ES2685498T3 - Proteína Rv2386c de la tuberculosis, composiciones y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende: (i) una secuencia proteica de Rv2386c; (ii) una variante de una secuencia proteica de Rv2386c que tiene al menos el 90% de identidad con la misma; o (iii) un fragmento inmunogénico de una secuencia proteica de Rv2386c; en donde la secuencia proteica de Rv2386c se selecciona de SEQ ID NO: 1 y 6; para el uso en: (a) el tratamiento de la tuberculosis; (b) el tratamiento de la tuberculosis latente; (c) la prevención de la tuberculosis latente; (d) la prevención de la reactivación de la tuberculosis; o (e) el retraso de la reactivación de la tuberculosis.

Description

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SEQ ID No: 63:

supuesto epítopo 11 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 64:

supuesto epítopo 12 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 65:

supuesto epítopo 13 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 66:

supuesto epítopo 14 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 67: supuesto epítopo 15 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 68:

supuesto epítopo 16 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 69:

supuesto epítopo 17 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 70:

supuesto epítopo 18 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 71:

supuesto epítopo 19 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 72: supuesto epítopo 20 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 73:

supuesto epítopo 21 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 74:

supuesto epítopo 22 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 75:

supuesto epítopo 23 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 76:

supuesto epítopo 24 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 77: supuesto epítopo 25 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 78:

supuesto epítopo 26 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 79:

supuesto epítopo 27 de células CD8 humanas

SEQ ID No: 80:

supuesto epítopo 28 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 81:

supuesto epítopo 29 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 82: supuesto epítopo 30 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 83:

supuesto epítopo 31 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 84:

supuesto epítopo 32 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 85:

supuesto epítopo 33 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 86:

supuesto epítopo 34 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 87: supuesto epítopo 35 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 88:

supuesto epítopo 36 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 89:

supuesto epítopo 37 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 90:

supuesto epítopo 38 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 91:

supuesto epítopo 39 de células CD8 humanas.

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SEQ ID No: 92: supuesto epítopo 40 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 93:

supuesto epítopo 41 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 94:

supuesto epítopo 42 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 95:

supuesto epítopo 43 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 96:

supuesto epítopo 44 de células CD8 humano.

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SEQ ID No: 97: supuesto epítopo 45 de células CD8 humanas.

SEQ ID No: 98: supuesto epítopo 46 de células CD8 humanas. SEQ ID No: 99: supuesto epítopo 47 de células CD8 humanas.

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letárgica, inactiva o latente (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis). Véase, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Capítulo 150, páginas 953-966 (16a edición, Braunwald et al., eds., 2005).

El término “reactivación de tuberculosis” se refiere a la manifestación posterior de los síntomas de la enfermedad en un individuo en quien se prueba positiva la infección (por ejemplo, en una prueba cutánea de tuberculina, de una manera adecuada en un ensayo basado en células T in vitro) pero que no tiene los síntomas evidentes de la enfermedad. La prueba de diagnóstico positiva indica que el individuo está infectado, sin embargo, el individuo puede o no haber manifestado anteriormente los síntomas de la enfermedad activa que se han tratado lo suficiente como para llevar a la tuberculosis hasta un estado inactivo o latente. Se reconocerá que se pueden iniciar métodos para la prevención, el retraso, o el tratamiento de la reactivación de la tuberculosis en un individuo que manifieste los síntomas activos de la enfermedad.

El término tuberculosis “resistente a fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa no se mantiene estática ni muere por (es decir, es resistente a) uno o más agentes quimioterapéuticos denominados "de primera línea" eficaces en el tratamiento de la tuberculosis (por ejemplo, isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina, y pirazinamida).

El término tuberculosis “resistente a múltiples fármacos” se refiere a una infección (por ejemplo, una infección por M. tuberculosis), en donde la cepa infecciosa es resistente a dos o más agentes quimioterapéuticos "de primera línea" eficaces en el tratamiento de tuberculosis.

Un “agente quimioterapéutico” se refiere a un agente farmacológico conocido y usado en la técnica para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis). Ejemplos de agentes farmacológicos utilizados para tratar la tuberculosis incluyen, pero no se limitan a, amikacina, ácido aminosalicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacino, ciprofloxacino, claritromicina, azitromicina y fluoroquinolonas. Los agentes quimioterapéuticos "de primera línea" o "de línea frontal" utilizados para tratar la tuberculosis que no es resistente a fármacos incluyen isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina, y pirazinamida. Los agentes quimioterapéuticos "de segunda línea" utilizados para tratar la tuberculosis que han demostrado resistencia a fármacos, es decir, a uno

o más fármacos "de primera línea" incluyen ofloxacino, ciprofloxacino, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, amikacina, kanamicina y capreomicina. Dichos agentes farmacológicos se revisan en el Capítulo 48 de Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman y Limbird eds., 2001.

Los términos “polipéptido”, “péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales y a los polímeros de aminoácidos no naturales. De una manera adecuada, un polipéptido según la presente invención consistirá solamente en restos de aminoácidos que aparecen de manera natural, especialmente los aminoácidos codificados por el código genético.

El término “aminoácido” se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos, así como a los análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que aparecen de manera natural. Los aminoácidos que aparecen de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxi-prolina, γ-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que aparece de manera natural, es decir, un carbono α que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metioninametil-sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptidos modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que aparece de manera natural. Miméticos de aminoácidos se refieren a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que aparece de manera natural. De una manera adecuada, un aminoácido es un aminoácido que se aparece de manera natural o un análogo de aminoácido, especialmente un aminoácido que se presenta naturalmente, y en particular los aminoácidos codificados por el código genético.

“Ácido nucleico” se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural, y no naturales, que tienen propiedades de enlace similares a los del ácido nucleico de referencia, y los cuales se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de estos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil-fosfonatos, metil-fosfonatos quirales, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). Adecuadamente, el término “ácido nucleico” se refiere a los desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que aparecen de manera natural, y a los polímeros de los mismos.

