BRPI0918959B1

BRPI0918959B1 - Proteínas recombinantes tendo atividade hemostática e capazes de induzir agregação plaquetária

Info

Publication number: BRPI0918959B1
Application number: BRPI0918959-9A
Authority: BR
Inventors: David Vandroux; Emmanuel De Maistre; Edourd Prost
Original assignee: Centre Hospitalier Universitaire De Dijon
Priority date: 2008-09-24
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2021-07-27
Also published as: FR2936247A1; AU2009295917A1; FR2936247B1; US8557774B2; CA2738209A1; EP2337796A1; US9115183B2; JP2012503481A; CN102224167B; WO2010034718A1; ES2419657T3; AU2009295917B2; CA2738209C; CN102224167A; JP5675620B2; IL211740A0; US20110207669A1; KR101700970B1; US20130260456A1; ZA201101989B

Abstract

proteínas recombinantes tendo atividade hemostática e capazes de induzir agregação plaquetária. a presente invenção se refere a proteínas recombinantes capazes de induzir a agregação plaquetária e utilizações das mesmas.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção se refere às protèinas recombinantes compostas pelo conjunto das sequências de i peptideo descrito para interagir com os receptores do colágeno de plaqueta. Essas protèinas têm atividade pró- agregante, independente da formação de uma tripla hélice. Elas podem ser produzidas em bactérias e em células de mamiferos

Antecedentes da Invenção |

Colágenos são os principais componentes estruturais da matriz extracelular de todos os organismos multicelulares.

Eles são uma familia de protèinas composta de 28 tipos diferentes que desempenham um papel durante o desenvolvimento e na homeostase tecidual. Eles são capazes de serem montados em várias estruturas supramoleculares sob a forma de fibrilas, microfibrilas ou redes.

Colágenos têm a característica comum de conter um ou mais domínios que têm uma estrutura de tripla hélice formada por três cadeias polipeptidicas, ou cadeias a, enroladas em conjunto. Como todos os três são aminoácidos, esta característica é habilitada pela presença de uma glicina nas porções helicoidais motivos que consistent de sequências G-X-Y repetidas, onde X é f requentementei uma prolina e Y uma hidroxiprolina essencial para a estabilização característica dos colágenos. Os hidroxilados principalmente por prolil-4-hidroxilase (P-4- H) em 4-hidroxiprolina. Há uma segunda hidroxilase, prólil- 3-hidroxilase, que permite a hidroxilação da prolina quando ela está na posição X, enquanto que na posição Y; uma I 10 prolina hidroxilada por P-4-H já é encontrada. Em uma molécula de colágeno, as cadeias alfa podem ser idênticas ou diferentes. !

Moléculas de colágeno são formadas de domínios helicoidais (ou domínios colágenos) flanqueadas pelos I 15 domínios não-helicoidais, chamados de propeptídeos N- e C-.

O reconhecimento das três cadeias α que formam uma molécula e o início das suas montagens estão sob o control^ da extremidade C-terminal (propeptídeo C) . Este processo é realizado no retículo endoplasmático. Subsequentemente, os 20 propeptídeos N- e C- são retirados durante a maturação do colágeno, deixando sequências não-helicoidais curtas, os telopeptídeos. l

Colágenos desempenham um papel importante nas paredes dos vasos, mantendo a integridade e elasticidade , dos mesmos. Esta parede é formada por colágeno tipo 1 I e colágeno tipo III, que são fibrilares, e de colágeno ' tipo IV, em forma de rede. Deve-se observar que o colágeno'tipo III também é fortemente expresso em placas de ateroma.'Além 5 disso, os colágenos são capazes de modular as funções de células determinadas pela interação direta com receptores celulares específicos. Assim, o colágeno, principalmente dos tipos I e III, são potentes ativadores da função plaquetária.

Colágeno tipo III é um homotrimero composto por 'três cadeias al dispostas em uma tripla hélice. Dois tripletes i G-P-P (potencialmente hidroxilado), presentes na extremidade C-terminal das cadeias al, são então suficientes e necessários para a nucleação e o dobramento 15 da tripla hélice (Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701} . Por outro lado, estes dois tripletes. não são suficientes para permitir a combinação inicial das três I cadeias. É interessante verificar que Bulleid et al. (1997) i observaram maior eficiência de formação de tripla hélice 20 quando três tripletes são mantidos, e essa eficiência é ainda maior do que para a molécula selvagem. Várias proteínas estão envolvidas no processo de montagem das cadeias monoméricas: HSP47 (proteína de choque térmico) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Propeptideo C, situado na extremidade C-terminal das cadeias monoméricas, aparece envolvido no alinhamento das cadeias α e a formação das pontes dissulfeto necessárias para a estabilização da proteina {Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(^22): 6694-701). Este propeptideo C é, desta forma, necessário apenas para assegurar a combinação das cadeias monomérilcas.

Vários pontos devem ser lembrados em relação a ele: •, •Trata-se de uma sequência descontinua de 15 I aminoácidos que determina a montagem padrão especifica das 10 cadeias αl {Hulmes DJ, J Struct Biol. Jan-Fev 2002; 13t7 (1- 2) : 2-10) . - Um dominio espiral enovelado localizado no inicio do propeptideo-C está envolvido na trimerização do colágeno III {Bulleid et al., EMBO J. 17 de novembro de 1997; 15 16(22): 6694-701). Este dominio é composto por quatro heptapeptideos (McAlinden et al, J Biol Chem. 24 de outubro de 2003; 278(43): 42200-7). - Ele contém oito residues de cisteina formação de pontes dissulfeto intra e intercatenárias.

A presença de pontes dissulfeto entre cadeias no C- telopeptideo ou C-propeptideo não é necessário parja a j combinação das cadeias e a formação da tripla hélice {Bulleid et al., Biochem J. Io de Jul 1996; 317(Pt 1): 195- I 202) . Deve-se notar que os experimentos são realizados com i . i o N-propeptideo. As noções de trimero e de alfa-ttipla i hélice parecem paradoxalmente independentes. Na ausência de i N-propeptideo, parece sensato deixar ou a cisteina 2 do CI propeptideo, ou as duas cisteinas do C-telopeptideo. ■ Esta 5 última porção, chamada de sequência nó (GPCCG), permite a formação de pontes dissulfeto apenas em virtude d!e um fenômeno preliminar de montagem e dobramento das cadeias al ■ i ('Boudko e Engel, J Mol Biol. 30 Jan 2004; 335(5): 1289-97) .

Seja de origem traumática ou a consequência da aterosclerose, os danos à parede arterial são acompanhados pela destruição do endotélio vascular e exposição dos componentes trombogênicos, como o colágeno. Isto é seguido i pela adesão de plaquetas no local danificado, em contato com superficies ricas em colágeno ou fragmentos de 15 colágeno, a sua ativação e a formação de um tromblo. A adesão e estabilização das plaquetas em contato com este colágeno são permitidos por meio de interações múltiplas, de afinidades altas, entre os receptores presented na superfície das plaquetas e o colágeno. Esta adesão pode 20 ocorrer de forma indireta, após a ligação do dominio Al do fator de von Willebrand (vWF) com o complexo plaquetário formado de glicoproteinas (Gp) GPIb-V-IX, em si ligado ao colágeno pelo seu dominio A3, ou pela interação direta entre um receptor de plaquetas e colágeno. Viários i ! •i I receptores podem ligar-se às moléculas de colágeno em sequências peptidicas altamente especificas, ou seja, /a ) 5 10 15 20 integrina α2βl, que desempenha um papel importante ha estabilização das plaquetas em contato com o colágeno,i e GpVI, considerado o mais importante para o receptor par<a a ativação plaquetária. Outro receptor, TIIICBP (proteína de I ligação ao colágeno tipo III), tem sido descrito como sendo capaz de se ligar ao colágeno diretamente. /

A taxa de fluxo do vaso sanguíneo é um determinante principal que define o tipo de receptores de colágéno das i plaquetas recrutados. Com uma taxa de fluxo elevada, as plaquetas interagem com colágeno via vWF atrávés do / receptor Gplb e depois elas são ativadas pela lig'ação via í GpVI; a integrina α2βl intervém apenas /como um estabilizador da ligação plaqueta-colágeno. Em Ima baixa taxa de fluxo, as plaquetas se ligam ao colágeno /através da / integrina α2βl, seguido pela ligação ao GpVI, leVando assim à ativação das mesmas, que é a etapa que/ prepara a agregação plaquetária. Da mesma forma, outros Receptores de i colágeno das plaquetas estão envolvidas, tais pomo TIIICBP. /

Em todos os casos, GpVI desempenha um importante papel na ativação plaquetária.

A adesão plaquetária é um processo ^ue agora está dissociado da ativação plaquetária. De fato, muitos peptideos, correspondendo às porções de peptideo curto de colágeno, são capazes de induzir a adesão de plaquetas sem levar a ativação das mesmas. No entanto, alguns desses peptideos têm a capacidade de induzir a ativação plaquetária. e exibem uma chamada atividade pró-agregante.

