BRPI0917840B1

BRPI0917840B1 - Processo para redução da contaminação viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, e uso de um extrato biológico

Info

Publication number: BRPI0917840B1
Application number: BRPI0917840-6A
Authority: BR
Inventors: Christian Rämsch; Thomas Schräder; Manfred Kurfürst; Thomas Moest
Original assignee: Nordmark Arzneimittel Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2009-08-27
Publication date: 2018-08-14
Also published as: EP2328623B2; EP2328623B1; WO2010022946A1; EP2328623A1; WO2010022808A1; US20110268844A1; EP2165717A1; JP2012500636A; JP6109881B2; ES2532637T3; US9107966B2; BRPI0917840A2; JP2015198670A; PL2328623T3

Description

(54) Título: PROCESSO PARA REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO VIRAL E MICROBIANA DE EXTRATOS BIOLÓGICOS, QUE CONTÊM SÓLIDOS, E USO DE UM EXTRATO BIOLÓGICO (51) lnt.CI.: A61L 2/00; C07K 14/435; C12N 9/94 (30) Prioridade Unionista: 12/06/2009 EP 09 007797.5, 16/06/2009 EP PCT/EP2009/004318, 27/08/2008 DE 10 2008 039 860.8 (73) Titular(es): NORDMARK ARZNEIMITTEL GMBH & CO. KG (72) Inventor(es): CHRISTIAN RÃMSCH; THOMAS SCHRÃDER; MANFRED KURFÜRST; THOMAS MOEST (85) Data do Início da Fase Nacional: 28/02/2011

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO VIRAL E MICROBIANA DE EXTRATOS BIOLÓGICOS, QUE CONTÊM SÓLIDOS, E USO DE UM EXTRATO BIOLÓGICO.

Campo de aplicação [001] A invenção se refere a um processo para a redução da carga viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, um extrato biológico, que contém sólidos, produzido por meio deste processo, bem como empregos de um tal extrato biológico, que contém sólidos.

Estado da técnica [002] Extratos, que são obtidos de material de partida biológico, podem apresentar uma alta carga de vírus. Vírus são ácidos nucleicos, que são envolvidos por um envoltório de proteína. No caso dos vírus envolvidos ainda é acrescido um envoltório de lipídio. Visto que os vírus não podem se replicar independentemente, eles dependem de hospedeiros. Em consequência disso, eles estão presentes em praticamente todos os seres vivos da terra. Pelo menos os vírus conhecidos são patogênicos para o homem, visto que eles possuem uma alta especificidade do hospedeiro. Para excluir de antemão um risco dos consumidores, os extratos, que são determinados para o consumo humano ou que são empregados como substância ativa em medicamentos, apresentam fundamentalmente não possuem nenhuma ou a menor carga viral possível. Nem sempre o próprio processo de produção leva a uma inativação ou eliminação significativa dos vírus presentes, de maneira que, especialmente na produção de substâncias farmacêuticas ativas, devem ser integrados ao processo estágios de empobrecimento ou inativação.

[003] Inúmeros métodos são conhecidos para o empobrecimento ou inativação de vírus e micro-organismos. Além da remoção mecâniPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 8/30

2/16 ca, por exemplo, através de cromatografia ou filtração, essas contaminações podem ser seletivamente inativadas pela adição de compostos químicos. Contudo, o último processo é tão problemático, na medida em que esses compostos precisam ser outra vez completamente removidos, para que não causem quaisquer efeitos tóxicos no produto final. Métodos físicos, tal como, por exemplo, tratamento térmico ou irradiação também são processos comuns para a inativação de vírus ou micro-organismos.

[004] Um desafio particular é a inativação ou eliminação de vírus de extratos biológicos complexos, cuja substância ativa são misturas de enzimas, sem destruir ou alterar, com isso, a atividade enzimática das proteínas.

[005] A substância farmacêutica ativa pancreatina, que é obtida como extrato do pâncreas de porcos e encontra aplicação em forma seca como agente terapêutico oral, tal como descrita na DE 3248588 A1, é de interesse particularmente econômico.

