PT89026B - Processo para a preparacao de factor de activacao dos neutrofilos - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a uma substância imunomodulatória.

Refere-se particularmente a um factor imunoestimulante capaz de activar leucócitos neutrófilos humanos, a partir daqui designado apenas como factor de activaçao de neutrófilos (NAF).

ENQUADRAMENTO GERAL

Os leucócitos neutrófilos (neutrófilos são os leucócitos mais comuns e elevam-se a cerca de 2/3 dos glóbulos brancos existentes no sangue humano. Possuem uma função essencial, a de proteger 0 orgânismo hospedeiro contra infecções microbianas. Os neutrófilos são móveis, respondem a estímulo quimiotácticos gerados depois da infecção e têm a capacidade de se movimentarem para os tecidos infectados para matar os microrganismos. A eliminação dos microrganismos, depende da capacidade microorganismos e de libertarem radicais de oxigénio e enzimas microbianas. (B.M.Babior, New Bng. J. Med. 298-1978-659-668 e M. Baggiolini Bxperientia 40-1984-906-909). A libertação de tais produtos depende da activação de neutrófilos, poderiam ser usados oom 0 fim de aumentar a activação dos neutrófilos, e portanto, melhorar o mecanismo de defasa anti-micróbios do corpo humano.

A requerente descobriu agora que os monóoitos humanos segregam um facto?que induz a exocitose e a eclosão respiratória ( formação de rs, dioais de oxigénio e libertação de enzimas) nos neutrófilos humanos e portanto possui propriedades de activaçao de neutrófilos, as quais são importantes na aetividade anti-microbiana.

factor pode ser obtido a partir do fluído da cultura de monóoitos humanos estimulados e apresentam um peso molecular aparente de aproximação 6000, mais precisamente cerca de 65OO, na electroferese em SDS-gel.

Os monóoitos são células fagocítioas similares aos neutrófilos^ Sm contraste com os neutrófilos, apresentam, no entanto, uma longa vida,

Migram a partir do sangue para, todos os sitios possíveis dos tecidos onde se transformam em macrôfagos, A transformação de monôcitos em macrôfagos pode também ser observada em ensaios experimentais de cultura de células. Os macrôfagos nos tecidos apresentam variadíssimas funções, principalmente a fagocitose de material indesejado e a produção de uma grande variedade de péptidos e proteínas, as quais são 'excretadas. Os macrôfagos reunem-se no local onde se verificam infecções persistentes e è nestes locais que a produção de NAF por parte destas células pode aumentar a capacidade de defesa dos neutrôfilos do hospedeiro e, portanto, têm uma função patofisiológicamente relevante.

NAF é caracterizado pelas suas capacidades de activação de neutrófiloí isto é indução da referida eclosão respiratória com produção de radicais de oxigénio e a indução da libertação de enzimas. Bn termos moleculares, NAF δ caracterizado pelas seguintes propriedades: um peso molecular aparente de cerca de 6500 em geleetroforese em geral de SDS, um ponto isoeléctrico de aproximadamente 8,6, resistência ao aquecimento até 80°C e a numerosos agentes desnaturantes mas sensíveis a prj>teases, as quais sugerem que o NAF é um polipéptido. A acção do NAF sobre os neutrôfilos humanos é às dos dois estimulantes quimiotáctioo^ conhecidos, o anafilatoxina G$a e o péptido baoteriano N- formil - L leucil - L - fenil - alanina (f MLP) mas é medida por um receptor superficial de neutrôfilos humanos a que o NAF se liga e que é diferente dos receptores de qualquer agonista conhecido de neutrôfilos humanos. 0 NAF é produzido pelos monôcitos humanos em cultura mas não por limfóoitos humanos. A produção depende da presença de um estímulo com 3 lipopolisacárido baoteriano (LPS), fito-hemaglotinina (PHA) ou concanavalina (ConA), e da concentração do estimulo e do tempo de incubação. Ξ inibida pela ciclo-heximida, indicando de novo que está envolvida a síntese de proteínas.

Tal como já se referiu, os monôcitos e macrôfagos sao fontes abundantes de uma variedade de proteínas e péptidos bioactivos (C.F. Nathan, J. Glin. Invest. 79 1987, 319-326). Foram identificados como produtores de três citoquinas distintas: interleuoina 1 (iL-l), factor de

necrose de tumores (TNF) e interferão-alfa (iFlí-cC). Foram publicados nulerosos relatórios mostrando que os monócitos e os macrófagos produzem também factores que actuam sobre os neutrófilos, os quais são diferentes dos acima mencionados. Gomo se mostram activos sobre os neutrófilos, estes factores serão na presente memória descritiva apresen-|tados com algum pormenor. Foi referido em variadas publicações que os macrófagos alveolares libertam factores que são quimiotáotioos para neutrófilos (j.A. Kazmierowski et al., J. Olin, Invest, 59 1977, 273281; W:W Merrill et al., J. Olin, Invest. 65 1980 268-270 e G. W. Hunjinghake et aL, J. Olin. Invest 66 1980 473-483) e os quais podem aumentar a defesa antimicrobiana no pulmão. Mostrou-se suksequentemente que estes factores aumentam a actividade microbiana dos neutrófilos (j.E. Pennington et al., J. Infeõt. Pis. 148 1983 101-109 e J. Glin.

Invest. 75 1985, 1230-1237). A purificação por filtração em gel e cro matoenfacação conduz ã identificação de um faotor sensível à protease (denominado HAF) produzido por macrófagos alveolares, com um peso molecular igual a 6000 e um ponto isoeléctrico de 7,6, Este factor foi indicado como sendo fracamente quimiotáctico e aumentar a eliminação de bactérias que sofreram a fagocitose pelos neutrófilos sem, no entanto, induzir ele mesmo a produção de radicais de oxigénio nem a libertação de enzimas. Um mecanismo semelhante de aumento de actividade anti-microbiana foi descrito por outros investigadores (A. Ferrante et al Glin. Bxp. Immunol. 56 1984, 559566), que mostraram que os neutrófi·· los humanos requerem a adição de um meio de cultura de monócitos ou macrófagos para provocarem a morte de Neigleria fowleri. Os mediadore^ da activaçao de granulócitos (GRAM) produzidos pelos monócitos humanos LPS-estimulados foram descritos por outros experimentadores (ã. Kapp et al., J. Invest. Dermatol. 86 1986, 523-528 e F.S. Maly et al., Lymphokine Res. £ 1986, 21-33). Foram descritas duas espécies de GRAU, uma maioritária com um peso molecular aparente de 60 000 e outra mino·· ritária com um peso molecular aparente de 10 000, que induziram um retardamento da resposta, à eclosão respiratória por parte dos neutrófilos humanos, como se revelou por quimioluminesoênoia,. Estes factores são sensíveis ao aquecimento e à tripâina e a sua produção depende da

estimulação dos monóoitos com LPS e, aparentemente, de novo da síntese proteica.

Variadíssimos relatórios descrevem factores derivados a partir de monócitos e/ou macrófagos com actividade quimiatáctica próxima dos neutrófilos. Foi descrito um factor denominado ·’ Quimiotaxina derivada de células mononucleares ” (MOC), que aparentemente é um péptido de peso molecular de 10000 e que difere de ORAM, (Ξ. Kownatzki et al., Olln Exp. Immunol. 64/^986^, 214-222). Um factor quimiotáctico de neutrófilos produzidos por monóoitos de sangue humano estimulados com LPS, com um peso molecular de aproximadamente 10000 e um ponto isoelectrico de 8-8,5 foi também descrito (T. Yoshimura et al., J. Immunol. 139/1987? 788-793). Finalmente foi tamhém relatado que macrófagos peritoneais de ratos estimulados em cultura com LPS, libertam um factor quimiotáctico neutrofílico (F.Q. Cunha et al., J. Ne d. Biol. Res. /Í986/ 775

-777 e Eur. J. Pharmaool. 129 /Í986/ 65-76 ).

Devido à natureza preliminar da informação hioquimica contida nestes relatórios é impossível especular sohre as similiaridades e diferença^ estruturais entre os vários factores descritos.

Subsequentemente à (s) data (s) da (s) prioridade (s) que é (são) reclamadas para a presente invenção, a purificação de um péptido correspondente provavelmente a NAF foi descrita por Van Damme et al., ( J.

Van Damme et al., J. Exp. Med. 167 /Ϊ9θθ7 1364-1376) e uma sequência idêntica à do NAP foi descrita por Gregory et al., (H. Gregory et al. , Biochem. Biophys. Res. Gommtro.. 151 1988 893-890) para um péptido que foi purificado a partir de sobrenadantes de linfócitos humanos es^imulad com lectina. 0 c DNA que codifica para MDNÒF (T. Yoshimura et al.,

Proc. Nat, Acad. Soi. USA 84 /Ϊ9θ7/» 9233-9237) foi recentemente clo·· nado (K. Matsushima et al., J» Exp. Ne d. 167^.98^, 1883-1893) e des·· cobriu-se que corresponde a 3-10G cDNA (j. Schmid e G. Weissmann,

J» Immunol. 139 /1987/ 250-256). Schmid e Weissmann demonstraram que 0 péptido codificado por 3-10 cDNA tem homologia estrutural com 0 fac|· tor de plaquetas 4, heta-tromhoglohulina, péptido III activador de tecido coneotivo pTAP-IIl) e péptido indutível por interferão-gama (gamma-IP-10). Estas moléculas são também homólogas dum péptido oom 73 resíduos (MGSA) com propriedades estimulantes do crescimento de me1 anona (A. Richmond et al., ΞΜΒΟ J. 7 /19887. 2025-2033) cuja sequência se parece muito com a deduzida a partir do gro-cDNA isolado a partir de fibroblastos (A. Anisowicz et al., Proc. Nat, Acad. USA 84 19θ7 7188-7192)· Uma protéina inflamatória derivada de maorófagos de murina (MIP) possivelmente relacionada oom as proteínas descritas, foi também mencionada (g. Davatelis et al., J. Exp. Med. 167 /1988/, 1939I944) e parece ser um membro da família de péptidos incluindo RANTES, produto 8 de kd dum cDNA Êolado a partir de clone de células T humanas provocadas por antigénios dependendes de IL-2 T.J, Schall et al., J, Immunol. 141 /1988/ 1018-1029)· As funções destes péptidos são em grande parte desconhecidas. MGSA e OTAP-III (o.W. Castor et al,, Pro. Nat. Acad. Sei, USA 80 1983, 765-769) foram descritas como sendo mitógenioas e 0 faotor 4 de plaquetas demonstrou-se ter efeitos imunomodulatórios (A.D. Barone et al, J. Biol. Chem 263 1988, 8710-8715)«

Os resultados obtidos sugerem que NAF aotiva seleotivamente os neutró·· filos através de nm processo mediado por receptor semelhante ao iniciado pelos agonistas quimiotáctioos.

