BRPI0915606A2 - Alfa-amilases variantes de bacillus subtilis e métodos de uso das mesmas - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA REDUÇÃO DO ENDURECIMENTO DE PÃO E MÉTODO PARA LIQUEFAÇÃO E SACARIFICAÇÃO DE AMIDO. A invenção refere-se a alfa-amilases de Bacillus subtilis (AmyE), suas variantes, ácidos nucleicos codificando as mesmas e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos. Métodos de uso de AmyE ou variantes das mesmas são descritos, incluindo liquefação e/ou sacarificação de amido. Tais métodos podem dar açúcares úteis para produção de etanol ou produção de xarope de milho com alto teor de frutose. Em alguns casos, as amilases podem ser usadas em pH baixo, na ausência de cálcio e/ou na ausência de glicoamilase.

Description

% Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA REDUÇÃO DO ENDURECIMENTO DE PÃO E MÉTODO PARA LI- QUEFAÇÃO E SACARIFICAÇÃO DE AMIDO".

PRIORIDADE O presente pedido reivindica prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios U.S. 61/059.513 e 61/059.618, que foram depositados em 6 de junho de 2008 e que são aqui incorporados a título de referência em sua to- talidade.

CAMPO DA INVENÇÃO Alfa-amilases de Bacillus subtilis (AMyE), suas variantes, ácidos nucleicos codificando as mesmas e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos são providos. Métodos de uso de AmyE ou variantes das mesmas são descritos, incluindo liquefação e/ou sacarificação de amido. Tais métodos podem render açúcares úteis para produção de etanol ou pro- , 15 dução de xarope de milho com alto teor de frutose. Em alguns casos, as v amilases podem ser usadas em pH baixo, na ausência de cálcio e/ou na au- r sência de glicoamilase.

ANTECEDENTES Amidos de grão, cereal e vegetal, por exemplo, amido de milho, são amplamente usados na fabricação industrial de produtos tais como xa- ropes e biocombustíveis. Por exemplo, xarope de milho com alto teor de fru- tose (HFCS) (High Fructose Com Syrup) é uma forma processada de xarope de milho tendo teor de frutose alto e uma doçura comparável ao açúcar, tor- nando o HFCS útil como um substituto para o açúcar em refrigerantes e ou- tros alimentos processados. A produção de HFCS atualmente representa uma indústria de um bilhão de dólares. A produção de etanol como um bio- combustível é também uma indústria em crescimento. Xaropes e biocombustíveis podem ser produzidos a partir de mi- lho através de um processo enzimático que catalisa a quebra de amido em glicose Este processo enzimático tipicamente envolve uma sequência de reações catalisadas por enzima: (1) Liquefação: Alfa (a)-amilases (EC 3.2.1.1) primeiro catali-

. 2/586 sam a degradação de uma suspensão de amido, que pode conter 30-40% p/p de sólidos secos (ds) (dry solids), em maltodextranos. a-amilases são endoidrolases que catalisam a clivagem aleatória de ligações a-1,4-D- glicosídicas internas.

Devido ao fato da liquefação ser realizada tipicamente em temperaturas altas, por exemplo, 90-100º C, a-amilases termoestáveis, tal como uma a-amilase de Bacillus sp., são preferidas para esta etapa. a- Amilases atualmente usadas para esta etapa, por exemplo, a-amilases de B. licheniformis, B.amyloliquefaciens e B. stearothermophilus (AmyS), não pro- duzem quantidades significantes de glicose.

Pelo contrário, o liquefato resul- tante tem um equivalente de dextrose baixo (DE) (Dextrose Equivalenf) e contém maltose e açúcares com altos graus de polimerização (DPn) (Degre- es of Polymerization). (2) Sacarificação: Glicoamilases e/ou a-amilases maltogênicas catalisam a hidrólise de extremidades de não redução dos maltodextranos + 15 formados após liquefação, liberando D-glicose, maltose e isomaltose.

A sa- v carificação produz xaropes ou ricos em glicose ou de alto teor de maltose. : No primeiro caso, glicoamilases tipicamente catalisam sacarificação sob condições ácidas em temperaturas elevadas, por exemplo, 60º C, pH 4,3. As glicoamilases usadas neste processo tipicamente são obtidas de fungos, por exemplo, glicoamilase de Aspergillus niger usada em OPTIDEXº L400 ou glicoamilase de Humicola grisea.

Enzimas de desramificação,tais como pulu- lanases, podem auxiliar na sacarificação. a-Amilases maltogênicas podem alternativamente catalisar saca- rificação para formar xaropes com alto teor de maltose. a-Amilases maltogê- nicas tipicamente têm um pH ótimo maior e uma temperatura ótima menor do que glicoamilase, e amilases maltogênicas tipicamente requerem Ca**. a- Amilases maltogênicas atualmente usadas para esta aplicação incluem a- amilases de B. subtilis, amilases de planta e a a-amilase de Aspergillus ory- zae, o ingrediente ativo de CLARASES L.

Reações de sacarificação exem- plaresusadas para produzir vários produtos são mostradas abaixo:

. 3/586 Amido liquefeito | D-glicose 0,3 % Maltose 2,0 % Outros oligossacarídeos 97,7 % Sacarificação | -pH 4,5 “pH 5,5 Glicoamíilase e/ou cramilase malttogênica pululanase 50 ppm Ca?” -60ºC, 72 h -55ºC, 48 h Xarope de glicose Xarope de Maltose D-glicose >95 % D-glicose 4% maltose 1,5% maltose 56% isomaltose 0,5% maltotriose 28% outros oligossacarídeos 1,0% outros oligossacarídeos 12% (3) Processamento adicional: Um ponto de ramificação no pro- cesso acontece após a produção de um xarope rico em glicose, mostrado no . lado esquerdo dos cursos de reação acima.

Se o produto desejado final for um biocombustível, levedura pode fermentar o xarope rico em glicose em Ô 5 etanol.

Por outro lado, se o produto final desejado for um xarope rico em gli- cose, glicose isomerase pode catalisar a conversão do xarope rico em glico- se em frutose.

A sacarificação é a etapa de limitação de taxa na produção de um xarope rico em glicose.

A sacarificação tipicamente acontece durante 48- 72 horas, momento quando muitas glicoamilase fúngicas perdem atividade significante.

Ainda, embora a-amilases maltogênicas e glicoamilase possam ambas catalisar sacarificação, as enzimas tipicamente operam em pH e temperaturas ótimos diferentes, conforme acima mostrado.

Se ambas as enzimas forem usadas sequencialmente, a diferença em condições de rea- çãoentre as duas enzimas necessita de ajuste do pH e da temperatura, o que deixa lento o processo geral e pode dar origem à formação de agrega- dos de amilose insolúveis.

Desta maneira, há a necessidade na técnica de um processo aperfeiçoado de fabricação de produtos industriais a partir de amido.

Em particular, há a necessidade de eficiências aprimoradas em uma etapa de

. 4/586 sacarificação.

SUMÁRIO São descritos composições e métodos com relação a uma a- amilase de Bacillus subtilis (AmMyE) e polipeptídeos relacionados. A a- amilase AmyE é única pelo fato de que ela exibe atividade específica alta abaixo de pH 5,0 e mesmo em pH de cerca de 4-4,5. Ainda, Ca?* não afeta a estabilidade térmica de AmyE, evitando a necessidade de adi8cionar Ca?”* exógeno para reações de liquefação ou sacarificação de amido. Essas ca- racterísticas de polipeptídeos de AmyE permitem que liquefação e sacarifi- cação sejam realizadas na mesma mistura de reação (e opcionalmente no mesmo recipiente de reação) sem a necessidade de ajustar o pH da mistura de reação entre liquefação e sacarificação. Em particular, as condições de reação não devem ter que ser ajustadas quando usando AmyE e uma glico- amilase, evitando uma etapa e atrasos de tempo entre liquefação e sacarifi- - 15 cação, junto com a formação potencial de agregados de amilose insolúveis. AmyE pode, então, ser usada sequencialmente ou simultaneamente com E uma glicoamilase para liquefazer e/ou sacarificar amido, e em um pH e con- centração de Ca?** que são ótimos para a glicoamilase. AmyE também exibe atividade de glicoamilase, reduzindo ou eliminando a necessidade de um polipeptídeo adicional com atividade de glicoamilase para realizar sacarifica- ção.

Em um aspecto, um método para liquefação e sacarificação de amido em um processo de conversão de amido é provido, compreendendo contato de um substrato de amido com um polipeptídeo de AmyE para for- maruma mistura de reação para liquefazer e sacarificar o substrato de ami- do na mistura de reação para produzir glicose, onde a liquefação e a sacari- ficação são realizadas na mesma mistura de reação sem um ajuste de pH.

Em algumas modalidades, a sacarificação é realizada na ausên- cia de um polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase. Em algu- mas modalidades, a liquefação é realizada em um pH adequado para a ati- vidade de um polipeptídeo de glicoamilase. Em algumas modalidades, o pH é 5,0 ou menor. Em algumas modalidades, o pl é 4,5 ou menor. Em moda-

. 5/586 lidades particulares, o pH é 4,0 ou menor. Em algumas modalidades, cálcio exógeno não é adicionado à mistura de reação. Em algumas modalidades, a concentração de cálcio na mistura de reação é menor do que cerca de 8 ppm.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo adicional tendo ativi- dade de glicoamilase é adicionado à mistura de reação antes de contato do substrato de amido com o polipeptídeo de AmyE. Em algumas modalidades, o polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase é adicionado à mis- tura de reação após contato do substrato de amido com o polipeptídeo de AmyE. Em algumas modalidades, o polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase é adicionado à mistura de reação simultaneamente ao contato do substrato de amido com o polipeptídeo de AmyE.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda fermen- tação de glicose produzida através da liquefação e da sacarificação para . 15 produzir um biocombustível, tal como um álcool. Em algumas modalidades, o álcool é etanol. Em algumas modalidades, o álcool é butanol. Em algumas à modalidades, pelo menos uma porção da sacarificação e da fermentação acontece na mesma mistura de reação simultaneamente, como no caso de SSF.

Em algumas modalidades, um processo de fermentação em ba- telada é usado como um sistema fechado, onde a composição da mistura de reação (incluindo o pH) é selecionada no início da fermentação e não é alte- rada durante a fermentação. Em outra modalidade, um sistema de "fermen- tação de alimentação em batelada" é usado, onde o substrato de amido é adicionado em aumentos conforme a fermentação progride. Em ainda outra modalidade, um sistema de fermentação contínuo é usado, onde um meio de formação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de mistura de reação condicionada é removida para pro- cessamento.

Em algumas modalidades, a solução de amido sacarificada é convertida em xarope à base de frutose-amido (HFSS), tal como HFCS. À conversão em HFSS pode ser catalisada em um pH de cerca de 6,0 a cerca

. 6/586 de 8,0, por exemplo, pH 7,5 e o produto pode conter cerca de 40-45% de frutose. Em algumas modalidades, o método compreende ainda contato da glicose produzida através de liquefação e sacarificação com uma glicose isomerase para produzir frutose (por exemplo, na forma de HFCS). Em al- gumas modalidades, cálcio exógeno não é adicionado à mistura de reação. Em algumas modalidades, a concentração de cálcio na mistura de reação é menos do que cerca de 8 ppm. Em algumas modalidades, o método inclui ainda contato da glicose produzida através de liquefação e sacarificação com uma glicose isomerase para produzir frutose sem redução da quantida- dedecálciona mistura de reação.

Em algumas modalidades, polipeptídeos de AmyE são adiciona- dos à mistura de reação em uma quantidade de cerca de 0,03-1 kg por ton métrica de sólidos secos (ds) (dry solids). Em algumas modalidades, a mis- tura de reação é uma pasta fluida de amido tendo cerca de 20-35% ds (p/p).

. 15 A reação de sacarificação pode ser realizada em uma temperatura de cerca de 60º C a cerca de 90º C, por exemplo, 70º C a 85º C ou até mesmo 10, 12, á 14, 16, 18 ou até mesmo 20º C abaixo da temperatura de gelação do amido (isto é, cerca de 75º C) e um pH de cerca de 4,0 a cerca de 6,0, por exem- plo, cerca de 4,2 a cerca de 4,8. Em algumas modalidades, o produto da reação de sacarificação é um xarope rico em glicose. A concentração de glicose pode atingir pelo menos cerca de 95% p/p ds.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de AmyE são qual- quer polipeptídeo de AmyE de ocorrência natural, por exemplo, os polipepti- deos de AmyE tendo uma sequência de aminoácido de SE QID NO: 1 ou SEQIDNO:3 ou uma sequência de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 3, por exemplo, con- forme medido com o algoritmo de alinhamento de sequência BLAST. Em modalidades particulares, o polipeptideo de AmMyE usado no método tem pelomenos 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequên- cia de aminoácido da SEQ ID NO:1. Em modalidades particulares, o polipep- tídeo de AmyE usado no método tem pelo menos 90% de identidade de se-

. 7/586 quência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:1.

Em algumas modalidades, o polipeptideo de AmyE usado no método inclui uma deleção do domínio de ligação a amido C-terminal. Em modalidades particulares, os polipeptídeos de AmyE tendo a deleção C- terminaltêm a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou uma sequên- cia de aminoácido com pelo menos cerca de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares, o polipeptídeo de AmyE é truncado do resíduo D425 (com referência à SEQ ID NO: 1).

Em outro aspecto, variantes de AmyE tendo propriedades vanta- josas são providas. As variantes de AmyE podem ter uma propriedade ou propriedades alteradas, comparado com um polipeptídeo de AmyE do tipo selvagem, por exemplo, uma propriedade alterada com relação à atividade específica com relação a substratos de amido, maltoeptaose e/ou maltotrio- . 15 se, especificidade de substrato, termoestabilidade, temperatura ótima, pH ótimo, faixa de pH e/ou temperatura, estabilidade oxidativa, habilidade em ' reduzir a viscosidade de uma composição de amido ou similar. Em alguns casos, a propriedade alterada da variante de AmyE refere-se à atividade es- pecífica sobre um substrato de farinha de milho, maltotriose, maltoeptaose particular em pH particular (por exemplo, 4 ou 5,8), estabilidade ao calor em uma temperatura particular (por exemplo, 60º C) ou desempenho de limpeza em um pH particular (por exemplo, pH 8 ou 10). A propriedade alterada pode ser caracterizada por um Índice de Desempenho (PI) (Performance Index), onde o PI é uma razão de desempenho da variante de AmyE comparado com uma AmyE do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o PI é maior do que cerca de 0,5, enquanto em outras modalidades, o pl é cerca de 1 ou é maior do que 1.

Em um aspecto, o polipeptídeo variante tem uma atividade de a- amilase e pelo menos uma característica alterada que aprimora o desempe- —nhodaenzima,o polipeptídeo variante compreendendo: uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60% de identi- dade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo de a-amilase paren-

. 8/586 tal selecionado de AmyE (SEQ ID NO: 1) ou uma variante truncada de AMyE (SEQ ID NO: 2) e uma modificação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20,21,22,23,24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,115,116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, - 15 191,192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, ' 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267,268,270,271,272,273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344,345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419,420,421,422,423,424 e 425; onde a modificação produz um polipeptídeo variante tendo um Índice de desempenho (PI) maior do que 1,0 para pelo menos uma caracte-

. 9/586 rística que aprimora o desempenho da enzima.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante compreende uma modificação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consis- tindo em 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131,132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, - 15 235,236,237,238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, , 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316,317,318,319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395,396,397,398,399,400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422,423,424 e 425, onde a modificação produz um polipeptídeo variante tendo um índice de desempenho (PI) maior do que 0,5 para expressão de proteína e um bPl maiordo que 1,1 para pelo menos uma característica que aprimora o desempenho da enzima.

Em algumas modalidades, a uma ou mais posições são selecio-

' 10/586 nadas do grupo consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,76, 77,78,79,80,81,82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, DO, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165,166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, . 15 241,242,243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, L 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318,319,320,321,322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393,394,395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 e 425, posições que são não totalmente restritivas para desempe- nho no polipeptídeo parental nem de comprimento integral nem no truncado.

Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de um oumaisresíduos de aminoácido presentes no polipeptídeo parental por resíduos de aminoácido diferentes, em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, IR,

. 11/586 18, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 20, 2R, 28, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4M, AN, 40, 48, 4T, AV, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, SN, 5R, 5V, SW, 5Y, 6C, 6D, 6E,6H,6K,6L, SM, 6N, 6P, 6Q, SR, 6S, 671, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 76, 7H, 71, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 78, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, BE, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 97, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, 10M, 10N, 10P, 100, 108, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 1198, 19V, 11W, 11X, 121, 12M, 12V, 13A,13C,13D,13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 148, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16L, 16M, 16Q, 168, 16T, 16V, 17A, 17F, 171, 17M, 170, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 198, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, . 15 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 208, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 211, 21K, 21L, 21M, 21N, 210, 21R, 218, 21V, 221, 22M, 220, f 228, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 238, 231, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 240, 24R, 248, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 258, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 261, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 271, 27L, 27M, 27N, 27P, 270, 27R, 278, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 288, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 297, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 3OM, 3ON, 30P, 30Q, 30R,30S, 30T, 30V, 3OW, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 310, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 328, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33], 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 338, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 358, 35V, 35W,35Y,36C,36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 391I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D,

- 12/586 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 418, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 438, 437, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 448, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 451, 45L, 45M, 450, 45P,450Q,458S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 468, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 476, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 478, 4771, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 481, 48K, 48L, 48N, 48P, 488, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49l, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 498, 49T, 49V, 49W, 49Y, —50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 508, 50T, 50V, SOW, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51M, S51N, 51P, 51Q, 51R, 518, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 528, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 531, 53V, 53W, - 15 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 540, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 551, 55N, 55P, f 550Q, 558, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 561, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 570, 57R, 578, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C,59D,59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 601, 60K, 60L, 6O0M, 6O0N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 618, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 628, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 641, 64M, 64N, 648, 6A4V, 64Y,65A,65C,65E, 65H, 651, 65K, 65L, SSM, 65Q, 65R, 658, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 678, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, —7ON,70S,71S, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 720, 728, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P, 738, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 748, 74T, 74Y, 75A, 75C,

. 13/586 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76S, 76V, 76Y, 77A, T7C, 77D, 77G, 77H, 771, 77K, 77L, T7R, 778, 777, 7TTV, TAW, 77X, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 781, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 790, 79S,79T,80A, 80L, 80M, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 818, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 821, 82M, 82Q, 82R, 828, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 831, 83L., 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 841, 84K, 84M, 84N, 84Q, 848, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 851, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 881, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 901, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 90S, - 15 90T, 90V, 90W, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 918, 91T, 91W, 91Y, 921, 92N, 927, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, ' 93F, 93G, 931, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 938, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V, —99A,99C,99E, 99F, 99G, 991, 991, 99M, 99N, 99P, 998, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A, 102A, 102G, 1020, 1028, 102W, 102Y, 103A, 103C, 1031I, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 1048, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 1061, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 1078, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109l, 109K, 109L, —109M, 109N, 109P, 109R, 1098, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 1111, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 1110, 111R, 111T, 119V, 111W, 111Y, 1124, 112C, 112D,

py 14/586 112E, 112F, 112G, 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, 1120, 112R, 1128, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 1131, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 1138, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151, 115L, 115M, 115N, 115Q,115R, 1158, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 11671, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 1170, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E, 118F, 118G, 118H, 1181, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 1191, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 119S, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 1218, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124l, 124K, 124M, 124Q, 124R, 1248, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 1251, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 1250, 125R, 1258, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, - 15 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 1268, 1267, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, í 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 1288, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 129], 129K, 129L, 129M, 129R, 1298, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130I, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 131), 131K, 131L, 131M, 131N, 1310, 131R, 1317, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 1321, 132L, 132M, 132N, 1320, 1328, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 1341, 134L, 134M, 134N, 134R, 1348, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N, 1350, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 1410, 1418, 141T, 149V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K, 142M, 142Q, 142R, 1428, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 1430, 143R, 1438, 143W, 144G, 1448, 1447, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 1471, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R,

- 15/586 148Y, 1498, 150A, 150H, 150N, 1508, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F, 151G, 151H, 1511, 151K, 151L, 151M, 1510, 151R, 1518S, 151T, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521], 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 1520, 152R, 1528, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 1531, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 1538, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 1541, 154N, 154P, 154Q, 1548, 154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 1551, 155L, 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 1561, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 1561, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C,157F, 157H, 1571, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 1581, 158M, 158Q, 1588, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L, 159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160I, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, . 15 161N, 1618, 162A, 162C, 162E, 162F, 1621], 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 1638, 1637, ' 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164l, 164L, 164M, 164N, 164Q, 1648, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 1658, 1651, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 1667, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 1678, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 1716, 171H, 171, 171L, 171M, 171N, 171Q, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 1740, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 1776, 177M, 177Q, 1778, 178C, 178G, 178M, 1788, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179I, 179L, 179M, 179P, 1798, 179T, 179V, —179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 1841, 184K, 1841, 184M, 184N, 184Q, 184R, 1848, 184T, 184V, 184W,

- 16/586 184Y, 185C, 185E, 185N, 1858, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 1878, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 1928, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941, 195A, 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 1951, 195K, 195L, 195M, 195N, 1950, 195R, 1958, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 1978, 197T, 197V, 198A, 198C, 198G, 198H, 1981, 198L, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 1991, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 199T, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 2001, 200K, 200L, . 15 —200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 2008, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201l, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P, À 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 2021, 202K, 2021, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 2028, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 2038, 2037, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204l, 2041, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 2051, 205K, 205L, 205M, 205N, 205R, 2058, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 2091, 209M, 209T, 209V, 210F, 2101, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211M, 211P,211S,211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 2128, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 2136, 213H, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 214l, 214K, 214L, 214M, 214N, 2140, 214R, 2148, 214T, 214V, 214W, 214Y, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 2171, 217K, 217M, 217N, 217P, 2170, 217R, 2178, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C,

P 17/586 219D, 219F, 219G, 219H, 219l, 219K, 219L, 219M, 219N, 2190, 219R, 219S, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 2211, 221L, 221M, 221N, 221Q, 221R, 2218, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 2221, 222K, 222M, 222P, 222R, 2228, 222T, 222V, 223A, 223C,223E,223F,223H, 2231, 223L, 223M, 223N, 2230, 223V, 223W, 2241, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 2251, 225K, 225L, 225M, 225N, 225P, 225Q, 2258, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, 2261, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 2278, 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 228S, 2281, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F,229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230Il, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R, 2308, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 2328, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 233l, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 2330, 233R, 233S, 233T, . 15 233V, 233W, 233Y, 234A, 23A4C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234], 2341, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C, ] 235F, 2351, 235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y,238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 2381, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F, 2391, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 2408, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241M, 241P, 2410, 241R,241S, 241T, 241V, 2417W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, 2421, 242K, 2421, 242M, 242Q, 2428, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 2431, 243K, 243L, 243M, 2430, 243R, 2438, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 2441, 244M, 2447, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N,245P, 245R, 2457, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 2461, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 2468, 2467, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M,

- 18/586 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 248G, 248H, 2481, 248K, 2481, 248M, 248Q, 248R, 248S, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 2498, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250l, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 2511, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 2521], 252K, 252L, 252M, 2520, 252R, 2528, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 2531, 253K, 253L, 253M, 253P, 253R, 253S, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254l, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 255l, 255K, 255L, 255N, 255P, 2550, 255R, 2558, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 2561, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 2571, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, . 15 258H, 2581, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 259l, 259K, 259L, 259M, 259P, 2590, i 259R, 2598, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 260I, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 2611, 261M, 261N, 261Q, 2618, 261T, 261V, 262A, 262C, 2621l, 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 263S, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 2641, 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 265T, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 2670Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270, 270L, 270M, 270N, 270R, 2708, 270V, 270Y, 271F, 272G, 2721, 272L, 272M, 272N, 2728, 272T, 272V, 273D, 273G, 2731, 273K, 273L, 273P, 2730, 273R, 2738, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 2741, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 2740, 274R, 2748, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 2751, 275K, 275L, 275M, 275N, 275P, 2750, 275R, 2758, 275T, 275V, 275W, 275Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 2768, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 277Q, 277R,

À 19/586 2778, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 2781, 279D, 279E, 279G, 279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 2798, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282|, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 282Q, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H, 2831, 2831, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284I, 284K, 2841, 284M, 284N, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 2851|, 285L, 285M, 285N, 2850, 285S, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 2861, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E, 287F, 287G, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 2878, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 2881, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 291I, 291L, 291M, . 15 291N, 291S, 291T, 291V, 202A, 202C, 2921, 2921, 292M, 292S, 2927, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 293S, 293V, 294C, , 294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 300l, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 3011, 301K, 301L, 301M, 3010, 301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 3028, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 3051, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 3070, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, — 309D, 309E, 309F, 309H, 309l, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 3101, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F,

- 20/586 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 311S, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 3128, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 3131, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 3130, 313R, 3138, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 3148, 314T, 314W, 314Y, 315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 3151, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 3170Q, 317R,317S,317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320l, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 3200, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, e 15 3211, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 3221, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, Á 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 3241, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 3248, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 3251, 325M, 325N, 325P, 3257, 325V, 325W, 325Y, 326A, 3260, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 3298, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 3311), 331K,331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 3318, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332], 332K, 3321, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333], 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334l, 3341, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336], 336K, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 337Q, 337R,

- 21/586 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 3381, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339], 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340l, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 3411, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 3421, 342M, 342N, 342R, 3428, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 3431], 343K, 343L, 343M, 343P, 3430, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, 344H, 344|, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 3448, 344T, 344W, 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345l, 345N, 3450, 3458, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346], 346K, 346L, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A, 347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 3470Q, 347R, 3478, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 348], 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, - 15 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349|, 349K, 3491, 349M, 349N, 3490, 349R, 3498, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N, ' 3508, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 3518, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352], 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 3531], 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T, 355C, 355D, 355E, 355F, 3595G, 3551, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561], 356K, 356L, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 357l, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 3570, 357R, 3578, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 3581, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 358T, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359l, 359K, 3591, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, —360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 3618, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362], 3621, 362M, 362Q, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G,

. 22/586 363H, 363N, 3630, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 3641], 3641, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365], 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 3658, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 366L, 366M, 366S,366T,366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367], 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 3677, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 3681, 368K, 3681, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 3681, 368V, 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369|, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 3710, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 3721], 372L, 372M, 372N, 3720, 3728, 372T, 373A, 373C, 373F, 373G, 3731], 373M, 3730, 3738, 373T, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 3741, 374L, 374M, 374N, 3748, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 3750, . 15 3758, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 3/76G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 3768, 376T, 376V, 377F, 377H, 3771, p 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 3/8M, 378N, 378P, 3/78Q, 3/8R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379l, 379K, 379L, 3790, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380l, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 3811l, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 3821, 382K, 3821, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 3831, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 3841], 384K, 3841, 384P, 384Q, 384S, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385l, 385K, 3851, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861, 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 3861, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871, 387L, 387N, 387Q, 387S, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 388|, 3881, 388M, 388N, 388P, 388Q, 388R, 388S, 3881, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F,

- 23/586 389H, 389|, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 3901l, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392M, 392N, 392Q, 392R, 3928, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, 394F, 394H, 3941, 394K, 3941, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 3948, 394T, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395|, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, 397E, 397F, 397G, 397H, 3971, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 3981, 3981, 398M, 398N, 398P, 3980Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, - 15 —399F,399H, 399, 399K, 399L, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400l, 400K, 400L, 400M, 400N, Á 400P, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 4018, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 4026, 402H, 4021, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 4027, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 4031l, 403M, 403N, 4030, 4038, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404], 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 4051, 405K, 405Q, 4058, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 4078, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409I, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410l, 410K, 410Q, 4108, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 4118, 4119V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 4121, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 4128, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E,

. 24/586 413F, 413G, 4131, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 4138, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 4161, 416L, 416P, 416Q, 416R, 4167, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 4176, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 4178, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420l, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 4208, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 4218, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221, 422M, 422N, 422Q, 4228, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 4230, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 4241, 424K, 424M, 424N, 4240Q, 424R, 4248, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425l, 425K, 425L,

: 15 425M,4258,425T,425V, 425W e 425Y.

Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição de í um ou mais resíduos de amina presentes no polipeptídeo parental por resí- duos de aminoácido diferentes em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R,1S, 17, IV, 1W,1Y,2A,2E,2F,26G, 2H, 21, 2P, 2Q, 2R, 28, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 41, 4K, 41, 40, 48, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, SW, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 78, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V,oW, 9Y, 101, 10L, 10M, 10P, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 121, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 148, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20M, 20R, 208, 20V, 20W, 20Y, 21E, 211, 21M, 21Q, 218, 21V, 221, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 238, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F,24G,24R, 248, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 258, 257, 25V, 25W, 25Y, 261, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 271, 27L, 27P, 270, 27R, 278, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M,

! 25/586 28N, 28P, 28Q, 28R, 288, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 310, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 328, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 350, 35R, 358, 35V, 35W, 36F, 36H, 361, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 398, 39V, 42V, 43A, 438, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44N, 44R, 448, 44T, 44Y, 45F, 45H, 451, 45L, 45M, 458, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 476, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 478, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 498, 497, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 518, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 520, 52R, 528, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 531, 53L, 53P, 53R, 538, , 15 53T,53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, S4N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, À 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 561, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 570, 57R, 578, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 6ON, 63H, 63N, 64A, 648, 65A, 651, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, —66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 671, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 681, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72Q, 728, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 790Q,79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 818, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85R, 858, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, — 880Q, 88R, 88S, 88T, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89l, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90D, 90E, 90F, 90H, 90I, 90K, 90M, 90N, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N, 910,

- 26/586 91R, 918, 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 93S, 93Y, 941, 95F, 95M, 961, 98C, 991, 100C, 100F, 100M, 100V, 103A, 103C, 103V, 104A, 1048, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 1078, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 1091l, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 110V, 111C, 111E, 111F, 1116, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 111Q, 111R, 1117, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 1128, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 1151, 115L, 115R, 115V, 115Y, 1164, 116F, 116G, 116H, 116], 116L, 116N, 116Q, 116R, 1167, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 1186, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 1191, 119K, 119L, 119M, 119Q, 1198, 119T, 119Y, 1218, . 15 124A,124K,1240, 124R, 1248, 124T, 125A, 125D, 125F, 1251, 125K, 1250, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126], 126K, 126L, Á 126N, 126P, 126R, 1268, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 1288, 1287, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 1321, 132N, 1328, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142), 142K, 142M, 1420, 142R, 1428, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 1438, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 1510, 1518, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 1528, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R, 153T, 153V, 153W, 153Y, 1544, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 1581, 158M, 158T, 158V, —159H,159I, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160], 160K, 160L, 160M, 160Q, 1608, 160T, 160V, 1621, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 1631, 163N, 1630, 163R, 163S, 163T, 163V,

. 27/586 163W, 163Y, 164G, 164H, 1641, 164N, 1648, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 1651, 165L, 165M, 165T, 165V, 166C, 1661, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 1678, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 1688, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 1711, 171M, 171N, 1710, 171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 1798, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187M, 187Q, 1878, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188P, 1880, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 1928, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 1981, 198L, 198V, 199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 199S, 199T, 199Y, 200I, 200N, 2008, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011, 201K, 201L, - 15 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 203I, 203K, 203L, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, ] 203Y, 2041, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 2051, 205L, 205M, 205N, 205V, 207A, 209L, 209V, 211H, 2118, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 2131l, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214l, 214K, 214L, 214M, 214N, 2140, 214R, 2148, 214T, 214V, 214W, 214Y, 2171, 2170, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 2190, 2198, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 2218, 221V, 222F, 2227, 223H, 223L, 223M, 223W, 224l, 225E, 225F, 225N, 225P, 225Q, 2257, 225Y, 2261, 2261, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H, 230, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 2328, 233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 233l, 233K, 233L, 233M, 233N, 2330, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 2361, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 2376, 237H, 2371, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E,

. 28/586 238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 239l, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241R, 2418, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 242), 242K, 242L, 2428, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 2436, 243H, 243], 243K, 243L, 243M, 243Q, 243R, 2438, 243T, 243V, 243W, 243Y, 2441, 244M, 244V, 245C, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 2461, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470, 247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 2488, 2481, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 2491, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250I, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y, 252F, 252L, 252W, 253F, 2531, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254], 254L, 254N, 254T, 254V, 254Y, 255A, . 15 255E, 255, 255K, 255P, 255R, 2558, 255V, 256A, 256C, 2561, 257E, 257], 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, ó 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D, 260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 2621, 263C, 263L, 263M, 2638, 263V, 264E, 264H, 264], 264L, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 2708, 270V, 271F, 272G, 272L, 2728, 272V, 273G, 2731, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 274], 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 274Q, 274R, 2748, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F, 275G, 275H, 275K, 275P, 2750, 275R, 2758, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 276I, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 2760, 276R, 276S,276T,276Y,277A,277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 2778, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 2790Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 2821, 282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 2841, 284K, 2841, 284N, 284R, 2848, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 286L, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287Q, 2878, 287T, 287V, 288C, 2881, 288M, 288V,

. 29/586 289A, 290Y, 291C, 291G, 291L, 2918, 291T, 292A, 292C, 2921, 292L, 2927, 293C, 293V, 294C, 294G, 2948, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 2971, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 2981, 298M, 298N,298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 2991, 299N, 299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 3011I, 301K, 301L, 301M, 301T, 3027, 303M, 3041, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 3128, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 3148, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, - 15 317R, 3178, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, i 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320Il, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321], 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 3221, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324l, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 32478, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325], 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 3311, 331L, 331Q, 3318, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 3331, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334l, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 3378, 337V, 337W, 337Y, 338G, 3381, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 3438, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344|, 344K, 344L, 344M,

. 30/586 344N, 344Q, 344R, 3448, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 3450Q, 3458, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347], 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 3478, 347T, 347V, 34A7W, 348F, 348H, 348), 348K, 348R, 348S, 3481, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349], 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353], 353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355], 355L, 355M,355V,355Y,356D, 356F, 356G, 3561, 356K, 356L, 356P, 3560Q, 3567, 356W, 356Y, 357A, 357H, 3571], 357K, 357L, 357N, 3570, 357R, 3578, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 358L, 358M, 358Q, 358R, 358S, 3581, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, ; 15 361C,361L, 361M, 361N, 361Q, 3618, 361T, 361V, 362A, 362C, 362], 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, E 364A, 364C, 364G, 364], 364L, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365], 365K, 3651, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 3678, 367T, 367W, 367Y, 368G, 3681, 368K, 3681, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691I, 369K, 3691, 369N, 369Q, 3698, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 3711, 371L, 371M, 371N, 3718, 371T, 371Y, 372A, 372C, 3721, 372L, 372N, 3728, 372T, 373A, 373C, 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 3741, 374M, 3748, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 3750, 3758, 375T, 375Y, 376G,3761,376S,376T,376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378], 378K, 3781, 378M, 378N, 378Q, 378R, 3781, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379l, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 3811I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382], 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384], 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 3851, 385K, 385L,

" 31/586 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 3871, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 3881, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 3891, 389M, 389Q, 389V, 390F, 3901, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 3921, 392N, 392Q, 392R, 3928, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 3930, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 3941, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397l, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399], 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400l, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 4008, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, . 15 401E,401F,4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 4018, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402], 402K, ' 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 4031, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 4058, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407], 407K, 407M, 407Q, 407R, 4078, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 4091, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 4118, 411Y, 412N, 4127, 413C, 413F, 413G, 4131, 413L, 413P, 413R, 4138, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 4140, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 4151, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 4160, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 4191, 419L, 4198, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 4208, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 4218, 421T, 422F, 4221, 4228, 422W, 423D, 4231, 423Q, 423R, 4231, 424M, 4240, 424R, 424V, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L, 425V e 425Y.

Em algumas modalidades, a substituição muda o resíduo de a-

. 32/586 minoácido presente na posição 153 por N, K ou F e o polipeptídeo variante exibe habilidade aumentada para converter substratos de maltose e matoep- taose em glicose comparado com o polipeptídeo parental. Em alguns casos, a substituição muda o resíduo de aminoácido presente na posição 153 para Keo polipeptídeo variante exibe habilidade aumentada para converter um substrato de DP7 em glicose comparado com o polipeptídeo parental.

Em algumas modalidades, a substituição é selecionada do grupo consistindo em L142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L e S254I, e onde a substituição aprimora o desempenho de liquefação do amido dos polipepti- deos variantes comparado com o polipeptídeo parental da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a substituição é selecionada do grupo consistindo em W60L, W60M, W6ON, 1100F, I1100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V e T279A, e onde a substituição aprimora o . 15 desempenho de liquefação de amido dos polipeptídeos variantes comparado com o polipeptídeo parental de SEQ ID NO: 2.

Í Em algumas modalidades, a substituição é selecionada do grupo consistindo em 052D, 052E, 0521, 052K, 052L, OS52N, 052Q, 052R, O52V, 056D, 056E, 0561, 056K, O056L, O056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089], 089K,089L, O89N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 1521, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531, 153K, 153L, 153N, 1530, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284], 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 2970, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 3211, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328], 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359], 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385], 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 388L, 388N, 3880, 388R, 388V, 391D, 391E, 391l, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V,

400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416], 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R e 416V, mutações que têm valores PI > 0,5 para ambas a proteína e atividade.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante não incluí uma modificação do resíduo de aminoácido em uma posição selecionada do gru- po consistindo em 75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266 e 306 do polipeptídeo parental.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante não inclui uma modificação do resíduo de aminoácido em uma posição selecio- nada do grupo consistindo em 75 e 123, que foram determinadas ser total- mente restritivas para desempenho no polipeptídeo parental truncado.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante não inclui uma modificação do resíduo de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo em 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 e 306, que foram determinadas ser totalmente restritivas para desempenho no polipeptídeo parental de . 15 comprimento integral.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo parental tem pelo me- : nos 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo parental tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido coma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 2. Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo parental tem pelo menos 90% de identidade de se- quência de aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a característica que aprimora o desempenho en- zimático é selecionada do grupo consistindo em estabilidade térmica aumen- tada, atividade específica aumentada e expressão de proteína aumentada.

Em algumas modalidades, a característica que aprimora o de- sempenho da enzima é selecionada do grupo consistindo em estabilidade térmica aumentada, atividade específica aumentada e expressão de proteína aumentada.

É também provida uma composição de processamento de amido compreendendo um polipeptíideo de AmyE (incluindo uma variante) e opcio- nalmente uma glicoamilase, uma pululanase, uma B-amilase, uma a-amilase

- 34/586 fúngica, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma isoamilase ou uma combinação das mesmas. Em modalida- des particulares, a composição inclui um polipeptídeo adicional tendo ativi- dade de glicoamilase.

É também provida uma composição para assar compreendendo um polipeptídeo de AmyE (incluindo uma variante) em uma solução ou em um gel. Um método para assar compreende adição da composição para as- sar a uma substância a ser assada e assar a substância. Em um aspecto relacionado, um método para redução de endurecimento de pão compreen- dendo adição a uma massa de pão de uma quantidade de polipeptídeo de AmyE suficiente para reduzir endurecimento comparado com a quantidade de endurecimento observada com uma massa de pão equivalente sem um polipeptídeo de AmyE.

Em outro aspecto, uma composição de limpeza é provida, com- - 15 preendendo um polipeptídeo de AmyE (incluindo uma variante) em uma so- lução aquosa e opcionalmente outra enzima, um detergente e/ou um agente 1 de alvejamento. A solução de limpeza pode ser usada para lavagem de rou- pas, lavagem de louça ou limpeza de outras superfícies. Em um método re- lacionado, louças, roupas e outras superfícies são contatadas com a compo- siçãode limpeza por um tempo suficiente para o artigo ser limpo.

Em outro aspecto, uma composição de retirada de sujeira de têxtil é provida, compreendendo um polipeptídeo de AmyE (incluindo uma variante) em uma solução aquosa, e opcionalmente outra enzima. Em um método relacionado, um têxtil é contatado com a composição de retirada de sujeirapor um tempo suficiente para retirar a sujeira do têxtil.

Em outro aspecto, ácidos nucleicos codificando variantes de AmyE, vetores de expressão compreendendo tais polinucleotídeos e células hospedeiras que expressam variantes de AmyE são providos. Em ainda ou- tro aspecto, um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico codifican- do qualquer uma das variantes de AmyE mostradas aqui é provido. Ainda, um ácido nucleico capaz de hibridização para um ácido nucleico codificando qualquer uma das variantes de AMyE mostradas aqui, ou o seu complemen-

- 35/586 to, é provido. Em outro aspecto, as composições e métodos envolvendo um ácido nucleico sintético codificando qualquer uma das variantes de AmyE mostradas aqui, onde os códons são opcionalmente otimizados para expres- são em um organismo hospedeiro particular, são providas.

Esses e outros aspectos e modalidades das composições e mé- todos serão aparentes a partir do relatório que segue e figuras acompanhan- tes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra um alinhamento de sequência entre AmyE tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 (aqui referida como "AmyE de comprimento integral") e AmyE tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (aqui referida como "Amy31A"). Diferenças nas sequências de aminoácido são mostradas em negrito. Os resíduos são numerados a partir do primeiro aminoácido na forma madura das enzimas.

- 15 A figura 2 mostra o plasmídeo pME630-7, o qual compreende um polinucleotídeo (marcado "SAMY425aa") que codifica AmyE-tr (SEQ ID Ã NO: 2). O plasmídeo compreende um polinucleotídeo em estrutura com o gene de SAMY que codifica uma sequência de sinal de a-amilase de B. /i- cheniformis (marcada "pre LAT").

A figura 3 mostra a atividade específica relativa de AMyE (SEQ ID NO: 1; "AmyE de comprimento integral"), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2; "AmyE truncada") e Amy31A (SEQ ID NO: 3) com relação a um substrato de amido de milho insolúvel marcado com Remazol Brilliant Blue (RBB). A hidrólise do substrato foi catalisada por 30 minutos a 50º C em pH 4,5, 5,0 ou 5,6. A ati- vidade da enzima foi determinada pela absorbância a 595 nm de marcador RBB liberado.

A figura 4A mostra a viscosidade (uNm) de 15 g de substrato de amido ds medida como uma função de tempo (minutos) na presença de 0,7 mg de AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) em pH de 4,5 ou 5,8. A figura 4B mostra vis- cosidade de substrato como uma função de tempo na presença de 2,2 mg de AmyE (SEQ ID NO: 1) em pH de 4,5 ou 5,8. A figura 4C mostra viscosi- dade de substrato como uma função de tempo na presença de 1,4 mg de

- 36/586 Amy31A (SEQ ID NO: 3) em pH de 4,5 ou 5,8. A figura 4D mostra viscosida- de de substrato como uma função de tempo na presença de 4,1 mg de Amy31A em pH de 4,5 ou 5,8. " A figura SA mostra análise calorimétrica diferencial de varredura (DSO) (Differential Scanning Calorimetric) de funções de capacidade de ca- lor em excesso de AmyE (SEQ ID NO: 1; "AmyE de comprimento integral") e AmyE-tr (SEQ ID NO: 2; AmyE truncada") na presença ou ausência de Ca?* 2 mM. A figura 5B mostra análise de DSC de Amy31A (SEQ ID NO: 3) na presença ou ausência de Ca** 2 mM. A figura 5C mostra análise de DSC de a-amilase de Geobacillus stearothermophilus (AmyS) na presença ou au- sência de Ca** 2 mM.

A figura 6 mostra os resultados de produção de glicose a partir de um substrato de maltose por AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) comparado com as variantes de posição Q153 de AmyE e AmyS truncada (SEQ ID NO: 4).

' 15 A figura 7 mostra os resultados de produção de glicose a partir de um substrato de maltoeptaose por AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) comparado f com as variantes de posição Q153 de AmyE e AmyS truncada (SEQ ID NO: 4).

A figura 8 mostra produtos de quebra detectados através de H- PLC seguindo uma incubação de O h (painel superior) e 72 h (painel inferior) de AmyE-tr com maltoeptaose (DP7).

A figura 9 mostra produtos de quebra detectados através de H- PLC seguindo incubação de O h, 2 h, 4 h e 24 h (painéis de cima para baixo) de AmyS com um substrato de DP7.

A figura 10 mostra produtos formados através da incubação de variante de Q153K de AmyE-tr com maltoeptaose (DP7). Traços de HPLC mostrados de cima para baixo correspondem ao tempo O h, 1h, 2h, 3he 24 h.

A figura 11 mostra formação de etanol por amilase AmyE trun- cadaeSPEZYMES Xtra em fermentação convencional em pH 4,3 e 5,8.

A figura 12 mostra hidrólise de amido granular insolúvel (sem cozimento) em etanol por AMyE de comprimento integral (FL) e truncada (tr)

- 37/586 comparado com AKkAA sozinho ou Stargen? 002 em pH 4,3 e pH 5,8.

A figura 13 mostra formação de glicose por AMyE de compri- mento integral de B. subtilis, AmMyE truncada e Amy31A em comparação com AmyS em pH 4,5 e 5,6.

A figura 14 mostra os resultados de incubação de AmyE de comprimento integral! com amido cru (farinha de milho) e detecção de oligos- sacarídeos produzidos com o tempo (0, 30, 90 minutos) através de detecção por HPLC. .

A figura 15 mostra os valores de viscosidade de pico e final obti- dosem ensaio de hidrólise de amido usando polipeptídeos de AmyE.

A figura 16 mostra os resultados de um ensaio de endurecimen- to de pão usando um polipeptídeo de AmyE.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS As sequências que seguem são referidas no pedido: - 15 SEQ ID NO: 1: sequência de aminoácido de AmyE de Bacillus subtilis de comprimento integral. A sequência de sinal nativa não é mostra- ' da. 1 LTAPSIKSCT ILEAWNWSFEN TLKENMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQO 51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI 101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNK THGNTOIKNW SDRWDVTONS LLGLYDWNTO 151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDESYG SQFWPNITNT 201 SAEFOYGEIL ODSASRDAAY ANYMDVTASN YCGHSIRSALK NRNLGVSNIS 251 EYASDVSADK LVTWVESEDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST 301 PLFFSRPEGG CNGVRFPGKS OIGDRGSALEF EDQOAITAVNR FENVMAGOPE 351 ELSNPNGNNQ IFMNORGSEG VVLANAÇSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA 401 GSFQVNDGKLI TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDOL 451 TITLRADANT IKAVYQINNG PETAFKDGDO FTIGKEGDPFG KTYTIMLKGT 501 NSDGVIRIEK YSFVKRDPAS AKTIGYONPN ENSOVNAYIY KHDGSRVIEL 551 TGSWPGKPMT KNADGIYILT LPADTDTINA KVIFNNGSAQ VPGONOPGED 601 YVLNGLYNDS GLSGSLPE SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácido de AmyE de Bacillus subtilis truncada (AmyE-tr). A sequência de sinal nativa não é mostrada.

1 LTAPSIKSCT ILEAWNWSFN TLKENMKDIH DAGYTAIOTS PINOVKEGNO 51 GDKSMSNWYW LYOPTSYOIG NRYLGTEQEF KEMCAMAEEY GIKVIVDAVI 101 NETTSDYBAI SNEVKSIPNH TEGNTOIKNK SDRWDVTONS LLGLYDWNTO 151 NTQOVOSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKE IELPDDESYG SQFWPNITNT

- 38/586 201 SAEFOYGEIL ODSASRDAAY ANYMDVTASN YCHSIRSALK NRNLGVSNIS 251 HYASDVSADK LVTWVESEDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST 301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGOPE 351 ELSNPNGNNOQ IFMNQRGSEG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGÇA 401 GSFQOVNDGKL TGTINARSVA VLYPD SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácido de variante de a- amilase de Bacillus subtilis Amy31a (No. de Acesso UniProtKB/TrEMBL O82953). A sequência de sinal nativa é mostrada em negrito. 1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FELVLSGPAA ANAETANKSN KVITASSVKNG 51 TILHAWNWSF NTLTONMKDI RDAGYAAIOT SPINOVKEGN OGDKSMSNWY 101 WLYOPTSYOT GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNETTSDYGA 151 ISDEIKRIPN WIKGNTOIKN WSDRWDITON ALLGLYDWNT QNTEVOAYLK 201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK EIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI 251 LODSASRDTA YANYMNVIAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD 301 KLVTWVESED TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSECS TPLFFSRPEG 351 GGNGVRFPGK SOIGDRGSAL FKDOAITAVN OFENEMAGOP EELSNPNGNN 401 QIFMNQORGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK 451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APEVEFLENYO TEAVESFNDO LIVTLRANAK : 501 TTKAVYQINN GOETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTO 551 EYTFVKKDPS QINIIGYONP DEWGNVNAYI YKEDGGGAIE LTGSKPGKAM 601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQONEPCF DYVQONGLYNN 651 SGLNGYLPE SEQ ID NO: 4: Sequência de proteína de a-amilase de Geoba- cillus stearothermophilus truncada (amilase SPEZYMEG Xtra). A sequência de sinal é mostrada em negrito. 1 MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGO EAKAAAPFNG TMMOYFEWYL 51 PDDGTIWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YCVYDLYDLG 101 EFNOKGTVRT KYGTKAQYLO AIQAAHAAGM OVYADVVFDH KGCGADGTEWV 151 DAVEVNPSDR NOEISGTYOI QAWIKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW 201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDE PEVVTELKNW 2581 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFEPDWL SYVRSQTCGKP LETVGEYWSY 301 DINKLENYIT KTNGTMSLED APLENKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD 351 QPTLAVTFVD NEDTEPGOAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD 401 YYGIPOYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDESDI IGWIREGVTE 451 KPCSGLAALI TDCPGCGSKWM YVCKOHAGKV FYDLTENRSD TVTINSDGWG 501 EFKVNGESVS VWVPRKTT SEQ ID NO: 5: Sequência de nucleotídeo codificando a AmyE de SEQ ID NO: 1.

e 39/586

CTTACAGCACCGTCGATCAAARAGCGGAACCATICTTCATECATGEAATTGGTCGTTCAATACGT TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATECAGGATATACÇAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA CCAAGTARAGGAAGGGAATCAAGGAGATARAAGCATGTCGAACTEGTACTGGCTGTATCAGCCG ACATCETATCAAATTGGCAACCETTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAMAGAAATGTGTCCAC CCGCTGAAGAATATGGCATABAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTARA AACTGGTCTGATCGATGGGATGICACGCAGAATTCATIGCTCEGECTETATGACTGGAATAÇAC AAAATAÇACAAGTAÇAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGAÇAGGGCATTGAATGACGGGEÇAÇA CEGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGECAGTTACGGCAGTÇAA TTTTGGCCEGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAMATCCTTCAGGATAGTG CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGECGIGTCGAATATCITCCCACTATGCATCTGATGTG TCTGCGGACAAGCTACTGAÇATGEGTAGAGTCGCATGATACGTATGCÇAATGATGATÇAAÇAÇT CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGECTEGECEGTGATAGCTTCTCETTCAGGÇAÇG TACGCCTCITITCTTITCCAGACCTGAÇGEAGECGGAAATGETETGAGETTCCCEGEGAAAAGÇ CARATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTFCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCARATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTICAAGTGA ACGATGETAAACTGACAGGCACGATCAATECCACGTCTGTAGCTETGCTTIATCCIGATGATAT TGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAÇAATTAÇAAAAÇAGGTGTAAÇACATTCTTTCAATGAT CAACTGACÇGATTACCTTGCGTEÇAGATGCGAATAÇAAÇAAAAGCCETTTATCAMATCAATAATG Í GACCAGAGACGGCGTTTAAGGATEGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAA AACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGCGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAÇT . TTIGTIAABAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGC TATCAAAATCCGAATCATTGEAGÇO AGEGTAAATGCTIATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGEÇCO TGGAAAACCAATGAÇTAAAAATGCAÇAÇGGAATTTACACGCTGACÇECTECCTECEÇAÇAÇEÇAT ACÇAACCAACGÇARAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTECCCEGTÇAÇAATÇAGÇOÇTE

GCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCEGTTCTCTTCCCCAT SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotídeo codificando AmyE-tr (SEQ ID NO: 2).

CTTACAGCACCGTCGATCAAAAÇCEGAACCATTCTTCATGCATGGAATTEGTCETTCAATACET TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATECAGGATATACAGCCATTCAGÇACATCTCCGATTAR CCAAGTAAAGGAAGGGAATÇAAGGAGATARAAGÇATGTCGAAÇTEGGTAÇTGECTGTATÇAGÇÇOG ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG CCECTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATIGITGACGCEGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA TGCCECEGATITCCAATGAGGTTAACAGTATTCCAAACTGGACACATEGAAACACACAAATTARA AACTGGTCTGATCGATEGGGATGTÇAÇEÇAGAATTCATTGCTÇEGGCTETATEAÇTEÇAATAÇAÇ ABAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGAÇAGGGCATTGAATGACEGECCAÇA CGGTTITICGAITIGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTIACGGCAGICAA TTTTGGCCGAATATCACAMATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT ABGGTCCGCTTTAMAGAATCGTAATCTGGGCGTCTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATETG TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTIAIGCCAATGATGATGAAGAGT

- 40/586

CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTACECTEGECEGTEATAGCTTCICGTTICAGEÇAG TACGCCTCTTITTICTTTTCCAGACCTGAGGGAGEGCEGAAATEGTGIGAGGTTCCCEGGGAAAAGO CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTITATITGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC ACAATGTGATGGCTGGAÇAGÇOTGAGGAAÇTCTCGAACCCGAATGGAMACAACCAGATATTTAT GAATCAGCGCGGCTCACATEGCGTTETGCTGGCAAATEGCAGGTICATCCTCTGTCTCTATCAAT ACGGCAACAMAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGEAGÇEGETTÇATTTCAAGTÇA

ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGETCTGTAGCTGTECTTTATCCTGAT SEQ ID NO: 7: Sequência de nucleotídeo codificando Amy31A de B. subtilis (SEQ ID NO: 3).

TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAAÇACGCTGACCÇAGAAÇA TGARAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGA AGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTEGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAG ATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCEGCTGAGAAAT ATGGTGICAMAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAG CGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTEGAGCEAC CGCTGEGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAMRAACACCOGAAG TACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGETGCTGATGGTTTITCGECTA CGACGCCECAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCEAAC ATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCEGACGCCGTEAÇA - CCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGECCATTCCATTICGTTCTGCECT GAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGÇATCCGACGTTTCTECTGAÇAAA " CTEGGTAACTTGGGTCEAGTÇCTÇAÇGAÇAÇÇTATGÇAAATGATGAÇGAGEAÇAGÇAÇÇTGÇATGEA GCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTT CTTTAGCCGTCCGGAAGGTGECGECAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAMATCTCAAATTGGTGAT CETGECTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATEG CAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCARACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCETEG CAGCAMACGCGTCEGTCCTGGCEAACECCEGTAGCTCTTCIGITACCATCAACACGTCTACCAAA CTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCETGCEGETECTEGTTCCTITCAGETAGCCAACGGCAAGE TGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTETTCTGTACCCGGACGACATTGECAACECTCE GCACGTEGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCETC ACTCTGCGTGCCAACECAAAMACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGETCAAGAAACTE CTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGEACCCGATTGGCACCACTTATAACET TAAACTGACTGECACCAATEGCCAGEGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGARA GACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGARTCCTGACCACTGEGETAATGTCAACECTT ACATCTATAMACATGATGETGGCEGTGCTATCGAACTGACCEGCTCTIGECCAGEGTARAGCCAT GACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTECCEGCCAATGCGGATACCGCAGATGECG AAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCECAGETTCCGEGCCAAAACCATCCGEGGCTTTGACTACG

TACABAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC SEQ ID NO: 8: Sequência de nucleotídeo codificando AmyS de Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 4).

> 41/586

GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGT TATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTIGGCATCACCGCTCTTTGGCT GCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCECAGCGACGTAGEGTACGGAGTATACGACTTGTATGAC CTCGGCGAATTCAATCAMAAAGGGACCGTCCGCAÇAAAATATGGAAÇAAAAGCTCAATATOTTC AAGCCATICAAGCCGCCCACGCCGCTEGAATECAAGTGTACGCOGATETCETEITCGACCATAA AGGCEGCECTEACEGCACEGAATEGETEGACECCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCOAA GAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGABATTTGATTTTCCCGGGCEGEGGCAAÇA CCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGETACCATTTTGACGGCGTTGACTEGGACGAAAGCCGAAA ATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCETGEGATTGGGAAGTAGACACAGAAAAÇEGA AACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGA AAAACTGCCCEAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGEGTTCCGGCTTGATECCETCAA GCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCG CTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAA CAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATC RAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGAITCAACCGACATTG GCCETCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCEGCCAAGCGCTECAGTCATEEGTCEACC CATGGTTCAMACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCETCTT TTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTICGCTGAAAAGCAAAATCGATCCG CTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACA TCATCEGETGEACAAGEGAAGECGTCACTGAAAAACCAGGATCCEGECTEECCECACTGATCAC - CEATEEGCCEGGAGGAAGCARATEGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGEAAAAGTGTTCIAT

GACCTTACCGECAACCGGAGTEACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGEGEGEAATTCAAAG - TCAATGGCGETTCEGTTTCEGTTTGECTTCCTAÇAAAMAÇGAÇO SEQ ID NO: 9: Sequência de sinal nativa da AmyE de SEQ ID NO: 1.

MFAKRFKTSLLPLEAGFLLLFELVLAGPAAASAETANKSNE SEQ ID NO: 10: Iniciador PSTAMYE-F 5'

CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTAÇAGCACCGTCGATCAA AAGCOGG

AAC SEQ ID NO: 11: Iniciador AMYENOPST-R 5&'

CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATIGGAACTCTGCIGATGTATTTGTG SEQ ID NO: 12: Iniciador AMYENOPST-F &'

CACAAATAÇATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAMRATCCTICAGGATAGTECOTCOÇAÇG SEQ ID NO: 13: Iniciador HPAIAMYE-R 5'

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGEGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC SEQ ID NO: 14: Iniciador HPAIAMYE466-R 5'

CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTEG SEQ ID NO: 15: Iniciador AMYE SEQ-F1 5'

TACACAAGTACAÇTCCTATCTG SEQ ID NO: 16: Iniciador AMYE SEQ-F2 5'

- 42/586

CATCCTCTGTCICTATCAATAÇ SEQ ID NO: 17: BP-17 variante de fitase de Buttiauxiella

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTOT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT PRGEHLISLM GGFYROKFQOO QGILSQOGSCP TPNSIYVWAD VDQORTLKTGE AFLAGLAPQC GLTIHHOONL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVOQAVEKEA QTPIDNLNQOH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPOAAWGNI HSEQEWASLL KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLOAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI LFIAGHDTNI ANIAGMINMR WILPGOPDNT PPGGALVFER LADKSGKOYV SVSMVYQOTLE QLRSQTPLSL NOPAGSVOLK IPGCNDQTAE GYCPLSTEFTR VVSQSVEPGC QLO

DESCRIÇÃO DETALHADA As presentes composições e métodos referem-se a uma a- amilase de Bacillus subtilis (AMyE) e variantes da mesma (coletivamente referidas como polipeptídeos de AmyE), que oferecem certas vantagens ; comparado com outras a-amilases. Por exemplo, polipeptídeos de AmyE exibem atividade específica alta para substratos de amido em um pH ácido, f permitindo que polipeptídeos de AmyE sejam usados para liquefação de a- mido sob condições que são também adequadas para sacarificação. Isto elimina a necessidade de ajustar o pH de uma pasta fluida de amido entre liquefação e sacarificação. Polipeptídeos de AmyE também possuem ativi- dade de glicoamilase, eliminando ou reduzindo a necessidade do uso de uma glicoamilase separada para realizar sacarificação. Ainda, polipeptídeos de AmyE requerem pouco ou nenhum cálcio para estabilidade térmica, eli- minando a necessidade de remover subsequentemente cálcio adicionado antes da realização da isomerização, desta maneira eliminando pelo menos uma etapa requerida para a produção de xarope de milho com alto teor de frutose. Essas e outras características das composições e métodos são descritas em mais detalhes, abaixo.

1. Definições e Abreviações A menos que de outra maneira definido, todos os termos técni- cos e científicos e abreviações devem estar de acordo com seus significados

- 43/586 comuns conforme compreendido por um versado comum na técnica. Os termos e abreviações que seguem são definidos por questão de clareza.

1.1 Definições Conforme aqui usado, o termo "amido" refere-se a qualquer ma- terial compreendido dos carboidratos de polissacarídeo complexos de plan- tas, compreendido de amilose e amilopectina com a fórmula (CsH1i0Os)x, on- de X pode ser qualquer número. Em particular, o termo refere-se a qualquer material baseado em planta incluindo, mas não limitado a, grãos, gramas, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, ar- roz,sorgo, aveias, mandioca, painço, batata, batata-doce e tapioca. Conforme aqui usado, o termo "oligossacarídeo" refere-se a uma molécula de carboidrato composta de 3-20 monossacarídeos. Conforme aqui usado, uma "amilase" refere-se a uma enzima capaz de catalisar a degradação de amido. Em geral, a-amilases (EC E 15 3.2.1.1; a-D-(1-4)-glicano glicanoidrolase) são enzimas de ação endo que clivam ligações a-D(1—4)O-glicosídicas dentro da molécula de amido de Ê uma maneira aleatória. Em contraste, as enzimas amilolíticas de ação exo, tais como B-amilases (EC 3.2.1.2; a-D-(1—4)-glicano maltoidrolase), e algu- mas amilases específicas de produto tal como a-amilase maltogênica (EC

3.2.1.133), clivam a molécula de amido da extremidade de não redução do substrato. B-Amilases, a-glicosidases (EC 3.2.1.20; a-D-glicosídeo glicoidro- lase), glicoamilases (EC 3.2.1.3; a-D-(1—4)-glicano glicoidrolase) e amilases específicas de produto podem produzir malto-oligossacarídeos de um com- primento específico a partir de amido. Conforme aqui usado, amilases inclu- em qualquerítodas as amilases, incluindo glicoamilases, a-amilases, B- amilases e a-amilases do tipo selvagem, tais como aquelas de Bacillus sp., B. licheniformis e B. subtilis, enquanto a-amilases incluem o subconjunto mencionado acima dessas enzimas. Conforme aqui usado, "variantes de a-amilase", e expressões similares,refere-se a variantes/mutantes de uma a-amilase de referência, que incluem uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido com relação à sequência de aminoácido parental (tipo selvagem; referência). O

- 44/586 termo "variante" é usado intercomutavelmente com o termo "mutante". A a- amilase variante pode incluir mutações na sequência de sinal com relação à sequência de sinal parental. Ainda, a a-amilase variante pode estar na forma de uma proteína de fusão contendo uma sequência de sinal de a-amilase heteróloga, tal como de B. licheniformis (LAT).

Um "ácido nucleico/polinucleotídeo parental", "ácido nuclei- co/polinucleotídeo do tipo selvagem" ou "ácido nucleico/polinucleotídeo de referência" refere-se a uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídeo parental e um ácido nucleico complementar ao mesmo.

Um "ácido nucleico/polinucleotídeo variante" refere-se a uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo variante ou um á- cido nucleico complementar ao mesmo ou uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos uma substituição, inserção ou deleção de base com rela- ção a uma sequência de polinucleotídeo parental ou um ácido nucleico com- - 15 plementaraomesmo. Onde especificado, tais ácidos nucleicos podem incluir aqueles tendo um grupo especificado de homologia com uma sequência de ' referência ou aqueles que são capazes de hibridizar para uma sequência de referência, por exemplo, sob condições adstringentes [por exemplo, 50º C e 0,2X SSC (1X SSC = NaCl 0,15M, citrato de Na3z 0,015M, pH 7,0)] ou condi- ções altamente adstringentes [por exemplo, 65º C e 0,1X SSC (1X SSC = NaCl 0,15M, citrato de Naz 0,015M, pH 7,0)]. Um ácido nucleico variante po- de ser otimizado para refletir uso de códon preferido para um organismo hospedeiro específico, tais como as leveduras metilotróficas (por exemplo, Pichia, Hansenula, etc) ou fungos filamentosos (por exemplo, Trichoderma (por exemplo, T. reesei), etc) ou outros hospedeiros de expressão (por e- xemplo, Bacillus, Streptomyces, etc).

Uma "sequência de sinal" é uma sequência de aminoácidos |i- gada à porção N-terminal de uma proteína, a qual facilita a secreção da pro- teína fora da célula. A "sequência de sinal" pode ser também referida como uma"sequência líder" ou uma "pró-sequência", Conforme aqui usado, a forma "imatura" ou "de comprimento in- tegral (FL) (Full-length)" de uma amilase inclui o peptídeo de sinal. A forma

- 45/586 imatura pode incluir outras modificações pós-traducionais.

Conforme aqui usado, a forma "madura de uma proteína extra- celular (tal como uma amilase) não tem a sequência de sinal. A sequência de sinal pode ser clivada durante o processo de secreção. Alternativamente, um polipeptíideo pode ser expresso em sua forma madura, por exemplo, co- mo uma proteína intracelular, ou sintetizado em sua forma madura.

Conforme aqui usado, uma forma "truncada" de AmyE (isto é, "AmyE-tr") refere-se a um polipeptídeo de AmyE com uma deleção de todo ou parte do domínio de ligação de amido C-terminal. Na AmyE tr de SEQ ID NO:2, por exemplo, a AmyE de SEQ ID NO: 1 é truncada no resíduo D425. Uma estrutura de cristal de resolução de 2,5À desta AmyE-tr está disponível no No. de Acesso 1BAG no Protein Databank, que é descrito em Fujimoto e outros, "Crystal structure of a catalytic-site mutante alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose", J. Mol. Biol. 277:393-407 (1998). . 15 AmyE-tr pode ser truncada em outras posições, por exemplo, Y423, P424, D426 ou 1427 da AmyE de SEQ ID NO: 1, contanto que todo ou parte do Ê domínio de ligação de amido C-terminal seja removido.

O termo "recombinante", quando usado em referência a uma cé- lula, ácido nucleico, proteína ou vetor-objeto, indica que o objeto foi modifi- cado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heterólogo ou a alte- ração de um ácido nucleico ou proteína nativo ou que a célula é derivada de uma célula então modificada. Desta maneira, por exemplo, células recombi- nantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressa genes nativos que são de outra maneira anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de modo algum.

Os termos "recuperados", "isolados" e "separados" referem-se a um composto, proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido que é removido de pelo menos um componente com o qual ele está naturalmente associado eencontrado na natureza.

Conforme aqui usado, o termo "purificado" refere-se a um mate- rial (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado) que está em

- 46/586 um estado relativamente puro, por exemplo, cerca de pelo menos 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro ou até mesmo pelo menos cerca de 99% puro.

Os termos "termoestável" e "termoestabilidade" referem-se à ha- bilidadede uma enzima em reter atividade após exposição a uma temperatu- ra elevada.

A termoestabilidade de uma enzima, tal como uma enzima a- amilase, é medida pela sua meia-vida (t 4) dada em minutos, horas ou dias, durante a qual metade da atividade da enzima é perdida sob condições defi- nidas.

A meia-vida pode ser calculada medindo a atividade de a-amilase re- sidual seguindo exposição a (isto é, provocada por) uma temperatura eleva- da.

Uma "faixa de pH" refere-se à faixa de valores de pH onde uma enzima exibe atividade catalítica.

Conforme aqui usado, os termos "estável em pH" e "estabilidade . 15 em pH" referem-se à habilidade de uma enzima em reter atividade em uma ampla faixa de valores de pH por um período de tempo predeterminado (por " exemplo, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora e similar). Conforme aqui usado, o termo "sequência de aminoácido" é si- nônimo dos termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" e são usados in- tercomutavelmente.

Onde tal sequência de aminoácido exibir atividade, ela pode ser referida como uma "enzima". O código de uma letra ou três letras convencional para resíduos de aminoácido é usado aqui.

O termo "ácido nucleico" compreende DNA, RNA, heteroduple- xes e moléculas sintéticas capazes de codificar um polipeptídeo.

Ácidos nu- —cleicospodem ser de filamento simples ou filamento duplo e podem ser mo- dificações químicas.

Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usa- dos intercomutavelmente.

Devido ao fato do código genético ser degenera- do, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particu- lar, e as presentes composições e métodos compreendem sequências de —nucleotídeo que codificam uma sequência de aminoácido particular.

A me- nos que de outro modo indicado, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em uma orientação 5' a 3'; sequências de aminoácido são es-

. 47/586 critas da esquerda para a direta em orientação amino para carbóxi, respecti- vamente.

O termo "homólogo" refere-se a uma sequência de aminoácido ou nucleotídeo tendo um certo grau de identidade com uma sequência de aminoácido ou nucleotídeo de referência ou outra característica estrutural ou funcional comum especificada.

Uma sequência homóloga é obtida para in- cluir uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou até mesmo 99% idêntica a uma sequência objeto, usan- do ferramentas de alinhamento de sequência convencionais (por exemplo, Clustal, BLAST e similar). Tipicamente, homólogos vão incluir os mesmos resíduos de sítio ativo que a sequência de aminoácido objeto, a menos que de outra maneira especificado.

Conforme aqui usado, "hibridização" refere-se a um processo a- . 15 través do qual um filamento de base de ácido nucleico emparelha com um filamento complementar, como acontece durante as técnicas de hibridização ' de blot e técnicas de PCR.

Conforme aqui usado, uma "sequência degenerada" em um áci- do nucleico é uma onde uma pluralidade de sequências de nucleotídeo codi- ficao mesmo códon, isto é, devido à degeneração do código genético.

Se- quências degeneradas podem ser selecionadas quanto à expressão ótima de um polipeptídeo codificado em um organismo hospedeiro particular, por exemplo, como uma consequência de preferências de códon.

Conforme aqui usado, uma molécula "sintética" é produzida a- través de síntese química ou enzimática in vitro ao invés de ser produzida por um organismo.

Conforme aqui usado, os termos "transformado", "estavelmente transformado" e "transgênico" usados com referência a uma célula signifi- cam que a célula tem uma sequência de ácido nucleico não nativa (por e- xemplo, heteróloga) integrada em seu genoma ou carregada como um plas- mídeo epissomal que é mantido durante múltiplas gerações.

O termo "introduzido", no contexto de inserção de uma sequên-

- 48/586 cia de ácido nucleico em uma célula, significa "transfecção", "transformação" ou "transdução", como conhecido na técnica.

Uma "linhagem hospedeira" ou "célula hospedeira" é um orga- nismo onde um vetor de expressão, fago, vírus ou outro construto de DNA incluindo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma a-amilase variante) foi introduzido. Células hospedeiras e- xemplares são células bacterianas. O termo "célula hospedeira" inclui proto- plastos criados a partir de células, tais como aquelas de um Bacillus sp.

O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou proteina refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre natural- mente em uma célula hospedeira.

O termo "endógeno" com referência a um polinucleotídeo ou pro- teína refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

" 15 Conforme aqui usado, o termo "expressão" refere-se ao proces- so através do qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de f ácido nucleico de um gene. O processo inclui ambas a transcrição e a tradu- ção.

Um "marcador seletivo" ou "marcador selecionável" refere-se a um gene capaz de ser expresso em um hospedeiro para facilitar a seleção de células hospedeiras que carregam o gene. Exemplos de marcadores se- lecionáveis incluem, mas não estão limitados a, antimicrobianos (por exem- plo, higromicina, bleomicina ou neomicina) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional à célula hospedei- ra "Cultura" refere-se a crescimento de uma população de células microbianas sob condições adequadas em um meio líquido ou sólido. Cultu- ra inclui bioconversão fermentativa de um substrato de amido contendo ami- do granular em um produto final (tipicamente em um recipiente ou reator).

"Fermentação" é a quebra enzimática de substâncias orgânicas por micro-organismos para produzir compostos orgânicos mais simples. Em- bora a fermentação geralmente aconteça sob condições anaeróbicas, não é

- 49/586 pretendido que o termo seja limitado apenas a condições anaeróbicas estri- tas, uma vez que fermentação acontece também na presença de oxigênio.

Um "gene" refere-se a um segmento de DNA que está envolvido em produção de um polipeptídeo e inclui regiões de codificação, regiões precedendo e seguindo as regiões de codificação e sequências intervenien- tes (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (exons).

Um "vetor" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo proje- tada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de desloca- mento, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e similar.

Um "vetor de expressão" refere-se a um construto de DNA com- preendendo uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo de interes- se, o qual está operavelmente ligado a uma sequência controle adequada capaz de realizar expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais se- : 15 —quências controle podem incluir um promotor para realizar transcrição e uma sequência operadora opcional para controlar transcrição, uma sequência ' codificando sítios de ligação de ribossomo adequados no mRNA, aumenta- dores e sequências que controlam a terminação de transcrição e tradução.

Um "promotor" é uma sequência reguladora que está envolvida na ligação de polimerase de RNA para iniciar transcrição de um gene. O promotor pode ser um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Um promotor exemplar é o promotor da a-amilase de Bacillus licheniformis (Am- yL).

O termo "operaveilmente ligado" significa que componentes es- pecíficados estão em uma relação (incluindo, mas não limitado a, justaposi- ção) permitindo que eles funcionem de uma maneira pretendida. Por exem- plo, uma sequência reguladora é operavelmente ligada a uma sequência de codificação de maneira que expressão da sequência de codificação está sob controle das sequências reguladoras.

O termo "sob controle transcripcional" significa que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente uma sequência de DNA, depende dela ser operavelmente ligada a um elemento que contribui para o

- 50/586 início de ou promove transcrição.

O termo "sob controle traducional" significa que a tradução de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente uma sequência de RNA, em um polipeptídeo depende dela ser operavelmente ligada a um elemento que contribui para o início ou promove tradução.

