo 10 (SEQ ID No.19) e (SEQ ID NO.20), gru- po 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID NO.22), grupo 12 (SEQ ID No.23) e (SEQ 20 ID NO.24), grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID NO.36), grupo 20 (SEQ ID NO.39) e (SEQ ID No.40), grupo 21 (SEQ ID NO.41) e (SEQ ID NO.42), e grupo 22 (SEQ ID No.43) e (SEQ ID NO.44) detecta bactéria Gram-positivas e/ou Gram-negativas em uma amostra.9. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- 25 terizado pelo fato de que o grupo 10 (SEQ ID NO.19) e (SEQ ID NO.20), gru- po 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID No.22), grupo 12 (SEQ ID NO.23) e (SEQ ID No.24), grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID No.26), grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID No.36), grupo 20 (SEQ ID No.39) e (SEQ ID NO.40), grupo 21 (SEQ ID NO.41) e (SEQ ID NO.42) detecta bactéria e grupo 22 (SEQ ID 30 No.43) e (SEQ ID NO.44) diferencia entre meningite aguda e crônica em uma amostra.10. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que o grupo de 1 a 22 (SEQ ID No. 1 a 44) como em uma combinação detecta o ácido nucleico alvo do vírus do herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, vÍrus varicela zoster, adenovírus, Eubactéria, organis- - mos Gram-negativas, bactérias Gram-positivas, Fungos, Mycobacterium tu- 5 bercu/osis, Mycobacterium che/onei, Mycobacterium fortuitum, Toxop/asma gondii e Ch/amyd/a trachomatis em uma amostra.11. Grupo de iniciadores de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os ditos iniciadores são marcados na extremidade 5' usando-se uma fração biotina resultando na 10 detecção por formação de um produto colorido.12. Grupo de iniciadores, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que os ditos iniciadores são marcados com marcadores fluorescentes tais como marcadores fluorescen- tes selecionados de um grupo que consiste em lsotiocianato de Fluorescên- . " 15 cia FTCC, nanopartículas fluorescentes inorgânicas, Quantum Dots®, Cy3, -· Cy5 possibilitando a detecção por qualquer dispositivo de varredura fluores- cente ou microscopia.13. Grupo de iniciadores de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é selecionada 20 de um grupo que consiste em Humor aquoso, fluido vÍtreo ou lavagem vÍtrea, raspagens de córnea, esfregaços conjuntivais, biópsia do cérebro ou da me- dula espinhal, fluido cerebroespinhal, sangue, plasma, lavagem broncoalveo- lar, pus, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido ascítico, fluido pericardial, flui- do sinovial, urina, esfregaços cervicais e vaginais e biópsia de linfonodo e 25 intestinal.14. Grupo de iniciadores de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que os patógenos causam endoftalmite infecciosa, ce- ratite, uveíte, retinite, meningite ou encefalite.15. Grupo de sequência de DNA de sonda específica de patóge- 30 no, caracterizado pelo fato de que é amplificado usando-se os grupos de iniciadores, como definidos na reivindicação 1, de um espécime padrão ou clínico usando reações de PCR Uniplex ou Multiplex, em que a dita sequên-cia de DNA de sonda é selecionada do grupo que consiste em:1. Sequência de DNA de Sonda "cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctaca " acaa gtctctgggggc" (SEQ ID No. 45) 5 2. Sequência de DNA de Sonda "ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccc cg" (SEQ ID No. 46)3. Sequência de DNA de Sonda "caagctgacggacamacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttc 10 gcgtg tgggac" (SEQ ID No. 47)4. Sequência de DNA de Sonda "ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggc g" (SEQ ID No. 48) b5. Sequência de DNA de Sonda 15 "cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccaga#g" -· (SEQ ID NO.49)6. Sequência de DNA de Sonda "gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccHgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg" (SEQ ID NO.50) 20 7. Sequência de DNA de Sonda "ggtcttgccggagctggtahaccttaaaactcactaccagtcaKtctatccatctgtctttgtcWcacggag gca" (SEQ ID No. 51)8. Sequência de DNA de Sonda "tccautaacgttgcatcamgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgc 25 taccg gaacgt" (SEQ ID No. 52)9. Sequência de DNA de Sonda "cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaa C" (SEQ ID No. 53)10. Sequência de DNA de Sonda 30 "tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcac aaaac cgatcgtagtccg" (SEQ ID No. 54)11. Sequência de DNA de Sonda"ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagt aatgc ctaggaatctgcc" (SEQ ID No. 55)12. Sequência de DNA de Sonda - " "acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgc 5 a" (SEQ ID No. 56)13. Sequência de DNA de Sonda "gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcucgggcagcaactcccccgggttgaagaa gaaa atcaccccgtcg" (SEQ ID No. 57)14. Sequência de DNA de Sonda 10 "aactmgactgccagacacactattgggcÜtgagacaacaggcccgtgccccttuggggggtggcat cc" (SEQ ID No. 58)15. Sequência de DNA de Sonda "tggttactcgcttggtgaatatgmataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc" (SEQ ID No. 59) 15 16. Sequência de DNA de Sonda "cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaacWggtgtaucgcagattggtcgcc" (SEQ ID No. 60)17. Sequência de DNA de Sonda "aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgcutatcaaatgacaagcttagatccgtKctcatacggttttcctc 20 ga" (SEQ ID No. 61)18. Sequência de DNA de Sonda "gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa" (SEQ ID No- 62)19. Sequência de DNA de Sonda 25 "tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccugacKtgggataacttcaggaaactggggcta atacc gg" (SEQ ID No. 63)20. Sequência de DNA de Sonda "cggcggcaagÜcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg" (SEQ ID No. 64) 30 21. Sequência de DNA de Sonda "ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccHcagHcgtcgcgggtcatcgggccggtgg" (SEQ ID No. 65)22. Sequência de DNA de Sonda "gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgHacctggtgctgatgccgaacaacccgc" (SEQ ID No. 66). - 16. Grupo de sequências de sonda de DNA específicas de pató- 5 genos de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita sonda de DNA é marcada na extremidade 5' usando uma fração biotina, resultando na detecção por formação de produto colorido.17. Grupo de sequências de sonda de DNA específicas de pató- genos de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a 10 dita sonda de DNA é marcada por marcadores fluorescentes orgânicos sele- cionados de lsotiocianato de Fluoresceno FITC, nanopartlculas fluorescen- tes inorgânicas, Quantum Dots® ou detecção possibilitando de Cy3, Cy5 por qualquer dispositivo ou microscópio de varredura fluorescente.18. Grupo de sequências de DNA alvo, conforme listado abaixo 15 de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que tenha com temperatura de fusão uniforme na faixa de 58,9°C a 83°C, complementares às sequências amplifi- cadas a serem usadas depois a imobilização em uma matriz de fase sólida, durante a hibridização para subsequentemente detectar e discriminar pató- genos específicos sob investigação, em que as dita sequências são selecio- 20 nadas do grupo que consiste em:1. 5'gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3' (SEQ ID No. 67)2. 5'cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3' (SEQ ID No. 68)3. 5'tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3' (SEQ ID No. 69)4. 5'aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3'(SEQ ID No. 70 25 5. 5'aatacaaagccgcagtgtcgtc 3'(SEQ ID No. 71)6. 5'gactccaggtacaccttgacgtactg 3'(SEQ ID No. 72)7. 5'cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3'(SEQ ID No. 73)8. 