[006] Um processo típico para a produção de pancreatina é descrito a seguir com referência à figura 1. As glândulas pancreáticas 1 oriundas de porcos domésticos são inicialmente trituradas 2 e submetidas a uma autólise 3. Através da filtração 4 do produto intermediário obtido dessa maneira, é obtido o filtrado selecionado 5. A seguir, as enzimas que se encontram no filtrado selecionado são precipitadas 6, a mistura filtrada 7 e obtido o bolo de filtração 8. O bolo de filtração obtido é finalmente moído 9, secado no vácuo 10 e outra vez moído, através do que é obtida a pancreatina. Os estágios do processo caracterizados com os índices de referência 2 a 10 levam, em cada caso, a produtos intermediários, que a seguir são designados como estágios intermediários.

[007] As substâncias ativas na pancreatina são, entre outras, diferentes enzimas que decompõem polímeros, tais como lipases, amiPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 9/30

3/16 lases e proteases. Uma condição para a eficácia do agente terapêutico é que todas as enzimas estejam presentes na substância ativa em uma certa proporção e em forma ativa. Uma particularidade da pancreatina é que as enzimas contidas estão presentes parcialmente em solução e parcialmente na partícula e dessa maneira, trata-se de uma suspensão.

[008] Pesquisas para a carga de vírus de pancreatina mostraram, que vírus circundados, mas não vírus não circundados, são significativamente inativados pelo processo de produção atual. Fundamentalmente, as substâncias ativas farmacêuticas não deveriam conter quaisquer vírus infecciosos. Visto que os processos de produção atuais evidentemente não estão em condição de eliminar uma contaminação potencialmente presente de vírus não envolvidos com margem de segurança satisfatória, devem ser implementados estágios redutores de vírus adicionais.

[009] Métodos clássicos de inativação de vírus, tal como, por exemplo, calor seco ou úmido ou métodos de empobrecimento de vírus, tal como, por exemplo, filtração ou cromatografia, não podem ser usados na maioria dos casos nos extratos de material de partida biológico e especialmente nos extratos de órgãos sem alterar a composição e/ou altas perdas de produto. Um problema particular desses extratos são frequentemente componentes não dissolvidos, que lhes conferem uma propriedade do tipo de suspensão. Por isso, ocorre o bloqueio de filtros ou colunas de cromatografia. Além disso, muitas vezes as substâncias eficazes são divididas tanto na fração dissolvida como também na fração em forma de partícula e dessa maneira, são parcialmente eliminadas através de processos de separação mecânicos.

[0010] Outros processos para a inativação de vírus, bactérias e fungos em materiais biológicos são conhecidos. Por exemplo, a WO 02/056824 A2 descreve a inativação de patógenos em materiais biolóPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 10/30

4/16 gicos através da aplicação de uma alta pressão. A invenção se refere ao tratamento de plasma sanguíneo, isto é, a uma solução de substâncias ativas biológicas em água. Bradley D. W. e colaboradores descrevem em Pressure cycling technology: a novel approach to virus inactivation in plasma (Transfusion, 40, 2000, 193) também um processo para o tratamento de plasma sanguíneo.

[0011] O tratamento de alimentos a alta pressão foi descrito diversas vezes. Por exemplo, mariscos podem ser tratados com alta pressão, para inativar norovírus ou vírus da hepatite A (Kingsley e colaboradores, Inactivation of a Norovirus by High-Pressure Processing, Appl. Environ. Microbiol. 2007, 581; Calci e colaboradores, High-Pressure Inactivation of Hepatitis A Virus within Oysters, Appl. Environ. Microbiol. 2005, 339). O tratamento deve conter as propriedades organolépticas do alimento. A atividade biológica de enzimas ou outras substâncias ativas após o tratamento de alta pressão não foi pesquisada. Além disso, nos dois casos pesquisaram-se os sólidos.

[0012] Contudo, sabe-se também, que tão facilmente não se pode prever, se por meio do tratamento de alta pressão realmente sucede uma inativação de determinados vírus (Grove S. F. e colaboradores, Inactivation of Foodborne Viruses of Significance by High Pressure and other Processes, J. Food Prot. 2006, 667). Dependendo se se trata de amostras líquidas ou amostras sólidas, devem ser selecionadas diferentes condições de processos com base na diferente compressibilidade das amostras.

