BRPI0921983B1 - moduladores tgr5, usos dos mesmos e kit - Google Patents

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BRPI0921983B1 BRPI0921983-8A BRPI0921983A BRPI0921983B1 BR PI0921983 B1 BRPI0921983 B1 BR PI0921983B1 BR PI0921983 A BRPI0921983 A BR PI0921983A BR PI0921983 B1 BRPI0921983 B1 BR PI0921983B1
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methyl
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Roberto Pelicciari
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Abstract

Patente de Invenção “MODULADORES TGR5, USOS DOS MESMOS E KIT” A presente invenção se refere a compostos de Fórmula A: HO R 4 R 2 R 5 R 6 R 1 R 7 R 10 R 8 R 9 (A) ou um sal, solvato, hidrato, pró-fármaco dos mesmos. Os compostos de Fórmula A são moduladores TGR5 úteis para o tratamento de várias doenças, que incluem doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças hepáticas, doenças auto-imunes, doenças cardíacas, doenças renais, cânceres, e doenças gastrointestinais.

Description

PEDIDO RELACIONADO
[001] O presente pedido reivindica a prioridade ao Pedido Europeu No. 08169462.2, depositado em 19 de novembro de 2008, estando seus conteúdos aqui incorporados.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção se refere a compostos que modulam TGR5 e composições úteis em métodos destinados ao tratamento e/ou à prevenção de várias doenças.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] O receptor TGR5 é um receptor acoplado à proteína G que foi identificado como um receptor de superfície celular responsável pelos ácidos biliáticos (BAs). Descobriu-se que a estrutura primária de TGR5 e sua responsividade pelos ácidos biliáticos são altamente conservados em TGR5 entre seres humanos, bovinos, coelhos, ratos, e camundongos, e, portanto, sugere que o TGR5 tenha funções fisiológicas importantes. Descobriu-se que o TGR5 é amplamente distribuído não apenas em tecidos linfóides, mas também em outros tecidos. Detectaram-se altos níveis de TGR5 mRNA na placenta, baço, e monócitos/macrófagos. Descobriu-se que os ácidos biliáticos induzem a internalização da proteína de fusão TGR5 a partir da membrana celular até o citoplasma. Kawamata et al. 2003, J. Bio. Chem., 278, 9435. Descobriu-se que o TGR5 é idêntico ao hGPCR19 reportado por Takeda et al. 2002, FEBS Lett. 520, 97-101.
[004] O TGR5 é associado ao acúmulo intracelular de cAMP, que é amplamente expresso em diversos tipos de células. Embora a ativação deste receptor de membrana em macrófagos diminua a produção de citocina pró-inflamatória, (Kawamata, Y., et al. J. Biol. Chem. 2003, 278, 9435-9440) o estímulo de TGR5 por BAs em adipócitos e miócitos aumenta o gasto de energia (Watanabe, M.et al. Nature. 2006, 439, 484-489). Este último efeito envolve a indução dependente de cAMP de iodotironina deiodinase tipo 2 (D2), que, convertendo-se localmente T4 em T3, produz uma atividade hormonal tireóide aumentada. De acordo com o papel de TGR5 no controle do metabolismo energético, os camundongos nocaute TGR5 fêmeas mostram um acúmulo significativo de gordura com ganho de peso corporal quando submetido a uma dieta hiperlipídica, indicando que a falta de TGR5 reduz o gasto de energia e obtém a obesidade (Maruyama, T., et al. J. Endocrinol. 2006, 191, 197-205). Além disso, e de acordo com o envolvimento de TGR5 em homeóstase de energia, relatou-se, também, que a ativação de ácido biliático do receptor de membrana promove a produção de peptídeo 1 semelhante ao glucágon (GLP-1) em linhagens celulares enteroendócrinas em murinos (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386-390). Com base em todas as observações anteriores, o TGR5 é um alvo atrativo para o tratamento de doenças, por exemplo, obesidade, diabetes e síndrome metabólica.
[005] Além do uso de agonistas de TGR5 para o tratamento e prevenção de doenças metabólicas, os compostos que modulam os moduladores TGR5 também são úteis para o tratamento de outras doenças, por exemplo, doenças nervosas centrais assim como doenças inflamatórias (WO 01/77325 e WO 02/84286). Os moduladores de TGR5 também proporcionam métodos de regular a homeóstase de ácido biliático e colesterol, absorção de ácido graxo, e digestão de proteínas e carboidratos.