Suas estruturas de tripla hélice parecem ser um pré- requisito essencial para esta atividade. Deve-se notar que quando alguns desses peptideos permanecem na forma monomérica, eles exibem uma atividade anti-agregante por um 10 mecanismo que continua a ser identificado, mas que poderia ser a ocupação dos sitios que se tornam indisponíveis para o colágeno natural.

A maioria dos trabalhos que visam identificar as sequências de peptideo envolvidas na adesão de plaquetas 15 com o colágeno tipo III usam o fragmento al(III)CB4 correspondendo ao fragmento de digestão por CNBr apresentando a maior atividade de agregação.

Várias porções do peptideo foram descritas nos últimos anos, como sendo capazes de se ligar e ativar as plaquetas. 20 Elas foram testadas sob a forma de peptideos de duas naturezas possíveis: - Semelhantes ao colágeno, formados pela repetição de porções GPO conservadas repetidas n vezes, não presentes na sequência natural de colágeno tipo III;

Ou correspondentes aos peptideos formados das porções peptidicas presentes na sequência al(III)CB4, principalmente obtidas por sintese quimica (Farndale et al., Biochem Soc Trans. Abr 2008; 36(Pt 2): 241-50}.

Integrina α2βl é um receptor para colágenos, laminina e outros ligantes em vários tipos celulares, incluindo células endoteliais e plaquetas. α2βl se liga ao colágeno através do seu dominio I nas porções dos peptideos presentes na sequência de colágenos fibrilares. Várias 10 porções foram descritas com maior afinidade por GFOGER presente na cadeia al de colágeno tipo-I. Para o colágeno tipo III, e ao contrário do colágeno tipo I, parece que várias porções GXYGER são necessárias para a ótima ligação, com GLOGER, GMOGER, GROGER e GAOGER como as porções 15 principais (Kim et al., J Biol Chem. 16 Set 2005; 280 (37): 32512-20}. Outras porções, como GLOGEN e GLKGEN, foram descritas, mas apresentam baixa afinidade por α2βl {Raynal et al., J Biol Chem. 17 Fev 2006; 281 (7): 3821-31}.

Observa-se que todos os peptideos sintetizados a partir 20 dessas porções apresentam uma atividade de adesão quando elas são organizadas sob a forma de uma hélice tripla.

Glicoproteina VI (GPVI) é uma glicoproteina transmembranar tipo I de 60-65 kDa pertencente à superfamilia da imunoglobulina (Ig). Ela é constitutivamente na superficie das plaquetas na forma de um complexo não-covalente com a cadeia y comum aos receptores de Ig (FcRy)• Os peptideos descritos como interativos com estes receptores são peptideos semelhantes 5 ao colágeno formado a partir da repetição de 4 a 10 tripletes de GPO {Morton et al., Biochem J. 1° Mar 1995; 306(Pt 2): 337-44 e Smethurst et al., J Biol Chem. 12 Jan 2007; 282(2): 1296-304} . Embora compreendendo 10% de porções GPO, o número máximo de repetições deste triplete 10 não ultrapassa três na sequência natural de colágeno tipo III. Deve ainda ser observado aqui que a formação da tripla hélice ou de uma forma polimérica, obtida quimicamente após uma modificação dos residues de cisteina ou lisina, é fundamental para conferir a estes peptideos uma atividade 15 pró-agregadora. Além disso, a presença de uma hidroxiprolina na posição 3 é essencial para esta atividade. Por outro lado, quando estão na forma monomérica, esses peptideos apresentam uma atividade anti- agregante (Asselin et al., Biochem J. 15 Abr 1999; 339 (Pt. 20 2): 413-8). Recentemente, Jarvis et al. identificaram a porção peptidica na seqüência de colágeno tipo III que apresenta a maior atividade de adesão. Ela é composta dos residues GAOGLRGGAGPOGPEGGKGAAGPOGPO localizados nos aminoácidos 523 a 549 de αl(III)CB4 {Jarvis et al., Blood. Mai 2008; 111 (10) : 4986-96} . Esta porção peptidica é composta de três GPOs, que não são consecutivos e que parecem ser o número mínimo necessário para uma adequada interação com GpVI.

A interação indireta entre o receptor plaquetário Gplb e colágeno é dependente do vWF, que é uma proteína plasmática multimérica secretada pelas células endoteliais e plaquetas, em resposta aos danos vasculares ou após um aumento da pressão parietal. Ela desempenha um papel principal no recrutamento de plaquetas em sítios danificados dos territórios vasculares sujeitos a taxas de fluxo elevadas. Este fator é composto por três domínios chamados Al, A2 e A3. Ele se liga ao colágeno através de seu domínio A3 e se liga ao receptor Gplb pelo seu domínio Al. O colágeno tipo III parece ter um único sítio, de alta afinidade, para o domínio A3 de vWF, que também está presente no colágeno tipo II. Esta porção peptídica está localizada entre os aminoácidos 403 e 413 e é composta por GPRGQOVMGFO, com certos aminoácidos críticos para a ligação ao FvW {Lisman T et al., Blood. Io Dez 2006; 108(12): 37536). Verkleij et al. identificaram como um sítio de ligação potencial os aminoácidos 541 a 558 compostos por GAAGPOGPOGSAGTOGLQ. {Verkleij et al., Blood. 15 Mai 1998; 91 (10): 3808-16) . Esta porção peptídica está localizada entre a porção vWF descrita por Lisman et al. e a porção de ligação αlβ2 à integrina GMOGER.

A equipe de Fauvel-Lafève descreveu a existência de um octapeptideo, KOGEOGPK, situado entre os aminoácidos 655 e 662 do fragmento al(III)CB4. 0 receptor plaquetário reconhecido por este octapeptideo foi identificado e nomeado TIIICBP (proteina de ligação ao colágeno tipo III) (Monnet E et al., J Biol Chem. 14 Ãbr 2000; 275(15): 109127) . Este octapeptideo é capaz de inibir a interação das plaquetas com o colágeno tipo III, mas não com colágeno tipo I, tanto em condições estáticas quanto fluidas. Mais recentemente, Pires et al. mostraram que este octapeptideo tem uma atividade inibitória sobre a agregação somente quando ele está na forma homotrimera. Pelo contrário, a sua estrutura em tripla hélice formada adicionando a estas extremidades cisteinas e GPP dá-lhe uma atividade pró- agregatória (Pires et al., Eur J Med Chem. Mai 2007; 42(5): 694-701) .

As propriedades biológicas e ultraestruturais dos colágenos, e notoriamente as suas capacidades de ligação aos receptores de membrana, abrem um vasto campo de aplicações por causa de suas múltiplas funções nos tecidos. No entanto, essas aplicações só têm sentido se for possível ter preparações homogêneas destes colágenos em grandes quantidades e de forma reprodutível.

Dois métodos de produção foram utilizados para esta finalidade. 0 trabalho e os desenvolvimentos realizados nessas duas áreas são geralmente altamente direcionados 5 para uma determinada aplicação. Assim, a síntese química pode produzir peptideos curtos que representam apenas uma pequena parte da proteína, em geral porções peptídicas de interesse. Sua principal aplicação refere-se à hemostasia e, mais precisamente, à modulação da ligação entre o 10 colágeno e as plaquetas.

No entanto, esses peptideos têm em geral apenas uma das atividades procuradas e isso pode depender da conformação tridimensional do peptideo e, notoriamente, da formação de uma tripla hélice. Assim, há uma necessidade 15 significativa pelo desenvolvimento de proteínas de colágeno recombinantes funcionalizadas que podem ser produzidas por sistemas biológicos que oferecem alta produtividade. Um grande obstáculo são as dificuldades de produção e purificação destas proteínas derivadas do colágeno devido 20 às suas tendências de agregar e aderir.

Até o momento sequências peptídicas curtas (menos de 50 aminoácidos) foram todas produzidas por síntese química, e não através de sistemas de produção celulares (Farndale et al., Biochem Soc Trans. Abr 2008; 36 (Pt 2): 241-50').

Além disso, estas porções foram sintetizadas de forma isolada. Por outro lado, a sintese de colágeno tipo III recombinante exibindo atividade de ligação plaquetária, foi realizada através de sistemas de produção celulares e é a 5 totalidade da sequência, por exemplo, proαl (III), que foi utilizada. 0 objetivo visado é a sintese de um procolágeno inteiro passiveis de ser organizado em uma tripla hélice (WO 9 307 889). Estes colágenos recombinantes têm em • principio aplicações múltiplas, nomeadamente aqueles da 10 sequência completa do colágeno.

É, portanto, uma questão de sintetizar proteinas menores de estrutura mais simples que sejam, portanto, menos exigentes em termos de produção, mas que preservem as atividades biológicas de interesse da proteina nativa.