2. SUMARIO DA INVENÇÃO

A Requerente descobriu que o NAF desta invenção induz a formaçao de radicais de oxigénio e a libertação de enzimas em neutrófilos humanos aotuando através de um receptor seleotivo, diferente de todos os outr« receptores até agora descritos.

Determinou-se a sequência total de aminoácidos que constituem 0 NAF purificado a partir do monócitos humanos estimulados por LPS e um código genético para a espécie de NAF principal sintetizado e expresso como um péptido recombinante oom as mesmas propriedades de aotivação de neutrófilos que o seu hómologo natural.

A invenção consequentemente, refere-se a NAF e ao seu isolamento a partir de fontes naturais tais como monócitos humanos.

Refere-se também ao NAF especialmente recombinante sintético e à sua preparação e expressão.

3. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

A sequência completa de aminoácidos do NAF determinado por métodos de sequênciamento conhecidos:

Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-ProPhe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ilç-Glu-Ser-Gly-ProHis-Cys-Ala-Asn-Thr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly-Arg-CluLeu-Cys-Leu-Asp-Pr o-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg-V al-V al-Glu-LysPhe-Leu-Ly s-Ar g-Ala-Glu-A sn—Ser.

A degradaçao de Bctaan da proteina completa e dos fragmentos típticos 7-26 e T 27-47 obtidos após quebra de ligações do NAF SH-metilado e de NAF amino-succini-lado origina a sequência até à posição 47· Por hiclró lise com ácido fórmico a 75/ ® degradação de Bdman, obtiveram-se duas sequências aproximadamente equimolares de 20 aminoácidos, seguidas poi¹ um único formato que corresponde â sequência aminoterminal do NAF para além da posição 20. A sequência dos péptidos carboxiterminais A 53-7* foi determinado por subtração e confirmada por análise do péptido típtico T 61-72. As oarboxipeptidases A e B originam produtos de clivagem detectáveis mas após o tratamento de 1 nanamole de NAF com carboxipeptídase Y libertam-se 120 picomoles de serina, indicativo da serina como a extremidade de carboxi.

Análises de vários lotes de NAF revelaram alguma heterogeneidade aminoterminal. A sequência acima descrita corresponde ao componente maio· ritário (7θ/), o qual se crê ser o principal responsável pelas activi·

dades biológicas. Podem ainda identificar-se três outras variantes:

Sequência 1 (cerca de 17$)

Ala-Val-Leu-Pro-Arg-Ser-Als.-Lys-Glu-Leu-Arg-Gys-Gln-Gys-Ile-LysThr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-I-Iis-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-ValIle-Glu-Ser-Gly-Pro-

isto ê a sequência completa acima descrita prolongada na N-extremidade por Ala-Val-Leu-Pro-Arg- (compreende a proteína completa então 77 aminoácidos)

Sequência 2 (oerca de

Lys-Glu-Leu-Arg-Oys-Gln-Gys-Ile-Lys-Thr-Tjfr-Ser-Lys-Pro-Phe-HisPro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Proisto é sequência completa acima descrita encurtada na N-extremidade Ser-Ala- (a protéina completa compreende portanto 70 aminoácidos).

8«ΙΚ&£ί*..3. (cerca de 5®

Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-ProLys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Sèr-GliTPro-.

isto é a sequência completa-acima;descrita, encurtada na N-extremidade de Ser-Ala-Lys- (a protéina compreende portanto 69 aminoácidos).

Todas estas frequências podem ser alinhadas com a sequência prevista a partir do 3-10 cDNA, compreendendo 99 aminoácidos (j. Schimd e G. Weissman, J.Imunol. 139 /1987/s 250-254). 0 péptido maioritário de NAF corresponde às posições 28 a 99 áa sequência de aminoácidos 3-10C, enquanto que as três variantes anteriores começam na posição 23 (sequê cia 1), 30 (sequência, <?) e 31 (sequência 3).

n9

A comparação entre a sequência, 3-100 derivada de cDNA e as sequências anteriormente referidas sugere que os fagócitos mononucleares sintetizam um precursor de NAF o qual é processado intracelularmente. 0 pepti do do resíduo 77 poderia, representai* a forma excretada, maior do NAF porque corresponde à sequência derivada de cDNA menos o péptido de 22 aminoácidos de sinal previsto. A espécie principal de NAF com 72 resíduos e os análogos com 70 e 69 resíduos podem resultar de modificações trnaslacionais posteriores.

Todas as formas de NAF têm quatro resíduos de cisteina que se espera formarem pontes de dissulfureto dentro da cadeia, as quais parecem importantes para a actividade visto que se verificou que 0 mercaptoetanol era inibidor (P.Peveri et al., J.Bxp. Med. 167 I547-I56O).

As pontes de dissulfureto é provável que liguem as posições 7-34 e 9-50 -Jal como na beta-tromboglobulina e no fa-ctor de plaquetas 4, que são parcialmente liomélogas do NAF.

De acordo com a homologia com a beta,-tromboglobulina, o NAF tem duas pontes de dissulfureto intramoleculares. Consequentemente, 0 seu peso molecular calculado é igual a 8384, 7, claramente mais elevado do que o peso molecular determinado por eleotroferese em SDS-gel.

A produção de NAF a partir de fontes naturais, tais como monóoitos humanos,faz-se com baixos rendimentos e requere opera,ções de purifica,ção extensas e complexas.

A fim de produzir NAF em quantidades mais elevadas e oom processos sintéticos de maior rendimento, são indicados por exemplo processos de química ou processos de DNA recombinante. A produção de NAF sintético, por exemplo, por métodos de DNA recombinante, incluindo a expressão num sistema de expressão eucariótico ou procariótico, por exemplo, em E. Coli insere-se também no âmbito da invenção. 0 NAF sintético, por exemplo, o NAF recombinante isolado por exemplo a partir de bactérias, tem (s) mesma (s) sequência (s) de aminoácidos que o NAF natural e as mesmas propriedades e actividades, NAF recombinante” significa NAF

obtido por meio de processos de 'DNA recombinante.

A preparação de NAF por métodos de DNA recombinante é reaJizado de acordo com técnicas conhecidas, nomeadamente, síntese, purificação e ligação de correspondentes oligonucleótidos, clonagem do gene de NAF sintético, expressão em Ξ. Coli e finalmente recuperação e purificação do NAF recombinante. Por exemplo, um gene que oodifioa para aminoácido 72 do NAF é sintetizado, preferivelmente com optimização de codão, e posteriormente olonado e expresso em E. Coli.

A análise da mancha de fíeSter de extractos baoterianos brutos usando um antissoro desemvolvido contra 0 NAF natural revela uma única banda que comigra com 0 NAF natural. 0 NAF recombinante purificado até ser homogeneizado tem sequências amino terminais e carboxiterminais idênticas às do NAF natural com 72 aminoácidos. Ensaiado em neutrófilos humanos, verificouse que tem a mesma actividade e potência que o NAF 24, natural induzido a quimiotaxia, um rápido aumento do Ga citosólioo livre, activação da eclosão respiratória e libertação dos conteúdos de grânulos específicos e azurófilos.

A Figura 13 mostra a configuração dum gene de NAF sintético. As alterações são evidentes em relação à sequência codifioante do 3-10C cDNA para facilitar a expressão em E. Coli. Na extremidade 3J 0 terminador TAA que ocorre normalmente é substituído pela terminação .tripla TAATAATGA e um sítio de BamHI é adicionado imediatamente a jusante. Na extremidade 5’, os sítios Pphl e Ciai são adicionados a fim de permitir a inserção na oolonagem e no vector de expressão, respeciivaaente,, Na base 34, d criado um sítio de restrição Taql para posteriores manipulações na extremidade 5’ por mudança do codão Arg de ACA para CGA.

fortalecimento por blocos (oligonucleótidos 1-2, 3-4, e 5-6) não tem vantagens relativamente à ligação simultânea de todos os 6 oligonuoleótidos. A fosforilação 5* de todos os oligonucleótidos origina

4V produtos de ligaçao de tamanha superior ao esperado, mas quando os oligonucleótidos terminais ( 1 36) não são fosforilados, o produto

com ο peso molecular mais elevado ê o gene completo com 248/240 bases. 0 gene é ligado em pBS cortado com Sphl/BamHI e transformado, em

E. Coli. 0 plasmídio ENA isolado a partir de 6 das colónias resisteni tes à ampicilina resultantes é cortado com Clál/Bam HI, proporcionando i

em todos os casos uma banda de 237 bp em gel de agarose a 1,4%. 0 sequênciamento de DNA revela os clones compreendendo a sequência correc! ta. Â cadeia Glal/BamHI de um clone correcto é retirado cio gel e clonado no vector promotor de Trp, pIL 402 (Termo). Como possível meio para aumentar a expressão, um terminador de transcrição sintático (ver exemplo 17) pode ser incorporado neste vector ligado à extremidade 3’ do gene humano GE-GSF no local Bam/ffl. 0 gene NAF á portanto inserido entre este local BamHi e 0 local Ciai a jusahte do local da iniciação de transcrição no promotor, para substituir o gene GIí-CSF.

plasmídio de expressão NAF resultante, p(MF)-6$3, á representado ' na Fig. 14.

