BRPI0920531A2 - anticorpos anti-cxcr4 e o uso dos mesmos para o tratamento de câncer - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A SELEÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-CXCR4, ANTICORPO ISOLADO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA DE BACTÉRIA OU LEVEDURA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, USO DE UM ANTICORPO E HIBRIDOMA DE MURINO. A presente invenção refere-se a um novo anticorpo isolado, ou os compostos derivados ou fragmentos funcionais do mesmo, capaz de ligar à CXCR4, mas também de induzir alterações conformacionais dos homodímeros e/ou heterodímeros de CXCR4. Mais particularmente, a presente invenção refere-se aos anticorpos 414H5 e 515H7, específicos para as proteína CXCR4, assim como seu uso para o tratamento de câncer. Composições farmacêuticas que compreendem estes anticorpos e um processo para seleção destes anticorpos também estão abrangidos.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A SELEÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-CXCRA, ANTICORPO I1SO- : LADO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA DE BACTÉRIA OU LEVEDURA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, USO DE UM ANTICORPO E HIBRIDOMA DE MURINO".

A presente invenção refere-se a novos anticorpos, em particular, anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados, capazes de se ligar especificamente a receptores de quimiocina (CXCR), assim como a se- quências de aminoácido e ácidos nucleicos que codificam estes anticorpos. Em um aspecto, a invenção refere-se a novos anticorpos, compostos derivados ou fragmentos funcionais, capazes de se ligar especificamente a CXCR4 e que possuem fortes atividades antitumorais. A invenção compreende, também, o uso destes anticorpos como um fármaco para o tratamento preventivo e/ou te- rapêutico de câncer, assim como nos procedimentos ou kits relacionados ao diagnóstico de câncer. Por fim, a invenção compreende composições compre- endendo tais anticorpos em combinação ou conjugação com outros compostos anticâncer, como anticorpos, toxinas, agentes citotóxicos/citostáticos, e o uso dos mesmos para a prevenção e/ou tratamento de determinados cânceres.

As quimiocinas são pequenos peptídeos secretados que contro- lama migração de leucócitos ao longo de um gradiente químico de ligante, conhecido como gradiente de quimiocina, especificamente durante as rea- ções imunes (Zlotnick A. ef al., 2000). Elas são dividas em duas grandes subfamílias, CC e CXC, com base na posição de seus resíduos de cisteína NH? terminais, e se ligam a receptores acoplados à proteína G, cujas duas principais famílias são designadas CCR e CXCR. Mais de 50 quimiocinas humanas e receptores 18 de quimiocina foram descobertos até o momento.

Muitos tipos de câncer possuem uma complexa rede de quimio- cinas que influencia a infiltração de células imunes do tumor, assim como o crescimento, sobrevivência, migração e angiogênese das células tumorais.

As próprias células imunes, células endoteliais e células tumorais expressam receptores de quimiocina e podem responder a gradientes de quimiocina. Estudos de amostras de biópsia de câncer humano e modelos de câncer de camundongo mostram que a expressão do receptor de quimiocina na célula

- 2/93 de câncer está associada a uma capacidade metastática aumentada.

Célu- las malignas de diferentes tipos de câncer possuem diferentes perfis de ex- pressão de receptor de quimiocina, mas o receptor de quimiocina 4 (CXCR4) é o mais comumente encontrado.

Células de pelo menos 23 tipos diferentes de cânceres humanos de origem epitelial, mesenquimal e hematopoiética expressam o receptor CXCRA4 (Balkwill F. et a/., 2004). O receptor de quimi- ocina 4 (também conhecida como fusina, CD184, LESTR ou HUMSTR) exis- te como duas isoformas que compreendem 352 ou 360 aminoácidos.

O resí- duo Asn11 é glicosilado, o resíduo Tyr21 é modificado pela adição de um grupo sulfato e Cys 109 e 186 são ligados com uma ligação de dissulfeto sobre a parte extracelular do receptor (Juarez J. et al, 2004). Este receptor é expresso por diferentes tipos de tecidos normais, células T naíive não de memória, células T regulatórias, células B, neutrófi- . los, células endoteliais, monócitos primários, células dendríticas células natu- ral killer, células-tronco hematopoiéticas CD34+ e em baixa quantidade no ] coração, cólon, fígado, rins e cérebro.

O CXCR4 desempenha um papel chave no tráfego de leucócitos, linfopoese de célula B e mielopoese. . O receptor CXCRA4 está superexpresso em um grande número de cânceres incluindo, mas não se limitando a cólon (Ottaiano A. et al. 2004), mama (Kato M. et al., 2003), próstata (Sun Y.X. et al., 2003), pulmões [carcinoma de pequenas células e de células não pequenas (Phillips R.J. et al., 2003)], ovário (Scotton CJ. et a/., 2002), pâncreas (Koshiba T. et al. 2000), rins, cérebro (Barbero S et a/., 2002), glioblastoma e linfomas.

O único ligante do receptor CXCRA4 descrito até o momento é o fator derivado de células do estroma-1 (SDF-1) ou CXCL12. O SDF-1 é se- cretado em grande quantidade nos linfonodos, medula óssea, fígado, pul- mões e em uma menor quantidade pelos rins, cérebro e pele.

O CXCR4 também é reconhecido por uma quimiocina antagonista, a proteína inflama- tória de macrófago viral Il (vMIP-II) codificada pelo herpes vírus humano tipo | O eixo CXCR4/SDF-1 desempenha um papel chave no câncer e está implicado diretamente na migração e invasão que leva às metástases.

- 3/93 De fato, as células de câncer expressam o receptor CXCRA4, migram e en- tram na circulação sistêmica. Então, as células de câncer param nos leitos vasculares em órgãos que produzem altos teores de SDF-1 onde elas proli- feram, induzem angiogênese e formam tumores metastáticos (Murphy PM., 2001). Este eixo também está envolvido na proliferação celular através da ativação da via de quinase regulada por sinal extracelular (ERK) (Barbero S. et al, 2003) e angiogênese (Romagnani P., 2004). De fato, o receptor CXCRA4 e seu ligante SDF-1 claramente promovem a angiogênese pela es- timulação da expressão de VEGF-A que, por sua vez, aumenta a expressão de CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. ef al., 2002). É fato conhecido, ainda, que os macrófagos associados ao tumor (TAM) se acumulam em áreas hipóxicas dos tumores e são estimulados para cooperar com as células tumorais e promover angiogênese. Foi observado que a hipóxia supra regulou seletiva- 1 mente a expressão de CXCR4 em vários tipos celulares incluindo TAM (Mantovani A. ef al, 2004). Recentemente foi demonstrado que o eixo CXCRA4/SDF-1 regula o transporte/residência de células progenitoras/tronco hematopoiéticas (HSC) CXCR4+ e pode desempenhar um papel na neovas- cularização. Evidências indicam que além de HSC, CXCRA4 funcional tam- bém está expresso em células-tronco de outros tecidos (células-tronco com- prometidas com o tecido = TCSCs) de modo que SDF-1 pode desempenhar um papel central na quimioatração de TOSCs CXCR4+ necessárias para regeneração de órgãos/tecidos, mas estas TOSC podem, também, ser uma origem celular de desenvolvimento de câncer (teoria de células-tronco can- cerígenas). Uma origem de câncer a partir de células-tronco foi demonstrada para leucemia humana e recentemente para vários tumores sólidos como cérebro e mama. Há vários exemplos de tumores CXCR4+ que podem se originar das células-tronco CXCR4+ específicas de tecidos/órgãos normais, como leucemias, tumores cerebrais, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de mama, hepatoblastoma, cânceres de ovário e cervicais (Kucia M.

etal,2005). O direcionamento de metástases tumorais pela interferência com o receptor CXCRA foi demonstrado in vivo com o uso de um anticorpo mo-

. 4/93 noclonal dirigido contra o receptor CXCRA4 (Muller A. et al., 2001). Resumi- damente, foi mostrado que um anticorpo monoclonal dirigido contra o recep- tor CXCRA4 (Mab 173 R&D Systems) reduziu significativamente o número de metástases de linfonodos em um modelo de câncer de mama ortotópico (MDA-MB231) em camundongos SCID. Outro estudo (Phillips R.J ef al, 2003) também mostrou o papel crítico do eixo SDF-1/CXCR4 em metástases em um modelo de carcinoma de pulmão ortotópico (A549) com o uso de an- ticorpos policlonais contra SDF-1, mas neste estudo não houve efeito sobre o crescimento tumoral nem sobre a angiogênese. Vários outros estudos também descreveram a inibição de metástases in vivo com o uso de duple- xes de siRNAs de CXCRA4 (Liang Z. et al., 2005), antagonistas bioestáveis do peptídeo de CXCRA4 (Tamamura H. ef al., 2003) ou crescimento tumoral in vivo com o uso de um antagonista de pequena molécula de CXCRA4, como * — AMD 3100 (Rubin uJ.B. et al. 2003; De Falco V. ef al., 2007) ou Mab (patente WOZ2Z004/059285 A2). Desta forma, CXCR4 é um alvo terapêutico validado ] para cânceres.

O receptor de quimiocina 2 (CXCR2), outro receptor de quimioci- na, também é descrito como um alvo interessante na oncologia. De fato, o CXCR?2 transmite um sinal de crescimento celular autócrino em vários tipos de células tumorais e pode também afetar o crescimento tumoral indireta- mente pela promoção de angiogênese (Tanaka T. et al. 2005). O receptor de quimiocina CXCR2 possui 360 aminoácidos. Ele é expresso principalmente em células endoteliais e especialmente durante a neovascularização. Várias quimiocinas se ligam ao receptor CXCR2: CXCLS5, -6, -7, IL-8, GRO-a, -B e - y, que pertencem às quimiocinas pró-angiogênicas ERL+. O receptor CXCR2 compartilha homologias de sequência com o receptor CXCRA4: 37% de identidade de sequência e 48% homologia de sequência. O eixo CXCR2/ligantes está envolvido em vários mecanismos de crescimento tumo- ral, como metástase (Singh RK. et al., 1994) proliferação celular (Owen J.D.

etal,1997)ena angiogênese mediada por quimiocinas ERL+ (Strieter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Por fim, os macrófagos e neutrófilos associados ao tumor são elementos chave do crescimento tumoral induzido

. 5/93 i por inflamação e quimiocinas, como CXCLS5, IL-8 e GRO-a iniciam o recru- tamento de neutrófilos.

A dimerização surgiu como um mecanismo comum para regular a função dos receptores acoplados à proteína G, e dentre estes estão os receptores de quimiocina (Wang J. e Norcross M., 2008). Foi mostrado que a homo e a heterodimerização em resposta à ligação de quimiocinas é neces- sária para o início e alteração da sinalização por inúmeros receptores de quimiocina. Evidências crescentes suportam o conceito de que dímeros ou oligômeros de receptores provavelmente são a unidade funcional básica dos receptores de quimiocina. Os dímeros do receptor de quimiocina são encon- trados na ausência de ligantes e as quimiocinas induzem alterações confor- macionais dos dímeros do receptor. Sabe-se que CXCRA4 forma homodíme- ros e também heterodímeros, por exemplo, com o receptor de opioide 5 7 (DOR) (Hereld D., 2008) ou CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). Neste úl- timo exemplo, peptídeos derivados dos domínios transmembrana de CXCR4 inibiram a ativação pelo bloqueio de transições conformacionais induzidas pelo ligante do dímero (Percherancier Y. et al., 2005). Outro estudo mostrou que peptídeo de CXCRA4-TMA4, um peptídeo sintético da região transmem- . brana de CXCRA, reduz a transferência de energia entre os protômeros de —homodímeros de CXCR4 e inibe a migração induzida por SDF-1 e polimeri- zação de actina em células malignas (Wang J. ef al., 2006). Mais recente- mente, também foi descrito que o CXCR7 formou heterodímeros funcionais com CXCR4 e aumentou a sinalização induzida por SDF-1 (Sierro F. ef al, 2007). Outros exemplos de heterodímeros constitutivos incluem estudos mostrando a interação de CXCR1 e CXCR?2 e formação dos respectivos ho- modímeros. Nenhuma interação foi observada para qualquer um destes com outro GPCR (adrenoreceptor alfa(1A)), indicando a especificidade da intera- ção de CXCR1 e CXCR2 (Wilson S. ef al., 2005).

Conforme anteriormente mencionado, os receptores CXCR4 e —CXCR?2 são interessantes alvos para tumores. A interferência com estes re- ceptores deve inibir o crescimento tumoral e metástases de uma forma muito eficaz pela redução da proliferação e angiogênese da célula tumoral, migra-

. 6/93 ção e invasão celular tumoral, recrutamento de neutrófilos e macrófagos pe- los tumores e pela inibição de células-tronco cancerígenas com CXCRA4. Um dos aspectos inventivos da presente invenção é gerar um anticorpo monoclonal de camundongo que induz alterações conformacionais dos dímeros de CXCRA.

A invenção abrange um Mab 414H5 de CXCRA4 (ou fragmentos do mesmo) capaz de se ligar e induzir alterações conformacio- nais de homodímeros de CXCRA4 e de heterodímeros de CXCR4/CXCR?2, e que tem fortes atividades antitumorais tanto em xenoenxerto de camundon- gos quanto em modelos de sobrevivência.

A invenção também abrange um Mab 515H7 CXCRA4 (ou fragmentos do mesmo) capaz de se ligar e induzir alterações conformacionais de homodímeros de CXCR4 e de heterodímeros de CXCR4/CXCR2, e que tem fortes atividades antitumorais.

Um Mab 414H5 anti-CXCR4inibe o crescimento tumoral em modelo de xenoenxerto ' de MDA-MB-231 e aumenta a sobrevivência de camundongos em um mode- lo de U937. Eles induzem alterações conformacionais em homodímeros de CXCRA4, mas também em heterodímeros de CXCR4/CXCR2. Esta nova pro- priedade deve ser de interesse para aplicação em terapia do câncer devido aos importantes papéis destes dois receptores de quimiocina no câncer.

Foi observado que o direcionamento de homo e heterodímeros dos receptores aumenta o efeito terapêutico do Mab.

De fato, demonstrou- se, por exemplo, que um Mab (h7C10) dirigido para receptores de IGF-IR e híbridos de insulina/IGF-1 foi mais potente em inibir o crescimento tumoral in vivo do que um Mab dirigido apenas para IGF-IR (Pandini G., 2007). Além disso, os Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 são antago- nistas silenciosos para CXCRA, eles não alteram o sinal basal em ensaios in vitro, mas inibem a sinalização induzida por SDF-1 em diferentes ensaios (ligação de GTPyS, liberação de cAMP) e também são capazes de inibir a proliferação e migração de células tumorais induzida por SDF-1 in vitro.

As moléculas que atuam como agonistas parcial ou como ago- nistas inversos exibem atividade intrínseca na ausência de ligantes.

Estes tipos de moléculas estabilizam, respectivamente, um estado de GPCR de alta afinidade ou de baixa afinidade, mesmo na ausência de ligante, ativando

: 7/93 ou inibindo, assim, as cascatas de sinalização à jusante (Galandin et al, 2007; Kenakin, 2004).

No caso dos Mabs 414H5 e 515H7, estas moléculas se compor- | taram como antagonistas silenciosos, sem qualquer atividade intrínseca no receptor CXCR4 na ausência de SDF-1. Este aspecto farmacológico é pro- vavelmente associado a menos efeitos colaterais adversos em comparação aos agonistas parciais ou inversos, como já observado para ligantes de re- ceptor opioide (Bosier e Hermans, 2007). De fato, a atividade de funcional de ambos os Mabs 414H5 e 515H7 é totalmente dependente da presença de SDF-1e nenhuma modulação da atividade do receptor CXCRA4 será obser- vada em tecidos e órgãos nos quais o ligante de SDF-1 não é expresso, se- cretado ou fornecido pela corrente sanguínea. Desta forma, os Mabs 414H5 e 515H7 são, provavelmente, menos tóxicos em comparação a outros ligan- " tes do receptor CXCR4 com eficácia positiva ou negativa. Além disso, os antagonistas silenciosos são a espécie em minoria no espaço farmacológico (Wurch et a/., 1999, Kenakin, 2004).

Surpreendentemente, os inventores foram capazes de gerar, pe- la primeira vez, anticorpos capazes de fazer ligação a CXCRA4, e também capazes de induzir alterações conformacionais dos homodímeros e/ou hete- rodímeros de CXCRA4. Mais particularmente, os anticorpos da invenção são capazes de induzir alterações conformacionais dos homodímeros de CXCRA, e também dos heterodímeros de CXCR4/CXCR?2.

No relatório descritivo a seguir, a expressão no plural "dímeros de CXCR4" deve ser compreendida como abrangendo os homodímeros de CXCR4e também os heterodímeros de CXCR4/CXCR2.

Deve ser mencionado neste estágio, que estes anticorpos nunca foram descritos na técnica anterior. Além disso, deve ser mencionado que a existência de heterodímeros de CXCR4/CXCR?2 nunca foi descrita.

Uma parte da invenção é a observação da existência de um he- terodímero formado por CXCR4 e CXCR?2.

Então, em um aspecto particular, a presente invenção se refere a um complexo isolado que compreende ou que consiste em heterodímero

. 8/93 de CXCR4/CXCR2.

De preferência, a parte do composto de CXCRA do dito comple- xo heterodimérico de CXCR4/CXCR2 é uma das duas isoformas humanas de CXCRA4 selecionada do grupo que consiste em: - isoforma b do receptor de quimiocina 4 (motivo C-X-C) [Homo sapiens] que tem a sequência mostrada no número de nº de acesso do Genbank NP 003458, SEQ ID No. 29:

MEGISIY TSDNYTEEMGSGDY DSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSHFLTGIVGN GLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPEWAVDAVANWYEGNFL CKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWI PALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSC YCHISKLSHSKGHQOKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLENKQGCEFE

NTVHKWISITEALAFFHCCLNPILY AFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKG - KRGGHSSVSTESESSSFHSS; - a isoforma a do receptor de quimiocina 4 (motivo C-X-C) [Homo ] sapiens] que tem a sequência mostrada sob o número de nº de acesso do Genbank NP 001008540, SEQ ID No. 30:

MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDY DSMKEPCFREENANFNKIFLPTIY SIFLTGI VGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLEVITLPEWAVDAVANWYFG NFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRY LAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVG VWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFY PNDLW VV VFQFQHIMVGLILPGIVI LSCYCUISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGI: SIDSFILLEIKQGC

EFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILY AFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILS KGKRGGHSSVSTESESSSFHSS; - uma variante de splicing alternativo transcricional ou uma vari- ante natural do mesmo, que possui pelo menos 95% de identidade a uma destas isoformas b ou a que possui a SEQ ID No. 29 ou 30; e - um fragmento da mesma capaz de ser reconhecido especifi- camente pelo seu ligante natural, fator derivado de célula do estroma-1 (SDF-1), e que tem, de preferência, pelo menos 100, 150 e 200 aminoácidos de comprimento. De preferência, a parte do composto de CXCR2 do dito comple- xo heterodimérico de CXCR4/CXCR2 é selecionada do grupo que consiste

. ' 9/93 em: - o receptor beta de interleucina 8 [Homo sapiens] que tem a se- quência mostrada no número de nº de acesso do Genbank NP 001548, SEQ ID No. 31:

MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVY VITY ALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLINLALADLLFALTLPIWAASKV NGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKE ICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSE GFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQOKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLL

ADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQOKFRHGLLKI — LAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL; - uma variante de splicing alternativo transcricional ou uma vari- ante natural do mesmo, que tem pelo menos 95% de identidade com este - receptor beta de interleucina 8 que tem a SEQ ID No. 31; e - um fragmento do mesmo capaz de ser reconhecido especifi- —camente pela !l-8 e que tem, de preferência, pelo menos 100, 150 e 200 aminoácidos de comprimento. Neste aspecto particular, a presente invenção compreende, também, um RNA ou DNA isolado que codifica um polipepti- deo que compreende o dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2.

Esta invenção compreende, adicionalmente, um construto de á- cido nucleico, de preferência, um vetor de expressão, tal como um plasmí- dio, que codifica o dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR?2.

A invenção compreende, adicionalmente, uma composição que compreende pelo menos um construto de ácido nucleico, de preferência, um vetor de expressão, tal como um plasmídio, que codifica a parte CXCR4 do dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2, e um segundo construto, de preferência, um vetor de expressão, tal como um plasmídio, que codifica a parte CXCR2 do dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR?2.

Neste aspecto, a invenção compreende, adicionalmente, um mé- todo para a preparação de uma célula hospedeira recombinante que expres- saodito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2, em que este método compreende uma etapa de transformar a dita célula hospedeira: a) com um construto de ácido nucleico, de preferência, um vetor

. 10/93 de expressão, tal como um plasmídio, que codifica o dito complexo hetero- dimérico de CXCR4/CXCR2; ou b) com pelo menos um construto de ácido nucleico, de preferên- cia, um vetor de expressão, tal como um plasmídio, que codifica a parte —CXCRA4 do dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2, e um segundo construto, de preferência, um vetor de expressão, tal como um plasmídio, que codifica a parte CXCR2 do dito complexo heterodimérico de CXCRA4/CXCR?2.

Em uma modalidade preferencial, a dita célula hospedeira é uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero.

Em uma modalidade preferencial, o(s) construto(s) de ácido nu- cleico que codifica(m) o dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2 codifica(m) também um primeiro marcador que está associado (particular- , mente por ligação covalente) com a sequência de CXCRA, tal como o mar- —cadorluc, e um segundo marcador que está associado (particularmente por ligação covalente) com a sequência de CXCR2, tal como o marcador de GFP (isto é, para análise de BRET).

A invenção compreende, também, um método para a seleção de um composto que tem atividade anticâncer ou que pode ser usado para a preparação de uma composição para o tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a etapa de: a) colocar a célula hospedeira recombinante da presente inven- ção que expressa o dito complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2, em contato com o composto a ser testado; e b) determinar se este composto é capaz de modular, de prefe- rência, inibir a atividade deste complexo heterodimérico de CXCR4/CXCR2 na célula hospedeira recombinante.

Em um primeiro aspecto, um objetivo da presente invenção é um processo para a geração e seleção dos anticorpos de acordo com a inven- ção Mais particularmente, a invenção se refere a um processo para a seleção de um anticorpo anti-CXCRA4, ou um de seus fragmentos funcionais

. 11/93 ou derivados, capazes de inibir a ativação dependente do ligante e a ativa- ção independente do ligante de CXCRA, o dito processo compreendendo as seguintes etapas: i) fazer uma triagem dos anticorpos gerados e selecionar os an- ticorpos capazes de ligar especificamente a CXCR4 e também modular a ativação de CXCRA; ii) testar os anticorpos selecionados na etapa i) e selecionar os anticorpos capazes de induzir alteração conformacional dos homodímeros de CXCRA, e então iii) testar os anticorpos selecionados na etapa i) e selecionar os anticorpos capazes de induzir alteração conformacional dos homodímeros de CXCRA4.