Conforme aqui usado, "biologicamente ativo" refere-se a uma sequência tendo uma atividade biológica específica, tal como uma atividade enzimática. No caso das presentes amilases, a atividade é atividade de a- amilase.

A "dureza da água" é uma medida dos minerais (por exemplo, cálcio e magnésio) presentes em água.

"Gelatinização" refere-se à solubilização de uma molécula de amido através de cozimento para formar uma suspensão viscosa.

Conforme aqui usado, o termo "liquefação" ou "liquefazer" signi- . 15 ficaum processo através do qual amido é convertido em dextrinas de peso molecular menor (isto é, mais curtas), que são geralmente mais solúveis e Á menos viscosas do que o material de amido de partida. Este processo en- volve gelatinização de amido simultaneamente com, ou seguido pela, adição de AmyE ou uma variante da mesma.

Conforme aqui usado, o termo "liquefação primária" refere-se a uma etapa de liquefação quando a temperatura da pasta fluida é aumentada para ou próximo de sua temperatura de gelatinização. Subsequente ao au- mento da temperatura, a pasta fluida é enviada através de um trocador de calor ou jato para temperaturas de a partir de cerca de 90-150º C, por exem- plo, 100-110º C (200-300º F, por exemplo, 220-235º F). Subsequente à apli- cação a uma temperatura trocadora de calor ou de jato, a pasta fluida é mantida por um período de 3-10 minutos nesta temperatura. Esta etapa de manutenção da pasta fluida a 90-150º C (200-300º F) é chamada liquefação primária.

Conforme aqui usado, o termo "liquefação secundária" refere-se à etapa de liquefação subsequente à liquefação primária (aquecendo para 90-150º C (200-300º FP), quando a pasta fluida é deixada esfriar para tempe-

. 51/586 ratura ambiente. Esta etapa de esfriamento pode ser de 30 minutos a 180 minutos, por exemplo, 90 minutos a 120 minutos.

Conforme aqui usado, o termo "minutos de liquefação secundá- ria" refere-se ao tempo que passou do início da liquefação secundária até o momento que o DE é medido.

"Sacarificação" refere-se em geral à conversão enzimática de maltodextrinas formadas após liquefação para glicose.

O termo "grau de polimerização (DP) ("Degree of Polymerizati- on")" refere-se ao número (n) de unidades de anidroglicopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são monossacarídeos, tais como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, tais como maltose e sa- carose. Um DP > 3 significa polímeros com um grau de polimerização maior do que 3. Com relação à conversão de amido, o termo "produto final" ou : 15 "produto final desejado" refere-se a moléculas derivadas de fonte de carbono especificada, que são enzimaticamente convertidas a partir de um substrato É de milho.

Conforme aqui usado, o termo "teor de sólidos secos (ds) (Dry Solids)" refere-se aos sólidos totais em uma pasta fluida, expressos em % de pesoseco.

O termo "pasta fluida" refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

O termo "amido residual" refere-se ao amido restante (solúvel ou insolúvel) em uma composição após fermentação ou hidrólise enzimática de um substrato contendo amido.

Conforme aqui usado, "uma etapa de reciclagem" refere-se à re- ciclagem de componentes de massa, que podem incluir amido residual, en- zimas e/ou micro-organismos para substratos de fermentação incluindo ami- do.

O termo "massa" refere-se a uma mistura aquosa incluindo uma fonte de carbono fermentável (por exemplo, carboidrato), que pode ser usa- da para produzir um produto fermentado, tal como um álcool. Os termos

. 52/586 "cerveja" e "massa" podem ser usados intercomutavelmente.

O termo "estilagem" refere-se a uma mistura de sólidos não fer- mentados e água, que representa o resíduo seguindo remoção de álcool de uma massa fermentada.

Os termos "grão seco em destiladores (DDG) (Distillers dried Grain)" e "grão seco em destiladores com solúveis (DDGS) (Distillers Dried Grain with Solubles)" refere-se a um subproduto útil de fermentação de grão.

Conforme aqui usado, "micro-organismo etanologênico" refere- se a um micro-organismo com a habilidade em converter açúcar ou oligos- sacaríideo em etanol. Os micro-organismos etalonogênicos são etalonogêni- cos em virtude de sua habilidade em expressar uma ou mais enzimas que individualmente ou juntas convertem açúcar em etanol.

Conforme aqui usado, o termo "produtor de etanol" ou "micro- organismo de produção de etanol" refere-se a qualquer organismo ou célula - 15 que é capaz de produzir etanol a partir de uma hexose ou pentose. Em ge- ral, células de produção de etanol contêm uma álcool desidrogenase e uma ' piruvato descarboxilase. Exemplos de micro-organismos de produção de etanol incluem micro-organismos fúngicos tal como levedura. Uma levedura preferida inclui linhagens de Saccharomyces, particularmente S. cerevisiae. Com relação a enzimas amilases e seus substratos, o termo "contato" refere-se à colocação da enzima em proximidade suficientemente grande com o substrato para permitir que a enzima converta o substrato em um produto final. Contato pode incluir mistura. O termo "derivado de" significa "originado de", "baseado em" ou "obtido de", "obtenível de" ou "isolado de", dependendo do contexto.

O termo "conversão enzimática" refere-se em geral à modifica- ção de um substrato (por exemplo, amido) através de ação enzimática (por exemplo, amilase).

Conforme aqui usado, o termo "desintegração" refere-se à hidró- lisede polissacarídeos em uma matriz de biopelícula conectando e ligando células microbianas individuais na biopelícula, com o que as células microbi- anas podem ser liberadas e removidas da biopelícula.

. 53/586 Um "retalho" é um pedaço de material, tal como um tecido, ao qual uma sujeira pode ser aplicada para avaliar a eficiência de limpeza de uma composição.

Conforme aqui usado, o termo "atividade específica" refere-se ao número de moles de substrato convertidos em produto por uma prepara- ção de enzima por tempo unitário sob condições específicas. Atividade es- pecífica é expressa como unidades (U)/mg de proteína.

Conforme aqui usado, o termo "biologicamente ativo" refere-se a uma molécula que exibe uma função biológica pré-selecionada.

O termo "rendimento" refere-se à quantidade de produto final produzida através de um processo, por exemplo, expressa em concentração, volume, quantidade ou uma porcentagem de material de partida.

"ATCC" refere-se à American Type Culture Collection localizada em Manassas, Va. 20108 (ATCC). : 15 Conforme aqui usado, um "agente de precipitação", para propó- sitos de purificação, refere-se a um composto eficaz para precipitar um poli- - peptídeo, tal como AmyE ou uma variante da mesma, a partir da solução. À forma do precipitado pode ser, por exemplo, cristalina, amorfa ou uma mistu- ra das mesmas.

"NRRL" refere-se a Agricultural Research Service Culture Collec- tion, National Center for Agricultural Utilization Research (e antes conhecida como USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria, IL.

Conforme aqui usado, um "retalho" é um pedaço de material, tal como um tecido, ao qual uma sujeira pode ser aplicada, ou que tem uma sujeira aplicada. O material pode ser, por exemplo, tecidos feitos de algodão, poliéster ou misturas de fibras naturais e sintéticas. Alternativamente, o ma- terial pode ser papel, tal como papel filtro ou nitrocelulose, ou um pedaço de um material duro, tal como cerâmica, metal ou vidro. Sujeiras exemplares incluem sangue, leite, tinta, grama, chá, vinho, espinafre, molho, chocolate, — ovo, queijo, argila, pigmento, óleo ou suas combinações.

Conforme aqui usado, um "retalho menor" é um pedaço de reta- lho que foi cortado com um dispositivo de punção único, ou um dispositivo

. 54/586 de punção de 96 furos fabricado sob encomenda, ou equivalente, onde o padrão de punção multifuros é combinado com placas de microtitulação de 96 poços padrão ou foi de outra maneira removido do retalho. O retalho po- de ser de têxtil, papel, metal ou outro material adequado. O retalho menor pode ter sujeira afixada ou antes ou após ele ser posto no poço de uma pla- ca de microtitulação de 24, 48 ou 96 poços.

Conforme aqui usado, o termo "alimento" compreende ambos o alimento preparado e os ingredientes para um alimento, tal como farinha, que são capazes de prover um benefício a um preparador de alimento de consumidor. Ingredientes de alimento incluem formulações que podem ser adicionadas a um alimento ou gênero alimentício para os propósitos de, por exemplo, acidificação ou emulsificação. O ingrediente alimentício pode estar na forma de uma solução ou um sólido, dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

- 15 Conforme aqui usado, o termo "farinha" refere-se a produtos de grão de cereal ou Sagu ou tubérculo moíidos ou triturados que foram tritura- : dos ou amassados. Em algumas modalidades, farinha pode também conter componentes em adição ao cereal ou material de planta moído ou amassa- do, tal como um agente de fermentação. Grãos de cereal incluem trigo, avei- a centeio e cevada. Produtos de tubérculo incluem farinha de tapioca, fari- nha de mandioca e pó de custarda. Farinha também inclui farinha de milho moída, farinha de milho, farinha de arroz, farinha integral, farinha de trigo com fermento, farinha de tapioca, farinha de mandioca, arroz moído, farinha enriquecida e pó de custarda.

Conforme aqui usado, o termo "estoque" refere-se a grãos e componentes de planta que são triturados ou quebrados. Por exemplo, ce- vada usada em produto de cerveja é um grão que foi moído grosseiramente ou triturado para dar uma consistência apropriada para produção de uma massa para fermentação. Um estoque pode incluir qualquer um dos tipos de —plantase grãos acima mencionados em formas trituradas ou moídas grossei- ramente.

Conforme aqui usado, o termo "índice de desempenho (PI) (Per-

- 55/586 formance Index)" refere-se à razão de desempenho de um polipeptídeo vari- ante para um polipeptídeo parental quanto a uma característica de desem- penho especificada. Dentro deste contexto, "mutações superiores" referem- se a mutações que têm um PI > 1; "mutações neutras" referem-se a muta- ções que têm um Pl >0,5; "mutações não prejudiciais" referem-se a muta- ções que têm um PI > 0,05; e "mutações prejudiciais" referem-se a mutações que têm um PI < 0,05.

Conforme aqui usado, o termo "glicoamilase (ou polipeptídeo de glicoamilase) adicionada (ou adicional)" ou "polipeptídeo adicional tendo ati- vidade de glicoamilase" refere-se a uma enzima glicoamilase que não é o mesmo polipeptídeo que AmyE.

As formas singulares "um", "uma" e "o, a" incluem referentes no plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desta maneira, por exemplo, referência a uma "enzima" inclui uma pluralidade de tais enzi- - 15 mas e referência à "a formulação" inclui referência a uma ou mais formula- ções e seus equivalentes conhecidos daqueles versados na técnica, e assim É por diante.

As faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a fai- xa. Cabeçalhos são descritivos e não pretendem ser limitações. Toda a refe- rênciamencionada aqui é incorporada a título de referência.

1.2 Abreviações As abreviações que seguem se aplicam a menos que de ou- tro modo indicado: AE álcool! etoxilato AEO álcool etoxilato AEOS álcool! etoxissulfato AES álcoo! etoxissulfato AGU unidade de atividade de glicoamilase AKAA a-amilase de Aspergillus kawachii AmyE a-amilase de Bacillus subtilis AmyS a-amilase de Geobacillus stearothermophilus AS álcool sulfato

. 56/586 BAA a-amilase bacteriana cDNA DNA complementar CMC carboximetilcelulose DE Equivalente de Dextrose DI destilada, deionizada DNA ácido desoxirribonucleico DP3 grau de polimerização com três subunidades DPn grau de polimerização com n subunidades DS ou ds sólido seco DTMPA ácido dietiltriaminopenta-acético EC comissão de enzima para classificação de enzima EDTA ácido etilenodiaminotetra-acético EDTMPA ácido etilenodiaminotetrametileno fosfônico EO óxido de etileno é: 15 F&HC cuidados de tecido e doméstico GAU unidades de glicoamilase fá HFCS xarope de milho com alto teor de frutose HFSS xarope à base de amido com alto teor de frutose IPTG isopropil B-D-tiogalactosídeo LA ágar Luria LB caldo Luria LU Unidades de Lipase LIT resíduo leucina (L) na posição 1 é substituído com um resí- duo treonina (T), onde os aminoácidos são designados por abreviações de letra única geralmente conhecidas na técnica MW peso molecular NCBI National Center for Biotechnology Information nm nanometro NOBS nonanoiloxibenzenossulfonato NTA ácido nitrilotriacético OD densidade óptica PCR reação em cadeia da polimerase

PEG polietileno glicol pl ponto isoelétrico ppm partes por milhão PVA poli(vinil álcool) PVP poli(vinilpirrolidona) RAU Unidades Amilase de Referência RNA ácido ribonucleico SAS alcano sulfonatos secundários 1X SSC NaCl! 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M, pH 7,0 SSF sacarificação e fermentação simultâneas SSU unidade de amido solúvel, equivalente ao poder de redução de 1 mg de glicose liberado por minuto TAED tetraacetiletilenodiamina TNBS ácido trinitrobenzenossulfônico TrGA glicoamilase de Trichoderma reesei wiv peso/volume 7 ww peso/peso wt tipo selvagem ul microlitro unNm microNewton x metro

2. Polipeptídeos de AmyE

2.1 Polipeptídeos de AmyE parentais a-Amilase de AmyE refere-se uma a-amilase de ocorrência natu- ral (EC 3.2.1.1; 1,4-a-D-glicano glicanoidrolase) de B. subtilis, conforme e- xemplificado pela SEQ ID NO: 1. Polipeptídeos relacionados têm sequências de aminoácido que diferem da sequência de uma AmyE de ocorrência natu- ral, por exemplo, sequências de aminoácido que têm pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cer- ca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelo menos cerca de 99% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 1, conforme medido com o algoritmo de alinhamento de sequência BLAST com parâmetros de default matching. Outro polipeptídeo de AmyE exemplar é Amy31A tendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 (Amy31A). Amy31A é descrita em Ohdan e outros, "Characteristics of two forms of alpha-amylases and structu- ral implication", Appl. Environ. Microbiol. 65(10): 4652-58 (1999) e No. de Acesso UniProtKB/TrEMBL 082953 (SEQ ID NO: 3). Amy31A tem cerca de 86% de identidade de sequência com a AmyE de SEQ ID NO: 1, usando o algoritmo BLAST. Polipeptídeos de AmyE adicionais incluem, mas não estão limitados a, a AmyE tendo a sequência de aminoácido descrita nos Nos. de Acesso NCBI ABW75769, ABK54355, AAF14358, AATO1440, AAZ30064, NP 388186, AAQ83841 e BAA3S1528, cujos conteúdos são aqui incorpora- dos a título de referência.

A sequência de aminoácido de AmyE representativa mostrada na SEQ ID NO: 1 é aquela de uma forma madura, que não tem a sequência e 15 de sinal nativa. A forma madura de uma AmyE é referida em outro ponto como "comprimento integral de AMyE". Em geral, a forma Madura de AmyE E é a de mais interesse como uma enzima, embora possa ser desejável ex- pressar a forma imatura (com uma sequência de sinal) para realizar secre- ção a partir de uma célula hospedeira. A sequência de sinal nativa desta AmyE é de 41 resíduos de aminoácido de comprimento e é mostrada na SEQ ID NO: 9. Os 45 resíduos de aminoácido N-terminais de SEQ ID NO: 3 são a sequência de sinal de Amy31A. Um alinhamento de sequência entre AmyE (SEQ ID NO: 1) e Amy31A (sem a sequência de sinal) é mostrado na figura 1.

Polipeptídeos de AmyE podem ter uma deleção do domínio de ligação de amido C-terminal, conforme exemplificado pelo polipeptídeo de AmyE truncado tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 (AmyE- tr). Este polipeptídeo é truncado a partir do resíduo D425 (referindo à SEQ ID NO: 1). A estrutura de cristal de resolução de 2,5 À de AmyE-tr está dis- — poníveldo Protein Databank Acession No. 1BAG, que é descrita em Fujimo- to e outros (1998) "Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B. subtilis complexed with maltopentaose", J. Mol. Biol. 277:393-407.

Amy Epode ser truncada em outras posições, por exemplo, Y423, P424, D426 ou 1427 da AmyE da SEQ ID NO: 1, contanto que todo ou parte do domínio de ligação de amido C-terminal seja removido. Truncamentos simi- lares podem ser feitos para Amy31A e outros polipeptídeos de AmMyE.

2.2 Variantes de AMyE Variantes de AMyE compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido comparado com a AmyE de ocorrência natural de SEQ ID NO: 1 ou comparado com a SEQ ID NO: 2 (o polipeptídeo truncado). Desta maneira, os polipeptídeos de AmyE de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 po- dem ser referidos como "polipeptídeos parentais", "enzimas parentais" ou "sequências parentais", a partir dos quais variantes de AmyE são derivadas. Os resíduos de aminoácido que não são modificados (isto é, as sequências de aminoácido contíguas restantes) podem ser idênticos àqueles de SEQ ID NO: 1 ou 2, idênticos àqueles de SEQ ID NO: 3 ou idênticos àqueles dos - 15 Nos. de Acesso NCBI ABW75769, ABK54355, AAFI4358, AATO1440, A- AZ30064, NP 388186, AMQ83841 e BAA3S1528. Alternativamente, as se- : quências de aminoácido restantes podem ter um grau especificado de iden- tidade de sequência para uma ou mais dessas sequências conforme medido usando, por exemplo, um alinhamento BLAST das sequências de proteína com parâmetros de alinhamento default. Por exemplo, as sequências restan- tes podem ter pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou até mesmo pelomenos cerca de 99%, de identidade de sequência com a AmyE de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

Variantes de AmyE podem ter uma modificação de aminoácido única ou podem ter, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais modificações de aminoácido comparado com a sequência de aminoácido de SEQIDNO:1o0ouSEQID NO: 2. As modificações incluem substituições, in- serções, deleções ou suas combinações. Em alguns casos, as modificações são para resíduos de aminoácido que não são requeridos para função bioló-

gica. A seleção de resíduos de aminoácido a serem modificados pode ser guiada por homologia de sequência dentre as sequências de AMyE. Em ge- ral, aminoácidos que são bem conservados em sequências de AmyE são mais prováveis de ser requeridos para atividade biológica. Por outro lado, posições de aminoácido que variam entre as sequências de AMyE são me- nos prováveis de ser requeridas para atividade biológica. Por exemplo, resí- duos de aminoácido que diferem no alinhamento entre AmyE e Amy31A, mostrados em negrito na figura 1, podem ser provavelmente modificados em uma variante de AMyE sem perda de atividade biológica.

Variantes de AmyE preferidas têm pelo menos atividade de 1,4- a-D-glicano glicanoidrolase parcial, comparado com uma AmyE de ocorrên- cia natural, e pelo menos uma propriedade alterada comparado com uma AmyE de ocorrência natural. A propriedade alterada pode ser com relação à atividade específica com relação a substratos de amido, maltoeptaose e/ou . 15 maltotriose, especificidade de substrato, termoestabilidade, temperatura óti- ma, pH ótimo, faixa de pH e/ou temperatura, estabilidade oxidativa, habilida- " de em reduzir a viscosidade de uma composição de amido ou similar. Em alguns casos, a propriedade alterada de variantes de AmyE refere-se à ativi- dade específica em um substrato de farinha de milho, maltotriose, maltoep- taose particular em pH particular (por exemplo, 4 ou 5,8), estabilidade ao calor em uma temperatura particular (por exemplo, 60º C) ou desempenho de limpeza em um pH particular (por exemplo, 8 ou pH 10). A propriedade alterada pode ser caracterizada por um Índice de Desempenho (PI), onde o PI é uma razão de desempenho da variante de AMyE comparado com uma —AmyE do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o PI é maior do que cer- ca de 0,5, enquanto em outras modalidades, o PI é cerca de 1 ou é maior do que 1.

Resíduos específicos que podem ser substituídos para fornecer propriedades benéficas em uma variante de AmyE resultante incluem um ou —maisdo que segue: 1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,

59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,131,132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206,207,208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, . 15 283,284,285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, : 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359,360,361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 e 425. Modificações em qualquer uma dessas posições produz um polipeptídeo variante tendo um índice de desempenho (PI) maior do que 0,5 para expressão de proteína e um PI maior do que 1 para pelo menos uma característica que aprimore o desempenho da enzima.

Um subconjunto de resíduos que podem ser substituídos para oferecer propriedades benéficas a uma variante de AmyE resultante inclui umourmaisdo que segue: 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11, 12, 13, 14, 15,16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150,151,152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246,247,248,249,250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, . 15 329,330,331,332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, f 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406,407,408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 € 425.

Modificações em qualquer uma dessas posições produz um po- lipeptídeo variante tendo um índice de desempenho (PI) maior do que 0,5 para expressão de proteína e um PI maior do que 1,1 para pelo menos uma característica que aprimore o desempenho da enzima. Em alguns casos, uma ou mais posições são selecionadas do grupo consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59,60,61,62,63, 64,65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,

117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181,183,184,185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,258,259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, . 15 334,335,336,337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, f 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409,410,411,412,413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424 e 425, posições que são não totalmente restritivas para desempenho nem no polipeptídeo parental de comprimento integral nem no truncado.

Algumas posições foram determinadas ser não totalmente restri- tivas para desempenho no contexto do polipeptídeo parental de Amye trun- cada(istoé,1,2,3,4,5,8,18,20,23, 24,25, 27, 28, 30, 35, 44, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 54, 56, 59, 68, 73, 76, 78, 85, 88, 89, 90, 91, 106, 107, 108, 109, 112, 115, 116, 118, 119, 124, 125, 126, 127, 131, 132, 134, 142, 143, 152, 153, 156, 160, 163, 166, 167, 184, 185, 187, 188, 190, 192, 195, 199, 200, 201, 202, 203, 212, 213, 214, 218, 219, 221, 222, 223, 233, 234, 238, 240, 241,243,245,247,248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 259, 260, 274, 275, 276, 277, 282, 283, 284, 287, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 318, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 331, 333, 344, 346, 347,

349, 357, 358, 359, 367, 368, 369, 378, 380, 382, 385, 386, 388, 390, 393, 395, 400, 401, 402 e 406) e algumas posições foram determinadas ser não totalmente restritivas para desempenho no contexto do polipeptídeo parental de AmyE de comprimento integral (isto é, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,19,21,22,26,27,29, 30,31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 48, 52, 53, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155,157,158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, - 15 269,270,271,272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, i 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381,383,384,387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420,

421, 422, 423, 424,425). Em alguns casos, a modificação é uma substituição de um ou mais resíduos presentes no polipeptídeo parental por resíduos de aminoáci- dodiferentes, por exemplo: 1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 16, 1H, 1K, 1M, 1N,1Q, IR, 18, 17, IV, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 20, 2R, 28, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 38, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4M, AN, 40Q, 48, 47, AV, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, SN, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, —6E, 6H, 6K, 6L, SM, GN, 6P, 6Q, SR, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 76, 7H, 71, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 78, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K,

9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 97, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 108, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 198, 119V, 11W, 11Y, 121, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 148, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16L, 16M, 16Q, 168, 161, 16V, 17A, 17F, 171, 17M, 170, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 198, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 208, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 211, 21K, 21L, 21M, 21N, 210, 21R, 218, 21V, 221, 22M, 220, 228S,22T,22V,23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 238, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 240Q, 24R, 248, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 258, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 261, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 276, 27H, 271, 27L, 27M, 27N, 27P, 270Q, 27R, 278, . 15 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 288, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 297, Na 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30l, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 300, 30R, 30S, 30T, 3OV, 3O0W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L,32M, 320, 328, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33], 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35P, 350, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 361, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, —38N,38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 418, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 438, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 441, 44M, 44N, 44P, 44R, 448, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 451, 45L, 45M, 450, 45P,45Q, 458, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461, 46L, 46M, 46N, 460Q, 46R, 468, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 476, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 478, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E,

48F, 48H, 481, 48K, 481, 48N, 48P, 488, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 491, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 498, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 508, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51M, S1N,51P, 510, 51IR, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 528, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 5371, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 551, 55N, 55P, 550Q,55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 561, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 561, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 578, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 598, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 601, 60K, 60L, 6O0M, 6ON, 60Q, 60R, 607, : 15 60V,61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 618, 617, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 628, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, Ea 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 64L, 64M, 64N, 648, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 651, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 65S, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 66T, 66V, 66W, 66Y, 67A,67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 678, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 68L, 68M, 68N, 68P, 68R, 688, 68T, 68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 7ON, 708, 718, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 720, 728, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P,738S,73T,73V,73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 748, 74T, 74NY, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 768, 76V, 76Y, T7A, 7T7C, 77D, 77G, 77H, 771, 7T7K, 77L, 77R, 778, 77T, TTV, TAW, 77X, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 788, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 790, 79S,79T,80A, 80L, 8OM, 80W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 818, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 828, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, 83F, 831, 83L,

83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 841, 84K, 84M, 84N, 84Q, 848, 84T, 8AV, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85L, 85M, 85N, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 871, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 881, 88K, 88L, —88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 881, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 891, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 901, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 908, 90T, 90V, 90W, 291A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 910, 91R, 918, 91T, 91W, 91Y, 92L, 92N, 92T, 92V, 93A, 93C, 93D, 93E, 93F,93G, 93, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 938, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99l, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A, 102A, 102G, 1020, : 15 1028, 102W, 102Y, 103A, 103C, 1031, 103M, 103N, 103S, 103V, 104A, 104C, 1048, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, Ns 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E, 106F, 106H, 1061, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N,107P, 107Q, 107R, 1078, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 109l, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 1111, 111K, 111L, 111M, 111N,111P, 1110, 111R, 1197, 1919V, 1919W, 1119Y, 1124, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, 112Q, 112R, 1128, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 1131, 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 1130, 1138, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 1158, 115T, 115V, 115W, 115Y, 1164, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 117F, 117L, 117N, 117Q, 117V, 117W, 117Y, 118A, 118C, 118D, 118E,

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155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, 1561, 156K, 156L, 156N, 156Q, 156R, 156T, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 1571, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 1581, 158M, 158Q, 1588, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 1591, 159L, —159M, 159N, 159R, 1598, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160l, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 1608, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 161G, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 1618, 162A, 162C, 162E, 162F, 1621, 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 1638, 1637, 163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 164I, 164L, 164M, 164N, 1640, 1648, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 1658, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 166T, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K, - 15 167L, 167M, 167Q, 167R, 1678, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, ia 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 1716, 171H, 171), 171L, 171M, 171N, 1710, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P, 1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 1740, 174V, 174NY, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 1776, 177M, 177Q, 1778, 178C, 178G, 178M, 1788, 178T, 179A, 179C, 179G, 179H, 179l, 179L, 179M, 179P, 179S, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 184l, 184K, 184L, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 185S, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 1878, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881, 188K, 1881, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, —190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L, 192N, 192P, 192R, 1928, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941, 195A,

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315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 3170, 317R, 3178, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 3188, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F, 319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 319S, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320l, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 3200, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321], 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 3221, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A, 324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324l, 324K, 324L, 324M, 324N, 324P, 324Q, 324R, 3248, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251], 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 326Q, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, -. 15 328L, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 3281, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, SM 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G, 3311, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 3321], 332K, 332L, 332M, 332Q, 332R, 332S, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 3331], 333K, 333L, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F, 334G, 334H, 334I, 3341, 334M, 334N, 3340, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 336], 336K, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 3371, 337N, 337P, 337Q, 337R, 3378, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 3381, 338M, 338N, 338P, 338S, 338T, 339C, 339G, 339, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340I, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 3411, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 3421, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343], 343K, 3431, 343M, 343P, 3430, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G,

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347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 347l, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 3470Q, 347R, 3478, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 3481, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 3481, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349l, 349K, 3491, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N,

3508, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 3518, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 352], 352K, 352N, 352Q, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 3531], 353K, 353L, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T,

-. 15 355C,355D,355E, 355F, 355G, 3551, 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561, 356K, 356L, 356M,

Nm 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H, 3571, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 3578, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K,

358L, 358M, 358P, 358OQ, 358R, 358S, 3581, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359l, 359K, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 361Q, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362],

3621, 362M, 3620, 362S, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 3630, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364l, 3641, 364M, 364Q, 3648, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365], 365K, 365L, 365M, 365N, 365R, 3658, 365T, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 3661, 366M,

— 366S,366T,366V,367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 3671, 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 368|, 368K, 3681, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 3681, 368V,

368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 3691I, 369K, 369L, 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 371Q, 371S, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 372], 372L, 372M, 372N, 3720,

3728, 372T,373A, 373C, 373F, 373G, 3731], 373M, 373Q, 3738, 373], 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374l, 374L, 374M, 374N, 3748, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 3750, 3758, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376], 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 3768, 3761, 376V, 377F, 377H, 3771,

377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378l, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379l, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380I, 3801, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A,

-. 15 381G, 381l, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 382], 382K, 3821, 382M, 382N,

Ra 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F, 383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 384], 384K, 3841, 384P, 384Q, 384S, 384T,

384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 385l, 385K, 3851, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C, 386D, 386F, 386G, 386H, 3861], 3861, 386N, 386P, 386R, 386S, 3861, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871, 387L, 387N, 387Q, 3878, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 3881, 3881, 388M, 388N,

388P, 388Q, 388R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 389|, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y, 390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390l, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A,

392C,392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 3921, 392M, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L, 393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E,

394F, 394H, 394, 394K, 3941, 394M, 394N, 394P, 394Q, 394R, 394S, 3947, 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 395l, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D, —397E,397F,397G, 397H, 3971, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 3981, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 3991, 399K, 3991, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400l, 400K, 400L, 400M, 400N, 400P, 400Q, 400R, 4008, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 4018, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, | 402H, 4021, 402K, 4021, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 4031, 403M, 403N, 4030, - 15 4038, 403T,403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 4041, 4041, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, ss 405G, 405H, 4051, 405K, 405Q, 4058, 405T, 406D, 406F, 4061, 406T, 406Y, 407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 4078, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, —408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 4091, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 4101, 410K, 410Q, 4108, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 4110, 411R, 4118, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 4121, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 4128, 412T, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 4131, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 4138, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 415K, 415P, 4150, 415R, 415V, 415W, 416F, 4161, 416L, 416P, 416Q, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 4178, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D,

419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 4198, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 4201l, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 4208, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 4218, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221, 422M, 422N, 422Q, 4228, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 4230, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 4241, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 4248, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 4251, 425K, 425L,

425M, 4258, 425T, 425V, 425W e 425Y.

Em alguns casos, a modificação é uma substituição de um ou mais resíduos presentes no polipeptídeo parental por resíduos de aminoáci- do diferentes conforme exemplificado por: 1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 10, 1R,18, 11, IV, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2P, 2Q, 2R, 28, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 41, 4K, 41, 40, 48, 47, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, . 15 6H,6K,6L,6P,6Q,6S, 6V, SW, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 78, 8A, 8C, BE, 8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, -.. 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 101, 10L, 10M, 10P, 108, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 121, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 148, 14T, 14V, 15F, 16M, 160, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20M, 20R, 208, 20V,20W, 20Y, 21E, 211, 21M, 21Q, 218, 21V, 221, 227, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 238, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 248, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 258, 25T, 25V, 25W, 25Y, 261, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 271, 27L, 27P, 27Q, 27R, 278, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 281, 28K, 28L,28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 288, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 328, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 361, 36L, 36S, 36T,36Y,37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 438, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44N, 44R, 448, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45], 45L, 45M, 458, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 461, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D,

47F, 47G, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 478, 47T, 47V, 47Y, 480, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 508, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 511, 51K, 51L, 51P, 510, S51R,51S,51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, S2N, 52Q, 52R, 528, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 531, 53L, 53P, 53R, 538, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 547, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 558, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 578, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 598, 59T, 59W, 60L, GON, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 651, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 671, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 681, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72Q, 728, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, -. 15 74T,76A,76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, T7K, 77L, 77R, 77X, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, Ns 79A, 79M, 79Q, 798, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 818, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 821, 82K, 821, 82M, 82Q, 82R, 82S, 827, 82Y, 83A, 83F, 831, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 85R,85S,385T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 86L, 8S6GM, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 88G, 88H, 88K, 88L, 88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 881, 88W, 88Y, 89D, 89F, 89G, 89H, 89l, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90D, 90E, 90F, 90H, 901, 90K, 90M, 90N, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91D, 91E, 91H, 91K, 91N,910Q,91R,91S, 92L, 92V, 93A, 93D, 93G, 93M, 93N, 93R, 938, 93Y, 941, 95F, 95M, 961, 98C, 991, 100C, 100F, 100M, 100V, 103A, 103C, 103V, 104A, 1048, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105M, 105W, 105Y, 106E, 106H, 106N, 106Q, 106S, 106T, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 1076, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 1078, 1077, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109D, 109H, 109I, 109K, 109L, 109N, 109R, 109S, 109V, 109W, 109Y, 110V, 111C, 111E,

111F, 1116, 111H, 111K, 111L, 111M, 111N, 1110, 111R, 1117, 112A, 112D, 112E, 112H, 112K, 112L, 112R, 1128, 112T, 112W, 112Y, 113A, 114L, 115A, 115H, 1151, 115L, 115R, 115V, 115Y, 116A, 116F, 116G, 116H,

1161, 116L, 116N, 116Q, 116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F,

118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 1188, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 1191, 119K, 119L, 119M, 119Q, 1198, 1197, 119Y, 1218, 124A, 124K, 124Q, 124R, 1248, 124T, 125A, 125D, 125F, 125], 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 1268, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A,

128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 1288, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 1321, 132N, 1328, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421,

-. 15 142K, 142M, 1420, 142R, 1428, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 1438, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E,

sm 1516, 151H, 151K, 151L, 151M, 1510, 1518, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 1520, 152R, 1528, 152V, 152W, 152Y, 153E, 153F, 153H, 153K, 153L, 153N, 153R,

153T, 153V, 153W, 153Y, 1544, 155M, 156A, 156F, 156G, 156K, 156L, 156Q, 156R, 156V, 156Y, 157F, 157H, 158A, 1581, 158M, 1587, 158V, 159H, 1591, 159L, 159M, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160], 160K, 160L, 160M, 160Q, 1608, 160T, 160V, 1621, 162M, 163A, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 163S, 1637, 163V,

163W, 163Y, 164G, 164H, 164L, 164N, 1648, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 1651, 165L, 165M, 1657, 165V, 166C, 1661, 166M, 166V, 167A, 167C, 167E, 167F, 167G, 1671, 167K, 167L, 167M, 167Q, 167R, 1678, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 168K, 168L, 168M, 168N, 1688, 168T, 168V, 168W, 168Y, 170C, 171E, 171H, 1711, 171M, 171N, 1710,

171R, 172A, 175Y, 179A, 179C, 179G, 179H, 1798, 179W, 180M, 181V, 184D, 186E, 187E, 187F, 187H, 1871, 187K, 187M, 187Q, 187S, 187V, 187W, 188A, 188D, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188P, 188Q,

188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190H, 190K, 190Q, 190R, 190S, 192G, 192K, 192L, 192P, 1928, 192V, 195D, 195F, 195G, 195H, 195K, 195M, 195R, 195V, 195W, 196A, 196C, 196E, 196F, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 196T, 196V, 196Y, 197L, 197V, 198A, 198C, 1981,

198L,198V,199C, 199D, 199E, 199F, 199H, 199R, 1998, 199T, 199Y, 200I, 200N, 2008, 200V, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202V, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203K, 2031, 203Q, 203R, 203S, 203T, 203V, 203W, 203Y, 2041, 204M, 204W, 204Y, 205A, 205C, 2051, 205L, 205M, 205N, 205V,

207A, 209L, 209V, 211H, 211S, 211T, 212G, 212N, 213A, 213E, 213F, 213G, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 214C, 214D, 214F, 214G, 214l, 214K, 214L, 214M, 214N, 214Q, 214R, 2148, 214T, 214V, 214W, 214Y, 2171, 217Q, 217T, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T,

- 15 218V, 218W, 218Y, 219D, 219F, 219G, 219H, 219I, 219N, 219Q, 2198, 219T, 219V, 219Y, 221C, 221E, 221G, 221Q, 2218, 221V, 222F, 2227,

1 223H, 223L, 223M, 223W, 224I, 225E, 225F, 225N, 225P, 2250, 2257, 225Y, 2261, 226L, 229D, 229E, 229N, 229T, 230A, 230D, 230E, 230F, 230H,

2301l, 230K, 230M, 230Q, 230R, 230S, 230V, 230Y, 231H, 231W, 232S,

233A, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331l, 233K, 233L, 233M, 233N, 2330, 2338, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235L, 235M, 236A, 236G, 2361, 236L, 236M, 236N, 236Q, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238E,

238G, 238N, 238R, 238S, 238W, 239l, 239M, 240A, 240E, 240F, 240G, 240L, 240Q, 240R, 240T, 240V, 240Y, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241R, 2418, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242F, 2421, 242K, 242L, 2428, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243D, 243E, 243F, 2436, 243H, 243|, 243K, 243L, 243M, 2430, 243R, 2438, 243T, 243V, 243W,

243Y,244I,244M, 244V,245C, 245F, 245H, 2451, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246C, 246D, 246E, 246G, 2461, 246L, 246Q, 246W, 246Y, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 2470,

247T, 247V, 247Y, 248F, 248G, 248K, 248L, 248Q, 248R, 2488, 2487, 248V, 248W, 249A, 249C, 249F, 2491, 249M, 249V, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250l, 250K, 250L, 250M, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 251K, 251L, 251M, 251P, 251Q, 251V, 251Y,

252F, 2521, 252W, 253F, 2531, 253K, 253L, 253M, 253R, 253T, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254, 254L, 254N, 2547, 254V, 254Y, 255A, 255E, 2551, 255K, 255P, 255R, 2558, 255V, 256A, 256C, 2561, 257E, 2571, 257L, 257P, 258C, 258D, 258E, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258V, 259A, 259G, 259H, 259K, 259Q, 259R, 259S, 259T, 259W, 260A, 260C, 260D,

260F, 260H, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260Y, 261M, 2621, 263C, 263L, 263M, 2638, 263V, 264E, 264H, 2641, 2641, 264Y, 267A, 267C, 267N, 267T, 268M, 268Q, 270F, 270G, 270N, 2708, 270V, 271F, 272G, 272L, 2728, 272V, 273G, 2731, 273L, 273T, 273Y, 274F, 274G, 274H, 2741, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 2740, 274R, 2748, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275F,

-. 15 275G, 275H, 275K, 275P, 275Q, 275R, 2758, 275T, 275V, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 2760Q,

sa 276R, 2768, 276T, 276Y, 277A, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277N, 277P, 277Q, 277R, 2778, 277T, 277V, 277Y, 279H, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279Y, 280F, 280Y, 281C, 281L, 282A, 282D, 2821,

282K, 282L, 282M, 282N, 282Q, 282T, 282W, 282Y, 283C, 283G, 283H, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284l, 284K, 2841, 284N, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285E, 285M, 286C, 2861, 286M, 286V, 287A, 287C, 287E, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287Q, 2878, 287T, 287V, 288C, 2881, 288M, 288V,

—289A,290Y,291C,291G,291L, 2918, 291T, 292A, 292C, 2921, 292L, 2927, 293C, 293V, 294C, 294G, 294S, 294T, 295A, 295G, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299G, 299, 299N,

299V, 300H, 300M, 300R, 300V, 301Il, 301K, 301L, 301M, 301T, 3027, 303M, 304L, 304Y, 305T, 305V, 307C, 307N, 308C, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L, 308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V,

308W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 3120, 312R, 3128, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 3130, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F,

314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 3148, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 3178, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320l, 320K, 320L, 320M, 320P,

3200Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321], 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 3221, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 3241, 324M, 324N, 324Q, 324R, 3248, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325], 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T,

-. 15 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 3311, 331L, 331Q, 3318, 331T, 331V, 331Y, 332A,

a 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 3338, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334l, 3341, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V,

336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 3381, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 3431, 343M, 3430, 3438, 3437, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 3441], 344K, 3441, 344M,

—344N, 3440, 344R, 3448, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 3451, 345N, 3450Q, 3458, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 3461, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349,

349K, 349M, 349N, 349R, 3498, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352H, 352Q, 352T, 352Y, 353A, 353D, 353E, 353G, 353,

353K, 353L, 353M, 353Q, 353V, 353W, 353Y, 355C, 355F, 355], 355L, 355M, 355V, 355Y, 356D, 356F, 356G, 3561, 356K, 356L, 356P, 3560Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357H, 3571, 357K, 357L, 357N, 3570, 357R, 3578, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358C, 358D, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K,

358L, 358M, 3580Q, 358R, 358S, 3581, 358V, 358Y, 359D, 359E, 359H, 359L, 359M, 359P, 359Q, 359R, 359T, 359V, 359W, 360F, 360P, 360T, 361C, 361L, 361M, 361N, 361Q, 3618, 361T, 361V, 362A, 362C, 3621, 362L, 362V, 362Y, 363D, 363G, 363H, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364G, 364], 3641, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365C, 365],

365K, 365L, 365N, 365R, 365S, 365V, 366A, 366K, 367L, 367M, 367N, 367R, 3678, 367T, 367W, 367Y, 368G, 3681, 368K, 368L, 368R, 368T, 368V, 368W, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369S, 369T, 369V, 369Y, 371A, 371C, 371F, 3711, 371L, 371M, 371N, 3718, 371T, 371Y, 372A, 372C, 3721, 372L, 372N, 3728, 372T, 3/3A, 373C,

.— 15 373F, 3731, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 3741, 374M, 3748, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 3758, 3757, 3795Y,

o 376G, 3761, 3768, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 3781, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 3791l, 379K, 379L, 3790,

379T,379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 3811l, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382|, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 3831, 383P, 3830, 383V, 384A, 384G, 384H, 384], 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 3851, 385K, 385L,

385N,385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 3871, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 3881, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390], 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y,

392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 3928, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393], 393L, 3930, 3938, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394], 394K, 394L,

394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 3976, 397H, 3971, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 3991, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 4001, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 4018, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 4021, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 4031, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 4058, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407l, 407K, 407M, 407Q, 407R, 4078, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 4091, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 4118, 411Y, Le 15 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 4131, 413L, 413P, 413R, 4138, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 4140, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, fat 415G, 4151, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 4160, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 4176, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 4170, 418D, 418F, 418H, 4181, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 4191, 419L, 4198, 419T,420D,420E, 420F, 420G, 420H, 420, 420K, 420L, 420Q, 4208, 4207, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 4218, 421T, 422F, 4221, 4228, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 4240, 424R, 424V, 424Y,

425A, 425), 425K, 425L, 425V e 425Y.

Em alguns casos, as substituições são selecionadas de 052D, — 052E, 052, O52K, 052L, O52N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 0561, 056K, 056L, O56N, 056Q, O56R, O56V, 089D, 089E, 089|, 089K, 089L, O89N, 089Q, 089R, O089V, 152D, 152E, 1521], 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 2510, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 2841, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321], 321K, 321L,

321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 3281, 328K, 328L, 328N, 3280, 328R, 328V, 347D, 347E, 347l, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359], 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369], 369K, 369L, 369N, 3690, 369R, 369V, 385D, 385E, 385], 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 3911, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R e 416V, mutações que têm valores PI > 0,5 para ambas a proteína e a ativi- dade.

Substituições que mudaram o resíduo de aminoácido presente na posição 153 do polipeptídeo de AmyE parental para N, K ou F exibiram habilidade aumentada para converter substratos de maltose e maltoeptaose em glicose. Substituições que mudaram o resíduo de aminoácido presente -. 15 na posição 153 do polipeptídeo de AmyE parental para K exibiram habilidade aumentada em converter um substrato DP7 em glicose.

MEM As substituições L142F, L142G, L142Q, L1428S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q0126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131Le S254I apri- moraram o desempenho de liquefação de amido no contexto do polipeptídeo de AmyE de comprimento integral. As substituições W60L, W60M, W6ON, 1100F, V100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270Ve T279A aprimoraram o desempenho de liquefação de amido no con- texto do polipeptídeo de AmyE truncada.

Substituições como uma ou mais de posições 052D, 052E, 052], 052K,052L,O52N, 0520, 052R, 052V, O56D, 056E, 056], 056K, 056L, O56N, 056Q, O056R, O56V, O89D, 089E, 089|, 089K, 089L, O89N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152], 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 1531, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 2510, 251R,251V, 284D, 284E, 284|, 284K, 2841, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308], 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 3211, 321K, 321L, 321N,

321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 3281, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 3471, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 3571, 357K, 357L, 357N, 3570, 357R, 357V, 359D, 359E, 359, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369|, 369K, 3691, 369N, 3690, 369R, 369V, 385D, 385E, 385], 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388], 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R e 416V têm valores de PI >0,5 para ambas a proteína e a atividade e são es- peradas ser combináveis para realização de várias propriedades de polipep- tídeos de AmyE. Embora muitas posições dos polipeptíideos de AMyE possam ser mutadas, as posições 75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266 e 306 de polipeptídeos de AmyE eram restritivas, no sentido que mutações nessas o 15 posições geralmente diminuem o desempenho. Em particular, as posições 75 e 123 foram determinadas ser totalmente restritivas para desempenho em Ns uma versão truncada do polipeptídeo parental, enquanto as posições 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 e 306 foram determinadas ser totalmente restritivas para desempenho em uma versão de comprimento integral do po- lipeptídeo parental. Notar que embora muitas mutações sejam listadas no contexto de grupos e subgrupos grandes, cada mutação é uma entidade separada e qualquer uma ou mais das mutações identificadas podem ser incluídas ou excluídas de um subgrupo adicional de mutações. Desta maneira, a compo- siçãoeos métodos incluem variantes de AmyE tendo qualquer uma ou mais variantes descritas aqui ou suas combinações.

3. Produção de Polipeptídeos de AmyE Uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo de AmyE pode ser expressa, em forma de enzima, usando um vetor de expressão que inclui tipicamente sequências controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de início de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

Vetores compreendendo os ácidos nucleicos codificando AmyE ou suas variantes são também providos. Células hospedeiras compreenden- do os vetores são providas. A célula hospedeira pode expressar o polinucle- otídeo codificando a variante de AMyE. O hospedeiro pode ser um Bacillus sp, por exemplo, B. subtilis.

3.1 Polinucleotídeos e Vetores Aspectos das presentes composições e métodos incluem polinu- cleotídeos codificando polipeptídeos de AmyE, bem como vetores e células hospedeiras úteis para expressão de polipeptídeos de AMyE com base em tais polinucleotídeos. Ácidos nucleicos codificando polipeptídeos de AmyE incluem os, mas não estão limitados aos, polinucleotídeos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, que codificam a AMmyE de SEQ ID NO: 1 e AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), respectivamente, e suas variantes. Polinucleotídeos representati- vos adicionais incluem aqueles de SEQ ID NO: 7, que codificam Amy31A - 15 (SEQIDNO: 3). A AmyE descrita nos Nos. de Acesso NCBI ABK54355, AAF14358, AATO1440, AAZ30064, NP 388186, AMQ83841 e BAA3S1528 - são similarmente codificadas por polinucleotídeos descritos em bancos de dados publicamente acessíveis, sequências que são incorporadas aqui a título de referência. Ácidos nucleicos podem ser sequências de DNA, mRNA ou cDNA. Ácidos nucleicos podem ainda incluir sequências degeneradas correspondendo a qualquer um dos ácidos nucleicos mencionados acima. Sequências degeneradas podem ser projetadas para expressão ótima atra- vés do uso de códons preferidos por um organismo hospedeiro particular. Vetor de expressão recombinante carregando sequência de —DNA codificando polipeptídeos de AmyE (incluindo variantes) pode ser qual- quer vetor que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinantes, e a escolha do vetor vai frequentemente depender da célula hospedeira na qual ele deve ser introduzido. Desta maneira, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, cuja replicação é independente de replica- ção cromossomal, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um ele- mento extracromossomal, minicromossomo ou um cromossomo artificial.

Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma cé- lula hospedeira, é integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) onde ele foi integrado. O gene integrado pode também ser amplificado para criar cópias múltiplas do gene no cromossomo através do uso de um construto amplificável direcionado por seleção de anti- biótico ou outra pressão seletiva, tal como um gene regulador essencial ou através de complementação de um gene de curso metabólico essencial. Um vetor de expressão vai tipicamente incluir os componentes de um vetor de clonagem, por exemplo, um elemento que permite replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção. O vetor de expressão compreende normalmente sequências de nucleotídeo controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de início de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais ge- ro 15 nes ativadores. Em um aspecto, todas as sequências de sinal usadas dire- cionam o material para o meio de cultura celular para coleta de enzima mais Na fácil e opcionalmente purificação. Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA codificando uma AmyE ou sua variante, o promotor, termi- nador e outros elementos, respectivamente, e inseri-los em vetores adequa- dos contendoa informação necessária para replicação, são bem conheci- dos dos versados na técnica (vide, por exemplo, Sambrook e outros, MO- LECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2º ed., Cold Spring Har- bor, 1989 e 3º ed., 2001).

No vetor, a sequência de DNA deve ser operavelmente conecta- daa uma sequência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostre atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha e possa ser derivada de genes codificando proteínas ou homólo- gas ou heterólogas para a célula hospedeira. Promotores adequados para direcionamento da transcrição da sequência de DNA codificando uma AmyE ou variantedamesma, especialmente em um hospedeiro bacteriano, inclu- em vários promotores derivados de Bacillus, tal como um promotor de a- amilase derivada de B. subtilis, B. licheniformis, B. stearothermophilus ou B.

amyloliquefaciens, o promotor do operon lac de E. coli, os promotores do gene dagA ou CelA da agarase de Streptomyces coelicolor e os promotores dos genes xylA e xy/lB de Bacillus subtilis, etc. Para transcrição em hospe- deiro fúngico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, a-amilase neutra de Aspergillus niger, a-amilase estável ácida de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ou ace- tamidase de A. nidulans. Quando o gene codificando a AmyE ou sua varian- teé expresso em uma espécie bacteriana tal como, por exemplo, E. coli, um promotor adequado pode ser selecionado, por exemplo, de um promotor de bacteriófago incluindo um promotor T7 e um promotor de fago lambda. E- xemplos de promotores adequados para a expressão em uma espécie de levedura incluem, mas não estão limitados a, os promotores Gal 1 e Gal 10 ro 15 de Saccharomyces cerevisiae e os promotores AOX1 e AOX2 de Pichia pas- toris.

Ao O vetor de expressão pode também compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariontes, sequências de poliadenilação operavelmente conectadas à sequência de DNA codificando a variante de a- amilase. Sequências de terminação e poliadenilação podem ser adequada- mente derivadas das mesmas fontes que o promotor. O vetor pode compre- ender ainda uma sequência de DNA que permite que o vetor replique na cé- lula hospedeira em questão. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, puB110, pE194 pAMB1, pl- CatHeplJ702.

O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hos- pedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um gene que confere resistência a antibiótico, por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Ainda, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus tais como amdsS, argB, niaD e xxsC, um marcador dando origem à resistência à higromicina, ou a seleção pode ser realizada através de cotransformção como conhecido na técnica. Vide, por exemplo, WO 91/17243.

3.2 Expressão de Polipeptídeo de AmyE e Organismos Hos- pedeiros É geralmente vantajoso se o polipeptídeo de AmyE for secretado no meio de cultura, quando expresso em uma célula hospedeira. Para esta finalidade, o polipeptíideo de AmyE pode compreender uma sequência de sinal que permite secreção da enzima expressa no meio de cultura. A se- quência de sinal pode ser codificada pelo mesmo gene que AmyE. Por e- xemplo, a AmyE mostrada na SEQ ID NO: 1 é expressa naturalmente com uma sequência de sinal e aminoácidos N-terminais adicionais tendo a se- quência MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE (SEQ ID NO: 9). A sequência de sinal pode ser alternativamente uma sequência de sinal de B. subtilis sp., de uma AmyE diferente ou até mesmo uma proteí- . 15 nadiferente. Ainda, a sequência de sinal pode ser de uma espécie diferente, por exemplo, B. licheniformis. A sequência de sinal pode ser escolhida para e. prover expressão ótima da AmyE ou sua variante em uma célula hospedeira particular, por exemplo. A AMyE madura pode ser produzida como um resul- tado de clivagem proteolítica de sequências adicionais do terminal N que não são sequências de sinal. Por exemplo, uma sequência de sinal de 31 resíduos de aminoácido de B. licheniformis ("sequência líder LAT") pode ser fundida em estrutura com uma sequência de AmyE. Por exemplo, um ácido nucleico codificando AmyE é operavelmente ligado a uma sequência de sinal de B. licheniformis no vetor de expressão mostrado na figura 2.

Uma célula isolada, ou compreendendo um construto de DNA ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedei- ra na produção recombinante de uma AmyE ou sua variante. A célula pode ser transformada com o construto de DNA codificando a AmMyE ou sua vari- ante, opcionalmente através da integração do construto de DNA (em uma ou mais cópias)no cromossomo do hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem uma vez que a sequência de DNA é mais provável de ser estavelmente mantida na célula. Integração dos construtos de DNA no cromossomo do hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme acima descrito em conexão com os tipos dife- rentes de células hospedeiras.

Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequados são espécies bacterianas Gram positivas, tais como Bacillaceae, incluindo B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alka- lophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. lautus, B. megaterium e B.

thuringiensis, Streptomyces spp., tal como S. murinus; espécie bacteriana do ácido láctico incluindo Lacfococcus spp., tal como L. lactis; Lactobacillus spp., incluindo L. reuteri, Leuconostoc spp.; Pediococcus spp.; e Streptococ- cus spp. Ainda outros hospedeiros úteis incluem Bacillus spp. A 7-7, por exemplo. Alternativamente, linhagens de uma espécie bacteriana Gram ne- -. 15 gativa pertencentes a Enterobacteriaceae, incluindo E. coli, ou a Pseudomo- nadaceae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.

TA Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser sele- cionado de espécies de leveduras biotecnologicamente relevantes, tais co- mo, mas não limitado a, Pichia spp., Hansenula spp., Kluyveromyces sSpp., Yarrowinia spp., Saccharomyces Spp., incluindo S. cerevisiae ou uma espé- cie pertencente a Schizosaccharomyces, tal como S. pombe. Uma linhagem da espécie de levedura metilotrófica Pichia pastoris pode ser usada como o organismo hospedeiro. Alternativamente, o organismo hospedeiro pode ser uma Hansenula spp. Organismos hospedeiros adequados dentre os fungos filamentosos incluem espécies de Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. ory- zae, A. tubigensis, A. awamori ou A. nidulans. Alternativamente, uma linha- gem de Fusarium Spp., por exemplo, Fusarium oxysporum ou Rhizomucor Spp., tal como R. miehei, pode ser usada como o organismo hospedeiro. Ou- tras leveduras adequadas incluem Thermomyces spp. e Mucor spp. Células fúngicas podem ser transformadas através de um processo envolvendo for- mação de protoplasto e transformação dos protoplastos seguido por regene- ração da parede celular de uma maneira conhecida na técnica. Um procedi-

mento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus, por exemplo, é descrito na EP 238023.

Um aspecto das presentes composições e métodos é um méto- do de produção de uma variante de AMyE, método que compreende cultivo de uma célula hospedeira conforme acima descrito sob condições que con- duzem à produção da variante e recuperação da variante a partir das células e/ou meio de cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qual- quer meio convencional adequado para cultivo da célula hospedeira em questão e obtenção de expressão da variante de AmyE. Meios e componen- tes do meio adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas, por exemplo, conforme descrito nos catálogos do American Type Cultura Collection (ATCC). Meios de cultura exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles para fermentações em batelada realizadas em um fermentador de o 15 tanque agitado de três mil litros (3.000 L). O meio de crescimento neste caso pode consistir em sólidos de restos de milho e farinha de soja como fontes tr de compostos orgânicos, junto com sais inorgânicos como uma fonte de só- dio, potássio, fosfato, magnésio e sulfato, bem como elementos traços. Tipi- camente, uma fonte de carboidrato tal como glicose é também parte do meio inicial Uma vez a cultura tendo se estabelecido e começado a crescer, o carboidrato é medido no tanque para manter a cultura como é conhecido na técnica. Amostras são removidas do fermentador em intervalos regulares para medir título de enzima usando, por exemplo, um método de ensaio co- lorimétrico. O processo de fermentação é parado quando a taxa de produção deenzima parade aumentar de acordo com as medições.

Um polipeptídeo de AmyE secretado das células hospedeiras pode ser convenientemente recuperado do meio de cultura através de pro- cedimentos bem conhecidos, incluindo separação das células do meio atra- vés de centrifugação ou filtragem e precipitação de componentes proteiná- —ceosdo meio por meio de um sal tal como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos tais como cromatografia de troca de íon, cromatografia de afinidade ou similar.

As células hospedeiras podem ser culturadas sob condições a- dequadas que permitam a expressão dos polipeptídeos de AMyE. Expressão das proteínas pode ser constitutiva de maneira que elas sejam continuamen- te produzidas, ou induzíveis, requerendo um estímulo para iniciar expressão.

No caso de expressão induzível, produção de proteína pode ser iniciada quando requerido através da adição de uma substância indutora, por exem- plo, dexametasona, IPTG ou Sepharose, ao meio de cultura, por exemplo. Polipeptídeos podem ser também produzidos recombinantemente em um sistema livre de célula in vitro, tal como o sistema de reticulócito de coelho TNTº (Promega).

Um hospedeiro para expressão de um polipeptídeo de AmyE pode ser culturado sob condições aeróbicas no meio apropriado para o hos- pedeiro. Agitação ou uma combinação de agitação e aeração pode ser pro- vida, com a produção acontecendo na temperatura apropriada para este ES 15 hospedeiro, por exemplo, de a partir de cerca de 30º C a cerca de 75º C, dependendo das necessidades do hospedeiro e da produção da variante de sa a-amilase desejada. A cultura pode acontecer de a partir de cerca de 12 a cerca de 100 horas ou mais (e qualquer valor de hora entre eles) ou mais particularmente de a partir de 24 a 72 horas. Tipicamente, o caldo de cultura estáem um pH de cerca de 5,5 a cerca de 8,0, novamente dependendo das condições de cultura necessárias para a célula hospedeira com relação à produção da variante de AmyE.

A atividade amilolítica da enzima expressa pode ser determinada usando, por exemplo, amido de batata como substrato. Este método é base- adona quebra de amido de batata modificado pela enzima, e a reação é se- guida por mistura de amostras da solução de amido/enzima com uma solu- ção de iodo. Inicialmente, uma cor azul fechando para preto é formada, mas durante a quebra do amido a cor azul fica mais fraca e gradualmente se transforma em um marrom avermelhado, que é comparado com um padrão devidro colorido.

Polipeptídeos de AMyE podem ser expressos como uma profteí- na de fusão que compreende sequências no terminal N e/ou C da forma ma-

dura de AmyE que facilita expressão, detecção e/ou purificação, por exem- plo, uma sequência de sinal ou um His-tag. Tal sequência inclui uma se- quência de sinal que facilita a secreção e a expressão da AMyE em um or- ganismo hospedeiro. Resíduos de aminoácido adicionais podem ser clivados doterminal Nde uma AmyE, seguindo clivagem da sequência de sinal, con- forme discutido em Yang e outros, "Nucleotide sequence of the amylase ge- ne from Bacillus subtilis", Nucleic Acids Res. 11: 237-49 (1983).

4. Purificação de polipeptídeos de AmyE Em alguns casos, métodos convencionais podem ser usados a fim de preparar um polipeptídeo de AmyE purificado. Após crescimento de um organismo em cultura, um caldo de crescimento (ou "fermentação") é obtido, e as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo maté- rias-primas de fermentação residuais, são removidos através de técnicas de separação convencionais para obter uma solução de amilase. Filtragem, Fa 15 centrifugação, microfiltragem, filtragem em tambor a vácuo giratório, seguido por ultrafiltragem, extração ou cromatografia ou similar são geralmente usa- ne dos.

É geralmente desejável concentrar a solução contendo a AmyE expressa ou suas variantes para otimizar recuperação, uma vez que o uso de soluções não concentradas requer tempo de incubação maior para cole- tar precipitados contendo a enzima purificada. A solução é concentrada u- sando técnicas convencionais até que o nível de enzima desejado seja obti- do. A concentração da solução contendo enzima pode ser conseguida atra- vés de qualquer uma das técnicas discutidas acima. Em uma modalidade, evaporação a vácuo giratória e/ou ultrafiltragem é usada. Alternativamente, ultrafiltragem pode ser usada.

Precipitação pode ser realizada usando, por exemplo, um agente de precipitação de haleto de metal. Agentes de precipitação de haleto de metal incluem: cloretos de metal alcalino, brometos de metal alcalino e mis- turas de dois ou mais desses haletos de metal. O haleto de metal pode ser selecionado do grupo consistindo em cloreto de sódio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e misturas de dois ou mais desses haletos de metal.

Haletos de metal adequados incluem cloreto de sódio e cloreto de potássio, particularmente cloreto de sódio, que pode ser usado ainda como um preservativo.

A seleção de condições da precipitação para recuperação máxima, incluindo tempo de incubação, pH, temperatura e con- centraçãode AmyE ou sua variante, será prontamente aparente a um versa- do comum na técnica após teste de rotina.

Em geral, pelo menos cerca de 5% p/v (peso/volume) a cerca de 25% p/v de haleto de metal são adicionados à solução variante de enzima concentrada e geralmente pelo menos 8% p/v.

Em geral, não mais do que cerca de 25% p/v de haleto de metal são adicionados à solução variante de enzima concentrada e geralmente não mais do que cerca de 20% pfv.

À concentração ótima do agente de precipitação de haleto de metal vai depen- der, dentre outros, da natureza da AmMyE específica ou variante da mesma e de sua concentração em solução. o 15 Uma alternativa para realizar precipitação da enzima é uso de compostos orgânicos, que podem ser adicionados à solução de variante de NE enzima concentrada.

O agente de precipitação de composto orgânico pode incluir: ácido 4-hidroxibenzoico, sais de metal alcalino de ácido 4- hidroxibenzoico, alquil ésteres de ácido 4-hidroxibenzoico e misturas de dois oumaisdesses compostos orgânicos.

A adição dos ditos agentes de precipi- tação de composto orgânico pode acontecer antes da, simultaneamente com ou subsequente à adição do agente de precipitação de haleto de metal e a adição de ambos os agentes de precipitação, composto orgânico e haleto de metal pode ser realizada sequencialmente ou simultaneamente.

Quanto aos relatórios vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 5.281.526 para Danisco A/S, por exemplo.

Em geral, os agentes de precipitação de composto orgânico são selecionados do grupo consistindo em sais de metal alcalino de ácido 4- hidrozibenzoico, tais como sais de sódio ou potássio, e alquil ésteres linea- res ouramiíficados de ácido 4-hidroxibenzoico, onde o grupo alquila contém de a partir de 1 a 12 átomos de carbono e misturas de dois ou mais desses compostos orgânicos.

Os agentes de precipitação de composto orgânico podem ser, por exemplo, alquil ésteres lineares ou ramificados de ácido 4- hidroxibenzoico, onde o grupo alquila contém de a partir de 1 a 10 átomos de carbono, e misturas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Com- postos orgânicos adequados incluem alquil ésteres lineares de ácido 4- hidroxibenzoico, onde o grupo alquila contém de a partir de 1 a 6 átomos de carbono e misturas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Metil éste- res de ácido 4-hidroxibenzoico, propil éster de ácido 4-hidroxibenzoico, butil éster de ácido 4-hidroxibenzoico, etil éster de ácido 4-hidroxibenzoico e mis- turas de dois ou mais desses compostos orgânicos podem ser também usa- dos. Compostos orgânicos adicionais incluem também, mas não estão limi- tados a, metil éster do ácido 4-hidroxibenzoico (metil PARABENO) e propil éster do ácido 4-hidroxibenzoico (propil PARABENO), que são também a- gentes de preservação de amilase. Adição de tal agente de precipitação de composto orgânico provê a vantagem de alta flexibilidade das condições de es 15 precipitação com relação a pH, temperatura, concentração de enzima, con- centração de agente de precipitação e tempo de incubação. Em geral, pelo Lua menos 0,01% p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicio- nado à solução variante de enzima concentrada e geralmente pelo menos 0,02% p/v. Em geral, não mais do que 0,3% p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicionado à solução variante de enzima concen- trada e geralmente não mais do que 0,2% pv.

A solução de enzima concentrada, contendo o agente de precipi- tação de haleto de metal e, em um aspecto, o agente de precipitação de composto orgânico, é ajustada para um pH que vai depender necessaria- —menteda variante de enzima a ser purificada. Em geral, o pH é ajustado pa- ra um nível próximo ao ponto isoelétrico (pl) da amilase. Por exemplo, o pH pode ser ajustado dentro de uma faixa de cerca de 2,5 unidades de pH abai- xo do pl a cerca de 2,5 unidades de pH abaixo do pl. O pH pode ser ajusta- do consequentemente se o pl da variante diferir do pl do tipo selvagem.

O tempo de incubação necessário para obter um precipitado de enzima purificado depende da natureza da enzima específica, da concentra- ção de enzima e do(s) agente(s) de precipitação específico(s) e sua(s) con-

centração(ões). Em geral, o tempo eficaz para precipitar a variante de enzi- ma está entre cerca de 1 a cerca de 30 horas; geralmente, ele não excede cerca de 25 horas. Na presença do agente de precipitação de composto or- gânico, o tempo de incubação pode ainda ser reduzido para menos do que cerca de 10 horas e na maioria dos casos mesmo até mesmo cerca de 6 horas.

Em geral, a temperatura durante a incubação está entre cerca de 4º C e cerca de 50º C. Geralmente, o método é realizado em uma tempe- ratura entre cerca de 10º C e cerca de 45º C e particularmente entre cerca de20ºC e cerca de 40º C. A temperatura ótima para indução de precipita- ção varia de acordo com as condições da solução e da enzima ou agente(s) de precipitação usado(s).

A recuperação geral de precipitado de enzima purificado e a efi- ciência com a qual o processo é conduzido são aprimoradas agitando a so- lução compreendendo a enzima, o haleto de metal adicionado e o composto orgânico adicionado. A etapa de agitação é feita ambos durante a adição do in haleto de metal e do composto orgânico e durante o subsequente período de incubação. Métodos de agitação adequados incluem movimento mecânico ou agitação, aeração vigorosa ou qualquer técnica similar.

A enzima purificada pode ser purificada mais através de técnicas de separação convencionais, tal como filtragem, centrifugação, microfiltra- gem, filtragem a vácuo giratória, ultrafiltragem, filtragem em prensa, microfil- tragem em membrana cruzada, microfiltragem em membrana de fluxo cru- zado ou similar. Microfiltragem em membrana cruzada pode ser um método usado. Purificação adicional do precipitado de enzima purificado pode ser obtida lavando o precipitado com água. Por exemplo, o precipitado de enzi- ma purificado pode ser lavado com água contendo o agente de precipitação de haleto de metal, por exemplo, com água contendo o haleto de metal e os agentes de precipitação de composto orgânico.

Durante a cultura, a enzima expressa pode acumular no caldo de cultura. Para o isolamento e a purificação da enzima expressa, o caldo de cultura pode ser centrifugado ou filtrado para eliminar células, e o líquido isento de célula resultante pode ser usado para a purificação da enzima. Em uma modalidade, o caldo isento de célula é submetido à salinização usando sulfato de amônio em cerca de 70% de saturação: a fração de precipitação de 70% de saturação é então dissolvida em um tampão e aplicada a uma colunatal como uma coluna Sephadex G-100 e eluída para recuperar a fra- ção ativa da enzima. Para purificação adicional, um procedimento conven- cional tal como cromatografia de troca de íon pode ser usado. Enzimas purificadas são úteis para todas as aplicações onde as enzimas são geralmente utilizadas. Por exemplo, elas podem ser usadas em detergentes de lavanderia e removedores de mancha, na indústria alimentí- cia, em processamento de amido e assado e em composições farmacêuticas como auxiliares digestivos. Elas podem ser feitas em um produto final que é ou líquido (solução, pasta fluida) ou sólido (granular, pó). Alternativamente, o produto de enzima pode ser recuperado e : 15 um agente de floculação é adicionado ao meio a fim de remover células e i restos de célula através de filtragem ou centrifugação sem purificação adi- —. cional da enzima. Polipeptídeos de AmyE produzidos e purificados através dos métodos descritos acima podem ser usados em uma variedade de aplica- ções industriais úteis. As enzimas possuem propriedades valiosas que facili- tam aplicações relacionadas a cuidado de tecido e doméstico (F&HC). Por exemplo, polipeptídeos de AMyE podem ser usados como um componente em composições detergentes de lavanderia, lavagem de louça e limpeza de superfície dura. Polipeptídeos de AmyE são também úteis na produção de adoçantes e etanol a partir de milho e/ou para retirada de sujeira de têxtil. Polipeptídeos de AmyE são particularmente úteis em processos de conver- são de amido, incluindo processos de liquefação e/ou sacarificação de ami- do, conforme descrito, por exemplo, no WO 2005/111203 e no Pedido U.S. Publicado No. 2006/0014265 (Danisco A/S). Esses usos de polipeptídeos de —AmyE são descritos em mais detalhes abaixo.

5. Composições e Métodos de Uso de Polipeptídeos de AMmyE

5.1. Composições e Métodos de Processamento de Amido

5.1.1 Visão geral Polipeptídeos de AMyE podem ser utilizados para processamen- to/conversão de amido, que é central para a produção de adoçantes, produ- ção de álcool para combustível ou bebida (isto é, álcool potável), produção deuma bebida, processamento de cana-de-açúcar ou produção de compos- tos orgânicos desejados, por exemplo, ácido cítrico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico, cetonas, aminoácidos, antibióticos, enzimas, vitami- nas, hormônios e similar. Conversão de amido geralmente envolve a hidróli- se de uma pasta fluida de amido gelatinizado ou granular em um hidrolisato de amido solúvel. Conversão de amido convencional envolve três processos enzimáticos consecutivos: um processo de liquefação, um processo de saca- rificação e um processo adicional para produzir um produto desejado a partir de glicose. Dependendo do produto desejado, o processo adicional pode ser isomerização, fermentação e similar. No processo de conversão de amido o 15 emxarope de frutose, o processo adicional é isomerização.

5.1.2. Composições de amido : O amido a ser processado pode ser obtido a partir de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais ou grão integral. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido a partir de milhos, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. Especialmente compreendidos são ambos os tipos cero- so e não-ceroso de milho e cevada. O amido pode ser uma qualidade de amido altamente refinado, por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5%, puro. Alternativamente, o amido po- de serum amido mais cru contendo material compreendendo grão integral moído, incluindo frações não amido tais como resíduos de germe e fibras. A matéria-prima, tal como grão integral, é moída para abrir a estrutura e permi- tir processamento adicional. Dois processos de moagem são adequados: moagem a úmido e aseco (trituraçãoa seco). Em moagem a seco, o núcleo todo é moído e u- sado. Grão moído a seco pode incluir quantidades significantes de compos- tos carboidrato não amido, em adição a amido. Quando tal material hetero-

gêneo é processado através de cozimento a jato, frequentemente apenas uma gelatinização parcial do amido é obtida. Moagem a úmido dá uma boa separação de germe e farinha (grânulos de amido e proteína) e é geralmente usada na produção de xaropes. O processo pode ser conduzido em um sis- tema de ultrafltragem onde o retentato é mantido sob recirculação na pre- sença de enzimas, amido cru e água, onde o permeato é o hidrolisato de amido solúvel. O processo pode ser conduzido também em um reator de membrana contínuo com membranas de ultrafiltragem, onde o retentato é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido cru e água, e onde opermeatoé o hidrolisato de amido solúvel. O processo pode ser conduzido ainda em um reator de membrana contínua com membranas de microfiltra- gem e onde o retentato é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido cru e água, e onde o permeato é o hidrolisato de amido solúvel. A pasta fluida de amido a ser usada em qualquer um dos aspec- - 15 tos acima pode ter cerca de 20% a cerca de 55% de amido granular de sóli- dos secos, cerca de 25% a cerca de 40% de amido granular de sólidos se- ] Cos ou cerca de 30% a cerca de 35% de amido granular de sólidos secos. À variante de enzima converte o amido solúvel em um hidrolisato de amido solúvel do amido granular na quantidade de pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

5.1.3 Liquefação e sacarificação Durante a etapa de liquefação, moléculas de amido de cadeia longa presentes na pasta fluida de amido são degradadas em moléculas ra- mificadas e lineares mais curtas (maltodextrinas) por uma a-amilase. Várias a-amilases estão comercialmente disponíveis, incluindo SPEZYMES Xtra (Genencor) e LIQOZYMEº (Novozymes). O processo de liquefação é geralmente realizado em cerca de 105-110º C por cerca de 5 a 10 minutos seguido por 1-2 horas a 95º C. O pH de liquefação está tipicamente entre cerca de 5,0 e cerca de 6,2 e geralmen-

te acima de 5,5. Para promover estabilidade de a-amilase sob essas condi- ções, 1 mM de cálcio é tipicamente adicionado (íons de cálcio livres 40 ppm). Seguindo este tratamento, a composição de amido liquefeita vai con- ter muitas dextrinas e terá um "equivalente de dextrose" (DE) de cerca de 10-15.

