BRPI0913577A2 - polipeptídeos cd83 solúveis, formulações e métodos de uso - Google Patents

Abstract

polipeptídeos scd83, sua composição farmacêutica, seus usos, bem como polinucleotídeo. a presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento ou a prevenção de repostas imunes indesejadas. as composições referem-se aos novos polipeptídeos solúveis (scd83) polipeptídeos e aos ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, formulações melhoradas (scd83) e ao uso de tais polipeptídeos e formulações no tratamento ou prevenção de alergias, doenças autoimunes e rejeição ao transparente. um polipeptídeos scd83 é fornecido, compreendendo seq id n°, 7 ou uma sequência de aminoácido possuindo uma identidade de, pelo menos 70% de seq id°: 7 são um aminoácido diferentes de cisteína, e, opcionalmente, um ou mais resíduos de aminiácidos 1,2,3,4 e 130 estão ausentes.

Description

I 4 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- i DEOS SCD83, SUA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, SEUS USOS, BEM h COMO POLINUCLEOTÍDEO". Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos novos polipeptídeos CD83 (SCD83) solúveis e aos ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos, as formulações (sSCD83) melhoradas e ao uso de tais proteínas e formulações no tratamento ou prevenção de alergias, doenças autoimunes e rejeição ao transplante.

Antecedentes da Invenção CD83 é uma molécula da superfamília de imunoglobulina (Ig) das proteínas (vide, por exemplo, Zhou e outros (1999) J.

Immunol. 149: 735-742; vide também a Patente US Nº 7.169.898; para revisão, vide Fujimoto e Ted- der ((2006) J.

Med.. 53 Dent:. Sci 86-91). CD83 serve como um marcador di- ferencial para células dendríticas maduras.

Embora a função precisa de CD83 continua a ser determinada, uma forma solúvel de CD83 tem sido relatada para ligar, também, as duas células dendríticas imaturas e maduras (vide Le- chmann e outros. (2001) (J. 194 Exp:. MED 1813-1821). Os autores também afirmaram que esta proteína diminuiu a expressão de CD80 e CD83 pelas o. 20 célulasdendríticas maduras in vitro e que inibiu a capacidade das células dendríticas de estimular as células T in vitro (vide também, Lechmann e ou- tros. (2002) Trends in Immunology 23 273-275). Similarmente, Kruse e outros. (2000) (J.

Exp.

Med. 191: 1581-1589) relataram que GC7 (N (1)-guanil-1,7- diaminoeptano) interferiu na translocação do núcleo citoplasmático do MRNA deCD83, impedindo a expressão da superfície de CD83 e inibindo, significati- vamente, a ativação dos linfócitos T por estas DCs.

Outros afirmaram a pre- sença de uma forma solúvel de CD83 in vivo (vide, por exemplo, Hock e ou- tros. (2002) Int.

Immunol.

Immunol. 13: 959-967). Estudos com DCs infecta- das por HSV-1 demonstram que a infecção viral leva à degradação do CD83 e ainibiçãodo transporte do MRNA de CD83, este possível mecanismo de es- cape pelo HSV-1 ainda suporta a importância de CD83 à biologia de DC (vide, por exemplo, Kruse e outros 74. (2000) J.: Virol. 7127-7136). |

O CD83 maduro inclui três domínios estruturais: um domínio ex- ' tracelular semelhante a lg; um domínio transmembrana; e um domínio cito- - plasmático.

O domínio extracelular de CD83 humano (hCD83ext, uma forma de sCD83) compreende um domínio simples semelhante a lg (tipo V) que é codificado por pelo menos dois éxons (vide, por exemplo, Zhou e outros ] (1999) J.

Immunol. 149: 735-742;GenBank ID *211697) e é fortemente ex- ' presso na superfície celular das células dendríticas maduras ('MDCs"). A patente US Nº 7.169.898 descreve uma sequência de ácido nucleico de cONA de CD83 humano (hCD83) (SEQ ID Nº: 1). A sequência de aminoácidos correspondente do comprimento total de hcD83 é mostrada na SEQ ID Nº: 2. Os resíduos de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID Nº: 2 cor- respondem a uma sequência de sinais, que é clivada da proteína madura B (resíduos de aminoácidos 20 a 205) Um domínio extracelular hcD83 - (hCD83ext) é codificado pela SEQ ID Nº:3. A sequência de aminoácido hCD83 correspondente é mostrada na SEQ ID Nº: 4 e também nos resíduos de aminoácidos 20 a 144 da SEQ ID Nº:2. O domínio transmembrana e o domínio citoplasmático correspondem aos resíduos de aminoácidos 145 a 166 da SEQ ID Nº: 2 e aos resíduos de aminoácidos 167 a 205 da SEQ ID Nº:2, respectivamente.

O hcD83ext do tipo selvagem contém três sítios de glicosilação (ou seja, os resíduos de aminoácido 60, 77 e 98 da SEQ ID Nº: 4) e cinco resíduos de cisteínas (ou seja, os resíduos de aminoácidos 27,35, 100, 107 e 129 da SEQ ID Nº: 2, que correspondem aos resíduos de amino- ácidos 8, 16, 81, 88 e 110 da SEQ ID Nº: 4). hCD83ext inibe a estimulação das células T mediada por DC (Lechmann e outros.

J.

Exp.

MED. (2001) 194:1813-1821) e é eficaz no tra- tamento do modelo de camundongo para a esclerose múltipla (encefalomíeli- te autoimune experimental (EAE); Zinser Med e outros (2004) J.

Exp: 200. 345-351). Estes estudos utilizaram um domínio extracelular hCD83 que compreendeu, adicionalmente, uma porção de quatro aminoácidos (Gly-Ser- —Pro-Gly, SEQ ID Nº:41) de um sítio de clivagem da trombina no terminal amino da proteína, assim como o primeiro aminoácido do domínio trans- membrana (Ile), e é mostrado na SEQ ID Nº: 5.

A publicação do PCT WOZ2004/046182 descreve um mutante Ú CDB83 solúvel em que o quinto resíduo de cisteina da SEQ ID Nº: 5 é mutado - de uma cisteína para uma serina para produzir a SEQ ID Nº: 6 (daqui por di- ante hcD83ext-M5) e propõe a utilização de hocD83ext-M5 e hCD83ext do ti- . 5 poselvagem no tratamento de doenças autoimunes, tais como esclerose múl- tipla e transplante.

Zinser e outros (Immunobiology (2006) 211:449-453) des- ' creve que hcD83ext do tipo selvagem forma um homodímero, em que as pri- meiras quatro cisteínas do domínio extracelular (ou seja, os resíduos de ami- noácidos 27, 35, 100 e 107 da SEQ ID Nº: 2; que correspondem aos resíduos de aminoácidos 12,20, 85 e 92 das SEQ ID Nº: 5 e 6) estão envolvidas na formação de ligações dissulfeto intramoleculares e a quinta cisteína (ou seja, o resíduo de aminoácido 129 da SEQ ID Nº: 1 ou o resíduo de aminoácido ' 114 da SEQ ID Nº: 5 e 6) é responsável pela ligação intermolecular do ho- . modímero.

Zinser e outros.

Ainda descrevem que as duas isoformas hCD83ext, ou seja, o dímero do tipo selvagem e o monômero mutante hcD83ext-m5, possuem uma capacidade semelhante inibitória quando testa- das in vitro e que a meia-vida biológica (in vivo) das duas isoformas hcCD83ext é comparável e foi entre 2 e 3 horas.

Além disso, usando o modelo EAE, Zin- ser e outros descrevem que uma isoforma mutante monomérica de CD83 so- lúvel (ou seja, hCD83ext-m5) tem uma atividade inibitória in vivo semelhante quando comparada com uma isoforma hcD83ext dimérica do tipo selvagem.

Tendo em vista as aplicações terapêuticas importantes de sCD83, os requerentes reconheceram a necessidade de polipeptídeos sCD83 melhorados e formulações do mesmo para o tratamento ou a pre- venção de uma resposta imune indesejada, tais como as doenças auto- imunes, alergias e rejeição ao transplante.

A presente invenção atende a es- ta necessidade e fornece vantagens adicionais também.

Breve Descrição da Listagem de Sequência SEQ ID Nº:1 representa um cDNA codificando uma proteína CD83 humana de comprimento total, incluindo a sequência do sinal.

SEQ ID Nº:2 representa a sequência de aminoácidos de uma proteína CD83 humana de comprimento total, incluindo a sequência do sinal.

SEQ ID Nº: 3 representa um cDNA codificando a sequência de ' aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano (hCD83ext). - SEQ ID Nº: 4 representa a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano (hCD83ext).

SEQ ID Nº: 5 representa a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular CD83 humano, que compreende ainda, no terminal a- ] mino, resíduos de aminoácidos (Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID Nº: 41), e no ter- minal carbóxi, o primeiro aminoácido do domínio transmembrana (Ile).

SEQ ID Nº: 6 representa uma variante da SEQ ID Nº: 5, em que o quinto resíduo de cisteína na posição 114 foi mutado em um resíduo de serina.

SEQ ID Nº: 7 representa uma variante de SEQ ID Nº: 5, em que ' o resíduo Xaa representa qualquer aminoácido. - SEQ ID Nº: 8 representa uma proteína de fusão hcD83ext. Os domínios GST e hcD83ext são separados pelo sitio de clivagem da trombi- na.

SEQ ID Nº: 9 representa um domínio extracelular hnCD83 do tipo selvagem, que compreende ainda o primeiro aminoácido (lle) do domínio transmembrana.

SEQ ID Nº: 10 representa um DNA codificando um mutante m5 C2S mutante de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 11 representa um mutante m5 C28S da SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 12 representa um DNA codificando um mutante m2 C2S mutante de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 13 representa um mutante m2 C2S de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 14 representa um DNA codificando um mutante m3 C28S de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 15 representa um mutante m3 C2S de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 16 representa um DNA codificando um mutante m4 C2SdeSEQIDNº: 9.

SEQ ID Nº: 17 representa um mutante m4 C28 de SEQ ID Nº: 9.

SEQ ID Nº: 18 representa um DNA codificando um mutante m2,3 |

C2S de SEQ ID Nº: 9. ' SEQ ID Nº: 19 representa um mutante m2, 3 C2S de SEQ ID Nº: - 9 SEQ ID Nº: 20 representa um DNA codificando um mutante m3,4 5 C2SdeSEQIDNº:º9. ] SEQ ID Nº: 21 representa um mutante m3,4 C2S de SEQ ID Nº: ' 9. SEQ ID Nº: 22 representa um DNA codificando um mutante m2,5 C2S de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 23 representa um mutante m2,5 C2S de SEQ ID Nº:

9. SEQ ID Nº: 24 representa um DNA codificando um mutante m3,5 “O C2SsdeSEQIDNº:9. . SEQ ID Nº: 25 representa um mutante m3,5 C2S de SEQ ID Nº:

O SEQ ID Nº: 26 representa um DNA codificando um mutante M4,5 C28S de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 27 representa um mutante M4,5 C2S de SEQ ID Nº:

9. SEQ ID Nº: 28 representa um DNA codificando um mutante m2, 3,5 C2S de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 29 representa um mutante m2, 3,5 C2S de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 30 representa um DNA codificando um mutante m3, 4,5C28SdeSEQID Nº:9 SEQ ID Nº: 31 representa um mutante m3,4,5 C2S de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 32 representa um iniciador para mutagênese C2S na segunda cisteína de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 33 representa um iniciador para mutagênese C2S na terceira cisteín de SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 34 representa um iniciador para mutagênese C28S na quarta cisteína de SEQ ID Nº: 9. ' SEQ ID Nº: 35 representa uma proteina CD83 de Pan trogloytes - (chimpanzé) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP 518248.2. SEQ ID Nº: 36 representa uma proteina CD83 da família Canis . 5 lupus (cão) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP 852647.1. SEQ ID Nº: 37 representa uma proteína CD83 de Bos taurus ' (bovino) e corresponde à sequência de Referência NCBI: NP 001040055.1. SEQ ID Nº: 38 representa uma proteina CD83 de Mus musculus (camundongo) e corresponde à sequência de Referência NCBI: NP 033986.1. SEQ ID Nº: 39 representa uma proteina CD83 de Rattus norve- gicus (ratazana) e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP 3415102. - SEQ ID Nº: 40 representa uma proteina CD83 de Gallus gallus (galinha selvagem vermelha") e corresponde à sequência de Referência NCBI: XP 41829.1. SEQ ID Nº: 41 corresponde ao Gly-Pro-Ser-Gly.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 é um alinhamento da sequência de proteínas geradas pelaversão MUSCLE, versão 3.6, utilizando a opção: -maxitiers 2 (vide Ed- gar RC (2004) Nucleic Acids Res 32 (5) :1792-7)). NP 00424.1 (SEQ ID Nº: 2) é um proteína CD83 humana (SEQ ID Nº: 2). XP 518248.2 é uma proteí- na CD83 do chimpanzé (SEQ ID Nº: 35). XP 852647.1 é uma proteína CDB83 do cão (SEQ ID Nº: 37). NP 001040055.1 é um proteína CD83 bovina (SEQIDNº* 37). NP 033986.1 é uma proteina CD83 do camundongo (SEQ ID Nº:38). XP 341510.2 é uma proteína CD83 do rato (SEQ ID Nº: 39). XP 41829.1 é uma proteína CD83 da galinha selvagem vermelha (SEQ ID Nº: 40). Os resíduos de aminoácidos sublinhados podem ser substituídos por qualquer aminoácido.

Os aminoácidos sublinhados e em negrito podem ser preferencialmente substituídos por uma substituição de aminoácido con- servadora.

Os resíduos de aminoácidos que não estão sublinhados não são substituídos, preferencialmente.

A figura 2 é um diagrama esquemático do plasmídeo ' pGEX2ThCD83ext.

- A figura 3 mostra a resolução SDS-PAGE das frações eluídas após a clivagem da trombina na coluna de GST-hCD83ext utilizando trombi- naa80(faixa2),40 (faixa 3), 20 (faixa 4), 10 (faixas 5 a 8) ou 5 (faixas 9 a 13) UMmML.As faixas 7 e 8 mostram as frações GST obtidas após a digestão ' de trombina e eluição de glutationa a 10 U/mL. Faixa 1: marcadores de peso molecular. As proteínas contaminantes presentes na trombina (Sigma) são mostradas na caixa tracejada.

A figura 4A mostra uma cromatografia de dois picos típica para a etapa de polimento de hcD83ext usando cromatografia de troca de ânion contendo os dois maiores picos. A figura 4B mostra a análise SDS-PAGE de ' cada uma das frações de polimento. As faixas 2 a 5 representam o primeiro - pico e as faixas 6 a 9 representam o segundo pico. A faixa 1 representa a amostra pós GST carregada na coluna de cromatografia de troca de ânion para o polimento. Nota-se que hcD83ext está localizada no primeiro pico, enquanto as outras proteínas contaminantes estão localizadas no segundo pico. O gel foi manchado com nitrato de prata.

A figura 5 mostra uma análise dos diferentes lotes das amostras hCcD83ext utilizando a redução SDS-PAGE e a coloração azul de Coomassi- e. As amostras de proteína foram armazenadas a -20ºC e foram formuladas em Tris a 20mM, NaCl a 50mM, 50% de glicerol, a amostra estava livre de glicerol na faixa 3. Os lotes foram feitos em várias datas diferentes e, portan- to, foram armazenados em diferentes períodos de tempo (ou seja, 4, 3, 3, 2, 10,5,9,5,6,5,6,6 meses nas faixas 2 — 10, respectivamente) antes da reali- zação da análise. A seta indica a posição do monômero, Além disso, as maiores espécies em peso molecular podem ser vistas, correspondendo, possivelmente, às formas multiméricas. As formas em peso molecular mais baixas correspondem aos produtos de degradação ou aos monômeros modi- ficados possivelmente mediados pelas ligações dissulfeto intramoleculares não-convencionais.

A figura 6 mostra uma análise dos diferentes lotes das amostras hCD83ext utilizando a redução SDS-PAGE e a coloração azul de Coomassi- ' e.

As amostras de proteína foram armazenadas a -20ºC e foram formuladas % em Tris a 20mMM, NaCl a SOMM, 50% de glicerol, exceto a amostra da faixa 3 que estava livre de glicerol.

Os lotes foram feitos em várias datas diferentes . 5 e, portanto, possuíam diferentes "idades" (ou seja, 4, 3, 3, 2, 10,5, 9,5, 6,5, 6, 6 meses nas faixas 2 - 10, respectivamente) na realização da análise.

As ' setas nas faixas 3, 6 e 7 realçam as várias espécies hoD83ext não-comuns possivelmente mediadas pelas ligações dissulfeto intramoleculares não- convencionais.

A figura 7 mostra uma análise de uma amostra hcD83ext com (A) SDS-PAGE reduzido, (B) SDS-PAGE não-reduzido e (C) Western blot- ting.

Os géis SDS foram manchados com nitrato de prata a fim de tornar as ] maiores espécies multiméricas (tais como trímero e tetrâmero) visíveis.

To- * das estas espécies foram verificadas de se associarem a hCD83ext por Western blotting.

A figura 8 é um cromatograma AEC mostrando os picos da eta- pa de polimento para hCD83m-2,5. A figura 9 mostra a redução da análise SDS-PAGE das frações CD83m-2,5 purificadas.

A figura 10 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das fra- ções CD83m-2, 5 purificadas.

A figura 11 mostra a análise espectroscópica de CD83m-2, 5 uti- lizando dicroísmo circular (CD). A figura 12 mostra a análise de espectrofluométrica de CD83m- 2,5. A figura 13 mostra a análise espectroscópica de CD83m-2 utili- zando dicroísmo circular.

A figura 14 é um cromatograma AEC mostrando os picos da e- tapa de polimento para hecD83m-3. A figura 15 mostra que a análise SDS-PAGE de CD83m-3 purifi- cado foi submetida a caracterização estrutural utilizando SDS-PAGE (figura 15), CD (figuras 16 e 17) e espectrofluometria (figura 18) com resultados | semelhantes aos de hcD83ext do tipo selvagem e CD83m-5. ' A figura 16 mostra a análise espectroscópica de CD83m-3 e ã CD83 do tipo selvagem (batelada 004 - 04) formulada em Tris a 20 mM, Na- Cl a 50 MM no pH 7,5 utilizando CD. A figura 17 mostra a análise espectroscópica de CD83m-3 (for- mulada tanto no pH 7,0 quanto no 7.5), utilizando o CD. ' A figura 18 mostra a análise espectrofluométrica de CD83m-3 formulada tanto no pH 7,0 quanto no 7,5. A figura 19 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das for- mas monoméricas hCD83ext-m3, hcD83ext-m5 e das formas monoméricas e do dímer de hCD83ext do tipo selvagem. A figura 20 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida das for- ] mas monoméricas hcD83ext-m3 (m3), hecD83ext-m5 (m5) das formas mo- - noméricas e do dímero das três preparações de hcD83ext do tipo selvagem (0044, 007 e 023) realizadas em dias diferentes, com ou sem pré- tratamento com NEM para evitar o embaralhamento da ligação dissulfeto.

A figura 21 mostra os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho de hcD83ext-m3, hoD83ext-M5 e três diferentes preparações de hcD83ext do tipo selvagem. Todas as preparações foram tratadas com NEM para evitar o embaralhamento da ligação dissulfeto. O primeiro pico (à esquerda) representa os dímeros, enquanto que o segundo pico (à direita) representa os monômeros.

A figura 22 mostra a análise SDS-PAGE reduzida de hcD83ext- m3 (m3), hoD83ext-m5 (m5) e três diferentes preparações de hoD83ext do tiposelvagem (wt 00444 ,wt 007 e wt 023).

A figura 23 mostra os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho do monômero hcD83ext-m5 mutante e duas diferentes prepara- ções de hcD83ext do tipo selvagem (004-4 e 023).

A figura 24 mostra a análise SDS-PAGE não-reduzida de duas diferentes preparações de hcD83ext-m5 (501 e 502) e seis diferentes prepa- rações de hcD83ext do tipo selvagem (007, 100, 021, 023, 80 e 90). 021, 023, 80 e 90). |

A figura 25 mostra a análise Western blot não-redutora de dife- ' rentes preparações de hoD83ext-m5 e hcD83ext do tipo selvagem. . A figura 26 mostra a capacidade de várias formulações de hCD83ext do tipo selvagem, hCD83ext-m3 e hoD83ext-m5 de inibirem a . 5 produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNy, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto , pela quantidade média de TNFa produzido por célula.