[006] Descreveram-se na literatura relativamente poucos exemplos de agonistas TGR5. Recentemente, os derivados de 23-alquil substituído e 6,23-alquil distribuído de ácido quenodeoxicólico (CDCA), tal como o composto de ácido 6a-etil-23(S)-metil-quenodeoxicólico mostrado abaixo, foram reportados como agonistas potentes e seletivos de TGR5 (Pellicciari, R.; et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 42654268).
Figure img0001
[007] Em particular, a metilação (configuração S) na posição C23 de ácidos biliáticos naturais (BAs) confere uma seletividade marcada ao TGR5 em relação à ativação de FXR (receptor farnesóide X), enquanto a substituição de 6α-alquil aumenta a potência em ambos os receptores. Alguns exemplos de outros agonistas TGR5 incluem ácido 6-Metil-2-oxo-4-tiofen-2-il-1,2,3,4-tetraidro-pirimidina-5-carboxílico benzil éster (WO004067008, Takeda Chemical Industries LTD, Japão, 2004) e ácido oleanóico (Sato, H.et al. Biochem. e Biophys. Res. Commun. 2007, 362, 793-798; Ito, F. et al. W02004067008, 2004). Mais recentemente, a primeira síntese de ácido quenodeoxicólico enantiomérico (CDCA) e ácido litocólico (LCA) permitiu acesso aos estudos da especificidade da interação de BAs naturais com TGR5 (Katona, B. W. et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 6048-6058).
[008] Os agonistas TGR5 recentemente desenvolvidos também proporcionaram pela primeira vez uma diferenciação farmacológica de efeitos genômicos versus não-genômicos de BAs e também permitiram estudos informativos da relação entre estrutura e atividade, por exemplo, verificou-se que a presença de um bolso de ligação de acessório em TGR5 representa um papel central na determinação da seletividade de ligantes (Consulte, Pellicciari, et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268). Neste contexto, a disponibilidade de moduladores TGR5 mais potentes e seletivos é necessária para identificar os recursos adicionais que afetam a ativação do receptor e caracterizar as ações fisiológicas e farmacológicas deste receptor com a finalidade de compreender melhor sua relação à prevenção e tratamento de doenças.
[009] Neste sentido, as propriedades biológicas e físico-químicas do composto de ácido cólico (CA), tendo a estrutura mostrada abaixo, são particularmente interessantes:
Figure img0002
[0010] O ácido cólico é um ácido biliático primário em seres humanos e em muitas espécies animais, também reportado como um dos componentes principais junto à bilirrubina de Calculus Bovis, um medicamento Chinês tradicional altamente conceituado (Chen, X., Biochem. Pharmacol. 2002, 63, 533-541). O ácido cólico (CA) é diferente do ácido quenodeoxicólico (CDCA) e seus derivados descritos anteriormente pela presença em C-12 de um grupo alfa- hidroxila adicional orientado no lado polar da molécula. Esta diferença estrutural “mínima” é responsável pelos recursos físico-químicos e biológicos consideravelmente diferentes desses dois ácidos biliáticos. Em relação ao CDCA, o CA protonado é quatro vezes mais solúvel e relativamente menos detergente como resultado de seu equilíbrio hidrofóbico/hidrofílico e sua polaridade. Além disso, o CA é desprovido de atividade voltada ao receptor FXR (EC50 > 100 μM) enquanto apresenta uma atividade agonística moderada em TGR5 (EC50 = 13,6 μM). Como uma consideração ainda mais importante, reportou-se anteriormente que a administração farmacológica de CA em 0,5% p/p em camundongos obesos induzidos por dieta evita e trata, de modo eficiente, a síndrome metabólica (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386). Muito embora este estudo tenha proporcionado resultados interessantes relacionados às funções endócrinas de ácidos biliáticos, a alta dosagem necessária (0,5% p/p) ainda limita a prova de conceito referente à relevância terapêutica de TGR5 no contexto de doenças metabólicas, visto que a modulação de outros alvos e de alvos desconhecidos não pode ser rejeitada nesta dosagem. Uma questão adicional também consiste no risco associado ao teste de uma alta dose de CA em estudos clínicos devido à produção do metabólito secundário tóxico BA DCA através de 7α- desidroxilação bacteriana intestinal extensiva e eficiente (Nagengast, F. M., Eur. J. Cancer, 1995, 31A, 1067).
