BRPI0908308B1 - cepa h. polymorpha, e processo para a fabricação de etanol - Google Patents

cepa h. polymorpha, e processo para a fabricação de etanol Download PDF

Info

Publication number
BRPI0908308B1
BRPI0908308B1 BRPI0908308-1A BRPI0908308A BRPI0908308B1 BR PI0908308 B1 BRPI0908308 B1 BR PI0908308B1 BR PI0908308 A BRPI0908308 A BR PI0908308A BR PI0908308 B1 BRPI0908308 B1 BR PI0908308B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
polymorpha
seq
gene
genes
ethanol
Prior art date
Application number
BRPI0908308-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Andriy Y. Voronovsky
Charles Abbas
Andriy Sibirny
Original Assignee
Archer Daniels Midland Company.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41265371&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0908308(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Archer Daniels Midland Company. filed Critical Archer Daniels Midland Company.
Publication of BRPI0908308A2 publication Critical patent/BRPI0908308A2/pt
Publication of BRPI0908308B1 publication Critical patent/BRPI0908308B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

CEPA FI. POLYMORPHA, PROCESSO PARA a FABRICAÇÃO DE E- TANOL E ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE Os genes SWA2 e GAMI ãa Ievedura, Schwanniomyces occidentalis, que encoâifica (Alfa)-arnilase e glucoamilase, respectivamente, foram clonados e expressos na H. polymorpha. A expressão foi obtida pela integração dos genes SWA2 e GAMI no cromossomo de H. polymorpha sob Iigação de modo operável a um promotor constitutivamente forte do gene de H. polymorpha - gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (HpGAP). Os transformantes resultantes adquiriram a habilidade de serem cultívados em um meio mínimo que contém amido soIúvel como única fonte de carbono e pode produzir Etanol em fermentação de alta temperatura a partir do amido até 10 g/l. Um gene XYN2 que encodifica a endoxilanase foi obtido a partir do fungo Tríchoderma reseei, e um gene xlnD que codifica para a ss-xilosidase foi obtido a partir do fungo Aspergillus niger.; A co- expressão destes genes foi também atingida pela integração no cromossomo de H. poIy-morpha sob o controle do promotor HpGAP. Os transformantes resultantes puderarn crescer em um meio mínimo suplementado com xilana de madeira de vidoeiro como única fonte de carbono. A expressão satisfatória de enzimas xilanolíticas resultou em uma cepa receptora que propicia a (...)