A figura 27 mostra a capacidade de hCD83ext do tipo selvagem, hcD8sext-m3 e hcD83ext-m5, todos formulado em pH 7,6, de inibirem a 10 produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNy, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produzida por células (MFU). Ú A figura 28 mostra a capacidade de hcD83ext do tipo selvagem - (formulada em pH 4,5 ou 5,5) e hcD83ext-m5 (formulada em pH 7,6) de ini- birem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNy, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produ- zindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produzida por células (MFU). A figura 29 mostra a diferença entre a capacidade de hoD83ext dotipo selvagem (formulada em pH 4,5 ou 5,5), ou as formas hocD83ext-m3 mutantes (formulada em pH 5,5) e hCD83ext-m5, duas preparações (formu- ladas em pH 7,6) de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs primatas estimulados por LPS/IFNy, como medidas tanto por uma porcentagem de monócitos produzindo TNFa quanto pela quantidade média de TNFa produ- zidapor células (MFU). A figura 30 mostra as diferenças entre a capacidade de hCcD83ext do tipo selvagem (batelada ARG-021; formulada em pH 7,6) e quatro preparações do mutante hCD83ext-m3 monomérico (formulado em pH 4,5 ou 5,5) de inibirem a produção de TNFa pelos PBMCs estimulados —porLPS/IFNy humano, como medidas pela porcentagem de monócitos pro- duzindo TNFa.

As figuras 31 a 35 mostram o efeito do pH e da temperatura no |

1" hcD83ext do tipo selvagem (lote 021), como analisado pelo SDS-PAGE não- ' reduzido (faixa esquerda) e reduzido (faixa direita). . A figura 36 é o gráfico mostrando a classificação patológica de aloenxertos renais em ratos no POD140: Pontuação média: O = normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada, 4 = alteração acentuada. , A figura 37 é o gráfico mostrando a classificação imuno- histoquímica de aloenxertos renais em ratos no POD140: Pontuação média: O = normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada, 42= alteração acentuada. Sumário da Invenção São fornecidos novos polipeptídeos CD83 solúveis (sSCD83) ' possuindo melhor estabilidade. Em um aspecto, é fornecido um polipeptídeo - sCD83 isolado, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7 ouuma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identi- dade na SEQ ID Nº: 7, em que um ou mais resíduos de aminoácidos 1, 2,3, 4 e 130 estão, opcionalmente, ausentes e resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 são os aminoácidos especificados em qualquer uma das linhas da Tabela 1. Preferencialmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoáci- doque não cisteina e, mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina.

Em um outro aspecto, um polipeptídeo sSCD83 isolado compre- ende a SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo me- nos 70% de identidade na SEQ ID Nº: 7, em que um ou mais resíduos de aminoácidos 12, 20,85 e 92 de SEQ ID Nº: 7 está ausente ou é um ou é um aminoácido que não cisteina, e, opcionalmente, um ou mais resíduos de a- minoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes.

Preferencialmente, o polipeptideo sCD83 isolado compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ 1DN*13,SEQID Nº: 15, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 19, SEQ ID Nº: 21, SEQ ID Nº: 23, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 27, SEQ ID Nº: 29 e SEQ ID Nº: 31, em que, opcionalmente, o resíduo de aminoácido 126 está ausente. |

Em ainda um outro aspecto, são fornecidos os ácidos nucleicos ' codificando os polinucleotídeos da invenção, bem como os vetores e as cé- + lulas compreendendo tais polinucleotídeos.

Os vetores e as células são úteis para a produção das composições de sCD83 descritas aqui. : 5 Os polipeptídeos sCD83, aqui fornecidos, são úteis para o tra- tamento ou a prevenção de uma resposta imune indesejada em um sujeito, , tais como doenças autoimunes, rejeição de transplantes e alergia.

Conse- quentemente, são fornecidas as composições farmacêuticas compreenden- do os novos polipeptídeos sSCD83, bem como os métodos para usar as com- posições do novos polipeptídeos sSCD83 para o tratamento de doenças auto- imunes, rejeição de transplantes e alergia.

Em ainda um outro aspecto, é fornecido um método para melho- ' rar o resultado de transplante em um receptor de transplante de mamíferos, - compreendendo a administração a um dito receptor de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de um polipeptídeo sCD83 precedente e um ou mais agentes imunossupressores, em que o agente imunossupressor atua de forma sinérgica com o dito polipeptídeo para melhorar o resultado do trans- plante.

Descrição Detalhada Os presentes inventores descobriram que CD83 solúvel (sCD83), em especial os polipeptídeos hCD83ext, correspondendo a SEQ ID Nº:5 e 6, perdem a estabilidade durante o armazenamento.

Surpreendente- mente, verificou-se que a mutação do terceiro resíduo de cisteina hcD83ext resulta em uma estabilidade melhorada e bioatividade comparável.

Este re- —sultado foi inesperado, porque, como discutido acima, Zinser. e outros (Im- munobiology (2006) 211:449-453) descrevem que hcD83ext forma um ho- modímero, em que as primeiras quatro cisteinas de hCD83ext estão envolvi- das na formação de ligações dissulfeto intramoleculares.

Assim, tendo em vista Zinser, seria de se esperar que cada uma das quatro primeiras cisteí- nasde hCD83ext fossem críticas para a manutenção da conformação ade- quada do domínio extracelular.

Inesperadamente, as mutações para estes resíduos de cisteina podem melhorar a estabilidade.

Além disso, a estabili- | dade foi encontrada para ser ainda mais reforçada quando tamponada em ' pH baixo, de preferência com pH 4,0 a 5,0, mais preferivelmente em um pH . de cerca de 4,5. A proteína sSCD83 do tipo selvagem parece ser instável e sensível às condições que influenciam a temperatura, o pH, a desamidação eahidrólise.

Alguns dos novos polipeptídeos sCD83 da invenção possuindo ' substituições de aminoácidos para um ou mais dos cinco resíduos de cisteí- na em hCD83ext são mostrados na Tabela 1. O termo "Não Cys "refere-se a qualquer aminoácido padrão ou não-padrão diferente de cisteína. Preferen- cialmente, a substituição de um resíduo de cisteína é uma substituição con- servadora de tal forma que um aminoácido possuindo um grupo R polar, não-carregado (por exemplo, serina, treonina, metionina, asparagina, glu- ] tamina e o aminoácido selenocisteína não-padrão) substitui a cisteína. Alter- mM nativamente, o resíduo pode ser eliminado sem substituição. A Tabela 1 mostra cinco posições de aminoácidos na SEQ ID Nº: 7 que são sítios po- tenciais para a substituição ou a supressão dos resíduos de cisteína. A SEQ ID Nº: 7 é uma variante da SEQ ID Nº: 5, em que um ou mais dos cinco resíi- duos que são cisteínas na SEQ ID Nº: 5 (ou seja, os resíduos 12, 20, 85, 92 e 114) podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido alternativo, |

Tabela 1 Exemplos Não-limitantes das Variantes de CD83ext de SEQ ID Nº: 7 | de hcD83ext | aminoácido | aminoácido | aminoácido | aminoácido | aminoácido mutante número 12 número 20 número 85 número 92 | número 114 : mo | nos | os | es | es | os | mo | os | nos | os | os | os | - ' mas =| os | es | cos | nãocs | nãos | * Não Cys = qualquer aminoácido diferente de cisteína. ** Os resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 correspon- | dem às posições dos primeiro, segundo, terceiro, quarto e quinto resíduos , de cisteína do domínio extracelular hnCD83, como representado pela SEQ ID . Nº: 7, em que a numeração destes resíduos é desviada por +4 em compara- ção com a SEQ ID Nº: 4 devido à adição dos resíduos Gly-Ser-Pro-Gly (SEQ IDNºº41)noterminal Nde SEQ ID Nº: 7.

i A Tabela 2 mostra a correlação da numeração dos cinco resí- ' duos de cisteína (ou sítios, onde um outro resíduo de aminoácido pode ser substituído por um resíduo de cisteina) nas SEQ ID Nº: 2 e 4a 8. A nume- ração varia devido à presença ou à ausência de diferentes porções de fusão doterminal N. Por exemplo, a SEQ ID Nº: 2 é uma sequência de comprimen- to total de hCD83, e contém uma sequência sinal de 19 aminoácidos do ter- minal N, bem como os domínios citoplásmicos e transmembrana, que estão ' ausentes nas SEQ ID Nº:4 a 8. O primeiro resíduo do aminoácido de um . domínio extracelular de hCD83 (Thr) está no resíduo de aminoácido 20 de SEQIDNº:2.ASEQ ID Nº: 4 é o domínio extracelular do amino ácido 125 de uma proteína hCD83, e corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 a144 de SEQ ID Nº: 2. As SEQ ID Nº:5 a 7 incluem a sequência dos quatro aminoácidos do terminal N (Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID Nº: 41) fundida em um domínio hCD83ext (resíduos de aminoácidos 5 a 129), que é seguido pelo primeiro resíduo de aminoácido do domínio transmembrana (Ile de resíduo de aminoácido 130). A SEQ ID Nº: 8 contém uma etiqueta GST do terminal N e o sítio de clivagem da trombina (resíduos de aminoácidos 1 a 13) fundi- da em um domínio hocD83ext (iniciando nos resíduos de aminoácidos 14 a 138), que é seguido pelo primeiro resíduo do aminoácido do domínio trans- membrana (lle de resíduo de aminoácido 139).

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Tabela 2 ' Alinhamento de cisteína ou resíduos de Xaa de várias sequências CD83 so- . lúveis ou de comprimento total Número de Posição do primeiro | Posição do primeiro resídi resíduos de resíduo de Treonina | de Cisteina ou Xaa no do: aminoácido na domínio extracelular (| extracelular de nCD83 " sequência hcD83 comprimento total

EB E 6 6 dB o Ç j| dr o A dae a "FE ESS resíduo de Cisteína ou terceiro resíduo | quarto resíduo quinto resíduo Xaa no domínio extra-| de Cisteina ou | de Cisteína ou de Cisteíina celular de hCD83 Xaa no domínio | Xaa no domínio | ou Xaa no extracelular extracelular domínio de hCD83 de hcD83 extracelular de hcD83 ELLE CIEOILE— O E— EIcEIEI EA Ex TE = A figura 1 mostra um alinhamento de polipeptídeos CD83 para ser humano (NP 004224,1; SEQ ID Nº: 2), chimpanzé (XP 518248.2; SEQ ID Nº: 35), cão (XP 852647.1; SEQ ID Nº: 36), bovino (NP 001040055.1; SEQ ID Nº: 37), camundongo (NP 033986.1; SEQ ID Nº: 38), rato (XP 341510.2; SEQ ID Nº: 39) e galinha vermelha selvagem (XP 418929.1; SEQ ID Nº: 40). Com referência à sequência CD83 humana mostrada na fi- gura1,odomínio extracelular corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 | a 144. Os resíduos sublinhados identificam as posições onde ocorrem as : substituições ou as exclusões de aminoácido conservativo e não- . conservativo no domínio extracelular e o primeiro resíduo de aminoácido de transmembrana dos polipeptídeos CD83 de mamíferos alinhados. Os resíi- duos sublinhados e em negrito identificam as posições onde ocorrem as substituições ou as exclusões de aminoácido conservativo. As proteinas 7 CD83 humanas e de camundongo possuem 63% da sequência de identida- de. A capacidade dos polipeptídeos CD83ext humanos (por exemplo, do tipo Silvestre (wt) ou m3 ) para suprimir a rejeição de transplantes em camun- —dongos, ratos e primatas não-humanos (vide exemplos) indica uma conser- vação da estrutura CD83 e a função entre as espécies de mamíferos.

Consequentemente, em um aspecto, é fornecido um polipepti- Ú deo sCD83, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7 . ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identida- dena SEQID Nº: 7, em que os resíduos de ácido amino 12, 20, 85, 92 e 114 são os aminoácidos especificados em qualquer uma das linhas da Tabela 1; e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sSCD83 consiste, essencialmente, em uma sequência de aminoácidos precedente.

Preferencialmente, o aminoácido 85 é serina e os aminoácidos 12, 20, 92 e 144 são cisteína.

Em outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo sSCD83, compre- endendo os aminoácidos da sequência de SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 70% de identidade para SEQ ID Nº: 7,emque um ou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 estão ausentes ou sejam um aminoácido diferente de cisteína, e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Preferencialmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoácido diferente de cisteína, e os resíduos de aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteina.

Mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sSCD83 consiste, essencialmente em uma sequência de aminoácidos precedentes. Nas modalidades preferidas, o | polipeptídeo sCD83 consiste na SEQ ID Nº: 7, nos resíduos de aminoácidos 1a 129 de SEQ ID Nº: 7, nos resíduos de aminoácido 5 a 129 de SEQ ID Nº: . 7 ou nos resíduos de aminoácidos 5 a 130 da SEQ ID Nº: 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado sSCD83 com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 19, SEQ ID , Nº: 21, SEQ ID Nº: 23, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 27, SEQ ID Nº: 29 e SEQ ID Nº: 31, em que, opcionalmente, o resíduo de aminoácido 126 está ausen- te.

A sequência de identidade dos novos polipeptídeos sCD83 da invenção com SEQ ID Nº: 7 pode ser de 70% a 100%. Preferencialmente, a sequência de identidades é de, pelo menos 75%, 80, 85%, 90%, 95%, 96%, : 97%, 98%, ou, pelo menos 99%. Os resíduos de aminoácidos na SEQ ID - NO 7 podem ser conservativa ou não-conservativamente substituídos. Prefe- rencialmente, as substituições são conservativas. Quando um ou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85, 92 e 114 de SEQ ID Nº: 7 não são cis- teina, eles são, preferencialmente, selecionados do grupo de aminoácido pequeno e/ou polar, tal como alanina, glicina, valina, treonina, metionina, li- sina, arginina, glutamina, asparagina, glutamato, aspartato e, mais preferi- velmente,serina. Em outras modalidades, a invenção fornece moléculas quiméri- cas compreendendo qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui fundidos a uma sequência de polipeptíideo ou aminoácido heteróloga. Os exemplos não- limitantes de tais moléculas quiméricas compreendem qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui fundidos, tanto no terminal N quanto no terminal C, a uma sequência de aminoácidos que transmite propriedades de funcio- nalidade e estabilidade adicionais. Em algumas modalidades, os polipeptí- deos sCD83 da invenção compreende, tanto no terminal N quanto no termi- nal C, uma sequência de sinal e/ou uma ou mais sequências de aminoácidos úteis para isolamento de proteínas (por exemplo, uma etiqueta de afinidade, tal como a glutationa-S-transferase, poli-His, FLAG, domínio de ligação de celulose, domínio Fc, lg, etc), ou uma parte da tal sequência de tal forma | que podem permanecer após o processamento da proteína. As porções de ' peptídeo adicionadas para facilitar a purificação podem, opcionalmente, se- . rem removidas antes da preparação final do polipeptídeo. Como um exemplo não-limitante, o polipeptideo SCD83 pode compreender, começando no ter- minalN, uma etiqueta GST, um sítio de clivagem da trombina e uma se- ' quência hcD83ext (vide, por exemplo, a SEQ ID Nº: 8). Esta fusão do poli- ' petídeo de etiqueta GST pode ser isolada pela ligação à glutationa imobili- zada e, em seguida, clivada com trombina). O produto da clivagem conteria, então, a porção carbóxi do sítio de clivagem da trombina (por exemplo, Gly- Ser-Pro-Gly, SEQ ID Nº: 41 fundida no terminal N de hoD83ext. Uma grande variedade de etiquetas de afinidade e métodos para a sua utilização na puri- ficação de proteínas são conhecidas por aqueles versados na técnica. (Vide, ] por exemplo, Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-533. . Em algumas modalidades de polipeptídeos quiméricos sSCD83, o polipeptídeo sSCD83 é fundido no terminal N ou C a um domínio Fc ou Ig de uma imunoglobulina (por exemplo, I9G1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgGA2), de preferência uma imunoglobulina humana. Os métodos para fazer tais proteí- nas de fusão são conhecidos por aqueles versados na técnica (Vide, por e- xemplo, Patentes US Nº 5.428.130 e EPA O 464 533). SCD83-Fc quimérico ouas proteinas de fusão sSCD83-lg pode melhorar as propriedades farma- cocinéticas (EPA 0 232 262).

Os termos "CD83 solúvel", "sCD83" e "CD83ext", como aqui uti- lizados, referem-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos uma par- te do domínio extracelular de um membro da família de proteinas CD83 e, emqueopolipeptideo CD83 solúvel não possui um domínio transmembrana CD83 que é capaz de fixar com firmeza a dita molécula na membrana de uma célula na qual é expressa. No entanto, um polipeptídeo solúvel CD83 pode incluir outros resíduos adicionais da proteina CD83 nativa de compri- mento total que estão fora do domínio extracelular, tal como uma porção do domíniotransmembrana que não é suficiente para fixar com firmeza a prote- ína CD83 solúvel à membrana de uma célula na qual é expressa. Além dis- so, os polipeptídeos sCD83 da invenção possuem atividade sCD83.

Um polipeptídeo sCD83 é dito possuir "atividade sSCD83" se a- Ú presentar, pelo menos, uma atividade do polipeptídeo sSCD83 de SEQ ID Nº: . 5, medida por qualquer ensaio apropriado.

Um polipeptídeo sCD83 é dito possuir "atividade sSCD83" se em tal um ensaio possuir pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da atividade do poli- ] peptídeo sSCD83 de SEQ ID Nº: 5, medida no mesmo ensaio.

Preferencial- ' mente, os polipeptídeos sSCD83 da presente invenção são capazes de se |i- gar a células dendríticas maduras imunoestimulatórias e diminuir a capaci- dade destas células dendríticas em estimular a proliferação de células T.

A atividade sSCD83 pode ser avaliada direta ou indiretamente, e pode ser medida in vivo ou in vitro; os ensaios adequados são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Kruse e outros (2000) J.

Virol 74: 7127-7136; Lechmann ' e outros. (2001) J.

Exp Med 194: 1813-1821, que descrevem um ensaio pre- - ferido para determinar a ligação das células dendríticas às células T e a for- mação dos grupos de células dendríticas de células T). O Pedido de Patente US 20040110673, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência, descreve os ensaios para atividade sCD83, tais como: 1) inibição da maturação de DC imatura para amadurecer as DCs na presença de um coquetel de matura- ção; 2) perda da expressão de CD80 e CD83 por DC madura na cultura com sCD83;3) inibição da capacidade de DC madura em estimular a proliferação de células T em ensaios de MLR; 4) inibição da formação do grupo típico pe- las DCs e a proliferação das células T e 5) inibição da encefalite auto-imune experimental((EAE) em camundongos.

O exemplo 4 do presente pedido de patente descreve um ensaio para atividade SCD83 que mede a capacidade desCD83 em diminuir a produção de TNFa pelos PBMCs estimulados por LPS/IFNy.

Assim, os polipeptídeos sCD83 da invenção podem diminuir a capacidade das células dendríticas maduras imunoestimulatórias em estimu- lar a proliferação de células T para pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação a um controle adequado, tal como, por exemplo, uma interação entre células dendríticas maduras i- munoestimulatórias e células T na ausência de sSCD83. |

Em algumas modalidades, a proteina de sSCD83 da invenção po- ' de diminuir a expressão de TNF-a, CD80 e/ou CD83 para células dendríticas . maduras imunoestimulatórias in vitro na presença de CD83 solúvel, durante pelo menos uma etapa do processo de maturação de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação a um ' controle adequado (Vide, por exemplo, Lechmann e outros. (2001) J. Exp. ' Med.. 194: 1813-1821; WO 2004/046182; Exemplo 4). Por exemplo, a adi- ção de sCD83 às células dendríticas imaturas altera a expressão de superfi- cie, de maneira tal que a expressão CD80 CD83 são diminuídas. A adição de sCD83 para amadurecer as células dendríticas reduz a expressão de CDB83, e as DCs tratadas com sSCD83 perdem a capacidade de estimular a proliferação de células T. Desta maneira, pode-se dizer em relação ao ' sCD83 que o mesmo alterou o imunofenótipo das células tratadas. É para . ser entendido por aqueles versados na técnica que as técnicas comumente utilizadas para a análise da expressão dos marcadores da superfície da cé- lula (por exemplo, análise FACS) às vezes pode produzir dados que repre- sentam as populações mistas das células, e deve ser tomado cuidado ao i- dentificar quais as populações que podem ser representadas em um deter- minado conjunto de dados.