[0011] Portanto, há uma necessidade pelo desenvolvimento de moduladores TGR5 destinados ao tratamento e/ou à prevenção de várias doenças. A presente invenção identificou compostos que modulam o TGR5 assim como métodos de utilização desses compostos para tratar ou prevenir doenças.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção se refere a moduladores TGR5 e seu uso para tratar e/ou prevenir várias doenças. A invenção se refere a compostos de acordo com a fórmula A:
Figure img0003
(A) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos. Na fórmula A, as variáveis R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, e R10 podem ser selecionadas a partir dos respectivos grupos de porções químicas definidas mais adiante na descrição detalhada. A invenção inclui uma composição que compreende um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção inclui um composto para uso em um método de tratamento ou prevenção de doenças em um indivíduo. A invenção também inclui o uso de uma composição ou composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento ou à prevenção de uma doença em um indivíduo. Em um aspecto, a doença é selecionada a partir de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças hepáticas, doenças auto-imunes, doenças cardíacas, doenças renais, cânceres, e doenças gastrointestinais.
[0013] A descrição anterior apresenta de modo preferencialmente geral os recursos mais importantes da presente invenção com o intuito de que a descrição detalhada da mesma a seguir possa ser compreendida, e as presentes contribuições à técnica possam ser melhor avaliadas. Outros objetivos e recursos da presente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalhada a seguir considerada em conjunto com os exemplos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0014] A Figura 1 é um gráfico que mostra o impacto do composto Ih3e sobre o ganho de peso corporal em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração.
[0015] A Figura 2 é uma série de nove gráficos (A-I) que mostram as alterações no perfil metabólico de camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e. A análise plasmática em camundongos obesos induzidos por dieta tratados com o composto Ih3e. A-D se refere a enzimas hepáticas. F-I se refere a lipídeos plasmáticos.
[0016] A Figura 3 é uma série de gráficos (A-B) que mostra os resultados da análise de insulina plasmática e do teste de tolerância oral à glicose em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0017] A Figura 4 é um gráfico que mostra as alterações nos níveis de glicose em camundongos submetidos à dieta de ração tratados com o composto Ih3e.
[0018] A Figura 5 é uma série de gráficos (A-D) que mostra a liberação de insulina in vivo após uma refeição teste em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0019] A Figura 6 é uma série de gráficos (A-D) que mostra o consumo de oxigênio e a produção de CO2, conforme medido por calorimetria direta em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0020] A Figura 7 são três gráficos (A-C) que mostram o valor da razão de troca respiratória (RER) calculado após a calorimetria indireta em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0021] A Figura 8 é uma série de gráficos (A-B) que mostra a atividade locomotora e a ingestão de alimentos e água para camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0022] A Figura 9 é uma série de gráficos (A-C) que mostra as alterações no peso de órgãos para camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração tratados com o composto Ih3e.
[0023] A Figura 10 é um gráfico que descreve a tensão superficial representada graficamente em relação ao logaritmo da concentração de composto Ih3e (mM) em NaCl 0,15M.
[0024] A Figura 11 é um fluxograma biliar para um experimento de infusão duodenal realizado utilizando-se o composto Ih3e.
[0025] A Figura 12 é um fluxograma biliar para um experimento de infusão femoral realizado utilizando-se o composto Ih3e.
[0026] A Figura 13 é um gráfico que descreve as taxas de secreção versus o tempo em experimentos de infusão femoral e duodenal realizados utilizando-se o composto Ih3e.
[0027] A Figura 14 é uma série de gráficos (A-D) relacionados ao composto Ih3e e seus metabólitos. A Figura 14A mostra o composto Ih3e e seus metabólitos principais identificados na bile utilizando-se espectrometria de massa no experimento iv. Os dados são reportados como valores de área absolutos. A Figura 14b é uma exibição em zoom da Figura 14A. A Figura 14C mostra o composto Ih3e e seus metabólitos principais identificados na bile utilizando-se espectrometria de massa. A Figura 14D é uma exibição em zoom da Figura 14C.
[0028] A Figura 15 é um gráfico que mostra a estabilidade do composto Ih3e (triangulo) e CA (quadrado) em cultura de fezes humanas.
[0029] A Figura 16 é um gráfico de barras que mostra a liberação dose-dependente de GLP-1 ex vivo induzida pelo composto Ih3e.
[0030] A Figura 17A mostra os gráficos de correlação para expressão hepática de mRNA de TGR5 e CoxVI1 a na população de referência genética BxD de ratos (n = 41).
[0031] A Figura 17B é um gráfico de barras que mostra a atividade de Cox em células STC-1 tratadas durante 1 hora com o composto Ih3e na concentração indicada. O veículo ou inibidor de adenilato ciclase MDL-12330-A (MDL) (1 μM) foi adicionado 15 minutos antes do tratamento (n = 3).