Seguindo o processo de liquefação, as dextrinas são tipicamente convertidas, em uma etapa de sacarificação separada, em dextrose, através da adição de uma glicoamilase (por exemplo, AMGº. Uma enzima de des- ramificação, tal como uma isoamilase ou uma pululanase (por exemplo, PROMOZYMES9), pode ser também adicionada. Para preparar a etapa de sacarificação, o pH da pasta fluida é tipicamente reduzido para um valor a- baixo de 4,5, enquanto mantendo a temperatura em 95º C ou mais, de ma- neira que a a-amilase de liquefação é desnaturada. A temperatura é então diminuída para cerca de 60º C e a glicoamilase e a enzima de desramifica- ' 15 ção são adicionadas para realizar a produção de glicose a partir de dextri- nas. O processo de sacarificação prossegue tipicamente por cerca de 24 a ' cerca de 72 horas.

5.1.4 Processamento adicional de glicose produzida através de sacari- ficação Após o processo de sacarificação, o xarope de dextrose pode ser convertido em xarope com alto teor de frutose usando uma glicose iso- merase imobilizada (tal como SWEETZYMES9), por exemplo. Em um aspec- to, o hidrolisato de amido solúvel do processo é submetido à conversão em xarope baseado em amido com alto teor de frutose (HFSS), tal como xarope de milho com alto teor de frutose (HFCS). Esta conversão pode ser conse- guida usando uma glicose isomerase, particularmente uma glicose isomera- se imobilizada em um suporte sólido. Isomerases compreendidas incluíam os produtos comerciais SWEETZYMES, IT (Novozymes A/S); G-ZYMEºIMGI e G-ZYME? G993, KETOMAXº, G-ZYMEº G993, G-ZYMEº G993 líquido e —“GENSWEETº IGI. Enquanto Ca?* aumenta a estabilidade de a-amilases convencionais, ele inibe fortemente a atividade de glicose isomerase. Desta maneira, Ca?* é tipicamente removido antes da isomerização, por exemplo,

através de troca de fon, de maneira que o nível de Ca?* esteja abaixo de 3-5 ppm.

Este processo consome tempo e é caro.

Alternativamente, glicose produzida através de sacarificação é usada para fermentação para produzir um produto de fermentação, por e- xemplo, etanol, butanol e outro composto descrito aqui e conhecido na técni- ca.

Um processo completo típico para produção de etanol a partir de material contendo amido através de fermentação compreende: (i) liquefação do mate- rial contendo amido com uma AmyE ou variante da mesma; (ii) sacarificação da massa liquefeita obtida; e (iii) fermentação do material obtido na etapa (ii) na presença de um organismo de fermentação.

Opcionalmente o processo compreende ainda recuperação do etanol.

Durante a fermentação, o teor de etanol atinge pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo me- nos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10% tal como pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cer- ' 15 cade 14%, pelo menos 15% ou pelo menos 16% de etanol.

Os processos de sacarificação e fermentação podem ser reali- Á zados como um processo de sacarificação e fermentação (SSF) simultâneo.

Quando a fermentação é realizada simultaneamente com a hidrólise, a tem- peratura pode estar entre 30º C e 35º C, particularmente entre 31º C e 34º CO processo pode ser conduzido em um sistema de ultrafiltragem, onde o retentato é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido cru, levedura, nutrientes de levedura e água e onde o permeato é um líquido con- tendo etanol.

Também é compreendido o processo conduzido em um reator de membrana contínua com membranas de ultrafiltragem e onde o retentato é mantido sob recirculação na presença de enzimas, amido cru, levedura, nutrientes de levedura e água e onde o permeato é um líquido contendo eta- nol.

Glicose produzida através de sacarificação pode ser também usada para produção de um produto de fermentação tal como etanol, buta- —nol, ácido cítrico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de só- dio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona ou eri- torbato de sódio.

5.1.5. Vantagens de a-amilase AmyE Polipeptídeos de AmyE oferecem várias vantagens quando usa- dos em hidrólise de amido, que as distinguem de outras a-amilases e permi- tem a otimização de métodos de hidrólise de amido. Primeiro, dextrinas po- dem ser convertidas em dextrose por polipeptídeos de AmyE sob as mes- mas condições de reação que são adequadas para glicoamilase. Isto obvia a necessidade de otimizar o pH e a temperatura de mistura de reação (por exemplo, pasta fluida) para uma a-amilase, e então ajustar as condições de reação para acomodar uma glicoamilase, por exemplo, através da redução do pH e/ou temperatura da pasta fluida. Desta maneira, o uso de AMyE em hidrólise de amido permite que liquefação e sacarificação sejam realizadas sob as mesmas condições de pasta fluida, desta maneira eliminando uma etapa em hidrólise de amido.

Em alguns casos, ambas a liquefação e a sacarificação podem serrealizadas em um pH único entre cerca de 4-7, por exemplo, cerca de 4- 5, cerca de 4-6, cerca de 5-6, cerca de 5-7 e cerca de 6-7. Note que o crité- ' rio de pH único ignora quaisquer mudanças pequenas no pH da mistura de reação que acontecem durante liquefação ou sacarificação, mas que não envolvem a adição de ácido ou base para mudar intencionalmente o pH da mistura de reação. Em alguns casos, ambas a liquefação e a sacarificação podem ser realizadas em um pH abaixo daquele que os processos de lique- fação convencionais são realizados, por exemplo, um pH de menos do que cerca de 5,0, menos do que cerca de 4,8, menos do que cerca de 4,6, me- nos do que cerca de 4,4, menos do que cerca de 4,2 ou até mesmo um pH decercade4,0.O uso de AmyE para liquefação também permite a inclusão de uma porcentagem maior de estilagem na composição de amido usada para liquefação, por exemplo, >50%, ou até mesmo 60%, da mistura de rea- ção. Em alguns casos, ambas a liquefação e a sacarificação podem ser rea- lizadas em uma temperatura de cerca de 20-105º C, por exemplo, 60-85º C, ouuma temperatura que é cerca de 10, 12, 14, 16, 18 ou até mesmo 20º C abaixo da temperatura de gelação do amido (isto é, cerca de 75º C). Impor- tante, liquefação e sacarificação podem ser realizadas totalmente sem um ajuste de pH interveniente. Alternativamente, onde o ajuste do pH for ainda desejado entre liquefação e sacarificação, ele pode ser realizado usando uma quantidade reduzida de ácido ou base, comparado com a quantidade usada em um processo convencional, desta maneira introduzindo menos sal namisturade reação.

Ainda, polipeptídeos de AmyE catalisam a quebra de açúcares complexos, tais como maltose, maltotriose e maltoeptaose, em glicose. Tal atividade enzimática é convencionalmente associada com glicoamilases ao invés de a-amilases. Tal atividade de polipeptídeos de AmyE permite que hidrólise de amido em glicose seja realizada ou na ausência de uma glicoa- milase separada ou na presença de uma quantidade reduzida de uma glico- amilase, comparado com a quantidade requerida usando uma a-amilase convencional. Desta maneira, o uso de polipeptídeos de AmyE em hidrólise de amido permite que liquefação e sacarificação sejam realizadas simulta- - 15 neamente usando uma enzima única que funciona como ambas uma a- amilaes e uma glicoamilase, desta maneira eliminando ou reduzindo a ne- cessidade de enzimas separadas.

Polipeptíideos de AmyE também requerem pouco ou nenhum Ca? para estabilidade, reduzindo ou eliminando a necessidade de adicionar Ca? a uma reação de liquefação. Em adição a evitar a etapa de adição de Ca”, isto evita a necessidade de subsequentemente remover Ca** de uma pasta fluida (por exemplo, através de troca de íon) antes do contato da pasta fluida com uma enzima tal como glicose isomerase, que é sensível a Ca?*. Obviar remoção de Ca?* economiza tempo e custo e aumenta a eficiência de produção de um xarope com alto teor de frutose.

Finalmente, polipeptídeos de AmyE têm uma alta atividade com relação a amido não gelatinizado, o que pode ser recalcitrante para a ativi- dade enzimática de a-amilases convencionais. |sto permite o uso de amido moído a seco cozido a jato para liquefação e sacarificação, onde amido moí- doaúmidoé geralmente preferido para aprimorar a eficiência de conversão.

Será compreendido que AmyE é adequada para uso em um pro- cesso de liquefação/sacarificação que é ligado à fermentação, isomerização ou qualquer outro processo subsequente, incluindo SSF.

5.1.6. Combinação de AmyE com Glicoamilases e Outras Enzimas Polipeptídeos de AmyE podem ser usados sozinhos (por exem- plo, como a enzima amilolítica única em processamento de amido) ou po- dem ser combinados com outras a- ou B-amilases ou outras enzimas para prover um "coquetel" com um amplo espectro de atividade. Por exemplo, o amido pode ser contatado com uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma a-amilase fúngica (EC 3.2.1.1), uma a-amilase bacteria- na, por exemplo, uma a-amilase de Bacillus ou uma a-amilase de não- Bacillus ou uma B-amilase (EC 3.2.1.2). Outra enzima amilolítica ou uma enzima de desramificação, tal como uma isoamilase (EC 3.2.1.68) ou uma pululanase (EC 3.2.1.41), pode ser combinada com polipeptídeos de AmyE. A isoamilase hidrolisa ligações de ramificação a-1,6-D-glicosídica em amilo- pectina e dextrinas B-limites e podem ser distinguidas de pululanases pela - 15 incapacidade de isoamilase em atacar pululano e pela ação limitada de iso- amilase em dextrinas a-limites.

] B-Amilases são amilases maltogênicas de ação exo que catali- sam a hidrólise de ligações 1,4-a-glicosídicas em amilose, amilopectina e polímeros de glicose relacionados, desta maneira liberando maltose. B- amilases foram isoladas de várias plantas e micro-organismos (Fogarty e outros, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112- 115, 1979). Essas B-amilases são caracterizadas por terem temperaturas ótimas na faixa de a partir de 40 a 65º C e pH ótimo na faixa de a partir de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. B-amilases compreendidas incluem, mas não estão limitadas a, B-amilases de cevada SPEZYMES BBA 1500, SPEZYMEº DBA, OPTIMALº ME, OPTIMALº BBA (Danisco A/S); e NOVOZYMS WBA (Novozymes A/S).

Conforme aqui descrito, polipeptídeos de AmyE têm atividade de glicoamilase e podem ser usados na ausência de uma glicoamilase separa- da Alternativamente, glicoamilases podem ser adicionadas em uma quanti- dade reduzida comparado com aquela requerida para métodos de hidrólise de amido convencionais. Preferivelmente, glicoamilase estão presentes em uma quantidade de não mais do que (isto é, menos do que) 0,5 unidade de atividade de glicoamilase (AGU)/g DS (isto é, unidades de atividade de gli- coamilase por grama de sólidos secos), não mais do que 0,4 AGU/g DS, não mais do que 0,3 AGU/g DS, não mais do que 0,2 AGU/g DS ou até mesmo não mais do que 0,1 AUG/g DS. Mais geralmente, uma glicoamilase pode ser adicionada em uma quantidade de 0,02-2,0 AGU/g DS ou 0,1-1,0 AGU/g DS, embora essas faixas compreendam o uso de mais glicoamilase do que é requerido em combinação com AmyE. Devido ao fato dos polipeptídeos de AmyE serem ativos no mesmo pH e na mesma temperatura que glicoamila- se, polipeptídeos de AMyE podem ser adicionados antes ou após a adição de uma glicoamilase ou simultaneamente com uma glicoamilase, por exem- plo, por meio de um coquetel incluindo ambas a AmyE e a uma glicoamilase. Deste modo, a ordem e a maneira de adição de uma a-amilase e uma glico- amilase não são mais críticas, permitindo flexibilidade aumentada em pro- . 15 —cessos de hidrólise de amido.

Glicoamilases (EC 3.2.1.3) podem ser derivadas de um micro- : organismo ou uma planta. Existem várias glicoamilase conhecidas de ori- gens fúngica e bacteriana. Glicoamilases bacterianas exemplares são glico- amilase de Aspergillus, em particular glicoamilase G1 ou G2 de A. niger (Bo- eleoutros(1984), EMBO. JJ. 3:1097-1102), ou suas variantes, tal como des- crito no WO 92/00381 e no WO 00/04136; glicoamilase de A. awamori (WO 84/02921); glicoamilase de A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991) 55(4); 941- 949) ou suas variantes ou fragmentos. Variantes de glicoamilase de Asper- gillus incluem aquelas que aumentam a estabilidade térmica: G137A e G139A (Chen e outros (1996) Prot. Eng. 9:499-505); D257E e D293E/Q (Chen e outros (1995) Prot. Eng. 8:575-582); N182 (Chen e outros (1994) Biochem. J. 301:275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe e outros (1996) Biochemistry, 35:8698-8704); e introdução de resíduos Pro nas posi- ções A435 e S436 (Li e outros (1997) Protein Eng. 10:1199-1204). Outras —glicoamilases incluem glicoamilase de Trichoderma reesie (por exemplo, SEQ ID NO: 3 do WO 2006/060062; TrGA), glicoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de T. emersonii (WO 99/28448), T. leycettanus (Pa-

tente U.S. No. RE 32.153), T. duponit ou T. thermophilus (Patente U.S. No.

4.587.215). Glicoamilases bacterianas incluem glicoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135138) e C. ther- mohydrosulfuricum (WO 86/01831). Outras glicoamilases adequadas inclu- em aquelas derivadas de Aspergillus oryzae, tal como glicoamilase tendo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou até mesmo 90% de homo- logia com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 no WO 00/04136. Também adequadas são glicoamilases comerciais tais como AMG 200L; AMG 300L; SANº SUPER e AMGº e (Novozymes); OPTIDEX? 300 (Genencor Division, Danisco US Inc.); AMIGASE? e AMIGASES PLUS (da DSM); G-ZYMEG G900 (Enzyme Bio-Systems); e G-ZYMEº G990 ZR (glico- amilase de A. niger e teor de protease baixo).

As fitases são enzimas capazes de quebrar ácido fítico (fitato) encontrado em grãos e sementes oleosas. O fitato, bem como intermediários : 15 em sua degradação, são acreditados desestabilizar ou de outra maneira afe- tar de modo adverso a-amilases, desta maneira reduzindo sua eficiência. As - fitases que podem ser usadas em combinação com a-amilases variantes são capazes de hidrólise de ácido fítico sob as condições definidas das etapas de incubação e liquefação. Em algumas modalidades, a fitase é capaz de liberar pelo menos um fosfato inorgânico de um inositol hexafosfato (ácido fítico). As fitases podem ser agrupadas de acordo com sua preferência quan- to a uma posição específica do grupo de éster de fosfato na molécula de fitato na qual hidrólise é iniciada (por exemplo, como 3-fitases (EC 3.1.3.8) ou como 6-fitases (EC 3.1.3.26)). Um exemplo típico de fitase é mioinositol- hexaquifosfato3-fosfoidrolase.

As fitases podem ser obtidas de micro-organismos tais como or- ganismos fúngicos e bacterianos. Alguns desses micro-organismos incluem, por exemplo, Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. terreus, A. ficum e A. fu- migatus), Myceliophthora (M. thermophila), Talaromyces (T. thermophilus), Trichoderma spp. (T. reesei) e Thermomyces (WO 99/49740). Também fita- ses estão disponíveis de espécies Penicillium, por exemplo, P. hordei (ATCC No. 22053), P. piceum (ATCC No. 10519) ou P. brevi-compactum (ATCC No.

48944). Vide, por exemplo, USP 6.475.762. Ainda, fitases estão disponíveis de Bacillus (por exemplo, B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Ci- trobacter, Enterobacter e Buttiauxella (vide WO2006/043178). Fitases comerciais estão disponíveis, tais como NATUPHOSº (BASF), RONOZYMEº P (Novozymes A/S), PHZYMEº (Danisco A/S, Diver- sa) e FINASEº (AB Enzymes). O método para determinação de atividade de fitase microbiana e a definição de uma unidade de fitase foram publicados por Engelen e outros (1994) J. AOAC Int. 77:760-764. A fitase pode ser uma fitase do tipo selvagem, uma variante ou fragmento da mesma.

Fitases exemplares são derivadas de espécies da bactéria Butti- auxiela. Buttiauxiela spp. inclui B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Linhagens de espécie Buttiauxella estão disponíveis da DSMZ, o German National Resource Cen- ter for Biological Material (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, DE). À : 15 linhagem Buttiauxella sp. P1-29 depositada sob o número de acesso NCIMB 41248 é um exemplo de uma linhagem particularmente útil da qual uma fita- se pode ser obtida. A fitase pode ser tipo selvagem BP, uma variante da mesma (tal como BP-11) descrita no WO 06/043178 ou uma variante con- forme descrito na Publicação de Patente U.S. No. US20080220498, deposi- tadaem6 de março de 2007 (vide, por exemplo, Tabela 1 e SEQ ID NO: 3).

A fitase pode ser também a variante BP-17 da fitase de Buttiau- xiella, tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, mostrada abaixo, ou uma fitase tendo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 17.

A quantidade (dosagem) de fitase usada nos processos de incu- bação e/ou liquefação pode estar na faixa de cerca de 0,001 a 50 FTU/g ds (por exemplo, na faixa de cerca de 0,01 a 25 FTU/g ds, cerca de 0,01 a 15 FTU/g ds, cerca de 0,01 a 10 FTU/g ds, cerca de 0,05 a 15 FTU/g ds e cerca de 0,05 a 5,0 FTU/g.

Outras enzimas que podem ser usadas em combinação com po- lipeptideos de AmyE incluem lipases, cutinases, proteases, celula- ses/hemicelulases, peroxidase, pectinase, pectino liases, lacases ou combi- nações das mesmas. Em alguns casos, um domínio de ligação de carboidra- todotipo descrito no WO 98/22613 pode ser usado.

5.2. Composições e Métodos de Limpeza e Lavagem de Louça Polipeptídeos de AmyE podem ser formulados em composições detergentes para uso em limpeza de louça e outras superfícies duras. Essas composições podem ser géis, pós ou líquidos. As composições podem inclu- ir polipeptídeos de AMyE como as únicas enzimas amilolíticas na composi- ção. Alternativamente, a composição pode incluir outras/adicionais enzimas amilolíticas, outras enzimas de limpeza e outros componentes, muitos dos quais são comuns para composições de limpeza. A composição detergente de lavanderia pode compreender ainda uma ou mais outras enzimas, tais - 15 como uma lipase, uma cutinase, uma protease, uma celulase, uma peroxi- dase, uma pectinase, uma pectino liase e/ou uma lacase ou uma combina- ' ção das mesmas.

Composições detergentes de lavagem de louça geralmente in- cluem um ou mais tensoativos que podem ser aniônicos, não iônicos, catiô- nicos, anfotéricos ou uma mistura desses tipos. O detergente pode conter 0% a cerca de 90% em peso de um tensoativo não iônico, tais como álcoois de cadeia reta propoxilados etoxilados de baixa a nenhuma espumação.

Composições detergentes líquidas podem incluir propileno glicol. Polipeptídeos de AmyE podem ser solubilizados em propileno glicol, por e- xemplo, através da circulação em uma solução de propileno glicol 25% vo- lume/volume contendo cloreto de cálcio 10%.

Composições detergentes de lavagem de louça podem incluir sais de builder de detergente de tipos inorgânicos e/ou orgânicos. Builders de detergente podem ser subdivididos em tipos contendo fósforo e não con- tendo fósforo. Composições detergentes geralmente contêm cerca de 1% a cerca de 90% de builders de detergente. Exemplos de builders de detergen- te alcalinos inorgânicos contendo fósforo são sais solúveis em água, especi-

almente pirofosfatos, ortofosfatos e polifosfatos de metal alcalino. Exemplos de builders de detergente alcalinos orgânicos contendo fósforo são sais de fosfonatos solúveis em água. Exemplos de builders inorgânicos não conten- do fósforo são carbonatos de metal alcalino solúveis em água, boratos e sili- catos, bem como os vários tipos de silicatos de alumínio cristalinos ou amor- fos insolúveis em água, dos quais zeólitos são os representantes mais bem conhecidos. Exemplos de builders orgânicos adequados são o metal alcalino; amônio e amônio substituído; citratos; succinatos; malonatos; sulfonatos do ácido graxo; carboximetoxi succinatos; poliacetatos de amônio; carboxilatos; policarboxilatos; aminopolicarboxilatos; poliacetil carboxilatos; e poliidroxis- sulfonatos. Outros builders orgânicos adequados incluem os polímeros e copolímeros de peso molecular mais alto conhecidos ter propriedades de builder, por exemplo, copolímeros de ácido poliacrílico, ácido polimaleico e E 15 —poliacrílico/polimaleico apropriados e seus sais. As composições de limpeza podem conter agentes de alveja- - mento, por exemplo, do tipo cloro/bromo ou do tipo oxigênio. Exemplos de alvejantes do tipo cloro/bromo inorgânicos são hipoclorito de lítio, sódio ou cálcio, e hipobrometo, bem como fosfato de trissódio clorado. Exemplos de alvejantes do tipo cloro/bromo orgânicos são N-bromo e N-cloro-imidas hete- rocíclicas tais como ácidos tricloroisocianúrico, tribromoisocianúrico, dibro- moisocianúrico e dicloroisocianúrico, e seus sais com cátions de solubiliza- ção em água tais como potássio e sódio. Compostos hidantoína são também adequados.

As composições de limpeza podem conter alvejantes de oxigê- nio, por exemplo, na forma de um persal inorgânico, opcionalmente com um precursor de alvejamento ou como um composto peroxiácido. Exemplos típi- cos de compostos de alvejamento peróxi são perboratos de metal alcalino, ambos tetraidratos e monoidratos, percarbonatos de metal alcalino, persilica- tose perfosfatos. Materiais ativadores adequados incluem tetraacetiletileno- diamina (TAED) e glicerol triacetato. Sistemas de ativação de alvejamento enzimáticos podem também estar presentes, tal como perborato ou percar-

bonato, glicerol triacetato e per-hidrolase, conforme descrito no WO 2005/056783, por exemplo.

As composições de limpeza podem ser estabilizadas usando agentes de estabilização convencionais para a(s) enzima(s), por exemplo, um bpoliol,tal como, por exemplo, propileno glicol, um açúcar ou um álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado do ácido bórico (por e- xemplo, um éster de borato aromático). A composição de limpeza pode tam- bém conter outros ingredientes detergentes convencionais, por exemplo, material desfloculante, material de carga, depressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes sequestrantes, a- gentes antirredeposição de sujeira, agentes de desidratação, corantes, bac- tericidas, agentes fluorescentes, espessantes e perfumes.

Finalmente, polipeptíideos de AmyE podem ser usados em de- tergentes de lavagem de louça convencionais, por exemplo, em qualquer um - 15 dos detergentes descritos nas publicações de patente que seguem, com a compreensão que polipeptídeos de AmyE são usados ao invés das, ou em S adição às, a-amilases descritas nas patentes e pedidos de patente publica- dos que seguem: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197 e Patentes U.S. Nos. 5.112.518; 5.141.664; e

5.240.632.

Composições detergentes contendo polipeptideo de AmyE po- dem ser formuladas para operações de lavagem de louça à mão ou na má- quina.

5.3. Composições e Métodos de Detergente para Lavanderia Polipeptídeos de AmyE podem ser um componente de uma composição detergente de lavanderia, por exemplo, na forma de um granu-

lado não-pó, um líquido estabilizado, uma enzima protegida ou similar. Gra- nulados não-pó podem ser produzidos, por exemplo, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente re- vestidos através dos métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de óxido de poli(etileno); (polietileno- glico, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxi- lados tendo de a partir de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois gra- xos etoxilados onde o álcool contém de a partir de 12 a 20 átomos de carbo- no e onde há 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di-e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materi- ais de revestimento de formação de película adequados para aplicação atra- vés de técnicas de leito fluido são descritos na, por exemplo, Patente GB No.

1.483.591. Preparações de enzima líquidas podem ser estabilizadas através : 15 da adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de a- çúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. ' Outros estabilizadores de enzima são conhecidos na técnica. Enzimas pro- tegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito na US

5.879.920 (Danisco S/A) ou na EP 238216, por exemplo. Polióis há muito tempo foram reconhecidos como estabilizadores de proteinas bem como para aprimoramento da solubilidade de proteínas. Vide, por exemplo, Kau- Shik e outros, J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003) e referências citadas ne- le; e M. Conti e outros, J. Chromatography 757: 237-245 (1997). Composição detergente de lavanderia pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, como géis, pós, grânulos, pastas ou líqui- dos. Um detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até cerca de 70% de água, e 0% a cerca de 30% de solvente orgânico, ele pode tam- bém estar na forma de um tipo de gel compacto contendo apenas 30% de água. Composição detergente de lavanderia tipicamente inclui um ou mais tensoativos, os quais podem ser aniônicos, não iônicos (incluindo se- mipolares), catiônicos ou zwitteriônicos ou uma combinação dos mesmos.

Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de a partir de 0,1% a 60% em peso. Em alguns casos, o detergente vai conter geralmente 0% a cerca de 40% ou cerca de 50% de tensoativo aniônico, tal como alquilben- zenossulfonato linear; a-olefinsulfonato; alquil sulfato (sulfato de álcool gra- xo) (AS); álcool etoxissuifato (AEOS ou AES); alcanossulfonatos secundá- rios (SAS); metil éteres do ácido a-sulfo graxo; ácido alquil ou alquenilsucci- nico; ou sabão. A composição pode também conter 0% a cerca de 40% de tensoativo não iônico tal como álcool etoxilato (AEO ou AE), álcool etoxilatos carboxilados, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicosídeo, alquildimetilaminoóxi- do, monoetanolamida do ácido graxo etoxilada, monoetanolamida do ácido graxo, amida do ácido poliidroxi alquil graxo (conforme descrito no WO 92/06154) ou derivados de N-acil-N-alquila de glicosamina ("glucamidas"). A composição detergente de lavanderia pode compreender ain- da uma ou mais outras enzimas, tais como uma lipase, uma cutinase, uma ' 15 protease, uma celulase, uma peroxidase, uma pectinase, uma pactina liase, uma lacase e/ou outra enzima amilolítica (por exemplo, outra a-amilase) ou . uma combinação das mesmas. Em alguns casos, a 2,6-B-D-frutan hidrolase pode ser incorporada a composições detergente de lavanderia e usada para remoção/limpeza de biopelícula presente em têxtil/roupa doméstica e/ou in- dustrial.

O detergente de lavanderia pode conter cerca de 1% a cerca de 65% de um builder de detergente ou agente de complexação tal como zeóli- to, difosato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTMPA), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camada (por exemplo, SKS-6 da Hoechst). O detergente pode ser também essencialmente livre de builder de detergente. Enzimas podem ser usadas em qualquer composição compatível com a estabilidade da enzima. As en- zimas podem ser protegidas contra componentes geralmente prejudiciais através de formas conhecidas de encapsulação, como através de granula- ção ou sequestro em hidrogéis, por exemplo. Enzimas e especificamente a- amilases com ou sem os domínios de ligação de amido não são limitadas a aplicações de lavanderia e lavagem de louça, mas podem encontrar uso em limpadores de superfície e produção de etanol a partir de amido ou biomas- sa.

O detergente de lavanderia pode compreender um ou mais po- límeros. Exemplos incluem carboximetilcelulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG), poli(vinil álcool) (PVA), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolimeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de lauril metacrilato /ácido acrílico. O detergente de lavanderia pode conter um sistema de alveja- mento, o qual pode compreender uma fonte de H2O> tal como perborato ou percarbonato opcionalmente combinada com um ativador de alvejamento de formação de perácido, tal como TAED ou nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS). Alternativamente, o sistema de alvejamento pode compreender pe- roxiácidos do tipo amida, imida ou sulfona, por exemplo. O sistema de alve- - 15 jamento pode também ser um sistema de alvejamento enzimático, onde uma per-hidrolase ativa peróxido, tal como aquele descrito no WO 2005/056783.

f As enzimas da composição detergente de lavanderia, incluindo polipeptídeos de AmyE, podem ser estabilizadas usando agentes de estabi- lização convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido láctico; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, tal como um éster de borato aromático; e a com- posição pode ser formulada conforme descrito, por exemplo, no WO 92/19709 e no WO 92/19708.

O detergente de lavanderia pode também conter outros ingredi- entes detergentes convencionais tais como condicionadores de tecido inclu- indo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti- corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos ou perfume, por e- xemplo. O pH (medido em solução aquosa em concentração de uso) é ge- ralmente neutro ou alcalino, por exemplo, pH de cerca de 7,0 a cerca de 11,0, embora polipeptídeos de AmyE também ajam em condições de pH baixo, como no caso de hidrólise de amido.

Um ou mais polipeptídeos de AmyE podem estar presentes em composições de limpeza de lavanderia em concentrações convencionalmen- te empregadas em tais composições, por exemplo, 0,00001-1,0 mg (calcula- da como proteína de enzima pura) de polipeptídeo de AmyE por litro de lí- —quidode lavagem. Composições detergentes exemplares incluem o que se- gue: (1) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo alquil- benzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 7% a cerca de 12%; álcool etoxissulfato (por exemplo, C12-C16 álcool, óxido de 1-2 etileno (EO)) ou alquil sulfato (por exemplo, C16-18) cerca de 1% a cerca de 4%; ál- cool etoxilato (por exemplo, C14-15 álcool, 7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, NaCO;3) cerca de 14% a cerca de 20%; silicato solúvel, cerca de 2 a cerca de 6%; zeólito (por exemplo, NaAISIO,) : 15 cercade 15% a cerca de 22%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 6%; citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, CgHsNa3zO7/CsHgO7) - cerca de 0% a cerca de 15%; perborato de sódio (por exemplo, NaBOz.H2O) cerca de 11% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 6%; carboxi- metilcelulose (CMC) e 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, ácido maleico/acrílico, copolímero, PVP, PEG), 0-3%; enzimas (calculada como enzima pura) 0,0001-0,1% proteína; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, supressores de espuma, perfumes, abrilhantadores ópticos, fotoalvejante) 0-5%.

(2) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo alquil- benzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 11%; álcool etoxissulfato (por exemplo, C12:8 álcool, 1-2 EO) ou alquil sulfato (por exemplo, C16-16) cerca de 1% a cerca de 3%; álcool etoxilato (por exem- plo, C14-15 álcool, 7 EO) cerca de 5% a cerca de 9%; carbonato de sódio (por exemplo, Na;CO;3) cerca de 15% a cerca de 21%; silicato solúvel, cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaAISIO,) cerca de 24% a cerca de 34%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO,z) cerca de 4% a cerca de 10%;

citrato de sódio/ácido cítrico (por exemplo, CsHsNazO7/CsH8O7) 0% a cerca de 15%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por e- xemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-6%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; ingredientes em quantidades menores (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0- 5%.

(3) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo alquil- benzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 5% a cerca de 9%; álcool etoxilato (por exemplo, C12-15 álcool, 7 EO) cerca de 7% a cerca de 14%; Sabão como ácido graxo (por exemplo, C16-22 ácido graxo) cerca de 1 a cerca de 3%; carbonato de sódio (como Na2CO;3) cerca de 10% a cerca de 17%; silicato solúvel; cerca de 3% a cerca de 9%; zeólito (como NaAiISi- Oy) cerca de 23% a cerca de 33%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO,) + 15 0% a cerca de 4%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO;3.H2O) cerca de 8% a cerca de 16%; TAED cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato (por e- ' xemplo, EDTMPA) 0% a cerca de 1%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cer- ca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3%; enzimas (calculado como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%,; ingredientes em quantidades menores (por exemplo, supres- sores de espuma, perfume, abrilhantador óptico) 0-5%.

(4) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo alquil- benzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 8% a cerca de 12%; álcool etoxilato (por exemplo, C12-15 álcool, 7 EO) cerca de 10% a cerca de 25%; carbonato de sódio (como NazCO;3) cerca de 14% a cerca de 22%; Silicato solúvel, cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito (por exemplo, NaAISiO,) cerca de 25% a cerca de 35%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 10%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-3%; enzi- mas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, supressores de espuma, perfume)

0-5%.

(5) Uma composição detergente líquida aquosa compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; álcool etoxilato (por exemplo, C12.15 álcool, 7 EO ou C12.15 álcool, 5 EO) cercade 12% a cerca de 18%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido oleico) cerca de 3% a cerca de 13%; ácido alquenilsuccínico (C12-14) 0% a cerca de 13%; aminoetanol cerca de 8% a cerca de 18%; ácido cítrico cerca de 2% a cerca de 8%; fosfonato 0% a cerca de 3%; polímeros (por exemplo, PVP, PEG) 0% a cerca de 3%; borato (por exemplo, B407) 0% a cercade 2%; etanol 0% a cerca de 3%; propileno glicol cerca de 8% a cerca de 14%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, dispersantes, supres- sores de espuma, perfume, abrilhantador óptico) 0-5%.

(6) Uma composição detergente líquida de estrutura aquosa - 15 compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 21%; álcool etoxilato (por exemplo, C12.15 álcool, 7 EO ou ' C12-15 álcool, 5 EO) 3-9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido olei- co) cerca de 3% a cerca de 10%; zeólito (como NaAISIO,) cerca de 14% a cerca de 22%; citrato de potássio cerca de 9% a cerca de 18%; borato (por exemplo, B1O;) 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose (CMC) 0% a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, PEG, PVP) 0% a cerca de 3%; polímeros de ancoragem (por exemplo, copolímero de lauril metacrilato/ácido acrílico); razão molar 25:1, MW 3800) 0% a cerca de 3%; glicerol 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredi- entesem quantidades menores (por exemplo, dispersantes, supressores de espuma, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-5%.

(7) Composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo sulfato de ál- cool graxo cerca de 5% a cerca de 10%; monoetanolamida do ácido graxo —etoxilado cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo 0-3%; carbo- nato de sódio (por exemplo, Na2CO;) cerca de 5% a cerca de 10%; silicato solúvel, cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaAISIO4) cerca de 20% a cerca de 40%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO,4) cerca de 2% a cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO;3.H7O) cerca de 12% a cerca de 18%; TAED cerca de 2% a cerca de 7%; polímeros (por e- xemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, abrilhantador óptico, supressores de espuma, perfume) 0-5%.

(8) Uma composição detergente formulada como um granulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de8%a cercade 14%; monoetanolamida do ácido graxo etoxilado cerca de 5% a cerca de 11%; sabão como ácido graxo 0% a cerca de 3%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 4% a cerca de 10%; silicato solú- vel, cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito (por exemplo, NaAISIO,) cerca de 30% a cerca de 50%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO,) cerca de 3% a cerca de 11%; citrato de sódio (por exemplo, CgHsNa3O;) cerca de 5% a Á cerca de 12%; polímeros (por exemplo, PVP, copolímero de ácido malei- ' co/acrílico, PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades me- nores (por exemplo, supressores de espuma, perfume) 0-5%. (9) Uma composição detergente formulada como um granulado compreendendo alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 6% a cerca de 12%; tensoativo não iônico cerca de 1% a cerca de 4%; sabão como ácido graxo cerca de 2% a cerca de 6%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO3) cerca de 14% a cerca de 22%; zeólito (por exemplo, —NaAISiO,) cerca de 18% a cerca de 32%; sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) cerca de 5% a cerca de 20%; citrato de sódio (por exemplo, CeHsNa3O;) cerca de 3% a cerca de 8%; perborato de sódio (por exemplo, NaBO;3.H2O) cerca de 4% a cerca de 9%; ativador de alvejamento (por e- xemplo, NOBS ou TAED) cerca de 1% a cerca de 5%; carboximetilcelulose (CMC)0%a cerca de 2%; polímeros (por exemplo, policarboxilato ou PEG) cerca de 1% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo,

abrilhantador óptico, perfume), 0-5%.

(10) Uma composição detergente líquida aquosa compreenden- do alquilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 15% a cerca de 23%; álcool etoxissulfato (por exemplo, C12-15 álcool, 2-3 EO) cerca de8%acercade 15%; álcool etoxilato (por exemplo, C12-15 álcool, 7 EO ou C12-15 álcool, 5 EO) cerca de 3% a cerca de 9%; sabão como ácido graxo (por exemplo, ácido láurico) 0% a cerca de 3%; aminoetanol cerca de 1% a cerca de 5%; citrato de sódio cerca de 5% a cerca de 10%; hidrótropo (por exemplo, toluenossulfonato de sódio) cerca de 2% a cerca de 6%; borato (por exemplo, B1O7) 0% a cerca de 2%; carboximetilcelulose 0% a cerca de 1%; etanol cerca de 1% a cerca de 3%; propileno glicol cerca de 2% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, polímeros, dispersan- tes, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-5%. - 15 (11) Composição detergente líquida aquosa compreendendo al- quilbenzenossulfonato linear (calculado como ácido) cerca de 20% a cerca Á de 32%; álcool etoxilato (por exemplo, C12-15 álcool, 7 EO, ou C12.15 álcool, 5 EO) 6-12%; aminoetanol cerca de 2% a cerca de 6%; ácido cítrico cerca de 8% a cerca de 14%; borato (por exemplo, Ba4O;) cerca de 1% a cerca de 3%; polímero (por exemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de ancoragem, tal como copolímero de lauril metacrilato/ácido acrílico) 0% a cerca de 3%; glicerol cerca de 3% a cerca de 8%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%; e ingredientes em quantidades me- nores (por exemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, abrilhantadores óp- ticos)0-5%.

(12) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo tensoa- tivo aniônico (alquilbenzenossulfonato linear, alquil sulfato, a-olefinsulfonato, metil ésteres do ácido a-sulifo graxo, alcanossulfonatos, sabão) cerca de 25% a cerca de 40%; tensoativo não iônico (por exemplo, álcool! etoxilato) cerca de 1% a cerca de 10%; carbonato de sódio (por exemplo, NaCO;3) cerca de 8% a cerca de 25%; silicato solúvel, cerca de 5% a cerca de 15%;

sulfato de sódio (por exemplo, Na2SO4) 0% a cerca de 5%; zeólito (NaAISi- O.) cerca de 15% a cerca de 28%; perborato de sódio (por exemplo, Na- BO3.H2O0) 0% a cerca de 20%; ativador de alvejamento (TAED ou NOBS) cerca de 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001-0,1%,; ingredientes em quantidades menores (por exemplo, perfume, abrilhantadores ópticos) 0-3%. (13) Composições detergentes conforme descrito nas composi- ções 1)-12) supra, onde todo ou parte do alquilbenzenossulfonato linear é substituído por (C12-C18) alquil sulfato. (14) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo (C;2- Ci18) alquil sulfato cerca de 9% a cerca de 15%; álcool etoxilato cerca de 3% a cerca de 6%; amida do ácido poliidroxi alquil graxo, cerca de 1% a cerca de 5%; zeólito (por exemplo, NaAISIO,) cerca de 10% a cerca de 20%; dissi- ' 15 licato em camada (por exemplo, SK56 da Hoechst) cerca de 10% a cerca de 20%; carbonato de sódio (por exemplo, Na2CO;z) cerca de 3% a cerca de 1 12%; silicato solúvel, 0% a cerca de 6%; citrato de sódio cerca de 4% a cer- ca de 8%; percarbonato de sódio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED cerca de 3% a cerca de 8%; polímeros (por exemplo, policarboxilato e PVP) 0% a cerca de 5%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001- 0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, abrilhantador óptico, fotoalvejante, perfume, supressores de espuma) 0-5%. (15) Uma composição detergente formulada como um granulado tendo uma densidade bruta de pelo menos 600 g/L compreendendo (C;2- Ci) alquil sulfato cerca de 4% a cerca de 8%; álcool etoxilato cerca de 11% a cerca de 15%; sabão cerca de 1% a cerca de 4%; zeólito MAP ou zeólito À cerca de 35% a cerca de 45%; carbonato de sódio (como NazCO;3) cerca de 2% a cerca de 8%; silicato solúvel, 0% a cerca de 4%; percarbonato de só- dio cerca de 13% a cerca de 22%; TAED 1-8%; carboximetilcelulose (CMC) 0% acerca de 3%; polímeros (por exemplo, policarboxilato e PVP) 0% a cerca de 3%; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0,0001- 0,1%; e ingredientes em quantidades menores (por exemplo, abrilhantador óptico, fosfonato, perfume) 0-3%.

(16) Formulações detergentes conforme descrito em 1)-15) su- pra, as quais contêm um perácido estabilizado ou encapsulado, ou como um componente adicional ou como um substituto para sistemas de alvejamento já especificados.

(17) Composições detergentes conforme descrito supra em 1), 3), 7), 9) e 12), onde perborato é substituído por percarbonato.

(18) Composições detergentes conforme descrito supra em 1), 3), 7), 9), 12), 14) e 15), as quais contêm adicionalmente um catalisador de manganês.

(19) Composição detergente formulada como um líquido deter- gente não-aquoso compreendendo um tensoativo não iônico líquido tal co- mo, por exemplo, álcool primário alcoxilado linear, um sistema de builder (por exemplo, fosfato), uma enzima(s) e álcali. O detergente pode também . 15 compreender tensoativo aniônico e/ou um sistema de alvejante.

Composições detergentes de lavanderia contendo polipeptídeo i de AmyE podem ser formuladas como composições detergentes de lavande- ria à mão ou na máquina, incluindo composições aditivas de lavanderia ade- quadas para o pré-tratamento de tecidos manchados e composições amaci- antes de tecido adicionadas ao enxágue, ou podem ser formuladas como composições detergentes para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica geral.

As composições detergentes podem incluir 2,6-B-D-fructano hi- drolase, uma ou mais enzimas a-amilase adicionais e uma ou mais outras enzimas de limpeza, tais como uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabi- nase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, uma lacase e/ou uma peroxidase e/ou suas combinações. Em geral, as propriedades da(s) enzi- ma(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (por exemplo, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáti- cos e não-enzimáticos, etc) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes.

Um aditivo detergente, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado como um granulado, líquido, pasta fluida, etc. Formulações aditivas de detergentes granuladas adequadas incluem granulados não pó.

É compreendido que nas composições detergentes, polipeptí- deos de AmyE podem ser adicionados em uma quantidade correspondendo a cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem, particularmente cerca de 0,05 a cerca de 5,0 mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem ou até mesmo particularmente em 0,1 acercade 1,0mg de proteína de enzima por litro de líquido de lavagem.

5.4. Enzimas para Uso em Combinação com Polipeptídeos de AmyE Conforme acima descrito, composições de limpeza contendo po- lipeptíideo de AmyE podem incluir uma ou mais enzimas adicionais, tais co- . 15 mo uma protease, uma lipase, uma cutinase, uma carboidrase, uma celula- se, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma . xilanase, uma oxidase, uma lacase e/ou uma peroxidase, 2,6-B-D-fructan hidrolase, enzimas a-amilase adicionais e suas combinações. Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (por exemplo, pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc) e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. Enzimas exemplares são descri- tas abaixo. Muitas dessas enzimas podem ser também usadas em combina- ção com polipeptídeos de AmyE em composições outras que não composi- ções delimpeza.

Proteases: proteases adequadas incluem aquelas de origem a- nimal, vegetal ou microbiana. Mutantes quimicamente modificados ou enge- nheirados de proteína são também adequados. As proteases podem ser uma serina protease ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease microbiana alcalina ou uma protease tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente aquelas derivadas de Bacillus sp., por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.287.841), subtilisina 147 e subtilisina 168 (vide, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsi- na (por exemplo, de origens de porco ou bovina) e proteases de Fusarium (vide, por exemplo, WO 89/06270 e WO 94/25583). Exemplos de proteases úteistambém incluem, mas não estão limitados a, as variantes descritas no WO 92/19729 e WO 98/20115. Enzimas proteases comercialmente disponí- veis adequadas incluem ALCALASES, SAVINASE”, PRIMASES, DURALA- SEº, ESPERASE? e KANNASEº (Novo Nordisk A/S); MAXATASES, MAXA- CALº, MAXAPEMº, PROPERASES, PURAFECTº, PURAFECT OXPº, FN2º eFN3º (Danisco A/S).

Lipases: lipases adequadas incluem aqueles de origem bacteri- ana ou fúngica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheirados de proteína são incluídos. Exemplos de lipases úteis incluem, mas não estão limitados a, lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, H.

” 15 lanuginosa (T. lanuginosus) (vide, por exemplo, EP 258068 e EP 305216) e H. insolens (vide, por exemplo, WO 96/13580); uma lipase de Pseudomonas É (por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes; vide, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia (vide, por exemplo, EP 331 376), P. stutzeri (vide, por exemplo, GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. linhagem SD 705 (vide, por exemplo, WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (vide, por exemplo, WO 96/12012); uma lipase de Bacillus (por exemplo, de B. subtilis; vide, por exemplo, Dartois e outros. Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (vide, por exemplo, JP 64/744992) ou B. pumilus (vide, por exemplo, WO 91/16422). Variantes de lipase adicionais compreendidas para uso nas formulações incluem aquelas descritas, por exemplo: nos WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225 e EP 260105. Algumas enzimas lipase comercialmente disponíveis incluem LIPOLASE? e LIPOLASE? Ultra (Novo NordiskA/S).

Poliestereases: Poliestereases adequadas incluem, mas não es- tão limitadas a, aquelas descritas no WO 01/34899 (Danisco A/S) e no WO

01/14629 (Danisco A/S) e podem ser incluídas em qualquer combinação com outras enzimas discutidas aqui.

Amilases: As composições podem ser combinadas com outras a-amilases, tal como uma a-amilase não variante. Essas incluem amilases comercialmente disponíveis, tais como, mas não limitadas a, DURAMYLº, TERMAMYLº, FUNGAMYLº e BANº (Novo Nordisk A/S), RAPIDASE? e PURASTARº (Danisco A/S).

Celulases: Celulases podem ser adicionadas às composições.

Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Mu- tantes quimicamente modificados ou engenheirados de proteína estão inclu- idos. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseu- domonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as ce- lulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum descritas nas Patentes U.S. Nos. . 15 4.435.307; 5.648.263; 5.691.178; 5.776.757; e WO 89/09259, por exemplo. Celulases exemplares compreendidas para uso são aquelas tendo benefício - de cuidado de cor para o têxtil. Exemplos de tais celulases são celulases descritas nas EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Danisco A/S), WO 96/34108 (Danisco A/S), WO 96/11262; WO 96/29397; e WO 98/08940, por exemplo. Outros exemplos são variantes de celulase, tais como aquelas descritas nos WO 94/0/7998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531 315; Patentes U.S. Nos. 5.457.046; 5.686.593; e

5.763.254. Celulases comercialmente disponíveis incluem CELLUZYMES e CAREZYMES (Novo Nordisk A/S); CLAZINASEº e PURADAXº HA (Danisco A/S); eKAC-500(B)º (Kao Corporation).

Peroxidases/Oxidases: Peroxidases/oxidases adequadas com- preendidas para uso nas composições incluem aquelas de origem de planta, bacteriana ou fúngica. Mutantes quimicamente modificados ou engenheira- dos de proteína estão incluídos. Exemplos de peroxidases úteis incluem pe- roxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e suas variantes como aquelas descritas nos WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257. Peroxi- dases comercialmente disponíveis incluem GUARDZYMES (Novo Nordisk

A/S), por exemplo.

5.5. Ensaios para Medição de Desempenho de Limpeza de Polipeptídeos de AmyE Ensaios exemplares para medição de desempenho de limpeza de polipeptídeos de AmyE são descritos abaixo e nos Exemplos apensos. Um ensaio padrão que pode ser usado para testar a eficácia de uma compo- sição de limpeza compreendendo um polipeptídeo de AMyE envolve um tes- te de retalhos. Retalhos tendo manchas de "resistência" conhecida em vá- rios tipos de material estão comercialmente disponíveis (EMPA, St. Gallen, Suíça; wik--Testgewebe GmbH, Krefeld Alemanha; ou Center for Test Mate- rials, Vlaardingen, Países Baixos) e/ou podem ser feitos pelo praticante (Morris e Prato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982)). Retalhos podem compreender, por exemplo, um tecido contendo algodão contendo uma mancha feita de sangue/leite/tinta (BMI) (blood/milk/ink), espinafre, - 15 grama ou chocolate/leite/ferrugem. Uma mancha BMI pode ser fixada em algodão com 0,0003% a 0,3% de peróxido de hidrogênio, por exemplo. Ou- í tras combinações incluem grama ou espinafre fixado com glutaraldeído 0,001% a 1%, mancha de gelatina de Coomassie fixada com glutaraldeído 0,001% a 1% ou chocolate, leite e ferrugem fixados com glutaraldeído 0001%a1l%.

O retalho pode ser também agitado durante incubação com um polipeptídeo de AmyE e/ou formulação detergente. Os dados de desempe- nho de lavagem são dependentes da orientação dos retalhos nos poços (ho- rizontal versus vertical), particularmente na placa de 96 poços. Isto indicaria quea mistura foi insuficiente durante o período de incubação. Embora haja várias maneiras de assegurar agitação suficiente durante a incubação, um porta-placa onde a placa de microtitulação é intercalada entre duas placas de alumínio pode ser construído. Isto pode ser tão simples quanto colocar, por exemplo, um vedante de placa adesivo sobre os poços e então grampe- aras duas placas de alumínio à placa de 96 poços com qualquer tipo de grampos comercialmente disponível, apropriado. Ele pode ser montado em um agitador de incubadora comercial. Ajuste do agitador para cerca de 400 rpm resulta em mistura muito eficiente, enquanto vazamento ou contamina- ção cruzada é eficientemente prevenido pelo porta-placa.

Ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS) pode ser usado para quantificar a concentração de grupos amino no líquido de lavagem. Isto pode servir como uma medida da quantidade de proteína que foi removida do re- talho (vide, por exemplo, Cayot e Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997)). No entanto, se uma amostra de detergente ou uma de enzima levar à formação de fragmentos de peptídeo incomumente pequenos (por exem- plo, a partir da presença de peptidases na amostra), então uma pessoa vai obterum sinal de TNBS maior, isto é, mais "ruído".

Outro meio de medição do desempenho de lavagem de san- gue/leite/tinta que é baseado em liberação de tinta pode ser quantificado através da medição da absorbância do líquido de lavagem. A absorbância pode ser medida em qualquer comprimento de onda entre 350 e 800 nm, por - 15 exemplo, 410 mm ou 620 mm. O líquido de lavagem pode ser examinado para determinar o desempenho de lavagem em manchas contendo mancha de grama, espinafre, gelatina ou Coomassie. Comprimentos de onda ade- quados para essas manchas incluem um de 670 nm para espinafre ou gra- ma e 620 nm para gelatina ou Coomassie. Por exemplo, uma alíquota do líquido de lavagem (tipicamente 100-150 ul. de uma microplaca de 96 poços, por exemplo) é removida e posta em um cadinho ou microplaca multipoço. Esta é então posta em um espectrômetro e a absorbância é lida em um comprimento de onda apropriado. O sistema pode ser também usado para determinar uma composição de enzima e/ou detergente adequada para la- vagem de louça, por exemplo, usando uma mancha de sangue/leite/tinta em um substrato adequado, tal como tecido, plástico ou cerâmica.

Em um exemplo, uma mancha BMI é fixada em algodão aplican- do peróxido de hidrogênio 0,3% ao retalho de BMI/algodão por 30 minutos a 25º C ou aplicando peróxido de hidrogênio 0,03% ao retalho de BMI/algodão por30 minutos a 60º C. Retalhos menores de aproximadamente 0,63 cm (0,25") são cortados do retalho de BMI/algodão e postos nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Em cada poço, uma mistura conhecida de uma composição detergente e uma enzima, tal como uma proteína vari- ante, é posta. Após colocação de um vedante de placa adesivo em cima da placa de microtitulação, a placa de microtitulação é grampeada em uma pla- ca de alumínio e agitada em um agitador orbital em aproximadamente 250 rpm por cerca de 10 a 60 minutos. No final deste tempo, os sobrenadantes são transferidos para poços em uma nova placa de microtitulação e a absor- bância da tinta a 620 nm é medida. Isto pode ser similarmente testado com manchas de espinafre ou manchas de grama fixadas a algodão através da aplicação de glutaraldeído 0,01% ao retalho de espinafre/algodão ou retalho de grama/algodão por 30 minutos a 25º C. O mesmo pode ser feito com manchas de chocolate, leite e/ou ferrugem.

5.6. Composições e Métodos de Retirada de Mancha de Têx- til São também compreendidos composições e métodos de trata- - 15 mento de tecidos (por exemplo, retirar a mancha de um tecido) usando um ou mais polipeptídeos de AmyE. Os polipeptídeos de AMyE podem ser usa- Ã dos em qualquer método de tratamento de tecido conhecido na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.077.316). Por exemplo, o toque e a aparên- cia de um tecido podem ser aprimorados usando um método envolvendo contatodo tecido com um polipeptídeo de AMyE em solução, opcionalmente sob pressão.

Polipeptídeos de AmyE podem ser aplicados durante ou após a tecelagem de têxteis ou durante o estágio de retirada de mancha ou uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Durante a tecelagem de têxteis, os fios são expostos à resistência mecânica considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios enrolados são frequentemente re- vestidos com amido ou derivados de amido de engomagem a fim de aumen- tar sua resistência à tensão e prevenir quebra. Polipeptídeos de AmyE po- dem ser aplicados para remover esses amido ou derivados de amido de en- gomagem. Após os têxteis terem sido tecidos, um tecido pode prosseguir para um estágio de retirada de goma. Isto pode ser seguido por um ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Retirada de goma é o ato de remover goma de têxteis. Após a tecelagem, o revestimento de goma deve ser removido antes do processamento adicional do tecido a fim de assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem. Polipeptídeos de AmMyE po- dem ser então usados em um método para retirada de goma de tecido com- preendendo hidrólise enzimática da goma através da ação dos polipeptídeos de AmyE.

Polipeptídeos de AMyE podem ser usados sozinhos ou com ou- tros reagentes químicos de retirada de goma e/ou enzimas de retirada de goma para retirar goma de tecidos, incluindo tecidos contendo algodão. Poli- peptídeos de AmyE podem ser ainda usados em composições e métodos para produção de uma aparência lavada em tecidos e roupas denim tingidos de índigo. Para a fabricação de roupas, o tecido pode ser cortado e costura- do em roupas, que são em seguida finalizadas. Em particular, para a fabri- cação de jeans denim, métodos de acabamento enzimático diferentes foram - 15 desenvolvidos. O acabamento de roupa em denim normalmente é iniciado com uma etapa de retirada de goma enzimática, durante a qual as roupas É são submetidas à ação de enzimas amilolíticas para prover maciez ao tecido e tornar o algodão mais acessível às etapas de acabamento enzimático sub- sequentes. Polipeptídeos de AMyE podem ser usados em métodos de aca- — bamento de roupas em denim (por exemplo, um "processo de bio-stoning"), retirada de goma enzimática e provendo maciez aos tecidos e/ou processos de acabamento.

5.7. Composições e Métodos para Assar e Preparação de A- limento Polipeptídeos de AmyE podem ser usados em composições e métodos para assar e preparação de alimento. Para usos comercial e do- méstico de farinha para assar e produção de alimento, é importante manter um nível apropriado de atividade de a-amilase na farinha. Um nível de ativi- dade que é muito alto pode resultar em um produto que é pegajoso e/ou —massudo e sem possibilidade de ser comercializado. Por outro lado, farinha com atividade de a-amilase insuficiente pode não conter açúcar suficiente para função de levedura apropriada, resultando em pão esmigalhado, seco.

Desta maneira, polipeptídeos de AmyE, sozinhos ou em combinação com outra(s) a-amilase(s) podem ser adicionados à farinha para aumentar o nível de atividade de a-amilase endógena em farinha. Conforme aqui descrito, polipeptídeos de AmyE têm uma temperatura ótima na faixa de 30-90º C, 50- 80º C,55-75º C ou até mesmo 60-70º C, o que os torna bastante adequados para aplicações de assar e preparação de alimento. A temperatura ótima de variantes de AmyE diferentes pode ser medida, por exemplo, em uma solu- ção a 1% de amido solúvel em pH 5,5 ou usando outros métodos conforme descrito aqui ou conhecido na técnica.

Em adição ao uso de grãos e outros produtos de planta para as- sar, grãos tais como cevada, aveias e trigo, bem como componentes de planta, tais como milho, lúpulo e arroz, são usados para produção de cerveja ambas comercial e caseira. Os componentes usados em produção de cerve- ja podem ser sem malte ou podem ser maltados, isto é, parcialmente germi- i 15 —nados, resultando em um aumento nos níveis de enzimas, incluindo a- amilases. Para produção de cerveja bem sucedida, níveis adequados de - atividade de enzima a-amilase são necessários para assegurar os níveis apropriados de açúcares para fermentação. Polipeptídeos de AmyE, sozi- nhos ou em combinação com outras a-amilase(s), podem ser adicionados a Wwortoumassa para aprimorar a conversão de amido. Conforme descrito em outro ponto aqui, polipeptídeos de AmyE exibem atividade de glicoamilase, permitindo que glicose seja gerada a partir de grãos contendo amido sem o uso de uma glicoamilase adicional ou com uma quantidade de glicoamilase reduzida comparado com aquela requerida usando outras a-amilases.

Polipeptídeos de AMyE podem ser ainda adicionados sozinhos ou em uma combinação com outras amilases para prevenir ou retardar o endurecimento, isto é, firmeza do miolo, de produtos assados. A quantidade de polipeptídeo de AmyE usada para amilase antiendurecimento estará tipi- camente na faixa de 0,01-10 mg de proteína de enzima por kg de farinha, — porexemplo, 1-10 mg/kg. Amilases antiendurecimento adicionais que podem ser usadas em combinação com polipeptídeos de AmyE incluem uma endo- amilase, por exemplo, uma endo-amilase bacteriana de Bacillus. A amilase adicional pode ser também uma a-amilase maltogênica, (EC 3.2.1.133), por exemplo, de Bacilus. NOVAMYLº é uma a-amilase maltogênica adequada da linhagem de B. stearothermophilus NCIB 11837 e é descrita em Christo- phersen e outros (1997) Starch, 50:39-45. Outros exemplos de endo- amilases antiendurecimento incluem a-amilases bacterianas derivadas de Bacillus, tal como B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens e exo-amilase, tal como B-amilase, por exemplo, de fontes de planta, tal como soja, ou de fon- tes microbianas, tal como Bacillus.

Composições para assar compreendendo um polipeptídeo de AmyE podem ainda incluir uma fosfolipase. A fosfolipase pode ter atividade A1 ou A2 para remover ácido graxo dos fosfolipídeos, formando um liso- fosfolipídeo. A fosfolipase pode ou não ter atividade de lipase, isto é, ativida- de sobre triglicerídeos. Ela tipicamente tem uma temperatura ótima na faixa de 30-90º C, por exemplo, 30-70º C. As fosfolipases adicionadas podem ser i 15 de origem animal, por exemplo, do pâncreas, por exemplo, pâncreas bovino ou porcino, veneno de cobra ou veneno de abelha. Alternativamente, a fosfo- Â lipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, levedura ou bactérias, tal como o gênero ou espécie Aspergillus, A. niger, Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilis- simus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhi- zus, R. japonicus, R. stolonifer, Sclerotinia, S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiel- la, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli, Klebsiella, K. pneumo- niae; Proteus, P. vulgaris; Providencia, P. stuartir, Salmonella, S. typhimuri- um; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, S. flexneri; Strep- tomyces, S. violeceoruber, Yersinia, Y. enterocolitica; Fusarium, F. oxyspo- rum, linhagem DSM 2672), por exemplo. Uma fosfolipase pode ser adicionada em uma quantidade que aprimora a maciez do pão durante o período inicial após assar, particular- mente as primeiras 24 horas. A quantidade de fosfolipase vai tipicamente estar na faixa de 0,01-10 mg de proteína de enzima por kg de farinha, por exemplo, 0,1-5 mg/kg. A atividade de fosfolipase vai geralmente estar na faixa de 20-10.000 Unidades de Lipase (LU)/kg de farinha, onde a Unidade de Lipase é definida como a quantidade de enzima requerida para liberar 1 upmo!l de ácido butírico por minuto a 30º C, pH 7,0, com goma arábica como emulsificante e tributirina como substrato. As composições de massa geralmente incluem farinha de trigo e/ou outros tipos de farinha, farinha ou amido tal como farinha de milho, a- mido de milho, farinha de centeio, farinha de aveia, farinha de soja, farinha de sorgo, farinha de batata ou amido de batata. A massa pode ser fresca, congelada ou parcialmente assada. A massa pode ser uma massa fermen- tada ou uma massa a ser submetida à fermentação. A massa pode ser fer- mentada de várias maneiras, tal como adicionando agentes de fermentação químicos, por exemplo, bicarbonato de sódio, ou através da adição de um fermento, isto é, massa de fermentação. A massa pode ser também fermen- : 15 tada através da adição de uma cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro), por exemplo, . uma linhagem comercialmente disponível de S. cerevisiae.

A massa pode compreender ainda outros ingredientes de massa convencionais, por exemplo, proteinas, tal como leite em pó, glúten e soja; ovos (ou ovos inteiros, gemas de ovos ou claras de ovos); um oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbo- namida (ADA) ou persulfato de amônio; um aminoácido tal como L-cisteína; um açúcar; ou um sal, tal como cloreto de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio. A massa pode compreender ainda gordura, por exemplo, triglicerídeos, tal como gordura granulada ou gordura vegetal e/ou um emulsificante tais com mono- ou diglicerídeos, ésteres do ácido diacetil tartárico de mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, po- liglicerol ésteres de ácidos graxos, ésteres do ácido láctico de monogliceri- deos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, polioxietileno estearatos —oulisolecitina. A massa pode ser também feita sem a adição de um emulsifi- cante. Opcionalmente, uma enzima adicional pode ser usada junto com a amilase antiendurecimento e a fosfolipase. A enzima adicional pode ser uma segunda (isto é, adicional) amilase, tal como uma amiloglicosidase, uma B-amilase, uma ciclodextrina glicanotransferase; uma peptidase, em particular uma exopeptidase; uma transglutaminase; uma lipase; uma celula- se; uma hemicelulase, em particular uma pentosanase tal como xilanase; uma protease; uma proteína dissulfeto isomerase, por exemplo, uma proteí- na dissulfeto isomerase conforme descrito no WO 95/00636; uma glicano- transferase; uma enzima de ramificação (enzima de ramificação 1,4-a- glicano); uma 4-a-glicanotransferase (dextrina glicosiltransferase); ou uma oxidorredutase, por exemplo, uma peroxidase, uma lacase, uma glicose oxi- dase, uma piranose oxidase, uma lipoxigenase, uma L-amino ácido oxidase ou carboidrato oxidase. A enzima adicional pode ser de qualquer origem, incluindo mamífero e planta, e particularmente de origem microbiana (bacte- riana, levedura ou fúngica) e pode ser obtida através de técnicas convencio- p 15 —nalmente usadas no campo.

A xilanase é tipicamente de origem microbiana, por exemplo, de- - rivada de uma bactéria ou fungo, tal como uma linhagem de Aspergillus, em particular de A. aculeatus, A. niger (por exemplo, WO 91/19782), A. awamori (por exemplo, WO 91/18977) ou A. tubigensis (por exemplo, WO 92/01793); de uma linhagem de Trichoderma, por exemplo, T. reesei, ou de uma linha- gem de Humicola, por exemplo, H. insolens (por exemplo, WO 92/17573). PENTOPANº E NOVOZYME 384º são preparações de xilanase comercial- mente disponíveis produzidas a partir de Trichoderma reesei. A amiloglicosi- dase pode ser uma amiloglicosidase de A. niger (tal como AMG?). Outros produtos de amilase úteis incluem GRINDAMYLº A 1000 ou A 5000 (dispo- nível da Grindsted Products, Dinamarca) e AMYLASES H ou AMYLASEº P (disponível da Gist-Brocades, Países Baixos). A glicose oxidase pode ser uma glicose oxidase fúngica, em particular uma glicose oxidase de Aspergil- lus niger (tal como GLUZYMES). Uma protease exemplar é Neutraseº. Uma lipase exemplar pode ser derivada de linhagens de Thermomyces (Humico- la), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus ou Pseudomonas, em parti- cular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Rhizomucor mi-

ehei, Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar ou Rhizopus arrhizus ou Pseudomonas cepacia. A lipase pode ser Lipase A ou Lipase B derivada de Candida Antarctica conforme descrito no WO 88/02775, por e- xemplo, ou a lipase pode ser derivada de Rhizomucor miehei conforme des- critonaEP 238.023, por exemplo, ou Humicola lanuginosa, descrita na EP

305.216, por exemplo, ou Pseudomonas cepacia conforme descrito na EP

214.761 e no WO 89/01032, por exemplo.

A preparação de enzima contendo polipeptídeo de AmyE pode opcionalmente estar na forma de um pó granulado ou aglomerado. A prepa- ração pode ter uma distribuição de tamanho de partícula estreita com mais de 95% (em peso) das partículas na faixa de 25 a 500 um. Granulados e pós aglomerados podem ser preparados através de métodos convencionais, por exemplo, através de pulverização de polipeptídeos de AmyE sobre um veí- culo em um granulador de leito fluido. O veículo pode consistir em núcleos - 15 em partícula tendo um tamanho de partícula adequado. O veículo pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, um sal (tal como NaCl ou sulfato de só- ' dio), um açúcar (tal como sacarose ou lactose), um álcool de açúcar (tal co- mo sorbitol), amido, arroz, grãos de milho ou soja. Partículas compreendendo polipeptíideos de AmyE podem ser também encapsuladas usando um lipídeo de grau alimentício, que pode ser qualquer composto naturalmente orgânico que é insolúvel em água mas é solúvel em solventes orgânicos não-polares, tal como hidrocarbono ou dietil éter. Lipídeos de grau alimentício adequados incluem, mas não estão limita- dos a, triglicerídeos ou na forma de gorduras ou óleos que são ou saturados ou insaturados. Exemplos de ácidos graxos e suas combinações que for- mam os triglicerídeos saturados incluem, mas não estão limitados a, ácidos butírico (derivado de gordura do leite), palmítico (derivado de gordura animal e de planta) e/ou esteárico (derivado de gordura de animal e planta). Exem- plos de ácidos graxos e suas combinações que formam os triglicerídeos in- saturados incluem, mas não estão limitados a, ácido palmitoleico (derivado de gordura animal e de planta), oleico (derivado de gordura animal e de planta), linoleico (derivado de óleos de planta) e/ou linolênico (derivado de óleo de semente de linhaça). Outros lipídeos de grau alimentício adequados incluem, mas não estão limitados a, monoglicerídeos e diglicerídeos deriva- dos dos triglicerídeos discutidos acima, fosfolipídeos e glicolipídeos. O lipídeo de grau alimentício, particularmente na forma líquida, é contatado com uma forma em pó de polipeptídeos de AmyE de tal maneira que o material de lipídeo cobre (envelopa) pelo menos uma porção da super- fície de pelo menos uma maioria, por exemplo 100% das partículas de poli- peptídeo de AmyE. As vantagens de envelopamento das partículas de poli- peptídeo de AmyE são duplas. Primeiro, o lipídeo de grau alimentício prote- gea enzima de desnaturação térmica durante o processo de assar para a- quelas enzimas que são lábeis ao calor. Consequentemente, enquanto os polipeptídeos de AmyE são estabilizados e protegidos durante estágios de provisão e assar, eles são liberados do revestimento de proteção no produto assado final, onde eles hidrolisam ligações glicosídicas em poliglicanos. O 8 15 veículo de liberação carregado também provê uma liberação sustentada da enzima ativa no produto assado. Isto é, seguindo o processo de assar, os 1 polipeptídeos de AmyE ativos são continuamente liberados do revestimento de proteção em uma taxa que age contra, e então reduz, a taxa de endure- cimento.

Em geral, a quantidade de lipídeo aplicada às partículas de poli- peptídeo de AmyE pode variar de um pouco de porcentagem do peso total da a-amilase a muitas vezes este peso, dependendo da natureza do lipídeo, da maneira que ele é aplicado às partículas, da composição da mistura de massa a ser tratada e da severidade da operação de mistura de massa en- volvida A enzima envelopada em lipídeo é adicionada aos ingredientes usados para preparar um produto assado em uma quantidade eficaz para prolongar a vida de prateleira do produto assado. O padeiro computa a quantidade de a-amilase envelopada, preparada conforme acima discutido, — que será requerida para atingir o efeito antiendurecimento desejado. A quan- tidade da a-amilase envelopada requerida é calculada com base na concen- tração de enzima envelopada e na proporção de a-amilase para farinha es-

pecificada. Uma faixa ampla de concentrações foi constatada ser eficaz, embora, conforme foi discutido, aprimoramentos observáveis em antiendure- cimento não correspondam linearmente à concentração de a-amilase, mas acima de certos níveis mínimos, aumentos grandes em concentração de a- amilase produzem pouco aprimoramento adicional. A concentração de a- amilase realmente usada em uma produção de padaria particular poderia ser muito maior do que o mínimo necessário a fim de prover o padeiro com al- guma garantia contra erros de medição para baixo inadvertentes pelo padei- ro. O limite inferior de concentração de enzima é determinado pelo efeito antiendurecimento mínimo que o padeiro deseja obter.

Um método de preparação de um produto assado pode compre- ender: (a) preparação de partículas de polipeptídeo de AmMyE revestidas com lipídeo, onde substancialmente 100 por cento das partículas são revestidas; (b) mistura de uma massa contendo farinha; (c) adição da a-amilase revesti- ] 15 da com lipídeo à massa antes da mistura ser completada e terminação da mistura antes do revestimento de lipídeo ser removido da a-amilase; (d) pro- Ú va da massa; e (e) assar a massa para prover o produto assado, onde a a- amilase está inativa durante os estágios de mistura, prova e assar e está ativa no produto assado. Os polipeptídeos de AMyE envelopados podem ser adicionados à massa durante o ciclo de mistura, por exemplo, próximo ao final do ciclo de mistura para permitir distribuição suficiente na massa; no entanto, o estágio de mistura é terminado antes do revestimento de proteção ser retirado da(s) partícula(s).

Em alguns casos, a-amilase bacteriana (BAA) pode ser adicio- nadaãàs partículas revestidas com lipídeo compreendendo polipeptídeos de AmyE. BAA reduz o pão a uma massa feito goma devido à sua termoestabi- lidade excessiva e atividade retida no pão totalmente assado; no entanto, quando BAA é incorporado às partículas revestidas com lipídeo, proteção antiendurecimento adicional substancial é obtida, mesmo em níveis de do- —sagem de BAA muito baixos.

Várias modificações e variação podem ser feitas nas composi- ções e métodos. Todas as referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

EXEMPLOS No relatório acima e nas reivindicações que seguem, as abrevia- ções que seguem se aplicam: % em peso (por cento em peso); ºC (graus Centígrados); HO (água); dH2O (água deionizada); dIH27O (água deionizada, filtragem Milli-Q); g ou gm (gramas); ug (microgramas); mg (miligramas); kg (quilogramas); uL e ul (microlitros); mL e ml (mililitros); mm (milímetros); um (micrometro); M (molar); mM (milimolar); uM (micromolar); U (unidades); MW (peso molecular); seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); hr(s) (ho- ra/horas); DO (oxigênio dissolvido); P/V (peso para volume); P/P (peso para peso); V/V (volume para volume); IKA (IKA Works Inc. 263 North Chase Parkway SE. Wilmington, NC); Genencor (Danisco US Inc., Genencor Divisi- on, Palo Alto, CA); Ncm (Newton centímetro) e ETOH (etanol). eq (equiva- lentes); N (Normal); ds ou DS (teor de sólidos secos), SAPU (unidade de - 15 protease ácida espectrofotométrica, onde em 1 SAPU está a quantidade de atividade de enzima protease que libera um micromo! de tirosina por minuto ' a partir de um substrato de caseína sob condições do ensaio) e GAU (unida- de de glicoamilase, que é definida como a quantidade de enzima que vai produzir 1 g de açúcar de redução calculada como glicose por hora a partir deum substrato de amido solúvel em pH 4,26 60º O). Exemplo 1 Construção de plasmídeo e expressão de proteína O método geral que segue foi usado para construção de plasmí- deo e expressão de proteína.

1.1 Construção de Plasmídeo Ácidos nucleicos codificando a AmyE de SEQ ID NO: 1 ou uma variante de AmyE truncada C-terminal, AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), foram clo- nados no vetor de expressão pHPLT de B. subtilis, descrito na Patente U.S. No. 5.024.943. A figura 2 mostra o vetor compreendendo um ácido nucleico codificando AmyE-tr. O vetor pHPLT continha o promotor LAT de B. licheniformis ("Plat"), uma sequência codificando o peptídeo de sinal de LAT ("preLAT"),

seguido por sítios de restrição Pstl e Hpal para clonagem. "ori-pUB" é a ori- gem de replicação de pUB110; "reppUB" é o gene de replicase de pUB110, "neo" é o gene de resistência à neomicina/canamicina de pUB110; "bleo" é o marcador de resistência à bleomicina. "Tlat" é o terminador transcripcional de amilasedeB./icheniformis.

Essas e outras características de plasmídeo PUB110 são descritas em McKenzie e outros, Plasmid 15(2): 93-103 (1986). Construtos de plasmídeo para a expressão de AmyE e AmyE-tr foram montados usando a sequência de codificação de AmyE descrita por Yang e outros, "Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus sub- tilis, Nucl.

Acids Res. 11(2): 237-49 (1983). O plasmídeo pME629.5 contém o ácido nucleico codificando a AmyE de comprimento integral de SEQ ID NO: 1. O gene tem uma deleção de três bases na sequência codificando o domínio de ligação de amido, comparado com a sequência descrita por Yang e outros. : 15 O plasmídeo pME630.7, mostrado na figura 2, continha a se- quência de AmyE truncada (isto é, AMyE-tr). AmyE-tr é truncada na posição ' D425 da SEQ ID NO: 1. AmyE-tr foi projetada com base em uma estrutura de cristal de uma variante de AMyE que não tinha o domínio de ligação de amido, conforme descrito em Fujimoto e outros, "Crystral structure of a ca- talyticsite mutante aplha-amylase from Bacillus subtilis complexed with mal- topentaose", J.