Sumário da Invenção

A presente invenção, portanto, se refere às proteinas recombinantes que possuem as porções necessárias para obter uma atividade pró-agregadora, sintetizada na forma de um monômero incapaz de ser estruturado na forma de uma tripla 20 hélice. A impossibilidade de formar esta tripla hélice é a consequência da ausência de: I) porções de reconhecimento de cadeia o entre eles, II) dominios N- e C-terminais de colágeno não-helicoidais, bem como III), dois tripletes GPO necessários para a iniciação da tripla hélice.

Surpreendentemente, a atividade pró-agregadora é obtida na ausência da formação de uma tripla hélice.

O depositante demonstrou de maneira surpreendente que é possivel unir três tipos de sequências peptídicas dentro 5 de uma única proteína monomérica com atividade pró- agregadora .

As proteínas recombinantes da presente invenção, desta forma, reúnem: - porções de peptideo com pelo menos uma repetição dos 10 quatro tripletes GPO, - sequências peptídicas descritas como tendo atividade de ligação aos vários receptores plaquetários presentes na sequência de colágeno nativa, - sequências de ligação entre essas porções formadas 15 da repetição de tripletes GXY.

A produção dessas proteínas por bactérias e células de mamíferos faz com que seja possível ter em grandes quantidades esses colágenos recombinantes da nova geração, resultado da combinação de sequências de peptideo 20 semelhantes ao colágeno e sequências presentes sob a forma natural do colágeno. Estes tipos de proteínas não exigem o favorecimento de células que não produzam colágenos constitutivamente como células hospedeiras para essa produção. Na verdade, suas sequências não permitem o reconhecimento das cadeias alfa de vários colágenos nativos. Pelo contrário, é necessário favorecer as células produtoras de colágeno que expressam as enzimas-chave da maturação do colágeno, como prolil-4-hidroxilase (P4H) e 5 HSP47. Os sistemas de produção de colágeno recombinantes atuais, ao contrário utilizam células que não produzem naturalmente o colágeno {Olsen et al., Adv Drug Deliv Rev. 28 Nov 2003; 55(12): 1547-67 e Ruggiero e Koch, Methods. Mai 2008; 45(1): 75-85). Isso envolve co-tansfectar o gene 10 que codifica as enzimas como P4H.

As proteinas recombinantes de acordo com a presente invenção têm muitas vantagens, incluindo: - reúnem porções de interesse em pequenas proteinas que são mais fáceis de produzir utilizando sistemas de 15 produção celulares, - atividade pró-agregante, na ausência de uma estrutura de hélice tripla, - a ausência, em suas sequências de sitios de reconhecimento de colagenase, mas a presença de sitios de 20 reconhecimento de HSP47, permitindo as suas produções pelas células produtoras de colágeno, - as suas atividades biológicas demonstradas por testes de referência (testes de agregação plaquetária), que são usados para monitorar os atuais tratamentos antiplaquetários e para explorar as funções plaquetárias.

As propriedades biológicas das protèinas recombinantes de acordo com a presente invenção tornam possivel prever muitas aplicações.

A primeira aplicação diz respeito à utilização destas protèinas como ferramenta de diagnóstico na exploração da doença trombótica: testes de agregação plaquetária, modelos de trombose in vitro e avaliação da eficácia dos tratamentos antiplaquetários atuais (aspirina, clopidogrel) e futuros tratamentos. As protèinas produzidas são derivadas de protèinas humanas e têm em suas sequências sítios de ligação para certos receptores plaquetários descritos por seus papéis na adesão e ativação das plaquetas. Os testes atuais usam colágenos de origem animal, cujas sequências não têm perfeita homologia com as dos seres humanos. Além disso, a variação do número e localização dos sítios de interação do receptor plaquetário entre as várias proteínas torna possível propor testes de validação alvo relevantes. Há fragmentos de peptideos que 20 tornam possível trabalhar mais especificamente sobre cada receptor plaquetário, mas seus métodos de produção são diferentes da invenção, com a síntese química versus a produção natural por células (importância de modificações pós-tradução).

A presente invenção pode desempenhar uma parte na composição das bandagens hemostáticas (reforçando assim o recrutamento no sitio das plaquetas no caso de lesão vascular), ou dos adesivos hemostáticos para evitar o risco 5 de sangramento (contexto cirúrgico). Os produtos estão atualmente no mercado, mas com um colágeno de origem animal.

Outra aplicação é o uso destas proteinas para ativar a cicatrização. A cicatrização de certas feridas requer a 10 migração, adesão e diferenciação no sitio de certas populações de células, incluindo plaquetas. Estes processos são dependentes das integrinas de superficie dessas células. Certas porções peptidicas presentes na estrutura das proteinas da invenção são, assim, capazes de interagir 15 com estas integrinas, promovendo a cicatrização.

Em um campo muito próximo, estas proteinas recombinantes podem ser propostas na composição de alguns cremes dermatológicos.

Outra aplicação de proteinas que inibem a função 20 plaquetária é o tratamento da aterotrombose. Receptores plaquetários são alvos terapêuticos com um futuro para combater as complicações da doença aterotrombótica. Até o momento, não há nenhuma molécula capaz de bloquear a fase inicial da adesão plaquetária no subendotélio. As várias estruturas protéicas das proteínas da invenção permitem a interação destas com esses receptores, levando a efeitos anti-adesão de plaquetas (mascaramento de sítio) e/ou efeitos pró-adesão de plaquetas. Os vários efeitos podem 5 ser obtidos com a mesma proteína, modulando suas propriedades físico-químicas.

Esta invenção fornece, deste modo, um reagente biológico com inúmeras aplicações que podem desempenhar um papel na composição dos kits: para avaliar as funções 10 plaquetárias, para ativar a diferenciação de células para o diagnóstico de disfunções hematológicas, para detecção por áreas de imagem de fibrose. Esta invenção também pode entrar na composição de bandagens hemostáticas para o recrutamento no sítio de plaquetas (em caso de lesão 15 vascular), adesivos hemostáticos para evitar o risco de sangramento, ou cremes dermatológicos. Descrição das sequências SEQ ID No. 1: Proteína recombinante tipo Coll-III SEQ ID No. 2: Polinucleotídeo que codifica a proteína 20 recombinante tipo Coll-III SEQ ID Nos. 3 a 6: Iniciadores

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados que têm a sequência do polipeptídeo da SEQ ID No. 1 ou o polipeptideo da posição 25 até a posição 152 da SEQ ID No. 1. '

A presente invenção também diz respeito aos polipeptideos isolados com pelo menos 70% de identidade em 5 todo seu comprimento com o polipeptideo da SEQ ID N °1 ou com o polipeptideo da posição 25 até a posição 152 da SEQ ID No. 1, e capaz de induzir uma agregação de plaquetas de sangue humano superior a 30% em um agregômetro plaquetário a 37 °C com agitação de 1000 rpm. 10 Em uma modalidade preferida, estes polipeptideos compreendem as seguintes porções peptidicas: - GXIX2GER, em que Xi e X2 representam, independentemente, um aminoácido selecionado de A, R, N, D, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V e O; 15 (GPX3)n, com n entre 4 e 10 e X3 representando p ou O; - GPRGQX4GVMGFX5, onde X4 e X5 representam independentemente P ou O.

P é prolina e O é hidroxiprolina. 20 Em outra modalidade preferida, estes polipeptideos compreendem as seguintes partes peptidicas: - GAPGER, - KPGEPGPK, - (GPP)n com n entre 4 e 10, - RGD.

A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptideo de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, o polinucleotideo tem a sequência de polinucleotideo da SEQ ID No. 2. A invenção também se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptideo da SEQ ID N ° 1.

A presente invenção também se refere aos cassetes de 10 expressão que compreendem na direção de transcrição: - um promotor funcional em um organismo hospedeiro, um polinucleotideo de acordo com a presente invenção, uma sequência de terminação funcional no mesmo 15 organismo hospedeiro.

A invenção também se refere a um vetor compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e/ou um cassete de expressão de acordo com a invenção.

A invenção também se refere a um organismo hospedeiro 20 transformado com um polinucleotideo de acordo com a invenção, um cassete de expressão de acordo com a invenção e/ou um vetor de acordo com a invenção.

A invenção também se refere às composições para uso como um fármaco, que compreendem um polipeptideo de acordo com a invenção, urn polinucleotideo de acordo com a invenção, um cassete de expressão de acordo com a invenção, um vetor de acordo com a invenção e/ou um organismo hospedeiro de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, a invenção se refere às composições para o tratamento de doenças trombóticas. Em outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se às composições para o tratamento de distúrbios da hemostasia.

A presente invenção também se refere ao uso dessas composições como um agente de cicatrização. Por último, a invenção refere-se às composições cosméticas que compreendem um polipeptideo como descrito acima.

A presente invenção diz respeito aos polipeptideos isolados que têm a sequência do polipeptideo da SEQ ID No. 1 ou o polipeptideo da posição 25 até a posição 152 da SEQ ID No. 1.