De acordo com a invenção, os derivados de um polipeptídeo sCD83 podem possuir um ou mais aminoácidos com uma cadeia lateral alte- rada. Tais polipeptídeos derivados incluem, por exemplo, aqueles compre- endendo aminoácidos, nos quais os grupos livres de amino formam cloridra- tos, grupos sulfonil p-tolueno, grupos carobenzóxi; os grupos livres de car- bóxiformam sais, metila, e de etil ésteres; os grupos livres de hidroxilas for- mam os derivados de O-acila ou O-alquila, assim como os aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, 4-hidroxiprolina para prolina, 5-hidroxilisina para lisina, homosserina para serina, ornitina para lisina, etc. Também estão incluídos os derivados do aminoácido que podem alterar à ligação covalente, porexemplo, a ligação dissulfeto que se forma entre dois resíduos de cisteí- na, que produz um polipeptídeo ciclizado. Um polipeptídeo sSCD83 solúvel ou seus derivados, pode ter um padrão de glicosilação nativo de uma molécula |

CD83 ou um padrão de glicosilação alterado ou pode ser não-glicosilado. : Os polipeptídeos sSCD83 da invenção podem ser um monômero, . díimero ou multímero de um polipeptídeo sCD83. A dimerização ou a multi- merização pode ser alcançada através da formação de uma ou mais pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína presentes na forma monomérica de ] uma proteina sSCD83 (que estão presentes, por exemplo, nas posições 12, ' 20, 85, 92 e 114 de SEQ ID Nº: 5), ou por meio de uma molécula ligante bi- funcional (por exemplo, uma diamina, um composto de ácido dicarboxílico ou similares), ligando as porções funcionais semelhantes ou diferentes (por e- xemplo, grupos carbóxi, grupos amino, grupos hidróxi, grupos tio, etc.) den- tro da forma monomérica do polipeptídeo sCD83. Este último inclui também o uso de polipeptídeos ligantes, por exemplo, de pequenos resíduos de ami- ] noácidos polares tais como: -[(Gly)xSer] y- (em que x é, por exemplo, 3 ou 4, . e Y é, por exemplo, 1 a 5)) para produzir estruturas diméricas que podem ser, diretamente, produzidas por técnicas recombinantes. Em modalidades preferidas, o SCD83 é um monômero.

Polipeptídeos sCD83 podem ser proteínas de fusão de pelo me- nos uma parte do domínio extracelular de CD83 e seus derivados (Vide, por exemplo, WO 2004/046182), enquanto a proteína de fusão retém uma ou mais atividades sSCD83, conforme definidas aqui. Em algumas modalidades, as proteinas compreendendo os resíduos adicionais de CD83 fora do domí- nio extracelular são abrangidas pelo termo "CD83 solúvel." Dessa maneira, os derivados apropriados incluem, mas não são limitados, as proteinas pos- suindo sequências adicionais fixadas aos terminais C ou N, por exemplo, as que carregam parte de um domínio transmembrana em seu terminal C ou as que carregam no terminal N um peptídeo curto (por exemplo, Gly-Ser-Pro- Gly (SEQ ID Nº: 41)), que podem resultar na clivagem de um sítio da trombi- na pela trombina, por exemplo, como produto de uma engenharia da protei- na de fusão, ou um peptídeo curto resultante de um fragmento de GST se- guindoa clivagem de uma proteína de fusão), assim como as fusões Ig e Fc.

Em outra modalidade, são fornecidos os polinucleotídeos isola- dos codificando os polipeptídeos sCD83 da invenção. Dessa maneira, uma | modalidade proporciona um polinucleotídeo isolado que compreende um ' ácido nucleico codificando um polipeptídeo que pode compreender, consisitir . na, ou consistir essencialmente na SEQ ID Nº: 7 ou em um aminoácido pos- suindo, pelo menos, 70% da identidade da sequência de SEQ ID Nº: 7; em queumou mais dos resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 estão ausen- ] tes ou é um aminoácido diferente de cisteíina; e, opcionalmente, um ou mais " resíduos de aminoácidos 1, 2, 3, 4 e 130 estão ausentes. Preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é um aminoácido diferente de cisteina; os resí- duos de aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteína. Mais preferivelmente, o resíduo de aminoácido 85 é serina. Preferencialmente, a identidade da se- quência é, no mínimo, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou, pe- lo menos, 99%. Utilizando o código genético, pode-se facilmente imaginar todos os ácidos nucleicos que correspondem a uma estrutura de leitura a- . berta codificando um polipeptídeo dado.

Em ainda um outro aspecto, são fornecidos os vetores que com- preendem os polinucleotídeos da invenção, bem como as células que com- preendem tais vetores. Os vetores e as células são úteis para produzir as composições CD83ext descritas aqui.

As proteínas CD83, as sequências de ácido nucleico e as estru- turas são conhecidas na técnica. A sequência de ácido nucleico de um cD- NA de CD83 humano (GenBank No. de Acesso . 211697) está estabelecida na SEQ ID Nº: 1. Esta sequência inclui uma sequência de codificação da po- sição 11 a 628 de SEQ ID Nº: 1 (incluindo o códon de parada). Uma se- quência de sinal é codificada nas posições 11 a 67 de SEQ ID Nº: 1. A codi- ficaçãode uma sequência de peptideo CD83 maduro estende a partir da po- sição 68 a 625. Os sítios de reconhecimento da enzima de restrição estão presentes no início e no final da SEQ ID Nº: 1 (nas posições 1 a6 e 1755 a 1760). A sequência de aminoácidos de um CD83 humano (conforme estabe- lecido no GenBank No. de Acesso Q01151 e codificado pela sequência de ácidos nucleicos estabelecida na SEQ ID Nº: 1) é estabelecida na SEQ ID Nº: 2. Outras sequências de CD83 humano estão disponíveis no Genbank No. de Acesso: NP 001035370 [isoforma b de antígeno CD83, Homo sapi- | ens: SEQ ID Nº: 2]; NP 004224 [isoforma a de antígeno CD83, Homo sapi- ' ens], EAWSS5353 [isoforma CRA c de antígeno CD83, Homo sapiens]; E- . AWB55352 [isoforma CRA b de antígeno CD83 Homo sapiens]; EAW55351 [isoforma CRA a de antígeno CD83 Homo Sapens]. Tais sequências podem seralinhadas para determinar os domínios conservados.

Ú As sequências CD83 de outros organismos estão disponíveis . nos seguintes Genbank Nos. de acesso: ABC68619 [Salmo sala; CAB63843 e NP 033986.1 (SEQ ID Nº: 38 [Mus musculus]; ABM67085 [Sparus aurata]l;, AAP93912 [Oncorhynchus mykiss], AAO62993 [Ginglymos- toma cirratuml; NP 001040055 [Bos taurus, SEQ ID Nº: 37]; XP 518248 [Pan trogloditos, SEQ ID Nº: 35], XP 001093364 [Macaca mulattal; XP 418929 [Gallus gallus; SEQ ID Nº: 40); NP 001101880 e XP 341510.2 [Rattus norvegicus, SEQ ID Nº: 39]; AAZO6133 [Mesocricetus auratus); - ACC60995 [Marmota monax] e XP 852647 [Canis familiaris, SEQ ID Nº: 36]. Outros membros da família CD83 de proteínas podem ser obti- dos pela hibridização de um ácido nucleico que compreende, por exemplo, a totalidade ou uma parte da região codificadora de CD83 humano que codifi- caa porção extracelular em diferentes fontes de ácidos nucleicos (por exemplo, o DNA, cDNA ou RNA genômico) de outros animais, tais como os mamíferos, ou de outros tecidos do mesmo organismo. Os polinucleotídeos adicionais codificando os polipeptídeos sCD83 podem ser feitos pela muta- ção in vitro ou in vivo de polinucleotídeos sSCD83 conhecidos e/ou isolados, ou as tais sequências de polinucleotídeos podem ser sintetizadas in vitro. Uma vez que uma codificação de ácidos nucleicos de uma prote- ínaCD83de ocorrência natural ter sido sequenciada, o domínio extracelular pode ser determinado pela comparação entre o domínio extracelular de mo- léculas CD83 conhecidas com o da sequência CD83 clonada. A forma solú- vel de uma dada proteína CD83 de ocorrência natural pode ser expressada de forma recombinante utilizando as técnicas descritas aqui. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica CD83 solúvel da invenção pode ser produzi- doe inserido em um vetor e transformado em células hospedeiras procarió- ticas ou eucarióticas, utilizando técnicas bem-conhecidas descritas aqui e | conhecidas ainda na área (Sambrook e outros. Molecular cloning:. A Labora- Í tory Manual, Laboratório de Cold Spring Harbor, NY, 1989).

. Um ácido nucleico de interesse que codifica uma forma solúvel de um membro da família de proteinas CD83 para uso de acordo com a presente invenção, pode ser inserido em um vetor de expressão para ex- pressão in vitro (por exemplo, utilizando, ensaios de transcrição/translação in . vitro ou kits comercialmente disponíveis), ou pode ser inserido em um vetor de expressão que contenha uma sequência promotora que facilita a transcri- ção e/ou a translação tanto em procariontes quanto em eucariontes pela transferência do vetor de expressão em uma célula apropriada. O termo "ve- tor" refere-se a um plasmídeo, vírus ou outro veículo conhecido na técnica que pode ser manipulado pela inserção ou a incorporação de um polinucleo- tídeo. Tais vetores podem ser usados para a manipulação genética (ou seja, . "vetores de clonagem") ou podem ser usados para transcrever ou transladar o polinucleotídeo inserido ("vetores de expressão"). Um vetor, geralmente, contém pelo menos uma origem de replicação para a propagação em uma célula e um promotor. Os elementos de controle, incluindo os elementos de expressão de controle estabelecidos aqui, presentes dentro de um vetor de expressão são incluídos para facilitar a transcrição e a translação (por e- xemplo,o sinal de junção para íntrons, a manutenção da estrutura de leitura correta do gene para permitir a translação do mRNA na estrutura e, códons de parada, etc.) O "elemento de controle" é pretendido incluir, no mínimo, um ou mais componentes, cuja presença pode influenciar a expressão, e também pode incluir componentes adicionais, por exemplo, sequências líder esequências de parceiro de fusão.

Uma célula na qual um vetor pode ser propagado e seus ácidos nucleicos transcritos, ou os polipeptídeos codificados expressados, é referi- da aqui como uma "célula hospedeira". O termo inclui também qualquer des- cendência da célula hospedeira em assunto. Mais além, um ácido nucleico de interesse, de acordo com a presente invenção, pode ser inserido em um vetor de expressão para a expressão in vivo para a terapia do gene somáti- ca. Com estes vetores, por exemplo, os vetores retrovirais, vetores de ade- | novírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores de expressão de plas- ' mídeo, os ácidos nucleicos da invenção são expressos na infec- . ção/introdução do vetor em DC.

As células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas, aos microorganismos, tais como bactérias, fungos, insetos e organismos de ma- ] míferos. Em modalidades preferidas, a célula hospedeira é Escherichia coli. ' Por exemplo, as bactérias transformadas com o ácido nucleico bacteriófago recombinante, o ácido nucleico de plasmídeo ou vetores de expressão de ácido nucleico cosmídeo contendo um ácido nucleico de interesse; fungos transformados com os vetores de expressão de fungo recombinantes con- tendo um ácido nucleico de interesse; sistemas de células vegetais infecta- dos pelo vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do ] mosaico da couve-flor,CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou trans- - formados com os vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por e- xemplo, plasmídeo Ti), contendo um ácido nucleico de interesse; sistemas de células de insetos infectados pelos vetores de expressão de vírus re- combinante (por exemplo, um baculovírus) contendo um ácido nucleico de interesse; ou sistemas de células de animais infectados pelos vetores de ex- pressão de vírus recombinante (por exemplo, os retrovírus, adenovírus, vírus vaccinia), contendo um ácido nucleico de interesse ou uma engenharia de sistemas de células animais transformadas para expressão estável. Para a expressão a longo prazo das formas solúveis dos mem- bros da família de proteínas CD83 nas células hospedeiras, é preferida a expressão estável. Dessa maneira, utilizando os vetores de expressão que contenham as replicações de origens virais, por exemplo, as células podem ser transformadas com um ácido nucleico de interesse controlado pelos e- lementos de controle adequados (por exemplo, sequências promoto- ras/potenciadoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.). Opcionalmente, o vetor de expressão também pode conter um ácido —nucleico codificando um marcador selecionável ou identificável que confere resistência a uma pressão seletiva, assim, permitindo que as células possu- indo o vetor a ser identificado, cresçam e se expandam. Alternativamente, o )

marcador selecionável pode ser um segundo vetor que é cotransfectado em M uma célula hospedeira com um primeiro vetor contendo um polinucleotídeo . da invenção.

Uma série de sistemas de seleção pode ser utilizada, incluindo, mas não limitado, ao gene timidina quinase do vírus de herpes simples, ao gene hipoxantina-guanina fosforibosil transferase e aos genes adenina fos- , foribosi Itransferase podem ser utilizados nas células tk, hgrpt ou aprt, res- pectivamente, Adicionalmente, a resistência antimetabólita pode ser usada como a base da seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato; o gene gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; o gene de neomici- na, que confere resistência aos aminoglicosideos G-418; e o gene higromici- na, que confere resistência à higromicina. Os genes selecionáveis adicionais ' foram descritos, ou seja, trpB, que permite as células utilizarem indol no lu- . gar de triptofano; hisD, que permite as células utilizarem histinol no lugar de histidina; e ODC (ornitina descarboxilase) que confere resistência aos inibi- dores da ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL-onitina, DEMO.

Os métodos para transformar as células procarióticas e as euca- rióticas com os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos sCD83 da in- venção, são conhecidos por aqueles versados na técnica. Após a transfor- mação, a forma solúvel de CD83 pode ser isolada e purificada de acordo com os métodos convencionais. Os métodos de produção, purificação e ma- nipulação de várias proteinas e derivados dos mesmos, bem como os áci- dos nucleicos codificando os mesmos também são bem-conhecidos na téc- nica. Vide, por exemplo, Sambrook e outros. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratório Cold Spring Harbor, NY); vide também Pa- tente US Nº 7169898; EUA Pat. App. App. Nº 10/382, 397 e EUA Pat. App. App. Nº 10/535. 522. Por exemplo, o lisado preparado a partir de uma ex- pressão hospedeira (por exemplo, as bactérias) pode ser purificado por H- PLC, cromatografia de exclusão por tamanho, eletroforese em gel, cromato- grafiade afinidade ou outras técnicas de purificação. As proteínas substan- cialmente puras também podem ser obtidas pela síntese química utilizando um sintetizador de peptídeo (por exemplo, Applied Biosystems, Inc., Foster

City, Califórnia; modelo 430A ou similares). ' Formulações de sCD83 . As composições de CD83ext podem ser processadas em con- junto com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, adequados e/ou veícu- los para fornecer as formas farmacêuticas adequadas para as várias indica- ções e tipos de vias de administração. Uma composição farmacêutica ade- . quada pode incluir veículos, qualquer solução fisiológica adequada ou dis- persante ou similares, solubilizantes, adjuvantes, estabilizantes, conservan- tes, formulações de liberação sustentada, etc. As soluções fisiológicas com- preendem qualquer solução aceitável ou meios de dispersão, tais como a solução salina ou a solução salina tamponada. O veículo também pode in- cluir agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes que atrasam a adsorção, e similares. Exceto na medida em que qualquer . meioconvencional, veículo ou o agente é incompatível com o ingrediente ati- vo,asua utilização é contemplada. O veículo pode ainda compreender um ou mais compostos adicionais, incluindo, mas não estão limitados, as citoci- nas, tais como, por exemplo, a interleucina-10 (IL-10) e TGF-B. Os exemplos de tais formulações e métodos de sua preparação são conhecidos na técni- ca (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed. (1985) MackPub.Co,., Easton, PA, EUA).

O Pedido de Patente PCT WOZ2004/046182 descreve hoD83ext do tipo selvagem purificado e os polipeptideos hnocD83m-5 (possuindo as SEQ ID Nº: 5 e 6, respectivamente) formulados em uma solução salina de fosfato tamponada (PBS) com pH 7,6. No entanto, conforme descrito aqui, CD83exte as variantes do mesmo possuem maior estabilidade quando for- mulados em um pH mais baixo. Por exemplo, o polipeptídeo hoD83ext puri- ficado, tal como o polipeptídeo de SEQ ID Nº: 5, está predominantemente na forma monomérica quando pela primeira vez purificado de acordo com o mé- todo descrito no Exemplo 1. Após a armazenagem em PBS em um pH de 7,3a7,6,a proteina progressivamente dimeriza e perde a bioatividade. Em contraste, hncD83ext armazenado em pH mais baixo, não apresentou a mesma perda em atividade. Surpreendentemente, CD83ext-m5 (SEQ ID Nº:

6) foi menos sensível ao pH elevado do que o equivalente de tipo selvagem ' (SEQ ID Nº: 5).

' Consequentemente, é fornecida uma composição farmacêutica, que compreende: um polipeptídeo CD83ext e um tampão fisiologicamente aceitável possuindo um pH de 4,0 a 5,0. Preferivelmente, o pH 4,3 a 4,7. Mais preferivelmente, o pH é cerca de 4,5. Em modalidades preferidas, o po- 7 lipeptideo CD83ext é o polipeptídeo de SEQ ID Nº: 4, 5, 6 ou 7. De preferên- cia, o tampão é tampão de acetato, mais preferivelmente tampão de acetato a 20mM, pH — 4,5.

Os requerentes também descobriram que a estabilidade e bioa- tividade de hcD83ext é melhorada pela formulação de uma composição compreendendo trealose, Dessa maneira, a composição é fornecida com- ] preendendo um polipeptídeo sCD83 formulado em 1 a 15% (w/v) de trealo- - se. Preferivelmente, a trealose está presente em cerca de 5 a 12% w/v, mais preferivelmente em cerca de 10% wW.

Algumas modalidades das composições de sCD83 da invenção podem ainda compreender um ou mais excipientes, tais como, mas não limi- tado aos, tampões, sais, tensoativos, poliálcoois, açúcares metais polivalen- tes, modificador de viscosidade, antioxidante e crioprotetores e combinações dos mesmos. Tais excipientes incluem, mas não estão limitados a, glicina, histidina, Fe (3+), Mg (2 +), ácido ascórbico, metionina, vitamina E, EDTA e a combinação de arginina mais o ácido glutâmico.

Em modalidades preferidas, os polipeptídeos CD83ext são for- mulados de 1,5 a 2,5 (de preferência 2,0) mg/ml. em um tampão acetato a 20mM,pH4,5, 10% wW de trealose, 0,5% w/v de ácido ascórbico e, opcio- nalmente, arginina a 50 mm mais ácido glutâmico a 50 mM, e armazenados congelados (preferivelmente em cerca de -20ºC). Tais formulações são es- táveis após vários ciclos de congelamento e descongelamento e são ade- quadas para administração a um sujeito. Todos os excipientes preferidos es- tãotantona listado FDA de ingredientes inativos quanto estão presentes em produtos de fármaco intravenosos aprovados.