Mol.

Biol. 277: 393-407 (1998). Vide também o RCSB Protein Data BankO Acession No. 1BAG, "Alpha-Amylase from Bacillus subtilis Complexed with Maltopentaose". Para expressão de construção de plasmídeo, o ácido nucleico —codificando o polipeptíideo de AmyE foi amplificado através de PCR usando HERCULASES (Stratagene, La Jolla, CA, USA) e purificado usando uma coluna provida em um estojo de purificação de PCR Qiagen QUIAQUIKº (Qiagen, Valência, CA, USA) e ressuspenso em 50 uL de água purificada MILLI-Qº. 50 ul do DNA purificado foram digeridos sequencialmente com Hpal(Roche)e Pstl (Roche) e o fragmento de DNA resultante foi ressuspen- so em 30 uL de água purificada MILLI-Qº. 10-20 ng/ul. de DNA foram clona- dos em plasmídeo pHPLT usando os sítios de clonagem de Pstl e Hpal.

As misturas de ligação foram diretamente transformadas em células de B. subti- lis competentes (genótipo: AaprE, AnprE, degUHy32 oppA, Aspol/lE3501, amyE::xyIRPxylAcomK-phleo). - Essas células de B. subtilis tinham um ge- ne de competência (comK) posto sob o controle de um promotor induzível —porxilose.

Competência para ligação a DNA e absorção é induzida pela adi- ção de xilose.

Devido ao fato do gene amyE no plasmídeo parental ter dois sítios de Pstfl, uma reação de fusão de PCR foi realizada para remover esses sítios antes da clonagem.

Fusão por PCR foi realizada após duas reações de PCR separadas.

Os primers que seguem foram usados para produção do construto de pHPLT usando os sítios Hpal e Pstl:

SEQ ID NO: 10: Iniciador PSTAMYE-F' $$CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTT- ACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC-3'

SEQ ID NO: 11: Iniciador AMYENOPST-R'

- S*CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG- GAACTCTGCTGATGTATTTGTG-3'

' SEQ ID NO: 12: Iniciador AMYENOPST-F' SX&CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA- TCCTTCAGGATAGTGCCTCÇAG-3'

SEQ ID NO: 13: Iniciador HPAIAMYE-R' SCAGGAAATCCGTCCICIGITAACICAATGGGGAAGA- GAACCGCTTAAGCCCGAGTC-3'

SEQ ID NO: 14: Iniciador HPAIAMYE-R' S=CAGGAAATCCGTCCTCTGITAACTCAATCAGGATAA- AGCACAGCTACAGACCTGG-3'

SEQ ID NO: 15: Iniciador AMYE SEQ-F' $TACACAAGTACAGTCCTATCTG-3'

SEQ ID NO: 16: Iniciador AMYE SEQ-F'

S-CATCCTCTGTCTCTATCAATAÇC-3' Os plasmídeos pME629.5 e pMNE630.7 expressam AmyE com uma sequência de sinal de 31 resíduos, que é clivada pós-traducionalmente.

Os 10 aminoácidos N-terminal subsequentes são processados separada- mente como proposto por Yang e outros (1983). pME629.6 codifica AmyE de

"comprimento integral" e pME630.7 codifica AMyE "truncada".

1.2 Expressão de Proteína Transformantes bacterianos carregando construtos codificando polipeptídeos de comprimento integral e truncados de AmyE foram selecio- nadosem ágar Luria (LA) com 10 ug/mL de neomicina, amido insolúvel 1% e incubados da noite para o dia a 37º C. Os transformantes mostrando um cla- reamento (ou halo) em torno da colônia foram selecionados para estudos adicionais. Pré-culturas de cada um dos transformantes foram cultivadas por 8 horas em LB com 10 ug/mL de neomicina. 30 ul de cada pré-cultura foram adicionados em um frasco de 250 mL cheio com 30 mL de meio de cultivo (descrito abaixo) suplementado com 10 ug/mL de neomicina e CaCl; 5 mM. O meio de cultivo era um meio semidefinido enriquecido baseado em tam- pão MOP's, com ureia como a fonte de nitrogênio principal, glicose como a fonte de carbono principal e suplementado com soytone 1% para crescimen- . 15 tode célula robusto. Os frascos de agitação foram incubados por 60-65 ho- ras a 37º C com mistura a 250 rpm. As culturas foram colhidas através de 1 centrifugação a 5.000 rpm por 20 minutos em tubos cônicos. Uma vez que ambas as proteínas AmyE de comprimento integral e AmyE truncada ex- pressavam em níveis altos, os sobrenadantes de cultura foram usados para ensaios subsequentes sem purificação adicional. Exemplo 2 Ensaios Comuns Os ensaios que seguem foram usados nos exemplos descritos abaixo. Desvios dos protocolos providos abaixo são indicados nos exemplos individuais. Nesses experimentos, um espectrofotômetro foi usado para me- dir a absorbância dos produtos formados após o término das reações.

2.1. Ensaio de atividade de amilase A atividade de amilase foi medida espectrofotometricamente. Amido de milho insolúvel covalentemente ligado com o marcador Remazol Brilliant Blue R ("amido de milho RBB", Sigma S7776) foi usado como um substrato. 75 ul. de pasta fluida 2% (peso ds) de amido de milho RBB em acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, 5,0 ou 5,6, foram adicionados a 10 ul de

100 ug /mL de enzima e misturados totalmente. A mistura foi então incubada a 50º C por 30 minutos. As amostras foram então postas em gelo e substrato foi removido através de centrifugação a 4.100 rpm por 20 minutos usando uma centrífuga de mesa. A quantidade de produto foi determinada através da medição da quantidade de corante azul liberada do amido. A densidade óptica (OD) do corante foi medida em triplicata a 595 nm.

2.2. Ensaio de medição de viscosidade Um viscômetro foi usado para medir a viscosidade de um subs- trato de amido de milho na presença de uma amilase em pH 4,5 e 5,8. Uma batelada de pasta fluida de amido de milho 30% ds foi recém-feita, usando ácido sulfúrico para diminuir o pH ou para 4,5 ou 5,8. Para cada reação, 50 g de pasta fluida (15 g ds) foram pesados e aquecidos por 10 minutos para 70º C. Quando da adição da a-amilase, a temperatura foi imediatamente aumen- tada de 70º C para 85º C e a reação foi agitada a 75 rpm. Uma vez a tempe- - 15 ratura da pasta fluida e da mistura de enzima tendo atingido 85º C, a visco- sidade foi monitorada por mais 30 minutos. E 2.3. Calorimetria diferencial de varredura (DSC) para medir estabilidade térmica A função de capacidade de calor em excesso de AmyE ou uma variante da mesma foi medida na presença ou na ausência de cloreto de cálcio 2 mM usando um microcalorímetro de alto rendimento de varredura ultrassensível (VP-Capillary DSC; MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA). Aproximadamente 500 ul de 0,5 mg/ml de AmyE ou uma variante da mes- ma foram digitalizados em faixa de temperatura de 30-120º C. a-Amilase de Geobacillus stearothermophilus truncada (AmyS) foi usada como um contro- le. A sequência de aminoácido de AmyS, incluindo uma sequência de sinal de 34 aminoácidos, é mostrada na SEQ ID NO: 4. A mesma amostra foi en- tão novamente digitalizada para checar a reversibilidade do processo. O tampão usado era acetato de sódio 10 mM, pH 5,5. Uma taxa de digitaliza- ção de 200º C/hfoiusada para minimizar quaisquer produtos resultantes de agregação. O ponto médio térmico (Tm) das curvas de DSC foi usado como um indicador de estabilidade térmica. O erro padrão em todas as medições de Tn era menos do que 1%.

2.4. Ensaio Bradford em placas de microtitulação de 96 po- ços A concentração de proteína em sobrenadantes de amostra foi determinada usando o Bradford QUICKSTARTº Dye Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). As amostras foram obtidas através de filtragem de cal- dos de culturas cultivadas em placas de microtitulação (MTPs) por 3 dias a 37º C com agitação a 280 rpm e aeração umidificada. 10 ul do filtrado de cultura foram combinados com 200 uL de Bradford QUICKSTARTº Dye Re- agentem um poço de uma segunda MTP. Após mistura completa, as MTPs foram incubadas por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. Bo- Ilhas de ar foram removidas e a OD (Optical Density — (Densidade Óptica)) foi medida a 595 nm. Para determinar a concentração de proteína, a leitura de base (de poços não inoculados) foi subtraída das leituras de amostra. - 15 2.5. Formação de glicose através de medição de HPLC Hidrólise de maltose e maltoeptaose ' Soluções de maltose ou maltoeptaose 0,5% foram preparadas em acetato de sódio 50 MM, pH 4,5 ou 5,6 ou em ácido málico 50 mM pH 5,6, conforme especificado para cada experimento. Todas as amostras de enzima foram inicialmente diluídas para 1 mg/mL. As misturas de reação foram preparadas diluindo a enzima usando as soluções de substrato apro- priadas para dar uma concentração de enzima final de 1 ppm, e então alí- quotas de 200 uL foram transferidas para tubos de tampa de rosca estéreis e postas em uma incubadora a 37º C. As reações foram paradas nos mo- mentos indicados através da diluição de 10 vezes em hidróxido de sódio 10 mM. Hidrólise de amido insolúvel Para medição da hidrólise de amido granular insolúvel, AMyE purificada ou suas variantes (24,5 g/L) foi diluída para uma concentração final de20,4 ppm em tampão de ácido málico, pH 5,6. A proteína foi então adicionada a uma solução de farinha de milho 5% preparada em tampão de ácido málico, pH 5,6, para uma concentração final de 1 ppm, e a mistura foi incubada em um agitador a 32º C. Amostras foram periodicamente removi- das e diluídas 10 vezes em NaOH 50 mM para extinguir a reação. Método de detecção de HPLC A formação de glicose e outros produtos de quebra dos substra- tosfoianalisada através de HPLC usando um sistema Agilent 1100 LC equi- pado com uma coluna Dionex PA-1 e detector eletroquímico. Amostras de uL foram injetadas e um gradiente de NaOH e acetato de sódio foi apli- cado a 1,0 mL/min 25º C. A distribuição de sacarídeos foi determinada a par- tir de padrões previamente ativados. Perfis de eluição foram obtidos durante 10 45 minutos. Quantificação de glicose produzida (relatada como g/L) foi obti- da usando padrão de referência de glicose autenticado (Sigma, MO, USA) para converter área de pico para os açúcares em concentrações de açúcar reais.

2.6. Formação de glicose usando substratos de maltose e 7 15 maltoeptaose A quebra de maltose ou maltoeptaose em glicose foi ensaiada Ú através de HPLC. Soluções de maltose e maltoeptaose 0,5% foram feitas em um tampão de acetato de sódio 50 mM em pH 4,5 e pH 5,6. Todas as amostras de enzima foram diluídas para 1 mg/mL de estoques purificados. À amostra de enzima de 1 mg/mL foi diluída mais na solução de maltose para dar uma concentração final de 1 ug/mlL de enzima. Alíquotas de 200 uL fo- ram então adicionadas a tubos de rosca estéreis e postas em uma incubado- ra a 37º C. As reações foram paradas após 2, 5 e 8 dias através da adição de hidróxido de sódio. A formação de glicose e a quebra de maltose foram analisadas através de HPLC contra padrões autênticos, usando os métodos descritos no Exemplo 2.5.

2.7 Ensaio triplex Ensaios de açúcares de redução totais padrão, glicose e iodo padrão foram realizados separadamente para caracterizar os produtos de digestão de amilopectina. Um substrato de amilopectina de milho 2,2% (p/p) foi preparado em tampão de acetato de sódio 55 mM pH 5,8 através da fer- vura da mistura com agitação por 30 minutos e então esfriamento para tem-

. 144/586 peratura ambiente. Cem yl de substrato foram postos em poços de uma pla- ca de microtitulação de poliestireno de ligação a meio de 96 poços e 10 ul de sobrenadantes de cultura diluídos de variantes de AmyE foram adicionados a ela. As placas foram vedadas (Nunc, No. cat. 236366) e imediatamente postasem uma incubadora de agitação iEMS e incubadas a 50º C por 10 minutos, 1150 rpm. As reações de amilase foram terminadas através da adi- ção de 20 ul. de NaOH 0,5N com mistura. Açúcares de redução totais presentes foram determinados atra- vês de mistura de 20 ul de 4-hidroxibenzidrazida 5% p/v (Sigma H9882, pre- paradaem HCl O,5N) com 80 ul de NaOH 0,5N seguido por 20 ul de reação de amilase em uma placa de PCR de borda inteira (full skirf) (Axygen PCR- 96-FS-C). A placa foi vedada (Microseal B adhesive sealer, BioRad MSB- 1001) e incubada a 95º C por 2 minutos seguido por esfriamento imediato para 25º C em um bloco de aquecimento de termociclização estilo PCR. 80 D 15 uLlde amostra de reação foram transferidos para uma placa de microtitula- ção de 96 poços de poliestireno e a densidade óptica foi medida a 440 nm - usando uma leitora de placa Spectramax. Glicose total presente em reações de amilase foi determinada em uma placa de microtitulação através de mistura de 20 ul de amostra de reação com 50 ul de 5,8 mg/ml de sal de diamônio de ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolino-S6-sulfônico) (Sigma, A1888) em tampão de fosfato de po- tássio 50 mM pH 6,8, contendo 0,005% de Tween 80 v/v seguido pela adi- ção de 30 ul de solução contendo 0,33 U/ml de peroxidase de peroxidase de rábano silvestre tipo VI (Sigma, P8375), 3,33 U/ml OxyGo (Glicose Oxidase, Genencor) preparado no mesmo tampão. A placa de microtitulação foi ime- diatamente posta em uma leitora de placa Spectramax, agitada por 5 segun- dos e a densidade óptica foi monitorada a 405 nm em intervalos de 9 segun- dos pelo período de tempo de 60-180 segundos.

Análise de iodo de reações de amilase foi realizada misturando uma diluição 1:4(em água)de amostra de reação de amilase com 80 ul de reagente Lugols (5 g de iodo, 10 g de iodeto de potássio dissolvidos em 100 ml de água) diluídos 1:20 em água em uma placa de microtitulação de poli-

. 145/586 estireno. A densidade óptica a 580 nm foi determinada usando uma leitora de placa Spectramax. Microsoft Excel foi usado para agrupar dados adquiri- dos do software Sofmax Pro (leitora de placa).

Os resultados de iodo são relatados como OD580 total; compri- mento de cadeia/amilose residual é uma função de OD total, desta maneira atividade de amilase é inversamente proporcional a OD total. Os açúcares de redução totais são relatados como OD440 total e são proporcionais a OD, desta maneira atividade de amilase é diretamente proporcional a OD. Glico- se total é relatada como uma taxa cinética no ensaio de glicose e é direta- mente proporcional. OD e taxas são relatados em lugar de conversão em quantidades conhecidas usando curvas padrão construídas a partir de glico- se. Razões são relatadas usando dados brutos e são então sem unidade. Os três tipos de dados foram combinados graficamente, como uma razão de iodo dividida pela razão de açúcares de redução total para glicose. - 15 2.8. Ensaio de viscometria de alto rendimento para determi- nação da taxa de redução de viscosidade É Um ensaio de viscometria de alto rendimento foi desenvolvido usando o rotor molecular comercialmente disponível CCVJ (9-(2-carboxi-2- cianovinil)julolidina). Um rotor molecular é uma espécie fluorescente cujo rendimento quantum (o número de fótons emitido dividido pelo número de fótons absorvidos) é dependente do volume livre do microambiente, que é relacionado por sua vez com a viscosidade. Para tais moléculas, rotação intramolecular é o modo de relaxamento preferido do estado excitado. Rota- ção intramolecular é inibida de uma maneira proporcional à viscosidade do microambiente, o equilíbrio de energia sendo dissipado através de relaxa- mento radiativo (emissão fluorescente).

Para medição da taxa de redução de viscosidade devido à ativi- dade enzimática, o rotor molecular CCVJ foi incorporado a uma suspensão tamponada de amilopectina de milho como segue. Uma solução de estoque de100mM de CCVJ foi preparada através da adição de 186 ul de dimetil sulfóxido a um frasco contendo 5 mg de CCVJ liofilizado (Sigma Aldrich Cor- poration, St. Louis, MO). A solução de estoque de CCVJ foi armazenada no

, 146/586 escuro em temperatura ambiente e checada quanto à precipitação antes do uso. 90 g de amilopectina de milho (MP Biomedicals LLC, Solon, OH) foram adicionados a 2.850 mL de água destilada. Isto foi aquecido até fervura com agitação constante, condições sob as quais a amilopectina gradualmente gelatinizoue dissolveu. A suspensão uniformemente viscosa, resultante, de amilopectina geleificada foi removida da fonte de calor e agitada continua- mente conforme ela retornava para temperatura ambiente, ponto onde 150 mL de tampão de acetato de sódio 1M pH 5,8 (antes preparado através de titulação de 1 molar de acetato de sódio com ácido acético 1 M) foram adi- cionados, seguido por 150 ul. de Tween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO). Quando o Tween-80 foi completamente dissolvido, 150 ul da solução de estoque de CCVJ 100 mM foram adicionados e dissolvidos, pon- to onde o reagente de amilopectina/ CCVJ estava completo e pronto para uso. O reagente foi armazenado em vidro transparente em temperatura am- - 15 biente com agitação constante durante os três dias que levou para completar a avaliação de viscometria.

À Para o ensaio, todas as tarefas de manuseamento de líquido fo- ram executadas por um robô Biomek FX” equipado com um cabeçote muiti- canal que permitia a pipetagem simultânea de todas as 96 poços de uma placa de microtituiação de 96 poços. 60 ul de reagente de amilopecti- na/CCVJ foram adicionados a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços de poliestireno sem tratamento preta (Corning Incorporated, Cor- ning, NY). 30 ul de amostra de enzima foram pipetados em cima disto e a placa de micrototitulação foi imediatamente lida em um fluorômetro Spec- tramax M2e (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA), que foi ajusta- do como segue: modo de fluorescência de leitura superior; comprimento de onda de excitação 435 nanometros (nm); comprimento de onda de emissão 495 nm; comprimento de onda de cutoff 455 nm; modo de leitura cinético com intervalo de leitura de 24 segundos; agitação de 15 segundos antes da leitura inicial, agitação de 3 segundos entre as leituras; tempo de leitura total de 192 segundos com um período de atraso de 20 segundos (eliminando de cada cálculo de taxa cinética os 9 primeiros pontos de dados coletados).

: 147/586 Neste ensaio, a taxa de redução de viscosidade foi medida em termos da taxa da queda no sinal de fluorescência. Taxas cinéticas de redu- ção de sinal de fluorescência foram automaticamente calculadas como "Vmax (mili-unidades por min)" pelo Softmax Pro, o software que vem com osinstrumentos Spectramax.

2.9 Ensaio de viscometria de alto rendimento para determi- nação de viscosidade pós-liquefação Para medição da redução em viscosidade pós-liquefação devido à atividade enzimática, o rotor molecular CCVJ foi incorporado a uma pasta fluidatamponada de farinha de milho como segue. Uma solução de estoque 100 mM de CCVJ foi preparada através da adição de 186 ul de dimetil sulfó- xido a um frasco contendo 5 mg de CCVJ liofilizado (Sigma Aldrich Corpora- tion, St. Louis, MO). A solução de estoque de CCVJ foi armazenada no es- curo em temperatura ambiente e checada quanto à precipitação antes do uso. Farinha de milho orgânica (Azure Farm, Dufur, OR) foi passada por ! uma peneira de 600 micrometros, então assada a 95 graus por 16 horas e " retornada para temperatura ambiente. Uma pasta fluida de farinha de milho de pH 5,8, 20% (p/p) foi preparada em bateladas de 2 kg através da combi- nação de 1520 g de água destilada, 80 mL de tampão de acetato de sódio 1MpH5,6 (previamente preparado através de titulação de 1 molar de aceta- to de sódio com 1 molar de ácido acético), 80 ul de Tween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO), 80 ul da solução de estoque de CCVJ 100 mM e 400 g de farinha de milho orgânica peneirada. A pasta fluida foi vigorosa- mente e continuamente agitada por meia hora usando uma barra de agita- ção magnética, ponto onde o pH foi checado e confirmado ser 5,8. A pasta fluida foi agitada vigorosamente e continuamente para manter a farinha de milho uniformemente dispersa, enquanto 90 ul de pasta fluida foram adicio- nados a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços de poliesti- reno sem tratamento preta (Corning Incorporated, Corning, NY) usando uma pipeta multicanal com pontas de 200 ul aparadas para um diâmetro interno de aproximadamente 2,3 milímetros, determinado através de calibrador ver- nier (Mitutoyo Corporation, Kure, Hiroshima, Japão). Para cada poço de pla-

. 148/586 ca de microtitulação, 10 ul de amostra de enzima foram pipetados em cima da pasta fluida de farinha de milho, após o que a placa foi vedada com uma vedante adesivo (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) e firmemente intercalada entre placas de metal pré-equilibradas em um forno em alta tem- peratura ajustado para 80 graus C.

A placa foi incubada por uma hora, após o que a placa foi removida para temperatura ambiente e deixada da noite para o dia em temperatura ambiente.

No dia seguinte, o vedante da placa foi removido e a placa foi lida em um fluorômetro Spectramax M2e (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) que foi ajustado como segue: modo de fluorescência de leitura superior; comprimento de onda excitação 435 nano- metros (nm); comprimento de onda de emissão 495 nm; comprimento de cutoff 455 nm.

Neste ensaio, uma diminuição em sinal fluorescente corres- pondeu a uma diminuição na densidade da farinha de milho gelatinizada, que por sua vez correspondia a um aumento em liquefação devido à ativida- f 15 deenzimática.

Exemplo 3 À Atividade específica e pH ótimo A atividade específica e o pH ótimo de AmyE de comprimento in- tegral (SEQ ID NO: 1), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) e suas variantes foram me- didos usando ensaios descritos no Exemplo 2.1. As atividades específicas foram determinadas espectrofotometricamente determinando a quantidade de corante liberado de um substrato de amido de milho RBB durante 30 mi- nutos a 50º C e pH 4,5, 5,0 e 5,6. A figura 3 mostra que AmyE-tr e AmMy31A têm atividades específicas mais altas em pH 4,5, comparado com pH 5 ou 5,6. AmyE mostra uma atividade específica maior em pH 5 do que em pH 5,6. Exemplo 4 Redução da viscosidade de um substrato de amido de milho A habilidade de AMyE, AmyE-tr e suas variantes em reduzir a viscosidade de um substrato de amido de milho foi determinada usando o método de ensaio descrito no Exemplo 2.2. A viscosidade foi medida como uma função de tempo em pH 4,5 e 5,8 para cada enzima.

As figuras 4A e

48, respectivamente, mostram que AmyE-tr e AmyE reduziram a viscosidade do substrato em ambos o pH 4,5 e 5,8. As viscosidades de pico eram a mesma, enquanto uma viscosidade final menor foi observada em pH 5,8. As figuras 4C e 4D, respectivamente, mostram que Amy31A tem um desempe- nhomelhorem pH 4,5 do que pH 5,8. Exemplo 5 Estabilidade térmica As estabilidades térmicas de AmyE, AmyE-tr e suas variantes fo- ram medidas na presença e na ausência de Ca?** para determinar se Ca?* contribuía para a estabilidade das enzimas, usando calorimetria diferencial de varredura (DSC) conforme descrito no Exemplo 2.3. DSC revelou que o processo de desdobramento térmico era irreversível.

A figura SA mostra os perfis de desdobramento de DSC para AmyE e AmyE-tr, com e sem ca? 2 mM.

A figura 5B mostra os perfis de desdobramento de DSC para variante Amy31A de comprimento integral.

A ausência de qualquer efeito de cálcio sobre os pontos de fusão térmicos sugere que nem AmyE, AmyE-tr nem Amy31A se liga a Ca?* ou são estabilizados por Ca?* na faixa de concentra- ção de mM.

Resultados contrastantes foram obtidos para a-amilase de G. stearothermophilus (AmyS), conforme mostrado na figura 5C.

A Tabela 1 sumarizaa temperatura de fusão das enzimas testadas.

Adição de Ca?** não mudou significantemente a estabilidade térmica de AmyE, AmyE-tr ou Amy31A, enquanto Ca** aumentou significantemente a estabilidade de AmysS.

Tabela 1. Sumário de medições de Th DSC ama RÉ Sem CaCl; adir = Com CaCl, AT Amostra cionado 2mM AmyE truncada 74,6 74,5 -0,1 AmyE de comprimento integral 76,4 76 -0,4 Amy31A variante 74,8 74,4 -0,4 AmyS 100 107,3 7,3

. 150/586 Exemplo 6 Conversão de maltose e maltoeptaose em glicose A habilidade de AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) e seis variantes de Am- yE de posição Q153 (C, F, 1, K, N e V) de AmyE-tr em converter substratos de maltosee maltoeptaose em glicose em pH 5,6 foi testada usando o en- saio de formação de glicose descrito no Exemplo 2.3. Glicose gerada foi medida após 1, 2 e 3 dias. Variantes AmyE-tr e AmyE foram usadas em 1 ppm. AmyS truncada (SEQ ID NO: 4) foi usada para comparação em uma dose similar.

A figura 6 mostra os resultados de produção de glicose a partir de um substrato de maltose. A produção de glicose por AmyS foi mínima, enquanto AmyE-tr e as variantes da posição Q153 produziram quantidades significantes de glicose. A variante Q153N foi o melhor produtor de glicose sob essas condições. Esses resultados confirmam que AmyE e uma variante f 15 de AmyE produzem eficientemente glicose a partir de maltose. A figura 7 mostra os resultados de produção de glicose a partir À de um substrato de maltoeptaose. Como foi o caso com maltose como um substrato, AmyS converteu maltoeptaose em glicose com eficiência pobre. Em contraste, AmyE-tr e as variantes da posição Q153 converteram malto- eptaose em glicose com muita eficácia, com variantes de A153K e F mos- trando a maior conversão por volta do dia 3. Este exemplo demonstra que AmyE e uma variante de AMyE produzem eficientemente glicose a partir de oligossacarídeos complexos.

Exemplo 7 Conversão de maltoeptaose em glicose A habilidade de AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), AmyS e variante de AmyE Q153K em converter maltoeptaose (DP7) em glicose (DP1) foi testa- da. Os produtos das reações foram analisados usando o método de HPLC descrito no Exemplo 2.2. Perfis de eluição representativos são mostrados nasfiguras8-10.

A figura 8 mostra que AmyE-tr converte DP7 predominantemen- te em DP1 e quantidades residuais de maltose (DP2) após uma incubação

I 151/586 de 72 horas. Em contraste, a figura 9 mostra que AmyS converte DP7 em oligossacarídeos menores com o tempo, produzindo uma mistura de oligos- sacarídeos DP5, DP4, DP3, DP2 e DP1. A figura 10 mostra um curso de tempo da conversão de DP7 em oligossacarídeos menores na presença de variante de AMyE Q153K. Níveis significantes de DP1, DP2 e DP3 foram detectados em menos de 1 h. Por volta de 3 h, a variante Q153K converteu DP7 predominantemente em DP1. Esses resultados mostram que AmyE e uma variante da mesma podem produzir eficientemente glicose (DP1) a par- tir de um substrato de DP7. Exemplo8 Geração e expressão de variantes posicionais Este exemplo refere-se à geração e à expressão de uma biblio- teca de variantes posicionais.

8.1. Geração de Bibliotecas Posicionais Plasmídeo pME630.7 (figura 2, Exemplo 1) foi usado para gerar bibliotecas posicionais em 150 resíduos de aminoácido diferentes de AMyE- - tr. A Tabela 1 lista cada resíduo para o qual uma biblioteca posicional foi fei- ta. Os resíduos são numerados com base em sua posição em SEQ ID NO:

2. O aminoácido listado em cada posição é o resíduo que aparece na AmyE deSEQIDNO:2 (isto é, o resíduo tipo selvagem). Tabela 1 vari- | ração duo ante ração duo do | Vari- | ração duo do ante | SEQ ID | do tipo | No. SEQ ID | tipo ante | SEQ ID | tipo NO: 2 selva- NO: 2 selva- NO: 2 selva- gem gem gem For Te ep Tee o | 2 | 2 jT js (13 w 12 26 E 18 | 3 ja 6 jm jr 13 27 |E | EE e e e e Be es | E Be ss Ts xs To e 8 ds 6 j163 jo 16 24 |D | Fo ss re Ss [re Tr) 8 2 Ns jo |R 18 37 | P | ESB kk Ts Ts Te 1 Tas Te

. 152/586 vari- | ração duo ante | ração duo do | Vari- | ração duo do ante | SEQ ID | do tipo | No.

SEQ ID | tipo ante | SEQ ID | tipo NO: 2 selva- NO: 2 selva- NO: 2 selva-

gem gem gem Fo a e Tere ee Se ns [O be ms e p& kk Te e PO ee e | [13 [3 6 1166 To ns se Tn [1a q Tr Te be e ms Te poe 7 [é ms me vo) [36 [4 [a e [5 Te Tn de E E [FO re e me e) Fe JE [e [1 | [ns ss x | [19 Ta qn 6 e TN nes Ts | [20 To Ta Sr Teo TT 12 Ts Ta ! [2 Te pe [me a qm sm e | BT ls [6 [2 Te Je 5 Rr : [E FR e 7 e po e e Ts | 23 Ts NO e [ss e es Ta) [26 Ts a [6 [2 fa [mw 6 fe BR tro 7 e a br ss Ja | [30 Tr Ta Ts [2 qn [1 e Te) [31 es a [a 1 Tyr Dn se 1 [32 18 Je e [2 Tn [1 e Te) [33 ]8 fe [8 [2 [ss 15 158 Tn) [x To [Te a 1a Ts Tn [36 [15 [o 6 [2 [N [136 [38 ss [E Tr oO e ee ne se Te [38 Ts Ta Je [25 [e 1 [58 [58 os Ta e [ar Ss ss Tso Ts [2 Tr [e e 1 se Ts [1 ms x [e e Ts mes Tr [e [ns [e e 1 1 ss Ta [E TT e re DT 11: Tx

. 153/586 vari- | ração duo ante | ração duo do | Vari- | ração duo do ante | SEQ ID | do tipo | No. SEQ 1D | tipo ante SEQ ID | tipo NO: 2 selva- NO: 2 selva- NO: 2 selva- gem gem gem ET N [e ss a [mes |P [as 123 je os [24 |s j15 (33 |R | [46 124 jnN os [256 |D j1m6 356 |D | [as 126 jo o [29 |D j1m6 41 6 | [2 Te Ds 2 Tx e dam Ts [ Ta Ss Sr Se e Tso Ts Tn A biblioteca posicional para cada um dos 150 resíduos listados na Tabela 1 continha aproximadamente 16 variantes de substituição de ami- noácido. As bibliotecas consistiam em células de B. subtilis transformadas contendo plasmídeos de expressão codificando sequências de variante de AmyE nas 150 posições descritas. Cada variante foi confirmada através de ' análise de sequenciamento de DNA antes da avaliação da atividade da pro- : teina. Clones individuais foram culturados conforme descrito abaixo para obter as variantes de AmyE diferentes para caracterização funcional.

8.2. Expressão de Proteína Os transformantes de B. subtilis contendo variantes de substitui ção de AmyE foram culturados em placas de 96 poços por 8 horas em LB (caldo Luria) com 10 pg/ml de neomicina e 30 ul desta pré-cultura foram adi- cionados a um frasco de 250 mL cheio com 30 mL de meio de cultivo (des- critos abaixo) suplementado com 25 ppm de cloranfenicol e CaCl 5 mM. Os frascos foram incubados por 60-65 horas a 37º C com mistura rotacional constante a 250 rpm. As culturas foram colhidas através de centrifugação a

5.000 rpm por 20 minutos em tubos cônicos. Os sobrenadantes de cultura foram usados para ensaios. O meio de cultivo era um meio semidefinido en- riquecido baseado em tampão de MOP's, com ureia como fonte de nitrogênio principal, glicose como a fonte de carbono principal e suplementado com soytone 1% para crescimento de célula robusto. Exemplo 9 Ensaio de hidrólise de amido para medir atividade específi-

f 154/586 ca e estabilidade térmica As variantes da posição de AmMyE foram avaliadas usando um ensaio de hidrólise de amido para medir a atividade específica e a estabili- dade térmica. Variantes de AmyE também foram ensaiadas usando um en- —saiode retalho de limpeza para medir o desempenho de remoção de man- cha. A estabilidade do pH de variantes de AmyE foi avaliada através da me- dição da atividade de amilase em um substrato de maltoeptaose. A termoes- tabilidade de cada uma das variantes de AmyE foi determinada através da medição da atividade de amilase em um substrato de maltotriose antes e após estresse por calor.

9.1. Determinação de Atividade Específica e Estabilidade Térmica Um ensaio de hidrólise de amido foi usado para medir atividade e estabilidade específicas de AmyE e variantes de AmyE. Condições que T 15 imitam mais próximo aplicações do mundo real em limpeza e processamento de grão foram usadas. Atividade é definida como extremidades de redução geradas por quebra enzimática de farinha de milho. Extremidades de redu- ção foram determinadas usando um ensaio PAHBAH (hidrazida do ácido p- hidroxibenzoico), descrito abaixo. Estabilidade é definida como atividade sustentada a80ºC.

Hardware: Agitador aquecedor Inheco Variomag Teleshake 95 com adaptador de placa para PCR (Hamilton Company, Reno NV); dispen- sador automático Thermo Electron Multidrop (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA); incubadora iEMS (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA); dispensador de disco de agitação &P Scientific (modelo VP722B); pla- ca de PCR de borda inteira Axygen PCR-96-FS-C (Axygen Scientific, Inc., Union City, CA); termociclizadores Tetrad (MJ Research, Waltham, MA), manuseadores de líquido Biomelº FX (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Hidrólise de amido: Azure Farms Organic Corn Flour (Norco, CA, USA) foipeneirada para obter a fração de <60 mícrons, assada 4 horas a 80º C, então deixada equilibrar da noite para o dia em temperatura ambien- te. A farinha de milho seca preparada foi posta em placas de POR Axygen b 155/586 usando a unidade VP722B como um dispensador com tampa de pó. À mas- sa de farinha posta em cada poço foi determinada ser aproximadamente 5 mg. 100 uL de acetato de sódio 50 mM pH 5,6 (para um pH de suspensão final -5,8) foram adicionados a cada poço e misturados. Sobrenadantes de —cultuoradeAmyE e variantes de AmyE foram diluídos para aproximadamente 20 pg/ml em tampão de diluição (água + Tween-8- 0,005%). 10 ul de sobre- nadante diluído foram transferidos para placas de reação de 8 minutos e 30 minutos e misturados uma vez através de pipetagem da amostra para cima e para baixo. Uma alíquota de 50 ul de óleo mineral leve foi transferida para cadapoço.As placas foram transferidas para unidades Inheco preaquecidas para 80º C. Em vários pontos de tempo seguindo incubação, a reação de hidrólise de amido foi parada através da adição de 10 ul de NaOH 4N a ca- da poço. Os produtos de reação de hidrólise de amido foram analisados a- través do ensaio PAHBAH. - 15 Ensaio PAHBAH: Alíquotas de 80 ul de NaOH 0,5N foram adi- cionadas a todos os poços de uma placa de PCR vazia (uma "placa de rea- á ção de PAHBAH"), seguido por 20 yuL de reagente de PAHBAH (hidrazida do ácido p-hidroxibenzoico 5% p/v (Sigma No. H9882, St. Louis, MO, USA) dis- solvidos em HCI 0,5N). As soluções foram misturadas através de pipetagem paracima e para baixo. 10 ul dos sobrenadantes de reação de hidrólise de amido foram adicionados a cada poço da placa de reação de PAHBAH. As placas foram vedadas em um termociclizador, programadas por 2 minutos a 95º C e então esfriadas para 20º C. Amostras de 80 yL das misturas de rea- ção de PAHBAH desenvolvidas foram transferidas para uma placa fresca, e —absorbância foi medida a 405 nm em um espectrofotômetro.

9.2. Determinação de Desempenho de Remoção de Mancha O desempenho de remoção de mancha de AmyE e variantes de AmyE foi determinado usando microrretalhos manchados com amido de ar- roz CS-28. Microrretalhos de diâmetro circular de 6,35 mm (% polegadas) foram obtidos da CFT Vlaardingen (Países Baixos). Dois microrretalhos fo- ram postos em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. As amostras de caldo de cultura filtrado foram testadas em uma y 156/586 concentração apropriada através de diluição com uma mistura de NaCl 10 mM, CaClz 0,1 MM, Tween-80 0,005% para 20x a concentração final no tes- te de desempenho. A concentração final de enzima foi cerca de 0,025-0,10 ppm. Desempenho de amilase foi medido em ambos o pH 8 e o pH 10.

190 ul ou de (A) uma solução tampão contendo HEPES 25 mM (Sigma, H7523), CaCl; 2 mM, Tween-80 0,005%, pH 8,0 ou (B) uma solução tampão contendo CAPS 25 mM (Sigma, C2632), CaClz 2 mM, Tween-80 0,005%, pH 10 foram adicionados a cada poço das placas contendo micror- retalhos. 10 ul de amostras de amilase diluídas foram adicionados a cada poço para prover um volume total de 200 ul/poço. A placa foi coberta com uma vedação de placa e posta em uma incubadora iEMS por 60 minutos a 40º C com agitação a 1.150 rpm. Seguindo incubação sob as condições a- propriadas, 100 ul de solução de cada poço foram removidos e postos em uma placa de microtitulação fresca e a absorbância foi medida a 488 nm em V 15 um espectrofotômetro. "Controles vazios", contendo 2 microrretalhos por po- ço e detergente mas sem quaisquer amostras de amilase, foram também ó. incluídos no teste. Cálculo do desempenho de hidrólise de amido de arroz CS-28: O valor de absorbância obtido foi corrigido para o valor controle vazio. A ab- —sorbância resultante, "AOD488", era uma medida para atividade de amilase. Para cada AmyE ou variante de AMyE, o índice de desempenho foi calcula- do dividindo a atividade da variante pela atividade da enzima do tipo selva- gem. O índice de desempenho então representa uma comparação do de- sempenho da variante (valor real) e da enzima de referência AMyE padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Ainda, os valores teóri- cos foram calculados usando os parâmetros da equação Langmuir da enzi- ma AmyE padrão. Variantes com diferenças de desempenho sobre enzima do tipo selvagem foram caracterizadas por um índice de desempenho (PI) (Perfor- —mancelndex). Um PI maior do que 1 (PI > 1) identificou uma variante melhor comparado com o padrão, por exemplo, tipo selvagem, enquanto um PI de 1 (Pl=1) identificou uma variante que tem o mesmo desempenho que o pa-

. 157/586 drão. Um PI de menos do que 1 (PI < 1) identificou uma variante que tem o mesmo desempenho que o padrão.

9.3. Determinação da Estabilidade do pH Um ensaio de atividade de amilase usando maltoeptacase como um substrato foi usado para determinar a estabilidade do pH de AmyE e va- riantes de AmyE. A atividade de alfa amilase foi medida através do monito- ramento de produção de glicose em pH 5,8 e pH 4 usando um ensaio cinéti- co colorimétrico acoplado à enzima. Reações de enzima foram realizadas em placas de microtitulação de 96 poços de poliestireno de fundo plano em temperatura ambiente. Para o ensaio conduzido em pH 5,8, 5 ul de sobre- nadante de cultura 5x diluído de AmyE ou variantes de AMyE em Tween-20 0,005% (p/v) em água foram misturados com 45 ul de tampão contendo ace- tato de sódio, pH 5,8, CaCl, Tween-20, peroxidase de rábano silvestre (Sigma-Aldrich, No. cat. 8375) e glicose oxidase (OXYGOº; Genencor Divi- - 15 sion, Danisco, US, Inc.). O volume de 50 ul final continha 50 MM, 2,6 mM, 0,005% (p/v), 20 U/ml e 50 U/ml de cada componente, respectivamente. As Ú reações foram iniciadas através da adição de 50 ul de tampão contendo ace- tato de sódio 50 MM, pH 5,8, 5,4 mg/ml de sal de diamônio de ácido 2,2” azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico) (Sigma Aldrich, No. cat. A1888) e —maltoeptaose 10 mM (Sigma-Aldrich, No. cat. M7753) e foram seguidas por 5 segundos de mistura. Formação de cor na reação foi monitorada a 405 nm em intervalos de 9 segundos por 240 segundos usando um espectrofotôme- tro SpectraMAX 250 (Molecular Devices, Union City, CA). A atividade de en- zima foi relatada como a taxa de formação de cor durante o intervalo de 120- 240 segundos de monitoramento. Para o ensaio conduzido em pH 4,0, o mé- todo conforme acima descrito foi repetido exatamente exceto usando tampão em pH 4,0 e 20 ul de amostras de AmyE ou variante de AMyE diluídas com ul de tampão contendo peroxidase/glicose oxidase, ajustando a concen- tração de componente apropriadamente. 30 9.4. Determinação de Termoestabilidade A termoestabilidade de AmyE e variantes de AmyE foi medida através da determinação da atividade de amilase em substrato de maltotrio-

- 158/586 se em pH 5,8, monitoramento da produção de glicose usando um ensaio cinético colorimétrico acoplado à enzima.

O método de ensaio usado aqui era o mesmo que aquele descrito usando o substrato de maltoeptaose.

Uma amostra de 20 ul de sobrenadantes de cultura diluídos de AMyE ou variantes —deAmyE foiusada,e formação de cor foi monitorada durante o intervalo de 60-180 segundos da reação.

Ainda, amostras de 80 ul de culturas diluídas foram então transferidas para placas frescas, fixadas com selantes de placa e incubadas por 30 minutos a 60º C com agitação de 650 rpm em um dispo- sitivo iIEMS (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA). As placas foram esfriadas em gelo por 4 minutos, então amostras de 20 ul foram ensaiadas quanto à atividade em substrato de maltotriose conforme acima descrito.

Como no ensaio anterior, para cada AmyE ou variante de AMyE, o índice de desempenho foi calculado dividindo a atividade da variante pela atividade da enzima do tipo selvagem.

O índice de desempenho se comparou ao desem- f 15 penhoda variante (valor real) e da enzima de referência AMyE padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína.

Á Exemplo 10 Desempenho relativo de variantes posicionais de AMyE Usando os procedimentos no Exemplo 9, o desempenho ou ati- vidade relativa de AmyE-tr foi comparado com variantes de AmyE geradas conforme descrito no Exemplo 6. Um total de 142 variantes posicionais ten- do seis ou mais membros foi avaliado.

Definições: As definições que seguem se aplicam.

Índice de desempenho (PI): razão de desempenho de proteína variante para parental Mutações progressivas: Pl> 1 Mutações neutras: Pl> 0,5 Mutações não-prejudiciais: Pl> 0,05 Mutações prejudiciais: PI< 0,05 Posições Totalmente Restritivas: Quaisquer mutações neutras para proteína e atividade Posições Não totalmente Restritivas: Pelo menos uma mutação

. 159/586 neutra para uma das propriedades testadas Posições Não restritivas: = 20% de mutações neutras para pelo menos uma propriedade.

A Tabela 2 sumariza os resultados das classificações de avalia- —çcãodesítiode AmyE-tre variantes de AMyE.

Na Tabela 2, a Coluna 1 indica a posição de aminoácido investigada.

A Coluna 2 mostra o aminoácido nes- sas posições na enzima do tipo selvagem.

A Coluna 3 indica o número de variantes nessas posições que foram investigadas neste estudo.

As colunas subsequentes proveem o número de variantes, seguido pela porcentagem (%)de Mutações neutras identificadas por cada ensaio realizado.

As propri- edades testadas foram como segue: Colunas 4 e 5 (farinha de milho ddG), atividade específica sobre substrato de farinha de milho; as Colunas 6e7 (DP3 ddG), hidrólise de maltotriose em pH 5,8; Colunas 8 e 9(DP7 pH4 ddG), hidrólise de maltoeptaose em pH 4; Colunas 10 e 11 (DP7 pH 5,8 . 15 ddG) hidrólise de maltoeptaose em pH 5,8; Colunas 12 e 13 (DP3 HS ddG), estabilidade ao calor (30 min a 60º C) usando ensaio de hidrólise de malto- Ú triose; Colunas 14 e 15 (Limpeza pH 8 ddG), ensaio de microrretalho de mancha de amido de arroz em pH 8; Colunas 16 e 17 (Limpeza pH 10 ddG), ensaio de microrretalho de mancha de amido de arroz em pH 10. Os 150 sítios avaliados em AmyE truncada continham duas posições totalmente res- tritivas, isto é, 75 e 123. Os 295 sítios avaliados em AmyE de comprimento integral continham 10 posições totalmente restritivas, isto é, 75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266 e 306.

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: 169/586 EXEMPLO 11 Formação de etanol por AmyE Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para testar o desempenho de AmyE truncada em fermentação de etanol convencional em liquefato de Illinois River Energy (IRE) (DS 31%) usando um ensaio de fer- mentação de etanol convencional.

Em suma, bateladas de liquefato de |lli- nois River Energy (IRE) DS 31% com ureia 400 ppm foram preparadas e o pH de uma batelada ajustado para 4,3 e da outra ajustado para pH 5,8 com H2SO, 5N. 100 g de substrato foram usados por frasco (Erlenmeyer 125 ml). As enzimas foram dosadas conforme indicado.

As fermentações foram ino- culadas com 0,2 ml de levedura Red Star Ethanol Red 10% (peridratada -45 min em água DI). Os frascos foram incubados a 32º C com barras de agita- ção a 320 rpm para fermentação de 48 horas.

A quantidade de etanol produ- zida foi medida através de análise de HPLC.

O desempenho de AmyE trun- - 15 cada (SEQID NO: 2) foi comparado com amilase SPEZYMEº Xtra (SEQ ID NO: 4) em pH 4,3 e pH 5,8. AmyE truncada e amilase SPEZYMEº Xtra fo- ' ram dosadas a 0,2 mg/gDS.

Conforme mostrado na figura 11, o rendimento de etanol final produzido por AmyE truncada em pH 5,8 é 12,0% (v/v). AmyE truncada em pH4,3deuum rendimento de etanol final de 7,3% (v/v). Os rendimentos de etanol! finais na presença de amilase SPEZYMEº Xtra foram 2,7% (vv) em pH 4,3 e 3,9% (v/v) em pH 5,8. EXEMPLO 12 Comparação de formação de etanol por AmyE e outras a-amilases Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para comparar a habilidade de AmyE de comprimento integral (SEQ ID NO: 1) e AmyE trun- cada (SEQ ID NO: 2) em hidrolisar amido granular insolúvel (sem cozimento) em etanol em pH 4,3 e pH 5,8, usando a fermentação de etanol em ensaio de milho moído integral descrito no Exemplo 11. Usando este ensaio, o desempenho de formação de etanol de AmyE de comprimento integral e truncada foi comparado com alfa amilase de A. kawachii (AKAA, GC626), dosada a 1,5 SSU/g (uma unidade da ativi-

. 170/586 dade de enzima — unidade de amido solúvel SSU é equivalente ao poder de redução de 1 mg de glicose liberada por minuto da hidrólise de substrato de amido de batata solúvel (4% ds) em pH 4,5e 50º C) e STARGENº 002 (alfa amilase de Aspergillus kawachi expressa em Trichoderma reesei e uma gli- coamilase de Trichoderma reesei que trabalha sinergicamente para hidroli- sar substrato de amido granular em glicose), dosado a 0,5 GAU/g, onde uma Unidade de Glicoamilase (GAU) é a quantidade de enzima que vai produzir 1 UM de açúcar de redução, calculado como glicose por hora a partir de subs- trato de amido solúvel (4% ds) em pH 4,2 e 60º C.

As definições de SSU e GAU são descritas em mais detalhes na Patente U.S.

No. 7.037.704. Ambas a AmyE de comprimento integral e a AmyE truncada foram dosadas a 0,2 mg/gDS.

A figura 12 mostra os resultados observados quando desempe- nho dessas enzimas foi comparado, em pH 4,3 e 5,8, e relatado como ren- - 15 dimento de etanol final produzido.

Quando testadas em pH 5,8, ambas a AmyE de comprimento integral e a truncada tiveram desempenho muito , comparável a STARGENº 0,02, com AmyE de comprimento integral real- mente sobrepujando os rendimentos de etanol observados para Stargenº 0,02 em pH 4,3. A AmyE truncada quando testada em pH 5,8 teve desem- —penho muito comparável a Stargenº? 002 testado no mesmo pH.

Em compa- ração, a alfa amilase de A. kawachii teve desempenho muito pobre em am- bos o pH 4,2 e pH 5,8. EXEMPLO 13 Formação de glicose por alfa amilases de Bacillus subtilis Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para determinar a habilidade de alfa amilases de Bacillus subtilis em converter maltose em glicose em pH 4,5 e 5,6 usando o ensaio de formação de glicose descrito no Exemplo 2. As reações foram analisadas após 2, 5 e 8 dias.

Conforme mostrado na figura 13, AmyE de B. subtilis de com- primento integral (SEQ ID NO: 1), AmyE truncada (SEQ ID NO: 2) e a amilase variante Amy31A (SEQ ID NO: 3) converteram eficazmente maltose em glicose, enquanto a a-amilase de Geobacillus stearothermophilus trun-

: 171/586 cada, AmyS (SEQ ID NO: 4), mostrou apenas uma quantidade mínima de formação de glicose sob essas condições. EXEMPLO 14 Ação de AmyE sobre Amido Cru Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para determinar a habilidade de AmyE de comprimento integral (SEQ ID NO: 1) em hidrólisar amido granular insolúvel (sem cozimento). O método de HPLC usado para detecção de sacarídeos produzidos a partir de amido insolúvel é como se- gue.

AmyE purificada (24,5 g/L) foi diluída para uma concentração fi- nal de 20,4 ppm em tampão de ácido málico, pH 5,6. A proteína foi então adicionada à solução de farinha de milho 5% em tampão de ácido málico, pH 5,6 para uma concentração final de 1 ppm. A mistura foi então incubada em um agitador a 32º C. Amostras foram periodicamente removidas e diluídas ' 15 em NaOH 50 mM para extinguir a reação. Amostras de 10 ul foram então E injetadas em um sistema de HPLC (Agilent 1000) capacitado com detecção eletroquímica. Uma coluna PA1 foi usada com um gradiente de NaOH e ati- vidade de acetato de Na a 25º C. A distribuição foi determinada a partir de padrões de atividade anteriores.

Resultados: Incubação de amido cru com 1 ppm de enzima Am- yE de comprimento integral levou a uma liberação dependenteo do tempo de vários oligossacarídeos (DP2, 3, 4, 5, 6, 7) bem como glicose (DP1).

A aparência desses produtos de degradação foi quantificada a- través de análise de HPLC de pontos de tempo de digestão. Dados para amostras de O, 30 e 90 minutos são mostrados na figura 14. Resultados comparáveis foram observados para a enzima AmyE truncada (dados não mostrados).

Exemplo 15 Bibliotecas posicionais em AmyE de comprimento integral Bibliotecas posicionais foram geradas em 295 sítios em AmyE de comprimento integral (SEQ ID NO: 1) pela Geneart (Geneart GmgH, Jo- sef-Engert-strasse 11, D-93053 Regensburg, Alemanha). A Tabela 3 lista

. 172/586 cada resíduo para o qual uma biblioteca posicional foi feita. Os resíduos são numerados com base em sua posição na SEQ ID NO: 1. Tabela 3: Bibliotecas posicionais geradas em AmyE de comprimento integral Lessa | St AE [te gueto Nº da variante de comprimento integral gem fa E A SO Pa e

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. 181/586 a par at Nº da variante de comprimento integral gem Poa [az asa aaa Pass as NR | oa o avo RR | . ae aa Wo | : ET RR Dr Las Pego Vinte bibliotecas nas posições 27, 30, 45, 52, 75, 88, 89, 126, 131, 167, 184, 223, 238, 241, 260, 307, 312, 344, 380 e 402 foram geradas em ambas a AmyE de comprimento integral e a AmyE-tr.

Os transformantes de B. subtilis contendo variantes de substituição de AmyE de comprimento integral foram culturados conforme descrito no Exemplo 8. Os sobrenadan- tes de cultura foram usados para ensaios.

Exemplo 16 Desempenho de variantes de AMyE Usando os procedimentos descritos nos Exemplos 8 e 9, o de- sempenho ou atividade relativa de AmyE de comprimento integral e AmyE truncada foi comparado com as variantes geradas em AmyE de comprimen- to integral e AMyE truncada.

A Tabela 4 sumariza os resultados das classifi-

cações de avaliação de sítio de variantes de comprimento integral de AMyE e a Tabela 5 sumariza os resultados das classificações de avaliação de sítio de variantes truncadas de AmyE. A Coluna 1 mostra o aminoácido na enzi- ma do tipo selvagem. A Coluna 2 indica a variante na posição que foi inves- tigada neste estudo. As colunas subsequentes mostram os valores de índice de desempenho das variantes para as propriedades testadas. As proprieda- des testadas foram como segue: determinação de proteína através do en- saio Bradford (expressão), taxa de redução da viscosidade (viscosidade de pico), redução em viscosidade pós-liquefação (viscosidade final), grau de polimerização (iodo), extremidades de redução geradas (extremidades de redução), glicose total presente (glicose), hidrólise de maltoeptaose em pH 5,8 (DP7 pH 5,8), estabilidade ao calor (30 min a 60º C) usando hidrólise de maltoeptaose em pH 5,8 (DP7 pH 5,8 aquecido), hidrólise de maltoeptaose em pH 4 (DP7 pH 4), estabilidade ao calor (30 min a 60º C) usando hidrólise ' 15 de maltotridse em pH 5,8 (DP3 HS), atividade específica em substrato de farinha de milho por 30 min (farinha de milho 30 min), ensaio de microrreta- lho de mancha de amido de arroz em pH 8 (Limpeza pH 8) e ensaio de mi- crorretalho de mancha de amido de arroz em pH 10 (limpeza, pH 10). O ín- dice de desempenho (PI) é definido como uma razão de desempenho de variante para proteína parental.

Amino- | Varian- | Expres- | Viscosi- | Visco- Extre- |Glicose| DP7 DP7 DP7 |Limpe- | Limpe- ácido te são dade de|si-dade mida- pH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH58| pHa | pHB8 | pH1O seiva- redu- aqueci- gem ção do | em io pos pese pes je joe [8e [e 16616) sFEFFEFFEEERS 2 ee pas pes pes pes pes je | Ss | e LS ss 1 O sFrFFEFEFEEFFE pes pes pe pes fes e e e js pe Les 12 o FrFFFFFFFFFF

. 183/586 E TEA E Fer ácido te são |dade de|si-dade mida- pH5,8 za za do tipo Pico Final des de pH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do eFFFFEFFEFEFE 2 ee ee pe pe pes poe | oe joe 108 1Se e SE) eFFFFFFFFFER sFrEFFFFFFEFE 2 ee poe pe pre fes pes pie pe e VE e (Cê [o ee pe fe eee pe e pe e CS SS 19 [espe pe esjes pe die pe 18 8 SE) ee ee pe esjes pe jee joe (Sé 158 (58 O — IserEEEEEEEER — sFFFEFFEFEFE Eee FeFFFFFFFF TEA EeFFFFFFFFEFER

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: 186/586 E TER E ef ácido te são dade de|si-dade mida- pH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4a | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 TES pe pes ce 1 SS | re |sS jme | es oo Lee ssEFFFFFEEEE 2 fm oe joe poe es penis [ev | seia es be

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E TER E e EA ácido te são |dade de |si-dade mida- pH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de PH5,8| pH4 | pHB | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 e os os poe pes e je é je je ce DS eFFEFEFFEEER CEEFeFEFFFFEE

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E FER E Fe cEA ácido te são [dade de|si-dade mida- pH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH58| pH4 | pHB | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 1 oe [e [28 Se [SS 1 oS |SE SS [68 | SS [2 Fer E=FFEFEFEFEA FFEFF=AFEFEEFEA FEFrFE=FsFFEFEEE joe es pos on os om basis | se je ss 1 SE

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. 191/586 E TER 8 Pe-Fé ácido te são |dadede|si-dade mida- pH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8! pH4 | pHe | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do FrEEFEFFEEEEF FrErE==FFEEER FrFEEFFFFFFEE sFFEFFFEFEEE 2 me os je [Pepe e js DE ce [2128 15P) [O js [OS oe [Se SS 1 3E | os | se 1 Se se [SE EE FEEEFF A = Fer FFEFEFEEE o Eres FF ss FF) oo DD e os Ce Espe 22 os cetlisS ss SS 15 [2 om cs pe pesjos poe | ce joe pos | Se ros 19] [O Se e e e e LS | e ce (e 13e Se [1 eee e pe je ce je e pe e e e) see EE FFFFEF

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. 193/586 E TER ES Pei ácido | te são |dade de|sidade mida- PH5,8 za za do tipo Pico | Final des de PH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do o sEEFFEEE EEE

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- 215/586 E TER E Fe ácido | te são dade de|si-dade mida- PH58 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 | pHB8 | pH1O sela- redu- aqueci- gem ção do CEFrFEEEFFEF FER 2 ee oe je jeto os jee joe e je e Doe > PE OS oe eejos es pos es es es je 1os) > |O Pe os [ue os | 22 | au jo jen| ae pos oe 1 | os pesos [e | oe | 1 je [oe [ee | ee 2 E e [oo poe ee [18 18 js je 1 5e je [oe 2 oe [os pesjee [e poe dee jon des [es 19

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ETTA E TER E Fe Fã ácido te são [dade de/si-dade mida- PpH5,8 za za do tipo Pico Final des de pH5,8| pH4 | pHB8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do [2 OS oe [e espe ce pe die pe e De DE [2 | e [E | 2epe e ce ce E Ce die 9) 2 fm Om [E [e je e pe pe e e Ve DE > 1 om je [SS ee [o | ee 1 e | e dee 19

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Ú 396/586 E TER 8 e ácido te são fdade de|si-dade mida- PH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 PEA [28 [E [2A 1 A SS jeê [e 193 SS E)

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E ER E e ácido te são jdade deisi-dade mida- PH5,8 za za do tipo Pico | Final des de PH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 2 [A [E [Es es [22 | 12 joe cs die joe 19 Es FFEEF TFF

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E TER E es ácido te são |dade de|si-dade| mida- pH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do sFEEFFFEFFEFE 2 O 2e os ee cs jus oe 17 | 28 josue | 98 [2 | CE [e ue je 8 | e De se e pe e) [2 1 CS 2 [ee es [2 | & 1 e [Ee (55 12) [2 E [E [e [SS PE 1 1 A | re 1 ee 1e 15e 1Sei

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- 400/586 E TER E [ef ácido te são |dade dejsi-dade mida- PH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 | pH8 | pH1IO selva- redu- aqueci- gem ção do O fm ee ee pes fee ps die je dee ce 158 1º 2 jus es je pe je pe e joe oe pes fee De

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' 402/586 E TEA E Fer ácido te são |dadede|si-dade mida- PH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 pH8 | pH1IO selva- redu- aqueci- gem ção do Es FEFFEFFFFE O ES [Pe e pe pes pe poe er A e e ce eEFrFFFFEEFFFE 2 es os joe jom ee josjoe en |on jon | ne 1 2a [2 PS os e [e pes [e |O joe e die [e DS 2 os [e ee fee pre Jos e die e fue De)

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. 404/586 E TTER E ee ácido te são [dade de|si-dade mida- pH58 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pHa | pHB8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do

EE EEEF OE E ce pos fee [oe joe Doe Los die e doe)

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] 406/586 AAA | E TER E Pei ácido te são dade de|si-dade mida- pH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pHa4 | pHB | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 1 os e pe pee [e Dos pes [os 1 | e 198) EEE rEEFEFFEE EFE sFFFFFFF [2 [E Pe pe pe pes e pes oe pe De e Àe) [2 e e pe pe je ce die fee jon die e De [2 [PE [e pe je pe 17 e e [8 e 13)

EFE FFFFFFEFFA | [2 E [E [Pe ce re pe je je fee Los fee |O — EFEFFEFEFEFES sr EFEF EEEF — EeFFEEFEEFEFEA [2 EE [e [Pe [32 1 | RS 1os joe jus | e 198

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FEFEEFFFFFFER [| Em [9P | 2e [SA cs | OS | ou [O Se | om | Se | 08] sEFEEFFFEFFE

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EFEFEEEFFFEFE — EEEEEEEEEFEFEEO 2 E oR | E [es | ce | og | as 194 [os | as 1 os 198) O PS [Pe [e poe [OS 8 [SS [Se 1 E 1) [O [SE [e os SS [8 1 SS êS 1 Se 15S (SS 18 2 E Os espe os [38 OS 1 2e SSI ss 19 |7O) A sEFFFFFFFFFF EeFFFFEFFFFEFERS 2 E e js ee poe ce e die e e dee e CeFFFEFFFFFEFFE 2 [E ES E Ee pe ce pe ce 8 2172 DS 2 E 9, [Oo pes om | 2 | 36 | 32 | 3S | 9S | 25 1 SS [O eee pe pe pe ps pe pe pes pe pes 19

- 408/586 E TER 8 ef ácido | te | são |dadede|si-dade mida- PH5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pHa | pHs | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 je os joe peejee pe de ie ce de pe E) 2 e os os pes om |& 1 óS | om joe je | 92 15e|

EEFEFEFEFEFEES EEEF FEFFFFER EEFEEFEFFFEFS EFEFEFFEFEFE EE FEEFEFEEFEFE

FF FEFFFFEFFEFS — EEFEEFEFEFEER 1 E ee e eee e | 21 os joe pe je Se) — EsFrEFEFEFFERA 1 es pe espe pes e e joe e SE)

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FF FEF TETE EEE [> e oe pes pese je je e e 13 SE [ode pe pe espe es pes pe ie ps ces &

' 409/586 E TER E af ácido te são jdade de|si-dade mida- pH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de PH5,8| pH4 | pH8 | pH1O selva- redu- aqueci- gem ção do 2 ES e PE e es des Die pie De e [e 2 E E o Pepe E e e e pe re el E EEEF FEFEErFE 2 cs e espe pe e je je e jee 13ei o E 28 [espe 1 | e Lee joe je pve joe

EEE EEEF FEET SS [e | e pes pee e e die pie fee je je EE [E e [SS oe je e be die e Dee e — EEEEFFEFEFEFER

EEE EEE EEFEEFE 2 E [28 [es] ce | 2S | S 1 om joe joe |ee Dee

EEE EEFEFFEFEE O em [ce e pes ee pe eis je e je Lee sr FFFEFFEFES 2 es oe je pesjes pie eis e desde Dee 2 ES je pespos e ee Die pie e ires 2 RS e fes pos e e De die eds e 2 Ee ce espe e e pie die eee e 2 E je eps e ie cs A e e Vs ess pe espe De e je joe e je je

EEE EEEF EFE [PO [e ca es e e es je je eee fes

' 410/586

Tabela 4. Valores de índice de desempenho médio para variantes de comprimento integral de AMyE Amino- | Varian- |Expres- | Viscosi-| Visco- Extre- [Glicose] DP7 | DP7 | DP7 |Limpe- | Limpe- ácido te são dade de|si-dade| mida- pH 5,8 za za do tipo Pico | Final des de pH5,8| pH4 | pHa | pH1O selva- redu- aqueci-

gem ção do | º | = | oz | vor pe joe Dae | ave Dave Does | ven ass Dre 2 ES pe oe e De | e | e joe pie es [Sei > E e jS 1 A e Doe Se ae se ss De) 2 E e ee pes pe [e oe | os joe joe oe 18) 2 ES [CS e ce ei pie 1oeílpjse poe Se Ve) | º | . | 99 | esa [ore jogo Dara | tes | 1a | esa | oca | 120 Lose | 2 ES pe os e De | oe | oe joel se oe SS Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) (testadas

Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem 001A 1,333 0,786 2,032 1988 | o855 | 0987 001E 1,276 0,768 1,739 1,471 0,835 [ER Ta Toe Tras ss Ts ss 001K 0,713 3,142 1,723 0,800 0,882

' 411/586 testadas as UI e e O ss] | ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem LE a re ss Es Ts [se | sm [ER Toe Tm | os | [is | 1) [IT 6 2 [os | 65 | 135 | 052 | 08 | [Tr o [266 [os | se | 1570 [ 088 | 16% | EE Tr Es Ts Ts Ts Ts [E E Ta os | ss sm es) EE ss os T 263 | 016 | 0 | 16 [Ts Tm [os | 029 | 1350 | 0565 | os | [Ke [er | se T 132 T osm | osso | [ro a Tor [os [os [075 | 1705 | os | [Fr a | os [07 | 06 | 07 | 055 | os | [TF [os [osso | so T os | oo | or) [Fr sa T os [os [on | 11 | 1 | 1050 | [FR Tom [1 Tom [67 | om | o) [Fr os [os | io [136 | 10 | 105 | 10% | [Tr oe T os | os | 1 [os | 0566 | os | FS se os Ts [rss | os [se | eo] [A oe To | io | 025 | 075 | 105 | 105) LA e Toe Ts E Te Te ss EE Ea Ts Fa se ss Ts) [RT BC 7 os T 25 Tom [1 | re) [A a [om 1 [6 [os | 115 | 1) [AS e Ton 2 Ts Tese | 125 | 25)

testadas e Teses eo ácido do dade de | dade Final dades de tipo seiva- Pico redução gem [ES Ts Ts Tr [e | 5) [A Re Tom | 11 | os | o [imã | 11 | [AR [ss To To Tess [os | ro | os) [A or [o | Taio ist | oo | 3 | oro | [A [ovo [11 [2565 | om | 128 | 16 | A os Tr rs so sr | rs] [A [os [os T 1257 [870 [os [iss | 1 [FL e [56 ae [ozos | ont | 26500 | som | [FS Ta Tom [427 | so | Ts | om) [FO Ee | om To os [om [125 | 1 | [Fo To [iss [7] on | 12 | 10) [FO 6 Te [os | es | is | os | os [FS To Ti [26 16 | 6 15 | [FL [7 Ts Tem [os [is 1 [PF e [0965 Tosa | os | im [1058 | 115 | [FS os T os Tas [om Te | 1] ' [E e [ese [e [os | Toe | to | to [PF sn [155 [o [67 | 125 | 05 | o | [PF [sa Tosse T 10 [02 [1652 | rose | ros] [PF one [oi | 27 | 70 | 005 | 030 | 006 | [FO Es es Te Tess | rm Tr | ro) EE Es TT Gs ss Tim eo) [CF ow [os | Tt | ss | os | im | os | [FS q osso Tio Ts To 125 Te) [FT o [os [os Tas [om | in | om | [E es Ti [os | 026 | 175 | 0552 | 105 | [E e To Tam Ts Too | os | oo] [Es o re Tosse [os Tr | os os% [E oe Tim | 052 Tom | is | os | 055 | [os | se [11 [os | o | 157 | os | om | E ss rs Tr Tas Ti Te 5 [E ss os Ta Ts Tom 2 Ts) [E Ts ss Tre Tm Tr Ta 1 [Ss | ow | os | 106 | 0300 | 0706 | os | osm | [E ee 66 Te | 1 | | ss Ts

Í 413/586 testadas em Tee es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [Ls | 6% [om] 15 | om | om | 125 | 17 | [sw [5 T os Tom | too [oo | 055 | [ETs [os | 5 ss [im | os | [E Te Tosse Tom [ess | os) [E e [os Tim are [os [iso | 1000 [E e Tor Ts sas Ts Tr [os] [E 6 | o750 Tiso Tas [055 | 116 | 117 | [E [o os | 55 | 125 | 08 | 100 | [E e [os Tm | 76 | os | 085 | 105 | [E e To 17 | 2 [om [mm | 1) | [E a | o osm Ti | se [os | os | ' Ee Tom 5 [5 | os [1 | 155) [E [ss [525 Ts 255 [oi [is | o | [E os | os | 136 | os [035 | 129 | 105 | [E or [1 Tie | 215 | 005 | 08 | 1 | [Ee sn | os | sm To [rs e) [Os sn [o | 11 | 23 | 075 | 1065 | vo | [x e | o | 1537 | 502 | 00 | 16006 | 657 Ex TOS e O [E ee Ts e 57 [E sa To | 1552 | 05 | o | 15 T 11) EE o Ts Es ss [Tess TT [E sv [15 es rss | 00 | 55 Tom | Es es ns [ss | [Bs] em) [ED Tea Te Te Tem Ts e)

' 414/586 testadas e ee e ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [x Te [5 6 | 5 ss ss | om [LN [e Toe T 15 [ar | 0222 | Ts [066 [x [e Tom [om [3 | os | os | rs) x er os | isz | 545 [o | 128 | 17 | [DN 66 To T 17 [Tas [on [sz |) [NT A | o T 16 Tom | 07 | 5 | o [NT e [ss [os Ts | os | os | os | [ON ex To | 1 [Tm [os is | ss | N | e | os | os Tas | os | 1058 | 1 | [NT e [57 | os | 156 | iso | os | o [Ne To Ti | 3 To [Ts [57 [x a [os | os | 257 | os [os | ss | [Ne | o | ie | am [os | os | os | Nos | 060 | sr | iss | on | 155 | 17 x e oe is | 2 | os | tos | 05 | [NT e | os T To | os | os 66 | o x em o 155 | 132 | 058 | so | ros LITE em Tm Ts se 1 1) [x [ese [os T 1560 [276 | 055 | 11 | 10 | [E e om [15 [206 [625 | 156 | 12 [x [e | 7 | 15 | su os [e [RF e [os Ti 106 To [rm | 55] [ER e [om Ts Tm [ss | 15 [26 [E Te [os Ts sm To | 1) [Ke [0 T 15 Tra os | 6 | os [KT e [om Te | 06 | 1 | e | [E es To Tm [om To [is | ns [KT ros | 165 sm | oe | em | e [KR e [o Ti [73 | os | e 1 [Rr e [O os [e | ss | 055 | 055 [ee Toa [250 [os Tom [6 | 17%

; 415/586 testadas

ENNGSNSE ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [EE E Ta Ts Ts Te Ts ss) [FS EF Tess Tr [ss Tom [ros om) [RF ES os To [226 [os [1 | o] [E e ps [ras Tr Tosse [res | 65 FE E IR e TWT e ww) [CR e [os ms | e | o | 1 | 057) [RT ee [o T 255 [em | om | 2907 | 155 | [na [is [os | 17 | 10 To | 105) [Res [ss Ts [sm | e [1 | os [E es Ti Te | 155 | ie [im | o | [Rr ser [1056 | 165 | 065 | 105 To | os | [Rr ev [1 | 657 [oo | 10 | os | Tom) EEE Rs Ts es ss | e [55 [NT es os | 1 [206 [085 | 100 | tom) : [RT se [o [67 | 1270 | 02 | 135 | os] - [NT e om [os | 257 | os | is | 10 | [NT e ss | os [o | is | 087 | 055 : [RT es [o | ss T 205 | os | 115 | os | [NT ss Tom | 65 | 1 | om | 11 | os) [Ness [os [os [25 | 077 | 102 | 055 [RT e [o o Tome [im | 17 [11 [NR e os Torn Ts | os ] 165 | os) [NT e To | os | a | os | 127 | 1153) | N | oesr | 081 | 0962 | 2602 | o6356 | 0905 | ooo | | “ | oass | 0812 | 106 | 3336 | oem | 1059 | 1025 | Nn [or | om | os | 2398 | 0662 | 1135 | 115 ) | N | oesv | os | 1122 | 2647 | 0266 | 1502 | 1196 | | N | ow | 0460 | 167 | 4607 | 0321 | 1639 | 1323 [| Nn | oe | om: | oso8 | 4152 | 0638 | 1309 | 1226) | x | oem | 100 | 096 | 009 | 1184 | 0953 | oom | X | oem | os | 0859 | 1508 | os81 | 1008 | 1021 | XX | og | os | os02 | o437 | o356 | 1244 | 0968 | | < | oem | 0908 | o662 | 0367 | 077 | 10233 | om | | < | oem | osso | os | osso | ovo | 1196 | 1043 | [| < | cem | 072% | o662 | 2305 | os86 | 1212 | 1038 |

» . V 416/586 Itestadas es eps O ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [A e [os ss Te ss Ti | ss [Rr Tem | 055 | 066 | 1565 [05 | os | os | [Rr es | 055 | o | 24 [08 | tom | 1 ) [Fe o [e [02 T 050 | 11655 | 10 | [Ken [os Tom | 7 | o | 136 [1 | pb A Ts [ss [is [os | 106 Pp ee os [rm 656 os [ss | [Pp os [so [15 | os | 10 | os | [Pp me se | | se | 076 | 11 | 106 | [o oa | os [5 | os | 07 | 115 | 1106 | [o e [o | 130 | 2656 [om | 12 | 1207) o Be e a [os Ts [mo | 35 [Be ss e 7 [os | 11 | 15 | = [CB e | 055 [om | 16 [om | os | “o e e os | os Tom [is [os Tosse [Pp e [ro | os [os | iz | 055 | os | [PB a 055 [is ss To | 1 | 11 [BR Tm Ge 6 [ss | ss os | [PDS Ts | 127 | 25 [os Tm | 1) Pp e ms 5 [Ts | | 1 | [PD e [sm Tr [im | om [1 | 115 | [o an [65 | rs es | 075 | 1 | 16 | Pe Tr [se | 25 | is [e | 157 | A e Too [os Tm [oz [1065 | os | Rr se Tor | os | 00 | o720 | 1205 | ros [LR ss Tr Tas [om [rm | 5 | e | [RS Tom [ss [ssa | om | se | 1a LR Ke ne Tre [os | o | os | os [Rr sm [06 Trio | 655 | os [125 | 765 [FR sa [562 | osso [iss | 07 | io | os [LR se [00 Tso [ram | os | 7366 | 2500 | [FI se To Tese [126 | o | 10 | 05 |

.