[0013] Além disso, o tratamento de alta pressão pode levar a uma alteração dos alimentos. Por exemplo, os frutos tornam-se marrons, quando são submetidos a um tal tratamento. Essa alteração da cor é atribuída a uma reação enzimática, o que permite concluir uma alteração da atividade biológica dessas enzimas.

[0014] Uma dificuldade particular há nas amostras biológicas, que

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5/16 não estão amplamente presentes em forma homogênea. Em um extrato contendo sólido em forma de uma suspensão as partes das substâncias ativas biologicamente ativas encontram-se na fase líquida, outras partes, nas partículas sólidas dispersas. Portanto, uma inativação de vírus nas partículas sólidas pode estar ligada com uma destruição das substâncias ativas, que se encontram na fase líquida, visto que a compressibilidade da fase líquida é superior a a das partículas sólidas. [0015] Devido a sua carga de vírus natural e seu caráter de suspensão, a pancreatina ou os estágios intermediários obtidos na produção, representam extratos biológicos, que contêm sólidos, exemplares. Nos experimentos clássicos de adição (spiking), a substância correspondente é adicionada a várias cepas de laboratório e o título é determinado antes e após o tratamento.

[0016] Além disso, há a necessidade de processos, nos quais as cargas virais e bacterianas contidas em um extrato biológico, que contém sólidos, são inteiramente reduzidas ou para um mínimo. O processo tem que ser igualmente adequado para sólidos e suspensões. O processo deve permitir especialmente a inativação de vírus não envolvidos na pancreatina.

Objetivo, solução, vantagem [0017] O objetivo da invenção é eliminar as desvantagens de acordo com o estado da técnica. Especialmente deve ser indicado um processo para reduzir a carga viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, que é adequado para sólidos e suspensões, que não reduz a atividade das enzimas contidas no extrato biológico, não piora as propriedades farmacologicamente desejadas e não produz quaisquer compostos químicos tóxicos. Além disso, devem ser indicados extratos produzidos por meio do processo e empregos desses extratos.

[0018] Esse objetivo é resolvido pelas características das reivindiPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 12/30

6/16 cações 1, 16, 18 e 19. Concretizações convenientes da invenção resultam das características das sub-reivindicações.

[0019] Em conformidade com a invenção, é projetado um processo para reduzir a carga viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, compreendendo os estágios [0020] (a) produção do extrato biológico, que contém sólidos, compreendendo pelo menos uma substância biologicamente ativa, selecionada de enzimas, proteínas e peptídeos ou uma mistura dessas substâncias ativas; e [0021] (b) submeter o extrato produzido no estágio (a) a um tratamento de alta pressão;

[0022] sendo que a atividade biológica do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão, corresponde pelo menos a 50% da atividade biológica do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão.

[0023] Um outro processo de acordo com a invenção, para a redução da carga viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, sem a redução da atividade das enzimas contidas no extrato biológico, compreende os seguintes estágios:

[0024] (a) glândulas pancreáticas oriundas de porcos domésticos são trituradas e submetidas a uma autólise;

[0025] (b) filtração do produto intermediário contido de acordo com o estágio (a) para a obtenção de um filtrado selecionado;

[0026] (c) o filtrado selecionado é submetido preferivelmente por 5 minutos a 15^oC a um tratamento de alta pressão a 400, 500 e 600 MPa (4000, 5000 e 6000 bar);

[0027] (d) precipitação das enzimas contidas no filtrado selecionado;

[0028] (e) filtração da mistura do estágio (d) para a obtenção de um bolo de filtração;

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7/16 [0029] (f) o bolo de filtração obtido de acordo com o estágio (e) é submetido preferivelmente por 5 minutos a 15^oC a um tratamento de alta pressão a 400, 500 e 600 MPa (4000, 5000 e 6000 bar);

[0030] (g) moagem do bolo de filtração obtido de acordo com o estágio (f) com subsequente secagem a vácuo e outra moagem para obter a pancreatina.