O peptideo da posição 1 até a posição 24 da SEQ ID No. 20 1 corresponde ao peptideo sinal que permite a secreção de proteinas recombinantes por uma célula hospedeira. Este peptideo sinal pode estar ausente ou ser substituído por outro peptideo sinal de acôrdo com técnicas bem conhecidas para a pessoa versada na técnica. A pessoa versada na técnica será capaz de escolher o peptideo de sinal homólogo ou heterólogo adequado para a expressão e a secreção de polipeptideos da presente invenção em vários sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos. Preferivelmente, 5 os polipeptideos da presente invenção são produzidos em células eucarióticas, ou organismos e, em particular, em células de mamíferos. Em uma modalidade particular da invenção, os polinucleotideos da presente invenção compreendem um peptideo sinal que permite a secreção destes 10 no meio extracelular. Em outra modalidade, a invenção refere-se ao polipeptideo maduro obtido após clivagem do peptideo sinal.

Os polipeptideos da presente invenção têm uma atividade biológica e, notoriamente, uma atividade pró- 15 agregante nas plaquetas do sangue humano detectada usando um agregômetro de plaquetas (Regulest, Florange, França), de acordo com a técnica de referência (Born, 1962). Plasma rico em plaquetas (PRP) é colocado em contato com um agonista (10 μL em 290 μL de PRP) e a limpeza do meio 20 (relacionada com a formação de agregados que caem para o fundo do tubo) é monitorada em tempo real (curva de agregação). Na ausência da agregação plaquetária, o sinal permanece plano (meio turvo persistente) . É possivel verificar a ausência ou presença de agregados, através de exame do tubo no final da medição. A avaliação da resposta do. teste de agregação plaquetária é realizada a 37 °C, com . agitação continua (1000 rpm). O aparelho é calibrado da seguinte forma: agregação de 0% com plasma rico em 5 plaquetas (preparação obtida por centrifugação lenta e concentração ajustada para 300 x 109/L) e agregação de 100% com plasma pobre em plaquetas (preparação obtida por centrifugação rápida). A qualidade das preparações de plaquetas foi validada através da verificação da resposta 10 aos agonistas de referência (5 μM de ADP e 1 μg/mL de colágeno), utilizada para o desenvolvimento da terapêutica antiplaquetária. Uma proteina é considerada pró-agregante quando é capaz de induzir a agregação maior do que 30%, e de forma irreversível.

As porções do peptideo de reconhecimento do receptor expressas na superfície de muitos tipos celulares, conferem no polipeptideo atividade dos seguintes tipos: - adesão celular, - recrutamento de células.

O efeito pró-agregante do polipeptideo, independente de sua estrutura de tripla hélice, é a consequência da ativação de um ou mais receptores presentes na superfície plaquetária (αlβ2, TIIICBP e GPVI).

A presente invenção também se refere aos fragmentos do polipeptideo da SEQ ID No. 1 que preservam pelo menos uma das atividades do polipeptideo. da SEQ ID No. 1. 0 termo "fragmento" de um polipeptideo indica um polipeptideo compreendendo uma parte, mas não a totalidade do 5 polipeptideo a partir do qual é derivado. A invenção, portanto, refere-se a um polipeptideo compreendendo um fragmento de pelo menos 100, 110, 120, 130, 140 ou 150 aminoácidos do polipeptideo da SEQ ID No. 1.

Esses fragmentos do polipeptideo da SEQ ID No. 1 10 preservam pelo menos uma das atividades do polipeptideo da SEQ ID No. 1, na atividade pró-agregante particular nas plaquetas de sangue humano. A invenção refere-se, portanto, aos fragmentos biologicamente ativos do polipeptideo da SEQ ID No. 1. O termo "fragmento biologicamente ativo" indica 15 um fragmento de um polipeptideo que preserva a função do polipeptideo a partir do qual ele é derivado. Os fragmentos biologicamente ativos do polipeptideo da SEQ ID No. 1, assim, preservam pelo menos uma das funções deste polipeptideo e, de preferência, preservam todas as 20 atividades biológicas do polipeptideo da SEQ ID NO. 1. Os métodos para a preparação dos fragmentos de um polipeptideo, bem como as técnicas para medir as atividades biológicas dos polipeptideos da presente invenção, são bem conhecidos para um técnico versado no assunto. A invenção também se refere aos polipeptideos que têm pelo menos uma das atividades do polipeptideo da SEQ ID No. 1, e com aminoácidos pelo menos 70% idênticos ao polipeptideo da SEQ ID No. 1. Preferencialmente, estes polipeptideos têm as 5 mesmas propriedades e, notoriamente, as mesmas atividades biológicas que o polipeptideo da SEQ ID No. 1. A invenção refere-se aos polipeptideos com aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e, preferencialmente, pelo menos 99% idênticos ao polipeptideo da SEQ ID No. 1. "Aminoácidos 10 idênticos" significa aminoácidos que são invariáveis ou inalterado entre duas sequências. Estes polipeptideos podem ter uma exclusão, uma adição ou uma substituição de pelo menos um aminoácido em relação ao polipeptideo da SEQ ID No. 1.

A presente invenção também se refere aos polipeptideos com pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e, preferencialmente, pelo menos 99% de homologia com o polipeptideo da SEQ ID No. 1. "Homologia" significa a medida da semelhança entre as sequências de protèinas.

Estes polipeptideos podem ter uma exclusão, uma adição ou uma substituição de pelo menos um aminoácido em relação ao polipeptideo da SEQ ID No. 1. O grau de homologia entre duas sequências, quantificado por uma pontuação, é com base na porcentagem de identidades e/ou preservação das substituições das sequências.

Os polipeptideos da presente invenção com certo grau de homologia ou identidade com o polipeptideo da SEQ ID No. 1, compreendem, pelo menos, 100 ou 150 aminoácidos.

Métodos para medir e identificar o grau de identidade e o grau de homologia entre os polipeptideos são conhecidos . pelas pessoas versadas na técnica. A ferramenta de * alinhamento AlignX (algoritmo Clustal W) do pacote de > software Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com), por exemplo, pode ser usada, de preferência usando as configurações padrão.

Os polipeptideos de acordo com a presente invenção são isolados ou purificadas a partir de seu ambiente natural. Os polipeptideos podem ser preparados por meio de vários métodos. Estes métodos são, notoriamente, a produção de polipeptideos recombinantes por células hospedeiras adequadas e suas subsequentes purificações, a produção por sintese quimica ou, finalmente, uma combinação destas várias abordagens. Esses vários métodos de produção são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Preferivelmente, os polipeptideos da presente invenção são produzidos por células procarióticas ou eucarióticas recombinantes. Os polipeptideos da presente invenção podem, deste modo, ser produzidos em bactérias ou em células de mamiferos.

A presente invenção também se refere às proteínas de fusão, proteínas ou proteínas quiméricas compreendendo os polipeptídeos de acordo com a invenção. 0 termo "polipeptideo" indica proteínas, bem como polipeptídeos 5 modificados.

Em uma modalidade da presente invenção, os polipeptídeos de acordo com a invenção são glicosilados. 0 polipeptideo da SEQ ID No. 1 tem notoriamente sítios de 0- glicosilação nos ácidos aminados lisina presentes nas posições 102 e 141 (na posição 3 de um triplete GXY) . Em uma modalidade preferida, o resíduo de asparagina na posição 93 do polipeptideo da SEQ ID No. 1 é glicosilado.

A invenção também se refere aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos acima definidos. De acordo com a 15 presente invenção, "polinucleotídeo" significa uma cadeia de nucleotídeos de fita única ou o seu complemento de DNA ou RNA, ou uma cadeia de nucleotídeos de fita dupla que pode ser de DNA complementar ou genômico. Preferencialmente, os polinucleotídeos da invenção são DNA, 20 em particular DNA de fita dupla. 0 termo "polinucleotídeo" também significa polinucleotídeos modificados. Os polinucleotídeos da presente invenção são isolados ou purificados a partir de seu ambiente natural. Preferencialmente, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser preparados por técnicas de biologia molecular clássicas, como descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989) ou por sintese quimica.

Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere ao polinucleotideo da SEQ ID No. 2. Em uma segunda modalidade, a invenção refere-se ao polinucleotideo da SEQ ID No. 2, cuja sequência encontra-se entre a posição 73 e a posição 459 da SEQ ID No. 1. Estes polinucleotideos codificam os polipeptideos acima definidos.

A presente invenção também se refere aos polinucleotideos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% e, de preferência, 99% de identidade com o polinucleotideo da SEQ ID No. 2 ou com o polinucleotideo cuja sequência se encontra entre a posição 73 e a posição 459 da SEQ ID No. 2. Estes polinucleotideos codificam de preferência um polipeptideo que preserva as atividades biológicas do polipeptideo da SEQ ID No. 1.