As análises de mancha de prata ou por mancha de Western de extractos de E. Coli induzidos por ácido indol-acrílico compreendendo p(NAF)-6T3 demonstram a produção dependente do tempo dum péptido que comigra oom 0 NAF natural e reaga com um anti-soro contra o NAF natural.

sistema de expressão acima mencionado pode também ser usado para a preparação das variantes de NAF, acima mencionadas, ou outros fiagmentos de NAF biologicamente activos, tais como fragmentos NAF truncados com amino.

As propriedades biológicas do NAF são específicas em relação à espécis. A actividade em coelhos reflete praticamente a actividade nos seres humanos.

Os testes preliminares em ratos, ratazanas e porcos guinea não revelaram qualquer actividade nítida.

NAF é indicado para uso no tratamento de condições que são acompanhadas ou causadas, localmente ou sistematicamente, por uma modificação do número ou do estado de activação das PEN (células polimorfonu-

cleares-neutrófilos)« 0 NAF modifica extensivamente estes parâmetros de PMN e é portanto indicado para uso no tratamento de condições nas quais um aumento no número ou do estado de activâção das PMN conduz a melhoramentos clínicos, por exemplo, em infecções provocadas por bactérias, microplasmas, leveduras e fungos e virais. Além disso, o NAF está indicado para uso em doenças inflamatórias, tais oomo psoriase, condições artríticas e asma, ou em condições de contagens anormalmente baixas de neutrófilos e/ou nível de neutfofilos baixo generalizado, e na preparação de antagonistas para uso nestas condições.

3. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Produção de NAF induzida por LPS

Colocam-se células mononucleares separadas da forma como se descreveu no Exemplo 1 em placas de cultura com 24 reentrâncias (5X10^ células em 1 ml) e estimulam-se oom LPS à concentração indicada. Recolhe-se o meio em intervalos de tempo variados, olarifica-se por centrifugação (20 000 rpm durante 20 minutos a 4°θ) θ mede-se a actividade do NAF. Células de um único dador; meios de culturas duplas^ Estes resultados são representativos de 4 experiências similares usando células de dadores diferentes.

: Figura 2; Produção de NAF por fagóoitos mononucleares mas não por linfócitos «w 6

a) A fraeção total de células mononucleares (5 X 10 células /ml) e de células suas derivadas ( o, O) são cultivadas na presença de 100 ng de LPS ( ·, o ) e na sua ausência (·Β,ΕΣ3) durante 24 horas«

A . b) Monéoitos (θ, 10 células/ml) e linfôcitos (Δ, 4 X 10° células/ j /ml) purificados por elutriação são cultivadas na presença de 100 ng de LPS.

Os gráficos representam valores médios relativos para a libertação de elastase a partir de experiências separadas 5(a) ® 6(b) realizadas ί cada uma delas em duplicado. Os dados são normalizados posicionando os j de 24 horas do ·, no painel aedo· · -no' painel b igual a 1,0 e caloulan do os outros valores ( médiat desvio padrão) relativos a este. Este tipo de representação é escolhido no sentido de se entrar em linha de conta com a variação de produção de NAF por um lado, e a resposto dos neutrófilos usados para testar o NAF, por outro.

Figura 3: Purificação parcial do NAF por cromatografia em fotocelulose

A distribuição de proteina (absorvância a 28 nm,- - -), do NAF (θ) e IL-1 (â) é representada. As fracções com actividades mais elevadas do NAF são realçadas 'oomo se indica.

Figura 4» Purificação do NAF por filtração em gel de HPLC

a) Distilbuição da proteina (absorvânoia a 280 nm) e tempo de eluição de marcadores de peso molecular ( setas : 1~ peso molecular 66200}

2- peso molecular 42 700; 3— peso molecular 21 500; 4^speso molecular 6 5θ0 θ 5- peso molecular 1 255)

b) Perfil da actividade do NAF.

Figura 5: Purificação Ao NAF por cromatografia em hidroxilapatite

NAF parcialmente purificado é carregado na coluna com baixa concentração salina e então eluído por um tampão compreendendo NaCl 1 II. As barras representam a actividade de NAF.

Figura 6; Purificação'do NAF~ por cromatografia em heparinasefarose

NAF parcialmente purificado ê carregado numa coluna com baixa concentração salina e então eluida com uma solução tampao compreendendo NaCl 1,5 M.

As barras representam a actividade do NAff.

Figura 7: Purificação do NAF por HPLG em fase inversa, numa ~ coluna Sá

a) 0 NAF purificado é carregado numa coluna RP em áoido trifluoraoétá oo a 0,1 %. A coluna é desemvolvida oom um gradiente linear de acetonitrilo em ácido trifluoracético a 0,1$.

b) As barras representam a actividade do NAF.

Figura 8: Purificação do NAF por HPLG em fase inversa, em coluna de GN-propilo

a) 0 NAF purificado é carregado numa ooluna de ON- propilo Bakerbond, A coluna é desenvolvida com um gradiente life.ear de h-propanol em ácido trifluoraoêtico a 0,1

b) As barras representam a actividade do NAF

Figura 9? Purificação do NAF por oromatofocagem:

C NAF purificado parcialmente é carregado numa coluna de oromatofocagem Ã. coluna é desenvolvida numa solução politampão 96-HGI, pH 7,0. As fracções são testadas em relação à actividade do NAF (-··-) e pH

Figura 10: Resposta da eclosão respiratória ao NAF purificado paroialmente

a) Produção de Super óxido: neutrófilos (3 X 10 ^/ml) são pré-incubacbs a 37° com ou sem 1 jura PAF durante 2 minutos e então estimulados com quantidades crescentes de NAF. Observam-se diminuições nos registos de citocromos c a seguir à adição de NAF.

b) Quimioluminescência dependente de S^0₂: Sao representadas à esquerda das curvas de evolução seguindo a estimulação oom NAF parcialmente purificado - e as concentrações aproximadamente equiactivas de G5a e fHLP A fase inicial da resposta é detalhada à direita. Os estimulantes são adicionados em 5θd® PBS-BSA·

Figura 11: Pesoriminacao entre NAF e G5a

05a e NAF são incubados durante 15 minutos com soro humano fresco ou com PBS e as actividades das preparações são determinadas ( produção de superóxido).

a)	05a em PBS,
Ό	05a em soro,
c)	só soro,
4)	NAF em PBS,
e)	NAF em soro.

Figura 12; Formação de superóxido em resposta à estimulação sequência! oom NAF paroialmente purificado, 05a e f^ILP

a) São pré-incúbados neutrófilos a 37°C durante 5 minutos e depois estimulados com diferentes agonistas como se indica (setas),

b) Estimulação sequencial ou repetida com 1TAF e 05a® As coridçõess são as indicadas na alínea a).

As setas representam a adição de agonistas oomo se indica. A concentração de 05a é de 0,5 nM em a) e de 0,2 nM em b), enquanto é de 20 nE de fMLP em ambas as experiências. Os agonistas são adicionados em 50 de PBS-BSA.

Figura 13; Sequência de nucleótidos do gene NAF sintético

0s nucleótidos simples, 017-1 a ON-6, usados na construção do gene são representados por linhas tracejadas. Os números dos nucleótidos Sublinhados) aparecem do lado direito acima da cadeia dupla. A sequência de péptido correspondente da forma mais importante é nomerada comepancb na extremidade aminoterminal (Ser). Os sítios da restrição com Olal e BamI estão indicados acima da cadeia dupla. 0 sítio de Taql criado poi substituição de C pelo A no codão arginina é também representado·

Figura 14: Vector de Expressão p(NAF)-6T3

E

A c Gene resistente à ampioilina

Trp P/O « Promotor triptofano

T - terminador sintético d© transcrição

Figura 15: Identificação do MAF natural e do reooabinado;

2*

Gráficos Superiores: Trocas de Ga citosólico livre induzidas por ITAF 6 natural (esquerda) e recomhinante (direita). Os neutrófilos (4 X 10 células/ml) são carregados cora quin-^ÃM 0,1 nmolar-e então estimulados com ITAF (marcado) 3 nlí. As trocas de -saturaçãp de quin-2 são calibradas como é descrito em V. Von Tscharner et al., J> Biol. Chem. 261 (1986) 10163-10168.

Gráficos inferiores: Solosão respiratória induzida por HAF natural 6 (esquerda) e ITAF recombinante (direita). Os neutrófilos (10 células/ml) são estimulados com NAF 3,10 e 30 nJS no Inicio da contagem dos tempos (t-0) e a produção de perómido de hidrogénio é medida por quimioluminescência (M.P. Wyman et al., Anal. Bbohem. 165 (Ι9θ7) 371' -378.

Figura l6: Derrame de plasma em zonas da pele

A seguir à injecção intradérmica de MAP ou de endotoxinaj Duração: 4 horasj

Média í erros padrão da resposta média, de 3 ooelhos.

Figura 17; Acumulação cLe neutréfilos em zonas da pele

Medido simultaneamnnte com as respostas repre sentadas na Figura 16.

