BRPI0916704A2 - composições farmacêutica, e imunogênica, usos de um polipeptídeo, e de um polinucleotídeo, proteína de fusão, e, polinucleotídeo - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA, E IMUNOGÊNICA, USOS DE UM POLIPEPTÍDEO, E DE UM POLINUCLEOTÍDEO, PROTEÍNA DE FUSÃO, E, POLINUCLEOTÍDEO A presente invenção está direcionada a um polipeptídeo que compreende: (i) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c. Em outros aspectos a invenção é direcionada aos polinucleotídeos associados, proteínas de fusão e métodos para o tratamento ou prevenção da tuberculose.

Description

i 1 “COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA, E IMUNOGÊNICA, USOS DE UM POLIPEPTÍDEO, E DE UM POLINUCLEOTÍDEO, PROTEÍNA DE FUSÃO, E, POLINUCLEOTÍDEO” DENIS ND

CAMPO DA INVENÇÃO

MÉTODO PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE TUBERCULOSE, USO DE USO DE UM A presente invenção diz respeito a polipeptídeos e polinucleotídeos para o uso no tratamento ou prevenção de tuberculose, em particular para o uso no tratamento ou prevenção de tuberculose latente e na prevenção ou retardo da reativação da tuberculose (e também aos métodos relacionados). A presente invenção diz respeito ainda a composições farmacêuticas e imunogênicas que compreendem os ditos polipeptídeos e polinucleotídeos, e aos métodos para o diagnóstico de tuberculose (em particular tuberculose latente).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crônica causada pela infecção com Mycobacterium tuberculosis e outras espécies de Mycobacterium. Ela é uma doença principal em países em desenvolvimento, assim como um problema crescente em áreas desenvolvidas do mundo. Acredita-se que mais do que 2 bilhões de pessoas estejam infectadas com os bacilos da TB, com cerca de 9,2 milhões de novos casos de TB e 1,7 milhões de mortes a cada ano. 10% destes infectados com os bacilos de TB desenvolverão TB ativa, cada pessoa com TB ativa infectando uma média de 10 a 15 outros por ano. Embora as taxas de incidência anual tenham globalmente chegado ao máximo, o número de mortes e casos está ainda em elevação devido ao crescimento da população (World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008). A Mycobacterium tuberculosis infecta indivíduos através da via respiratória. Os macrófagos alveolares engolfam a bactéria, mas ela é fo E;'I-P22 Ia * )2ôB.zZCCYOÉUENT)ÉAÉ AA >a 2) 7 % 55 É! EINÉ i : 2 : capaz de sobreviver e proliferar inibindo-se a fusão de fagossoma com lisossomas ácidos. Uma resposta imune complexa que envolve células T CD4+ e CD8+ resulta, resultando por fim na formação de um granuloma. Central ao sucesso da Mycobacterium tuberculosis como um patógeno está o —fatodequea bactéria isolada, mas não erradicada, pode persistir por períodos i longos, deixando um indivíduo vulnerável ao desenvolvimento posterior da : TB ativa. Menos do que 5% dos indivíduos infectados desenvolvem a TB ativa nos primeiros anos depois da infecção. O granuloma pode persistir por décadas e acredita-se contenha Mycobacterium tuberculosis viva em um estado de dormência, provada de oxigênio e nutrientes. Entretanto, recentemente foi sugerido que a maioria das bactérias no estado de dormência estejam localizadas em tipos de célula que não de macrófago espalhadas por todo o corpo (Locht et al, Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11): 1665-1677). O desenvolvimento de TB ativa ocorre quando o equilíbrio entre a imunidade natural do hospedeiro e o patógeno muda, por exemplo como um resultado de um evento imunossupressivo (Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1): 7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2): 87-95). Uma hipótese dinâmica que descreve o equilíbrio entre TB latenteeTB ativa também foi proposta (Cardana P-J Inflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6: 27-39; Cardana P-J Infection 2009 37(2): 80-86).

Embora uma infecção possa ser assintomática por um período considerável de tempo, a doença ativa é mais habitualmente manifestada como uma inflamação aguda dos pulmões, resultando em cansaço, perda de — peso, febre e um tosse persistente. Se não tratada, complicações sérias e morte tipicamente resultam.

A tuberculose pode ser no geral controlada usando terapia de antibiótico prolongada, embora tal tratamento não seja suficiente para prevenir a disseminação da doença. Indivíduos infectados podem ser

DNS A SS A A A A AA

: 3 ê assintomáticos, mas contagiosos, por algum tempo. Além disso, embora a submissão com o regime de tratamento seja crítico, o comportamento do paciente é difícil de monitorar. Alguns pacientes não completam o curso de tratamento, que pode levar ao tratamento ineficaz e ao desenvolvimento de — resistência a medicamento. l A TB resistente a medicamento múltiplo (MDR-TB) é uma * forma que falha em responder às medicações de primeira linha. 5% de todos os casos de TB são MDR-TB, com uma estimativa de 490.000 novos casos de MDR-TB ocorrendo na cada ano. Extensivamente, a TB resistente a medicamento (XDR-TB) ocorre quando a resistência às medicações de segunda linha se desenvolvem no topo da MDR-TB. É estimado que 40.000 novos casos da XDR-TB virtualmente não tratável surjam anualmente (World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008). Mesmo se um curso completo de tratamento com antibiótico fosse completado, a infecção com M. tuberculosis pode não ser erradicada do indivíduo infectado e pode permanecer como uma infecção latente que pode ser reativada.

De modo a controlar a disseminação da tuberculose, a vacinação eficaz e diagnóstico precoce preciso da doença são da maior importância.

O diagnóstico da infecção pela TB latente é habitualmente obtida usando o teste de pele da tuberculina, que envolve a exposição intradérmica do derivado purificado da proteína tuberculina (PPD). As respostas de célula T específicas de antígeno resultam no endurecimento —mensurávelno local de injeção em 48 a 72 horas depois da injeção, que indica a exposição aos antígenos micobacterianos. A sensibilidade e especificidade, entretanto, têm sido um problema com este teste, e indivíduos vacinados com a BCG não podem sempre ser facilmente distinguidos de indivíduos infectados (isto é particularmente importante considerando-se o fato de que a Ia E SL a o o o a A A o as AA a

: 4 z BCG não protege contra a infecção latente). No geral, indivíduos que receberam a BCG mas não estão infectados pela M. tuberculosis mostram uma reação PPD abaixo de 10 mm no diâmetro ao passo que as pessoas que têm uma reação de PPD acima de 10 mm no diâmetro são consideradas ter —sidoinfectadaspelaM. tuberculosis. Entretanto, esta regra não é aplicável aos i indivíduos com imunossupressão devido à infecção pelo HIV, que pode Í resultar em uma reação PPD abaixo de 10 mm no diâmetro; ou em países endêmicos onde as pessoas infectadas pelas micobactérias que não tuberculose podem apresentar uma reação PPD acima de 10 mm no diâmetro. O progresso em anos recentes tem observado o desenvolvimento de ensaios com base em célula T in vitro, com base na liberação de interferon gama e usando antígenos que são mais específicos para a M. tuberculosis do que o PPD, a saber ESAT-6 e CFP-10. Estes testes de especificidade alta parecem ser pelo menos tão sensíveis quanto o teste de 15º pele da tuberculina e também demonstram menos reatividade cruzada devido à vacinação com BCG. Ver Pai M et al Expert Rev. Mol. Diagn. 2006 6(3): 413-422 para uma revisão recente de diagnóstico de TB latente. Entretanto, visto que ESAT-6/CFP-10 são antígenos de estágio precoce, ensaios com base no ESAT-6/CFP-10 podem atuar apenas de modo ideal em pessoas recentemente infectadas. Consequentemente, a identificação de novos antígenos especificamente associados com a tuberculose latente pode ajudar no desenvolvimento de ensdaios mais sensíveis qie poderiam detectar infecções latentes de duração mais longa. Permanece uma necessidade quanto às estratégias eficazes —parao tratamento e prevenção da tuberculose, em particular o tratamento e prevenção da TB latente e a prevenção da reativação da TB.

SUMÁRIO RESUMIDO DA INVENÇÃO A presente invenção no geral diz respeito à identificação de Rv2386c como um antígeno de TB (em particular um antígeno associado com |

* - : a TB latente) e aos métodos e usos relacionados na prevenção e tratamento de TB, especialmente na prevenção e tratamento de TB latente e na prevenção ou retardo da reativação de TB.

A presente invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; ' (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (li) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína deRv2386c.

A presente invenção também fornece um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; para o uso como um medicamento.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método para o tratamento ou prevenção de TB que compreende a administração de uma quantidade segura e eficaz de um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (1) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; a um paciente em necessidade deste, em que os ditos polipeptídeo induz uma resposta imune, em particular uma resposta imune contra Mycobacterium tuberculosis.

: 6 % O uso de um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (11) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína i de Rv2386c; ' na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de TB, representa um outro aspecto da invenção. A presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (1) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

Também é fornecido um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende: : (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (11) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; para o uso como um medicamento.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a um método para o tratamento ou prevenção de TB que compreende a administração de uma quantidade segura e eficaz de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c;

d 7 : (11) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; , 5 a um paciente em necessidade deste, em que o dito polinucleotídeo induz uma resposta imune, em particular uma resposta imune : contra Mycobacterium tuberculosis.

O uso de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (11) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de TB, representa um outro aspecto da invenção.

Adicionalmente, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende: (a) um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (ii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (b) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de (a); e (c) um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

t 8 ê Além disso, é fornecida uma composição imunogênica que compreende: (a) um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; : 5 (1) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou : (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (b) um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de (a);

S (c) um intensificador de resposta imune não específica.

Adequadamente, a composição farmacêutica e imunogênica compreende uma combinação de um Rv2386c e um segundo componente antigênicoda tuberculose heterólogo.

Também é fornecido um vetor de expressão que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

Células hospedeiras, transformadas com o dito vetor de expressão, formam um outro aspecto da invenção. Adicionalmente é fornecido uma célula hospedeira que recombinantemente expressa um polipeptídeo que compreende: (í) uma sequência de proteína de Rv2386c;

ê 9 : (11) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (ii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c. . 5 Além disso, é fornecido um método para a produção de um polipeptídeo que compreende: y (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (1il) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; o dito método compreendendo a etapa de expressar recombinantemente o dito polipeptídeo dentro de uma célula hospedeira.

Adicionalmente é fornecido um anticorpo ou fragmento deste queespecificamente se liga a um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (1) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína deRv2386c.

O uso dos ditos anticorpos em diagnóstico também é fornecido (tais como métodos para o diagnóstico de tuberculose que compreendem determinar a presença de um anticorpo ou fragmento deste que especificamente se liga aos polipeptídeos da invenção em uma amostra — biológicade um indivíduo de teste). Também são fornecidos kits de diagnóstico que compreendem: (a) um polipeptídeo da presente invenção; (b) aparelho suficiente para contatar o dito polipeptídeo com uma amostra (por exemplo, sangue integral ou mais adequadamente PBMC)

: 10 : de um indivíduo; e . (c) meios para quantificar a resposta de célula T da amostra. Um outro aspecto da invenção diz respeito a um kit de diagnóstico que compreende: : 5 (a) um polipeptídeo da presente invenção; e i (b) aparelho suficiente para contatar o dito polipeptídeo com as ' células dérmicas de um paciente. Em uma forma de realização o indivíduo que recebe um polipeptídeo, polinucleotideo ou composição da invenção pode ter — tuberculose ativa (por exemplo, infecção ativa pela M. tuberculosis). Em uma | segunda forma de realização o indivíduo pode ter tuberculose latente (por exemplo, infecção dormente pela M. tuberculosis). Em uma terceira forma de realização o indivíduo pode ser isento de tuberculose (por exemplo, isento de infecção pela M. tuberculosis).

Um indivíduo que recebe um polipeptídeo, polinucleotídeo ou composição da invenção pode ter sido anteriormente vacinado contra a tuberculose (por exemplo, vacinado contra a infecção pela M. tuberculosis), tal como ter sido vacinado com o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Alternativamente, um indivíduo que recebe um polipeptídeo, polinucleotídeo —oucomposição da invenção pode não ter sido anteriormente vacinado contra a tuberculose (por exemplo, não vacinado contra a infecção pela M. tuberculosis), tal como não ter sido vacinado com o Bacilo de Calmette- Guerin (BCG).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Porcentagem de células CD4 e CD8 de camundongos CB6F1 imunizados que expressam IFN-gama e/ou IL-2 e/ou TNF-alfa citocinas no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização).

FF DÊ CO IT£[ú-ôEAÉSENspaEÊEI í 11 â Figura 2: Perfil de citocina no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) da resposta CD4 específia de antígeno em camundongos CB6F1 imunizados. Figura 3: Perfil de citocina no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) da resposta CD8 específica de antígeno em camundongos CB6F1 imunizados. " Figura 4: Porcentagem de células CD4 e CD8 de camundongos CB6F1 imunizados que expressam IFN-gama e/ou IL-2 e/ou citocinas de TNF-alfa no dia 35 (isto é, 7 dias após a terceira imunização).

Figura 5: Perfil de citocina no dia 35 (isto é, 7 dias após a terceira imunização) da resposta CD4 específica de antígeno em camundongos CB6F1 imunizados.

Figura 6: Perfil de citocina no dia 35 (isto é, 7 dias após a terceira imunização) da resposta CD8 específica de antígeno em camundongos CB6F1 imunizados.

Figura 7: Porcentagem de células CD4 e CD8 de camundongos C57BL/6 imunizados que expressam IFN-gama e/ou IL-2 e/ou citocinas de TNF-alfa no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização).

Figura 8: Perfil de citocina no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) da resposta CD4 específica de antígeno em camundongos C57BL/6 imunizados.

Figura 9: Perfil de citocina no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) da resposta CD8 específica de antígeno em camundongos C57BL/6 imunizados.

— DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS LISTADAS SEQ ID No: 1: sequência de polipeptídeo de Rv2386c da cepa H37Rv da M. tuberculosis.

SEQ ID No: 2: sequência de polinucleotídeo de Rv2386c da cepa H37Rv da M. tuberculosis. RR iiilirns>s5aO5O?OOO ES ê 12 3 SEQ ID No: 3: sequência de polipeptídeo de Rv2386c da cepa CDC1551 de M. tuberculosis.

SEQ ID No: 4: sequência de polipeptídeo de Rv2386c da cepa F11 de M. tuberculosis. —SEQIDNo:5: sequência de polipeptídeo de Rv2386c da cepa Haarlem A de i M. tuberculosis. : SEQ ID No: 6: sequência de polipeptídeo de Rv2386c da cepa C de M. tuberculosis.

SEQ ID No: 7: sequência de polipeptídeo de Rv2386c do BCG. / SEQID No: 8: sequência de polipeptídeo de Mtb8,4. SEQ ID No: 9: sequência de polipeptídeo de Mtb9,8. SEQ ID No: 10: sequência de polipeptídeo de Mtb9,9. SEQ ID No: 11: sequência de polipeptídeo de Ra12. SEQ ID No: 12: sequência de polipeptídeo de Ra35. SEQID No: 13: sequência de polipeptídeo de TBH9. SEQ ID No: 14: sequência de polipeptídeo de Mtb40. SEQ ID No: 15: sequência de polipeptídeo de Mtb41. SEQ ID No: 16: sequência de polipeptídeo de ESAT-6. SEQ ID No: 17: sequência de polipeptídeo de Ag85A. —SEQID No: 18: sequência de polipeptídeo de Ag85B.

SEQ ID No: 19: sequência de polipeptídeo de alfa-cristalina.

SEQ ID No: 20: sequência de polipeptídeo de MPT64. SEQ ID No: 21: sequência de polipeptídeo de Mtb32A.

SEQ ID No: 22: sequência de polipeptídeo de Mtb32A maduro mutado em Ser/Ala SEQ ID No: 23: sequência de polipeptídeo de TB10,4. SEQ ID No: 24: sequência de polipeptídeo de Mtb72f.

SEQ ID No: 25: sequência de polipeptídeo de M72. SEQ ID No: 26: sequência de polipeptídeo de Mtb71f.

: 13 : SEQ ID No: 27: sequência de polipeptídeo da fusão de M92. SEQ ID No: 28: sequência de polipeptídeo da fusão de M103. SEQ ID No: 29: sequência de polipeptídeo da fusão de M114. SEQ ID No: 30:epítopo de célula CD4 humana putativa 1. —SEQIDNo:3!:epítopo de célula CD4 humana putativa 2. SEQ ID No: 32:epítopo de célula CD4 humana putativa 3. ' SEQ ID No: 33:epítopo de célula CD4 humana putativa 4. SEQ ID No: 34:epítopo de célula CD4 humana putativa 5. SEQ ID No: 35:epítopo de célula CD4 humana putativa 6. —SEQID No: 36:epítopo de célula CD4 humana putativa 7. SEQ ID No: 37:epítopo de célula CD4 humana putativa 8. SEQ ID No: 38:epítopo de célula CD4 humana putativa 9. SEQ ID No: 39:epítopo de célula CD4 humana putativa 10. SEQ ID No: 40:epítopo de célula CD4 humana putativa 11. 15" SEQID No: 41:epítopo de célula CD4 humana putativa 12. SEQ ID No: 42:epítopo de célula CD4 humana putativa 13. SEQ ID No: 43:epítopo de célula CD4 humana putativa 14. SEQ ID No: 44:epítopo de célula CD4 humana putativa 15. SEQ ID No: 45:epítopo de célula CD4 humana putativa 16. —SEQID No: 46:epítopo de célula CD4 humana putativa 17. SEQ ID No: 47:epítopo de célula CD4 humana putativa 18. SEQ ID No: 48:epítopo de célula CD4 humana putativa 19. SEQ ID No: 49:epítopo de célula CD4 humana putativa 20. SEQ ID No: 50:epítopo de célula CD4 humana putativa 21. —SEQID No: 5l:epítopo de célula CD4 humana putativa 22. SEQ ID No: 52:epítopo de célula CD4 humana putativa 23. SEQ ID No: 53:epítopo de célula CD8 humana putativa 1. SEQ ID No: 54:epítopo de célula CD8 humana putativa 2. SEQ ID No: 55:epítopo de célula CD8 humana putativa 3.

NS A AAA

ROQUCCqN——pDpD—Y— e de ill a ASSAR nina nest, : 14 : SEQ ID No: 56:epítopo de célula CD8 humana putativa 4. SEQ ID No: 57:epítopo de célula CD8 humana putativa 5. SEQ ID No: 58:epítopo de célula CD8 humana putativa 6. SEQ ID No: 59:epítopo de célula CD8 humana putativa 7. —SEQIDNOo:60:epítopo de célula CD8 humana putativa 8. | SEQ ID No: 61:epítopo de célula CD8 humana putativa 9. ' SEQ ID No: 62:epítopo de célula CD8 humana putativa 10. SEQ ID No: 63:epítopo de célula CD8 humana putativa 11. SEQ ID No: 64:epítopo de célula CD8 humana putativa 12. SEQID No: 65:epítopo de célula CD8 humana putativa 13. SEQ ID No: 66:epítopo de célula CD8 humana putativa 14. SEQ ID No: 67:epítopo de célula CD8 humana putativa 15. SEQ ID No: 68:epítopo de célula CD8 humana putativa 16. SEQ ID No: 69:epítopo de célula CD8 humana putativa 17. 15º SEQID No: 70:epítopo de célula CD8 humana putativa 18. SEQ ID No: 71:epítopo de célula CD8 humana putativa 19. SEQ ID No: 72:epítopo de célula CD8 humana putativa 20. SEQ ID No: 73:epítopo de célula CD8 humana putativa 21. SEQ ID No: 74:epítopo de célula CD8 humana putativa 22. —SEQID No: 75:epítopo de célula CD8 humana putativa 23. SEQ ID No: 76:epítopo de célula CD8 humana putativa 24. SEQ ID No: 77:epítopo de célula CD8 humana putativa 25. SEQ ID No: 78:epítopo de célula CD8 humana putativa 26. SEQ ID No: 79:epítopo de célula CD8 humana putativa 27 —SEQID No: 80:epítopo de célula CD8 humana putativa 28. SEQ ID No: 81:epítopo de célula CD8 humana putativa 29. SEQ ID No: 82:epítopo de célula CD8 humana putativa 30. SEQ ID No: 83:epítopo de célula CD8 humana putativa 31. SEQ ID No: 84:epítopo de célula CD8 humana putativa 32.

; 15 : SEQ ID No: 85:epítopo de célula CD8 humana putativa 33. SEQ ID No: 86:epítopo de célula CD8 humana putativa 34. SEQ ID No: 87:epítopo de célula CD8 humana putativa 35. | SEQ ID No: 88:epítopo de célula CD8 humana putativa 36. —SEQID No: 89:epítopo de célula CD8 humana putativa 37. i SEQ ID No: 90:epítopo de célula CD8 humana putativa 38. : SEQ ID No: 91:epítopo de célula CD8 humana putativa 39. SEQ ID No: 92:epítopo de célula CD8 humana putativa 40. SEQ ID No: 93:epítopo de célula CD8 humana putativa 41. SEQID No: 94:epítopo de célula CD8 humana putativa 42. SEQ ID No: 95:epítopo de célula CD8 humana putativa 43. SEQ ID No: 96:epítopo de célula CD8 humana putativa 44. SEQ ID No: 97:epítopo de célula CD8 humana putativa 45. SEQ ID No: 98:epítopo de célula CD8 humana putativa 46. SEQID No: 99:epítopo de célula CD8 humana putativa 47. SEQ ID No: 100:epítopo de célula CD8 humana putativa 48. SEQ ID No: 101:epítopo de célula CD8 humana putativa 49. SEQ ID No: 102:epítopo de célula CD8 humana putativa 50. SEQ ID No: 103:epítopo de célula CD8 humana putativa 51. —SEQID No: 104:epítopo de célula CD8 humana putativa 52. SEQ ID No: 105:epítopo de célula CD8 humana putativa 53. SEQ ID No: 106:epítopo de célula CD8 humana putativa 54. SEQ ID No: 107:epítopo de célula CD8 humana putativa 55. SEQ ID No: 108:epítopo de célula CD8 humana putativa 56. —SEQID No: 109:epítopo de célula CD8 humana putativa 57. SEQ ID No: 110:epítopo de célula CD8 humana putativa 58. SEQ ID No: 111:epítopo de célula CD8 humana putativa 59. | SEQ ID No: 112:epítopo de célula CD8 humana putativa 60. SEQ ID No: 113:epítopo de célula CD8 humana putativa 61.

SOS

: 16 : SEQ ID No: 114:epítopo de célula CD8 humana putativa 62. SEQ ID No: 115:epítopo de célula CD8 humana putativa 63. SEQ ID No: 116:epítopo de célula CD8 humana putativa 64. SEQ ID No: 117:epítopo de célula CD8 humana putativa 65. ' 5 —SEQIDNo:ll8:epítopo de célula CD8 humana putativa 66. SEQ ID No: 119:epítopo de célula CD8 humana putativa 67. : SEQ ID No: 120:epítopo de célula CD8 humana putativa 68. SEQ ID No: 121:epítopo de célula CD8 humana putativa 69. SEQ ID No: 122:epítopo de célula CD8 humana putativa 70. ; 10 — SEQID No: 123:epítopo de célula CD8 humana putativa 71. | SEQ ID No: 124:epítopo de célula CD8 humana putativa 72. SEQ ID No: 125:epítopo de célula CD8 humana putativa 73. SEQ ID No: 126:epítopo de célula CD8 humana putativa 74. SEQ ID No: 127:epítopo de célula CD8 humana putativa 75. SEQID No: 128:epítopo de célula CD8 humana putativa 76. SEQ ID No: 129:epítopo de célula CD8 humana putativa 77. | SEQ ID No: 130:epítopo de célula CD8 humana putativa 78. SEQ ID No: 131:epítopo de célula CD8 humana putativa 79. SEQ ID No: 132:epítopo de célula CD8 humana putativa 80. —SEQID No: 133:epítopo de célula CD8 humana putativa 81. SEQ ID No: 134:epítopo de célula CD8 humana putativa 82. SEQ ID No: 135:epítopo de célula CD8 humana putativa 83. SEQ ID No: 136:epítopo de célula CD8 humana putativa 84. SEQ ID No: 137:epítopo de célula CD8 humana putativa 85. —SEQIDNo:138:epítopo de célula CD8 humana putativa 86. SEQ ID No: 139:epítopo de célula CD8 humana putativa 87. SEQ ID No: 140:epítopo de célula CD8 humana putativa 88. SEQ ID No: 141 :epítopo de célula CD8 humana putativa 89. SEQ ID No: 142:epítopo de célula CD8 humana putativa 90.

t 17 : SEQ ID No: 143:epítopo de célula CD8 humana putativa 91. SEQ ID No: 144:epítopo de célula CD8 humana putativa 92. SEQ ID No: 145:epítopo de célula CD8 humana putativa 93. SEQ ID No: 146:epítopo de célula CD8 humana putativa 94. —SEQIDNo:l47:epítopo de célula CD8 humana putativa 95. | SEQ ID No: 148:epítopo de célula CD8 humana putativa 96. ' SEQ ID No: 149:epítopo de célula CD8 humana putativa 97. SEQ ID No: 150:epítopo de célula CD8 humana putativa 98. SEQ ID No: 151:epítopo de célula CD8 humana putativa 99. — SEQID No: 152:epítopo de célula CD8 humana putativa 100. SEQ ID No: 153:epítopo de célula CD8 humana putativa 101. SEQ ID No: 154:epítopo de célula CD8 humana putativa 102. SEQ ID No: 155:sequência de polipeptídeo de Rv1753c da cepa H37Ry da M. tuberculosis. SEQID No: 156:sequência de polipeptídeo de Rv2707c da cepa H37Rv da M. tuberculosis.

DESCRIÇÃO DETALHADA Correntemente, a vacinação com bactérias vivas é o método mais eficiente para induzir imunidade protetiva. A Mycobacterium mais comum utilizada para este propósito é o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de M. bovis que foi desenvolvida nos idos dos anos 60.

Entretanto, a segurança e eficácia do BCG é uma fonte de controvérsia - embora proteja contra a manifestação da doença severa em crianças, a BCG não previne o estabelecimento de TB latente ou a reativação de doença — pulmonar na vida adulta. Adicionalmente, alguns países, tais como os Estados Unidos, não vacinam o público geral com este agente.

Quase toda a nova geração de vacinas contra a TB que estão correntemente em desenvolvimento clínico foram planejados como vacinas de pré-exposição. Estas incluem vacinas de subunidade, que foram

OO

? 18 : particularmente eficazes na imunidade de reforço induzida pela vacinação do BCG anterior, e vacinas micobacterianas vivas avançadas que intentam substituir o BCG com mais cepas eficientes e/ou mais seguras.

Embora estas vacinas intentem melhorar a resistência à infecção, elas provavelmente devem — sermenos eficazes como vacinas de pós-exposição ou terapêuticas em Casos de TB latente (Lin MY et al Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - o Drug Targets 2008 8: 15-29). Várias das proteínas que são fortemente expressadas durante os estágios iniciais de infecção de Mycobacterium foram mostradas fornecer eficácia protetiva forte em modelos de vacinação de animal.

Entretanto, a vacinação com antígenos que são altamente expressados durante os estágios iniciais de infecção podem não fornecer uma resposta imune ideal para lidar com os últimos estágios da infeção.

O controle adequado durante os últimos estágios de infecção pode requerer células T que são específicas para os antígenos particulares que são expressados neste momento.

As vacinas de pós-exposição que diretamente alvejam as bactérias persistentes dormentes podem ajudar na proteção contra a reativação de TB, realçando deste modo o controle da TB, ou permitindo ainda a depuração da infecção.

Uma vacina que alvejasse a TB latente portanto reduziria significante e economicamente as taxas de infecção pela TB global.

As vacinas de subunidade com base nos antígenos de estágio tardio também seriam utilizadas em combinação com antígenos de estágio inicial para fornecer uma vacina de fase múltipla.

Alternativamente, os antígenos de estágio tardio seriam usados para complementar e melhorar a vacinação do BCG (pelo reforço da resposta do BCG ou através do desenvolvimento de cepas do BCG recombinates avançadas). Rv2386c, também conhecido como Mbtl, catalisa a transformação inicial na biossíntese de micobactina pela converção de corismato para salicilato (Zwahlen et al.

Biochemistry 2007 46: 954-964).

: 19 : Rv2386 foi anteriormente identificado como estando associado com a expressão sob condições de estresse embora não resultasse na proteção quando administrado como uma vacina de DNA em um modelo de porquinho da Índia (Vipond er al. Vaccine 2006 24: 6340-6350).