Description

PRIORIDADE E REFERÊNCIAS INCORPORADAS
[001] O presente pedido reivindica prioridade para o pedido provisório no U.S. 61/050.685, depositado em 06 de maio, 2008, que está incorporado integralmente a título de referência, incluindo-se no mesmo todas as referências citadas naquele documento (repetidas no presente), nos limites em que tais referências ajudem na compreensão da invenção ou na obtenção de materiais e métodos que possam facilitar a prática da invenção. Se o conteúdo de uma referência citada entrar em conflito com o ensinamento do presente pedido, esse deve prevalecer.
CAMPO DA TÉCNICA
[002] O presente pedido refere-se ao campo da produção de etanol celulósico por fermentação, particularmente a fermentação de fontes de amido e carbono xilana, ainda, mais particularmente, a cepas de H polymorpha recombinante úteis para a produção de etanol por fermentação em amido e xilana e, ainda mais particularmente, a cepas de H. polymorpha que excretam α- amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase (SEQ ID NO:4) recombinan- tes, e/ou xiloidrolase e xilosidase para alcançarem a produção de etanol por fermentação em meio contendo amido e xilana.
INTRODUÇÃO
[003]A produção de etanol para combustível a partir de matérias-primas renováveis, tal como a biomassa de plantas, é de grande relevância Econômica e Ecológica. As lignoceluloses de planta são potenciais cargas alternativas à sacarose e aos polissacarídeos com base de amido que são comum e amplamente utilizadas para a produção de bioetanol. A lignocelulose e outros polissacarídeos derivados de plantas representam uma fonte de energia renovável sustentável que pode ser reproduzida pela bioconversão de dióxido de carbono. Um dos muitos benefícios ambientais visados em relação a bicombustíveis produzidos a partir de plantas em relação aos combustíveis fósseis é a redução significativa de gases do efeito estufa [6, 24].
[004]A maior parte do etanol produzido no mundo atualmente é derivada de amido ou sacarose. Amidos e açúcares são abundantes em muitas colheitas, mas a expansão da produção de etanol como um combustível líquido de transporte vai exigir matérias-primas que não concorram diretamente com usos de alimentos e de alimentação para animais. Tais matérias-primas incluem resíduos de subproduto de lignocelulose da agricultura e silvicultura [14].
[005]A palavra lignocelulose é um termo genérico para a matéria de plantas derivada de resíduos agrícolas e de madeira. É composta principalmente de lignina e celulose, assim como quantidades significativas de hemicelulose com quantidades menores de proteínas estruturais e matéria orgânica solvente passível de extração [14]. A hemicelulose é um polissacarídeo substituído que consiste em xilana como cadeia principal e está presente nas paredes celulares de plantas [H].
[006] O processamento de lignocelulose e amido para etanol consiste em quatro operações principais: pré-tratamento, hidrólise, fermentação, e separação/purificação do produto. A bioconversão do amido envolve a hidrólise e a fermentação enzi- mática da glicose resultante em etanol com a produção de copro- dutos de alimentação animal. A hidrólise de lignocelulose é mais difícil devido a esta estrutura mais complexa e a grande variação nesta composição em diferentes plantas (cereais, madeiras moles, madeiras duras, etc.) e dentro de uma planta (caules, cascas, palhas, sabugos, forragem, folhas, cernes, etc.) [14]. A xilose é o maior açúcar de pentose obtido sob hidrólise de fração de hemicelulose com L-arabinose C5 e outros açúcares C6 tais como glicose, manose, galactose como as hexoses primárias [11].
[007] Devido a muitas etapas envolvidas e os altos aportes de energia requeridos para processar a lignocelulose, o desenvolvimento de tecnologias mais diretas e baratas são necessárias para a viabilidade comercial de lignoceluloses como matérias-primas. A conversão microbiana direta (DMF, Direct Microbial Fermentation (Fermentação Microbiana Direta)) de polímeros de carboidratos é uma opção que pode melhorar a Economia de produção de bioetanol a partir de lignocelulose. Um dos pré- requisitos chave para o desenvolvimento desta tecnologia é a obtenção de microorganismos podem fermentação direta de amido e xilana para etanol em temperaturas elevadas [15]. A temperatura ótima das enzimas hidrolíticas atuais envolvidas em DMF é aproximadamente 50oC onde a maioria dos microorganismos utilizados atualmente na produção de bioetanol a partir de lignocelulose e açúcares de amido são mesófilos com ótimo crescimento e temperaturas de fermentação entre 28 e 40oC [6].
[008] Estudos recentes em laboratórios indicam que a levedura metilotrófica termotolerante, Hansenula polymorpha, é capaz de fermentar D-xilose e D-glicose para etanol em temperaturas elevadas (37 a 48° C). Em vista de sua alta temperatura ótima para crescimento e fermentação, a H. polymorpha é uma boa candidata para um desenvolvimento posterior de tecnologia DMF [3, 26]. Já que a H. polymorpha não pode utilizar amido e xila- na como fontes de carbono e energia, a clonagem e a expressão excessiva de genes xilanolíticos e amilolítico heterólogos nes- ta levedura são necessárias.
[009]As β-1,4-xilanas são polissacarídeos heterogê-neos encontrados na maioria das partes das paredes celulares das plantas. Os monômeros de xilose ligante de β-1.4 formam uma cadeia principal na qual diversos substituintes são anexados [30]. A hidrólise da cadeia principal de xilana é catalisada por endo-β-1,4-xilanases (1,4-β-D-xilana xilana hidrolase, EC 3.2.1.8) e β-D-xilosidases (1,4-β-D-xilana xiloidrolase, EC 3.2.1.37). As endo-β-xilanases agem em xilanas e xilo oligossa- carídeos, produzindo principalmente misturas de xilo oligossa- carídeos. As β-D-xilosidases hidrolisam os xilo oligossacarí- deos como D-xilose [19]. Os fungos Trichoderma e Aspergillus secretam grandes quantidades de enzimas degradantes de xilana eficientes. O Trichoderma reesei é um fungo mesofílico filamentoso conhecido por suas atividades celulolítica e xilanolítica [3]. As duas maiores endo-xilanases passíveis de indução secre- tadas por este fungo são Xynl e Xyn2. A Xyn2 (SEQ ID NO: 7) representa mais de 50% do total da atividade xilanolítica de T. reesei cultivado em xilana. Os membros do gênero Aspergillus são também eficientes produtores de enzimas celulolíticas e xi- lanolíticas. O gene xlnD de A. niger codificando o 804- aminoácido β-xilosidase foi expresso na levedura com sucesso [19].
[010] O amido é composto de duas frações de peso molecular alto: amilose e amilopectina. A amilose, o menor componente (20 a 30%) é um polissacarídeo linear formado por resíduos de glicose ligante α-1,4 e pontos de ramificação α-1.6, enquanto que a amilopectina representa a maior fração de amido (70-80%) e é altamente ramificada [4]. O amido é degradado por duas amilases secretadas: α-amilase (SEQ ID NO: 2) e a glucoa- milase (SEQ ID NO:4) [25]. A α-amilase (SEQ ID NO: 2) (1,4-α-D- glucano glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) catalisa a clivagem de endoamilolítico de ligações de α-1,4 glicosídicas de substrato de amido e similares que liberam maltose, oligossacarídeos e limitam as dextrinas. A glucoamilase (1,4-α-D-glucano- glucoidrolase, EC 3.2.1.3) (SEQ ID NO:4) hidrolisa os gluco- oligossacarídeos e maltose para D-glicose. A levedura Schwanni- omyces occidentalis produz enzimas amilolíticas e fermenta o amido em etanol com alta eficiência [34]. A α-amilase (SEQ ID NO: 2) secretada por esta levedura é codificada pelo gene SWA2 (SEQ ID NO: 1). O gene GAM1 (SEQ ID NO: 3) codifica a glucoami- lase (SEQ ID NO:4) secretória.
[011]Alguns resíduos agrícolas de lignocelulose obtidos no processamento de grãos de cereal tais como milho (exemplo: cascas fibrosas de milho) contêm uma quantidade significativa de amido. Por esta razão o desenvolvimento de cepas micro- biais pela conversão direta ativa tanto de amido quanto de lig- nocelulose em etanol é de grande significância comercial.
DESCRIÇÃO RESUMIDA
[012]Aqui são descritas as cepas de H. polymorpha amilolítica e xilanolítica com capacidade de fermentação alcoólica diretas de amido e xilana. A construção das cepas pela inserção eficaz nos cromossomos e expressão dos genes Scw. occi- dentalis SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3), T. reesei XYN2 e A. niger xlnD nesta levedura. Além disso, uma cepa que expresse excessivamente piruvato descarboxilase (PDC) foi projetada com um ou mais destes genes. Em cada caso, as cepas conseguiram crescer apenas em um meio que contém ou amido solubi- lizado ou xilana solubilizada e conseguiram fermentar as mesmas em etanol em vários níveis. As cepas que também expressaram ex- cessivamente PDC apresentaram títulos mais altos de etanol que as cepas que apenas expressaram excessivamente os genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3).
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[013] Figura 1. Os Esquemas lineares dos plasmídeos pGAM1 (SEQ ID NO: 3) (~ 6,63 kb), pGAM1 (SEQ ID NO: 3)SWA2 (SEQ ID NO: 1) (~ 9,1 kb), pOR1 (~10,8 kb) e pOR11 (~10 kb). O fragmento de genoma S. cerevisiae que contém o gene LEU2 é apresentado como caixa cinza, o promotor HpGAP é apresentado como caixa verde, o terminal HpAOX: caixa laranja, o ORF do gene GAM1 (SEQ ID NO: 3) é apresentado como caixa azul, o ORF do gene SWA2 (SEQ ID NO: 1): caixa vermelha, o gene aminoglicosídeo 3- fosfotransferase (APH):caixa preta. Sítios de restrição:H, Hind III; RV, EcoRV; K, Kpn; RI, EcoR I; Sl, Sal I; BI, BamH I; Bg, Bgl II; Sc, Sac I; P, Pst I; Sm, Sma I.
[014] Figura 2. Os Esquemas lineares dos plamídeos pKO8-GAPpr (7,6 kb), pKO8-GAPpr_SWA2 (SEQ ID NO: 1) (9,1 kb) e pKO8-GAPpr_XYN2 (8,27 kb). O fragmento de genoma S. cerevisiae que contém o gene LEU2 é apresentado como caixa cinza, o promotor HpGAP é apresentado como caixa amarela, o terminal HpA- OX:caixa azul, o ORF do gene SWA2 (SEQ ID NO: 1):caixa vermelha, o ORF do gene TrXYN2:caixa laranja. Sítios de restrição:H, Hind III; Nd, Nde I; K, Kpn I; RI, EcoR I; Sl, Sal I; BI, BamH I; Bg, Bgl II; Sc, Sac I; P, Pst I; Nt, Not I.