Figura 18: Efeito da Folimixina B na acumulaçao de neu.tr ófilos:

A seguir à injecçâo intradérmica de W (ΐθ“^ moles/zona), fMLP (ΐθ“⁹ moles/zona) ou endotoxina (lo”¹^ moles/zona); duração; 2 horas;

Média 4·erros padrão da resposta média de 3 coelhos.

5· bxbmplos

Os exemplos seguintes ilustram a invenção. Todas as temperaturas estão em graus centígrados expressas. Usam-se as seguintes abreviaturas;

PHA: Fito-hemaglotinina

ConA. Concanavalina

LPS: Lipopolissacárido de 33. Coli

BSA: Albumina de soro de buvino fMLP: N-Formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina

PAF 1-0-Hexade cil-2-0-acetil-sn-glicero-3-fosf ocolina (factor activador de plaquetas)

MEM: Meio essencial mínimo de Eagle (Seromed GmbH, Munique,

FRG), suplementado com 25 pg/ml de neomicina, tamponizado a pH 7 »4 com NaHCO^ 25 mM e HBPES 20mM.

MEM-PPL:

Gomo o anterior, contendo em adição nma solução de proteínas de plasma pasteurizada (5% PPL-SRK, Sxííss Red Gross Laboratory, Berna, Suiça) e 100 Bl/ml de penicilina e estreptomicina (GibcoA.G,, Basle, Sniça);

~ — 2+ 2¼

PBSs Solução salina com tampao de fosfato sem Ga ^T e Hg (.137 mM NaOl, 2,7 mM KOI, 8,1 mM NaHgPO^ e 1,5 mM KEgPO^, ajus tado a pH 7,4)

PBS-BSA: . PBS complementado com 0,9 mM CaClg, 0, 49 mM MgCl₂ e 2,5 mg/ml BSA.

HEPES Acido Μ-2-hidroxietilpiperazina-N -2-etanossulfonico

FPL-SRE: Solução de proteínas plasmáticas (Swiss Red Gross)

NAF: Factor ou protéina de activação de neutrófilos

GX: Ciclo-heximida

IL-1: Interleucina-1

SOB: Superóxido

C5a: Anafilatoxina

GPGt Vidro de poros controlados

PAGE Eleotroforese em gel de poliacrilamida

GM-CSF: Factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos

CB: Gitocalasina B (5jlg/ral)

MES: Acido 2-(N-morfolino)etanossulfónico

HPLC: Gromatografia em fase líquida sob alta pressão

SDS: Dodecil-sulfato de sódio

PARTE I; Produção ds NAF por Monóoitos Humanos

Exemplo 1? Produção de NAF por monóoitos humanos estimulados oom LPS

Os monóoitos humanos sao isolados a partir de camadas cor de couro de sangue de dadores( Swies Sed- Cross Laboratory Berna, Suiça) por centri-

fugação através de um gradiente de Ficoll-Paque. Este método separa os neutrófilos das assim denominadas células mononucleares, uma mistura de monóoitos ( cerca de 20/) e linfócitos (cerca de 80/)· São usadas três preparações de monóoitos: (i) a fraoção total de células mononucleares, (ii) monóoitos enriquecidos a partir da fracção de células mononucleares por aderência, e (iii) 9θ/ de monóoitos puros separados a partir de linfócitos por elutriação centrífuga (G.Garotta et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 140 (1986) 94θ-954 © K.J. Clemetson et al., J. Exp. Med. lól (1985) 972-983).

As células são cultivadas em MBM- PPL e estimuladas com comcentnaçõe3 crescentes (0,1 ng a lj^g/ml) de LPS. Em tempos diferentes, alíquotas j de meios de cultura são retiradas como amostras e nelas determina-se a aetividade do NAF como a capacidade de induzir a libertação de elastase a partir de monóoitos feumanos pré-tratados com citocalasina B (B. Dewald et al., Biochem. Pharmacol. 36 (1987) 2505-2510).

Culturas de células mononucleares compreendendo monóoitos e linfócitos numa proporção de 1:5 produzem NAF quando estimuladas oom LPS (100 mg/ml). NAF acumula-se no meio durante 24 horas e os niveis de produção estacionam entre as 24 ® as 48 horas. 0 NAF não se forma em ausência de estímulos. A Figura 1 representa a evolução com o tempo e a dependência em relação com a concentração dos efeitos de LPS o qual é já activo entre 0,1 ng/ml e 1 ng/ml,

A origem do NAF é estudada usando diferentes preparações de céoulas mononucleares. A Figura 2a representa geração de NAF dependente de LPS pela fracção total de células mononucleares e os monóoitos eelec·

cionados a partir dela por aderência. Bstes resultados confirmam que a produção de NAF depende de LPS e indica que o NAF é produzido pelos monócitos. A presença de linfócitos não parece influênciar a quantida de de NAF produzida. São obtidos resultados semelhantes com moãôcitos e linfócitos purificados por elutriação. Como se mostra na Figura 2b, 0 NAF é produzido por monócitos mas não por linfócitos.

Exemplo. 2: Produção de NAF por monócitos humanos estimulados oom PHA ou ConA

A fraoçao de cálulas mononucleares obtida a partir de oamada cor de couro de sangue humano, separada como foi descrito no Exemplo 1, são cultivadas nas condições referidas no Exemplo 1, e estimuladas com PHA (5y*g/ml) ou ConA (lO^ig/ml). A variação oom o tempo da produção de NAF é semelhante às observadas oom células mononucleares estimuladas com 100 ng/ml de LPS. Um máximo é obtido após cerca de 24 horas,

Exemplo 3SInibição da produção do NAF pela Ciolo-heximida facto de o NAF não ssr libertado imediatamente após estimulação dos monócitos, mas sim num intervalo de tempo de horas, dependendo da concentração do estímulo, sugere que é referida uma nova síntese de proteínas e que a produção do NAF é realmente induzida pelo estimulo. 0 requisito da síntese das proteinas é demonstrado por experiências nas quais a produção de NAF é inibida pela adição da ciclo-heximida. Os resultados de uma experiência representativa é apresentado na Tabela 1.

Tabela I

Inibição da produção cie NAF pela oioloheximida

Tratamento Produção média de NAF apôs

4h 8h 24h

(nenhum)	0	0	0
LPS	726	2042	2633
LPSfGX	0	0	0
LPSfGX at 4h	774	966	639
LPSfGX at 8h	752	1884	1854
A cicloeximida (CX, 10 ykig/ml) é adicionada (100 ng/ml). A actividade é apresentada em	4 ou 8 horas após LPS unidades de fluorescência,

expresando a libertação de elastase.

PARTE II Purificação do NAF

Exemplo 4: Separação de NAF e IL-1 por cromatografia em fosfooelulose

As célalas mononuoleares obtidas a partir de camadas cor de couro de sangue de doadores como se déscreveu no Exemplo 1 são cultivadas em MBK-PPL durante 48 horas em presença de 100 ng/ml de LPS em frascos de cultura por agitador (l,5 litros 5 X 10° células/ml). Os sobrenadantes da cultura são então colectados, centrifugados a 20000 rpm durante 20 mlnutos a 4, ' sentido de remover as particulas e sao

então carregados numa coluna de fosfocelulose (ííhatman pll, 1,4 x 6 cm) equilibrada com uma solução de tampão de fosfa,to de potássio 20 mM, pH 7,2 compreendendo NaCl 20mM e glicerol 5$. A coluna é lavada com 30 ml de um gradiente de concentração de NaCl linear (0,02 Mal,

M) no mesmo tampão. Colectam-se fracçoes de 2 ml em polietilenoglicol a 0,1$ e a actividade do NAF e de IL-1 ensaiada. A absorvância a 280 nm ó monitorizada como uma medida de proteína.

A Figura 3 representa os perfís de distribuição de proteínas (absorvância a 28o nm) e duas actividades biológicas, a libertação de elastase como uma medida da actividade de NAF e a proliferação de timócitos como uma medida de actividade de IL-1. A maior da protéina bem como a actividade do IL-1 são recuperadas a partir do volume da correA te que a atravessou. A eluição com um gradiente linear de NaCl origina uma pequena actividade a baixa força iónica seguida de um pico de acti vidade de libertação de elastase correspondente ao NAF, 0 qual inioia a eluição a 0,5 M e atinge o seu máximo a NaCl 0,8 Π. 0 pico é simétr:.· co e é procedido por um pequeno patamar. Algum material absorvente de UV é eluído pelo gradiente salino; o seu perfil, no entanto, não coincide com as actividades biológicas determinadas. Como se indica na Figura 3, IL-1 e NAF podem ser completamente separados. Não ha actividade de libertação de elastase associada com IL-1 nem actividade de indução de proliferação de timácitos associada com NAF. A recuperação do NAF por fraccionamento é praticamente 100$, sugerindo que 0 meio não contém inibidores nem activadores.

Uni

Exemplo 5 Purificação do NAF por filtração através de gel a amostra de 200^*1 de NAF parcialmente purificado por cromatografia em fosfocelulose (Exemplo 4) á aplicada a uma coluna HPLC TSK -G 2000 SW (7,5 x 600 mm) oom uma pré colunaTSK-GSWP- (75 ^x 75 mm) . A coluna ê pre corrida por NaHPO 100 mM, pH 7,0 compreendendo NaCl 100 mM, à / * Λ» Λ» taxa de 0,5 ml/minuto. Gomo padrões de calibraçao usam-se albumina de

soro de bovino ( peso molecular 66200), ovalbumina (peso molecular 427OO), inibidor tripsina de soja ( peso molecular 21500), aprotinina ( peso molecular 6500) e aotinomicina D (peso molecular 1255)· θ NAF é eluído com um pico levemente assimétrico logo após a aprotinina, e bem acima da aotinomicina D» 0 peso molecular aparente do NAF é portai to aproximadamente 6500. Nenhuma actividade relativa ao NAF é eluida antes ou depois do pico descrito. (Fig. 4).