[0031] Preferivelmente, o extrato biológico, que contém sólidos, é produzido como suspensão, compreendendo uma fase líquida e partículas de sólidos dispersos nesta, sendo que a mistura de substâncias ativas biologicamente ativas é dissolvida, em uma parte, na fase líquida e em uma outra parte, está ligada às partículas sólidas. Do mesmo modo, preferivelmente, o extrato biológico, que contém sólidos, pode ser produzido em forma sólida.

[0032] Pelo termo extrato biológico, que contém sólidos, deve ser entendido aqui um extrato, que compreende uma substância biologicamente ativa, selecionada de enzimas, proteínas e peptídeos ou uma mistura dessas substâncias ativas. É preferível, que o extrato biológico, que contém sólidos, compreenda uma mistura das substâncias ativas biologicamente ativas mencionadas A seguir, para simplificar, o extrato biológico, que contém sólidos, é designado também como extrato.

[0033] O extrato biológico, que contém sólidos, é preferivelmente um extrato, que foi obtido como extrato alcoólico ou aquoso de órgãos animais. A substância biologicamente ativa contida ou a mistura de substâncias ativas podem estar presentes no extrato tanto em solução como também ligadas a sólidos. Um tal extrato biológico, que contém sólidos, é um extrato complexo. A substância biologicamente ativa ou a mistura dessas substâncias ativas apresenta preferivelmente atividade farmacêutica.

[0034] Pelo termo substância biologicamente ativa são entendiPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 14/30

8/16 das substâncias ativas farmacêuticas e substâncias ativas terapêuticas. Substâncias ativas biologicamente ativas no sentido dessa invenção são, por exemplo, enzimas, proteínas e peptídeos.

[0035] Órgãos animais exemplares, a partir dos quais o extrato pode ser obtido, são o fígado, o pâncreas e a mucosa estomacal.

[0036] Exemplos de extratos biológicos, que contêm sólidos, de acordo com a invenção,são extratos, que são obtidos do pâncreas, especialmente do pâncreas do porco. Exemplos especiais são a pancreatina, bem como os estágios intermediários obtidos em sua produção. Esses estágios intermediários são caracterizados na figura 2 com os índices de referência 2 a 10. Exemplos preferidos desses estágios intermediários são o filtrado selecionado (índice de referência 5 na figura 2) e o bolo de filtração (índice de referência 8 na figura 2), após cuja obtenção é efetuado um tratamento de alta pressão, isto é, o filtrado selecionado e/ou o bolo de filtração podem ser submetidos a um tratamento de alta pressão (índice de referência 13 ou 14 na figura 2). A pancreatina é obtida do pâncreas como substância ativa farmacêutica. A pancreatina, bem como os estágios intermediários obtidos na produção contêm, entre outros, as enzimas lipase, amilase e protease. Dessa maneira, eles são extratos biológicos, que contêm sólidos, no sentido da presente invenção. Os extratos são preferivelmente produzidos como extratos aquoso-alcoólicos no estágio (a) do processo de acordo com a invenção.

[0037] O processo de acordo com a invenção,pode ser aplicado em todas as formas de vírus, tais como vírus de DNA e RNA, vírus envolvidos e não envolvidos, além disso, em viriões e prionas ou sistemas biológicos semelhantes, bem como bactérias e fungos. O processo é preferivelmente usado para reduzir a carga de vírus não envolvidos na pancreatina do pâncreas de porco ou em estágios intermediários correspondentes obtidos na produção (vide figura 2).

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9/16 [0038] O processo de acordo com a invenção,permite a redução da carga de vírus e micro-organismos de extratos biológicos, que contêm sólidos, sem que sua atividade enzimática seja essencialmente reduzida, as propriedades farmacologicamente ambicionadas piorem ou sejam produzidos compostos químicos tóxicos.

[0039] A atividade biológica dos extratos biológicos, que contêm sólidos, após o tratamento de alta pressão,deveria importar pelo menos 50% da atividade biológica do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão, preferivelmente pelo menos 80%, de modo particularmente preferido, pelo menos 90%.

[0040] Se uma das substâncias ativas biologicamente ativas, que estão contidas no extrato, é uma enzima, então a atividade enzimática do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão deveria importar em pelo menos 50% da atividade enzimática do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão, preferivelmente pelo menos 80%, de modo particularmente preferido, pelo menos 90%.