A expressão "modular", deve ser compreendida como um au- , mento ou uma inibição. De preferência, os anticorpos selecionados da in- venção devem inibir a ativação de CXCRA4.

Conforme explicado anteriormente, a indução de alterações con- formacionais dos dímeros de CXCRA4 é um aspecto importante da invenção, uma vez que estes anticorpos apresentarão um real interesse para uma po- pulação maior de pacientes.

A geração do anticorpo pode ser feita através de qualquer méto- do conhecido por um versado na técnica como, por exemplo, fusão de uma célula de mieloma com células de baço de camundongos imunizados ou ou- tras espécies compatíveis com as células de mieloma selecionadas [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Os animais imunizados podem incluir camundongos transgênicos com loci de imunoglobulina humana que, então, produzem anticorpos humanos diretamente. Outra modalidade possível pode consistir em uso de tecnologias de apresentação em fago para a triagem de bibliotecas.

A etapa de triagem i) pode ser feita por qualquer método ou pro- cesso conhecido pelo versado na técnica. Como exemplos não restritivos, pode-se mencionar ELISA, BlAcore, imunoistoquímica , análise de FACS e triagens funcionais. Um processo preferencial consiste em uma triagem por

, 12/93 análise de FACS do transfectante de CXCRA4 e de pelo menos uma linhagem celular tumoral para se certificar de que os anticorpos produzidos serão ca- pazes de reconhecer também o receptor nativo sobre células tumorais.

Este processo será descrito mais precisamente nos exemplos a seguir.

À expres- são"modulara ativação de CXCR4" se destina a modular pelo uma das ati- vidades mostradas nos exemplos 4, 5, 7 e 13 abaixo.

De preferência, modular: - A ligação específica nas membranas celulares do SDF-1 ligan- te sobre o receptor CXCRA (vide Exemplo 4), particularmente, por competi- ção sobre a membrana da célula eucariótica transformada, tais como mem- branas de CHO-K1, expressando de maneira estável o receptor CXCR4 hu- mano selvagem; - A ligação específica nas membranas celulares do GTPyS no " receptor CXCRA4 (vide Exemplo 5), particularmente, sobre a membrana de células eucarióticas transformadas, tais como células NIH-3T3, expressando de maneira estável e constitutiva as membranas do receptor CXCRA4 selva- gem; - A inibição mediada por CXCRA4 da produção de CAMP (vide Exemplo 7); e . - A mobilização mediada pelo receptor CXCRA4 dos estoques de cálcio intracelular (vide Exemplo 13). Com mais preferência, esta modulação de pelo menos uma des- tas atividades é uma inibição da atividade.

Em uma modalidade preferencial das etapas ii) e ili) de seleção do processo da invenção, as ditas etapas ii) e iii) consistem em avaliação dos anticorpos por análise BRET sobre células que expressam CXCR4- RLuc/CXCRA4-YFP e CXCRA4-Rluc/CXCR2-YFP, respectivamente, e seleção de anticorpos capazes de inibir pelo menos 40%, de preferência, 45 %, 50 %, 55 % e, com a máxima preferência, 60% do sinal de BRET.

A tecnologia BRET é uma tecnologia conhecida como sendo re- presentativa da dimerização de proteína [Angers et al, PNAS, 2000, 97:3684-89].

, 13/93

A tecnologia BRET, usada nas etapas ii) e iii) do processo, é bem conhecida pelo versado na técnica e será detalhada nos exemplos a seguir.

Mais particularmente, BRET (Bio luminescence Resonance Energy Transfer) é uma transferência de energia não radiativa que ocorre entre um — doador bioluminescente (Renilla Luciferase (Rluc)) e um aceptor fluorescen- te, um mutante de GFP (proteína verde fluorescente) ou YFP (proteína ama- * rela fluorescente). No presente caso, EYFP (proteína amarela fluorescente intensificada) foi usada.

A eficácia da transferência depende da orientação e da distância entre o doador e o aceptor.

Então, a transferência de energia só pode ocorrer se as duas moléculas estiverem próximas (1 a 10 nm). Esta propriedade é usada para gerar ensaios de interação proteína- proteína.

De fato, de modo a estudar a interação entre os dois parceiros, o primeiro é fun- dido geneticamente à luciferase de Renilla e o segundo ao mutante amarelo " da GFP.

As proteínas de fusão são geralmente, mas não obrigatoriamente, expressas em células de mamífero.

Na presença de seu substrato de mem- brana permeável (coelenterazina), a Rluc emite luz azul.

Se o mutante de GFP estiver mais perto do que 10 nm da Rluc, pode ocorrer uma transferên- cia de energia e um sinal amarelo adicional pode ser detectado.

O sinal de BRET é medido como a razão entre a luz emitida pelo aceptor e a luz emiti- da pelo doador.

Desta forma, o sinal de BRET aumentará conforme as duas proteínas de fusão forem colocadas em proximidade ou se uma alteração conformacional colocar os mutantes de Rluc e GFP mais próximos.

Se a análise BRET consistir em uma modalidade preferencial, qualquer método conhecido pelo versado na técnica pode ser usado para mediras alterações conformacionais dos dímeros de CXCRA4. Sem limitação, as seguintes tecnologias podem ser mencionadas: FRET (transferência de energia de ressonância por fluorescência [Fluorescence Resonance Energy Transfer]), HTRF (fluorescência homogênea resolvida no tempo [Homoge- nous Time resolved Fluorescence]), FLIM (microscopia de fluorescência de formação de imagens ao longo do tempo de vida [Fluorescence Lifetime |- maging Microscopy]) ou SW-FCCS (espectroscopia de fluorescência de cor- relação cruzada ao comprimento de onda único [single wavelength fluores-

« 14/93 cence cross-correlation spectroscopy]).

Outras tecnologias clássicas também podem ser usadas, como coimunoprecipitação, AlphaScreen, reticulação química, Duplo-híbrido, cro- matografia de afinidade, ELISA ou Far-Western Biotting.

Em um aspecto particular do processo de acordo com a inven- ção, a etapa ii) consiste em avaliar os anticorpos por análise BRET sobre células que expressam CXCR4- RLuc/CXCR4-YFP e selecionar anticorpos capazes de inibir pelo menos 40% do sinal do BRET.

Em um outro aspecto particular do processo de acordo com a in- venção,aa etapa iil) consiste em avaliar os anticorpos por análise BRET em células que expressam CXCRA4-RLuc/CXCR2-YFP e selecionar anticorpos capazes de inibir pelo menos 40% do sinal de BRET.

Em um segundo aspecto, um objeto da invenção é um anticorpo ' isolado, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, que é obtido —pelodito processo. O dito anticorpo ou um de seus fragmentos ou derivados, é capaz de se ligar especificamente a CXCR4 humano e, se necessário, de preferência, também é capaz de inibir a ligação natural de seu ligante, o dito anticorpo sendo também capaz de induzir alterações conformacionais de dímeros de CXCRA.

As expressões "fragmentos funcionais e derivados" será definida em detalhes posteriormente no presente relatório descritivo.

Deve ser compreendido que a invenção não se refere aos anti- corpos na forma natural, isto quer dizer, eles não estão no seu ambiente na- tural, mas eles foram capazes de serem isolados ou obtidos por purificação a partirde fontes naturais, ou ainda obtidos por recombinação genética, ou por síntese química, e que eles podem, então, conter aminoácidos não naturais, conforme será descrito posteriormente.

Mais particularmente, de acordo com um outro aspecto da in- venção, reivindica-se um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que compreen- de pelo menos uma região determinante de complementaridade, CDR, esco- lhida a partir de CDRs que compreendem as sequência de aminoácido SEQ

ID Nos. 1 to 12.

Mais particularmente, de acordo com um outro aspecto da in- venção, reivindica-se um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que compreen- de pelomenos uma região determinante de complementaridade, CDR, esco- lhida a partir de CDRs que compreendem as sequência de aminoácido SEQ ID Nos. 2, 5 ou 40 a 49.

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo isolado, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que compreende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das sequências SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 1,2, 3, “ 4, 5ou86.

De acordo com um outro aspecto, a invenção se refere a um an- ticorpo isolado, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que compreende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das se- quências SEQ ID Nos. 40, 2, 41, 42, 5 ou 43 ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 40, 2, 41,42, 50uU 43.

Um "fragmento funcional" de um anticorpo significa, em particu- lar, um fragmento de anticorpo, como fragmentos Fv, scFv (sc=cadeia úni- ca), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia-vida tenha sido aumentada. Estes fragmentos funcionais serão descri- tos em detalhes posteriormente na presente descrição.

Um "composto derivado" ou "derivado" de um anticorpo significa, em particular, uma proteína de ligação composta de uma estrutura de peptí- deo e pelo menos uma das CDRs do anticorpo original de modo a preservar sua capacidade de reconhecer CXCRA4. Estes compostos derivados, bem conhecidos de um versado na técnica, serão descritos em detalhes posteri- ormente na presente descrição.

Com mais preferência, a invenção compreende os anticorpos, seus compostos derivados ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, notadamente quiméricos ou humanizados, obtidos por recombinação genética ou síntese química.

De acordo com uma modalidade preferencial, o anticorpo de a- cordo com a invenção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcio- nais, é caracterizado pelo fato de consistir em um anticorpo monoclonal.

"Anticorpo monocional" é compreendido como significando um anticorpo originado a partir de uma população quase homogênea de anticor- pos. Mais particularmente, os anticorpos individuais de uma população são idênticos, com a exceção de algumas possíveis mutações de ocorrência na- tural que podem ser encontradas em proporções mínimas. Em outras pala- vras, um anticorpo monoclonal consiste em um anticorpo homogêneo que se ' origina do crescimento de um único clone de célula (por exemplo, um hibri- —doma, uma célula hospedeira eucariótica transfectada com uma molécula de i DNA que codifica o anticorpo homogêneo, uma célula hospedeira procarióti- ca transfectada com uma molécula de DNA que codifica o anticorpo homo- gêneo, etc.) e é caracterizado, geralmente, por cadeias pesadas de uma e apenas uma classe e subclasse, e cadeia leve de apenas um tipo. Os anti- corpos monoclonais são altamente específicos e são direcionados contra um único antígeno. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos poli- clonais que incluem tipicamente vários anticorpos dirigidos contra vários de- terminantes, ou epitopos, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único epitopo do antígeno.

Deve ser compreendido que a invenção não se refere aos anti- corpos na forma natural, isto é, eles não são retirados do seu ambiente natu- ral, mas eles são isolados ou obtidos por purificação a partir de fontes natu- rais, ou obtidos por recombinação genética, ou por síntese química e, assim, eles podem conter aminoácidos não naturais, conforme será descrito abaixo.

Mais particularmente, de acordo com uma modalidade preferen- cial da invenção, o anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado por compreender uma cadeia leve que compre-

ende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das sequências de aminoácido SEQ ID No. 1, 2 ou 3, ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 1, 2 ou 3; ou ele compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das sequências de aminoácido SEQ ID Nos. 4, 5 ou 6, ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de pre- ferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 4, 5 ou 6.

De acordo com outra modalidade, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende pelo menos uma das três CDRs das sequências SEQ ID No. 1, 2 ou 3, ou ' pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 1,2 ou3.

Em uma forma preferencial, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende as três seguintes CDRs, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, sendo que: - a CDR-L1 compreende a sequência SEQ ID No. 1 ou 9, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 1 ou 9; - a CDR-L2 compreende a sequência SEQ ID No. 2 ou 10, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2 ou 10; - a CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 3, ou uma se- quência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a — sequência SEQID No. 3.

De acordo com uma modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3. De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou umde seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 9, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3. Mais particularmente, os anticorpos da invenção, ou um de seus 10 compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma de três CDRs das sequências SEQ ID Nos. 4, 5 ou 6, ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e ' 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 4,50u6.

Com mais preferência ainda, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada compreendendo as três seguintes CDRs, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3, em que - a CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID Nos. 4, 7 ou 11, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID Nos. 4, 7 ou 11; - a CDR-H2 compreende a sequência SEQ ID Nos. 5 ou 12, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 5 ou 12; e - a CDR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 6 ou 8, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 6 ou 8.

De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada que compreen-

de a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 7, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 8.

De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada compreenden- do a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 11, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 12 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6.

Mais particularmente, de acordo com uma modalidade preferen- cial da invenção, o anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia leve que compreende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das sequências de aminoácido SEQ ID Nos. 40, 2 ou 41 ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e ' 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No.

40,2 ou41; ou ele compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma CDR escolhida dentre as CDRs das sequências de aminoácido SEQ ID Nos. 42, 5 ou 43, ou pelo menos uma CDR cuja sequência tem pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após ali- nhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 42, 5 ou 43.

De acordo com outra modalidade, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende pelo menos uma das três CDRs das sequências SEQ ID Nos. 40, 2 ou 41, ou pelo menos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 40, 2 ou 41.

De uma forma preferencial, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende as trêsseguintes CDRs, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que: - a CDR-L1 compreende as sequências SEQ ID No. 40 ou 46, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 40 ou 46; - a CDR-L2 compreende as sequências SEQ ID No. 2 ou 47, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2 ou 47; e - a CDR-L3 compreende a sequência SEQ ID No. 41, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No 41.

De acordo com uma modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 40, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41.

De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou : um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 46, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 47 e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41.

Mais particularmente, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato dequeelescompreendem uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma das três CDRs das sequências SEQ ID Nos. 42, 5 ou 43, ou pelo me- nos uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 42,5 ou 43.

Com mais preferência ainda, os anticorpos da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracterizados pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada compreendendo as três seguintes CDRs, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3, em que: - a CDR-H1 compreende a sequência SEQ ID Nos. 42, 44 ou 48, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID Nos. 42, 44 ou 48;

- a CDOR-H2 compreende a sequência SEQ ID No. 5 ou 49, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 5 ou 49; - a CDOR-H3 compreende a sequência SEQ ID No. 45 ou 43, ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 45 ou 43 De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada que compreen- deaCDR-H1da sequência SEQ ID No. 44, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 45.

De acordo com outra modalidade particular, os anticorpos, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, são caracteriza- ' dos pelo fato de que eles compreendem uma cadeia pesada que compreen- deaCDR-H1da sequência SEQ ID No. 48, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 49 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 43.

Na presente descrição, os termos "polipeptídeos", "sequências de polipeptídeo", "peptídeos" e "proteínas ligadas a compostos de anticorpo ou suas sequências" são intercambiáveis.

Deve ser compreendido que a invenção não se refere aos anti- corpos na forma natural, isto é, eles não são retirados do seu ambiente natu- ral, mas eles são isolados ou obtidos por purificação a partir de fontes natu- rais, ou obtidos por recombinação genética, ou por síntese química e, assim, eles podem conter aminoácidos não naturais, conforme será descrito abaixo.

Em uma primeira modalidade, a região determinante de com- plementaridade, ou CDR, significa as regiões hipervariáveis das cadeias pe- sada e leve de imunoglobulinas, como definido por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5º Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, e edições posteriores). Há três C- —DRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve. Aqui, os termos "CDR" e "CDRs" são usados para indicar, dependendo do caso, uma ou mais, ou mesmo todas as regiões contendo a maior parte dos resíduos de aminoácido responsáveis pela afinidade de ligação do anticorpo pelo antígeno ou epito- po que ele reconhece. Em uma segunda modalidade, por regiões de CDR ou CDR(s), pretende-se indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves dasimunoglobulinas, como definido por IMGT.

A numeração única de IMGT foi definida para comparar os do- mínios variáveis independentemente do receptor de antígeno, do tipo de ca- deia, ou da espécie [Lefranc M. -P., Inmunology Today 18, 509 (1997) / Le- franc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. Na numeração única de IMGT, os aminoácidos conservados sempre possuem a mesma posição, por exemplo, cisteíina 23 (Ist-CYS), triptofano 41 (TRP-conservado), aminoácido ' hidrofóbico 89, cisteína 104 (2º-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ouJ-TRP). A numeração única de IMGT fornece uma delimitação padroni- zada das regiões estruturais (FRI-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 398 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinan- tes de complementaridade: CDRI-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. As lacunas representam posições desocupadas, os comprimentos de CDR-IMGT (mostrado entre parênteses e separados por pontos, por exemplo, [8.8.13]) se tornam informação crucial. A numeração única de IMGT é usada em representações gráficas bidimensionais, chama- das de IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. e Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21- 30(2007)),eem «estruturas tridimensionais em IMGT/estrutura 3D-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nu- cl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)).

Há três CDRs de cadeia pesada e três CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é usado aqui para indicar, dependendo do caso, uma destas regiões, ou várias, ou mesmo todas as regiões contendo a maior par- te dos resíduos de aminoácido responsáveis pela afinidade de ligação do anticorpo pelo antígeno ou epitopo que ele reconhece. Para maior clareza,

deve ser compreendido que na descrição a seguir, e mais particularmente nas tabelas 2 e 3, as CDRs serão definidas pela numeração de IMGT, pela numeração de Kabat e pela numeração comum.

A numeração comum reagrupa parte dos resíduos de cada CDR que são comuns para as CDRs, conforme definido pelos sistemas de nume- ração de IMGT e de Kabat.

O sistema de numeração de IMGT define as CDRs de acordo com o sistema de IMGT definido acima, enquanto o sistema de numeração de Kabat define as CDRs de acordo com o sistema de Kabat definido acima.

Mais particularmente, a CDR-L1 consiste na SEQ ID No. 1 (QSLYNSRTRKNY) nos sistemas de numeração comum e de IMGT e SEQ ID No. 9 (KSSOSLYNSRTRKNYLA) no sistema de numeração de Kabat. Com relação a CDR-L2, ela consiste na SEQ ID No. 2 (WAS) ' nos sistemas de numeração comum e de IMGT e SEQ ID No. 10 (WASTRES) no sistema de numeração de Kabat. A CDR-L3 consiste na SEQ ID No. 3 (KOSYNLRT) para todos os três sistemas de numeração.

Para a cadeia pesada, a CDR-H1 consiste na SEQ ID No. 4 (TDYY) no sistema de numeração comum, na SEQ ID No. 7 (GFTFTDYY) no sistema de numeração de IMGT e na SEQ ID No. 11 (TDYYMS) no sis- tema de numeração de Kabat. A CDR-H2 consiste na SEQ ID No. 5 (IRNKANGYTT) nos sistemas de numeração comum e de IMGT e na SEQ ID No. 12 (FIRNKANGYTTEYSASVKG) no sistema de numeração de Kabat.

Finalmente, a CDR-H3 consiste na SEQ ID No. 6 (DIPGFAY) nos sistemas de numeração comum e de Kabat, e consiste na SEQ ID No. 8 (ARDIPGFAY) no sistema de numeração de IMGT.

Mais particularmente, a CDR-L1 consiste na SEQ ID No. 40 (QSLFNSRTRKNY) nos sistemas de numeração comum e de IMGT e SEQ ID No. 46 (KSSOSLFNSRTRKNYLA) no sistema de numeração de Kabat.

Com relação a CDR-L2, ela consiste na SEQ ID No. 2 (WAS) nos sistemas de numeração comum e de IMGT e SEQ ID No. 47 (WASARDS) no sistema de numeração de Kabat. A CDR-L3 consiste na SEQ ID No. 41 (MQOSFNLRT) para todos os três sistemas de numeração.

Para a cadeia pesada, a CDR-H1 consiste na SEQ ID No. 42 (DNY) no sistema de numeração comum, na SEQ ID No. 44 (GFTFTDNY) no sistema de numeração de IMGT e na SEQ ID No. 48 (DNYMS) no siste- ma de numeração de Kabat.

A CDR-H2 consiste em SEQ ID No. 5 (IRNKANGYTT) nos sis- temas de numeração comum e IMGT e na SEQ I|D No. 49 (FIRNKANGYTTDYSASVRG) no sistema de numeração de Kabat.

Finalmente, a CDR-H3 consiste na SEQ ID No 43 (DVGSNYFDY) nos sistemas de numeração comum e de Kabat, e consiste em SEQID No. 45 (ARDVGSNYFDY) no sistema de numeração de IMGT. No sentido da presente invenção, a "porcentagem de identidade” entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a por- centagem de resíduos de nucleotídeos ou de aminoácidos idênticos entre as ' duas sequências a serem comparadas, obtida após alinhamento ótimo, esta porcentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas se- quências sendo distribuídas aleatoriamente ao longo de seu comprimento. À comparação entre duas sequências de ácido nucleico ou de aminoácido é tradicionalmente executada pela comparação das sequências após alinha- mento ótimo das duas, a dita comparação sendo podendo ser conduzida por segmento ou pelo uso de uma "janela de alinhamento". O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser executado, além da comparação manual, através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], através do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], através do método de — pesquisade similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] ou através de programas de computador com o uso destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Soft- ware Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou pelo programa de comparação BLAST NR ou BLAST P).

A porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucleico ou de aminoácido é determinada pela comparação das duas se- quências otimamente alinhadas, na qual a sequência de ácido nucleico ou de aminoácido sendo comparadas podem ter adições ou deleções em rela- ção à sequência de referência para alinhamento ótimo entre as duas se- quências. A porcentagem de identidade é calculada pela determinação do número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou nucleotídeo é —idênticoentre as duas sequências, de preferência, entre as duas sequências completas, dividindo o número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de alinhamento e multiplicando o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade entre as duas sequências. Por exemplo, o programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequen- ces-anewtool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250) disponível na página da internet http:/Wwww.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, pode ser usado com os parâmetros padrão (notavelmente para os parâmetros "penalidade por lacuna aberta" ' ("open gap penalty"): 5, e "penalidade por extensão da lacuna" ("extension gap penalty"): 2; a matriz selecionada sendo, por exemplo, a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa); a porcentagem de identidade entre as duas sequências a comparar é calculada diretamente pelo programa. Para a sequência de aminoácido que exibe pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade a uma sequência de ami- —noácido de referência, exemplos preferenciais incluem as que contêm a se- quência de referência, determinadas modificações, notavelmente uma dele- ção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, truncamento ou extensão. No caso de substituição de um ou mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, são preferenciais as substituições nas quais os amino- ácidos substituídos são trocados por aminoácidos "equivalentes". Aqui, a expressão "aminoácidos equivalentes" se destina a indicar quaisquer amino- ácidos que serão provavelmente substituídos por um dos aminoácidos estru- turais, entretanto, sem modificar as atividades biológicas dos anticorpos cor- respondentes e dos exemplos específicos definidos abaixo.