Exemplo 6: Purificação do NAF por hidroxilapatite

Um conjunto de fracções obtidas a partir de cromatografia em fosfooelulose (Exemplo 4) com um volume total de 15 ml ( correspondendo a aproximadamente 800 ml da cultura sobrenante não fraecionada) ê diluída de 1:10 com uma solução tampão (fosfato de sódio 10 mM, pH 6,9 em polietileno-glicol 6000 0,1%) e carregada numa coluna com 3 ml de hidroxilapatite (Biogel HTP) equilibrado no tampão. A coluna é lavada com 3 x 3 ml do tampão do carregamento e em seguida eluida com tampão de carregamento suplementado oom NaGl 1M. Através desta, técnica 0 NAF é recuperado a partir da coluna. A subsequente eluição com o tampão de fosfato de sódio 0,5 M, pH 6,9 não origina qualquer actividade posterior de NAF ( Fig. 5)·

Exemplo 7: Purificação do NAF heparina-sefarose

Uma amostra de 1 ml de NAF parcialmente purifiçado por cromatografia com fosfocelulose (Exemplo 4) ó carregada numa coluna de 0,5 ml de heparina-sefarose 4B equilibrada em fosfato de sódio 10 ml-l, pH 7,3 suplementado com 0,1% de polietilenoglicol 6000 e NaGl 5θ mM. A coluna é lavada com o mesmo tampão e então eluida com fosfato de sódio 10 mM, pH 7,3 suplementado com NaGl 1,5 K. Uma quantidade mínima de NAF ó detectada no fluído que passa através da coluna depois da lavagem, mas a maior parte da actividade ligada à ooluna é eluida com o

tampão de maior força iónica (Fig. 6).

Exemplo 8: Purificação do NAF por cromatografia em fase líquida a alta pressão em fase inversa

Uma amoskra de NAF purificado por cromatografia em fosfocelulose (Exen pio 4) seguida de purificação com hidroxilapatite (Sxemplo 6) é apli cada numa coluna 0^ de fase inversa de poros largos (Biorad RP 304)·

A coluna é eluída com um gradiente de acetonitrilo de 0 a 80%, em ácido trifluoracético 0,1% com um aumento de 0,66% minuto. 0 caudal de passagem é de 0,5 ml/minuto. As fracções são recolhidas e secas sob vácuo. Os resíduos são re-suspendidos em 100 jul de PBS compreendendo polietileno-glicol 6000 0,1 % e é analisada a actividade do NAF. 0 NA3’ é eluído com um tempo de retenção de cerca de 60 minutos, correspondendo aproximadamente a acetonitrilo 40%, como um único pico agudo berji definido (Figura 7).

Exemplo 9: Purificação do NAF por cromatografia em fase líquida a alta pressão oom inversão de fase numa coluna CN - propilo

Uma amostra de NAF purificado por croma/cograf ia com inversão de fase como foi descrito no Exemplo 8, seoa sob vácuo e re-suspensa em 100 D de PBS contendo polietileno-glicol 0,1% é diluída com um volume de ácido trifluoracético 0,1% e aplicada numa coluna Bakerbond de ciano (CN)-propilo de poros largos (Baker Research Products, Phillipsburg, NJ, USA). A coluna ê eluída com um gradiente que se prolonga de 0 a 50% de n- propanol em ácido trifluoracético 0,1% com um aumento de O,41^ninuto. 0 caudal de passagem é de 0,5 ml/minuto. As fracções são recolhidas e secas sob vácuo. Os resíduos são re-suspendidos em 100 jjlL de solução salina com tampão de fosfato compreendendo 0,1 % de polietileno-glicol 6000 e ê analisada a, actividade do NAF. 0 NAF é eluído em dois picos bem definidos, um maior oom um tempo de retenção

àe 53 minutos, correspondendo a 22% de n-propanol, e um menor responsável por menos de 30% de actividade total, com um tempo de retenção de 66 minutos, correspondendo a 27,5% d® n-propanol (Fig. 8).

Exemplo 10; Cromatofocagem do NAF

Uma amostra de 4 ml de NAF parcialmente purificado por cromatografia em fosfooelulose (Exemplo 4) á submetida a diálise contra um tampão inicial constituído por: etanolamina - HG1 25 mH, pH 9,4 e θ,Ι % de polietileno-gliool 6000, e é carregada numa coluna PBS 94 (θ»Τ ^x 19 cm, Pharmacia) equilibrada oom 0 mesmo taiapão. A coluna é então eluida com 200 ml do politampão 96 - HGI (diluido 1:10 cm água), pH 7,0 compreendendo polietileno-gliool 0,1%. Sao recolhidas fraeções com tempos de eluição de 10 minutos a um caudal de 10-14 ml/h. e ensaiadas para a, actividade do NAF. A maior parte da actividade ê eluida na região de pE 8,8 (Figura 9).

PARTE UI: Caracter iza,ção Biológica e Fisico-quimioa do NAF

Exemplo 11: Propriedades fisico-químioas do NAF

NAF parcialmente purificado obtido por cromatografia, fosfooelulose (Exemplo 4) d usado nestas experiências.

Após a cromatografia era fosfooelulose, as fraeções com a mais elevada actividade de NAF são submetida a diálise durante o período nocturno a 4° C contra PBS usando-se para tal uma membrana, com 0 corte de peso meleoular de cerca de 100 dalfon.

A preparação obtida é então objecto dos seguintes tratamentos:

a) Incubação a 37° G com ou sem tripsina, quimotripsina ou proteinase K (lOO ttg/ml) seguida de adição de um excesso de BSA (2 mg/ml) para

interromper a proteólise do NAF;

b) Aquecimento a 56°C, 80°C ou 95°θ ( ©m comparação com 22° C para controlo)5

c) Exposição a pH2 ou 10 (a 22°) seguido de ajustamento a pH 7,4 ( em comparação com pH 7,4 para, controlo);·

d) Exposição a cloreto de litio 2Π, cloreto de guanidínio 613, 2 merca· ptoetanol á lfe ou dodeoil sulfato de sódio (SDS) a 0,5 $ durante 3 h a 22°, seguida, de diálise durante 24 horas a 4° contra PBS. Após as adições, as amostras de NAF são tratadas âa mesma, forma e testadas para observação ds possível influência sobre o ensaio de NAF.

Gomo se conclui a partir dos resultados apresentados na Tabela 2, 0 NAF é notoriamente resistente à inactivação. A sua, actividade é destruída após incubação com diferentes proteases, indicando que o NAF é um polipéptido como contraste, o NAF é facilmente inactivado por aquecimento, condições de pH ácido ou alcalino, nem por exposição a SUS. E obtida alguma inactivação com 2-mercaptoetanol, cloreto de gua nídífiàc e cloreto de litio.

Tabela 2

Tabela 2

Propriedades Fisiooquimicas do NAF

Tratamento	Condições	actividade relativa
Temperaturas	22°, 3b	100
	56°, lb	82 .
	80°, 15 min	80
	951 5 min	66
pH 2,0	22°, 3 b	76
pH 10,0	22° 3 h	90
SDS 0,5 fo	22°, 3 h	100
2-mercaptoetanol 1,0$	22°, 3 b	30
Cloreto de lítio 2 M	22°, 3 h	52
Cloreto de guanidinio 6 M	22°, 3 h	68
Tripsina 100 jmg/ral	37°, 4 b	100
	37°, 12 h	8
(X^chimotripsãna lOOjAg/ml	37°, 4 b	80
	37°, 12 b	1
Proteinase K lOOJag/ml	37°, 12 b	0

Bxemplo 12: Exocitose induzida por NAF ( indução da libertação de — grânulos pelo NAF de neutrõfilos humanos) ~ **

Neutrõfilos (5 ς 10° /ml) em suspensão em FBS/BSA são pré-incubadas com ou sem citocalasina B (5 g/ml) a 37° durante 5 minutos.

A libertação de grânulos é então iniciada por adição de estímulo, por exemplo, NAF ou um estímulo padrão. A reacção ê enterronpida após quinze minutos por rápido arrefecimento em gelo seguida de centrifugação para sedimentar as células. Determina-se o teor em vitamina B 12 - protéina ligante. glucuramidose e lactato debidrogenase no meio isento de células e nas peletes ceculares, e a libertação destes constituintes é calculada em percentagem do conteúdo total celular ( B. Dewalt e H. Baggiolini, Methods Bnzynol. 132 - 1986 - 267).

Os efeitos do NAF sobre a libertação da vitamina B 12 - proteina ligante e^-glucuronidase - os quais são constituintes dos grânulos específicos e a específicos e azurofílicos, respectivamente - estão sumarizados na Tabela 3s

Tabela 3

Exocitose dependente de estimulo do conteúdo de grânulos pelos neutrofilos humanos

Estímulos

Percentagem de libertação de

CB

Vit. B12- proteína ? Jp-glneuro- dehidrogenase ligante nidase láctea

nenhum		—	6,0 t	θ ,4	2,1 ϊ 0,4	6,2 t 2,5
NAF	50 ul	-	12,9 *	1,6	2,7 * 1,3	5,8 t 0,7
NAF	100 ul	-	13,9 -	2,1	3,0 t ι,3	6,8 i 2,2
FMLP	0,luM	-	14,0 -	0,9	2,3 -0,8	5,7 - 1,1
Nenhum		+	10,0 -	1,1	2,4 ί 0,2	7,0 í 3,2
NAF	50 ul	4	25,6 *·	3,4	7,9 - 2,0	6,7 - 1,6
NAF	100 ul	4	26,8 ΐ	4,9	8,5 - 1,7	7,3-2,1
FMLP	0,1 uM	4	35,6 -	5,5	12,1 ΐ 4,4	5,3 -1,6

4.

valores médios - desvio padrao

Em neutrófilos normais, 0 NAF induz apenas a exocitose de grânulos específicos. Quando as células são pré tratadas com citocalasina B, no entanto, é obtida uma intensa libertação dos dois tipos de grânulos. Sob as últimas condições, a libertação de JEJ-gluouronidase é análoga à causada pela elastase, o marcador usado para ensaiar a actividade do NAF (Exemplo l). Em termos quantitativos, as propriedades indutoras de exocitose do NAF são similares às do péptido quimictáctico fMLP. Nenhum estímulo induz a libertação da enzima oitosolica lactatof-desidrogenase, indicando que o prejuízo celular ê despra*.