"Nucleotideos idênticos" significa nucleotideos que são invariáveis ou inalterados entre duas sequências. Estes 20 polinucleotideos podem ter uma exclusão, uma adição ou uma substituição de pelo menos um nucleotideo em comparação com o polinucleotideo de referência.

A presente invenção também refere-se aos polinucleotideos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% e, de preferência, pelo menos 99% de homologia com o polinucleotideo da SEQ ID NO. 2 ou com o polinucleotideo cuja sequência encontra-se entre a posição 73 e a posição 459 da SEQ ID No. 2. Estes polinucleotideos codificam de 5 preferência um polipeptideo que preserva as atividades biológicas do polipeptideo da SEQ ID No. 1.

"Homologia" significa a medida da semelhança entre as sequências nucleicas. Estes polinucleotideos podem ter uma » exclusão, uma adição ou uma substituição de pelo menos um nucleotideo em comparação com o polinucleotideo de referência. 0 grau de homologia entre duas sequências, quantificado por uma pontuação, é com base na porcentagem de identidades e/ou substituições de preservação das sequências.

Métodos para medir e identificar o grau de identidade e do grau de homologia entre as sequências de ácidos nucleicos são bem conhecidos para a pessoa versada na técnica. A ferramenta de alinhamento AlignX (algoritmo Clustal W) do pacote de software Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com), por exemplo, pode ser usada, de preferência usando os parâmetros predefinidos.

A presente invenção também se refere aos polinucleotideos capazes de hibridizar seletivamente com o polinucleotídeo da SEQ ID NO. 2 ou com o polinucleotídeo cuja seqüência encontra-se entre a posição 73 e a posição 459 da SEQ ID No. 2. De preferência, a hibridização seletiva é realizada sob condições de estringência média e preferencialmente sob condições de alta estringência. Estes polinucleotídeos codificam de preferência polipeptídeos tendo as atividades biológicas do polipeptideo da SEQ ID i 1 No. 1. "Sequência capaz de hibridar seletivamente" ’ significa, de acordo com a presente invenção, as sequências que hibridizam com a sequência de referência a um nível significativamente maior do que o ruído de fundo. O nível do sinal gerado pela interação entre a sequência capaz de hibridizar seletivamente e as sequências de referência é geralmente 10 vezes mais intenso, de preferência 100 vezes mais intenso do que o da interação das outras sequências de DNA que geram o ruído de fundo. As condições de hibridização estringentes que permitam a hibridização seletiva são bem conhecidas para as pessoas versadas na técnica. Em geral, a temperatura de hibridação e lavagem é pelo menos 5 °C mais baixa do que a Tm da seqüência de referência em um dado pH e para uma determinada força . iônica. Tipicamente, a temperatura de hibridização é de pelo menos 30 °C para um polinucleotídeo de 15 a 50 nucleotídeos, e de pelo menos 60 °C para um polinucleotídeo de mais de 50 nucleotideos. Por exemplo, a hibridação é realizada no seguinte tampão: 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA, 500 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado.

Lavagens, por exemplo, são realizadas sucessivamente,, com baixa estringência em 2X SSC, tampão SDS 0,1%, com estringência média em 0,5X SSC, 0,1% de tampão SDS e com alta estringência em 0,lX SSC, 0,1% de tampão SDS. A hibridização pode naturalmente ser realizada de acordo com 10 outros métodos comuns conhecidos para as pessoas versadas na técnica (ver, em particular Sambrook et al., Molecular Cloning: At Laboratory Manual, 1989). Preferencialmente, os polinucleotideos que hibridizam seletivamente a um polinucleotideo de referência preservam a função da 15 sequência de referência.

A presente invenção de forma geral se refere aos polinucleotideos que codificam os polipeptideos de acordo com a invenção. Devido à degeneração do código genético, diferentes polinucleotideos podem codificar o mesmo 20 polipeptideo.

A invenção também se refere a uma ligação do anticorpo especificamente ao polipeptideo da SEQ ID N ° 1.

"Ligação especificamente" significa que esses anticorpos se ligam apenas ao polipeptideo da SEQ ID N ° 1.

Em particular, os anticorpos não se ligam aos outros antigenos e, notoriamente, não a outras proteinas colagenosas.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção são preferencialmente anticorpos monoclonais específicos, notoriamente de origem murina, quiméricos ou humanizados que poderiam ser obtidos de acordo com métodos padrões bem conhecidos para a pessoa versada na técnica.

Em geral, as técnicas para a preparação de anticorpos monoclonais ou os seus fragmentos funcionais, notoriamente de origem murina, podem ser selecionadas dentre aquelas descritas em particular no manual de Anticorpos (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, p. 726, 1988) ou a técnica de preparação à base de hibridoma bem conhecida pela pessoa versada na técnica. "Anticorpo" significa também anticorpos quiméricos ou humanizados.

A invenção também se refere aos cassetes de expressão que compreendem na direção de transcrição: - um promotor funcional em um organismo hospedeiro, - um polinucleotideo de acordo com a invenção, uma sequência de terminação funcional no mesmo organismo hospedeiro.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de acordo com a invenção é inserido em um cassete de expressão usando técnicas de clonagem bem conhecidas pela pessoa versada na técnica. Este cassete de expressão compreende os elementos 5 necessários para a transcrição e tradução das sequências que codificam os polipeptídeos de acordo com a invenção.

Vantajosamente, este cassete de expressão compreende, ao mesmo tempo, elementos que fazem com que uma célula hospedeira produza um polipeptideo e elementos necessários 10 à regulação desta expressão.

Qualquer tipo de sequência promotora pode ser usada nos cassetes de expressão, de acordo com a invenção. A escolha do promotor vai depender notoriamente do organismo hospedeiro escolhido para a expressão do gene de interesse.

Certos promotores permitem expressão constitutiva, enquanto que outros promotores são, ao contrário, induzíveis. Entre os promotores funcionais em bactérias, aquele da RNA polimerase do bacteriófago T7 pode ser citado em particular. Entre os promotores funcionais em leveduras, o promotor do gene GAL1 ou os promotores GAL4 e ADH de S. cerevisiae podem ser citados. Dentre os promotores funcionais em células eucarióticas superiores e notoriamente em células de mamíferos, CMV (citomegalovírus), SV40, o RSV (vírus do sarcoma de Rous), beta-actina humana ou de galinha, beta-globina, PGK (fosfogliceratoquinase), EFlalfa, timidina quinase e MMTV (virus do tumor mamário de camundongo) podem ser citados. Todos estes promotores são descritos na literatura e são 5 bem conhecidos para a pessoa versada na técnica.

Cassetes de expressão, de acordo com a presente invenção, podem ainda incluir qualquer outra sequência necessária para a expressão de polipeptideos ou polinucleotideos como, por exemplo, elementos de regulação 10 ou sequências de sinais que permitem a secreção de polipeptideos produzidos pelo organismo hospedeiro. Qualquer sequência de regulação que aumente o nível de expressão da sequência codificadora inserida no cassete de expressão pode ser nomeadamente utilizada. De acordo com a invenção, outras sequências de regulação, que estão localizadas entre o promotor e a sequência de codificação, tais como ativadores de transcrição ("intensificadores"), podem notoriamente ser utilizadas em combinação com a sequência reguladora do promotor.

Uma grande variedade de sequências de terminação pode ser usada nos cassetes de expressão, de acordo com a invenção; estas sequências permitem o término da transcrição e poliadenilação do RNAm. Qualquer sequência de terminação funcional no organismo hospedeiro selecionado pode ser utilizada.

A presente invenção também se refere a um polinucleotideo compreendendo um cassete de expressão de acordo com a invenção, vantajosamente os cassetes de 5 expressão de acordo com a presente invenção são inseridos em um vetor.

A presente invenção, assim, também se refere aos vetores de replicação ou expressão para a transformação de um organismo hospedeiro que compreende pelo menos um 10 polinucleotideo ou cassete de expressão de acordo com a presente invenção. Este vetor pode notoriamente corresponder a um plasmideo, um cosmideo, um bacteriófago ou um virus no qual está inserido um polinucleotideo ou um cassete de expressão de acordo com a invenção. As técnicas 15 para a construção desses vetores e para a inserção nesses vetores de um polinucleotideo da invenção são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Geralmente, qualquer vetor capaz de ser mantido, capaz de se auto- replicar ou capaz de se propagar em uma célula hospedeira 20 para induzir notoriamente a expressão de um polinucleotideo ou um polipeptideo pode ser usado. A pessoa versada na técnica irá escolher vetores adequados de acordo com o organismo hospedeiro a ser transformado, e de acordo com a técnica de transformação utilizada.

Os vetores da presente invenção são notoriamente usados para transformar um organismo hospedeiro, com vista à replicação do vetor e/ou a expressão de um polipeptideo de acordo com a invenção no organismo hospedeiro.