[0041] A infectividade viral do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta temperatura,deveria ter sido reduzida em torno de um fator superior a 1 logw, preferivelmente superior a 3 logw, de modo particularmente preferido, superior a 4 logw, em comparação com a infectividade viral antes do tratamento de alta pressão. Isso se aplica especialmente também para a infectividade viral de vírus envolvidos. Por exemplo, a infectividade de vírus não envolvidos na pancreatina após o tratamento deve ser reduzida em torno de um fator superior a 1 logw, preferivelmente superior a 3 logw, de modo particularmente preferido, superior a 4 logw, em comparação com sua infectividade antes do tratamento. Preferivelmente, a carga de germens após o tratamento de alta pressão não importa em mais do que 500 UFC/g, preferivelmente não mais do que 100 UFC/g.

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10/16 [0042] No tratamento do extrato a alta pressão não são acrescentadas quaisquer substâncias químicas, de maneira que a carga com substâncias tóxicas após o tratamento não é superior a antes do tratamento.

[0043] O estágio (b) do processo de acordo com a invenção, é preferivelmente efetuado com a aplicação de pressões na faixa de 100 a 800 MPa (1000 até 8000 bar), preferivelmente na faixa de 200 a 700 MPa (2000 até 7000 bar), de modo particularmente preferido, na faixa de 300 a 600 MPa (3000 até 6000 bar). De acordo com a invenção, o tratamento de alta temperatura é efetuado a pressão constante ou através de impulsos de pressão e pode ser efetuado no processo de passagem ou no processo em bateladas em aparelhos correspondentes. O tempo de ação do tratamento de alta pressão sobre o extrato produzido no estágio (a) importa preferivelmente em 1 a 60 minutos. O tratamento de alta pressão é preferivelmente efetuado a temperaturas entre -20^oC e 30^oC, de modo particularmente preferido, entre -10^oC e 20^oC.

[0044] A fase líquida do extrato, que é submetido a um tratamento de alta pressão no estágio (b), pode conter como solvente, água ou uma mistura de água e um solvente orgânico. A fração de solvente pode encontrar-se na faixa entre 1 e 90% em peso, em relação ao peso da suspensão. No caso dos extratos biológicos obtidos na produção de pancreatina, o solvente usado é preferivelmente um álcool, de modo particularmente preferido, isopropanol. A fração de isopropanol encontra-se tipicamente entre 5 e 85% em peso, em relação ao peso da suspensão.

[0045] Em conformidade com a invenção, está previsto, além disso, um extrato biológico, que contém sólidos, que foi obtido pelo processo de acordo com a invenção. Este extrato é caracterizado por baixa carga viral e microbiana. Apesar do tratamento prévio a alta presPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 17/30

11/16 são, sua atividade biológica, especialmente sua atividade enzimática não diminui essencialmente, suas propriedades farmacologicamente tencionadas não pioram e ele não apresenta quaisquer compostos químicos tóxicos, que foram acrescentados ao tratamento.

[0046] O extrato de acordo com a invenção, obtido através de tratamento de alta pressão ou a substância ativa biológica produzida deste, pode ser usada para a produção de medicamentos, especialmente o âmbito da terapia enzimática oral, bem como nutriente ou alimento ou suplemento alimentar.

Breve Descrição dos desenhos [0047] A seguir, a invenção é ilustrada com base em exemplos, que não devem restringir a invenção, com referência aos desenhos. Nesse caso, mostram [0048] figura 1 - um diagrama funcional de um processo para a preparação de pancreatina de glândulas pancreáticas de porcos de acordo com o estado da técnica;

[0049] figura 2 - um diagrama funcional de um processo de acordo com a invenção, para a produção de pancreatina de glândulas pancreáticas de porcos;

[0050] figura 3 - um diagrama, que mostra as atividades enzimáticas relativas após o tratamento de filtrado selecionado do processo de produção de pancreatina com diferentes pressões em porcento, em relação à atividade de partida da amostra não tratada;

[0051] figura 4 - um diagrama, que mostra as atividades enzimáticas relativas após o tratamento de bolo de filtração do processo de produção de pancreatina com diferentes pressões em porcento, em relação à atividade de partida da amostra não tratada;

[0052] figura 5, figura 6 e figura 7 - diagramas, que mostram as atividades enzimáticas relativas após o tratamento de bolo de filtração do processo de produção de pancreatina com diferentes pressões e

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12/16 diferentes temperaturas em porcento, em relação à atividade de partida da amostra não tratada.