! : 5 Recentemente, uma faixa de candidatos à vacina contra a M. tuberculosis foi proposta com base em uma análise de bioinformática do ' genoma inteiro da M. tuberculosis (Zvi et al. BMC Medical Genetics 2008 1: 18) e no teste de proteínas diferencialmente expressadas em indivíduos ativa e latentemente infectados (Schuck SD et al. PLoS ONE 2009 4(5): e5590).

Embora os macrófagos tenham sido mostrados atuar como os efetores principais da imunidade à Mycobacterium, as células T são os indutores predominantes de tal imunidade. O papel essencial das células T na proteção contra a tuberculose é ilustrada pelas taxas aumentadas de reativação de TB nos indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência humana, devido ao esgotamento associado de células T CD4+. Além disso, a transferência adotiva de células T CD4+ empreeendida no auge da resposta | imune primária para M. tuberculosis mostrou conferir proteção contra M. tuberculosis em camundongos deficientes em célula T (Orme et al J. Exp. Med. 1983 158: 74-83).

As células T CD4+ reativas com Mycobacterium foram mostradas ser produtoras potentes de interferon y (IFN-y), que, por sua vez, tem sido mostrado deflagrar os efeitos anti-micobacterianos de macrófagos em camundongos (Flynn et al. J. Exp. Med. 1993 178: 2249-2254). Embora o papel de IFN-y nos seres humanos seja menor claro, estudos têm mostrado — que 1,25-diidróxi-vitamina D3, sozinha ou em combinação com IFN-y ou fator-alfa de necorse de tumor, ativa macrófagos humanos para inibir a infecção pela M. tuberculosis. Além disso, é conhecido que IFN-y estimula macrófagos humanos a fabricar 1,25-diidróxi-vitamina D3. Similarmente, a interleucina-12 (IL-12) tem sido mostrada desempenhar um papel no estímulo

: 20 : da resistência à infecção pela M. tuberculosis. Para uma revisão da imunologia da infecção pela M. tuberculosis, ver Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Patogenesis, Protection and Control (bloom ed., 1994), Tuberculosis (2º ed., Rom and Garay, eds., 2003), e Harrison's Principles of : 5 Internal Medicine, Capítulo 150, pp. 953-966 (16º ed., Braunwald, et al., eds., 2005). ' A presente invenção no geral diz respeito à identificação de Rv2386c como um antígeno de TB (em particular um antígeno associado com a TB latente) e aos métodos e usos relacionados na prevenção e tratamento de TB, especialmente na prevenção e tratamento de TB latente e na prevenção ou retardo da reativação de TB.

A invenção portanto fornece uma proteína de Rv2386c, variante desta ou fragmento imunogênico desta, ou um polinucleotídeo que codifica a dita proteína, variante ou fragmento, para o uso no tratamento ou prevenção de TB. Adequadamente, o uso pode ser especificamente na prevenção e tratamento de TB latente (especialmente no tratamento de TB latente). Alternativamente, o uso pode ser na prevenção ou retardo da reativação de TB (especialmente no retardo da reativação de TB, por exemplo por um período de meses, anos ou ainda indefinidamente).

O termo “espécie de Mycobacterinm do complexo da tuberculose” inclui aquelas espécies tradicionalmente consideradas como causando a doença de tuberculose, assim como espécies ambientais e oportunísticas de Mycobacterium que causam tuberculose e doença pulmonar em pacientes imuno comprometidos, tais como pacientes com AIDS, por exemplo, M tuberculosis, M. bovis, ou M. africanum, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitim, e M. scrofulaceum (ver, por exemplo,, Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, pp. 953-966 (16º

EQ toeSeetlcoiMdciooMMmemliemiu"":.;xrilu st SS O OO AO Ao taÃÃOoc : 21 : ed., Braunwald, et al., eds., 2005). A presente invenção é particularmente direcionada à infecção com M. tuberculosis.

O termo “infecção ativa” refere-se a uma infecção (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) com sintomas e/ou lesões da doença —manifestados(adequadamente com sintomas da doença manifestados). i Os termos “infecção inativa”, “infecção dormente” ou ' “infecção latente” referem-se a uma infecção (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) sem sintomas e/ou lesões da doença manifestados (adequadamente sem sintomas da doença manifestados).

O termo “tuberculose primária” refere-se à doença clínica (manifestação de sintomas da doença) diretamente a seguir da infecção (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis). Ver, Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, pp. 953-966 (16º ed., Braunwald, et al., eds., 2005).

Os termos “tuberculose secundária” ou “tuberculose pós primária” referem-se à reativação de uma infecção dormente, inativa ou latente (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis). Ver, Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, pp. 953-966 (16º ed, Braunwald, et al., eds., 2005).

O termo “reativação da tuberculose” refere-se à manifestação posterior de sintomas da doença em um indivíduo que testa positivo quanto ao teste de infecção (por exemplo, em um teste de pele de tuberculina, adequadamente em um ensaio com base em célula T in vitro) mas não tem sintomas aparentes da doença. O teste de diagnóstico positivo indica que o indivíduo é infectado, entretanto, o indivíduo pode ter manifestado anteriormente ou não sintomas da doença ativa que foi tratada suficientemente para levar a tuberculose em um estado inativo ou latente. Será reconhecido que os métodos para a prevenção, retardo ou tratamento de reativação da sÓ OSS oi, ÍPF0O |

: 22 : tuberculose pode ser iniciados em um indivíduo que manifeste sintomas ativos da doença.

O termo tuberculose “resistente a medicamento” refere-se a uma infecção (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) em que a cepa : 5 — infecciosa não é mantida estática ou morta (isto é, é resistente a) um ou mais dos agentes quimioterapêuticos chamados de “linha de frente” eficazes em ' tratar a tuberculose (por exemplo, isoniazid, rifampin, etambutol, | estreptomicina e pirazinamida). O termo tuberculose “resistente a medicamento múltiplo” — refere-se a uma infecção (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) em que | a cepa infecciosa é resistente a dois ou mais dos agentes quimioterapêuticos da “linha de frente” eficazes no tratamento da tuberculose.

Um “agente quimioterapêutico” refere-se a um agente l farmacológico conhecido e usado na técnica para tratar a tuberculose (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis). Os agentes farmacológicos exemplificados usados para tratar tuberculose incluem, mas não são limitados a amicacina, ácido aminossalicílico, capreomicina, ciclosserina, etambutol, etionamida, isoniazid, canamicina, pirazinamida, rifamicinas (isto é, rifampin, rifapentina e rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina e fluoroquinolonas.

Agentes quimioterapêuticos de “Primeria linha” ou “Linha de frente” usados para tratar a tuberculose que não é resistente a medicamento incluem isoniazid, rifampin, etambutol, estreptomicina e pirazinamida.

Os agentes quimioterapêuticos de “segunda linha” usados para tratar a tuberculose que tem demonstrado resistência a — medicamento a um ou mais medicamentos de “primeria linha” incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminossalicílico, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina.

Tais agentes farmacológicos são revisados no Capítulo 48 de Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman and Limbird eds., 2001. rr

: 23 : Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados intercambiavelmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos também se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial —deum aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, assim como aos polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente e polímeros de ' aminoácido que não ocorrem naturalmente. Adequadamente um polipeptídeo de acordo com a presente invenção consistirá apenas de resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente, especialmente aqueles aminoácidos — codificado pelo código genético.

O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos que ocorrem naturalmente e sintético, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e O-fosfosserina. Análogos de aminoácido referem-se aos compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono a que é ligado a um hidrogênio, um grupo —carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificadas, mas retém a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. Os miméticos de aminoácido referem-se — aos compostos químicos que tem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona em uma maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente. Adequadamente um aminoácido é um aminoácido que ocorre naturalmente ou um análogo de aminoácido,

OS OA

: 24 : especialmente um aminoácido que ocorre naturalmente e em particular aqueles aminoácidos codificados pelo código genético. “Ácido nucléico” refere-se aos desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes na forma de filamento único ou duplo.

O : 5 — termo abrange ácidos nucléicos contendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificados, que são sintéticos, ' que ocorrem naturalmente, e que não ocorrem naturalmente, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucléico de referência, e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência.

Os exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirais, 2-O-metil | ribonucleotídeos, peptídeo-ácido nucléicos (PNAs). Adequadamente o termo “ácido nucléico” refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos que ocorrem naturalmente e polímeros destes.

A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido : nucléico particular também implicitamente abrange variantes desta : conservativamente modificadas (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares, assim como a sequência | explicitamente indicada (adequadamente a mesma se refere à sequência | 20 explicitamente indicada). Especificamente, as substituições de códon | degenerado podem ser obtidas pela geração de sequências em que a terceira | posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituídos com | resíduos de base mista e/ou resíduos de desoxiinosina (batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J.

Biol.

Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol.

Cell.

Probes 8: 91-98 (1994)). O termo ácido nucléico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.

Os aminoácidos podem ser aqui aludidos pelos seus símbolos de três letras habitualmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra

OQ——Q———————tÔoeaoec.-,«ê ic s—— —D ——p e o OM Pp SÓ AM: SMS MAO“ “P“T ir 561 Ar ., >." WS A OO : 25 j recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

Os nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser aludidos pelos seus códigos de letra única habitualmente aceitos.

Pelo termo “sequência de proteína de Rv2386c? como aqui : 5 —usadoé intencionada a sequência de polipeptídeo fornecida na SEQ ID No: 1 ou um homólogo desta de uma espécie de Mycobacterium do complexo da * tuberculose, por exemplo, uma espécie tal como M. tuberculosis, M. bovis, ou M. africanum, ou uma espécie de Mycobacterium que seja é ambiental ou oportunística e que cause infecções oportunísticas tais como infecções pulmonares em hospedeiros imuno comprometidos (por exemplo, pacientes com AIDS), por exemplo, BCG, M. avium, M. intracellulare, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum] M. kansasil M. simiae, M. vaccae, M.

Jortuitum, e M. scrofulaceum (ver, por exemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, pp. 953-966, 16º ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Para garantir uma alta taxa de eficácia entre hospedeiros vacinados, os componentes de uma vacina devem ser bem conservados entre as cepas de significância clínica.

Adequadamente, a proteína Rv2386c é derivada da H37Rv de M. tuberculosis (isto é, a sequência de polipeptídeo — fornecida na SEQ ID No: 1) ou um homólogo desta de uma outra cepa de M. tuberculosis (tal como as cepas CDC1551, F11, Haarlem A e O). A cepas de M. tuberculosis que são associadas com a resistência a medicamento (por exemplo, MDR ou especialmente XDR) são uma base particularmente valiosa para a sequência de proteína de Rv2386c.

As cepas de interesse incluem: CDCI1551 - cepa transmissível e virulenta Família Haarlem (tal como Haarlem A) - Cepas resistentes a medicamento encontradas em populações humanas comprimidas.

Os membros da Família Haarlem de cepas de M. tuberculosis foram encontradas SNS As A AAA AAA AAA A t 26 i em muitas partes do mundo.

O primeiro representante da família foi descoberto em Haarlem, Países Baixos.

KZN4207 - Sensível a medicamento isolado de pacientes em KwaZulu-Natal, África do Sul : 5 KZN1435 - Resistente a medicamento múltiplo (MDR) isolado i de pacientes em KwaZulu-Natal, África do Sul w KZN605 - Extensivamente resistente a medicamento (XDR) : isolado de pacientes em KwaZulu-Natal, África do Sul C - Altamente transmitida na Cidade de Nova Iorque.

Em um estudo esta cepa foi descoberta ser mais comum entre usuários de drga injetável e resistente aos intermediários de nitrogênio reativo (Friedman et al.

J.

Infect.

Dis. 1997 176(2): 478-84) 94 MA4241A - Isolado em San Francisco em 1994 de um | paciente nascido na China. esta cepa foi anteriormente analisada pela análise dedeleção genômica (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8): 2869-2873). 02 1987 - Isolado em San Francisco em 2002 de um paciente nascido na Coréia do Sul.

Esta cepa foi anteriormente analisada pela análise de deleção genômica (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8): 2869-2873). T92 - Isolado em San Francisco em 1999 de um paciente nas —cidosnas Filipinas.

Esta cepa foi publicada em Hirsh er al.

PNAS 2004 101: 4871-4876). T85 - Isolado em San Francisco em 1998 de um paciente nascido na China.

Esta cepa foi publicada em Hirsh et al.

PNAS 2004 101: 4871-4876). EASO054 - Isolado em San Francisco em 1993 de um paciente nascido na Índia.

Esta cepa foi anteriormente analisada pela análise de deleção genômica (Gagneux et al., PNAS 2006 103(8): 2869-2873).

: 27 : Gagneux et al., PNAS 2006 103(8): 2869-2873 e Herbert et al. Infect. Immun. 2007 75(12): 5798-5805 fornecem fundo valioso na faixa de cepas de M. tuberculosis que são conhecidas existir.

Mais adequadamente, a proteína Rv2386c é selecionada da : 5 — sequência de polipeptídeos fornecida nas SEQ ID Nos: | e 3 a 7, em particular SEQ ID Nos: 1 e 3 a 6, tal como a SEQ ID No: 1. ? Os polinucleotídeos de interesse particular são aqueles que compreendem (tal como que consiste de) uma sequência que codifica: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variantee de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (11) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

Os polinucleotídeos adequadamente compreenderão (tal como consistirão de) uma variante da SEQ ID NO:2 ou fragmento da SEQ ID NO:2 que codifica um fragmento imunogênico de uma proteína Rv2386c.

COMBINAÇÕES Os polipeptídeos relacionados com Rv2386c da presente invenção podem compreender ainda outros componentes planejados para realçar a sua imunogenicidade ou melhorar estes antígenos em outros aspectos. Por exemplo, a isolação melhorada do antígenos de polipeptídeo pode ser facilitada através da adição de um trecho de resíduos de histidina (habitualmente conhecido como um rótulo His) a uma extremidade do antígeno.

O termo “rótulo His” refere-se a uma carreira de resíduos de histidina, tipicamente seis resíduos, que são inseridos dentro da sequência de referência. Para minimizar o rompimento da atividade associada com a sequência de reference, um rótulo His é tipicamente inserido no terminal N, de modo usual imediatamente depois do resíduo de metionina iniciador, ou Nr " o

: 28 : à ainda no terminal C. eles são usualmente heterólogos com a sequência nativa mas são incorporados visto que eles facilitam a isolação pela melhora da ligação da proteína às resinas de cromatografia de afinidade a metal imobilizadas (IMAC). Falando no geral a presença ou ausência de um rótulo : 5 —Hisnão é de significância do ponto de vista de evocar uma resposta imune desejável contra a proteína de referência. Entretanto, para evitar o risco de : uma reação adversa contra o próprio rótulo His, é considerado melhor minimizar o comprimento do rótulo His por exemplo, a quatro ou menos resíduos, em particular dois resíduos (ou excluir o uso de um rótulo His totalmente).

Melhorar a magnitude e/ou magnitude da resposta imune evocada as composições, polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção podem compreender cópias múltiplas do antígeno da invenção e/ou polipeptídeos heterólogos adicionais (ou polinucleotídeos que os codificam) da espécie de ! 15 Mycobacterium (em particular M. tuberculosis).

Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que quando vários componentes são utilizados em combinação, a apresentação exata pode ser variada. Por exemplo, um componente Rv2386c e uma cópia adicional do antígeno da invenção ou um componente de antígeno heterólogo adicional seria apresentado: (1) como dois componentes de polipeptídeo individuais; (2) como uma proteína de fusão que compreende ambos os componentes de polipeptídeo; (3) como um componente de polipeptídeo e um de — polinucleotídeo; (4) como dois componentes de polinucleotídeo individuais; (5) como um único polinucleotídeo que codifica dois componentes de polipeptídeo individuais; ou pNCN—.—OÓÇc E «ses ccccateqac0cc”—— e — DDS AAA :Cl.Ôó9“ Ss CPA NEHIY2->5252 na nA,?)YV-l0SUMRT > ya ?? ) 1 0ô Ba. no Io] s70 a = 0 . "0 . ' 29 : (6) como um único polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende ambos os componentes de polipeptídeo.

Esta flexibilidade aplica-se igualmente às situações onde três ou mais componentes são usados em combinação.

Entretanto, por À 5 conveniência, é frequentemente desejável que quando vários componentes estão presentes eles estejam contidos dentro de uma única proteína de fusão Í ou um polinucleotídeo que codifica uma única proteína de fusão.

Em uma forma de realização da invenção todos os componentes de antígeno são fornecidos como polipeptídeos (por exemplo, dentro de uma única proteína de fusão). Em uma forma de realização alternativa da invenção todos os componentes de antígeno são fornecidos como polinucleotídeos (por exemplo, um único polinucleotídeo, tal como um que codifica uma única proteína de fusão). O termo “heterólogos” quando usado com referência às 15º porções de um ácido nucléico indica que o ácido nucléico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza.

Por exemplo, o ácido nucléico é tipicamente recombinantemente produzido, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para compor um novo cido nucléico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região codificadora de uma outra fonte.

Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão). “Polipeptídeo de fusão” ou “proteína de fusão” referem-se a uma proteína tendo pelo menos dois polipeptídeos heterólogos (por exemplo, pelo menos dois polipeptídeos de Mycobacterium sp.) covalentemente ligados, diretamente ou via um ligador de aminoácido.

Os polipeptídeos que formam a proteína de fusão são tipicamente ligados do terminal C ao terminal N, embora eles possam também estar ligados do terminal C ao terminal C, do

| : terminal N ao terminal N, ou terminal N ao terminal C. Os polipeptídeos da proteína de fusão podem ser em qualquer ordem. Este termo também refere-se a variantes conservativamente modificadas, variantes polimórficas, alelos, mutantes, fragmentos imunogênicos, e homólogos interespécie dos antígenos . 5 que compõem a proteína de fusão. Os antígenos de Mycobacterium tuberculosis são descritos em Cole et al., Nature 393: 537 (1998), que divulga ' o genoma da Mycobacterium tuberculosis inteiro. Os antígenos de outras espécies de Mycobacterium que correspondem aos antígenos de M. tuberculosis podem ser identificados, por exemplo, usando algoritmos de comparação de sequência, como aqui descrito, ou outros métodos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, por exemplo, ensaios de hibridização e ensaios de ligação de anticorpo.

O termo “fundido” refere-se à ligação covalente entre dois polipeptídeos em uma proteína de fusão. Os polipeptídeos são tipicamente unidos via uma ligação peptídica, diretamente entre si ou via um ligador de aminoácido. Opcionalmente, os peptídeos podem ser unidos via ligações covalentes não peptídicas conhecidas por aqueles de habilidade na técnica.

Os antígenos de Exemplary M. tuberculosis que pode ser combinado com Rv2386c incluem um ou mais (por exemplo, 1 a 5, tal como 1a3,em particular 1) dos seguintes (tais como um ou mais de (i) a (xii)): (1) Mtb8,4 (também conhecido como DPV e Rvl11740), a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 102 da WO97/09428 (cDNA na SEQ ID No: 101) e em Coler er al Journal of Immunology 1998 161: 2356-2364. De interesse particular é a sequência — Mtb8,4 madura que é ausente no peptídeo de sinal condutor (isto é, resíduos de aminoácido de 15 a 96 da SEQ ID No: 102 da WO97/09428). A sequência de polipeptídeo de tamanho natural de Mtb8,4 é mostrada na SEQ ID No: 8; (1) Mtb9,8 (também conhecido como MSL e Rv0287), a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 109 da

OO Oiii HX.:2S ii “5 “”“” )0s aZ7 a ss!

: 31

; WO98/53075 (fragmentos de MSL são divulgados nas SEQ ID Nos: 110 a 124 da WO98/53075, SEQ ID Nos: 119 e 120 sendo de interesse particular) e também em Coler er al Vaccine 2009 27: 223-233 (em particular os fragmentos reativos mostrados na Figura 2 nesta). À sequência de

. 5 — polipeptídeo de tamanho natural para Mtb9,8 é mostrada na SEQ ID No: 9;

(iii) Mtb9,9 (também conhecido como Mtb9,9A, MTI, MTI--A

Í e Rv1793) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 19 da WO98/53075 e em Alderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7: 551-559 (fragmentos de MTI são divulgados nas SEQ ID Nos: 17 e 51 a 66 da WOS98/53075, SEQ ID Nos: 17, 51, 52, 53, 56 e 62 a 65 sendo de interesse particular). Várias variantes de polipeptídeo de MTI são descritas nas SEQ ID Nos: 21, 23, 25, 27, 29 e 31 da WO98/53075 e em Alderson et al Journal of Experimental Medicine 2000 7: 551-559. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Mtb9,9 é mostrada na SEQ ID No: 10;

(iv) Ral2 (também conhecido como antígeno de terminal C de Mtb32A) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 10 da WO01/98460 e em Skeiky et al Journal of Imunology 2004 172: 7618-7682. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Ral2 é mostrada na SEQ ID No: 11;

(v) Ra35 (também conhecido como antígeno de terminal N de Mtb32A) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 8 da WO01/98460 e em Skeiky et al Journal of Imunology 2004 172: 7618-7682. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Ra35 é mostrada na SEQ ID No: 12;

(vi) TCH9 (também conhecido como Mtb39, Mtb39A, TbH9FL e Rv1196) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 107 da WO97/09428, e também em Dillon et al Infection and Immunity 1999 67(6): 2941-2950 e Skeiky et al Journal of Immunology 2004 172:

PC— ne ea ii a ii aro mA NÓ SÓSKÁÉEÉúÍÉÂÂOâMJN e OA), 2.“ç AO OT : 32 : 7618-7682. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para TDH9 é mostrada na SEQ ID No: 13;

(vii) Mtb40 (também conhecido como HTCC1 e Rv3616c) à sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 138 da —WO98/53075 (cDNA na SEQ ID No: 137). A sequência de polipeptídeo de

' tamanho natural para Mtb40 é mostrada na SEQ ID No: 14;

: (viii) Mtb41 (também conhecido como MTCC2 e Rvy0915c) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 142 da WO98/53075 (cDNA na SEQ ID No: 140) e em Skeiky er al Journal of

—Imunology 2000 165: 7140-7149. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Mtb41 é mostrada na SEQ ID No: 15;

(ix) ESAT-6 (também conhecido como esxA e Rv3875) a sequência de polipeptídeo do qual é descrita na SEQ ID No: 103 da WOS97/09428 (cCDNA na SEQ ID No: 104) e em Sorensen et al Infection and

Immunity 1995 63(5): 1710-1717. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para ESAT-6 é mostrada na SEQ ID No: 16

(x) antígenos complexos Ag85 (por exemplo, Ag85A, também conhecido como fbpA e Rv3804c; ou Ag85B, também conhecido como fbpB e Rv1886c) que são debatidos, por exemplo, em Content et al Infection and

—Immunity 1991 59: 3205-3212 e em Huygen et al Nature Medicine 1996 2(8): 893-898. A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Ag85A é mostrada na SEQ ID No: 17 (a proteína madura dos resíduos 43 a 338, isto é, a falta do peptídeo de sinal, sendo de interesse particular). A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Ag85B é mostrada na SEQ ID No: 18 (a

— proteína madura dos resíduos 41 a 325, isto é, a falta do peptídeo de sinal, sendo de interesse particular);

(xi) Alfa-cristalina (também conhecido como hspX e Rv2031c) que é descrito em Verbon et al Journal of Bacteriology 1992 174: 1352-1359 e Friscia et al Clinical and Experimental Immunology 1995 102:

sSSO"»,Eeqeeaseoeessee poeta —— — — —— Re np Sm a Ao A MM ÂÂXI!MSTISTS A e : 33 ? 53-57 (de interesse particular são os fragmentos que correspondem aos resíduos 71 a 91,21 a 40,91 a 110 e 111 a 130). A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para alfa-cristalina é mostrada na SEQ ID No: 19; (xii) Mpt64 (também conhecido como Rv1980c) que é descrito : 5 em Roche er al Scandinavian Journal of Immunology 1996 43: 662-670. À sequência de polipeptídeo de tamanho natural para MPT64 é mostrada na ' SEQ ID No: 20 (a proteína madura de resíduos 24 a 228, isto é, a falta do peptídeo de sinal, sendo de interesse particular):

(xiii) Mtb32A, a sequência de polipeptídeo do qual é descrita naSEQID No: 2 (tamanho natural) e resíduos 8 a 330 da SEQ ID No: 4 (madura) da WO01/98460, especialmente variantes tendo pelo menos um da tríade catalítica mutado (por exemplo, o resíduo de serina catalítico, que por exemplo pode ser mutado para alanina). A sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Mtb32A é mostrada na SEQ ID No: 21. A forma madura de Mtb32A tendo uma mutação Ser/Ala é mostrada na SEQ ID No: 22;

(xiv) TB10,4, a sequência de polipeptídeo de tamanho natural para TB10,4 é mostrada na SEQ ID No: 23

(xv) Rv1753c, a sequência de polipeptídeo de tamanho natural

—paraRvl753c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv é mostrada na SEQ ID No: 155; e/ou

(xvi) Rv2707c, a sequência de polipeptídeo de tamanho natural para Rv2707c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv é mostrada na SEQ ID No: 156.ou combinações destes, tais como (por exemplo combinações tais

— comode(a)a(g)):

(a) uma combinação de componentes Ral2, TDH9 e Ra35, por exemplo na forma de uma proteína de fusão, tal como Mtb72f.

À sequência de polipeptídeo de Mtb72f é descrita na SEQ ID No: 6 da WO2006/117240 (cCDNA na SEQ ID No: 5) e em Skeiky et al Journal of Immunology 2004

: 34 ; 172: 7618-7682 (onde a mesma incorpora um rótulo His opcional para ajudar na purificação, quando utilizada na presente invenção adequadamente Mtb72f é ausente dos resíduos de histidina opcionais). A sequência de polipeptídeo para Mtb72f é mostrada na SEQ ID No: 24; . 5 (b) uma combinação dos componentes Ral2, TDH9 e Ra35 | mutados em Ser/Ala (isto é, onde o resíduo de serina catalítico foi substituído com alanina), por exemplo na forma de uma proteína de fusão, tal como M72. A sequência de polipeptídeo de M72 é descrita na SEQ ID No: 4 da WO2006/117240 (cCDNA na SEQ ID No: 3) onde a mesma incorpora uma histidina dupla opcional para ajudar na fabricação, quando utilizada na presente invenção M72 também pode incorporar uma histidina dupla embora adequadamente M72 esteja ausente da histidina dupla opcional (isto é, os resíduos 4 a 725 da SEQ ID No: 4 da WO2006/117240 são de interesse particular). A sequência de polipeptídeo para M72 é mostrada na SEQ ID No: 25 (c) uma combinação de componentes Mtb8,4, Mtb9,8, Mtb9,9 e Mtb41, por exemplo na forma de uma proteína de fusão, tal como Mtb71f.

A sequência de polipeptídeo de Mtb71f está descrita na SEQ ID No: 16 da WO99/051748 (cDNA na SEQ ID No: 15), onde a mesma incorpora um rótulo His opcional para ajudar na purificação, quando utilizada na presente invenção adequadamente Mtb71f corresponde aos resíduos de aminoácido 9 a 710 da SEQ ID No: 16 da WO99/051748. A sequência de polipeptídeo para Mtb71f é mostrada na SEQ ID No: 26; (d) uma combinação de Mtb72f ou M72 (adequadamente sem — resíduos de histidina opcionais para ajudar na expressão) com Mtb9,8 e Mtb9,9, por exemplo em uma proteína de fusão.

A sequência de polipeptídeo para uma fusão M72-Mtb9,9-Mtb9,8 é mostrada na SEQ ID No: 27 (fusão M92), quando usada na presente invenção, a fusão M72-Mtb9,9-Mtb9,8 pode

O.ODÇPÇPPÂ2sSD.YPÉ5.———<-nSp—S— ps see see ss ss om . 1 0. I >"... ” vo º-ÚVa2 o. >= : 35 + opcionalmente incorporar uma histidina dupla a seguir do resíduo de metionina iniciador para ajudar na fabricação; (e) uma combinação de Mtb72f ou M72 (adequadamente sem resíduos de histidina opcionais para ajudar na expressão) com Ag85B, por : 5 —exemploem uma proteína de fusão, tal como Mtb103f. A sequência de polipeptídeo de Mtb103f é descrita na SEQ ID No: 18 da WO03/070187 : (cDNA na SEQ ID No: 10), onde a mesma incorpora um rótulo His opcional para ajudar na purificação, quando utilizada na presente invenção adequadamente Mtb103f corresponde aos resíduos de aminoácido de 8 a 1016 da SEQID No: 18 da WO03/070187. Também de interesse particular é M103, isto é, Mtb103f que incorpora uma mutação Ser/Ala no componente Ra35, quando utilizada na presente invenção adequadamente MI103 corresponde aos resíduos de aminoácido de 8 a 1016 da SEQ ID No: 18 da WO03/070187 em que o resíduo Ser na posição 710 foi substituído com Ala.