A presente invenção também se refere a um método para preparar um polipeptideo de acordo com a invenção compreendendo as seguintes etapas: - um organismo hospedeiro é transformado com um vetor de expressão compreendendo um cassete de expressão de acordo com a invenção e/ou com um polinucleotídeo de acordo com a invenção, - os polipeptídeos produzidos pelo organismo hospedeiro são isolados.

A presente invenção também se refere a um método para transformar um organismo hospedeiro através da integração no organismo hospedeiro anteriormente referido de pelo menos um polinucleotídeo ou cassete de expressão ou vetor de acordo com a invenção. O polinucleotídeo pode ser integrado no genoma do organismo hospedeiro ou replicado, de forma estável, no organismo hospedeiro. Métodos para transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos para a pessoa versada na técnica e são amplamente descritos na literatura.

A presente invenção também se refere a um organismo hospedeiro transformado com um polinucleotideo, cassete de expressão ou vetor de acordo com a invenção. "Organismo hospedeiro" significa, em particular de acordo com a invenção, qualquer organismo unicelular ou multicelular, 5 inferior ou superior, em particular selecionado a partir de bactérias, leveduras e células de eucariotos superiores, em particular as células de mamiferos, tais como CHO (células de ovário de hamster chinês), BHK (rim de hamster jovem), HEK-293 (linhagem celular de rim embrionária humana), NSO 10 (linhagem de células de mieloma de camundongo), Per.C6 (Crucell), e YB2/0 (ATCC No. CRL 1662). "Organismo hospedeiro" significa um organismo não-humano.

A invenção também se refere às composições para uso como um fármaco que compreende um polipeptideo de acordo 15 com a invenção, um polinucleotideo de acordo com a invenção, um cassete de expressão de acordo com a invenção, um vetor de acordo com a invenção e/ou um organismo hospedeiro de acordo com a invenção. A presente invenção, assim, também se refere com as composições farmacêuticas 20 compreendendo um polipeptideo de acordo com a invenção, um polinucleotideo de acordo com a invenção, um cassete de expressão de acordo com a invenção, um vetor de acordo com a invenção e/ou um organismo hospedeiro de acordo com a invenção.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere às composições para a prevenção e/ou tratamento de tromboses.

Em outra modalidade, a presente invenção se refere às 5 composições para a prevenção ou o tratamento de distúrbios da hemostasia.

A invenção também se refere às ditas composições para o uso como um agente de cicatrização.

Em outra modalidade, as composições da invenção podem também ser usadas como: - reagentes de diagnóstico para detectar: • certas disfunções plaquetárias • doenças hematológicas - componentes ativos de bandagens hemostáticas e adesivos 15 na composição de cremes dermatológicos e cosméticos.

A presente invenção também se refere aos métodos terapêuticos para o tratamento de tromboses compreendendo a administração a um individuo de uma quantidade efetiva de um polipeptideo de acordo com a invenção, um polinucleotideo de acordo com a invenção, um cassete de expressão de acordo com a invenção, um vetor de acordo com a invenção e/ou um organismo hospedeiro de acordo com a invenção.

A presente invenção se refere, por fim, ao uso dos polipeptídeos, polinucleotídeos e organismos hospedeiros transformados da presente invenção para a fabricação de fármacos.

A invenção refere-se às composições farmacêuticas compreendendo um polipeptideo, polinucleotídeo ou organismo hospedeiro transformado, tal como definido na presente invenção, e um excipiente farmacêutico adequado.

As ditas composições podem ser formuladas para a administração aos mamíferos, incluindo seres humanos. 0 regime de dosagem varia de acordo com o tratamento e a doença em questão. As ditas composições são preparadas de tal forma a poder ser administradas por via digestiva ou parenteral.

Nas composições farmacêuticas da presente invenção para a administração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local ou retal, o ingrediente ativo pode ser administrado na forma de unidades de administração, em mistura com os veículos farmacêuticos clássicos, aos animais ou aos seres humanos.

Formas de unidade adequadas de administração compreendem formas por via oral, como comprimidos, cápsulas de gelatina, pós, grânulos e soluções orais ou suspensões; formas sublingual e bucal de administração; formas subcutânea, intramuscular, intravenosa, intranasal intraocular de administração; e as formas retais de administração.

Quando uma composição sólida na forma de comprimido é preparada, o principal ingrediente ativo é misturado com um 5 excipiente farmacêutico, tal como gelatina, amido, lactose, estearato de magnésio, talco, goma arábica ou análogos. Os comprimidos podem ser revestidos com sacarose ou outros materiais adequados ou podem ser tratados de tal forma que eles tenham atividade prolongada ou retardada e que 10 continuamente liberem uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo.

Uma preparação em cápsulas de gelatina é obtida pela mistura do ingrediente ativo com um diluente e vertendo a mistura obtida em cápsulas de gelatina moles ou duras.

Uma preparação em forma de xarope ou elixir pode conter o ingrediente ativo junto com um adoçante, um antisséptico, assim como um agente flavorizante e um corante adequado.

Pós ou grânulos dispersiveis em água podem conter o ingrediente ativo em mistura com agentes de dispersão ou umectantes, ou agentes de suspensão, bem como os corretores de aroma ou adoçantes.

A invenção também se refere às composições cosméticas que compreendem um polipeptideo como descrito acima.

Essas composições podem ainda incluir ingredientes ativos classicamente utilizados na dermatologia como emolientes, ingredientes ativos de hidratantes, agentes de reestruturação da barreira cutânea, anti-irritantes e 5 agentes suavizantes. As composições cosméticas de acordo com a invenção podem ser formuladas na forma de várias preparações adequadas para aplicação tópica. De acordo com uma modalidade preferida, as diversas preparações são adequadas para aplicação tópica e incluem cremes, emulsões, leites, pomadas, loções, óleos, soluções aquosas ou de hidroálcool ou glicólicas, pós, sprays, geleias, géis, hidrogéis ou qualquer outro produto para aplicação externa. Estas composições cosméticas também podem conter antioxidantes, conservantes, etc. A invenção ainda refere- 15 se a um método de tratamento cosmético, de cuidados de higiene ou embelezamento e/ou a um método para perfumar a mucosa e/ou pele que é normal, seca, oleosa, mista, desidratada, envelhecida, sensivel, irritada, desconfortável, intolerante, com um desequilíbrio 20 relacionado com o envelhecimento intrínseco, extrínseco ou hormonal, ou relacionado ao ataque exogênico (de poluentes, UV, estresse, etc.), com tendência alérgica, ou com distúrbios de pigmentação, caracterizado pelo fato de que consiste na aplicação de uma composição de acordo com a invenção.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é a Expressão de RNA mensageiro que codifica a proteina em células CHO-S aderentes 5 transfectadas de forma transitória.

A Figura 2 representa a agregação plaquetária induzida pelo meio condicionado (CM) de células CHO-S aderentes, transfectadas de maneira transitória, na presença ou ausência de epinefrina.

A Figura 3 representa a expressão do RNA mensageiro que codifica a proteina em um clone de célula estável. A Figura 4 apresenta a detecção por Western blotting da presença da proteína-6X-histidina em várias frações bacterianas obtidas após a purificação.

A Figura 5 mostra a agregação plaquetária induzida pela proteina produzida em bactérias. A Figura 6 mostra a validação por Western blotting da especificidade do soro de coelho obtido após 89 dias da imunização.

EXEMPLOS

A. Produção transitória pelas células de mamíferos 1. Construção do vetor Plasmídeo 1 (NVH001-A)

Plasmídeo NVH001-A contém os seguintes elementos: - um intron do plasmideo pCIneo (Promega: vetor de expressão de mamífero pCIneo) - a proteína da invenção NVH001 do vetor pUC57-NVH001 (encomendado de GeneCust) e possuindo o peptideo de sinal 5 de colágeno tipo III (NP_000081) - uma cauda poli-A de RNAm de hGH (NM_000515) - um promotor CMV de pCDFl-MCSl-EFl-copGFP (System Biosciences: Lentivetores de clonagem e expressão de DNAc pCDF). 10 Plasmideo 2 (NVH001-B1), 3 (NVH001-B2), 4 (NVH001-C1) e 5 (NVH001-C2)

Plasmideos NVH001-B1 e C1-NVH001 contêm os seguintes elementos: - uma origem SV40 do plasmideo derivado pSV2-Neo (ori 15 SV40:l-989 no vetor ATCC 37149) - um promotor/intensificador que pode ser um daqueles descritos em Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3a edição, Sambrook e Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press 20 - um cassete de higromicina de pMono-hygro-mcs (Invivogen) - as proteínas da invenção NVH001 do vetor pUC57- NVH001 (encomendadas de GeneCust) e possuindo o peptideo de sinal de colágeno tipo III (NP__000081) um C-propeptideo do plasmideo pUC57-proC (encomendada do GeneCust) - uma cauda polyA de RNAm de hGH (NM_000515).