Qualquer via de administração pode ser usada incluindo, mas não limitada a, transcutânea, intracutânea (i.c), intraperitoneal (i.p), subcutã- ' nea (s.c), intramuscular (i.m), intravenosa (i.v), internodal (i.n), etc., pode ser . escolhida para a entrega de CD83ext e derivados do mesmo. Preferivelmen- te, CD83ext é administrado i.v. um dos versados na técnica irá apreciar que as diferentes formas de administração serão adequadas para diferentes compostos e/ou indicações, e será capaz de selecionar o método mais ade- ' quado de administração. Por exemplo, a psoríase pode ser tratada topica- mente com uma formulação adequada para administração à pele, enquanto o lúpus eritematoso sistêmico pode ser tratado pela administração a um su- jeito de uma formulação adequada para injeção intraperitoneal. Os profissio- nais versados na técnica estão familiarizados com os critérios e os métodos de ajuste das doses e da administração dos compostos, como, por exemplo, a avaliação dos resultados dos testes convencionais clínicos e laboratoriais, - incluindo ensaios bioquímicos e imunológicos. Onde for apropriado, os com- ponentes de um medicamento podem ser administrados separadamente. Para o uso terapêutico ou profilático, os compostos da presente invenção sozinhos ou em combinação com outros compostos moduladores imunes (por exemplo, os antígenos induzindo tolerância, Ciclosporina A, a- lém de FK506 mais MMF, rapamicina mais CD45RB, corticosteroides, etc.), são administrados a um indivíduo, preferivelmente um mamífero, mais prefe- rivelmente um paciente humano, para tratamento ou prevenção em uma maneira apropriada para a indicação médica.

Em algumas modalidades, sSCD83 é administrado a um indivi- duo, fornecendo ao indivíduo um ácido nucleico que codifica uma proteína — sCDB83.Por exemplo, sCD83 pode ser administrado a um indivíduo como um DNA ou mRNA codificando o polipeptideo sSCD83 de SEQ ID Nº: 7. Da mesma forma, em algumas modalidades, sSCD83 é fornecido para as células in vitro ou in vivo através da transformação de uma célula hospedeira (isto é, uma célula) com um ácido nucleico que codifica uma proteína sSCD83; a cé- lula hospedeira transformada pode então expressar proteina sCD83, propor- cionando assim proteína sSCD83 com outras células, bem como a si mesmo (isto é, a célula hospedeira transformada). Em tais modalidades, as células hospedeiras adequadas incluem as células dendríticas.

Em modalidades on- ' de sCD83 é fornecido como uma proteína CD83 codificando o ácido nuclei- . co, o termo "sCD83" pode também referir-se ao ácido nucleicos codificando a proteina sSCD83, Qualquer ácido nucleico adequado pode ser utilizado, in- —cluindo DNA, RNA ou um ácido nucleico sintético, desde que codifique uma : proteina CD83. Um ácido nucleico pode ser fornecido em um vetor apropria- ' do para a expressão da proteína codificada ou do fragmento de proteína.

Os vetores e métodos adequados para produzi-los são conhecidos na técnica.

Usos terapêuticos de sSCD83 As composições de sCD83, descritas aqui, são úteis para a pre- venção, cura, redução e/ou alívio de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta ' imune.

Por exemplo, o polipeptídeo hcD83ext de SEQ ID Nº: 5, foi avaliado - em uma série de modelos animais.

Utilizando o modelo de encefalite auto- imune experimental (EAE) em camundongo (um modelo para a esclerose múltipla humana), à paralisia pode ser inibida por sSCD83 na definição tanto em um pré-tratamento quanto em um tratamento ativo.

Os dados recentes também demonstram que sCD83 é capaz de prolongar a sobrevida do en- xerto cardíaco e da pele em camundongos, e quando usado em combinação com doses subterapêuticas de agentes imunossupressores bem- caracterizados, sSCD83 é capaz de um efeito a longo prazo na sobrevida do enxerto em um modelo de transplante cardíaco murina.

Os dados experi- mentais indicam também que sCD83 pode inibir o aparecimento de diabetes em um modelo de comando tipo 1. Além disso, os resultados estão disponí- veis, aos quais sugerem que o tratamento com sCD83 não resulta em imu- nossupressão global.

Os exemplos aqui demonstram que o polipeptídeo CD83ext de SEQ ID Nº: 7 (em que os resíduos de aminoácidos 1, 2,3,4e 130 estão presentes, o resíduo de aminoácido 85 é Ser e os resíduos de a- minoácidos 12, 20, 92 e 114 são Cys) é eficaz na prevenção da rejeição de enxerto em modelos de mamíferos de coração e transplante renal.

Dessa maneira, algumas modalidades fornecem um método pa- ra tratar ou prevenir pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune em ' um indivíduo, compreendendo a administração de um polipeptídeo sCD83 . da invenção ao referido indivíduo.

As disfunções ou funções indesejadas de uma resposta imune incluem doenças autoimunes, rejeição de transplante, doençae alergia do versus hospedeiro.

A doença autoimune que pode ser tratada utilizando os novos polipeptídeos sCD83 da invenção incluem, mas º não estão limitadas aos, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes autoimune (tipo 1), esclerose Pênfigo, doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, mias- tenia grave, automiocardite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, vasculite, uma doença inflamatória crônica intestinal, tais como doença de Crohn ou colite ulcerativa, autoimunopatias associadas a B27 HLA, tais como Morbus Bechterew, doença pulmonar obstrutiva crôni-

ca (DPOC), espondilite anquilosante e AIDS. . Consequentemente, os polipeptídeos CD83 solúveis da inven- ção e/ou ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos sSCD83 podem ser utilizados para a produção de um medicamento para o tratamento ou a pre- venção de uma doença ou condição médica causada pela disfunção ou fun- ção indesejada de uma resposta imune.

Por exemplo, tais medicamentos podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de doenças autoimu- nes, alergias, asma, rejeição de um tecido ou transplante de órgãos, ou uma resposta imune indesejada para uma composição terapêutica, de tal forma que a resposta imune indesejada é reprimida.

Em algumas modalidades, a resposta imune indesejada é dire- cionada para uma composição terapêutica, e um objetivo da invenção é tole- raroindivíduo à tal composição terapêutica.

Um indivíduo é considerado pa- ra ser tolerado e/ou ter sido imunossuprimido (ou seja, a tolerância imunoló- gica é considerada ter sido induzida ou adquirida) se pelo menos um desses objetivos for alcançado.

Induzindo a "imunossupressão" ou "tolerando" a um indivíduo, como utilizado aqui, significa que pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta i- mune envolvendo células dendríticas, células B e células T é impedido, cu- | rado, reduzido ou aliviado em comparação a um controle não-tratado ou um ' outro controle adequado, (por exemplo, em comparação com o sintoma an- . terior ao tratamento ou a gravidade esperada do sintoma sem tratamento, se o tratamento for destinado a impedir o desenvolvimento ou a reduzir a gravi- dadede uma resposta imune). Aqueles versados na técnica estão familiari- zados com a seleção e a aplicação dos métodos de medição e avaliação dos ' sintomas, bem como com a seleção de controles adequados.

Dessa maneira, o sujeito é considerado a ser tolerado e/ou a i- munossupressão é considerada ter ocorrido onde pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imunológica é reduzido ou aliviados em, pelo menos, 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em compara- ção a um controle adequado. Em modalidades em que o tratamento se des- . tina a reduzir o risco de um indivíduo em desenvolver um distúrbio autoimu- ne,orisco é reduzido ou aliviado em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em comparação a um controle adequado; esta avaliação pode ser realizada estatisticamente em uma popu- lação de indivíduos. Em modalidades onde o tratamento destina-se a tolerar um indivíduo para uma composição terapêutica, uma função indesejada de umaresposta imunológica é reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90%, 95% ou 100% em comparação a um controle adequado. Em outras modalidades, os objetivos da invenção incluem a pro- dução de células dendríticas tolerogênicas; nestas modalidades, "sintoma" refere-se a um parâmetro do comportamento das células, tanto in vivo quan- toemínvitro.

Os métodos da invenção são úteis para fins terapêuticos e, des- sa maneira, são destinados a prevenir, curar ou aliviar pelo menos um sin- toma de uma doença ou um distúrbio causado pela disfunção ou função in- desejada de uma resposta imune. Um sintoma de uma doença ou um distúr- bioé considerado ser reduzido ou aliviado se o sintoma for diminuído, au- mentado ou melhorado, conforme o caso, em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% ou mais em comparação a um controle adequado, tal | como em comparação com o sintoma anterior ao tratamento ou em compa- ' ração com a gravidade esperada do sintoma, onde o tratamento destina-se a . ser preventivo.

Um versado na técnica está familiarizado com as técnicas e os critérios para avaliar as mudanças nos sintomas.

Os sintomas das doen- çasoudos distúrbios causados pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem o . seguinte: histologia anormal de um tecido transplantado, função anormal de um tecido transplantado; duração breve de tempo de sobrevida após o even- to, tal como, por exemplo, o diagnóstico ou a transplantação; nível nível a- normal ou indesejavelmente alto ou baixo ou número de poteína(s) indicado- ra(s) ou outro(s) composto(s) no sangue, tais como anticorpos indesejáveis ou células indesejáveis (por exemplo, o antígeno específico de células den- dríticas ou células T); nível anormal ou indesejavelmente alto ou baixo ou o - número de células indicadoras no sangue ou em outras partes do corpo, por exemplo, um nível indesejavelmente baixo ou o número de células T regula-

doras, de modo que uma resposta imune indesejada é iniciada ou mantida.

Se necessário, a tolerização ou a tolerância e/ou a imunossu- pressão in vivo pode ser medida utilizando ensaios in vitro, tais como, por exemplo, em uma reação mista de linfócitos utilizando células isoladas de um indivíduo.

Da mesma forma, a tolerização ou a tolerância e/ou a imunos- supressão alcançadas em células ex vivo também podem ser medidas em ensaios ex vivo, utilizando diversos tipos de células, tais como, por exemplo, as células dendríticas, as células T ou as células B.

Se a tolerização ou a tolerância e/ou a imunossupressão são medidas utilizando um método ex vivo, atolerização ou tolerância é considerada ter ocorrido se a resposta das células a um estímulo imunológico for reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90% ou mais em comparação a um controle adequa- do.

Os ensaios direta ou indiretamente apropriados medem a resposta imu- ne e são conhecidos na técnica; eles incluem, mas não estão limitados a: ensaios de reação mista de linfócitos; ensaios de citotoxicidade; ensaios de titulação de anticorpos; ensaios para a produção de IL-10; ensaios para a produção de TGF-B; avaliação dos marcadores da superfície de célula; e

| ensaios para a expressão de Foxp3.

' As proteínas de sSCD83 da invenção podem ser coadministradas - com outros compostos imunossupressores. O termo "composto imunossu- pressor" refere-se a um composto que é capaz de esgotar o tamanho de uma população de clones de linfócitos T e/ou B, ou que é capaz de suprimir a sua reatividade, expansão ou diferenciação. Os compostos imunossupres- ' sores para uso nos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a: inibidores da calcineurina, incluindo a ciclosporina (também conhecida como "CsA", comercializado como Neoralº ou Sandimmunº?) e tacrolimus (também conhecido como "FK506," comercializado como Prograf”), inibido- res de metabolismo purina, tais como o micofenolato de mofetil (também co- nhecido como "MMF," comercializado como CellCept?) e azatioprina (co- mercializado como Azasanº ou Imuranº), inibidores da proliferação, tais co- - mo everolimus (comercializado como Certicanº) e sirolimus (também conhe- cido como "rapamicina" ou "Rapa", comercializado como Rapamune?); anti- corpos monocionais ("mAb'"), tais como anti-CD45 e anti-CD45RB (vide, por exemplo, Patente US No. 7.160.987); anticorpos monocilonais dirigidos con- tra as células T, tais como OKT3; anticorpos monoclionais dirigidos contra o receptor IL-2, incluindo anticorpos anti-Tat humanizados, tais como basilixa- mabe daclizumab; substâncias que bloqueiam as vias da célula T coestimu- latórias, tais como proteína de fusão CTLA-4-Ig1; substâncias que são ca- pazes de induzir quimerismo (ou seja, a coexistência entre o doador e o re- ceptor de células imune, em que o tecido do enxerto é reconhecido por si mesmo); e os tratamentos de pré-transplante não-mieloblativos, tais como a ciclofosfamida (comercializado como Cytoxanº). Para uma discussão sobre os imunossupressores e os seus alvos, vide, por exemplo, Stepkowski (2000) Expert Rev. Mol. Med. 21 de junho de 2000: 1-23). Por "quantidade eficaz" de uma substância entende-se que uma quantidade é, no mínimo, suficiente para atingir pelo menos um objetivo da invenção, quando administrada a um indivíduo de acordo com os métodos da invenção. Dessa maneira, por exemplo, uma "quantidade eficaz" de uma composição terapêutica sSCD83 é, no mínimo, suficiente para tolerizar ao in- | divíduo uma composição terapêutica, quando é coadministrada a um indiví- ' duo com CD83 ou produz um efeito mensurável sobre pelo menos um sin- . toma de uma doença ou distúrbio causada pela disfunção ou função indese- jada de uma resposta imune. A quantidade eficaz de um composto imunos- supressor sSCD83 pode ser determinada com relação aos sintomas exibidos em um indivíduo ou pode ser determinada a partir de estudos clínicos ou ex- . trapolados de estudos adequados em sistemas modelo. Dessa maneira, por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto imunossupressor sSCD83 inclui uma quantidade que seria esperada para produzir um efeito mensurá- velem pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio com base em um intervalo de dosagem determinado em um estudo clínico utilizando um método da invenção. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais - administrações, aplicações ou dosagens. As administrações, aplicações e dosagens adequadas podem variar em função de uma série de fatores, in- cluindo, mas não limitados a: atividade específica das composições; a formu- lação das composições; o peso corporal, idade, saúde, doença e condição do sujeito a ser tratado; e a via de administração das composições para um indivíduo. Em alguns casos, a quantidade mínima de sCD83 necessária para ser uma quantidade eficaz pode ser reduzida devido à presença de CD83 solúvel preexistente no paciente (vide, por exemplo, Hock e outros (2006) (Tissue Antigens 67: 57 - 60)); um dos versados na técnica será prontamen- te capaz de ajustar a dosagem e a administração, etc., a fim de alcançar os melhores resultados. Por exemplo, sSCD83 pode ser administrado a um paci- ente dentro de um intervalo possuindo: uma extremidade inferior de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 ou 700 mg/kg, ou 1,2, 8, 7, 10, 20, 50 ou 100 g/kg; e uma extremidade superior de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 7,10, 20, 50, 70, 100, 200, 500 ou 700 mg/kg ou 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50, 100 ou 200 g/Kkg.

Como o indivíduo pode ser tolerizado aos compostos exógenos por CD83, para fins terapêuticos, é importante que o indivíduo seja exposto, pelo menos, durante o tratamento ou, pelo menos durante a janela da eficá-

cia de CD83, aos compostos aos quais a tolerização não é desejada.

Dessa ' maneira, por exemplo, o indivíduo não deve ser exposto aos antígenos de . tumor específicos e aos micro-organismos que causam doenças, incluindo vírus, bactérias, fungos, etc.

Geralmente, como utilizado aqui, por "indivíduo" entende-se qualquer animal que necessite de tratamento.

Dessa maneira, por exemplo, um "indivíduo" pode ser um paciente humano ou um paciente ' não-humanos ou mamífero ou pode ser outro paciente que é um animal.

Quando a prevenção de uma doença ou de uma condição médi- ca é desejada, um indivíduo pode ser tratado em intervalos regulares (por exemplo, aproximadamente: a cada dois anos, a cada ano, a cada seis me- ses, a cada dois a quatro meses ou a cada mês). No entanto, em todas as modalidades da invenção, os métodos e as composições da invenção são ] administrados a um indivíduo que foi identificado como possuindo uma de- . terminada doença ou distúrbio causado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune ou a um indivíduo que foi identificado como sendo susceptíveis de desenvolver uma determinada doença ou distúrbio.

Por e- xemplo, um indivíduo pode ser identificado como suscetível de desenvolver uma determinada doença ou distúrbio como um resultado do exame do his- tórico familiar do indivíduo, de um teste médico, tal como um teste genético ouumteste para determinar a enzima do indivíduo ou os níveis de metabóli- to, ou de ser diagnosticado com uma outra doença ou distúrbio.

Desta ma- neira, por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados para tratar uma doença autoimune, para evitar o desenvolvimento de uma doença auto- imune ou para reduzir o risco de um indivíduo para desenvolver uma doença autoimune.

Geralmente, um curso de tratamento termina quando o indivíduo não está sendo tratado para aliviar ou prevenir uma determinada doença ou condição médica causada pela disfunção ou função indesejada de uma res- posta imune.

Dessa maneira, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição médica causada pela disfunção, a resposta imune indesejada ou a função indesejada de uma resposta imu- ne, em que uma quantidade eficaz de sSCD83 é administrada a um indivíduo assim que a imunossupressão for alcançada.

Em uma modalidade, a respos-

| ta imune indesejada é selecionada do grupo consistindo em doenças autoi- ' munes, rejeição de transplantes e alergia. Tais métodos podem ainda com- - preender a administração de uma ou mais ciclosporina A (CsA); rapamicina mais anticorpo anti-CD45RB monocional; e tacrolimus (FK506) mais micofe- nolatomofetil (MMF).

Em modalidades preferidas, a doença autoimune é selecionada , do grupo consistindo em lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo |, Pênfi- go, doença de Graves, tireoide de Hashimoto, miastenia grave, automiocar- dite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, - 10 vasculite, uma doença crônica inflamatória intestinal, doença de Crohn ou colite ulcerativa, Morbus Bechterew, espondilite anquilosante e doença pul- monar obstrutiva crônica (DPOC). ' Em algumas modalidades, é fornecido o uso de um novo poli- - peptídeo sCD83 da invenção para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma resposta imune indesejada em um indivíduo mamiífe- ro.

Em outro aspecto, é fornecido um método para melhorar o resul- tado de transplante em um receptor de transplante de mamíferos, compre- endendo administrar ao dito receptor uma quantidade terapeuticamente efi- cazdo polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um ou mais agentes imunossupressores, em que o agente imunossupressor atua de forma sinérgica com o dito polipeptídeo para melhorar o resultado do transplante. Em uma modalidade, o dito agente imunossupressor é ciclospo- rina A. Em outras modalidades, os ditos agentes imunossupressores são ra- pamicina mais anticorpo anti-CD45RB monoclonal; ou tacrolimus (FK506) mais micofenolato mofetil (MMF).

Os métodos da invenção podem ser utilizados a fim de tratar in- divíduos que são ou podem ser afetados por uma doença ou distúrbio cau- sado pela disfunção ou função indesejada de uma resposta imune, tal como, porexemplo: alergia, asma, rejeição de uma transplante de tecido, uma res- posta imune a uma substância administrada cronicamente, uma doença au- toimune, tais como miastenia grave, esclerose múltipla, vasculite, uma doen-

ça inflamatória crônica intestinal, tais como doença de Crohn ou colite ulce- ' rativa, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistêmico, doenças de pe- ' le tais como psoríase, artrite reumatoide e diabetes mellitus dependente de insulina e AIDS.

Os métodos da invenção podem ser usados para tratar os indivíduos afetados por uma doença ou distúrbio que envolve as células B ou funções de células B, tais como, por exemplo: hiperplasia de células B, tal ' como a leucemia (incluindo mieloma múltiplo e leucemia linfoide aguda); cé- lulas B de hiperatividade associada a AIDS, síndrome do choque tóxico, do- ença do soro e doença periodontal (vide, por exemplo, Mahanadi e outros (2002) J.

Periodontal Res 37: 177-183). A doença do soro é um grupo de sintomas causado por uma resposta imune indesejada a certos medicamen- tos ou soro.

Ou seja, a doença do soro pode resultar quando o antissoro de outro animal ou de ser humano é dado a um indivíduo em um esforço para - induzir a imunização passiva.

Em algumas modalidades, os métodos da in- venção proporcionam tratamento para uma doença ou distúrbio que envolve as células B ou as funções da célula B, em que o tratamento não resulta em depleção de células B, ou seja, uma diminuição no número e/ou subtipo de células B no indivíduo.

Dessa maneira, em algumas modalidades, os métodos da in- venção são usados para prevenir, curar ou aliviar, pelo menos, um sintoma de rejeição de um transplante de tecido em um receptor de tecidos.

Em tais modalidades, o receptor de transplante ("receptor" ou sujeito) pode ser trata- do com sCD83 e, opcionalmente, um antígeno associado com o tecido transplantado, tal como, por exemplo, um antígeno preparado a partir de ou extraído do tecido transplantado, por exemplo, por lise ou homogeneização de uma amostra do tecido transplantado.