A sequência de polipeptídeo para M103 é mostrada na SEQ ID No: 28, quando usada na presente invenção, a fusão M72-Mtb9,9-Mtb9,8 pode opcionalmente incorporar uma histidina dupla a seguir do resíduo de metionina iniciador para ajudar na fabricação; (f uma combinação de Mtb72f ou M72 (adequadamente sem — resíduos de histidina opcionais para ajudar na expressão) com Mtb41, por exemplo em uma proteína de fusão, tal como Mtb114f. A sequência de polipeptídeo de Mtb114f é descrita na SEQ ID No: 16 da WO03/070187 (cDNA na SEQ ID No: 9), onde a mesma incorpora um rótulo His opcional para ajudar na purificação, quando utilizada na presente invenção — adequadamente Mtb114f corresponde aos resíduos de aminoácido de 8 a 1154 da SEQ ID No: 16 da WO03/070187. Também de interesse particular é MI14, isto é, Mtb114f que incorpora uma mutação Ser/Ala no componente Ra35, quando utilizada na presente invenção adequadamente MI114 corresponde aos resíduos de aminoácido de 8 a 1154 da SEQ ID No: 16 da

O OOOA...Ç.YÇO.O— OD. .Y-29PAÇ.Ç.,. 5.S O0SSO5.j«O..ÇÉÇ.DPRÍ« SA see ss ses ss aceno 0 o 1 "20" “SS “ ls. . — "ni" =“ lo ..-ssSS.l..í."" : 36 t WO03/070187 em que o resíduo Ser na posição 710 foi substituído com Ala. | A sequência de polipeptídeo para M114 é mostrada na SEQ ID No: 29, | quando usada na presente invenção, a fusão M72-Mtb9,9-Mtb9,8 pode opcionalmente incorporar uma histidina dupla a seguir do resíduo de . 5 —metioninainiciador para ajudar na fabricação; | (g) uma combinação de componentes Ag85B e ESAT-6, tal ' como em uma fusão descrito em Doherty et al Journal of Infectious Diseases 2004 190: 2146-2153; e/ou (h) uma combinação de componentes Ag85B e TB10,4, tal —comoem uma fusão descrita em Dietrich et al Journal of Immunology 2005 174(10): 6332-6339 190: 2146-2153.

As combinações de um componente Rv2386c e um componente Mtb40 são de interesse particular. Obviamente tais combinações opcionalmente podem conter outros componentes de antígeno adicionais (por exemplo, um componente M72).

Uma outra combinação de interesse compreende um componente Rv2386c e um componente M72.

Uma outra combinação de interesse compreende um componente Rv2386c e um componente Rv1753c.

Outras combinações de interesse incluem aquelas que compreendem um componente Rv2386c e um componente Rv2707c.

Uma combinação adicional de interesse compreende um componente Rv2386c e um componente alfa-cristalina.

A pessoa habilitada reconhecerá que combinações não — necessitam contar com as sequências específicas descritas acima em (i) a (xvi) e (a) a (b), e que as variantes conservativamente modificadas (por exemplo, tendo pelo menos 70% de identidade, tal como pelo menos 80% de identidade, em particular pelo menos 90% de identidade e especialmente pelo menos 95% de identidade) ou fragmentos imunogênicos (por exemplo, pelo

O ÇÇÇ[ O... OQOD2—ÇCÇY—Ç———— ao aros pr ss e e e e e ss ! :- or 2" ""-.—.' 0. : 37 . menos 20% do antígeno de tamanho natural, tal como pelo menos 50% do antígeno, em particular pelo menos 70% e especialmente pelo menos 80%) das sequências descritos podem ser usados para se obter o mesmo efeito prático. . 5 Cada uma das sequências de antígeno individual acima | também é divulgada em Cole et al Nature 1998 393: 537-544 e Camus ' Microbiology 2002 148: 2967-2973. O genoma de M. tuberculosis H37Rv é publicamente disponível, por exemplo no sítio da web do Welcome Trust Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/Projects/M tuberculose/) e em outra parte, Muitos dos antígenos acima também são divulgados nos pedidos de patente U.S. números 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849 e em pedidos de patente PCT PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 e WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

As composições, polipeptídeos, e ácidos nucléicos da invenção também podem compreender polipeptídeos adicionais de outras fontes.

Por exemplo, as composições e proteínas de fusão da invenção podem incluir polipeptídeos ou ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos, em que o polipeptídeo realça a expressão do antígeno, por exemplo, NS1, uma proteína do virus da influenza (ver, por exemplo, a WO99/40188 e WO93/04175). Os — ácidos nucléicos da invenção podem ser engendrados com base na preferência de códon em uma espécie de escolha, por exemplo, seres humanos (no caso de expressão in vivo) ou uma bactéria particular (no case de produção de polipeptídeo).

, . 38 * O componente Rv2386c também pode ser administrado com um ou mais agentes quimioterapêuticos eficazes contra tuberculose (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis). Os exemplos de tais agentes quimioterapêuticos incluem, mas não são limitados a, amicacina, ácido . 5 —aminossalicílico, capreomicina, ciclosserina,y etambutol, etionamida, isoniazid, canamicina, pirazinamida, rifamicinas (isto é, rifampina, rifapentina | e rifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina e fluoroquinolonas. Tal quimioterapia é determinada pelo julgamento do médico encarregado do tratamento usando combinações de medicamento preferidas. Os agentes quimioterapêuticos de “primeria linha” usados para tratar a tuberculose (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) que não é resistente a medicamento incluem isoniazid, rifampin, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. Os agentes quimioterapêuticos de “segunda linha” usados para tratar tuberculose (por exemplo, infecção pela M. tuberculosis) que tem demonstrado resistência a medicamento a um ou mais medicamentos de “primeria linha” incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácido aminossalicílico, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina.

Os agentes quimioterapêuticos convencionais são no geral administrados em um período relativamente longo (cerca de 9 meses). À combinação de agentes quimioterapêuticos convencionais com a administração de um componente Rv2386c de acordo com a presente invenção pode permitir que o período de tratamento quimioterapêutico seja reduzido (por exemplo, para 8 meses, 7 meses, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 — meses oumenos)sem uma diminuição em eficácia.

De interesse particular é o uso de um componente Rv2386c em conjunção com o Bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Por exemplo, na forma de um BCG modificado que recombinantemente expressa Rv2386c (ou uma variante ou fragmento deste como aqui descrito). Alternativamente, o

N—— sr. .“p3ú“ a na[]!E?*%+ IS] 6 “é a"“"““VO PíPSÊ9A “a 00:>âPJÊ*S “iões. . .s-. : 39 3; componente Rv2386c pode ser usado para realçar a resposta de um indivíduo à vacinação do BCG, pela co-administração ou pelo reforço de uma vacinação do BCG anterior. Quando usado para realçar a resposta de um indivíduo à ; vacinação do BCG, o componente Rv2386c obviamente pode ser fornecido na | . 5 forma de um polipeptídeo ou um polinucleotídeo (opcionalmente em i conjuncção com componentes antigênicos adicionais como descrito acima).

' A pessoa habilitada reconhecerá que combinações de componentes não necesitam ser administradas juntas e podem ser aplicadas: separadamente ou em combinação; ao mesmo tempo, sequencialmente ou dentro de um período curto; através da mesma via ou através de vias diferentes. Não obstante, por conveniência é no geral desejável (onde os regimes de administração são compatíveis) administrar uma combinação de componentes como um única composição.

Os polipeptídeos, polinucleotídeos e composições da presente invenção usualmente serão administradas aos seres humanos, mas são eficazes em outros mamíferos incluindo mamíferos domésticos (por exemplo, cães, gatos, colehos, ratos, camundongos, porquinhos da Índia, hamsters, chinchilas) e mamíferos agrícolas (por exemplo, vacas, porcos, ovelha, cabras, cavalos).

“FRAGMENTOS IMUNOGÊNICOS Os epítopos de célula T são trechos contíguos curtos de aminoácidos que são reconhecidos pelas células T (por exemplo, células T CDA4+ ou CD8+). A identificação de epítopos de célula T pode ser obtida através dos experimentos de mapeamento de epítopo que são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3º ed., 243-247 (1993); BeiBbarth er al Bioinformatics 2005 21(Supl. 1): 129-i37).

Alternativamente, os epítopos podem ser prognosticados usando os métodos debatidos nos Exemplos.

: 40 + Como um resultado do envolvimento crucial da resposta de célula T na tuberculose, está facilmente evidente que os fragmentos do polipeptídeo Rv2386c de tamanho natural que contém pelo menos um epítopo de célula T será imunogênico e pode contribuir para a imunoproteção. Tais ' 5 — fragmentos são aqui aludidos como fragmentos imunogênicos. Os fragmentos imunogênicos de acordo com a presente * invenção tipicamente compreenderão pelo menos 9 aminoácidos contíguos da sequência de polipeptídeo de tamanho natural (por exemplo, pelo menos 10), tal como pelo menos 12 aminoácidos contíguos (por exemplo, pelo menos 15 ou pelo menos 20 aminoácidos contíguos), em particular pelo menos 50 aminoácidos contíguos, tal como pelo menos 100 aminoácidos contíguos (por exemplo pelo menos 200 aminoácidos contíguos). Adequadamente os fragmentos imunogênicos serão pelo menos 20%, tal como pelo menos 50%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% do comprimento das sequência de polipeptídeo de tamanho natural.

Será entendido que em uma população hibridizada diversa, tal como os seres humanos, tipos HLA diferentes significam que epítopos específicos podem não ser reconhecidos por todos os membros da população. Consequentemente, para maximizar o nível de reconhecimento e escala de resposta imune a um polipeptídeo, é no geral desejável que um fragmento imunogênico contenha uma pluralidade dos epítopos da sequência de tamanho natural (adequadamente todos os epítopos).

Fragmentos particulares da proteína Rv2386c que podem ser de uso incluem aqueles contendo pelo menos um epítopo CD4+, — adequadamente pelo menos dois epítopos CD4+ e especialmente todos os epítopos CD4+ (tais como aqueles epítopos descritos nos Exemplos e nas SEQ ID Nos: 30 a 52, particularmente aqueles associados com uma | pluralidade de alelos HLA, por exemplo, aqueles associados com 2, 3, 4, 5 ou | mais alelos).

: : 41 $ Outros fragmentos da proteína Rv2386c que podem ser de uso incluem aqueles contendo pelo menos um epítopo CD8, adequadamente pelo menos dois epítopos CD8 e especialmente todos os epítopos CD8 (tais como aqueles epítopos descritos nos Exemplos e nas SEQ ID Nos: 53 a 154, . 5 — particularmente aqueles associados com uma pluralidade de alelos HLA, por exemplo, aqueles associado com 2, 3, 4, 5 ou mais alelos).

Ú Onde um fragmento individual do polipeptídeo de tamanho natural é usado, um tal fragmento é considerado ser imunogênico onde o mesmo evoca uma resposta que seja pelo menos 20%, adequadamente pelo menos 50% e especialmente pelo menos 75% (tal como pelo menos 90%) da atividade da sequência de referência em um ensaio de reestimulação in vitro de PBMC ou sangue integral com antígenos específicos (por exemplo, a reestimulação por um período de entre várias horas até duas semanas, tal como até um dia, 1 dia a 1 semana ou | a 2 semanas) que mede a ativação das células via linfoproliferação, produção de citocinas no sobrenadante de ; cultura (medido pelo ELISA, CBA etc) ou caracterização de respostas de célula T e B pelo tingimento intra e extracelular (por exemplo, usando anticorpos específicos para marcadores imunes, tais como CD3, CD4, CD8, 112, TNFa, IFNg, CD40L, CD69 etc) seguido pela análise com um citômetro —defluxo. Adequadamente, um fragmento é considerado ser imunogênico onde o mesmo evoca uma resposta que é pelo menos 20%, adequadamente pelo menos 50% e especialmente pelo menos 75% (tal como pelo menos 90%) da atividade da sequência de referência em um ensaio de proliferação de célula T e/ou produção de IFN-gama.

Em algumas circunstâncias uma pluralidade de fragmentos do polipeptídeo de tamanho natural (que podem ser sobrepostos ou não e podem abranger ou não a totalidade da sequência de tamanho natural) pode ser usado para obter uma resposta biológica equivalente à própria sequência de tamanho natural. Por exemplo, pelo menos dois fragmentos imunogênicos (tais como

AAA e e W.iisisss 2“ *IENCAÔÊ* )”SS O “MV Pa" " : 42 k três, quatro ou cinco) como descritos acima, que em combinação fornecem pelo menos 50%, adequadamente pelo menos 75% e especialmente pelo menos 90% da atividade da sequência de referência em um ensaio de reestimulação in vitro de PBMC ou sangue integral (por exemplo, um ensaio . 5 —deproliferaçãode célula T e/ou produção de IFN-gama).

VARIANTES “Variantes” ou “variantes conservativamente modificadas” aplicam-se tanto à sequência de aminoácido quanto à de ácido nucléico. Com respeito às sequências de ácido nucléico particulares, as variantes —conservativamente modificadas referem-se a aqueles ácidos nucléicos que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucléico não codifca uma sequência de aminoácido, para sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um número grande de ácidos nucléicos funcionalmente idêntico codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico levam às variantes “silenciosas” ou “degeneradas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácido nucléico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucléico. Uma pessoa de habilidade reconhecerá que cada códon em um ácido —nucléico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo é implicita em cada sequência descrita.

AAA AAA a a a A o a ES“ a o aa Mao SO STO O OEM MOSS MA SUE Re Ng E A e : 43 é Um polinucleotideo da invenção pode conter diversas variações silenciosas (por exemplo, de 1 a 50, tal como de 1 a 25, em particular de 1 a 5, e especialmente 1 códon pode ser alterado) quando comparado com a sequência de referência. Um polinucleotídeo da invenção : 5 — pode conter diversas variações conservativas não silenciosas (por exemplo, de 1 a 50, tal como de 1 a 25, em particular de 1 a 5, e especialmente 1 códon Ú pode ser alterado) quando comparado com a sequência de referência. As variações não silenciosas são aquelas que resultam em uma mudança na sequência de aminoácido codificada (através da substituição, deleção ou adição de resíduos de aminoácido). Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que uma sequência de polinucleotídeo particular pode conter variações conservativas tanto silenciosas quanto não silenciosas.

Em relação às variantes de uma sequência de proteína, a pessoa habilitada reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais aos polipeptídeo, que altera, adicioa ou deleta um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos é uma “variante conservativamente modificada” onde a(s) alteração(ões) resulta(m) na substituição de um aminoácido com um aminoácido funcionalmente similar ou a substituição/deleção/adição de resíduos que não impactam — substancialmente a função biológica da variante.

As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidos na técnica. tais variantes conservativamente modificadas são além disso e não excluem variantes polimórficas, interespécies homólogas, e alelos da invenção.

Um polipeptídeo da invenção pode conter várias substituições conservativas (por exemplo, de 1 a 50, tal como de 1 a 25, em particular de 1 a 10, e especialmente 1 resíduo de aminoácido pode ser alterado) quando comparado com a sequência de referência. No geral, tais substituições conservativas cairão dentro de um dos agrupamentos de aminoácido

CCN

: 44 h especificados abaixo, embora em algumas circunstâncias outras substituições podem ser possíveis sem afetar substancialmente as propriedades imunogênicas do antígeno. Os seguintes oito grupos cada um contém aminoácidos que são tipicamente substituições conservativas um do outro: . 5 1) Alanina (A), Glycine (G); | 2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucine (1), Leucine (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonine (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins 1984).

Adequadamente tais substituições não ocorrem na região de um epítopo, e portanto não tem um impacto significante sobre as propriedades imunogênicas do antígeno.

As variantes de proteína também podem incluir aquelas em que aminoácidos adicionais são inseridos comparados com a sequência de referência, por exemplo, tais inserções podem ocorrer em 1 a 10 posições (tal —comode1a5S posições, adequadamente 1 ou 2 posições, em particular 1 posição) e pode, por exemplo, envolver a adição de 50 ou menos aminoácidos em cada posição (tal como 20 ou menos, em particular 10 ou menos, especialmente 5 ou menos). Adequadamente tais inserções não ocorrem na região de um epítopo, e portanto não têm um impacto significante sobre as — propriedades imunogênicas do antígeno. Um exemplo de inserções inclui um trecho curto de resíduos de histidina (por exemplo, de 2 a 6 resíduos) para ajudar na expressão e/ou purificação do antígeno em questão.

As variantes de proteína incluem aquelas em que os aminoácidos foram deletadas comparadas com as sequência de referência, por

: 45 + exemplo, tais deleções podem ocorrer em 1 a 10 posições (tal como de 1 a 5 posições, adequadamente 1 ou 2 posições, em particular 1 posição) e pode, por exemplo, envolver a deleção de 50 ou menos aminoácidos em cada posição (tal como 20 ou menos, em particular 10 ou menos, especialmente 5 . 5 ou menos). Adequadamente tais deleções não ocorrem na região de um epítopo, e portanto não têm um impacto significante sobre as propriedades ' imunogênicas do antígeno.

A pessoa habilitada reconhecerá que uma variante de proteína particular pode compreender substituições, deleções e adições (ou qualquer combinação destes). Os métodos de determinar as regiões de epítopo de um antígeno são descritos e exemplificados nos Exemplos.

As variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade e omais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade (tal como pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%) com a sequência de referência associada.

Os termos “idêntica” ou “identidade percentual”, no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou sequências de polipeptídeo, referem-se a — duas ou mais sequências ou sub-sequências que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, 70% de identidade, opcionalmente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade em uma região especificada), quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou pelo alinhamento manual e inspeção visual.

Tais sequências são depois ditas serem “substancialmente idênticas.” Esta definição também refere-se ao compliment de uma sequência de teste.

— ww ..-kaBA227â“QA“ RN A “&ÓÕO& "i2ôiº5D ii"Í"CÓ6i, ”6ér2 o" ."0cs s SÉ iM .>I . 0d" : 46 ? Opcionalmente, a identidade existe em uma região que é de pelo menos cerca de 25 a cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento, ou opcionalmente em uma região que tem de 75 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento. Adequadamente, a : 5 comparação é realizada em uma janela que corresponde ao comprimento inteiro da sequência de referência.

: Para a comparação de sequência, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando do uso de um algoritmo de comparação de sequência, as — sequências de teste e referência são introduzidas em um computador, as cooredenadas da subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros de programa de Default podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algorítmo de comparação de sequência depois calcula as identidas de sequência percentuais para as sequências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.

Uma “janela de comparação”, como aqui usado, refere-se a um segmento em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas — sequências são otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzidos, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pela homologia do algoritmo de alinhamento de Needleman & —Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa quanto à similaridade de Pearson & Lipman, Proc.Nat'l.Acad.Sci. USA 85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WD, ou pelo ENS O, O, O e e rr

: 47 , alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)). Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP.

O PILEUP cria um alinhamento de sequência múltiplo de um grupo de sequências . 5 — relacionadas usando alinhamentos progressivos, aos pares para mostrar a relação e a identidade de sequência percentual.

Ele também plota uma árvore ] ou dendograma qu mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento.

O PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J.

Mol.

Evol. 35: 351-360 (1987). O método —usadoé similar ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma de um comprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos.

O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento aos pares das duas sequências mais similares, produzindo um grupo de duas sequências alinhadas.

Este grupo é depois alinhado à sequência mais relacionada seguinte ou grupo de sequências alinhadas.

Dois grupos de sequências são alinhadas por uma extensão simples do alinhamento aos pares de duas sequências individuais.

O alinhamento final é obtido por uma série de alinhamentos progressivos, aos pares.

O programa é conduzido pela designação de — sequências específicas e as suas coordenadas de aminoácido ou nucleotídeo para as regiões de comparação de sequência e pela designação dos parâmetros de programa.

Usando PILEUP, uma sequência de referência é comparada a outras sequências de teste para determinar a relação de identidade de sequência percentual usando os seguintes parâmetros: peso de intervalo de default (3,00), peso do comprimento do intervalo de default (0,10), e intervalos de extremidade pesados.

O PILEUP pode ser obtido do pacote de software de análise de sequência GCG, por exemplo, a versão 7.0 (Devereaux et al., Nuc.

Acids Res. 12: 387-395 (1984). DME E A A a A AAA A A A A

| : 48 | ; ' . Um outro exemplo de algoritmo que é adequado para ! | i determinar a identidade de sequência percentual e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., . Nuc.

Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) e Altschul er al., J.

Mol.

Biol. 215: . S —403-410 (1990), respectivamente.

O software para realizar as análises de BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (sítio da web em www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este ' algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequência de alta contagem (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência dúvida, que se iguale ou satisfaça alguma contagem de limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de referência.

T é aludido como o limiar de contagem de palavra da vizinhança (Altschul et al., supra). Estes acertos de palavra da vizinhança inicial atua como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPsmais longas que as contenham.

Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para tão longa quanto a contagem de alinhamento acumulativo possa ser aumentado.

As contagens acumulativas são calculadas usando, para as sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recomepnsa para um par de resíduos que se —emparelham; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos desemparelhados; sempre < 0). Para as sequências de aminoácido, uma matriz de contagem é usada para calcular a contagem acumulativa.

A extensão dos acertos de palevra em cada direção são parados quando: a contagem de alinhamento acumulativo cai fora pela quantidade X do seu valor máximo — obtido; a contagem acumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o final de cada sequência é atingido.

Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento.

O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como defaults um !

; o | ? comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5,N=-4 e uma comparação de ambos os filamentos.

Para as sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como defaults um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem BLOSUM62 . 5 (ver Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 89: 10915 (1989)) alinhamentos (b) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N=-,e uma CG comparação de ambos os filamentos.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, —Proc.Nat'l.Acad.Sci.

USA 90: 5873-5787 (1993)) Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido ocorreria ao acaso.

Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a | 15 uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucléico de teste com o ácido nucléico de referência é menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menos do que cerca de 0,01, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 0,001. A presente invenção também se estende aos polinucleotídeos que compreendem uma primeira sequência de nucleotídeo que seletivamente hibridisa sob condições moderadamente severas (tal como sob condições altamente severas) ao complemento de uma segunda sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (11) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (ii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

, so * A frase “condições de hibridização altamente severa” refere-se às condições sob as quais uma sonda hibridizará à sua subsequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácido nucléico, mas a nenhuma outra sequência. As condições altamente severas são dependentes de . 5 —sequênciae serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia ' extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hibridization and the strategy of —nucleic acid assays” (1993). No geral, as condições altamente severas são selecionados ser de cerca de 5 a 10ºC mais baixo do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma concentração iônica e pH definidos. A T, é a temperatura (sob concentração iônica, pH, e concentração nucléica definidos) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo são apresentadas em excesso, na Tm, 50% das sondas são ocupadas no equilíbrio). As condições altamente severas serão aquelas em que a concentração salina é menor do que cerca de 1,0M de íon sódio, tipicamente de cerca de 0,01 a 1,0M de concentração de íon sódio (ou outros sais) no pH 7,0 a 83 e a - temperatura é de pelo menos cerca de 30ºC para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições altamente severas também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo — é pelomenos duas vezes o fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridização de fundo. As condições de hibridização altamente severas exemplares podem ser como as seguintes: 50% de formamida, 5x SSC, e 1% de SDS,

AAA

: s1 ? incubando a 42ºC, ou, 5x SSC, 1% de SDS, incubando a 65ºC, com lavagem em 0,2x SSC, e 0,1% de SDS a 65ºC.

Ácidos nucléicos que não hibridizam entre si sob condições altamente severas são ainda funcionalmente equivalentes se os polipeptídeos : 5 — que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a degenerescência de códon máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucléicos tipicamente — hibridizam sob condições de hibridização moderadamente severas. As “condições de hibridização moderadamente severas” exemplares incluem uma hibridização em um tampão de 40% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37ºC, e uma lavagem em 1X SSC a 45ºC. Uma hibridização positiva é pelo menos duas vezes o fundo. Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente reconhecerão que condições de hibridização e 15º lavagem alternativas podem ser utilizadas para fornecer condições de severidade similares.

A frase “seletivamente (ou especificamente) hibridiza a” refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula apenas a uma sequência de nucleotídeo particular sob condições de hibridização — severas quando esta sequência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, DNA ou RNA celular total ou biblioteca).

Em qualquer evento, as variantes de uma sequência de polipeptídeo terão essencialmente a mesma atividade como a sequência de referência variante (no caso de polinucleotídeos, as sequências de — polinucleotídeo codificarão um polipeptídeo que tem essencialmente a mesma atividade como a sequência de referência). Por essencialmente a mesma atividade é intencionado pelo menos 50%, adequadamente pelo menos 75% e especialmente pelo menos 90% da atividade da sequência de referência em um ensaio de reestimulação in vitro de PBMC ou sangue integral com

: 52 , antígenos específicos (por exemplo, a reestimulação por um período entre várias horas até duas semanas, tal como até um dia, 1 dia a 1 semana ou 1a 2 semanas) que medem a ativação das células via linfoproliferação, produção de citocinas no sobrenadante de cultura (medido pelo ELISA, CBA etc) ou . 5 caracterização de respostas de célula T e B pelo tingimento intra e extracelular (por exemplo, usando anticorpos específicos para marcadores ' imunes, tais como CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69 etc) seguido pela análise com um flowcytometer. Adequadamente, essencialmente pela mesma atividade é intencionado pelo menos 50%, adequadamente pelo “menos 75% e especialmente pelo menos 90% de atividade da sequência de referência em um ensaio de proliferação de célula T e/ou produção de IFN- gama.

COMPOSIÇÕES DE POLINUCLEOTÍDEO Como aqui usado, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma 15º molécula que foi isolada livre de DNA genômico total de uma espécie particular. Portanto, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo refere- : se a um segmento de polinucleotídeo que contém uma ou mais sequências codificadoras já é substancialmente isolado de, ou purificado isento de, DNA genômico total da espécie a partir da qual o polinucleotídeo é obtido.

Como será entendido por aqueles habilitados na técnica, os polinucleotídeos desta invenção podem incluir sequências genômicas, extra- genômicas e codificadas plasmídeo e segmentos de gene engendrados menores que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e outros. Tais segmentos podem ser naturalmente — isolados, ou sinteticamente modificados pela mão do homem.

“Isolado,” como aqui usado, significa que um polinucleotídeo é substancialmente distante de outras sequências codificadoras, e que o polinucleotídeo não contém porções grandes de DNA codificador não relacionado, tais como fragmentos de cromossoma grandes ou outros genes e”, .. :..i)-.-"25w207â2":91"""""-" " a" ""0)—" “oww "" . nA ú áSPP . = , oi na nm PAI DDETDTTI TT o . s3 r funcionais ou regiões codificadoras de polipeptídeo. Um ácido nucléico isolado é separado de outras matrizes de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam proteínas outras que não o gene. Naturalmente, isto refere-se ao segmento de DNA como originalmente isolado, e não excluem genes ou . 5 regiões codificadoras posteriormente adicionadas ao segmento pela mão do homem.

Como será reconhecido pelo técnico habilitado, os polinucleotídeos podem ser de filamento único (codificador ou de anti- sentido) ou de filamento duplo, e pode ser DNA (genômico, cDNA ou — sintético) ou moléculas de RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm introns e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira de um para um, e moléculas de mMRNA, que não contém introns. As sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais pode, mas não necessita, estar presente dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um antígeno de Mycobacterium ou uma porção deste) ou podem compreender uma variante, ou um equivalente biológico ou funcional de uma tal sequência. As variantes de polinucleotídeo podem conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, como ainda descrito abaixo, preferivelmente tal que a imunogenicidade do polipeptídeo codificado não é dimininuída, em relação à proteína de referência. O efeito sobre a imunogenicidade do polipeptídeo — codificado pode ser no geral avaliado como aqui descrito.

Em formas de realização adicionais, a presente invenção fornece polinucleotídeos e polipeptídeos isolados que compreendem vários comprimentos de trechos contínuos de sequência idêntica a ou complementar a uma ou mais das sequências aqui divulgadas. Por exemplo, polinucleotídeos

. 54 F são fornecidos por esta invenção que compreendem pelo menos cerca de 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos contíguos da sequência de referência aqui divulgada assim como todos os comprimentos intermediários there between. Será facilmente entendido que : 5 “comprimentos intermediários”, neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores quotados, tais como 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, ' 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etce.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluindo todos os números inteiros de 200 a 500; 500 a 1.000, e outros.