Os aminoácidos equivalentes podem ser determinados tanto por sua homologia estrutural com os aminoácidos pelos quais eles são substituí- dos ou com base nos resultados de ensaios comparativos de atividade bio-

lógica entre os vários anticorpos que serão provavelmente gerados.

Como um exemplo não limitador, a tabela 1 abaixo resume as possíveis substituições que serão provavelmente executadas sem resultar em uma modificação significativa da atividade biológica do anticorpo modifi- cado correspondente; substituições inversas são naturalmente possíveis sob as mesmas condições. Tabela 1 | : reg he | É conhecido pelos versados na técnica que no estado atual da técnica a maior variabilidade (comprimento e composição) entre as seis C- DRs é encontrada nas três CDRs de cadeia pesada e, mais particularmente,

na CDR-H3 desta cadeia pesada. Consequentemente, será evidente que as CDRs características preferenciais dos anticorpos da invenção, ou de um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, serão as três CDRs da cadeia pesada, isto é, para o 414H5, as CDRs codificadas pelas sequências SEQIDNos.7,5,8e11,12,6, respectivamente, definidas de acordo com IMGT e Kabat e, para o 515H7, as CDRs codificadas pelas sequências SEQ ID Nos. 44, 5, 45 e 48, 49, 43, respectivamente, definidas de acordo com IMGT e Kabat. Com mais preferência ainda, a CDR correspondente à CDR- H3 codificada pela sequência SEQ ID No. 8 ou 6 para o 414H5 e 45 ou 43 parao515H7. Em uma modalidade específica, a presente invenção refere- se a um anticorpo murino, ou compostos derivados ou fragmentos funcionais do mesmo.

Outra modalidade da invenção apresenta um anticorpo, ou seus ' compostos derivados ou fragmentos funcionais, que compreende uma ca- deialeve que compreende as três CDRs a seguir: : CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 1; CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 ou de uma sequência com pelomenos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2; e CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 3 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 4 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 4; CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 ou de uma sequência com — pelomenos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 5; e CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 6.

Mais uma outra modalidade da invenção apresenta um anticor- po, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que com- preende uma cadeia leve que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 1; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 ou de uma sequência com pelomenos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência Ú SEQ ID No. 3 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 7 ou de uma sequência : com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 7; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- ciaSEQIDNo.5;e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 8 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 8.

Mais uma outra modalidade da invenção apresenta um anticor- po, ouum composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que com- preende uma cadeia leve que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 9 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 9; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 10 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 10; e

- CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 3 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 11 ou de uma sequência com pelomenos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 11; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 12 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 12; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 6.

Um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional ' do mesmo, de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que com- preende: ' - uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1, a CDR- L2 da sequência SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da se- quência SEQ ID No. 3; e - uma cadeia pesada que compreende a CDR-H1 da sequência SEQID No. 7,a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da se- quência SEQ ID No. 8.

Em outra modalidade, um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a invenção é caracteriza- do pelo fato de que compreende: - uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 9, a CDR- L2 da sequência SEQ ID No. 10 e a CDR-L3 da se- quência SEQ ID No. 3; e - uma cadeia pesada que compreende a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 11, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 12 e a CDR-H3 da se- — quênciaSEQ ID No.6.

De acordo com mais uma outra modalidade, o anticorpo da in- venção, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracteri-

zado pelo fato de que ele compreende uma sequência de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 13 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 13; e em que ele compreende uma sequência de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 14 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 14. Outra modalidade da invenção apresenta um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, que compreende uma cadeia leve que compreende as três seguintes CDRs: CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 40 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 40; ' CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 ou de uma sequência com pelomenos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% identidade após : alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2; e CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 41 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 42 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 42; CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 5; e CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 43 ou de uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 43.

Mais uma outra modalidade da invenção apresenta um anticor- po, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que com-

preende uma cadeia leve que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 40 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 40; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 2; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- ciaSEQID No. 41 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 44 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- “cia SEQIDNo.44; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 ou de uma sequência : com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 5; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 45 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- ciaSEQID No. 45.

Mais uma outra modalidade da invenção apresenta um anticor- po, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que com- preende uma cadeia leve que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 46 ou de uma sequência com pelomenos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 46; - CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 47 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 47; e - CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 41 e uma cadeia pesada que compreende as três CDRs a seguir: - CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 48 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 48; - CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 49 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- cia SEQ ID No. 49; e - CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 43 ou de uma sequência com pelo menos 80% de identidade após alinhamento ótimo com a sequên- ciaSEQID No. 43.

Um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que com- preende: Ú - uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQID No. 40, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da se- ' quência SEQ ID No. 41; e - uma cadeia pesada que compreende a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 44, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da se- quência SEQ ID No. 45.

Em outra modalidade, um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a invenção é caracteriza- do pelo fato de que compreende: - uma cadeia leve que compreende a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 46, a CDR- L2 da sequência SEQ ID No. 47 e a CDR-L3 da se- quência SEQIDNo.41;e - uma cadeia pesada que compreende a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 48, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 49 e a CDR-H3 da se- quência SEQ ID No. 43.

De acordo com mais uma outra modalidade, o anticorpo da in- venção,ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, é caracteri- zado pelo fato de que ele compreende uma sequência de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 50 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 50; e em que ele compreende uma sequência de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 51 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID No. 51.

Como observado acima, a invenção também se refere a qual- quer composto derivado de um anticorpo conforme descrito na invenção. Mais particularmente, o anticorpo da invenção, ou seus com- postos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que o dito composto derivado consiste em uma proteína de ligação que compre- ende um arcabouço de peptídeo sobre o qual pelo menos uma CDR é enxer- tada de modo a preservar todo ou parte das propriedades de reconhecimen- É to de parátopo do anticorpo inicial.

. 15 Uma ou mais sequências dentre as seis sequências de CDR : descritas na presente invenção podem também estar presentes sobre o ar- cabouço de proteína das várias imunoglobulinas. Nesse caso, a sequência de proteína torna possível recriar um esqueleto de peptídeo favorável ao enovelamento das CDRs enxertadas, permitindo a eles preservar suas pro- —priedades de reconhecimento de antígeno do parátopo.

Em geral, um versado na técnica sabe como determinar o tipo de arcabouço de proteína sobre o qual enxertar pelo menos uma das CDRs que geradas a partir do anticorpo original. Mais particularmente, sabe-se que para serem selecionados, tais arcabouços devem satisfazer o maior número de critérios, da seguinte forma (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167- 187): - boa conservação filogenética; estrutura tridimensional conheci- da (como, por exemplo, por cristalografia, espectroscopia de RMN ou qual- quer outra técnica conhecida de um versado na técnica); - pequeno tamanho; - pouca ou nenhuma modificação pós-transcricional; e/ou - facilidade para serem produzidos, expressos ou purificados.

A origem destes arcabouços de proteína pode ser, mas não se limita às estruturas selecionadas dentre: fibronectina e, de preferência, o domínio de fibronectina tipo 1Il 10, lipocalina, anticalina (Skerra A., J.

Biote- chnol, 2001, 74(4):257-75), proteína Z originada do domínio B da proteína A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A ou proteínas com um motivo repe- tido, como a "repetição de anquirina" (Kohl et a/., PNAS, 2003, vol. 100, Nº 4, 1700- 1705), a "repetição de Armadillo", a "repetição rica em leucina" e os "tetratricopeptídeos repetidos". Os arcabouços derivados de toxinas como, por exemplo, toxinas de escorpiões, insetos, plantas, moluscos etc., e os inibidores de proteína da sintase neuronal do óxido nítrico (PIN) também devem ser mencionados.

Um exemplo não restritivo destas construções híbridas é a in- serção da CDR-H1 (cadeia pesada) de um anticorpo antiCD4, especialmen- “te, 13B8.2, em uma das alças na PIN, a nova proteína de ligação assim obti- da preservando as mesmas propriedades de ligação que o anticorpo original ' (Bes et al., Biochem.

Biophys.

Res.

Commun., 2006, 343(1), 334-344). De forma puramente ilustrativa, a enxertia da CDR-H3 (cadeia pesada) de um anticorpo antilisozima VHH em uma das alças da neocarzinostatina (Nicaise et al, Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891) pode também ser menciona- da Por fim, conforme descrito acima, estes arcabouços de peptídeo podem compreender de uma a seis CDRs originadas do anticorpo original.

De preferência, mas sem ser um requisito, um versado na técnica seleciona- rá pelo menos uma CDR da cadeia pesada, a última sendo conhecida como sendo primariamente responsável pela especificidade do anticorpo.

A sele- ção de uma ou mais CDRs relevantes é óbvia para um versado na técnica, que então escolherá técnicas conhecidas adequadas (Bes et a/, FEBS Let- ters 508, 2001, 67-74). Um aspecto específico da presente invenção refere-se a um mé- todo para selecionar um composto derivado de um anticorpo de acordo com a invenção, o dito composto derivado sendo capaz de inibir in vitro e/ou in vivo o crescimento de células tumorais e o dito composto derivado compre-

endendo um arcabouço de peptídeo sobre o qual pelo menos uma CDR de anticorpo é enxertado, caracterizado pelo fato de que ele inclui as seguintes etapas:

a) a colocação em contato, in vitro, de um composto, que com-

preende um arcabouço de peptídeo sobre o qual pelo menos uma CDR de anticorpo é enxertada, com uma amostra biológica contendo células tumo- rais capazes de crescer sob condições que permitem que estas células cresçam; e

« —b) seleção do dito composto, caso o dito composto seja capaz deinibirocrescimento destas células tumorais,

e caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma CDR enxertada é selecionada dentre as seguintes CDRs: - a CDR da sequência SEQ ID No. 1, 9, 40, 46 ou uma sequên- ' cia com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identi- dade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 1, 9, 40, 46; ' - a CDR das sequências SEQ ID No. 2, 10, 47 ou uma sequên- cia com pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identi- dade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 2, 10, 47; - a CDR das sequências SEQ ID No. 3, 41 ou uma sequência com pelomenos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 3, 41;

- a CDR das sequências SEQ ID No. 4, 7, 11, 42, 44, 48 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 4, 7, 11,

42,44,48,

- a CDR das sequências SEQ ID No. 5, 12, 48 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 5, 12,49; e

- a CDR das sequências SEQ ID No. 6, 8, 43, 45 ou uma se-

—quênciacom pelo menos de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identida- de após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID No. 6, 8, 43, 45. De acordo com um modo preferencial, o método pode incluir na etapa a) a colocação em contato in vitro de um composto que compreende um arcabouço de peptídeo sobre o qual pelo menos duas ou três CDRs de anticorpo são enxertadas.

De acordo com um modo ainda preferencial deste método, o ar- — cabouço de peptídeo é selecionado dentre os arcabouços ou proteínas de ligação cujas estruturas foram mencionadas acima.

Obviamente, estes exemplos não são de forma alguma restriti- vos, e qualquer outra estrutura conhecida ou óbvia para um versado na téc- nica deve ser considerada como estando abrangida pela proteção conferida pelo presente pedido de patente.

A presente invenção refere-se, desta forma, a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o arcabouço de peptídeo é selecionado dentre proteínas que são a) ' bem conservadas filogeneticamente, b) de arquitetura robusta, c) com uma organização molecular tridimensional bem conhecida, d) de pequeno tama- : nho e/ou e) compreendendo regiões que podem ser modificadas por deleção e/ou inserção sem modificação das propriedades de estabilidade. De acordo com uma modalidade preferencial, o anticorpo da invenção, ou seus com- postos derivados ou fragmentos funcionais, é caracterizado pelo fato de que odito arcabouço de peptídeo é selecionado dentre i) arcabouços originados de fibronectina, de preferência, domínio 10 de fibronectina tipo 3, lipocalina, anticalina, proteína Z originada do domínio B da proteína A de Staphylococ- cus aureus, tioredoxina A ou proteínas com um motivo repetido, como a "re- petição de anquirina" (Kohl et a/, PNAS, 2003, vol. 100, Nº 4, 1700-1705), a "repetição de armadillo", a "repetição rica em leucina" e os "tetratricopepti- deos repetidos" ou iii) inibidores de proteína da sintase neuronal do óxido nítrico (PIN).

Um outro aspecto da invenção refere-se aos fragmentos funcio- nais do anticorpo descrito acima.

Mais particularmente, a invenção refere-se a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento funcional é selecionado dentre os fragmentos Fv,

Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc e diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia-vida tenha sido aumentada, como fragmentos peguilados. Tais fragmentos funcionais do anticorpo de acordo com a inven- ção consistem, por exemplo, nos fragmentos Fv, scFv (sc = cadeia única), Fab, F(ab)2,Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia- vida tenha sido aumentada por modificação química, como pela adição de polialquileno glicol, como polietileno glicol (PEGuilação) (fragmentos pegui- lados são chamados de Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG e Fab" PEG), ou pela incorporação em um lipossomo, microesferas ou PLGA, os ditos fragmentos possuindo pelo menos uma das CDRs características da invenção que é notavelmente capaz de exercer atividade, de uma maneira geral, ainda que parcial, do anticorpo a partir do qual ele se origina.

De preferência, os ditos fragmentos funcionais irão compreender ' ou incluir uma sequência parcial da cadeia pesada ou leve variável do anti- corpo a partir do qual eles são derivados, a dita sequência parcial sendo su- ' ficiente para reter a mesma especificidade de ligação que o anticorpo a partir do qual ele se origina e afinidade suficiente, de preferência, pelo menos igual a 1/100, com mais preferência, pelo menos 1/10 daquela do anticorpo a par- tir do qual ele se origina.

Tal fragmento funcional irá conter pelo menos cinco aminoáci- dos, de preferência 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 ou 100 aminoácidos consecutivos da sequência do anticorpo a partir do qual ele se origina.

De preferência, estes fragmentos funcionais serão dos tipos Fv, secFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, que possuem geralmente a mesma especificidade de ligação que o anticorpo a partir do qual eles resul- tam. De acordo com a presente invenção, os fragmentos do anticorpo da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos descritos acima por mé- todos tais como digestão enzimática, incluindo pepsina ou papaína, e/ou por clivagem das pontes de dissulfeto por redução química. Os fragmentos de anticorpo podem também ser obtidos por técnicas de genética recombinante também conhecidas do versado na técnica ou por síntese de peptídeo atra- vés, por exemplo, de sintetizadores automáticos de peptídeo, como aquelas disponíveis junto à Applied BioSystems, etc. . Para maior clareza, a tabela 2 abaixo resume as várias sequên- cias de aminoácido correspondentes ao anticorpo da invenção. Tabela 2 (em que Mu. = murino e Ch. = quimérico Anticor-| Numera- Cadeia pesada Cadeia leve Fe TT

CDR

LER LL are OR comm [OO Tens 13 | Lam [eo [ore TT [Log [TO FE ae AO EE Re RA : Fa To | atas [ore [so [eras Te LE am a Lote Ae rat [OO eras Ts Lam O o [or eo [eras [e [LE pone] Ts [Domino verve [O TA LL ema e | [Dommovanáveren | ss TETE ae a Eee RA Lam TO Ee LR [E [oras TT o EE Re a EL Re Ro ee | e | me po ção da

CDR La O enrris S E Re Se LL are | [Fo To [Lo Te "E LE seno so Os sn 6 [Pomar [O TUR] : ' Outro aspecto específico da presente invenção refere-se a um anticorpo quimérico, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende, também, regi- ões constantes de cadeia leve e cadeia pesada derivadas de um anticorpo deuma espécie heteróloga ao camundongo, especialmente, homem.

Ainda outro aspecto específico da presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado, ou seus compostos derivados ou fragmentos fun- cionais, caracterizado pelo fato de que as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas do anticorpo humano são, respectivamente, a região lambda ou kappa e a região gama-1, gama-2 ou gama-4.

De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibri- doma murino capaz de secretar um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, notadamente o hibridoma de origem murina depositado na coleção francesa para culturas de micro-organismos (CNCM, Pasteur Institute, Paris, França) em 22 de outubro de 2007, sob o número 1-3860. O dito hibridoma foi obtido pela fusão de esplenócitos de camundongos Balb/C imunizados e células das linhagens de mieloma Sp 2/0- Ag 14.

O anticorpo monocional, aqui chamado de 414H5, ou seus com-

postos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é secretado pelo hibridoma depositado na CNCM em 22 de outubro de 2007, sob o número 1-3860 obviamente faz parte da presente invenção.

De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um hibri- doma murino capaz de secretar um anticorpo monocional de acordo com a invenção, notadamente o hibridoma de origem murina depositado na coleção francesa para culturas demicro-organismos (CNCM, Pasteur Institute, Paris, França) em 25 de junho de 2008, sob o número 1-4019. O dito hibridoma foi obtido pela fusão de esplenócitos de camundongos Balb/C imunizados e células das linhagens de mieloma Sp 2/O-Ag 14. O anticorpo monoclonal, aqui chamado de 515H7, ou seus com- postos derivados ou fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é secretado pelo hibridoma depositado na CNCM em 25 de junho de 2008, sob o número 1-4019 obviamente faz parte da presente in- ' venção. O anticorpo da invenção compreende, também, anticorpos quiméri- cos ou humanizados. Um anticorpo quimérico é um que contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada) derivada de um anticorpo de uma da- da espécieem combinação com regiões constantes da cadeia leve e da ca- deia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga a dita dada espé- cie. Os anticorpos, ou fragmentos quiméricos dos mesmos, podem ser preparados com o uso de técnicas de genética recombinante. Por exem- plo,o anticorpo quimérico poderia ser produzido pela clonagem de DNA re- combinante contendo um promotor e uma sequência que codifica a região variável de um anticorpo monoclonal não humano da invenção, notadamen- te, murino, e uma sequência que codifica a região constante do anticorpo humano. Um anticorpo quimérico de acordo com a invenção codificado por talgene recombinante poderia ser, por exemplo, uma quimera camundongo- humano, a especificidade deste anticorpo sendo determinada pela região variável derivada do DNA murino e seu isotipo determinado pela região constante derivada do DNA humano. É feita referência a Verhoeyn et al. (Bi- oEssays, 8:74, 1988) para métodos para preparar anticorpos quiméricos.

Em outro aspecto, a invenção descreve um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, que consiste em um anticorpo quimérico.

Em uma modalidade preferencial particular, o anticorpo quiméri- co, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo da invenção compreende uma sequência de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 64, e que compreende uma sequência de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 65.

Em uma outra modalidade preferencial, o anticorpo quimérico da invenção, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, compre- ende uma sequência de cadeia leve que compreende a sequência de ami- : noácidos SEQ ID No. 66, e que compreende uma sequência de cadeia pe- — sada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 67.

' "Anticorpos humanizados" significa um anticorpo que contém re- giões de CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, as outras partes da molécula de anticorpo sendo derivadas de um (ou vários) anticor- pos humanos. Além disso, alguns dos resíduos do segmento do esqueleto (chamaos FR) podem ser modificados para preservar a afinidade de ligação (Jones et a/. , Nature, 321 :522-525, 1986; Verhoeyen ef al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et a/., Nature, 332:323-327, 1988). Os anticorpos humanizados da invenção, ou fragmentos dos mesmos, podem ser preparados por técnicas conhecidas de um versado na área (como, por exemplo, as descritas nos documentos Singer et al., J. Im- mun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et a/., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; e Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Tais anticorpos humanizados são preferenciais por seu uso nos métodos envol- vendo diagnósticos in vitro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico in vivo. Outras técnicas de humanização, também conhecidas de um versado na técnica, como, por exemplo, a técnica de "enxertia de CDR" descrita por PDL nas patentes EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP O 566 647 ou

US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089 e US5.693.761. As patentes US

5.639.641 ou 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293 podem também ser citadas. Além disso, a invenção também refere-se a anticorpos humani- zados originados dos anticorpos murinos descritos acima. De uma forma preferencial, as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada deri- vadas do anticorpo humano são, respectivamente, a região lambda ou kappa e a gama-1, gama-2 ou gama-4. Na modalidade correspondente ao isotipo I9G1, uma caracterís- tica adicional do anticorpo é a de exibir funções efetoras, como citotoxicida- de celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Um novo aspecto da presente invenção refere-se a um ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre os se- ] guintes ácidos nucleicos (incluindo qualquer código genético degenerado): - um ácido nucleico, DNA ou RNA, que codifica um anticorpo, ou : um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a invenção; - um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico como de- finido em a); - um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos, capaz de hi- bridizar sob condições altamente estringentes com pelo menos uma das CDRs das sequências de ácido nucleico SEQ ID Nos. 15 a 26 ou SEQ ID Nos. 52 a 61 ou uma sequência com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após alinhamento ótimo com as sequências SEQIDNos. 15a260ouSEQID Nos.52a61;e - um ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos, capaz de hibridizar sob condições altamente estringentes com pelo menos a cadeia leve da sequência de ácido nucleico SEQ ID No. 27 ou SEQ ID No. 62 ou SEQ ID No. 68 ou 70 e/ou a cadeia pesada da sequência de ácido nucleico SEQID No. 28 ou SEQ ID No. 63 ou SEQ ID No. 69 ou 71 ou uma sequên- cia com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identi- dade após alinhamento ótimo com as sequências SEQ ID Nos. 27 e/ou 28 ou SEQ ID Nos. 62 e/ou 63 ou SEQ ID Nos. 68 e/ou 69 ou SEQ ID Nos. 70 e/ou 71.

A tabela 3 abaixo resume as várias sequências de nucleotídeo que dizem respeito ao anticorpo da invenção.

Tabela 3 es o | Ce po ção da CDR ' Co as Lo ese |) La ae IO : O DA EE

EC - Lo = ee 1) a O [ee NO Lo = em 1) Lo | ee Tx) ca ae RO [apar ANT [Co ema | 7 [pomino ani [Og Co semen | [ooo Os Lo Ta Te Co o ee 1)

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O EC NC E ae To [am To e Lo em 1) E ae e ea ig er IO [eo NT [o |senmenannm] [pomar | TS [o eeewana | 7 | | comia verve [O O Os termos "ácido nucleico", "sequência nucleica", "sequência de ácido núcleico", "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", "sequência de polinu- cleotídeo" e "sequência de nucleotídeo", usados de maneira intercambiável na presente descrição, significam uma sequência precisa de nucleotídeos, modificada ou não, que define um fragmento ou uma região de um ácido nucleico, contendo nucleotídeos não naturais ou não, e sendo um DNA de fita dupla, um DNA de fita simples ou produtos de transcrição dos ditos DNAs.