Descrição detalhada da invenção e melhor método para a execução da invenção [0053] Uma forma de concretização do processo de acordo com a invenção, para a produção de pancreatina é descrito a seguir com referência à figura 2. As glândulas pancreáticas 1 oriundas de porcos domésticos são inicialmente trituradas 2 e submetidas a uma autólise

3. Através de filtração 4 do produto intermediário obtido dessa maneira, obtém-se o filtrado selecionado 5. O filtrado selecionado pode ser submetido a um tratamento de alta pressão 13 antes do tratamento posterior. Em seguida, as enzimas, que se encontram no filtrado selecionado, são precipitadas 6, a mistura filtrada 7 e obtém-se o bolo de filtração 8. O bolo de filtração obtido é submetido a um tratamento de alta pressão 14. O bolo de filtração é finalmente moído 9, secado no vácuo 10 e outra vez moído, com o que é obtida a pancreatina 12. [0054] De acordo com o processo representado na figura 2, pode ser previsto um tratamento de alta pressão do filtrado selecionado 13 ou um tratamento de alta pressão do bolo de filtração 14 ou um tratamento de alta pressão do filtrado selecionado 13 e um tratamento de alta pressão do bolo de filtração 14.

Exemplo 1 [0055] O seguinte exemplo descreve o tratamento de estágios intermediários do processo de produção de pancreatina como extratos biológicos, que contêm sólidos, que foram obtidos do pâncreas de porcos, com alta pressão.

[0056] (1) Execução [0057] O tratamento foi efetuado no processo em bateladas em um equipamento de alta pressão.

[0058] a) Um estágio intermediário do processo de produção de

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13/16 pancreatina dissolvido em isopropanol a 40% (filtrado selecionado com cerca de 5% em peso, de fração sólida, em relação ao peso do filtrado selecionado, vide índice de referência 13 da figura 2) foi submetido por 5 minutos a 15^oC a um tratamento de alta pressão a 400, 500 e 600 MPa (4000, 5000 e 6000 bar).

[0059] b) Alternatívamente, nas mesmas condições, foi efetuado um tratamento de alta pressão com bolo de filtração (vide índices de referência 14 da figura 2, fração sólida cerca de 50% em peso, de fração líquida, constituída em cerca de 80% em peso, de isopropanol e em cerca de 20% em peso, de água).

[0060] Para as duas amostras, a atividade da lipase, amilase e protease foi determinada em comparação com uma amostra não tratada.

[0061] (2) Avaliação [0062] Os resultados apresentados mostram, que as três atividades enzimáticas medidas no bolo de filtração (figura 2) também não diminuem significativamente em um tratamento de alta pressão com 600 MPa (6000 bar) (figura 4). A atividade da lipase era estável também no filtrado selecionado (figura 2) com todas as pressões. Em contrapartida, a atividade da amilase diminuiu nitidamente no filtrado selecionado com pressões de > 400 MPa (> 4000 bar) (figura 3).

Exemplo 2 [0063] O seguinte exemplo descreve o tratamento de bolos de filtração do processo de produção de pancreatina, que foi obtido de pâncreas de porco, com alta pressão.

[0064] (1) Execução [0065] O tratamento foi efetuado no processo em bateladas em um equipamento de alta pressão.

[0066] O bolo de filtração (vide os índices de referência 14 da figura 2, fração sólida de cerca de 50% em peso, fração líquida, constituíPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 20/30

14/16 da em cerca de 80% em peso, de isopropanol e em cerca de 20% em peso, de água) foi submetido a um tratamento de alta pressão com diferentes pressões e temperaturas.