[0032] A Figura 17C é um gráfico que mostra o consumo de oxigênio em células STC-1, conforme medido utilizando-se o analisador de fluxo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience). A primeira linha pontilhada vertical indica a adição de veículo ou MDL- 12330-A (MDL) ao meio de cultura, e a segunda linha pontilhada descreve o tratamento com o composto Ih3e em 1 μM (n = 10).
[0033] A Figura 17D é um gráfico de barras que mostra a razão ATP/ADP em células STC-1 tratadas conforme na Figura B (n=3).
[0034] A Figura 17E mostra gráficos de correlação para expressão hepática de mRNA de TGR5 e Kir6.2 na população de referência genética BxD de ratos de acordo com uma estratégia similar descrita na Figura A.
[0035] A Figura 17F é um gráfico de barras que mostra os níveis de expressão mRNA de TGR5, CoxIV, e Kir6.2 em células STC-1 transfectadas durante 36 horas com controle ou mTGR5 shRNA conforme medido por PCR quantitativo em tempo real. Os níveis almejados de mRNA foram normalizados em níveis de 36B4 mRNA (n = 3). Os dados são representados como média ± SE; teste t de Student não-emparelhado; *p < 0,05.
[0036] A Figura 18A mostra gráficos de correlação para expressão hepática de mRNA de TGR5 e Cav2.2 na população de referência genética BxD de ratos (n = 41) conforme encontrado no website da GeneNetwork University of Tennessee.
[0037] As Figuras 18B e 18C são gráficos que mostram o nível intracelular de cálcio em células NCI-H716 transfectadas com um vetor simulado, um vetor de expressão hTGR5, ou hTGR5 siRNA durante 36 horas e tratadas com 1 (B) ou 10 μM (C) do composto Ih3e. A seta representa o tratamento com o composto Ih3e (n = 3).
[0038] A Figura 18D é um gráfico que mostra o nível intracelular de cálcio em células NCI-H716 tratadas com 3 μM do composto Ih3e (indicado pela seta) na presença de veículo ou inibidor de adenilato ciclase MDL-12330-A (MDL) (10 μM). O MDL ou veículo foi adicionado 15 minutos antes do tratamento com o composto Ih3e (n = 3).
[0039] A Figura 18E é um gráfico que mostra o nível intracelular de cálcio em células NCI-H716 tratadas com 1% de glicose e, então, com 1 μM do composto Ih3e (n = 3).
[0040] A Figura 18F é um gráfico de barras que mostra a liberação GLP-1 em células NCI-H716 tratadas com 1% de glicose ou 1 μM do composto Ih3e, ou uma combinação de ambos os agentes (n = 3).
[0041] A Figura 18G é um gráfico de barras que mostra a liberação GLP-1 em células STC-1 transfectadas durante 36 horas com controle, vetor de expressão mTGR5, ou mTGR5 shRNA e, então, expostas 30 minutos ao composto Ih3e na concentração indicada. Um inibidor DPP4 (Millipore) foi adicionado ao meio de cultura a 0,1% (n = 3).
[0042] A Figura 18H é um gráfico de barras que mostra o impacto de 30 minutos do tratamento com o composto Ih3e na liberação GLP-1 em células STC-1 transfectadas com o vetor de expressão mTGR5 na presença de um veículo ou inibidor de adenilato ciclase MDL-1 2330-A (10 μM). O MDL ou veículo foi adicionado 15 minutos antes do tratamento com o composto Ih3e. Um inibidor DPP4 (Millipore) foi adicionado no meio de cultura a 0,1% (n = 3). Os dados são representados como média ± SE. Teste t de Student não- emparelhado; #p < 0,05 tratamento com o veículo versus composto Ih3e; #p < 0,05 tratamento com veículo versus MDL-1 2330-A.
[0043] A Figura 19A é um gráfico que mostra os resultados de um teste de tolerância oral à glicose (OGTT) em camundongos macho TGR5-Tg alimentados durante 10 semanas com a dieta HF e em ninhadas de machos com idade compatível alimentados com uma dieta CD ou HF ao longo da mesma duração. Todos os camundongos tinham 8 semanas de idade na iniciação da dieta HF. O peso corporal de TGR5-Tg e das ninhadas de controle era igual a 37,9 ± 1,7 g e 37,0 ± 1,8 g, respectivamente (n = 8; estatisticamente não diferente). O gráfico de barras adjacente representa a área média sob a curva (AUC) (n = 8).