45/93 i Deve-se também incluir aqui que a presente invenção não se re- fere a sequências de nucleotídeo no seu ambiente cromossômico natural, isto é, em um estado natural. As sequências da presente invenção foram isoladas e/ou purificadas, isto é, elas foram amostradas diretamente ou indi- retamente, por exemplo, por uma cópia, seu ambiente tendo sido pelo me- nos parcialmente modificado. Os ácidos nucleicos isolados obtidos por gené- tica recombinante, através, por exemplo, de células hospedeiras, ou obtidos por síntese química também devem ser mencionados aqui.

"As sequências nucleicas que exibem uma porcentagem de iden- tidade de pelo menos 80%, de preferência, 85%, 90%, 95% e 98%, após alinhamento ótimo com uma sequência preferencial" significa sequências nucleicas que exibem, com relação a uma sequência de ácido nucleico de referência, determinadas modificações como, em particular, uma deleção, “um truncamento, uma extensão, uma fusão quimérica e/ou uma substituição, notadamente pontual. De preferência, estas são sequências que codificam Ú as mesmas sequências de aminoácido que a sequência de referência, isto estando relacionado à degeneração do código genético, ou sequências complementares que provavelmente hibridizarão especificamente com as sequências de referência, de preferência sob condições altamente estringen- tes, especialmente as definidas abaixo.

Hibridização sob condições altamente estringentes significa que as condições relacionadas à temperatura e força iônica são selecionadas de tal forma que elas permitem que a hibridização seja mantida entre dois frag- mentos de DNA complementares. De modo puramente ilustrativo, as condi- ções altamente estringentes da etapa de hibridização com o propósito de definir os fragmentos de polinucleotídeo descritos acima são vantajosamente as seguintes.

A hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA é executada em duas e- tapas: (1) pré-hibridização a 42 ºC durante três horas em tampão de fosfato (20mM,pH7,5) contendo SSC 5X (SSC 1X corresponde A uma solução de NaCl 0,15 M + citrato de sódio a 0,015 M), 50% de formamida, 7% de dode- cil sulfato de sódio (SDS), Denhardt 10X, 5% de sulfato de dextrano e 1% de

DNA de esperma de salmão; (2) hibridização primária durante 20 horas a uma temperatura que depende do comprimento da sonda (isto é, 42 ºC para | uma sonda >100 nucleotídeos de comprimento) seguido de duas lavagens de 20 minutos a 20 ºC em SSC 2X + 2% de SDS, uma lavagem de 20 minu- tosa20 Cem SSC 0,1X+ SDS 0,1%. A última lavagem é executada em SSC 0,1X + SDS 0,1% durante 30 minutos a 60 ºC para uma sonda de >100 nucleotídeos de comprimento. As condições de hibridização altamente es- tringentes descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido po- dem ser adaptadas por um versado na técnica para oligonucleotídeos mais longos ou mais curtos, de acordo com os procedimentos descritos em Sam- brook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor La- boratory; 3º edição, 2001). A invenção também refere-se a um vetor compreendendo um á- ] cidos nucleicos conforme descrito na invenção. A invenção refere-se, especialmente, a vetores de clonagem Ú e/ou expressão que contêm tal sequência de nucleotídeo.

Os vetores da invenção contêm, de preferência, elementos que permitem a expressão e/ou a secreção de sequências de nucleotídeo em uma dada célula hospedeira. O vetor deve, então, conter um promotor, si- nais de início e término de tradução, assim como regiões de regulação de transcrição adequadas. Ele deve ser capaz de ser mantido de uma forma estável na célula hospedeira e pode, opcionalmente, ter sinais específicos que especificam a secreção da proteína traduzida. Estes vários elementos são selecionados e otimizados por um versado na técnica de acordo com a célula hospedeira usada. Para este propósito, as sequências de nucleotídeo podem ser inseridas em vetores autorreplicantes no interior do hospedeiro escolhido ou podem ser vetores integrados do hospedeiro escolhido.

Tais vetores são preparados por métodos tipicamente usados por um versado na técnica e os clones resultantes podem ser introduzidos emum hospedeiro adequado por métodos padrão como lipofecção, eletropo- ração, choque térmico ou métodos químicos.

Os vetores são, por exemplo, vetores de origem plasmídial ou vi-

ral. Eles são usados para transformar células hospedeiras de modo a clonar Ou expressar as sequências de nucleotídeo da invenção.

A invenção compreende, também, células hospedeiras transfor- madas por, ou que compreendem um vetor conforme descrito na presente invenção.

A célula hospedeira pode ser selecionada dentre sistemas pro- carióticos ou eucarióticos, como células bacterianas, por exemplo, mas tam- bém células de levedura ou células animais, especialmente, células de ma- mífero. Células de insetos ou de plantas também podem ser usadas.

A invenção também refere-se a animais, diferentes de seres humanos, que possuem uma célula transformada de acordo com a invenção.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo de acordo com a invenção, ou um de seus frag- : mentos funcionais, o dito método sendo caracterizado pelo fato de que inclui as seguintes etapas: ' a) a cultura em um meio e nas condições de cultura adequadas para uma célula hospedeira de acordo com a invenção; e b) a recuperação do dito anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, produzido desta forma a partir do meio de cultura ou a partir das ditascélulas cultivadas.

As células transformadas de acordo com a invenção são úteis nos métodos para a preparação dos polipeptídeos recombinantes de acordo com a invenção. Métodos para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção na forma recombinante, caracterizados pelo fato de que u- sam um vetor e/ou uma célula transformada pelo vetor de acordo com a in- venção, também estão compreendidos na presente invenção. De preferên- cia, uma célula transformada por um vetor de acordo com a invenção é culti- vado sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo supracitado e a recuperação do dito peptídeo recombinante.

Conforme já mencionado, a célula hospedeira pode ser selecio- nada dentre sistemas procarióticos ou eucarióticos. Em particular, é possível identificar as sequências de nucleotídeo da invenção que facilitam a secre-

ção em um tal sistema procariótico ou eucariótico. Um vetor de acordo com a invenção transportando tal sequência pode, então, ser usado vantajosa- mente para a produção das proteínas recombinantes a serem secretadas.

De fato, a purificação destas proteínas recombinantes de interesse será faci- litada pelo fato de que elas estão presentes no sobrenadante da cultura celu- lar e não dentro das células hospedeiras. | Os polipeptídeos da invenção podem também ser preparados por síntese química. Um deste método de preparação também é um objeto da invenção. Um versado na técnica conhece métodos para síntese química, tais como técnicas em fase sólida (vide, especialmente, Steward et a/., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2º ed.) ou técnicas em fase sólida parcial, por condensação de fragmentos ou por síntese convencional em solução. Os polipeptídeos obtidos por síntese ' química e capazes de conter aminoácidos não naturais correspondentes também estão compreendidos na invenção.

: Os anticorpos, ou os compostos derivados ou fragmentos fun- cionais dos mesmos, que serão provavelmente obtidos pelo método da in- venção também estão compreendidos na presente invenção.

De acordo com mais um aspecto, a presente invenção refere-se aum anticorpo, conforme descrito acima, caracterizado pelo fato de que ele é capaz, adicionalmente, de se ligar especificamente a um receptor da famí- lia quimiocinas humanas e/ou é capaz de inibir especificamente a sinaliza- ção deste receptor. De acordo com uma nova modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, que consiste em um anticorpo biespecífico, no sentido em que compreende um segundo motivo capaz de interagir com qualquer receptor envolvido no de- senvolvimento de tumores, como, por exemplo, VEGFR, VEGF, EGFR, IGF- 1R, HER2neu, HGF, cMET, FGF, tetraspaninas, integrinas, CXCRA4 (diferen- te do anticorpo da presente invenção, isto é, direcionando outro epítopo), CXCR7 ou CXCR?2. Os anticorpos biespecíficos ou bifuncionais constituem uma se-

gunda geração de anticorpos monocionais nos quais duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula (Hollinger e Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419). Sua utilidade foi demonstrada nos domínios diagnóstico e terapêutico em relação a sua capacidade de recrutar novas funções efetoras ou atingir várias moléculas sobre a superfície de cé- lulas tumorais; estes anticorpos podem ser obtidos por métodos químicos (Glennie MJ et a/., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et a/, 1995, J. Hemat., 377-382) ou métodos somáticos (Staerz U.D. e Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et a/, 1986, Method Enzymol, 121: 210- 228) mas também, de preferência, por técnicas de engenharia genética que tornam possível forçar a heterodimerização e, assim, facilitar a purificação do anticorpo pretendido (Merchand et a/, 1998, Nature Biotech., 16:677-681). Estes anticorpos biespecíficos podem ser construídos como uma IgG inteira, um Fab'2 biespecífico, Fab'PEG, diacorpos ou um scFv biespecí- fico, mas também como um anticorpo biespecífico tetravalente no qual dois ' sítios de ligação estão presentes para cada antígeno direcionado (Park ef a/, 2000, Mol. Immunol, 37(18): 1123-30) ou os fragmentos do mesmo, confor- me descrito acima.

Em adição a uma vantagem econômica dado que a produção e a administração de um anticorpo biespecífico são mais econômicas do que a produção de dois anticorpos específicos, o uso dos tais anticorpos biespecí- ficos tem a vantagem de reduzir a toxicidade do tratamento. De fato, o uso de um anticorpo biespecífico torna possível diminuir a quantidade global de anticorpos circulantes e, consequentemente, uma possível toxicidade.

Em uma modalidade preferencial da invenção, o anticorpo bies- pecífico é um anticorpo bivalente ou tetravalente.

Por fim, a presente invenção refere-se ao anticorpo descrito a- cima, ou seus compostos derivados ou fragmentos funcionais, para uso co- mo um fármaco.

A invenção também refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um composto que consiste em um anticorpo da invenção, ou um de seus compostos derivados ou fragmentos funcionais como um in-

grediente ativo. De preferência, o dito anticorpo é suplementado por um ex- cipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção também refere-se a uma composição, caracterizada pelo fato de que compreende, adicionalmente, como um produto combinado para uso de uma forma simultânea, separada ou estendida, um anticorpo antitumoral diferente de um anticorpo dirigido contra CXCRA.

De acordo com mais uma outra modalidade, a presente inven- ção também refere-se a uma composição farmacêutica, conforme descrita acima, que compreende pelo menos um segundo composto antitumoral se- lecionado dentre os compostos capazes de inibir especificamente a atividade de tirosina quinase de receptores como IGF-1R, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR ou VEGF, ou qualquer outro composto antitumoral conhecido de um versado na técnica.

: i Em um segundo aspecto preferencial da invenção, o dito segun- do composto pode ser selecionado dentre os anticorpos antiEGFR, anti-|GF- Ú 1R, ant-HER2/neu, anticMET, VEGFR, VEGF, etc., isolados, ou seus frag- mentos funcionais e compostos derivados, capazes de inibir a atividade pro- liferativa e/ou antiapoptótica e/ou angiogênica e/ou indutiva da disseminação metastática promovida pelos ditos receptores.

Também é adequado mencionar os anticorpos antiCD20 como, por exemplo, rituximabe, ibritumomabe ou tositumomabe; anticorpos an- ticCD33 como gemtuzumabe ou lintuzumabe; anticorpos antiCD22 como e- pratuzumabe; anticorpos antiCD52 como alemtuzumabe; anticorpos antiEp- CAM como edrecolomabe, Ch 17-1A ou IGN-101; anticorpos antiCTP21 ou 16 como Xactin; anticorpos antiDNA-Ag como "***I-Cotara TNT-1; anticorpos antiMUC1 como pemtumomabe ou R1150; anticorpos antiMUC18 como ABX-MA1; anticorpos antiGD3 como mitumomabe; anticorpos antiECA como CeaVac ou labetuzumabe; anticorpos antiCA125 como OvaRex; anticorpos anti-HLA-DR como apolizumabe; anticorpos antiCTLA4 como MDX-010; an- ticorpos antiPSMA como MDX-070, "In, ºY-J591, "Lu J591, J5S91-DM1; anticorpos antiLewis Y como IGN311; anticorpos antiangiogênese como AS 1405 e *YmuBC1; anticorpos antiTrai-R1 como TRAIL RIMAb ou TRAIL

R2mAb.

Outra modalidade complementar à invenção consiste em uma composição como descrita acima que compreende, adicionalmente, como um produto combinado ou conjugado, para uso em uma forma simultânea, separada ou estendida, um agente citotóxico/citostático.

"Uso simultâneo" significa a administração de ambos os com- postos da composição compreendidos em uma forma de dosagem única.

"Uso separado" significa a administração, simultânea, de ambos os compostos da composição, compreendidos em formas de dosagem dis- tintas.

"Uso estendido" significa a administração sucessiva de ambos os compostos da composição, cada um deles estando compreendido em uma forma de dosagem distinta.

: Em geral, a composição de acordo com a invenção aumenta 5 consideravelmente a eficácia do tratamento para câncer. Em outras pala- : vras, o efeito terapêutico do anticorpo da invenção é intensificado de forma inesperada pela administração de um agente citotóxico. Outra vantagem subsequente produzida por uma composição da invenção refere-se à possi- bilidade de usar doses eficazes menores do ingrediente ativo tornando pos- sível, desta forma, evitar ou reduzir os riscos do aparecimento de efeitos co- laterais, em particular, o efeito do agente citotóxico. Além disso, esta compo- sição torna possível obter o efeito terapêutico esperado mais rapidamente.

"Agente terapêutico anticâncer” ou “agente citotóxico” significa uma substância a qual, quando é administrada a um paciente, trata ou previ- neodesenvolvimento de câncer no paciente. Exemplos não limitadores des- tes agentes incluem agentes "alquilantes", antimetabólitos, antibióticos anti- tumorais, inibidores mitóticos, inibidores do funcionamento da cromatina, antiangiogênicos, antiestrógenos, antiandrógenos e imunomoduladores.

Tais agentes são citados em VIDAL, por exemplo, na página de- —dicada aos compostos relacionados à oncologia e hematologia sob o título "Citotóxico"; os compostos citotóxicos citados pela referência a este docu- mento são citados na presente invenção como agentes citotóxicos preferen-

ciais.

"Agente alquilante" refere-se a qualquer substância que pode se ligar covalentemente com ou que pode alquilar qualquer molécula, de prefe- rência, um ácido nucleico (por exemplo, DNA), no interior de uma célula. E- — xemplos destes agentes alquilantes incluem mostardas de nitrogênio, como mecloretamina, clorambucila, melfalan, cloridrato, pipobromano, prednimus- tina, fosfato dissódico ou estramustina; oxazafosforinas como ciclofosfamida, altretamina, trifosfamida, sulfofosfamida ou ifosfamida; aziridinas ou etileno- iminas como tiotepa, trietilenoamina ou altetramina; nitrosoureas como car- —mustina, estreptozocina, fotemustina ou lomustina; sulfonatos de alquila co- mo busulfam, treosulfam ou improsulfam; triazenos como dacarbazina; ou complexo de platina como cisplatina, oxaliplatina ou carboplatina.

"Antimetabólito" refere-se a uma substância que bloqueia o ' crescimento e/ou metabolismo celular pela interferência com determinadas o 15 atividades, geralmente, a síntese de DNA. Exemplos de antimetabólitos in- ' cluem metotrexato, 5-fluorouracila, floxuridina, 5- fluorodesoxiuridina, capeci- tabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinosídeo, 6-mercaptopurina (6- MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gencitabina, cladribina, desoxicoformicina e pentostatina.

"Antibióticos antitumorais" refere-se a um composto que pode evitar ou inibir a síntese de DNA, RNA e/ou proteínas. Exemplos destes an- tibióticos antitumorais incluem doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina valrrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomici- na C, bleomicina e procarbazina.

"Inibidores mitóticos" evitam a progressão normal do ciclo celular e mitose. Em geral, os inibidores de microtúbulos ou "taxoides" como pacli- taxel e docetaxel são capazes de inibir a mitose. Os alcaloides da vinca, co- mo vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina, também são capazes de inibir a mitose.

"Os inibidores de cromatina" ou "inibidores de topoisomerase" são substâncias que inibem o funcionamento normal de proteínas que for- mam a cromatina, como as topoisomerases | e Il. Exemplos destes inibido-

res incluem, para topoisomerase |, camptotecina e seus derivados, como irinotecano ou topotecano; para topoisomerase Il, etoposídeo, fosfato de eti- posídeo e teniposídeo. Um agente "antiangiogênico" é qualquer fármaco, composto, substância ou agente que inibe o crescimento dos vasos sanguíneos. Exem- plos de agentes antiangiogênicos incluem, sem limitação, razoxina, mari- mastate, batimastato, prinomastato, tanomastato, ilomastato, CGS- 27023A, halofuginona, COL-3, neovastato, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, esqualamina, endostatina, SUS416, SU6668, interferon- alfa, EMD 121974, interleucina-12, IM862, angiostatina e vitaxina.

"Antiestrógeno" ou "antagonista de estrogênio" refere-se a qual- quer substância que reduz, antagoniza ou inibe a ação do estrogênio. E- xemplos destes agentes são tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, | iodoxifeno, anastrozol, letrozol e exemestano. Agente "antiandrógeno" ou "antagonista de androgênio" refere-se a qualquer substância que reduz, an- ' tagoniza ou inibe a ação do androgênio. Exemplos de antiandrógenos inclu- em flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciprote- rona, finasterida e cimetidina. Imunomoduladores são substâncias que estimulam o sistema imune. Exemplos de imunomoduladores incluem interferon, interleucinas como aldesleucina, OCT-43, denileucina diftitox ou interleucina-2, fatores de necrose tumoral como tasonermina, ou outros tipos de imunomoduladores como lentinano, sizofirano, roquinimex, pidotimode, pegademase, timopenti- na, poli 1:C ou levamisol em combinação com 5-fluorouracila.

Para mais detalhes, um versado na técnica pode se referir ao manual publicado pela associação francesa de professores de química intitu- lado "Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer", edição TEC e DOC, 2003 [em francês].

Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita compo- siçãoda invenção como um produto combinado é caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico é ligado quimicamente ao dito anticorpo para uso simultâneo.

Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita compo- sição é caracterizada pelo fato de que o dito agente citotóxico/citostático é selecionado dentre os inibidores ou estabilizadores de fuso, de preferência, vinorelbina e/ou vinflunina e/ou vincristina.

De modo a facilitar a ligação entre o dito agente citotóxico e o anticorpo de acordo com a invenção, moléculas espaçadoras podem ser in- troduzidas entre os dois compostos a ligar, como o poli(alquileno)glico! polie- tileno glicol ou os aminoácidos; ou, em outra modalidade, os derivados ati- vos dos ditos agentes citotóxicos, nos quais funções capaz de reagir com o dito anticorpo foram introduzidas, podem ser usados. Estas técnicas de liga- ção são bem conhecidas de um versado na técnica e não serão discutidas em mais detalhes na presente descrição.

Outros inibidores de EGFR incluem, sem limitação, anticorpos ] monoclonais C225 e 22Mab antiEGFR (ImClone Systems Incorporated), —ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) ou os compos- : tos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI- 166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), fluno- mida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI- 1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth- Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GMBH/Roche), Naamidine A (Bristol-board Myers Squibb), RC-3940-ll (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehrin- ger Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM- 252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFEM-A12 (Parker Hughes Center Cancer), WHI-P987 (Parker Hughes Center Cancer), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) ou a "vacina de EGFR" (York Medical/Centro of Immunologia Molecular).

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma composição ca- racterizada pelo fato de que pelo menos um dos ditos anticorpos, ou dos — compostos derivados ou fragmentos funcionais dos mesmos, é combinado ou conjugado com uma toxina celular e/ou um radioisótopo. De preferência, a dita toxina ou o dito radioisótopo é capaz de evitar o crescimento ou a pro-

liferação da célula tumoral, especialmente, inativando completamente a dita célula tumoral. Também de preferência, a dita toxina é uma toxina de entero- bactéria, especialmente, exotoxina A de Pseudomonas.

Os radioisótopos que são preferencialmente combinados com os anticorpos terapêuticos são radioisótopos que emitem raios gama, de prefe- rência, iodo”?', ítrio”, ouro”, paltádioº, cobre””, bismuto?” e antimônio?"!. Os radioisótopos que emitem raios alfa e beta também podem ser usados na terapia.

"Toxina ou radioisótopo combinado com pelo menos um anticor- po da invenção, ou um fragmento funcional do mesmo" refere-se a qualquer meio que torna possível ligar a dita toxina ou o dito radioisótopo a este pelo menos um anticorpo, especialmente, por ligação covalente entre os dois : : compostos, com ou sem a introdução da molécula de ligação. Exemplos de agentes que permitem a ligação química (covalen- ' te), eletrostática, ou não covalente de todo ou de parte dos elementos do conjugado incluem, em particular, benzoquinona, carbodi-imida e mais parti- cularmente, EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodi-imida), dimaleimida, ácido ditio bis-nitrobenzoico (DTNB), S-acetil tio-acetato de N- —succinimídila (SATA), agentes de ligação com um ou mais grupos, com um ou mais grupos de fenilasida, reagindo com raios ultravioleta (UV), com a máxima preferência N-[4-(azidosalicilamino)butil])-3'-(2'-piridilditio)- propionamida (APDP), N-sucinimidil-3(2-piridilditio)-proprionato (SPDP) e 6- hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

Outra forma de ligação, especialmente para radioisótopos, pode consistir no uso de agentes quelantes de íons bifuncionais.

Exemplos destes quelantes incluem os quelantes derivados de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou DTPA (ácido dietilenotriaminopen- tacético) que foram desenvolvidos para ligar metais, particularmente, metais — radioativos, com imunoglobulinas. Desta forma, o DTPA e seus derivados podem ser substituídos sobre a cadeia carbônica por vários grupos de modo a aumentar a estabilidade e a rigidez do complexo ligante-metal (Krejcarek et al., 1977; Brechbiel et a/, 1991; Gansow, 1991; Patente US 4.831.175).

Por exemplo, o DTPA (ácido dietilenotriaminopentacético) e seus derivados, que há muito são amplamente usados em fármacos e biologia tanto na sua forma livre quanto na forma de um complexo com um fon metá- — lico, exibem a notável característica de formar quelatos estáveis com íons * — metálicos, que podem ser acoplados com proteínas de interesse terapêutico ou diagnóstico, como anticorpos, para o desenvolvimento de conjugados radioimunes para a terapia do câncer (Meases et a/, 1984; Gansow et al, 1990).