Exemplo 13 t Eclosão respiratória induzida por NAF ( indução da formação de superóxido pelo NAF de neutrófilos humanos).

A formaçao de supdróxido é medida a, 37 como a redução sensível SOB do ferricitocromo G (m. Market e al., Methods:Enzynol. 132 - 1984 -267). A mistura de ensaio (800 jú.) consiste em 0,75 x Í0^ células/ /ml de PBS - BSA contendo c.ítrcromo c 85 ^»M. As alterações de absorvân cias são registadas num espectrofotómetro com uma série de díodos Hewlett-Paohrad 8 451A equipado com uma covete de permuta de 7 lngares termostatizada. A Tabela 4 documenta a capacidade do NAF em elioitar a eclosão respiratória em neutrófilos humanos.

Tabela 4 ^Produção de superóxido dependente do NAF pelos neutrófilos humanos

Sedução de citporomo 0
NAF	Taxa máxima	Total em 3 minutos
(^1) 1	(nmol/min)	(nmol)
5	0, 81	0,89
10	1, 45 - 0,63	1,45 - 0,50
20	2,32 t o,56	2,16 t o,39
30 (	2. 51 í 0,55	2,391 o,55
50	3, 51 * 0,69	3,10 t 0,55
100	3, 69	3,69
f todos	os valores são expressos por	6 10 células
• Valores médios - desvio patrão r

obtido um aumento gradual da taxa máxima e da quantidade total de formação de superóxido com o aumento da quantidade do NAF. Tal como se pode mostrar por experiências comparativas, as quantidades de NAF oriIginadoras de níveis máximos de produção de superóxido correspondem às Ide indução máxima de exocitose.

Exemplo 14:Formaoao de BL O„ .Λ comparação com fMLP e G5a como estímulos Ae eclosão respiratória em neutrófilos humanos)

As propriedades do NAF, fMLP e G5a com estímulos da eclosão respiratória são comparadas determinando a produção de superóxido ou de péro xido de hidrogénio pelas células estimuladas, A formação do superóxido é determinada da forma referida no Exemplo 13. A formação do peróxido de hidrogénio é determinada por quimioluminescência (M. P, líuymaim e al., Anal. Biochem. 165 - 1987 - 371/378)· A mistura a ensaiar consiste em PBS-BSA compreendendo az ida de sódio 0,1 M, luminol 6

0,01 mM, peroxidase de rábano silvestre 9 U/ml e 10 neutrófxlos e é pré-incubada durante 10 minutos a 37°, a reacção é iniciada pela adição do estímulo usando uma microsseringa.

A Figura 10 representa a formação d.e superóxido induzida por quantidades crescentes de íTAF. Devido ao seu rápido começo, à sua elevada velocidade e permaturo nível, a resposta ao NAF parece-se muito com a provocada ft>ILP ou C5a. A resposta a NAF é acentuadamente intensificada por pré-tratamento das células com PAF (Figura 10) que também intensifica a produção de superóxido provocada por fMLP ou G5a. Uma comparação directa das respostas a NAF, fMLP e C5a é apresentada na Figura 9, Os registos de quimioluminescência da velocidade de formação de Hg Og em função do tempo realçam a similaridade das respostas. Estas medidas, bem como outras, mostram ainda que os tempos entre a adição do estímulo e 0 começo da produção de Hj Og induzida pelo NAF', fMLP e C5a são idênticos e elevam-se a oeroa de 2 segundos, como previamente se registou para fMLP, G5a, PAF e leucotrieno B4 (M.P. Wymann e al. J. Biol. Chem. 262 - 1987 - 12 048)« A semelhança quantitativa e qualitafiva de resposta dos neutrófxlos a NAF, a fMLP e a G5a indica que 0 NAF activa os neutrófilos ligando-se a um reoeptor superficial e comporta-se então como um receptor agonista.

V

Exemplo 15: Descriminação entre NAF e 05a

Tal como se referiu no Exemplo 14, o perfil de actividade do NAP em ! relação aos neutrófilos humanos ê similar ao da. de G5a. As similaridaI des entre estes dois pêptidos estendem-se âs propriedades físico-quíj micas que os distinguem tal como a resistência ao calor e â acidez.

i

Considerando que C5a e o NAP têm efeitos semelhantes sohre os neutrófilos, devem realizar-se experiências posteriores no sentido de ohter l| uma total descriminação entre estes dois factores. Expõem-se amostras de NAF e de C5a a soro humano fresco. Este tratamento sabe-se < que transforma G5a no seu derivado desarginilado relactivamente ânactivo por clivagem por meio de uma carhoxipeptidase. Como se mostra na Figura 11, o tratamento com o soro elimina completamente a actividade do G5a, não afeotando no entanto a actividade do NAF, demonstrando pois que estes dois agentes são estruturalmente diferentes

Exemplo 16: Evidência de que NAF tem o seu receptor específico nos neutrófilos

Quando neutrófilos são estimulados duas vezes com a mesma quantidade do mesmo receptor agonista ( por exemplo, fMLP) e a produção de superóxido ê registada como medida de resposta dos neutrófilos, a, segunda estimulação é virtualmente inactiva. Por outro lado, quando se usan agonistas que actuam sohre diferentes receptores em sequência ( por exemplo, fl-ILP seguido de 05a.) estas estimulações originam uma resposta normal. Experiências deste tipo são portanto usadas no sentido de se verificar se o NAP actua por meio de um seu seu próprio receptor ou por meio de um receptor tamhém usado por outros agonistas.

A Figura 12a mostra que os neutrófilos respondem normalmente a fMLP a seguir a primeiro tratamento NAF ou G5a.NA Figura. 12b são representados os resultados de repetidas estimulações com NAF e . G5u a concentrações que originam a formação de aproximadamente a mesma quanti-

dade de superóxido e depois uma segunda vez com o mesmo estímulo ou com estímulos alternados. Quando o mesmo agonista é aplicado pela segunda vez, as células não respondem à segunda estimulação. Belo contrário, obtém-se uma resposta normal a 05& ®m células estimuladas primeiro com NAF e ao ITAF dm células primeiramente estimuladas oom 05a» Como os neutrófilos mostram uma completia des-sensibilização a qualquer dos estímulos mas não des-sensibilização cruzada, 0 NAF e 0 05a pareceu exercer os seus efeitos estimulatórios pnr intermédio de receptores não relacionados, indicando que são estruturalmente diferentes. As combinações de ITAF com PAF, fMLP e leucotrieno B^ também não apresentam des-sensibilização cruzada. NAF actua, portanto, através de um receptor selec-tivo até agora desconhecido.

Exemplo 17: Acumula,ç-ao de neutrófilos e derrame de plasma induzido pela

ITAF em coelhos

Sáb examinadas respostas inflamatórias na pele d.e ooelhos albinos New

Zeland conscientes de 2,0 a, 2,5 kg. Sedimentam-se os eritrócitos do sangue dos coelhos dadores com hidroxietil celulose (Polysoienoes, Warrington, Pa.) e purificam-se os neutrófilos no plasma resultante rico em leucócitos (^94$ de neutrófilos ) por centrifugação com gradiente de densidade em Percoli (Pharmacia, Uppsala, Sweden). As células sao re-suspensas em solução de Tyrod isenta de Ga^ e Ug^ compreendendo ~ 6

1C$ de plasma pobre em plaquetas, a,té se obter uma concentração de 1Θ leucóoitos/ml e marcam-se durante 15 minutos à temperatura ambiente com JtiGi de ' índio-oxina (amersham) 10 células. As células marcadas são então lavadas por centrifugação com plasma pobre em plaquetas a 6

10$ e misturam-se aproximadamente 10 células por recipiente com albumina de soro humano (Amersham) com 10 ^».Gi de •'iodo e é injeotado intravenosamente através da veia, lateral da orelha, dos ooelhos com lesões inflamatórias em estudo. Fazem-se então injecção intradermais de agente inflamatórios e os animais são mortos duas horas após nos estudos com actinomicina D e polixina B, 4h depois em experienoias de res-

t posta à dose. A meio do período em que as células radio-identifiçadas estão em circulação, uma amostra de sangue é recolhida e são determinadas as actividades especifica,s dos neutrôfilos e do plasma no sangue, ffi determinada ao fim de cada experiência, a ridioaotividade nas lesões inflamatórias com um contador gamma de canais múltiplos, a actividade nos pontos de controlo da, pele é subtraída e é calculado o número abso luto de neutrôfilos e o volume de plasma acumulados nas lesões inflamatórias a partii* dns actividades específicas. 0 número de neutrôfilos em lesões inflamatórias são padronizadas entre animais expimindo os l resultados como número de oélulas/10 neutrôfilos que circulam/ ml de sangue periférico, de acordo oom o método de Gybulky e al., Am. J. Pathol. 124 - 1986 - 367.

NAF recombinante obtid.o como se descreve no Exemplo 19, ê dissolvido a 4CGyog/ml em meio essencial mínimo (50mI«í) com 0,45 K de NaCl (ph 6,5). A endotoxina (B. Coli sorotipo G55íBS, Sigpia, St. Louis, Mo.