5'ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3'(SEQ ID No. 74)9. 5' ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3'(SEQ ID No. 75) 30 10. 5'tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3'(SEQ ID No. 76)11. 5'ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3'(SEQ ID No. 77)12. 5' gacctgggctacacacgtgctaca 3'(SEQ ID No. 78)13. 5'ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3'(SEQ ID No. 79)14. 5' ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3'(SEQ ID No. 80) - t 15. 5' tttataaatcctgtccaccccgt 3'(SEQ ID No. 81) 16. 5' aaattcatgagêatctgtg- - caactttg 3'(SEQ ID No. 82) 5 17. 5' atgatgcWatcaaatgacaagcttagatcc 3'(SEQ ID No. 83)18. 5' gtaagtcaaggatgctggcataatg 3'(SEQ ID No. 84)19. 5' gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3'(SEQ ID No. 85)20. 5' aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3'(SEQ ID No. 86)21. 5' cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3'(SEQ ID No. 87) 10 22. 5' atcagcctggccggccgttacctggtg 3'(SEQ ID No. 88).19. Grupo de sequências alvo de DNA de acordo com a reivindi- cação 18, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências alvo de DNA são marcadas na extremidade 5' usando uma fração biotina resultando na detecção por formação de produto colorido. . 15 20. Grupo de sequências alvo de DNA de acordo com a reivindi- cação 18, caracterizado pelo fato de que as ditas sequências alvo de DNA são marcadas por marcadores fluorescentes orgânicos selecionados de um grupo que consiste em lsotiocianato de Fluoresceno FITC, nanopartículas fluorescentes inorgânicas, Quantum Dots®, possibilitando a detecção de Cy3 20 ou Cy5 por qualquer dispositivo ou microscópio de varredura fluorescente.21. Método para a detecção e discriminação de patógenos em uma amostra por amplificação dos genes específicos de tais patógenos por realização de ensaio de PCT multiplex (reação em cadeia de polimerase) usando-se a combinação de grupos de iniciadores, como definidos na reivin- 25 dicação 1, caracterizado pelo fato de e em etapas posteriores o(s) produto(s) (sondas) é(SãO) hibridizado(s) para sequências (alvos) de DNA complemen- tares imobilizadas em uma matriz de fase sólida em uma formato multiplex por métodos convencionais e O(S) produto(s) hibridizado(s) é(São) detecta- do(s) por métodos convencionais para subsequentemente detectar e discri- 30 minar o dito patógeno.22. Método para a detecção e discriminação de patógenos em uma amostra caracterizado pelo fato de ser por amplificação dos genes es-pecíficos de tais patógenos por realização de PCR multiplex (reação em ca- deia de polimerase) usando o grupo 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID No.2), grupo 2 (SEQ ID No.3) e (SEQ ID NO.4 ), grupo 3 (SEQ ID NO.5) e (SEQ ID NO.6 ), " grupo 4 (SEQ ID NO.7) e (SEQ ID NO.8), grupo 5 (SEQ ID NO.9) e (SEQ ID 5 No.lO), grupo 6 (SEQ ID No.11) e (SEQ ID No.12), grupo 7 (SEQ ID No.13) e (SEQ ID NO.14), grupo 8 (SEQ ID NO.15) e (SEQ ID NO.16), grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID NO.26), grupo 16 (SEQ ID NO.31) e (SEQ ID NO.32), e grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID NO.36); e em etapas posterio- res O(S) (sondas) amplificado(s) é(SãO) hibridizado(s) para sequências (al- lO vos) de DNA complementares imobilizados em uma matriz de fase sólida em um formato multiplex por métodos conhecidos e O(S) produto(s) hibridiza- do(s) é(SãO) detectado(s) por métodos conhecidos para subsequentemente detectar e discriminar o dito patógeno.23. Método para a detecção e discriminação de patógenos que 15 causam sÍndromes, tais como enfoftalmite infecciosa ou ceratite ou uveíte ou retinite ou meningite caracterizado pelo fato de ser por amplificação dos ge- nes específicos de tais patógenos por realização de ensaio de PCR multiplex (reação em cadeia de polimerase) na