[0044] As Figuras 19B e 19C mostram os níveis de insulina plasmática (painel superior) e GLP-1 (painel inferior) durante OGTT (19B) ou antes e após um desafio de refeição teste (19C) (n = 8).
[0045] A Figura 19D é um gráfico de barras que mostra a liberação GLP-1 a partir de explantes ileais isolados dos camundongos machos de controle e TGR5-Tg durante 18 semanas submetidos à dieta HF e expostos durante 1 hora às concentrações indicadas de LCA (n = 4).
[0046] A Figura 19E é uma série de imagens que são seções pancreáticas representativas coloradas por insulina imunofluorescente de camundongos macho TGR5-Tg alimentados com uma dieta HF durante 20 semanas ou de ninhadas de machos com idade compatível alimentados com uma dieta CD ou HF ao longo da mesma duração.
[0047] A Figura 19F é um gráfico de barras que mostra um perfil de distribuição de ilhotas pancreáticas de camundongos machos TGR5-Tg e ninhadas de controle alimentos com uma dieta CD ou HF conforme descrito na Figura 19E. As ilhotas foram contadas e dimensionadas pelo software de análise ImageJ em quatro seções pancreáticas alternadas coloradas com H&E afastadas umas das outras por 150 μM (n = 5).
[0048] A Figura 19G é um gráfico de barras que mostra o teor de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas com colagenase de camundongos macho TGR5-Tg e ninhadas de controle alimentadas com uma dieta CD ou HF, conforme descrito na Figura 19E.
[0049] A Figura 19H é um gráfico que mostra os resultados de um OGTT em camundongos macho TGR5-/- e TGR5+/+ alimentados com uma dieta HF durante 8 semanas. A inserção representa o AUC médio. O peso corporal de camundongos macho TGR5-/- e TGR5+/+ no momento da análise era igual a 46,3 ± 3,9 g e 51,9 ± 2,0 g, respectivamente (n = 8; estatisticamente não diferente).
[0050] As Figuras 19I e 19J são gráficos que mostram os níveis plasmáticos GLP-1 em camundongos TGR5+/+ (Figura 19I) e TGR5-/- (Figura 19J) alimentados com CD após um desafio de glicose oral, precedido 30 minutos antes pela administração oral de solução salina ou composto Ih3e (30 mg/kg), sozinho ou em combinação com um inibidor dipeptidil-peptidase-4 (DPP4i, 3 mg/kg) (n = 6). Os dados são representados como média ± SE. Teste t de Student não- emparelhado; #p <0,05, camundongos alimentados com HF comparados aos camundongos tratados com o composto Ih3e alimentados com HF; e #p < 0,05, camundongos alimentados com HF versus CD exceto por (I) e (J), onde se avaliou os camundongos tratados com solução salina ou DPP4i versus camundongos tratados com composto Ih3e ou Ih3e + DPP4i, e camundongos tratados com solução salina# - versus DPP4i.
[0051] A Figura 20A é um gráfico que mostra os resultados da medição por HPLC dos níveis plasmáticos do composto Ih3e em camundongos macho C57BL6/J tratados com o composto Ih3e alimentados com CD, HF, e HF.
[0052] A Figura 20B é um gráfico que mostra o resultado da intervenção alimentar com o composto Ih3e (30 mg/kg/d) iniciado após um período de 14 semanas de alimentação com HF no momento indicado pela seta. A evolução do peso corporal em todos os grupos foi acompanhada ao longo do estudo (n = 8).
[0053] A Figura 20C é um gráfico de barras que mostra a composição corporal conforme avaliado por qNMR após 8 semanas de intervenção alimentar (n = 8).
[0054] A Figura 20D é um gráfico de barras que mostra a massa de órgão conforme expresso como um percentual do peso dos camundongos de controle alimentados com CD.
[0055] A Figura 20E é um gráfico de barras que mostra a ingestão de alimentos (n = 8).
[0056] A Figura 20F é uma série de gráficos de barras que mostram a atividade horizontal espontânea e o gasto energético, avaliado pela mediação do consumo de oxigênio (VO2) e pela liberação de dióxido de carbono (VCO2), que foram monitorados durante um período de 18 horas 6 semanas após a iniciação da intervenção alimentar. O quociente respiratório (RQ) foi calculado como a razão VCO2/ VO2. Os gráficos de barras representam o AUC médio. Para a RQ, os gráficos de barras representam a média (n = 8).
[0057] A Figura 20G é um gráfico de barras que mostra a expressão genética em BAT por PCR quantitativo em tempo real após 18 semanas de intervenção alimentar. Os níveis almejados de mRNA foram normalizados em níveis 36B4 mRNA (n = 8).