: 417/586 ' Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) em Te eo ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem LE SR TE esmero ss [E 6 Tom [esto [os | os | 085 | os | [RF sw [or T os5 Taim | om [1 | 05) [OR sw Tom | 1 | ss | os | im | 0066 | [FE 5 | 0557 T os | ss [om | 10 | 105 | LEE ss Ts Ts Ts ss Ts [TO es [06 [ie Tosse [o | 156 | 1 [Fr se [o | sto | 2050 | os | om | o | re os | o | 26 | 09 | 050 | 05% | o EO Esc Ee [ras em Tom [ns To FE DE ER Tem Tee Ts | 1 | 2 [Tr se To | om [230 | om | os | os | i [Fr o [os | os [23 | 106 [o | 05 | [Tr sw | os | os Tz66 [om | 118 | 10 ET e [07 Ts [os Tor [1 | [a oe To Ti [25 | o | 16 | 1607 | [a [o [os [687 | 1 | 076 | 68 | o | [a one [05 | os | 116 | os | om7 | o | [a o os | om [vs] 025 | 126 | 085 | [a [ee [os | Too | os | 07 | io | oe | [a [om [ 089 | 155 | o220 | 07066 | 1068 | 1020 | [a o To | 6 | 75 | om | 21 | 17 | [a | om | 0866 | ter | 2105 | 086 | om | 1056 | [a e os | 155 [1576] 027 | 202 | 162 a e rs Tres [2 | ns [osso | os | [a [e [os Tre [sm | [os | 05: [a e Tom | 11 | 356 | os | 119 | 085 | [a [om [0506 | 1 | 127 | os | 10 | 16 | [a es To [1 | 66 | 06 [15 | 107 | [ES es Te Tem] se Te | e)

> a .

7 418/586 ' (Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [La TE To o Ts Ts Tr TO [a e os [20 | [os [7 | 167 | [a E es Te Te To | mm | 135) [Ev se [026 [160 [066 | 0156 | an [Tri6s [Ly so [ o0o Tas [526200 | 002 1257 | 5% | [| y [oe [029 | tem | sas | 006 | 034 | 005 | [Y oF | 0610 | ir | aaie | 0466 | is6a | 082 [56 To Tas [ss [os T 57 | ram [| 65 | 6565 Ti 6575 | o | iam | 760 [Ly es | 67 | [000 | os | 1365 | oo [ya To | 15 [es | o [2 | [O ps os Tim ss Ton | | sm) [| sv [os Ts | 35 [035 | 15 | 00 | — EO oe [es [re [os Ta | 1 [Va [006 | 6 e [on | ss | 15e | o ER as Tim [Ts o | ss | om yr [04 T 1350 | om [om [16 | 126 | Oy em | o26 | 0567 | so | o | o | oo | [E sr To Ta [ss Tm 65 es [E ea | os | 11 Tso | te | 115 | 11 [Ec e 22 Ts [ss [o | 226 | 20 [E 6 oo Tres [oro | 0256 | 1753 | rss] [E or [o | 105 | as | 075 | 1007 | 05 | [E we [om | o | sem | 0506 | 1106 | 05 | [E A os | 07 | oi | 077 | os | 066 | [E e [on | is | 2 os | os [EK [052 [os | 1520 | 032 | ie | 1 [E E os Tons Tso re Ts Te [E e [o [os 20 [om | 1 | 056 | [E e To [os [3 | 050 | 122 | 1 [E TR [oe [os | se | om | is | 105 | LE Ta we ww ww | [E [6 [68 | os | 7 | os | nm | 1 [E [em | o [on | 55 | os [| 5 | [ES em Ts Tum Ts Tu

,

f . 419/586 testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose tipo selva- Pico redução gem [E se To Ti ss sm Ts | Tm) [NT ow [om | os | 006 | 0552 [om | tos | [NT ss To | 155 | 2 [065 | To | 105 | [x ese Tor [115 | sm o [155 | os) [Nes | 680 | 055 | 125 | 050 | 16 | 11 [LN ss [os | os | 025 [os T os [os | [NT T Ko | 15 [20 | os [x | 12 | [NT os T 066 T oa To7 [os | 129 [06] [NT [56 os [it [osst [o | Tm | os [NT esa Tons Tie [re [Tostes | 12 [NT or | 07 | 118 | 4767 | 055 | 1160 | 105 | [Nos T o7 | vs | 165 | os | tis | os] [LN sr [os | 15 | 205 | oo Ti | os [ON [o [056 | 16 | ze | 036 | iz | 105

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. 420/586 testadas es Up es pe O Je] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E e 055 | 1 | 5 sm | 1 | 12) [E sk [os | | 12 [032 | 1306 | To [e et [034 T 728 | tos | 015 | 155 [1 [Ee sw os | 16 | 255 To | 105 | os) [e sw [om | 166 | 27 | 06 | 1 | 05 | [6 ste To | 157 | 5 [om [se | om | [e se [on | 1276 [2 To | 16 | 10) [e sit [on | 126 | 286 [os | 12 | Tom | [E ss To To Tas [on Ti | ros) [e sv | os | 155 [ss] o [155 | 122 [E sw ss Ts a [or [Tess Ts — CE Te as Tas Te es e [PB o | oi | os | am | 005 | 0 | 1706 o CEO E e [rm Tess Ts [im] [a e o | om | o | 060 | 126] 102% [posa | os | os | 12 [or | 112 | 105 | [E e To | im | ot | 128 | 116) Br E ess Ts [ms os [155 | 129 [o K | osm | os | 1500 | 105 | 1006 | 1006 | [BL sa To To Ts [os Tim [mo [posam | os [1 | as | 085 | mm | 166) [5 [oa is [os | 17 | 1 | os | 05 [Bo | 007 | 185 | 610 | 005 | 1672 | 1565 | [po | o7m | 1350 | 60 | 066 | 150 | 1215 [Bor [os | 11 | 375 [675 | 125 | 1000 [5 [os [o | 113 | 60 | om | 1057 [ 058 | [5 | sr | os | 10 | 315 | 0506 | 1406 | 186 [BT [o [1 | 17 | o | 16 | 126 | [pm | o | 15 | 552 | 023 | 165 | 1356 [BL LB os os To [os | ar [252 [E a ns Tosa Te Ti Tess 5) [E oe | os | 11 [1625 | 0355 | 1207 | 0500 — [Es [os | io Tese | ins Tin Toe

, É 421/586 ' Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem sn 4088 0,684 1,815 1,025 1,018 [| s sw om | 115 | som | 050 | 1166 | os | 0537 | 1,459 | -3288 0,397 1,526 1,231

1.030 o6aa | 1219 [Es eso | essi [| root T Tess 0.87 [E [sm 6 T os Tam | 145 | os [Ss [sr T oss | 1175 | 030 107 | os56 | [Ts | oseR | 0882 1,218 0,491 0739 | 1,068 | To 0,922 1172 -1,633 0,992 1,162 1,137 059A 1,031 1,720 4,959 1,628 0,623 059C 0,711 6,571 0,239 1,175 0,521 [OX E os seo | 11 | om 059 1.025

'

: Ú 422/586 (testadas ee Coste es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

[XE 65 [5 Ts | e 15 | e) Ss ss Tras rr Tess Tom | os) x se [os [150 Ta | 066 | 116 | 0506 [IT Ls ss Te TT [om [se [635 [3 [66 Tom | 156 | ss | 00 | 113 | 00 | [E 6 Tso | 7 ie is | 16 [E se a [ss Tom os | io [a [sw [os | o | om [om | 15 | o | [a osse | ost6 [0565 | asm T 07 | To | os | EE e os Tras Gs os Ts | ros [a se To [11 | 122 | 066 | 137 | 110 [a ss se Tom [os | os [is [6]

o e es os Ti [is | os | 1500 [56 [a e oz [o | s20 | os | rss | ros o CE Tc Ee e TT se | e To) [a [ww [608 | 1 | 1 | os | 125 | 1 | [a e Tam [e [sm | o | 35 | es | [a [Re | 08 | 15 | sem | osm5 | im | 1 | [a es Ts Ti [sr | se | 15 o) Fa Ta Ea Ti Tra Ts TT e) [a [6 [on T 15 | a | om [126 | 110 | [E e To [se Ts sr Ts | ss [a sr os [re Tess [os [os | 055) [XT se os Te [se | 00 | se [os | [EL oa Te sa [e Te] em) [E oe Ts Ts Dose Tm | os LE To Ts ET Ea TT | e Fo LE opa Tas Es Ta Tm] e | [XT oss Ts Tie om | 132 | 556 EO Bs sas sm 1] em Ts)

7 , 423/586

' Tabela 5. Indices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

[Ly [E om [sm | ss | om [om] 25 | [XT er [050 | 76 | 10 | oo | 2860 | o220 [EX a Tom Ts [is | 001 | 035 | 60 | [o 655 7 | 63 | 6 | 10 | ns) [E e 616 | iss [siso | 00 | 055 | 00 [E e Tais | os | o | om | o | oo | [e 5 1 [45 T 267 [00 | o5to | 050 E om Tess Ts | 0 | os | 500 o e es nm [o Tone | 0 | o | ooo [o om 6 | 0356 | 20505 | 02 | sm | 026 | o Ecs Es Tess [245 | 7005 [555 | os o e Tn | se | 505 | om | om | os ET es Ts Ts [76 [56 | os [e TR Tas [on | 06 | o | 57 | 00 | [FEST [Em Tia Ts [ss 37] 0 | [o ss 1 | o | 2] sm | ss | 00 | [FL os Tr [os [275 | 00 | ass | os [IL e Toa To [Toi [ss Tia o) LED os Tas GE Ts [Ts [Tr e To is om | 65 | 125] 10) [Is q oss rm Tm Ts Te | os [FW [os zo [os | 0275 | 1 | 6 | [Loss q [o [os [ss | 5 a ' : 424/586 testadas me ee ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem Fa Tm [Te Tu e [am 6 | 0 | [a 5 To [sr [6 | om | 155 | o16 | La Tosse Ts or Ts To [a Ee [os om | e [im | om | 057 | [a o os [or | 16 [on | os | 075) [a [e | os [om | 025 | 055 | 05 | 05% | [a TA [os [5 [om [os | 120 | 10 | a ss | ie | os | 66 | 10 | 055 | [a [KT 65 [osso | os | Tor [os | os | [a ss Tosse osso | os | 165 | 16 | e [E e os Ti Ten [se [im | e) a e Ts To | is [sis | ss [a e 6 os [os | o | os | os a e [ra os To o | esse | ass [a Ts Ts www ww) o Ca e sa TT os ss Tie | o [a o [os | vs | os | os | os | os | o Dee a [Tn Ts os | | e [a [5 | os To [13 [om [1 | os) [A oe [105 | 0250 | 115 | 105 | 026 | os | [A os [os Tm | 675 | ox | 10 | os | [AR se os Toe [om [om [os | sm) [A 5 | os | os Ti | os | om | 05% | [E e os os [rs ss | os T 066 [A sm ossos To | 1 [657 | 15 [A e Te To Ti [1 [o | os | [E E Tam ea ri e 2 1 [E ss 6a To To os 6 | o [E a To Tom [os 115 | ro | os [E se Too Tae [75 o | 62 | om [Ec Tra Te Gs Te Te 5)

: i 425/586 Itestadas ee Cet es es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

[E e [Ts | sm e [55 5) [E [6 Tr T osso Ti Tr [os | os [E sn [os Ts 20 | os | 11 | 106 | [E se [o | 727 [55 | 00 [65 [aim | [E KT os To Tr [so Ts | 1266] [E es [636 | 155 T 685 | om | 2206 | 145 | [E sm Toe T 1552 | 7 | 035 155 [1 | [E sos Ti Ts [os [116 | ro [E 6 [os Tio Ts [os | io | 100 [E | Rr To | 165 | 265 | om | 10 | 165) [E | 66 [os | mm [os | os | 10 | 05 | [E cs [os Ts Tao | om [im [5 [E ev os | o [im | 00 | 2688 | 155 | [E e [oi Ts | 3246 [00 | 2055 | 268 |

— CE e ss Ts Ts so ss | 6 [E A Tso T os Ta [1357 [os | ros]

o CET e o Tam Te [os | ss | 152] [E se [167 [om | i207 | 15 | os | os] [E [oe | 1456 | 07 | 125 | 200 | 056 | 056 | [E E o Tri [om [1 Tre o) [E [o [os [sm | 22 | 10 | 10 | 166 | [E e [os Tm | 467 | io [iss | 105 | [e [o [os [os | som | 10 | 0566 | 050 | [E o [ 06 | 126 | 15 [om | 12 | 050 | [E | oa | 15 [os | tm | 1087 | 00 | os | [e | om | os | 100 | 02 | os | 0s08 | 0508 | [E es Ts To Tr Oz es To [E e os Tom [os ogia | os | os [E e | os Ti [os os | o | os [ES Gs Tre Gee am ss | [Ec sr ss Ton [556 | os | roso | Toss [e | os | isso [os [os | 15 | 10 )

, “

- 426/586

7 Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades; (testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem 0901 0,619 1271 0,275 0429 | 1,369 | 1,202 090K 0,788 1,019 0,470 0,607 1,109 o870 0757 [OX eso | os o5T | or o757 [xy es [0 | so | 265 | oo | 257 Cy Rr e e ww | e | ww) [xy ss | os T 1236 | 10 | os5 Ts | 1055 [Oy [em | os | 0565 | os | 16 | 105 | 105 | Ls er [oz Te 0650 oe | os7 | os | 0605 | os | [E sk | os Tom o 0,057 7,789 26,228 0,016 6,631 2437 [E in Tosse T os T ros Tosss | os | os Es es Tw e TT ww | OR | or | om | com | os | oo | om [e sw | oo | ass [sets | o005 | 18707 | 5202 | DP | 106E | 0549 | 1486 1,936 0,339 1,418 1,169 [PB [or [oz Ti [as | em [e ||

Õ , 427/586 | testadas

ENNGSNEE ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [5 re | o | 3 | Tm [om | 35 | [Db rs o Tess [555 [on | 15516 | 6 [E KT 0 To7 [2067 [6] ser 25 | [ps [om | 216 | 123 | 00 | 305 | os | [Pp rn | on [0336 [ossaa7| 0000 26660 | 6670 | E a [2 Tr [ss Tom | 25 [er [be [019 | 116 | neo [00 | o | oo [Br Ta Ts Ten [550 To 20 Tm [pb er [0150 | Tom | se | 005 | 066 | oo [Bos [os Tan [22 [660 | ss | 157 [Be [o [e Tess | 06 [7 | 33 [Pp 6 [os [67 | 070 | 007 | som | 2067 | ET ee Te Tra a | 2) oc Ee TZ TT Ts Es — ER e se ese es Tr Os o EEE ss Tr Tese Tosse is [FF [55 Ts Ter Tom os [os O [5 Tas [Es Tess Ts Ts) [EX mon Tom | Te [om [im | 05 | E 5 [Te [os Ts To] oss XT oz [am [3 | o | am | 156] [RT os Tim [64 | 027 | 156 | osso [O To TT 2 [os [is | [XT [os TT [267 | om | 1850 | 1007 | [XX To TT Tom [sm [so | 10] [E re es TT Er Tess TT 1) E re 5 Tr Tso [os | 16 | os A es rs Tras [Es ass os os [A e [os Ti Tom | one | 10 [| 10)

E , 428/586 Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem Pao o8N | 1,309 0,800 2432 | 2085 | 0913 1,080 [A | 7 [os ] 11 | 087 | 0565 | 1355 | Tom | ros 178 | se 17 os | tm | 081 | os | 115 | tom 7057 9166 | 17 170

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É y 429/586 testadas ss [O e o] O Je | ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

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. ' a - 430/586 testadas

ESENNGNSNCN ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem ET TST Ts Ts Tm Tess so [E e em e | 15 [om [o | [Es ra 696 [1006 T os T ros Tas | os [so [os Tm Tso | os | 10 | os [Er o [ns Os os Ts [osso [E [05 T 12 Tr ss is | o [FS os Tosse [o [ss Ts os) [FO e [os Tie [os | o | im | o | [Fm os [sz [os Tom | os | 055 | [ES FE ss Ts Ts es Tr Ts [FO e [os T 126 | 1226 | 036 | ii | 0565 | [FS 6 om | 16 | 22 | osm | | osm . | P [mm | o | no | no | ND | ND No [FT [or To | es | oe | os | osso [FS re os Tm Ti [on | 155 | ess) o CEO ss Tue Ds Dos [e Ts [Fm [ore Te T os T oss Te ss) [FO ss To [rs | os | ss ss Fc Fe er Ts Te Tm [ss [eo ES Bs os ess [em es] [FL Ts To [27 [os | o | os [FO e oe | o | 036 | os [11 | 055 | [FO nv 66 rs [os | og me ss) [ET Gn o [e [ess [o | ss | eo) [FS [os Ts ss Tess Tin To [NT a om Ts | 3 Tim 15 | sm) NT e or [Tra [es [ass Tr ss) [No [os T os | Ta [1200 [os T os | [ne [o | osso | 23 | 1160 | 055 | os [NT A os Ts | so T os To Tom [LN se [os | os ss | iso [os | os | [Nm [00 | ss T 16228 | 0010 | tor | 005 | [NT os Ts Te To | 2 | mo) [NT e [os Ts Ts | or | io | os x es Tm se To [iss |] [Ne [os | or [ese [os [15 | 05 |

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A ' : 431/586 (testadas e ee ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem NT Te Es Tm | sm Tm [Es o) [NT 1 | 07 | os | 67 [055 | To | os | RT FR oe TE [Tas Ts Ts | o [NT ns To Ti [om Tas [se | 65 NT nose [so To 032 | 15 | 05 q Dos 147 [1 [1 | 1 | 11 [Ns [om | 1 [2355 | om | im | os [e o [os | 2565 | 05 | 00 | 05 | sm | [E me [6 [a | ss | o | ame om) [E sr [oe Tr [sm | | o | os) : [e e [1 | 05 | 2505 | 00 | os | o | : [e e o Tas | se | 007 | 055 | 05 | [E e [ses [5 6 | 0450 [osso [6 [ma [oi | so | 255 | 006 | 56 | om | [E e 1 | | 20 [Tm Tess | st] [E as To | 043 | 30 To | om | oi [e Tv [7027 | 176 | 43 [007 | 036 | oo | [E mn [7 | os | 206 | 006 | Bs | os | [6 | [26] om | 600 | 00 | 2 | o055 | [Na [os [15 | 400 | oo 15 | e [ne [om | 27% | 065 | 00 | 25 | 155 | [| N 65 | oi | 2665 | 2698 | 0066 | 3070 | 136 | [ON [Ee To [16 [39 | oo | 52 | os) [ON [se | 005 | 26 | 12065 | 00 | 292 | 06 | [NT 6 [6 [27 | 77 | om | 2 | os | [NT [e [76750 [6450 | 00 | 3765 | ass [ne [622 | 215 | 527 [010 | 156 | os | [A e [o | so | sam | o0 | ss | osor | [ON [sm 0060 [as [2615 | 0 | 458 | os [Na [os | sm | 151 | 005 | 002 | ss | [ONT ze [o | 37 [156 | om | 205 | 126 [Nes 626 | 20 [7 | o | 220 | 127

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. 432/586 Itestadas e ee ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem PTE Ts E TE e EE es [NT e [os T 22 [6 | 005 | 256 | 77 [NT Gm [ns Te o es | nm | em x es [o Tem | 7 [om | 456 | o [Ir a Oz Toe [236 T 16 | 0950 | 05 [Fo 6 Tom [es | ns | os | 05 | [o [Go [os Te | 156 | 06 | 055 [Fe [om [em | iso | on | 24 | 1 [E 65 os | sm | 15 [6 | 05 | EE Ds Tm Ts Tom im Fe es Ton | ae Ts es | os E oe To Tese [5 Tem | — EEE Rs E [Os [es e oo E es [es Tr | os [os] os | a a os Ta Te ze | 10 | os [a se [676 | 050 | 240 | 067 | 055 | om | a om [ais | se [om | 122 | om | [a se os | 1736 | 356 | os | ns | ore [a [6 | om | 126 | 265 [o | 122 | 065 | a o | os a | 35 | os | 16 | os | [a Re [57 T 005 30 [osso | 1165 | 57] Fa Te os Tom [rs Tr Ta Te a GF os [1 [75 | se | o | os [a me os [13 [76 | 17 | oo | os a Rs [rm Tosa [7 | os | os [La es se Te [re [e ns 1 [a Tr [om [1657 | 50 | 07 | tom | 055 | Fa Tr [os Tosse se 5 | [a mw [os [12 [30 | o | 1 | o7o | [E Ts Ts Ts e is Ts

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í / 433/586 itestadas es Tee ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem LoL EE Er EE Ee E 1 E Te Tin [65 | 60 | 11 | 02) EEE TE TE Es To Tas rs) [Ie [o Ton [2 Ts Ts | 1) [E [Be [rss Ts [560 [os | so [OE [Er Es E om] 5 5) e e Trios 20 T 06 | most | osso | ER es To [2 TT Tess 5 TT es Tr [756 [om | 30 | 3 [e es Ts [nn 06 | 30 | 105) EG Ee TT Es TT Ts | 15 [e Ts Ton [768 | 00 | 65 | 0 | [EE Es Es [Ts | 15 | | 5 | [RA [7 ano Tae [00 | 06 | 0 | o EO Es e a Tess [om 5 To [LE Ea Ts [ss Ton os | 727 -— CITE [6 | Ts [065 | | om | [e [6 [40 [71 | om | 75 0265 [es [em | ste | 035 [00 [5 | 5 | [E 1a [sm | 1 | 025 | om | 052 | 05 | E e e | os Ts Tm | os [os [Ss si [os | 25 [5 | 25 [1256 | 056 ss Tess [zo ss | os [io | os] [Ls em [ss T 126 Tm | o | 116 | os Es Rs [ms Ts To [Ti O [E SP [6 [52 [ea | os | 4216 | 06 [sie [es | o | 047 | os Ts | 105 [Ls er | osm | 16 | 062 | os | os | os ET ev [se | is Tso | os | 135 | 256 | [Pp Tia [oi | 123 | 16 | 05 | 3 | 106 | [PT [os [112 | 28 [om [1 | tom |

, 7 434/586 testadas

Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução [| D | 1328E | 0436 | 1646 | 4116 | 0208 | 1698 | 1013 | | Do | 1328 | 0042 | 10351 | 23670 | 001 | 6724 | 2318 | | o 16 | otos | sa | 25400 | 0022 | 147o | 0101 | [| Pp | 12H | 0261 | 2075 | 9038 | om | 2362 | 1201 | | o | 12 | om | 10656 | 066 | 0550 | 1236 | 1025 | | D | 13X | 0000 | 45047 | 209722 | 0002 | 31693 | 7831 | | DD | 13% | 015 | 1153 | 7519 | oo | 1627 | 0507 | | PD | 18mM | 0133 | 4165 | 4801 | 0053 | 2060 | 0969 | | PD | 132 | oem | ooo | 1059 | os | 1006 | 0826 | | Db | 132P | on | 4396 | 5515 | 0028 | 0769 | oo | | Pp | 1320 | oom | sao | 12490 | 0028 | 5062 | 1805 | | DD | 12R | 003 [1317 | 652866 | 0000 | 66823 | 1644 | [| o | 1s | osor | osso | oo | 075 | 1020 | 0981 | | DD [1327 | o1se | 2219 | 12647 | 0035 | 1454 | 0289 | i [| D | 13 [oo | 63535 | 34110 | 0001 | sesmo | 15566 | | o jm] om | 202 | 2207 | 0155 | 1988 | 1164 |

. | o | 13 | oo | 4934 | 40968 | 0011 | 7o50 | 1857 | | ww | 130 | 0131 | 3632 | 2714 | 0050 | 3546 | 1829 | [Re ss Ts [im [o [is | 5 | Ns [or Ts [6752 [os T 1160 | 11 [Rs [ss [et [os | 008 | 75 27) [NT se 5 | 522 | 66 | ooo | o | 0126 [Ns | os | os | 327 | om | 17 | ie [x se es Te7 | 16 | se | so | 2350 | x sw [| so | 6557 | 0050 | nes | os [ns [os ] 056 T 2006 | 6756 | to | 102) LEA E os Ts [na es [em

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' . 435/586

É Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades;

Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

Ler e [e sm | 75 | 0 | 65 | 027 | [rr OK Tosse [os Ts | 05 | 67 | os [Ee os [Tm Es [Ts [Ts st [E e [65 Tin [os is | 12 | 65 | [ER [3 Tre | 126 | os | 055 | om) [ET Es Tm Ts Tr | 2 | 125 | os) Er om im ss | 11 | 13 | 05 ) [rr e e [os T 286 | 65 | 665 | 05 | LEE Tas os [is [oe [05 | 67 |

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a : 7 436/586 itestadas e e es e O ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [TOS e Tosse [om | 120 | os | 057 | [Fr ss [os [e ns [os | se | 16 o Er e as Ti [To ss Ts 6 [Fe ss [im [5 | 1 [15 | 12 [a [ss [o os | 20 | is | 05 | Tom | [a se [o | o | 34o | 06 | is | 106 | [a ss | rs | os | as | Tom | os | os ' a Ts ne os ss Ts es Ts [a [sr [os | 1052 [as | 0800 | 105 | 055 | [a se os Tr Ts Tom | Tem) o Ce es Ts eso Tas Ts | 655 | 055 [a ss os Tom Ts | 6075 | ros | os o ac os oe [so Ts Tosse [rss os [e ss [0865 To Ta | 10 | om [om | [a [rs os Ti | [os | rs) [e sw [os [60 | siso | 082 | 105 | 058 | [a [To [145 [65 | 00 | 106 | 032 | EEEF E Ts Gs Ds To TT [a ss [Tee Tess Tosm | 135 | os | os | [E Ss o Tie os e Te Os) [a ss [oo T 126 | 266 | os | is | 127 a sw [om Tm Tim Te Dm | 1 | a E e Ts Toe Tom [nm e) [E e To [os | om | 135 [os | 085 | [E e Ts | Toe To | 120 [re | e) [E se ss Tr [Toss Tin Tr es) [Es Ts To ss Tr [Te 5) [E ss Ss To To Ti | 1 | e) E e Ts os [os | ret es Ts [EO Tres Ts Ts 2 [sm [es

, 437/586 itestadas es CO qe pe O es] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem E rs Tre ss Tee [Ti ss | e [see Ts [os [6 To T 06 | asse) [ET sv ss [ss Te os [ss Tosse Ps e [e | 1 To Ts [is | im [Es ess Ts os ss is | mo) [LR es Tie Ti | 15 | 135 | 05 | 0 | [LR [e [os [1166 | 2138 | 0760 1067 | 1040) [RF e [as To | e Ts sm os [LR ee [os Ts [515 | 05 10 | os [ER or [os Ts [sm [os | 115 | 056 [Re [086 Tiso | 605 | om | im | To | [LR [en [os [is [os | o6m | os | os) o CER Rs Ts e os Ts OT [FR DK | os | os | 15 | om | ne | 17) o CRF e [eso Tr Tom Ts Tn [CR e [os Te | ie [os [in | 1 [LF can Grs [ss | osm [Ts | ss | ss FE Es Es E Tm Te [LR ea os [205 [616 | 675 | is | ros) [Rs Tom [im Tm Tee o | 10) [EF os Tr [ei os T ros | os [RF 6 [os Ti [no os | ss | 1667 EE ra as TT Em a Ts 5 [OR [sw [om | 68 | 020 | os | 1006 | os | [E [a [os | Tom | o | ij [10 | 105 | [E se [687 | ros | Tso | oe | io | os [E [so [ot | 16 | a [os | ii | Toi [E [e [10 [os | 127 | om | os | os | [BTT [os] | 22 | om | 1 | om | [6 [To os Tio 70 [675 | | 5 EB Ts Ee re es Ta Ts e) [o [os os | sm | os | tom | 1 | [e [ee os | 105 | 2267 [osso | 125 | ss [Ep [6 [0550 | ves | sa | 1008 | 106 | 15 [CB e ss TT | sm | is [10 | so [e [Te [os [065 | 503 [0000 | 236 | om |

+ 7 438/586 |testadas es e Ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [FB TF es Es Es Te Ts TT) [e [Rr | o77 | oo Tiso | os | 1218 | 0550 [5 [ss To | 10 | 50 | 10 | 17 | 16 [BT Ts ss TT a Ts Te To) [e 6 [is | om | som [iss [o | 1 | [E [Te | osso Tio [as [165 | 15 | 6) Ep Te Ts ess 22 Ts Te o [E sa [os Tr T 156 | os [io [07 | [E e e TT w Tn ww [| [E se To Tas Te | om [32 | 13 [E [e os Tr Tem Tom | 2655 |) o Ec Os eso [oss T os [os o [6 Fr Ke e Te TWT : [E e [61 Tm | 376 [005 | 322 | 5 [E Rose Te [21 | oo | 258 | 1 [CE Ee Gs Tre [Em Ts LE os Te Te ww Te) [E ow [66 | 275 | 05 [om [38] 1 | [NT a [os Ti [ess Tiso [2 5 [LN er [rat [os | 3155 | rã | os | ass [NT Te [26 [os [os | 57 | 089 | os [NT GF os Ti 7 is Tese Tim eo) [NT 6 Tese [os | os | pas To [os [x Ts He os [iz | [osts | oem [Ns o | 1 [266 | 085 | 16 | io [x e ss Ts [en os [o | [x Te To [is | 2 [os | ros [NT em osso Ti5s7 [os | o [15 [5 [TT Te [7 [a | oe Ts Os) [Na es Te Ts [os Tr | o

, 439/586 Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades; Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [x Ts es ss | | o Te | [NT 6 Ts [os T ss | 1067 | os66 | 00 [NT Om [0565 os [257 [os | 105 | 1002 [NT en [058 | os | om | 086 | 08 | os | [Re os os | om | em | 17 | 165 | o o 7 | 46 | 155 | os | 15 | [rose om | 255 | 6537 Tom | 217 | 070 [E e om [em [725 To [37] 055 | [FS so o | ass | ass [00 | 2556 | To [Fe [em Ts | 245 | 0055 [250 Toe LF rs Es TT [ss Tn | es | [FF 6 [os [2 [500 | 000 [164 | 325 | [PF es [o sm [6 | 00 | 6] 17) [Fe oo Tess | ros [os | 15460 | asoi o RO se [os Tess [ss [00 | asse | o766 [FO ee 6656 | 0360 T 26665 | 00 | 675 | 2305 — EEE Es Ts 6 [om | Te [CF 0 Ts [5025 [ 00 7028 | ra | [RF sa [om | 6506 | sm | 008 [as | 126 | FG 5 Ts | 7 | om Tre | 016 [FS e [e Ts [70 sm | 1 | [FO e 000 | 662 [160306] o00 | soam | as05 | [FS o | e | 5356 [on | re | s1s5 [FI BW o Tie 36 | 00 | oe | 25 [FO [o Tas Ts | om Te | [ps Tm e e ww o [ po [6 | 0005 [3604666 [1000857] 0000 | tets7oa | s66são | [Bo ee oz [sr | ss [om | 1856 | os [BD sr [0 | 06 | 15505 | o0o | 1746 | 0255 | [o [e | 007 | esto | 6252 [00 | ss | mosto | [o sa [0065 | ais | 2756 | 000 T 2126 | 0358 [E ss oe | 5 Tn | om | 220 | os [5 [sx [0135 | os | 683 | 005 | osoo | 012 [ps [00 | est [5560 | 005 | 7266 | 056 | Ps a 22 | so | o | am | 7 [PB e [os | eso T 635 | 00 | 276 | os [Ps To ss 22 [om | so | 005 | [Pa [0065 Tan | 38 [00 ] 2015 | 056 |

+ : 440/586 testadas em [O eee O es O) ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [DT TR E 7 ss 15] 15 e) [Bs Es Ts TT [es em se | [Bs [on Ts | 23 | 00065 | 26 | 66 PB sw [1 T 225 T 7540 | 0 Te | 2 [pe [om Tem | 755 [em | 2 | 03 | [Br En es [em | em [se is [o [sa [2 Toe | 165 | 152 | om | Toe | [Fe om Tons ss Ts om | | 11) ET Ts TT [Gs Te ss e o) E o sr Ts | 75 | os Tin | 2) FEET Ee Ts Term Ts [Ts 6) o EE [es Ts [Ta [oasis [5 [e e [os | iss | o [os [iam | 1 o Ee Ts [Te [6 Tso ss | [e se [on | 126 | 262 | 07 | 122 | 166 | FE Tr Rs Ta 6 Tom sz | [E e [en [25 Tam Tom [2 [1] [E Ts [a Ts Tom om [Ens Tm) E Sr as Ts Es Ts 6 1 [E [ss Ts [e os e | so [E a [ss os Tese [5 | om | os | [EG om Te Ton se | | 7] [E [se [os | os | et | os [os | os | [E os Ts Tr os Ti | e) [Ls Ts Tess To [e sm | | 15 [ss es [e | 5 | se is | mo) [E em [6 | osio Tas Tess Ts | [ss ess os Teo os | 1 [| os [Ss 68 [08 | 0570 | sm | 085 | 1056 | 105 | [E ea | om | 126 T 26570 | 06 [im | 17]

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' , 441/586 (testadas EFENNGaNcm ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem

[Ls TT es re es Te [Tm iso) Ls rs se Tr 67 ss Ti 15) [sv os Ts | os | 086 | 1202 | 1199 [E se or To [om | em] 1206 | 085 [e Ts [o | ez Tem | om | 242 | 0257 | [E se Ton Tas | sm | 00 | am] 175 | [e sr o | 2157 | 55 Tom | 257 | 12 | [e qm | os | o | 17 [os | 12 | 076 | [a se [ess [ro | 26 [07 [| or [ET os | 27 [725 | 0087 | 2067 | os | [o e om [2 | 2 | o [210 | 08 | o E se o Tens [an [05 | 715 | 0750 | [6 [sa [7 | 626 | vo | om | o | Te | o ER RR Tre Tess [oe Time | 16) Es Ts Ts [om Tese se | in) [E sv = [620 [7545 | 06 | Te | om [E sw [om [rm 5 Tom | ss im) [a e ns Tom | 255 [om [o | 15 | [E se Tres ess Tre | 56 | os | ro | [a se [5 | os | 2200 [so | 0556 | 0658 Fa Te [e Tre es om Ts e) [E TE Es ns Dm | om | 1 | 120 | [a sa [os [iss Te [o Ts | 156 [E rs 6 [ss Ts [om [135 | 120 [a e Ts [5 [5 | 5 se | is [a rs Te Ts Te TT 26 | os | ss [ass Ts [ss | Ts | 122 | 117 | [a rs 66 Ts T os [67 [io | 05 La es Tosa [Tr rs Tm [es mo) [a ss [1 ss Ts | 1x | 15 | [a es | o6 | 1250 | o | osso T 158 | 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Ts [os Tso 115 | 025 [sm is [RC e [on Ts Tr | 052 | 11 | os | [E Toa Ti Gs To | se | 16 [ON [sr [os 160 | 008 | 06 | 055 | os | [NT es Tem Te a | se Tin | 1) [Ns [os om | soe | rn | os | os [x [os Ts sm | um [2 | 1 | [NT es [526 T 16 [65 [om Tr | Te) [FG [om Te [em [om | 25 | iz [FO me To Tim [es [os | 266 | 156 | [IL 25 [o Te [77 [e | 155 | es) [Fe [66 T 152 T 23 [om | 37 | o | testadas EnNNcGaNcm ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E E [o Ts 5 ss | 26 | os [FO 2 Toe T iss | 055 1 025 [sm | os [FS ss Tm om | rm | 15 | Ty | 200º | otor | 4259 | 4348 | 0030 | 33868 | 1175 | | 7 | 2% | 00 | 3286 | 36641 | 0005 | 4663 | O67a | | T | 2005 | o769 | 1127 | 2009 | os66 | 1139 | 1012 ) | 7 | 20v | os | 1567 [| 4818 | 0152 | 1966 | 1269 ) | 7 | 20w | oost | 10879 | 5065 | ooo | 4055 | ormo | ' | Ss | 20 | 60961 | 1093 | 0420 | 12138 | 106 | 1193 | | Ss | 206 | oem | 100 | 007 | 0815 | og | 0832 | i | Ss | 2E | o8m | 1215 | 0856 | 0910 | 112 | 1175 | | Ss | 20h | 087 | 0904 | 1404 | 0700 | 1079 | 1054 | | Ss ] 2007 | 60704 | 1049 | 0613 | os07 | 1238 | 1046 | | Ss | 20x | 0972 | 0963 | 0423 | 1001 | 102 | 1066 | | Ss | 20 | 062 | 0995 | 2102 | 0414 | 1391 | 1173 | [5 Gm is Ts [o 17 | 067 | 1055 [E Tr ss Tas Ts ns | ros [E e [os T 27 [6 | 7 | 1 | [Ls ze im | 1 To [is | | 1 E O ss Ts Tem ss | 1 [E | os T ris [07 | os Ts | E E ss Ti [se [os Ts [ms o) E [os Ts [a Ts Te | 11 [A 2 To [317 | 16 | 0 [75% | o | [A E [5 | 7 | 15 | 36 | 2 | os | [A 2 Tom [43 | som | om | 226 | o | itestadas e qe es es] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [RT 2a os T 15 Tr [om | 255 | 15) [FO 2 0 | es [576 | on [rs | 457 [A [za | 072 T sm | 276 | 006 | 26% | 1062 | [A 26 Tom [1 [sms | 000 || se | [a [2 [o | 262 | 175 | 00 | 26656 | 1356 | A E E Ts o [iz | se | ns [a [208 | 0067 | 2665 | se | 00 | 225 | oe | [RF e To Tese Tom [o | es | 55] o E e a [Ts Tom iss [is [0565 [E ze Toe | am Tim [o [156 | o o CE E si ss | Ee To is | 6 [E 26 [om | se 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Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades) e Ce e es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem FR TE ET e e wA [A [2 Ton [os | 25 [om | 12 | 126) [A Tg o Tie | 755 | 060 Ti | 065 [A 26 [o | 26 | rom [065 | iso | ros [A E Ts Tom st | os To | 7 [OR 2 | 06 | 06 | 1950 | 0556 | 136 | 105 | [A ge [os Tim | 7 | os 10 | 005 | Ea e o OS Te Te e O [A [6 [os os 16 [os [1 | os | [A en [ore os | 017 | 062 | 110 | 0905 A a To Tim eo | os | 125 | 1 [A KT 1605 | os or | is | 1 : [Az [os Ts Ts T 127 | os | 095 o CATE o TT [is [o | e | 165 [A es [o T 26 [7 [oe ] 12 | o) [A [er or 6 | osse [060 | tir | ros [E 6 [os [os | Ts T os | tos | roxo [A ee [oe | 156 | 70 [oo [iz | 11 [A e [om Tr [se | 06 T 15 | os [A 2 | 05 | 135 | at | 032 | 1346 | tom | [A | 256 | 0850 | 108 | 2863 | 104 | 110 | os | [A [eis [os [is [255 | 20 | Te | se) [A 26 | 020 | 180 | os | on | 275 | 2 [A ze [os | o | sa7 | om | 1059 | os | Az os Ts To [62 | 156 | 13 [A [26 [0 | eso | 650 | 0012 | 40% | ro [A er [o6 T 1606 [65257 | 0000 | 9966 | 3706 testadas es Te ES ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [RA | 2 | 0605 T 1200 | 06 | os | tas [166 [a e [o [126 [527 To Ts [o [a zw | 016 | a600 | 2585 [ 005 | 357 | 156 [a 1 e [0 [1055 | 25 | 005 | 467 | os | a Ee e 2 | 2760 | o | | 6 [A 2 | 005 [75 | en [0 [18 | o | [a e [oi | 50 T 1086 | 0057 | sos | 2006 [a om | 11 | 2 | 007 | 236 [os o ae em [es Ts [om [es [es [A 25 | 6 | e | si | om | 15 | om) — Ca e es [e | e os Ti | [A Rr [oi | so | so | ooo [am | [A ev os | 17 | em | em [107 | os) La e Ts Dos Te [7 | in e [NT 2 | om | tom | To | 070 | 1616 | 556 | [ne [es Ti T 97 To | os | os) pn e e Te ww ss [Tor Tino | am [os os | oss5 [ON 26 [os | 165 | 06 [675 | 1 | os nz [om To | 322 Tm | is | o [ne | 2] ese [is | 10 | 08 | 055 | [TT Te Te ww x | [x dm | os | to | o | o | e | [x e os 15 Ts | 02 | se [o [ne e ie | 1 Ts [om | 5 [ON 225 | os | os | 216 | 07 | Tom | os) x e os Ti | 5 e in os [Se es Ts T 126 [os Ts | ro)

testadas e CT eee O es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem poe es es ww ww) ze om Ts | sim | om 25] em | [Ds Ts Gas | 0 | os | 006 O E ee Ts [755 | sm | 2 | os LO E Es Tm Tm se Ti e [Gr ee [Ts ss 76 | er | 255 | E E Es [7655 Te [60 | 3 | o “o O esa [60 | 29006 T snes | 0005 | iss | ea LO e ee Ge Ts [1 | 25 | os o O Es [os [55 Ts | 00 | siso | as [o [es [ssa | 005 | 66 | sm | [Fr ET es Es Tm [om [2 | 12 | O e em Ts | 2 [o | 17 | 15 E Sa e [os o [25 | om | 5 RE [ez | nm Ts | sm [1 | 115 [Rn E [os | os Tom | os | om | 16 | [Re [ese os To Tosa [so | 16 | EF E Te sm Tom Tim | 1 | is [Rr ss [em os | 006 | os | To | 56 | [RE es Te [sm [im | 1 | 1 | ES E se [e ss To [im | 12 | [LR e ss [o [is | om | om | o LR as ess Tom Ts [om | ss | ros [Rn ass [om | 16 [610] som | se | or [Rr se [eso | rose | 106 | 675 | nos | 105 | [nes ss Ts [55 | os | os | 11065 Rr Es om [es] 47 | os T 1 | 50 [LR a | os os To [os | ros | rs [Ar es | oe | om | 055 | io | 060]

itestadas e Ce pes es] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E a Ts ea 3 | | sm] os [5 2 Tosse Tost [ o006 T os T 0557 | os | Ee om Ts Tom [om | 1 | o [E [E | os Ts | 25 | 06 Tm | 1 [sz om Tiso | 2 | 065 | 132 | 117) [E E o [mm] 25 | 05 | 127 [im ) [E E os [os Tosse | or | 15 | 116) EO os [Ts Tr Tm 1 | 165) [EO Ter [os Toe Ts To is) E Es 1 [os Too [55 | 0 | 065 | o ER ss [Tm [os | ie [in Tiso [Ee ss Ts Tosa Ti | | ss) o CEE TT os Ta | ss | se Ts [E EB Tm Ts 7 e | | os [A se [os Tom Tso | 67 | ros | oo | [A 5 525 Ts [sm | em | 156 | om) [AS E os | os [rs | e | 16 | oe) [A Es Toe [as [5 [om Te | 0 | [A [66 | Tm se os | 126 | os | os [A ass os Toe Ts 67 | os | 0557 | [A e [oz Tr | 2 | o | 15 | os | [A ss [53 [155 T 2766 | 015 | Ts | or A E os [rs 6 Tom Tim | os A e se [iss | 5 | 05 | er | 056 [A ss [os [os T 76655 | 0205 T 16 [os] [A 6 [os [o | 70 | 07 | 17 | os | [A os Ti | 20 | 055 Tso | 105 a E oa [zm 27 oz Ts [me [AS [os Te e om | 1 | 1 |)

testadas e Ce ss ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [FT e osso [os Te 72 To [os | osso | [Ea To Tm | 67 | ess | 10 | 056 [Rr ze T os [11 [2556 [649 | 135 | 1306 [Rr [056 Tom | 36 | 07 [05 | 05 | [E rs [o Ts Ts | os | 1257 | os [CR 26 | o | os | s2%6 | 08 | os | o65 | [FA ss To [7 [om [se | os RS os Tom [ss To | | 0 | [Rr zm | om | os | 100 | 056 | 06 | 0505 | [RT nos [os [08 | os [os | osso | [EG [E rs Tm | 1 [os] on [CF a [o | is | 05 [165 | 1 | 15 | [RI LR ss Ts [osmose [ss [os : [FR os [ns e os [sm | ss o CRISE os Tom sm | 05 | os ] os [Rm | 062 | os | 61 | 039 | nom | o | [x a [os Tom 73 [sm | om] os [NT e os [se | To | os | os] [x Go [Tm st e | o | os | os [E Ge [Tess Ts | se | | os | os [NT EF Te os [sir Ts [ss | os] [x 6 07 T osso To [os | 107 | os | [NA [6 | os | as | 08 | os | os [NT a or TT 77 se | e | ros [RE [To Te [ss | se os [x [o [ii Ts [os | 15 | o | [NT E o Ti Tens [o | 27 | 055 [x st oss Tn Ts os Te | os [xs Tom [os | sm | 075 [os | os) [Rc os osso [se [os | os | os [LR Ev [7 Tosse Ts [os Ts | os: [NT zw | 080 | os | ev | 066 | io | osso | [NTE ess [ns 6a 5 | se | [RT Ga 096 Tess os [om [ro | os [ce Ten [no [em [os | Ts To testadas es Ce Ce ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem x Ta [Tm ss [o Tm] mo) [NT [ze Tom Tm | ss 7 [Tm | 10 [NT [om | 155 [os [os [is | os [26 Tom [iz | 32 | 030 | 156 | 120 Nas [o Ti is [on | 1 | 5 | RT Tor | 11 T 765 | 06 | ts 6) [na [om | 11 | 055 | os [im | x E [om | 1 20 os | Tm [x ze om | 12 | os [one | 122 | 26 [NT e Ts | [Ee Tom [ss 06 [RN [6 [os Ts To [ox q os | o | [nr [om Tim [o [os | 1 | 05 | [on 25 T os | 00 | 205 | om | osm | os | [nes [os | 0805 | 070 [os | 10 | os | — On Es Tom TT oss [ass Tese | se | ros x E Tem | io ss [om 122 | 10 | o E es Dor Tie Tom os [so | ms) [E 25 [636 T 48 | zo | os | 16 | ros [e [265 [660 | io | os [om | tos | os | [e 2 ] 06 | 137 To [oo [25 | os [e 25 [os [os | 12 | os [is | os e 2 | os | 65 | 110 [om | om | 1 | e a iss | im | 055 | 135 | 10 | 105 | [e [om | os | os | 65 | sm | os) [e as | om [2 [ve [om | 2 | o | [6 [66 Too [aos [655 | om | 715 | 16o | [E 26 [65 | om [oi | os [005 | To [E Ev Tom Tie [oe [nm | ss | [E am | os | 125 | om [om [| 7 | [Ls za Te [os Tee | om o Ts | [se em Tan | 160 | om | 36 | oz E Ee ne To TR ss os] 06 [Os e | om | 1252 | or | 005 | 035 | oo

(testadas am Ce ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [ET Ds Tm e es Tm | 6) [ET ess TT [3 | 0 | 162 | 15 | [EG em TT Ts [os [1 | 17 [EK [om To Ts om [157 | 07 | [sn [o [om | 1 [os | 1 | 11 | [EE Hs ss Tm se To | 055 | [E Ge 66 Ts2 | som | 005 | 23 | 045 | EEE e Tr Dan ess Tim ns [EE 5 Dos Tm | Ts is [NT E [os [rs Ts Ti | er o CO Ee se TT [ss Dos | 5 | os [CR [o [om | oi | 26 | o | om | 7 | - CRT ese [| 26 Tosse | 055 | os [Rr [os 125 Ts Tom | 15 [5 | [NT es os Ts [Tess Ts ro [NT es 67 os | 640 [os | 1065 | o | [NT E es se Ts To [15 15] [A Gs Te Tos im | 16 [so | 1656 Lx e es Ts [rm ss | | [NT ze os | 10 [25 [o | oz | 10 | [XT a | 055 Tm [Tosss [o7 | 110 T ros [RR os Ts To | 67 | 116 | 106 | [RF 26 Tom | 126 To55 [os [117 | 106 | [NT [on [11 | 0 | 065 | 1 | 1155 [RT Es [os Ts | osso | 67 [io | o [ON a om | 126 [om [om | 120 | 1 | [Os e [Tom | ss | 15 | 05 | 00 | [se [66 T Tio q 26500 | 046 | 15 | 10 | [E e [is | 058 | 550 [os | os | 055 | [Os Fem [Ts | 1400 [os | 123 | 116 | [E 56 [os | to | 6205 | 055 | 1 | os [sz [os | 1 | 207 | os | 107% | 05 | itestadas em Coste es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [ES se Tr | | rm nm o) [E E Ts Ta Tr ss Ts se) [E sn ss Tosse [77 [11 | 086 | os] [EE E Es Te e E 13) [E [20 | os | os | 122 | om | io | 05 | [E ss Tas Ts se | o rs) [E sw [os Tos | 27 [o | 1005 | 07 | [E zm Tom | 15 | os os | 125 | 165 [E sv [os Tosa [Tim 1 | 1 [E a os os [os Tm | es | [Fe a Tas ss Tee Ti | [ES Es TT [Te es Ts | 1 FE Es Ta ess es ] oss Tm) « [RT se os [os Tom To | o | sos [E To a me es Tim | 1 o Rs os Ti ss To Ti | | [RT et [os Ts Ts [e | [1 [nn am on | 11 | 55 Tom | 130 [17 | [RN [ss [os Te | 115 | os | osso [E 6 To [65 | so | 005 | 10 | osm | [Rr e | os Tio [7305 | 67 | 10 | 10 [A ar | 085 | 10 | 165 | 0685 | 10 | 1 | [Ev o Ps Es Ts TT |) [Ye [o Tr To [o | 1 | 125 [Oy [sw [1 | 205 | 225 | 00 | | o | [O E [5 Test [1 | 0 | 156 | 5) E os Tim es | is | ss [YA [om | 26 | 110 [0 | 30 | 7 | [3 = a 00 Ta Tao | 005 | 2 | o75 E Toss Tm os [os [se 25 [x za im | os | om | 14 | os | os [XY 22 [5 12350 [555 Ton [ss | 7 | [> 2 em | 270 | om | 00 | 222 | 17 | —

testadas em Co ese es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [FS E Ts Te Tom [5 | | [E es Tm Tom Ts [sm | 36) [RT Ee Ts os | | 135] 153 | os [A [sr Tosm [os | 2360 [o | 116 | 15065 | [A A [iz os Tem | 156 | os | os E E Es e Te es [ss [A ER Tra es Tem 7 || 1 ) [A ss [ne | os | 56 | iss | o5to | os : [A 26 Tom [sm | 20 | 065 | 055 | os : [A 2 [os | sir | 0765 | os | tom | 055 | A E TE os | | is | ss | 10 | se sm Tie [oe [un [18 | 165] E Es 6 [rm | se | | 225 | 06 | Ls a [iz os | 125 | ss | os | 165 [E Ev [Te om | 22 | 105 | os | 055 [ELE om Tim ss To | | is [pe | o | in | 0722 [075 T To | osso | [BE es [es Ts Tom 15 Te) [EPL Sos [165 | om | 032 | 155 | 1206]

testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose tipo selva- Pico redução gem [PD Es Ts Tr ss 1 Tm | [bp [a [5 | 227 | om | o | 0 | 3 | [PD Es Bs Ts rs ss Ts o) Ps De Tr TT [os sis [5 [o 5 [65 | sm | os | os | 105 | os | [PO Es Ts Ts [os os [rs Ts) [Ps To Ti Tom Tom mm | | [Pa [o Ts Tom [os TT [| [BO ass [os Tas [os Tom [5 | 55) DT zs To | [om | 6 [6 | 15 | [PL ss To To sm ss | | [DT 5 [066 | rim | 0655 [os | 120 | 116 | [EE se Te | an Tn Ts) o Ts om | ss | os | 135 | 150 | os — EE [e ese [sn 02 | 626 T 156 : [E E Te rss Ts Tom [rs | 17 [E SR Ts os Ts ss o) Ee oe o [os Oss Toe | 5 Es [os Tm | 5 | 0 | 15 | 05 [ET E Ts To [ese Teo [re Ts) EE [ow To Ts | | os | 155 LEE ns er e [a ess os [ET ER ss Te [os Ts | ss] oss) [Em [055 To Tom | os | 100 | os | [LE En e [335 Ts [o [ar | se [Pa Tor To Ts | os | 2 | 1 | [Pp e [os Tim Tom | os | os | ro [o [26 [0455 Traz | 005 | 0206 | 175 | 136 [PL 75 TT Tee | o | ni | o [BrT ess TT Tr sm Te Ts) [o gx [o Tr | 1 | os | 120 | To [EL se Tras es Toss Ts Tso)

testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução [| D | 25M | 028 | 1427 | 0176 | 0252 | 1636 | 1206 | | D | 269 | 0305 | 1835 | 3385 | 0153 | 2045 | 1408 | | p | 269a | os67 | 1412 | 27422 | 0436 | 1522 | 1307 | | DP | 26R | 6460 | 1503 | 0349 | 0307 | 1568 | 1297 | | pb | 2508 | 0524 | 1317 | 2406 | 034 | 145 | 1150 | | Pp | 2697 | o765 | 1001 | 1433 | 0635 | 11733 | 1109 | | D | 256 [0563 | 1421 | 2962 | 033 | 1460 | 1192 | [| Pp | 250 | 0269 | 146 | 1002 | 014 | 236 | 1273 | | X | 2604 | 0500 | tmwsz | 2101 | 03558 | 1305 | 0994 | | K | 26 | 0329 | 1122 | 980 | ot | 1734 | 100 | | < | 2600 | os02 | 1330 | 2362 | 0266 | 1303 | 1006 | | K | 268 | os7 | 1306 | 1746 | 0163 | 15623 | 1022 | | K | 260 | oe | 1381 | 12368 | 0185 | 1559 | 1022 | : | K | 26H | 0815 | 0953 | oss56 | o768 | 1195 | 1162 | | < | 260 | 0088 | 2723 | 19594 | 0018 | 3204 | 0894 | i | K | 26m | 0202 | 192 | 0538 | 0133 | 21590 | 1498 | [| xXx | 260R | 08% | 1074 | 1958 | 0730 | 1022 | 0906 | | K | 26068 | 0403 | 1268 | 6420 | 0269 | 1430 | 1105 | | K | 2607 | 0008 | 42091 | 72850 | 0003 | 44934 | 19893 | | K | 26Y | o403 | 1305 | 2148 | 0105 | 1718 | 1252 | | D | 2a | o74 | 1146 | 3905 | 0676 | 1001 | 0967 | | Pp [20 | 676 | 093 | 2004 | 0426 | 0967 | 087 | | Pp | 27%F | omo | 0900 | 3548 | 0920 | 1064 | os | | Pp | 246 | o6m | 1410 | 0204 | 0564 | 1278 | 1026 | | D | 27H | os0 | 080 | 3904 | 0666 | oem | 0866 | | Pp | 274 | 67 | or | 2666 | 052 | t1om | 1071 | | Pp | 27X | o6%6 | 0819 | 2208 | 03% | 1108 | 0882 | | D | 274 | 064 | 1162 | 0146 | 0400 | 1313 | 1152 | | PD | 27%4M | 080 | 092 | 8237 | 083 | 1060 | 1002 | | DP | 24N | 0863 | 1056 | 1791 | 0726 | 1000 | 0027 | [| PD | 27%P | om | 1044 | 1667 | 0591 | 1031 | 08065 |

Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades.

Itestadas

Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [1 zm oe os [| [2 | om | voz | 0313 | os [Pp zw | om om | som | 02 | 172 | osm | EERNINREZ:) 1,160 0,816 1,723 1,279 | 0708 | 0634 | | Do | 278F | 0905 0,996 0,730 0,741 0,519 | o | 26 108 o75 oa l D | 27H 0,976 0,790 1,028 0735 | os6s4 | [o [| 275 0,908 0,916 -0,402 0,740 0,621 [5 | 355 | vm | os | 7556 | os | os | os | | bp | 27%QA | os66 | 0916 | nois 0,828 0,830 0,703 Pp 7 om | 0556 | o650 | os | 0225 Lp 2 os a635 0736 [5 zw | 67 | 10 | o77 | os6 | 102 | oem | | e | 2784 | 0881 1,232 -2,011 1,087 0,950 | E ze | os | 1 | 32 | os | 1007 | 085 | | E TJ 276F | o742 | 1268 | 2627 0,672 1,249 0,751 | E | 276 | 080 | 1369 | 275 | 07 | 178 | o75 [E [| 76 1,246 0,874 1,315 0,818 0,711 [e e | T os | 456 | 157 | 058 | os |

Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose tipo selva- Pico redução gem CE TE EA Tm ss | is o [E 6 | 06 | 157 | sem | om [12 | 0065 | [E gr on | iss | as | om | 1266 | rom [E Tv [1 Tosse | 25 | 0 | os | 005 | [E | 651 Tn | 57 | 005 | 0705 | 00 | EE ss Ts [os | os 1127 | 07 [EG ss Tim Tos | 1 os | om | [Ee Tom | om Ts [om | os | os | [EE o [1 [os To | 16 | os | [E e os [is | oe | om | 105) | 066 | LE A os Tr sa or Ts 06 | CET EA om Ts 25 To | 20 | os ELE [o | 255 | os | om | 2 | is — CE ER Dr Ts Tess [sm | 122 | oe [E em [ss [15 | 15 ] os | 10 | os | o CE E 7 ss To To se | se LEE e Ts ss [oo 165 Toe | EG om Tim [ss [os | os | 0 | [CEC ER os Ts [sm | 06 | om | 052) FE E Ts Tr [ora | or os | os [E ET [o T 15 To | os | 1 | os | FE E ss rm os [os | 6 | os [E em ss | 13 [02 om | 1 | 056 | [EE 56 Ts Tee os [5 | os | EEE 18 Toe Tom [is sm | os [E ze 12 Tom | os | 165 | om | os | [Em TT om Ts is o | es | [EE Ts To Tm | 1 ss] os) EEE es TT Tas es Tr | o E [os Ts sm [os [e | 165) [E e TT Ts is [1 | 15) [Os a [os | os | os | to | 106 | 105 | [E ss Ts [os | [6 | 1050) [Eee a Te Ten om | 15 | os

Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades; me Ce es es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [Es 5 Ts | 5 Tu es | 2 [E 2x [os T os | os | oz | 05 | os | sz [66 [os] os T 100 [os | os | E [os To | o | es | 1 1) [CB 2 | om | sm | 1650 | 003 | 1506 | 026 [pq e [os | 1 [10 os | 12 | 126 | Lp a om [Gsm 5 [o [375 | 152) [E se se [iz | om T os | se | is [BE es [iz [7575 | 020 | 150 | 16 [o 25 [om | 24 | 16] 00 | 17 | tez | [Be [o em | 1 [0 [65] 1 | o CEE se os [om [os [1565 | os | [o ze [os [imo 36 | 10 | 1 | 1 | — CET [ess | rm Tess os Tim | 15) [Bass [os [es Ts | oo | a | 15 Es Es Tn To | se Ti | se | PB e o ss Ts 020 Tie | 15 [Pp 26 | 62 | 162 | 17 | 0065 | 2205 | 1356 EE [es [mz | est os [rm | 11 EE es Te Es Tom [35 | 1 [o a [o | os | om | 11 | 007 | os [o e [om Tor | 03 | om | 055 | os | [Be Ts] rm Ta | os | os | 100 [Pr E [E Tm [se | e 1 | 0 | [bp 26 | 085 | 157 | 07 | om | Tom | 108 | [Bs [es | se To | 55 | 10 | os | [o 2 [om | os | o | 060 | tis | tom | [BK os Toi Ts [os [135 | 11 | [PBS os [om 7 | e [iz | 16 | [Pp E os os Tese [mm | os | 00 | [Ba | 56 ] os [oa [o [os | oe Pe Tom | o | 10 | on | 65 | 026 | [pa [os T os | 03 [os | 1015 | os [be | 06 | [a [o [Ts | mo) [Ps Tess Tess [om | os | tom | 16%]

testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose tipo selva- Pico redução gem [5 Ta 6 | [sm mm mm] ms) [o sw | os [os | om [075 [1 | 6 | [o sm [os | om os [om | 1 | os | [o 2 [67 To | 00 | 67 | 1277 | 135 [LR [a [os [6 | [o | | 15 | [Rr e [om Tim [327 [os | 105 | os | [FS To Ts Tm o [ss | 15) [CRF e ess Tess | 2 | oe 6 | os) [RF e za Tm [6 [oo Tm | osss [FR E os | os 555 Too Ti | oa [RR zm os [e | | | | xo [Rm [os | o | ss | 055 ] os se) [FR re [om os To Ts so) [RS 2 [or [os | 1650 | 055 [2 [ie — Free Te Te Te O To [FS Gm ss Ts os | om Ts se) o RS e ess Ts [om [57 | ss [Fa e [Ts om Tese Te | 11 [Rs Tosa [1 | 02 [02 | is | 0652 [LR sr om [os | om | 055 | 1 | os] [FS [o Tom | om Tom Tm | 1 [FS | o Tr Ti om | se | 256 [RS ev [6566 Tas Ts To | ss | sms [FO om Tra eis Ts | os | Gs) [FS Ge To Ts | Tom | e) [FG [ei | ss [67 To Ts | ss [FG [es [Ga [Es To Tm | 226) [FGF en Em ee Tom] 3 | 16) [FS [25 | 05 [55 Tom | 5 Ts) [FG [2 ] Ts T 256 Tom ] 56 | 05 [FE Er ee Tas Ts 3 | [ET 2 | e | 255 | 06 [35 | 67 [POST [se | 26 | 377 | | [FO sm | om T 435 [13006 | 0005 | 620 | om7 | LF E Ta ss Tm [om Ts | 6) [FS Tam Tom [15 35] 37 |) [FO GR [06 Tas | 660 | ooo os | 00 [FO Toi [sw | 56 To0 | os | 00 | testadas Amino- Variante | Expressão | Viscosi- Viscosi- Extremi- Glicose tipo selva- Pico redução gem [ESET E Ts ms [Te Ts e [FO [om [52 Tese um | se | 7 [FL son Ton Tso [104 | om | 1167 | 00 LEE Ee OR sr oe | ss 55 [E a [Te ess | 122 | 25 | 0 | os [ET e Tom Tio [25 [os [10 10] [ES o Tre [rs To rs | os [E se os Ti [25 | os | tom | ro] [E e [om Ts | 17 | 02 [56 | 11 | [ES To [Ts 7 To [nm |) [E ss [os | mo [26 | 05 | tom | 100 | [E [se [o | os | 35 | om | 11 | 11 | [E e os | es | 27 | os 1 | 1 [E [zm [o ] oo | 2557 [so | om [ 11 | o e E e ess Tom | os | os | os [ET Es o Ts [7 | [125 | os [E [sa | 11 Tome | 33 | 155 | vs | 11 | o CE ER os [os Ta oe | o | os | [ETs Tom Tre [2 [os [se | 25) [E [Ts To E [ossos | os [E 6 T os | 055 | 20 | os | 1 | 11 | [E [sw [085 77 | 326 | 085 | 1 | 105 | [E sv 556 To [se Tom Ti | o) [o so [on is | st | os | is | 1 [E se Tom | 11 [210 | os | 27 | 156 [E rs Toss Tr ee se Ti | 1) [o sn [o To | 270 [om | 135 | 17 [E o Tm To [os | is [o | E a ne Eis 655 | oo Tas | one [e se [o | 10 | 21 [or | 105 | os | [E ss [om | ss 1 | 00 | 130 | 02 CE ss Ts Tom Ts [ss |)

testadas em ee es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [e [E os os | os | 124 | 0550 | 075 [6 [io To Tamo | ss | o0m | 2756 | os | [a sm [ais | 140 [00 | asse | 065 [E sm To T 555 T 20000 | 0005 | Tae | 265 [CE os Tr [6 | 66 | ss | 075 | [Es [on [sm | 55 [om 265 | 10 | [o [io [005 T ss | ss | 00 | si | 157 | [o a o Ts | os | om | 3 | 150 | [CE ER em [67 em | om | 250 | 53 | e | aos | os | No [No | No | No | No | ' [| s amv | oa [| ND | ND | ND | no | no | | e | sw | -ooss | 3564 | 16305 | 0013 | 3219 | 0468 | | e | sr | oo | 22260 | 63157 | 0004 | 18621 | 4063 | | 6 | sa | 09 | om | 1406 | 0825 | 0960 | 0664 | | e [ano 62 | 227 | 65566 | 016 | 2056 | 103% | | 6 [ 31 | 0231 | 2000 | 8116 | ooo | 222 | 0026 | | e [31 ot | 2774 | sos | oo32 | 4012 | 1286 | [| Ss | aum os | 1158 | 3143 | 02568 | 1651 | 0904 | | e | an | 0463 [| 1062 | 5915 | 032 | 167 | 09 | | e am | oo | 4233 | 44246 | 0014 | 9763 | 3147 | [| 6 | am | o | 1504 | 247 | 02390 | 141 | 0746 | | e [No | No | No | ND | ND | No | [E e | o Tso Tn | om [sm | o | [EG ess Ts so To | 1 | 11 LE rms os [Tr Ts [Ti Ts | es) [EG Es Ts Ts Te Ts e)

itestadas ee Tee es] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [x Ta Ts Ts e e [se e) [NT e [on [e | 266 | 055 | ij | 106 nm [o | ei [om [os | 1 | 1 | [NT sz [os [6 | 066 | 08 | | [RG Ee Ta es ee Ts 6) [On sz [om T 125 [os | os | 110 | om | [RT om Tm [os | 122 |) Lx Ge ess Ts Ee es [Ts se) [NE 05 Tom | 36 | 67 [in | 105 | Na To Tess | 15 | os | 146 | 1550 [NT sa [o | 05 [4a | os | 1008 | 100 | [Ne [020 ] 6217 [640 | 00 | 0202 | 00 | | Ns [os TT | 045 [67 | 150 | 0556) [TR e [ww [e e o) — Does Te [e om ss Tm ss [NT on | e [es [055 | im Ts | o DT Te os Teen [se ss 5) [NT e sr | os es | 0 | ss | rm [RT e [66 Tm T 155 | oe | is | 26 [e es [o | 137 Ts | os | iz | os [E e on | 1 | 2 | se 16 | 05% | E em e ww | w [5 x [E [e [om To | sr] os [ns | ss) [E Gs ss Ts Ts os ze e) [e x [os Ts [652 Tom | ss | os | e es o [1 To | o is | om Ee a [rm Ts os es es [E Gs [Ge Tr 2 To Ts [ss] [E es Tom [sr Tese Ts | rs [ss] [E Es [ss Ts 65 os [rs 55)

testadas em Ce ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem E Ge rs os [ossos T os | os Cy o os [is | 042 | 070 | 11 | 100 | [EV Ge om os | os | or | rss | st | [| e [is Too Tom [iss | os | 1065 | [Ge | 6055 | 16 Tom | 05 | 10 | 17 | [VR [om [is 1 [os | 16% | 0550 | [Oy ss [056 T os | os | 075 | os | om | o DT es es Ts [os To | se [FOLGA 0 os To Te [Mes Toss - RO ee ese [ss [6 | 065 | os | os [FO ee [on | 122 | 620 | os | 5 | os [EF GR ss Ts Tess Tess] Ts ss [FTF ss Te | mm [o [17 | 06 | [FG esa Te om [os TT se FF Re TT [mm o [3 | 087 o) [FG os Ts Tom [os | os | 055 E ER Ea Ts Tam [se | [se | [FOLGR [5 Tess osm T | osm [FG [ess Te a [oro | | os [FG om [iz | om [os | ist 6 [FO GR om [se e [os ss | ie) [RO es [os | os [se [12 | 11 | [FSB [os Ti | [om [xe | 11 | [FS GM os Ts [os To [1 | 126) EEE Res Tre Ra Res Te Ta [FT em [se 732 | os [o [1 | os | [E Ga 1 06 | re Ts [00 | 5 T 07 Es ss Tr 6 [ore Tr [o ss [os Ts Ts [os | 12 | 106 | [E ETs Tee Ts [os Ta Te) [E e oe Ts Tese [a | 12 | 16)

(testadas es ee pe O es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E Tr Ts Ts Es TE TS Te [o e on] nm Tosa | om | iz | 15% | e ER em | se | os os | 14 | 127 CE re Re TS Es Te Ts Ts [EG or 12 [70 [06 | 17 | is] [o sn | 65 Tito | 2156 [os | 17 | 132 [E Gs os [15 | 05 | 05 | 132 | 11) [E Es Tess Tosse | e | ns Te [CE ss Tess os Tri [osso] [Re os Tom [722 Ton | 1 | 10 [KR [sis [on] os | em [os [128 | 105 | [Rs Tom To | 157 | os | 1 | 11 — Free Te [De e e e LF Gs E om Tm e [is os [OK [56 [61 | 1582 [15513 | 0676 | 0665 | 005 | Car Es e Te e O o TE Te ss ss Te | ess [Ee es Tem ss sm Te 1) EE es Te Tem Te ET [E Ge Ts [st | so ] 106 | 082 [os | E E es Ts Rss e 1 | [E KT o | 15 | To [036 | 123 ] os) [E [os Ta | 136 [om [18 | 10 | [E ess Ti [2 | 0565 | 17 | os | E E oe Tre ss Te Ts E E ss Ts ss ss [Ts | 5: [E a [655 Te | mm | 055 [is | 106 | [E ER om Tas Te | om Tem | sm) [E | os 5 | 02 | 07 | 10 | 052 testadas es Up ee es O ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem Te e rs ee TE | | La a [To Ts 4 | 6 [ss | 10 [a ee 65 Tost | 320 [os | 10 | os | [a e ossos Tom [os | 055 | os | a e [ne [os | 5 | ne [os | os La e os TT ess Tom | 11 | 11 | [a o [os [om [ss | om | 1056 | 056 | a ss os Ts Tum [os 10 | 100 | [a sm [oz | ss | ss [os | ss [11] [a [er [es es [3 | os | 10 [om | [a [sc | os [os | am [os | o | o) [am ss Tie [65 | 1 | 10 | on [a [san os | os | 625 | oa [6 | os | — Te E ea Es E Ts | 3 5 a sr ss [Te | 255 | o | os | 100 o aces os Te 7 [os | is | 1 La ess TT Ti [os [os | os [a ev 65 6 | nm [se | sm] os La e es Te er es | 11] 15 | [Es 2 [15 | ss | o | | 067) [6 [se Ts Ts [em 0 | sa | 25 E ss Te [27 | nm 11] om) [e [ass | 035 [o | 67 [om | om | oo) e E [6 [3 | 3250 [05 | 10 | o0% | [e se [06 | sm [7665 [016 | 200 | o | se [ss [6 [6 [655 [06 | 15 | oo | e e em | Ts om | os | 055 e ss is [1 ss 7 | 5 | om | 06 | E rs ee 6 Ts om ss | 256 [E ss [o T 212 | 15 | 005 | 2005 | 1650 | rs E e [E Tn | ss | [e Tv [e | oe | 5 [es [5] 65) [E E E ss | 5] 10 [Ts o | testadas em Cet es jess ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [PT es [se [65] Tm 6) [pb sm om [16 | 255 [06 | 16 | os [pb e [om [o | 105 | 10 | 0 | os [Pp [E os Tso [Gs To Ti | os [E E Re Tr [Ge 7 ss | [PB A [os T 10 | 256 | os [10 | os) [Pr E es Ts Ta | 022 Ts | os Pr Es rs rss os | | os [o a [os [1650 [75 [o | 156 | 1367 | [PB e 7 [26 Tr [os [im | 16 | [pr ss ss Ts | 275 [os [os | os [pr E os Ts | sm om [iso os [5 ss | io | oe | 07 | 11 | 057 | o | [pb Ross so [os [os | 5 o) — Co Gs [o [e Ts [os | 1 | 0 | [Pp 3 [os | 1 | 245 | o | 136 ] 055) o EE ese [os [55 ossos [bw [om [105 | iss [os | 1] 1 ) [pb Es [om sm [se Toe Tm | 155) [RF is [os Ts [os [os | os [LR [se [oss To [se os [os [os [RT 5 [e [1 | 30 | o [sm | os [RF se [eis [30 | som | 006 [265 | re [CR se [ese | 1 | 100 To | 79 T 66 [FA E sn TT TE os T 126 | e EF Es sa rss Tem os [ss | oe [LR se [os [0556 T os [os | om | os [EF Es TT Ts Ts [e Tie e) LF Es Ge [rs os ns [os | oe [FR a [os [se [sr [o sz [os [RT e [or 15 [06 Tom | 115 | 155 [EF Es es Ts e osso Ts os [FE ess ss Ts | 065 | ros | ros [RS sw [0 [5060 T s095 | 000 [asi | as [CR 5 [oz Tent [om T 00 | 25 | sie EEE Ts Ts Ts os 2 | 15 EEE Es Ts Ts ss ss] Ts)

testadas em ese es ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem ET Te e se 66 | 7 | e | [se es Tio Ts [os 15] om) [se Ter Ti | 11 [os Tn | ore) [EE Rs Ts Tem e es] 16 [E e es Tam Tas [00 Tm | 1 [E sv [6 T 112 | em | e | ese | 17 | E e [e Ts [ss | o | 15 | 0217] [Re [os [102 | is] os | 105 | 100 | [Ao | 655 T 112 | 00 [085 | os | 1006 | [A e Ts 16 | os T 05 | os | os o RT os ss | os os Ti | oo [A [6 To Tiso | 152 | om Tom | os) o Ca Tosse Ts [o ss | os | [A se ess [os os0s | os02 | os | asse | [E E ss To Tem [os | om | os) [E es Tom Tom Tostes | os | os [A sv [os [056 | 18 | os | 1005 | 083 ) [A sm | o77m | 055 | 046 | 0583 | 108 | o) [A Ge [6765 Tom To Tom | 126 | 16 [E se [15 [057 | 00 [Tom | os | os) [E Tso [o 1272 | 67 | 6 | 1 | 105 | [LE Ls ss Tn [os [7 | 105 | 102 E Ss es ss ss Tom | | rs [ETs Tess Tos | 6 | 1 | 106 | [Ec EK [o [os [00 | 5 T os | 056 [ES es Tr 67 [om [ss [E Es es Ts re E [or os [CE sn Ts To [5 | 125 | os | 0506 | testadas em ee ES ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E se 5 Ts em em | | sm | [E e TT os 6 Ts | os | 65 | LER rs se o | 27 se | 1 [E Gs [es [os | 3a | os | 107 | 005 | [Ec es Togo Ts Tm [ss | 05 | [Ev ess Ts [on es | e | 11 [ET e To es | | 1 | 17 [a se [os iso Tese | 105 | 16 | 1550 [a so [os | | os [os | 10 | 10 | [ETs 0 To | 5 Ts | 6 | 0505 [a [se [os | 11 Tie [os | ie | 15 | [a ss e | os Ts | 175 | os | os | as [is om [65] 125 | os | o | FE EK Hs es [13 12 | os | 057 | "o CE Es ss Tese Te Ti | 1 | 11 | a E Tre Tm [ss 12 | os | os o EE Es Te Ts To se | ss Ts [Ea Gs Ts TT o 115 [os | 0 [a ss [os | osso | or | om | 087 | om | La ss Ts Toe [2 sm | os T os CE Es se Ts [iz Ts | 15 | 055 [E EE [Ts Ts se | 1 | os | os [a sw | 06 | 10 | 1556 T 058 | 1256 | 1002 | [a Es ss os | o25 Toe [175 | 102) [O se [os [om | 115 | os | 05 | os [UT E Te Tn [Om 6 | se] oss [ya [os [| 1 | 5 | om Tin | 1 [VT ee os [17 | 1 | oe | 1 | 115 [e os | os Tom | Ton | io | oo) [E Ge Ts Ts [oe is ss | 0 [ss ns | 66 Ton [is [os | os [O E es Es Te Tom | 135 Te) [Ye To To [066 [106 [os | os | [UR | so [os T os | 115 | os] os |