amostra clínica usando a reunião única de grupos de iniciadores de avanço e reversos conforme definidos na reivin- 20 dicação 1, e em etapas subsequentes O(S) produto(s) (sondas) amplificados é(São) hibridizado(s) para sequências de DNA complementares (alvos) imo- bilizadas em uma matriz de fase sólida em um formato multiplex por méto- dos conhecidos e O(S) produto(s0 hibridizado(s) é(SãO) detectado(s) por mé- todos conhecidos para subsequentemente detectar e discriminar o patógeno 25 específico causador da sÍndrome sob investigação.24. Método para detecção de um ácido nucleico alvo de um ou mais que um patógeno em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra clínica, 30 b. extrair DNA da dita amostra, c. conduzir reação em cadeia de polimerase multiplex usando a combinação de grupos de iniciadores conforme definidos na reivindicação 1,para obter um produto amplificado, d. desnaturar o produto amplificado, e. hibridizar o ditto produto amplificado desnaturado com um ou mais que uma sequência de DNA alvo, e 5 f. detectar o produto hibridizado usando-se o método convencio- nal.25. Método para detecção de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o dita sequência de DNA alvo é imobilizada em uma matriz. 10 26. Método de detecção de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que a dita sequência de DNA alvo é como definida na reivindicação 18.27. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que o dito produto hibridizado é detectado usando- se a sequência de DNA de sonda conforme definida na reivindicação 15.28. Método para a detecção simultânea de todos os patógenos causadores de infecção ocular externa, endoftalmite ou uveíte ou meningo- encefalite, caracterizado pelo fato de que compreende o seguinte: a) obter uma amostra clínica de paciente sofrendo de infecção, b) extrair DNA de uma porção ou total da amostra obtida na etapa s, C) conduzir uma PCR mu- liplex usando uma reunião de iniciadores, como definida na reivindicação 1, marcados por biotina ou traçadores fiuorescentes e reagentes padrão de PCR no DNA modelo obtido na etapa b, d) desnaturação do produto de PCT obtido na etapa c, e) hibridizar os produtos de PCT com os alvos, como defi- nidos na reivindicação 18, imobilizados em uma matriz sólida, f) detectar os híbridos de DNA obtidos na etapa e, na matriz sólida por métodos enzimáti- cos ou fluorescentes.29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que os patógenos são vÍrus do herpes sim- ples 1 e 2, citomegalovírus, vírus varicela zoster, adenovirus, Eubactéria, organ ismos Gram-positivos, bactérias Gram-negativas, Fungos, Mycobacte- rium tubercu/osis, Mycobacterium che/onei, Mycobacterium fortuitum, Toxo-p/asma gondii e Ch/amydia trachomatis.30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizado pelo fato de que todos os grupos de iniciadores podem ser usados juntos em um tubo único usando-se condições de ciclo térmico W' 5 uniformes, caracterizados por terem uma etapa de desnaturação a 94°C por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de 45 segundos a 60°C-64°C, 45 segundos a 72°C e 45 segundos a 94°C seguido por 10 minutos de extensão da rea- ção a 72°C.31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 10 a 30, caracterizado pelo fato de que os ditos iniciadores são marcados na extremidade 5' usando-se a fração biotina resultando na detecção por for- mação de produto colorido.32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 31, caracterizado pelo fato de que os ditos iniciadores são marcados por » 15 marcadores fluorescentes orgânicos selecionados do grupo que consiste em lsotiocianato de Fluoresceno FITC, nanopartículas fluorescentes inorgâni- cas, Quantum Dots® possibilitando detecção de Cy3, Cy5 por qualquer dis- positivo ou microscópio de varredura