Ainda de preferência, o dito pelo menos um anticorpo da inven- ção que forma o dito conjugado é selecionado dentre seus fragmentos fun- cionais, especialmente, fragmentos que perderam seu componente Fc, como fragmentos scFv.

: A presente invenção compreende, também, o uso da composi- ção para a preparação de um fármaco destinado à prevenção ou tratamento : de câncer.

A presente invenção também se refere ao uso de um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de preferência humanizado, e/ou de uma composição de acordo com a invenção para a preparação de um fármaco para inibir o crescimento de células tumorais. Em geral, a presente invenção refere-se ao usar de um anticorpo, ou um com- posto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de preferência, humani- zado, e/ou de uma composição para a preparação de um fármaco para a prevenção ou tratamento de câncer.

Os cânceres preferenciais que podem ser prevenidos e/ou trata- dos incluem câncer de próstata, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometrial, câncer de cólon, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer pancreático ou qualquer outro câncer.

A invenção também se refere ao uso de um anticorpo, ou um — composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, e/ou de uma compo- sição conforme descrita acima, para a preparação de um fármaco para mo- dular a atividade de CXCR4 em uma célula.

Outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso do anticor- po conforme descrito em um método de diagnóstico, de preferência, in vitro, de doenças relacionadas ao nível de expressão de CXCRA. De preferência, as ditas doenças relacionadas à proteína CXCR4 no dito método de diagnós- ticoserão cânceres.

Desta forma, os anticorpos da invenção, ou os compostos deri- vados ou fragmentos funcionais dos mesmos, podem ser empregados em um método para a detecção e/ou quantificação de proteína CXCR4 em uma amostra biológica in vitro, especialmente, para o diagnóstico de doenças associadas a uma expressão anormal com esta proteína, como cânceres, em que o dito método compreende as seguintes etapas: a) colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo de acordo com a invenção, ou um composto derivado ou fragmento funcional do : i mesmo; b) demonstrar o complexo antígeno-anticorpo possivelmente | formado.

Desta forma, a presente invenção compreende, também, os kits ou acessórios para a implementação de um método conforme descrito, que compreende os seguintes elementos: a) um anticorpo policlonal ou monocional da invenção; b) opcionalmente, reagentes para constituir o meio favorável às reações imunológicas; c) opcionalmente, reagentes que revelam os complexos antíge- no-anticorpo produzidos pela reação imunológica.

Vantajosamente, os anticorpos ou fragmentos funcionais do mesmo podem ser imobilizados sobre um suporte, especialmente, um chip de proteínas. Um destes chips de proteína é um objeto da invenção. Vanta- josamente, os chips de proteína podem ser usados nos kits ou acessórios necessários para detectar e/ou quantificar a proteina CXCR4 em uma amos- tra biológica.

Deve ser mencionado que o termo "amostra biológica" refere-se, na presente invenção, a amostras retiradas de um organismo vivo (especi-

almente, sangue, tecido, órgão ou outras amostras retiradas de um mamífe- ro, especialmente ser humano) ou qualquer amostra que provavelmente con- terá uma tal proteína CXCR4 (como uma amostra de células, transformadas, Se necessário).

O dito anticorpo, ou um fragmento funcional do mesmo, pode es- tar sob a forma de um imunoconjugado ou de um anticorpo marcado de mo- do a obter um sinal detectável e/ou quantificável. Os anticorpos marcados da invenção, ou os fragmentos funcionais do mesmo, incluem, por exemplo, conjugados de anticorpo (imunoconjugados), que podem ser combinados, por exemplo, com enzimas como peroxidase, fosfatase alcalina, a-D- galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, anidrase carbônica, acetilco- linesterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose-6 fosfato desidroge- nase ou por uma molécula como biotina, digoxigenina ou 5-bromo- : Ú desoxiuridina. Marcadores fluorescentes também podem ser combinados comos anticorpos da invenção ou fragmentos funcionais do mesmo, incluin- ' do especialmente, fluoresceína e seus derivados, fluorocromo, rodamina e seus derivados, proteína verde fluorescente (GFP), dansila, umbeliferona, etc. Nestes conjugados, os anticorpos da invenção ou fragmentos funcionais dos mesmos podem ser preparados por métodos conhecidos de um versado —natécnica. Eles podem ser ligados com enzimas ou marcadores fluorescen- tes diretamente; através de um grupo espaçador ou um grupo de ligação como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA); ou na presença de agentes de ligação como os mencionados acima para os conjugados terapêuticos. Os conjugados transportando marcadores de fluoresceína podem ser prepara- dos por reação com um isotiocianato.

Outros conjugados podem também incluir marcadores quimiolu- minescentes como lumino! e dioxetano, marcadores bioluminescentes como luciferase e luciferina, ou marcações radioativas como iodo”, jodo?, ijo- do”, iodo", bromo””, tecnécio?*”, índio”!, índio! *”, gálioó”, gálio*, rute- nio*, rutênio””, rutênio”, rutênio”%, mercúrio”, mercúrio?, rênio, rê- nio", rênio”*, escândio””, tetúrio”?*”, telúrio” 2", telúrio” 2", túlio*, túlio*”,

túlio*, flúor", trio” e jodo"**. Os métodos existentes conhecidos de um versado na técnica para ligação de radioisótopos com anticorpos, diretamen- | te ou através de um agente quelante como o EDTA ou DTPA acima mencio- nados, podem ser usados tal como para radioisótopos de diagnóstico. Desta forma, deve ser mencionada a marcação com 1º Na pela técnica de clora- mina-T [Hunter W.M. e Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495]; marcação com tecnécio”*" conforme descrito por Crockford et al. (Patente US

4.424.200) ou ligação através de DTPA conforme descrito por Hnatowich (Patente US 4.479.930).

A invenção também se refere ao uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um fármaco para o direcionamento específico de um composto que é biologicamente ativa com relação a célu- las que expressam ou superexpressam CXCRA.

' i No sentido da presente descrição, um "composto biologicamente ativo" é qualquer composto capaz de modular, especialmente, inibir, a ativi- Ú dade celular, especialmente, o crescimento, proliferação, transcrição e tra- dução gênica.

A invenção também se refere a um reagente para diagnóstico in vivo que compreende um anticorpo de acordo com a invenção, ou um frag- mento funcional do mesmo, de preferência, marcado, especialmente, radio- marcado, e seu uso em formação de imagens para fins médicos, especial- mente para a detecção de câncer relacionado à expressão ou superexpres- são celular de CXCRA.

A invenção também se refere a uma composição, como um pro- duto combinado ou a um conjugado anti-CXCR4/toxina ou radioisótopo, de acordo com a invenção, usado como um fármaco.

De preferência, a dita composição como um produto combinado ou o dito conjugado será suplementado por um excipiente e/ou um veículo farmacêutico.

Na presente descrição, "veículo farmacêutico" significa um com- posto, ou uma combinação de compostos, presente em uma composição farmacêutica que não causa reações secundárias e que, por exemplo, facili-

ta administração dos compostos ativos, aumenta seu tempo de vida e/ou eficácia no organismo, aumenta sua solubilidade em solução ou melhora seu armazenamento. Estes veículos farmacêuticos são bem conhecidos e serão adaptados por um versado na técnica de acordo com a natureza e a via de administração dos compostos ativos selecionados.

De preferência, tais compostos serão administrados por via sis- têmica, especialmente, por via intravenosa, intramuscular, intradérmica, in- traperitoneal, subcutânea ou oral. Com mais preferência, a composição que compreende o anticorpo de acordo com a invenção será administrada em várias doses espaçadas igualmente ao longo do tempo. Suas vias de admi- nistração, esquemas de dosagem e formas galênicas ótimas podem ser de- terminadas de acordo com os critérios geralmente levados em consideração quando se estabelece um tratamento adequado para um paciente como, por : exemplo, a idade ou o peso corporal do paciente, a severidade do estado geraldo paciente, sua tolerância ao tratamento e os efeitos colaterais senti- Ú dos.

Desta forma, a invenção refere-se ao uso de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, para a preparação de um fármaco para o direcionamento específico de um composto que é biologicamente ativo a células que expressam ou superexpressam CXCRA.

Outras características e vantagens da invenção ainda aparecem na descrição com os exemplos e figuras cujas legendas são apresentadas abaixo.

LEGENDAS DAS FIGURAS As figuras 1A e 1B mostram a expressão de CXCR4 e CXCR2 em células de câncer por análise de qPCR, respectivamente.

A figura 2 mostra a expressão das proteínas CXCR4 e CXCR2 em células de câncer por análise de FACS.

As figuras 3A e 3B mostram a competição da ligação específica del SDF-1 por SDF-1 não marcado (figura 3A) e Mabs 414H5 e 515H7 (figura 3B) sobre membranas celulares de células CHO-K1 que expressam de maneira estável CXCRA4 humano selvagem (T: ligação total; NS: ligação

7 inespecífica).

As figuras 4A e 4B mostram a modulação da ativação de proteí- na G pelo Mab 414H5 (figura 44) e pelo Mab 515H7 (figura 4B) através do monitoramento das respostas de ligação de [PS]GTPyS no receptor CXCR4 selvagem expresso de maneira estável em células NIH-3T3. A figura 5 mos- tra a modulação da ativação da proteína G pelos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 através do monitoramento das respostas de ligação de [SIGTPyS em células tumorais humanas HelLa estimuladas com SDF-1 (10 and 100 nM).

As figuras 6A a 6F mostram a modulação da associação do re- ceptor CXCR4 com diferentes parceiros de interação por SDF-1 e pelos Mabs 414H5 e 515H7 através de uma abordagem de transferência de ener- gia por ressonância de bioluminescência (BRET) em células HEK293. (figu- i ras 6A e 6B: homodimerização de CXCR4:CXCRA; figuras 6C e 6D: hetero- dimerizaçãode CXCR2:CXCRA4 e figuras 6E e 6F: recrutamento mediado por i CXCRA4 de B-arrestina).

As figuras 7A e 7B mostram a inibição da produção de cAMP es- timulada por forscolina por SDF-1 e Mabs 414H5 e 515H7 em células NIH3T3 que expressam de maneira estável o receptor CXCRA4.

A figura 8 mostra a modulação da ativação de proteína G pelos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 através do monitoramento das das res- postas de ligação de [PSIGTPyS no receptor CXCR4 mutante Asn<119>Ser constitutivamente ativo expresso de maneira estável em células CHO-K1.

A figura 9 ilustra a inibição da proliferação de células HelLa indu- zidapor SDF-1 pelo Mab 414H5 in vitro.

As figuras 10A e 10B mostram a inibição da migração de células U937 induzida por SDF-1 pelo Mab para CXCR4 414H5 (figura 10A) e Mab 515H7 (figura 10B) in vitro.

A figura 11 mostra a inibição do crescimento tumoral de xenoen- xerto MDA-MB-231 pelo Mab anti-CXCR4 414H5 (A) e pelo Mab 515H7 (B) em camundongos Nod/Scid. A figura 12 mostra a atividade do Mab anti- CXCR4 414H5 em modelo de sobrevivência de camundongos Nod/Scid

Ue37.

As figuras 13A a 13C mostram a inibição da liberação de cálcio induzida por SDF-1 pelo Mab anti-CXCR4 515H7 em células CHO-CXCR4 (figura 13A) e células de câncer MDA-MB-231 (figura 13B), U937 (figura 130).

A figura 14 mostra a inibição de tumor de xenoenxerto KARPAS 299 de célula T em camundongos Nod/Scid por 414H5.

A figura 15 mostra a atividade do Mab anti-CXCR4 murino m515H7 em modelo de sobrevivência em camundongos Nod/Scid U937.

A figura 16 mostra a atividade do Mab anti-cCXCR4 murino m515H7 na inibição do crescimento de tumor de xenoenxerto KARPAS 299 de célula T em camundongos Nod/Scid.

A figura 17 mostra a competição pela ligação específica de — —[?MSDF-1 pelos Mabs murinos m414H5 e m515H7 e Mabs quiméricos c414H5 e c515H7 sobre membranas celulares de células CHO-K1 que ex- Ú pressam de maneira estável CXCR4 humano do tipo selvagem (T: ligação total; NS: ligação inespecífica).

A figura 18 mostra a modulação da ativação da proteína G pelos Mabs murinos m414H5 e m515H7 e pelos Mabs quiméricos c414H5 e —c515H7 pelo monitoramento das respostas de ligação de [PS]JGTPyS no re- ceptor CXCR4 selvagem expresso de maneira estável em células NIH-3T3 estimuladas com SDF-1 (10 nM).

A figura 19 mostra a modulação da ativação de proteína G pelos Mabs murinos anti-CXCR4 m414H5 e m515H7 Mabs e pelos Mabs quiméri- cos c414H5 e c515H7 pelo monitoramento das respostas de ligação de [S]GTPyS em células tumorais humanas HeLa estimuladas com SDF-1 (10 nM).

As figuras 20A-20C mostram a modulação da associação do re- ceptor CXCR4 com diferentes parceiros de interação por SDF-1 e pelos Mabs m414H5, c414H5, m515H7 e c515H7 através de uma abordagem de transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) em células HEK293. (figuras 20A: homodimerização de CXCR4:CXCRA; figura

| 63/93 20B: heterodimerização de CXCR2:CXCR4 e figuras 20C: recrutamento de B-arrestina mediado por CXCR4). As figuras 21A e 21B mostram a inibição da liberação de cálcio induzida por SDF-1 em células CHO-CXCRA (figura 21A) e em células U937 (figura21B) As figuras 22A e 22B mostram a inibição da migração de células U937 induzida por SDF-1 pelos Mabs para CXCR4 m414H5 e c414H5 (figura 22A) e Mabs m515H7 e c515H7 (figura 22B) in vitro. A figura 23 mostra a atividade dos Mabs anti-CXCR4 quiméricos em modelo de sobrevivência de camundongos Nod/Scid U937.

EXEMPLOS Exemplo 1: Expressão de CXCR4 e CXCR2 em células de câncer o Análise por Q-PCR De modo a quantificar a expressão relativa de CXCR4 e CXCR2 Ú em diferentes linhagens celulares de câncer, um RT-PCR em tempo real foi usado. As amostras de RNA foram extraídas a partir de diferentes linha- gens celulares com o uso dos protocolos RNeasy Mini ou Midi (Qiagen Cor- poration, França). As amostras de RNA foram então controladas com o uso do sistema automatizado de eletroforese Experion (BIO-RAD Corporation, França) e mostrou uma boa qualidade/integridade. Um ug de cada amostra de RNA foi convertido em molde de cDNA com o uso do Kit iScript cDNA Synthesis (BIO-RAD Corporation, França). Os níveis de cDNA foram quanti- ficadoscomo uso de qPCR com uma sonda TaqMan para CXCR2 ou como uma sonda SYBERGreen para CXCRA4. A comparação das amostras exige normalização, então a referência interna RPLO foi introduzida. As sondas TaqMan (usadas para CXCR2) carregavam um marcador repórter 5' FAM e um grupo "quencher" 3' TAMRA. A enzima de PCR foi ativada através de — aquecimento durante 2 minutos a 50ºC e 10 min a 95ºC. Um procedimento em duas etapas foi usado, 15 segundos 95ºC e 1 min a 62ºC durante 40 ou 45 ciclos em uma mistura de PCR contendo 5 ul de molde de cDNA (diluição

1/20), 1 x qPCR Mastermix (TaqgMan Universal PCR Master Mix, Applied Bi- osystems Corporation, Branchburg New Jersey, EUA), 50 a 900 nM de cada iniciador e 50 a 100 nM de sonda em um volume total de 50 ul. Todas as re- ações foram realizadas com o uso do instrumento iCycler (BIO-RAD Corpo- —ration). O Q-PCR permitiu a determinação do limiar de detecção (Ct). Quanto menor o valor de Ct, mais expresso está o gene testado. Os iniciadores e a sonda para a proteína ribossomal humana, grande, PO foram: iniciador de sentido direto, 5 *- GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3' (SEQ ID No.32); iniciador de sentido reverso, 5'- AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3'(SEQ ID No.33); sonda, 5 (FAM)- TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA- (TAMRA)-3' (SEQ ID No. 34). ' i Os iniciadores para o CXCR4 humano (receptor de quimiocina 4) foram: | iniciador de sentido direto, 5' -CTCCTTC ATCCTCCTGGAAATC-3 ' (SEQ ID No. 35); iniciador de sentido reverso, 5*- CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-S ' (SEQ ID NO. 36).

Os iniciadores e a sonda para CXCR2 humano (receptor de qui- miocina 2) foram: iniciador de sentido direto, 5- GTGGTCATTATCTATGCCCTGG- S ' (SEQ ID NO. 37); iniciador de sentido reverso, 5 '- CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-S ' (SEQ ID NO.38); sonda, 5 (FAM)- TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA- (TAMRA)-3' (SEQ ID No. 39).

No estudo comparativo, a expressão de dois genes [o gene tes- tado (CXCRA4 ou CXCR2) e RPLO)] foi quantificada em duas amostras dife- rentes: a linhagem celular testada e uma linhagem celular de referência. À linhagem celular de referência correspondeu à linhagem celular contendo a menor expressão do gene quantificado. O cálculo da expressão gênica com- parativa foi feito com o uso da seguinte fórmula:

Expressão gênica relativa = (1+ Egene) CC / (1+ EgpLo)ÔCtA- E gene = eficiência da reação de PCR com o uso de iniciado- res/sonda do gene quantificado ErPLo = eficiência da reação de PCR com o uso dos iniciado- res/sondade RPLO Ct = limiar de detecção ACt(1)= Ctgene (linhagem celular testada) - Ctyene (linhagem celu- lar de referência) ACt(2)= Ctrp1o (linhagem celular testada) - Ctrp1o (linhagem celu- lardereferência).

Para cada série de PCR, um valor de quantidade relativa do ge- ne foi calculado, e as linhagens celulares de câncer foram classificadas em grupos considerando seus níveis de expressão do maior para o negativo.

. “Todos os dados são apresentados nas figuras 1A e 1B. Todas as linhagens celulares de câncer testadas expressaram CXCRA (figura 1A) e CXCR2 com ' a exceção de DU145 e U-87MG para CXCR?2 (figura 1B).

- Análise de FACS: As linhagens celulares de câncer MDA-MB-231 , PC3 e U937 fo- ram permeabilizadas e, então, incubadas com 10 ug/mL de anticorpos mo- —noclonais anticCXCR4 [44717 (R&D Systems) versus seu controle isotípico IgG2b [SIGMA] ou 10 ug/mL de anticorpos monocionais anti-CXCR2 (anti h- CXCR2, clone 48311, R&D Systems, Mab 331 versus seu controle isotípico IgG2a). As células foram então lavadas com 1%BSA/PBS/0.01% NaN3. A seguir, anticorpos secundários marcados com Alexa foram adicionados às células, que foram deixadas em incubação a 4ºC durante 20 min. As células foram então lavadas novamente duas vezes. Após a segunda lavagem, a análise de FACS foi feita. Os resultados destes estudos de ligação são for- necidos na figura 2. Desta forma, as células tumorais, tais como MDA-MB- 231, PC3 e U937, expressaram ambas as proteínas CXCR4 e CXCR2.

Exemplo 2: Geração de anticorpos monocionais (Mabs) con- tra CXCR4 humano.

Para gerar anticorpos monoclonais para CXCR4, camundon-

gos Balb/c foram imunizados com células NIH3T3-CXCRA4 recombinantes e/ou peptídeos correspondentes à terminação N e alças extracelular de CXCRA4. Camundongos de 6 a 16 semanas de idade na primeira imunização, foram imunizados uma vez com o antígeno em adjuvante de Freund comple- to subcutaneamente (subcutaneamente) seguido de 2 a 6 imunizações com antígeno em adjuvante de Freund incompleto subcutaneamente.

A resposta imunológica foi monitorada por coletas de sangue retro-orbitais.

O soro foi rastreado por ELISA (conforme descrito abaixo) e os camundongos com títu- los altos de anticorpos anti-CXCR4 foram usados para as fusões.

Os ca- —mundongos foram estimulados intravenosamente com o antígeno dois dias antes do sacrifício e remoção do baço. - ELISA Para selecionar os camundongos produtores de anticorpos anti- ' — — CXCRA4, os soros dos camundongos imunizados foi testado por ELISA.

Re- sumidamente, placas de microtitulação foram revestidas com peptídeo N- ' terminal [1-41] purificado conjugado a BSA a um equivalente de 5upg de pep- tídeo/mL, 100ul/poço, incubadas a 4ºC de um dia para o outro e, então, bloqueadas com 250uL/poço de 0,5% de gelatina em PBS.

As diluições de plasma dos camundongos imunizados com CXCRA4 foram adicionadas a ca- da poçoeincubadas por 2 horas a 37ºC.

As placas foram lavadas com PBS e, então, incubadas com um anticorpo cabra anti-lgG de camundongo conju- gado a HRP (Jackson Laboratories) durante 1 hora a 37ºC.

Após a lavagem, as placas foram reveladas com substrato de TMB, a reação foi paralisada 5 min após pela adição de 100 ul/poço de H2SO, 1M.

Os camundongos que desenvolveram os maiores títulos de anticorpos anti-CXCR4 foram usados para a geração de anticorpo. - Geração de hibridomas produtores de Mabs para CXCRA4. Os esplenócitos de camundongo, isolados de camundongos Balb/c que desenvolveram os títulos mais elevados de anticorpos anti- —CXCRA4 foram fundidos com PEG a uma linhagem de células de mieloma de camundongo Sp2/0. As células foram plaqueadas a aproximadamente 1x10” Ipoço em placas de microtitulação seguido de uma incubação de duas se-

manas em meio seletivo contendo ultra meio de cultura + 2 mM de L- gluta- mina + 1 mM de piruvato de sódio + HAT 1x. Os poços foram então rastrea- dos por ELISA quanto a anticorpos IgG monocionais anti-CXCR4. Os hibri- domas secretores de anticorpo foram então subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante, cultivados in vitro para gerar anticorpo para aná- lise posterior.

Exemplo 3: Caracterização por análise de FACS da especifi- cidade de ligação dos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 e reconheci- mento de linhagens de células de câncer.

Neste experimento, a ligação específica a CXCR4 humano dos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 foi examinada por análise de FACS.