A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes de la misma modificadas de forma conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada (de una manera adecuada, se refiere a

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a la expresión) con Mtb41, por ejemplo, en una proteína de fusión, tal como Mtb114f. La secuencia polipeptídica de Mtb114f se describe en SEQ ID No: 16 de WO03/070187 (ADNc en SEQ ID No: 9), en donde incorpora una etiqueta de histidina opcional para ayudar a la purificación, cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, Mtb114f corresponde a los restos aminoácidos 8-1154 de SEQ ID NO: 16 de WO03/070187. También es de particular interés M114, es decir, Mtb114f que incorpora una mutación de Ser/Ala en el componente Ra35; cuando se utiliza en la presente invención, de una manera adecuada, M114 corresponde a 8-1154 restos aminoácidos de SEQ ID NO: 16 a partir de WO03/070187-También es de particular interés M114, es decir, Mtb114f que incorpora una mutación de Ser/Ala en el componente Ra35, cuando se utiliza en la presente invención de manera adecuada M114 corresponde a 8-1154 restos aminoácidos de SEQ ID NO: 16 a partir de WO03/070187 en donde el resto Ser en posición 710 ha sido reemplazado por Ala. La secuencia polipeptídica para M114 se muestra en SEQ ID No: 29, cuando se utiliza en la presente invención, la fusión de M72-Mtb9.9-Mtb9.8 puede incorporar opcionalmente una doble histidina después del resto de metionina de inicio para ayudar a la fabricación;

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una combinación de componentes Ag85B y ESAT-6, tal como en una fusión descrita en Doherty et al, Journal of Infectious Diseases 2004 190:2146–2153; y/o

(h)

una combinación de componentes Ag85B y TB10.4, tal como en una fusión descrita en Dietrich et al, Journal of Immunology 2005 174(10):6332-6339 190:2146–2153.

Las combinaciones de un componente Rv2386c y un componente Mtb40 son de un interés particular. Obviamente, tales combinaciones podrían contener opcionalmente otros componentes de antígeno adicionales (por ejemplo, un componente de M72).

Otra combinación de interés comprende un componente Rv2386c y un componente M72.

Una combinación adicional de interés comprende un componente Rv2386c y un componente Rv1753c.

Otras combinaciones de interés incluyen aquellas que comprenden un componente Rv2386c y un componente Rv2707c.

Una combinación adicional de interés comprende un componente Rv2386c y un componente alfa-cristalina.

La persona experta reconocerá que las combinaciones no necesitan apoyarse en las secuencias específicas descritas anteriormente en (i)-(xvi), y (a)-(h), y que se pueden utilizar variantes modificadas conservadoramente (por ejemplo, que tienen al menos 70% de identidad, tal como al menos 80% de identidad, en particular al menos 90% de identidad, y especialmente al menos 95% de identidad) o fragmentos inmunogénicos (por ejemplo, al menos 20% del antígeno de longitud completa, tal como al menos 50% del antígeno, en particular al menos 70%, y especialmente al menos 80%) de las secuencias descritas, para lograr el mismo efecto práctico.

Cada una de las secuencias de antígenos individuales anteriores se describen también en Cole et al, Nature 1998 393:537-544 y en Camus Microbiology 2002 148:2967-2973. El genoma de M. tuberculosis H37Rv está disponible públicamente, por ejemplo, en el sitio web Welcome Trust Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/), y en otros lugares.

Muchos de los antígenos anteriores se describen también en las Solicitudes de Patente U.S. Números 08/523.435, 08/523.436, 08/658.800, 08/659.683, 08/818.111, 08/818.112, 08/942.341, 08/942.578, 08/858.998, 08/859.381, 09/056.556, 09/072.596, 09/072.967, 09/073.009, 09/073.010, 09/223.040, 09/287.849, en las Solicitudes de Patente PCT PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 y WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.

Las composiciones, polipéptidos, y ácidos nucleicos para el uso en la invención también pueden comprender polipéptidos adicionales a partir de otras fuentes. Por ejemplo, las composiciones y las proteínas de fusión para el uso de la invención pueden incluir polipéptidos o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, en donde el polipéptido mejora la expresión del antígeno, por ejemplo, NS1, una proteína del virus de influenza (véanse, por ejemplo, WO99/40188 y WO93/04175). Los ácidos nucleicos para el uso en la invención se pueden diseñar basándose en la preferencia de codones en una especie de elección, por ejemplo, en seres humanos (en el caso de la expresión in vivo) o en una bacteria particular (en el caso de la producción de polipéptidos).

El componente Rv2386c también se puede administrar con uno o más agentes quimioterapéuticos eficaces contra la tuberculosis (por ejemplo, contra la infección por M. tuberculosis). Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, amikacina, ácido aminosalicílico, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, kanamicina, pirazinamida, rifamicinas (es decir, rifampina, rifapentina y rifabutina), estreptomicina, ofloxacino, ciprofloxacino, claritromicina, azitromicina y fluoroquinolonas. Tal quimioterapia se determina por el juicio del médico tratante utilizando combinaciones de fármacos preferidos. Agentes quimioterapéuticos de "primera línea" utilizados para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis) que no son resistentes a fármacos, incluyen isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicina y pirazinamida. Agentes quimioterapéuticos de "segunda línea" utilizados para tratar la tuberculosis (por ejemplo, la infección por M. tuberculosis) que han

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demostrado resistencia a uno o más fármacos de “primera línea”, incluyen ofloxacino, ciprofloxacino, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, amikacina, kanamicina y capreomicina.

Los agentes quimioterapéuticos convencionales se administran en general durante un período relativamente largo (aproximadamente 9 meses). La combinación de los agentes quimioterapéuticos convencionales con la administración de un componente Rv2386c según la presente invención, puede permitir que se reduzca el período del tratamiento quimioterapéutico (por ejemplo, a 8 meses, 7 meses, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses o menos) sin una disminución en la eficacia.

Es de un interés particular el uso de un componente Rv2386c en conjunto con el Bacillus Calmette-Guerin (BCG). Por ejemplo, en forma de un BCG modificado que exprese de una manera recombinante Rv2386c (o una variante o un fragmento del mismo, como se describe en la presente memoria). Alternativamente, el componente Rv2386c se puede utilizar para mejorar la respuesta de un sujeto a la vacunación con BCG, ya sea mediante administración conjunta o potenciando una vacunación previa con BCG. Cuando se utiliza para mejorar la respuesta de un sujeto a la vacunación con BCG, el componente Rv2386c se puede proporcionar obviamente en forma de un polipéptido o de un polinucleótido (opcionalmente junto con componentes antigénicos adicionales, como se describe anteriormente).

La persona experta reconocerá que las combinaciones de componentes no se necesitan administrar juntas, y que se pueden aplicar: por separado o en combinación; al mismo tiempo, en secuencia o dentro de un período corto; a través de la misma o de diferentes vías. No obstante, para mayor conveniencia, en general es deseable (cuando los regímenes de administración son compatibles) administrar una combinación de componentes como una sola composición.

Los polipéptidos, polinucleótidos y composiciones para el uso en la presente invención usualmente se administrarán a seres humanos, pero son eficaces en otros mamíferos, incluyendo mamíferos domésticos (por ejemplo, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, cobayas, hámsters, chinchillas), y mamíferos agrícolas (por ejemplo, vacas, cerdos, ovejas, cabras, caballos).