[015] Figura 3. Os Esquemas lineares de plasmídeos pXYN2 (~ 4,24 kb), pXYN2xlnD (~ 7,61 kb) e pOR2 (~9,57 kb). Caixa cinza, o fragmento de genoma S. cerevisiae que contém o gene LEU2; caixa verde, o promotor HpGAP; caixa laranja, o terminal HpAOX; caixa azul, o fragmento que contém ORF de um gene A. niger xlnD; caixa vermelha, o fragmento que contém ORF de gene T. reseei XYN2. Sítios de restrição:H, Hind III; RV, EcoRV; K, Kpn I; RI, EcoR I; Sl, Sal I; B, BamH I; Bg, BgI II; Sc, Sac I; P, Pst I; Sm, Sma I; Xb, Xbal; Sp, Sph I.
[016] Figura 4. A produção de etanol pelos recombinan- tes de H. polymorpha, 2Eth- leul-1/pOR 1 # 14' (A) e # 7 (B) no meio YNB mínimo com 2 % de amido solúvel como única fonte de carbono com meio de pH:1 diferente- sem pH adjacente; 2 - pH 6; 3 - pH 5,5; 48 ° C, 135 rpm.
[017] Figura 5. A produção de etanol pela cepa recom- binante de H. polymorpha 495 2Eth- leul-1/pOR2 no meio YNB mínimo com 3% ou 9% xilana de madeira de vidoeiro com meio de pH diferente (A) e condições de aeração (B). 48° C.
[018] Figura 6. A demonstração de genes GAM1 (SEQ ID NO: 3), SWA2 (SEQ ID NO: 1), XYN2 (SEQ ID NO: 7), e xlnD sob o promotor de HpGAP em DNA genômico de transformadores de H. polymorpha por meio de PCR. Banda ## 2, 3:no par de iniciadores K43, Ko51 foi utilizado para análise dos transformantes obtidos pela transformação com plasmídeo pOR2 para mostrar o construto artificial: T. reesei XYN2 ORF fundido com promotor HpGAP e terminal HpAOX. Banda ## 4, 5: o par de iniciadores K43, Ko47 foi utilizado para análise dos transformantes obtidos por plas- mídeo pOR2 para apresentar o construto: A. niger xlnD fundido com o promotor HpGAP. Banda ## 6,7: o par de iniciadores K43, Ko49 foi utilizado para análise do transformante obtido por plasmídeos pOR1 e pOR11 para mostrar o construto: GAM1 (SEQ ID NO: 3) de Scw. occidentalis fundido com o promotor HpGAP1. Banda ## 8, 9: o par de iniciadores K43, Ko50 foi utilizado para análise dos transformantes obtidos por plasmídeos pOR1 e pOR11 para mostrar o construto: ORF de Scw. occidentalis SWA2 (SEQ ID NO: 1) fundido com o promotor HpGAP1 e terminador HpA0X. Banda ## 1, 10: marcadores DNA.
[019] Figura 7. A Formação de halos claros pelos re- combinantes de H. polymorpha que expressam os genes Scw. occi- dentalis SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) conduzidos pelo promotor HpGAP1. A cepa de controle Scw. occidentalis não produz um halo no meio suplementado com glicose (B) devido à repressão de promotores nativos de genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3). A segunda cepa de controle 2Eth- leul-1 não pode crescer no meio com amido como única fonte de carbono (A).
[020] Figura 8. A produção de etanol por cepas recom- binantes de H. polymorpha 2Eth- leul-1/pOR1 ## 7 e 14' no meio YNB mínimo com 2% do amido solúvel, 48 ° C, 135 rpm.
[021] Figura 9. A análise SDS-PAGE de meio cultural das cepas recombinantes # 7, 14 (495 2Eth- leul-1/pOR1), 1', 2' 4', 2g (495 2Eth- leul-1/pOR11) e cepa receptora 495 2Eth- leul- 1.A Eletroforese foi realizada com o uso de um gel de separação 8%, bandas de proteína foram visualizadas por mancha Coomasie e Silver. A, visualização de glucoamilase; B, visualização de α- amilase (SEQ ID NO: 2); as bandas difusas de α-amilase (SEQ ID NO: 2) presumidamente são devido às diferenciações de graus de glicosilação. L, marcador de peso molecular de proteína.
[022] Figura 10. A Formação de halos claros pelos re- combinantes de H. polymorphas ##7, 14 (495 2Eth- leul-1/pOR1) e integrantes de multicópias ## 1', 2', 3', 4' e 2g (495 2Eth- leul-1/pOR11).
[023] Figura 11. Resultados de hibridização Southern dot-blot que ilustra um número de cópia de genes codificando enzimas amilolíticas em transformantes de H. polymorpha. O promotor HpGAP foi utilizado como uma sonda. Cepas:1 - wt (1 cópia padrão); 2, 3 - ## 7, 14 (aproximadamente 3 a 4 cópias); 4, 5, 7 - ## 1', 2', 4', respectivamente (aproximadamente 6 a 8 có-pias); 6 - # 3' (~3 cópias).
[024] Figura 12. A Atividade específica de α-amilase (SEQ ID NO: 2) (A) e glucoamilase (SEQ ID NO:4) (B) em meio cultural de cepas de levedura recombinantes ## 7, 14, 6 (495 2Eth- leul-1/pOR1) contendo 3 a 4 cópias de genes de amilase e ## 1', 2' 4', 2g (495 2Eth- leul-1/pOR11) contendo 6 a 8 cópias dos genes.
[025] Figura 13. A produção de etanol pelos recombi- nantes de H. polymorpha 2Eth- leul-1/pOR1 (# 1: um meio de produção de etanol das cepas ## 7 e 14) e 2Eth- leul-1/pOR11 (# 2: um meio de produção de etanol das cepas ## 1', 2', 4', 2g). As cepas foram cultivadas em meio YNB mínimo com 3% de amido solúvel de pH 5,5, 48 ° C, 135 rpm.
[026] Figura 14. A produção de etanol pelas cepas de H. polymorpha que expressem excessivamente os genes de enzimas amilolíticas e gene PDC1 no meio mínimo com 3% amido solúvel; 48°C, 135 rpm. 4', os transformantes 495 2Eth- leul-1/pOR11 (cepas de recipiente, controle); 6p, 10, 12, as transformantes 4'/ploxZeoloxPDC1Hp.
[027] Figura 15. A Formação de halos claros pelo re- combinante de H. polymorpha #6p (4'/ploxZeoloxPDC1Hp) e seus derivativos: integrantes ## 1, 2, 2-1, 3, 4, 5, 7, 9, 10 (6p/pOR1).
[028] Figura 16. A produção de etanol pelas cepas de cepa de H. polymorphas que expressam excessivamente as enzimas amilolíticas e Pdc1p em meio mínimo com 3% de amido solúvel em 47°C com aeração restrita. 4', o transformante 495 2Eth- Ieu1- 1/pOR11; 6p, o transformante 4'/pZeoloxPDC1Hp; 3, 4, 5, os transformantes 6p/pOR1.
[029] Figura 17. O crescimento de recombinantes de H. polymorpha que expressam genes endoxilanase (SEQ ID NO: 8) e β- xilosidase (SEQ. ID NO 6) no meio com a xilana como única fonte de carbono. A, Crescimento das cepas recombinantes que expressam genes de endoxilanase e β-xilosidase (cepas ## 6x e 8x) em meio sólido com xilana como única fonte de carbono. B, Acúmulo de biomassa por cepas que expressam genes de endoxilanase (SEQ ID NO: 8) e β-xilosidase (SEQ. ID NO 6) durante o crescimento em meio mínimo líquido com 3% de xilana de madeira de vidoeiro (B1) ou 2% de xilose (B2), 48 °C, 240 rpm. 6x, 8x, os transfor- mantes 495 2Eth- leu1-1/pOR2.
[030] Figura 18. Formação de halos amarelos (A) ou claros (B) pelos recombinantes de H. polymorpha que expressam os genes A.niger xlnD e T.reseei XYN2.
[031] Figura 19. Atividade específica de endoxilanase (A) e β-xilosidase (B) em cultura de meio de cepas recombinan- tes de H. polymorpha 495 2Eth-/pOR2 ## 6x e 8x.
[032] Figura 20. A. sequência de construtos recombi- nantes que contém o promotor GAP de H. polymorpha (sublinhado simples) de modo operável ligado ao gene SWA2 (SEQ. ID NO 1) e ao terminal AOX de H. polymorpha AOX (sublinhado duplo). B. A sequência de aminoácido de α- amilase (SEQ. ID NO 2) de Schwan- niomyces occidentalis codificado pelo gene SWA2 (SEQ ID NO: 1).
[033] Figura 21. A. Sequência de um construto recombi- nante que contém o promotor GAP de H. polymorpha GAP (sublinhado simples) ligado de maneira operável a um gene GAM1 (SEQ. ID NO 3) e ao terminal AOX de H. polymorpha (sublinhado duplo). B. Sequência de aminoácido da glucoamilase (SEQ. ID NO 4) de Schwanniomyces occidentalis codificada pelo gene GAM1 (SEQ ID NO: 3).
[034] Figura 22. A. Sequência de um construto recombi- nante que contém o promotor GAP de H. polymorpha (sublinhado simples) ligado de modo operável a um gene xlnD (SEQ. ID NO 5) de A. niger incluindo sua sequência de terminal endógeno (SEQ. ID NO 9, sublinhado duplo). B. Sequência de aminoácido de β- xilosidase (SEQ. ID NO 6) codificada pelo gene xlnD.
[035] Figura 23. A. Sequência de um construto recombi- nante que contém o promotor GAP de H. polymorpha (sublinhado simples) ligado de modo operável a um gene Xyn2 (SEQ. ID NO 7) de Trichoderma reesei incluindo sua sequência de terminal endógeno (SEQ. ID NO 10, sublinhado duplo). B. Sequência de aminoá- cido de endo-β-xilanase (SEQ. ID NO 8) codificado pelo gene Xyn2.
[036] Descrição Detalhada de Métodos, Cepas e Resultados
[037]Cepas e Meios.
[038]A cepa de H. polymorpha 495 2Eth- leu1-1 deficiente de β-isopropilamato desidrogenase e que não consegue crescer em etanol [14], foi utilizada como recipiente para isolamento dos recombinantes amilolíticos e xilanolíticos. Esta cepa é um derivativo de NCYC 495 leu1-1 [8]. Cepas e transformantes de levedura cresceram em YPD (0,5% extrato de levedura, 1% pep- tona, 2% glicose) ou meio mínimo (0,67% YNB sem aminoácidos, 2% glicose, 3% amido solúvel (Sigma S2630-500G) ou 3% xilana de madeira de vidoeiro (Fluka X0502-100G) em 37oC ou 48 °C. Para a cepa 495 2Eth- leu1-1, leucina (40 mg/l) foi adicionada ao meio. Para a seleção de transformantes de levedura em YPD, 0,2 mg/l de G418 (geneticina) ou 150 μg/ml de zeocina foram adicionados.
[039]A cepa E. coli DH5α [Φ80dlαcZΔM15, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17(r-k, m+x), supE44, relAl, deoR, Δ(lac- ZYA- argF)U169] foi utilizada como hospedeira para propagação de plasmídeos. A cepa cresceu em 37°C em meio LB tal como descrito previamente [27]. Células transformadas E. coli foram mantidas em um meio que contém 100 mg/L de ampicilina. Técnicas de DNA.
[040] Técnicas padrão de clonagem foram aplicadas [27]. Isolamento de DNA plasmídeo de E. coli foi experimentado com o Sistema de Purificação de DNA Minipreps Wizards Plus SV (Promega, Madison, WI, E.U.A). O DNA genômico de H. polymorpha, Scw. occidentalis, T. reesei e A. niger foi isolado utilizando o Kit de Purificação Wizards DNA genômico (Promega, Madison, WI, E.U.A). As endonucleases de restrição, ligase de DNA T4 e polimerase de DNA T4 (Fermentas, Vilnius, Lituânia) foram utilizadas de acordo com as especificações do fabricante. Os fragmentos de DNA foram separados em 0,8% gel de agarose (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, E.U.A) em 1xTAE [27]. O isolamento de fragmentos de gel foi executado com Kit de Extração de DNA (Millipore, Bedford, MA, E.U.A). polimerase de DNA Taq e Poli- merase de Mistura com Alta Fidelidade (Fermentas, Vilnius, Lituânia) foram utilizados para PCR analítico e preparativo, respectivamente. Os PCRs foram executados em termociclador GeneAmps PCR Sistema 9700 (Applied Byosistems, Foster City, CA, E.U.A). A transformação de levedura H. polymorpha pela eletro- poração foi executada como foi descrito acima [5], A construção de plasmídeos transportando os genes de α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase de Scw. occidentalis.