NIH3T3, células transfectadas NIH3T3-hCXCRA4 e linhagens de células de câncer MDA-MB-231, HeLa e U937 foram incubadas com 10 y- - i g/mL de anticorpo monocional 414H5 e 515H7. As células foram então lava- das com 1%BSA/PBS/0,01% de NaN3. A seguir, anticorpos secundários Ú marcados com Alexa foram adicionados às células e que foram deixadas em incubação a 4ºC durante 20 min. As células foram então lavadas novamente duas vezes. Após a segunda lavagem, a análise de FACS foi feita. Os resul- tados destes estudos de ligação são fornecidos na Tabela 4 a seguir, que mostra [média de intensidade de fluorescência (MFI) obtida por FACS] que os Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 se ligaram especificamente à linhagem celular transfectada CXCR4 humano-NIH3T3 enquanto que não houve reco- nhecimento nas células NIH3T3 parentais. Estes Mab também foram capa- zes de reconhecer linhagens de células de câncer humanas, por exemplo, —célulasde câncerdemama MDA-MB-231, células de câncer pró-mieolocítico U937 e células de câncer de colo do útero HeLa.

Os Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 reconheceram NIH3T3- hCXCR4 transfectante, mas não houve reconhecimento das células NIH3T3 selvagens parentais. Os Mabs 414H5 e 515H7 também foram capazes de reconhecer as linhagens de células de câncer.

Tabela 4 (o ugim) Exemplo 4: Ligação por competição dos Mabs anti-CXCR4 i 414H5 e 515H7 por [*IISDF-1 em membranas de CHO-K1 expressando de maneira estável o receptor CXCRA4 humano Este ensaio permite avaliar a capacidade dos Mabs 414H5 e 515H7 competirem pela ligação de [PÉIISDF-1 radiomarcado ao receptor CXCRA4 humano, nos sítios de ligação ortostéricos ou alostéricos . As células CHO-K1, expressando de maneira estável e constitu- — tivaoreceptor CXCR4 humano foram obtidas mediante transfecção de célu- . 10 las CHO-K1 naive (ATCC CCL-61) com um vetor de expressão de mamífero : transportando a sequência de codificação inteira do receptor CXCR4 huma- no (RefSeq NM 003467). As células foram propagadas em meio de cultura completo [DMEM-Ham F12 suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e 500 pg/ml de geneticina]. Os experimentos de ligação do radioligan- te foram conduzidos em membranas celulares obtidas mediante raspagem mecânica de células CHO/CXCRA4 em tampão de lise [Hepes 20mM, pH 7,4, NaCl 150mM] seguido de centrifugação (10.000 g, 15 min). A ligação de [*I]|SDF-1 (atividade específica: 1500 Ci/mmol) foi realizada com o uso da tecnologia de SPA (ensaio de cintilação por proximidade - GE Healthcare). Resumidamente, as membranas celulares (30 ug/poço) foram incubadas em tampão de ligação [Hepes 20 mM, pH 7,4, CaCi2 1 mM, MgCI2 5 mM, NaC! 150 mM, BSA 1%] junto com o composto a ser avaliado (SDF-1 ou mAb), radioligante (1 nM) e finalmente, microesferas de SPA-WGA-PVT (7,3 mg/poço). O equilíbrio da ligação foi atingido após 1 hora a 25ºC.Após centri- fugação [1000 g durante 10 minutos], as contagens radioativas foram medi- das em um contador de cintilação (TopCount, Perkin Elmer). A ligação ines- pecífica foi estimada na presença de 10 uM de SDF-1 não-marcado.

O SDF-1 não-marcado inibiu de forma dose-dependente a liga-

ção de [*IISDF-1 com um valor de pKi (IC50 = concentração de ligante que gera 50% de inibição da ligação específica de [*PIISDF-1) de 7,75 + 0,27 nM (n=4) (figura 3A). Sob as mesmas condições experimentais, nossos Mabs anti-CXCR4 (100 nM) competiram de forma eficaz pela ligação de [PIISDF- 1 coma seguinte ordem de classificação de eficácia de competição (% de inibição de [ÉIISDF-1): 515H7 (64 + 3%) 414H5 (43 + 4 %) (figura 3B). Exemplo 5: Modulação de ligação de [ººS] GTPyS nas mem- branas celulares expressando receptor CXCRA4 selvagem pelos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7.

Este ensaio funcional permite monitorar a ativação da proteína G através do receptor CXCR4 humano selvagem e sua modulação por ligantes de CXCR4 e Mabs 414H5 e 515H7. As células NIH-3T3 expressando de maneira estável e constitutiva o receptor CXCR4 selvagem foram obtidas . conforme descrito no exemplo acima para células CHO-K1. As células HeLa (carcinoma de colo de útero humano) foram propagadas em meio de cultura : completo [EMEM suplementado com 10% de SFB, 1% de L-glutamina, 2 UM de bicarbonato de sódio]. A ligação de [SIGTPyS foi feita sobre membranas celulares obtidas mediante raspagem mecânica de em tampão de lise [He- pes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM] e centrifugação adicional (10000 g, 15 min). A incorporação e detecção de [”S]IGTPyS (atividade específica: 1000 Ci/mmol) foi feita com o uso da tecnologia de SPA (ensaio de cintilação por proximidade - GE Healthcare). Resumidamente, as membranas celulares (10 ug/poço) foram incubadas em tampão de ligação [Hepes 20 mM, GDP 3uM, MgCl2 10 mM, NaC! 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4] junto com o composto a ser avaliado (SDF-1 ou Mab de interesse), [ºSIGTPyS (0,2 a 0,4 nM) e finalmente, microesferas de SPA-WGA-PVT (7,3 mg/poço). A reação de liga- ção foi realizada durante 1 hora a 25ºC. Após centrifugação [1000 g durante 10 minutos), as contagens radioativas foram medidas em um contador de cintilação (TopCount, Perkin Elmer). A potência do antagonista foi calculada pela aplicação da equação de Cheng Prussofí KB= [conc. anta- gol((ECSO/EC50)-I) onde EC50 e EC50' são, respectivamente, a potência de SDF-1 na ausência e na presença de mAb. O SDF-1 induziu um aumento dose-dependente da ligação de [ºSIGTPyS, como o resultado da ativação da proteína G pelo receptor CXCRA4. A estimulação máxima da ligação de [S]GTPyS representa, respectivamente, 167% e 320% sobre a ligação ba- sal de [”S]JGTPyS para as membranas celulares de HeLa e NIH3T3/CXCRA. A potência de SDF-1 foi similar para ambas as linhagens celulares e corres- pondeu a 41,3 + 9,7 nM (figuras 4A a 4B). Sob estas condições experimen- tais, a potência do antagonista dos Mabs 414H5 e 515H7, como determina- do nas células NIH3T3/CXCRA4 foi de 51 nM e 15 nM, respectivamente. Uma eficácia antagonista similar foi observada para células HeLa (figura 5).

Exemplo 6: Associação de CXCRA4 com diferentes parceiros de interação: homo e heterodimerização, recrutamento de f-arrestina através de uma abordagem de transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) e efeito dos Mabs 414H5 e 515H7 sobre - — estes dímeros Este ensaio funcional permite avaliar as alterações conformacio- i nais induzidas mediante a ligação de SDF-1 e/ou Mabs 414H5 e 515H7 ao receptor CXCR4 com relação à formação de homodímero de CXCRA4 e hete- rodímero de CXCR2/CXCR4 assim como o recrutamento da proteína de si- nalização de B-arrestina-2.

Vetores de expressão para cada um dos parceiros de interação investigados foram construídos como proteínas de fusão com o corante cor- respondente (luciferase de Renilla reniformis, Rluc e proteína amarela fluo- rescente, YFP) pela aplicação de técnicas de biologia molecular convencio- nais. Dois dias antes da realização dos experimentos de BRET, as células HEK293 foram transitoriamente transfectadas com vetores de expressão que codificam os parceiros de BRET correspondentes: [CXCR4/Rluc + CXCR4 MNFP] para estudar homo dimerização de CXCR4, [CXCR4/Rluc + CXCR2:YFP] para estudar a heterodimerização de CXCR4 e CXCR2 e [CXCR4/Rluc + B-arr2:YFP] para estudar o recrutamento mediado por CXCRA4de B-arrestina-2.

No dia seguinte, as células foram distribuídas em placas brancas de 96 MW pré-revestidas de polilisina em meio de cultura completo [DMEM suplementado com 10 % de SFB]. As células foram primeiro cultivadas a 37ºC com 5 % de CO2 de modo a permitir a adesão das células à placa. As células foram então privadas de alimento com 200 ul de DMEM/poço de um dia para o outro. Imediatamente antes do experimento de BRET, o DMEM foi removido e as células foram lavadas rapidamente com PBS. As células fo- ram então incubadas em PBS na presença ou ausência de anticorpo, 10 min a 37ºC antes da adição de coelenterazina H 5 uM com ou sem SDF-1 300 nM em um volume final de 50 ul. Após a incubação por mais 10 minutos a 37ºC, a captura de emissão de luz a 485 nm e 530 nm foi iniciada com o uso do leitor multimarcador Mithras LB940 (Berthold) (1 seg./comprimento de onda/poço repetida 15 vezes à temperatura ambiente). O cálculo da razão de BRET foi feito conforme anteriormente descrito (Angers et al., 2000): [(emissão 530 nm) - (emissão 485 nm) X Cf] / . Ú (emissão 485 nm), onde Cf = (emissão 530 nm) / (emissão 485 nm) para células que expressam a proteína de fusão Rluc sozinha sob as mesmas Ú condições experimentais. A simplificação desta equação mostra que a razão de BRET corresponde à razão de 530/485 nm obtida quando os dois parcei- ros de BRET estão presentes, corrigida pela razão de 530/485 nm obtida sob as mesmas condições experimentais, quando apenas o parceiro fundido a Rlucestá presente no ensaio. Com o propósito de legibilidade, os resultados são expressos em unidades de milliBRET (mBU); mBU corresponde à razão de BRET multiplicada por 1000.

O SDF-1 (300 nM) aumentou em cerca de 20% o sinal de BRET resultante da proximidade espacial das proteínas adaptadoras e aceptoras fundidas ao receptor CXCRA, indicando provavelmente a formação de ho- modímeros de CXCR4/CXCRA4 ou alterações conformacionais de dímeros pré-existentes (Figures 6A e 6B). De forma interessante, o SDF-1 (300 nM) reduziu em cerca de 24 % o sinal de BRET resultante da proximidade espa- cial das proteínas adaptadoras e aceptoras fundidas a CXCR2 e CXCRA4, também indicando provavelmente a formação de heterodímeros de CXCR2/CXCRA ou alterações conformacionais de dímeros pré-existentes (figuras 6C e 6D). Neste último caso, a conformação ativada por SDF-1 de

: 72/93

CXCRA4/CXCR?2 parece menos favorável para a transferência de energia de BRET.

Em ambos os casos, os Mabs 414H5 e 515H7 foram capazes de modular alterações conformacionais induzidas por SDF-1 para homodímeros de CXCRA4 (63 % de inibição do aumento de BRET induzido por SDF-1 para 414H5e69% de inibição do aumento de BRET induzido por SDF-1 para 515H7, figuras 6A e 6B, respectivamente) assim como para a formação de heterodímeros de CXCR2/CXCR4 (50% de inibição da redução de BRET induzida por SDF-1 para 414H5 e 90% de inibição da redução induzida por SDF-1 para 515H7, figuras 6C e 6D, respectivamente). Os Mabs 414H5 e 515H7 também foram capazes de modular sozinhos a proximidade espacial de CXCRA4/CXCR4 e CXCR2/CXCRA, respectivamente, indicando uma influ- ência dos Mabs 414H5 e 515H7 na conformação dos homodímeros de CXCRA4/CXCRA4 e heterodímeros de CXCR2/CXCRA (figuras 6A, 6B, 6C e : : 6D). A ativação de CXCR4 por SDF-1 (300 nM) gerou um forte recrutamento da molécula de sinalização intracelular B-arrestina, conforme mostrado pela Ú intensificação de 233% no sinal de BRET (figuras 6E e 6F). Este recrutamen- to foi parcialmente inibido pelos Mabs 414H5 e 515H7 (inibição de cerca de 20% para 414H5 e 95% para 515H7, figuras 6E e 6F, respectivamente) mos-

trando o efeito dos Mabs 414H5 e 515H7 sobre a sinalização.

Exemplo 7: Inibição mediada por CXCRA4 da produção de cAMP

Este ensaio funcional foi delineado para monitorar a sinalização do receptor CXCRA ao nível das adenilato ciclases através de proteínas ini- bitórias de Gi/o.

O procedimento LANCE para cAMP (Perkin Elmer) foi apli- cado conforme detalhado pelo fabricante.

Resumidamente, células NIH3T3 expressando de maneira estável e constitutiva o receptor CXCR4 selvagem foram obtidas e propagadas conforme descrito acima.

As células foram cole- tadas com o uso do agente isento de tripsina Versene e ressuspensas a uma concentração de 10º células/ml em uma solução contendo o Mab anti-AMP ligadoa AlexaFluor (diluição de 1/100) e o composto (forscolina, SDF-1 e/ou Mabs 414H5 e 515H7). Mediante incubação durante 30 min. à temperatura ambiente, a mistura de detecção contendo os complexos de európio-

estreptavidina (diluição de 1/125) e biotina-cAMP (diluição de 1/125) foi adi- cionada. Após incubação por 1 hora à temperatura ambiente, o sinal de FRET resultante foi medido em um leitor multimarcador Mithras LB940 (Ber- thold). Os dados são expressos como valores fluorescentes arbitrários ou como estimulação relativa em relação à resposta de SDF-1 mediante subtra- ção do efeito de FK.

A forscolina (FK) estimulou de forma dose-dependente a produ- ção de CAMP com uma potência de cerca de 0,3 UM em células NIH3T3/CXCRA (figura 7A). Na co-presença de SDF-1, os níveis de CAMP intracelular diminuíram como um resultado da ativação da proteína inibitória Gi/o pelo receptor CXCRA4. A potência de SDF-1 foi de 5,0 + 3,1 nM (figura 7A). Os Mabs 414H5 e 515H7 inibiram de forma eficaz o efeito estimulado por forscolina de SDF-1 (100 nM) em mais de 60 % para 414H5 e em mais BR — de80% para 515H7 (figura 7B). ' Exemplo 8: Modulação da ligação de [”SIGTPyS em mem- Ú branas celulares expressando constitutivamente ativo o receptor CXCRA4 mutante Asn'”*Ser pelos Mabs 414H5 e 515H7.

Este ensaio funcional permite monitorar a ativação da proteína G através de um receptor CXCR4 mutante constitutivamente ativo (CAM) —Asn'"ºSer (consulte Zhang et al, 2002). Este ensaio sensível permite discri- minar os ligantes de CXCRA4 com base na sua atividade intrínseca (agonista parcial, antagonista silencioso ou agonista inverso). Conforme anteriormente descrito por Zhang e outros, ligantes de CXCR4 como AMD3100 ou T140 se comportaram, respectivamente, como agonista parcial e agonista inverso no receptor CXCR4 CAM. A identificação do antagonista silencioso pode ser difícil uma vez que esta classe de moléculas deve apresentar afinidades si- milares por ambos os estados ativo e inativo de CXCR4 (Wurch et al., 1999).

A introdução de uma mutação Asn119Ser na sequência de codi- ficação do receptor CXCRA foi realizada pela aplicação de técnicas de biolo- gia molecular convencionais (kit de mutagênese sítio-dirigida QuickChange, Stratagene, EUA). Células CHO-K1 expressando de maneira estável e cons- B titutiva o receptor CXCR4 CAM foram obtidas conforme descrito no exemplo acima.

A ligação de [PSIGTPyS foi feita em membranas celulares obtidas por raspagem mecânica em tampão de lise [Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM] e centrifugação adicional (10000 g, 15 min). A incorporação de [PS]IGTPyS (atividade específica: 1000 Ci/mmol) foi feita com o uso da tec- —nologiade SPA (ensaio de cintilação por proximidade - GE Healthcare). Re- sumidamente, as membranas celulares (10 ug/poço) foram incubadas em tampão de ligação [Hepes 20 mM, GDP 3uM, MgCI2 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4] junto com o composto a ser avaliado (SDF-1 ou mAb), [SIGTPyS (0,4 nM) e finalmente, microesferas de SPA-WGA-PVT (7,3 mg/poço). A reação de ligação foi realizada durante 1.hora a 25ºC.

Após centrifugação [1000 g durante 10 minutos], as contagens radioativas foram medidas em um contador de cintilação (TopCount, Perkin Elmer). O SDF-1 (100 nM) estimulou a ligação de [”*S]GTPyS em 130 %. O agonista - inverso T140 inibiu a ligação basal (- 17 %) e estimulada por SDF-1 (- 159 %) de [PSIGTPyS.

Em contrapartida, os Mabs 414H5 e 515H7 se comporta- Ú ram como as antagonistas silenciosos de CXCRA4 CAM, sem alterar a ligação basal de [S]IGTPyS (figura 8), mas inibindo a ligação de [PSJGTPyS induzida por SDF-1 (figura 8). Exemplo 9: Inibição da proliferação de células HeLa induzi- daporSDF-|peloMab anti-CXCR4 414H5 in vitro Células HeLa da ATCC foram cultivadas de forma rotineira em meio EMEM (Lonza Corporation.

Venders.

Bélgica), 10% de SFB (SIGMA Corporation.

St Louis.

EUA), 1% de L-glutamina (Invitrogen Corporation.

Es- cócia, UK), 2% de bicarbonato de sódio solução a 7,5% (Invitrogen Corpora- tion.

Escócia, UK). As células foram repicadas 3 dias antes dos ensaios de proliferação para que elas ficassem confluentes. - Proliferação de células HeLa induzida por SDF-1. As células HeLa foram plaqueadas em placas para cultura de te- cido de 96 poços a uma densidade de 1 x 10º células/poço em 200 ul de —meiosem soro (meio EMEM mais 1% de L-glutamina, 2% de bicarbonato de sódio, solução a 7,5%). Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as dilui- ções adequadas de SDF-1 foram adicionadas às células HeLa.

Após um total de 76 horas de cultura, as células foram pulsadas com 0,25 uCi de ['Hltimidina (Amersham Biosciences AB.

Uppsala.

Suécia) durante 16 horas.

A magnitude de [3H] timidina incorporada no DNA foi quantificada por conta- gem por cintilação líquida.

Os resultados foram expressos como índice de proliferação = [cpm médio de células + SDF-1/ com médio de células - SDF-1]. As células HeLa foram incubadas com SDF-1 (0 a 1000ng/ml). O SDF-1 estimulou a proliferação in vitro de células HeLa em 1,5 a 2 vezes.

À concentração de SDF-1 necessária para obter o índice de proliferação mais altoereproduzível foi de 200 ng/ml (25 nM). ' - Inibição da proliferação in vitro de células HeLa induzida por SDF-1 pelo Mab para CXCR4 414H5 As células HeLa foram plaqueadas em placas para cultura de te- - i cido de 96 poços a uma densidade de 1 x 10º células/poço em 200 ul de meiosem soro (meio EMEM mais 1% de L-glutamina, 2% de bicarbonato de Ú sódio, solução a 7,5%). Vinte e quatro horas após o plaqueamento, diluições adequadas de Mab anti-CXCR4 414H5 em meio de diluição, foram adiciona- das em triplicata às células HeLa na presença ou na ausência de SDF-1 a uma concentração final de 200 ng/ml (25 nM). Após um total de 76 horas de cultura, as células foram pulsadas com 0,25 uCi de [HJtimidina (Amersham Biosciences AB.

Uppsala.

Suécia) durante 16 horas.

A magnitude de [3H] timidina incorporada no DNA foi quantificada por contagem por cintilação líquida.

Os resultados foram expressos como a fração afetada (Fa) cal- —culadacomo uso da fórmula: Fa = [1- [cpm médio de células incubadas com Mab + SDF-1/ com médio de células incubadas com meio de diluição + SDF- 1)] x 100. O efeito in vitro do Mab anti-CXCR4 414H5 sobre a proliferação de células HeLa induzida por SDF-1 foi caracterizado.

As células HeLa fo- — ram incubadas com Mab 414H5 ou controle com ou sem SDF-1 (200 ng/ml). O SDF-1 estimulou o crescimento in vitro de células HeLa (1,5 a 2 vezes). À curva dose-resposta para Mab 414H5 foi obtida pelo tratamento das células com diluições seriadas duas vezes de Mab variando de O a 1500 nM, 24 h após o plaqueamento das células. Como a proliferação celular foi avaliada 76 horas após o plaqueamento, cada condição testada corresponde a um tempo de exposição de 48 h ao Mab ou controle. Os resultados foram ex- pressos como a fração afetada (Fa) com o uso da fórmula descrita acima. Os resultados (representados na figura 9) mostraram que o Mab para CXCRA4 414H5 inibiu a proliferação de células HeLa induzida por SDF-1 in vitro. Exemplo 10: Efeito dos Mabs anti-CXCR4 414H5 e 515H7 sobrea migração de células U937 induzida por SDF-1 Para avaliar o efeito inibidor dos anticorpos monoclonais anti- CXCRA4 414H5 e 515H7 sobre o processo de migração, 100 000 células U- 937 em meio RPMI 1640 suplementado com 2% de SFB, foram plaqueadas - na câmara superior de câmaras de migração (placas de 24 poços com ta- — manho dos poros de 8 um) na presença ou na ausência de SDF- 1 na parte | inferior dos poços e com ou sem os Mabs 414H5 e 515H7 na câmara supe- rior. Neste ensaio, IgG2a e I9G2B murinas foram introduzidas como contro- les de isotipo. Duas horas após o plaqueamento, as células em migração foram contadas. Os resultados apresentados nas figuras 10A para 414H5 e

20. 10B para 515H7 demonstraram que, conforme esperado, o SDF-1 foi capaz de induzir um aumento significativo da migração das células U-937. Nenhum efeito foi observado quando as células foram incubadas com o controle isotí- pico de IgG2 . Em contrapartida, para as células incubadas com os Mabs 414H5 e 515H7, uma redução significativa e reproduzível na migração de células U937 induzida por SDF-1 foi observada: 50% com Mab 414H5 e mais de 80% com o Mab 515H7.

Exemplo 11: Inibição pelo Mab anti-CXCR4 414H5 do cres- cimento tumoral de xenoenxerto de MDA-MB-231 em camundongos Nod/Scid.