Fragmentos inmunogénicos

Los epítopos de células T son tramos contiguos cortos de aminoácidos que son reconocidos por células T (por ejemplo, células T CD4+ o CD8+). La identificación de epítopos de células T se puede lograr a través de experimentos de mapeo de epítopos que son bien conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3a edición, 243-247 (1993); Beißbarth et al, Bioinformatics 2005 21(Suplemento 1):i29i37).

Alternativamente, los epítopos se pueden predecir empleando los planteamientos discutidos en los Ejemplos.

Como resultado de la involucración crucial de la respuesta de células T en la tuberculosis, es fácilmente evidente que los fragmentos del polipéptido Rv2386c de longitud completa que contienen al menos un epítopo de células T serán inmunogénicos y pueden contribuir a la inmunoprotección. Tales fragmentos son referidos en la presente memoria como fragmentos inmunogénicos.

Los fragmentos inmunogénicos para el uso según la presente invención típicamente comprenderán al menos 9 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia polipeptídica de longitud completa (por ejemplo, de al menos 10), tal como al menos 12 aminoácidos contiguos (por ejemplo, al menos 15 o al menos 20 aminoácidos contiguos), en particular, al menos 50 aminoácidos contiguos, tal como al menos 100 aminoácidos contiguos (por ejemplo, al 200 aminoácidos contiguos). De una manera adecuada, los fragmentos inmunogénicos serán al menos el 20%, tal como al menos 50%, al menos 70%, o al menos 80% de la longitud de la secuencia polipeptídica de longitud completa.

Se entenderá que en una población diversa, tal como en los seres humanos, diferentes tipos de HLA significan que los epítopos específicos pueden no ser reconocidos por todos los miembros de la población. En consecuencia, para maximizar el nivel de reconocimiento y la escala de respuesta inmunitaria a un polipéptido, generalmente es deseable que un fragmento inmunogénico contenga una pluralidad de epítopos a partir de la secuencia de longitud completa (de una manera adecuada, todos los epítopos).

Los fragmentos particulares de la proteína Rv2386c que pueden ser útiles incluyen aquellos que contienen al menos un epítopo CD4+, de una manera adecuada al menos dos epítopos CD4+, y especialmente todos los epítopos CD4+ (tales como los epítopos descritos en los Ejemplos y en SEQ ID NOs: 30-52, en particular aquellos asociados con una pluralidad de alelos HLA, por ejemplo, aquellos asociados con 2, 3, 4, 5 o más alelos).

Otros fragmentos de la proteína Rv2386c que pueden ser útiles incluyen aquellos que contiene al menos un epítopo CD8, de una manera adecuada al menos dos epítopos CD8, y especialmente todos los epítopos CD8 (tales como los epítopos descritos en los Ejemplos y en SEQ ID NOs: 53-154, en particular aquellos asociados con una pluralidad de alelos HLA, por ejemplo, aquellos asociados con 2, 3, 4, 5 o más alelos).

Cuando se utiliza un fragmento individual del polipéptido de longitud completa, se considera que tal fragmento es inmunogénico cuando provoca una respuesta que es al menos el 20%, de una manera adecuada al menos 50%, y

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especialmente al menos 75% (tal como al menos 90%) de la actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de re-estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre entera con antígenos específicos (por ejemplo, una re-estimulación durante un período de entre varias horas hasta dos semanas, tal como hasta un día, de 1 día a 1 semana o de 1 a 2 semanas), que mide la activación de las células por medio de linfoproliferación, producción de citoquinas en el sobrenadante de cultivo (medido mediante ELISA, CBA, etc.) o caracterización de respuestas de células T y B mediante tinción intra y extracelular (por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para inmuno-marcadores, tales como CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFNg, CD40L, CD69, etc.), seguido por el análisis con un citómetro de flujo. De una manera adecuada, se considera que un fragmento es inmunogénico cuando provoca una respuesta que es al menos 20%, de una manera adecuada al menos 50%, y especialmente al menos 75% (tal como al menos 90%) de la actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de proliferación de células T y/o de producción de IFN-gamma.

En algunas circunstancias se puede utilizar una pluralidad de fragmentos del polipéptido de longitud completa (que pueden superponerse o no, y pueden o no cubrir la totalidad de la secuencia de longitud completa) para obtener una respuesta biológica equivalente a la secuencia de longitud completa en sí misma. Por ejemplo, al menos dos fragmentos inmunogénicos (tal como tres, cuatro, o cinco) como se describe anteriormente, que en combinación proporcionen al menos 50%, de una manera adecuada al menos 75%, y especialmente al menos 90% de la actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de re-estimulación in vitro de PBMC o de sangre entera (por ejemplo, un ensayo de proliferación de células T y/o de producción de IFN-gamma).

Variantes

“Variantes" o "variantes modificadas conservadoramente” se aplica a las secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas conservadoramente se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas.

Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que un codon especifica a alanina, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos conducen a variantes "silenciosas" o "degeneradas", que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula idéntica funcionalmente. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Un polinucleótido para el uso en la invención puede contener un número de variaciones silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar 1-50, tal como 1-25, en particular 1-5, y especialmente 1 codón(es)) cuando se compara con la secuencia de referencia. Un polinucleótido para el uso en la invención puede contener un número de variaciones conservadoras no silenciosas (por ejemplo, se pueden alterar 1-50, tal como 1-25, en particular 1-5, y especialmente 1 codón(es)) cuando se compara con la secuencia de referencia. Las variaciones no silenciosas son aquellas que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada (ya sea a través de la sustitución, deleción, o adición de restos de aminoácidos). Los expertos en la técnica reconocerán que una secuencia de polinucleótido particular puede contener variaciones conservadoras tanto silenciosas como no silenciosas.

Con respecto a las variantes de una secuencia proteica, la persona experta reconocerá que las sustituciones, deleciones, o adiciones individuales al polipéptido, que altera, agrega, o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos es una “variante modificada conservadoramente”, en donde la alteración o alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido similar funcionalmente, o la sustitución/deleción /adición de restos que no impactan sustancialmente la función biológica de la variante.

Las tablas de sustitución conservadora, que proporcionan aminoácidos similares funcionalmente, son bien conocidas en la técnica. Tales variantes modificadas conservadoramente son en adición a, y no excluyen, variantes polimórficas, homólogos inter-especies, y alelos de la invención.