Itestadas FHaNGaNde ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [O Es Ta Tr Grs E Ts es) [E E Ts Ts om | os | 05 | [E e [os To | rm | om | 105 | os | [Oy [se [os Tom | 186 | os | 1064 | 1070 | [A ee [7 | os T os | 15 | 0556 | 055 | [A se [it | 067 | os | 155 | 100 | 0566 [A [see | os0 [iso | 05 | 07 | 122 | 1065 | [A [ns | os Tor | 142 | os | os [A [A | o | osto T10 [10 | os | 006 | [A e os [ms [is [os [a [506 A e os To 7 e [os | o: [AT [6 | 065 Tim mm | 1 [125 | 127 | [A [sm | 102 | 02 | osto [137 | os | os | [A se [ss TT | om | mo [115 | 10 | o A Gs [os [565 | 246 [os | 13 | 1 [A [se [6051 | os | os | vs | os | o5m | o CE Es os Tm [em Tin | 16 | 1 A ss 66 | ros [ro | asse Ts | 106 [A [7 Too | ros0 [1305 | osso [e [7 [Ea 66 T 11 Tam | 1 | 1 | 105 | [ET e ae [om [oo T 060 | te | os | CET sm Tr Tr os T 16 T os [o | 07 | 126 | os [os | 126 | 105 | Ee os ss Tem ss | 055 | 0565 [E SE sa Tas 7 | os Te | [E E os Ts [os [67 Tm | 100 [E os [Ta ss [ss Ts Ts [Em Ts To [7 | an Too | os [ss os | os | os | 1155 | 055 | 1006 | [Ex re To Tra Te ss Ts [Ex ss Ts zo Ts Ti | 11) ETs Tess Tr 7 | os Ts | 1) EE pa Tr Tam ss Tim | e) [o sw [os | 15 | 10 | 6 | 1 | 105 | [E ss [is | sm [om | 1 | 1656 testadas e Os OS ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [e TE [e e E Ts Te | es [FG [3 Tosse Ts | 1365 | os | 005 [6 [e Toe | 05 | 187 | 102 | 096 | 05 | [Hr [E TT Ts [23 [ins om | os) [FE 667 Tae so | o | ias | ss [6 [Gs Ts | oss | | 126 | os | 10% [Hr [Gs ss Tron ss [osso | | 105 [FE 3 [os [om | os | om | Tm | 105 | [Hs [6070 T 55 | ss | o | 127 | 115 | [Gs os Ts | so [ros | o | o [ETs os [1 [11 | 058 | 050 | os | [Hr [o Ts [os | os [o | os) [HT e Ts Ts [620 | 050 | om | os | o EC [ss Tosse [os | os [os | 5 | 075 [6 [ss os | 15 | os | om | 10 | 055 | o rr Ge [os Ts | so | os | imo | 106 [Fr 36 [55 [im Ts [6 [o | 220 | [RH [| 045 | 5 | 200 | 026 | 155 | 106 Rr E os Ts [Os | os | 56 Te E se os TT ost [os [os | ro] ros [E Ee ss Tr [os [os | 055 | 05 | [E E | 05 | os | vm | os | 003 | os | E [E os Ts Ts om | 15 | om [E E Te se Ten Tm | os | sm | Fa E ss Tg [ss | os Ts | 5 [6 | os | 1 [om | 05 | 105 | 105 | [e E os [os [os | os [os | 16 | [E a os os [os [os [16 | vo | EE SER pn Ts Tie Tess Tm | [Es [os [os [os | o [105 | tos | [E sm osso [is [os | os [156 | 157 | [E E ps Tm Ts [os e | 1)

Tabela 5. Índices de desempenho médio de variantes truncadas de AmyE para as propriedades ms) [eee e ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [NT esa [ze [656 | 026 | 16 | os | 055 | [NT se Tr Ts Ts 5 | 5 | so [Roso [rios [068 | 325 | 152 [os | 056 | [NT se [os [ei | 57 | os | 150 | 1355 [NT se [osso Tim | ms | om ] 11 |) [RT se [os [1 [om 025 | 1 | 13% [Nes [6 [066 | 1656 | 1210 | 067 | 0565 | [Nes [os [11 [025 [os | 127 | 11 | [x se o [17 [som Ts iss | 1155 [nes | os | os | 15 | 085 | 11] 17) Lx ss ns | ir [Osso [o [ss Te [NT ss [os T 20650 | 100025 | 0000 | is0345 | so07s | [LN ssa [os [ros T ossos | tos | tos > ON se [osso [os [005 [055 | os | 0550 [NT ss Tom T 1150 | o | ess T 1560 | os o EE e sa | or [os Ti | ss [NT [em [55 | 21 | oe | 125 | 11 | NT E [on [os Tam [ess | 126 | 1666] [x ess [em [20 Ti | sm [3 | | [NT a ns os [15 | e | 055 | 10 | RT se re [ss | om 57 | 085 | osso [NR so [os To | | 06 | os | 1012) [NT e [os | 105 | os | 050 | 0866 | 106 | xs re or | os Ta [or | 07 [NT se [er To [20 q 04 | 105 | os) [ON sm | osm | os | 1605 | os | os | os | [NT ss | ss T os T 1355 [osso | os | o857 | [NT sx [iss | os T os [os | os | os [x [ess [is Ti | os | ie | o [NT sw iss Tese | 165 | 1 | o | 10 | [NT e [os | 10 | 075 | om | 10 | 150 | [x ssa [e os 1 [os [so | os [ON TR [ss | o | 085 | os | os | os | [ON 6 Ts [ow | 162 | 055 | os | os | [Rs Tess | [se ss Dim [a] [NT Te [oem [6 [27 | | 1 | 115 | [EE ss Tie Te a rs Te)

testadas e Cespe O e] ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem LOTE E EE Tee TT Te es [e a [Te TT oss [os [17 [os [os] [e [E [os [os [os [om | os | 675] [e sr Tom Te [ss Tom] 17 6 [6 [sm [07 | os q 155 [osso | io | os [e ee [os [os | 157 | om [| 1 | [e e | os T 165 a sm Tim | e) [6 sm [os | os TT [om [om | os | [e ss T oi0s Tas | 559 [005 Tai | Tas o E Gs or Ts [is ess Tio 6) [e em [ss Ts | 155 To Ti o CE sw es [Es [6 [om | 5 ss) [x [os [os [1 [on [1 | os [5 se os | oss [os [os Tr | ros] [ss [om [6055 | 15 [on | 11 [ro [ss [os | 139 T 06 | 1050 | ro | ro [x se em [e se [o [ns | rs [E [ssa | os | 057 ] o0 | 0850 | 100 | os | [E ss [6 Tiso [00 | 67 [to | Tom [E as Tess Ts Te 35 Ts [E Gsm Ton Tm | es | os | ie Tm [Ex Gs Tess [os [o | 1 | 1) [E ss [os ess [ss os | pas [A [e T os [os [or | 0850 [162 | ros] [Rr [265 Tor | rs | om [os | 126 | 126 [E se To Tim Tm [os e [e testadas e ee ess ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E EE Re Tr ES ee Tr Ts [HP [6 To [os [326 Tm | 1 | 166] [LR Ge om [os [o | om | 1 | 10 | [RT se os [oo [0267 | osso T 0565 [oss [Rn | sm | ir | 086 | 080 | 1300 | 0856 | 0805 | [RT a [ns [o 025 | sz [osso | os [Fc Gs eis Esse To | 255 | re) [TR [sa | ot | os00 T os | os | os | osso | [RR Tosse [is [om | om [om | 160) [OR [36 T os | 1 | 208 [on [1 | 10 | [E GS Ts Tess Ts Tm oe | os: [LR [sv q os | eso [ o750 T 9765 | 0555 | ass [RR [3 | 0566 | osio [os | 0850 | 0876 | os | - CO Gs [ese | os | 2 | 066 | is | se o CE O [e Tosse | ros | 657 | ros [E Ss Ts Tio [os | os | 0 | os) [E [E | o | 121 | os | 035 [6 | 115 | [E ss sz Ts [75 or Tom | o [E e Tom [10 Ts o [os | 10 [Ee om Ts se [os ] 125 | me) [CET ss Ti Tem om [os | 6 [EE Res Tre Es Te Ts | e) [FE e os Ts To [| 1 | 171 [EG ss 05 Ton] 1 [os | os [E e [em [en om | e | o | e | ER ss Ts [os] se | | [EG ss TT Ts [e | | [5 Gs [os [os To | [| 115) E e ss Tess om 1 | 1 | 15) [E a [ss | os T 55 | 2356 [os | 1005 | [re Te Te Te Te TT) [E Ge [Tre Te Ts Tim [Tm | ss testadas e Tee ee ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem [E ee Ti [os | 15 se | mo) [E e Ts Too To | ss [os | ss [EG [im os | 25 | se [os | os | [5 sm [iz | os | 166 | 16 [os | sto [spa a e TT TT) [E se [os Tm T 25 [7 | es | e [E sr | os | os | 1618 | 1006 | 0550 | 055 | Ls ET os Te TI ww TO) [E sm [os Ti o | 05 | 1 | 10 | [E sm To: T os T as | osso | ro | ros sea Ts e De o 1 To o CE Ge es Ts [5 | T 055 | 05 [E ss ss | os Tre [os [os os o EE ns es is ] se | 055 | 656 E e os Ts Tm [os [io | is [E ss | os [055 [ora | 1157 | os E sa | [so | 56 | 17 | 0565 | 16 | [x ee iss Ts [msm | 15 | mo) [Ls sa [05 | os | 129 T 0555 [o | 15% [E e [os Ts | o [osso [5 [RT os Tin | som [os [Tm e x e er ix ss [om [Tm | 127 LE e Do Tim | 5 Tom [136 [250 [LI ese [ss Tom [62 [in os | 6) [Fr see [os | 052 | o | 07 | me | 15 [IL ss os Ti 3 [o sa 5) [se [rom [om [on Te | os | os [TO sa [ese Tess Tom [om | os | ss)

testadas em Crepes e ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem Fr E E TE 6 se 1 | 12 | [Ir se 0265 Tesm | 6055 | 065 | 106 | 1005 LE Gs em Te os Tess [1 | 120 Gs Ts Tess [o | | 1 | 16 LI Es O Ton [em | 1420 | os | os | [FO Gs [os To | eis [os [1 | 105 | [Or ssa [6 [os | 025 | 16 | 150 | 0065 | [FG | on Tom os | os | 17 | 115 [Ts [os Tm | es [os | 1 | 10% | [5 | sm | om [os | tr | 105 [A [Gee | 6866 [6556 [6680 T os05 | T005 | row [E o ss [e a ese [ms | 115 o A ee [os Te | on | os | os | rom - CT Ga ossos Ts | om | oo | os | [a [ss | os Tom | os [o [15 | 116) a ss [os os Ts Tom | e | me) [a Ge ss Ti 7 [om | tom | tos | a ss [os [os [os [om | 12 | 126) [A [sw [07 | 100 | osse | 0735 | 1195 | 117 E ss em os [is [os | 122] 115) [FR so [15 | os5t T 1586 | 155 | 0565 os [RF Ger [os | os Ts | 115 | 1 | om [Gee ss [os | 5 [es sm | 156 [A Gs | os ist [os [16 Ts | 11 LE ss oa ss Tan Tr 1 |) [E Ge [os Ts [om [Om [os | os [FG eso [es Te | 085 | 055 | os | itestadas e Coe es es O ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução " gem

[E Es o [om | ss [mm [KR se Tosa Tosse To [os | 1 | 10 [FS Gs oss Tim ee ss Tm | rs) [KR mw [os [67 [os | os | ist | 125 [FIOS GA [Om osso Tese [26 | o | sm) [Fw [os | 060 | 2507 | os | ot | oo | LF a Ts Ts [ss Ts | os | 07 [FL e se Ti [os To | os T oss [FIG om To Tiso [07 | os Tom) [Fe [os | os | tem | o [10 | 108 | o Cr SER ss Tee [7 | os | 15 | os | [FS ass Ts To [os [os | os)

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testadas FSaNNcGaNca ácido do dade de | dade Final dades de tipo selva- Pico redução gem LES EE ss Es e res eo [DR 3 [os Ti 7 [om | 11 | 1 | [LR sw | os | 1250 | 06 Tosse | 155 | 267 LF Es e Tn e [em ss 35 [psi 6 ms | os | 15 [os | 055 | [pe [om | 05 | vs | tom | os | os | PE Ta TS TT e ww EB ss os Tr [ee e ss ss [Ps [ss Tra [ss om | ron | os [BT ss | o [os [oe | st | sm | os PGS Ba os [Tras 0] se | [o [se [om | om [028 | 085 | os | os | [Br Es os Tess Tom [o | tm | 1 | Ps ess a | oe | iss | ros | 16 "o oe O os [oz | 065 | om | os BEBE TE De e TT e e — Dose es Tm es | o [os | e) [EL Gs os Ti [06 | on | 1657 | 1056) [ps Tom | 126 | os | om | 1277 | 11) [DT ss 055 so [ss [os | 1 | 5) [EB E ess Ts Ts [os [os T oss [o sw | 056 | os [oi [ 07 | 1065 | o | [o 5 6 | oo [05 | 105 | 087 | 105 | [A e o | oe | os os [os [se [A e [os Tr [os0s Tr osio | os Tosse [a FT oss |1m [ s6 | om | os | os) [A Es Tom Tr Ea Tas ss 2 [A [2008 [081 | 05686 | 04 | 0706 | os | os | [a o Toss Tim Ts om | 1] 11) [A xr [056 | 0565 | uso | osm | os | os | [A [os T os | o7m | io | oo | 1505 | [A o [135 [os | 12 | 156 | 0050 | os | [A a [om [os | a | Toe | 05 | os | [A 66 To | 162 | 0 | om [ii | 167)

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Itestadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | s | nom | 11 | 10m | 109 | 105 | 073 | o8 | om | | s | ossr | 1027 | 1038 | os | os6 | 128 | 09 | 115 | | s | 1023 | oem | 002 | 105 | 099 | os0 | 126 | om | | s | tom | os02 | 1130 | 100 | 085 [| 101 | 115 [| om | | s | oem | oror | os | os5 | om0 | 08 | om | om | | s | os | 0021 | nom | oem | om | o86 | 129 | o8 | | s | 1116 | 116 | 1116 | oo [ 106 | 118 | 105 [| 068 | | s | osm | o9m | oows | 101 | 104 | 08 | 101 | 101 | | s | os22 | 0062 | 0880 | 102 | 103 | 07% | 110 | os | | s | now | 1061 | osos | 100 | 103 | om | 101 | o8 | | s | 1068 | 1133 | 1097 | os85 | os5 | om | om | om | | s | 152 | 1416 | 1405 | 106 | 101 | os8 | 113 | 057 | i | s | oss2 | 0650 | 0867 | os5 | o82 | 068 | o85 | oa | | s | 1096 | 090 | 1120 | 080 | om | 062 | 02 | 106 | | | s | 10% | 1048 | 1063 | os | 085 | 070 | o8 | os6 |

| s | 120 | 1200 [1212 | 101 | 106 | 100 | om | 10 | | s | -0362 | 0438 | 0912 | 000 | 000 | ooo | om | 000 | | s | 1060 | 1103 | 1026 | 104 [ 106 | 124 | 108 | 066 | | s | 1000 | 1110 | o76r | 100 | 10 | 08 | 09 | 104 | | s | 150 | 1708 | 3767 | 000 | oo | 000 | 000 | ooo | | s | 7366 | 615 | 8760 | 118 | 101 | 06 | os | o21 | | s | os | no [| om | 086 | om | om [om | 1m | | s |-osu |] -os%6| om | om | om | 000 | om | ooo | | s | 1188 | 117 | 0976 | 10 | 106 | 103 | om | os | | s | 1200 | 1202 | 0651 | 106 [11 | 116 | 1565 | 125 | | s | -0278 | 0360 | 0740 | 000 | 000 | 000 | ooo | ooo | | s |-o161 | 0209 | 0301 | 000 | 000 | 000 | 000 | oo | | s | -0406 | 0587 | 1015 | 000 | oo | om | om | ooo | | x | os66 | o663 | 0846 | 097 | os | os | 10 | os | | nº | 1102 | 0060 | 1156 | 002 | os | om | os0 | 105 | | n | 1027 | 1014 | 1061 | 104 | 102 | 082 | 116 [| 10) | | an J 1198 [1221 [417 | 106 [ 106 | 102 | 120 | 187 |) | n [1267 | 1337 | 1368 | 100 | 100 | 120 | 134 | 147 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O tipo sel- aquecido 3omin vagem | n [10238 | 1067 | osr | 105 | 101 | os2 | 089 | 116 | | n | os87 | 0004 | 0851 | 101 | os | 104 | 101 | 120 | | n | 1204 | 107 | 1156 | 10 | 09 | 11 | 086 | 150 | | n | 1002 | 0850 | 1072 | oo | o8 | os | 106 | 080 | [| n [0861 | 0500 | 087 | 083 | om | 082 | om | os | | n | 1052 | 0933 | 1017 | 008 | o86 | o73 | 090 | oss | | n | 0932 | 0008 | 0651 | 100 | os | o8t | 08 | os | | n | osso | 0963 | nest | nor | 086 | om | 11 | 189 | | n [114 | 1160 | 117 | 103 | 096 | 086 | 10 | 13) | | n | 1016 | 1015 | 1015 | 008 | os | os | 107 | oss | | n | 1128 | 1060 | 1006 | 101 | 096 | os | 002 | 106 | | n [107 | 0957 | 1044 | 104 | 09 | 097 | om | 122 | | n | 1236 | 0932 | 1159 | 000 | 08 | 082 | os | oss | [| <x | 1089 | 0708 | 1018 | os | o87 | o8r | 100 | 179 | | x | sms | -esm | 115422] 08 | 08 | o70 | 110 | 136 | [| x | 114 | 0964 | 116 | 11 | 106 | 100 | 133 | 226 | [ x | 104 | 0940 | 0002 | 117 | 11 | 086 | 128 | 16 | [| x [1264 | 1130 | 1246 | 089 | 096 | 106 | 096 | 158 | | x | 11656 | 1052 | 1100 | ose | 101 | os | o86 | 150 | | x | 1167 | 1090 | 11865 | oo5 | o | os | 008 | 165 | | x | 107% | 0908 | 1006 | 108 | 100 | os | 002 | 10 | [| x [1268 | 0925 | 1272 | 108 | 08 | 086 | os | 218 | | x | os862 | 057% | 081 | 08 | o7% | om | om | 154 | [| x* | 1036 | 0600 | oset | oo: | om | om | om | 100 | [| x | 2149 | 2600 | -so17 | 000 | oo | ooo | ow | ooo | | x [1163] 1053 | 1172 | 101 | 08 | 106 | 106 | 163 | | x | 117 | 084 | 104 | 106 | 09 | 107 | 136 | 178 | | x | 1120 | 0702 | 1046 | 107 | 080 | 102 | 08 | 187 | | x | 1007 | o6m | 1101 | 102 | 086 | om | oe | 266 | | nm Í osm | 0600 | 0846 | 108 | 096 | 100 | 126 | 106 | | nm | 1700 | 1463 | 1938 | 000 | 090 | 053 | 126 | o67 | | nm | oem | 0645 | 0865 | 102 | os | os0 | os | o75 | [nm | 1062 | 0959 | 1101 | 107 | 106 | o&s | 126 | o0 | itestadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | nm | 103 | 094 | 1038 | 113 [ 110 [ 08 | os | 118 | | [1127 | 070 | 1001 | 108 | 105 | o8 | 120 | 119 | | mn [1 | no | os | os | 066 | 08 | os | os | [| n | oswo | 0053 | 1031 | os | 08 | om | 105 | o7 | [| n [1463 | 1297 [1774 | 091 | 090 | om | 0659 | om | | ns | 0982 | 0723 | 0862 | 100 | 09 | o7 | om | o7% | | nm | 1040 | 0749 | 1018 | 113 | 10 | 090 | 146 | 113 | [| ns | ossos | 0755 | 0980 | 107 | os | 103 | oot | oo | [| ns [os82 | om | 0952 | 110 | 089 | oo8 | 123 | 107 | [| ns | osso | ora | ooss | 105 | 097 | 100 | 110 | o7m | | nm | 1053 | 0753 | 0908 | 000 | 106 | 101 | 1065 [| 11 | | x» | 1016 | 0763 | 1004 | 005 | 08 | o8t | om | o6s | | pn | oew6 | 0685 | 1032 | 080 | os | os82 | 0653 | o7 | i | an | 107% | 1074 | 1038 | 084 | os | oo | 082 | o8 | | qn | 0900 | 1000 | 0902 | 109 | 106 | 101 | oem | om | i | n | osme | 1025 | osso | 105 | 110 | om | 117 | 106 |

| n | 106 | 1046 | 1008 | 101 | og | os | om | os | | n | oswo | 1036 | 0036 | 101 | o | o76 | os | os | | n | 1100 | 1226 | 1301 | 006 | 09 | 082 | o6s6 | os | | nº | os4o | 0816 | 0606 | 005 | 088 | 08 | 08 | os: | | n [1086 | 0781 | 1008 | os | o7m | om | om | om | | n | os | 1033 | 072 | 11 | 11% | 1 [18 | 136 | | n | 1062 | 1124 | 1053 | 087 | 086 | o&6 | 07 | os | à | 1080 | 0746 | 1056 | 114 [ 118 | 094 | oe | om | | n [12 | 1236 | 1201 | 096 | 09 | 10 | 052 | 122 | | n | 1367 | 1101 | 1260 | 105 | 088 | 106 | os | 124 | [| n | 1100 | 0870 | 1164 | 106 | 08 | 089 | 103 | 100 | [| x | os2i | 0662 | 0804 | 103 | om | oo | 127 | o8 | | x [121 | 1005 | 1320 | 080 | o85 | os | os2 | o6 | | x | 1058 | 1025 | 1070 | 102 | os | 088 | 106 | 102 | [| x | 1031 | 1046 | 1033 | 106 | 105 | 105 | 1396 | 136 | [| x | 063 | 1009 | 1028 | 112 | 11 [1 | 128 | 163 | [x [1001 | 1031 | 1012 | 103 | 08 | 106 | 137 | 136 | | x | osmo | 092 | osra | 104 | om | 110 | 11 | om | [ x | 1053 | 1008 | 1070 | 089 | om | oo | 100 | 106 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem [| x | osso | ne08 | 1024 | 000 | o68 | o8 | 121 | 07 | | x | os5t | o657 | 0884 | 100 | 08 | 107 | 103 | os | | < | os3 | os | 0867 | os8 | os | om0 | 103 | 105 | | x | 101 | 099 | 1015 | 102 | 101 | 09 | 065 | o8 | [| x | 1031 [ 1116 | 1020 | 100 | 09 | 106 | 126 | 102 | [x [1046 | 1061 | 1070 | 101 | 095 | om | 126 | o7s | [x [1166 | 1107 | 1108 | 107 [ 104 | 118 | 120 | 105 | | x | 1000 | 0850 | 1105 | 106 | o70 | 101 | 1323 | 002 | | e | 100 | o6s7 | 006 | 103 | 080 | om | om | o86 | | p | 1316 | 1002 | 1307 | 110 | 08 | 118 | 139 | 1nm | | p | os | oss6 | om | os | 103 | 107 | 107 | os | | D | 1052 | 0958 | 095 | os86 | 103 | 129 | om | o8s | i | DD [1121 | 1045 | 1022 | 08 | 09 | 11 | 096 | o86 | | D | 121 | 1085 | 1169 | 112 | 106 | 101 | 166 | 122 | i | np | 124 | 0869 | 1210 | 101 | 08 | 139 | 133 | 09 |

| » | 107 | osw6 | 1006 | os | os | om | om | o7s | [| » [os | 048 | 0765 | os | os | om | 112 | o7 | | p [osm | osss | oss | 101 | 082 | om | 118 | o8 | | p | os | 1040 | oses | ost | os | 105 | om | om | | p [111 | os06 | 1046 | os | om | 106 | os | om | | p | os | 066 | 081 | 103 | os | 00 | 120 | os | | p [111 | 0683 | 1059 | 102 | om | 117 | o86 | om | | p | 10 | o746 | 08869 | 101 | 08 | om | 100 | o86 | | p | 113 | 0760 | 1043 | 104 | 090 | 123 | 082 | om | [ e | 1022 | 0806 | 0862 | 11 | 10 | 132 | 086 | os | |» | 1040 | 0704 | 097º | 103 | 100 | 131 | 094 | o67 | | = | os81 | 0530 | oes3 | os | om | 080 | om | 13 | | nm | os62 | 0643 | o8m | o8r | om | os | om | 118 | | nm | osos | os0 | os | 090 | 08 | om | 110 | 110 | | ms | os | os40 | 1026 | 100 | 087 | om | om | 122 | | = | osse | oro | 0881 | os | os | 150 | om | 117 | | ns | 1847 | 1882] | 2101 | 086 | om | 119 [om | 12 | | +=. | osse | osee | 06878 | oo | os2 | 106 | 081 | oo | [ns [1222 | os57 | 1260 [| 095 | 004 | 106 | 096 | 113 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | nm | 10 | oro | 008 | os8 | o81t | 067 | os | 120 | | nm | 0963 | 0840 | 0934 | 104 | 096 | 085 | om | oo | [| nm | 360 [335 | 471 | 107 | 120 | 06 | 116 | 383 | | nm | oes2 | 0oss | os6 | os | 100 | 10º | 008 | 120 | [| mn | ormes | o745 | oms | 101 | 1o7 [ 119 | 127 | 115 | | nm | oss4 | 0829 | 0865 | os9 | 098 | 110 | om | 146 | | mn | 111 | 1037 | 1124 | 107 | 106 | 131 | 121 | 176 | | nm | osto | oes3 | os52 | os | os6 | 136 | om | 105 | | nm | osso | 0810 | os | oco | nos | 102 | os | 125 | | nm | 1026 | 0800 | 1040 | 100 | ou | 106 | 118 | 122 | | t+ [os | 0716 | 086 | 080 | os | os | oe | 122 | | 1 | 1176 | 1060 | 1210 | 108 | 108 | os | om | os | | rt | 118 | 1231 [| 1168 | 087 | 106 | oes | 163 | 120 | i | t+ [os | 0006 | oem | 104 | 10 | 08 | 108 | 147 | [| 1 | os6i | 091 | os02 | 100 | 096 | 100 | 106 | 152 | | 1 | 107 | 1067 | 1046 | 091 | os | om | om | oo | | t+ f os&s | os | 0880 | oor | o68 | 11 | 100 | 105 | | 1 [11 | 0866 | 1108 | 088 | o83 | om | om | 069 | | rt Í[10m| os | 1041 | oo | 090 | or | 066 | 101 | [ 1 [2626 | 2650 | 2701 | oo | 11 | 11 | om | 16) | | 1 | os | 0888 | 096 | 110 | 113 | 10º | 106 | 155 | | rx | os | ss | osso | 103 | 106 | o82 | 126 | 127 | | 1 Josi | 1021 | 094 | 100 | 104 | 080 | os | 119 | | 1 | oss3 | 0056 | 091 | os5 | nos | 116 | 080 | 116 | | 7 [1057 | 101 | 1130 | 080 | 10 | 120 | 107 | 125 | | 7 | 1096 | 0808 | 1065 | 105 | 059 | os | 100 | 143 | [ a [1222 | 1163 | 1218 | 104 | 088 | 112 | 103 | oo: | [| a | 1053 | os | 1137 | om | o7m | 106 | 06º | o68 | [| a [0702 | 0700 | 0832 | 00 | om [ om | 104 | 120 | [ a [os | 10 | 1001 | 11 [| 107 [| om | os | oos | [| a | osso | oess | 0961 | 106 | neo | 136 | 124 | 100 | | o | os66 | ori | 08% | 104 | 062 | 054 | 132 | 07 | | a | 1062 | 1147 | 1034 | 103 | 101 | 110 | 1223 | 062 | | o | 140 | 146 [ 1566 | 096 | 102 | 008 | 102 | 116 | [ a | 10 | 1003 | 1056 | 099 | o9s | 122 | 162 | 100 | testadas ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | a | 1563 | 1205 | 1567 | 087 | o65 | 102 | om | 10 | | e | 0903 | o7m | 0878 | 100 | 082 | 106 | 079 | o76 | | e | 1003 | oem | 0954 | 10 | os8 | 08 | 137 | om | | o | oss2 | 0749 | 0854 | 100 | o76 | o54 | o59 | o8 | | a | 1000 | 1142 [1002 | 10 | 128 | 155 | 222 | 132 | | o | 107 | 1163 | 1052 | 102 | 105 | 086 | 136 | o85 | | e | 1062 | 1105 | 1043 | 09 | 104 | 090 | 088 | os | | a | 1300 | 1340 | 1486 | 100 | 119 [ om | 183 | 116 | | a | 177 | 167 | 1914 | 10 | 07 | 073 | 085 | 086 | | o | 1886 | 1020 | 1368 | 100 | 086 | 093 | or | 123 | | v | 1150 | 0951 | 127 | 08 | o68 | 120 [17 | os | [| vy | sese | 6102 | 12218] 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | v |-o184 | 024 | 0456 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | i | v | 2302 | 1474 | 2468 | 085 | 026 | 075 | 176 | os | | | vy | os | 0600 | 0702 | 085 | os8 | 08 | 140 | 181 |

| v | 10 | 0735 | 10% | 101 [| 07º | o8 | 1523 | 28 | | v | -s223 | 4038 | 8305 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | | vy | 1247 | 0672 | 1090 | 118 | 00 | o6 | 12 | o5 | | v | 106 | 0936 | 1038 | 100 | o60 | or | 188 | 005 | | v | oro | 0682 | 1054 | o82 | os54 | o79 | 146 | 009 | | v | 19806 | 1879 | 2706 | 078 | 066 | 121 | 267 | o | | v | 2412 | 2201 | 2910 | 110 | 080 | 090 | 252 | om | | v |-0503 | 0632 | 1167 | 000 | ooo | ooo | oo | ooo | | vy | 1266 | 1006 | 1167 | 083 | 053 | 102 [12 | 12) | | v [1012 | 099 | 1078 | 086 | o70 | os | 117 | 182 | | v [-oms | 0233 | 0463 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | v | 3200 | 23541 | 4215 | 097 | 008 | os | 123 | 006 | | e | 110 | 0805 | 097 | os | o78 | os2 | 158 | 127 | | e | 1246 | 1163 | 1469 | 094 | 080 | os82 | o78 | 116 | | e | 127 | 1106 | 127) | 087 | o78 | 068 | 130 | 107 | | e | os | os21 | 0846 | 112 | o87 | om | 248 | 154 | | e | os65 | 0746 | 0804 | 08 | os8 | os2e | 197 | 135 | | e | 0900 | os | o667 | os | ostr | 108 | 182 | 136 | [ e | os6 | o67 | 06826 | 00 | o82 | om | 19 | 132 | testadas ácidodo | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | 1004 | 0822 | 1556 | 086 | 059 | 063 | 325 | 179 | | e | oso | 0684 | oom5 | ot | om | os | 167 | 120 | | e | os51 | 0751 | 0835 | om | os | 112 | 174 | 160 | | e | 1236 | 1069 | 1315 | 100 | o7º | o88 | 196 | 121 | | e | os | os2s | osm | os | o82 | o68 | 354 | 33 | | e | 103 | 1033 | 10468 | 105 | 093 | 089 | 190 | 128 | | e | 10º | no | 096 | os | o86 | 109 | 1866 | 156 | | e | 1168 | 1186 | 1068 | 085 | 082 | o86 | 190 | 126 | | e | 103º! | 074 | 0000 | 086 | 073 | 11 | 1696 | 129 | | an | 1047 | 0661 | 0064 | 100 | o74 | 088 | 09 | om | | an | 1815 | 114 | 1518 | 105 | 096 | 08 | 062 | o | | nº | 1025 | 0950 | 1036 | os | 086 | o68 | 08 | om | | an | 1063 | 1042 | 1027 | 089 | om | om | 102 | 118 | | | n | osto | 0894 | 06804 | 084 | o67 | om | 126 | o82 | | n | 1105 | 1103 | 0815 | os | os | om | 128 | 10º | ' | qn | o750 | 0466 | 0652 | os | os7 | 070 | os | om | | n | 1206 | 0988 | 0900 | os | o76 | 022 | 128 | 136 | | x | 1048 | 0699 | 0956 | 103 | os52 | o7% | 109 | oa | | n | os | 0667 | 0766 | oo | 06 | 087 | 082 | o7% | | n | 1068 | 6762 | 100 | os | 081 | 069 | os | o65 | | Nn | 1026 | 0918 | 0810 | 079 | os7 | om | 130 | 108 | | n | 101 | 0963 | 0952 | 100 | o87 | om | 125 | os | | n | osos | 0826 | 0706 | os | os | om | 123 | os6 | | an | 1080 | 0868 | 0948 | 103 | o67 | ost | 109 | 10 | | an | osme | ora | 0810 | os | o68 | om | 107 | om | | an | 1167 | 0835 | 1102 | 105 | 065 | 088 | 132 | o67 | | o | osso | 0631 | os67 | om | o7m | 100 | o68 | om | | e [10 | os: | 1200 | os | om | 07º | os | os | | a | 1120 | 1045 [11 | 106 | 103 | 131 | 08 | 08 | | o | 1150 | 1108 | 1146 | 10 | 095 | om | 104 | 106 | | e | 1105 | 1052 | 1060 | 100 | 085 | 102 | og | om | | o | 1166 | 1065 | 1108 | oor | 088 | 106 | om | oss | | o | 1236 | os | 1127 | 100 | 07% | os | os | 11 | | a [118 | os [112 | 099 | o8 | 130 | 11 | 1% | [ a | 1161 | o704 | 1134 | 006 | 08 | 113 | 051 [| o76 |

TE testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | o f 1052 | 057% | 1068 | 002 | om | 095 | om | o7s | | e 102 | 0687 | 1004 | 090 | o7 | o87 | o76 | o62 | [| e | 1050 | 0615 | 0897 | o8s | 054 | 061 | os | o8 | | o | 114 | 0874 | 1059 | 080 | 082 | o8o | 120 | 124 | | a [1263 | 1012 | 1264 | 107 | 09 | 116 [an | 10) | | a | 1306 | 0831 | 1270 | 101 | o7 | 08 | 067 | o6 | | a | 1121 | 070 | 1060 | 104 | o75 | os | oe | 118 | | e | 115 | om | 1020 | 104 [ 087 | 127 | 088 | 106 | [| e | 1156 | 0760 | 113 | 086 | 08 | 118 | 08 | os | | e | os | osm | os | os | o7m% | 06 | 106 | os | | e | 1272 | 0805 | 1322 | oe | 065 | 040 | 008 | o70 | | e | os | o722 | 1026 | os5 | os6 | o5t | om | os6 | | e | 132 | 0085 | 1264 | 10 | 06 | 05 | 121 [| 080 |

' | e | 1217 | 0950 | 1058 | 110 | 07 | om | 1223 | 151 | [| e | 1169 | oses | 1035 | os | 063 | os6 | 101 | os | ! [| e | 1206 | ooo | 1122 | 110 | 055 | 066 | 11 | os |

| e | 1072 | o7ei | 0853 | 100 | 060 | o75 | 130 | 182 | | e [136 | 1106 | 1336 | os | 06 | 053 | 1m | 10 | | e | oses | 0526 | o8ws | oot | os3 | os | om | os | [| e | oss0 | 0438 | 0700 | 062 | 053 | os7 | 100 | os | | e | 0816 | o413 | 0640 | om | om | om | 109 | om | | e | 1004 | 0620 | 0916 | 102 | 06 | o5t | 105 | 121 | | e | 1005 | o653 | 0835 | 101 | 066 | 051 | 161 | 160 | | e 1021 | 0723 | 0987 | os | om | om | 119 | om | | e [107 | 0653 | 086 | 105 | 062 | om | 118 | 110 | | e [126 | om | 1134 | 11 | 050 | 094 | 121 | o7%6 | | e | os | osso | 0701 | os0 | os | 062 | om | o60 | | p | 0800 | 0506 | 0741 | 06 | om | o68 | 07 | os | | » | 100 | 1470 | 2104 | 080 | om | om | o | 112 | [| » | 1108 | 0008 | 1097 | oes | om | oo | 180 | o7s | | p | oem | 0709 | 0804 | oem | 068 | om | 176 | os7 | [| p | 0056 | 0663 | 0882 | oe5 | 068 | om | 160 | om | |» 1153 | 093 | oz | 10 | om | 100 | 166 | 114 | [| p | 103 | o750 | 0850 | 089 | o6 | 105 | 1823 | 112 | testadas ácido do | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O0 tipo sel- aquecido 3omin vagem | p | 1088 | 0813 | os6t | os | os | 105 | 122 | 113 | | » | os&i | ora | o150 | o89 | o64 | 100 | os | os6 | | D | 093 | os | osm | ot | os0 | 0% | 11 | o8 | | D | 20% | 15865 | 1413 | 082 | 0340 | 054 | 116 | o7 | | » 1100 | 1165 | 1104 | 080 | o8 | 09 | 115 [| 106 | | p | osos | 1020 | 0816 | 089 | 070 | 102 | 239 | 17 | | o | 1000 | 1002 | 0910 | 00 | o8s | om | 14 | 090 | | D | 1188 | 119 | 1067 | os | o81 | 103 | 152 | 009 | | p | 1226 | 119 | 113 | 10 | 090 | 11 | 1 | 129 | | p | 1300 | 1046 | 1131 | 086 | 064 | 085 | 142 | 119 | | p |1212 | 061 | 1066 | os | 042 | om | 132 | 120 | [| s ess | 0643 | 007 | os | 086 | os | os | o7 | | s | 082% | 0621 | 0852 | 10 | os | 069 | 139 | om |

| s | 10% | o8m | 1068 | 106 | os | 063 | 103 | 066 | | s | 096º | os06 | oes3 | os6 | 082 | 10 | 118 | am | - | s | 0980 | os5e | 1020 | 104 | 096 | 11 | 127 | 101) |

| s | os68 | 0753 | 0827 | os | 086 | 11 | 107 | 113 | | s [1100 | 0823 | 0867 | os89 | o1 | om | om | 10 | | s | o702 | 0566 | 0763 | os | 080 | 070 | o8s | o7s | | s | 6900 | o7m7 | 088 | 11 | 10 | o8 | 164 | 104 | | s | os | osst | osso | 10 | os | 067 [151 | os | | s | os | 1056 | 0964 | os6 | oo | 100 | om | 106 | | s | ose2 | osm | 0706 | 105 | 09 | om | 118 | 125 | | s | 1186 | 1068 | 1063 | 106 | 100 | 09 | om | 106 | | s | 1010 | 0005 | 0934 | 000 | 086 | om | 108 | o7 | | s 1186 | 101 | 0965 | 100 | om | 128 | 106 | o8 | | s | 1031 | oso5 | 0881 | 100 | om | 106 | 136 | o82 | | s | os21 | 0631 | 0789 | 096 | o8t | o75 | om | o8 | | s | os0s | 1010 | 100 | 106 | 112 | 07% | om | om | | s | osso | os65 | oem | 110 | 122 | 08 | 127 | om | | s | 1018 | 107 | 0940 | 107 | 116 | 124 | 097 | os | | s | 1062 | 1105 | 0860 | os | 11 | 107 | 130 | 10 | : [| s | 1046 | 0940 | 06870 | 085 | os | 080 | 145 | os |

Itestadas

EE PEA ácidodo | pH5,8 | pH5,8 pH4 de milho pH8 pH1O0 tipo sel- aquecido 30min vagem | s 1003 | 0820 | 10 [| 10 [om | 112 | 08 | om | | s | os | 0624 | 0812 | 08 | 081 | o75 | 088 | om | | s | osos | os36 | 0808 | os | 080 | o76 | 104 | os | | s | os67 | osos | os6t | os | 102 | 112 | om | om | | s | 1126 | 1097 | 1004 | 08 | 101 | 112 | 086 | os | | s | 1056 | 1051 | 0824 | 102 | 110 | 08 | 127 | 112 | [| s | 1066 | 1117 | 1014 | 102 | 106 | 106 | 146 | om | | s | 102 | 0960 | oo | 113 | 114 | 126 | 10 | 006 | | s | 1162 | 10223 | 1001 | 102 | o8r | 1223 | 1 | 113 | | s | 110 | 0868 | 1057 | 110 | o87 | o8t | 1563 | om | | xy | osoo | oser | o6m | 121 | 082 | os5 | 109 | oi | | x | oa | os00 | 0694 | 193 | 187 | 033 | 067 | o25 | | x | os32 | 0350 | 0655 | 079 | o75 | 020 | om | o20 | ' | xy | 1003 | os82 | 1107 | 082 | om | 1 | 100 | om | ' | x | osso | 0364 | 0512 | 061 | 053 | 063 | oo | 025 | | xy | oss2 | 0273 | 016 | 090 | 086 | os | 124 | o18 | | xy | 4619 | 4834 | 6620 | 000 | 000 | 000 | ooo | 000 | | y [oa | 0304 | 0305 | 083 | 06 | os35 | 096 | o26 | | y | o7 | os37 | 0863 | 087 | 00 | om | os | os0 | | xy | o206 | 0240 | 0318 | 119 | 10 | 029 | 088 | 006 | | xy | oo | 0352 | 0469 | 135 | 106 | om | 087 | o16 | | xy | os06 | 0313 | o186 | om | o6sr | 021 | 083 | om | | x | osoe | os45 | 0752 | 122 | 106 | 05 | 116 | 026 | | x | oso6 | os35 | 0654 | 111 | 09 | 057 | 08 | 020 | | x | osso | oss0 | 0757 | 082 | o6r | 07º | 089 | oo6 | | x | 1208 | o9m | 1168 | o6r | os0 | 112 | 102 | os | | a | 0936 | 0735 | 0933 | 09 | 080 | 080 | om | os: | | o [1237 | 1120 | 1466 | 090 | 081 | 057 | 069 | oa | | e | os! | 0898 | os | 100 | 080 | 06 | om | 100 | | e | 091 | os66 | os2t | 107 | om | om | o62 | om | | e | 1026 | 1053 | 1096 | 104 | 090 | 087 | om | 103 | | e | 1060 | 1102 | 1104 | 096 | os | os | 066 | oss | 1a | 1067 | 1058. | 1008 | os |. 10 | 126 | 109 | 109 | : [| e | 1056 | 1018 | 1090 | 10 | os | 112 | o75 | 113 |

(testadas

EEE ácido do | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | o | 1030 | 0720 | 1060 | 089 | o86 | 110 | 066 | o6 | | o | 1015 | 0753 | 1030 | 087 | o7o | oo | o67 | 068 | | o | 110 | 1082 | 1124 | 101 | 087 | 095 | 11 | 102 | | o [151 | 1802 | 2521 | 128 | 134 | 158 | 229 | 14 | | e | 1067 | 1250 | 1128 | 008 | 101 | 112 | 106 | 104 | | e | osra | 1013 | 0900 | os6 | 086 | 133 | om | o8 | | e | 1187 | 1159 | 1158 | 089 | 0890 | 111 | 068 | om | | a | 1170 | 1146 | 1200 | 107 | 098 | 134 | 082 | 116 | | o | 137% | 1266 | 142 | 107 | 104 | 149 | 0685 | 002 | | e | ost| os7m | 068 | 101 | 081 | 109 | 095 | os6 | | x | o7ws | osm | o6st | os | om | o | om | o8 | | x | 131 | 11238 | 1868 | 117 | o55 | 058 | 153 | 062 | | xy 0603 | -o68s | 1596 | 000 | 000 | 000 | ooo | o00 | i | x | 3863 | ss01 | sao | 081 | om | os | 156 | 232 | | x | os% | 0704 | 083 | 107 | o65 | os8 | 132 | 100 | | | x | -s430 | 5322 | e818 | 000 | ooo | oo | 000 | ooo | | x [1222 | 0863 | o7o7r | 105 | 050 | 078 [| 121 | o64 | | x | 1600 | 1067 | 1163 | 107 | 053 | 054 | 126 | 130 | | x [6 | sass | 7269 | 07 | 046 | om | 1864 | 16 | | x [1788 | 1268 | 1614 | 090 | 057 | os5 | 100 | om | | x | o760 | 0491 | 0686 | 103 | 057 | os2 | 115 | os | | xy [0896 | -osss | 1487 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | | xy | 637% | sem | em | 09 | om | om | om | 146 | | xy |-1060 | 1188 | 2272 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | x | 4263 | 3876 | 521 | 146 [| 08 | 18) [14 | 138 | | xy J om | o166 | 037% | ot | om | 01 | 065 | om | | xy | 316 | 271 | 2098 | 080 | 051 | 050 | 165 | 151 | | x | oswo | o684 | 06839 | 115 | 070 | 065 | 176 | om | | e | 0635 | 076 | 1566 | 000 | ooo | 000 | ooo | ooo | | e | -os04 | 0407 | 1087 | 000 | ooo | ooo | 000 | ooo | | e |-0394 | 0490 | 0002 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | e |-0347 | 0437 | 0001 | 000 | ooo | 000 | 000 | ooo | | e | -0s28 | 0420 | 0875 | 000 | ooo | 000 | ooo | ooo | | e | -0s12 | 0302 | 0622 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | [ e [-0208 | 0387 | 077 | oo | oo | ooo | 000 | ooo | testadas ácidodo | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30omin vagem | e | 056 | 0720 | 1435 | 000 | 000 | 000 | ooo | 000 | | e | 0303 | 047 | 1012 | 000 | oo | ooo | ooo | ooo | | e | 0905 | 1160 | 248 | 000 | 000 | 000 | ooo | ooo | | e | 0513 | 0633 | 127 | 000 | oo | ow | 000 | ooo | | e [-03872 | 0465 | 0970 | 000 | ooo | 000 | ooo | ooo | | e |[-os27 | 0410 | 0832 | 000 | 000 | 000 | ooo | ooo | | e | 032 | 0403 | 0817] 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e | 0454 | 06526 | 1020 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | | e | 0408 | -o556 | 1148 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e | 0316 | 0381 | 0709 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | | e 0312 | 0342 | 0760 | 000 | ooo | 000 | ooo | ooo | | 1 | osme | 0626 | os | no | no | no | no | no | | t+ | osm | 076 | ossa | 100 | om | om | os7 | o6s2 | ' | + | 107 | o68s | 1058 | 100 | oo | os | o8s | om | | t+ | 1486 | 1263 | 1519 | 101 | 080 | 10º | 067 | ost | i | 7 | osst | or: | os2t | 102 | os | os | o62 | 058 | | 7 [1048 | 0906 | 1133 | 08 | os | om | o67 | om | | t+ | oser | ori | 107 | os | 060 | os6e | 033 | 04 | | + | osw6 | 0656 | os! | om | oe | 07 | om | o6s | | + | os | oo | oss2 | 106 | oo | 116 | 062 | 06 | [x | 108 | 1007 | 1058 | 104 | 101 | 104 | 063 | 063 | | 1 [os | os20 | 0885 | os | ow | 121 | 126 | os5 | | 17 | oem | osm | os | os | oo | 110 | 057 | 046 | | t+ 106 | 1008 | 1113 | 101 | 100 | 068 | 088 | 03 | | t+ [106 | 081 | osma | 107 | 100 | 106 | 109 | 089 | | a | 082 | 0650 | os | 104 | 00 | 086 | om | 109 | | a | 0508 | 067 | 1358 | o7 | o6r | 060 | 150 | 20 | | a | 107% | 108 | 1084 | 10 | 100 | 008 | om | 143 | | o | 0627 | 0061 | ost7 | 100 | 102 | os8o | o8s | 11 | | o | ore | 0853 | om | 102 | 101 | 07 | 09 | 106 | | a | 0923 | 095 | 0052 | 102 | 105 | o8s | 000 | 116 | | a | 1006 | 1050 | 1034 | 084 | os | os | 100 | 103 | | a | os00 | 0026 | 0007 | 100 | 105 | oso | om | 121 | : | a | 09x | 0826 | 0826 | 105 | os | or | 136 | 117 | : | a | 09% | 0745 | 0089 | 08 [ 08 | om | om | 11 | testadas ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | 1056 | o7ei | 1035 | 000 | 000 | ooo | no | om | | e | oso1 | oss4 | 0915 | os | ooo | 07 | nos | om | | e | os3 | 0906 | 0885 | 109 | 114 | 119 [118 | 143 | | a | 0902 | os80 | oem | 103 | 108 | om | 139 | 143 | | a | 12 | no | 1 | 16 | 128 | 099 | 104 | 136 | | a | 1020 | 1017 | 1018 | 113 | 113 | 104 | 116 | 107 | | a | os50 | 0848 | 0940 | 102 | 101 | 088 | o8 | 107 | | a | 114 | 1004 | 1100 | 102 | 08 | 108 | 105 | 130 | | a | osme | ora | oem | 105 | 100 | 114 | 106 | 126 | | a | -1015 | -1033 | 1440 | 000 | 000 | 000 | ooo | om | | a | os03 | oss8 | 08068 | 104 | 107 | o8s | os8 | 115 | | a | os | 1051 | 0968 | 103 | 114 | 118 | 00 | 126 | | a | os | oom | oo | 117 | 137 [| 147 | 118 | 126 | ó | a | osm | os | oem | 129 | 136 | 146 | 14 | 173 | | a | 0961 | 0665 | oom | 10 | or | oo | 104 | 110 | | a | osos | ora | oem | 10 | om | 080 | 086 | os | | a | os | om | oem | 105 | 100 | 086 | o8s | os6 | | a |-o586 | 0640 | 1280 | 000 | 000 | 000 | 000 | oo | | a [1167 | 112 | 1190 | 10 | 115 | 106 | 101 | 130 | | a | 1010 | 0956 | 1006 | 137 | 156 | 121 | 128 [| 134 | | a | 1000 | 0858 | 080 | 112 | 118 | 104 | 126 | 107 | | e | 091 | 056 | 0906 | 085 | os8 | 103 | 08% | o8 | | e | 2286 | 1887 | 2813 | 104 | 02 | 180 | 104 | on | | e | osms | 0703 | osso | os | os | 116 | 126 | o8 | | e | 197 | 1715 | 2160 | os5 | om | 136 | 114 | os | [| e | os02 | om | os | 103 | osm2 | 148 | 105 | 105 | | e | 106 | 090 | 1062 | 102 | os | 120 | 105 | 096 | | e | 4380 | 3830 | 5304 | 102 | 098 | 084 | 040 | 145 | | e | 122 | 1055 | 1221 | 08 | 082 | 009 | 116 | o7% | “ole des [11119 [1592 [ 080 | o42 | 072 | om | 11 | [ e | 10186 | 0836 | 1161 | 08 | o60 | 084 | 080 | o72 | testadas

EPE ES ácidodo | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | 1003 | os60 | 107 | os | os3 | 080 | 082 | o8 | | e | 102 | 1032 | 1001 | 089 | 089 | 136 | 136 | 100 | | e | 1051 | 1om | 1057 | 102 | 106 | 127 | 104 | 092 | | e | oses | oso%6 | 0088 | 106 | 108 | 150 | 098 | 11 | | e | 1196 | 1166 | 1216 | 105 | 101 | 136 | 107 | 113 | | e | 1568 | 1568 | 1834 | 115 | 106 | 097 | o8s | 122 | | e | 2751 | 2406 | 2007 | 103 | 090 | 09 | 122 | 032 | | e | 1126 | 0869 | 1178 | 009 | 09 | 107 | 082 | 110 | | e | osos | 0695 | 0914 | 09 | o81 | o68 | 00: | 095 | | e | 1767 | 1738 | 246 | 140 | 139 | 068 | 237 | 180 | | e | osm | osme | nos | 100 | 087 | 086 | om | 100 | | e | os65 | os0s | os | 103 | 102 | ot | o8s | 105 | | e | 1008 | 1056 | 10323 | 115 [11 [17 [127 | 14 | | e | 1000 | 0733 | 1006 | 106 | 106 | 096 | 106 | 103 | | e | os8e | os2r | osmo | osm0 | o8r | o8s | 105 | 110 | ' | e | osse | 0646 | 0084 | 102 | 096 | o8 | om | 117 | | e | osma | 0746 | 0080 | 087 | om | 081 | om | om | | e | os46 | 0732 | os51 | 08 | 087 | 089 | 112 | 101) | | e | os42 | 0870 | 0020 | 110 | 106 | 136 | 116 | 107 | | e | oss5 | 1000 | 1011 | 118 | 120 | 1561 | 102 | 146 | | e | os5 | oss7 | 0808 | 105 | 105 | 114 | 116 | 14 | | e | os | nom | oem | 101 | 106 | 087 | 088 | 154 | | e | os | oso5 | 0054 | 105 | 106 | 119 | 116 | 11 | | e | oss2 | 1000 | oem | 100 | 1% | 117 [12 | 10 | | e | os2i | 0823 | 005 | 110 | 110 | 122 | 104 | 110 | | e |111 | 101 | 1127 | 106 | 09 | 145 | 126 [| 133 | | e | 1027 | 0763 | 1015 | 100 | o8t | 087 | 106 | 102 | | xy | ass6 | 4189 | esor | 1523 | 138 | 1486 | 134 | 059 | | xy | 147% | 1105 | 1260 | 1041 | 106 | o86 | om | 123 | | xy | 1061 | os7s | 1056 | om | 101 | o87m | 08 | om | | x | 1046 | 0960 | 1038 | 105 | 11 | 080 | o8r | 110 | | x | 1306 | 1323 | 1468 | 098 | 106 | 088 | om0 | om | | x | osso | oss2 | oso5s | 105 | 116 | 118 | o82 | 121 | | x | 1168 | 1010. | 1206 | 146 | 165 | 136 | 136 | 18 | : [ x 1 os: | ore | 1017 | 105 [| 103 | 115 | 100 | 1x0 |

(testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | xy | os82 | 0603 | 002 | os | os | om | 109 | 109 | | x» | osmre | 0455 | 0730 | 112 | 082 | 066 | 104 | om | | x | o768 | 0544 | o7or | 132 | 112 | 118 | 147 | 133 | | x |-osms | 0887 | 1716 | 000 | 000 | oo | 000 | oo | | x | oss4 | o7ws | oss6 | 101 | os | os | 087 | om | Lx [1 [no | 1 | 10 [101 [11 | 086 | 122 | | x 1160 | os882 | 1146 | 080 | 096 | 106 | oo | 1m [| xy | ossos | o7eo | 1090 | 107 | 104 | 110 | os | 107 | | x | 107 | 6729 | 1066 | 107 | 107 | oe | 103 | 147 | | xy 1063 | 0728 | 1040 | 11 | 106 [| 1% | 107 [| 106 | | e [121 | 1240 [127 | 103 | os | o6ss | om | 103 | [| e | osse | 1035 | 1454 | 096 | 098 | 025 | o46 | 026 | | e | osw | oo | os | 10 | 106 | 10 | oe | 14 | | e | 1190 | 13290 | 1328 | 046 | 110 | 086 | 086 | 141 | | e | o706 | 091 | 1053 | 108 | 10 | on | oa | os9 | : [| e | osso | 0957 | 096 | 106 | 105 | 002 | 080 | 116 | | e | -osos | 0666 [1152] no | no | no | no | no | | e | os | 083 | 0920 | 106 | os | os | oe | 136 | | e | 2966 | 2530 | 387 | 101 | 088 | 010 | 120 | 032 | | e [1151 | o9m | 1254 | 103 | 094 | o6s8 | o68 | 109 | | e | oss2 | 0862 | os | 11 | 112 | 008 | 07% | 105 | | e | 3468 | sem | 47233 | 103 | 10º | 084 | 005 | 202 | | e | os | no | 101 | om | 104 | o8s | 088 | 136 | | e | osm | oow | osme | om | 101 | om | os | 100 | | e | oss | 1101 | 1040 | 118 | 116 | om | 098 | 104 | | e | 116 | 1163 | 1220 | 110 | 116 | 050 | 080 | 100 | | e | sao | 8256 | 12470] 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | 6 | 237 | 2257 | 32238 | 160 | 15º | 005 | 080 | 226 | | e | 1052 | osm | 1166 | 110 | om | om | om | o | | D 1463 | 0800 | 1727 | 104 | 028 | 01 | 194 | om | | D [137 | 0863 | 13% | 118 | o66 | oa | 110 | 065 | | D | 1052 | 0889 | 1042 | om | om | os | os | oe | | » | os | om [os | 121 | 06 | oso | 126 | 101 |

1.p | 0240 | 0269 | 0568 | 000 | oc | ooo | ooo | om [ » | 1452 | 1096 [ 117 | 085 | os6 | 066 [| 17 | o6& | testadas ácido do | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | » | -5328 | 4324 | 7oio | 150 | 06 | ou | 197 [| 123 | | p | -os6 | o8s1 | 1762 | 151 | 029 | 066 | 258 | o7 | | p | -osso| 076 | 1614] 118 | 032 | os | 1523 | 052 | | p |-105331]| -sos32 |-147260] 089 | 023 | 008 | 164 | o21 | | » | 113 | os | 10% | 115 | 043 | 062 | 146 | o75 | | p» | 0208 | 0316 | 0701 | oc | 000 | om | 000 | ooo | | » | 1416 | 0810 | 1400 | 105 | 036 | os5 | 151 | o7% | | p | -0308 | -osto | -06ot | 190 | 026 | om | 258 | 122 | |» | 1861 | 1020 | 1940 | 109 | 040 | 038 | 151 | ou | | p | 3223 | 1850 | 3230 | 107 | 038 | 050 | 121 | 040 | | » | 207 | 1000 | 227 | 116 | 048 | 045 | 122 [| os5 | | Pp | 207 | 1300 | 2068 | 078 | os | 09 | 149 | 10 |

: | D | 1002 | 1363 | 1734 | 080 | 040 | 069 | 152 | 08 | | > | 1061 | 0656 | 1066 | 103 [ ost | 080 | 125 | os3 | | | > | 1104 | 0766 | 1056 | 124 | 052 | 060 | 130 | 216 |

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| 000 | 000 | no | ooo | [an | osso | 0164 | 091 | 100 | 002 | 000 | 062 | oa | | n [1427 | 0400 | 1364 | 102 | 002 | 009 | 088 | os3 | | n [1528 | 0369 | 1898 | 100 | 001 | 008 | o8s | o7 | [| n Í 16233 | 1026 | 2768 | 000 | 000 | oo | ooo | ooo | [x 1051 | 0508 | 1611 | 100 | 004 | 04 | 19 | 133 | [| pn | 104 | 0657 | 1637 | 110 | 006 | 08 | 151 | 212 | | n [14153] 5470 | 17265] 166 | 001 | ot | 1465 | 046 | | n [1061 | 0224 | 0784 | 141 | 001 | 008 | 145 | 0652 | | nº [0576 | 0468 | 1161 | 000 | 000 | 000 | ooo | 000 | | n [1676 | 101 | 2690 | 103 | 004 | 086 | 036 | o7 | | n [47 | 1522 | 4678 | 128 | 002 | 001 | 137 | 06 | a | 14to | 0400 | 100 | 146 | 001 | 000 | 197 | oro | [| n | 1486 | 06512 | 14323 | 127 | 003 | 020 | 146 | o7 | | n | 1205 | 0362 | 00238 | 173 | 001 | 002 | 153 | 050 | o | n 10387 | 3709 | 12600 | 160 | 001 | oo | 160 | o15 | | n 0352 | 0206 | 0735 | 000 | 000 | om | oco | ooo | | n [1602 | -o7 | 2315] 125 | 002 | 056 | 06 | om | | 1 | oss2 | o274 | 0621 | 087 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testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | 1 | 107% | 0413 | 1031 | oor | 022 | 024 | 09 | o7% | | a | oem | 0536 | ore | 116 | o7m | o7% | 106 | 086 | | a | os | 0653 | 0024 | 125 | 07 | 053 | 052 | 030 | | e | os36 | 015 | os65 | 141 | 005 | ot | 114 | ox | | o | 1070 | 0824 | 12867 | 1523 | 09 | 04 | 108 | 042 | | o | oes9 | 0400 | 0720 | 125 | 012 | 023 | 088 | os3 | | o | oss2 | 1008 | 0665 | 124 | 124 | 095 | 174 | 147 | | o | 1376 | 1261 | 0906 | o | om [| 122 | 108 | 162 | | a | 1213 | 1109 | 14046 | oo | 131 | 166 | 17 [| 147 | | e | ore | 0300 | 0556 | 143 | 042 | 04 | 115 | om | | a | osor | 1066 | 1062 | 115 [ 1% | 203 | 086 | o60 | | a | 1100 | 1163 | 0613 | 088 | 102 | 100 | 080 | os | | e | osss | 0702 | 06586 | 136 | 050 | or | 115 | 050 | | o | 081 | os50 | nes | 104 | om | 055 | 112 | o6s | | e | 1166 | 1066 | 1560 | os | 088 | 103 | om | om | -) | o | 1622 | 1361 | 0920 | 130 [| 155 | 087 | 052 | 020 | | a | 1166 | 0460 | 1266 | 121 [| 055 | 081 | 122 | 042 | [— To230 | 260 | 0530 | 000 | 000 | 000 [om | om | | + | ess | 0265 | 0767 | ooo | om | 000 | 000 | ow | | 1 | 0740 | 0768 | 1726 | 000 | 000 | 000 | ow | 000 | [Er ozs1 [706 | 1520 | 000 | mo [000 | 000 | 000 | | 1 7054 | 2577 | 8440 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | 1 0266 | 0307 | 0662 | 000 | 00 | ooo | 000 | 000 | | 1 0346 | 0373 | 0848 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000 | | 1 | 0567 | -osss | nes | 000 | om | 000 | 000 | 000 | | + 130 | 047 | 1640 | 06 | 004 | 023 | 073 | oo | | 1 1023 | oser | 1818 | 128 | 001 | 005 | 052 | oo | | + 1102 | 116 | 275 | 000 | 000 | 000 | om | ooo | | 1 0467 | 0465 | 1064 | 000 | 000 | 000 | om | ooo | | 1 | 0462 | 0468 | 1074 | 000 | 000 | om | 000 | ow | | 1 | 0352 | 0454 | 0045 | 000 | 000 | 000 | 000 | ow | | 1 esta | 0302 | 0027 | 000 | 000 | 000 | 000 | om | | 1 19167 | 10107 | 26506] 000 | 000 | om | 000 | ooo | | + | oz | 0264 | 0800 | 109 | 001 | oor | 06º | 028 | : [Cr nom | osse | 11662 | 000 | 000 | 000 | om [om | testadas ácido do | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | 1 | 2122 | 1804 | 7266 | 000 | 000 | oo | ooo | ooo | | s | 09% | 0752 | 0085 | o87 | o86 | nos | 088 | om | | s | os& | os66 | 0765 | o88 | 099 | o82 | ose | om | | s | osee | 1057 | o8r | 110 | 121 | 094 | 105 | 087 | | s [om | os%6 | 080 | om | o62 | o6s6 | 121 | 068 | | s | 1004 | 0869 | 0824 | 125 | 125 | 072 | 09 | 143 | | s | 1227 | 1020 | 092 | 104 | 091 | 100 | 101 | 126 | | s | 1196 | 1081 | 1063 | 130 | 166 | 120 | 09 | os | | s | os | om | os: | 086 | o8m | om | 100 | om | | s | 113 | 109 | 1128 | 089 | oe6 | 100 | 082 | om | | s | 2253 | 1562 | 4008 | 000 | oo | ooo | ooo | ooo | | s | 1062 | 1061 | 1080 | 106 | 118 | om | 080 | 0653 | - | s | 1056 | ogrt | 0720 | 107 | om | 0684 | 08 | 101 | | s | 1002 | 101 | 103 | 110 | 107 [ 096 | os | om | P | s | 1246 | 0708 | 119 | 120 | 040 | 044 | 009 | 0094 | í | s | 1354 | 0968 | 1119 | 10 | o83 | 086 | o8s | om | | p | 15% | os66 | 1875 | 082 | 004 | 000 | 06 | oo. | | p | os | or | osso | os | o67 | om | 068 | o6 | | p | 1026 | 013 | 1064 | os | oot | oos | 105 | os | | p | 335 | 1430 | 4769 | 094 | 005 | 055 | 005 | om | | p | -o685 | 0569 | 1300 | 000 | 000 | ooo | mo | ooo | | p | 1202 | 0239 | 1226 | 00 | 00 | o1 | 102 | 006 | | e | 101 | 0262 | 0831 | os | 005 | 029 | oo | 090 | | p [136524 | 6920 | 20403] 051 | 005 | 0268 | on | 257 | | D | -o71 | 0337 | 1017] 100 | o07 | oi | 121 | 002 | | e | 13090 | osss | 1724 | 003 | 004 | 003 | 8 | 002 | |» | osos | 0189 | osso | 080 | 004 | 022 | 11 | oe | | p | -0400 | 0513 | 1220 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | | D | 242 | 0743 | 3050 | om | oo | 01 [| 105 | ox | | p | 3202 | 1813 | 4769 | 000 | 000 | 000 | oo | 000 | | p | 1004 | 0376 | 0031 | oo | 00º | 023 | 122 | 002 | |» [0635 | 0360 [1038 | 000 | 000 | om | om [om : | p [24542 | 11167] 3627] 096 | 008 | 014 | 020 | 006 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | D | 1268 | 0205 | 1268 | 103 | 003 | om | 122 | oa | | p | 3097 | 1365 | 4428 | 087 | 008 | 004 | 132 | 01 | | w | os26 | 0274 | 0636 | 078 | 005 | ot | o8s | os | [| w | 2082 | 1731 [237 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | [ w | 1066 | os1 | 111 | 088 | 006 | 026 | os8e | os | | w | 1161 | 0920 | 1204 | 096 | 043 | 040 | 008 | o87 | | w [13508 | 5347 | 15714 | 089 | 003 | 001 | 149 | 197 | | w | 3667 | 1910 | 4420 | 182 | 004 | os | 263 | 27 | | w |-os83 | -o7so | 1541 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000 | | w | 1202 | 0207 | 1275 | 088 | 002 | 021 | 009 | os | | w | os | o150 | 0850 | om | o02 | o21 | o87 | o8 | | w | 1602 | osse | 1805 | o84 | 001 | nos | om | om | : | w [3110 | 2748 | 3949 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000 | | | w | 1016 | 0464 | 1076 | 0688 | 007 | ow [| 110 | 10 | [| w |-2099| 7142 | 23985] 110 | 002 | o12 | 151 | 179 | . | w [0856 | -os00 | 1411 | 132 | 002 | 028 | 002 | 122 | | w | -o7%s | -o4ra [1207] 180 | 025 | 043 | 14 | 275 | [| w | 1055 | os82 | 1112 | 086 | 040 | 046 | 08 | 124 | | + [06% [101 | 2227 | 00 | 000 | ooo | ooo | ooo | [| 1 0236 | 0306 | 0223 | o76 | 123 | 021 | o18 | 003 | | 1 | oser| om | os6s | 149 | 252 | 197 | 122 | 029 | | 1 josn | 0369 | 0220 | 246 | 369 | 0653 | 042 | 026 | | 1 | o165 | 0206 | 0189 | 157 | 243 | 07 | 080 | 06 | | 1 | oso4 | 0303 | 0428 | 194 | 023 | on | 169 | 020 | | 1 | 0366 | os22 | os | 142 | 228 | 031 | 06 | 029 | | 1 | osor | os | 0497 | 060 | 082 | os8 | 126 | 021 | | + | 0387 | 0508 | 1067 | oco | ooo | ooo | no | ooo | | 1 | o4e7 | o456 | 0456 | 256 | 301 | 037 | 0606 | 022 | | 1 | oars | os40 | 0269 | 204 | 203 | 046 | 020 | o12 | | 1 | om | om | oo | 176 | 033 | 015 | om | om | | 1 [0650 | -0683 | 1629 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | | + |.0813 | os67 | 0526 | 116 | 187 | 174 | 07 | 004 | ão testadas ácidodo | pH5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | osso | 0200 | 077 | 106 | 007 | o28 | os3 | o2 | | e | osos | osor | o452 | 131 | 023 | 021 | 005 | 026 | | e | os68 | 0250 | 02463 | 163 | 008 | o1 | 008 | om | | e | 1886 | os1 | 0565 | 122 | 003 | om | 019 | oss | | e |-os | 0422 | 0935 | 000 | 000 | ooo | ooo | o00 | | e | osst | 045 | 0890 | 124 | 005 | 022 | 010 | o7s | | e | os67 | om | o408 | 110 | 007 | ou | oo | oo: | | e | os | om | oa | 117 | oor | o2r | os | 00 | | e |-o7ss | oem | 2168 | 000 | oo | ooo | ooo | ooo | | e | o7s6 | 0246 | 0562 | 112 | ou | 025 | ow | oo | | e | ore | 0205 | 0453 | 102 | ow | 022 | om | 02 | — e | os | 0822 | 0703 | 11º | ot | o36 | 03 | oo | : | e |-om7ms | oem | sem | oo | om | 000 | 000 | ooo | | e [53128] -34205]| 79204] 157 | 001 | o24 | 088 | om | Fm | 1 | osso | os61 | oem | ost | om | om | 100 | os | | 1 | 1062 | os06 | 1057 | o8s | 101 | om | om | o66 | | 7 | oem | oss3 | oes0 | net | ass | om | os8 | om | | rt | now | 109 | 1041 | os | 103 | o83 | 066 | 126 | | 1 | os | osos | osss | os | om | om | 102 | 125 | | 1 | osso | oe2s | os62 | os8 | om | 118 | om | 115 | | 1 | 17108 | 1010 | 1057 | os88 | omo0 | 118 | om | 116 | | 1 | 1042 | 0892 | oem | os | og | 126 | 068 | 118 | | 1 | osss | o7os | 1006 | oss | om | 181 | 115 | 1124 | | 1 | 1033 | 0740 | 1006 | 088 | o66 | 101 | oes | 100 | | 1 | 0823 | osert | om | oer | om | om | 112 | 107 | | 1 | oss2 | osm | os | 087 | om | om | om | 123 | | 1 | os61 | 0683 | 0918 | 082 | o78 | o65 | o7 | o868 | | 7 | osst| ossi | 00% | oem | o82 | ose | om | 132 | | 1 | 106 | os27 | 1072 | os9 | 089 | 096 | 06º | 109 | | 1 | 1182 | oem | 1119 | 086 | o88 | 115 | 089 | 150 | | 1 | 1050 | 1065 | 1020 | os6 | 080 | 127 | oos | 112 | | 1 | 1200 | 0865 | 1138 | 086 | 048 | 128 | 080 | 096 | - [| e | oss6 | om | oes2 | os2 | o7m | o7m | om | o81 | testadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | oso5 | 0524 | 1016 | 09 | 094 | 103 | 053 | o84 | | o | osm | os62 | os | os | os5 | o67 | os | o66 | | o | os | osms | os | om | 102 | o86 | 115 | 095 | | o | os | 0681 | 0846 | 105 | 102 | o8s | 122 | 112 | | o | os85 | 0863 | os05 | 103 | o85 | 089 | oos | 100 | | o | osm | os2s | 0928 | 105 | 090 | 143 | 120 | 105 | | o | os0 | 089 | 096 | 097 | 101 | om | o8s | 107 | | e | 1008 | 06873 | 0981 | os | os | o80 | 139 | o7 | | e | 1050 | 0623 | 1034 | o84 | o86 | 080 | 087 | o86 | | e | ogro | o7m | oss7 | os5 | os | 106 | 087 | os | | o | oss5 | osos | os21 | om | os | 135 | om | os | | o | oa | os87 | 0669 | ot | ow | 037 | om | om | | o | 1261 | 131 | 1164 | 106 [| 116 | 125 | 189 | 15 | * 1 e | ess | osor | 080 | 108 | 080 | os6 | os | or | | | o | 111 | 1105 | 110 | 096 | 096 | 115 | 081 | os | ' | o | 122% | 1207 | 127 | 10 | 100 | 139 | 100 | 086 | | | e | 10% | 091 | 1031 | om | 081 | 106 | 100 | o66 | | oe | 118 | 087 | 1158 | 09 | 06 | 101 | 056 | o6 | | s | osso | 0576 | 0950 | 106 | om | 127 | 103 | 120 | | s | os | o6ts | 0843 | os | os | oes | 080 | os6 | | s | osss | o8ws | osm0 | os | os | os5 | 069 | o8 | | s | 10 | 086 | 1037 | os | o8t | os | o8s | 127 | | s | osm% | 076 | 0908 | 110 | 08 | 136 | os | 118 | | s | os | om: | os | os | o70 | 101 | o8 | o7 | | s | os | om | 0083 | 10 | os | 11 | 08 | om | | s | oem | ore | 0850 | 105 | 087 | os | os | 106 | | s |183783]|105651 198778] 091 | om | o66 | o7 | oo | | s | oem | 06885 | os | 101 | oss | omo | ooe | 121 | | s | osso | oss1 | osso | os | os | 106 | 119 | 16 | | s | ogu | osos | og | 102 | os | oso | os | om | Ls | 1om | os8t | 1040 | 106 | oo | os | 086 | o1 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | R | os6e | o751 | oses | om | 083 | 106 | o7%6 | os6 | | R | oso6 | os2t | 1026 | 097 | 096 | 103 | 048 | 089 | | Rr | osos | nose | no | 008 | 101 | 137 | om | oe | | Rr | osso | nessa | oser | 107 | 108 | 150 | 07 | 068 | | Rr | oem | 101 | 0900 | 008 | 105 | o78 | oe | o7 | | Rr | 112 | 1222 | 11657 | 108 | 118 | 115 | 080 | 06 | | Rr |] ossz | now | no62 | 102 | 106 | 185 | 105 | 106 | | R | 1202 | 1173 | 1246 | 107 | 102 | 080 | om | om | | R | 11me | os65 | 111 | 102 | 08 | 136 | 1523 | 142 | | R | 107% | oem | 1127 | 102 | 08 | 096 | o7m5 | o66 | | R | 100 | 0769 | 1050 | 008 | 080 | 09 | 06 | om | | Rr | os26 | os54 | 0827 | os | 097 | o80 | om | 109 |