O objetivo destes experimentos foi avaliar a capacidade dos Mabs anti-CXCRA4 414H5 e 515H7 em inibir o crescimento de xenoenxerto de MDB-MB-231 em camundongos Nod/Scid. As células MDA-MB-231 da

ECACC foram cultivadas de forma rotineira em meio DMEM (Invitrogen Cor- poration, Escócia, UK), 10% de SFB (Sigma, St Louis MD, EUA). As células foram repicadas 48 horas antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento. Dez milhões de células MDA-MB-231 fo- ram enxertadas em PBS a camundongos Nod/Scid com 7 semanas de idade (Charles River, França). Cinco dias após a implantação, os tumores eram mensuráveis (34 mmº<Vº<40 mm?) e os animais foram divididos em grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável. Os camundongos foram tratados intraperitoneal. com uma dose de carregamento de 2 —mg/camundongo de Mab 414H5 e Mab 515H7, respectivamente.

A seguir, os camundongos foram injetados com 1 mg/dose/camundongo de Mab 414H5 duas vezes por semana ou 0,5 mg/dose/camundongo de Mab 515H7 três vezes por semana. Um grupo com - PBS foi introduzido como um grupo de controle neste experimento. O volume dotumor foi medido duas vezes por semana e calculado pela fórmula: 9/6 X i comprimento X largura X altura. As análises estatísticas foram feitas em ca- da medida com o uso de um ensaio de Mann-Whitney.

Nestes experimentos, nenhuma mortalidade foi observada du- rante o tratamento. Em comparação ao grupo com PBS, houve uma inibição significativa do crescimento tumoral entre D7 e D39 (p < 0,002) para o Mab 415H5 1 mg/dose ou 515H7 0,5 mg/dose e o volume tumoral médio após 5 semanas de tratamento foi reduzido em 82% e 50% em relação ao PBS para os Mab 415H5 e 515H7, respectivamente (figuras 11A e 11B).

Exemplo 12: Atividade do Mab anti-CXCR4 414H5 em mode- lode sobrevivência de camundongos de U937 Células U937 da ATCC foram cultivadas em meio RPMI 1640, 10% de SFB, 1% de L-glutamina. As células foram repicadas dois dias antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento. Dez milhões de células U937 foram injetadas intraperitoneal. a camundon- gos Nod/Scidfêmeas. Dois dias após a implantação, os camundongos foram tratados subcutaneamente com uma dose de carregamento de 2 mg de 414H5 mAb/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticorpo/camundongo. Os camundongos de controle receberam injeções de PBS, uma vez que foi mostrado em estudos anteriores que nenhuma dife- rença foi observada na sobrevivência entre camundongos injetados com PBS e camundongos administrados com um controle isotípico de IgG ca- — mundongo.A sobrevivência dos camundongos foi monitorada todos os dias.

Os resultados descritos na figura 12 mostraram que os camun- dongos tratados com o Mab 414H5 tiveram um aumento dramático e signifi- cativo na longevidade com T/C% de cerca de 343.

Exemplo 13: Mobilização mediada pelo receptor CXCR4 dos estoques de cálcio intracelular.

Este ensaio funcional foi projetado para monitorar a sinalização do receptor CXCRA através da estimulação da via da fosfolipase C, induzin- do a liberação de cálcio a partir dos estoques intracelulares do retículo en- - doplásmico. As células CHO-K1 expressando de maneira estável e constituti- va o receptor CXCRA4 selvagem foram obtidas conforme descrito no exemplo acima. As células MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama humano) e U937 (linfoma humano) foram propagadas em meio de cultura completo, respectivamente [DMEM suplementado com 10% de SFB] e [RPMI 1640 —suplementado com 10% SFB, 20 mM HEPES, 1% de solução de aminoáci- dos não essenciais, 1% de piruvato de sódio, 1% de L-glutamina, 4,5 g/L de glicose]. Todos os tipos celulares foram plaqueados em placas de 96MW pretas a uma densidade de 100.000 células/poço em meio de cultura ade- quado. As células foram privadas de alimento de um dia para o outro antes de conduzir os experimentos. As células são carregadas com corante de cálcio fluorescente (Fluo-4 No Wash, Invitrogen US) em tampão de carrega- mento [HBSS 1x, HEPES 20 mM, ácido de probenicide 25 mM] durante 30 min. a 37ºC seguido de 30 min. a 25ºC. A estimulação por SDF-1 foi feita por injeção direta em cada poço. Para os experimentos de antagonismo, 10 ulde solução de Mab são adicionadas diretamente no tampão de carrega- mento pelo menos 10 min. antes do SDF-1. As medições cinéticas da fluo- rescência são realizadas em um leitor de microplacas por fluorescência mul-

timodo Mithras LB940 (Berthold) com o uso dos seguintes ajustes: excitação a 485 nm, emissão a 535 nm, energia de excitação a 10000 unidades arbi- trárias. A fluorescência em cada poço é registrada durante 0,1 segundo por segundo e durante um período de tempo de 20 segundos antes da injeção de SDF-1(sinal basal). A seguir, 20 ul de SDF- 1 são injetados e o registro dos dados ocorreu durante um período de tempo de 2 min. Cada condição experimental é realizada em duplicata. Os valores para cada poço são pri- meiro corrigidos pela subtração da fluorescência basal e da fluorescência emitida por um poço de controle sem células. Os dados relativos são ex- —pressos como uma porcentagem da estimulação máxima obtida por SDF- 1 (100 nM).

%O SDF-1 (100 nM) induziu uma liberação rápida e forte de cál- cio intracelular em CHO/CXCRA4 recombinante, enquanto nenhum sinal de - fluorescência foi detectado em células CHO-K1 naíve. A intensidade máxima atingiu > 160 % sobre a fluorescência basal e foi observada cerca de 30 se- gundos após a estimulação por SDF-1; curvas cinéticas similares foram ob- servadas com MDA-MB-231 e U-937 (figuras 13 A, 13B, 13C), embora a in- tensidade de fluorescência máxima por SDF-1 (100 nM) tenha sido inferior (130 a 140 % acima do basal). O anticorpo 515H7 (133 nM) gerou uma inibi- ção fortee quase completa do sinal de cálcio induzido por SDF-1 (100 nM) em todas as três linhagens celulares investigadas.

Exemplo 14: Inibição pelo Mab anti-CXCR4 414H5 do cres- cimento tumoral de xenoenxerto de KARPAS 299 de célula T em ca- mundongos Nod/Scid.

O objetivo deste experimento foi avaliar a capacidade do Mab anti-CXCR4 414H5 em inibir o crescimento de xenoenxerto de KARPAS 299 em camundongos Nod/Scid.

Células KARPAS 299 da ECACC foram cultivadas de modo roti- neiro em meio RPMI, 1% de L-Glu e 10% de SFB (Sigma, St Louis MD, EUA). As células foram repicadas 48 horas antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento. Cinco milhões de células KARPAS 299 foram enxertadas em PBS a camundongos Nod/Scid com 7 semanas de idade (Charles River, França). Cinco dias após a implantação, os tumores eram mensuráveis (32 mmº<vô<49 mm?) e os animais foram di- vididos em grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável. Os camundongos foram tratados intraperitoneal. com uma dose de carrega- . 5 mentode2mg/camundongo de Mab 414H5. A seguir, os camundongos foram injetados duas vezes por semana a 1 mg/dose/camundongo de Mab 414H5.Um grupo com PBS foi introduzido como um grupo de controle neste experimento. O volume do tumor foi medi- do duas vezes por semana e calculado pela fórmula: 1/6 X comprimento X largura X altura. As análises estatísticas foram feitas em cada medida com o uso de um ensaio de Mann-Whitney. Neste experimento, nenhuma mortalidade foi observada durante o tratamento. Em comparação ao grupo com PBS, houve uma inibição signi- - ficativa do crescimento tumoral entre D7 e D33 (p < 0,002) para o Mab 414H51mg/dose e o volume tumoral médio após 5 semanas de tratamento i foi reduzido em 73% em relação ao PBS para o Mab 414H5 (figura 14).

Exemplo 15: Atividade do Mab anti-CXCR4 515H7 em mode- lo de sobrevivência de camundongos de U937. Células U937 da ATCC foram cultivadas em meio RPMI 1640, 10%de SFB, 1% de L-glutamina. As células foram repicadas dois dias antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento. Dez milhões de células U937 foram injetadas intraperitoneal. a camundon- gos Nod/Scid fêmeas. Dois dias após a implantação, os camundongos foram tratados subcutaneamente com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab 515H7/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mg de anticor- po/camundongo. Os camundongos de controle receberam injeções de PBS, uma vez que foi mostrado em estudos anteriores que nenhuma diferença foi observada na sobrevivência entre camundongos injetados com PBS e ca- mundongos administrados com um controle isotípico de IgG camundongo. A — sobrevivência dos camundongos foi monitorada todos os dias. Os resultados descritos na figura 15 mostraram que os camundongos tratados com o Mab 515H7 tiveram um aumento dramático e significativo na longevidade com

2. 81/93

A T/C% de cerca de 280 para o Mab 515H7 (figura 15). Exemplo 16: Inibição pelo Mab anti-CXCR4 515H7 do cres- . cimento tumoral de xenoenxerto de KARPAS 299 de célula T em ca- mundongos Nod/Scid.

O objetivo deste experimento foi avaliar a capacidade do Mab anti-CXCR4 515H7 em inibir o crescimento de xenoenxerto de KARPAS 299 em camundongos Nod/Scid.

Células KARPAS 299 da ECACC foram cultivadas de modo roti- neiro em meio RPMI, 1% de L-Glu e 10% de SFB (Sigma, St Louis MD, EUA). As células foram repicadas 48 horas antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento. Cinco milhões de células KARPAS 299 foram enxertadas em PBS a camundongos Nod/Scid com 7 semanas de idade (Charles River, França). Cinco dias após a implantação, . — ostumoreseram mensuráveis (32 mmº<V*<49 mm?) e os animais foram di- vididos em grupos de 6 camundongos com tamanho de tumor comparável. Ú Os camundongos foram tratados intraperitoneal. com uma dose de carrega- mento de 2 mg/camundongo de Mab 515H7. A seguir, os camundongos foram injetados duas vezes por se- mana a 1 mg/dose/camundongo de Mab 515H7. Um grupo com PBS foi in- troduzido como um grupo de controle neste experimento. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana e calculado pela fórmula: 1/6 X compri- mento X largura X altura. As análises estatísticas foram feitas em cada me- dida com o uso de um ensaio de Mann-Whitney. Nestes experimentos, ne- nhuma mortalidade foi observada durante o tratamento. Em comparação ao grupo com PBS, houve uma inibição signifi- cativa do crescimento tumoral entre D7 e D33 (p < 0,002) para o Mab 515H7 1 mg/dose e o volume tumoral médio após 5semanas de tratamento foi re- duzido em 63% para o Mab 515H7 em relação ao PBS (figura 16). Exemplo 17: Produção de Mabs quiméricos anti-CXCR4 c414H5eC515H7. ' Formatos quiméricos dos Mabs 414H5 e 515H7 murinos foram projetados: eles correspondem aos domínios variáveis de cadeia leve e ca-

. 82/93 x deia pesada dos anticorpos murinos de interesse, fundidos geneticamente aos domínios constantes humanos Ckappa e IgG1. Todos os Mabs recombi- nantes foram produzidos por transfecção temporária com o uso do sistema HEK293/EBNA com um vetor de expressão pCEP4 (Invitrogen, EUA). As sequências de nucleotídeo completas correspondentes aos domínios variá- veis das cadeias pesada e leve dos Mabs 414H5 e 515H7 foram sintetizadas por síntese de gene global (Genecust, Luxemburgo). Elas foram subclona- das em um vetor pCEP4 (Invitrogen, EUA) transportando a sequência de codificação inteira da domínio constante da cadeia leve [Ckappa] ou pesada [CH1-dobradiça-CFB-CFB] de uma imunoglobulina IgG1 humana.

Todas a etapas de clonagem foram feitas de acordo com técnicas de biologia mole- cular convencionais conforme descrito na referência Laboratory Manual (Sambrook e Russel, 2001) ou de acordo com as instruções do fabricante. - Cada construto genético foi completamente validado por sequenciamento de —nucleotídeo com o uso do kit de sequenciamento Big Dye Terminator Cycle Ú (Applied Biosystems, EUA) e analisado com o uso de um analisador genéti-

co 3100 (Applied Biosystems, US). As células HEK293 EBNA adaptadas em suspensão (Invitrogen, US) foram cultivadas de forma rotineira em frascos de 250 ml em 50 ml de meio isento de soro Excel! 293 (SAFC Biosciences) suplementado com 6 mM de glutamina em um agitador orbital (velocidade de rotação a 110 rpm). A transfecção temporária foi feita com 2.106 células/ml com o uso de polieti- lenoimina (PEI) de 25 kDa linear (Polysciences) preparada em água a uma concentração final de 1 mg/ml misturada e DNA plasmidial (concentração finalde 1,25 pg/ml para uma razão de plasmídio de cadeia pesada para ca- deia leve de 1 :1). 4 horas após a transfecção, a cultura foi diluída com um volume de meio de cultura fresco para atingir uma densidade celular final de 106 células/ml.

O processo de cultivo foi monitorado com base na viabilidade celular a produção de Mab.

Tipicamente, as culturas foram mantidas por 4 a S5dias.

Os Mabs foram purificados com o uso de uma abordagem de croma- tografia convencional sobre uma resina de proteína A (GE Healthcare, EUA). Todos os Mabs diferentes foram produzidos em teores adequados para ava-

. 83/93 db : liações funcionais. Os níveis de produtividade variam tipicamente entre 6 e 15 mg/L de Mabs purificados. Exemplo 18: Caracterização por análise de FACS da especi- ficidade de ligação dos Mabs anti-CXCR4 quiméricos c414H5 e c515H7 ereconhecimento de linhagem de células de câncer.

Neste experimento, a ligação específica dos Mabs quiméricos anti-CXCR4 c414H5 e c515H7 a CXCRA4 humano foi examinada por análise de FACS.

NIH3T3, células transfectadas NIH3T3-hCXCRA4 e a linhagem de células de câncer MDA-MB-231 foram incubadas com 10 ug/mL de anticorpo monocilonal c414H5 e c515H7. As células foram então lavadas com 1% de BSA/PBS/ 0,01% de NaN3. A seguir, anticorpos secundários marcados com Alexa foram adicionados às células e que foram deixadas em incubação a o 4ºC durante 20 min. As células foram então lavadas novamente duas vezes. Após a segunda lavagem, a análise de FACS foi feita. Os resultados destes ' estudos de ligação são fornecidos na Tabela 5 a seguir, que mostra [média de intensidade de fluorescência (MFI) obtida por FACS] que os Mabs quimé- ricos anti-CXCR4 c414H5 e c515H7 se ligaram especificamente à linhagem celular transfectada CXCR4 humano-NIH3T3 e também reconheceu linha- gens de células de câncer humanas, por exemplo, células de câncer de mama MDA-MB- 231.

Tabela 5 Exemplo 19: Ligação por competição dos Mabs anti-CXCR4 murinos m414H5 e m515H7 e Mabs quiméricos c414H5 e c515H7 por [*IISDF-1 em membranas de CHO-K1 expressando de maneira estável o receptor CXCR4 humano Este ensaio permite avaliar a capacidade dos Mabs m414H5, mMS515H7 e Mabs quiméricos c414H5, c515H7 competirem pela ligação de

- 84/93 x [*IISDF-1 radiomarcado ao receptor CXCR4 humano, nos sítios de ligação ortostéricos ou alostéricos . As células CHO-K1, expressando de maneira estável e constitutiva o receptor CXCR4 humano foram obtidas mediante transfecção de células CHO-K1 naive (ATCC CCL-61) com um vetor de ex- pressão de mamífero transportando a sequência de codificação inteira do receptor CXCR4 humano (RefSeq NM 003467). As células foram propaga- das em meio de cultura completo [DMEM-Ham F12 suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e 500 ug/ml de geneticinal.

Os experimentos de ligação do radioligante foram conduzidos em membranas celulares obtidas mediante raspagem mecânica de células CHO/CXCR4 em tampão de lise [Hepes 20mM, pH 7,4, NaCl 150mM] seguido de centrifugação (10.000 g, 15 min). A ligação de [”*PIISDF- 1 (atividade específica: 1500 Civmmol) foi reali- zada com o uso da tecnologia de SPA (ensaio de cintilação por proximidade 200 GE Healthcare). Resumidamente, as membranas celulares (30 upg/poço) foram incubadas em tampão de ligação [Hepes 20 mM, pH 7,4, CaCI2 1 mM, Ú MgCl2 5 mM, NaCl 150 mM, BSA 1%] junto com o composto a ser avaliado (SDF-1 ou mAb), radioligante (1 nM) e finalmente, microesferas de SPA- WGA-PVT (7,3 mg/poço). O equilíbrio da ligação foi atingido após 1 hora a 25ºC.

Após centrifugação [1000 g durante 10 minutos], as contagens radioa- tivasforam medidas em um contador de cintilação (TopCount, Perkin Elmer). A ligação inespecífica (NS) foi estimada na presença de 10 uM de SDF-1 não-marcado.

Os Mabs anti-CXCR4 (100 nM) competiram de forma eficiente pela ligação de [*IISDF-1 com a seguinte ordem de classificação de eficá- ciade competição (% de inibição de [*IISDF-1): m515H7 (62 + 10%), C515H7 (55 + 4%), m414H5 (30 + 5%) e c414H5 (21 + 10 %) (figura 17). Exemplo 20: Modulação da ligação de [**SJGTPyS nas mem- branas celulares expressando o receptor CXCR4 selvagem pelos Mabs murinos anti-CXCR4 m414H5 e m515H7 e Mabs quiméricos c414H5 e cs15H7 Este ensaio funcional permite monitorar a ativação da proteína G através do receptor CXCR4 humano selvagem e sua modulação pelos Mabs

- 85/93 murinos anti-CXCR4 m414H5, m515H7 e Mabs quiméricos c414H5, c515H7. As células NIH-3T3 expressando de maneira estável e constituti- va o receptor CXCR4 selvagem foram obtidas conforme descrito no exemplo acima para células CHO-K1. As células HeLa (carcinoma de colo de útero — humano) foram propagadas em meio de cultura completo [EMEM suplemen- tado com 10% de SFB, 1% de L-glutamina, 2 uM de bicarbonato de sódio]. À ligação de [S]JGTPyS foi feita sobre membranas celulares obtidas mediante raspagem mecânica de em tampão de lise [Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM] e centrifugação adicional (10000 g, 15 min). A incorporação e detecção de [PSIGTPyS (atividade específica: 1000 Ci/mmol) foi feita com o uso da tecnologia de SPA (ensaio de cintilação por proximidade - GE Healthcare). Resumidamente, as membranas celulares (10 pg/poço) foram incubadas em tampão de ligação [Hepes 20 mM, GDP 3uM, MgCI2 10 mM, NaCi 100 mM, o EDTA 1 mM, pH = 7,4] junto com o composto a ser avaliado (SDF-1 e Mab deinteresse), ”SIGTPyS (0,4 nM) e finalmente, microesferas de SPA-WGA- ] PVT (7,3 mg/poço). A reação de ligação foi realizada durante 1 hora a 25ºC. Após centrifugação [1000 g durante 10 minutos], as contagens radioativas foram medidas em um contador de cintilação (TopCount, Perkin Elmer). As IC50 foram calculadas para cada Mab.

Sob estas condições experimentais, a ICS0 dos Mabs m414H5, c414H5, m515H7 e C515H7, como determinado nas células NIH3T3/CXCR4 foi de 1,6 nM, 1,4 nM, 1,9 nM e 1,5 nM, respectivamente (figura 18). A IC50 dos Mabs m414H5, c414H5, m515H7 e c515H7 determinada com o uso de células Hela nas mesmas condições experimentais foram 0,5 nM, 0,3 nM, 02nMe06nM, respectivamente (figura 19).

Exemplo 21: Associação de CXCRA com diferentes parcei- ros de interação: homo e heterodimerização, recrutamento de B- arrestina através de uma uma abordagem de transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) e efeito dos Mabs muri- nos m414H5, m515H7 e Mabs quiméricos c414H5 e c515H7 sobre estes dímeros , Este ensaio funcional permite avaliar as alterações conformacio-

- 86/93 nais induzidas mediante a ligação de SDF-1 e/ou Mabs murinos m414H5, m515H7 e Mabs quiméricos c414H5, e c515H7 ao receptor CXCRA4 com re- lação à formação de homodímero de CXCR4 e heterodímero de CXCR2/CXCR4 assim como o recrutamento da proteína de sinalização de B- arrestina-2.

Vetores de expressão para cada um dos parceiros de interação ' investigados foram construídos como proteínas de fusão com o corante cor- respondente (luciferase de Renilta reniformis, Rluc e proteína amarela fluo- rescente, YFP) pela aplicação de técnicas de biologia molecular convencio- nais. Dois dias antes da realização dos experimentos de BRET, as células HEK293 foram transitoriamente transfectadas com vetores de expressão codificando os parceiros de BRET correspondentes: [CXCR4/Rluc + CXCR4 NFP] para estudar homo dimerização de CXCRA, [CXCR4- Rluc + CXCR2- o YFP] para estudar a heterodimerização de CXCR4 e CXCR2 e [CXCR4-Rluc + B-arr2-YFP] para estudar o recrutamento mediado por CXCR4 de B- Ú arrestina-2. No dia seguinte, as células foram distribuídas em placas brancas de 96 MW pré-revestidas de polilisina em meio de cultura completo [DMEM suplementado com 10 % de SFB]. As células foram primeiro cultivadas a 37ºC com 5 % de CO2 de modo a permitir a adesão das células à placa. As — célulasforam então privadas de alimento com 200 ul de DMEM/poço de um dia para o outro. Imediatamente antes do experimento de BRET, o DMEM foi removido e as células foram lavadas rapidamente com PBS. As células fo- ram então incubadas em PBS na presença ou ausência de anticorpo, 15 min a 37ºC antes da adição de coelenterazina H 5 uM com ou sem SDF-1 100 nMem um volume final de 50 ul. Após incubação por 5 minutos a 37ºC e incubação adicional à temperatura ambiente durante 20 minutos apenas pa- ra homo e heterodímeros, a captura de emissão de luz a 485 nm e 530 nm foi iniciada com o uso do leitor multimarcador Mithras LB940 (Berthold) (1 seg./comprimento de onda/poço repetida 15 vezes à temperatura ambiente).

O cálculo da razão de BRET foi feito conforme anteriormente descrito (An- gers et al., 2000): [((emissão 530 nm) - (emissão 485 nm) X Cf] / (emissão 485 nm), onde Cf = (emissão 530 nm) / (emissão 485 nm) para células que

- 87/93 expressam a proteína de fusão Rluc sozinha sob as mesmas condições ex- perimentais.