Un polipéptido para el uso en la invención puede contener un número de sustituciones conservadoras (por ejemplo, se pueden alterar 1-50, tal como 1-25, en particular 1-10, y especialmente 1 resto (s) de aminoácidos) cuando se compara con la secuencia de referencia. En general, tales sustituciones conservadoras caerán dentro de una de las agrupaciones de aminoácidos especificadas más adelante, aunque en algunas circunstancias son posibles otras sustituciones sin afectar sustancialmente las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son típicamente sustituciones conservadoras entre sí:

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Alanina (A), Glicina (G);

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Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3)

Asparagina (N), Glutamina (Q);

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Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7)

Serina (S), Treonina (T); y

8)

Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins 1984).

De una manera adecuada estas sustituciones no se presentan en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

Las variantes de proteína también pueden incluir aquellas en donde se insertan aminoácidos adicionales comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, tales inserciones pueden presentarse en 1-10 localizaciones (tal como 1-5 localizaciones, de una manera adecuada 1 ó 2 localizaciones, en particular 1 localización) y, por ejemplo, pueden implicar la adición de 50 aminoácidos o menos en cada localización (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, especialmente 5 o menos). De una manera adecuada, estas inserciones no aparecen en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un tramo corto de restos de histidina (por ejemplo, 2-6 restos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.

Las variantes de proteína incluyen aquellas en donde se han suprimido aminoácidos, comparándose con la secuencia de referencia, por ejemplo, estas deleciones pueden presentarse en 1-10 localizaciones (tal como 1-5 localizaciones, de una manera adecuada en 1 ó 2 localizaciones, en particular en 1 localización) y pueden, por ejemplo, implicar la supresión de 50 aminoácidos o menos en cada localización (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, especialmente 5 o menos). De una manera adecuada, estas supresiones no aparecen en la región de un epítopo y, por tanto, no tienen un impacto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.

La persona experta reconocerá que una variante de proteína particular puede comprender sustituciones, deleciones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).

Los métodos para determinar las regiones de epítopo de un antígeno se describen y se ejemplifican en los Ejemplos.

Las variantes exhiben al menos aproximadamente 90% de identidad (tal como al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99%) con la secuencia de referencia asociada.

Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o sub-secuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad sobre una región especificada), al compararse y alinearse para una máxima correspondencia en una ventana de comparación, o una región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Entonces se dice que tales secuencias son “sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente de 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, u opcionalmente sobre una región que tiene 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. De una manera adecuada, la comparación se lleva a cabo sobre una ventana correspondiente a toda la longitud de la secuencia de referencia.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar parámetros del programa predeterminados , o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a un segmento en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas óptimamente. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede

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y similares. Tales segmentos se pueden aislar naturalmente, o pueden ser modificados sintéticamente por la mano del hombre.

“Aislado”, como se emplea en la presente memoria, significa que un polinucleótido está sustancialmente lejos de otras secuencias de codificación, y que el polinucleótido no contiene grandes porciones de ADN codificante no relacionado, tales como los fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes de polipéptidos. Un ácido nucleico aislado se separa de otros marcos de lectura abierta que flanquean el gen y que codifican proteínas diferentes del gen. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye a los genes o a las regiones codificantes agregadas posteriormente al segmento por la mano del hombre.

Como será reconocido por el experto, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificante o anti-sentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc, o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN de una manera de uno a uno, y moléculas de ARNm, que no contienen intrones. Pueden estar presentes, pero no es necesario, secuencias codificantes o no codificantes adicionales dentro de un polinucleótido para el uso en la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar enlazado a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un antígeno de Mycobacterium o una porción del mismo), o pueden comprender una variante, o un equivalente biológico o funcional de tal secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones, y/o inserciones, como se describe adicionalmente más adelante, preferiblemente de manera que no se disminuya la inmunogenicidad del polipéptido codificado, en relación a la proteína de referencia. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado se puede evaluar generalmente como se describe en la presente memoria.

La presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados que comprenden diferentes longitudes de tramos contiguos de secuencia idéntica o complementaria a una o más de las secuencias descritas en la presente memoria. Por ejemplo, esta invención proporciona polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, o 1.000 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de referencia descrita en la presente memoria, así como todas las longitudes intermedias entre los mismos. Se entenderá fácilmente que “longitudes intermedias”, en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los enteros a través de 200-500; 500-1.000, y similares.

Por otra parte, será apreciado por los expertos ordinarios en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria. Algunos de estos polinucleótidos tienen una identidad relativamente baja con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente invención contempla específicamente los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones, por ejemplo, los polinucleótidos que se optimizan para la selección de codones humanos y/o de primates. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria están dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones, y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no es necesario, tener una estructura o función alterada. Los alelos se pueden identificar empleando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación, y/o comparación de secuencias de bases de datos).

Identificación y caracterización de nucleótidos

Los polinucleótidos se pueden identificar, preparar, y/o manipular empleando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido se puede identificar, como se describe con mayor detalle a continuación, mediante el cribado de una micromatriz de ADNcs. Tales cribados se pueden llevar a cabo, por ejemplo, utilizando una micromatriz de Synteni (Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante (y esencialmente como se describe por Schena et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:10614-10619 (1996), y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:2150-2155 (1997)). Alternativamente, los polinucleótidos se pueden amplificar a partir del ADNc preparado a partir de células que expresan las proteínas descritas en la presente memoria, tales como las células de M. tuberculosis. Tales polinucleótidos se pueden amplificar mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para este planteamiento, se pueden diseñar cebadores específicos de la secuencia, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente memoria, y se pueden comprar o sintetizar.

Se puede utilizar una porción amplificada de un polinucleótido para aislar un gen de longitud completa a partir de una biblioteca adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de M. tuberculosis), empleando técnicas bien conocidas. Dentro de tales técnicas, se criba una biblioteca (ADNc o genómico) utilizando una o más sondas de polinucleótido o cebadores adecuados para la amplificación. Preferiblemente, una biblioteca se selecciona por tamaños para incluir moléculas más grandes. También se pueden preferir las bibliotecas con cebado aleatorio para identificar las regiones 5’ y secuencia arriba de los genes. Se prefieren las bibliotecas genómicas para obtener

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proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguido por elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en tales sistemas se pueden diseñar para incluir sitios de disociación de proteasa de heparina, trombina, o factor XA, de manera que el polipéptido clonado de interés pueda liberarse a voluntad del resto de GST

En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se pueden utilizar varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Otros vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles incluyen GAP, PGK, GAL, y ADH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (supra), y Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987), y Romas et al., Yeast 8 423-88 (1992).

En los casos en los que se utilizan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican los polipéptidos puede ser activada mediante cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores virales, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV en solitario o en combinación con la secuencia líder omega a partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, se pueden utilizar promotores vegetales, tales como la subunidad pequeña de RUBISCO, o promotores de choque por calor (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construcciones se pueden introducir en células vegetales mediante la transformación directa del ADN, o mediante transfección mediada por patógeno. Estas técnicas se describen en un número de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, páginas 191-196 (1992)).