fluorescente.33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 20 a 32, caracterizado pelo fato de que o(S) produto(s) hibridizado(s) é(São) de- tectado(s) usando-se sequência de DNA de soda específica conforme defi- nida na reivindicação 15, usando-se um macroarranjo ou slot b/ot ou ensaio de sonda em linha.34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pe- 25 lo fato de que o macroarranjo compreende as sequências de DNA alvo con- forme definidas na reivindicação 18, fixada a uma fase sólida que compre- ende nitrocelulose, náilon, náilon carregado, vidro ou poliestireno.35. Ensaio de PCR multiplex usando uma combinação de grupos de iniciadores, como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de 30 que qualquer sÍndrome ciínica causada por uns poucos ou todos os patóge- nos conforme definidos na reivindicação 29 está sendo investigadas por de- tecção de qualquer um patógeno individual ou grupos de patógenos presen-tes em um espécime clínico.36. Kit para a detecção simultânea de todos os patógenos cau- k sadores de infecção ocular externa, endoftalmite ou uveíte ou retinite ou mé- - ningoencefalite, caracterizado pelo fato de compreender o seguinte: 5 a) uma reunião de iniciadores conforme definidos na reivindica- ção 1, b) uma matriz de sequências de DNA, conforme definidas na reivindi- cação 18 imobilizadas em uma fase sólida adequada, c) reagentes padrão requeridos para amplificação de DNA por reação em cadeia de polimerase, d) reagentes padrão requeridos para hibridizar os produtos de PCR amplifi- lO cados para a matriz de sequências de DNA imobilizadas em uma fase sóIida adequada, e) reagentes padrão requeridos para detectar e discriminar o pro- duto hibridizado final.37. Kit para detecção de patógenos em uma amostra, caracteri- -B zado pelo fato de que compreende um grupo de iniciadores 1 a 22 (SEQ ID 15 No: 1 a SEQ ID No: 44), caracterizado pelo fato de que os patógenos são vírus do herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, vÍrus varicela zoster, adeno- vÍrus, Eubactéria, bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, Fun- gos, Mycobacterium tubercu/osis, Mycobacterium che/onei, Mycobacterium fortuitum, Toxop/asma gondii e Ch/amydia trachomatis. 20 38. Kit para detecção de rinite viral em uma amostra, caracteri- zado pelo fato de que compreende um grupo de iniciadores 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID NO.4), grupo 3 (SEQ ID NO.5) e (SEQ ID NO.6), grupo 4 (SEQ ID NO.7) e (SEQ ID NO.8), grupo 5 (SEQ ID NO.9) e (SEQ ID No.lO), grupo 6 (SEQ ID NO.11) e (SEQ ID NO.12), 25 grupo 7 (SEQ ID NO.13) e (SEQ ID NO.14), e grupo 8 (SEQ ID No.15) e (SEQ ID No.16).39. Kit para detecção de ceratoconjuntivite em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende um grupo 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID NO.4), grupo 3 (SEQ ID 30 NO.5) e (SEQ ID No.6), grupo 9 (SEQ ID NO.17) e (SEQ ID NO.18), e grupo 17 (SEQ ID NO.33) e (SEQ ID NO.34).40. Kit para detecção de uveíte em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende um grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID NO.26), grupo 14 (SEQ ID No.27) e (SEQ ID NO.28), grupo 15 (SEQ ID NO.29) e (SEQ ID NO.30), grupo 16 (SEQ ID NO.31) e (SEQ ID NO.32). - 41. Kit para infecção de endoftalmite infecciosa em uma amos- 5 tra, caracterizado pelo fato de que compreende o grupo 10 (SEQ ID No.19) e (SEQ ID NO.20), grupo 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID NO.22), grupo 12 (SEQ ID NO.23) e (SEQ ID NO.24), grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID NO.36), grupo 19 (SEQ ID No.37) e (SEQ ID NO.38), grupo 20 (SEQ ID NO.39) e (SEQ ID No.40). grupo 21 (SEQ ID No.41) e (SEQ ID NO.42), e grupo 22 10 (SEQ ID NO.43) e (SEQ ID NO.44).42. Kit para a detecção de meningoencefalite