Além disso, será avaliado por aqueles de habilidade comum na | 10 técnica que, como um resultado da degenerescência do código genético, : existem muitas sequências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo | como aqui descrito. Alguns destes polinucleotídeos carregam identidade relativamente baixa com a sequência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, polinucleotídeos que variam devido às diferenças no uso de códon são especificamente considerados pela presente invenção, por exemplo polinucleotídeos que são otimizados par a seleção de códon de ser humano : e/ou primata. Além disso, alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeo aqui fornecidas estão dentro do escopo da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alteradas. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de base de dados).

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO Polinucleotídeos podem ser identificados, preparados e/ou manipulados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser identificado, como descrito em mais detalhes abaixo, pela triagem de uma microssérie de

. 55 ? cDNAs.

Tais triagens podem ser realizadas, por exemplo, usando um microarranjo Synteni (Palo Alto, CA) de acordo com as intruções do fabricante (e essencialmente como descrito por Schena et al, Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 93: 10614-10619 (1996) e Heller et al, . 5 — Proc.Natl.Acad.Sci.

USA 94: 2150-2155 (1997)). Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser amplificados a partir do cDNA preparado a partir de células que expressam as proteínas aqui descritas, tais como células de M. tuberculosis.

Tais polinucleotideos podem ser amplificados via reação da cadeia da polimerase (PCR). Para este método, os iniciadores específicos de — sequência podem ser planejados com base nas sequências aqui fornecidas, e podem ser adquiridos ou sintetizados.

Uma porção amplificada de um polinucleotídeo pode ser usada para isolar um gene de tamanho natural a partir de uma biblioteca adequada (por exemplo, uma biblioteca de cCDNA de M. tuberculosis) usando técnicas bem conhecidas.

Dentro de tais técnicas, uma biblioteca (CDNA ou genômica) o é triada usando uma ou mais sondas ou iniciadores de polinucleotídeo hos adequados para a amplificação.

Preferivelmente, uma biblioteca é selecionada por tamanho para incluir moléculas maiores.

As bibliotecas iniciadas aleatórias também pode ser preferidas para identificar regiões a 5º e a montante de genes.

As bibliotecas genômicas são preferidas para se obter | introns e estender sequências 5º.

Quanto as técnicas de hibridização, uma sequência parcial pode ser rotulada (por exemplo, pela tradução em entalhe ou rotulação em extremidade com **P) usando técnicas bem conhecidas.

Uma biblioteca — bacteriana ou bacteriófago são depois no geral triados pelos filtros de hibridização contendo colônias bacterianas desnaturadas (ou tecido contendo placas de fago) com a sonda rotulada (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Colônias ou placas de hibridização são selecionadas e expandidas, e o DNA é isolado para outra análise.

Os

* 56 ? clones de cDNA podem ser analisados para determinar a quantidade de sequência adicional, por exemplo, pela PCR usando um iniciador da sequência parcial e um iniciador do vetor. Os mapas de restrição e as sequências parciais podem ser geradas para identificar um ou mais clones de . 5 — sobreposição. A sequência completa pode ser depois determinada usando técnicas padrão, que podem envolver gerar uma série de clones de deleção. As sequências de sobreposição resultantes podem ser depois montadas em uma única sequência contíguas. Uma molécula de cDNA de tamanho natural pode ser gerada pela ligação de fragmentos adequados, usando técnicas bem conhecidas.

Alternativamente, existem numerosas técnicas de amplificação para se obter uma sequência codificadora de de tamanho natural a partir de uma sequência de cDNA parcial. Dentro de tais técnicas, a amplificação é no geral realizada via PCR. Qualquer uma de uma variedade de kits comercialmente disponíveis pode ser usada para realizar a etapa de amplificação. Os iniciadores podem ser planejados usando, por exemplo, % software bem conhecido na técnica. Os iniciadores são preferivelmente de 22 a 30 nucleotídeos no comprimento, têm um teor de GC de pelo menos 50% e recozem à sequência alvo em temperaturas de cerca de 68ºC a 72ºC. A região amplificada pode ser sequenciada como descrito acima, e as sequências de sobreposição montadas em uma sequência contíguas.

Uma tal técnica de amplificação é a PCR inversa (ver Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186 (1988)), que usa enzimas de restrição para gerar um fragmento na região conhecida do gene. O fragmento é depois — circularizado pela ligação intramolecular e usado como um padrão para PCR com iniciadores divergentes derivados da região conhecida. Dentro de um método alternativo, as sequências adjacentes a uma sequência parcial podem ser recuperadas pela amplificação com um iniciador a uma sequência ligadora e um iniciador específico para uma região conhecida. As sequências

« 57 Fr amplificadas são tipicamente submetidas a uma segunda rodada de amplificação com o mesmo iniciador ligador e um segundo iniciador específico para a região conhecida. Uma variação neste procedimento, que utiliza dois iniciadores que iniciam a extensão em direções opostas da . 5 sequência conhecida, é descrita na WO96/38591. Uma outra tal técnica é conhecida como “amplificação rápida de extremidades de cDNA” ou RACE. Esta técnica envolve o uso de um iniciador interno e um iniciador externo, que hibridizam a uma região poliA ou sequência de vetor, para identificar sequências que são 5º e 3º de uma sequência conhecida. Técnicas adicionais incluem PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19 (1991)) e PCR caminhante (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60 (1991)). Outros métodos que utilizam amplificação também podem ser utilizados para se obter uma sequência de cDNA de tamanho natural. Em certos casos, é possível obter uma sequência de cDNA de tamanho natural pela análise de sequências fornecidas em uma base de dados i * —de rótulo de sequência expressado (EST), tal como aquela disponível do * GenBank. Pesquisas quanto os ESTs de sobreposição no geral podem ser realizadas usando programas bem conhecidos (por exemplo, pesquisas BLAST da NCBJ), e tais ESTs podem ser usados para gerar uma sequência contígua de tamanho natural. As sequências de DNA de tamanho natural também podem ser obtidas pela análise de fragmentos genômicos.

EXPRESSÃO DE POLINUCLEOTÍDEO EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS As sequências de polinucleotídeo ou fragmentos destas que codificam polipeptídeos, ou proteínas de fusão ou equivalentes funcionais — destes, podem ser usadas em moléculas de DNA recombinantes para direcionar a expressão de um polipeptídeo em células hospedeiras apropriadas. Devido à degenerescência inerente do código genético, outras sequências de DNA que codificam substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácido funcionalmente equivalente podem ser produzidas e oo EtiI |" A 2“ .|]“65( AA MACA RT Ni | , = 58 | - estas sequências podem ser usadas para clonar e expressar um dado polipeptídeo.

Como será entendido por aqueles de habilidade na técnica, pode ser vantajoso em alguns casos produzir sequências de nucleotídeo que . 5 codificam polipeptídeo que possuem códons que não ocorrem naturalmente.

Por exemplo, códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou o eucariótico particular podem ser selecionados para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de RNA recombinante tendo propriedades desejáveis, tais como uma meia vida que seja mais longa do que aquela de um transcrito gerado a partir da sequência que ocorre naturalmente.

Além disso, as sequências de polinucleotídeo podem ser engendradas usando métodos no geral conhecidos na técnica de modo a alterar sequências que codificam polipeptídeo por uma variedade de razões, ' 15 incluindo mais não limitado a, alterações que modificam a clonagem, fer : processamento, e/ou expressão do produto de gene.

Por exemplo, o E. embaralhamento de DNA pela fragmentação aleatória e remontagem pela i PCR de fragmentos de gene e oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados para engendrar as sequências de nucleotídeo.

Além disso, a mutagênese direcionada ao sítio pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, mudar a preferência de códon, produzir variantes de junção, ou introduzir mutações, e assim por diante.

As sequências de ácido nucléico naturais, modificadas, ou recombinantes podem estar ligadas a uma sequência heteróloga para codificar uma proteína de fusão.

Por exemplo, para triar bibliotecas de peptídeo quanto a inibidores da atividade de polipeptídeo, pode ser útil codificar uma proteína quimérica que possa ser reconhecida por um anticorpo comercialmente disponível.

Uma proteína de fusão também pode ser engendrada para conter um sítio de clivagem localizado entre a sequência que codifica o polipeptídeo

: — so + e a sequência de proteína heteróloga, de modo que o polipeptídeo pode ser clivado e purificado da porção heteróloga.

As sequências que codificam um polipeptídeo desejado podem ser sintetizadas, no todo ou em parte, usando métodos químicos bem . 5 — conhecidos na técnica (ver Caruthers, M.

H. et al., Nucl.Acids.Res.Symp.Ser. pp.215-223 (1980), Hom et al, Nucl.Acids.Res.Symp.Ser. pp.225-232 i (1980)). Alternativamente, a própria proteína pode ser produzida usando métodos químicos para sintetizar a sequência de aminoácido de um polipeptídeo, ou uma porção deste.

Por exemplo, a síntese de peptídeo pode ser realizada usando várias técnicas de fase sólida (Roberge et al., Science 269: 202-204 (1995)) e a síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA). Um peptídeo recém sintetizado pode ser substancialmente purificado pela cromatografia líquida de alto desempenho preparativa (por exemplo, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) ou e ' outras técnicas comparáveis disponíveis na técnica.

À composição dos & peptídeos sintéticos pode ser confirmada pela análise ou sequenciamento de aminoácido (por exemplo, o procedimento de degradação de Edman). Adicionalmente, a sequência de aminoácido de um polipeptídeo, ou qualquer parte desta, pode ser alterada durante a síntese direta e/ou combinada usando métodos químicos com sequências de outras proteínas, ou qualquer parte desta, para produzir um polipeptídeo variante.

De modo a expressar um polipeptídeo desejado, as sequências de nucleotídeo que codificam o polipeptídeo, ou equivalentes funcionais, — podem ser inseridas em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificadora inserida.

Os métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir sequências contendo vetores de expressão que codificam um polipeptídeo de interesse e

. « 60 | çF elementos de controle transcricionais e traducionais apropriados.

Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo.

Tais técnicas são descritas em Sambrook etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), e Ausubel etal., ó 5 — Current Protocols in Molecular Biology (anualmente atualizada). ! Uma variedade de sistemas de vetor de expressão/ hospedeiro o pode ser utilizada para conter e expressar as sequências de polinucleotídeo.

Estes incluem, mas não são limitados a, microorganismos tais como bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, plasmídeo, ou vetores de expressão de DNA cosmídicos; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de célula de inseto infectadas com vetores de expressão viral (por exemplo, baculovírus); sistemas de célula vegetal transformada com vetores de expressão viral (por exemplo, o vírus mosáico da couve flor, CAMV; vírus mosáico do tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas “= * decéluladeanimal.

S Os “elementos de controle” ou “sequências reguladoras” : presentes em um vetor de expressão são aquelas regiões não traduzidas dos intensificadores de vetor, promotores, regiões não traduzidas 5º e 3º--que interagem com as proteínas da célula hospedeira para realizar a transcrição e tradução.

Tais elementos podem variar em sua força e especificidade.

Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, pode ser usado.

Por exemplo, quando da clonagem em sistemas bacterianos, promotores indutíveis tais como o promotor lacZ híbrido do fagomídeo PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif) ou plasmídeo PSPORTI1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e outros podem ser usados.

Em sistemas de célula de mamífero, promotores de genes de mamífero ou de vírus de mamífero são no geral preferidos.

Se for necessário

CA AAA CS, O hi 61 $ gerar uma linhagem de célula que contenha cópias múltiplas da sequência que codifica um polipeptídeo, vetores com base em SV40 ou EBV podem ser vantajosamente usados com um marcador selecionável adequado.

Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem . 5 ser selecionados dependendo do uso pretendido para o polipeptídeo expressado.

Por exemplo, quando quantidades grandes são necessárias, por exemplo para a indução de anticorpos, vetores que direcionam a expressão de alto nível de proteínas de fusão que são facilmente purificadas podem ser usados.

Tais vetores incluem, mas não são limitados aos vetores de clonagem e expressão da E. coli multifuncionais tais como BLUESCRIPT(Stratagene), em que a sequência que codifica o polipeptídeo de interesse pode ser ligada no vetor ma matriz com sequências para o Met de terminal amino e os 7 resíduos subsequentes de B-galactosidase de modo que uma proteína híbrida seja produzida; vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J.

Biol.

Chem. 264: 5503-5509 (1989)); e outros.

Vetores pPGEX (Promega, Madison, Wis.) em * — também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como & proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). No geral, tais * proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pela absorção às pérolas de glutationa-agarose seguidas pela elução na presença de glutationa livre.

As proteínas fabricadas em tais sistemas podem ser planejadas para incluir heparina, trombina ou sítios de clivagem de protease do fator XA de modo que o polipeptídeo clonado de interesse possa ser liberado da porção GST à vontade.

Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, vários vetores — contendo promotores constitutivos ou indutíveis tais como fator alfa, álcool f oxidase, e PGH podem ser usados.

Outros vetores contendo promotores constitutivos ou indutíveis incluem GAP, PGK, GAL e ADH.

Para revisões, ver Ausubel et al. (supra) e Grant er al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987) e Romas et al.

Yeast 8 423-88 (1992).

? Em casos onde vetores de expressão vegetais são usados, a | expressão de sequências que codificam polipeptídeos podem ser acionadas por qualquer um de vários promotores.

Por exemplo, promotores virais tais | como os promotores 358 e 198 de CaMV podem ser usados sozinhos ou em : 5 — combinação coma sequência líder ômega de TMV (Takamatsu, EMBO ]. 6: 307-311 (1987)). Alternativamente, promotores vegetais tais como a subunidade pequena de RUBISCO ou promotores de choque térmico podem ser usados (Coruzzi et al., EMBO 1]. 3: 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224: 838-843 (1984); e Winter et al., Results Probl.

Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Estas construções podem ser introduzidas em células vegetais ; perla transformação de DNA direta ou transfecção mediada por patógeno. : Tais técnicas são descritas em várias revisões no geral disponíveis (ver, por exemplo, Hobbs em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992)). Um sistema de inseto também pode ser usado para expressar 1 ”* um polipeptídeo de interesse.

Por exemplo, em um tal sistema, o vírus da 4 poliedrose nuclear Autographa californica (ACNPV) é usado como um vetor 4 para expressar genes estranos em células de Spodoptera frugiperda ou em Trichoplusia larvae.

As sequências que codificam o polipeptídeo podem ser —clonadasem uma região não essencial do vírus, tal como o gene da poliedrina, e colocado sob o controle do promotor da poliedrina.

A inserção bem sucedida da sequência que codifica polipeptídeo tornará o gene da poliedrina inativo e produzirá vírus recombinante que carece da proteína de revestimento.

Os vírus recombinantes podem ser depois usados para infectar, por exemplo, células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae em que o polipeptídeo de interesse pode ser expressado (Engelhard et al, Proc.Natl.Acad.Sci.

U.S.A. 91: 3224-3227 (1994)). Em células hospedeiras de mamífero, vários sistemas de expressão com base viral são no geral disponíveis.

Por exemplo, em casos E sl a A A A ——————»————“———x5<s«q«2—.——..———.—————— SM Mas Ad A be! 63 TF onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, sequências que codificam um polipeptídeo de interesse podem ser ligadas em um complexo de transcrição/tradução de adenovírus que consiste do promotor tardio e sequência líder tripartida. A inserção em uma região El ou E3 não essencial . 5 — do genoma viral pode ser usado para se obter um vírus viável que é capaz de expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectadas (Logan & Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81: 3655-3659 (1984)) Além disso, intensificadores de transcrição, tais como o intensificador do vírus do sarcoma de Rous (RSV), pode ser usado para aumentar a expressão em células — hospedeiras de mamífero. Métodos e protocolos para trabalhar com vetores adenovirais são revisados em Wold, Adenovirus Methods and Protocols, | 1998. Referências adicionais com respeito ao uso de vetores adenovirais | podem ser encontradas em Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004. Os sinais de início específicos também podem ser usados para Too seobter tradução mais eficiente de sequências que codificam um polipeptídeo z de interesse. Tais sinais incluem o códon de início ATG e sequências : adjacentes. Em casos onde as sequências que codificam o polipeptídeo, o seu códon de início, e sequências a montante são inseridos no vetor de expressão apropriado, nenhum dos sinais de controle transcricionais ou traducionais adicionais pode ser necessário. Entretanto, em casos onde apenas a sequência codificadora, ou uma porção desta, é inserida, sinais de controle de tradução exógenos incluindo o códon de início de ATG deve ser fornecido. Além disso, o códon de início deve estar na matriz de leitura correta para garantir a — tradução do inserto inteiro. Os elementos traducionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais quanto sintéticas. À eficiência de expressão pode ser realçada pela inclusão de intensificadores que são apropriados para o sistema de célula particular que é usado, tal como |

E

| ——;w>Bsôn( ya o -sr—-F oê S3GA o 64 | + aqueles descritos na literatura (Scharf. et al., Results Probl.

Cell Differ. 20: | 125-162 (1994)). | Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida quanto a sua capacidade para modular a expressão das sequências inseridas ou . 5 — para processar a proteína expressada ma maneira desejada.

Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não são limitados a, acetilação, carboxilação, i glicosilação, fosforilação, lipidação, e acilação.

O processamento pós traducional que cliva uma forma “prepro” da proteína também pode ser usado para facilitar a inserção, dobra e/ou função corretas.

As células hospedeiras diferentes tais como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, e WI38, que têm mecanismo celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós traducionais, podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estranha.

Para a produção de longa duração, alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável é no geral preferida.

Por CN exemplo, as linhagens de célula que estavelmente expressam um z polinucleotídeo de interesse podem ser transformadas usando vetores de ? expressão que podem conter origens virais de replicação e/ou elementos de expressão endógenas e um gene marcador selecionável no mesmo ou em um vetor separado.

A seguir da introdução do vetor, as células podem ser | deixadas crescer por | a 2 dias em um meio enriquecido antes que elas sejam mudadas para meio seletivo.

O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e a sua presença permite o cultivo e recuperação de células que expressam com êxito as sequências introduzidas.

Os clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula.

Qualquer número de sistemas de seleção pode ser usado para recuperar linhagens de célula transformadas.

Estes incluem, mas não são limitados aos genes da timidina cinase do vírus do herpes simples (Wigler er DS O A A AA A AA O AA |

————————i a 65 al., Cell 11: 223-32 (1977)) e da adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22: 817-23 (1990)) que podem ser utilizados em células tk' ou aprt, respectivamente. Também, a resistência a antimetabólito, antibiótico ou herbicida pode ser usada como a base para seleção; por exemplo, dhfr que . 5 confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 77: 3567-70 (1980)); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos, | neomicina e G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981)); e als ou pat, que conferem resistência ao clorsulfuron e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Os genes selecionáveis adicionais foram descritos, por exemplo, trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartiêman & Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988)). Recentemente, o uso de marcadores visíveis tem ganho popularidade com tais marcadores como antocianinas, B-glicuronidase e seu substrato GUS, e luciferase e seu substrato aos luciferina, sendo amplamente usados não apenas para identificar ":. transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de ? proteína transitória ou estável atribuível a um sistema de vetor específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55: 121-131 (1995)).

Embora a presença/ausência da expressão de gene marcador sugere que o gene de interesse também está presente, a sua presença e expressão pode necessitar ser confirmada. Por exemplo, se a sequência que codifica um polipeptídeo é inserida dentro de uma sequência de gene marcador, as sequências contendo células recombinantes podem ser identificadas pela ausência da função de gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em tandem com uma sequência que codifica polipeptídeo sob o controle de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou seleção usualmente indica também a expressão do gene em tandem.

Alternativamente, as células hospedeiras que contêm e expressam uma sequência de polinucleotíideo desejada podem ser identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Estes procedimentos incluem, mas não são limitados a, . 5 —hibridizações de DNA-DNA ou DNA-RNA e técnicas de bioensaio ou imunoensaio de proteína que incluem tecnologias com base em membrana, i solução, ou chip para a detecção e/ou quantificação de ácido nucléico ou proteína.

Uma variedade de protocolos para detectar e medir a expressão — de produtos codificados por polinucleotídeo, usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para o produto são conhecidos na técnica. Os exemplos incluem ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Um imunoensaio com base em dois sítios, monoclonais utilizando anticorpos monoclonais reativos para dois epítopos não interferentes em um Co dado polipeptídeo pode ser preferido para algumas aplicações, mas um ensaio "%* de ligação competitivo também pode ser utilizado. Estes e outros ensaios são 6 descritos, entre outros lgares, em Hampton et al., Serological Methods, A Laboratory Manual (1990) e Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983).

Uma ampla variedade de rótulos e técnicas de conjugação são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e pode ser usada em vários ensaios de ácido nucléico e aminoácido. Meios para produzir hibridização rotulada ou sondas de PCR para detectar as sequências relacionadas com os — polinucleotídeos incluem oligorrotulação, tradução de entalhe, rotulação de extremidade ou amplificação pela PCR usando um nucleotídeo rotulado. Alternativamente, as sequências, ou qualquer uma de suas porções podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, são comercialmente disponíveis, e podem ser

RSS SO A AAA AA usados para sintetizar sondas de RNA in vitro pela adição de uma polimerase ; de RNA apropriada tal como T7, T3, ou SP6 e nucleotídeos rotulados.

Estes procedimentos podem ser conduzidos usando uma variedade de kits comercialmente disponíveis.

As moléculas repórtes ou rótulos adequados, que : 5 — podem ser usados incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes, ou cromogênicos assim como substratos, cofatores,

inibidores, partículas magnéticas, e outros.

As células hospedeiras transformadas com uma sequência de polinucleotídeo de interesse podem ser cultivadas sob condições adequadas —paraa expressão e recuperação da proteína a partir da cultura de célula.

À proteína produzida por uma célula recombinante pode ser secretada ou contida intracelularmente dependendo da sequência e/ou do vetor usado.

Como será entendido por aqueles de habilidade na técnica, vetores de expressão contendo polinucleotídeos podem ser planejados para conter sequências de sinal que direcionam a secreção do polipeptídeo codificado o. através de uma membrana de célula procariótica ou eucariótica.

Outras ". construções recombinantes podem ser usadas para unir sequências que O codificam um polipeptídeo de interesse para a sequência de nucleotídeo que codifica um domínio de polipeptídeo que facilitará a purificação de proteínas solúveis.

Tais domínios que facilitam a purificação incluem, mas não são limitados a, peptídeos queladores metálicos tais como módulos de histidina- triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação na imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash). A inclusão de sequências ligadoras cliváveis tais como aquelas específicas para o Fator XA ou enterocinase (Invitrogen.

San Diego, Calif.) entre o domínio de purificação e o polipeptídeo codificado pode ser usada para facilitar a purificação.

Um tal vetor de expressão fornece a expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo de interesse e um ácido nucléico que codifica 6 resíduos de histidina que precedem uma , tiorredoxina ou um sítio de clivagem de enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação na IMIAC (cromatografia de afinidade de íon metálico i imobilizado) como descrito em Porath er al., Prot. Exp. Purif. 3: 263-281 . 5 — (1992) enquanto que o sítio de clivagem de enterocinase fornece um meio para purificar o polipeptídeo desejado da proteína de fusão. Um debate de ' vetores que contém as proteínas de fusão é fornecido em Kroll er al., DNA Cell Biol. 12: 441-453 (1993)).

TÉCNICAS DE LIBERAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO IN VIVO Em formas de realização adicionais, as construções genéticas que compreendem um ou mais dos polinucleotídeos da invenção são introduzidos em células in vivo. Isto pode ser obtido usando qualquer uma de uma variedade de métodos bem conhecidos, diversos dos quais são esboçados abaixo para o propósito de ilustração.

1. ADENOVÍRUS to Um dos métodos preferidos para a liberação in vivo de uma ou o c mais sequências de ácido nucléico envolve o uso de um vetor de expressão de ' adenovírus. “Vetor de expressão adenovírus” é intencionado a incluir aquelas construções contendo sequências de adenovírus suficientes para (a) sustentar o empacotamento da construção e (b) para expressar um polinucleotídeo que foi clonado nesse ponto em uma orientação de sentido ou anti-sentido. Naturalmente, no contexto de uma construção de anti-sentido, a expressão não requer que o produto de gene seja sintetizado. O vetor de expressão compreende uma forma geneticamente —engendrada de um adenovírus. O conhecimento da organização genética de | adenovírus, um vírus de DNA de 36 kb, linear, de filamento duplo, permite a substituição de pedaços grandes de DNA adenoviral com sequências estranhas até 7 kb (Grunhaus & Horwitz, 1992). Ao contrário do retrovírus, a infecção adenoviral de células hospedeiras não resulta na integração

SFA !A A.RKceoesC"OQ Ô A OO O) II 69 cromossômica porque o DNA adenoviral pode replicar em uma maneira : epissômica sem genotoxicidade potencial. Também, os adenovírus são estruturalmente estáveis, e nenhum rearranjo do genoma foi detectado depois de amplificação extensiva. O adenovírus pode infectar virtualmente todas as & 5 — células epiteliais independente do seu estágio do ciclo celular. Até agora, a infecção adenoviral parece estar ligado apenas à doença branda tal como a doença respiratória aguda em seres humanos.

O adenovírus é particularmente adequado para o uso como um vetor de transferência de gene por causa do seu genoma de tamanho médio, facilidade de manipulação, alto título, faixa de célula alvo ampla e alta infectividade. Ambas as extremidades do genoma viral contém repetições invertidas de 100 a 200 pares de base (iTRs), que são elementos cis necessários para a replicação e empacotamento de DNA viral. As regiões inicial (E) e tardia (L) do genoma contêm unidades de transcrição diferentes —quesão divididas pelo início da replicação de DNA viral. A região El (EIA e oo EIB) codifica proteínas responsáveis pela regulagem da transcrição do * genoma viral e uns poucos genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e ' E2B) resulta na síntese das proteínas para a replicação de DNA viral. Estas proteínas estão envolvidas na replicação de DNA, na expressão de gene tardia eexclusãode célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genes tardios, incluindo a maioria das proteínas capsídicas virais, são expressadas apenas depois de processamento significante de um único transcrito primário emitido pelo promotor tardio principal (MLP). O MLP, (localizado a 16,8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia da infecção, e todos os —mRNA's emitidos a partir deste promotor possuem uma sequência líder 5“- tripartida (TPL) que os tornam preferidos para trandução dos MRNA's. Em um sistema corrente, o adenovírus recombinante é gerado a partir da recombinação homóloga entre vetor de transporte e vetor pró-viral. Devido à recombinação possível entre dois vetores pró-virais, os adenovírus do tipo selvagem podem ser gerados a partir deste processo. Portanto, é crítico z isolar um único clone de vírus de uma placa individual e examinar a sua estrutura genômica.

i A generação e propagação dos vetores adenovirais correntes, : 5 —que são deficientes em replicação, dependem de uma única linhagem de célula auxiliar, designada 293, que foi transformada a partir de células renais embrionárias humanas pelos fragmentos de DNA Ad5 e constitutivamente expressa proteínas El (Graham et al., 1977). Visto que a região E3 é dispensável do genoma de adenovírus (Jones & Shenk, 1978), os vetores —adenovirais correntes, com o auxílio das células 293, carregam o DNA estranho na El, na D3 ou em ambas as regiões (Graham & Prevec, 1991). Na natureza, o adenovírus pode empacotar aproximadamente 105% do genoma do tipo selvagem (Ghosh-Choudhury et al., 1987), fornecendo capacidade para cerca de 2 kB extras de DNA. Combinados com os aproximadamente 5,5 15º kBdo DNA que é recolocado nas regiões El e E3, a capacidade máxima do * * vetor de adenovírus corrente está abaixo de 7,5 kB, ou cerca de 15% do " comprimento total do vetor. Mais do que 80% do genoma viral de adenovírus ' permanece na cadeia principal do vetor e é a fonte da citotoxicidade transportada pelo vetor. Também, a deficiência de replicação do vírus deletado em El é incompleta. Por exemplo, o vazamento da expressão de gene viral foi observada com os vetores correntemente disponíveis nas altas multiplicidades de infecção (MOT) (Mulligan, 1993). As linhagens de célula auxiliares podem ser derivadas de células humanas tais como células renais embrionárias humanas, células — musculares, células hematopoiéticas ou outras células mesenquimatosas ou epiteliais embrionárias humanas. Alternativamente, as células auxiliares podem ser derivadas das células de outra espécie mamífera que são permissivas para o adenovírus humano. Tais células incluem, por exemplo, células Vero ou outras células mesenquimatosas ou epiteliais embrionárias de ns 5>”AÂ< A. ºº“ÔOOA O DO OSS 71 macaco. Como estabelecido acima, a linhagem de célula auxiliar - correntemente preferida é a 293. : Racher et al. (1995) divulgaram métodos melhorados para cultivar células 293 e propagar adenovírus. Em um formato, agregados de ã 5 —célulanaturalsão cultivados pela inoculação de células individuais em frascos agitadores siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) contendo 100 a 200 ml de meio. À seguir de agitação a 40 rpm, a viabilidade celular é estimada com azul de tripano. Em um outro formato, microcarregadores de Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/1) são utilizados como segue. Um : 10 inóculo de célula, recolocado em suspensão em 5 ml de meio, é adicionado ao | carregador (50 ml) em um frasco Erlenmeyer de 250 ml e deixado estacionário, com agitação ocasional, por 1 a 4 h. O meio é depois substituído com 50 ml de meio fresco e a agitação iniciada. Para a produção de vírus, as células são deixadas crescer a cerca de 80% de confluência, tempo depois do

15. qualomeio é substituído (a 25% do volume final) e o adenovírus adicionado ". * aumMOI de 0,05. As culturas são deixadas estacionárias durante a noite, a A seguir do que o volume é aumentado para 100% e a agitação começada por | mais 72 horas. Exceto a exigência de que o vetor de adenovírus seja defeituoso em replicação, ou pelo menos condicionalmente defeituoso, a natureza do vetor de adenovírus não é acreditado ser crucial para a prática bem sicedida da invenção. O Adenovírus pode ser de qualquer um dos 42 sorotipos conhecidos diferentes ou subgrupos A-F. O adenovírus tipo 5 de subgrupo C é o material de partida preferido de modo a obter um vetor de — adenovírus defeituoso em replicação condicioal para o uso na presente invenção, visto que o Adenovírus tipo 5 é um adenovírus humano em torno do qual uma grande quantidade de informação bioquímica e genética é conhecida, e o mesmo foi historicamente usado para a maioria das construções que utilizam adenovírus como um vetor.