También se puede utilizar un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de tales sistemas, se utiliza el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican el polipéptido se pueden clonar en la región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción con éxito de la secuencia que codifica el polipéptido dejará inactivo el gen de polihedrina y producirá el virus recombinante que carece de la proteína de la cubierta. Entonces los virus recombinantes se pueden utilizar para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o Trichoplusia larvae, en donde se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:3224-3227 (1994)).

En células huésped de mamífero, generalmente hay disponibles varios sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en los casos en donde se utiliza un adenovirus como vector de expresión, se pueden ligar secuencias que codifican un polipéptido de interés en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede emplear la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral para obtener un virus viable, el cual es capaz de expresar el polipéptido en las células huésped infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:3655-3659 (1984)). Además, se pueden utilizar potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero. Los métodos y protocolos para trabajar con vectores de adenovirus se revisan en Wold, Adenovirus Methods and Protocols, 1998. Se pueden encontrar referencias adicionales con respecto al uso de vectores de adenovirus en Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

También se pueden utilizar señales de inicio específicas para lograr una traducción más eficiente de secuencias que codifican un polipéptido de interés. Tales señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que se inserten secuencias que codifican el polipéptido, su codón de inicio, y las secuencias corriente arriba, en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de transcripción o traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que solamente se inserta la secuencia de codificación, o una porción de la misma, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto entero. Los elementos de traducción exógenos y los codones de inicio pueden ser de diferentes orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que se utiliza, tales como los descritos en la bibliografía (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas, o para procesar la proteína expresada en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. También se puede emplear el procesamiento post-traduccional que disocia una forma “prepro” de la proteína, para facilitar la inserción, el plegamiento, y/o la función correctos. Se pueden seleccionar diferentes células huésped, tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38, que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traduccionales, para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, generalmente se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente un polinucleótido de interés, se pueden transformar utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos, y un gen marcador seleccionable, sobre el mismo vector o sobre un vector

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replicación del virus con E1 suprimido es incompleta. Por ejemplo, se ha observado una fuga de la expresión génica viral con los vectores actualmente disponibles a altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).

Las líneas celulares auxiliares se pueden derivar a partir de células humanas, tales como células de riñón embrionarias humanas, células musculares, células hematopoyéticas, u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias humanas. Alternativamente, las células auxiliares se pueden derivar a partir de células de otras especies de mamífero que sean permisivas para el adenovirus humano. Estas células incluyen, por ejemplo, las células Vero u otras células mesenquimales o epiteliales embrionarias de mono. Como se mencionó anteriormente, la línea celular auxiliar actualmente preferida es la 293.

Racher et al. (1995) han descrito mejores métodos para cultivar las células 293 y propagar el adenovirus. En un formato, se cultivan agregados celulares naturales inoculando células individuales en matraces giratorios siliconizados de 1 litro (Techne, Cambridge, Reino Unido) que contienen 100-200 ml del medio. Después de agitar a 40 rpm, se estima la viabilidad celular con azul de tripano. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, Reino Unido) (5 g/l) como sigue. Se agrega un inóculo celular, resuspendido en 5 ml del medio, al vehículo (50 ml) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, y se deja estacionario, con agitación ocasional, durante 1 a 4 horas. Luego se reemplaza el medio con 50 ml de medio fresco, y se inicia la agitación. Para la producción del virus, se permite que las células crezcan hasta aproximadamente una confluencia del 80%, después de cuyo tiempo, se reemplaza el medio (hasta el 25% del volumen final), y se agrega el adenovirus a una MOI de 0,05. Los cultivos se dejan estacionarios durante la noche, seguido de lo cual, se aumenta el volumen hasta el 100%, y se comienza la agitación durante otras 72 horas.

A parte del requisito de que el vector de adenovirus sea defectuoso en replicación, o al menos condicionalmente defectuoso, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica con éxito de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 serotipos diferentes o subgrupos A-F conocidos. El adenovirus tipo 5 o subgrupo C es el material de partida preferido para obtener un vector de adenovirus defectuoso en replicación condicional para el uso en la presente invención, debido a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano acerca del cual se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética, e históricamente se ha utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como un vector.

Como se mencionó anteriormente, el vector típico según la presente invención es defectuoso en replicación, y no tendrá una región E1 de adenovirus. Por lo tanto, será más conveniente introducir el polinucleótido que codifica el gen de interés en la posición a partir de la cual se hayan eliminado las secuencias que codifican E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifica el gen de interés también se puede insertar en lugar de la región E3 suprimida, en los vectores de reemplazo de E3, como se describe por Karlsson et al. (1986), o en la región E4, donde una línea celular auxiliar o un virus auxiliar complementa al defecto de E4.

El adenovirus es fácil de cultivar y manipular, y exhibe un amplio rango de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupo de virus se puede obtener en altas titulaciones, por ejemplo, de 109-1011 unidades formadoras de placas por ml, y son altamente infecciosos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere de la integración en el genoma de la célula huésped. Los genes extraños suministrados por los vectores de adenovirus son episomales, y por lo tanto, tienen una baja genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos secundarios en estudios de vacunación con adenovirus de tipo salvaje (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), demostrando su seguridad y su potencial terapéutico como vectores de transferencia genética in vivo.

Los vectores de adenovirus se han utilizado en la expresión de genes eucariotas (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992), y el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). Recientemente, estudios con animales sugirieron que se podría utilizar el adenovirus recombinante para la terapia génica (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Los estudios en la administración de adenovirus recombinante a diferentes tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyección muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993), e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Los vectores de adenovirus se pueden originar a partir de adenovirus humanos. Alternativamente, se pueden originar a partir de adenovirus de otras especies, por ejemplo de chimpancé, que pueden tener la ventaja de que los vectores virales no se neutralizan por los anticuerpos contra los adenovirus humanos que circulan en muchos sujetos humanos (véase, por ejemplo, Tatsis N et al. Gene Therapy 2006 13:421-429).

El adenovirus tipo 35, el cual es relativamente poco común, y por lo tanto, hay bajos niveles de inmunidad preexistente al propio vector, se ha utilizado como un sistema de suministro en ciertas vacunas de tuberculosis que se están desarrollando (véase, por ejemplo, Radosevic et al., Infection and Immunity 2007 75(8):4105-4115). El adenovirus tipo 35 también puede ser de un valor particular en la presente invención como un vector de suministro.