[0058] A Figura 20H é um gráfico que mostra os adipócitos marrons primários isolados dos camundongos machos C57BL/6J alimentados com CD submetidos à cultura durante 12 horas com veículo ou 3 μM do composto Ih3e, e o consumo de O2 foi medido utilizando-se um analisador de fluxo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience) (n = 5). As linhas pontilhadas ilustram a adição do agente de desacoplamento FCCP em sucessivas doses de 250 e 500 nM.
[0059] A Figura 20I é uma série de imagens que são imagens representativas da coloração red O em óleo (ORO) de criosseções (painel superior) e coloração vermelha Sirius de seções incrustadas com parafina (painel inferior) do fígado no fim da intervenção alimentar. A fibrose é indicada pela seta.
[0060] A Figura 20J é uma série de gráficos de barras que mostra o teor de lLipid em amostras de fígado extraídas de acordo com o método de Folch’s (n = 8).
[0061] As Figuras 20K e 20 consistem em uma série de gráficos de barras que mostram os níveis plasmáticos de enzimas hepáticas (Figura 20K) e lipídeos (Figura 20L) no fim da intervenção alimentar (n = 8). Os dados são representados como a média ± SE. Teste t de Student não-emparelhado; *p < 0,05, camundongos alimentados com HF comparados aos camundongos tratados com o composto Ih3e alimentados com HF; e #p < 0,05, camundongos alimentados com HF versus CD.
[0062] A Figura 21A é um gráfico que mostra o resultado de um OGTT em camundongos macho C57BL6/J alimentados com CD e HF suplementados com 30 mg/ kg/d do composto Ih3e durante 8 semanas seguindo o início de obesidade induzida pela alimentação com uma dieta HF durante 10 semanas. A inserção representa o AUC médio. O peso corporal dos camundongos tratados com veículo e composto Ih3e era igual a 38,08 ± 1,83 g e 32,26 ± 0,95 g, respectivamente (n = 8; p < 0,05).
[0063] A Figura 21B é um gráfico que mostra glicemia e insulinemia de jejum (4 horas de jejum) em camundongos DIO após 3 semanas de intervenção alimentar com o composto Ih3e (painel superior). Os níveis de insulina plasmática durante OGTT em camundongos DIO (painel inferior).
[0064] A Figura 21C é um gráfico que mostra o resultado de um OGTT em camundongos macho db/db de 14 semanas de idade alimentados com CD tratados com 30 mg/kg/d de composto Ih3e durante 6 semanas. A inserção mostra o AUC médio (n = 8).
[0065] A Figura 21D é um gráfico que mostra a glicemia e insulinemia de jejum (4 horas) em camundongos db/db após 6 semanas de tratamento com o composto Ih3e (painel superior). Os níveis de insulina plasmática durante OGTT em camundongos DIO (painel inferior).
[0066] A Figura 21E é uma série de dois gráficos de barras que mostram a sensibilidade à insulina avaliada através da taxa de infusão de glicose média em equilíbrio (euglicemia) em um clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (10 mU insulina/min/kg) em camundongos DIO (segundo o início de obesidade induzida pela alimentação com uma dieta HF durante 10 semanas) após 10 semanas de intervenção alimentar com o composto Ih3e (30 mg/kg/d) (n = 5). A avaliação da produção de glicose hepática e sua supressão por insulina, assim como a taxa de desaparecimento de glicose, foi avaliada em equilíbrio utilizando-se 3H-glicose (n = 5).
[0067] A Figura 21F é uma série de gráficos de barras que mostra a captação de glicose simulada por insulina nos tecidos indicados medida utilizando-se tracers de 14C-2-desoxiglicose (n = 5).
[0068] A Figura 21G é uma série de gráficos de barras que mostra a definição de perfil de expressão genética no fígado que foi realizada por PCR quantitativo em tempo real. Os níveis almejados de mRNA foram normalizados em níveis 36B4 (n = 8). Os dados são representados como a média ± SE. Teste t de Student não- emparelhado; *p < 0,05, Camundongos alimentados com HF comparados com camundongos tratados com o composto Ih3e alimentados com HF; e #p < 0,05, camundongos alimentados com HF versus CD.