Como estabelecido acima, o vetor típico de acordo com a é presente invenção é defeituoso em replicação e não terá uma região El de . adenovírus. Assim, será mais conveniente introduzir o polinucleotídeo que codifica o gene de interesse na posição da qual as sequências que codificam é S —El foram removidas. Entretanto, a posição de inserção da construção dentro . das sequências de adenovírus não é crítica para a invenção. O polinucleotídeo que codifica o gene de interesse também pode ser inserido no lugar da região E3 deletada em vetores de substituição de E3 como descrito por Karlsson et al. (1986) ou na região E4 onde uma linhagem de célula auxiliar ou vírus auxiliar complementa o defeito E4.

O adenoviírus é fácil de cultivar e manipular e exibe ampla faixa hospedeira in vitro e in vivo. Este grupo de vírus pode ser obtido em altos títulos, por exemplo, 10º a 10"' unidades formadoras de placa por ml, e eles são altamente infecciosos. O ciclo de vida do adenovírus não requer a integração no genoma da célula hospedeira. Os genes estranhos liberados EN. pelos vetores adenovirais são epissômicos e, portanto, têm baixa WE genotoxicidade para as células hospedeiras. Nenhum efeito colateral foi relatado em estudos de vaccinação com adenovírus do tipo selvagem (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), demonstrando a sua segurança e potencial — terapêuticocomo vetor de transferência de genes in vivo. Vetores adenovirais foram usados na expressão de gene eucariótico (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) e desenvolvimento de vacina (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Recentemente, estudos de animal sugeriram que o adenovírus recombinante — seria usado para a terapia de gene (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet er al, 1990; Rich et al, 1993). Estudos na administração de adenovírus recombinante aos tecidos diferentes incluem a instilação traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld er al., 1992), injeção muscular (Ragot et al., 1993), injeção intravenosa periférica (Herz & Gerard, : 1993) e inoculação estereotática no cérebro (Le Gal La Salle et al., 1993). : Vetores adenovirais podem se originar de adenovírus humano.

Alternativamente eles podem se originar de adenovírus de outra espécie por ã S — exemplo, chimpanzé que pode ter a vantagem de que os vetores virais não são neutralizados pelos anticorpos contra adenovírus humano que circula em muitos indivíduos humanos (ver por exemplo,: Tatsis N et al Gene Therapy 2006 13: 421-429). O Adenovírus tipo 35, que é relativamente incomum e portanto existem níveis baixos de imunidade pré-existente para o próprio vetor, foi usado como um sistema de liberação em certas vacinas contra a tuberculose que estão sendo desenvolvidas (ver por exemplo, Radosevic et al Infection and Immunity 2007 75(8): 4105-4115). O Adenovírus tipo 35 também pode ser de valor particular na presente invenção como um vetor de liberação. “2 RETROVÍRUS a Os retrovírus são um grupo de vírus de RNA de filamento único caracterizado por uma capacidade para converter o seu RNA para DNA de filamento duplo em células infectadas por um processo de transcrição reversa (Coffin, 1990). O DNA resultante depois estavelmente se integra nos cromossomas celulares como um pró-virus e direciona a síntese de proteínas virais.

A integração resulta na retenção das sequências de gene viral na célula reciptora e seus descendentes.

O genoma retroviral contém três genes, gag, pol, e env que codificam proteínas capsídicas, enzima de polimerase, e — componentes de envelope, respectivamente.

Uma sequência encontrada a montante do gene gag contém um sinal para o empacotamento do genoma dentro de virions.

Duas sequências de repetição de terminal longo (LTR) estão presentes nas extremidades 5“ e 3“do genoma viral.

Estas contêm sequências promotoras e intensificadoras fortes e também são requeridas para s a integração no genoma da célula hospedeira (Coffin, 1990). De modo a construir um vetor retroviral, um ácido nucléico que codifica uma ou mais sequências de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo s 5 de interesse é inserido no genoma viral no lugar de certas sequências virais para produzir um vírus que é defeituoso em replicação. De modo a produzir i virions, uma linhagem de célula de empacotamento contendo os genes gag, pol, e env mas sem a LTR e componentes de empacotamento são construídos . (Mann et al., 1983). Quando um plasmídeo recombinante contendo um —cDNA, junto com a LTR retroviral e sequências de empacotamento é introduzida nesta linhagem de célula (pela precipitação com fosfato de cálcio por exemplo), a sequência de empacotamento permite que o transcrito de RNA do plasmídeo recombinante seja empacotado em partículas virais, que são depois secretadas no meio de cultura (Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann er al, 1983). O meio contendo os retrovírus ". * — recombinantes é depois coletado, opcionalmente concentrado, e usado para a To transferência de gene. Os vetores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de célula. Entretanto, a integração e expressão estáveis requerem a divisão de células hospedeiras (Paskind et al., 1975).

Um novo método planejado para permitir o alvejamento específico de vetores retrovirais foi recentemente desenvolvido com base na modificação química de um retrovírus pela adição química de resíduos de lactose ao envelope viral. Esta modificação permitiria a infecção específica de hepatócitos via receptores da sialoglicoproteína.

Um método diferente ao alvejamento de retrovírus recombinantes foi planejado em que anticorpos biotinilados contra uma proteína do envelope retroviral e contra um receptor de célula específico foram usados. Os anticorpos foram ligados via os componentes de biotina pelo uso de estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticorpos contra

O A AA No a aa ao OO OO O» Ô5OÔOSOSSÓAOXA52AMMÓÂÁAOSSCAHM)ÂÂÀRâUAÁÉ ÔNUS RE E 75 abtígenos classe I e classe II do complexo da histocompatibilidade maior, eles é demonstraram a infecção de uma variedade de células human que transportam estes antígenos de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al., i 1989). ' S — 3. VÍRUS ASSOCIADOS A ADENO AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) é um : parovírus, descoberto como uma contaminação de estoques adenovirais. O mesmo é um vírus ubíquo (anticorpos estão presentes em 85% da população « humana US) que não foi ligado a nenhuma doença. O mesmo também é .- 10 classificado como um dependovírus, porque a sua replicação é dependente da presença de um vírus auxiliar, tal como adenovírus. Cinco sorotipos foram isolados, dos quais AAV-2 é o melhor caracterizado. AAV tem um DNA linear de filamento único que é encapsidado em proteínas capsídicas VP1, VP2 e VP3 para formar um virion icosaédrico de 20 a 24 nm no diâmetro (Muzyczka & McLaughlin, 1988).

.. : O DNA de AAV é de aproximadamente 4,7 quilobases de sa comprimento. O mesmo contém duas matrizes de leitura aberta e é flanqueado | por dois ITRs. Existem dois genes principais no genoma do AAV: rep e cap. O gene rep codifica proteínas respons[aveis pelas replicações virais, ai passo — que cap codifica a proteína capsídica VP1-3. Cada ITR forma uma estrutura de grampo de cabelo na forma de T. Estas repetições de terminal são os únicos componentes cis essenciais do AAV para a integração cromossômica. Portanto, o AAV pode ser usado como um vetor com todas as sequências codificadoras virais removidas e substituídas pelo cassete de genes para liberação. Três promotores virais foram identificados e nomeados p5, p19, e P40, de acordo com a sua posição no mapa. A transcrição de p5 e p19 resulta na produção de proteínas rep, e a transcrição de p40 produz as proteínas capsídicas (Hermonat & Muzyczka, 1984).

————————-—..————-... >9;9 9) 5 AS 6“.? ..= 2a" 0““e “” "o "P"íº“o =3 a sô 5) >. =S 0 . )- Pl 76 Existem vários fatores que instigaram os pesquisadores a : estudar a possibilidade de usar rAAV como um vetor de expressão. Um é que as exigências para a liberação de um gene para integrar no cromossoma i hospedeiro são surpreendentemente poucas. É necessário ter as ITRs de 145 : 5 — paresde base, que são apenas 6% do genoma do AAV. Isto deixa espaço no vetor para montar uma inserção de DNA de 4,5 kb. Embora esta capacidade i de transporte possa impedir o AAV de liberar genes grandes, o mesmo é amplamente adaptado para liberar construções de anti-sentido. : O AAV também é uma boa escolha de veículos de liberação devido à sua segurança. Existe um mecanismo de recuperação relativamente complicado: não apenas o adenovírus do tipo selvagem ms também os genes AAV são requeridos para mobilizar rÃAV. Igualmente, o AAV não é patogênico e não associado com nenhuma doença. A remoção das sequências codificadoras virais minimiza reações imunes para a expressão de gene viral, eportanto, rAAV não evoca uma resposta inflamatória. ” * — 4, OUTROS VETORES VIRAIS COMO CONSTRUÇÕES DE EXPRESSÃO “ao Outros vetores virais podem ser utilizados como construções de expressão na presente invenção para a liberação de sequências de oligonucleotídeo ou polinucleotíideo a uma célula hospedeira. Vetores — derivados de vírus tais como o vírus da varíola (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), lentivírus, vírus da poliomielite e vírus do herpes podem ser utilizados. Outros vetores derivados de poxvírus, tais como vetores derivados de fowl-pox, também podem ser esperados ser de uso. Estes oferecem várias características atraentes para várias células de mamífero (Friedmann, 1989; —Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Com o reconhyecimento recente de vírus defeituosos da hepatite B, novos discernimentos foram obtidos na relação estrutura-função de sequências virais diferentes. Estudos in vitro mostraram que o vírus poderia reter a capacidade para o empacotamento dependente de auxiliar e

CcccccooRRoe*—D*Dã AN! GUNS A O MAO A NAp SÓ Í?ÃÍ?.S*SÁA. SÓOSoO $sâ<iR %S ô“ST“MA uMefaââsl PNpP O .º | !.º :"“"-." a“ “NôéKéK« :/” 917) O T7 transcrição reversa a despeito da deleção de até 80% do seu genoma (Horwich : et al., 1990). Isto sugeriu que porções grandes do genoma seria substituído . com material genético estranho. O hepatotropismo e persistência (integração) foram propriedades particularmente atrativas para a transferência de gene . 5 — direcionada ao fígado. Chang et al. (1991) introduziu o gene da cloranfenicol : acetiltransferase (CAT) em genoma do vírus da hepatite B de pato no lugar das sequências que codificam a polimerase, superfície, e pré-superfície. Este foi co-transfectado com vírus do tipo selvagem em uma linhagem de célula de º hepatoma aviário. Os meios de cultura contendo altos títulos do vírus . 10 recombinante foram usados para infectar hepatócitos de pato novo primários. A expressão do gene CAT estável foi detectada por pelo menos 24 dias depois da transfecção (Chang et al., 1991). Os vetores “virais” adicionais incluem partículas semelhantes a vírus (VLPs) e fagos.

5. VETORES NÃO VIRAIS eo De modo a efetura a expressão das sequências de «. , oligonucleotídeo ou polinucleotídeo da presente invenção, a construção de expressão deve ser liberada em uma célula. Esta liberação pode ser realizada in vitro, como em procedimentos de laboratório para transformar linhagens de célula, ouin vivo ou ex vivo, como no tratamento de certos estados de doença. Como descrito acima, um mecanismo preferido para a liberação é via infecção viral onde a construção de expressão é encapsulada em uma partícula viral infecciosa. Uma vez que a construção de expressão tenha sido liberada na —célulao ácido nucléico que codifica as sequências de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo desejadas pode ser posicionado e expressado em sítios diferentes. Em certas formas de realização, o ácido nucléico que codifica a construção pode ser estavelmente integrado no genoma da célula. Esta integração pode ser na posição e orientação específicas via recombinação

AS SS A AAA A homóloga (substituição de gene) ou pode ser integrado em uma posição & aleatória, não específica (aumento de gene). Já em outras formas de . realização, o ácido nucléico pode ser estavelmente mantido na célula como um segmento separado, epissômico de DNA. Tais segmentos de ácido . 5 —nucléico ou “epissomas” codificam sequências suficientes para permitir a | manutenção e replicação independente de ou em sincronização com o ciclo da i célula hospedeira. Como a construção de expressão é liberada a uma célula e onde na célula o ácido nucléico permanece é dependente do tipo de Em construção de expressão utilizada. NS) Em certas formas de realização da invenção, a construção de expressão que compreende uma ou mais sequências de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo pode simplesmente consistir de DNA recombinante nu ou plasmídeos. A transferência da construção pode ser realizada, por exemplo, por qualquer método que física ou quimica permeabilise a membrana celular. Isto é particularmente aplicável para transferência in vitro mas pode ser “º? * aplicado também ao uso in vivo. Dubensky er al. (1984) o DNA de -. , poliomavírus injetado com êxito na forma de precipitados em fosfato de cálcio no fígado e baço de camundongos adultos e recém nascidos demonstrando replicação viral ativa e infecção aguda. Benvenisty & Reshef — (1986) também demonstrou que a injeção intraperitoneal direta de plasmídeos precipitados com fosfato de cálcio resultou na expressão dos genes transfectados. É considerado que o DNA que codifica um gene de interesse também pode ser transferido em uma maneira similar in vivo e expressa o | produto de gene.

| 25 Uma outra forma de realização da invenção para transferir uma construção de expressão de DNA nu em células pode envolver o bombardeio de partícula. Este método depende da capacidade para acelerar os microprojéteis revestidos com DNA a uma velocidade alta permitindo que eles perfurassem as membranas celulares e entrassem nas células sem as

OO

| 79 matar (Klein et al., 1987). Vários dispositivos para acelerar partículas : pequenas foi desenvolvida. Um tal dispositivo conta com uma descarga de : alta voltagem para gerar uma corrente elétrica, que em por sua vez fornece a força motora (Yang et al., 1990). Os microprojéteis usados têm consistido de ê 5 — substâncias biologicamente inertes tais como pérolas de tungstênio ou ouro. Órgãos selecionados incluindo o fígado, pele, e tecido i muscular de ratos e camundongos foram bombardeados in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Isto pode requerer a exposição cirúrgica do tecido : ou células, para eliminar qualquer tecido que esteja entre a pistola e o órgão . 10 alvo,istoé, tratamento ex vivo. Mais uma vez, o DNA que codifica um gene particular pode ser liberado via este método e ainda ser incorporado.

Bactérias também podem ser utilizadas como um método de liberação (por exemplo, listeria, ver a WO2004/11048) e em particular BCG.

COMPOSIÇÕES DE POLIPEPTÍDEO A presente invenção, em outros aspectos, fornece composições ** * depolipeptídeo.

so o No geral, um polipeptídeo da invenção será um polipeptídeo i isolado (isto é, separado daqueles componentes com os quais o mesmo pode ser usualmente encontrado na natureza). Por exemplo, uma proteína que ocorre naturalmente é isolada se a mesma é separada de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural. Preferivelmente, tais polipeptídeos são pelo menos cerca de 90% puros, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% puros e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% puros. Um polinucleotídeo é — considerado estar isolado se, por exemplo, o mesmo é clonado em um vetor que não é uma parte do ambiente natural.

Os polipeptídeos podem ser preparados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas. Os polipeptídeos recombinantes codificados pelas sequências de DNA como descrito acima

OS podem ser facilmente preparados a partir de sequências de DNA usando | - qualquer uma de uma variedade de vetores de expressão conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. A expressão pode ser obtida em qualquer célula hospedeira apropriada que tenha sido transformada ou S — transfectada com um vetor de expressão contendo uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante. As células hospedeiras adequadas i incluem células procariotas, de levedura, e eucarióticas superiores, tais como células de mamífero e células vegetais. Preferivelmente, as células «+ hospedeiras utilizadas são de E. coli, levedura ou uma linhagem de célula de | . 10 mamífero tal como COS ou CHO. Os sobrenadantes de sistemas de hospedeiro/vetores adequados que secretam a proteína ou polipeptídeo recombinantes no meio de cultura podem ser primeiro concentrados usando um filtro comercialmente disponível. A seguir da concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iônica. Finalmente, uma ou mais etapas “* * de HPLC de fase reversa pode ser utilizada para purificar ainda mais são polipeptídeo recombinante.

Os polipeptídeos da invenção, fragmentos imunogênicos destes, e outras variantes tendo menos do que cerca de 100 aminoácidos, e no geral menos do que cerca de 50 aminoácidos, também pode ser gerados por meios sintéticos, usando técnicas bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. Por exemplo, tais polipeptídeos podem ser sintetizados usando qualquer uma das técnicas de fase sólida comercialmente disponíveis, tais como o método de síntese de fase sólida de Merrifield, onde os — aminoácidos são sequencialmente adicinados a uma cadeia de aminoácido em crescimento. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146 (1963). Equipamento para a síntese automatizada de polipeptídeos é comercialmente disponível de fornecedores tais como Perkin Elmer/Applied BioSystems

Division (Foster City, CA), e pode ser operado de acordo com as instruções . do fabricante.

Dentro de certas formas de realização específicas, um polipeptídeo pode ser uma proteína de fusão que compreende polipeptídeos múltiplos como aqui descritos, ou que compreendem pelo menos um polipeptídeo como aqui descrito e uma sequência não relacionada, os exemplos de tais proteínas incluem as proteínas do tétano, tuberculose e hepatite (ver, por exemplo, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336: 86-91 | . (1997)). Um parceiro de fusão pode, por exemplo, ajudar no fornecimento de . 10 epítopos auxiliares T (um parceiro de fusão imunológica), preferivelmente epítopos auxiliares T reconhecidos pelos seres humanos, ou pode ajudar na expressão da proteína (um intensificador de expressão) em rtendimentos mais altos do que a proteína recombinante nativa. Certos parceiros de fusão preferidos são parceiros de fusão tanto imunológicos quanto intensificadores de expressão. Outros parceiros de fusão podem ser selecionados de modo a “º " aumentar a solubilidade da proteína ou para permitir que a proteína seja -« , alvejadaaos compartimentos intracelulares desejados. Ainda outros parceiros de fusão incluem rótulos de afinidade, que facilitam a purificação da proteína. As proteínas de fusão no geral podem ser preparadas usando técnicas padrão, incluindo conjugação química. Preferivelmente, uma proteína de fusão é expressada como uma proteína recombinante, que permite a produção de níveis aumentados, em relação a uma proteína não fundida, em um sistema de expressão. Em resumo, as sequências de DNA que codificam os componentes de polipeptídeo podem ser montados separadamente, e —ligadosemum vetor de expressão apropriado. A extremidade 3º da sequência de DNA que codifica um componente de polipeptídeo é ligada, com ou sem um ligador peptídico, à extremidade 5º de uma sequência de DNA que codifica o segundo componente de polipeptídeo de modo que as matrizes de leitura das sequências estejam em fase. Isto permite a tradução em uma única

AA proteína de fusão que retém a atividade biológica de ambos os componentes a polipeptídicos. Uma sequência de ligador peptídico pode ser utilizada para separar o primeiro e segundo componentes de polipeptídeo por uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo dobre nas suas estruturas secundárias e terciárias. Uma tal sequência de ligador peptídico é incorporada | na proteína de fusão usando técnicas padrão bem conhecidas na técnica. As sequências de ligador peptídico adequadas podem ser escolhidas com base Na nos seguintes fatores: (1) a sua capacidade para adotar uma conformação | . 10 prolongada flexível; (2) a sua incapacidade para adotar uma estrutura secundária que interagiria com epítopos funcionais no primeiro e segundo polipeptídeos; e (3) a falta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que reagiriam com os epítopos funcionais do polipeptídeo. As sequências de ligador peptídico preferidas contêm resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos quase neutros, tais como Thr e Ala também podem ser usados na VU * — sequência ligadora. As sequências de aminoácido que podem ser utilmente -. , utilizadascomoligadores incluem aquelas divulgadas em Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 8258 a 8262 (1986); Patente U.S. No. 4.935.233 e Patente U.S. N. 4.751.180. A sequência ligadorano geral pode ser de | a cerca de 50 aminoácidos no comprimento. As sequências ligadoras não são requeridas quando o primeiro e segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácido de terminal N não essenciais que podem ser usadas para separar os domínios funcionais e prevenir interferência estérica.

Dentro de formas de realização preferidas, um parceiro de fusão imunológico é derivado da proteína D, uma proteína de superfície da bactéria — gram-negativa — Haemophilus influenza B (WO91/18926). Preferivelmente, um derivado da proteína D compreende aproximadamente a primeira terceira da proteína (por exemplo, os primeiros 100 a 110 aminoácidos do terminal N), e um derivado de proteína D pode ser lipidado. : Dentro de certas formas de realização preferidas, os primeiros 109 resíduos de um parceiro de fusão de lipoproteína D são incluídos no terminal N para i prover o polipeptídeo com epítopos de célula T exógenos adicionais e para aumentar o nível de expressão na E. coli (funcionando assim como um intensificador de expressão). A cauda lipídica garante apresentação ideal do | antígeno às células que apresentam antígeno.

Outros parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus da influenza, NS1 (hemaglutinina). - Tipicamente, os 81 aminoácidos do terminal N são usados, embora

: 10 — fragmentos diferentes que incluem epítopos auxiliares T possam ser usados.

Em uma outra forma de realização, o parceiro de fusão imunológico é a proteína conhecida como LYTA, ou uma porção desta (preferivelmente uma porção de terminal OC). LYTA é derivada de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase conhecida como amidase LYTA (codificada pelo gene LytA; Gene 43: 265- *? * 292 (1986)). LYTA é uma autolisina que especificamente degra certas a ligações na cadeia principal de peptidoglicano.

O domínio de terminal C da proteína LYTA é responsável pela afinidade para a colina ou em alguns análogos de colina tais como DEAE.

Esta propriedade foi explorada para o — desenvolvimento de plasmídeos que expressam C-LYTA de E. coli úteis para a expressão de proteínas de fusão.

A purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento C-LYTA no terminal de amino foi descrito (ver Biotechnology 10: 795-798 (1992)). Dentro de uma forma de realização preferida, uma porção de repetição de LYTA pode ser incorporada dentro de uma proteína de fusão.

Uma porção de repetição é encontrada na região de terminal C partindo no resíduo 178. Uma porção de repetição particularmente preferida incorpora resíduos de 188 a 305.

| CÉLULAS T . As composições imonoterapêuticas também podem, ou alternativamente, compreender células T específicas para um antígeno de i Mycobacterium. Tais células no geral podem ser preparadas in vitro ou ex vivo, usando procedimentos padrão. Por exemplo, células T podem ser isoladas da medula óssea, sangue periférico, ou uma fração de medula óssea | ou sangue periférico de um paciente, usando um sistema de separação de célula comercialmente disponível, tal como o Isolex* System, disponível da " Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; ver também a Patente U.S. No. — 10 5.240.856; Patente US. No. 5.215.926; WO89/06280; WO91/16116 e WOS92/07243). Alternativamente, as células T podem ser derivadas de linhagem de células ou culturas relacionadas ou não relacionadas humanas, não humanas.

: As células T podem ser estimuladas com um polipeptídeo da 157, invenção, polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo, e/ou uma célula A que apresenta antígeno (APC) que expressa um tal polipeptídeo. Tal : à « — estimulação é realizada sob condições e por um tempo suficiente para permitir a geração de células T que são específicas para o polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo ou polinucleotídeo está presente dentro de um — veículo de liberação, tal como uma microesfera, para facilitar a geração de células T específicas.

As células T são consideradas ser específicas para um polipeptídeo da invenção se as células T especificamente proliferam, secretam citocinas ou matam as células alvo revestidas com o polipeptídeo ou que — expressam um gene que codifica o polipeptídeo. À especificidade de célula T pode ser avaliada usando qualquer uma de uma variedade de técnicas padrão. Por exemplo, dentro de um ensaio de liberação de cromo ou ensaio de proliferação, um índice de estimulação de mais do que duas vezes de aumento na lise e/ou proliferação, comparada com controles negativos, indica |

NS 85 especificidade de célula T. Tais ensaios podem ser realizados, por exemplo, . como descrito em Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070 (1994)).

Alternativamente, a detecção da proliferação de células T pode ser realizada i por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação de célulaT pode ser detectada medindo-se uma taxa aumentada de síntese de DNA (por exemplo, pelas culturas de rotulação de pulso de células T com | timidina tritiada e medindo a quantidade de timidina tritiada incorporada no DNA). O contato com um polipeptídeo da invenção (100 ng/ml a 100 ug/ml, - preferivelmente 200 ng/ml a 25 ug/ml) por 3 a 7 dias deve resultar em um — 10 aumento de pelomenos duas vezes na proliferação das células T. O contato como descrito acima por 2 a 3 horas deve resultar na ativação das células T, como medidas usando ensaios de citocina padrão em que um aumentop de duas vezes no nível de liberação de citocina (por exemplo, TNF ou IFNy) é indicativo de ativação de célula T (ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)). As células T que foram ativadas em resposta a tum polipeptídeo, polinucleotídeo ou APC que expressa polipeptídeo podem 2a o, Ser CD4* e/ou CD8”. As células T específicas de proteína podem ser expandidas usando técnicas padrão. Dentro de formas de realização preferidas, as células T são derivadas de um paciente, um doador relacionado —ouum doador não relacionado, e são administrados ao paciente a seguir da estimulação e expansão.

Para propósitos terapêuticos, as células T CD4+ ou CD8+ que proliferam em resposta a um polipeptídeo, polinucleotídeo ou APC podem ser expandidas em número in vitro ou in vivo. A proliferação de tais células T in vitro podem ser realizadas em uma variedade de modos. Por exemplo, as células T podem ser re-expostas a um polipeptídeo, ou um peptídeo curto que corresponda a uma porção imunogênica de um tal polipeptídeo, com ou sem a adição de fatores de crescimento de célula T, tais como interleucina-2, e/ou células estimuladoras que sintetizam um polipeptídeo. Alternativamente, uma

AAA A 86 ou mais células T que proliferam na presença da proteína podem ser . expandidas em número pela clonagem. Métodos para clonar células são bem conhecidos na técnica, e incluem diluição limitante. i COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS Em formas de realização adicionais, as composições de polinucleotídeo, polipeptídeo, célula T e/ou anticorpo aqui divulgadas serão formuladas em soluções farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis para a administração a uma célula ou um animal, sozinho, ou em . combinação com uma ou mais outras modalidades de terapia. 210 Também será entendido que, se desejado, o segmento de ácido nucléico (por exemplo, RNA ou DNA) que expressa um polipeptídeo como aqui divulgado pode ser administrado também em combinação com outros agentes, tais como, por exemplo, outras proteínas ou polipeptídeos ou vários | agentes . farmaceuticamente ativos, incluindo agentes quimioterapêuticos eficazes contra uma infecção de M. tuberculosis. De fato, não existe *º * virtualmente nenhum limite para outros componentes que também podem ser 4 . — incluídos, dado que os agentes adicionais não causam um efeito adverso significante no contato com as células alvo ou tecidos hospedeiros. As composições podem ser assim liberadas juntas com vários outros agentes — como requeridos no caso particular. Tais composições podem ser purificadas a partir de células hospedeiras ou outras fontes biológicas, ou alternativamente podem ser quimicamente sintetizadas como aqui descrito. Igualmente, tais composições podem compreender ainda composições de RNA ou DNA substituídas ou derivatizadas.