2. Retrovirus

Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenarios caracterizados por la capacidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). Entonces el

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4. Otros vectores virales como construcciones de expresión

Se pueden emplear otros vectores virales como construcciones de expresión en la presente invención para el suministro de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos a una célula huésped. Se pueden emplear vectores derivados a partir de virus, tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), lentivirus, virus de la polio, y virus del herpes. Se puede esperar que también sean útiles otros vectores derivados de poxvirus, tales como vectores derivados de la viruela aviar. Éstos ofrecen varias características atractivas para diferentes células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Con el reciente reconocimiento de virus de hepatitis B defectuosos, se obtuvo una nueva perspectiva sobre la relación estructura-función de diferentes secuencias virales. Los estudios in vitro mostraron que el virus podría retener la capacidad para el empaquetamiento dependiente del auxiliar y la transcripción inversa, a pesar de la supresión de hasta el 80% de su genoma (Horwich et al., 1990). Esto sugirió que grandes porciones del genoma se podrían reemplazar con material genético extraño. El hepatotropismo y la persistencia (integración) fueron propiedades particularmente atractivas para la transferencia del gen dirigida al hígado. Chang et al. (1991) introdujeron el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del virus de hepatitis B de pato en lugar de las secuencias de codificación de polimerasa, superficiales, y pre-superficiales. Se co-transfectó con el virus de tipo salvaje en una línea celular de hepatoma aviar. Se utilizaron medios de cultivo que contienen altas titulaciones del virus recombinante para infectar los hepatocitos de patito primario. La expresión estable del gen CAT se detectó durante al menos 24 días después de la transfección (Chang et al., 1991).

Los vectores "virales" adicionales incluyen partículas tipo virus (VLPs) y fagos.

5. Vectores no virales

Para efectuar la expresión de las secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos, se debe suministrar la construcción de expresión a una célula. Este suministro se puede llevar a cabo in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas celulares, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad. Como se describe anteriormente, un mecanismo preferido para el suministro es mediante infección viral donde la construcción de expresión se encapsula en una partícula viral infecciosa.

Una vez que se ha suministrado la construcción de expresión a la célula, el ácido nucleico que codifica las secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos deseadas se puede colocar y expresar en diferentes sitios. El ácido nucleico que codifica la construcción se puede integrar establemente en el genoma de la célula. Esta integración puede estar en la localización y orientación específicas mediante recombinación homóloga (reemplazo de genes), o se puede integrar en una localización aleatoria no específica (aumento de genes). El ácido nucleico se puede mantener establemente en la célula como un segmento episomal separado de ADN. Tales segmentos de ácidos nucleicos o “episomas” codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación, independientemente de, o en sincronización con, el ciclo de la célula huésped. Cómo se suministra la construcción de expresión a una célula, y en dónde permanece el ácido nucleico en la célula, depende del tipo de construcción de expresión empleada.

La construcción de expresión que comprende una o más secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos puede consistir simplemente en ADN o plásmidos recombinantes desnudos. La transferencia de la construcción se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante cualquier método que permeabilice física o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, pero se puede aplicar también al uso in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectaron con éxito ADN de poliomavirus en forma de precipitados de fosfato de calcio en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando la replicación viral activa y una infección aguda. Benvenisty y Reshef (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con fosfato de calcio, da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica un gen de interés también se puede transferir de una manera similar in vivo, y expresar el producto genético.

Otro método para transferir una construcción de expresión de ADN desnudo a las células puede implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad para acelerar los microproyectiles recubiertos con ADN a una alta velocidad, permitiéndoles perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de estos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles utilizados han consistido en sustancias inertes biológicamente, tales como perlas de tungsteno o de oro.

Los órganos seleccionados, que incluyen hígado, piel, y tejido muscular de ratas y ratones, se han bombardeado in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir de la exposición quirúrgica del tejido o de las células, para eliminar cualquier tejido intermedio entre la pistola y el órgano diana, es decir, el tratamiento ex vivo. Nuevamente, mediante este método puede suministrarse ADN que codifica un gen particular, y aún así incorporarse.

También se pueden utilizar bacterias como un método de suministro (por ejemplo, listeria, véase WO2004/11048) y en particular BCG.

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Referencia

Modelo experimental Punto del tiempo: Puntuación máximaa

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Modelo de hipoxia de Wayne# 14d (NRP-2): 4 7d (NRP-1): 2

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Modelo de hipoxia de Wayne# 30 y 80d: 5 14 y 20d: 4 10 y 12d: 3 6 y 8d: 2

Schnappinger D et al. J. Exp. Med. 2003 198:693-704

Infección de macrófagos de ratón, +/γ-INF 24 y 48h: 5

Karakousis PC et al. J. Exp. Med. 2004 200:647-657

Implante subcutáneo de fibra hueca en ratones 10d: 3

Talaat AM et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.. 2004, 101:4602-4607

Infección de ratones. MTB recogida de pulmónb 28d: 3

Sassetti CM et al. Mol. Microbiol. 2003 48:77-84

Bibliotecas mutadas TraSH cultivadas en un medio sólido 14d:5

Rengarajan J et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2005, 102:8327-8332

Infección de macrófagos de ratón, +/γ-INF con bibliotecas mutadas TraSH de M. tuberculosis 7d:5

Sassetti CM et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2003 100:12989-12994

Ratones C57BL/6J infectados con Bibliotecas mutadas TraSH de M. tuberculosis 7, 14, 28 y 56d:5

a Puntuación máxima basándose en la relevancia como un modelo de latencia; h = hora; d = día.

b Proporción de M. tuberculosis a partir de pulmón de Balb/c a MTB en un cultivo aireado durante 28 días.

# Wayne LG y Hayes LG Infect. Immun. 1996 64:2062-2069.

Etapa 2 -Al aplicar el segundo criterio, el orden de clasificación de expresión genética, las puntuaciones de

5 los genes a partir de cada conjunto de datos, se ordenó de la más alta a la más baja, basándose en la proporción de expresión (expresión doble en la condición experimental frente a las células en cultivo líquido en fase logarítmica). El gen de puntuación más alta recibió la puntuación máxima para ese conjunto de datos particular (enumerados en la columna 3 de la Tabla 1. (por ejemplo, 5, 4 …, 1 punto)). La puntuación se redujo en 0,005 puntos para cada gen en orden hasta cero, o hasta que se alcanzó el final del conjunto de datos. Por tanto, cuando la puntuación máxima fue

10 de 4 puntos, el gen clasificado como 100o recibiría una puntuación de 3.500. Para una puntuación máxima de 5 puntos, 1000 genes o el 25% del genoma de M. tuberculosis recibió una puntuación. Para los experimentos donde se recolectaron datos de múltiples puntos de tiempo, la puntuación máxima a través de todos los puntos de tiempo se utilizó como la puntuación final.