[0069] A Figura 22A é uma série de gráficos que mostra os resultados de um estudo onde os camundongos machos TGR5+/+ e TGR5-/- foram alimentados com uma dieta HF durante 9 semanas, e um primeiro OGTT foi realizado posteriormente. O HF foi, então, suplementado com o composto Ih3e em 30 mg/kg/d. Um segundo OGTT foi realizado 4 semanas após a iniciação do tratamento com o composto Ih3e. As curvas representam a tolerância à glicose antes e após o tratamento de 4 semanas com o composto Ih3e em camundongos TGR5+/+ (painel esquerdo) e TGR5-/- (painel direito). A inserção representa o AUC médio. Em camundongos TGR5+/+, o peso corporal antes e após o tratamento com o composto Ih3e era igual a 46,86 ± 3,54 g e 43,50 ± 3,47 g, respectivamente (n = 8; estatisticamente não diferente). Em camundongos TGR5~/, o peso corporal antes e após o tratamento com o composto Ih3e era igual a 54,34 ± 2,23 g e 52,30 ± 2,72 g, respectivamente (n = 8; estatisticamente não diferente).
[0070] A Figura 22B é uma série de gráficos que mostra os níveis de insulina plasmática que foram simultaneamente medidos durante o OGTT em camundongos DIO em TGR5+/+ (painel esquerdo) e TGR5-/- (painel direito) antes e após o tratamento de 4 semanas com o composto Ih3e. A inserção representa o AUC médio (n = 8). Os dados são representados como a média ± SE. Teste t de Student não- emparelhado; *p < 0,05, camundongos tratados com o veículo comparados aos camundongos tratados com o composto Ih3e 7.
[0071] A Figura 23 é um gráfico que mostra as taxas de vazão biliática dos compostos Ih3e e Ii3e em um experimento de infusão femoral em 1 μmol/min/kg durante 1 hora e a taxa de vazão biliática em um experimento femoral como a infusão de controle com 3% BSA de solução fisiológica durante 1 hora.
[0072] A Figura 24 é um gráfico que mostra as taxas de secreção de composto Ih3e e tauro-Ih3e vs. tempo em um experimento femoral em 1 μmol/min/kg durante 1 hora.
[0073] A Figura 25 é um gráfico que mostra as taxas de secreção de composto Ii3e e tauro-Ii3e vs. tempo em um experimento femoral em 1 μmol/min/kg durante 1 hora.
[0074] A Figura 26 é um gráfico que mostra o composto Ih3e e seus metabólitos principais identificados em amostras biliáticas coletadas durante o experimento de infusão femoral. Os dados são reportados como valores de área absolutos.
[0075] A Figura 27 é uma exibição em zoom da Figura 26.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0076] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados na descrição em anexo abaixo. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou em testes da presente invenção, os métodos e materiais serão descritos agora. Outros recursos, objetivos, e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição. No relatório descritivo, as formas no singular também incluem as formas no plural, exceto onde o contexto indicar explicitamente em contrário. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um indivíduo versado na técnica à qual a presente invenção pertence. No caso de conflito, o presente relatório descritivo prevalecerá.
Definições
[0077] Por motivos de conveniência, reúnem-se determinados termos usados no relatório descritivo, exemplos e reivindicações em anexo.
[0078] O termo “tratar”, conforme o uso em questão significa aliviar, moderar, reduzir, eliminar, modular, ou melhorar, isto é, induzir regressão do estado ou condição de doença.
[0079] O termo “prevenir”, conforme o uso em questão significa interromper, completamente ou quase completamente um estado ou condição de doença, a ocorrência em um paciente ou indivíduo, especialmente quando o paciente ou indivíduo for pré-disposto a tal doença ou se o mesmo estiver em risco de contrair um estado ou condição de doença. O termo evitar também pode incluir inibir, isto é, interromper o desenvolvimento de um estado ou condição de doença, e aliviar ou melhorar, isto é, induzir uma regressão do estado ou condição de doença, por exemplo, quando o estado ou condição de doença já puder estar presente.
[0080] O termo “6-Et,23(S)-MeCA” se refere à composto Ih3e tendo a estrutura química:
Figure img0004
[0081] Alternativamente, o composto Ih3e também pode ser referido como ácido 6α-etila-(23S)-metil-3α,7α,12α triidr0xi-5β-colan- 24-óico.
[0082] Conforme o uso em questão, “BA” significa ácido biliático e derivados de ácido biliático. Os ácidos biliáticos são ácidos esteróide carboxílicos derivados a partir de colesterol. Os ácidos biliáticos primários são ácidos cólicos e quenodeoxicólicos. No corpo, esses ácidos são conjugados com glicina ou taurina antes de serem secretados na bile.