A formulação de excipientes e soluções carregadoras farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida por aqueles de habilidade na técnica, como é o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para o uso das composições particulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo por exemplo, a administração e DRESS A A A AA A a formulação orais, parenterais, intravenosas, intranasais, e intramusculares.

- Outras vias de administração incluem via as superfícies mucósicas. Tipicamente, as formulações que compreendem liberar uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 0,1 ug a cerca de 1000 ug de —polipeptídeo por administração, mais tipicamente cerca de 2,5 ug a cerca de 100 ug de polipeptídeo por administração. Em relação às composições de polinucleotídeo, estas liberam tipicamente cerca de 10 ug a cerca de 20 mg do polinucleotídeo inventivo por administração, mais tipicamente de cerca de 0,1 “ mg a cerca de 10 mg do polinucleotídeo inventivo por administração.

: 10 Naturalmente, a quantidade de composto(s) ativo(s) em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada de um tal modo que uma dosagem adequada será obtida em qualquer dose unitária dada do composto. Fatores tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia vida biológica, via de administração, vida de prateleira do produto, assim como 15º outras considerações farmacológicas serão consideradas por uma pessoa * * habilitadana técnica de preparar tais formulações farmacêuticas, e como tal, «+» , uma variedade de regimes de dosagem e tratamento pode ser desejável.

1. LIBERAÇÃO ORAL Em certas aplicações, as composições farmacêuticas aqui — divulgadas podem ser liberadas via administração oral a um animal. Como tais, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um carregador comestível assimilável, ou elas podem ser incluídas em cápsulas de gelatina de casca dura ou mole, ou elas podem ser comprimidas em tabletes, ou elas podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta Os compostos ativos podem ser ainda incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabetes bucais, comprimidos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, e outros (Matiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; Patente U. S. 5.641.515; Patente

U. S. 5.580.579 e Patente U. S. 5.792.451, cada uma aqui especificamente . incorporado por referência na sua totalidade). Os tabletes, comprimidos, Pílulas, cápsulas e outros também podem conter os seguintes: um aglutinante, como goma tragacanto, acácia, amido de milho, ou gelatina; excipientes, tais — como fosfato de dicálcio; um agente de desintegração, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e outros; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante, tal como sacarose, lactose ou sacarina podem ser adicionados ou um agente flavorizante, tal como hortelã, . óleo de gaultéria, ou sabor de cereja. Quando a forma unitária de dosagem é — 10 uma cápsula, amesma pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carregador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, tabletes, pílulas, ou cápsulas podem ser revestidos com goma laca, açúcar, ou ambos. Um xarope de elixir pode conter o componente ativo, sacarose como um agente adoçante metil e propilparabenos O como preservantes, um corante e flavorizante, tal como sabor de cereja ou . » , laranja, Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma unitária de dosagem deve ser farmaceuticamente pura e substancialmente não tóxica nas quantidades utilizadas. Além disso, os — componentes ativos podem ser incorporados na preparação e formulações de liberação prolongada.

Para a administração oral as composições da presente invenção podem ser alternativamente incorporadas com um ou mais excipientes na forma de um enxágues bucais, dentifrício, tablete bucal, pulverização oral, ou formulação sublingual oralmente administrada. Por exemplo, um enxágue bucal pode ser preparado incorporando o ingrediente ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado, tal como uma solução de borato de sódio (Solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser incorporado em uma solução oral tal como uma contendo borato de sódio,

glicerina e bicarbonato de potássio, ou disperso em um dentifrício, ou . adicionado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a uma composição que pode incluir água, aglutinantes, abrasivos, agentes flavorizantes, agentes espumantes, e umectantes. Alternativamente as composições podem ser —modeladoem uma forma de tablete ou solução que pode ser colocado sob a lingua ou de outro modo dissolvido na boca.

2. LIBERAÇÃO INJETÁVEL Em certas circunstâncias será desejável liberar as composições . farmacêuticas aqui divulgadas parenteral, intravenosa, intramuscular, — 10 intradermicamente, ou mesmo intraperitonealmente como descrito na Patente U.S. 5.543.158; Patente U. S. 5.641.515 e Patente U. S. 5.399.363 (cada uma aqui especificamente incorporada por referência em sua totalidade). As soluções dos compostos ativos como base ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturadas com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser ço preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas destes e em .-» , óleos. Sob condições comuns de armazenagem e uso, estas preparações contêm um preservante para prevenir o crescimento de microorganismos. As formas farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéries e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéries (Patente U. S. 5.466.468, especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade). Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida até o grau em que seringabilidade fácil exista. A mesma deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O carregador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e outros), misturas adequadas destes, e/ou óleos NS SS A A A AAA | vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um . revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser facilitada por vários agentes —antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e outros. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realziada pelo uso nas ' composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, — 10 monoestearatode alumínio e gelatina. Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponizada se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glicose suficientes. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas paraa administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. 7º * Nestaconexão, um meio aquoso estéril que pode ser utilizado será conhecido .- +» , poraquelesde habilidade na técnica considerando-se a presente divulgação. | Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionado a 1000 ml de fluido hipodermóclise ou injetado no sítio — proposto de infusão (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15º Edição, pp. 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá dependendo da condição do indivíduo que é tratada. A pessoa responsável para a administração, em qualquer evento, determinará a dose apropriada para o indivíduo. Além disso, para a administração humana, as preparações devem atingir esterilidade, pirogenicidade, e os padrões de segurança e pureza gerais como requerido pelo FDA Office of Biologics Standards.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente

N—————õ oq RO eosOO OO AO EEE AAA ATO 91 apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como . requerido, seguido pela esterilização filtrada. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação dos várious ingredientes ativos esterilizados em i um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros S ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são as técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional . desejado de uma solução destes previamente filtrada estéril. , 10 As composições aqui divulgadas podem ser formuladas em uma forma neutra ou salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de amino livre da proteína) e que são formadas com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e outros. Os sais formados com os grupos carboxila “o livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por .» , exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e bases | orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e outros. Na formulação, as soluções serão administradas em uma maneira — compatível com a formulação de dosagem e em quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de medicamento, e outros. Como aqui usado, “carregador” inclui qualquer um e todos os — solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção, tampões, soluções carregadoras, suspensões, colóides, e outros. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer medio ou agente convencionais

NS OA seja incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições á terapêuticas é considerado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A frase “farmaceuticamente aceitáveis” refere-se a entidades — moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar indesejada quando administradas a um ser humano. À preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente ativo é ! bem entendido na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas : como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; as formas sólidas — 10 adequadas para a solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção também pode ser preparada. A preparação também pode ser emulsificada.

3. LIBERAÇÃO NASAL E BUCAL Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas podem ser liberadas pelas pulverizações intranasais, pulverizações bucais, | 15 inalação, e/ou outros veículos de liberação aerossol. Os métodos para a * * * liberação de genes, ácidos nucléicos, e composições peptídicas diretamente . . , aospulmõespor exemplo via pulverizações de aerossol nasal e bucal foram descritas por exemplo, na Patente U. S. 5.756.353 e Patente U. S. 5.804.212 (cada um especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade). Do mesmo modo, a liberação de medicamentos usando resinas de micropartícula intranasais (Takenaga er al, 1998) e compostos de lisofosfatidil-glicerol (Patente U. S. 5.725.871, especificamente aqui incorporados por referência na sua totalidade) também são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas. Do mesmo modo, a liberação de medicamento —transmucósica na forma de uma matriz de suporte de politetrafluoroetileno é descrita na Patente U. S. 5.780.045 (especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade).

MS 93

4. LIBERAÇÃO MEDIADA POR LIPOSSOMA, NANOCÁPSULA E MICROPARTÍCULA . Em certas formas de realização, os inventores consideram o uso de lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas i lipídicas, vesículas, e outros, para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. Em particular, as composições da presente invenção podem ser formuladas para a liberação encapsulada em uma partícula de lipídeo, um lipossoma, uma vesícula, um nanoesfera, ou uma nanopartícula ou coisa parecida. . Tais formulações podem ser preferidas para a introdução de formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucléicos ou construções aqui divulgadas. A formação e uso de lipossomas é no geral conhecida por aqueles de habilidade na técnica (ver por exemplo, Couvreur ef al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que descrevem o uso de lipossomas e nanocápsulas na terapia de antibiótico alvejada para as infecções e doenças bacterianas intracelulares). Recentemente, os lipossomas foram desenvolvidos * “ com estabilidade sérica e meio tempos de circulação melhorados (Gabizon & . * . Papahadjopoulos, 1988; Allen e Choun, 1987; Patente U. S. 5.741.516, especificamente aqui incorporados por referência em sua totalidade). Além disso, vários métodos de lipossoma e preparações equivalentes a lipossoma como carregadores de medicamento potenciais foram revisados (Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; Patente U. S. 5.567.434; Patente U. S. 5.552.157; Patente U. S. 5.565.213; Patente U. S. 5.738.868 e Patente U. S. 5.795.587, cada um especificamente aqui incorporado por referência em sua totalidade). Os lipossomas foram usados com êxito com vários tipos de célula que são normalmente resistentes à transfecção por outros procedimentos incluindo suspensões de célula T, culturas de hepatócito primário e células PC 12 (Renneisen et al., 1990; Muller er al., 1990). Além disso, os lipossomass são isentos das restrições de comprimento de DNA que SONS a são típicas de sistemas de liberação com base viral.

Os lipossomas foram . usados eficazmente para introduzir genes, medicamentos (Heath & Martin, 1986; Heath er al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta & Puglisi, 1996), agentes radioterapêuticos (Pikul et al., 1987), enzimas (imaizumi et al., — 1990a; Imaizumi et al., 1990b), vírus (Faller & Baltimore, 1984), fatores de transcrição e efetores alostéricos (Nicolau & Gersonde, 1979) em uma variedade de linhagens de células e animals.

Além disso, várias trilhas clínicos bem sucedidas que examinam a eficácia da liberação de medicamento | . mediadas por lipossomas foram completadas (Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier er al., 1988). Além disso, vários estudos sugerem que o uso de lipossomas não está associado com respostas autoimunes, toxicidade ou localização gonadal depois da liberação sistêmica | (Mori & Fukatsu, 1992). Lipossomas são formados de fosfolipídeos que são dispersados em um meio aquoso e espontaneamente formam vesículas de bicamada * * concêntrica multilamelares (também chamadas de vesículas multilamelares + . (MLVs) MLVs no geral têm diâmetros de 25 nm a 4 um.

A sonificação de ML Vs resulta na formação de vesículas unilamelares pequenas (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 À, contendo uma solução aquosa no núcleo.

Os lipossomas carregam semelhanças com as membranas celulares e são considerados para o uso em conexão com a presente invenção como carregadores para as composições de peptídeo.

Estes são amplamente adequados tanto como substâncias solúveis em água quanto lipídeo podem ser aprisionadas, isto é, nos espaços aquosos e dentro da própria bicamada, respectivamente.

É possível que os lipossomas que carregam medicamento possam ser ainda utilizados para a liberação específica de sítio de agentes ativos modifivando-se seletivamente a formulação lipossômica.

Além disso para as dilvulgações de Couvreur et al. (1977; 1988), a seguinte informação pode ser utilizada na geração de formulações lipossômicas. Os fosfolipídeos podem formar uma variedade de estruturas ' outras que não lipossomas quando dispersos em água, dependendo da razão molar de lipídeo para água. Em razões baixas os lipossomas são a estrutura preferida. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, S — concentração iônica e a presença de cátions bivalentes. Os lipossomas podem mostrar permeabilidade baixa para substâncias iônicas e polares, mas em temperaturas elevadas sofrem uma transição de fase que acentuadamente altera a sua permeabilidade. A transição de fase envolve uma mudança de . uma estrutura intimamente empacotada, ordenada, conhecida como o estado . 10 de gel, para uma estrutura frouxamente empacotada, menos ordenada, conhecida como o estado fluido. Isto ocorre em uma temperatura de transição de fase característica e resulta em um aumento na permeabilidade para os íons, açúcares e medicamentos.

Além da temperatura, a exposição às proteínas pode alterar a permeabilidade de lipossomas. Certas proteínas solúveis, tais como citocromo o o c, ligam, deformam e penetram a bicamada, causando deste modo mudanças —* - na permeabilidade. O colesterol inibe esta penetração de proteínas, aparentemente pelo empacotamento dos fosfolipídeos mais firmemente. É considerado que a maioria das formações de lipossomas úteis para a liberação deantibióticoe inibidor conterá colesterol.

A capacidade para aprisionar solutos varia entre tipos diferentes de lipossomas. Por exemplo, ML Vs são moderadamente eficientes no aprisionamento de solutos, mas SUVs são extremamente ineficientes. SUVs oferecem a vantagem de homogeneidade e reprodutibilidade na — distribuição de tamanho, entretanto, e um compromisso entre tamanho e eficiância de aprisionamento é oferecido pelas vesículas unilamelares grandes (LUVs). Estes são preparados pela evaporação do éter e são três a quatro vezes mais eficientes no aprisionamento de soluto do que ML Vs.

Além das características de lipossomas, um determinante . importante nos compostos de aprisionamento são as propriedades fisicoquímicas do próprio composto. Os compostos polares são aprisionados nos espaços aquosos e compostos não polares se ligam à bicamada lipídica da — vesícula. Os compostos polares são liberados através da permeação ou quando a bicamada é quebrada, mas os compostos não polares permanecem afiliados com a bicamada a menos que a mesma seja rompida pela temperatura ou exposição às lipoproteínas. Ambos os tipos mostram taxas de efluxo máximas . na temperatura de transição de fase. | 210 Os lipossomas interagem com células via quatro mecanismos diferentes: endocitose pelas células fagocíticas do sistema reticuloendotelial tais como macrófagos e neutrófilos; absorção à superfície de célula, pelas forças hidrofóbicas ou eletrostáticas fracas não específicas, ou pelas interações específicas com componentes da superfície celular; a fusão com a 15" membrana celular plasmática pela inserção da bicamada lipídica dos eos lipossomas na membrana plasmática, com a liberação simultânea de .-.-. 2. conteúdos lipossôômicos no citoplasma; e pela transferência de lipídeos lipossômicos para membranas celulares ou subcelulares, ou vice e versa, sem qualquer associação dos conteúdos lipossômicos. Frequentemente é difícil determinar qual mecanismo é operativo e mais do que um pode operar ao mesmo tempo.

O destino e disposição de lipossomas intravenosamente injetado depende das suas propriedades físicas, tais como tamanho, fluidez, e carga de superfície. Eles podem persistir em tecidos por horas ou dias, — dependerdo da sua composição, e meia vidas na faixa do sangue de minutos a vparias horas. Os lipossomas principais, tais como MLVs e LUVs, são absorvidos rapidamente pelas células fagocíticas do sistema reticulo endotelial, mas a fisiologia do sistema circulatório restringe a saída de tais espécies grandes na maioria dos sítios. Eles podem sair apenas em lugares onde aberturas grandes ou poros saem no endotélio capilar, tal como o . sinusóides do fígado ou baço. Assim, estes órgãos são o sítio predominante de captação. Por outro lado, SUVs mostram uma distribuição de tecido mais i amplo mas ainda são sequestrados altamente no fígado e baço. No geral, este — comportamento in vivo limita o potencial alvejador de lipossomas a apenas aqueles órgãos e tecidos acessíveis ao seu tamanho grande. Estes incluem o sangue, fígado, baço, medula óssea, e órgãos linfóides.

O alvejamento no geral não é uma limitação em termos da . presente invenção. Entretanto, o alvejamento específico deve ser desejado, : 10 métodos estão disponíveis para visto ser realizado. Os anticorpos podem ser usados para ligar à superfície dos lipossomas e para direcionar o anticorpo e seus conteúdos de medicamento aos receptores antigênicos específicos localizados em uma superfície do tipo de célula particular. Os determinantes de carboidrato (componentes de superfície celular de glicoproteína ou glicolipídeo que desempenham um papel no reconhecimento, interação e -º * adesão de célula-célula) também podem ser usados como sítios de . * . reconhecimento visto que eles têm potencial no direcionamento de lipossomas aos tipos de célula particulares, Principalmente, é considerado que a injeção intravenosa de preparações lipossômicas seria usada, mas outras vias de administração também são concebíveis.

Alternativamente, a invenção fornece formulações de nanocápsula farmaceuticamente aceitáveis das composições da presente invenção. As nanocápsulas no geral podem aprisionar compostos em um modo estável e reprodutível (Henry-Michelland er al., 1987; Quintanar- — Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987). Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (de tamanho em torno nde 0,1 um) devem ser planejados usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. As nanopartículas de polialquil- cianoacrilato biodegradáveis que atingem estas exigências são consideradas ias - 98 para o uso na presente invenção. Tais partículas podem ser são facilmente . fabricadas, como descrito (Couvreur ef al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 e Patente U. S.

5.145.684, especificamente aqui incorporados por referência em sua totalidade). Emplastros de pele também podem ser utilizados para a liberação transcutânea.

COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS : Em certas formas de realização preferidas da presente invenção, composições imunogênicas são fornecidas. As composições | imunogênicas no geral compreenderão um ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos, tais como aqueles debatidos acima, em combinação com um imunoestimulante. Um imunoestimulante pode ser qualquer substância que intensifique ou potencie uma resposta imune (mediada por anticorpo e/ou 15º célula) para um antígeno exógeno. Os exemplos de imunoestimulantes -º * incluem adjuvantes, microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo . * « poliláctico) e lipossomas (nos quais o composto é incorporado; ver, por exemplo, Fullerton, Patente U.S. Nº 4.235.877). A preparação de composições imunogênicas é no geral — descrita, por exemplo, em Powell & Newman, eds., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995). As composições farmacêuticas e composições imunogênicas dentro do escopo da presente invenção também podem conter outros compostos, que podem ser biologicamente ativos ou inativos. Por exemplo, uma ou mais porções imunogênicas de outros — antígenos de M. tuberculosis podem estar presentes, incorporados em um polipeptídeo de fusão ou como um composto separado, dentro da composição farmacêutica ou imunogênica. As composições imunogênicas ilustrativas podem conter um | polinucleotídeo (por exemplo, DNA) que codifica um ou mais dos polipeptídeos como descritos acima, tal que o polipeptídeo seja gerado in situ . (evocando deste modo uma resposta imune). Como mencionado acima, o DNA pode estar presente dentro de qualquer uma de uma variedade de sistemas de liberação conhecidos por aqueles de habilidade comum na — técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucléico, sistemas de expressão bacteriana e viral. Numerosas técnicas de liberação de gene são bem conhecidos na técnica, tais como aquelas descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198 (1998), e referências aí - citadas. Os sistemas de expressão de ácido nucléico apropriados contém as — sequências de DNA necessárias para a expressão no paciente (tal como um promotor e sinal de terminação adequados). Os sistemas de liberação bacterianos envolvem a administração de uma célula hospedeira bacteriana (por exemplo, uma cepa de Mycobacterium, Bacilo ou LactoBacilo, incluindo Bacilo de Calmette-Guerrin ou Lactococcus lactis) que expressam o polipeptídeo (por exemplo, na sua superfície de célula ou secreta o o polipeptídeo) (ver, por exemplo, Ferreira, et al., An Acad Bras Cienc (2005) 2 . 77:113-124; e Raha, er al., Appl Microbiol Biotechnol (2005) PubMedID 15635459). Em uma forma de realização preferida, o DNA pode ser introduzido usando um sistema de expressão viral (por exemplo, varíola ou outro pox vírus, retrovírus, ou adenovírus), que pode envolver o uso de um vírus não patogênico (defeituoso), vírus competente de replicação. Os sistemas adequados são divulgados, por exemplo, em Fisher-Hoch et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8: 17-21 (1990); Patente U.S. — Nos. 4.603.112, 4.769.330, e 5.017.487; WO89/01973; Patente U.S. No.

4.777.127, GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Kolls et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91: 215-219 (1994); Kass- Eisler ef al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 90: 11498 a 11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88: 2838 a 2848 (1993); e Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202- . 1207 (1993). As técnicas para incorporar DNA em tais sistemas de expressão são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. O DNA também pode ser “nu,” como descrito, por exemplo, em Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993) e revisado por Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993). A captação de DNA nu pode ser aumentado pelo revestimento do DNA sobre pérolas biodegradáveis, que são eficientemente transportados nas | células. Estará evidente que uma composição imunogênica pode compreender z tanto um componente de polinucleotídeo quanto um de polipeptídeo. Tal 2 10 composição imunogênica pode fornecer uma resposta imune realçada.

Estará evidente que uma composição imunogênica pode conter sais farmaceuticamente aceitáveis dos polinucleotídeos e polipeptídeos aqui fornecidos. Tais sais podem ser preparados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (por exemplo, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias e aminoácidos básicos) e bases ao inorgânicas (por exemplo, sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio e - + . magnésio). Embora qualquer carregador adequado conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica possa ser utilizado nas composições —imunogênicas desta invenção, o tipo de carregador variará dependendo do modo de administração. As composições da presente invenção podem ser formuladas por qualquer maneira apropriada de administração, incluindo por exemplo, a administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Para a administração parenteral, — tal como injeção subcutânea, o carregador preferivelmente compreende água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para a administração oral, qualquer um dos carregadores acima ou um carregador sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magnésio, podem ser utilizados. As microesferas biodegradáveis (por exemplo, polilactato . poliglicolato) também podem ser utilizadas como carregadores para as composições farmacêuticas desta invenção. As microesferas biodegradáveis É adequadas são divulgadas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.897.268,

5.075.109, 5.928.647, 5.811.128, 5.820.883, 5.853.763, 5.814.344 e

5.942.252. Uma pessoa também pode utilizar um carregador que compreende os complexos de proteína particulada descritos na Patente U.S. No. 5.928.647, que são capazes de induzir uma respostas de linfócito T citotóxica restrita de -. classe I em um hospedeiro.

Tais composições também podem compreender tampões (por | exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes queladores tais como EDTA ou —glutationa, adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio), solutos que - tomama formulação isotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o — + . Sangue de um receptor, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou preservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os compostos também podem ser — encapsulados dentro de lipossomas usando a tecnologia bem conhecida. Qualquer uma de uma variedade de imunostimulantes pode ser utilizada nas composições imunogênicas desta invenção. Por exemplo, um adjuvante pode ser incluído. A maioria dos adjuvantes contém uma substância Planejada para proteger o antígeno de catabolismo rápido, tal como hidróxido —dealumínioouóleo mineral, e um estimulador de respostas imunes, tais como lipídeo A, Bortadella pertussis ou espécie de Mycobacterium ou proteínas derivadas de Mycobacterium. Por exemplo, M. vaccae deslipidada, desglicolipidada (“pVac”) pode ser usada. Os adjuvantes adequados são comercialmente disponíveis como, por exemplo, Adjuvante Incompleto e

CW .— W)=202 1A9º,9595)/1)2 2 “966 »:P > >J Tru" "CC". " 2. 0" 102 Adjuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante . 65 da Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); ASOIB, ASO2A, | AS15, AS-2 e derivados destes (GlaxoSmithKline, Filadélfia, PA); CWS ] (equeleto de parede celular de um Bacilo da tuberculose), TDM (trealose — dicorinomicolato), Leif (fator de iniciação de alongamento de Leishmania), sais de alumínio tais como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacarídeos catiônica ou anionicamente . derivatizados; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil lipídeo À (MPLO); e quil A (por exemplo, QS-21). Citocinas, tais como i GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, também podem ser usados como adjuvantes.

Um adjuvante refere-se aos componentes em uma vacina ou composição terapêutica que aumenta a resposta imune específica ao antígeno (ver, por exemplo, Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8: 1409-1411 OS (1992)). Os adjuvantes induzem respostas imunes da resposta tipo Th1 e tipo + . Th>2, As citocinastipo Th! (por exemplo, IFN-y, IL-2, e IL-12) tendem a favorecer a indução de resposta imune mediada por célula a um antígeno administrado, enquanto que as citocinas tipo Th-2 (por exemplo, IL-4, IL-5, 116, 11-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais. Os adjuvantes capazes de estimular preferencialmente uma resposta imune mediada por célula Th-1 são descritos na WO94/00153 e WO95/17209. Dentro das composições imunogênicas aqui fornecidas, a composição adjuvante é preferivelmente planejada para induzir uma resposta imune predominantemente do tipo Thl. A seguir da aplicação de uma composição imunogênica como aqui fornecida, um paciente tipicamente sustentará uma resposta imune que inclui respostas tipo Th1 e Th2. Dentro de uma forma de realização preferida em que uma resposta é predominantemente tipo Th1, o nível de citocinas tipo Thl aumentará a um CNO ]

grau maior do que o nível de citocinas tipo Th2. Os níveis destas citocinas ' podem ser facilmente avaliadas usando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, ver Janeway, et al., Immunobiology, 5º Edição, 2001. As composições de Rv2386c usualmente compreendem um ou mais adjuvantes, por exemplo, ASOIB (monofosforil lipídeo A 3-des-O- acilado (3D-MPLO) e QS21 em uma formulação de lipossomas; ver, a Publicação de Patente U.S. No. 2003/0143240); ASO02A (3D-MPLQO e QS21 e uma emulsão de óleo em água; ver, Bojang, et al., Lancet (2001) 358: 1927); . ENHANZYNQO (Detox); 3D-MPLGO; saponinas incluindo Quil A e seus — componentes por exemplo, QS21 e miméticos de saponina; CWS (esqueleto | de parede celular de um Bacilo de tubérculoy TDM (trealose dicorinomicolato); — aminoalquil — glicosaminida — 4-fosfatos — (AGPs); oligonucleotídeos imunoestimuladores por exemplo, CPG; Leif (fator de iniciação de alongamento de Leishmania); e derivatives destes. Em uma forma de realização preferida, um polipeptídeo Rv2386c é administrado com “ umoumais adjuvantes selecionados do grupo que consiste de 3D-MPLGO e - + . QS21emuma formulação de lipossomas por exemplo, ASO01B e 3D-MPLGO e QS21 e uma emulsão de óleo em água (por exemplo, AS02A). Sistemas de adjuvante ASOIB e ASO2A são descritos ainda em Pichyangkul, et al.,

20. Vaccine(2004)22:3831-40. Quando da liberação do antígeno Rv2386c como um ácido nucléico, o mesmo pode ser liberado, por exemplo, em um vetor viral (isto é, um vector de adenovírus), ou em uma célula hospedeira de bactéria mutante (isto é, uma célula hospedeira mutante, avirulenta de Mycobacterium, —LactoBacilo ou Bacilo incluindo Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) e Lactococcus lactis). Os adjuvantes preferidos para o uso na evocação de uma resposta predominantemente tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídeo A (MPLO) preferivelmente monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado (3D-MPLO), opcionalmente com um sal de . alumínio (ver, por exemplo, Ribi, er al, 1986, Immunology and Imunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, pp. i 407-419; GB 2122204B; GB 2220211; e US 4.912.094). Uma forma preferida —de3D-MPLQO está na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula pequeno menor do que 0,2 mm no diâmetro, e seu método de fabricação é divulgado na WO94/21292. As formulações aquosas que compreende monofosforil lipídeo A e um tensoativo foi descrito na WO98/43670. Os : adjuvantes preferidos exemplificados incluem ASO0IB (MPLO e QS21 em uma formulação de lipossoma), 3D-MPLO e QS21 em uma formulação de | lipossomas, ASO02A (MPLG e QS21 e uma emulsão de óleo em água), 3D- MPLO e QS21 e uma emulsão de óleo em água, e AS15, disponível da GlaxoSmithKline. Os adjuvantes MPLG são disponíveis da GlaxoSmithKline (ver a Patente US Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094).

Os oligonucleotídeos contendo CpG (em que o dinucleotídeo -º * CpGnãoé metilado) também induz uma resposta predominantemente Th1. — : . CpGé uma abreviação para os motivos de citosina-guanosina dinucleotídeo presentes no DNA. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, na WO96/02555, WO99/33488 e Patente U.S. Nos.