[0067] Para todas as amostras a atividade da lipase, amilase e protease foi determinada em comparação com a amostra não tratada. [0068] (2) Avaliação [0069] Os resultados apresentados mostram, que a inativação das enzimas no bolo de filtração (figura 2) depende tanto da pressão, como também da temperatura. A atividade da lipase apresentou a maior estabilidade e não foi significativamente inativada também com pressões de 700 MPa (7000 bar) (figura 5). Em contrapartida, a amilase mostrou a maior sensibilidade em relação ao tratamento de alta pressão. Baixas temperaturas tinham uma influência estabilizante sobre as atividades da enzima (figura 5).

Exemplo 3 [0070] O seguinte exemplo descreve a inativação do vírus FCV não envolvido por meio de alta pressão (FCV = Felines Calicivirus). [0071] (1) Execução [0072] O tratamento foi efetuado no processo em bateladas em um equipamento de alta pressão.

[0073] Uma solução padrão de FCV em meio de cultura foi submetida a um tratamento de alta pressão com diferentes pressões e temperaturas por diferentes períodos de tempo. O título do vírus foi determinado na amostra de partida e nas amostras tratadas.

[0074] (2) Avaliação [0075] Os resultados apresentados (tabela 1) mostram, que o título do vírus diminui através do tratamento de alta pressão em todas as amostras, além da amostra, que foi tratada a 20^oC, 5 minutos com 400 MPa (4000 bar), até abaixo do limite de detecção de 1,9 log. Da diferença do título do vírus entre a amostra não tratada e amostras trataPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 21/30

15/16 das resulta um fator de empobrecimento de > 6,3 log. O FCV é usado como vírus modelar para o HEV também não envolvido, que foi detectado em porcos e vale como patógeno humano, mas mesmo não podendo ser detectado na cultura celular. Um empobrecimento desse vírus em torno de > 6 log de estágios, representa uma melhora essencial da segurança biológica da pancreatina.

Tabela 1: Título do vírus após tratamento de alta pressão de uma solução de FCV

tratamento	400 MPa (4000 bar)	500 MPa (5000 bar)	600 MPa (6000 bar)
tempo (min)	temperatura (^oC)
0	20	8,2 log
5	20	3,6 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	20	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	20	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	-5	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	-5	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
5	-5	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
15	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
15	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log
15	0	< 1,9 log	< 1,9 log	< 1,9 log

Exemplo 4 [0076] O seguinte exemplo descreve a inativação dos vírus não envolvidos FCV, EMCV (virus Encephalomyocarditis) e Reo3 por meio de alta pressão.

[0077] (1) Execução [0078] O tratamento foi efetuado no processo em bateladas em um equipamento de alta pressão.

[0079] Os três virus foramadicionados ao bolo de filtração do processo de produção de pancreatina e submetidos a um tratamento de alta pressão a 600 MPa (6000 bar) com diferentes temperaturas e difePetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 22/30

16/16 rentes períodos de tempo. O título do vírus foi determinado nas amostras de partida (provas de carga (load)), nas amostras tratadas e nas amostras não tratadas após a execução do tratamento de alta pressão (amostras de retenção (hold)).

[0080] (2) Avaliação [0081] Os resultados apresentados (tabela 2) mostram, que o título de todos os vírus pesquisados foi significativamente reduzido através do tratamento de alta pressão. Para FCV resulta um fator de redução de 3,82 log. Os dois outros vírus foram reduzidos até um título abaixo do limite de detecção de 1,5 log. Dos títulos de carga correspondentes resultam fatores de redução de > 4,98 log para EMCV e > 3,78 log para Reo3. Uma redução dos títulos desses três vírus zoonóticos (FCV = modelo para HEV) em mais do que 3,5 log de estágios, representa uma melhora essencial da segurança biológica da pancreatina. Com esse teste foi possível mostrar, que o título de vários vírus em processos intermediários do processo de produção de pancreatina pode ser significativamente reduzido através de um tratamento de alta pressão. Uma ótima ativação do vírus é obtida nas condições, que asseguram simultaneamente uma estabilidade máxima das enzimas presentes na pancreatina (temperaturas < 0^oC).