A simplificação desta equação mostra que a razão de BRET corresponde à razão de 530/485 nm obtida quando os dois parceiros de BRET estão presentes, corrigida pela razão de 530/485 nm obtida sob as — mesmas condições experimentais, quando apenas o parceiro fundido a Rluc está presente no ensaio.

Com propósito de legibilidade, os resultados são expressos em unidades de milliBRET (mMBU); mBU corresponde à razão de BRET multiplicada por 1000. O SDF-1 (100 nM) aumentou em cerca de 10% o sinal de BRET resultante da proximidade espacial das proteínas adaptado- rase aceptoras fundidas ao receptor CXCRA, indicando provavelmente a formação de homodímeros de CXCR4/CXCRA4 ou alterações conformacio- nais de dímeros pré-existentes (figura 20A). De forma interessante, o SDF-1 (100 nM) reduziu em cerca de 17 % o sinal de BRET resultante da proximi- - — dade espacial das proteínas adaptadoras e aceptoras fundidas a CXCR2 e CXCRA4, também indicando provavelmente a formação de heterodímeros de Ú CXCR2/CXCRA4 ou alterações conformacionais de dímeros pré-existentes (figura 20B). Neste último caso, a conformação ativada por SDF-1 de CXCR4/CXCR2 parece menos favorável para a transferência de energia de BRET.

Em ambos os casos, os Mabs m414H5, c414H5 e m515H7, c515H7 foram capazes de modular as alterações conformacionais induzidas por SDF-1 para homodímeros de CXCRA4 (75 % de inibição do aumento de BRET induzido por SDF-1 para c414H5 e 96% de inibição do aumento de BRET induzido por SDF-1 para c515H7, figura 20A) assim como para a for- mação de heterodímero de CXCR2/CXCR4 (77% de inibição da redução de BRET induzida por SDF-1 para c414H5 e 98% de inibição da redução de BRET induzida por SDF-1 para C515H7, figura 20B). Os Mabs m414H5, c414H5, m515H7 e c515H7 também foram capazes de modular a proximi- dade espacial de CXCR4/CXCR4 e CXCR2/CXCRA, respectivamente, indi- cando uma influência destes Mabs sobre a conformação de homodímeros de

CXCR4/CXCR4 e heterodímeros de CXCR2/CXCRA (figuras 20A e 20B). A ativação de CXCR4 por SDF-1 (100 nM) gerou um forte recru- tamento da molécula de sinalização intracelular B-arrestina, conforme mos-

- 88/93 trado pela intensificação de 400% no sinal de BRET (figura 20C). Este recru- tamento foi parcialmente inibido pelos Mabs c414H5 e C515H7 (inibição de cerca de 63% para c414H5 e 93% para c515H7, figura 20C) mostrando o efeito dos Mabs sobre a sinalização. : Exemplo 22: Mobilização mediada pelo receptor CXCR4 dos estoques intracelulares de cálcio Este ensaio funcional foi projetado para monitorar a sinalização do receptor CXCRA4 através da estimulação da via da fosfolipase C, induzin- do a liberação de cálcio a partir dos estoques intracelulares do retículo en- doplásmico.

As células CHO-K1 expressando de maneira estável e constituti- va o receptor CXCRA4 selvagem foram obtidas conforme descrito no exemplo acima. As células U937 (linfoma humano) foram propagadas em meio de o cultura completo, respectivamente [DMEM suplementado com 10% de SFB]

15. e[RPMI 1640 suplementado com 10% SFB, 20 mM HEPES, 1% de solução i de aminoácidos não essenciais, 1% de piruvato de sódio, 1% de L- glutamina, 4,5 g/L de glicose]. Todos os tipos celulares foram plaqueados em placas de 98MW pretas a uma densidade de 100.000 células/poço em meio de cultura adequado. As células foram privadas de alimento de um dia parao outro antes de conduzir os experimentos. As células são carregadas com corante de cálcio fluorescente (Fluo-4 No Wash, Invitrogen US) em tampão de carregamento [HBSS 1x, HEPES 20 mM, ácido de probenicide 25 mM] durante 30 min. a 37ºC seguido de 30 min. a 25ºC. A estimulação por SDF-1 foi feita por injeção direta em cada poço. Para os experimentos de antagonismo, 10 ul de solução de Mab são adicionadas diretamente no tam- pão de carregamento pelo menos 10 min. antes do SDF-1. As medições ci- néticas da fluorescência são realizadas em um leitor de microplacas por fluo- rescência multimodo Mithras LB940 (Berthold) com o uso dos seguintes a- justes: excitação a 485 nm, emissão a 535 nm, energia de excitação a 10000 unidades arbitrárias. A fluorescência em cada poço é registrada durante 0,1 segundo por segundo e durante um período de tempo de 20 segundos antes da injeção de SDF-1 (sinal basal). A seguir, 20 ul de SDF- 1 são injetados e

. 89/93 o registro dos dados ocorreu durante um período de tempo de 2 min. Cada condição experimental é realizada em duplicata. Os valores para cada poço são primeiro corrigidos pela subtração da fluorescência basal e da fluores- cência emitida por um poço de controle sem células. Os dados relativos são expressos como uma porcentagem da estimulação máxima obtida por SDF- 1(100 nM). e O SDF-1 (100 nM) induziu uma liberação rápida e forte de cálcio intracelular em CHO/CXCR4 recombinante, enquanto nenhum sinal de fluo- rescência foi detectado em células CHO-K1 naive. A intensidade máxima atingiu > 140% sobre a fluorescência basal e foi observada cerca de 40 se- gundos após a estimulação por SDF-1; curvas cinéticas similares foram ob- servadas com células U-937 (figuras 21 A, 21B). O anticorpo quimérico c515H7 (133 nM) gerou uma inibição forte e quase completa do sinal de cál- -— — cioinduzido por SDF-1 (100 nM) em todas as três linhagens celulares inves- tigadas.

Exemplo 23: Efeito dos Mabs anti-CXCR4 murinos m414H5, m515H7 e Mabs quiméricos c414H5, c515H7 sobre à migração de célu- las U937 induzida por SDF-1 Para avaliar o efeito inibidor dos anticorpos monoclionais anti- CXCR4 m414H5, m515H7, c414H5 e c515H7 sobre o processo de migra- ção, 100000 células U-937 em meio RPMI 1640 suplementado com 2% de SFB, foram plaqueadas na câmara superior de câmaras de migração (placas de 24 poços com tamanho dos poros de 8 um) na presença ou na ausência de SDF- 1 na parte inferior dos poços e com ou sem os Mabs c414H5, m414H5, c515H7 e m515H7 na câmara superior. Neste ensaio, IgG2a e IgG2b murinas foram introduzidas como controles de isotipo. Duas horas após o plaqueamento, as células em migração foram contadas. Os resulta- dos apresentados nas figuras 22A (para c414H5 versus m414H5) e 22B (pa- ra c515H7 versus m515H7) demonstraram que, conforme esperado, o SDF- 1 /foicapazde induzir um aumento significativo da migração das células U-

937. Nenhum efeito foi observado quando as células foram incubadas com o controle isotípico de IgG2 . Em contrapartida, para as células incubadas com

: 90/93 ' os Mabs c414H5, m414H5, c515H7 e m515H7 uma redução significativa e reproduzível na migração de células U937 induzida por SDF-1 foi observada: 50% com os Mabs c414H5 e m414H5 e mais de 80% com os Mabs c515H7 e m515H7.

Exemplo 24: Atividade dos Mabs anti-CXCR4 quiméricos c414H5 e c515H7 em em modelo de sobrevivência de camundongos de Us37 Células U937 da ATCC foram cultivadas em meio RPMI 1640, 10% de SFB, 1% de L-glutamina. As células foram repicadas dois dias antes da enxertia para que elas estivessem na fase exponencial do crescimento.

Dez milhões de células U937 foram injetadas intraperitoneal. a camundon- gos Nod/Scid fêmeas. Dois dias após a implantação, os camundongos foram tratados subcutaneamente com uma dose de carregamento de 2 mg de Mab — — c414H5 ou c515H7/camundongo e, então, duas vezes por semana com 1 mgde anticorpo/camundongo. Os camundongos de controle receberam inje- ' ções de PBS, uma vez que foi mostrado em estudos anteriores que nenhu- ma diferença foi observada na sobrevivência entre camundongos injetados com PBS e camundongos administrados com um controle isotípico de IgG camundongo. A sobrevivência dos camundongos foi monitorada todos os dias. Os resultados descritos na figura 23 mostraram que os camundongos tratados com os Mabs c414H5 e c515H7 tiveram um aumento dramático e significativo na longevidade com T/C% de cerca de 210 e 180 para c414H5 e c515H7, respectivamente.

? 7 TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL [ DESTINATÁRIO: PIERRE FABRE MEDICAMENT 4 msmuTERecimC EPE RATE o ga MOO NO CASO DEDEPÓSTO. — CENTRE DIMNUNOLOGIE PIERRE EABRE ela AUTORIDADE | NTERNACIONAL DE 5, AVENUENAPOLEON 1 -- BP 60497 , DEPÓSITO identificada abaixo 74164 SAINT-JULIEN-EM-GENEVOIS LL. NOME E ENDEREÇO DO DEPOSITANTE |. IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação fornecida pelo Número de acesso fornecido pela DEPOSITANTE: AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO: F50067-006 (5B) 515H7 cl 1 À CNCM 1-4019 - —|[N DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA - O micro-organismo identificado acima (1) foi acompanhado por : (x) uma descrição científica 7 (x) designação taxonômica proposta (marca com um X quando aplicável) IN. RECIBO E ACEITAÇÃO A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o micro-organismo identificado acima (1), o qual foi recebido em 25-06-2008 (data do depósito original) IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO O micro-organismo identificado acima (1) foi recebido pela presente Autoridade In- ternacional de Depósito em — (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em(data do recibo do requerimento para conver- são V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: COLLECTION NATIONALE DE Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder CULTURES DE de representação da Autoridade Internacio- MICROORGANISMES (CNCM) nal de Depósito ou de oficial(is) responsá- Endereço: INSTITUT PASTEUR vel(is) :Georges Wagener 25 RUE DU DOCTEUR

ROUX 75724 PARIS CEDEX 15 Data: Paris, 08 setembro 2008 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido. — Formulário BP/4 (página única)

e. TRATADO DE BUDAPESTE . SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA

FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL Destinatário

MME NATHALIE CORVAIA DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE ET Emitido por força da regra 10.2 pela

MME LILIANE GOETSCH AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO INSTITUT DE RECHERCHE PIERRE FABRE identificada abaixo CENTRE D'IMMUNOLOGIE PIERRE FABRE 5, AVENUE NAPOLEON ll! — BP 60497 74164 SAINT-JULIEN-EM-GENEVOIS

NOME E ENDEREÇO DO DEPOSITANTE

1. DEPOSITANTE Il. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: PIERRE FABRE MEDICAMENT - ' INSTITUT DE RECHERCHE PIERRE FABRE Número de acesso fornecido pela CENTRE D'IMIMIUNOLOGIE PIERRE FABRE AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO CNCM 1|-4019 - ; io Endereço: 5, AVENUE NAPOLEON HlI-- BP 60497 Data do depósito ou da transferência”: 25-junho-2008 74164 SAINT-JULIEN-EM-GENEVOIS UI, DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE A Viabilidade do micro-organismo identificado acima (II) foi testado em 19-06-2006 ?.

Nessa data, o referido micro-organismo foi (X)º viável º inviável * Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência).

? “Noscasos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (ili), referem-se ao teste de viabilidade mais recente. ? MarcarcomumXo campo aplicável

IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TESTE DE VIABILIDADE FOI CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE |Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da autoridade Internacional MICROORGANISMES (CNCM) de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)

GEORGES WAGENER Endereço: INSTITUT PASTEUR RUE DU DOCTEUR ROUX Data: Paris, 08 setembro 2008 75724 PARIS CEDEX 15 - * Preenchersea informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos

Claims (1)

1. Í REIVINDICAÇÕES : 1. Processo para a seleção de um anticorpo anti-CXCR4, ou um de seus fragmentos funcionais ou derivados, capaz de inibir a ativação de CXCRA, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: ) triar os anticorpos gerados e selecionar os anticorpos capazes de ligar especificamente a CXCR4 e também modular a ativação de CXCRA4; 1) testar os anticorpos selecionados na etapa i) e selecionar os an- ticorpos capazes de induzir alteração conformacional dos homodímeros de CXCRA, e então ii) testar os anticorpos selecionados na etapa ii) e selecionar os an- ticorpos capazes de induzir alteração conformacional dos heterodímeros de CXCR4/CXCR2.

   2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que a etapa ii) consiste em avaliar os anticorpos por análise com BRET em células que expressam ambos CXCR4-RLuc/CXCRA4-YFP e sele- cionar anticorpos capazes de inibir pelo menos 40% do sinal do BRET, pre- ferencialmente 45%, 50%, 55% e, mais preferencialmente, 60% do sinal do BRET.

   3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lofatode que a etapa iii) consiste em avaliar os anticorpos por análise com BRET em células que expressam ambos CXCR4-RLuc/CXCR2-YFP e sele- cionar anticorpos capazes de inibir pelo menos 40% do sinal do BRET, pre- ferencialmente 45%, 50%, 55% e, mais preferencialmente, 60% do sinal do BRET.

   4. Anticorpo isolado, ou composto derivado ou fragmento funcio- nal do mesmo, caracterizado pelo fato de que é capaz de ser obtido por um processo como definido na reivindicação 1.

   5. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que consiste em um anticorpo monocilonal.

   6. Anticorpo isolado, ou composto derivado ou fragmento funcio- nal do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende 6 CDRs e pelo menos uma CDR é escolhida dentre as CDRs apresentando as sequencias . compreendendo pelo menos a SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49.

   7. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de inibir a ativação de CXCRA4.

   8. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de inibir pelo menos uma das seguintes atividades: - ligar-se especificamente às membranas celulares do ligante SDF-1 no receptor CXCRA; - ligar-se especificamente às membranas celulares de GTP,S no receptor CXCRA4; - produção de CAMP mediada pela inibição de CXCR4; e - mobilização de depósitos intracelulares de cálcio mediada por CXCRA.

   9. Anticorpo ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de i) induzir mudança conformacional de homodímero CXCR4 e/ou induzir mudança conformacional de heterodímero conformacio- nal CXCR4/CXCR2.

   10. Anticorpo ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: - um anticorpo compreendendo uma cadeia leve compreenden- do a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 1, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 3; - um anticorpo compreendendo uma cadeia leve compreenden- do a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 9, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No 10eaCDR-L3da sequência SEQ ID No. 3; - um anticorpo compreendendo uma cadeia leve compreenden- do a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 40, a CDR-L2 da sequência SEQ ID

   No. 2 e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41; . - um anticorpo compreendendo uma cadeia leve compreenden- do a CDR-L1 da sequência SEQ ID No. 46, a CDR-L2 da sequência SEQ ID No. 47 e a CDR-L3 da sequência SEQ ID No. 41; Ss - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendo a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 4, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6; - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendo a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 7, a CDR-H2 da sequência SEQ IDNo.5eaCDR-H3da sequência SEQ ID No. 8; - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendo a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 11, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 12 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 6; - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendoa CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 42, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 43; - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendo a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 44, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 45; e - um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreen- dendo a CDR-H1 da sequência SEQ ID No. 48, a CDR-H2 da sequência SEQ ID No. 49 e a CDR-H3 da sequência SEQ ID No. 43.

   11. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ditoanticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: - um anticorpo compreendendo - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 1, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da sequencia SEQ ID No. 3; e - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- quencia SEQ ID No. 4, a CDR-H2 da SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequen- cia SEQ ID No. 6;

   ! - um anticorpo compreendendo : - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 1, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da sequencia SEQ ID No. 3; e - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- quencia SEQ ID No. 7, a CDR-H2 da SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da sequen- cia SEQ ID No. 8; - um anticorpo compreendendo - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 9, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 10 e a CDR-L3 da sequencia SEQ ID No. 3; e - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- quencia SEQ ID No. 11, a CDR- H2 da SEQ ID No. 12 e a CDR-H3 da se- quencia SEQ ID No. 6; - um anticorpo compreendendo - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 40, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 da sequencia SEQ ID No. 41; e - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- quencia SEQ ID No. 42, a CDR- H2 da SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da se- quencia SEQ ID No. 43; - um anticorpo compreendendo - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 40, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 2 e a CDR-L3 dasequencia SEQ ID No. 41;e - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- quencia SEQ ID No. 44, a CDR- H2 da SEQ ID No. 5 e a CDR-H3 da se- quencia SEQ ID No. 45; - um anticorpo compreendendo - uma cadeia leve compreendendo a CDR-L1 da se- quencia SEQ ID No. 46, a CDR-L2 da sequencia SEQ ID No. 47 e a CDR-L3 da sequencia SEQ ID No. 41; e

   É - uma cadeia pesada compreendendo a CDR-H1 da se- . quencia SEQ ID No. 48, a CDR- H2 da SEQ ID No. 49 e a CDR-H3 da se- quencia SEQ ID No. 43.

   12. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: - um anticorpo compreendendo: - uma sequencia de cadeia leve compreendendo a se- quencia de aminoácidos SEQ ID No. 13, e - uma sequencia de cadeia pesada compreendendo a sequencia de aminoácidos SEQ ID No. 14; - um anticorpo compreendendo: - uma sequencia de cadeia leve compreendendo a se- quencia de aminoácidos SEQ ID No. 50, e - uma sequencia de cadeia pesada compreendendo a sequencia de aminoácidos SEQ ID No. 51.

   13. Anticorpo secretado por hibridomas de murino, caracterizado pelo fato de que é um hibridoma depositado no CNCM, Instituto Pasteur, Paris, em 22 de outubro de 2007, sob o número 1-3860 ou um hibridoma de- —positado no CNCM, Instituto Pasteur, Paris, em 25 de junho de 2008, sob o número 1-4019.

   14. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico.

   15. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: - um anticorpo compreendendo: - uma sequencia de cadeia leve compreendendo a se- — quenciade aminoácidos SEQ ID No. 64, e - uma sequencia de cadeia pesada compreendendo a sequencia de aminoácidos SEQ ID No. 65;

   : - um anticorpo compreendendo: : - uma sequencia de cadeia leve compreendendo a se- quencia de aminoácidos SEQ ID No. 66, e - uma sequencia de cadeia pesada compreendendo a sequenciade aminoácidos SEQ ID No. 67.

   16. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que é se- lecionado dentre os seguintes ácidos nucleicos: (a) ácido nucleico, DNA ou RNA, codificando para um anticorpo, ou para um composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como de- finido em qualquer uma ou mais das reivindicações 4 a 15; (b) ácido nucleico complementar a um ácido nucleico como defi- nido em (a); (c) ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capaz de hi- bridizar sob condições altamente severas com pelo menos um dos CDRs das sequencias de ácido nucleico SEQ ID Nos. 15 a 26 ou SEQ ID Nos. 52 a 61,e (d) ácido nucleico de pelo menos 18 nucleotídeos capaz de hi- bridizar sob condições altamente severas com pelo menos a cadeia leve da sequencia de ácido nucleico SEQ ID No. 27 ou SEQ ID No. 62 ou SEQ ID No 68 ou7oO e/ou a cadeia pesada da sequencia de ácido nucleico SEQ ID No. 28 ou SEQ ID No. 63 ou SEQ ID No. 69 ou 71.

   17. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 16.

   18. Célula hospedeira de bactéria ou levedura, caracterizada pe- lofatode que compreende um vetor como definido na reivindicação 17.

   19. Método para produção de anticorpo, ou um composto deri- vado ou fragmento funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as seguintes etapas: - cultivar em um meio e nas condições de cultura adequadas para uma célula hospedeira como definida na reivindicação 18; e - recuperar o dito anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais,

   Ô assim produzido a partir do meio de cultura ou a partir das ditas células culti- : vadas.

   20. Anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracte- rizado pelo fato de que é para uso como um fármaco.

   21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende como um ingrediente ativo um composto que consiste em um anticorpo, ou composto derivado ou fragmento funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 15 e 20.

   22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- da pelo fato de que compreende, adicionalmente, como um produto de com- binação, um anticorpo anti-tumoral diferente de anticorpo direcionado contra CXCRA, o dito anticorpo sendo preferencialmente selecionado dentre os an- ticorpos contra EDFR, IGF-IR, HER2/neu, cMET, VEGFR, VEGF, CD20, tal como rituximab, ibritumomab ou tositumomab; CD33, tal como gemtuzumab ou limtuzumab; CD22, tal como epratuzumab; CD52, tal como alemtuzumab; EpCAM, tal como edrecolomab, Ch 17-1A ou IGN-101; CTP21 ou CTP16, tal como Xactin; DNA-AG, tal como "*I-Cotara TNT-1; MUC1, tal como pemtu- momab ou R1150; MUC18, tal como ABX-MA1; GD3, tal como mitumomab; CEA, talcomo CeaVac ou labetuzumab; CA125, tal como OvaRex; HLA-DR, tal como apolizumab; CTLAA, tal como MDX-010; PSMA, tal como MDX-070, Mn & *Y-J591, Lu J591, J5S91-DM1; Lewis Y, tal como IGN311; angio- genese, tal como AS1405 e 90YmuBC1; Trail-R1, tal como TRAIL RImAb ou TRAIL R2mAb.

   23. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- da pelo fato de que compreende, adicionalmente, como um produto de com- binação ou de conjugação, um agente citotóxico/ citostático, uma toxina ce- lular e/ou um radioisótopo.

   24. Composição de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- da pelofatode que é para uso como um fármaco.

   25. Uso de um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmen- to funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4

   ' a 15 e 20, e/ou de uma composição como definida em qualquer uma das . reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para a modulação da atividade de CXCR4 em uma célula.

   26. Uso de um anticorpo, ou um composto derivado ou fragmen- —tofuncional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 15 e 20, e/ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.

   27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fa- tode que o referido câncer é um câncer selecionado dentre câncer de prós- tata, osteosarcoma, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer endometri- al, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer pancreático e câncer de cólon.

   28. Hibridoma de murino, caracterizado pelo fato de que o referi- do hibridoma é um hibridoma depositado na CNCM, Instituto Pasteur, Paris, em22 de outubro de 2007, sob número |-3860 ou um hibridoma depositado na CNCM, Instituto Pasteur, Paris, em 25 de junho de 2008, sob o número |-

   4019.