6.008.200 e 5.856.462. as sequências de DNA imunoestimuladoras também são descritas, por exemplo, por Sato et al., Science 273: 352 (1996). CpG quando formulado em composições imunogênicas, é no geral administrado em solução livre junto com antígeno livre (WO96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antígeno (WO98/16247), ou — formulado com um carregador tal como hidróxido de alumínio ((antígeno de superfície da Hepatite) Davis et al. supra; Brazolot-Millan et al, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8). CpG é conhecido na técnica como sendo um adjuvante que pode ser administrado pelas vias tanto sistêmica quanto mucósica (WO96/02555, EP 468520, Davis et al., J.

SO OO A

Immunol., 1998, 160(2): 870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol., 1998, . 161(9): 4463-6).

Um outro adjuvante preferido é uma saponina ou miméticos de : | saponina ou derivados, tais como Quil A, preferivelmente QS21 (Aquila : 5 — Biofarmaceutics Inc., Framingham, MA), que pode ser usado sozinho ou em combinação com outros adjuvantes. Por exemplo, um sistema realçado envolve a combinação de um derivado de monofosforil lipídeo A (MPLO) e saponina, tal como a combinação de QS21 e 3D-MPLG como descrito na * WOS94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol, como descrito na WO96/33739. Outras formulações | preferidas compreendem uma emulsão de óleo em água e tocoferol. Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPLO e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO95/17210. Os adjuvantes de saponina adicionais de uso na presente invenção incluem QS7 (descrito na WO96/33739 e WO96/11711) e QS17 (descrito na Patente U.S.

- * No.5.057.540e EP 0362279 Bl). voo Alternativamente as formulações de saponina podem ser combinadas com veículos de vacina compostos de quitosano ou outros polímeros policatiônicos, partículas de polilactídeo e polilactídeo-co- glicolídeo, matriz polimérica com base em poli-N-acetil glicosamina, partículas compostas de polissacarídeos ou polissacarídeos quimicamente modificados, lipossomas e partículas com base em lipídeo, partículas compostas de monoésteres de glicerol, etc. As saponinas também podem ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particuladas tais como lipossomas ou ISCOMGs. Além disso, as saponinas podem ser formuladas juntas com um éter ou éster de polioxietileno, em uma solução ou suspensão não particulada, ou em uma estrutura particulada tal como um lipossoma paucilamelar ou ISCOMO. As saponinas também podem ser formuladas com excipientes tais como CARBOPOLO para aumentar a viscosidade, ou pode ser formulada em uma forma de pó seco com um . excipiente em pó tal como lactose.

Em uma forma de realização, o sistema adjuvante inclui a ' combinação de um monofosforil lipídeo A e um serivado de saponina, tal comoa combinação de adjuvante QS21 e 3D-MPLº, como descrito na WOS94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com lipossomas contendo colesterol, como descrito na WO96/33739. Outras formulações adequadas compreendem uma emulsão de óleo em água e ; tocoferol.

Uma outra formulação adjuvante adequada que utiliza adjuvantes QS21,3D-MPL” e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na | WOS95/17210. Yu Um outro sistema de adjuvante realçado envolve a combinação de um oligonucleotídeo contendo CpG e um derivado de saponina particularmente a combinação de CpG e QS21 como divulgada na WO00/09159. Adequadamente a formulação adicionalmente compreende - * * umaemulsãodeóleoem água e tocoferol. é ET Outros adjuvantes adequados incluem MONTANIDEG ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMSO (CSL), MF-59 (Chiron), a série SBAS de adjuvantes (SmithKline Beecham, —Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa), RC-529 (Corixa) e outros aminoalquil glicosaminida 4-fosfatos (AGPs), tais como aqueles descritos nos Pedidos de Patente U.S. pendentes Serial Nos. 08/853,826 e 09/074,720, as divulgações dos quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades, e adjuvantes de éter polioxietileno tais como aqueles descritos na —WO99/52549Al.

SmithKline Beecham and Corixa Corporation são agora parte da GlaxoSmithKline.

Outros adjuvantes adequados incluem moléculas adjuvantes da fórmula geral (1): HO(CHCH,0O),-A-R e rEE€Fc AA RR RR io, oro TO VDÉHDHDHDHDMDDH 107 | em que, n é de 1 a 50, A é uma ligação ou -C(O)-, R é alquila C1.56 ou Fenil . Cr-50 alquila. Um outro adjuvante de interesse é a cadeia da toxina b shiga, S usada por exemplo como descrito na WO2005/112991.

Uma forma de realização da presente invenção consiste de uma composição imunogênica que compreende um éter de polioxietileno da fórmula geral (1), em que n está entre 1 e 50, preferivelmente 4 e 24, mais preferivelmente 9; o componente R é alquila Cr.50, preferivelmente C1-Cx, e o . mais preferivelmente alquila Cp, e A é uma ligação. A concentração dos —éteres de polioxietileno devem estar na faixa de 0,1 a 20%, preferivelmente de i 0,1 a 10%, e o mais preferivelmente na faixa de 0,1 a 1%. Os ésteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: éter polioxietileno-9-laurílico, éter de polioxietileno-9-esteorílico, éter polioxietileno-8-esteorílico, éter polioxietileno-4-laurílico, éter polioxietileno- 35-laurílico, e éter polioxietileno-23-laurílico. Éteres de polioxietileno tais - comoéter polioxietileno laurílico são descritos no índice Merck (12º edição: . » . entrada7717). Estas moléculas de adjuvante são descritas na WO99/52549.

Qualquer composição imunogênica aqui fornecida pode ser preparada usando métodos bem conhecidos que resultam em uma combinação de antígeno, intensificador de resposta imune e um carregador ou excipiente adequados. As composições aqui descritas podem ser administradas como parte de uma formulação de liberação prolongada (isto é, uma formulação tal como uma cápsula, esponja ou gel (composta de polissacarídeos, por exemplo) que efetua uma liberação lenta de composto a seguir da administração). Tais formulações no geral podem ser preparadas usando tecnologia bem conhecida (ver, por exemplo, Coombes et al., Vaccine 14: 1429-1438 (1996)) e administrado, por exemplo, pela implantação oral, retal ou subcutânea, ou pela implantação no sítio alvo desejado. As formulações de liberação prolongada podem conter um polipeptídeo, polinucleotídeo ou

| 108 anticorpo disperso em uma natriz carregadora e/ou contida dentro de um | . reservatório circundado por uma membrana controladora de taxa. | Os carregadores para o uso dentro de tais formulações são : biocompatíveis, e também podem ser biodegradáveis; preferivelmente a formulação fornece um nível relativamente constante de liberação de componente ativo.

Tais carregadores incluem micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeo), poliacrilato, látex, amido, celulose, dextrano e outros.

Outros carregadores de liberação retardada incluem biovetores : supramoleculares, que compreendem um núcleo hidrofílico não líquido (por exemplo, um polissacarídeo ou oligossacarídeo reticulados) e, opcionalmente, uma camada externa que compreende um composto anfifílico, tal como um fosfolipídeo (ver, por exemplo, a Patente U.S.

No. 5.151.254 e Pedidos PCT WO94/20078, WO/94/23701 e WO96/06638). A quantidade de composto ativo contido dentro de uma formulação de liberação prolongada depende do sítiode implantação, da taxa e duração esperada de liberação. mo Qualquer uma de uma variedade de veículos de liberação . * + podem ser utilizados dentro das composições farmacêuticas e composições imunogênicas para facilitar a produção de uma resposta imune específica de antígeno. os veículos de liberação incluem células que apresentam antígeno —(APCSs), tais como células dendríticas, macrófagos, células B, monócitos e outras células que podem ser engendradas para serem APCs eficientes.

Tais células podem, mas não necessitam, ser geneticamente modificadas para aumentar a capacidade para apresentação do antígeno, melhorar a ativação e/ou manutenção da resposta de célula T e/ou para ser imunologicamente — compatível com o receptor (isto é, haplotipo HLA emparelhado). APCs no geral podem ser isolados de qualquer um de uma variedade de fluidos biológicos e órgãos, e podem ser células autólogas, alogênicas, singênicas ou xenogênicas. d

Certas formas de realização preferidas da presente invenção . usam células dendríticas ou seus progenitores como células que apresentam antígeno. As células dendríticas são APCs altamente potentes (Banchereau & ' Steinman, Nature 392: 245-251 (1998)) e foram mostradas serem eficazes como um adjuvante fisiológico para evocar a imunidade profilática ou terapêutica (ver Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529 (1999)).

No geral, as células dendríticas podem ser identificadas com base na sua forma típica (estrelada in situ, com processos citoplasmáticos acentuados + (dendritos) visíveis in vitro), sua capacidade para absorver, processar e apresentar antígenos com alta eficiência e a sua capacidade para ativar | respostas de célula T ingênuas. As células dendríticas, naturalmente, podem ser engendradas para expressar receptores ou ligandos de superfície de célula específicos que não são habitualmente encontrados nas células dendríticas in vivo ou ex vivo, e tais células dendríticas modificadas são consideradas pela presente invenção. Como uma alternativa para as células dendríticas, células - * dendríticas carregadas com antígeno de vesícula secretadas (chamadas . * + exossomas) podem ser usadas dentro de uma composição imunogênica (ver Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600 (1998)).

As células dendríticas e progenitoras podem ser obtidas a partir do sangue periférico, medula óssea, linfônodos, baço, pele, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequados. Por exemplo, as células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo pela adição de uma combinação de citocinas tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa às culturas de monócitos colhidas do sangue periférico. Alternativamente, as — células positivas em CD34 colhidas de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas pela adição às combinações de meio de cultura de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando fIt3 e/ou outro(s) composto(s) que induz(em) diferenciação, maturação e proliferação de células dendríticas.

As células dendríticas são convenientemente categorizadas . como células “imaturas” e “maduras”, que permite um modo simples para descriminar entre dois fenótipos bem caracterizados.

Entretanto, esta ' nomenclatura não deve ser interpretada excluir todos os estágios — intermediários possíveis de diferenciação.

As células dendríticas imaturas são caracterizadas como APC com uma alta capacidade para a captação e processamento de antígeno, que correlaciona-se com a alta expressão de receptor Fey e receptor de manose.

O fenótipo maduro é tipicamente ” caracterizado por uma expressão mais baixa destes marcadores, mas uma alta — expressão de moléculas de superfície celular responsáveis pela ativação de célula T tal como MHC de classe I e classe II, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CDI11) e moléculas coestimulatórias (por exemplo, CDA40,

CD80, CD86 e 4-1BB). APCs no geral podem ser transfectadas com um polinucleotídeo que codifica uma proteína (ou porção ou outra variante desta) o tal que o polipeptídeo, seja expressado na superfície da célula.

Tal transfecção . + . pode ocorrer ex vivo, e uma composição farmacêutica ou composição imunogênica que compreende tais células transfectadas podem depois ser usadas, como aqui descrito.

Alternativamente, um veículo de liberação de gene que alveja uma célula dendrítica ou que apresenta outro antígeno pode ser administrado a um paciente, resultando na transfecção que ocorre in vivo.

A transfecção in vivo e ex vivo de células dendríticas, por exemplo, no geral pode ser realizada usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos na WO97/24447, ou o método da pistola de gene — descrito por Mahvi ef al., Imnmunology and Cell Biology 75: 456-460 (1997). A carga de antígeno de células dendríticas pode ser obtida incubando-se as células dendríticas ou células progenitoras com o polipeptídeo, DNA (nu ou dentro de um vetor plasmídico) ou RNA; ou com bactéria ou vírus que expressam antígeno recombinantes (por exemplo, vetores da varíola, fowlpox,

adenovírus ou lentivírus). Antes de carregar, o polipeptídeo pode ser ' covalentemente conjugado a um parceiro imunológico que fornece ajuda de célula T (por exemplo, uma molécula carregadora). Alternativamente, uma i célula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não — conjugado, separadamente ou na presença do polipeptídeo.

As composições imunogênicas e composições farmacêuticas podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou dose múltipla, tais como ampolas ou frascos selados. Tais recpientes são de modo preferível “ hermeticamente selados para preservar a esterilidade da formulação até o uso.

No geral, as formulações podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, uma | composição imunogênica ou composição farmacêutica podem ser | armazenadas em uma condição seca por congelamento que requer apenas a adição de um carregador líquido estéril imediatamente antes do uso.

Em algumas formas de realização, uma “iniciação” ou no primeira administração de um polipeptídeo Rv2386c (incluindo variantes, - + . fragmentos imunogênicos ou proteínas de fusão), ou polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo, é seguida por um ou mais “reforço” ou administrações subsequentes de um polipeptíideco Rv2386c (incluindo variantes, fragmentos imunogênicos ou proteínas de fusão) ou polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo (método de “preparação e reforço”). Por exemplo, uma primeira administração com um polipeptídeo Rv2386c (incluindo variantes, fragmentos imunogênicos ou proteínas de fusão) ou polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo é seguida por uma ou mais — administrações subsequentes de um polipeptídeo Rv2386c (incluindo variantes, fragmentos imunogênicos ou proteínas de fusão) ou polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo.

Em uma forma de realização, uma primeira administração com um polipeptídeo ou polinucleotídeo Rv2386c é seguida por uma ou mais administrações subsequentes de um polipeptídeo Rv2386c. Em uma forma de ' realização, uma primeira administração com um polipeptídeo — ou polinucleotídeo Rv2386c é seguida por uma ou mais administrações subsequentes de um polinucleotídeo Rv2386c. Usualmente a primeira S — administração ou “iniciação” e a segunda administração ou “reforço” são dadas em cerca de 2 a 12 semanas separadamente, ou até 4 a 6 meses separadamente. As administrações de “reforço” subsequentes são dada em cerca de 6 meses separadamente, ou tão longo quanto 1, 2, 3, 4 ou 5 anos - separadamente. O tratamento reforçador convencional (por exemplo, uma administração iniciadora de proteína seguida por uma administração reforçadora de proteína) também pode ser útil em prevenir ou tratar a tuberculose (por exemplo, prevenir ou tratar a tuberculose latente, em particular prevenir ou retardar a reativação da tuberculose).

ANTICORPOS “Anticorpo” refere-se a um polipeptídeo que compreende uma a região de matriz de um gene da imunoglobulina ou fragmentos destes que — « . especificamente liga e reconhece um antígeno. Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões constantes capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, e mu, assim como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplar compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (cerca de 25 kDa) e uma “pesada” (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno.

Os termos cadeia leve variável (V”) e cadeia pesada variável (Vu) referem-se : a estas cadeias leve e pesada respectivamente. Anticorpos existem, por exemplo, como imunoglobulinas ' intactas ou como vários fragmentos bem caracterizados produzidos pela — digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab)',, um dímero de Fab que por si só é uma cadeia leve unida a Vn-Cul por uma ligação de dissulfeto. O F(ab)', pode ser reduzido sob - condições brandas para romper a ligação de dissulfeto na região de dobradiça, — convertendo deste modo o dímero F(ab), em um monômero Fab”. O | | monômero Fab? é essencialmente Fab com parte da região de dobradiça (ver Fundamental Immunology (Paul ed., 3º ed. 1993). Embora vários fragmentos | de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, | uma pessoa de habilidade avaliará que tais fragmentos podem ser sintetizados | 15 de novo quimicamente ou usando-se a metodologia de DNA recombinante. . * Assim, o termo anticorpo, como aqui usado, também inclui fragmentos de , +» . anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou aqueles identificados usando bibliotecas de 20º “demonstração de fago (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552- 554 (1990)).

Para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais, qualquer técnica conhecida no ramo pode ser usada (ver, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.S. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para polipeptídeos desta invenção. Também, camundongos transgênicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados. Alternativamente, a tecnologia de demonstração de ' fago pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que especificamente se ligam aos antígenos selecionados (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., — Biotechnology 10:779-783 (1992).

A frase “especificamente (ou selectivamente) liga” a um anticorpo ou “especificamente (ou seletivamente) imunorreage com,” quando da alusão de uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que jo é determinativa da presença da proteína em uma população heterogênea de — proteínas e outros produtos biológicos. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados se ligam a uma proteína particular pelo menos duas vezes o fundo e não ligam substancialmente em uma quantidade significante a outras proteínas presentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo sob condições tais pode requerer um anticorpo que seja é selecionado quanto a sua especificidade para uma particular proteína.

“CO Po exemplo, anticorpos policlonais incitados para as proteínas de fusão — * . podem ser selecionados para se obter apenas aqueles anticorpos policlonais que são especificamente imunorreativos com a proteína de fusão e não com componentes individuais das proteínas de fusão. Esta seleção pode ser obtida —subtraindo-se anticorpos que reagem cruzado com os antígenos individuais. Uma variedade de formatos de imunoensaio pode ser usada para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína (ver, — por exemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser usados para determinar imunoreatividade específica). Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal de fundo ou ruído e mais tipicamente mais do que 10, 20 ou 100 vezes o fundo (por exemplo, ligação a outras proteínas . de Mycobacterium, tais como outras proteínas de Mycobacterium tuberculosis).

Í DIAGNÓSTICOS Em um outro aspecto, esta invenção fornece métodos para o uso de um ou mais dos polipeptídeos descritos acima para diagnosticar | tuberculose (por exemplo usando ensaios com base na resposta de célula T ou | ensaios com base em anticorpo de formato convencional). a Por exemplo, é fornecido um método para determinar infecção anterior pela M. tuberculosis em um indivíduo que compreende: (a) obter uma amostra do indivíduo; (b) contatar a dita amostra com um polipeptídeo isolado que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (1i) uma variante de uma sequência de proteína de * ? Rv2386cou 2a (ii) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; (co) quantificar a resposta da amostra.

A amostra por exemplo pode ser sangue integral ou células purificadas. Adequadamente a amostra conterá células mononucleadas de sangue periférico (PBMC). Em uma forma de realização da invenção o indivíduo será soropositivo. Em uma segunda forma de realização da invenção o indivíduo será soronegativo.

Adequadamente o indivíduo não terá sido anteriormente vacinado contra a infecção pela M. tuberculosis (por exemplo, adequadamente o indivíduo não terá sido anteriormente vacinado com BCG).

A resposta da amostra pode ser quantificada por uma faixa de meios conhecidos por aqueles habilitados na técnica, incluindo o monitoramento da proliferação de linfócito ou a produção de citocinas ou . anticorpos específicos. Por exemplo, a célula T ELISPOT pode ser usada para monitorar citocinas tais como interferon gama (iFNy), interleucina 2 (iL2) e ' interleucina 5 (iL5). A célula B ELLISPOT pode ser usada para monitorar a estimulação de antígenos específicos de M. tuberculosis. A resposta celular | também pode ser caracterizada pelo uso de tingimento e análise intra- e extra- | celular por um citômetro de fluxo. Os métodos de quantificar uma resposta de proliferação de * amostra incluem: (i) pulsar células cultivadas com um radiorrótulo (por exemplo, timidina tritiada) e monitorar a captação de trítio (por exemplo, cintilação gasosa); (11) rotular com éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) e monitoramento da divisão de célula usando a citometria de fluxo.

PN, Quantificar uma resposta de citocina da amostra inclui em . + - particularomonitoramento da produção de interferon gama.

Quando do uso de tais métodos de quantificação, uma resposta positiva a um antígeno pode ser definida por uma razão de sinal para ruído (razão S/N) de pelo menos 2:1 (por exemplo, pelo menos 3:1 ou pelo menos 5:1).

Em um outro aspecto da presente invenção métodos são fornecidos para o diagnóstico de infecção pela M. tuberculosis usando um teste de pele. Como aqui usado, um “teste de pele” é qualquer ensaio realizado diretamente em um paciente em que uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) (tal como inchaço, vermelhidão ou dermatite) é medida a seguir da injeção intradérmica de um polipeptídeo Rv153c como descrito acima (ou variante, fragmentos imunogênicos destes ou nucleotídeos que os codificam). Tal injeção pode ser obtida usando qualquer dispositivo adequado suficiente para contatar as combinações de . antígeno com células dérmicas do paciente, tal como uma seringa de tuberculina ou seringa de 1 ml.

A reação é medida depois de um período de ' tempo, por exemplo pelo menos 48 horas depois da injeção, especialmente de 48a72 horas. | A reação de DTH é uma resposta imune mediada por célula, ! que é maior em pacientes que foram expostos anteriormente ao antígeno de teste.

A resposta pode ser medida visualmente, usando uma régua.

No geral, ” uma resposta que é maior do que cerca de 0,5 cm no diâmetro, especialmente maior do que cerca de 1,0 cm no diâmetro, é uma resposta positiva, indicativa de infecção pela M. tuberculosis anterior, que pode ser manifestada ou não como uma doença ativa.

Para o uso em um teste de pele, o componente Rv2386c é adequadamente formulado como uma composição farmacêutica contendo um carregador fisiologicamente aceitável.

Adequadamente, o carregador utilizado [ O emtais composições farmacêuticas é uma solução salina com preservantes . + . apropriados,tais como fenol e/ou Tween 80º.

A presente invenção fornece ainda kits para o uso dentro de qualquer um dos métodos de diagnóstico acima.

Tais kits tipicamente compreendem dois ou mais componentes necessários para realizar um ensaio de diagnóstico.

Componentes podem ser compostos, reagentes, recipientes e/ou equipamento.

Por exemplo, um recipiente dentro de um kit pode conter um anticorpo monoclonal ou fragmento deste que especificamente se liga a uma proteína.

Tais anticorpos ou fragmentos podem ser fornecidos ligados a um material de suporte, como descrito acima.

Um ou mais recipientes adicionais podem incluir elementos, tais como reagentes ou tampões, a serem usados no ensaio.

Tais kits também podem, ou alternativamente, contêm um reagente de detecção como descrito acima que contém um grupo repórter adequado para a detecção direta ou indireta de ligação de anticorpo.

Alternativamente, um kit pode ser planejado para detectar o nível de mRNA que codifica uma proteína em uma amostra biológica.

Tais kits no geral compreendem pelo menos uma sonda ou iniciador de oligonucleotídeo, como descrito acima, que hibridiza a um polinucleotídeo que codifica uma proteína.

Um tal oligonucleotídeo pode ser usado, por exemplo, dentro de um ensaio de PCR ou hibridização.

Componentes adicionais que podem estar presentes dentro de tais kits incluem um segundo — oligonucleotídeo e/ou um reagente de diagnóstico ou recipiente para facilitar a l detecção de um polinucleotídeo que codifica uma proteína da invenção.

Outros kits de diagnóstico incluem aqueles planejados para a detecção de respostas mediadas por célula (que pode, por exemplo, ser de uso nos métodos de diagnóstico da presente invenção). Tais kits tipicamente 15” compreenderão: wo (1) aparelho para obter uma amostra de célula apropriada de + + umindivíduo;, (1i) meios para estimular a dita amostra de célula com um polipeptídeo Rv2386c (ou variante deste, fragmentos imunogênicos deste, ou "DNA que codifica tais polipeptídeos); (ii) meios para detectar ou quantificar a resposta celular ao estímulo.

Os meios adequados para quantificar a resposta celular incluem um kit de célula B ELISPOT ou alternativamente um kit de célula T —ELISPOT, que são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Um kit possível compreende: (a) um polipeptídeo da invenção; e (b) um reagente de detecção adequado para a detecção direta ou indireta da ligação de anticorpo.

De interesse particular são kits de diagnóstico feitos de . encomenda para quantificar respostas de célula T: Um kit de diagnóstico que compreende: ' (a) um polipeptídeo da invenção; e (b) aparelho suficiente para contatar o dito polipeptídeo com as células dérmicas de um indivíduo. Um kit de diagnóstico que compreende: (a) um polipeptídeo da invenção; l , (b) aparelho suficiente para contatar o dito polipeptídeo com uma amostra (por exemplo, sangue integral ou mais adequadamente PBMC) de um indivíduo; e (c) meios para quantificar a resposta de célula T (por exemplo, proliferação ou produção de IFN-gama).

EXEMPLOS 157 Os seguintes exemplos são fornecidos apenas por via de a ilustração e não por via de limitação. Aqueles de habilidade na técnica . * . facilmentereconhecerão uma variedade de parâmetros não críticos que seriam mudados ou modificados para produzir resultados essencialmente similares. EXEMPLO 1 - IDENTIFICAÇÃO DE Rv2386c COMO UM ALVO DE —VACINACONTRA TB LATENTE O gene Rv2386c também conhecido como Mbtl, codifica uma proteína que está envolvida na biogênese de micobactinas sideróforas contendo hidroxifeniloxazolina onde a mesma converte corismato para salicilato, a unidasde iniciadora para a síntese siderófora de micobacterina.

Rv2386c foi selecionado com base em uma ampla análise de genoma de genes de Mycobacterium tuberculosis associados com a manutenção da fase de dormência e infectividade como em Murphy e Brown BMC. Infect. Dis. 2007 7: 84-99. Os alvos de gene da fase de dormência potenciais em Mycobacterium tuberculosis foram priorizados através de uma meta-análise de bioinformática de conjuntos de dados de microssérie de DNA . de genoma amplo publicados de expressão de gene bacteriano sob condições de dormência simuladas. A localização subcelular de proteínas da M. ' tuberculosis codificadas pelos genes, foi subsequentemente realizada no genomainteiro para identificar alvos de vacina.

Em resumo, as condições experimentais nos modelos de dormência foram bastante variadas de modo que um sistema de contagem de zero a cinco foi desenvolvido para normalizar estes dados com base nos dois - critérios: 1) a relevância das condições experimentais para o estado dormente e2)a ordem de classificação da expressão. À contagem máxima para um conjunto de dados experimental particular foi ajustado com base na relevância potencial para a ocorrência clínica de infecções pela M. tuberculosis na fase de dormência. A Tabela 1 mostra os conjuntos de dados coletados para a Etapa 1 junto com as contagens máximas ajustadas para cada conjunto de dados. Conjuntos de dados adicionais sobre a essencialidade de gene para . * crescimento foram obtidos de estudoes publicados usando experimentos de 2 + . Ssilenciamento com base em transposon (TraSH). Os genes que não tiveram nenhum efeito sobre o crescimento receberam uma contagem de zero.

Tabela 1 - Fontes, modelos experimentais, e critérios de contagem para a expressão de gene de microssérie de DNA de M. tuberculosis e silenciamento de gene de genoma amplo (essencialidade da fase de crescimento).

Referência Modelo Experimental Ponto de tempo: contagem máxima” Betts IC et al. Privação sob O, controlado 96h: 3 Mol. Microbiol. 2002 43: 717- 24h:2 731 4h:1 Hampshire T et al. Esgotamento de nutriente sob | 62 e 75d: 5 Tuberculosis.(Edinb.) 2004 84: | O, controlado 49d: 4 228-238 18d: 2 Muttucumaru DG et al. Modelo de Wayne de|14d(NRP-2):4 Tuberculosis.(Edinb.) 2004 84: hipoxia” Td (NRP-1): 2 239-246

Modelo Experimental Ponto —de tempo: contagem máxima” Voskuil MI et al.

Modelo de Wayne de/30e80d:5 “ Tuberculosis.(Edinb.) 2004 84: | hipoxia” 14 e 20d: 4 218-227 10 e 12d: 3 | 6e8d:2 | " Schnappinger D et al.

Infecção de macrófagos de | 24 e 48h: 5 J.

Exp.

Med. 2003 198: 693- | camundongo, +/- y-INF 704 Karakousis PC et al.

Implante — subcutâneos — de | 10d: 3 J.

Exp.

Med. 2004 200: 647- | fibra oca em camundongos 657 Talaat AM et al.

Infecção de camundongos. | 28d: 3 Proc.Natl.Acad.Sci.

U.S.A | MTB colhido do pulmão” 2004, 101: 4602-4607 Sassetti CM et al.

Bibliotecas — mutadas —em|14d:5 : Mol.

Microbiol. 2003 48: 77- | TraSH cultivadas em meio 84 sólido : Rengarajan J er al.

Infecção de macrófagos de | 7d: 5 Proc.

Natl.Acad.Sci.U.S.A camundongo, +/- y-INF com 2005, 102: 8327-8332 bibliotecas mutadas —em TraSH de M. tuberculosis Sassetti CM er al.

Camundongos C57BL/6J | 7, 14,28 e 56d: 5 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A infectados com bibliotecas 2003 100: 12989-12994 mutadas em TraSH de M. tuberculosis *Contagem máxima com base na relevância como um modelo de dormência; h - “ * =hora;d=dia . . P"RazãodeM tuberculosis de pulmão de Balb/c para MTB em cultura aerada por 28d.