: | Rr | -o438 | 0505 | 6955 | 000 | 000 | 000 | 000 | oo | | R | 1114 | 1006 | 1097 | oo7 | os | om | 07º | os | | R | 1086 | 107 | 1067 | 116 | 124 | 130 | 086 | o7s |

| R | 1050 | 1048 | 1056 | 106 | 106 | 155 | 087 | ost | | Rr | 100 | 102 | 1124 | 112 | 10 | 160 | 062 | o7 | | R | 1206 | 1069 | 1202 | 105 | os | 104 | o7m | o63 | | R | osw6 | om | oess | 105 | 101 | o88 | 106 | om | | eo | 1048 | 0737 | 1050 | 08 | os | 067 | oo | om | | e | 1017 | o8m | 1020 | 08 | 095 | 101 | oo | o75 | | e | 1000 | 0808 | 1026 | 000 | om | om | 131 | o86 | | e | 094 | 0802 | 0086 | 100 | 107 | om | 11 | os | | e | 1017 | 1001 | 1001 | 101 | 105 | 080 | 13 | 11 | | em | 1058 | 1o12 | 1038 | 102 | 105 | ow | 156 | 116 | | eo | 1192 | 1103 | 1000 | 100 | 10 | 085 | 1323 | 106 | | eD | 1112 | 1038 | 1072 | 096 | 102 | 095 | 109 | os6 | | e | 1146 | 0968 | 1081 | 106 | os8 | o9r | 202 | 11 | | e | 1056 | oees | 1028 | 008 | 100 | 096 | 08 | os | | e | 1056 | o7 | 1047 | 080 | o86 | 06 | 127 | 082 | | e | 1215 | 1470 | 2002 | 000 | 000 | ooo | om | oo | | e | osri | o757 | 0860 | oer | os | om | 124 | om | | eo |. 092 | 0755. | 0966 | os | os88 | os | 221 | 170 | : [ eo | 1078 | os60 | 1036 | 100 | or | o6s | 110 | o96 |

| testadas so e 5 |" PESTE ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | eo | oss6 | o7es | osor | 103 | 100 | 105 | 140 | 106 | | e | 1101 | o87 | 10422 | 089 | 080 | os | oo | os | | e | 1140 | 0881 | 1126 | 107 | 102 | 137 | 165 | 115 | | e | 1063 | 0637 | 1026 | 109 | 105 | 135 | 157 | 106 | [| 1 | o73o | 0454 | 0840 | 107 | om | o88 | 116 | 08 | [| + | os61 | 0506 | 0853 | 102 | o68 | om | os | 149 | | 1 | os8 | no | os | 08 | o6 | o8s | os6 | 125 | | e |167 | 13227 | 1562! | 006 | om | 106 | 200 | 236 | | 1 | 107 | 1001 | 1138 | 101 | 083 | 100 | 114 | 04 | | 1 | 1340 | 1100 | 1367 | 102 | o81 | om | 112 | o8 | — e Jos | nm | om] 10 [os | os | 12 | om | . [| e | 1040 | 0718 | 1004 | 080 | om | os | 116 | 102 | | 1 | 1664 | 1467 | 2010 | 103 | o82 | oo: | o6s | 116 | a | + |[-o646 | -o78o | 1700 | 000 | ooo | oo | ooo | ooo | | + | 1383 | 1260 | 14606 | 101 | 08 | oot | 128 | 116 | [| 1 [200 | 1952 | 2148 | 104 | 086 | 116 | 126 | 139 | | 1 | 107 | os2't | 1228 | 104 | 081 | 08 | os | 100 | | 1 [os | no | 08 | 104 | 086 | 107 | 11 | 107 | | 1 [1707 | 1418 | 1626 | 127 | 10 | 166 | om | 126 | | 1 | 1053 | ora | 1108 | 116 | 088 | oe | 17 | 116 | | 0 | 1005 | oras | 1085 | 101 | ost | 08 | 110 | oe | | nº | osm | os50 | 088! | om | os | om | os | os | | an | os | o76 | 087 | os | om | om | os | oos | | n [1121 | 1176 | 1106 | oor | 06 | om | 11 | os | | n os2s | 0996 | 0048 | 115 | 100 | 122 | 117 | oe | | qn | os | 088 | 0807 | os | os | oor | os | os | | n | 1031 | 1056 | 1008 | 100 | os | 086 | 100 | om | [| x | os63 | o668 | 0988 | 096 | 08 | os | 105 | 000 | | x» | oem | 0707 | nes | 101 | 06 | 106 | os | om | | qn | 0340 | 0000 | 2176 | 086 | o86 | 088 | 08 | 066 | [x | 1052 | 1124 | 1010 | 101 | 101 | 086 | 100 | os | testadas Eee TETE ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | n | os | 1000 | 091 | 100 | 104 | 073 | 129 | ooo | | qn | os | 106 | 0961 | 109 | 106 | 128 | oos | 105 | | qn | ogms | 101 | 1015 | 060 | oo | 08 | 106 | 06 | [| n | os67 | 0685 | os | 104 | 101 | 087 | 154 | 109 | | x | 1003 | 0802 | 0800 | 101 | 008 | os | 137 | 151 | | n | 0998 | 0746 | 1012 | 098 | 067 | om | om | om | | P | osss | 0389 | 1166 | 119 | 008 | o16 | os | 060 | | P | 1872 | 082 | 2100 | 086 | 010 | 015 | 022 | o6si | | P | 159 | ogm | 1721 | 100 | 021 | ote | 136 | 027 | | P | 1361 | 0920 | 146 | 087 | o27 | 039 | 069 | 064 | | P | 2605 | 1828 | 4424 | 129 | 005 | 024 | 078 | 066 | | P [6175] 3861 10301] 106 | 008 | 017 | 178 | 073 | | P | 2sm |] 165 | 332 | 103 | 018 | 000 | ox | ou | “o LP | 6ow | 3862 | e233 | 118 | 008 | 008 | 136 | 020 | | | P [172 | 1284 | 3070 | 109 | 006 | cor | 158 | 072 | | P | s500 | 2218 | 4038 | 110 | 006 | 026 | 129 | 07 | | | P | 17600 | 127 | 2854 | 106 | 008 | 021 | 085 | o4 | | P |-294r | 16478 | 43257] 1323 | 000 | 002 | 082 | 11 | | P | 1068 | 1303 | 2468 | 107 | 01 | om | o7s | os | | P | -o76 | 06 | 1568 | 000 | 000 | ooo | oco | ooo | | P [am | 17 | 3622 | 128 | 006 | 026 | 136 | 06 | | P [43161 | 18481 | 6515965] 121 | 033 | 030 | 117 | 026 | | P [73% | 1032 [10022] 131 | 013 | ot | 129 | 008 | | P | 4069 | 26863 | 6366 | 147 | 010 | 006 | 142 | 036 | | P | 206 | 1704 | 4756 | 143 | 001 | 086 | 075 | sos | | Pp | oo | no | oco | oco | no | oo | om | ooo | | p 704369 |300525 884277] 102 | oos | o24 | 08 | o | | D | ogs | 0191 | os | 109 | nos | 030 [173 | 026 | | pD | -o689 | 6550 | 1270 | oco | no | oo | om | ooo | | D | -1208 | 0622 1821 | oco | no | 000 | om | ooo | | » | 0805 | 06578 [137 | 000 | no | ooo | om | ooo | | p | 0896 | 0504 | 1341 | 000 | no | om | om | ooo | | p | -osot | 0418 | 0876 | 000 | no | ooo | om | ooo | “e po 22772 | 2050 | 4901 | 000 | 000 | ooo | om | ooo | [| p | -16m | 0662 | 1718] 000 | no | 000 | oo | ooo |

(testadas ácidodo | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O tipo sel- aquecido 30min vagem | p | 122% | 037% | 1475 | 126 | 00 | 087 | 100 | 029 | | p | -0250 | -os20 | 0715 | ooo | ooo | 000 | ooo | oo | | p [117] oe | 1618 | 00 | 000 | ooo | oo | oo | | p | -o260 | 0315 | 06804 | 000 | 000 | ooo | 000 | o00 | | D | 175 | 0365 | 186 | 118 | 001 | 06 | 132 | 08 | | » [10682] 3012 | 12034 | 125 | 003 | 030 [| 221 | o6 | | p | 00650 | os | 1115] 000 | om | 000 | oo | ooo | | p [087% | -os1s | 1091 | 000 | oo | 000 | oo | oo | | p [061 | -os8o | 1167 | 000 | 000 | 000 | 000 | oo | | e | 065 | 0252 | 08465 | 08 | oor | o21 | o75 | om | | e | 1006 | os26 | 1163 | 083 | 016 | 037 | os | o66 | | e [102% | 05 | 1076 | 082 | 026 | 035 | om | om | — le | 10% | 0408 | 1036 | om | 01 | 030 | 1523 | 113 | : | e | 1053 | 0302 | 1065 | 098 | 006 | om | 069 | os6 | E | e | 107 | o1s7 | 1065 | oo | 008 | 038 | 13 | 1 | | e | os | 0100 | 0063 | 0 | oo | 020 | 103 | om | | e [117 | 0261 | 1252 [| 002 | 004 | 023 | 082 | os | | e | os87 | ots | 1002 | om | oos | 024 | 112 | o76 | | e | osws | 0695 | oso5 | 100 | 05º | 052 | o66 | os6 | | e | 1004 | 0300 | os61 | 088 | oo | om | om | o7 | | e | os06 | 0266 | osts | 006 | oo | om | 11 | os | | e | 1046 | 0228 | 1137 [| 102 | 00 | 01 | om | os | | e | 1306 | os03 | 146 | 114 | 016 | om | 127 | 107 | | e | 117 | 0238 | 1191 | 09 | oo | 049 | 101 | o | | e [1417 | 0207 | 1090 | 008 | 008 | 029 | 103 | o63 | | e | 1152 | 036 | 1067 | 102 | ot | or [127 | 11 | | e | 114 | 0230 | 1220 | 101 | 008 | 030 | 057 | o76 | | s | o706 | os02 | 0626 | 005 | 060 | 043 | 09 | os | | s | os | 0754 | 0950 | oor | 082 | 101 | om | om | | s | 1048 | 107 | 1074 | 106 | 128 | 108 | 09 | os' | | s | oss2 | 0766 | osts | os2 | 080 | os | 078 | os | | s | 1126 | 1155 | 1059 | 104 | 126 | 176 | 09 | 116 | Ls | 1080 | 0560 | 1033 | 101 | 03 | 087 | 129 | os | testadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | s | 114 | 0350 | 1164 | 085 | om | 048 | 128 | 138 | | s | 10 | 0435 | 1056 | 102 | om | 03 | om | 08 | | s | o6os | 0250 | 0867 | os | 020 | 060 | 108 | o6s | | s 1 os | 061 | 0904 | 09 | 082 | 106 | os | os | | s | os% | 0536 | 0955 | os5 | o67 | 087 | oss | os | | s | 103 | 0306 | 1019 | 085 | os | om | om | os | | s | 1050 | 024 | 1015 | 068 | 009 | 027 | 086 | os | | s | 11 | 0700 | 1149 | 101 | 08 | 1322 | 103 | 104 | | s [1165 | os64 [1121 | 104 | 048 | om | 118 | 07 | | s | 1053 | 1288 | 1706 | 000 | 000 | ooo | om | ooo | | e | 0803 | 0203 | 0930 | oo7 | o62 | os | 108 | 11% | | e | os2 | o11o | 088 | 087 | 026 | 046 | 008 | o8 | | e | 0806 | 0270 | 1861 | 000 | 000 | ooo | om | ooo | “e [190 [os | 2407 | 143 | 006 | 06 | 2237 | 16 | | | e | 1200 | 0108 | 1367 | 101 | 006 | o6s | 104 | os | | e | oro | 0053 | 0826 | 101 | 005 | oa | 118 | 036 | | | e | os 017 | 1324 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e | oem | 0045 | 1057 | 102 | 005 | om | 106 | 02 | | e | 0s2 | 0196 | 1763 | 000 | 000 | oo | oco | om | [| e | os&6 | om: | 1362 | 107 | 00 | 035 | 102 | 026 | | e | 2721 | 0707 | 6332 | 000 | 000 | ooo | om | ooo | e |-o1mo| 0000 | com | 107 | oor | 032 | 138 | om | | e | os | 0321 | 1034 | 080 | oo | os0 | 161 | or | | e | 115 | 0256 | 1127 | 102 | 047 | 085 | 118 | 131 | | e | 0700 | 0262 | 17561 | 000 | 000 | ooo | om | oo | | e | 067 | 0256 | 1732 | 000 | 000 | ooo | oco | oo | | e [1408 | 0189 | 1836 | 120 | ou | os8 | 118 | 098 | | e | 142 | 0125 | 1727 | 102 | 006 | os0 | oer | oes | | e | 0368 | 0137 | 0320 | 105 | 122 | 08 | om | o7 | | a | os6r | 1003 | oo7a | 104 | 1323 | 137 | 107 | 061 | | e | osws | 0863 | 0522 | 104 | 120 | 1233 | 008 | os | | o | os84 | 0952 | 0500 | 101 | 100 | 115 | 103 | os | [ a | 1097 | 0836 | 1205 | 107 | 087 | 135 | oes | o66 | | a | 12866 | 1155 | 1405 | 110 | 104 | 21 | 136 | 1% | [ o [128 | 1121 [122 | 101 | 058 | 107 | 11 | om | testadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | o | 1376 | 123 | 1278 | 096 | 057 | 124 | 105 | 060 | | o | os61 | 1019 | 0970 | 080 | 1 | 112 | om | om | | e | 1103 | 1038 | 1165 | 10 | 08 | om | 109 | o85 | | e | osm | osor | oem | 103 | om | 110 | 105 | 095 | | a [14m | 1155 | 1168 | 100 | 098 | 100 [11 | or | | e | 1058 | 1044 | 1074 | 107 | 108 | 130 | 124 | om | | a | 1056 | 1026 | 1104 | 118 | 11 | 095 | 103 | o8 | | e | os | no | os | os | os | 1596 | 115 | oo | | P | oem | osa | 0821 | 0687 | oo | 030 | 063 | 100 | | P | 1001 | 070 | 1031 | 087 | o42 | os4 | 082 | os0 | | P | oss2 | osse | oe50 | css | 008 | 11 | os | 115 | | P | 107 | os64 | 1008 | 10 | 050 | oss | 121 | 09 | | P | 103 | os | 1011 | 08 | 07º | os3 | o8 | om | “le Jose | 0746 | 1001 | oo | o | 040 | o76 | 121 | ! | Pr Josi | 0681 | 10 | os | os | 05º | 0895 | os | - | P | 106 | os860 | 1040 | o88 | 023 | 042 | 102 | 100 | | | P | os87 | 0596 | 0056 | 096 | 032 | 03 | om | om | | P | osw6 | 0533 | os | 090 | 037 | o4t | om | 100 | | P | osoo | 0653 | new | 088 | o4o | 051 | o86 | oso | | P | osso | 0763 | os63 | os | os6 | oso | 088 | 102 | | P | oss7 | os16 | os59 | 100 | 030 | 028 | 116 | 110 | | P | os | om | 1066 | 100 | ost | ost | 098 | 109 | | P | 11 | o87a | 1221 | 096 | 045 | 050 | 107 | o86 | | P | 10% | om | 111 | no | no [no | no | no | | P | 1455 | 0806 | 1552 | 093 | 039 | o6s | oa | 112 | | P [1468 | 0766 | 1661 | 100 | 042 | 036 | 019 | 150 | | an | 090 | 0673 | osm | 101 | 082 | 07 | 057 | o66 | | an | os | os | os68 | 09 | 002 | 085 | o8s | 108 | | an | 10 | 1040 | 1015 | 102 | 106 | 096 | om | ost | | n | ogro | 1007 | os9s | 101 | 101 | 115 | 058 | os | | Nan | 1087 | 1066 | 1115 | 102 | 080 | 080 | 125 | oso | | n | osso | ossi | oem | 101 | oo | os | os7 | oro | | an | 1026 | 1043 | 1027 | 104 | 101 | 076 | 086 | oro | | n [1184 | 1078 | 1220 | 100 | om | om | o68 |. o21 | [ n [1126 | 0860 | 1157 | 104 | 09 [ 054 | 084 | o66 | testadas [a A ps 5 | o es ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O0 tipo sel- aquecido 30min vagem | n | oem | 0703 | os | 100 | o87 | 061 | 043 | 04 | | an | 1om | 1om | 1160 | 100 | 081 | om | oa: | 0658 | | an | 08% | osw6 | 080 | 102 | 100 | 110 | 095 | o75 | | n | 1061 | 1150 | 1om | 117 | 120 | 0890 | 112 | os | | n | 0303 | 0434 | 0400 | 051 | 052 | 000 | 029 | 005 | | n | 139 | 1269 | 1430 | 108 | 089 | 080 | o7%6 | 037 | | n | 1452! | 1185 | 1508 | 110 | 101 | om | 101 | 090 | | rt [147 | 1031 | 1567 | 085 | os6 | 101 | om | 10 | | rt | 1626 | 1435 | 1768 | 087 | 062 | 086 | 103 | om | | 17 [21 | 1052 | 2606 | os | os2 | 067 | 088 | 136 | | 7 | 162 | 1561 | 2368 | 083 | os7 | 109 | 126 | o8 | | 1 | 5900 | 5637 | nor | 083 | 050 | 034 | 105 | 096 | — lr J12 | 1263 | 146 | 07 | 066 | os6 | 052 | oo | : | rt | 182 | 1466 | 1511 | 101 | 08 | 120 | 218 | om | | t | 186 | 1318 | 1330 | om | o8 | 11 | 128 | os | Sl | rt | 162% | 1161 | 1858 | 086 | 073 | 089 | o55 | o8 | | 1 | osse | 0693 | 0027 | o7m | o64 | om | om] om | | 1 | 107% | 1032 | os68 | o87 | om | 122 | 095 | os | | 1 | 16m | 1303 | 2040 | 079 | o | 064 | om | 110 | | 1 | 2246 | 2447 | 4578 | 030 | 023 | 022 | 166 | os | | xr | 221 | 1905 | 2651 | 078 | o48 | ose | 092 | oo | | Tt | 103 | 1056 | 1021 | 098 | 105 | 130 | 088 | 124 | | rt |-1656 | 1651] 20862 | 130 | 06 | 305 | 061 | 359 | | + | 3066 | 2861 | 3002 | 07 | o43 | 008 | 037 | 026 | | s | 1120 | 0860 | 1105 | 09 | 08 | 10 | 096 | 106 | | s | 121% | 1064 | 1214 | 100 | 09 | 126 | 097 | 127 | | s | 1186 | 1156 | 117 | 100 | 082 | 09 | 104 | 106 | | s | 1826] 1265 | 1369 | 102 | 09 | 098 | 060 | 130 | | s | 1004 | os60 | 1052 | 105 | om | 142 | 083 | 103 | | s | 1066 | 0846 | 0891 | os | os | 116 | 107 | 119 | | | s | 1061 | 0904 | 1054 | 006 | 08 | 106 | 080 | 116 | | s [107 | 0826 | 104 | 09 | 089 | 140 | 181 [| 182 | testadas

ENSNNNSDRE ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O tipo sel- aquecido 30min vagem | s | 1164 | om | 1146 | 087 | 0686 | 112 | om | 10 | | s | 102 | 0756 | 1021 | 08 | om | om | oss | om | | s | 1050 | 0802 | 1020 | om | o7 | om | om | om | | s | 112 | 0836 | 1065 | oe | o76 | os80 | oe | om | | s | 1032 | 0801 | 1017 | os | 08 | om | 106 | 11 | | s | 1102 | 1001 | 1138 | 09 | o85 | o8 | 121 | 120 | | s | 10152 | 083 | 1146 | 102 | 09 | 106 | 116 | 16 | | s | 1101 | 0766 | 1000 | 100 | 085 | 102 | 105 [| 119 | | s | 101 | o7s7 | 1068 | 102 | 08 | 146 | 13 | 126 | | s | 1164 | 1184 | 1268 | 096 | 064 | om | om | 11 | | a | os52 | 0850 | 0027 | 100 | 102 | 126 | oe | 13 | | a | 0633 | 1053 | 2034 | 000 | 000 | 000 | ooo | oo | | a | 1050 | 112 | 2002 | 000 | 00 | 000 | om | 000 | « a [om | 09 | 182 | 086 | o56 | 055 | 105 | 234 | ' | a | 1004 | 0801 | 1165 | 093 | o78 | 087 | 082 | 129 | : | a | -3280| 3407 | 5300 | o85 | o78 | 066 | o66 | om | | a 10866 | 9041 | 14750] 105 | o75 | 118 | 08 | 172 | | a | 147 | 10 | 1904 | 070 [| 020 | 066 | 131 | os | | a | os | 0416 | 0942 | 000 | 000 | 000 | ow | oo | | a | 65830 | s6732 | 79613] 106 | os | o67 | om | 174 | | a | 2046 | somo | 4915 | 082 | o66 | 200 | 004 | 274 | | a | 131 | 1260 | 137 | 080 | 082 | 103 | om | os | | a | 1550 | 1478 | 1765 | 104 | 086 | o8 | 105 | 140 | | a | 1168 | 1161 | 1178 | 107 [10 | 11 | 120 [| 0686 | | a | 107 | 104 | 2066 | 000 | 000 | ooo | oo | ooo | | a | 1124 | 0997 | 1895 | 080 | 052 | 054 | 116 | 196 | | e | os68 | 0667 | 0801 | 085 | 08 | 107 | 156 | 109 | | e | 1116] 1032 | 1200 | 08 | 092 | 125 | 124 | 128 | | e | 1282 | 1306 | 1315 | 087 | 086 | 153 | 268 | 150 | | e | 106 | 1067 | 1175 | 008 | om | 130 | om | os | | | e | 1208 | 1135 | 1228 | 09 | 09 | 132 | 158 | 11 | Le | 115 | 103 | 1178 | 09 | 09 | 156 | 168 | 175 | testadas SP rs EE ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | e | 10163 | o8m | 1168 | 101 | 090 | 135 | 114 | 121 | | e | 136 | 1270 | 1460 | 086 | 080 | om | o76 | 102 | | e [1077 | 1012 | 13151] 087 | 073 | 056 | 080 | 16 | | e | 1046 | 1053 | 1065 | 099 | 0987 | oe | 112 | 126 | | e | 1032 | 1107 | 116 | 096 | 091 | 082 | 116 | 150 | | e | 1161 | 117 | 1206 | 082 | 08 | 103 | os | 110 | | e | 1038 | 1043 | 1072 | 082 | o8r | 110 | 078 | 0868 | | e | 1151 | 1068 | 1155 | 096 | om: | 113 | 110 | 109 | | e | 112 | 1020 | 119 | 093 | 089 | 154 | 060 | 121 | | e | 1220 | 0890 | 1205 | os | os | 16 | 087 | 116 | | » | os | os05 | os | oss | oo | 005 | o7s | o | | p [1181 | 0757 | 0987 | o67 | 024 | 020 | os0 | os | | p | 1751 | 0476 | 1300 | 100 | 001 | oos | os8 | o15 | . | p [1327 | -os18 | 1846 | 000 | 000 | 000 | ooo | oco | | p | 1087 | om | os | 116 | 048 | 038 | 08 | o | | | p [2048] 6026 [17006] 063 | 002 | oo | ooo | os2 | | p | 0640 | osso | 1152 | 000 | ooo | oo | ooo | 000 | | p | -osmo | oem | 1446 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | p | -o7so | 0534 | 1248 | 000 | 000 | om | ooo | ooo | | Pp | 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Itestadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O tipo sel- aquecido 3omin vagem | s | 111 | 1090 | 1339 | 097 | 086 | 105 | 109 | 113 | | s | 1190 | 1160 | 1174 | 112 | 114 | om | 115 | 13 | | s | 10 | 0025 | 0881 | 103 [ 116 [| 124 [| 113 | 12 | | s | 1161 | 1103 | 1226 | 106 [| 129 | 11 | 136 [| 129 | | s | 10% | 1119 | 1om | 100 [ 11 | 124 | 136 [| 102 | | s | os | oem | 1123 | 098 | 07 | om | 06 | oo | | s | os | os | 0961 | 103 | 08 | o82 | 096 | 117 | | s | 2170 | 3167 | 2504 | 072 | 038 | os8 | 098 | o81 | | s | 1190 | 06805 | 1156 | 102 | 09 | 121 | o | 112 | | s | 1047 | os | 09 | 105 | 08 | 112 | 120 [| 140 | | s | 1031 | o765 | 1005 | 100 | 102 | 106 | 085 | 115 | | s | osso | oros | news | 105 | 102 | 151 | 143 | 127 | | s | 1101 | orar | 12396 | 096 | om | om | 126 | 14 | “los [oem | os6 [08865 | 101 | 105 | 085 [| 124 | 102 | i | a | ostw | 0625 | 080 | 107 | 091 | 106 | 08 | 11 | | | a | oss2 | 060 | 111 | os | 060 | o8s | o4e | 105 | | a | osso | 0802 | 0940 | os | 073 | o66 | 108 | 118 | | a | oes5 | 0813 | 0833 | oes | 066 | 082 | 082 | os | | a | oss6 | 0753 | 0006 | 102 | o88 | 09 | oo | os | | a Jos | o66i | oe | 101 | 086 | os | oe | om | | a | 1006 | o736 | 1016 | 117 | 082 | om | 126 | 112 | | a | 1005 | 0551 | 1020 | 115 | 050 | 053 | o8 | 158 | | a | os& | 0731 | 1056 | 101 | om | o66 | om | 114 | | a | osse | os97 | 0938 | 120 | 069 | o73 | 088 | 110 | | a | 0830 | 0686 | 0704 | 106 | o84 | 069 | 09 | 102 | | a | -oss6 | 0462 | 0881 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000 | | a | 1046 | 0s623 | 1015 | 106 | o88 | o86 | 066 | os | | a | o6z% | os61 | 0627 | 107 | 0806 | 08 | om | 120 | | a | osez | 0062 | ooss | 103 | 101 | om | 11 | 10 | | a | 1108 | 1002 | 1090 | 105 | 096 | om | om | os | | a | 118 | 0973 | 1162 | 089 | 091 | 082 | 088 | o86 | | a | 1905 | 1741 | 1701 | 105 | 076 | 062 | 106 | 115 | | a | 1261 | o762 | 1190 | 08 | o73 | o67 | 086 | om | | x | osve | 0684 | 094 | 101 | om | 10 | 101 | o8s | Lx | oso2 | os | oem | oo | oos | o8r | om | om | testadas ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | x | oso1 | oe | osse | 101 | 101 | 102 | om | 10 | | x | 127 | 12238 | 1338 | 094 | 100 | 082 | 063 | oe | | x | or | ooto | 084 | 105 | 112 | 102 | om | om | | x | 106 | 1026 | 1107 | 106 | 106 | 102 | 120 | 095 | | x | oss5 | 0880 | 0805 | 104 | 105 | o8z | o7s | om | | x | oss5 | 0627 | 0800 | 087 | os6 | o8s | 094 | 08 | | x | oswm | o6smº | os32 | 109 | 101 | 080 | 106 | 102 | | x | os | o772 | os06 | 106 | 109 | 100 | o62 | o686 | | x | osso | -o402 | -0833 | 000 | 000 | ooo | amo | ooo | | x | osme | os02 | 1151 | 102 | 106 | 116 | 07% | om6 | | *« | osso | 1002 | 0940 | 101 | 109 | 103 | o8t | 116 | | x | osei | oem | o768 | 087 | 082 | 110 | 052 | 00 |

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| n | os61 | 0225 | os | 103 | os | o7ms | o8r | om |

Itestadas ácido do | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH1o tipo sel- aquecido 3omin vagem | nan | 1066 | 0322 | 1050 | 106 | 080 | om | os | os | | n | 112 | 0389 | 116 | 105 | 103 | 085 | 102 | o8t | | n | os | 0335 | 0604 | 120 | 120 | 129 | 126 [| 107 | | n | 1104 | 037 | 1115 | 106 [ 111 | 096 | 119 | 105 | | n | 1082 | 0362 | 117 | 120 | 126 [126 | 17 | 139 | | an | 1000 | 0368 | 1056 | 107 | 106 | 117 | 128 | 102 | | n | os | 0818 | 0081 | 112 | 102 | 142 | 102 | 09 | | n | 111 | 0327 | 1139 | 118 | 100 | 122 | 183 | 154 | | nº | 1062 | 0253 | 1068 | 116 | 098 | 139 | 116 | 106 | | pn | 1107 | 0254 | 1110 | 104 [ 08 | 070 | 095 | os2 | | pn | -027 | 0122 | 0741 | 000 | 000 | ooo | 000 | ooo | | x | oem | oa17 | ovo | 106 | 107 | 126 | 103 | 096 | | x | osss | 0305 | 0022 | 104 [ 107 | 106 | 140 | 125 |

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(testadas ácido do | pH5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | x [1807 | 1290 | 1369 [121 [11 [126 [1% | 112 | | x | -osm | 0460 | 0805 | 112 | om | os | os6 | os | | xy | 187 | 146 | 1500 | 117 | 080 | os8 | os0 | os | | xy [13303] 7600 | 1201 | 122 | 050 | 029 | 085 | 10 | | > | 2004 | 1118 | 2300 | 131 | 030 | oo | o73 | os | | xy | 173] 1706 | 34 | 08 | 025 | 085 | o83 | o66 | | x | 1560 | 0811 | 1400 | 104 | 036 | 062 | o68 | os | | x | 13% | o665 | 1161 | 122 | 040 | 090 | 080 | 109 | | xy | 7550 | so62 | 730 | 122 | 051 | 08 | o8t | 160 | | > | sem | 26872 | 65534 | 114 | 040 | 005 | om | om |

: : | a | osmra | osos | os | os86 | no | 101 | 105 | o76 |

| a | 1088 | 0903 | 1083 | 100 | om | og | o8s | 187 | | a | 0802 | 0540 | 0900 | 107 | os50 | o6s | 087 | oem | | a | os | om | os | 105 | 08 | om | om | os | | a | 1165 | 0936 | 1154 | 108 | 100 | 08 | 107 | 14 | | a | oss5 | 0640 | 0886 | 104 | 09 | o88 | 138 | 157 | | a | 1000 | o667 | 1053 | 008 | 100 | o7 | 08 | 10) | | a | oszo | 0650 | 0059 | 106 | 002 | 105 | 106 | 119 | | a | 1270 | 0708 | 1067 | 080 | 028 | 068 | 17 | o | | a | 1000 | 1054 | 1035 | 104 | 102 | om | 122 | 13 | | a | os | os | os06 | 101 | 09 | 082 | 06 | os | | a [111 | 0804 | 1079 [| 106 | 050 | 060 | om | os | | a | oss7 | oss2 | 0006 | os | ow | os | 10 | os | | a | 1161 | ogm | 126 [11 [| 10) | 079 [nm | 120 | | a | oswo | o650 | 1038 | 119 | 107 | 070 | 100 | 115 | | s | oso6 | os01 | 0630 | om | om | os | 128 | o67 | | s | or | ot4o | 06560 | 040 | 002 | oa | 131 | 026 | | s | 12390 | 0272 | 1002 | 101 | 066 | 124 | 166 | 123 | | .s | 1002 | 0328 | 0850 | 107 | 123 | 17 | 165 | os | | s | os | 1036 | 0033 | 065 | 08 | 215 | 146 | 08 | testadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | s | 2502 | 0341 | 2506 | 126 | ou | ost | 168 | 151 | | s | osm| om | 086 | 122 | 08 | 116 | 00 | o7 | | s | 1169 | 1330 | 1167 | om | o8s | 117 | oe | 1m | | s | 113 | 0104 | 1167 | 1323 | 036 | or | 126 | 126 | | s | 1664 | o274 | 2067 | 113 | ou | o64 | 102 | 000 | | s | 1047 | 0188 | os68 | 112 | 055 | 107 | 130 | o8 | | s | os%s | 0276 | 094 | 105 [141 | 186 | 267 [| 08 | | s | 727%s| 116 | 67750] 135 | om | o1 | 353 | 213 | | s | om | om | o6sm | 030 | 024 | 062 | 149 | 046 | | » | 1067 | 037 | 1070 | 106 | 023 | 020 | 112 | om | | p | os | 0365 | 0905 | 105 | os0 | 039 | ooo | os | | o | 1ma | 1045 | 1145 | 103 | 107 | 124 | 130 | o7 | | o | 122 | 033 | 1108 | 106 | 006 | om | 139 [ 106 | | D | 133 | 0363 | 127 | 104 | 008 | 034 | 088 | 096 | | p» 0605 | 0026 | 031 | 107 | 01 | os | 11 | o6 | | p | 1269 | 0469 | 1272 | 107 | 020 | 046 | 14º | 06 | | | o | 1267 | 0204 | 13463 | 104 | 005 | 038 | 166 | 126 | | o [os | 0546 | 1020 | 102 | 024 | 036 | 132 | 106 | | p | osos | 0149 | os80 | 103 | ot | o05 | 106 | om | | p | 10% | os | 1070 | om | o78 | 09 | 10 | o7 | | D | 109 | 0268 | 1100 | 105 | 033 | 039 | 130 | o6 | |» Í 1162 | 0150 | 1207 | 102 | 002 | 026 | 186 | 127 | | D [14 | 0269 | 1162 | 102 | ow | 096 | 08 | o8 | | p | oss6 | 0419 | 0985 | tor | om | om | 118 | o656 | | p [112 | 046 [1221 | 100 | 05 | o8 | 14 | o75 | | e | 1302 | om | 1201 | 120 | 003 | os0 | 151 | 069 | | D | 10% | ot7 | 104 | 102 | 008 | 038 | 116 | os | | s | 2164 | 2592 | 2264 | 08 | 082 | 068 | om | os | | s | osto | 077 | 0020 | os | os | 070 | 056 | os | | s | 106 | 1017 | 1121 | 085 | 100 | 122 | 068 | os | | s | 1066 | 0520 | 1149 | o88 | 070 | 093 | om | om | | s | 1861 | 1037 | 202 | 07 | o7s | 19 | 004 | 086 | | s | os%o | o7es | os54 | os8 | os | 107 | o88 | 123 | “los | 1122 | 0846 | 119 | 082 | 087. | 133. | om | 10 | [| s | osso | 0742 | 0963 | 008 | osº | os | o68 | 07 | testadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | s | os | 0sma | ooo | om | om | o1o | 036 | om | | s | os6 | 0650 | oses | 103 | 101 | o66 | 06 | os | | s | 100 | 1019 | 1061 | os | 095 | 120 | o68 | om | | s | 0805 | 0749 | os80 | os | 009 | 164 | 082 | 106 | | s | os | 087 | os | om | 082 | 135 | 103 | 009 | | s | oem | 0831 | osmo | os | oem | 14 | oem | 122 | | s | os63 | os | 1017 | om | oo | 08 | 008 | 104 | | s | 1801 | 1323 | 1603 | 080 | 083 | 120 | 060 | os | | p | oss2 | ore | 1082 | 088 | om | 06 | oso | oe | | D | 16 | 1030 | 1011 | 088 | 101 | om | oos | oe | [| DD | 136 | 1333 | 1382 | 102 | 088 | o66 | 143 | 086 | | D | 10 | 107 | 107% | 107 | 086 | om | 115 | 106 | : | p | 1164 | 1106 | 1236 | 086 | oe | o80 | 082 | o46 | |» | 1067 | osso | 1057 | os | om | om | 102 | 10 | ! | D [116 | 08 [1187 | om | o57 | om | oo | 107 | | p | 1265 | 1072 | 1235 | 090 | o82 | 101 | om | 102 | | D | 146 | 1464 [157 | 098 | 00 | oe | o6t | oe | | D | 13% | 13 | 1340 | 087 | 088 | om | 116 | 110 | | DD | 13 | 1307 | 136] 104 | 086 | 068 | 150 | 134 | |» | 1186 | 117 | 1200 | 104 | 086 | om | 101 | os | | D [111 | 1128 | 11233 | 100 | 09 | o8s | 108 | o8r | | D | 126 | 1016 | 1233 | 110 | 085 | o8s | 155 | 131 | | o [186 | 111 | 1682] | 066 | o52 | 021 | 422 | 23 | | x | oem | 0663 | 1031 | 106 | os6 | 092 | os | 11 | | x | 1009 | 1006 | 1152 | 101 | 086 | 107 | 1223 | o1 | | x | os | 1017 | 1036 | 110 | 119 | 105 | 102 | 114 | [x | 10m | 1o0m | 1138 | an | 1% [not | nor | nos | | x | v1oso | 1106 [1157 | 120 | 126 | 1233 [15 | 14 | | x | 1176 | 1217 [1202 | 119 | 114 | 095 | 1323 | 103 | | x | 141 | 0006 | 1520 | 107 | 096 | o70 | 080 | oo: | | x | 1402 | 1367 [| 1640 | 107 | 00 | o78 | 04 | 06 | [x | 1024 | 1006 | 1103 | 124 | 128 | 095 | 129 | 116 |

Itestadas ácido do | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | x | -0501| 0678 | 1132 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | x | 101 | 106 | 1038 | 113 [ 123 | 09 | 100 [| 114 | | x | os | 107 | 0801 | 102 | 106 | om | 1238 [ 121 | | x | 1138 | 1173 | 1168 | 112 | 1223 | 09 | 114 | 09 | | x |-2327 | 21866 | -26205| 101 | 082 | 068 | 095 | o7s | | x | 4621 | 4316 | 5514 | 115 | 08 | 058 | 1506 | 10) | | x [6775] 4300 | 61265] 119 | 106 | 089 | 043 | 199 | | x | 1236 | 0909 | 1321 | 116 | 106 | om | 108 | 120 | | e | 101 | 07 | 0504 | oe | 070 | o7s | om | os | | P | osoe | 087 | 0376 | os | os | o42 | oo | om | |» | osws | o620 | 0239 | 083 | 082 | om | om | 140 | | e | 11656 | 1200 | 0459 | os0 | 088 | o80 | 172 | o8 | | e | 1062 | 1009 | 0200 | 002 | om | om | 121 | 121 | | o | 108 | 1035 | 03268 | 116 [ 115 | 08 | 14 | 10º |

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| p | 1000 | os26 | 0081 | 108 | 11 | 153 | om | 120 | | p | oss6 | osto | nem | 112 | 1% | 187 (an | 115 | | p | 1062 | os | 1057 | 100 | 105 | 1523 | om | 135 | | e | 112 | o8os | 1056 | 1 | 107 | 115 | 139 | 146 | | » | 1058 | 072 | 1051 | 112 | 100 | 116 [11 | 1651 | | » | osss | os46 | 0876 | 008 | 082 | om | 106 | os | | p | oss | 0605 | 0836 | 008 | 086 | 11 | 106 | 100 | | p | os51 | os5e | 0587 | o4r | 046 | 040 | 036 | om | | p | osz7 | 0681 | os | os | 85 | 103 | o8 | 105 | | p | os | 0764 | oss7 | 086 | os | om | 17 | 161) | | p | osss | om | oem | 112 | 104 | 165 | om | 139 | |» | 1059 | oem | 10% | 114 | 106 | 139 [| 136 | 151 | | p | os | 0686 | 087 | 11 | oo | 160 | 100 | 127 | | p | osto | o628 | 0940 | 109 | 090 | 148 | 129 | 127 | | p | 1047 | os82 | 1066 | 108 | 104 | 107 | 08 | 11 | | R | 104 | 0736 | 1048 | 107 | 100 | 088 | o87 | o8s | | Rr | oss2 | osso | os | 113 | 112 | 102 | 12 | 136 | LR | 2554 | 2810 | 3702 | 121 | 126 | 026 | 154 | o6s6 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH1O0 tipo sel- aquecido 30min vagem | R | oeos | osss | oest | 117 | 115 | 097 | 08 | 004 | | R | 1056 | 1149 | 1164 | 106 | 112 | 11 | 165 | 097 | | R | os7ws | 0665 | 0754 | 127 | 137 | 1233 | 138 | 130 | | R | os | mo | os | 106 | 118 | 128 | 09 | 0682 | | R | oem | osso | os | 117 | 113 | 08 | os | om | | R | osso | 0820 | 0950 | 121 | 115 | 086 | 112 | 134 | | R | 1108 | o7es | 1124 | 130 | 117 | 094 | 064 | 14 | IR | 15 | no | 11 | 11 | 006 | oe | 09 | o8 | | R | esti | osso | 1112 | 106 | 101 | 06506 | o81 | 081 | | R | -2705 | 2694 | om | 143 | 142 | 030 | 006 | 142 | [| R | 110 | 1158 | 1136 | 107 | 113 | 102 | 072 | 080 | | R | essa | 1024 | nom | 110 | 126 | 1306 | 083 | 109 | | R | oszz | oess | 1000 | 113 | 117 | 138 | 067 | o62 | : | R | 101 | 1015 | 1054 | 118 | 117 | 128 | 069 | 000 | | R | 3110 | 2960 | 3734 | 119 | 118 [17 | 067 | oso | : | R | 387% | 3752 | 4265 | 117 | 107 | 098 | os0 | 155 | | P | 4708 | 412 | 3404 | 00 | 002 | 006 | 059 | 107 | | P | 107 | 0860 | oew | 087 | o8s | 057 | 0852 | 102 | | P |-081o | 0385 | 0754 | 000 | ooo | 000 | 000 | ooo | | P 0706 | 0790 | 1227 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | [e [0224 [0201 [=o640 | ooo | om [om [000 | 000 | | P | 0200 | -0250 | 6656 | 000 | ooo | ow | 000 | oco | | P [0176 | 0230 | 0406 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | P | -033 | 0384 | 0650 | 000 | 000 | ooo | 000 | ooo | | P | 017 | 0233 | 06512 | 000 | ooo | ooo | 000 | ooo | | P | 0384 | 0461 | 1005 | 000 | ooo | ooo | 000 | ooo | | P | 3470 | 4155 | seiws | 000 | oo | ow | 000 | ooo | | P | osiws | 065% | 0752 | 002 | 082 | 0652 | 0066 | 11 | | P [087% | osza | 1050 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | | P [0421 | 06589 | 1108 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | P | 0204 | 037 | 0808 | 000 | 000 | ooo | 000 | ooo | | P 1127 | -10108 | 13406] 109 | 087 | 060 | o | 262 | | P | 2087 | 1508 | 1578 | 104 | os | 115 | 060 | 136 | | e | 067 | 087 | -1e0s | 000 | ooo | ooo | 000 | ooo | | P 37 | 0439 | 1038 | 000 | ooo | ooo | 000 | ooo | testadas ácido do | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | e | os | os6s | om | 103 | 087 | 088 | om | o82 | | e | os64 | 0706 | 0864 | 100 | o88 | 118 | 006 | 086 | | e | os | 083 | 0004 | 107 | 098 | 07 | o8s | o78 | | e | oes2 | oem | oe | 107 | 106 | 130 | 104 | 08 | | e | 118 | 1026 [om | 105 | 10 | 14 | om | os | | e | 100 | 1007 | osor | 108 | 104 | 161 | 080 | o7 | | e | 1067 | os8t | 1026 | 124 | 120 | 159 | 103 | 115 | | e | 1150 | 094 | 1016 | 106 | 10 | 120 | os | 103 | | e | 113 | 0808 | 1056 | 110 | 106 | 102 | 126 | 096 | | e | 10 | 0581 | 0862 | 09 | 081 | om | 101 | os | | e | oso6 | 0500 | 077 | 101 | o88 | 09 | 121 | 102 | | e | osst | 057% | 0500 | 102 | 09 | 128 | oes | o6 | | e | 1053 | 07860 | 0062 | 105 | os | 129 | 08 | 086 | | e | os | 0673 | om | 105 | 100 | 138 | am | 165 | i | e | 1161 | 0868 | 1073 | 112 | 105 | 134 | 086 | o | | e | 08% | 0856 | 08 | 11 | 102 | 138 | om | o7m | | | e | 10 | 0886 | 1030 | 106 | 102 | 124 | 083 | os |

| e | 10% | 0810 | 082 | 105 | 08 | 121 | 102 | 11 | | e | 115 | 0826 | 0936 | 102 | og | 118 | 104 | 085 | | e | 086 | -os6i | 1761 | 027 | 030 | 068 | 117 | om | | e | 0396 | coco | 0103 | 101 | 10 | os | ose | os | | e |11m | 117 | 112) | 102 | 106 | om | os | 060 | | e [117 | 117 | 097 | os | 104 | 083 | 005 | 101 | | e | 1204 | 1203 | 0735 | os | 100 | os | os6 | os | | e | 474 | 4500 | 3057 | 100 | om | 063 | 037 | o86 | | e | 1032 | 0924 | 0702 | 103 | 08 | 126 | 122 | 116 | | e | 0462 | 0508 | 1262 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | | e | os&s | o6es | 0719 | oo | os | os57 | om | om | | e | oss3 | os | 0764 | os | o | o69 | or | osr | | e | -e7m | -o6m | 0810 | 108 | 086 | on | 008 | o62 | | e | 107 | 10% | 0521 | om | 08 | 073 | o8s | os | | e | 1050 | 0967 | 094 | 008 | 105 | os | 082 | om | | e | 1300 | 1269 | 0602 | 002 | o8 | 069 | os | om | Le [17 [1681 | 097 | 104 | 09 | os | 047 | 066 | testadas ácido do | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | e | 1438 | 1065 | 1054 | 106 | 084 | 073 | 076 | 103 | | e | 0740 | 0408 | 0450 | 103 | o75 | o60 | 060 | 120 | | e | 1288 | 0981 | 095º | 085 | o65 | o49 | 146 | 149 | | e | 1820 | 144 | 1572 | 08 | 066 | o57 | 145 | 186 | | e [387% | 3420 | 4132! | 102 | 070 | o27 | 018 | 26 | | e | 1050 | 0829 | 0626 | 086 | o68 | o8r | 115 | 127 | | e [1551 | 117% | 1726 | 069 | 038 | 045 | 030 | o12 | | e | -saso | 3022 | 6535 | 102 | 07 | 004 | 136 | 107 | | e | 177 | 1265 | 1794 | 121 | 072 | 006 | 080 | 127 | | e [1321 | 1220 [1100 | 106 | 086 | 028 | 136 | 104 | | e [2451 | 2166 | 1817 | 101 | o7m | 058 | 17 | 222 | | e | 181 | 1740 | 090 | 102 | 081 | o43 | oot | 124 | | e [10362 | sem |-10s00] 109 | o80 | 010 | 112 | 294 |

: | e | os | no | 04 | os | om | o8s | 006 | 106 | | e | 1188 | 1066 | 0608 | os | o7m5 | o46 | 082 | 127 | : | e | om | no | 00 | o | 060 | 004 | 082 | 028 |

| e |-1400 | 1163 | 1608 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e | -7o64 | s7as | 7406 | 102 | o7m5 | o | 157 | 030 | | e | 0654 | 0401 | 0312 | 102 | om | om | 14 | oo | | e | 1162 | 0821 | 0570 | 10 | om | oo | or | 065 | | e | 1135 | 09 | 0680 | os6 | 063 | 06 | os | o47 | | e | 0802 | om | os55 | os | 06º | os | os | osr | | e | 172% | 1578 | 12233 | 088 | 067 | 002 | 100 | 128 | | e | 1056 | 077 | os02 | os | o6s | oor | 130 | 11 | | e | 26560 | 22865 | 1512 | 088 | 061 | 068 | 092 | 066 | | e | 1064 | 0659 | 0400 | 085 | 064 | 073 | 130 | 109 | | 6 [a | 3207 [3191 | 106 | om | o4e | 126 | 186 | | e | oss7 | o6w | os | 102 | om | om | os | os | | e | os | no | 020 | 101 | 08 | o6s6 | 129 | os2 | | e | 148 | 1400 | 1407 | 010 | 023 | 083 | 03 | 183 | | e | 1321 | 1198 | 0551 | 101 | 088 | o68 | 095 | om | | e | osse | 1036 | os81 | 08 | om | oe | 150 | 137 | | e | 1008 | 0529 | os67 | 086 | 080 | o72 | 100 | os6 | | e. | 1240 | 1109 | 0616 | 084 | 076. | 082 | om | 060 | [| e | 16% | 1424 | 0810 | 100 | o76 | 060 | oo | os6 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e | 7338 | 6384 | 7438 | 142 | 08 | 001 | 248 | 264 | | e | 1200 | 0816 | 0586 | os | o7%6 | oss | oe | om | | n | osm | oem | o70 | 100 | o88 | om | oo | o54 | | x | 107 | 0899 | 10623 | 100 | os | 086 | o7r | o69 | | an | 1081 | 1080 | 1100 | os | os5 | o87 | oe | o87 | | an 1031 | 1047 | 1008 | 10 | 106 | 089 | 095 | 099 | | n | 1138 | 1150 | 0952 | 098 | 102 | 092 | 008 | om | | an | 1030 | 1052 | oome | 106 | 110 | o8s | 115 | om | | an | 1102 | 1186 | 1057 | 101 | 102 | o88 | 104 | o81 | | n | 1346 | 1260 | 1266 | 110 | 107 | o67 | oos | 086 | | n | 107% | ogm | os66 | 101 | os | om | oss | 118 | | an | 1310 | 0916 | 12860 | 108 | 097 | 082 | o68 | 09 | | an | 08% | o7m | os02 | 10 | 09 | om | o86 | oe | | n | 0146 | o16r | 041 | 0651 | 053 | 06 | ost | -o1o | ' | pn | oo54 | no | 0034 | 101 | 102 | om | 126 | 08 | | n | 10 | no | 08 | os | 100 | 08 | 117 | 096 | | | an | 1063 | 1052 | 1010 | 106 | 106 | 080 | 112 | 004 | | n [111 | 1066 [| 10% | 11 [ 112 | 008 | 092 | o6 | | an | 1052 | 1020 | oom | 110 | 10 | 103 | oo8 | 089 | | an | 1100 | 0966 | 1058 | 109 | 106 | 107 | os | o86 | | an | 1232 | 0805 | 1036 | 110 | 096 | os | 110 | 106 | | e | osso | 06% | o7ss | 111 | 085 | om | 08 | os | | e | osw | 0861 | 090 | os | 087 | ose | os | 008 | | e | 10 | no | 080 | 109 | 103 | oso | os | 146 | | e | os& | oem | 076 | 116 | 106 | os | ow | 121 | | e | 102 | 1057 | 081 | 106 | 106 | 080 | o8r | 114 | | e | os | ogw | 0743 | os | 085 | 100 | os | 00 | | e | 1198 | 1096 | 0803 | os | om | os | oo | 104 | | e | os&6 | 0752 | osm | 105 | om | 103 | 140 | 140 | | e | os6 | 062 | 0703 | 106 | om | 08 | 09 | 00 | | e | ossa | 0604 | 0725 | 106 | 00 | 096 | 103 | 008 | | e | ose | os! | os: | 115 | 104 | o8s [| 117 | 126 | | e | 10% | oss7 | osm | 103 | om | os [13 | 156 | [| e | ossos | 1040 | 0680 | 102 | 101 | os | 100 | 135 | Pa testadas ácidodo | pH 5,8 PpH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | e | 10 | 1022 | 0833 | 104 | 103 | om | oe | 11 | | e | 147 | 1501 | 1721 | 145 [| 139 | ou | 100 | 14 | | e | 106 | 168] | 1187 | 122 | 09 | 050 | 146 | 113 | | e | 108 | 088 | 1200 | 115 | 106 | 080 | 12 | 102 | | e | 101 | 0690 | 083 | 117 | 105 | 082 | 116 | 11 | | v | o762 | 0584 | o6t | 104 | 084 | 06 | 110 | 102 | | v | 0038 | o765 | 0890 | 102 | o8r | o68 | oes | 106 | | v | os | os: | osso | 106 | om | om | 085 | om | | v | o7os | 0742 | 0681 | 102 | os | os | 116 | 150 | | v | 0381 | 0305 | 085 | 042 | o | o46 | 08 | os | | v 1208 | 1029 | 0887 | 110 | os | oo | 107 | 13 | | v | 1006 | 0821 | 0875 | 109 | 089 | 106 | 14 | 135 | | v | 128 | 086 | 1219 | 107 | 08 | 11 | 08 | 100 | | | v | os | os88 | 0859 | 08 | om | om | om0 | om | | v | 110 | o757 | 0866 | os | os | o8s | 086 | 07% | | | v | 1080 | 1003 | 0820 | 101 | o8 | 105 | 136 | 11 | | vy | 1266 | 0867 | 121 | 100 | 087 | os | os | 11 | | v | 1336 | 0638 | 1106 | 102 | om | os | 106 | 106 | | P | 080: | 0535 | 0696 | 103 | 09 | o81 | om0 | 122 | | P | om | 0620 | osso | 102 | o8 | om | 008 | 11 | | P | os | 0709 | 0733 | 008 | om | 08 | 105 | oso | | P | 0858 | 0753 | 0555] 08 | o8r | 112 | om | os | | P | 1043 | 06867 | oe | 103 | os | 1 | 105 | o | | P | 0842 | 0869 | oem | 110 | 101 | 105 | 080 | oss | | P | osms | 0703 | 0348 | 132 | 1 | 147 [120 | 106 | | P | osm | 0533 | os | 104 | om | 082 | 08 | os | | P | os8&68 | 07 | os63 | 110 | 086 | 110 | 088 | 116 | | P | osso | 0730 | os84 | 110 | 10 | 110 | 100 | os | | P | 080 | 0575 | 0573 | om | os | 06 | 109 | os | | P | 0035 | 0675 | os46 | 098 | 08 | os | om | os | | P | 1020 | 0683 | 0569 | 101 | 098 | os | 078 | os | | P | 1003 | o835 | 0954 | 110 | 086 | 148 | 096 | om | | P | 1072 | 0810 | os | 11 [10 [112 [121 | 104 | testadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8B pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | P 1130 | 0852 | 0970 | 11 [ 101 | 102 | 07% | 230 | [| P 1009 | o684 | 0626 | 110 | 08 | 138 | 08 | 117 | | e 0965 | 0620 | 0404 | 112 | 102 | 082 | 075 | om | [| e [251 | 291 | 612 | om | ot | om | 285 | os | | e | 1136 | os7 | 1046 | 100 | 08 | 080 | os | o6 | | e | 1005 | 0702 | os21 | 096 | 086 | 143 | 09 | os | | e | 123 | 10866 | 0865 | 082 | os | 130 | 002 | os6 | | e | 1150 | os: | 083 | 08 | 082 | o | 112 | os | | e | 10% | 072 | os% | 082 | om | o82 | 056 | o65 | | e | 1046 | 0660 | 0856 | os | o8 | o74 | 068 | os6 | | e | 133 | 0959 | 0822 | 086 | 082 | 07º | om | os |

: | e | 1360 | 0085 | 1046 | 084 | o76 | 147 | 102 | 068 | | e | 1068 | 0751 | 0702 | 088 | 070 | 101 | 101 | o66 | | [ e [12390 | 0842 | 0866 | 080 | 068 | o72 | 082 | om |

| e | 1386 | 0903 | os81t | os | o76 | 116 | 105 | 103 | | x | ss | 0738 | 1069 | 086 | os | 088 | 07% | or | | x | 0900 | 0663 | 1068 | os | 090 | om | os | om | | x | os0s | 0935 | 1007 | 104 | 104 | o85 | 10 | o6s | | x [1183 | 1016 | 1053 | 101 | 09: | 068 | 086 | os2 | | x | 107 | 0959 | oem | os | oo | 104 | o8 | 060 | [| x | 1086 | oess | 1142 | 101 | 09 | 11 | 008 | o7s | | x | oss | no | os | os | os | os | 07% | os | [| x | os6e | o6s27 | 0886 | 09 | 082 | 106 | om | om | | x | os86 | 0740 | 1023 | 103 | 095 | os | 118 | os | | x | os | oso7 | 1216 | 000 | 000 | 000 | 00 | ooo | | x | 11 | no | 105 | 107 | 096 | 106 | 105 | os | | x | 1047 | 0766 | 1052 | 104 | 09 | om | 085 | om | | s | os | 0646 | 0731 | 080 | o7 | 070 | 085 | 065 | | s | osse | 0764 | 0605 | 102 | om | o82 | 113 | 110 | | s | 1266 | 1163 | 117 | 08 | 088 | o7%6 | o82 | o7 | [| s [1303 | 1200 | 0814 | 096 | os | o67 | 148 | om | [ s [ os7m | oss8 | 0663 | 101 | os | 089 | 105 | 117 |

Itestadas ácido do | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1O tipo sel- aquecido 30min vagem | s | 1072 | 107 | 0620 | 0% | om | 065 | 101 | os | | s | 1266 | 1161 | 0755 | 087 | 08 | om | 117 | os | | s | osss | 0807 | 0551 | 109 | os | os | 126 | 101) | | s | 101 | 0730 | 0684 | 102 | 085 | 080 | 116 | 10 | ' | s | 1164 | 0908 | 0685 | 101 | 080 | o6 | o8s | om | | s | 101 | 0600 | 0566 | 080 | os82 | o6r | om | 115 | | s | 1064 | 1021 | ore | om | om | 081 | os | o60 | | s | 1722 | 2201 | 4726 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | s | 1004 | 0969 | 0004 | 106 | 113 | 110 | 096 | os | | s | or | ori | om | 100 | 085 | om | 100 | 131 | | s [177 | 1438 | 1168 | 096 | 08 | 110 | 086 | o86 | | s | 1788 | 1224 | 0810 | 087 | 080 | 105 | 130 | 106 | | o | oser | 06% | os | oss | os | os | 100 | 107 |

: | o | oss2 | os | os7 | os | os | 151 | om | o7 | | o | 0667 | os | osso | 102 | 101 | 124 | 080 | 104 | - | o | osm | osm7 | 08 | 10 | 107 | 117 | om | 107 |

| oe | 1182 | 1065 | 1151 | 11 | 11 | 129 | 090 | 147 | | o | 1008 | 1038 | oem | 10 | 105 | 121 | 100 | 126 | | o | 1022 | 1047 | 0968 | 100 | 102 | 088 | om | os | | o | 110 | 1056 | 1152 | 098 | os | 083 | om | os | | o | 1025 | osos | os8 | 103 | 09 | om | 121 | 124 | [| e | 1066 | 0787 | 1070 | 107 | os | o50 | om | om | | a | osre | 0703 | 0865 | 095 | oss | om | om | 11 | | o | os85 | os | oo | os | or | 104 | om | 106 | | o | 188 | 1704 | 1431 | 09 | 085 | om | om | os | | e | 1027 | 1025 | 0066 | 104 | 107 | 080 | o8s | 10 | | e | 118 | 1098 | 1090 | 100 | 10 | 116 | 08 | o8 | | e | 100 | 1001 | 0861 | 100 | os | 148 | 08 | om | | o | 103 | os | 1014 | 088 | om | 110 | 086 | o7 | [| e [117 | 1006 | 112 | 112 [ 106 | 124 [114 | 10 | | e | oss7 | om | 0683 | 110 | 0686 | om | om | os82 | | e | -osoo | 1023 | 1918 | 073 | om | 201 | 247 | 146 | | e 1315 | 1598 | 3465 | 000. | 000 | 000 | ooo | ooo | [ e [417] 4308 | 8114 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | itestadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo set aquecido 3omin vagem | e | 0661 | -os8or | 1839 | 000 | oo | ooo | ooo | ooo | | e [014 | 0120 | 0264 | 000 | 000 | os | 076 | 086 | | e |-oso | 076 | 1507 | 000 | 000 | ooo | ooo | oo | | e |-0sos | -nsot | 1725 | 000 | 000 | oo | oo | ooo | | e | -0436 | 0563 | 1271 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e | 2482 | 2616 | 5126 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | e | 0256 | os08 | 0665 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | e | -o410 | 0500 | 1108 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | | e | 297 | 251 | som | os | o68 | om | 1m | 159 | | e | -0303| 0346 | 07866 | 000 | 000 | 000 | oo | ooo | | e |-o461 | 0544 | 1208 | 000 | 000 | ooo | ooo | ooo | | e |-062 | 0733 | 1654 | 000 | 000 | 000 | 000 | ooo | i | p | os60 | o6m | ori | 104 | o6 | om | 11 | 107 | : | p | os6s | om | 0750 | 100 | o68 | om | om | o66 | | » | os | osts | nes | 105 | o7e | nos | os2 | 095 | | p | osso | os0o | o621 | os | 117 | o88 | om | 123 | | p | oss6 | oess | 0776 | 10 | 17 | 112 | 112 | 106 | |» | asse | os62 | o540 | 080 | 114 | 106 | 086 | 117 | | p | os66 | 0635 | o6m | os | css | om | 127 | 132 | | p | 092 | 0665 | 0553 | 096 | 062 | os6 | 10 | 115 | | p | 187 | 080 | 0005 | 080 | 680 | os | 10 | 11 | | p [103 | 0743 | 0856 | 123 | 125 | 103 | 168 | 146 | | p | 090 | os00 | 075 | 108 [| 121 | 09 | 17 | 106 | | p | osw6 | 0900 | 0621 | 102 | 105 | 05 | 082 | os | | p | os2%6 | 087% | 0765 | 103 | 126 | 076 | 082 | 126 | | e | 1056 | 1113 | 0651 | 113 | 1237 | 086 | 19 | 169 | | p | os | oses | 086 | 115 | 13 | 08 | 142 | 115 | |» | 106] 1006 | o76s | 11 | 125 | 106 | 106 | 138 | | p | osss | os66 | 066 | 104 | 11 | os | 08 | 121 | | p | 100 | og1z2 | 0805 | 106 | 116 | 086 | 106 | 107 | | Pp | 1302 | 0831 | 0087 | 106 | 105 | 08 | om | 11 | - LR | os | o6m | 0808 | 107 | om | 10 | 06 | os | [ R | os& | o7e6s | 0706 [ 105 [| 125 | om | os | o7s | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | R | os | os02 | 060 | 104 | 129 | 059 | 050 | 102 | | R | 1662 | 1639 | 1418 | 106 | 134 | 104 | o8 | 107 | | R | os4s | os61 | 072 | 105 | 141 | 093 | o69 | o8 | | R | osos | 1001 | 0800 | 112 | 130 | 125 | o88 | 116 | | R | oem | os | os | 116 | 139 | 089 | 150 | oo | | R | osos | 075 | osso | 110 | 123 | 107 | 080 | os | | R | 118 | om | 114 | 117 | 126 | 106 | 11 | 09 | | Rr | osor | ost | osm | 115 | 123 | 085 | 08 | 10 | | Rr | os | os26 | omor | 101 | 116 | 043 | o | om | | Rr | 1026 | os68 | 1002 | 106 | 132 | 072 | os9 | o6 | | R | os | os96 | ogm | 115 | 138 | 09 | o6 | 106 | [| Rr | 1052 | 0961 | 102r | 136 | 154 [| 125 | 106 | 120 | | R | 4403 | 4159 | 6037 | 145 | 148 | 163 | 031 | 274 | | R | 1432 | og7s | 1040 | 120 | 130 | 050 | 066 | 109 | i | s | 1102 | 0858 | 0528 | 091 | 105 | 107 | om | os | . | s | osw6 | os00 | 087 | 102 | 118 | os | o64 | o62 | | s |-oose | 0234 | 0100 | 105 | 124 [| 113 | 002 | 106 | | s | os | 0893 | 09 | 17 | 136 | 137 | om | 100 | | s | ossos | os9s | 0260 | 105 | 120 | 1323 | 100 | 187 | | s | -o623 | -o621 | 0808 | 000 | 000 | ooo | ooo | oo | | s | 2265 | 174 | 1200 | 008 | 117 | 104 | 09 | 119 | | s | om | osw | 0624 | 0982 | 080 | 122 | 088 | om | | s | -0205 | -o27a | 0463 | 018 | ou | 163 | 128 | 11 | | s | 2006 | 1049 | 2635 | o7% | om | 1565 | 162 | 14 | | s | 10900 | 1066 | 0706 | 107 | 112 | 106 | 118 | 137 | | s | 2762 | 2264 | 2642 | 099 | 090 | om | 068 | 123 | | s [172 | 1700 | 3059 | 000 | ooo | ooo | ooo | ooo | | a | 1021 | 0990 | 0006 | 105 | 108 | 07º | 080 | os7 | | a | osso | os2s | oot2 | 100 | 118 | om | om | os6 | | a | osso | 1113 | 1000 | 113 | 118 | 08 | 118 | 110 | | a | os63 | 1012 | os68 | 102 | 109 | os82 | om | o7 | -— La | oo | 091 | 0685 | 009 | 105 | om | oo | o8 | [ a | ossos | os6s | 0064 | 104 | 105 | om | 106 | os | testadas ácidodo | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | a | oes4 | oe8s7 | osm | 104 | 103 | os6 | om | os | | a | os&s | o7er | 0913 | 100 | 099 | om | 11 | om | | a | os | oso1 | 0866 | 110 | 106 | om | om | 106 | | a | osos | nest | 095 | 104 | 102 | om0 | om | oe: | | a | os | oss | 002 | 15 | 11 | om | 07% | oo | | a | 1067 | 1036 | 1026 | 191 | 106 | 08 | 104 | 068 | | a |] 0968 | 057 | os50 | 102 | 108 | o84 | 08 | 106 | | a | o627 | o667 | 0731 | 100 | 103 | 086 | om | os | | a | osm | oem | 0913 | 104 | 102 | 097 | om | 106 | | a | os0 | 06832 | 0833 | 106 | 101 [ o8t | om | os | | a | 117 | 0706 | 10623 | 104 | 098 | 06 | oso | os | | e | osso | ori | os | 103 | oo8 | om | 109 | os | | e | 1052 | 09 | 1053 | 108 | 103 [ 08 | 080 | 08 | | e | 1056 | 0966 | 1040 | 109 | 110 | 105 [102 | or |

| | e | 10 | 0826 | 0870 [| om | 100 [11 | om | os6 | | e | 1063 | 0528 | 1044 | 106 | 103 | 094 | 104 | 105 | | | e | osst | o761 | 0883 | 108 | 107 | 104 | om | 106 |

| e | 110 | os7xa | 1070 | 104 | os | 113 | 09 | om | | e | os02 | o467 | 0708 | oo | 0% [om | om | om | | e | osso | 057% | 0860 | 104 | 095 | om | 103 | 095 | [| e |-031 | 0300 | 0615 | 000 | 000 | 000 | om | ooo | | e | 1012 | 0749 | 1021 | 109 [| 104 [ 11 | 08 | 124 | | e | osm | 0727 | os | os | 00 | os | 0% | 102 | | e | os63 | 0s32 | oss7 | 100 | 102 | 15º [| 05 | om | | e Jog | 0726 | 093 | 10 | 105 | 12 | 115 | 086 | | e | 1069 | 0777 | 1056 | os | 08 | 135 | om | 06 | | e | 110 | o8tm | 1022 | 08 | om | 11 | 052 | om | | a | osso | 0720 | 1000 | os | 08 | om | om | os | | o | os2t | 0760 | 0953 | 100 | 088 | 106 | oor | ow | | a | os | 077 | oes3 | oo | om | 106 | 104 | om | | a | 1068 | 09005 | 10866 | 100 | om | 10 | om | 1º | | a | osm | 0735 | 0885 | ow | om [126 | 11 | 005 | | a | os85 | 0740 | 0916 | 104 | 095 | om | 106 | 008 | | a | 0803 | o648 | 0826 | 09 | 09 | om | om | 106 | La [10% | o707 | 107% | om | 105 [ 06 | o8o | 00 | testadas ácidodo | pH 5,8 PH 5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | o | 0913 | 06233 | 0923 | 008 | 088 | om | oer | 119 | | a | 092 | 0816 | 0908 | 000 | os | 095 | 107 | o8s | | e os | 0707 | 0820 | 08 | 005 | 08 | oo | 105 | | a fosmo | o746 | 0700 | os | os | oo | 117 | 106 | | a | osw | oss7 | 0623 | 082 | oo8 | ore | 07 | 109 | | e [10% | 087% | 0900 | 103 [| 101 | 09 | 11 | 105 | | a | 0900 | 0980 | 1003 | 104 | 101 | 082 | 107 | 006 | | a 1050 | 1002 | 1067 | 101 | 087 | o7m5 | os | os | | a | 1038 | 0806 | 0906 | os | oss | o7m | 108 | 104 | | v | os20 | 0651 | 0865 | oss | 086 | o7e | oos | 114 | | v | os22 | 0802 | 087 | ow | om | os | 105 | os | | v | os33 | 0957 | 0942 | os | 100 | om | 102 | 106 | [| v Jos | oom | 094 | 105 | 106 | ost | oos | oo | : | v | os6 | 1023 | 0976 | 080 | om | 066 | om | os | | v | osss | 1000 | 0936 | 107 | 106 | os6 | 107 | 110 | : | v | 11 | 1140 [1156 | 100 | 097 | 054 | 002 | oo | | v [1130 | 1054 [1128 | 100 | om | osz | 100 | 112 | | v | ss | 0762 | 0066 | 100 | om | om | om | om | | v | oz | 0630 | 08 | 100 | 098 | os86 | oos | 103 | | v [os | 076 | 08 | 10 | os | os | 088 | 000 | | v 0616 | 0660 | 1144 | 000 | 000 | oo | ow | ooo | | v | 08% | 0960 | os | 100 | 105 | o70 | os | 104 | | vy Jos | 102 [08 | 107 | 110 | om | 08 | 101 | | vy Ff osm | 0986 | 08 | 105 | 103 | 08: | os | oo8 | | vy Ff oss8 | 0891 | 096 | 103 | os | om | 128 | 006 | | vy 10 | o700 | 1018 | 106 | 086 | o7 | 070 | 08 | | a Ff os | o75 | oom | 103 | om | 112 | os | 103 | | a | osm | 06884 | om | os | 086 | 101 | om | o65 | | a Ff 102 | 0805 | 1026 | 005 | 08 | om | 112 | 00: | | a Íoss | os8m | oo2r | oo | om | 09: | os | 00 | | a | os91 | o700 | 0040 | 006 | 0686 | 110 | os6 | 080 | | a | os | 0701 | 1026 | oo | 084 | 103 | 127 | 11 | : [ a osso | 0591 [0902 | 102 | 086 | 100 | os6 | 126 | [ a [11 | oo | 117 | 103 | 101 | 086 | 105 | 103 | testadas e o Ja E | clase ar ácidodo | pH5,8 | pH5,8 pH4 demilho | pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | a | oem | 0654 | os2o | 107 | 088 | 11 | om | 10 | | a | 1040 | 0938 | 1042 | 086 | 082 | 101 | 0896 | 100 | | a | ooo | o7ei | 1050 | os | om | om | 106 | om | | a | oss6e | o6s2 | o8m | 104 | 096 | 081 | 08 | os | | a | 0654 | 0692 | osmo | 080 | o8z | om | 113 | os | | a | 1138 | 100 | 1132 | 09 | os5 | 09 | 08 | om | | a | 1136 | 1055 | 1117 | 100 | 097 | 086 | 14 | 1% | | a | 112 | 0754 | 1075 | 0898 | os6 | os | og | os | | e | os | 0636 | os57 | 102 | os | oot | 105 | oos | — le | osse | 0754 | os | 000 | 002 | 08 | o8r | o66 | | e | os | os05 | osso | 100 | 108 [ om | om | 12 | | e | osso | osso | ne22 | 100 | 102 | 104 | 08 | 107 | | e | 1054 | 0866 | 1071 | 101 | 106 | 087 | 106 | 112 | : | e | osso | os67 | os | 110 [112 [19 | 06 | os | | e | 1306 | 1187 | 1326 | 104 | 108 | 109 | o8 | 109 | : | e | 10 | 077 | 1017 | 105 | os | 098 | om | 11m | | e | 1001 | o7o7 | 1106 | 108 | 107 | 122 | 096 | 121 | | e | o782 | os21 | 0801 | 099 | os | oo | 118 | 180 | | e | os81 | 0616 | 0061 | 008 | os | 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[| s | oem | 077 | 0026 | 100 | om | o8 | om | or | | s | 1005 | ogws | 09% | os | os9 | 140 | 104 | o8 | | s | 1047 | 0869 | 1058 | 101 | 104 | 110 | 07% | 106 | | s | 1042 | 0959 | 1043 | 102 | 100 | 122 | 086 | om | | s | 1136 | 0806 | 1102 | 103 | 08 | 110 [147 | 126 | | s | 1157 | o8m | 1166 | 117 | 106 | 104 | 1056 | 112 | | s | os | os62 | osm | oos | o78 | o6i | os | om | | s | oser | oro | 097 | os5 | om | o7m5 | os8 | 100 | | s |-0203 | 0029 | 0008 | os5 | o8t | om | o7m5 | o76 | | s | oss2 | o7o7 | os | os0 | os | o68 | os | 106 | | s | 1100 | 08 | 1128 | 106 | 087 | 126 | 119 | 112 | | s | 112 | 080 | 112 | 108 | 086 | 115 | 08 | 060 | | s | oem | ora | os | 107 | 102 | 120 | 106 | 106 | ls | 1031 | 0893 | 0978 | 102 | os | 089 | 10 | os |. : | s | os | 062 | 0806 | 101 | 087 | 082 | 102 | os6 | itestadas ácidodo | pH 5,8 pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | s | osos | 0754 | 0650 | os | os2 | o68 | om | 14 | | s | os | no | 102 | 100 | 09 | 117 | 106 | 086 | | s | os: | 08652 | 0953 | 103 | 08 | 120 | 082 | 096 | | s | os | 0706 | 0801 | 089 | os | om | 086 | 103 | | s | oser | os38 | os8t | os | os | o87 | os | 106 | | s | os | 0731 | os57 | os5 | oo | 083 | o8s | 095 | | s | os | 0626 | 082 | 100 | 09 | 083 | om | 121 | [| s / om | no | 102 | os | os | 08 | om | 105 | | s | os&s | 1003 | 1005 | 102 | 090 | o87 | 106 | 06 | | s | osso | oset | oem | 104 | 106 | 086 | 102 | 106 | | s | osso | os46 | 0918 | os6 | 102 | 106 | 128 | 123 | | s | os | mo | os | 10 | 100 | 10 | om | oz | | s | 1020 | og7me | 1016 | 103 | 09 | 093 | o54 | os | i | s | 1037 | 0926 | 1024 | os | 097 | 066 | om | o75 | , | s | 1152 | 0906 | 1132 | os | 082 | o66 | 07 | om |

| s | 106 | no | 112 | 10 | 09 | om | os | 128 | | s | osoo | 0862 | 0918 | os87 | om | 07% | om | 202 | | s | os86 | 1036 | os | os | os | o7%8 | om | oo | | s | oswe | 1054 | 0088 | 105 | 110 | om | os | oo | | s | 1051 | 1061 | 1047 | 10 | 101 | os | os6 | om | | s | 112 | 1150 | 1000 | 105 | 106 | 085 | 102 | 096 | [s | 1030 | 1035 [| 1018 | 10 | 103 | 060 | o6s | 115 | | s | 1018 | 082 | 096 | 101 | 100 | 058 | 11 | 106 | | s | 1026 | 0662 | 094 | 102 | os | 067 | 089 | o63 | | s | 1119 | 0760 | 0949 | 100 | 090 | 073 | o86 | om | | s | noso | osto | oos4 | 104 | 090 | om | oss | 107 | | s | osso | os84 | 0874 | 101 | 10) | 087 | 091 | o8 | | s | 1086 | 1127 | 1089 [| 109 [112 | 121 | 109 | 092 | | s | 1110 | 1184 | 1102 | 104 [| 115 | 090 | 14 | 1387 | | s | 1197 | 1219 | 1157 | 107 | 10º | 10º | 108 | 109 | | s | 107 | 1093 | 1044 | 106 | 104 | 07 | o7x6 | 101 | | s | 183 | 1167 | 1266 | 107 | 106 | om | 1296 | 106 | | s | 1196.| osw | 118 | 107 | 102 | om | oes | 112 | '

testadas ácido do | pH5,8 PH5,8 pH4 de milho pH8 pHio tipo sel- aquecido 30min vagem | 1 | os&s | osoi | 1007 | os8r | oss5 | 109 | 10º | o86 | | 1 | ot | oem | 0910 | 00 | os | 08 | os | os | [| 1 | 1020 | 0804 | 1016 | 008 | os | 10 | 002 | os | | 7 [1120 | 1016 | 118 | 107 | 103 | 09 | 104 | 118 | | 1 [os | osm | oes8 | 100 | ost | om | 066 | om | | 1 | oss | oss2 | 0804 | 103 | 09 | 128 | 118 | om | | t+ [121 | 1060 | 1227 | 105 [ 09 | 137 | 13 | 106 | | 1 | 1003 | 0702 | 0973 | 104 | 09 | 17 | 18 | 1 | | 7 [1150 | 0770 | 1190 | 102 | 082 | o8 | 104 | 126 | | 1 [oem | ost | 00% | os | o8 | o7m5 | 104 | 086 | | 1 [os | os61 | 082 | os6 | os | os | oo | om | | t+ | 1020 | 0607 | 0904 | 080 | 080 | 104 | 08 | os | | + | oss6 | 0681 | 0030 | 100 | os | 120 | 114 | o8 | | 1 | 1006 | om | 1062 | os2 | o82 | 095 | oo | 131 | i | Tt | 1061 | 0764 | 1021 | 085 | 068 | 124 | om | os | . | 1 | 1006 | o761 | 1058 | 107 | om | 130 | 109 | om | | 1 | 102 | 0702 | os | 104 | 086 | 124 | 106 | 115 | | 1 | 1064 | 0722 | 1046 | 008 | 08 | os | om | 102 | | a | os8t | os43 | osso | 105 | 09 | 07º | om | o28 | | a | 11 | 11 | 1167 | 112 [ 106 | 079 | 120 | 07 | [| a [1132 | 1150 | 1063 | 105 | 109 | 080 | 130 | 129 | | a | 1204 | 1262 | 11623 | 10 | 106 | oe | 116 | 106 | | a | 113 | 1064 | 1105 | 106 | 105 | oe: | oo | 10 | | a | 1012 | 0861 | 0963 | 106 | 09 | 07 | oe | 120 | [ a | 1156 | 106 | 1128 | 103 | 09 | o8r | os | 105 | | a [117 | 1157 [1121 | 105 | 106 | 095 | 143 | 200 | | a [127 | 120 | 1236 | 107 | 106 | 105 | 115 | 128 | a | 1172 | 1150 | 1172 | 106 | 106 | 086 | 100 | 124 | | a | 1106 | 00098 | 1138 | 106 | 100 | 106 | 1268 | 115 | [| a 127 | 0849 | 1220 | 112 | 10 | 086 | 115 | 106 | | x | osse | 0601 | 0836 | 101 | os | 10 | om | 10 |. [ x [1001 | 0806 | 1089 | os | os | o87 | om | 060 | testadas