Plasmideos NVH001-B2 e NVH001-C2 contêm os mesmos 5 elementos que os plasmideos NVH001-B1 e Cl, exceto o propeptideo-C. Todos os plasmideos finais são sequenciados para verificar que nenhuma mutação foi introduzida no DNA da proteina de interesse e nos elementos fornecidos. 10 2. Transfecção de células de mamiferos

Plasmideo 1 (NVH001-A) 1. Vetor NVH001-A é transfectado, de forma transitória, em células CHO-S tornadas aderentes e cultivadas em meio RPMI contendo 5% de soro de bezerro 15 fetal utilizando o kit Lipofectamine 2000 da Invitrogen. 2. Os sobrenadantes de cultura são coletados nos dias 3 e 4, as proteinas produzidas são purificadas e, depois, suas atividades de ligação plaquetárias são testadas usando um agregômetro. 20 Plasmideo 2 (NVH001-B1) , 3 (NVH001-B2) , 4 (NVH001-C1) e 5 (NVH001-C2) 1. Vetores NVH001-B1, NVH001-B2, NVH001-C1 e NVH001-C2 são transfectados de forma transitória em células CHO-S tornadas aderentes e cultivadas em meio RPMI contendo 5% de soro de bezerro fetal, utilizando o kit Lipofectamine 2000 da Invitrogen.

O RNA das células transfectadas são extraidos nos dias 1, 2, 3, 4 e 5, pela adição de 800 μL de TRIZOL (Invitrogen). Os DNAcs correspondentes são obtidos por transcrição reversa a partir de 1 μg de RNA total. A amplificação por PCR foi realizada no DNAc. Os amplicons são a seguir detectados após a migração em um gel de agarose a 2% durante 30 minutos a 125 V. Um controle 10 positivo (plasmídeo transfectado) e um controle negativo também foram realizados. O marcador de peso molecular (à esquerda) é usado para verificar o tamanho do amplicon. Expressão nas células transf ectadas com RNArn que codifica a proteína da invenção é observada a partir do dia 15 1. Esta expressão aumenta ligeiramente ao longo do tempo e é mantida após 5 dias. O progresso da expressão do RNArn é representado na Figura 1. 2. Os sobrenadantes de cultura são coletados nos dias 3 e 4, as proteínas produzidas são purificadas e, a seguir, 20 suas atividades de ligação plaquetária são testadas usando um agregômetro. 3. Atividade biológica da proteína da invenção: agregação plaquetária

A atividade de ligação plaquetária da proteína da invenção é avaliada por agregometria. As amostras de sangue em tubos de citrato, coletadas a partir de doadores voluntários saudáveis após consentimento por escrito, são centrifugadas a 150 g por 15 minutos para a obtenção de I plasma rico em plaquetas (PRP). A concentração é ajustada para 300 giga/L. Os testes de agregação são realizados usando um agregômetro de plaquetas Regulest®, com agitação (1000 rpm) a 37 °C. Esta técnica se baseia na leitura fotométrica de acordo com o método Born, que consiste na 10 medição da evolução da transmissão de luz de um meio turvo,

PRP, em resposta a um ativador de função plaquetária. Se agregados plaquetários são formados, o meio é limpo e um aumento na transmissão de luz é observado. Uma molécula é considerada como tendo um efeito pró-agregante quando um 15 aumento de mais de 30% é observado nesta transmissão associada com uma interrupção na inclinação correspondente a esta depuração.

A Figura 2 representa a agregação plaquetária induzida pelo meio condicionado de células CHO-S aderentes, 20 transfectadas de maneira transitória, na presença ou ausência de epinefrina.

A mistura reacional é composta de 2 90 μL de PRP ao qual é adicionado 30 μL de meio condicionado na presença ou ausência de 0,1 μM de epinefrina. A resposta plaquetária é medida por 10 minutos. A auto-agregação (-o-) define a linha de base. Adição de 0,1 μM de epinefrina induz um leve deslocamento da linha de base, estável por 10 minutos (-•- ). A adição de 30 μL meio condicionado induziu uma resposta limitada (18%) após 2 minutos (-V-). Esse deslocamento é estável durante os 10 minutos de observação. A adição de epinefrina por 2 minutos, seguido pela adição de 30 μL de meio condicionado induziu a agregação plaquetária total em 5 minutos (-▼-). Esta agregação não é reversível, sugerindo 10 que os agregados formados são estáveis.

Adicionando 30 μL de meio condicionado de células CHO- S aderentes não-transfectadas não induz a agregação (resultado não apresentado).

B. Produção estável de células de mamíferos

1. Construção de vetor Plasmideo 1 (NVH001-A) 1. A unidade intron-NVHOOl-hGHpA é removida do vetor construído para a expressão transitória e é clonada em um vetor de produção contendo um cassete de higromicina de 20 pMono-higro-mcs (Invivogen). 2. O vetor final é sequenciado para verificar que nenhuma mutação foi introduzida no DNA da proteína de interesse e nos elementos fornecidos. 3. 0 vetor linearizado é transferido de forma estável em células CHO tornadas aderentes utilizando o kit de Lipofectamina 2000 de Invitrogen. As células transfectadas são selecionadas por niveis progressivos de higromicina B. 5 A Figura 3 representa a expressão do RNA mensageiro que codifica a proteina em um clone de célula estável.

RNA celulares são extraidos nos dias 1, 2, 3 e 4 pela adição de 800 μL de TRIZOL (Invitrogen). Os DNAc correspondentes são obtidos por transcrição reversa a partir de 1 μg de RNA total. A amplificação por PCR foi realizada em DNAc utilizando os iniciadores 5'- AGCTGGCGCGCCGCCACCATG-3' (S) e 5'- GCTTCCGGGAGGCCCTGGCTTCCCATC-3' (AS) . Os amplicons são a seguir detectados após a migração em um gel de agarose 2% durante 30 minutos a 125 V. Um controle positivo, correspondente ao DNA do plasmideo, é usado. O marcador de I peso molecular (à direita) é usado para verificar o tamanho do amplicon. A expressão estável é observada no clone celular.

C. Produção em bactérias

1. Construção O DNA da molécula de interesse (NVH001) é amplificado por PCR no vetor pUC57-NVH001 usando o iniciador tagNVHOOl- sentido: GCTGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGTCGCCCGGGAGCTCCTGGAGA GAGAGGATTG e o iniciador tagNVHOOl-anti-sentido: GCACGGATCCTATTAGCCAGGGCAAGGTCCAGGGGCTC, que torna possivel a adição de uma etiqueta de βX-histidina no lado N-terminal 5 da proteina NVH001. Os produtos de PCR são clonados no vetor pET3d (pET3d-NVH001) permitindo a produção da molécula em bactérias (New England Biolab).

A presença e a sequência correta do DNA são verificadas pelo sequenciamento. 2. Produção 1. O vetor pET3d-NVH001 é transfectado em bactérias BL21 que permitem a produção em massa de protèinas. 2. As bactérias são inoculadas em 1 L de meio nutritivo e são incubadas a 37 °C até ODgoonm ser obtida em 15 que as bactérias estejam em fase exponencial. 3. Produção de proteina é induzida por IPTG durante 5 horas a 30 °C. 4. As bactérias são peletizadas, lisadas e a proteina da invenção é purificada na fração solúvel (sobrenadante) e 20 insolúvel (corpo de inclusão) das bactérias em colunas de etiqueta anti-6X-histidina de Macherey-Nagel.

A Figura 4 mostra a detecção por Western blotting da presença da proteina-6X-histidina em várias frações bacterianas obtidas após a purificação. * 40 μL de cada fração obtida após eluição da coluna de etiqueta anti-6X-histidina é depositado em gel de poliacrilamida 16%. A eletroforese é realizada em tampão de migração (glicina 192 mM, Tris-HCl 25 mM pH 6,8 e 0,1% de SDS) a 18 mA, com a presença de marcadores de peso molecular (Amersham) utilizando o sistema de migração Mini- Protean 3 (Biorad). As proteinas separadas no gel são transferidas em uma membrana PVDF (BioRad) por 60 min a 70 V. A ligação não-especifica é bloqueada pela incubação da membrana por 120 min a 37 °C e com agitação, em uma solução salina de Tris + 0,1% de Tween-20 (TBS-T) contendo 5% de leite desnatado. A membrana é, a seguir, incubada de um dia para o outro a 4 °C com um anticorpo monoclonal de etiqueta anti-6X-histidina (Sinalização Celular) diluida a 1/1000 em TBS-T. Após 3 lavagens de 5 minutos em TBS-T, a membrana é incubada por 60 minutos em temperatura ambiente em um anticorpo anti-camundongo conjugado com peroxidase (Jackson Laboratories) diluida a 1/10.000. A membrana é novamente lavada três vezes por 5 minutos em TBS. O resultado é visualizado pela técnica de quimiluminescência com o kit ECL (Amersham).