Geralmente, o tratamento dos re- ceptores do transplante de acordo com os métodos da invenção pode incluir um tratamento prévio, em conjunto com (ou seja, ao mesmo tempo), e/ou após o transplante do tecido.

Em algumas modalidades, os métodos da in- venção previnem, curam ou aliviam todos os sintomas adversos da rejeição de um transplante de tecido, de forma tal que o tratamento contínuo do indi- víduo transplantado para evitar a rejeição se torne desnecessário; em tais

| modalidades, diz-se que a tolerância de enxerto foi induzida no indivíduo. ' Em algumas modalidades, o doador do tecido a ser transplanta- ' do ("doador do transplante") pode ser tratada com sCD83 antes de remover o tecido para transplante no receptor pretendido, em que o objetivo do tra- tamentoé induzir a tolerância e/ou a imunossupressão no receptor do trans- plante.

Em algumas modalidades, tanto o doador do transplante quanto o . receptor do transplante podem ser tratados de acordo com os métodos da invenção.

O termo "tecido", como usado áqua, engloba os órgãos distintos e/outecidos especializados (por exemplo, fígado, rim, coração, pulmão, pe- le, ilhotas pancreáticas, etc.), bem como o termo tecidos "líquidos" (por e- xemplo, sangue, componentes do sangue, tais como plasma, células, tais como células dendríticas, etc.); o termo "tecido" também abrange partes e + subpartes dos órgãos distintos e dos tecidos "líquidos". Aqueles versados na técnica estão familiarizados com os méto- dos de avaliação e tratamento dos receptores e doadores de transplante, a fim de alcançar o melhor resultado possível para tanto os receptores quanto os doadores.

Dessa maneira, os versados na técnica prontamente são pron- tamente capazes de avaliar e ajustar as dosagens e a administração de CDB83, pelomenos um outro composto imunossupressor e, opcionalmente, uma composição terapêutica como adequado para um determinado indiví- duo.

Como será prontamente apreciado a partir da discussão acima, os mé- todos da invenção compreendem uma série de etapas; estas etapas podem ser executadas em qualquer ordem, desde que pelo menos um objetivo da invenção seja alcançado.

Como os métodos podem envolver várias adminis- trações de vários compostos, uma certa sobreposição das etapas também pode ocorrer.

Os métodos de tratamento fornecidos pela invenção incluem o uso de CD83 e pelo menos um outro composto imunossupressor e a indu- ção da tolerância e/ou imunossupressão em um indivíduo in vivo.

Os meios da administração destas substâncias para um indivíduo incluem, mas não são limitados às vias convencionais e fisiologicamente aceitáveis, tais como, | por exemplo, oral, pulmonar, parenteral (por exemplo, intramuscular, intra- : articular, intraperitoneal, intravenosa (IV) ou injeção subcutânea), inalação . (através de uma formulação de pó fino ou uma névoa fina (aerossol)), trans- dérmico, intradérmico, nasal, vaginal, retal ou rotas de administração sublin- qgual Quando a composição farmacêutica compreende um ácido nu- . cleico para a administração de uma determinada espécie de animal, o ácido nucleico para o uso da invenção pode ser derivado a partir desta espécie.

Por exemplo, quando uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) codificando sCD83 é para ser administrada aos seres humanos, o ácido nucleico pode codificar um poli- peptídeo compreendendo sCD83 de SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de a- i minoácidos possuindo, pelo menos, 65% identidade de aminoácido de SEQ . ID Nº: 7. Os ácidos nucleicos para a utilização da invenção podem ser admi- nistrados juntamente com os agentes que aumentam a permeabilidade da membrana celular e/ou a captação celular dos ácidos nucleicos.

Os exem- plos destes agentes são poliaminas, conforme descrito, por exemplo, em An- tony e outros (1999) Biochemistry 38: 10775-10784; poliaminas ramificada, conforme descrito, por exemplo em Escriou e outros. (1998) Biochem.

Bio- phys.

Acta 1368: 276-288; poliaminolipídeos conforme descrito, por exemplo, em Guy-Caffey e outros (1995) J.

Biol.

Chem. 270: 31391-31396; DOTMA conforme descrito em Feigner e outros (1987) Proc.

Nat'l.

Acad.

Sci.

EUA 84: 7413-7417 e porfirinas catiônicas, conforme descrito, por exemplo, em Benimetskaya e outros (1998) Nucl.

Acids Res. 26 (23): 5310-5317. Definições Como usados no relatório descritivo e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem referências no plural a me- nos que o contexto claramente indique de outra maneira.

Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo as respecti- vasmisturasdasmesmas.

Como usado aqui, o termo "compreendendo" destina-se a dizer que as composições e os métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em" quando usado para defi- ' nir as composições e os métodos, deve entender-se excluíndo outros ele- - mentos de qualquer importância fundamental à combinação.

Dessa maneira, uma composição consistindo essencialmente nos elementos como definidos aqui, não poderia excluir os traços de contaminantes a partir do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como + uma solução salina de fosfato tamponada, conservantes e similares.

Os po- lipeptídeos ou as proteínas que "consistem essencialmente em" uma dada sequência de aminoácidos são aqui definidos para conter de O a 10 aminoá- cidos adicionais em cada extremidade tanto no terminal N quanto no terminal C de uma dada sequência de aminoácidos.

Preferivelmente, eles não con- têm mais de cinco, preferivelmente não mais que dois, e mais preferivelmen- ] te ainda não mais que um aminoácido adicional no terminal amino e/ou car- - bóxi da proteína ou do polipeptídeo.

Os ácidos nucleicos ou polinucleotídeos que "consistem essencialmente em" uma dada sequência de ácido nucleico são aqui definidos para conter não mais que trinta, preferivelmente não mais de seis, mais preferivelmente não mais que três, e mais preferivelmente ain- da não mais que um nucleotídeo adicional no terminal 5' ou 3' da sequência de ácidos nucleico. "Consistindo em" significa excluir mais do que elementos de traço dos outros ingredientes e etapas substanciais do método para ad- ministrar as composições da presente invenção.

As modalidades definidas por cada um destes termos de transição.. O termo "células dendríticas (DCs)" refere-se a uma população diversificada dos tipos de células morfologicamente semelhantes encontra- dosem uma variedade de tecidos linfoides e tecidos não-linfoides, Steinman (1991) Ann.

Rev.

Immunol. 9:271-296. As células dendríticas constituem os APCs mais potentes e preferenciais no organismo.

Enquanto as células dendríticas podem ser diferenciadas a partir de monócitos, as mesmas pos- suem fenótipos distintos.

Por exemplo, um marcador específico de diferenci- ação, o antigeno CD14, não é encontrado nas células dendríticas, mas é possuído por monócitos.

Além disso, as células dendríticas maduras não são fagocíticas, enquanto que os monócitos estão fortemente fagocitando as cé-

| lulas. Demonstrou-se que DCs maduras podem fornecer todos os sinais ne- ' cessários para a ativação e proliferação das células T.

- O termo "resposta imune" refere-se, amplamente, as respostas de linfócitos específicas de antígenos às substâncias estranhas. Qualquer substância que pode desencadear uma resposta imune é dita ser "imunogê- nica" e é referida como um "imunógeno". Todos os imunógenos são antíge- . nos, no entanto, nem todos os antígenos são imunogênicos. Uma resposta imune desta invenção pode ser humoral (através da atividade de anticorpo) ou mediada por células (através da ativação das células T).

Como usado aqui, o termo "substituição de aminoácido conser- vadora" refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido dentro do mesmo grupo de aminoácidos. Os aminoácidos podem ser classi- ] ficados de acordo com seus grupos R, da seguinte forma: 1) grupos R não- . polares, alifáticos; 2) grupos R polares, não-carregados; 3) grupos R aromá- ticos; 4) grupos R carregados positivamente; e 5) grupos R carregados ne- gativamente. Os aminoácidos dos grupos R não-polares, alifáticos incluem: glicina, alanina, valina, lucina, isoleucina e prolina. Os aminoácidos dos gru- pos R polares, não-carregados incluem serina, treonina, cisteina, metionina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos com os grupos R aromáticos inclu- em fenilalnina e tirosina. Os aminoácidos com grupos R carregados positi- vamente incluem lisina, arginina e histidina. Os aminoácidos com grupos R carregados negativamente incluem aspartato e glutamato.

Os termos "polinucleotídeo", "ácidos nucleicos" e "molécula de ácido nucleico" são utilizados indiferentemente para referirem-se às formas poliméricas de nucleotídeos de qualquer tamanho. Os polinucleotídeos po- dem conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos. Os nucleotídeos podem possuir qualquer estrutura tridimensional, e podem executar qualquer função, conhecida ou não-conhecida. O termo "polinu- cleotídeo" inclui, por exemplo, moléculas de filamento simples, filamento du- ploe de hélice tripla, um gene ou um fragmento do gene, éxons, íntrons, MRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, poli- nucleotídeos ramiíificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer se- | quência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e ' iniciadores. Além de uma molécula de ácido nucleico nativa, uma molécula - de ácido nucleico da presente invenção também pode compreender molécu- las de ácido nucleico modificadas. Como usado aqui, mRNA refere-se a um RNA que pode ser traduzido em uma célula.

O termo "peptídeo" é usado em seu sentido mais amplo para re- . ferir-se a um composto de dois ou mais aminoácidos da subunidade, análo- gos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser liga- das por ligações peptídicas. Em outra modalidade, a subunidade pode ser ligada por quaisquer outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Quando usados aqui, o termo "aminoácido" refere-se tanto aos aminoácidos naturais e/ou artificiais quanto aos sintéticos, incluindo a glicina e tanto os isômeros ópticos D quanto L, análogos de aminoácidos e peptidomiméticos. Um pep- . tídeo de três ou mais aminoácidos é comumente chamado de oligopeptídeo seacadeiado peptídeo for curta. Se a cadeia do peptídeo for longa, o pep- tídeo é comumente chamado de um polipeptídeo ou proteína.

O termo "veículo de entrega do gene" é definido como qualquer molécula que pode levar os polinucleotídeos inseridos em uma célula hos- pedeira. Os exemplos de veículos de entrega de genes são lipossomas, po- límeros biocompatíveis, incluindo os polímeros naturais e os polímeros sinté- ticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos; lipopolissacarídeos; en- velopes virais artificiais; partículas de metal; e as bactérias ou vírus, tais co- mo baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vetores de fungos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica, que foram descritos para a expressão em uma variedade de hospedeiros eucarióticos e procarióticos, e pode ser usado para a terapia do gene, bem como para a expressão da proteína simples.

O termo "entrega do gene", "transferência dos genes", "transfec- ção" e similares, como aqui utilizados, são os termos que referem-se à intro- dução de um polinucleotideo exógeno em uma célula hospedeira, indepen- dentemente do método utilizado para a introdução. A transfecção refere-se à entrega de qualquer ácido nucleico no interior de uma célula. A entrega do )

gene refere-se à entrega de um ácido nucleico que pode ser integrado no ' genoma da célula hospedeira, ou que pode se replicar independentemente . do genoma da célula hospedeira.

A entrega do gene ou a transferência do gene não refere-se à introdução de um mRNA em uma célula.

Os métodos de transfecção incluem uma variedade de técnicas, tais como a eletropora- ção, os complexos de entrega de ácido nucleico com base no íon catiônico, . com base no ilídeo e com base na proteína, vetores virais, entrega do "gene gun" e várias outras técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica.

O polinucleotídeo introduzido pode ser introduzidas mantido de forma estável nacélula hospedeira ou pode ser expresso de forma transitória.

Em algumas modalidades, um mRNA codificando um polipeptíideo sCD83 é introduzido em uma célula e é expressado de forma transitória.

A manutenção estável ] geralmente requer que o polinucleotídeo introduzido tanto contenha uma ori- é gem de replicação compatível com a célula hospedeira quanto se integre em um replicon da célula hospedeira, tal como um replicon extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial.

Um número de vetores é capaz de mediar a transferência dos genes para as células de mamíferos, como é conhecido na técnica e descrito aqui.

O termo "vetor viral" é definido como um vírus produzido de forma recombinante ou uma particular viral que compreende um polinucleo- tídeo a ser entregue em uma célula hospedeira, tanto in vivo, ex vivo quanto in vitro.

Os exemplos de vetores virais incluem os vetores retrovirais, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores alfavírus e simila- res.

Os vetores alfavírus, tais como os vetores com base nos vírus Semliki Foresteos vetores com base no virus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso em terapia e imunoterapia do gene.

Vide Schlesinger e Dubensky (1999) Curr.

Opin.

Biotechnol. 5:434-439 e Zaks e outros (1999) Nat.

Med. 7:823-827. Nos aspectos onde a transferência dos genes é mediada por um vetor retroviral, um constructo do vetor refere-se ao polinucleotídeo compre- endendo o genoma retroviral ou parte do mesmo, e um gene terapêutico.

Como usado aqui, a "transferência do gene mediada retroviral" ou a "trans- dução retroviral"” tem o mesmo significado e refere-se ao processo pelo qual

)

um gene ou as sequências de ácidos nucleicos são transferidos de forma ' estável dentro da célula hospedeira através da força do vírus entrando na - célula e integrando seus genomas no genoma da célula hospedeira. O vírus pode entrar na célula hospedeira através do seu mecanismo normal de in- fecção ou pode ser modificado de tal forma que ele se liga a um receptor ou ligando da superfície da célula hospedeira diferente para entrar na célula. . Como usado aqui, o termo "vetor retroviral" refere-se a uma partícula viral capaz de introduzir o ácido nucleico exógeno em uma célula através de um mecanismo de entrada do tipo viral ou viral.

Os retrovírus transportam a informação genética na forma de RNA; no entanto, uma vez que o vírus infecta a célula, o RNA é transcrito reversamente na forma de DNA que se integra ao DNA genômico da célula ] infectada. A forma integrada de DNA é chamada provírus. Nos aspectos on- « de a transferência dos genes é mediada por um vetor de DNA viral, tal como um adenovírus (Ad), pseudoadenoviral ou vírus adenoassociado (MV), o constructo do vetor refere-se aos polinucleotíideos compreendendo o geno- ma viral ou parte do mesmo, e um transgene. Adenovírus (Ads) são um gru- po de vírus relativamente bem-caracterizado e homogêneo, incluindo mais de 50 sorotipos. (Vide, por exemplo, WO 95/27071). Os Ads são fáceis de crescer e não exigem a integração no genoma da célula hospedeira. Os ve- tores recombinantes derivados de Ad, particularmente aqueles que reduzem o potencial de recombinação e geração de vírus do tipo selvagem, também foram construídos. (Vide, WO 95/00655 e WO 95/11984). MV do tipo selva- gem possui alta infectividade e especificidade de integração no genoma da célulahospedeira. (Vide, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6466-6470 e Lebkowski e outros (1988) Mol, Cell. Biol. 8:3988- 3996).

Os vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem, no qual um polinucleotídeo pode ser ligado operacionalmente, são conhecidos na técnica. Tais vetores são capazes de transcrever o RNA in vitro ou in vivo, e estão comercialmente disponíveis a partir de fontes tais como Stratagene (La Jolla, CA) e Biotech Promega (Madison, WI). A fim de otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, ' adicionar ou alterar as porções não-traduzidas 5 'e/ou 3' dos clones ou de . outras sequências que podem interferir com ou reduzir a expressão, tanto no nível da transcrição quanto no nível de tradução. Alternativamente, o con- senso dos sítios de ligação de ribossomo pode ser inserido imediatamente no códon de partida 5' para realçar a expressão.

. Os veículos de entrega de gene também incluem vários vetores não-virais, incluindo os complexos DNA/lipossomos e os complexos proteí- na-DNA virais alvejados. Os lipossomos que também compreendem um an- ticorpo-alvo ou fragmento do mesmo podem ser usados nos métodos da presente invenção. Para aumentar a entrega de uma célula, os ácidos nucle- icos e proteínas desta invenção podem ser conjugados com os anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos que ligam os antígenos de superfície da . célula, por exemplo, TCR, CD3 ou CDA.

O termo "hibridização" refere-se a uma reação em que um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através da ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucieotí- deos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer pelo emparelhamento com base Watson-Crick, ligação Hoogstein, ou em qualquer outra forma de sequência específica. O complexo pode compreender dois filamentos que formam uma estrutura duplex, três ou mais filamentos que formam um complexo muiltifi- lamentado, um filamento de auto-hibridização simples ou qualquer combina- ção destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa em um processo mais amplo, tal como o início de uma reação de PCR, ou a cliva- gem enzimática de um polinucleotídeo por uma ribozima.

As condições rigorosas de hibridização são as seguintes: a pré- hibridização dos filtros contendo um ácido nucleico de interesse é realizada por 8 horas durante a noite em 65ºC em um tampão composto por 6xSSC, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,02%, e DNA de esperma de salmão desnaturado a 500 ug/ml., Os filtros são hibridi- zados por 48 horas a 65ºC, a temperatura de hibridização preferida, em uma mistura de pré-hibridização contendo DNA de esperma de salmão desnatu-

rado a 100 ug/ml e 5-20x106 da sonda 32 P rotulada.

Posteriormente, as la- ' vagens do filtro são realizadas a 37ºC por uma hora em uma solução con- . tendo 2xSSC, Ficoll a 0,01% e BSA 0,01%, seguido por uma lavagem em 0,1xSSC a 50ºC. por 45 min.

Seguindo as etapas de lavagem, as sondas hibridizadas são detectáveis por auto-radiografia.

Tais métodos são bem- conhecidos na técnica e citados em Sambrook e outros, 1989; e Ausubel e . outros, 1989. Uma região de polinucleotídeo ou um polinucleotídeo (ou uma região de polipeptídeo ou polipeptídeo) que possui uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de "identidade de sequência" para outra sequência significa que, quando alinhadas, o percentual das bases (ou aminoácidos) é o mesmo na comparação das duas sequências.

Para deter- minar a identidade da porcentagem das duas sequências de aminoácidos, . ou das duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas parafinsde comparação ideal (por exemplo, os intervalos podem ser intro- duzidos em uma ou tanto em uma primeira quanto em uma segunda se- quência de ácido nucleico ou aminoácido para alinhamento ideal e as se- quências não-homólogas podem ser desconsideradas para fins de compara- ção). Em uma modalidade preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação, é de, pelo menos, 30%, prefe- rivelmente, pelo menos, 40%, mais preferivelmente, pelo menos, 50%, 60%, e mais preferivelmente ainda, pelo menos, 70%, 80%, 90 %, 100% do com- primento da sequência de referência.

Os resíduos de aminoácidos ou nucle- otídeos nas posições de aminoácidos ou nas posições de nucleotídeos cor- respondentes são então comparados.

Quando uma posição na primeira se- quência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotideo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas às desta posição (como utilizado aqui, a "identidade" de aminoáci- do ou ácido nucleico é equivalente ao aminoácido ou ácido nucleico "homó- logo”). A identidade da porcentagem entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhada pelas sequências, levando em conta o número de intervalos, bem como o comprimento de cada interva-

lo, que devem ser introduzidas para o alinhamento ideal das duas sequên- º cias.

. A comparação das sequências e a determinação da identidade da porcentagem entre as duas sequências podem ser feitas utilizando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a identidade da porcen- tagem entre as duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o º algoritmo Needleman e Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) o qual foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em geg.com), utilizando tanto uma matriz Blossum 62 quanto uma matriz PAMZ50, eum intervalo de peso de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um comprimen- to de peso de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em ainda outra modalidade preferida, a identi- dade da porcentagem entre duas sequências de nucleotídeos é determinada : utiizando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em - gcg.com), utilizando uma matriz NNVYSgapdna.CMP e um intervalo de peso de 40,50,60,70 ou 80 e um comprimento de peso de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um con- junto particularmente preferido de parâmetros (e o que deve ser utilizado a menos que indicado de outra maneira) é uma matriz de pontuação Blossum 62, com uma penalidade de intervalo de 12, uma penalidade de intervalo es- tendida de 4, e uma penalidade de intervalo da estrutura de leitura de 5. A identidade da porcentagem entre os dois aminoácidos ou as sequências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) o qual foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade do comprimento de intervalo de 12 e uma penali- dadedeintervalode4.