[041] O quadro aberto de leitura (ORF) junto com o terminal nativo do gene GAM1 (SEQ ID NO: 3) codificando glucoa- milase (~3,27 kb) foi isolado do DNA genômico da cepa Schw. oc- cidentalis NRRL Y-2470 pelo uso de iniciadores PCR Ko48 (CCC AAG CTT ATG ATT TTT CTG AAG CTG) e Ko4 9 (GGA AGA TCT TTC TTT ACA AGA CCA ATG). Os sítios de restrição Hind III e Bgl II foram incorporados aos iniciadores Ko48 e Ko49 (os sítios de clivagem estão sublinhados). O produto PCR foi digerido com endonucleases de restrição Hind III e BgI II e posto sob o promotor forte constitutivo do gene gliceraldeído-3-fosfato desidroge- nase (HpGAPpr), digerido com Hind III e Bam HI. O construto HpGAPpr+GAM1 (SEQ ID NO: 3) foi inserido em um sítio Bam HI do plasmídeo pUC57 por meio de ligação dupla. O plasmídeo resultante foi nomeado como pGAM1 (SEQ ID NO: 3) e utilizado como vetor para as seguintes construções (Figura 1). ORF do gene SWA2 (SEQ ID NO: 1) codificando α-amilase (SEQ ID NO: 2) (~2 kb) foi amplificado pelo PCR, com o uso de iniciadores de SWA1 (TAG TCG CA TAT GAG ATT TTC AAC TGA AGG) , SWA2 (SEQ ID NO: 1) (CTA TTG ATT GCA GAT GCC AGA TCC C) e DNA genômico de Scw. occidentalis NRRL Y-247 como modelo. O sítio de restrição Nde I foi incorporado no iniciador SWA1. 5'- terminação do produto PCR foi digerido com Nde I, em que o 3'- terminação foi inadequado. O produto foi inserido no plasmídeo pKO8-GAPpr (Figura 2). ORF do gene SWA2 (SEQ ID NO: 1) foi posto sob o HpGAPpr e fundido com o terminador HpAOX (HpAOXtr). O plasmídeo construído pKO8-GAPpr_SWA2 (SEQ ID NO: 1) foi utilizado como modelo para amplificação por PCR do fragmento de DNA que contém HpGAPpt+SWA2_ORF+HpAOXtr utilizando iniciadores K43 (CCG GAT CCC AAT TAT CAT TAA TAA TC), Ko51 (CGC GGA TCC AAT CTT GCC TTT AAA ATG). O produto resultante de PCR foi digerido com endonuclease de restrição Bam HI e inserido no sítio Bam HI do plasmídeo pGAM1. O plasmídeo construído foi nomeado pGAM1SWA2 (Figura 1). O gene Saccharomyces cerevisiae LEU2 (marcador de seleção) foi inserido no sítio de restrição Pst I do plasmídeo pGAM1SWA2 e o construto resultante foi nomeado pOR1 (Figura 1).
[042] O gene aminoglicosídeo 3 -fosfotransferase (APH) que confere resistência ao G418 em leveduras foi isolado do plasmídeo pGLG61 após a sua digestão pela endonuclease de restrição Pst I. O fragmento de pGLG61 [30] Pst I que contém o gene foi ligado com a porção Pst I do plasmídeo pOR1 que carrega os genes recombinantes GAM1 (SEQ ID NO: 3), SWA2 (SEQ ID NO: 1) e parte de bactéria, mas sem o gene S. cerevisiae LEU2. O plas- mídeo resultante foi nomeado pOR11 (Figura 1).
[043]A sequência dos construtos recombinantes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) para expressão em H. polymorpha é apresentada nas Figuras 20 e 21 respectivamente. Construção de plasmídeos que carregam os genes de en- doxilanase e β-xilosidase de T. reesei e A. niger, respectivamente .
[044] O gene xlnD que codifica para β-xilosidase (SEQ. ID NO 6) foi derivado do fungo A. niger. ORF do gene xlnD junto com o terminador nativo (~2,79 kb) foi isolado do DNA genômico da cepa NRRL 3 A. niger utilizando iniciadores Ko46 (TGC TCT AGA ATG GCG CAC TCA ATG TCT CG) e Ko47 (CCC GAG CTC AGC TAT GCT AGC AAG CAG C). O produto PCR foi tratado com endonucleases de restrição Sac I e Xba I (os sítios destas endonucleases flanqueiam o produto) e coloca sob o HpGAPpr. O construto HpGA- Ppr+xlnD foi inserido no sítio de Sac I do plasmídeo pUC57. O plasmídeo resultante foi nomeado pxlnD e utilizado como vetor para as seguintes construções (Figura 3).
[045] ORF do gene XYN2 que codifica endoxilanase (~0,67 kb) sem região de íntrons foi amplificado pelo PCR, com o uso de iniciadores TR1 (TTC TCA CAT ATG GTT GCC TTT TCC AGC CCT CAT CTG CGC), TR2 (CTA GTT GCT GAC ACT CTG TGA GGC AGA ACC ACT ACC ACC), TRir (GAG CCG CCA AAG TTG ATG GGA GCA GAA GAT CCA GTC GTC), TRif (GAC GAC TGG ATC TTC TGC TCC CAT CAA CTT TGG CGG CTC) e DNA genômico de T. reseei NRRL 11460 como modelo. 5'- terminação do produto PCR foi digerido com Nde I, em que o 3'- terminação foi inadequado. O produto foi inserido no plasmídeo pKO8-GAPpr (Figura 2). ORF do gene XYN2 foi colocado sob HpGA- Ppr e terminado pelo HpAOXtr. O plasmídeo resultante pKO8- GAPpr_XYN2 (Figura 2) foi utilizado como modelo de amplificação pelo PCR do fragmento de DNA que contém HpGA- Ppr+ORF_XYN2+ HpAOXtr que usam iniciadores K43 (CCG GAT CCC AAT TAT CAT TAA TAA TC) , Ko50 (GGA AGA TCT AAT CTT GCC TTT AAA ATG). O produto resultante PCR foi digerido com endonucleases de restrição Bam HI e BgI II e inserido no sítio Bam HI do plasmídeo pxlnD. O plasmídeo construído foi nomeado pxlnDXYN2 (Figura 3).
[046] O gene S. cerevisiae LEU2 foi inserido no sítio do Pst I plasmídeo pxlnD XYN2 e o plasmídeo final foi designado como pOR2 (Figura 3).
[047]A sequência dos construtos recombinantes XyID e XYL2 para expressão em H. polymorpha são apresentados nas Figuras 22 e 23 respectivamente. Triagem para atividade de amilase.
[048]As cepas recombinantes obtidas após as transformações com plasmídeos que carregam genes de α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase (SEQ ID NO:4) foram triados por atividade amilolítica após plaqueamento em meio mínimo que contém 2% de amido solúvel (Sigma) como fonte de carbono. As placas foram incubadas a 37oC por dois dias seguidos após serem mantidas a 4oC durante a noite. Clones amilolíticos foram detectados por halos claros em torno de colônias [4, 16]. Triagem para atividade de endoxilanase (SEQ ID NO: 8)
[049] Transformantes correspondentes foram triados pela habilidade de degradação de xilana após serem plaqueados em meio mínimo que contém 0,2% de 4-Ometil-D-glucurono-D-xilana- remazol azul brilhante R (RBB)-xilana (Sigma) e 2% glicose como fonte de carbono. As placas foram incubadas a 37oC por três a quatro dias. A endoxilanase cliva a RBB-xilana em um produto incolor que forma halos claros em torno das colônias [11, 20]. Triagem para atividade de β-xilosidase (SEQ. ID NO 6)
[050] Os transformantes correspondentes foram triados pela atividade de β-xilosidase após serem plaqueados em meio mínimo que contém 1 mM de p-nitrofenil-e-D-xilosídeo (PNPX) e 2% de glicose como uma fonte de carbono. As placas foram incubadas a 37oC por uma a três horas. A atividade enzimática foi detectada pela produção de halos amarelos em torno das colônias [19]. Ensaios de atividade de α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase (SEQ ID NO:4)
[051] Diluições apropriadas da cultura sem células foram utilizadas para ensaios enzimáticos.
[052]A atividade de amilase total foi medida com o uso do método de ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS). Uma alí-quota de 50 μl de cultura sobrenadante foi incubada com 200 μl de 0,4M tampão de acetato de sódio (pH 5,0) que contém 2% amido solúvel por trinta minutos a 50 ° C. A mistura foi fervida por dez minutos até parar a reação. Uma unidade de atividade de α- amilase (SEQ ID NO: 2) foi definida como a quantidade de enzima requerida para liberar μmol de redução de açúcar por ml por minuto sob as mesmas condições de cultura [17, 22].
[053]No ensaio da atividade de glucoamilase, após manter 0,9 ml da solução de amido fervida no tampão de acetato de sódio (pH 5,5) a 30oC por cinco minutos, 0,1 ml da amostra foi adicionada e a mistura foi incubada por quinze minutos. A reação foi então interrompida ao ferver a mistura de reação por dez minutos, e a concentração de glicose produzida foi determinada com o uso do kit de ensaio "Diagluc" (UBT, Lviv, Ucrânia) [9]. A atividade de α-amilase (SEQ ID NO: 2) foi calculada pela subtração da atividade de glucoamilase da atividade total de amilase. Uma unidade de atividade de glucoamilase foi definida como a quantidade requerida de enzima para liberar 1 μmol de glicose por minuto do substrato [28]. Ensaios da atividade de β-xilosidase e endoxilanase
[054]As culturas produtoras de enzimas foram cultivadas em 3 ml YPD durante a noite. As células foram coletadas por centrifugação e sobrenadante foi utilizado para medir a atividade das enzimas.
[055]A atividade de endo-β-1,4-xilanase foi ensaiada pelo método descrito por Bailey et al. [1] com 1% de xilana de madeira de vidoeiro (Fluka) como substrato a 50 °C. As diluições apropriadas da solução de cultura sem células a 50 mM de tampão de citrato de sódio (pH 5,0) foram utilizadas como fonte de enzima. A quantidade de açúcar liberado foi determinada pelo método de ácido dinitrossalicílico [20]. A atividade de β- xilosidase (SEQ. ID NO 6) foi quantificada pelo uso de substrato cromofórico PNPX a uma concentração de 5 mM. O sobrenadante foi utilizado como fonte de β-xilosidase para ensaios de determinação de atividade. Todas as atividades foram expressas em kat/ml; um katal é a quantidade de enzimas necessárias para produzir 1 mol de redução de açúcar de xilana de madeira de vidoeiro ou substrato cromofórico por segundo [19]. Ensaio de produção de etanol.
[056] Para uma produção de etanol, os transformantes H. polymorpha foram cultivados durante quatro dias em meio mínimo líquido que contém 3% de amido solúvel ou 3% xilana de madeira de vidoeiro a 48°C, em condições semi-aeróbicas. As concentrações de etanol no meio foram determinadas após cada 24 horas utilizando o kit "Alcotest" [10]. Efeitos do pH e aeração na efetividade da fermentação de amido em etanol.
[057]As condições ótimas para a fermentação direta de amido em etanol por transformantes isolados foram estudadas. As cepas de levedura foram pré-culturadas a 48oC em 50 ml de meio YPD em frascos 125 ml Erlenmeyer por 48 horas com agitação estabelecidas a 220 rpm no agitador Inkubator 1000 Heidolph (Schwabach, Alemanha). As células foram inoculadas em concentração de 2 mg/ml em 50 ml da meio mínimo que contém 3% de amido de batata solúvel como única fonte de carbono.
[058] O efeito do pH do meio numa produção de etanol durante a fermentação de amido foi investigado. O ótimo pH para α-amilase (SEQ ID NO: 2) é ~ 6,0 e para glucoamilase é de 5,2 a 5,5. A fermentação foi feita utilizando o meio com pH 5,5 e 6,0. Um tampão de 1 M de fosfato de potássio foi utilizado ajustando-se o pH médio. A produção de etanol ficou no meio com pH 5.5 (Figura 4 A & B).