En la Etapa 3, las puntuaciones para cada gen en cada una de las condiciones experimentales se recolectaron en

15 una base de datos Microsoft Access. Se agregaron campos de referencia para facilitar la priorización, tales como Refseq ID (Identificación de Secuencia de Referencia), Función Genbank, Nota Genbank, Clasificación de

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Predicción

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Epijen

sitio web: www.jenner.ac.uk/EpiJen/ Doytchinova, I. A., P. Guan, D. R. Flower. “EpiJen: a server for multi-step T cell epitope prediction.” BMC Bioinformatics, 2006, 7, 131.

Syfpeithi

sitio web: www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: “SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.” Immunogenetics (1999) 50: 213-219

PredTAP

sitio web: antigen.i2r.a-star.edu.sg/predTAP/ Zhang,G.L., Petrovsky,N., Kwoh,C.K., August,J.T. y Brusic,V. (2006) “PREDTAP: a system for prediction of peptide binding to the human transporter associated with antigen processing.” Immunome Res. 2(1), 3.

PAPROC

sitio web: www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html C. Kuttler, A.K. Nussbaum, T.P. Dick, H.-G. Rammensee, H. Schild, K.P. Hadeler, “An algorithm for the prediction of proteasomal cleavages”, J. Mol. Biol. 298 (2000), 417-429. A.K. Nussbaum, C. Kuttler, K.P. Hadeler, H.-G. Rammensee, H. Schild, “PAProC: A Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages available on the WWW”, Immunogenetics 53 (2001), 87-94.

Resultados Tabla 2 Supuestos epítopos de Rv2386c de células T CD4+ humanas

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición ácido de Amino- Secuencia del epítopo SEQ ID No: Alelo HLA

1

54 WVLAAGVQA SEQ ID No: 30 DRB1_0401

2

55 VLAAGVQAM SEQ ID No: 31 DRB1_0301, DRB1_1301

3

73 VIRDGVTRR SEQ ID No: 32 DRB1_0301, DRB1_0401

4

125 LAPHTPLAR SEQ ID No: 33 DRB1_1301

5

148 IRLFDAGIR SEQ ID No: 34 DRB1_1101, DRB1_1301, DRB1_1501

6

155 IRHREAIDR SEQ ID No: 35 DRB1_0801, DRB1_1301

7

164 LLATGVREV SEQ ID No: 36 DRB1_1301

8

187 FRRRVAVAV SEQ ID No: 37 DRB1_0101, DRB1_0801

9

216 FAIDFPLTY SEQ ID No: 38 DRB1_0301, DRB1_0401

10

220 FPLTYRLGR SEQ ID No: 39 DRB1_1101

11

224 YRLGRRHNT SEQ ID No: 40 DRB1_0801, DRB1_1101, DRB1_1501

12

234 VRSFLLQLG SEQ ID No: 41 DRB1_1301

13

238 LLQLGGIRA SEQ ID No: 42 DRB1_1501

14

253 LVTAVRADG SEQ ID No: 43 DRB1_1301

15

257 VRADGVVIT SEQ ID No: 44 DRB1_0301, DRB1_0401

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición ácido de Amino- Secuencia del epítopo SEQ ID No: Alelo HLA