O ácido nucleico e as sequências da proteína, descritas aqui, podem ser usadas como uma "sequência de consulta" para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais buscas podem ser re- alizadas utiizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Alts- chul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas BLAST de nucle- otídeo podem ser realizada com o programa NBLAST, pontuação = 100,

comprimento das plavras = 12 para obter sequências de nucleotídeos homó- ' logas às moléculas de ácido nucleico mMafA da invenção.

As pesquisas . BLAST de proteína podem ser realizada com o programa XBLAST, pontua- ção = 50, comprimento das palavras = 3 para obter as sequências de ami- —noácidoshomólogas às moléculas de proteína mMafA da invenção.

Para ob- ter os alinhamentos de intervalo para fins de comparação, BLAST de interva- 7 lo pode ser utilizado, conforme descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Quando utilizam-se os programas BLAST e BLAST de intervalo, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados.

Vide ncbi.nlm.nih.gov.

O termo "isolado" significa separado dos componentes, das célu- las e outros, em que o polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anti- i corpo ou fragmentos dos mesmos, são normalmente associados com os na- - turais.

Por exemplo, no que diz respeito a um polinucleotídeo, um polinucleo- tídeo isolado é aquele que é separado das sequências 5 'e 3' com o qual é normalmente associado no cromossomo.

Como é evidente para aqueles versados na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento (s) do mesmo, ocorrendo de forma artificial, não ne- cessita de "isolamento" para distingui-lo dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural.

Além disso, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteina de anticorpos, ou fragmentos (s) do mesmo "concentrado", "sepa- rado" ou "diluído" são distinguíveis dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural, em que a concentração ou o número de moléculas por volume é maior do que o "concentrado" ou menor do que o "separado" dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural.

Um polinucleotídeo, peptídeo, poli- peptídeo, proteína de anticorpos, ou fragmentos(s) do mesmo, os quais dife- rem dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural, em sua sequên- cia primária ou, por exemplo, pelo seu padrão de glicosilação, não precisam estar presentes na sua forma isolada, uma vez que é distinguível dos que, em contrapartida, ocorrem de forma natural através da sua sequência primá- ria, ou, alternativamente, por outra característica, tal como glicosilação- padrão.

Embora não afirmado explicitamente para cada uma das composi-

ções descritas aqui, é preciso entender que todas as modalidades acima pa- ' ra cada uma das composições descritas abaixo e em condições adequadas - são fornecidas por esta invenção. Assim, um polinucleotídeo que não ocorre de forma natural é fornecido como uma modalidade separada dos polinucle- otídeos isolados que ocorrem de forma natural. Uma proteína produzida em uma célula bacteriana é fornecida como uma modalidade separada da prote- * ina isolada que ocorre de forma natural de uma célula eucariótica ao qual é produzida na natureza. Uma célula de mamíferos, tais como células dendríti- cas, é isolada, se for removida do sítio anatômico da qual ela é encontrada em um organismo.

O termo "célula hospedeira", "célula-alvo" ou "célula receptora" destinam-se a incluir qualquer célula individual ou célula de cultura que pode ser ou tenha sido receptores de vetores ou a incorporação de moléculas de . ácido nucleico, polinucleotídeos e/ou proteínas exógeno. Também destina- sea incluir a descendência de uma célula simples, e a descendência não pode necessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou no DNA genômico total ou complementar) para a célula-mãe original devido a uma mutação natural, acidental ou deliberada. As células podem ser proca- rióticas ou eucarióticas, e incluem, mas não estão limitadas, as células de bactérias, células de fungos, células de animais e células de mamíferos, por exemplo, murinos, ratos símios ou seres humanos.

O termo "indivíduo" é um vertebrado, preferivelmente um mamí- fero, mais preferivelmente um ser humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, símios, seres humanos, animais de fazenda, a- nimaisde esporte e animais de estimação.

O termo "composição" significa uma combinação de agente ati- Vo e outro composto ou composição, ativa ou inerte (por exemplo, um agen- te detectável ou rotulado), tal como um adjuvante.

O termo "composição farmacêutica" destina-se a incluir uma combinação de um agente ativo com um veículo inerte ou ativo, tornando a composição adequada para uso terapêutico ou diagnóstico in vitro, in vivo ou ex vivo.

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Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitá- ' vel" abrange qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tal como uma . solução salina de fosfato tamponada, água e emulsões, tal como uma emul- são óleo/água ou água/óleo, vários tipos de agentes umectantes e outras formulações descritas aqui. As composições também podem incluir estabili- ' zantes e conservantes. Para os exemplos de veículos, estabilizadores e ad- - juvantes, vide Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 18 ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)) O termo "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efeito de resultados benéficos ou desejados, tais como a supressão da res- posta imune, tratamento, prevenção ou melhora de uma condição médica (infecção, doença, etc.). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em ] uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. As dosagens apro- . priadas podem irão variar dependendo do peso corporal, idade, saúde, do- ençaou condição a ser tratada e a via de administração. De acordo com a descrição acima, os exemplos a seguir servem para ilustrar, mas não limitar, os vários aspectos da presente invenção. É para ser entendido, embora nem sempre explicitamente, que os reagentes descritos a seguir são meramente exemplificativos e que os equivalentes dostaissão conhecidos na técnica. Exemplos Experimentais Métodos gerais: Para as técnicas gerais, vide Current Protocols in Immunology, eds. Coico e outros (Wiley, Hoboken, New Jersey). Para os métodos de puri- ficação sSCD83, vide Lechmann e outros. (2002) Protein Expr. Purif. 24:445-

452. Exemplo 1 Bioprocesso para Produção de hcD83ext recombinante em E. coli e purifi- cação a jusante O plasmídeo pGEX2ThCD83ext (descrito no Pedido de Patente US 2007/0167607 e diagramado na figura 2) foi utilizado para a expressão de hcD83ext. Neste plasmídeo, a expressão de uma proteína de fusão GST-

hCD83ext está sob a regulação de um promotor tac induzível a IPTG. A se- º quência da proteína de fusão é mostrada na SEQ ID Nº: 8. Nesta sequência, . os resíduos de aminoácidos 1 a 5 correspondem à etiqueta GST, os resí- duos de aminoácidos 6 a 13 correspondem a um sítio de clivagem da trom- bina, os resíduos de aminoácidos 14 a 138 correspondem ao domínio extra- ] celular de CD83 humano, e os resíduos de aminoácidos 139 (isoleucina) cor- : respondem ao primeiro aminoácido contíguo do domínio extracelular de CD83 humano. A etiqueta GST permite a captura da proteína de fusão utili- zando a cromatografia de afinidade GST. A proteína capturada pode então serclivada (tanto dentro quanto fora da coluna) pela trombina em um sítio de clivagem da trombina (entre os resíduos de aminoácidos 9 e 10 ou SEQ ID Nº: 8) na junção do GST e da fusão hCD83ext, a fim de liberar a porção i hcDp83ext. Devido ao design de um sítio de clivagem da trombina na junção . entre GST e hcD83ext, o produto final de hoD83ext possui quatro aminoá- cidos extras(ou seja, Gly-Ser-Pro-Gly, SEQ ID Nº: 41) no terminal amino. PGEX2ThCD83ext foi transformado em várias cepas de Escheri- chia coli comuns de DH5a JM109, HB101 e BL21, a fim de escolher o hos- pedeiro ideal para a expressão hcD83ext. E. coli BL21 superou as outras expressões de hospedeiro (dados não mostrados). BL21 (F-ompT-gal-dem- lon HSDS (rb-mb); ATCC no. de acesso BAA-1025) é particularmente ade- quado para a produção de proteínas recombinantes, devido à inativação dos dois genes da protease (lon e ompT), resultando na diminuição da proteólise dos produtos de genes estrangeiros. A redução da proteólise é particular- mente importante para as proteínas recombinantes com uma origem euca- riótica, tais como hcD83ext, quando E. coli é utilizado como um hospedeiro de expressão.

Vários parâmetros de cultura, incluindo a receita média, a condi- ção de indução (ou seja, o tempo de indução e a concentração de IPTG), a velocidade de agitação e a temperatura, foram otimizados para aumentar o rendimento de hcD83ext recombinante. No procedimento otimizado, uma colônia isolada de BL21/pGEX2ThCD83ext foi inoculada em um meio LB a 100 mL acrescido de ampícilina (Ap) a 50 ug/mL e incubada a 37 ºC em um agitador rotativo a 200 rpm por aproximadamente 12 horas para produzir ' uma cultura de semente. A cultura de semente (80 mL) foi usada para inocu- . lar um biorreator de bancada (Omni-Cultura, VIRTIS, Gardiner, Nova lorque, EUA), contendo 1 L de volume de trabalho do meio de cultura (NaCl a 5 g/L, extratode levedura Bacto a 20 g/L, Bacto triptona a 20 g/L, glicose a 5 g/L e anti-espumante 289 a 10 uL/L (Sigma, St. Louis, MO, EUA)). Quando a den- - sidade das células chegou a um OD600 — 2, foi adicionado isopropil B-D tio- galactopiranosídeo (IPTG) a 0,5 mM na indução. O biorreator foi então re- movido com filtro de ar esterilizado a 2 L/min para aeração. O pH da cultura foiregulamentado em 7,0 + 0,1, adicionando 3 N NH4O0H ou 3 N HCl utili zando uma combinação de eletrodo de pH (Mettler Toledo, Suíça), um con- trolador de pH (PC310, Suntex, Taipei, Taiwan) e duas bombas peristálticas ' (101 U/R, Watson Marlow, Falmouth, Reino Unido). O biorreator foi operado . a 28ºC e 650 rpm por aproximadamente seis horas após a indução.

Após a cultivação, as células foram colhidas por centrifugação a 6000 x g e 2ºC por 10 min, pesadas e pélete armazenado a -80ºC para pos- terior processamento. Normalmente, um pélete de célula de aproximada- mente 20 g em peso celular úmido (wcw) pode ser obtido a partir de 1 L da cultura. O pélete de célula foi ressuspenso em 0,05 g-wcw/mL em tampão de solução salina de fosfato tamponado (pH 7,3). Uma batelada (20 mL) da suspensão de célula a cerca de 20 OD600 foi sonicada intermitentemente (ou seja, 0,5 segundo dentro, 0,5 segundo fora) por 4 minutos, utilizando um processador ultrassônico com ponta regular (Misonix). O lisado de célula so- nicado foi então centrifugado a 15.000 x g e 2 ºC por 15 minutos para remo- verosrestos de células. O sobrenadante, contendo proteínas solúveis totais foi filtrado com um filtro de 0,45um antes do processamento cromatográfico subsequente para a purificação de proteínas, e também foi analisado por ensaio de GST, SDS-PAGE e Western blotting. Após a preparação do extrato de célula, como descrito acima, a proteína de fusão recombinante GST-hCD83ext foi processada e purificada por três etapas principais: 1) capturar utilizando uma coluna de afinidade a GST, 2) clivar na coluna com trombina para liberar a porção hCD83 na fase líquida e 3) polir através da cromatografia de troca iônica, a fim de remover a : trombina e outras proteínas contaminantes (por exemplo, endotoxina). (Vide, . por exemplo, Bhikhabhai e outros (2005) J. Chromatogr 1080:83-92; e Dian e outros (2002) J. Chromatogr 769:133-144.). Mais especificamente, na eta- pade captura, o lisado preparado acima (ou seja, o sobrenadante filtrado a partir de células sonicadas, que contém proteínas solúveis totais, incluindo a - fusão GST-hCD83ext em PBS) foi carregado em uma coluna de afinidade cromatográfica GST (GE Healthcare, Baie d'Urfé, Quebec, Canadá). Estima- se que a coluna de afinidade GST seria saturada pelo GST hcD83ext- carregado em aproximadamente 200 U GST/mL de coluna média. Uma vez que o nível de expressão específica de GST-hCD83ext para uma amostra típica de cultura foi de 2,5 U por unidade de GST/OD600, o lisado obtido a partir de 80 células por unidade de OD600 mL de coluna média foi carregado . para a coluna GSTrap.

A concentração da trombina e do tempo ideal de clivagem para a clivagem in situ do GST ligado a hoD83ext foram determinados. Duas colu- nas saturadas de afinidade a GST a 20 mL com GST hcD83ext foram inici- almente injetadas manualmente com trombina (Sigma) na coluna de resina a 80 U de trombina/mL, uma concentração sugerida pelo fabricante, incubadas emtemperatura ambiente por 2 ou 4 horas, e em seguida, o líquido bruto na coluna cromatográfica de afinidade GST contendo hcD83ext e trombina foi expulso utilizando um volume de coluna do tampão de ligação. A porção de GST junto GST-hCD83ext não-digerido foi, então eluída da coluna com o tampão de eluição (Tris a 50 mM, glutationa a 10 MM, pH 8,0). Observou-se que a incubação por duas horas foi o tempo suficiente para a clivagem. U- sando o tempo de incubação de duas horas, a trombina, em várias concen- trações (ou seja, 80, 40, 20, 10 e 5 U de trombina/mL de coluna média) foi injetada em cinco colunas saturadas de afinidade GST para testar a eficiên- cia de clivagem e os resultados são resumidos na figura 3. Mais de 95% de GST-hCD83ext foram clivados quando a concentração de trombina foi supe- rior a 10 U de trombina/mL de coluna média, que foi determinada como a concentração de trombina ideal para a realização de clivagem na coluna.

Com tal concentração de trombina relativamente baixa, o tempo de incuba- º ção foi prolongado para 2,5 horas para garantir a clivagem completa. Embo- . ra o grau de pureza hcD83ext nesta fração foi elevado de acordo com a análise de SDS-PAGE (faixas 2 a 5 na figura 3), as proteinas nesta fração pós-GST estavam instáveis e tenderam a degradar (dados não-mostrados).

A etapa de polimento foi projetada para remover endotoxina, . trombina e outras proteínas contaminantes de hcD83ext. Um sistema cro- matográfico de baixa pressão (BioLogic LP, BioRad, Hercules, CA, EUA), equipado com uma forte coluna de troca aniônica (Q, GE Healthcare) foi uti- lizado para o polimento. O tampão Tris (a 20 mM, pH 7,5) com NaCl a 50 mM e tampão Tris com NaCl a 1 M foram utilizados como tampões de carga e eluição, respectivamente. As frações contendo o hcD83ext puro foram re- ] unidas e concentradas com uma ultrafiltração utilizando uma célula agitada - de alta pressão(Amicon, modelo 8010 com o disco YM10, Millipore Canadá, Cambridge, Ontário, Canadá). O produto final de hoD83ext foi esterilizado por filtração, antes do armazenamento. Utilizando esta fração do produto fi- nal, o coeficiente de extinção de hoD83ext estava determinado a ser de a- proximadamente 1,16 OD280-mlLimg/cm. A proteina pode ser ainda mais concentrada e/ou tampão trocado em um tampão de baixo pH utilizando a filtração de fluxo tangencial (ou técnicas semelhantes). Os resultados con- tendo um cromatograma típica e a análise SDS/PAGE do teor de proteínas de cada fração são resumidos nas figuras 4A e 4B, respectivamente. Como mostrado, um pool através do fluxo contido em baixa endooxina hcD83ext purificada, Exemplo2 Caracterização estrutural de hnCD83ext do tipo selvagem O hcD83ext do tipo selvagem purificado, quando preparado co- mo descrito no Exemplo 1 e formulado tanto na presença quanto na ausên- cia de 50% de glicerol, degradou quando armazenado a 4ºC, talvez devido a uma instabilidade intrínseca desta biomolécula. Dessa maneira, a proteína foi armazenada a -20ºC, o que impediu completamente a degradação. No entanto, a dimerização ainda pode acontecer nesta condição congelada du- | rante o armazenamento a longo prazo.

Os resultados analíticos utilizando : SDS/PAGE reduzidos e não reduzidos de várias amostras de hoD83ext de . diferentes bateladas e, portanto, com diferentes idades, estão resumidos nas figuras 5 e 6. Embora essas amostras mostraram um padrão idêntico, quan- doanalisadas por um SDS-PAGE reduzido (figura 5), elas eram bem diferen- tes em termo da composição de dímero quando analisadas pelo SDS-PAGE * não-reduzido (figura 6). Geralmente, a composição de dímero aumentou monotonicamente com a idade da amostra, indicando a conversão progres- siva do monômero ao dímero sob esta condição de armazenamento.

Note- seque havia pelo menos duas formas diferentes de monômero (faixa 6, figu- ra 6) e três formas diferentes de dímero (faixas 3 e 7, figura 6) provenientes de diversas preparações da amostra. ] Lechmann e outros (Biochem.

Biophys.

Res.

Commun. (2005) * 329:132-139) identificaram a quinta cisteína de hCD83ext como o resíduo de aminoácido chave mediando uma ligação dissulfeto intermoleculares para formar dímeros de hcD83ext.

No entanto, quando armazenados nas condi- ções relativamente oxidativas armazenadas anteriormente, a análise de SDS/PAGE não-reduzida revelou a tendência das preparações de hCD83ext purificado em formar dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros ainda maior (figura7B).A identidade destas bandas de alto peso molecular foi investiga- da por Western blotting com anticorpos anti-CD83. Resumidamente, as pro- teínas separadas pelo SDS-PAGE não-reduzido (figura 7B) foram eletroapa- gadas em uma membrana de PVDF após SDS-PAGE utilizando uma Célula Mini Trans-Blotº (Bio-Rad) de acordo com um protocolo padrão (Towbin e outros(1979) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 76:4350-4354). A transferência ele- troforética foi conduzida em uma voltagem constante de 100 V por 1 h.

A hi- bridização da proteína-anticorpo foi realizada conforme descrito por Sam- brook e outros.

Cloning Molecular: A Laboratiry Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova lorque, EUA, 1989. Um anticorpo monocional anti- CD83 de camundongo (CD83-1G11, laboratórios Cedarlane limitada, Hornby, Ontário, Canadá) foi utilizado como anticorpo primário.

O anticorpo secundário foi IgG de cabra anti-camundongo conjugado com a peroxidase

| de rábano-silvestre (Sigma). Os polipeptídeos hcD83 relacionados (por e- ' xemplo, GST-hcD83ext e hcD83ext) foram detectados por um método colo- . rimétrico utilizando tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) como substrato.

Como mostrado na figura 7C, as bandas correspondentes aos dí- meros, trímeros, tetrâmeros e multímeros ainda maiores eram de fato hCD83ext relatado.

Este dado sugere que um ou mais dos quatro primeiros - resíduos de cisteína de hCD83ext estão envolvidos na formação de ligações dissulfeto intramoleculares e/ou intermoleculares.

As várias formas de mo- nômeros e dímeros nas figuras 6 e 7 podem eventualmente resultar em dife- rentes emparelhamentos entre estes cinco resíduos de cisteína associados às pontes dissulfeto intramoleculares.

Dessa maneira, embora Cys1289 seja o resíduo-chave que conduz a formação da ligação dissulfeto intermolecular : para a dimerização, outros resíduos de cisteina também poderiam estar en- - volvidos na formação extensa de pontes dissulfeto intermoleculares para multimerização.

Exemplo 3 Construção, purificação e caracterização dos novos mutantes de Cisteina a Serina de hcD83ext Há cinco resíduos de cisteínas (ou seja, os resíduos de aminoá- cidos27(8),35 (16), 100 (81), 107 (88), e 129 (110) de SEQ ID Nº: A (SEQ ID Nº: 1), especificados aqui como Cys1, Cys2, Cys3, Cys4 e Cys5, respec- tivamente) em hCcD83ext do tipo selvagem mostrado na SEQ ID Nº: A (a qual corresponde aos resíduos de aminoácidos 20 a 144 do hCD83 mostra- do na SEQ ID Nº: 2). Enquanto Cys 5 foi previamente demonstrado ser im- portante na formação do dímero hcD83ext (Lechmann e outros (2005)), a presença de multímeros maiores, como mostrados na figura 6, sugere que, além de Cys5, outros resíduos de cisteina podem ser responsáveis pela formação das ligações dissulfeto intermoleculares e intramoleculares.