[059] O efeito de aeração na eficiência de fermentação foi estudado. As taxas de rotação de 120 a 180 rpm foram testados. A produção de etanol mais alta foi no caso de rotação de 135 rpm. Efeitos de pH, a aeração e concentração de substrato na efetividade de fermentação de xilana para etanol.
[060]As condições ótimas para a fermentação de xilana de madeira de vidoeiro para etanol por transformantes isolados forma estudados. As cepas de levedura foram pré-culturados a 48oC em 50 ml de meio YPD em frascos de 125 ml Erlenmeyer por 48 horas com agitação estabelecida a 220 rpm. As células foram removidas pela centrifugação a 4.000 rpm por cinco minutos, lavadas e inoculadas (em concentração de 2 mg/ml) em 50 ml de meio mínimo que contém 3% ou 9% de xilana de madeira de vidoeiro e 0,05% de glicose como fontes de carbono.
[061] O efeito do pH do meio na produção de etanol durante a fermentação de xilana foi investigado. A fermentação foi executada utilizando-se o meio com pH 4,5 e 5,8. Um tampão de solução de fosfato de potássio 1M foi utilizado para ajustar o pH médio com concentração final de 0,1M no meio. A melhor produção de etanol foi atingida no meio com pH 5,8 (Figura 5A).
[062] O efeito da aeração sobre a eficácia da fermentação foi estudado. As taxas de rotação de 120 a 180 rpm foram testadas. A produção de etanol mais alta no caso de 120 rpm (Figura 5B). A concentração mais alta de xilana (9%) resultou em uma melhor produção de etanol (Figura 5). Hibridização em transferência Southern
[063]A rotulação de sonda de DNA e hibridização foi desempenhada pelo uso de Rotulação de Ácido Nucléico Direto e Sistema de Detecção Amersham ECL não radioativo (GE Healthcare, E.U.A.), de acordo com o manual do fabricante. Para a transferência de pontos Southern quantitativa, o preparado de diluições em série de genômicos de DNA de levedura foi desnaturado em 0,4 M de NaOH, manchado sobre membrana de náilon (Hybond N+, Amersham Pharmacia Biotech) e rotulado com fragmentos de DNA apropriados, seguidos por visualização com o kit de detecção Amersham ECL tal como descrito acima. O HpGAPpr foi utilizado como sonda. Eletroforese em Gel.
[064] O SDS-PAGE foi executado pelo método de Laemmli [19]. As proteínas concentradas do extrato sem células foram visualizadas pela coloração Silver e coloridas com azul brilhante Coomassie. A concentração em gel fracionador e de empilhamento é 12% e 5% de poliacrilamida, respectivamente. 20 μl de solução Laemmli adicionada a 20 μl de mostra e 35 μl de mistura foram injetados ao gel fracionador [31]. Expressão Resultante de genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) de Scw occidentalis em H. polymorpha.
[065]A cepa de H. polymorpha 495 2Eth-leul-1 foi utilizada como recipiente para transformação pelo plasmídeo Sph I linearizado pOR1 (esquema de plasmídeo é apresentado na Figura 1). Depois que as células de transformação foram plaqueadas com um meio mínimo suplementado com 2% de glicose e 1% de amido solúvel. Entre ~ 140 transformantes os 14 que formaram os maiores halos claros amilolíticos foram os escolhidos. A presença de genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) sob HpGAPpr nestes transformantes foram apresentados por PCR utilizando iniciadores correspondentes (Figura 6). Os transformantes conseguiram crescer em amido solúvel e fermentar o substrato em etanol a 37 e 48 °C. A secreção eficiente das amilases com os integrantes foram apresentados pela formação de halos claros em torno das colônias (Figura 7 A & B). O melhor integrante selecionado (2Eth- leu1/pOR1 # 7) produziu acima de 3 g/l etanol após 48 horas de fermentação em um meio mínimo com 3% de amido solúvel a um pH 5,5, a 48oC (Figura 8). Para obter cepas de H. polymorpha com atividade amilolítica tentamos aumentar os núme- ros de cópias de SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3). Com este objetivo, o plasmídeo pOR1 l (Figura 3) levando o marcador dominante (gene APH que confere resistência para G418) e genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) foram utilizados. A cepa H. polymorpha 495 2Eth- leu1 foi utilizada como recipiente para transformação pelo plasmídeo linearizado Sph I pOR1 l. Após a transformação, as células foram plaqueadas em um meio YPD com 0,2 g/1 G418. Cinco transformantes estáveis foram encontrados e retirados entre ~ 80 resultando colônias resistentes a G418. A presença de genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) sob o HpGAPpr nestes transformantes foi mostrada em um meio por PCR utilizando iniciadores correspondentes (Figura 6). A produção de enzimas recombinantes ( α- e glucoamilase) por estas cepas foi demonstrada pela SDS-PAGE (Figuras 9 A e B).
[066] Isolados acompanhando a transformação com o plasmídeo pOR1 l formaram halos claros amilolíticos maiores em relação aos melhores transformantes isolados previamente do plasmídeo pOR1 (Figura 10). A hibridização Southern demonstrou a presença de aproximadamente seis a oito cópias dos genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) nos transformantes isolados (Figura 11).
[067] Os transformantes 495 2Eth- leu1-1/pOR11 mostraram uma atividade mais alta tanto do α- quanto do glucoamilase quando comparados com as cepas que contêm apenas três a quatro cópias dos genes de amilase (Figuras 12 A e B).
[068]A eficácia da fermentação de amido alcoólico de transformantes isolados foi estudada. Estes transformantes apresentaram uma elevada produção de etanol (6,5 g/l após 72 horas de cultivo) quando comparados com os transformantes isolados previamente pela transformação pOR1. A fermentação foi executada em um meio YNB mínimo com 3% de amido solúvel a pH 5,5, 48 °C, 135 rpm (Figura 13). Isolamento das cepas de H. polymorpha com propriedades melhoradas de fermentação de amido.
[069] O plasmídeo ploxZeoloxPDClHp construído previamente em laboratório [14], foi utilizado para obter cepas de H. polymorpha com propriedades amilolíticas melhoradas. Seguindo a expressão excessiva do gene de piruvato descarboxilase (PDC1), estas cepas foram caracterizadas por uma produção de etanol melhorada quando comparadas à cepa de controle 495 2Eth- [14]. O plasmídeo ploxZeoloxPDC1Hp que contém o gene PDCl conduzido com o HpGAPpr foi linearizado pelo BamHI e utilizado para a trans-formação da cepa #4', isolada previamente (495 2Eth-/pOR1). Os transformantes resistentes a zeocina foram selecionados em um meio YPD suplementada com 150 μg/ml de zeocina. Alguns destes integrantes estáveis foram selecionados para futuros estudos. A efetividade da fermentação alcoólica destes recombinantes foi estudada. Todos os transformantes apresentaram níveis mais altos da produção de etanol (7 a 8 g/l) comparados com a cepa 4' (acima de 4 g/l; Figura 14).
[070]A cepa #6 (o transformante 4'/ploxZeoloxPDC1Hp, que apresentou o nível mais alto da produção de etanol) foi utilizado como recipiente para a transformação com o plasmídeo pOR1 linearizado com Sph I. Os transformantes Leu+ foram selecionados em um meio mínimo sem leucina e estabilizados. Os trans- formantes estáveis forma plaqueados em um meio mínimo suplementada com 2% amido solúvel. Alguns dos integrantes, que formaram halos claros maiores em comparação com a cepa #6, foram selecionados para estudos futuros (Figura 15). A efetividade de fermentação alcoólica desses recombinantes foi estudada. Todos os transformantes mostraram níveis mais altos da produção de eta- nol (9 - 10 g/l) quando comparados com a cepa #6 (Figura 16). Expressão dos genes T.reesei XYN2 e A. niger XLND em H. polymorpha.
[071] O plasmídeo pOR2 que contém os genes T. reesei XYN2 e A. niger xlnD conduzidos com o HpGAPpr (Figura 3) foi linearizado por Sphl e utilizados para transformação da cepa H. polymorpha 495 2Eth-leul-1. Os transformantes Leu+ foram estabilizados. A presença dos genes XYN2 e xlnD sob o HpGAPpr em transformantes foi testada por PCR utilizando os iniciadores correspondentes (Figura 6).
[072] Os transformantes conseguiram crescer em xilana como única fonte de carbono (Figuras 17, A, B1 e B2). A secreção eficiente de endoxilanase (SEQ ID NO: 8) e β-xilosidase (SEQ. ID NO 6) com os integrantes foi apresentada pela formação de halos claros ou amarelos em meio que contém 0,2% RBB-xilana ou ImM PNPX, respectivamente (Figura 18 A e B). A atividade de ambas as enzimas foi medida (Figura 19 A e B). Os transforman- tes conseguiram fermentar xilana de madeira de vidoeiro em eta- nol com baixa eficiência (aproximadamente 0,35 g/l) em ambos a 37 e 48°C. Co-expressão de T.reesei XYN2, A. niger XLND, com genes Scw. occidentalis SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) em H. polymorpha.
[073] Em um primeiro caso, os transformantes 495 2Eth- leul-1/pOR11 que contêm ambos os genes α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase de Scw. occidentalis integrados ao cromossomo de H. polymorpha são utilizados na cepa hospedeira. O plasmídeo pOR2 que contém os genes T. reesei XYN2 e A.niger xlnD conduzidos com o HpGAPpr é linearizado pelo Sphl e utilizado para a transformação da cepa H. polymorpha 495 2Eth-leu1-1/pOR11. Os transformantes são estabilizados como antes. A presença dos genes XYN2 e xlnD é testada por meio de PCR utilizando os iniciadores correspondentes. Os transformantes serão podem ser cultivados com amido solúvel e/ou xilana solúvel como única fonte de carbono. A secreção eficiente das quatro enzimas será demonstrada essencialmente tal como foi descrito acima. Os transfor- mantes podem fermentar em um meio misturado que contém tanto o amido solúvel quanto xilana de madeira de vidoeiro em etanol tanto a 37 quanto a 48°.
[074] Em um segundo caso, o transformante descrito acima, tendo ambos os genes α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoa- milase já transformados na cepa, A'/ploxZeoloxPDClHp, que expressa excessivamente o gene PDC é utilizado como cepa hospedeira. Novamente, o plasmídeo pOR2 que contém os genes T. reesei XYN2 e A.niger xlnD conduzidos com o HpGAPpr é linearizado pelo Sphl e utilizado para transformação da cepa hospedeira H. polymorpha. Os transformantes são estabilizados como antes. A presença dos genes XYN2 e xlnD é testada por PCR utilizando iniciadores correspondentes. Os transformantes serão podem ser cultivados com amido solúvel e/ou xilana solúvel como única fonte de carbono. A secreção eficiente das quatro enzimas será demonstrada essencialmente tal como descrito acima. Os trans- formantes podem fermentar um meio misturado que contém tanto o amido solúvel quanto xilana de madeira de vidoeiro em etanol a ambos 37 e 48o em um nível mais alto do que os transformantes fizeram no primeiro caso devido à expressão excessiva complementar da enzima PDC na célula hospedeira.