é dissolvida numa solução salina, normal isenta de pirogenes fMLP é dissolvido em dimetil a 10 M e diluído para, concentrações de trabalhe em FPS. Polimixina, B e actinomicina D são dissolvidas em 1 ml de etanc' e diluida a 20 vezes por mistura, com NAF, endotoxina ou fKLP em PFS.

Em estudos sobre a inibição de respostas inflamatórias são injectadas ug de «Glímíxina B e 10 moles de actinomicina D por zona de pele com 10 moles de endotoxina. Em^- todas as experiências sao injectacte intradermicamente por zona através de agulhas do tamanho 26, oom 5 réplicas de ca,da tratamento em cada animal.

NAF induz um derrame do plasma, dependente da, dose (Figura 16) e acumulação de neutrôfilos (Figura 17) no intervalo de doses testadas (lO*^ a 10“⁹ moles por zona). Em comparação a endotoxina causa 0 derrame do plasma (figura 16) e a acumulação neutrófila (Figura 17) de intensidade 10 moles por zona. Em cinco coelhos o NAF é 3 a 10 vezes mais potente do que fKLP como estimulo ps,ra 0 derrame do plasma e a acumulação de neutrôfilos. A acumulação de neutrôfilos induzida por diluição do tampão usado para dissolver 0 NAF a,té à concentração

SV auQ presente nas soiuçoes originando 10 ^y moles por zona, nao difere das

respostas nas zonas que recebem somente PFS. A possibilidade de que a aetividade da preparaçao de NAF possa ser devida a uai contaminante de endotoxina é examinada por injecção de polimixina B (40jag/zona) juntamente com NAF, fSíLP ou endotoxina. A polimixina B causa 84/ da inibição da resposta à endotoxina (10 moles) mas não afecta a acumulação de neutrófilos induzida por NAF (ΐθ”^ moles) ou fMLP (l0~^ moles) (Figura 18), A injecção de um inibidor não-reversível da transcrição do RNA, aotinomioina D (10 moles/zona) conjuntamente oom 1(T moles de endotoxina cansa 90/ de inibição dos neutrófilos (figura 19) Em contraste, a aotinomioina D produz efeito sobre a acumulação de neu trófilos induzida pelo NAF (lO moles) (figura 19).

Os resultados mostram que o NAF é activo e induz a acumulação de neutrófilos dependendo da dose e o derrame do plasma em lesões inflamatórias. A potência molar do NAF ê comparável â quimiotáctica clássica C5a e LTB e 3 a 5 mais elevada do que fMLP, A acumulação de neutrófilo induzida pelo NAF nao é inibida pela injecção intradérmica simultânea de um inibidor de síntese das proteínas (aotinomioina D). Assim, NAF aotua directamente, como um agonista quimiotáctica tal como fNLP e não como endotoxina.

Exemplo 18: Exocitose induzida por NAF (efeitos sobre os neutrófilos de coelhos)

Isolam-se neutrófilos de coelhos a partir de sangue periférico ( obtido na veia ou na artéria do ouvido por sedimentação com dextrano segui da pela centrifugação com gradiente efe densidade Nypaque-Ficoll. Usa-s NAF natural purificado.

Condições de exocitose; 0,6 x 10 células (num volume total de 0,15 ml pré tratadas com titocalasina B durante 5 minutos a 37 » sao estimuladas com NAF (o,l - 100 nK) ou fMLP (lOO nM) durante 15 minutos. Determina-se a N - acetil - JB - glucosaminidase um marcador granular azurófilo, no meio isento de células. Os resultados são apresentados na Tabela 5·

Tabela 5

Exooitose induzida por NAF

Estímulo	Concentração (níí)	N-aceti-B-gluoosam inidase (pmol/min)
(nenhum)		41
NAF	0,1	' 53
	1,0	99
	10,0	139
	100,0	. 157
fMLP	100,0	181

PARTS IV: NAF Recombinante

Exemplo 19? Síntese e expressão do NAF em Ξ. Coli.

a) Síntese e purificação de oligonúoleotídos

Os oligonucleótidos ΟΝ- 1 9, ON-6 (ver Figura 13) sao sintetizados num sintetizador automático de DNA uando os métodos químicos usuais, com 3» - cianoetil - N,N - diisopropilfosfoamidina nuoleósidos como monómenos , num suporte sólido tal como gel de sílica Fractosil ou vidro poroso controlado (GPC) (S. L. Beaucage e Π.Η. Caruthers, Tetr. Letters 22 -/~198l0 1859; N. D. Sinba e al,, Nuoleio Aoids Res, 12

-[ 1984 J- 4539).

Os materiais destritilados são separados a partir do suporte por um tratamento de duas horas com amónia a 25$ à temperatura ©aifoientè todos os grupos protectores são eliminados ροχ* aquecimento da solução amoniacal durante 20 horas a 55 graus centígrados e os produtos são liofilizados.

A separação das matérias primas é efectuada por eleotroferese em gel de poliacrilamida (PAGE) com aorilamida 12$,hisacrilamida 0,3$, ureia 7«, tris-borato 0,089 M, ácido hórico 0,089 Ug, KDTA 0,00211 à 20V/cm, Oligonucleôtidos de comprimento inteiro são localizados por sombra de UV em placas de gel ds sílica flurescente; as porções de gel são cortadas e electroeluídas numa câmara de eluição. As soluções contentradas são des-salinizadas numa coluna de Biogel P2 (30 x 0,9 cm) por eluição com etanol a 10$ e liofilizadas.

** ^52

Amostras de OU- 1 a OIT·—6 sao marcadas radioaotivamente com -P -jÇATP e polinucleótidos quinase. Análises por PAG® autorradiografia confirmam que estes são homogéneos. As sequências ccrmectas são confirmadas por sequenciamento de Maxam-Gil-bert dos oligonucleôtidos imobilizados num papel de filtro modificado (A. Rosen-thal et al., Nuoleio Acids Res. 12 - /19857- 1173-1184).

b) Recozimento e ligação

A fim de reoozer e ligar, porções de 250 pmoles de oligonucleôtidos são fosforilados com de ^P-ATP (5000 ^Ci/mmol) e 9 unidades de polinucleótido-quinase em 20 ^il de tampão de quinase (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (1982), Gold Spring Harbor Laboratory, N. T.) durante 40 minutos a 37°, seguido por um tratamento durante 20 minutos com 5 mmoles de ATP não marcado. A reacção e interrompida com IJÚ. de EDTA 0,5 M a 7θ°· Os oligonucleótidos são purificados por absorção em cartuchos NENSORB 20 (Du Pont) e eluição com etanol a 20$ e o rendimento é aproximadamente 90$· θ

- recozimento a ligação simultâneos de iguais quantidades de 30 a 100 I pmoles de ON-2 a OH-5 5’-fosforilado e 0N-1 e 0M-6 não fosforilados sao feitos em 25 de tampão (Tris-HCl 125 mMX pH 7,6) compreendendo |I Mg Clg 25 mM. A mistura é aquecida durante 4 minutos a 90°, arrefecil) da a 14 em 3 horas e incubado durante mais 14 horas a 14°. 0 volume ji é ajustado a 60 j»l com Tris-HCl 9® wi-I, pH 7,6 MgClg 10 mH ditiotrei( tol 10 mM, ATP 1 mM, 0,1 mg/ml de albumina de sor.o de bovino contendo

1600 a 2000 unidades de T4-ligase. A ligação é levada a cabo durante 14 horas a 14° e interrompida pela adição de 1 pl de EDTA 0,511 ® aque_; cimento a 7θ°· Após a extracção com fenol, a solução aquosa é levada ε. acetato de sódio 0,3 M e acetato de magnésio 0,01 II, o ADET é precipitado com etanol e os produtos são purificados por PAGE (^acrilamida, ureia 7 M) com uma carga máxima de 10 pmoles de ΑΏΪΙ por uma ranhura de 1,5 cm em camadas de gel com a espessura de 0,5 mm. 0 produto de i comprimento correcto é identificado por autorradiografia, o segmento j do gel cor’tado e o ADN é electroeluído durante 6 horas a 200V em Biotrap BT100 e precipitado oom etanol, originando um rendimento final de 5 a 8 pmoles de ADN de dupla-camada purificado por 100 pmoles de oli' gonucleótidos.

i j °) Cloues de genes sintéticos

S Uma amostra de 110 ng de gene de UAF sintético isolado é ligado com 260 ng de plasmídio de DNA pBS com Sphl/BamK&eorte purificado em gel de agarose (Stratagene). Um décimo desta mistura de ligação é usada ' para transformar 200 de células da es^étie Ξ. Coli estirpe 5& nada competente pelo método de D. Hanaban, J. Uol. Biol. 166 (1983) 557-580, e aproximadamente 320 colónias resistentes à ampicilina são produzidas por ng de ADH inteodurido. Seis clones são picados e desem·volvem-se durante a noite em caldo/ampicilina. 0 plasmídio de ADN é preparado ( H.C. Birnbolm e J. Doly., Muoeio Aoids Res. J (1979) 1513-1523) ® experimentado em gel de agarose a 1$. 0 ADU puro superhélice é isolado por electroferese das bandas em papel 3 MM (Whatman) e centrifugado em tubos de Eppendorf. Depois da extracção com fenol e a

precipitação com etanol, o DNA é sequenciado pelo método de terminação de oadeias de plàsmíâos desnaturados com alcalis usando os iniciadores T3 e T7 (Stratgene) e a enzima sequenase (E.J. Ghen et al., DNA £ (1985) 165-170).