A fim de investigar esta possibilidade, dois plasmídeos, pGEX2ThCD83ext (descri- toacima)e pGEX2ThCD83extmutC129S (descrito no Pedido de Patente US 2007/0167607 e gentilmente cedido pelo Dr.

Alexander Steinkasserer), fo- ram utilizados para a mutagênese de sítio dirigida a fim de estudar a função | dos outros resíduos de cisteina hCD83ext pGEX2ThCD83ext e ' PGEX2ThCD83extmutC129S são idênticos, com exceção do códon para o . resíduo do ácido aminado 129. Em pGEX2ThCD83ext, este códon especifica o resíduo de cisteéina do tipo selvagem, enquanto que em pGEX2ThCD83extimutC129S, este códon foi mutado para codificar um resí- duo de serina,

- Dez novos plasmídeos foram construídos a partir PGEX2ThCD83ext ou prEX2ThCD83extmutC129S utilizando a mutagênese de sítio dirigida a um ou mais dos outros três códons cisteína (ou seja, Cys2

Cys3,e Cys4)paraos códons de serina (Nota: Estas cisteínas para as mu- tações de serina são referidas como mutações "C2S"). As variantes do CD83 mutante C2S foram nomeadas como CD83m-X, Y, Z, em X, Ye Z es- Ú pecificam o número de cisteína (s) com a mutação C2S.

O termo "CD83m-X, . Y, Z" (por exemplo, CD83m-3) é utilizado, intercambiavelmente, com o termo "CD83ext-MX, Y, Z" (por exemplo, CD83ext-m3). Por exemplo, CD83m-3,4 é um mutante CD83 com a mutação C28S em tanto em Cys100 (ou seja, Cys3) quanto em Cys107 (ou seja, Cys4), enquanto o mutante original de hcD83extmutC129S pode ser especificado como CD83m-5. Os plasmídeos na Tabela 3 são nomeados pela adição de "p" em frente as variantes mutan- tes CD83 correspondentes.

As sequências de sCD83 referidas na Tabela 3 por SEQ ID Nº correspondem à sequência da região CD83 extracelular mais o primeiro aminoácido do domínio transmembrana (Ile). Nota-se que estas sequências não incluem a porção de GST e o sítio de clivagem da trombina que são fundidos no terminal N do domínio extracelular, não inclu-

emas sequências do vetor.

Tabela 3 ' Plasmídeos e Oligonucleotídeos Plasmídeo Genotipo Sequência de nucleotídeo Sequência de . da região hnCD83, não aminoácido da incluindo o restante do região hCD83, terminal amino do sítio não incluindo o de clivagem da trombina restante do ter- , minal amino do sítio de clivagem " da trombina PGEX2ThCD83 Pre: GST-CD83, Ap” Resíduos de nucleotídeo SEQ ID Nº:9 ns vu vo nasal o [eDssma — PwosTcDss CasAp sEGIDNHZ — |sEGDNAS | pCD83m-2,3 Pwuc:GST-CD83, C2S, SEQ ID Nº 18 SEQ1D Nº:19 is cs su suo pCDE3m-3,4 Pac: GST-CD83, C3S, SEQ ID Nº:20 SEQ1D Nº:21 Ai esa o EPE . PpCD83m-2,5 Piaci: GST-CD83, C2S, SEQ ID Nº:22 SEQ1D Nº:23

SR ES A A pCD83m-2,5 Prc::GST-CD83, C3S, SEQ ID Nº:24 SEQ1D Nº:25 is es vu vs pCDS83mMm-4,5 Pias: GST-CD83, CAS, SEQ ID Nº:26 SEQ ID Nº:27 A essa o CAE pCDS3m-2,35 Prac:GST-CD83, C2S, SEQ ID Nº28 SEQ DI NO:29 A osscia CSA PCDEIM-3,4,5 Pis GST-CD83, C3S, SEQ ID Nº:30 SEQ DI NO:31 o eae [to STA A | Lo Indador de SEQ IAN] Lo o CTYs2 5 GTGGACTIGCCC |SEQIDN32

AGTACTGCC CCC TEG GAT3' Ccys3 SATCCGAMACACT | SEQIDN%33

ACG AGC TCC AAC TCG GGG 3' CcYsa 5 GGGACATACAGG |SEQIDNº:34

AGT ACT CTG CAG GAC CCG 3' Três iniciadores (ou seja, CYS2 CYS3 e CYS4 na Tabela 1) fo- ram utilizados para a mutagênese de sítio dirigida pelo alvejamento dos có- dons Cys2,Cys3e Cys4. As mutações silenciosas também foram introduzi- das para gerar novos sítios de restrição (ou seja, Scal para Cys2 e Cys4 e |

Sacl para Cys3) para fins de triagem.

A restrição da digestão de vários ' plasmídeos mutados com SCAI e Sacl foi utilizada para rastrear a presença : da combinação desejada de mutações C2S (dados não-mostrados). A região de codificação de cada região variante da proteina de fusão hcD83ext foi confirmada pelo sequenciamento de DNA, e as SEQ ID NOs corresponden- tes à região de codificação (mas não inclinados a etiqueta GST e o sítio de - clivagem da trombina) estão listadas na Tabela 2. Nota-se que um códon de arginina "AGG" (no resíduo de aminoácido número 50 de hCD83ext) em to- dos os plasmídeos derivados (e possivelmente em pGEX2ThCD83ext e pGEX?PThCD83extmutC129S também) é diferente da arginina do códon cor- respondente de "AGA" na sequência cDNA de CD83 depositada no Gen-

Bank, embora essa diferença não afete a sequência da proteina CD83. A produção e a purificação de cada mutante CD83 foram reali- . zadas utilizando os protocolos de fermentação e purificação descritos no E- xemplo1. Tipicamente, os dois maiores picos de eluição de proteínas apare- cem no perfil do cromatograma da etapa de polimento utilizado a cromato- grafia de troca iônica (AEC) e as frações correspondentes ao primeiro pico são reunidas e concentradas para formar o produto final nCD83ext.

No en- tanto, o primeiro pico da etapa de polimento para a purificação de CD83m- 2,5 pareceu ser reduzido significativamente sob condições normais de fun- cionamento e a maioria de CD83m-2,5 foi eluída no segundo pico, quando o gradiente de sal foi aplicado (figura 8). Essa baixa produtividade não melho- rou quando o pH do tampão foi reduzido para 6,5 (dados não-mostrados). No entanto, CD83m-2,5 ainda pode ser purificado pela junção das frações correspondentes ao primeiro pico menor.

A caracterização estrutural mos- trou que, embora o padrão de banda de CD83m-2,5 parece ser semelhante ao hoD83ext de tipo selvagem com a análises SDS-PAGE redutoras e não- redutoras (figuras 9 e 10, respectivamente), a proteína apresentou um perfil muito diferente na análise espectroscópica utilizando dicroísmo circular (CD) (figura 11) e espectrofluometria (figura 12). Resultados semelhantes foram observados quando purificam-se os dois outros mutantes de CD83m-2 (figu- ra 13) e CD83m-2, 3,5 (dados não-mostrados). Desde CD83m-2, CD83m-2,5 e CD83m-2,3,5 dividam a mutação C2S em Cys2, os dados sugerem que : esta mutação pode resultar em uma mudança significativa na estrutura da & proteína ou nas propriedades bioquímicas, a qual melhoram sua ligação às resinas AEC e, posteriormente, afetarão o perfil de eluição durante a etapa ' 5 de polimento.

Com base na previsão da proteína estrutural, uma ligação dis- sulfeto intramolecular poderia se formar entre Cys2 e Cys4. A presença des- - ta ligação dissulfeto intramolecular pode ser importante na estabilização da estrutura da proteína ou, até mesmo, melhorar a bioatividade.

Usando exatamente a mesma da fermentação e os protocolos de processamento a jusante para hCD83ext do tipo selvagem e CD83m-5, CD83m-3 foi produzido e purificado.

Os dois picos de eluição principais das proteínas apareceram na etapa de polimento utilizando AEC (figura 14) e a ' questão da produção acima associada com CD83m-2 não foi observada na - produção de CD83m-3, o que implica que a mutação C2S em Cys3 Cys5 e não resultou em uma grande mudança estrutural.

CD83m-3 purificado foi submetido a caracterização estrutural utilizando SDS-PAGE (figura 15), CD (figuras 16 e 17), e espectrofluometria (figura 18) com resultados semelhan- tes aos hcD83ext de tipo selvagem e CD83m-5. Nota-se que uma duplica- ção clara e reprodutível foi observada no SDS-PAGE não-reduzido (figura 15). Além disso, nota-se que nenhuma dessas duas bandas correspondendo aos 3 CD83m duplos pareceram possuir uma mobilidade idêntica às espé- cies monoméricas de CD83m-5, mas a banda superior CD83m-3 pareceu possuir uma mobilidade idêntica às espécies monoméricas dos hCD83ext do tipo selvagem (figura 19). Para evitar o embaralhamento da ligação dissulfe- to potencial durante a preparação da amostra para SDS-PAGE não- reduzido, o protocolo foi modificado pelo pré-tratamento da amostra com N- etilmaleimida (NEM). Os grupos alquilatos NEM livres de tiol nos resíduos de cisteina não formaram ligações dissulfeto e, dessa maneira, evitam a ligação dissulfeto subsequente pelo resíduo de cisteíina.

Parece que o protocolo mo- dificado utiizando NEM fornece um método mais confiável e consistente pa- ra a quantificação de dímeros de CD83, impedindo qualquer embaralhamen- to da ligação dissulfeto potencial, e o monômero de CD83 é observado como uma única banda, ao invés de dupla (figura 20). ' Anteriormente Zinser e outros. (Immunobiology (2006) 211:449- : 453) relataram que Cys5 é a cisteína principal responsável pela dimerização de CD83 e que hcD83ext-m5 formou monômeros ao invés de dímeros.

No entanto, observou-se uma significativa dimerização de hcD83ext-m5 na aná- lise com cromatografia de exclusão por tamanho (SEC; figura 21) e este re- . sultado foi consistente com o resultado de SDS-PAGE não-reduzido utilizan- do o protocolo modificado com o pré-tratamento de NEM (fígura 20). Surpre- endentemente, a dimerização de hocD83ext-m3 ausente ou mínima baseou- senos resultados de SEC (figura 21) e SDS-PAGE não-reduzido com o pro- tocolo de NEM modificado (figura 20). Estes resultados sugerem que Cys3 ou mesmo outros resíduos de cisteína (ou seja, Cys1, Cys2 e Cys4) também ] poderiam desempenhar papel relevante na dimerização CD83. Nota-se que - a molécula de hcD83ext-m3 parece possuir uma mobilidade idêntica às es- péciesde monômero de hcD83ext do tipo selvagem, mas uma mobilidade um pouco maior do que CD83m-5 (figura 20). Dessa maneira, as formas monoméricas de hcD83ext-m3 e hoD83ext-m5 podem possuir uma estrutu- ra diferente, enquanto que o monômero de hCD83extm3 poderia possuir uma estrutura de proteínas semelhantes ou até mesmo idênticas ao monô- merode hCD83ext do tipo selvagem.

Todas estas variantes de CD83 pare- cem possuir um padrão de banda idêntico na análise com mobilidade SDS- PAGE reduzido (figura 22) e SEC reduzido (figura 23), em que apenas as espécies monoméricas foram observadas.

Em resumo, observou-se que ao utilizar SDS-PAGE reduzido (fi- gura 24), contraria-se a afirmação anterior de que hcCD83ext-m5 está pre- sente apenas como um monômero (Nota para mim mesmo: revisar este pe- dido de patente), outros resíduos de cisteína nas espécies mutantes podem estar envolvidos na multimerização para formar dímeros, trímeros e até mesmo tetrâmeros.

Estas espécies multiméricas mostraram estarem associ- — adasaoCDB83 utilizando Western blotting (figura 25). |

Exemplo 4 ' Comparação de hcD83ext do tipo selvagem, hcD83m3 e hcD83ms e o efei- - to do pH na estabilidade da proteína A capacidade de hcD38ext do tipo selvagem e mutante para i- nibira produção de TNFa pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) estimuladas por LPS/IFN-y foi avaliada em um ensaio in vitro utili- - zando PBMCs de macacos cinomólogos. Especificamente, as PBMCs icono- logies foram isoladas e pré-tratadas por 12 horas com diferentes concentra- ções (0,5, 5, 25 e 100 ug/ml) de hCD83ext do tipo selvagem (formulado em pHA45ou5,5), hocD8dext-m3 ou hoD8sext-m5 (501-1). HCD83ext-m3 e hCcD83ext.m5 foram formulados com pH 5,5 ou 7,6, respectivamente. As cé- lulas foram então ativadas durante 6 horas com LPS (1 ug/ml) mais IFN-y ' (100 U/ml) na presença de Brefeldina A (4 ug/ml) e depois intracelularmente - manchadas por TNFa utilizando um kit Fix/Perm disponível comercialmente. A aquisiçãoe a análise do fluxo de citometria da quantidade de TNFa produ- zido foi avaliada utilizando tanto células dendríticas mieloides quanto monó- citos. Os resultados são expressos na % do mDC ou monócitos produzindo TNFa e na Média de Unidades de Fluorescência (MFU), os quais represen- | tam os níveis de TNFa com base em cada célula. Como mostrado na figura 26,hCD83m-3 é mais ativo que o mutante m5, que é mais ativo do que o hCcD93ext do tipo selvagem na inibição da produção de TNFa pelas PBMCs estimuladas. Além disso, hCD83ext do tipo selvagem mantém maior ativida- de quando formulado em pH 4,5 do que quando formulado em pH 5,5. As formulações de hcD83ext do tipo selvagem tanto em pH4,5 quanto em pH 5,5 são mais ativas do que as formulações em pH 7,6 (dados não- mostrados).

A atividade de hcD83ext-M5 e hcD83ext do tipo selvagem foi comparada em um ensaio de inibição semelhantes a TNFa, como descrito acima, com a exceção de que tanto as proteínas do tipo selvagem quanto as do mutantem3 foram formuladas em pH 7,6. Como mostrado na figura 27, hCD83ext-m5 superou duas preparações de hcD83ext do tipo selvagem na capacidade de inibir a produção de TNFa por pelas PBMCs cinomólogas es-

timuladas por LPS/IFN-y.

. A proteína hoD83ext do tipo selvagem originalmente formulada . em pH 7,6 (dados mostrados nas figuras 26 e 27) teve tampão trocado por um tampão com um pH de 4,5 ou 5,5 e re-testada, como descrito acima, pa- raa capacidade de inibir a produção de TNFa pelas PBMCs cinomólogas ] estimuladas por LPS/IFN-y in vitro. Os dados mostrados na figura 28 de- . monstram que a bioatividade da proteína do tipo selvagem (WT) pode ser reforçada através da formulação do material em um tampão acídico (pH 4,5 ou pH 5,5). Consequentemente, um pH de cerca de 4,5 a 5,5 pode estabili- zarohCD83ext, por minimizar potencialmente o impacto do estresse do am- biente (por exemplo, oxidação, desaminação, temperatura etc.) No entanto, quando hcD83ext-m3 foi formulado em pH 5,5, foi mais ativo do que o tipo ' selvagem formulado tanto no pH 4,5 quanto no pH 5,5 (figura 29). . HCD83ext-m3 é também mais ativo do que hcD83ext-m5, no entanto, o hCD83m-5 em pH 5,5 não foi testado neste ensaio. Curiosamente, quando a capacidade do tipo hocD38ext do tipo selvagem, hoD83ext-m3 e hcDssext- m5 para inibir a rejeição do enxerto foi testada em um modelo in vivo de transplante de coração de camundongo (100 ug por mouse por dia, durante 8 dias), pareceu haver uma pequena diferença em sua habilidade de prolon- gara sobrevida do enxerto. Quando utilizado como monoterapia, cada uma das formas foi capaz de prolongar a sobrevida do enxerto em um tempo de sobrevida média de 8 dias a aproximadamente 14 dias. Quando combinado com imunossupressores comercializados (inclusive Ciclosporina), todas as formas exibiram perfis sinérgicos semelhantes aos perfis de sobrevida a lon- go prazo. Assim, um valor de hCD83ext-m3 e ajuste de pH (para o pH baixo) parece ter melhorado a estabilidade da proteína total A estabilidade/atividade melhorada de hcD83ext-m3 quando comparada a hcD83ext do tipo selvagem foi confirmada em um ensaio se- melhante, utilizando PBMCs humanas. Como mostrado na figura 30, cada uma das quatro diferentes preparações de hoD83ext-m3 (-002-2-3 formula- do em PBS, pH 5,5; -D02-1 formulada em Tris, pH 7,6; -003-2-2 formulado em PBS pH 5,5 e -003-3-2 formulado em PBS, pH 4,5) superou hcD83ext do tipo selvagem (designado como ARG-021 formulado em PBS pH 7,6) na ' sua capacidade de inibir a produção de TNFa pelas PBMCs humanas esti- . muladas por LPS/IFN-y.

Exemplo 5 Glicerolestabiliza as Formulações de hCD83ext Quando hcD83ext é formulado para armazenamento com uma . concentração final de glicerol a 50% (uma menor concentração de glicerol também pode ser utilizada) e posteriormente testada in vivo em uma concen- tração final de glicerol! a 8% em combinação com a ciclosporina no modelo detransplante de coração de camundongo, foi registrada a sobrevida do en- xerto a longo prazo (> 100 dias), enquanto que nos experimentos em que o glicerol foi omitido do estudo de combinação, a sobrevida média foi limitada ] a aproximadamente 14 dias. . Exemplo 6 Degradação da Força de hcD83ext do tipo selvagem Um estudo da degradação da força com o lote 021 da solução estoque de hcD83ext do tipo selvagem (alíquotas congeladas em PBS pH 7,6, - 6 mg CD83/mL) foi realizado da seguinte forma.

Várias alíquotas fo- ram descongeladas e combinadas.

As soluções foram preparadas conforme descritona tabela abaixo:

Tabela 4 ' Condições de Estresse para um Estudo da Degradação da Força Condições Descrição E Je Controle da TA | O estoque foi diluído com água em uma concentração final de CD83 [o [actrume nano a contete amem paatam | ' Acídica O estoque foi diluído com HCL em uma concentração final de CD83 . a - 1 mg/ml e a concentração de HCL a 50 mM, e mantido em condições a por 3 a 24 horas.

Básica O estoque foi diluído com NaOH em uma concentração final de CD83 a 1 mg/ml e a concentração de NaOH a 50 mM, e mantido em condições a por 3 a 24 horas.

Oxidação O estoque foi diluído com peróxido de oxigênio em uma concentração final de CD83 a - 1 mg/ml e a concentração de peróxido a 1,2% ou 0,12%, - e mantido em condições ambientes por 3 horas.

Luz O estoque foi diluído com água em uma concentração final de CD83 * a - 1 mg/ml e exposto a uma fonte de luz D65/ID65 por 1 a 5 dias.

Outra alíquota foi enrolada em realce e posta na câmara de luz para explicar que as condições degrativas na câmara não são um resultado direto de exposição à luz.

Este controle escuro continuou na câmara por 5 dias.

Calor O estoque foi diluído com água em uma concentração final de CD83 [O fe romerame ane mentvã o Na conclusão do tempo de exposição demonstrado, as amostras acídicas e básicas foram neutralizadas.