HA WayneLGeHayesLG Infect.

Immun. 1996 64: 2062-2069 Etapa 2 - Na aplicação do segundo critério, a ordem de classificação da expressão de gene, contagens de gene de cada conjunto de dados foram ordenados do mais alto para o mais baixo com base na razão de expressão (vezes de expressão na condição experimental versus células em cultura líquida na fase log). O gene de contagem mais alta recebeu a contagem máxima para este conjuntop de dados particulares (listados na coluna 3 da Tabela 1. (por exemplo, 5, 4 ..., 1 pontos)). À contagem foi diminuída em 0,005 pontos para cada gene em ordem até zero, ou o final do conjunto de dados foi atingido.

Assim quando a conatgem máxima foi de 4 pontos, o 100º gene classificado receberia uma contagem de 3.500. Para uma contagem máxima de 5 pontos, 1000 genes ou 25% do genoma da M. . tuberculosis recebeu uma contagem.

Para experimentos onde os dados de pontos de tempo múltiplos foram coletados, a contagem máxima através de ' todos os pontos de tempo foi usada como a contagem final. $ Na etapa 3 as contagens para cada gene em cada uma das condições experimentais foram coletadas em uma base de dados Microsoft Access database.

Os campos de referência foram adicionados para facilitar a priorização, tal como o Refsegq ID, função Genbank, nota Genbank, ç classificação Tuberculist, e os links KEGG e Sanger Center.

Combinando-se —osdados de estudos e fontes diferentes, uma vista de consenso foi atingida em i torno dos genes e caminhos particulares mais críticos para a sobrevivência no estado dormente.

Na Etapa 4, uma lista priorizada de alvos terapêuticos foi derivada utilizando os 400 genes de contagem de topo (-10% do genoma) suplementado pela análise computacional e manual perita de caminhos ot bioquímicos, enzimologia, tratabilidade de medicamento, homologia aos . + - geneshumanos e outros conhecimentos anteriores.

A enorme maioria dos genes de contagem alta vêm do subconjunto onde dois ou três dos grupos intersectam. : 20 Na Etapa 5, a identificação da localização subcelular de proteínas de M. tuberculosis codificadas pelos genes, foi realizada no genoma inteiro.

A heurística usada para o prognóstico de proteína de membrana é descrito em Chalker et al.

J.

Bacteriol. 2001 183: 1259-1268. Os perfis de hidropatia média (H) (von Heijne G J.

Mol.

Biol. 1992 225: 487-494) foram — gerados usando valores de hidropatia GES (Engelman DM et al.

Annu.

Rev.

Biophys.

Biophys.

Chem. 1986 15: 321-353) pesado usando uma janela trapezóide.

Usando um processo similar às etapas iniciais do algoritmo TopPred II (Claros MG et al.

Comput.

Appl.

Biosci. 1994 10: 685-686), segmentos de transmembrana helicoidal (TMS) foram prognosticados para i |

| cada sequência de peptídeo pela seleção de 19 aminoácidos centralizados no . valor H mais alto (MaxH), mascarando estes de outra consideração, e repeatir o processo até que nenhum dos picos com um H de >0,5 permaneceu.

As i posições subcelulares foram designadas com base no valor de pico MaxH, — número de segmentos com um H de >1,0, e distribuição e valores de pico H da TMS putativa.

Um corte de MaxH de 1,15 foi escolhido para maximizar a discriminação entre dois conjuntos de dados de SwissProtein release 34 contendo proteínas de transmembrana e citoplásmicas, respectivamente (Boyd k D et al.

Protein Sci. 1998 7: 201-205). As proteínas com um MaxH <1,15 foram classificadas como citoplásmicas, enquanto que aqueleas com um i MaxH >1,15 e pelo menos três TMS possíveis foram classificadas como proteínas de membrana.

As proteínas ancoradas foram definidas como tendo exatamente dois TMS, um começando antes do aminoácido (aa) 35 e um tendo um H >1,15 com o outro tendo um H não mais baixo do que 0,5. 15º SignalP com ajustes Gram positivos foi especificamente usado for M. = bacterium para identificar proteínas secretadas entre aquelas classificadas . + - como citoplásmica ou “desconhecida” na análise heurística (Nielsen H er al.

Protein Eng. 1997 10: 1-6). Rv2386c classificou-se muito alto como um antígeno de — vacina de acordo com diversos critérios:

(1) Rv2386c é consistentemente supra-regulado através de todos os modelos de dormência.

Entre o conjunto total de 3999 genes classificados na meta-análise, Rv2386c foi classificado em 120º como um dos 10% de topo de genes super-expressados através de todos os modelos de

— dormência.

A contagem super-regulada para Rv2386c foi de 13,165 que favoravelmente comparou com a contagem de gene de topo de 22,98. Rv2386c foi minimamente infra-regulado, contando apenas levemente menos do que O (-2,316 comparada com -18,13 para a maioria dos genes amplamente infra regulados). |

| 124 | (ii) A descontaminação de ferro dos macrófagos é crucial para . a sobrevivência e infectividade de de M. tuberculosis.

Moléculas pequenas chamadas de sideróforos funcionam nas bactérias para ligar o ferro para a Í captação intra-celular, A Mbtl catalisa a primeira etapa na formação do único sideróforodaM. tuberculosis, a micobactina T, a biossíntese da qual depende da produção de salicilato a partir de corismato (Harrison et al.

J.

Bacteriol. 2006 188: 6081-6091). A expressão de Mbtl é induzida durante a infecção pela M. tuberculosis de macrófagos THP-1 humanos (Gold et al.

Mol. * Microbiol. 2001 42: 851-865). A estrutura 3D da proteína está disponível e o mecanismo de ação enzimática da Mbtl foi bem estudado (Zwahlen et al.

Biochemistry 2007 46: 954-964). Rv2386c classificou alto na contagem de essencialidade e é requerido pela M. tuberculosis para a sobrevivência em modelos de crescimento in vitro (contando 2,6 da contagem possível de 5). (iii) A localização subcelular prognosticou que a proteína 15º Rv2386c é secretada e assim tem exposição extracelular significante, + — * indicando adequabilidade como um alvo de vacina. 1 - + EXEMPLO2-IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPO DE Rv2386c Método O prognóstico de epítopo de célula T foi com base nos seguintes métodos: CD4eCD8 | Multipred sítio da web: antigen.i2r.a-star.edu.sg/multipred/ ZhangG.L, KhanA.M, SrinivasanK.N, AugustJ.T. e Brusic,V. (2005) “MULTIPRED: a computational system for prediction of promiscuous HLA binding peptides” Nucleic Acids Res. 33, W172- W179. | SVMHC sítio da web: www-bs.informatik.uni-tuebingen.de/SVMHC “Prediction of MHC class I binding peptides, using SYMHC.” Pierre Dônnes and Arne Elofsson in: BMC Bioinformatics 2002 3:25 CD4 ProPred sítio da web: www.imtech.res.in/raghava/propred/ Singh,H. e Raghava,G.P.S.(2001) “ProPred: Prediction of HLA- DR binding sites.” Bioinformatics,17(12), 1236-37.

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Tabela 2 - epítopos de célula T de CD4+ humana de Rv2386c putativo Número de = topo Posição de Sequência de pior “ SEQ1D No: alelo HLA CD4 aminoácido| epítopo = putativo WVLAAGVQA SEQ ID No: 30 DRB1 0401 VLAAGVQAM SEQT1D No: 31 DRB1 0301, DRBI 1301

ATA LAPHTPLAR SEQ ID No: 33 DRB1 1301 DRBI 1101, DRBI 1301, 148 IRLFDAGIR SEQ ID No: 34 7 DRB1 1501 [| 6 [ss IRHREAIDR SEQ ID No: 35 DRB1 0801, DRB1 1301 | 8 jo | FRRRVAVAV SEQ TD No: 37 DRBI 0101, DRB1 0801 | . | a [6 FAIDFPLTY SEQ ID No: 38 DRB1 0301, DRBI 0401 | LOTE AAA TIS | DRB1 0801, DRBI 1101, u 224 YRLGRRHNT SEQ ID No: 40 ” DRB!1 1501 inladação tata LVTAVRADG SEQ1D No: 43 DRB1 1301 SEQ ID No: 44 DRB1 0301, DRB1 0401 | | | too DRB1I 0301, DRBI 0401, | . 262 VVITEPLAG SEQTD No: 45 | DRB1 1301, DRBI 1501 | | | 25 | WERAISVR | | SEQIDNo:46 | 1D No: 46 | — prego A ' ' IDFMTVRER SEQ ID No: 47 DRBI 1301 FRLDECPRG SEQ ID No: 48 DRB1 0301, DRBI 0401 LYSGAVVML SEQ ID No: 49 DRBI 0301 YSGAVVMLS SEQ ID No: 50 DRB1 0401, DRBI 1101 VVMLSADGG SEQTD No: 51 DRB1 0401, DRBI 1301 aa) Tabela 3 - Epítopos de célula T CD8+ humana de Rv2386c putativo Número de Posição de Sequência de epítopo CD8 SEQ ID No: alelo HLA . — | aminoácido epítopo putativo SVATGAVST | SEQID No: 54 A 0201 | 3 TT 8 IPMPAGVNP | SEQID No:55 B 0702, BS1, Cw 0401 | a TT PMPAGVNPA | SEQID No: 56 A 0201 PAGVNPADL | SEQID No:57 A 2402, B 3501 A24, B 0702, B44, Cw 0401, Cw 0602, 7 25 NPADLAAEL | SEQID No: 59 7 7 FF B7,B 3501, BS] a Aa A A a A A a A a EA AI pg —— mn —— e As e o nm MeÔÂ922 "5 CSS Ia RR 127 NineDA: Posição de | Sequência de putativo | LE aa RD | am oo EE AA RD am o E aa De | am | A ear DE [O [E TE pan FDS | a Ss ca | [ETF os RA ' [E ear sepNT | mraB — [EO E RSA O o E A NAS | a | | [GR | voaA | saNe | apra DE E TE es DE O e POR SA DEE | ar a e RES O em | ES Tm soe | e —— CAs om see o Rr

NOSSOS SA

ES sx A] Baal] NC epítopo CD8 . SEQ ID No: alelo HLA à. aminoácido epiítopo putativo | | TF e RE e | [Fo FE RAE o TE E ss RE o eso LE TE rs se SA ET [ra RN | ri [PO a ee] DN am AA

OSSOS

Posição de | Sequência de epítopo CPE SEQID No: alelo HLA . aminoácido epítopo . putativo DO GE o ENTE | es | [FF ss RE O ÇA ' [o e a O e LFL A [BRA] mm FT EA [RR | i Como pode ser observado das Tabelas 2 e 3, Rv2386c contém vários epítopos de célula T CD4+ e CD8 prognosticados. Além disso, esta informação sugere que a proteína carrega epítopos que podem ser reconhecidos pelos HLAs que ocorrem mundialmente (isto é HLAs de * 5- indivíduos Caucasianos, Africanos, Asiáticos ou Latino-Americanos - ver o sítio da web em www.alelofrequencies.net). Ú EXEMPLO 3 - HOMÓLOGOS DE H37Rv As sequências de Rv2386c de várias cepas de M. tuberculosis e BCG foram identificadas usando pesquisas de BLASTP do GenBank — (sequência de referência H37Rv número de acesso YP 177877.1): % de identidade CDCIS551 |NP 336935, XP 0012883421 ZP 022477711 ZP 008781601 [99 CAL72388.1 O alinhamento das sequências homólogas indicam um alto nível de identidade

ENSAIOS BIOLÓGICOS Quantificação das respostas de célula T para Rv2386c Os polipeptídeos podem ser triados quanto a sua capacidade para ativar células T (indução da proliferação e/ou produção de citocinas) em . célula mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou em preparações de sangue integral de indivíduos infectados (tais como latentemente infectados). : Os indivíduos latentemente infectados são usualmente identificados por um teste de pele que tem um diâmetro acima de 10 mm e sem sintomas, sem nenhuma cultura positiva em Mtb, com um catarro negativo e sem nenhuma lesão (como detectado pelo raio X do tórax). Uma ampla faixa de ensaios in vitro pode ser usada com base , nas amostras de PBMC ou sangue integral: depois da reestimulação na presença do antígeno (ou variante/fragmento imunogênico deste como i apropriado) a proliferação das células pode ser determinada (como medido pela CFSE/citometria de fluxo) ou a produção de citocinas quantificadas (presentes no sobrenadante de células cultivadas e medidos pelo ELISA, ou, depois do tingimento intracelular de células T CD4 e CD8 e análise pela citometriade fluxo). A, Por exemplo, as amostras de PBMC podem ser obtidas de - « . Sangue integral heparinizado pela centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque a seguir de procedimentos padrão.

As células podem ser depois lavadas e criopreservadas em nitrogênio líquido até o teste (para mais detalhes ver Lalvani A et al.

J.

Infect.

Dis. 1999 180: 1656-1664). Proliferação de célula T A resposta imune específica pode ser caracterizada realizando- se a análise de proliferação de linfócito usando a timidina tritiada.

Esta técnica avalia a expansão celular no estímulo in vitro a um antígeno.

Na prática, a proliferação de célula é determinada pela incorporação estimativa de timidina tritiada no DNA, um processo intimamente relacionado com as mudanças subjacentes no número de célula.

Mais adequadamente, a proliferação de linfócito pode ser realizada usando o éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceina

(CFSE). CFSE espontânea e irreversivelmente se liga às proteínas tanto . intracelulares quanto de superfície celular pela reação com cadeias laterais de lisina e outros grupos amina disponíveis. Quando as células de linfócito se ' dividem, a rotulação de CFSE é distribuída igualmente entre as células filhas, que são portanto metade tão fluorescentes quanto os precursores. Como um resultado, metade da intensidade de fluorescência celular marca cada geração sucessiva em uma população de células proliferantes e é facilmente seguida pela citometria de fluxo (para mais detalhes ver Hodgkins, PD et al J. Exp. - Med. 1996 184: 277-281).

Practicamente, depois de descongelar, a PMBC pode ser | lavada e tingida com CFSE antes de ser cultivada (2 x 10º células) por 72 hrs com 10 ug/ml de antígeno em meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com glutamina, aminoácido não essencial, piruvato e soro AB humano inativado por calor). As células podem ser depois colhidas e seu fenótipo caracterizado usando tingimento de superfície para identificar células T CD8 so e CD4+ de memória. Subsequentemente, a análise de citometria de fluxo pode . + - serusada para indicar o grau de proliferação de linfócito em resposta a cada antígeno (proporção de células com intensidade CFSE diminuída na estimulação in vitro).

— Produção de Citocina A produção de IFN-y (ou a produção de outras citocinas tais como por exemplo, IL2, TNF-alfa, ILS, IL12 etc) pode ser medida usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). As placas de ELISA podem ser revestidas com um anticorpo monoclonal de camundongo direcionado ao —IFN-y humano (PharMingen, San Diego, CA) em PBS por quatro horas na temperatura ambiente. Os reservatórios são depois bloqueados com PBS contendo 5% (P/V) de leite em pó desnatado por 1 hora na temperatura ambiente. As placas são depois lavadas, por exemplo, seis vezes em PBS/0,2%0 TWEEN-20 e as amostras diluídas 1:2 em meio de cultura nas | placas de ELISA são incubadas durante a noite na temperatura ambiente. As . placas são mais uma vez lavadas e um soro de IFN-y anti-ser humano de coelho policlonal, por exemplo, diluído 1: 3000 em PBS/10% de soro de i cabra normal pode ser adicionado a cada reservatório. As placas são depois — incubadas por duas horas na temperatura ambiente, lavadas e IgG anti-coelho ligada à peroxidase de rábano (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) pode ser adicionada, por exemplo, a uma diluição de 1: 2000 em PBS/5% de leite em pó desnatado. Depois de mais duas horas de incubação na temperatura e ambiente, as placas são lavadas e substrato de TMB adicionado. À reação — pode ser interrompida depois de 20 min com ácido sulfúrico 1 N. a densidade | ótica pode ser depois determinada a 450 nm usando 570 nm como um comprimento de onda de referência. Tipicamente, as frações que resultaram em ambas as réplicas dando um OD duas vezes maior do que a OD média de células cultivadas em meio sozinho podem ser consideradas positivas. EXEMPLO4- IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGOS CB6F1 AN, A imunogenicidade do antígeno foi avaliada em camundongos , + - CB6FI (primeira geração da cruza de camundongos BALB/c e CS7BL/6). Os camundongos CB6F1 foram imunizados | intramuscularmente três vezes (no dia 0, dia 14 e dia 28) com 0,5 ug ou 2 ug ; 20 de antígeno de proteína em combinação com o Sistema Adjuvante ASO1E (uma formulação de adjuvante lipossômico que compreende 3D-MPL e QS21). O planejamento experimental foi como segue: ep e Tão [| Ro [Ra [RIA | Um total de 24 camundongos foram usados em cada grupo de — protocolo. Os linfócitos de sangue periférico (PBL) foram coletados e | reunidos no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) e dia 35 (isto é,

E RR

7 dias após a terceira imunização) e as respostas de célula T CD4 & CD8 . específicas de antígeno (como determinado pelas células T CD4 ou CD8 que produzem IL-2 e/ou IFN-gama e/ou TNF-alfa) foram medidas pela citometria de fluxo depois da reestimulação durante a noite in vitro com reuniões de — peptídeos de 15mer abrangendo as sequências de interesse.

A detecção de células T de camundongo que expressam IL-2 e/ou IFN-gama e/ou TNF-alfa foi feita usando-se a amplificação in vitro direcionada por antígeno de curta duração.

ã Em resumo, solução de PharmLyse (BD-Pharmingen) foi — adicionada ao sangue periférico de camundongo heparinizado de modo a lisar | as células sanguíneas vermelhas. Os PBLs (Linfócitos Sanguíneos periféricos) obtidos foram lavados e depois incubados na presença de uma reunião de peptídeos de 15-mer - sobreposição em 11 aminoácidos - abrangendo a sequência do antígeno de interesse e de 1 ug/ml de anticorpos para CD28 e CD49d (BD-Pharmingen). Cada peptídeo de 15-mer foi usado em uma NS, concentração final de 1 ug/ml. Os controles médios foram também - + . estimuladoscom anticorpos para CD28 e CD49d.

O composto que bloqueia a secreção de citocina brefeldin-A (BD-Pharmingen) foi adicionado 2 h depois do início das culturas a 37ºC, 5% deCO;eas células mantidas a 37ºC, 5% de CO, por 4 horas adicionais seguido pela incubação durante a noite a +4ºC.

As células foram depois colhidas e tingidas com anti-CD4 ligadas a Pacific Blue (BD - clone RM4-5, BD-Pharmingen) e proteína peridinina clorofila A (PerCp) anticorpos anti-CD$ alfa ligados a cianina 5,5 — (Cy5,5) (clone 53-6,7, BD-Pharmingen).

As células foram depois lavadas, fixadas, permeabilizadas (kit Cytofix-cytoperm, BD-Pharmingen) e tingidas com anticorpos anti-IFN-g ligadas a aloficocianina (clone XMG1.2, BDPharmingen), anticorpos anti-IL- 2 ligada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) (clone JES 6-5H4, Beckman poe Ao a aa eeititimcintia MA OA OO 2) 9355) 0!2"|útt P“ciO.OA.AÂAOÀÚÓ AMON an 134 Coulter) e anticorpos anti-TNF alfa ligados a ficoeritrina (PE) (clone MP6- . XT22, BDPharmingen). Depois das lavagens finais, as células tingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo LSR II (Beckton-Dickinson). Um ' número mínimo de 10.000 células foram adquiridas no subconjunto CD8+. Para outro fundamento ver Walzer T er al Cell Immunol. 2000 206(1): 16-25 e Maecker HT et al J. Immunol. Methods 2001 255(1-2): 27-

40. Como controles negativos, algumas células foram também : cultivadas durante a noite in vitro em meio de cultura (não estimulado). As — respostas específicas de antígeno foram calculadas subtraindo-se a resposta de | citocina média produzida pelas células não estimuladas da resposta de citocina média produzida pelas células estimuladas por peptídeo. Em cada ponto no tempo e para cada grupo, os dados foram coletados de 4 agrupamentos de 6 camundongos cada. Os dados abaixo são apresentados como a% de células T CD4 ou CD8 que produzem IL-2 e/ou PA, IFN-gama e/ou TNF-alfa. Cada agrupamento individual de camundongos é . * « plotado (triângulos) assim como o valor médio do grupo (bar). A Figura 1 mostra que no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização), respostas de célula T CD4 e CD8 específicas de Rv2386c são detectadas em camundongos imunizados com cada dose de Rv2386c/ASOIE. Os níveis de respostas de célula T CDA4 específicas de Rv2386c são similares independente da dose de imunização deRv2386. Ao contrário, camundongos imunizados com 2 ug de Rv2386c/ASO1E demonstraram respostas de célula T CD8 específicas de Rv2386c mais altas do que os camundongos —imunizadoscom 0,5 ug de Rv2386c/ ASOIE. A Figura 2 mostra o perfil de citocina de resposta de célula T CD4 do PBL estimulado com a reunião de peptídeo Rv2386c (meio não removido) no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização). A Figura 3 mostra o perfil de citocina de resposta de célula T

CD8 do PBL estimulado com a reunião de peptídeo Rv2386c (meio não . removido) no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização). A Figura 4 mostra que no dia 35 (isto é, 7 dias após a terceira Ú imunização), as respostas de célula T CD4 e CD8 específicas de Rv2386c são | 5 — detectadas em camundongos imunizados com dose de Rv2386c/ASOIE. Os | níveis de respostas de célula T CD4 específicas de Rv2386c são similares independente da dose de imunização deRv2386. Ao contrário, camundongos imunizados com 2 ug de Rv2386c/ASO1E demonstraram respostas de célula | x T CD8 específicas de Rv2386c mais altas do que os camundongos imunizados com 0,5 ug de Rv2386c/ ASO1E. i A terceira dose de imunização aumenta a resposta de célula T CDA4 mas não resposta de célula T CD8. A Figura 5 mostra o perfil de citocina de resposta de célula T CDA4 do PBL estimulado com reunião de peptídeo Rv2386c (meio não removido) no dia35 (isto é, 7 dias após a terceira imunização). A, A Figura 6 mostra o perfil de citocina de resposta de célula T — + . CD8 do PBL estimulado pela reunião de peptídeo Rv2386c (meio não removido) no dia 35 (isto é, 7 dias após a terceira imunização). EXEMPLO 5 - IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGOS C57BL/6 A imunogenicidade do antígeno também foi avaliada em camundongos C57BL/6.

Camundongos CS5T7BL/6 foram imunizados intramuscularmente três vezes (no dia 0, dia 14 e dia 28) com 1 ug ou 4 ug de antígeno de proteína em combinação com um Sistema Adjuvante ASO1E — (uma formulação adjuvante lipossômica que compreende 3D-MPL e QS21).

O planejamento experimental foi o seguinte: [Ea E a o PR [| [ess [TREAT [rs | Linfócitos de sangue periférico (PBL) foram coletados e reunidos no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização) e dia 35 (isto é, . 7 dias após a terceira imunização) e as respostas de célula T CD4 & CD8 específicas de antígeno (como determinadas pelas células T CD4 ou CD8 que produzem IL-2 e/ou IFN-gama e/ou TNF-alfa) foram medidas pela citometria —de fluxo depois da reestimulação durante a noite in vitro com reuniões de peptídeos de 15mer abrangendo as sequências de interesse. O procedimento seguido foi como descrito anteriormente. Como controles negativos, algumas células também foram , cultivadas durante a noite in vitro em meio de cultura (não estimulada). As — respostas específicas de antígeno foram calculadas subtraindo-se a resposta de | citocina média produzida pelas células não estimuladas da resposta de citocina média produzida pelas células estimuladas com peptídeo. Em cada ponto de tempo e para cada grupo, os dados foram coletados de 4 reuniões de 6 camundongos cada. Os dados data abaixo são 15º apresentados como a% de células T CD4 ou CD8 que produzem IL-2 e/ou A, IFN-gama e/ou TNF-alfa. Cada reunião individual de camundongos é plotada

2. - : (triângulos) assim como o valor médio do grupo (bar). A Figura 7 mostra que no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização), respostas de célula T CD4 e CD8 específicas de Rv2386c são — detectadas em camundongos imunizados com cada dose de Rv2386c/ASO1E. Os níveis de respostas de célula T CDA4 específicas de Rv2386c são similares independente da dose de imunização de Rv2386c. Ao contrário, camundongos imunizados com 4 ug de Rv2386c/ASO1E demonstraram respostas de célula T CD8 específicas de Rv2386c mais altas do que camundongos imunizados coml ugdeRv2386c/ASOIE. Devido a dificuldades técnicas, os dados para a primeira reunião de célula na dose de 4 ug não estão disponíveis. A Figura 8 mostra o perfil de citocina de respostas de célula T CDA4 da PBL estimulada com a reunião de peptídeo Rv2386c (meio não removido) no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização). Devido a dificuldades técnicas, os dados para a primeira reunião de células na dose de 4 . ug não estão disponíveis. A Figura 9 mostra o perfil de citocina de resposta de célula T ' CD8 da PBL estimulada com a reunião de peptídeo Rv2386c (meio não — removido) no dia 21 (isto é, 7 dias após a segunda imunização). Devido a dificuldades técnicas, os dados para a primeira reunião de células na dose de 4 ug não estão disponíveis.

Os dados imunológicos para o dia 35 não estavam ainda = disponíveis no momento em que este pedido foi preparado. , 10 Em conclusão pode ser mencionado que o antígeno Rv2386c é | capaz de evocar uma resposta imune tanto nos camundongos CB6F1 quanto nos C57BL/6. Além disso, o perfil de produção de citocina indica que uma grande proporção de células específicas de antígeno T expressam uma pluralidade de citocinas associadas com Th1 (isto é, uma resposta de célula T polifuncional é evocada). Importantemente as células T tanto CD4 quanto 2 CDB8 específicas de antígeno estão presentes depois da imunização, as células . = »- CD8 podem ser particularmente importantes em um cenário de TB latente. Rv2386c portanto pode ser esperado ser de valor substancial na prevenção, tratamento e diagnóstico da infecção de tuberculose latente.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por via de ilustração e exemplo para os propósitos de clareza de entendimento, estará facilmente evidente a uma pessoa de habilidade comum na técnica considerando-se as divulgações desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a esta sem divergir do espírito ou — escopo das reivindicações anexas.

Todas as referências neste pedido, incluindo patentes e pedidos de patente, são aqui incorporadas por referência no grau mais completo possível como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem | específica e individualmente indicados como sendo incorporados por referência.

Claims (24)

NO | 1 ' REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender: - NA (a) um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii)um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de (a); e (c) um carregador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

2. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender: (a) um polipeptídeo que compreende: (i) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii)jum fragmento imunogênico de uma sequência de —proteínadeRv2386c; ou (bjum polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de (a); e (c) um intensificador de resposta imune não específico.

3. Uso de um polipeptídeo compreendendo: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (iii)um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c,

O —— i 2 caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de tuberculose. -— 4. Uso de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (lii)um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de tuberculose.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração a um indivíduo que apresenta tuberculose ativa.

6. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração a um indivíduo que apresenta tuberculose latente.

7. Uso de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração a um indivíduo que não apresenta tuberculose.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamento de tuberculose.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de — tuberculose.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamento de tuberculose latente.

TCE i 3

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção de tuberculose latente.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, — caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a prevenção da reativação da tuberculose.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o retardo da reativação da tuberculose.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de proteína de Rv2386c.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo consiste de uma sequência

15. deproteínade Rv2386c.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c tendo pelo menos 90% de identidade — damesma

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo consiste de uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c tendo pelo menos 90% de identidade da mesma.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a j 25 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo consiste de um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv23 86c.

NN—————— "——" " ==" = "O — - : . 20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a proteína de Rv2386c tem a sequência da SEQ ID NO:1; -—-

21. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de o fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c ser selecionado a partir de qualquer uma das SEQ ID Nos: 30-154.

22. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c;ou (iii)um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c.

23. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo que compreende: (1) uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (Gii)um fragmento imunogênico de uma sequência de —proteínade Rv2386c.

24. Composição, caracterizada pelo fato de compreender: (a) um polipeptídeo que compreende: () uma sequência de proteína de Rv2386c; (ii) uma variante de uma sequência de proteína de —Rv2386c;ou (1) um fragmento imunogênico de uma sequência de proteína de Rv2386c; ou (b) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de (a); e (c) um component M72.