EEE A ácidodo | pH 5,8 PpH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | < | 0946 | ost | oser | 100 | oss | o82 | 100 | os | | <x | 1073 | 0851 | 1054 | os | os | om | om | o7 | | x | osse | oss1 | os66 | 100 | os | og | om | om | | x | sos | oews | 1030 | os | o8t | 106 | o86 | om | | x | 107 | 0895 | 1078 | os | 080 | os | om | om | [| x | 1068 | os | 1055 | 097 | oe | 100 | os | oos | | x [117 | 0854 | 1168 | 095 | oo | 084 | 085 | os | | x* | oem | os35 | 0919 | 000 | 000 | ooo | ooo | oo | | x | 1048 | 1036 | 1040 | os | os | 080 | 104 | o75 | [| x | osw6 | osot | gra | 108 | 107 | 08 | 008 | o66 | | x | oss6 | 0931 | 06268 | 087 | osr | om | om | 10 | | x [1167 | 1127 | 1172 | 10 [ 100 | 089 | oes | o6 | . | x | 1196 | 1106 | 1162 | 08 | os | o87 | 060 | om | | «x | 1050 | os48 | 1043 | 100 | os | o7%6 | om | 107 | | x 1246 | 1063 | 1240 | 107 | 089 | 080 | o8s | oss | | | x [157% | 1168 | 1604 | 09 | om | o7 | 009 | om | | P fosse | o6s62 | oem | 101 | os | om | o7m | om | | P | os0o | 0791 | oe2s | 100 | om | om | oe | 105 | | P | os | 0665 | 0681 | os | os | os2 | om | 109 | | P |] oss2 | ns67 | ns | ow | os | os | 10 | 108 | | P | os63 | 1016 | 0963 | os | 105 | 107 | 116 | 11 | | P | 1005 | 1089 | 1019 | 068 | os | 082 | om | os | | P Í oswe | 1026 | 1007 | 101 | 100 | 106 | 002 | os | | P | oss6 | os | 0827 | 100 | 086 | 115 | 088 | os | | P 102% | os07 | 0888 | om | oo | os | 136 | 151 | [| P 1067 | osm | 1066 | 104 | 100 | 103 | 115 | os | | P | osm | osma | o8ma | 100 | 098 | os | om | 105 | | P | os | 0863 | 0915 | 100 | 107 | 102 | 16 | 146 | | P | 0906 | 1083 | 0685 | 008 | 104 | 100 | 105 | 136 | | P | osso | 1068 | oses | 104 | 109 | 110 | 088 | os1 | | P | 1007 | 1108 | 1111 | 080 | 08 | 110 | 082 | os | | P | 10006 | 1121 | 1002 | 11 | 10 | 116 [126 | 126 | [| e [1166] 1065 | 1124 [| 104 | 098 | 122 | 1523 | 136 | [ P [ osor | o722 | os | 100 | os | 117 | o | os | testadas

EA A EA ácidodo | pH 5,8 | pH5,8 pH4 de milho pH8 pH10 tipo sel- aquecido 30min vagem | rR [101 | 086 | 0906 | 107 | 02 | o8r | 151 | 100 | [Rr | 1008 | 0895 | 1000 | 120 | 115 | 119 | 0686 | 104 | | R | 1190 | 1164 | 1166 | 102 | 102 | 101 | 080 | oo | [LR [14 | 1201 | 1150 | 090 | 1096 | 101 | 085 | or | [| R | oss6 | osm2 | oa | 119 | 121 | 261 | 110 | 08% | | R | 1046 | 1045 | 1020 | 10 | 107 | 115 | 0656 | o7m | | R | 1316 | 1260 | 127 | 104 | 103 | 100 | 105 | om | | Rr | 1226 | 0915 | 1205 | 112 | 104 | 128 | 154 | 129 | | R | o74e | 0600 | 0817 | 069 | 091 | 086 | 088 | o7 | | Rr | 101 | 0951 | 1000 | 101 | 100 | oo8 | o6t | oo | | Rr | 1001 | 0963 | 0981 | 103 | 110 | 119 | oes | om | | R | 1102 | 1126 | 1064 | 104 | 105 | 114 | 073 | 06 | | R | 1056 | 1005 | 1047 | 106 | 106 | 106 | 075 | 243 | [| R | 1187 | 1061 | 1162 | nor | 11 | 113 | 083 | 096 | f | R | 1231 | 1127 | 1266 | 108 | 106 | 134 | om | 125 | [| R | 1273 | 0897 | 1235 | 112 | 105 | 10 | 088 | os6 | É | » | oso2r | 0688 | os62 | 100 | oso | oe | os | oe | | p | osws | oso2 | ns | os9 | os | os | o8s | 102 | | o | oe | no | o | 020 | o28 | 1350 | 428 | 323 | |» | osso | 101 | os | oes | 105 | 120 | o8o | 101 | | p | os | 1038 | 094 | 1 | 117 | 129 | 11 | 116 | | p | os2o | 092 | oe54 | 108 | 110 | 118 | 100 | 124 | | » [3462 | 3545 | 4100 | 164 | 202 | 068 | 202 | 213 | | D | osss | os | os2 | 11 | 107 | os | oo | 154 | | » | 1063 | 0700 | 1028 | 111 | 10 | 08 | os | 100 | | D | osee | oro | osso | os8 | os | 068 | 06 | oo: | | D | osso | o7es | os6 | os | om | os | 100 | 101 | | o fi | nD | 107 | 103 | 103 | 103 | 08 | 110 | | p | osme | os27 | oos8 | 089 | 104 | 109 | 080 | 136 | | D | 1068 | 1054 | os08 | 100 | 109 | 086 | 110 | 136 | | » | 12% | 1202 | 1190 | 106 | 106 | 147 | os | 113 | [| p [1108 | 1086 | 1008 | 100 | 112 | 106 | o82 | 110 | | » | osso | 067 | 0964 | 114 | 118 | 17 [1% | 1447 | [| » | 1054 | 0897 | os06 | 110 | 107 | 120 | 080 | 142 | [ » [100 | 077 [0843 | 107 | 104 | 1206 [| 105 [| 100 | testadas ácido do | pH 5,8 pH 5,8 pH4 de milho pH8 pH1o tipo sel- aquecido 30min vagem | a | 0866 | 0704 | 0686 | os8 | osm2 | 122 | om | os | | a | 0890 | 0006 | 1015 | oo | om | 11 | os | o7% | a | 0968 | 0852 | 0953 | 00 | os | 158 | 002 | 106 | | a [1180 | 1068 | 1167 | 1065 [11 | 125 | 072 | os | | a | os% | 0820 | 087 [| 11 [11 | 158 | 070 | 119 | | a | 1047 | 0946 | 1052] | 11 [17 | 14 | 107 [ 086 | | a | os65 | o750 | 0915 | 106 [ 10 | 137 | 0656 [| 127 | | a [os | 065 | 0933 | 108 [| 105 | om | om | 124 | | a | os84 | 057% | 0862 | 100 | 08 | o6 | o6s | o7 | | a | os | 0549 | 0837 | os | om | o8 | om | om | | a | os | 0656 | 0956 | oo | os | 102 | 06 | 106 | | a | os: | os | 0000 | 006 | 08 | os | 102 | 115 | | a | osmo | 0605 | 0912 | 100 | os | 130 | 107 | 127 | | | a 106 | 1057 | 10238 | 105 [ 102 | 127 | 080 | os | | | a Jos | os81 | 091 | 103 [| 1% | 10 | o8 | 109 | | e 1006 | 067 | 107 | om | om | om | 166 | 165 | | e | os6 | 0746 | 0940 | 103 [ os | om | 130 | o8s | | e [114 | 00 | 1170 | 103 | 09 | om | om | os | | e | 1106 | 0029 | 1058 | os | os | os5 | o63 | os6 | | e [115 [107 | 1208 | 107 | 101 | 116 | 002 | 120 | [| e | 1545 | 1287 [1568 | 113 | 10 | 118 | 08 | o86 | | e | 1208 | 0701 | 1168 | 108 | 102 | 112 | 085 | 11 | | e 104 | 0526 | 10190 | 006 | 086 | 082 | ox | 105 | [| e | os% | 0722 | os8 | 101 | om | os | om | 123 | | e | 1360 | 0675 | 1446 | 070 | om | o7 | os6 | om | | e | 1080 | 0852 | 1109 | 106 | 088 | 106 | o8s | 126 | | e | oss | 0745 | 0802 | 106 | 103 | 095 | 138 | 159 | : [ e | 117 | 07: [1149 | 107 | o | 106 | 106 | 102 | testadas ácidodo | pH5,8 | pH5,8 | pH4 demilho | pH8 pH10 tipo sel- aquecido 3omin vagem | e 122 | 0804 | 1274 | 112 | 09 | 116 | 09 | 113 | | e | 1087 | 1013 | 1039 | o7m5 | os | 124 | 087 | 101 | | e | 1103 | o6ot | 1085 | 106 | 090 | 108 | 104 | 130 | | =s | 1016 | 0951 | 0528 | 058 | os | oo8 | os80 | o97 | | s | 0893 | osso | css | om | os5 | os5 | 116 | o63 | | s | 1026 | 0697 | 0000 | 102 | 102 | 116 | o7 | 08 | Ls |1m | 127 [117 | 10 | 10 | 09 | 115 | 10 | | s | 10m6 | 1266 | 1219 | 086 | om | om | os | os | | s [112 | 1186 | 1109 | 100 | 092 | 103 | 060 | 114 | | s | 12% | 113 | 1208 | 085 | 08 | 110 | 09% | 127 | | s | 1135 | 083 | 1155 | 09 | 080 | 092 | 11 | 08 | | s [10 | os | osm | os | om | os | o7x6 | 082 | | s | 1017 | 1002 | os8s | ot | os8r | 105 | 06 | os6 | i | =s | 1008 | 0904 | 1004 | 084 | 09 | 085 | os8 | om | | s | os | osm | 0025 | om | om | 097 | om | om | | | s | 117 | 116 | 1179 | 086 | om | 103 | o57 | o6 | | s 1201 | 1166 | 1160 | 106 | 096 | 104 | om | 108 | | s | 1206 | 107% | 117 | oso | o7 | os | 062 | om | | n | 1054 | 0954 | 1022 | 087 | os | 083 | ones | o63 | | n | 1103 | 0900 | 1075 | 102 | 105 | 089 | 102 | o7%6 | | nº [1180 | 07523 | 1084 [| 11 | 110 | 141 | 106 | 124 | | n | 1202 | 0881 | 1167 | 105 | 100 | 108 | 09 | os | [ n | o685 | 0401 | 0735 [| 076 | o75 | 07º | o75 | om | Com base nos dados de desempenho relativo de variantes de AmyE quanto às propriedades descritas nas Tabelas 2, 4 e 5, as posições de AmyE de comprimento integral e truncada foram classificadas como se- gue: Posições totalmente restritivas: quaisquer mutações neutras pa- ra qualquer propriedade testada Posições não totalmente restritivas: pelo menos uma mutação neutra para uma das propriedades testadas

Posições não restritivas: > 20% mutações neutras para pelo me- nos uma propriedade

A Tabela 6 mostra as posições não-totalmente restritivas e a i- dentidade do resíduo de aminoácido do tipo selvagem em cada posição nas variantes de AmyE truncadas, junto com a % de mutações neutras para ca- da propriedade.

Todas as posições listadas podem ser mutadas para alterar o desempenho da maneira desejada para qualquer uma das propriedades testadas.

A Tabela 7 mostra as posições não-totalmente restritivas e os resí- duos de aminoácido do tipo selvagem em cada posição nas variantes de AmyE de comprimento integral, com a % de mutações neutras para cada propriedade.

Novamente, todas as posições listadas podem ser mutadas para alterar o desempenho da maneira desejada para qualquer uma das propriedades testadas.

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Como será aparente a partir do relatório acima, certas posições podem ser mutadas em polipeptídeos de AmyE para alterar uma ou mais propriedades sem substancialmente afetar de modo adverso qualquer pro- priedade.

Essas mutações são coletivamente referidas como mutações combináveis para propriedades de superfície.

Tais posições são boas candi- datas para produção de mutações únicas, e combinações de mutações, uma vez que elas são geralmente tolerantes à manipulação.

Por outro lado, mu- tações nessa posição dão propriedades distinguíveis às variantes de AMyE resultantes, indicando que elas são importantes para estrutura e/ou função deenzima.

Posições correspondentes em outras amilases parentais, incluin- do a-amilase outra que não AmMyE, podem ser similarmente mutadas.

Em alguns casos, onde a posição correspondente em outras amilases parentais incluir um resíduo de aminoácido diferente, ela pode ser mutada para incluir um resíduo de aminoácido encontrado em um polipeptídeo de AmyE do tipo selvagem.

As posições são como segue: 052D, 052E, 052], 052K, 052L, i O52N, 052Q, 052R, 052V, O56D, 056E, 0561, 056K, 056L, O56N, 0560, - O56R, O56V, O89D, 089E, 089l, 089K, 089L, OS89N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 1521, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153], 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 2011, 201K, 201L, 201N, 2010, 201R, 201V, 251D, 251E, 2511, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 2841, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 2971, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 3081, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321l, 321K, 321L, 321N, 3210Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328|, 328K, 3281, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D,347E, 347, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357], 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359], 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369|, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 3851], 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 3881, 388K, 3881, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 3911, 391K, 391L, 391N, 3910, 391R, 391V, 400D, 400E, 4001, 400K, 400L, 400N, 4000, 400R, 400V, 416D, 416E, 4161, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R e 416V.

Mu- tações em todas essas mutações têm valores de Pl> 0,5 para ambas a pro-

teina e a atividade, demonstrando que posições podem ser mutadas sem destruir a expressão ou desempenho da proteína. Exemplo 17 Liquefação no Viscômetro Redução da viscosidade de farinha de milho devido à ação da a- amilase foi monitorada usando um instrumento Viscotester 550 HAAKE. A pasta fluida de substrato é feita diariamente fresca em modo de batelada com sólidos secos de farinha de milho 30%. O pH foi ajustado para 5,8 u- sando ácido sulfúrico. 50 g da pasta fluida (15 g de sólidos secos) são pesa- dose pré-incubados, com agitação, por 10 minutos para aquecer para 70º C. Quando da adição de a-amilase a temperatura é imediatamente aumentada de 70º C para 85º C com uma velocidade giratória de 75 rpm. Uma vez a temperatura da pasta fluida e da mistura de enzima tendo atingido 85º C, sua temperatura é mantida constante e a viscosidade é monitorada por mais 30 minutos. A viscosidade foi medida em toda a rodada e é relatada em uNm.

: AmyE do tipo selvagem (comprimento integral ou truncada) e vá- rias variantes da mesma foram dosadas em a partir de cerca de 0,25 a 1,5 mg/50 g de pasta fluida de farinha de milho e a viscosidade registrada.

Um gráfico típico da viscosidade da pasta fluida com o tempo é mostrado na figura 15, onde a AmyE de comprimento integral do tipo selva- gem e as variantes de comprimento integral de AmyE 1100F e W60M são comparadas. Em outros casos, apenas o pico e a viscosidade final da pasta fluida são tabulados. Os resultados para AmyE do tipo selvagem, de com- primento integral, e as variantes L142F, L142G, L142Q, L1428S, L142W, L142Y, A2141, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, Si13iL e S2541, produzidas na base de AmyE de comprimento integral, são mostra- dos nas Tabelas 8 e 9. Os resultados para AmyE do tipo selvagem, trunca- da, e as variantes W60L, W6OM, W6ON, N100F, 1100M, S105M, S105W, G207A,T270A,T270E, T270L, T27ON, T270V e T279A, produzidas na base de AmyE truncada, são mostrados na Tabela 10.

Tabela 8. Viscosidades de pico e final obtidas usando AmyE do tipo selvagem e variante truncada (saco de farinha de milho F

Viscosidade de o sema [o vscosctema Lo rmBro | eso | 260 | 6sso | Lo eM26o | os | 29600 | 1825 | | tmM20 | oa | gsm | "2800 -— | | mes | oa | 300 | 2465 | | eae | 20 | 2760 | 190 | aa | ao | 2170. | 566 | | say | 140 | 26600 | so | | eso | so | oo ao | | eme ao as as | | | emo | so | 28300 | 520 | : Lost | so | 2600 | aso | Tabela 9. Viscosidades de pico e final obtidas usando amyE do tipo selvagem e variante truncada (bolsa de farinha de milho G. o ae oo Tese dose (mg) pico viscosidade final LOW eso 3360 | so | | LM42r | oas | 2860 | 70 || | rm26o | oo | 2560 | 260 | | L120 | o3o | 260 | as0 | | 1m28 | 02 | 310 | 1100 | Leo | os | 2860 | são | Lao os | 260 | 7% | | ess | os | "3240 | 200 | [osso 1820 |

Tabela 10. Viscosidades de pico e final obtidas usando amyE do tipo selvagem e variante truncada (bolsa de farinha de milho H rn aee HE eme dose (mg) pico viscosidade final [me [os [am | eo | wma 2220 | own oo | somo | axso = | |omem | om | 29200 | 80 | | somw | om | 300 | 160 | [ema [om q 2 | sm |ore | oo | 33200 | 1300 Edessa rs Toro dooseoa o ma a [eme | sm Desempenho aprimorado no ensaio de viscômetro pode ser i- dentificado usando vários critérios, isto é, viscosidade de pico menor, visco- sidade final menor ou uma dose de enzima menor requerida para produzir viscosidades de pico ou finais similares com relação à dose requerida para uma enzima de referência (controle). O texto em negrito nas Tabelas 9-10 indica os critérios com os quais cada variante demonstra desempenho apri- morado comparado com o respectivo controle do tipo selvagem.

Exemplo18 Termoestabilidade de AMyE de comprimento integral, AmyET-tr e vari- antes de AmyE usando Calorimetria Diferencial de Varredura Curvas de capacidade de calor em excesso foram medidas u- sando um microcalorímetro de alto rendimento de varredura ultrassensível, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA). O procedimento pa-

drão para medições de DSC e a teoria da técnica são previamente publica- dos (Freire, E. (1995) "Differential Scanning Calorimetry Methods". Mol.

Biol. 41:191-218). Aproximadamente 500 ul de 0,5 mg/ml de AmyE-tr ou varian- tes de AmyE truncada foram digitalizados em faixa de temperatura de 30- 120º C.

A mesma amostra foi então novamente digitalizada para checar a reversibilidade do processo.

O tampão usado era acetato de sódio 10 mM, pH 4,0 ou pH 5,8. Uma taxa de digitalização de 200º C/h foi usada para mi- nimizar quaisquer produtos que possam resultar de agregação.

O ponto mé- dio térmico (Tm) das curvas de DSC foi usado como um indicador da estabi- lidade térmica.

A Tabela 11 mostra os valores de Tr de AmyE truncada do tipo selvagem e variantes de AMyE truncada testadas em pH 4,0 e pH 5,8. de AmyE truncada ento o es | 75 | - truncada 74,9 o ER E Exemplo 19 Endurecimento de Pão Os exemplos que seguem referem-se ao uso de um polipeptídeo deAmyE para reduzir endurecimento de pão.

A.

Receita para Testes para Assar Testes para assar foram realizados com uma receita de esponja e massa de pão branco padrão para torrada americana.

A massa de esponja é preparada a partir de 1400 g de farinha "Gold Medal" da General Mills, USA, 800 g de água; 40 g de óleo de semente de colza, 7,5 g de GRINDS- TEDº SSL P55 Veg, 10 g de emulsificante DIMODANº PH20 e 60 g de leve- dura comprimida. A esponja é misturada por 1 minuto em velocidade baixa e subsequentemente 3 min em velocidade 2 em um misturador espiral Hobart. A esponja é subsequentemente fermentada por 3 horas a 25º C, UR 85%.

Em seguida, 600 g de farinha "Gold Medal", 18 g de levedura comprimida, 5 g de propionato de cálcio, 160 g de sacarose, 5 g de propio- nato de cálcio, 432 g de ácido ascórbico (concentração final 60 ppm) e ADA (azodicarbonamida; concentração final 40 ppm) são adicionados à esponja. A massa resultante é misturada por 1 minuto em velocidade baixa e então 2 min em velocidade alta em um misturador Diosna. Entao 30 g de sal são a- dicionados à massa.

A massa é deixada descansar por 5 min em temperatura ambi- ente e então 550 g de pedaços de massa são feitos de acordo com um ta- | manho, moldados em abridor de massa Glimek com os ajustes 1:4, 2:4, : 3:15, 4:12 e largura 8 em ambos os lados e transferidos para uma forma de assar. Depois de prova por 65 min a 43º C em UR de 95% as massas são assadas por 26 minutos a 200º C em um forno MIWE. B. Protocolo para Avaliação de Firmeza, Resiliência e Coe- são Firmeza, resiliência e coesão são determinadas através da aná- lise de fatias de pão através da Texture Profile Analysis usando um Texture Analyser From Stable Micro Systems, UK. Cálculo de firmeza e resiliência é feito de acordo com o padrão pré-ajustado pela Stable Micro System, UK. A sonda usada é redonda de alumínio de 50 mm.

O pão é fatiado com a largura de 12,5 mm. As lâminas são pren- sadas para um pedaço circular com um diâmetro de 45 mm e medidas indi- vidualmente.

Os ajustes que seguem são usados: Velocidade de Pré-teste: 2 mm/s, Velocidade de Teste: 2 mm/s, Velocidade Pós-teste: 10 mm/s, Distân- cia de Teste de Ruptura: 1%, Distância: 40%, Força: 0,098 N, Tempo: 5,00 seg, Cont: 5, Carga: 5 kg; Tipo de Disparo: Auto — 0,01N.

O modo de compressão é uma modificação do modo usado em Método padrão AACC 74-09. A amostra é comprimida duas vezes no teste.

C.

Protocolo para Avaliação de Firmeza A firmeza foi determinada em uma compressão de 40% durante a primeira compressão.

A figura é a força necessária para comprimir a fatia para 40% da espessura total.

Quanto menor o valor, mais macio é o pão.

À firmeza foi expressa como uma pressão, por exemplo, em hPa.

D.

Propriedades de Manuseamento Aprimoradas de Produ- tos Alimentícios Testados com um Polipeptídeo de Variante de AMyE Pão foi assado com 0,4 mg/kg de AmyE-tr e a firmeza do pão é testada de acordo com os protocolos mostrados acima em vários momentos após assar.

A firmeza do pão foi testada.

Como um controle, firmeza de pão assado sem uma enzima é também medida.

A figura 16 mostra os resultados de um teste de assar onde a : firmeza de pão tratado com AmyE-tr foi comparada com a firmeza de pão ' sem enzima.

Um aumento reduzido em firmeza a partir do dia 1 ao dia 14 no pão assado com AmyE-tr indicou que a enzima tem efeito antiendurecimento e pode aprimorar a capacidade do pão em se manter fresco.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para liquefação e sacarificação de amido em um pro- cesso de conversão de amido, caracterizado pelo fato de que compreende contato de um substrato de amido com um polipeptídeo de Am- yE para formar uma mistura de reação para liquefação e sacarificação do substrato de amido na mistura de reação para produzir glicose, em que a liquefação e a sacarificação são realizadas na mesma mistura de reação sem um ajuste do pH.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a sacarificação é realizada na ausência de um polipeptídeo adi- cional tendo atividade de glicoamilase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a liquefação é realizada em um pH adequado para a atividade de um polipeptídeo de glicoamilase.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo ' fato de que o pH é 5,0 ou menor. .

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o pH é 4,5 ou menor.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fatodequeopHé4o0 ou menor.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase é adi- cionado à mistura de reação antes do contato do substrato de amido com o polipeptídeo de AmyE.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase é adi- cionado à mistura de reação após contato do substrato de amido com o poli- peptídeo de AmyE.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que um polipeptídeo adicional tendo atividade de glicoamilase é adi- cionado à mistura de reação simultaneamente com contato do substrato de amido com o polipeptídeo de AMyE.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fermentação de glicose produzida através de liquefação e sacarificação para produzir um álcool.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatodequeo álcool é etanol.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que pelo menos uma porção da sacarificação e da fermentação acontece na mesma mistura de reação simultaneamente.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende ainda contato da glicose produzida através de lique- fação e sacarificação com uma glicose isomerase para produzir frutose.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cálcio exógeno não é adicionado à mistura de reação.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de cálcio na mistura de reação é menos do que , cerca de 8 ppm.

. 16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda contato da glicose produzida através de liquefação e sacarificação com uma glicose isomerase para produzir frutose sem reduzir a quantidade de cálcio na mistura de reação.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de AmyE tem pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o polipeptídeo de AmyE tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de AmyE inclui uma deleção do domínio de liga- ção de amido C-terminal.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptíideo de AmyE é um polipeptídeo variante tendo ativi- dade de a-amilase e pelo menos uma característica alterada que aprimora o desempenho da enzima, o polipeptídeo variante compreendendo: uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60% de identi- dade de sequência de aminoácido com um polipeptídeo de a-amilase paren- tal selecionado de AmyE (SEQ ID NO: 1) ou uma variante truncada de AMyE

(SEQIDNO:2))e uma modificação em uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59,60,61,62,63,64, 65,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, ' 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, . 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221,222,223,224,225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298,299,300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374,375,376,377,378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418,

419, 420, 421, 422,423, 424 e 425; em que a modificação produz um polipeptídeo variante tendo um índice de desempenho (PI!) maior do que 1,0 para pelo menos uma caracte- rística que aprimore o desempenho da enzima.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe- lo fato de que a modificação é uma substituição de um ou mais resíduos de amina presentes no polipeptídeo parental por resíduos de aminoácido dife- rentes selecionados do grupo consistindo em 1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 18, 1T, IV, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 21, 2K, 2L,2M,2N,2P,20, 2R, 28, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 31, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 41, 4K, 4L, 4M, 4N, 40Q, 48, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 51, 5K, 5L, SN, SR, 5V, SW, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, GN, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 76, 7H, 71, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 78, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C,8E,8F, 8G, 8H, 81, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 1 9D, 9E, 9F, 9H, 91, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 97, 9V, 9W, 9Y, 10A, 101, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 108, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 118, 19V, 19W, 11Y, 121, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 131, 13L, 13M, 130, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 148, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A,16D,16E, 16F, 16G, 16H, 161, 16L, 16M, 16Q, 168, 161, 16V, 17A, 17F, 171, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 180, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 208, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 211, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 218, 21V,221,22M, 220, 228, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 231, 23L, 23M, 23N, 23R, 238, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 241, 24N, 24P, 24Q, 24R, 248, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 251, 25K, 25L, 25R, 258, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26], 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 271, 27L, 27M, 27N, 27P, 270Q,27R, 278, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 281, 28K, 281, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 288, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M,

3ON, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 311, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 318, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 320, 328, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 331, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 341, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 351, 35L, 356M, 35N, 35P, 350, 35R, 358, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 361, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 391, 39L, 39M, 39N, 39P, 398, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N,418, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 430, 438, 43T, 43V, 440, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 441, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 448, 44T, 44V, 44W, 44X, 450, 45C, 45F, 45G, 45H, 45), 45L, 45M, 45N, 45P, 450, 458, 45T, 45Y, 460, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 461, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 468, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 476, 47H, 471, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 478, 47T, 47V, 47X, 480, Í 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 481, 48K, 48L, 48N, 48P, 488, 48T, 48V, 48W, . 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 491, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 498, 497, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 501, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 508, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51), 51K,51L,51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 518, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 521, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 528, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 531, 53L, 53N, 53P, 53R, 538, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 541, 54L, 54M, 54N, 54P, 540, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, —5651,55N,55P, 550, 558, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 561, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 560, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 571, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 578, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 598, 59T, 59V, 59W, 60A, 6OC, 60D, 60E, 60G, 601, 6OK, 60L, SOM, 6ON, 60Q, —6OR, 60T, 6OV, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 618, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 621, 62K, 62L, 62Q, 628, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 641, 64L, 64M, 64N,

648, 64V, 64Y, 65A, 65C, 65E, 65H, 651, 65K, 65L, 65M, 65Q, 65R, 658, 66D, 66E, 66F, 66G, 66H, 661, 66K, 66L, 66M, 66N, 66Q, 66R, 661, 66V, 66W, 66Y, 67A, 67C, 67D, 67E, 67F, 67G, 671, 67K, 67L, 67N, 67P, 67Q, 67S, 67T, 67W, 68A, 68C, 68D, 68E, 68F, 68G, 68H, 681, 681, 68M, 68N, 68P,68R,68S,68T,68V, 68W, 68Y, 69A, 69C, 69M, 69P, 69T, 69V, 70A, 70E, 70H, 7ON, 708, 718, 72C, 72D, 72E, 72F, 72G, 72H, 721, 72K, 72L, 72P, 72Q, 728, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73A, 73C, 73E, 73F, 73H, 731, 73K, 73L, 73M, 73P, 738, 73T, 73V, 73W, 74A, 74E, 74F, 74M, 748, 74T, 74Y, 75A, 75C, 75D, 75E, 75P, 76A, 76D, 76E, 76F, 76G, 761, 76L, 76M, 76P, 76Q,76R, 768, 76V, 76Y, 77A, 77C, 77D, 77G, 77H, 771, 77K, 77L, 77R, 778, TTT, T7V, TTW, 77Y, 78A, 78C, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 781, 78K, 78L, 78M, 78N, 78P, 78R, 78S, 78T, 78V, 78W, 78Y, 79A, 79G, 79L, 79M, 79N, 79Q, 798, 79T, 80A, 80L, 80M, 8O0W, 80Y, 81A, 81C, 81D, 81E, 81G, 81H, 811, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 818, 81T, 81V, 81W, 81Y, 82A, 82D, 82F,82G, 821, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82V, 82W, 82Y, 83A, " 83F, 831, 83L, 83T, 83V, 84A, 84D, 84E, 84G, 841, 84K, 84M, 84N, 84Q, 848, 84T, 84V, 85D, 85E, 85F, 85G, 851, 85K, 851, 85M, 85N, 85R, 858, 85T, : 85V, 85W, 86C, 86D, 86E, 86F, 86G, 861, 86K, 861, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87F, 87G, 87T, 88A, 88C, 88D, 88F, 88G, 88H, 88l, 88K,88L,88M, 88N, 88Q, 88R, 88S, 88T, 88V, 88W, 88Y, 89A, 89C, 89D, 89F, 89G, 89H, 89l, 89K, 89L, 89M, 89N, 89P, 89Q, 89R, 89S, 89T, 89V, 89W, 89Y, 90C, 90D, 90E, 90F, 90G, 90H, 901, 90K, 90L, 90M, 90N, 90Q, 90R, 90S, 90T, 90V, 90W, 91A, 91C, 91D, 91E, 91F, 91H, 91K, 91L, 91M, 91N, 91P, 91Q, 91R, 918, 91T, 91W, 91Y, 921, 92N, 927, 92V, 93A, 93C, 93D,93E,93F, 93G, 931, 93L, 93M, 93N, 93P, 93Q, 93R, 938, 93T, 93V, 93W, 93Y, 94A, 94C, 941, 94M, 94T, 95A, 95F, 95L, 95M, 95V, 95Y, 96A, 96C, 961, 96L, 96M, 96P, 96T, 97A, 97E, 97M, 97W, 98C, 98G, 981, 98L, 98M, 98T, 98V, 99A, 99C, 99E, 99F, 99G, 99l, 99L, 99M, 99N, 99P, 99S, 99T, 100A, 100C, 100F, 100M, 100N, 100P, 100T, 100V, 100Y, 101A, 102A, 102G, 102Q, 1028, 102W, 102Y, 103A, 103C, 1031I, 103M, 103N, 1038, 103V, 104A, 104C, 1048, 105C, 105D, 105E, 105F, 105G, 105H, 105K, 105L, 105M, 105Q, 105R, 105T, 105V, 105W, 105Y, 106A, 106C, 106E,

106F, 106H, 1061, 106K, 106L, 106M, 106N, 106Q, 106R, 106S, 106T, 106V, 106W, 106Y, 107A, 107C, 107E, 107F, 107G, 107H, 1071, 107K, 107L, 107M, 107N, 107P, 107Q, 107R, 1078, 107T, 107V, 107W, 108C, 108D, 108E, 108F, 108G, 108H, 1081, 108K, 108L, 108N, 108P, 108R, 108S, 108T, 108V, 108W, 108Y, 109C, 109D, 109E, 109F, 109G, 109H, 1091I, 109K, 109L, 109M, 109N, 109P, 109R, 109S, 109T, 109V, 109W, 109Y, 110L, 110M, 110V, 111A, 111C, 111E, 111F, 111G, 111H, 1111, 111K, 111L, 111M, 111N, 111P, 111Q, 111R, 1117, 119V, 119W, 111Y, 112A, 112C, 112D, 112E, 112F, 112G, 112H, 1121, 112K, 112L, 112M, 112P, 1120, 112R, 1128, 112T, 112V, 112W, 112Y, 113A, 113D, 113F, 113G, 113), 113K, 113L, 113M, 113N, 113P, 113Q, 1138, 113T, 113V, 113W, 113Y, 114F, 114L, 114P, 114T, 115A, 115C, 115F, 115G, 115H, 1151, 115L, 115M, 115N, 115Q, 115R, 1158, 115T, 115V, 115W, 115Y, 116A, 116D, 116E, 116F, 116G, 116H, 1161, 116L, 116N, 1160, 116R, 11671, 116V, 116W,

15. 116Y, 117F, 117L, 117N, 1170, 197V, 117W, 117Y, 1184, 118C, 118D, ' 118E, 118F, 118G, 118H, 1181, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, . 1188, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119A, 119C, 119D, 119E, 119F, 119G, 119H, 1191, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119R, 1198, 119T, 119V, 119Y, 121A, 121M, 121N, 1218, 122R, 123E, 124A, 124C, 124D, 124E, 124F, 124G, 124l, 124K, 124M, 124Q, 124R, 1248, 124T, 124V, 124Y, 125A, 125D, 125E, 125F, 125G, 125H, 1251, 125K, 125L, 125M, 125N, 125P, 1250, 125R, 1258, 125V, 125W, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 1261, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 1268, 126T, 126V, 126W, 126Y, 127C, 127L, 127M, 127V, 128A, 128C, 128D, 128E, 128F, 128G, 128H, 1281, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 1288, 128T, 128V, 128Y, 129A, 129C, 129D, 129E, 129F, 129H, 1291, 129K, 129L, 129M, 129R, 1298, 129T, 129V, 129Y, 130A, 130C, 130D, 130F, 130G, 130H, 130l, 130K, 130L, 130M, 130P, 130R, 130T, 130V, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131E, 131F, 131G, 131H, 1311, 131K, 131L, 131M, 131N, 1310, 131R, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132A, 132C, 132E, 132H, 1321, 132L, 132M, 132N, 1320, 1328, 132W, 132Y, 134C, 134D, 134E, 134F, 134G, 134lI, 134L, 134M, 134N, 134R, 1348, 134T, 134V, 134Y, 135A, 135C, 135E, 135M, 135N,

135Q, 135R, 136A, 136C, 136F, 136L, 136T, 136Y, 137C, 138A, 138C, 138F, 138H, 138N, 138R, 138W, 138Y, 139A, 139C, 139G, 139H, 139L, 139M, 139S, 140A, 140C, 140F, 140G, 141A, 141F, 141H, 141P, 141Q, 1418, 141T, 141V, 141Y, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 1421, 142K,

142M, 1420, 142R, 1428, 142T, 142W, 142Y, 143A, 143C, 143D, 143F, 143K, 143L, 143M, 143N, 1430, 143R, 1438, 143W, 144G, 1448, 144T, 144V, 144W, 145W, 146A, 146E, 146M, 146T, 147C, 147F, 147H, 1471, 147L, 147N, 147P, 147Y, 148A, 148C, 148F, 148H, 148K, 148M, 148R, 148Y, 1498, 150A, 150H, 150N, 1508, 151A, 151C, 151D, 151E, 151F,

151G, 151H, 1511, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151R, 1518, 1517, 151V, 151Y, 152A, 152C, 152D, 152E, 152F, 152G, 152H, 1521, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 1528, 152V, 152W, 152Y, 153A, 153C, 153D, 153E, 153F, 153G, 153H, 1531, 153K, 153L, 153M, 153N, 153P, 153R, 1538, 153T, 153V, 153W, 153Y, 154A, 154C, 1541, 154N, 154P,

1540,1548S,154T, 154Y, 155A, 155C, 155E, 155F, 155G, 155H, 1551, 155L, Ú 155M, 155T, 155V, 155W, 156A, 156C, 156D, 156E, 156F, 156G, 156H, . 1561, 156K, 156L, 156N, 1560, 156R, 1561, 156V, 156W, 156Y, 157A, 157C, 157F, 157H, 1571, 157M, 157T, 157V, 158A, 158F, 158H, 1581, 158M, 158Q, 1588, 158T, 158V, 159A, 159C, 159E, 159F, 159G, 159H, 159I, 159L,

159M, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 159W, 159Y, 160A, 160C, 160D, 160E, 160F, 160G, 160H, 160l, 160K, 160L, 160M, 160N, 160Q, 160S, 160T, 160V, 160W, 160Y, 161A, 161C, 1616, 161H, 161K, 161L, 161M, 161N, 1618, 162A, 162C, 162E, 162F, 162], 162M, 162V, 163A, 163C, 163E, 163F, 163G, 163H, 1631, 163K, 163L, 163N, 163Q, 163R, 1638, 163T,

163V, 163W, 163Y, 164A, 164F, 164G, 164H, 1641, 164L, 164M, 164N, 164Q, 1648, 164T, 164V, 164W, 164Y, 165C, 165G, 1651, 165L, 165M, 165Q, 1658, 165T, 165V, 165W, 165Y, 166A, 166C, 166D, 166E, 166F, 166G, 166H, 1661, 166K, 166M, 166N, 166Q, 166R, 166S, 1667, 166V, 166W, 166Y, 167A, 167C, 167D, 167E, 167F, 167G, 167H, 1671, 167K,

167L, 167M, 167Q, 167R, 1678, 167T, 167V, 167W, 167Y, 168C, 168E, 168F, 168G, 1681, 168K, 168L, 168M, 168N, 168S, 168T, 168V, 168W, 168Y, 169L, 170C, 170G, 170V, 171A, 171C, 171E, 171F, 171G, 171H, 1711,

171L, 171M, 171N, 1710, 171R, 171V, 172A, 172C, 172E, 172F, 172P,

1731, 173M, 173V, 173Y, 174D, 174E, 174G, 174H, 174L, 1740, 174V, 174Y, 175H, 175M, 175W, 175Y, 176E, 176F, 1761, 176K, 176L, 176V, 176Y, 177C, 1776, 177M, 177Q, 1778, 178C, 178G, 178M, 1788, 178T,

179A, 179C, 179G, 179H, 179l, 179L, 179M, 179P, 1798, 179T, 179V, 179W, 179Y, 180A, 180D, 180M, 180N, 180Y, 181A, 181C, 181L, 181M, 181V, 182A, 183C, 183M, 184A, 184C, 184D, 184E, 184F, 184G, 184H, 1841], 184K, 1841, 184M, 184N, 184Q, 184R, 184S, 184T, 184V, 184W, 184Y, 185C, 185E, 185N, 1858, 185T, 186E, 187A, 187C, 187D, 187E,

187F,187H, 1871, 187K, 187L, 187M, 187N, 187P, 187Q, 187R, 1878, 187T, 187V, 187W, 187Y, 188A, 188C, 188D, 188E, 188F, 188G, 1881, 188K, 188L, 188M, 188N, 188P, 188Q, 188R, 188T, 188V, 189F, 189W, 190A, 190C, 190E, 190F, 190H, 190K, 190L, 190M, 190Q, 190R, 190S, 190W, 190Y, 191A, 191L, 191T, 191Y, 192D, 192E, 192F, 192G, 1921, 192K, 192L,

— 192N,192P,192R, 1928, 192T, 192V, 193A, 1931, 193L, 193M, 1941, 195A, Í 195C, 195D, 195F, 195G, 195H, 1951, 195K, 195L, 195M, 195N, 1950, ' 195R, 1958, 195T, 195V, 195W, 195Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196G, 196H, 1961, 196K, 196L, 196M, 196Q, 196R, 196S, 1961, 196V, 196W, 196Y, 197A, 197C, 197F, 197L, 1978, 197T, 197V, 198A, 198C,

198G, 198H, 1981, 1981, 198M, 198N, 198R, 198S, 198V, 199A, 199C, 199D, 199E, 199F, 199G, 199H, 199l, 199L, 199M, 199P, 199R, 199S, 1997, 199V, 199Y, 200A, 200C, 200D, 200E, 200F, 200G, 200H, 200I, 200K, 200L, 200M, 200N, 200P, 200Q, 200R, 200S, 200V, 200W, 200Y, 201A, 201C, 201D, 201E, 201F, 201G, 201H, 201l, 201K, 201L, 201M, 201N, 201P,

2010, 201R, 201T, 201V, 201W, 201Y, 202C, 202F, 202G, 2021, 202K, 202L, 202M, 202N, 202P, 202Q, 202R, 2028, 202T, 202V, 202Y, 203A, 203C, 203F, 203G, 2031, 203K, 203L, 203N, 203P, 203Q, 203R, 2038, 2037, 203V, 203W, 203Y, 204A, 204C, 204E, 204l, 204L, 204M, 204T, 204V, 204W, 204Y, 205A, 205C, 205D, 205E, 205F, 205G, 205H, 2051, 205K,

205L, 205M, 205N, 205R, 2058, 205T, 205V, 205W, 205Y, 206F, 207A, 207C, 207M, 208K, 208N, 208R, 209C, 209F, 209L, 209M, 209T, 209V, 210F, 210I, 210V, 210W, 211A, 211C, 211D, 211E, 211G, 211H, 211WM,

211P, 2118, 211T, 211W, 211Y, 212A, 212C, 212E, 212G, 212H, 212N, 212P, 212Q, 2128, 212T, 212Y, 213A, 213C, 213D, 213E, 213F, 2136, 213H, 2131, 213K, 213L, 213M, 213P, 213Q, 213R, 213T, 213V, 213Y, 214C, 214D, 214F, 214G, 214l, 214K, 214L, 214M, 214N, 2140, 214R,

2148, 214T,214V, 214W, 214NY, 215A, 215C, 215H, 215T, 216C, 216K, 217E, 217F, 217G, 2171, 217K, 217M, 217N, 217P, 217Q, 217R, 2178, 217T, 217V, 217Y, 218C, 218D, 218E, 218F, 218G, 218H, 2181, 218K, 218L, 218M, 218N, 218P, 218Q, 218R, 218S, 218T, 218V, 218W, 218Y, 219C, 219D, 219F, 219G, 219H, 2191, 219K, 219L, 219M, 219N, 2190, 219R,

2198, 219T, 219V, 219W, 219Y, 220F, 221C, 221E, 221G, 2211, 221L, 221M, 221N, 2210, 221R, 2218, 221T, 221V, 221Y, 222A, 222C, 222D, 222F, 222G, 2221, 222K, 222M, 222P, 222R, 2228, 222T, 222V, 223A, 223C, 223E, 223F, 223H, 2231, 223L, 223M, 223N, 2230, 223V, 223W, 2241, 224L, 224V, 224Y, 225A, 225C, 225E, 225F, 225H, 2251, 225K, 225L, 225M,

225N, 225P, 225Q, 2258, 225T, 225V, 225W, 225Y, 226A, 226C, 226F, ] 2261, 226L, 226M, 226T, 227A, 227C, 227D, 227E, 227G, 227M, 2278, : 228C, 228D, 228M, 228N, 228P, 2288, 228T, 228V, 229C, 229D, 229E, 229F, 229G, 229H, 229M, 229N, 229Q, 229R, 229T, 229V, 229Y, 230A, 230D, 230E, 230F, 230G, 230H, 230l, 230K, 230M, 230P, 230Q, 230R,

2308, 230V, 230Y, 231A, 231C, 231H, 231L, 231M, 231Q, 231W, 232A, 232C, 232M, 232N, 232Q, 2328, 232Y, 233A, 233C, 233D, 233E, 233F, 233G, 2331l, 233K, 233L, 233M, 233N, 233P, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234L, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235C,

235F,235L,235M, 235T, 236A, 236C, 236D, 236E, 236G, 236H, 236], 236K, 2361, 236M, 236N, 236Q, 236S, 236T, 237A, 237C, 237D, 237E, 237F, 237G, 237H, 2371, 237K, 237L, 237P, 237Q, 237R, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238C, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239A, 239E, 239F,

2391, 239M, 239T, 240A, 240C, 240D, 240E, 240F, 240G, 240H, 240I, 240L, 240M, 240N, 240Q, 240R, 2408, 240T, 240V, 240W, 240Y, 241A, 241C, 241D, 241E, 241F, 241G, 241H, 2411, 241K, 241L, 241M, 241P, 2410,

241R, 2418, 241T, 241V, 241W, 241Y, 242A, 242C, 242D, 242E, 242F, | 242], 242K, 2421, 242M, 242Q, 2428, 242T, 242V, 242W, 242Y, 243A, 243C, 243D, 243E, 243F, 243G, 243H, 243I, 243K, 243L, 243M, 2430, 243R, 2438, 243T, 243V, 243W, 243Y, 244A, 244F, 2441, 244M, 2447, 244V, 244W, 244Y, 245A, 245C, 245D, 245F, 245H, 245, 245L, 245M, 245N, 245P, 245R, 245T, 245V, 245W, 245Y, 246A, 246C, 246D, 246E, 246F, 246G, 246H, 2461, 246K, 246L, 246P, 246Q, 246R, 246S, 246T, 246W, 246Y, 247A, 247D, 247E, 247F, 247G, 247H, 2471, 247L, 247M, 247N, 247P, 247Q, 247T, 247V, 247Y, 248A, 248C, 248E, 248F, 2486, 248H, 2481, 248K, 2481, 248M, 248Q, 248R, 2488, 248T, 248V, 248W, 249A, 249C, 249E, 249F, 249H, 249L, 249M, 249P, 249S, 249V, 249Y, 250A, 250C, 250E, 250F, 250G, 250H, 250l, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250T, 250V, 250W, 250Y, 251A, 251C, 251D, 251E, 251G, 2511, 251K, 251L, 251M, 251N, 251P, 251Q, 251R, 251V, 251Y, 252C, 252D, 252E, 252F, 252G, 252H, 2521], 252K, 252L, 252M, 252Q, 252R, Í 2528, 252T, 252V, 252W, 253C, 253E, 253F, 253G, 253H, 2531, 253K, , 253L, 253M, 253P, 253R, 2538, 253T, 253V, 253W, 253Y, 254A, 254F, 254G, 254H, 254l, 254K, 254L, 254N, 254P, 254R, 254T, 254V, 254W, 254Y, 255A, 255C, 255E, 255F, 255G, 2551, 255K, 255L, 255N, 255P, 2550, 255R, 2558, 255T, 255V, 255W, 255Y, 256A, 256C, 2561, 256M, 256N, 256T, 257A, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 2571, 257K, 257L, 257M, 257N, 257P, 257Q, 257R, 257T, 257V, 257W, 258C, 258D, 258E, 258F, 258G, 258H, 2581, 258K, 258L, 258M, 258N, 258Q, 258R, 258S, 258T, 258V, 258Y, 259A, 259E, 259G, 259H, 2591l, 259K, 259L, 259M, 259P, 2590, 259R, 259S, 259T, 259W, 259Y, 260A, 260C, 260D, 260E, 260F, 260G, 260H, 2601, 260L, 260M, 260N, 260Q, 260R, 260S, 260T, 260V, 260W, 260Y, 261A, 261C, 2611, 261M, 261N, 261Q, 261S, 261T, 261V, 262A, 262C, 262], 262M, 262T, 263A, 263C, 263L, 263M, 263N, 263P, 2638, 263V, 264D, 264E, 264G, 264H, 264], 264L, 264N, 264Y, 265A, 265C, 265F, 265M, 2657, 265Y, 267A, 267C, 267D, 267F, 267G, 267H, 267M, 267N, 267Q, 267T, 267V, 268M, 268Q, 268R, 268V, 268Y, 270C, 270F, 270G, 270, 270L, 270M, 270N, 270R, 2708, 270V, 270Y, 271F, 272G, 2721, 272L,

272M, 272N, 2728, 272T, 272V, 273D, 273G, 2731, 273K, 273L, 273P, 2730, 273R, 2738, 273T, 273V, 273W, 273Y, 274A, 274C, 274F, 274G, 274H, 274, 274K, 274L, 274M, 274N, 274P, 2740, 274R, 2748, 2747, 274V, 274W, 274Y, 275A, 275C, 275E, 275F, 275G, 275H, 2751, 275K,

275L,275M, 275N, 275P, 2750, 275R, 2758, 2757, 275V, 275W, 2795Y, 276A, 276C, 276D, 276F, 276G, 276H, 2761, 276K, 276L, 276M, 276N, 276P, 276Q, 276R, 2768, 276T, 276V, 276W, 276Y, 277A, 277C, 277D, 277F, 277G, 277H, 2771, 277K, 277L, 277M, 277N, 277P, 2770, 277R, 2778, 277T, 277V, 277W, 277Y, 278A, 278C, 278T, 279D, 279E, 279G,

279H, 2791, 279K, 279L, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279R, 2798, 279V, 279W, 279Y, 280A, 280D, 280E, 280F, 280G, 280H, 280K, 280L, 280M, 280N, 280Q, 280R, 280S, 280T, 280Y, 281C, 281F, 281L, 282A, 282C, 282D, 282E, 282F, 282G, 282H, 282|, 282K, 282L, 282M, 282N, 282P, 2820, 282R, 282T, 282V, 282W, 282Y, 283A, 283C, 283F, 283G, 283H,

283l, 283L, 283M, 283N, 283P, 283R, 283S, 283T, 283V, 283W, 283Y, ' 284A, 284C, 284E, 284F, 284G, 284H, 284|, 284K, 284L, 284M, 284N, . 284P, 284Q, 284R, 284S, 284T, 284V, 284W, 284Y, 285A, 285C, 285E, 285H, 2851, 285L, 285M, 285N, 285Q, 2858, 285T, 285V, 285Y, 286A, 286C, 2861, 286M, 286N, 286Q, 286T, 286V, 287A, 287C, 287D, 287E,

287F, 287G, 287H, 2871, 287K, 287L, 287M, 287N, 287P, 287Q, 2878, 287T, 287V, 287W, 287Y, 288A, 288C, 2881, 288M, 288T, 288V, 289A, 289S, 290F, 290H, 290M, 290Y, 291C, 291F, 291G, 2911, 291L, 291M, 291N, 2918, 291T, 291V, 292A, 292C, 2921, 292L, 292M, 2928, 2927, 292W, 293C, 293D, 293E, 293F, 293G, 293N, 293Q, 2938, 293V, 294C,

294G, 294M, 294N, 294S, 294T, 294V, 295A, 295C, 295G, 295T, 296A, 296C, 296F, 296G, 296H, 296K, 296M, 297A, 297C, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297N, 297P, 297Q, 297R, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298C, 298D, 298E, 298F, 298H, 2981, 298K, 298L, 298M, 298N, 298P, 298Q, 298R, 298S, 298V, 298W, 299C, 299D, 299E,

299F, 299G, 299H, 2991l, 2991, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299V, 300A, 300C, 300F, 300H, 3001I, 300K, 300L, 300M, 300N, 300Q, 300R, 300S, 300V, 300Y, 301C, 301D, 301F, 301H, 301I, 301K, 301L, 301M, 3010,

301R, 301T, 301V, 302C, 302E, 302F, 302G, 302K, 302M, 302N, 302S, 302T, 303L, 303M, 303W, 303Y, 304C, 304E, 304G, 304L, 304N, 304Y, 305A, 305G, 3051l, 305N, 305T, 305V, 307A, 307C, 307D, 307N, 307Q, 307T, 307V, 307Y, 308A, 308C, 308D, 308F, 308G, 308H, 3081, 308K, 308L,

308M, 308N, 308P, 308Q, 308R, 308S, 308T, 308V, 308W, 308Y, 309C, 309D, 309E, 309F, 309H, 309l, 309K, 309M, 309N, 309P, 309R, 309S, 309T, 309V, 309Y, 310A, 310D, 310E, 310F, 310H, 3101, 310L, 310M, 310N, 310P, 310Q, 310R, 310S, 310T, 310Y, 311A, 311C, 311D, 311E, 311F, 311H, 311K, 311L, 311M, 311N, 311P, 311Q, 311R, 3118, 311T, 311V,

311W, 311Y, 312A, 312C, 312D, 312E, 312F, 312G, 312H, 3121, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313C, 313D, 313E, 313F, 313H, 3131l, 313K, 313L, 313M, 313N, 313P, 313Q, 313R, 313S, 313T, 313V, 313W, 313Y, 314A, 314C, 314D, 314F, 314G, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 3148, 314T, 314W, 314Y,

315C, 315D, 315E, 315G, 315H, 3151, 315K, 315L, 315M, 315N, 315P, : 315Q, 315T, 315V, 316C, 316D, 316H, 3161, 316L, 316M, 316Y, 317A, . 317C, 317D, 317E, 317F, 317G, 317H, 3171, 317K, 317L, 317N, 3170, 317R, 3178, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 3181, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319A, 319D, 319F,

319G, 319H, 319L, 319N, 319P, 319Q, 3198, 319V, 319W, 320A, 320C, 320D, 320F, 320G, 320H, 320l, 320K, 320L, 320M, 320N, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320W, 320Y, 321A, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 3211, 321K, 321L, 321M, 321N, 321P, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 3221, 322M, 322V, 323A, 323C, 323H, 323N, 323R, 323S, 323T, 324A,

324C, 324E, 324F, 324G, 324H, 324l, 324K, 3241, 324M, 324N, 324P, 3240, 324R, 3248, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325C, 325D, 325F, 325G, 325H, 3251l, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326A, 3260, 327C, 327D, 327F, 327G, 327H, 327K, 327N, 327P, 327R, 327T, 327V, 327Y, 328C, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K,

328L, 328N, 328P, 3280, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329A, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 330A, 330C, 330H, 330L, 330M, 330S, 330W, 330Y, 331C, 331D, 331F, 331G,

3311, 331K, 331L, 331M, 331N, 331Q, 331R, 3318, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332E, 332F, 332G, 332], 332K, 3321, 332M, 332Q, 332R, 3328, 332V, 332Y, 333C, 333D, 333F, 333G, 333H, 333], 333K, 3331, 333M, 333N, 333P, 333R, 333S, 333T, 333V, 333W, 333Y, 334C, 334D, 334F,

334G, 334H, 3341l, 3341, 334M, 334N, 334Q, 334R, 334S, 334T, 334V, 334Y, 335A, 335L, 335M, 335Q, 335T, 335V, 336A, 336C, 336E, 336F, 336G, 336H, 3361], 336K, 3361, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336S, 336V, 336W, 336Y, 337D, 337G, 337H, 337K, 337L, 337N, 337P, 3370, 337R, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338C, 338F, 338G, 3381, 3381, 338M, 338N,

338P,338S,338T,339C,339G, 3391, 339S, 339T, 339V, 340D, 340E, 340F, 340G, 340H, 340l, 340K, 3401, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 3411, 341L, 341M, 341V, 341W, 341Y, 342A, 342D, 342E, 342F, 342G, 342K, 3421, 342M, 342N, 342R, 342S, 342V, 342Y, 343A, 343C, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343l, 343K, 343L, 343M, 343P, 3430,

3438, 343T, 343V, 343W, 343Y, 344A, 344C, 344D, 344E, 344F, 344G, ' 344H, 344l, 344K, 3441, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, . 344Y, 345A, 345C, 345D, 345E, 345F, 345G, 345H, 345|l, 345N, 3450, 345S, 345T, 345V, 345W, 345Y, 346C, 346D, 346E, 346F, 346H, 346], 346K, 3461, 346M, 346N, 346P, 346R, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347A,

347C, 347D, 347E, 347F, 347H, 3471, 347K, 347L, 347M, 347N, 347P, 3470, 347R, 3478, 347T, 347V, 347W, 347Y, 348C, 348F, 348G, 348H, 3481, 348K, 348M, 348N, 348P, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349C, 349D, 349F, 349G, 349H, 349l, 349K, 3491, 349M, 349N, 349Q, 349R, 349S, 349T, 349V, 349W, 349Y, 350A, 350C, 350D, 350N,

3508, 351A, 351D, 351G, 351H, 351K, 351L, 351M, 351P, 351Q, 351R, 351S, 351T, 351V, 351W, 351Y, 352A, 352D, 352E, 352F, 352G, 352H, 3521, 352K, 352N, 3520, 352R, 352T, 352V, 352W, 352Y, 353A, 353C, 353D, 353E, 353F, 353G, 353l, 353K, 3531, 353M, 353N, 353Q, 353R, 353T, 353V, 353W, 353Y, 354A, 354C, 354M, 354P, 354Q, 354S, 354T,

355C,355D,355E,355F, 355G, 355], 355K, 355L, 355M, 355N, 355T, 355V, 355W, 355Y, 356D, 356E, 356F, 356G, 356H, 3561, 356K, 3561, 356M, 356P, 356Q, 356T, 356W, 356Y, 357A, 357C, 357D, 357E, 357F, 357H,

3571, 357K, 357L, 357M, 357N, 357P, 357Q, 357R, 3578, 357T, 357V, 357W, 357Y, 358A, 358C, 358D, 358E, 358F, 358G, 358H, 3581, 358K, 3581, 358M, 358P, 358Q, 358R, 358S, 3581, 358V, 358W, 358Y, 359A, 359C, 359D, 359E, 359F, 359G, 359H, 359l, 359K, 359L, 359M, 359P, 3590, 359R, 359S, 359T, 359V, 359W, 359Y, 360F, 360H, 360L, 360N, 360P, 360R, 360T, 360W, 361A, 361C, 361G, 361H, 361L, 361M, 361N, 3610, 361S, 361T, 361V, 361W, 361Y, 362A, 362C, 362E, 362H, 362, 3621, 362M, 362Q, 3628, 362T, 362V, 362Y, 363D, 363E, 363F, 363G, 363H, 363N, 363Q, 363R, 363S, 363V, 363W, 363Y, 364A, 364C, 364D, 364E, 364G, 364], 3641, 364M, 364Q, 364S, 364T, 364V, 365A, 365C, 365D, 365F, 365G, 365], 365K, 3651, 365M, 365N, 365R, 3658, 3657, 365V, 365W, 365Y, 366A, 366C, 366E, 366F, 366G, 366H, 366K, 3661, 366M, 366S, 366T, 366V, 367A, 367C, 367D, 367E, 367F, 367H, 367], 367K, 367L, 367M, 367N, 367P, 367R, 367S, 367T, 367V, 367W, 367Y, 368D, 368F, 368G, 3681, 368K, 3681, 368M, 368N, 368P, 368Q, 368R, 368T, 368V, í 368W, 368Y, 369A, 369C, 369D, 369E, 369F, 369G, 369I, 369K, 369L, . 369M, 369N, 369P, 369Q, 369R, 369S, 369T, 369V, 369W, 369Y, 370A, 371A, 371C, 371F, 371G, 371H, 3711, 371L, 371M, 371N, 3710, 3718, 371T, 371W, 371Y, 372A, 372C, 372G, 3721], 372L, 372M, 372N, 3720, 3728, 372T, 3/3A, 3/3C, 3/73F, 373G, 3731, 373M, 373Q, 3738, 3737, 373V, 373W, 373Y, 374C, 374E, 374G, 374l, 374L, 374M, 374N, 3748, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375G, 375H, 375L, 375M, 3750, 3758, 375T, 375V, 375W, 375Y, 376C, 376D, 376E, 376F, 376G, 376H, 376, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 3768, 376T, 376V, 377F, 377H, 377], 377K, 377L, 377P, 377T, 377W, 377Y, 378A, 378C, 378D, 378E, 378F, 378G, 378H, 378l, 378K, 378L, 378M, 378N, 378P, 378Q, 3/8R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379D, 379G, 379H, 379l, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379W, 379Y, 380A, 380C, 380D, 380E, 380F, 380G, 380H, 380l, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381A, 381G, 381l, 381K, 381N, 381P, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382D, 382F, 382G, 382H, 3821], 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382T, 382V, 382W, 382Y, 383A, 383C, 383E, 383F,

383G, 383H, 383L, 383N, 383P, 383Q, 383S, 383T, 383V, 383W, 383Y, 384A, 384D, 384F, 384G, 384H, 3841, 384K, 3841, 384P, 384Q, 3848, 384T, 384V, 384W, 385A, 385C, 385D, 385E, 385F, 385G, 385H, 3851, 385K, 3851, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386C,

386D,386F,386G, 386H, 386], 386L, 386N, 386P, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387A, 387D, 387E, 387G, 3871I, 387L, 387N, 387Q, 3878, 388A, 388C, 388D, 388E, 388F, 388G, 388H, 3881, 388L, 388M, 388N, 388P, 388Q, 3868R, 388S, 388T, 388V, 388W, 388Y, 389C, 389E, 389F, 389H, 3891I, 389K, 389M, 389N, 389Q, 389S, 389T, 389V, 389W, 389Y,

390A, 390C, 390D, 390E, 390F, 390G, 390H, 390l, 390K, 390L, 390M, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391E, 391F, 391G, 391H, 3911, 391K, 391L, 391N, 391P, 391R, 391S, 391T, 391V, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 3921, 392M, 392N, 392Q, 392R, 3928, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 3931, 393L,

—393M, 393P, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394E, ' 394F, 394H, 394], 394K, 3941, 394M, 394N, 394P, 3940, 394R, 394S, 394T, . 394V, 394W, 395A, 395C, 395E, 395F, 395G, 395H, 3951l, 395K, 395L, 395M, 395N, 395P, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396A, 396C, 396D, 396E, 396G, 396M, 396P, 396S, 396T, 397A, 397C, 397D,

397E,397F,397G, 397H, 3971, 397L, 397M, 397P, 397R, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398D, 398E, 398F, 398G, 3981, 398L, 398M, 398N, 398P, 398Q, 398R, 398S, 398T, 398V, 398W, 398Y, 399A, 399C, 399D, 399E, 399F, 399H, 3991, 399K, 3991, 399P, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400N,

—400P,400Q, 400R, 4008, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401H, 4011, 401K, 401L, 401M, 401N, 401P, 401Q, 401R, 4018, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402], 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403E, 403G, 403H, 4031, 403M, 403N, 4030,

403S, 403T, 403V, 403W, 403Y, 404D, 404E, 404F, 404G, 404H, 404I, 404L, 404M, 404N, 404P, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405E, 405F, 405G, 405H, 4051, 405K, 405Q, 4058, 405T, 406D, 406F, 406L, 406T, 406Y,

407A, 407C, 407E, 407F, 407G, 407H, 4071, 407K, 407M, 407N, 407P, 407Q, 407R, 4078, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408A, 408D, 408E, 408F, 408H, 4081, 408K, 408N, 408P, 408Q, 408S, 408T, 408V, 408Y, 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409H, 409, 409L, 409M, 409Q, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410F, 410G, 410l, 410K, 410Q, 4108, 410T, 410V, 410W, 410Y, 411A, 411D, 411E, 411F, 411G, 411H, 4111, 411L, 411M, 411N, 411Q, 411R, 4118, 411V, 411W, 411Y, 412A, 412D, 412E, 412H, 412, 412K, 412L, 412M, 412N, 412R, 4128, 4127, 412V, 412Y, 413C, 413E, 413F, 413G, 4131, 413L, 413M, 413N, 413P, 413R, 4138, 413V, 413W, 413Y, 414A, 414C, 414E, 414F, 414G, 414H, 414L, 414M, 414N, 414P, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415F, 415G, 415H, 4151, 415K, 415P, 415Q, 415R, 415V, 415W, 416F, 4161, 416L, 416P, 4160, 416R, 416T, 416V, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 4171, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 4178, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418|, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, í 419E, 419F, 419G, 419H, 4191, 419L, 419P, 419Q, 4198, 419T, 419Y, 420D, h 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 4208, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 4211, 421L, 421M, 4218, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 4221, 422M, 422N, 4220, 4228, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 4231, 423K, 423P, 4230, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424), 424K, 424M, 424N, 4240, 424R, 4248, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425l, 425K, 425L, 425M, 4258, 425T, 425V, 425W e 425Y.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe- lofatode que a modificação é uma substituição do resíduo de aminoácido presente na posição 153 por N, K ou F e o polipeptídeo variante exibe habili- dade aumentada em converter substratos de maltose e maltoeptaose em glicose comparado com o polipeptídeo parental.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe- lofatode que a modificação é uma substituição selecionada do grupo con- sistindo em L142F, L142G, L142Q, L1428S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L e S254I.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe- lo fato de que a modificação é uma substituição selecionada do grupo con- sistindo em W60L, W60M, W60N, 1100F, 1100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T27ON, T270V e T279A.

25. Método para redução do endurecimento de pão, caracteriza- do pelo fato de que compreende adição a uma massa de pão de uma quan- tidade de polipeptídeo de AmyE suficiente para reduzir endurecimento com- parado com a quantidade de endurecimento observada com uma massa de pão equivalente sem um polipeptídeo de AmyE.

26. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, ou de processo, ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- lada ou ilustrada no pedido de patente.