Dos seis clones, três, isto é, clones 1,2 e 6, continham a sequência de NAF correcta, Os outros três clones tinham erros: o clone 3 tinha um resíduo G extra inserido após o codão de iniciação ATG, pelo que a sequência de código completa fica posta fora da fase. No olone 5, C é substituído por T na posição 34, pelo que se forma um código de interrupção após 0 aminoácido N² 6. Finalmente,no clone 4 falta um G na posição 13· Esta posição não está na sequência do código mas na região entre o codão de iniciação e o sítio de ligação do ribosoma.

plasmidio contém a sequência correota ( Clone 6) é cortado com enzimas de restrição Ciai e BamHI e o fragmento de 237 pares de bases é isolado a partii* de um gel de agarose por eluição para w papel 3ΓΙΜ como acima se descreve. Este fragmente é então ligado a um fragmento de DMA linear que contêm, da esquerda para a direita:

- um sítio de endonuclease de restrição BamHI;

- um terminador de transcrição sintético { CCCGGGCGATGAATGGCCCGGG ou CCCGGGGCGATTCATCGCGCGGG)5

- uma secção da plasmidio pAT153, do sítio de Sall no nuoleótido n² ' 651 através da origem da replicação e d.e gene de resistência à ampicilina até ao sitio EcoBI no nuoleótido n² 0;

- 0 promotor tripfofano E. Coli;

- um sitio Ciai situado aproximadamente 5 pares de bases a jusante dc stio de ligação do robisoma no promotor.

plasmídio de expressão resistente à .ampicilina resultante, designa; do por p(NAF)- 6T3 (Figura, 14) , é transformado em células de Ξ. Goli í da estirpe ΗΒ101.

I terminador de transcrição nao ê essencial para a expressão de NAF em E. Goli. Isso permite uma terminação eficiente do NAF-mBNA produzido pela polimerase de E. Goli e assim aumenta a rendimento da expressão . 0 NAF pode no entanto ser expresso no mesmo vector sem 0 terminador de transcrição, mas o rendimento é então, no entanto, 30 a 5θ$ inferior.

Este código genético sintético para NAF bem como outros genes que ..codificam para a mesma sequência de péptidos básicos mas que têm uma · sequência de nucleótidos diferente ou codificam para péptidos de diferentes comprimentos pode também ser expresso em E. Goli usando outros promotores, por exemplo, os promotores lambda PL ou Lao ou Tàc de 23. , Goli. Os genes podem também sei* introduzidos usando outros vectores e expressos noutros organismos, por exemplo, leveduras, fungos, células animais, linhas de células bactéria,na,s, planta,s e organismos superiores transgénicoa.

c) Expressão

A expressão de p(lTAF)-6T3 em 22. Goli ΞΒ 101 é levado a oabo da seguinte forma:

Pré-cultura 1: 5θρύ- de uma cultura em glicerol da linha de células mantida a -20° são adicionados a 10 ml do meio LB estéril (10 g/l de triptona,, 5 g/l de extracto de levedura-© 10 g/l de NaOl) contendo 100 ^ig/ml de ampicilina. A cultura é agitada num incubador durante 8 horas a 37° e 200 rpm.

Pré-cultura 2:8 ml do meio da pré-cultura. 1 sao inoculados em 1 litro de meio M9 (j. II. Killer Experimenta in Molecular Genetics (1972) Gold Spring Harbor Laboratory, N. Y. ,p431-433) contendo glucose 0,2$, ácidos casamínicos (Difco) 0,5$, 25 mg/l de triptofano e 100^ig/ml de

ampiciNaa· Esta cultura, é agitada num incubador durante 15-16 horas a 37° e a 200 rpm.

I _ .

I (Fermentação: a fermentação principal á levada a cabo num fermentador de 7θ litros com um volume de trabalho de 35 1· Emprega-se o.jnesmo médio que para a pré-oultura 2 com a excepção de que apenas são adicionados 5 mg/l de triptofano* k pré-cultura 2 é inoculada neste meio., e a fermentação é continuada a 37 até se obter uma densidade.óptica de 2,8 a 600 nm (ΒΟ^θθ). Quando a ΏΟ^θθ .atinge 2,8, é adicionado ácido Indol-acrllico em etanol até à concentração final de 20 mg/l. Depois de quatro horas, a ΰΟ^θθ tinha aumentado até 13,5; a centrifugação produz uma pelete de 516 g.

d) Purificação de NAF recombinante

Às células de E. Goli contendo NAF recombinante são armazenadas a -20? Lotes de 100 g são lavados com 100 ml de Tris --HG1 20 mM,~.pH 8,0 contendo NaCl 50 mH, ressuspendem-se em 25© ml do mesmo tampão e são desfeitas a 175-Kg/c® (2500 psi)..numa prensa Francesa (Aminco). Depois I da centrifugação a47000 g durante 40 minutos, .a pelete é resssuspeni dida no mesmo tampão, recentrifugada e armazenada a -20°. Porções.de ί 10 g sao suspensas em 100 ml de HBS-NaOEt 50 mH, pH 6,5, guanidina-HGl , 6 M, agitadas durante 1 hora e submetidas à diálise contra ácido aoé1 tico a 0,5/· 0 produto resultante da..diálise é clarificado por centri·:

! fugaçãoe carregado em aliquotas numa coluna Mono-S (HR 5/5, Pharmacia). À coluna é lavada con HES-NaOH 50 mM, pH 6,5, contendo NaCl .0,2 M e eluida com um caudal de 0,5 mil/minuto con um gradiente linear no mesmo tampão (.0,2 a 0,5 M de NaOl). As fracções com um maior teor de NAF são reunidas e cromatografadas numa coluna de poros largos de inversão de fase de HPLG (0,46 x 125 mm Vydao G4TP) ex.ácido trifluoracético. a 0,1/ e um gradiente de acetonitrilo de 20 a 60/ a um caudal de passagem de 1 ml/ minuto.

PARTE V: Identificação de NAF Natural e Recombinante

ÍW

I Exemplo 20: Identifioaoao físioo-quimioa ! 0 NAF recuperado por cromatografia em fase líquida a alta pressão ] (ver Exemplo 19) é considerado puro com base, em dois critérios:-os .

geles de SDS-poliacrilamida manchados oom prata apresentam apenas uma j única banda que coincide com NAF natural (l jig de NAF recombinante da ί fracçao do pico de HPLC na pista 2 em comparação oom um jag de NAF-na ! pista 3 com citccromo o . de padrões de peso molecular (12,5 kd) e apro tinina (6,5 kd) na pista l).e a degradação de Bdman de péptido clivado com ácido fórmico origina.isequênoias das extremidades de amino e de ..carboxi que correspondemà do NAF natural com 72 aminoácidos. A , análise dos aminoácidos está de acordo com a composição que é esperada a partir da sequência. Não se encontra metionina indicando que este resíduo é provavelmente removido pelas bactérias.

Exemplo 21: Identificação Bioquímica

Ensaia-se NAF natural e recombinante em paraàelo em neutrófilos humanos. Eles provocam-alterações virtualmente idênticas em-Ca ^T citosólico livre, originando um aumento máximo a uma-concentração tão peque na como 3 nM (Figura 15) · Obtém-se uma resposta de. explosão respirató I ~ ria dependente da concentração quase idêntica oom as duas preparações no intervalo de 1 a 30 nH como se detecta.por quimioluminescência.JL equivalência entre NAF-natural e recombinantetambém se reflecte nas medições de quimiotaxia e exooitose. A migração quimiotáctica observa-se entre 0,1 e 10 mM com um efeito máximo de 1 nH (Tabela 6). Com ambos os péptidos, se observa uma significativa libertação de protâín de ligação de vitamina dos grânulos específicos ia 0,3 uM β de~.be ta-glucuronidase de grânulos azurófilos a 1 nM.-Estè efeito aumenta com a concentração do estímulo como se mostra na Tabela 7·

Tabela 6

Quimiotaxia dos neutrófilos induzida por NAF

NAF (nM)	nat	reo
0, 1	98 ± 6	88-6
1 r,o	123 4 6	124-3
' 10,0	127 4 3	126 ± 4

Os valores representam médias ± desvios padrão da migração frontal principal em . A migração aliatória em ausência de um estímulo quimiotâctico é 6l - 5 um. Nat^NAF natural rec^NAF reoombinante

Tabela 7

Exocitose proteína ligante da Vit. B^₂ beta-glucuronidase

NAF (nM)	nat	rec	nat	- rec
ί 0,3	7,8 * 3,6	5,4 1 2,0	1,1 - 0,8
3,0	21,9 * 4,2	20,2 ± 3,7	8,2 - 1,9
30,0	28,4 4 3,7	28,1 - 3,8	14,2 ±2,1

Percentagem de libertação de neutrófilos pré-tratados com citocalasi6 na Β (4 -X 10 células/ml) estimulados com NAF natural (nat) ou NAF reoombinante (rec). A libertação dos correspondentes controlos não tratados é dedurida. Média - desvio padrão (n^a3)♦

Claims (6)

1*- Processo para a preparação de factor de activação dos neutrõfilos (FAN) f caracterizado pelo facto de compreender a purificação por meio da cromatografia, da parte sobrenadante de culturas de monocitos huma nos e sua recuperação, ou pelo facto de compreender a síntese, a purificação e a ligação dos correspondentes oligonucleotidos, a olonação do gene de FAN sintético resultante, a sua expressão, recuperação e purificação.

2&- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a cromatografia em fosfato de celulose, hidroxila, heporina-sefarose ou a cromatografia em fane liquida sob alta pressac inversa numa coluna 04 ou de GN-propilo.

3^a- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender uma purificação mediante o enfoque cromático.

4*- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a expressão em Bscberichia coli.

5^a- Processo de acordo com a reivindicação 1, .caracterizado pelo fae to de compreender a utilização de qualquer dos oligonucleótidos ON-1 até 011-6.

6a- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fac to de compreender a utilização dò vector de expressão p(FAN)-6T3·