16

262 VVITEPLAG SEQ ID No: 45 DRB1_0301, DRB1_0401, DRB1_1301, DRB1_1501

17

295 IVEHAISVR SEQ ID No: 46 DRB1_1301

18

321 IDFMTVRER SEQ ID No: 47 DRB1_1301

19

375 FRLDECPRG SEQ ID No: 48 DRB1_0301, DRB1_0401

20

384 LYSGAVVML SEQ ID No: 49 DRB1_0301

21

385 YSGAVVMLS SEQ ID No: 50 DRB1_0401, DRB1_1101

22

389 VVMLSADGG SEQ ID No: 51 DRB1_0401, DRB1_1301

23

415 WLRAGAGII SEQ ID No: 52 DRB1_0101

Tabla 3 Supuestos epítopos de Rv2386c de células T CD8+ humanas

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

1

3 ELSVATGAV SEQ ID No: 53 A_0201

2

5 SVATGAVST SEQ ID No: 54 A_0201

3

18 IPMPAGVNP SEQ ID No: 55 B_0702, B51, Cw_0401

4

19 PMPAGVNPA SEQ ID No: 56 A_0201

5

21 PAGVNPADL SEQ ID No: 57 A_2402, B_3501

6

23 GVNPADLAA SEQ ID No: 58 A3

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

7

25 NPADLAAEL SEQ ID No: 59 A24, B_0702, B44, Cw_0401, Cw_0602, B7, B_3501, B51

8

28 DLAAELAAV SEQ ID No: 60 A_0201

9

33 LAAVVTESV SEQ ID No: 61 A2, A_0201, B51

10

37 VTESVDEDY SEQ ID No: 62 A1, A_0101, A_0301

11

38 TESVDEDYL SEQ ID No: 63 B44

12

40 SVDEDYLLY SEQ ID No: 64 A1, A_0101, A3

13

48 YECDGQWVL SEQ ID No: 65 A24, B_4403, B51, Cw_0401, B44

14

52 GQWVLAAGV SEQ ID No: 66 A2, A_0201

15

55 VLAAGVQAM SEQ ID No: 67 A2, B8

16

65 ELDSDELRV SEQ ID No: 68 A_0201

17

67 DSDELRVIR SEQ ID No: 69 A_0101, A_0301

18

82 QQWSGRPGA SEQ ID No: 70 A_0201, A_0301

19

86 GRPGAALGE SEQ ID No: 71 A3, B8

20

87 RPGAALGEA SEQ ID No: 72 B7, B_0702, B_3501, B51

21

91 ALGEAVDRL SEQ ID No: 73 A2, A_0201

22

93 GEAVDRLLL SEQ ID No: 74 B44

23

106 AFGWVAFEF SEQ ID No: 75 A24

24

124 RLAPHTPLA SEQ ID No: 76 A2, A_0201, A3

25

125 LAPHTPLAR SEQ ID No: 77 A_0101, A_0301

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

26

126 APHTPLARV SEQ ID No: 78 B7, B_3501, B51

27

127 PHTPLARVF SEQ ID No: 79 A24, B44

28

130 PLARVFSPR SEQ ID No: 80 A_0101, A3, A_0301

29

133 RVFSPRTRI SEQ ID No: 81 B7

30

134 VFSPRTRIM SEQ ID No: 82 A24, B8

31

143 VSEKEIRLF SEQ ID No: 83 A1, A24

32

153 AGIRHREAI SEQ ID No: 84 B8, B51

33

164 LLATGVREV SEQ ID No: 85 A2, A_0201

34

170 REVPQSRSV SEQ ID No: 86 B44

35

172 VPQSRSVDV SEQ ID No: 87 B7, B8

36

180 VSDDPSGFR SEQ ID No: 88 A_0101, A_0301

37

183 DPSGFRRRV SEQ ID No: 89 B_3501, B51

38

185 SGFRRRVAV SEQ ID No: 90 B8, B51

39

186 GFRRRVAVA SEQ ID No: 91 A_0301, B8

40

187 FRRRVAVAV SEQ ID No: 92 A3, B8, B51

41

190 RVAVAVDEI SEQ ID No: 93 A24, B7

42

198 IAAGRYHKV SEQ ID No: 94 B8, B51

43

200 AGRYHKVIL SEQ ID No: 95 B7, B8

44

202 RYHKVILSR SEQ ID No: 96 A3, A24

45

206 VILSRCVEV SEQ ID No: 97 A2, A_0201

46

214 VPFAIDFPL SEQ ID No: 98 B7, B_3501, B51

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

47

216 FAIDFPLTY SEQ ID No: 99 A1, A_0101, B_3501, B51

48

218 IDFPLTYRL SEQ ID No: 100 B44

49

226 LGRRHNTPV SEQ ID No: 101 B8, B51

50

228 RRHNTPVRS SEQ ID No: 102 A3, B8

51

231 NTPVRSFLL SEQ ID No: 103 A_0101, A24

52

233 PVRSFLLQL SEQ ID No: 104 A_0201, B7

53

245 RALGYSPEL SEQ ID No: 105 A2, A_0201, B_3501, B51

54

246 ALGYSPELV SEQ ID No: 106 A_0101, A2, A_0201

55

249 YSPELVTAV SEQ ID No: 107 A2

56

250 SPELVTAVR SEQ ID No: 108 B_0702, B_3501, B51

57

256 AVRADGVVI SEQ ID No: 109 A3, A_0301, B7

58

264 ITEPLAGTR SEQ ID No: 110 A_0101, A_0301

59

266 EPLAGTRAL SEQ ID No: 111 B7, B8, B_3501, B51

60

270 GTRALGRGP SEQ ID No: 112 A3, B8

61

272 RALGRGPAI SEQ ID No: 113 A24, B7, B51

62

288 LESNSKEIV SEQ ID No: 114 B44

63

294 EIVEHAISV SEQ ID No: 115 A_0201

64

295 IVEHAISVR SEQ ID No: 116 A_0101

65

298 HAISVRSSL SEQ ID No: 117 B7, B8, B_3501

66

301 SVRSSLEEI SEQ ID No: 118 B7

67

305 SLEEITDIA SEQ ID No: 119 A2

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

68

311 DIAEPGSAA SEQ ID No: 120 A_0101, A_0301

69

313 AEPGSAAVI SEQ ID No: 121 B44

70

327 RERGSVQHL SEQ ID No: 122 B7, B44

71

331 SVQHLGSTI SEQ ID No: 123 A24, B7

72

342 RLDPSSDRM SEQ ID No: 124 A2, A_0201

73

344 DPSSDRMAA SEQ ID No: 125 B7, B_3501

74

346 SSDRMAALE SEQ ID No: 126 A1, B8

75

348 DRMAALEAL SEQ ID No: 127 B7, Cw_0401, Cw_0602

76

349 RMAALEALF SEQ ID No: 128 A24

77

351 AALEALFPA SEQ ID No: 129 A2, A_0201, B_3501

78

352 ALEALFPAV SEQ ID No: 130 A_0101, A2, A_0201

79

353 LEALFPAVT SEQ ID No: 131 B8, B_4403

80

357 FPAVTASGI SEQ ID No: 132 B7, B8, B_3501, B51

81

359 AVTASGIPK SEQ ID No: 133 A3, A_0301, B7

82

360 VTASGIPKA SEQ ID No: 134 A_0201

83

364 GIPKAAGVE SEQ ID No: 135 A_0301, B8

84

365 IPKAAGVEA SEQ ID No: 136 B7, B_3501

85

367 KAAGVEAIF SEQ ID No: 137 A24, B_3501

87

369 AGVEAIFRL SEQ ID No: 138 A_0201, B51

87

376 RLDECPRGL SEQ ID No: 139 A2, A_0201

88

380 CPRGLYSGA SEQ ID No: 140 B7, B_3501

Nº del supuesto epítopo de CD4

Posición de Amino-ácido Secuencia epítopo del SEQ ID No: Alelo HLA

89

383 GLYSGAVVM SEQ ID No: 141 A2, A_0201, A_0301, A3

90

384 LYSGAVVML SEQ ID No: 142 A24, B44

91

390 VMLSADGGL SEQ ID No: 143 A2, A_0201, A24

92

397 GLDAALTLR SEQ ID No: 144 A_0101, A3, A_0301

93

398 LDAALTLRA SEQ ID No: 145 A_0201, B_4403

94

400 AALTLRAAY SEQ ID No: 146 A_0101, A_0301, B_3501

95

402 LTLRAAYQV SEQ ID No: 147 A_0201

96

407 AYQVGGRTW SEQ ID No: 148 A24

97

414 TWLRAGAGI SEQ ID No: 149 A24

98

424 EESEPEREF SEQ ID No: 150 B44

99

430 REFEETCEK SEQ ID No: 151 B44

100

438 KLSTLTPYL SEQ ID No: 152 A2, A_0201

101

440 STLTPYLVA SEQ ID No: 153 A_0101, A_0201

102

441 TLTPYLVAR SEQ ID No: 154 A3, A_0301

Como se puede ver a partir de las Tablas 2 y 3, Rv2386c contiene un número de epítopos de células T CD4+ y CD8 predichos. Además, esta información sugiere que la proteína lleva epítopos que pueden ser reconocidos por los HLAs que se presentan en todo el mundo (es decir, los HLAs de individuos caucásicos, africanos, asiáticos, o latinoamericanos – véase el sitio web en www.allelefrequencies.net).

Ejemplo 3 – Homólogos de H37Rv

Se identificaron las secuencias de Rv2386c a partir de varias cepas de M. tuberculosis y BCG utilizando búsquedas BLASTP de GenBank (secuencia de referencia H37Rv, número de acceso YP_177877.1):

Cepa

Número de Acceso % de Identidad

CDC1551

NP_336935.1 100

imagen33

imagen34

imagen35

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3