A presença de proteinas é observada em várias frações. A banda principal obtida com um peso molecular de aproximadamente 19 KDa corresponde à forma monomérica da proteína. Bandas também podem ser observadas em certas fracções correspondentes às proteínas com pesos moleculares de 26 KDa, 43 KDa e 60 KDa.

3. Demonstração de sua atividade biológica: agregação 5 plaquetária

A atividade de ligação plaquetária da proteína da invenção é avaliada por agregometria. As amostras de sangue em tubos de citrato, coletados de doadores voluntários saudáveis após consentimento por escrito, são centrifugadas 10 a 150 g por 15 minutos para a obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP). A concentração é ajustada para 300 giga/L. Os testes de agregação são realizados usando um agregômetro de plaquetas Regulest®, com agitação (1000 rpm) a 37 °C. Esta técnica se baseia na leitura fotométrica de acordo com 15 o método Born, que consiste em medir a evolução da transmissão de luz através do PRP, que começa como um meio turvo, em resposta a um ativador plaquetário. Se agregados plaquetários são formados, o meio fica mais límpido e um aumento na transmissão da luz é observado. Uma molécula é 20 considerada como tendo um efeito pró-agregador quando um aumento de mais de 30% é observado nesta transmissão associada com uma quebra na inclinação correspondente a esta depuração.

A Figura 5 mostra a agregação plaquetária induzida pela proteina produzida em bactérias.

As diversas frações eluidas da coluna de etiqueta anti-6X-histidina que contêm a proteina detectada por Western blotting são recolhidas e um liofilizado é obtido 5 por centrifugação. Parte deste liofilizado é incubado na presença de glutaraldeido 0,25% por 3 horas a 4 °C e, a seguir, dialisado de um dia para o outro contra IX PBS a 4 °C antes de sua utilização em agregometria.

A mistura reacional é composta de 290 μL de PRP ao 10 qual é adicionado 30 μL de PBS contendo a proteina. A resposta plaquetária é medida por 25 minutos. As linhas marcadas com -o- e -V- apresentam a resposta obtida após a adição de uma solução de PBS e de PBS-glutaraldeido dialisado, respectivamente: nenhuma agregação é observada.

A adição de PBS contendo a proteina não agregada por glutaraldeido (-▼-) ou agregado por glutaraldeido e dialisado (-•-) mostra agregação significativa 10 minutos após eles terem sido adicionados. Esta agregação atinge 90% (-▼-) e 100% (-•-), respectivamente, após 20 minutos.

D. Produção de anti-proteina do anticorpo de interesse em coelhos 1. A proteina é produzida em grande quantidade nas bactérias BL21, como descrito anteriormente. 2. Dois coelhos são imunizados 4 vezes em intervalos de 3 semanas, isto é, em DO, D21, D42 e D63, com a proteina purificada suplementada (v/v) com o adjuvante de Freund. 3. Os coelhos são sacrificados ao final do protocolo 5 em D89 e os soros são recuperados por centrifugação após a sangria dos animais. 4. As IgGs são purificadas por cromatografia de afinidade em coluna especifica a fim de eliminar as proteinas plasmáticas.

A Figura 6 mostra a validação por Western blotting da especificidade do soro de coelho obtido após 89 dias da imunização. 10 μL de duas preparações de proteinas produzidas em bactérias, cuja atividade agregadora foi validada pela agregometria, é depositado em gel de poliacrilamida 16%. A eletroforese é realizada em tampão de migração (glicina 192 mM, Tris-HCl 25 mM pH 6,8 e SDS a 0,1%) a 18 mA, com a presença de marcadores de peso molecular (Amersham) utilizando o sistema de migração Mini-Protean 3 (Biorad).

As proteinas separadas no gel são transferidas em uma membrana PVDF (BioRad) por 60 min a 70 V. A ligação não- especifica é bloqueada pela incubação da membrana por 120 min a 37 °C e com agitação, em uma solução salina de Tris + Tween-20 0, 1% (TBS-T) contendo 5% de leite desnatado., A membrana é, então, incubada de um dia para o outro a 4 °C ou com soro de coelho, retirado no D89 do protocolo de imunização e diluído a 1/100, ou com um anticorpo monoclonal de etiqueta anti-6X-histidina (Cell Signaling) 5 diluído a 1/1000 em TBS-T. Após 3 lavagens de 5 minutos em I TBS-T, a membrana é incubada por 60 minutos em temperatura ambiente, em um anticorpo anti-camundongo ou anti-coelho conjugado com peroxidase (Jackson Laboratories) diluído a ! 1/10.000. A membrana é novamente lavada três vezes por 5 minutos em TBS. O resultado é visualizado pela técnica de quimiluminescência com o kit ECL (Amersham).

A visualização mostra a presença de uma banda dupla, presente nas duas preparações de proteínas (A, poços 1 e 2), com um peso molecular de 60 KDa. Esta banda também é ; 15 detectada pelo anticorpo de etiqueta anti-6X-histidina, mostrando que é realmente a proteína da invenção (B, poços 1 e 2) . Deve-se observar que nós não mais observamos as outras bandas detectadas pelo anticorpo de etiqueta anti- 6X-histidina nas frações purificadas de bactérias. Este 20 resultado sugere que a imunização foi eficaz apenas para a forma multimérica da proteína da invenção ou que a proteína da invenção e montada em um multímero, uma vez purificada. Referências Asselin et al., Biochem J. 15 Abr 1999; 339(Pt 2): 413-8 Born et al., Nature Junho 1962, 194: 927-9 Boudko e Engel, J Mol Biol. 30 Jan 2004; 335(5): 1289- 97 5 Bulleid et al., EMBO J. 17 Nov 1997; 16(22): 6694-701 Bulleid et al., Biochem J. Io Jul 1996; 317 (Pt l):195-202

Farndale et al., Biochem Soc Trans. Abril 2008; 36 (Pt 2): 241-50 Hulmes DJ, J Struct Biol. Janeiro-Fevereiro 2002; 137(1-2): 2-10 Jarvis et al., Blood. 15 Mai 2008; 111(10): 4986-96 Kim et al., J Biol Chem. 16 Set 2005; 280(37): 32512- 20 15 Lisman T et al., Blood. Io Dez 2006; 108(12): 3753-6 McAlinden et al., J Biol Chem. 24 Out 2003; 278(43): 42200-7 Monnet E et al., J Biol Chem. 14 Abr 2000; 275(15): 10912-7 20 Morton et al., Biochem J. Io Mar 1995; 306(Pt 2): 337- 44 Olsen et al., Adv Drug Deliv Rev. 28 Nov 2003; 55(12): 1547-67 Pires et al., Eur J Med Chem. Maio de 2007; 42(5): 56 694-701 Raynal et al., J Biol Chem. 17 Fev 2006; 281(7): 3821- 31 Ruggiero e Koch, Methods. Maio de 2008; 45(1): 75-85 5 Smethurst et al., J Biol Chem. 12 Jan 2007; 282(2): 1296-304 Verkleij et al., Blood. 15 Mai 1998; 91(10): 3808-16.

Claims

1. Polipeptídeo isolado caracterizado pelo fato de que consiste da sequência do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou o polipeptídeo da posição 25 até a posição 152 da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele é capaz de induzir uma agregação de plaquetas do sangue humano superior a 30% em um agregômetro de plaquetas a 37 °C com agitação de 1000 rpm.

3. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ele compreende pelo menos as seguintes partes do peptídeo: - GX1X2GER, em que X1 e X2 representam, independentemente, um aminoácido selecionado de A, R, N, D, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V e O; - (GPX3) n com n entre 4 e 10 e X3 representando P ou O; - GPRGQX4GVMGFX5, em que X4 e X5 representam independentemente P ou O.

4. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ele compreende pelo menos as seguintes partes do peptídeo: - GAPGER, - KPGEPGPK, - (GPP)n com n entre 4 e 10, - RGD.

5. Polinucleotídeo isolado caracterizado pelo fato de que consiste da sequência do polinucleotídeo da SEQ ID No. 2 que codifica um polipeptídeo conforme definido pelas reivindicações 1 a 4.

6. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de compreender na direção de transcrição: - um promotor funcional em um organismo hospedeiro, - o polinucleotídeo, conforme definido pela reivindicação 5; - uma sequência de terminação funcional no mesmo organismo hospedeiro.

7. Vetor caracterizado pelo fato de que ele compreende o polinucleotídeo, conforme definido pela reivindicação 5 e/ou o cassete de expressão conforme definido pela reivindicação 6.

8. Organismo hospedeiro microbiano caracterizado pelo fato de ser transformado com o polinucleotídeo conforme definido pela reivindicação 5, o cassete de expressão conforme definido pela reivindicação 6 e/ou o vetor conforme definido pela reivindicação 7.

9. Composição cosmética caracterizada pelo fato de que ela compreende o polipeptídeo conforme definido pelas reivindicações 1 a 4 e um veículo cosmeticamente aceitável.