em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o grupo 1 (SEQ ID No.l) e (SEQ ID NO.2), grupo 2 (SEQ ID NO.3) e (SEQ ID NO.4 ), grupo 3 (SEQ ID NO.5) e ,. (SEQ ID NO.6 ), grupo 4 (SEQ ID NO.7) e (SEQ ID No.8), grupo 5 (SEQ ID 15 NO.9) e (SEQ ID No.lO), grupo 6 (SEQ ID NO.11) e (SEQ ID NO.12), grupo 7 -- (SEQ ID NO.13) e (SEQ ID NO.14), grupo 8 (SEQ ID NO.15) e (SEQ ID NO.16), grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID NO.26), grupo 16 (SEQ ID NO.31) e (SEQ ID NO.32), e grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID NO.36).43. Kit pra detecção de bactérias Gram-positivas e/ou Gram- 20 negativas em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o grupo 10 (SEQ ID No.19) e (SEQ ID NO.20), grupo 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID No.22), grupo 12 (SEQ ID No.23) e (SEQ ID NO.24), grupo 18 (SEQ ID No.35) e (SEQ ID No.36), grupo 20 (SEQ ID No.39) e (SEQ ID No.40), grupo 21 (SEQ ID NO.41) e (SEQ ID NO.42), e grupo 22 (SEQ ID NO.43) e 25 (SEQ ID NO.44).44. Kit para detecção de meningite aguda e/ou crônica em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o grupo 10 (SEQ ID NO.19) e (SEQ ID NO.20), grupo 11 (SEQ ID NO.21) e (SEQ ID NO.22), grupo 12 (SEQ ID No.23) e (SEQ ID No.24), grupo 13 (SEQ ID NO.25) e (SEQ ID 30 NO.26), grupo 18 (SEQ ID NO.35) e (SEQ ID No.36), grupo 20 (SEQ ID NO.39) e (SEQ ID No.40), grupo 21 (SEQ ID NO.41) e (SEQ ID NO.42) detec- ta bactéria e grupo 22 (SEQ ID NO.43) e (SEQ ID NO.44) em uma amostra.45. Matriz imobilizada com a sequência de DNA alvo tendo se- quência de nucleotídeos conforme estabelecida em SEQ ID No:67 a 88, so- zinhas ou em combinação. "bd a %
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| MY163053A (en) * | 2007-06-01 | 2017-08-15 | Council Scient Ind Res | A novel method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system |
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| EP2831286A4 (en) * | 2012-03-30 | 2016-04-06 | Intelligent Med Devices Inc | OPTIMIZED PROBES AND PRIMERS AND METHODS OF USE THEREOF FOR BINDING, DETECTION, DIFFERENTIATION, INSULATION AND SEQUENCING OF HERPES SIMPLEX VIRUS |
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| EP3225696B1 (en) * | 2014-11-19 | 2020-06-03 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Primer set and method for amplifying exons of pkd1 gene and pkd2 gene |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639871A (en) | 1988-09-09 | 1997-06-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| JPH10323189A (ja) * | 1997-05-23 | 1998-12-08 | Toyobo Co Ltd | 抗酸菌属細菌の検出または菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
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| KR100316093B1 (ko) * | 1999-05-29 | 2001-12-12 | 김정준 | 마이코박테리아 균종 동정용 올리고뉴클레오티드 |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
| JP2003144153A (ja) * | 2001-11-09 | 2003-05-20 | Gifu Univ | 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット |
| CN1329523C (zh) * | 2002-08-09 | 2007-08-01 | 中国人民解放军基因工程研究所 | 一种限制性荧光标记方法 |
| CN1508264A (zh) * | 2002-12-18 | 2004-06-30 | 云南大学 | 一种临床感染性疾病基因芯片诊断方案 |
| EP1623042B1 (en) | 2003-05-07 | 2011-04-06 | Coris Bioconcept SPRL | One step oligochromatographic device and method of use |
| CN1195070C (zh) * | 2003-05-09 | 2005-03-30 | 陶开华 | 一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用 |
| CA2562775C (en) * | 2004-04-07 | 2015-08-04 | Access Bio, Inc. | Nucleic acid detection system |
| JP2006129810A (ja) * | 2004-11-08 | 2006-05-25 | Canon Inc | 感染症起炎菌検出用プローブセット及び担体及び遺伝子検査方法 |
| CN101111596A (zh) * | 2005-01-31 | 2008-01-23 | 株式会社益力多本社 | 以rRNA为标的的微生物定量分析方法 |
| US20070134652A1 (en) * | 2005-11-09 | 2007-06-14 | Primera Biosystems, Inc. | Multiplexed quantitative detection of pathogens |
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