Todas as amostras foram armaze- nadasa-20ºC até serem analisadas utilizando SEC-HPLC e géis de foco isoelétrico (IEF). Os resultados de SEC-HPLC são fornecidos na Tabela 5. |

Tabela 5 ' SEC-HPLC: Resumo do Estudo da Degradação da Força ; MONÔMERO AGREGADO MENTOS | Controle TA 1 58,82 4,90 36,28 Í Controle TA 2 58,78 5,86 35,36 | Controle TA 3 58,29 6,53 22,31 | 7 Controle TA 4 58,74 6,41 34,85 Controle TA 5 58,33 7,08 34,60 Controle TA 6 57,02 9,54 33,44 | Controle TA 7 53,76 12,46 33,78 Ácido 3 horas 1 65,48 4,06 30,45 | Ácido 3 horas 2 64,21 4,85 30,94 . | Ácido 24 horas 1 77,55 4,06 1840 | Ácido 24 horas 2 77,33 4,03 18,65 7 | Base 3 horas 1 40,77 0,66 58,57 | Base 3 horas 2 41,20 1,00 57,80 | —Base24horas 1 53,54 24,06 23,97 Base 24 horas 2 54,44 23,41 22,15 Aquecimento 3 horas 1 65,96 0,00 32,43 Aquecimento 3 horas 2 66,07 0,00 32,44 | Aquecimento 24 horas 1 31,93 0,00 68,07 | Aquecimento 24 horas 2 35,45 0,00 64,55 | Oxidação 0,12% 1 51,25 11,48 37,26 | Oxidação 0,12% 2 50,51 12,538 36,96 | Oxidação12% 1 37,38 9,62 52,99 Oxidação 1,2% 2 37,46 9,51 53,03 Luz 1 dia 1 45,88 15,70 27,65 Luz 1 dia 2 45,71 15,96 38,33 | Luz 5 dias 1 27,35 35,58 3707 Luz 5 dias 2 27,35 35,45 37,20 | Controle escuro 1 31,38 36,38 32,25 | Controle escuro 2 31,35 35,76 32,89 Os dados gerados utilizando SEC-HPLC e o foco isoelétrico (não-mostrado), indicam que os produtos de degradação de hCD83ext são | mais eletronegativos do que o material de partida. Isso pode ser atribuído ' principalmente às desamidações múltiplas ou a hidrólise e será avaliado em - estudos de pré-formulação em curso. Esses dados também sugerem que o pH acídico está se estabilizando tanto no estado de agregação quanto no estado de carga de hCD83ext. Com relação ao estado de carga, IP será de ] 6,9. Outra banda principal aparece na temperatura ambiente (TA) de contro- . le, com pl de -6,8. Do ponto de vista do tamanho molecular, as condições acídicas (pH 2) favoreceram o monômero (—- 4% de agregação, mesmo que o con- troleTA). Todas às outras condições (base, peróxido, luz, calor, TA) mostra- ram um aumento de agregação. hcD83ext parece ser de luz estável. A de- gradação observada para esta amostra é mais provável devido à exposição : às condições ambientes, ao invés de luz. É claro que tanto o calor (70ºC) e a . condição básica (pH —-12) causaram uma degradação rápida; e, após quatro horas, as bandas principais estão ausentes e uma infinidade de bandas ele- tronegativas são observadas. As condições acídicas (pH -2) pareceu estabi- lizar a proteina tanto para o estado de agregação quanto para o estado de carga de hCD83ext. O perfil IEF parece intacta, nesmo quando comparado ao controle de TA.

Para investigar ainda o papel do pH e a sua influência na estabi- lidade da proteina, hoD83ext do tipo selvagem (lote 021 em PBS, pH 7,6) foi recentemente descongelado e analisado (primeira linha da Tabela 6) ou ar- mazenado em temperatura ambiente em 2 a 8ºC, em pH de 4,5,6,7,8e9. As amostras foram mantidas a -70ºC até serem analisadas, após 1,2,4e 10 dias de armazenamento. Estas amostras foram então analisadas por SEC- HPLC (Tabela 6) ou utilizando Bioanalisador SDS-PAGE (em condições re- duzidas e não reduzidas; figuras 31 a 35).

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Tabela 6 . Resumo do Resultado SEC-HPLC para o Estudo da taxa de degrades do pH ! % DE %SDEAGRE- %DEFRAG- OO er renseoes 965 otórro Caio manos | [| P"“' 54,35 1,98 413687 | o 59,47 2,20 38,33 | 7 Recentemente preparado o 57,18 2,13 40,69 j no dia da análise 0,35 59,60 6,31 34,09 | - 0,35 59,83 6,32 33,85 0,35 59,86 6,76 33,38 | 2-8C 1 52,63 4,32 43,05 | 2-8BC 10 51,46 4,20 44,34 ? TA 1 52,99 0,00 47,01 TA 10 45,99 2,45 51,56 2-8C 1 52,36 4,92 42,72 PA 2-8C 10 51,48 6,97 41,55 ' TA 1 53,58 0,00 46,42 TA 10 41,16 4,61 64,23 * 2-8C 1 48,54 6,39 45,07 | 6 2-8C 10 44,16 9,90 45,94 | TA 1 53,81 0,00 46,19 TA 10 31,17 11,78 57,05 2-8C 1 56,35 6,02 37,63 7 2-8C 10 43,01 12,60 44,39 TA 1 52,11 0,00 47,89 TA 10 28,61 17,27 54,12 2-8C 1 58,75 5,76 35,49 8 2-8C 10 12,26 9,75 77,99 TA 1 53,32 4,66 42,02 TA 10 31,12 22,25 46,63 2-8C 1 59,06 9,03 31,91 a 2-8C 10 46,87 16,05 37,08 TA 1 58,07 4,79 37,14 TA 10 35,57 20,16 44,27 Estes dados sugerem que as condições são mais favoráveis pa- raapoiara estabilidade de sSCD83 quando sCD83 é tamponado em pH baixo (pH 4 a 5), sob essas condições as alterações na agregação e estado de carga parecem ser minimizadas.

Além disso, a exposição à base de peróxi- do, calor, luz ou às condições de temperatura ambiente parecem aumentar a agregação ou a fragmentação e/ou a degradação. |

Todos os experimentos com animais a seguir foram realizados ' de acordo com as orientações do Canadian Council on Animal Care.

Os ex- . perimentos descritos abaixo utilizaram sCD83 recombinante, purificado hu- mano de E. coli, tanto de uma forma do tipo selvagem (hCD83ext-wt; SEQ 1IDN* 5) quanto de uma forma mutante m3 (hCD83ext-m3; SEQ ID Nº: 7), i em os aminoácidos 12, 20, 92 e 114 são cisteina (Cys) e o aminoácido 85 é . serina (Ser). Exemplo 7 HCD83ext-m3 Induz Tolerância de Aloenxerto a Longo Prazo no Modelo de Trasplante de rim em murino O modelo de transplante de rim ortotópico em comando (vide Zhang e outros (2005) Microsurgery 16 (2) :103-109) foi utilizado para avaliar ' a capacidade de hcD83ext-m3 em induzir a tolerância do aloenxerto.

Os . camundongos BALB/c receberam aloenxertos de rim de camundongos C57BL/6 doadores.

Os camundongos receptores foram tanto não-tratados (dois camundongos) quanto tratados com hcD83ext-m3 (3 camundongos; 100 ug/camundongo/dia, i.v.) um dia antes do transplante (dia 1), o dia do transplante (dia 0) e por sete dias dias pós-operatório (POD). Os dois ca- mundongos não tratados sobreviveram por 28 e 35 dias, dando um tempo médio de sobrevida (MST) de 31 + 4,9 dias.

Os três camundongos tratados com hcD83ext-m3 cada sobreviveram por mais de 100 POD.

Consequen- temente, a monoterapia com hCD83ext-m3 conduz à aceitação do aloenxer- to a longo prazo no modelo de transplante de rim ortotópico no camundongo.

Em uma experimento separado, resultados semelhantes foram obtidos por tratamento com hcD83ext-wt.

Exemplo 8 CD83ext-wt ou CD83-m3 sozinho ou em combinação com Ciclosporina À suprime a rejeição do transplante no modelo de Aloenxerto de coração hete- rotópico em murino Modelo animal: modelo de transplante de coração em camun- dongo C57BL/6-to-BALB/c O modelo de Aloenxerto de coração heterotópico em murino foi utilizado para determinar o efeito de hCD83ext-m3 tanto sozinho quanto em , combinação com a ciclosporina A (CsA) para prevenir a rejeição dos trans- . plantes de coração ectópicos. Adultos do sexo masculino C57BL / 6 (H-2b) foram utilizados como doadores e camundongos BALB/c (H-2d) foram utilizados como receptores (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA). O trans- plante de coração heterotópico intra-abdomina foi realizado como descrito . anteriormente (Corry e outros (1973) Transplantantion 16 (4) :343-350 e Wang e outros (2007). J Immunol 179 (7) :4451-4463). Neste estudo, a ci- rurgia de transplante envolveu o transplante de corações plenamente incom- patíveis MHC dos doadores C57BL/6 aos receptores BALB/c, de tal forma que o coração autólogo, bem como o coração alogênico, esteve presente no receptor.

' Os receptores de transplantes de coração foram tratados como . segue: Grupo 1 (cinco receptores) não recebeu nenhum tratamento. Grupo 2 (3 receptores) recebeu monoterapia hCD83ext-m3 por iv. a 100 ug/camundongo/dia, a -1 a +7 POD. Grupo 3 (4 receptores) receberam mo- noterapia hCD83ext-m3 por i.v. de 100 ug/camundongo/dia, de -1 a +7 POD mais CsA a 15 mg/kg/dia, diariamente até o final do experimento, s.c. As ba- tidas dos corações dos aloenxertos foram monitoradas e avaliadas diaria- mente por palpação abdominal direta de forma dupla-cega para detectar o estado de rejeição/aceitação do coração. A sobrevida do transplante de co- ração foi medida em número de dias pós-operatório (POD) no qual o cora- ção alogênico continuou a bater. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7 POD: Em um experimento separado, a habilidade de hCD83ext-wt so- zinho, Csa sozinho ou hcD83ext-wt mais CsA em suprimir a rejeição ao transplante de coração foi avaliada como descrito acima. Os receptores de transplantes de coração foram tratados como segue: Grupo 4 (4 receptores)

receberam monoterapia de hcCD83ext-wt (SEQ ID Nº5) por i.v. a 100 . ug/camundongo/dia, a partir do dia anterior ao transplante até a rejeição ao . enxerto. Grupo 5 (6 receptores) recebeu monoterapia CsA (15 mg/camundongo/dia, s.c.). Grupo 6 (4 receptores) receberam hCD83ext-wt poriv.a100 ugicamundongo/dia mais CsA a 15 mg/kg/dia, s.c., diariamen- ' te, do primeiro dia antes do transplante até os setes dias pós-transplante. Os - resultados são mostrados na Tabela 8. Tabela 8 ração (POD! dias hcD83ext-wt | : + animal morto por batidas fortes do coração enxertado (não a- credita-se ser relacionado com o tratamento) Os experimentos acima mostram que hcD83ext-m3 e monote- rapia de hcD83ext-wt prolongam a sobrevida do aloenxerto em aproxima- damente 2 vezes em comparação aos controles não-tratados. Além disso, hCD83ext-m3 e CD83ext-wt sinergizam com CsA permitindo à sobrevida do aloenxerto a longo prazo em contrapartida à monoterapia de CsA.

Em outros experimentos, o tratamento dos receptores de trans- plante de coração de camundongo com CsA até POD 50 mais hcD83ext-m3 (100 ug, IV, i.v. -1 a 7+) leva a concluir a tolerância do aloenxerto, como de- —monstrado pela falta de rejeição após o encerramento da terapia de CsA diá- ria no dia 50 (dados não-mostrados). Em contraste, a monoterapia de CSA ou a monoterapia de hcD83ext-m3 conduz à rejeição após cerca de 13 a 17 dias, indicando que hocD83ext-m3 sinergiza com CsA (vide Tabelas 7 e 8). Surpreendentemente, a terapia de combinação não conduz à tolerância ao aloenxerto permanente quando o CSA é retirada no dia 28, indicando que um tempo de sobrevida inesperadamente longo livre de rejeição é necessá-

rio para alcançar a tolerância completa independentemente do fármaco (da- . dos não-mostrados). Poucas dosagens de hcD83ext-m3 (ou seja, 3 dosa- - gens nos dias -1 a +1) levam a uma sinergia completa com CsA, mas de- monstrou-se uma tolerância operacional incompleta pela rejeição rápida quando CsA é retirado no dia 50 (dados não mostrados). Portanto, é de- ] monstrado um efeito da resposta da dosagem para a indução de tolerância - ao aloenxerto, Exemplo 9 HCD83ext-m3 evita rejeição crônica aos aloenxertos do rim de rato Em seres humanos, a rejeição crônica ocorre meses ou anos após o transplante, e é a causa mais comum da perda do enxerto. A rejeição crônica resulta na lenta deterioração da função do enxerto, caracterizada pa- ' tologicamente no rim por atrofia tubular, fibrose intersticial e espessamento - fibroso intimal das artérias. Um modelo de transplante de rim de rato bem-estabelecido (es- sencialmente como descrito em Bédard e outros (2006) Transplantantion 81 (6) :908-14) e na Patente US 7.514.405, o conteúdo ao qual está incorpora- do por referência aqui) foi utilizado para avaliar se hoD83ext-m3 em combi- nação com CsA pode suprimir a rejeição crônica. Neste modelo, os recepto- res de transplante de rim são tratados com uma dosagem a curto prazo (11 dias) de ciclosporina (CsA) para prevenir a rejeição aguda inicial, Tais recep- tores de transplante demonstram, confiavelmente, as alterações patológicas características da rejeição crônica ao enxerto no dia pós-operatório (DPO)

140. Os ratos F344 serviram como doadores de rim aos ratos Lewis. Três receptores de transplante de controle foram tratados, sozinhos, com doses subterapêuticas de CsA (0,75 mg/kg/dia; POD 0 a 10). Um segundo grupo de três receptores de transplante foi tratado com tanto CsA (0,75 mg/kg/dia; POD 0 a 10) quatro com hcD83ext-m3 (100 mg/dia, i.v., POD 1 a 7). Os receptores transplantados foram sacrificados no POD 140 e os rins transplantados foram avaliados para a indicação de rejeição crônica através de histologia e imuno-histoquímica. A histologia do rim foi marcada por um | patologista independente avaliando a atrofia tubular, atrofia glomerular, fi- . brose intersticial, espessamento intimal, infiltrados de células e cicatrização . cortical em uma escala de O a 4, em que O =normal, 1 = variação mínima, 2 = mudança leve, 3 = mudança moderada e 4 = alteração acentuada.

Como mostrado na figura 36, o tratamento com CsA mais hcD83ext-m3 melho- rou,de forma significativa, (p <0,05) a pontuação em cada categoria, em re- - lação ao tratamento com CsA sozinha.

Os dados da figura 37 demonstram que hcD83ext-m3, de forma significativa (p <0,05), melhora a classificação imuno-histoquímica em aloenxertos de rins no que diz respeito a deposição dos depósitos do anticorpo de IgG e IgM nos glomérulos (G) e capilares peri- tubulares (PTC) e reduz a infiltração celular por CD2, CDA4 e células ED-1. Em resumo, hcD83ext-m3 em combinação com CsA previne a rejeição crô- ' nica do aloenxerto em um modelo de transplante de rim do rato.

A preven- ” ção da rejeição crônica pelo hcD83ext-m3 mais o tratamento com CsA está associada com a regulação baixa de deposição de anticorpos intraenxerto e a prevenção da fibrose de atrofia/intersticial tubular, que são as característi- cas histológicas da rejeição crônica em receptores de transplante de rim.

Es- tes dados destacam a multifuncionalidade de hoD83ext-m3. Além de sua capacidade de bloquear a rejeição celular aguda, como demonstrado nos estudos acima de transplante de coração e de rim do camundongo, este modelo mostra sua capacidade de suprimir a inflamação crônica e a respos- ta imune humoral (ou seja, a patologia da rejeição crônica é independente da rejeição celular aguda). Exemplo 10 Tratamento com hcD83ext-m3 mais Ciclosporina A prolonga a sobrevivência do enxerto de rim em primatas não-Humanos Um dos rins de cada receptor do macaco cinomólogo foi substi- tuído por um rim que foi removido do outro macaco cinomólogo.

Além disso, o rim não-transplantado do receptor é removido cirurgicamente de forma que orimtransplantado é de sustentação da vida.

Três pacientes transplantados foram tratados com hcD83ext-m3 (3 mg/kg) i.v. de -1 a +7 POD (9 dosa- gens), juntamente com CsA subterapêutica diariamente (10 mg/kg i.m.), até | o dia 50. Três receptores de transplante no grupo de controle receberam . monoterapia de CsA (10 mg/kg, i.m.). Todos os animais foram monitorados - pelas rejeições do aloenxerto através de métodos, incluíndo a avaliação da produção de urina, os níveis de creatinina sérica e o consumo de alimentos eágua Um animal de cada grupo foi sacrificado prematuramente (não ba- i seado em rejeição aguda), deixando-se dois animais de cada grupo para a - análise final do estudo. Os resultados são mostrados na Tabela 9. Tabela 9 e EEE da do enxerto de sobrevida

EEE E Ei BM | to mangim. - la Jodoses liomgmaim | so | Nenhum dos animais do grupo controle (que receberam a mono- terapia de CsA) sobreviveram até a data da rescisão de CsA (dia 50), en- quanto ambos hcCD83ext-m3 mais os animais tratados com CsA não apre- sentaram sintomas clínicos de rejeição no dia 50 (ou seja., Apetite normal, creatinina e a produção de urina). No entanto, após a rescisão de CsA am- bos os animais tratados por hCD83ext-m3 rejeitaram rapidamente, indicando aindução de tolerância insuficiente para controlar a rejeição aguda. Nos próximos experimentos, os receptores de transplante de rim receberão hcD83ext-m3 (10 gm/kg/2 vezes ao dia iv. -1 a +13 POD) mais CsA (10 mao/kg, i.m.) diariamente por 90 dias, seguido por uma redução de 50% de CsA a cada duas semanas, a fim de (1) demonstrar uma sinergia clinicamente relevante com a CsA e (2) avaliar o nível de tolerância opera- cional induzido. |

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo sCD83 isolado, caracterizado pelo fato de que . compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de aminoácido possuindo, pelo menos, uma identidade de 70% à SEQ ID Nº 7; emque um ou mais resíduos de aminoácidos 12, 20, 85 e 92 de SEQ ID Nº: 7 estão ausentes ou são um aminoácido diferente de cisteina e, op- cionalmente, um ou mais resíduos de aminoácido 1, 2, 3, 4 e 130 estão au- sentes.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido 85 é um resíduo de aminoácido diferente de cisteína.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 12, 20, 92 e 114 são cisteína.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado —pelofatode que o resíduo de aminoácido 85 é serina.

5. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a identidade da sequência é de, pelo menos, 95%.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado — 20 pelofatodequeaidentidadedasequênciaéde 100% f

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência selecionada do grupo consis- tindo na SEQ ID Nº: 7; os resíduos de aminoácido 1 a 129 de SEQ ID Nº: 7, os resíduos de aminoácido 5 a 129 de SEQ ID Nº: 7 e os resíduos amino resíduos de aminoácido 5 a 130 de SEQ ID Nº: 7.

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 12, 20, 92 e 114 são cisteína.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o resíduo de amjnoácido 85 é serina.

10. Polipeptídeo sCD83 isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistin- do nas SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 15, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 19, SEQ

ID Nº: 21, SEQ ID Nº: 23, SEQ ID Nº: 25, SEQ ID Nº: 27, SEQ ID Nº: 28 e SEQ ID Nº: 31, em que, opcionalmente, o resíduo de aminoácido 126 está . ausente.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10.

12. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o po- lipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

13. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma resposta imune indesejada em um indivíduo mamífero.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fa- to de que a resposta imune indesejada é selecionada do grupo consistindo em doenças autoimunes, rejeição aos transplantes e alergia.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fa- to de que a doença autoimune é selecionado do grupo consistindo em lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo |, Pênfigo, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, miastenia grave, automiocardite, esclerose múltipla, artrite reumatoide, psoríase, uveoretinite autoimune, vasculite, uma doença infla- matória crônica do intestino, doença de Crohn ou colite ulcerativa, Morbus Bechterew, espondilite anquilosante e doença pulmonar obstrutiva crônica (CPOD).

16. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, e um ou mais agentes imunossupressores, carac- terizado pelo fato ser para a fabricação de um medicamento para melhorar o resultado do transplante em um receptor de transplante de mamíferos, em que o agente imunossupressor atua de forma sinérgica com o dito polipepti- deo para melhorar o resultado do transplante.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito agente imunossupressor é Ciclosporina A.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os ditos agentes imunossupressores são rapamícina mais anti- corpo anti-CD45RB monoclonal ou tacrolimus (FK506) mais micofenolato . mofetila (MMF).

19. Polipeptídeo sCD83 isolado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo é purificado de E. coli.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo é purificado de E. coli.