DISCUSSÃO
[075]A produção de etanol para combustível de materi- al de planta renovável tem grande significado econômico e ecológico. Um dos subprodutos da indústria de fresagem a úmido de milho que já está disponível em grandes quantidades é a fração de casca de fibra de milho. Esta fração é misturada e secada com outros subprodutos processantes e fração de destilamento de fermentação de etanol para produzir alimento de glúten de milho. As cascas de fibra de milho consistem de 35% hemicelulose, 18% celulose e 20% amido (proteína, olho de fibra e lignina estão presentes também neste material) [7], a xilana é o maior componente da hemicelulose. Os estágios industriais que incluem hidrólise enzimática de xilana e amido são demasiado caros. Por isso a conversão microbial direta destes polímeros em etanol é de grande significância Econômica. Por esta razão, o desenvolvimento de micro-organismos podem realizar hidrólise simultânea de amido e xilana e fermentação dos açúcares liberados em eta- nol a temperaturas elevadas é de grande importância para a produção de combustível de etanol do milho. A glicose e a xilose são os principais açúcares liberados após hidrolise de amido e xilana, respectivamente. A levedura H. polymorpha fermenta a glicose e a xilose em etanol a temperaturas elevadas. No entan-to, a H. polymorpha não pode utilizar materiais de amido e xi- lana e cultivar neles como única fonte de carbonos.
[076] Foram clonados dois genes da levedura Scw. occi- dentalis SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) que codificam a α-amilase (SEQ ID NO: 2) e glucoamilase (SEQ ID NO:4), respectivamente. Ambas estas enzimas são necessárias para hidrólise de amido. Os genes SWA2 (SEQ ID NO: 1) e GAM1 (SEQ ID NO: 3) foram expressos com sucesso na H. polymorpha. Cepas re- combinantes isoladas são podem ser cultivadas em amido como única fonte de carbono. São também podem fermentar amido solú- vel em etanol a 48 ° C. Nós mostramos que números de cópias crescentes de genes aumentam a capacidade das cepas recombinan- tes para a hidrólise de amido e produção de etanol.
[077] Os genes de T. reesei XYN2 e A. niger xlnD que codificam a endoxilanase e β-xilosidase, respectivamente, foram clonados e expressados em H. polymorpha. Pelo menos duas destas enzimas são necessárias para a hidrólise de xilana. Integrantes isolados conseguiram crescer com a xilana como única fonte de carbono e fermentá-la em etanol a ambos 37 e 48 °C. A baixa efetividade da conversão de xilana em etanol por cepas isoladas é mais provável devido à capacidade inicial baixa de cepas de H. polymorpha na fermentação alcoólica de xilose. As melhorias futuras na fermentação de xilana pelas cepas construídas exigirão uma fermentação etanólica de xilose como pré-requisito. Estas cepas poderão então ser utilizadas como recipientes para construção de recombinantes efetivos xilanolíticos. REFERÊNCIAS 1. Bailey, M. J., P. Biely e K. Poutanen. 1992. Inter laboratory testing of methods for assay of xylanase activity. J. Biotechnol. 23:257 a 270. 2. Banat, I.M., P. Nigam, D. Singh, P. Marchant e A.P. McHale. 1998. Ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentrations. Part I:yeasts in general. World J Microbiol Biotechnol. 14:809 a 821. 3. Dmytruk, O. V., A. Y. Voronovsky, C. A. Abbas, K. V. Dmytruk, O. P. Ishchuk e A. A. Sibirny. 2008. Overexpression of bacterial xylose isomerase and yeast host xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res. 8:165 a 173. 4. Eksteen, J.M., P. van Rensburg, R.R. Cordero Otero e LS. Pretorius. 2003. Starch fermentation by recombinant Sac- charomyces cerevisiae strains expressing the α-amylase and glucoamylase genes from Lipomyces kononenkoae and Saccharomycopsis fibuligera. Biotechnol. Bioengineer. 84:639 a 646. 5. Faber, KN, P. Haima, W. Harder, M. Veenhuis e G. Ab. 1994. Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 25:305 a 310. 6. Fujita, Y. e J. Ito. 2004. Synergistic saccharification e direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme. Appl. Environ. Microbiol. 70:1.207 a 1.212. 7. Gaspar, M., G. Kalman e K. Reczey. 2007. Corn fiber as a raw material for hemicellulose and ethanol production. Process Biochem. 42:1.135 a 1.139. 8. Gellissen, G., G. Kunze, C. Gaillardin, J.M. Cregg, E. Berardi, M. Veenhuis e I. van der Klei. 2005. New yeast expression platforms based on methylotrophic Hansenula polymorpha and Pichia pastoris and on dimorphic Arxula adenini- vorans and Yarrowia lipolytica a comparison. FEMS Yeast Res. 5:1.079 a 1096. 9. Gonchar, M. V. 1998. Sensitive method for quantitative determination of hydrogen peroxide and oxidase substrates in biological samples. Ukr. Biokhim. Zh. 70:157 a 163. 10. Gonchar, M. V., M.M. Maidan e A. A. Sibirny. 2001. A new oxidase-peroxidase kit for ethanol assays in alcoholic beverages. Food Technol. Biotechnol. 39:37 a 42 11. den Haan R. e W. H. van ZyI. 2001. Differential expression of the Trichoderma reesei [beta]-xylanase II (xyn2) gene in the xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Appl Mi- crobiol Biotechnol. 57:521 a 527. 12. Haki, G.D. e S.K. Rakshit. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes:a review. Bioresource Technology. 89:17 a 34. 13. Ishchuk, O. P., A. Y. Voronovsky, O. V. Stasyk, G. Z. Gayda, M. V. Gonchar, C. A. Abbas e A. A. Sibirny. 2008. Improvement of xylose high-temperature fermentation in Hansenu- la polymorpha due to overexpression of the PDCl gene coding for pyruvate decarboxylase. FEMS Yeast Res. Em imprensa. 14. Jeffries, T. W. e Y. S. Jin. 2000. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by yeasts. Adv. Appl. Microbiol. 47:221 a 268. 15. Kadam, K. L. e S. L. Schmidt. 1997. Evaluation of Candida acidothermophilum in ethanol production from lignocellulosic biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:709 a 713. 16. Kang, N. Y., J. N. Park, J. E. Chin, H. B. Lee, S. Y. Im e S. Bai. 2003. Construction of an amylolytic indus-trial strain of Saccharomyces cerevisiae containing the Schwan- niomyces occidentalis α-amylase gene. Biotechnol. Lett. 25:1.847 a 1.851. 17. Kiliç, D. e B. Õzbek. 2004. a- Amylase inactiva-tion by temperature during starch hydrolysis. Process Biochem. 39:1.137 a 1.144. 18. Kulkarni, N., A. Shendye e M. Rao. 1999. Molecu-lar and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiol. Rev. 23:411 a 456. 19. La Grange, D. C, I. S. Pretorius, M. Claeyssens e W. H. van ZyI. 2001. Degradation of xylan to D-xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae coexpressing the Aspergillus niger β-xylosidase (xlnD) and the Trichoderma reesei xylanase II (xyn2) genes. Appl. Environ. Microbiol. 67:5.512 a 5.519. 20. La Grange, D. C, I. S. Pretorius e W. H. van ZyI. 1996. Expression of a Trichoderma reesei [beta]-xylanase gene (XYN2) in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 62:1.036 a 1.044. 21. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural pro-teins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:680 a 685. 22. Liu, Z., G. Zhang e S. Liu. 2004. Constructing an amylolytic brewing yeast Saccharomyces pastorianus suitable for accelerated brewing. J. Biosci. Bioeng. 98:414 a 419. 23. Marin, D., A. Jimenez e M. Fernandez Lobato. 2001. Construction of an efficient amylolytic industrial yeast strain containing DNA exclusively derived from yeast. FEMS Microbiol. Lett. 201:249 a 253. 24. Mosier, N. e C. Wyman. 2005. Features of promi-sing technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 96:673 a 686. 25. Piontek, M., J. Hagedorn, C. P. Hollenberg, G. Gellissen e A. W. M. Strasser. 1998. Two novel gene expression systems based on the yeasts Schwanniomyces occidentalis and Pi- chia stipitis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:331 a 338. 26. Ryabova, O. B., O. M.Chmil e A. A.Sibirny. 2003. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermoto- lerant methylotrophic yeast Hansemila polymorpha. FEMS Yeast Res. 4:157 a 164. 27. Sambrook, J., E. F. Fritsh e T. Maniatis. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 28. Shigechi, H., Y. Fujita, J. Koh, M. Uedac, H. Fu kuda e A. Kondo. 2004. Energy-saving direct ethanol production from low-temperature-cooked corn starch using a cell-surface engineered yeast strain co-displaying glucoamylase and [alpha]- amylase. Biochem. Eng. J. 18:149 a 153. 29. Shigechi, H., J. Koh, Y. Fujita, T. Matsumoto, Y. Bito, M. Ueda, E. Satoh, H. Fukuda e A. Kondo. 2004. Direct production of ethanol from raw corn starch via fermentation by use of a novel surface-engineered yeast strain codisplaying glucoamylase and [alfa]-amylase. Appl. Environ. Microbiol. 70:5.037 a 5.040. 30. Sohn, J. H., E. S. Choi, H. A. Kang, J. S.Rhee, M. O. Agaphonov, M. D. Ter-Avanesyan e S. K. Rhee. 1999. A dominant selection system designed for copynumber-controlled gene integration in Hansenula polymorpha DL-I . Appl Microbiol Bio- technol 51:800 a 807. 31. Torronen, A., L. R. Mach, R. Massner, R. Gonza-les, N. Kalkkinen, A. Harkki e C. P. Kubicek. 1992. The two major xylanases from Trichoderma reese: characterization of both enzymes and genes. Biothechnology. 10:1.461 a 1.465. 32. Ulgen, K. O. e B. Saygih. 2002. Bioconversion of starch into ethanol by a recombinant Saccharomyces cerevisiae strain YPG-AB. Process Biochem. 37:1.157 a 1.168. 33. de Vries, R. P. e J. Visser. 2001. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides. Microbiol. MoI. Biol. Rev. 65:497 a 522. 34. Wang, T. T., L. L. Lin e W. H. Hsu. 1989. Cloning and expression of a Schwanniomyces occidentalis α-amylase gene in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environment. Microbiol. 55:3.167 a 3.172. 35. Zaldivar, J., J. Nielsen e L. Olsson. 2001. Fuel ethanol production from lignocellulose:a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Bio- technol. 56:17. 1/2