Tabela 2: Título do vírus após tratamento de alta pressão de FCV,

EMCV e Reo3 no bolo de filtração de pancreatina

tratamento	título (log TCID50)
temperatura (^oC)	duração (min)	FCV	EMCV	Reo3
amostra de carga	6,97	6,48	5,28
0	5	4,76	2,97	2,97
0	15	5,77	< 1,5	2,88
-10	5	4,35	< 1,5	< 1,5
-10	15	3,15	< 1,5	< 1,5
amostra retenção	6,79	6,73	5,05

[0082] Os exemplos de concretização são igualmente objeto da invenção.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para redução da contaminação viral e microbiana de extratos biológicos, que contêm sólidos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) prover o extrato biológico, que contém sólidos, compreendendo pelo menos uma substância biologicamente ativa, selecionada de enzimas, proteínas e peptídeos ou uma mistura dessas substâncias ativas; e (b) submeter o extrato produzido no estágio (a) a um tratamento de alta pressão utilizando pressões na faixa de 300 a 600 MPa (3000 até 6000 bar);

sendo que o extrato biológico, que contém sólidos, foi obtido a partir do pâncreas de um animal, sendo que pelo menos uma das substâncias biologicamente ativas, que estão contidas no extrato, é uma enzima e a atividade da enzima do extrato biológico contendo sólidos, após o tratamento de alta pressão, corresponde a pelo menos 50% da atividade da enzima do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão, sendo que que a infectividade viral do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão, foi reduzida em torno de um fator superior a 1 logw em comparação com a infectividade viral antes do tratamento de alta pressão;

sendo que o extrato biológico, que contém sólidos, é provido como uma suspensão, que compreende uma fase líquida e partículas sólidas dispersas na mesma, a mistura de substâncias biologicamente ativas sendo parcialmente dissolvida na fase líquida e sendo parcialmente ligada às partículas sólidas, e sendo que a fração de solvente da suspensão está em uma faixa entre 1 e 90% em peso, em relação ao peso da suspensão.

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2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o extrato biológico, que contém sólidos, foi obtido do pâncreas do porco.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tratamento de alta pressão é efetuado a uma pressão constante ou com pressões pulsantes.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o extrato biológico, que contém sólidos, é submetido a um estágio de filtração antes do tratamento a alta pressão, com o que são obtidos um filtrado e um bolo de filtração, sendo que o bolo de filtração é submetido ao tratamento de alta pressão.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o bolo de filtração compreende um teor de sólido de pelo menos 40% em peso, em relação ao peso do bolo de filtração.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para preparação de pancreatina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(i) cominuir glândulas de pâncreas obtidas a partir de porcos dométicos;

(ii) submeter as glândulas de pâncreas cominuídas à autólise;

(iii) filtrar o produto intermediário obtido desta forma para obter o filtrado selecionado;

(iv) precipitar a enzima a partir do filtrado selecionado;

(v) filtrar a mistura para obter o bolo de filtração;

(vi) moer o bolo de filtração;

(vii) secar a vácuo o bolo de filtração moído; e (viii) moer o bolo de filtração seco a vácuo novamente; sendo que o bolo de filtração obtido na etapa (v) é submetiPetição 870180047180, de 01/06/2018, pág. 25/30

3/3 do ao tratamento de pressão elevada.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a atividade da enzima do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão, corresponde a pelo menos 90% da atividade da enzima do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a atividade enzimática do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão corresponde a > 80% da atividade enzimática do extrato biológico, que contém sólidos, antes do tratamento de alta pressão.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a infectividade viral do extrato biológico, que contém sólidos, após o tratamento de alta pressão, foi reduzida em torno de um fator superior a 4 logw em comparação com a infectividade viral antes do tratamento de alta pressão.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a carga do extrato biológico, que contém sólidos, com substâncias tóxicas, após o tratamento de alta pressão, não é superior a antes do tratamento de alta pressão.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a carga de germens com formadores de não esporos após o tratamento de alta pressão encontra-se abaixo do limite de detecção ou é inferior a 50 UFC/g.
12. Uso de um extrato biológico, que contém sólidos, produzido pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é como nutriente ou alimento ou como suplemento alimentar.

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