Claims (6)

1. CEPA H. POLYMORPHA, caracterizada por compreender pelo menos um gene SWA2 que codifica uma α-amilase, de acordo com a SEQ ID NO: 2, e, pelo menos, um gene GAM1 que codifica uma glucoamilase, de acordo com a SEQ ID NO: 4, sendo que os genes são ligados de modo operável a pelo menos um HpGAP promotor obtido de H. polymorpha, que expresse os ditos genes na cepa de H. polymorpha, e que inclui, adicionalmente, um gene PDC1 que codifica uma piruvato descarboxilase de H. polymorpha ligado de modo operável a um Promotor HpGAP que expressa a dita piruvato descarboxilase na cepa de H. polymorpha e as ditas enzimas α-amilase e glucoamilase são secretadas em um meio de crescimento da cepa H. polymorpha que contém apenas amido solúvel como uma fonte de carbono a uma temperatura de 37 °C a 48 °C.
2. CEPA DE H. POLYMORPHA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos genes SWA2 e GAM1, que codificam uma α-amilase e uma glucoamilase, respetivamente, serem integrados dentro do cromossomo de H. polymorpha.
3. CEPA DE H. POLYMORPHA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o pelo menos um gene SWA2 ou GAM1, incluir, adicionalmente, um terminador ligado de modo operável ao dito gene para terminar a transcrição do gene expressado.
4. CEPA DE H. POLYMORPHA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos um gene Xyn2 que codifica uma endoxilanase, de acordo com a SEQ ID NO: 8, e, pelo menos, um gene xnlD que codifica uma β-xilosidase de acordo com a SEQ ID NO: 6, em que cada gene é ligado de modo operável a pelo menos um promotor que expresse os ditos genes na cepa de H. polymorpha e as ditas enzimas sejam secretadas em um meio de 2/2 crescimento da cepa de H. polymorpha que contenha apenas ou em uma única combinação, um amido solúvel e uma xilana solúvel como fonte de carbono.
5. PROCESSO PARA A FABRICAÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender o crescimento da cepa de H. polymorpha, conforme definido na reivindicação 1, em um meio que compreende amido solúvel sob as condições que fazem com que a H. polymor- pha produza etanol.
6. PROCESSO PARA A FABRICAÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender o crescimento da cepa de H. polymorpha, conforme definido na reivindicação 1, em um meio que compreende amido solúvel e uma xilana solúvel sob as condições que fazem com que a H. polymorpha produza etanol.
BRPI0908308-1A 2008-03-24 2009-05-06 cepa h. polymorpha, e processo para a fabricação de etanol BRPI0908308B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5068508P 2008-05-06 2008-05-06
US61/050,685 2008-05-06
PCT/US2009/042975 WO2009137574A2 (en) 2008-05-06 2009-05-06 Development of strains of the thermotolerant yeast hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan by expression of starch and xylan degrading enzymes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0908308A2 BRPI0908308A2 (pt) 2015-07-21
BRPI0908308B1 true BRPI0908308B1 (pt) 2021-01-12

Family

ID=41265371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0908308-1A BRPI0908308B1 (pt) 2008-03-24 2009-05-06 cepa h. polymorpha, e processo para a fabricação de etanol

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9388399B2 (pt)
EP (1) EP2279241B1 (pt)
CN (2) CN102112596B (pt)
BR (1) BRPI0908308B1 (pt)
HU (1) HUE050997T2 (pt)
WO (1) WO2009137574A2 (pt)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011128712A1 (en) * 2010-04-12 2011-10-20 Stellenbosch University Biofuel production
ES2371317B1 (es) * 2010-06-14 2012-11-07 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanol.
US10066237B2 (en) 2011-11-22 2018-09-04 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2013075644A1 (en) * 2011-11-22 2013-05-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
JP2015501643A (ja) 2011-12-09 2015-01-19 ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー 発酵ブロスから生成物アルコールを取り出す方法
CN104428418B (zh) * 2012-01-12 2018-06-15 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 赋予酵母对乙醇和高温的耐受性的基因
CA2997380A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Yeast strains for the expression and secretion of heterologous proteins at high temperatures
GB201620658D0 (en) * 2016-12-05 2017-01-18 Univ Stellenbosch Recombinant yeast and use thereof
FR3083245B1 (fr) 2018-07-02 2022-06-17 Lesaffre & Cie Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogenes et leur utilisation dans la production de bioethanol

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257115A1 (en) * 1986-08-21 1988-03-02 Heineken Technisch Beheer B.V. Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes
EP0260404B1 (en) * 1986-08-21 1995-05-31 VAN DEN BERG, Robert Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes
US5487989A (en) * 1988-08-31 1996-01-30 Bioenergy International, L.C. Ethanol production by recombinant hosts
DE4329969A1 (de) * 1993-09-04 1995-03-09 Basf Ag Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen in Hefe
US5935789A (en) * 1997-01-31 1999-08-10 Korea Institute Of Science And Technology Autonomously replicating sequences, GAPDH gene and promoter derived from Hansenula polymorpha, expression vectors containing same and method for the selection of transformants
EP0911416B1 (en) * 1997-10-01 2006-05-17 DSM IP Assets B.V. Protein production process
DK1242603T3 (da) * 1999-11-23 2004-06-28 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Integrationsvektorer og fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante proteiner i svampe
DE10220894A1 (de) * 2002-05-10 2003-11-27 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Promotoren mit veränderter Transkriptionseffizienz

Also Published As

Publication number Publication date
CN103060216A (zh) 2013-04-24
EP2279241A4 (en) 2012-05-30
CN102112596B (zh) 2014-06-18
EP2279241A2 (en) 2011-02-02
BRPI0908308A2 (pt) 2015-07-21
WO2009137574A3 (en) 2010-04-15
US20110045562A1 (en) 2011-02-24
HUE050997T2 (hu) 2021-03-01
EP2279241B1 (en) 2020-04-08
WO2009137574A2 (en) 2009-11-12
US9388399B2 (en) 2016-07-12
CN103060216B (zh) 2016-07-06
CN102112596A (zh) 2011-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Voronovsky et al. Development of strains of the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan
CA2657684C (en) Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
EP2279241B1 (en) Development of strains of the thermotolerant yeast hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan by expression of starch and xylan degrading enzymes
ES2527681T3 (es) Tratamiento de material celulósico y enzimas útiles en el mismo
EP2197893B1 (en) Novel fungal enzymes
KR101120359B1 (ko) 섬유소를 효과적으로 분해할 수 있는 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 재조합벡터를 포함하는 형질전환체, 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법
JP2016154548A (ja) 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法
WO2012027374A2 (en) Novel fungal carbohydrate hydrolases
WO2009138877A2 (en) Heterologous expression of fungal cellobiohydrolases in yeast
BRPI0614631A2 (pt) proteìnas de fusão entre enzimas de degradação de parede celular de plantas, e seus usos
WO2012021883A2 (en) Novel fungal enzymes
US20120282666A1 (en) Method for producing ethanol
CN102858969B (zh) β-葡萄糖苷酶及其用途
CN102159700A (zh) 纤维素水解力强化酵母的制作和使用
Ueda et al. Heterologous expression and characterization of a cold-adapted endo-1, 4− β− glucanase gene from Bellamya chinensis laeta
EP3262164B1 (en) Hemicellulose-degrading compositions and uses thereof
WO2015118205A1 (es) Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables
Sibanda Evaluation of high recombinant protein secretion phenotype of saccharomyces cerevisiae segregant
BR112017028171B1 (pt) Polinucleotídeo que codifica uma proteína tendo atividade de xilanase, vetor compreendendo o dito polinucleotídeo, método para fabricação de um transformante, transformante transformado com o dito vetor, agente de sacarificação de biomassa compreendendo proteína com atividade de xilanase e método para fabricação de açúcar a partir de biomassa
WO2015011319A1 (es) Célula hospedadora de myceliophthora thermophila que expresa una enzima alfa-xilosidasa heteróloga y su uso en un procedimiento de degradación de biomasa

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according art. 34 industrial property law
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according art. 34 industrial property law
B07A Technical examination (opinion): publication of technical examination (opinion)
B06A Notification to applicant to reply to the report for non-patentability or inadequacy of the application according art. 36 industrial patent law
B09A Decision: intention to grant
B16A Patent or certificate of addition of invention granted

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/01/2021, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.