[0083] “Alquil” inclui grupos alifáticos saturados, que incluem grupos de alquila de cadeia linear (por exemplo, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptiila, octila, nonila, decila), grupos alquila de cadeia ramificada (por exemplo, isopropila, terc-butila, isobutila), grupos cicloalquila (por exemplo, alicíclicos) (por exemplo, ciclopropila, ciclopentila, cicloexila, cicloeptila, ciclooctila), grupos cicloalquila substituídos por alquila, e grupos alquila substituídos por cicloalquila. Em determinadas modalidades, uma alquila de cadeia linear ou ramificada tem seis ou menos átomos de carbono em sua cadeia principal referida como “alquil inferior” (por exemplo, C1-C6 para cadeia linear significa 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 átomos de carbono, C3-C6 para cadeia ramificada significa 3, 4, 5, ou 6 átomos de carbono). Em alguns exemplos, uma alquila de cadeia linear ou ramificada tem quatro ou menos átomos de carbono em sua cadeia principal. Além disso, as cicloalquilas têm 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 átomos de carbono em sua estrutura de anel.
[0084] O termo “alquil substituído” se refere a porções alquila tendo um substituinte substituindo um ou mais átomos de hidrogênio em pelo menos um ou mais átomos de carbono da cadeia principal de hidrocarbonetos. Esses substituintes podem incluir, por exemplo, alquila, alquenila, alquinila, halogênio, hidroxila, alquil carbonilóxi, aril carbonilóxi, alcóxi carbonilóxi, arilóxi carbonilóxi, carboxilato, alquil carbonil, aril carbonil, alcóxi carbonil, amino carbonil, alquil amino carbonil, dialquil amino carbonil, alquil tiocarbonil, alcoxila, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquil amino, dialquil amino, aril amino, diaril amino, e alquil aril amino), acilamino (incluindo alquil carbonil amino, aril carbonil amino, carbamoil e ureído), amidino, imino, sulfidril, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquil sulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, ciano, azido, heterociclil, alquil aril, ou uma porção aromática heteroaromática.
[0085] “Aril” inclui grupos com aromaticidade, incluindo grupos aromáticos “não-conjugados” com 5 e 6 membros ou de anel único que podem incluir de zero a quatro heteroátomos, assim como sistemas “conjugados”, ou multicíclicos com pelo menos um anel aromático. Exemplos de grupos arila incluem benzeno, fenila, pirrola, furan, tiofeno, tiazola, isotiazola, imidazola, triazola, tetrazola, pirazola, oxazola, isooxazola, piridina, pirazina, piridazina, e pirimidina, e similares. Além disso, o termo “arila” inclui grupos arila multicíclicos, por exemplo, tricíclicos, bicíclicos, por exemplo, naftaleno, benzoxazola, benzodioxazola, benzotiazola, benzoimidazola, benzotiofeno, metileno dioxifenil, quinolina, isoquinolina, naftridina, indola, benzofuran, purina, benzofuran, deazapurina, ou indolizina. Esses grupos arila tendo heteroátomos na estrutura de anel também podem ser referidos como “heterociclos de arila”, “heterociclos,” “heteroarilas” ou “heteroaromáticos”. O anel aromático pode ser substituído, em pelo menos uma posição de anel, por tais substituintes descritos anteriormente, como, por exemplo, halogênio, hidroxila, alcóxi, alquil carbonilóxi, aril carbonilóxi, alcóxi carbonilóxi, arilóxi carbonilóxi, carboxilato, alquil carbonil, alquil amino carbonil, aralquil amino carbonil, alquenil amino carbonil, alquil carbonil, aril carbonil, aralquil carbonil, alquenil carbonil, alcóxi carbonil, amino carbonil, alquiltio carbonil, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluindo alquil amino, dialquil amino, aril amino, diaril amino, e alquil aril amino), acilamino (incluindo alquil carbonil amino, aril carbonil amino, carbamoil e ureído), amidino, imino, sulfidril, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquil sulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, ciano, azido, heterociclil, alquil aril, ou uma porção aromática ou heteroaromática. Os grupos aril também podem ser fundidos ou unidos a anéis alicíclicos ou heterocíclicos, que não são aromáticos com o intuito de formar um sistema multicíclico (por exemplo, tetralina, metileno dióxi fenil).
[0086] Exceto onde o número de átomos de carbono for especificado em contrário, o “alquil inferior” inclui um grupo alquila, conforme definido anteriormente, porém, tendo um a dez, por exemplo, de um a seis, átomos de carbono em sua estrutura de cadeia principal.
[0087] O termo “alcóxi” ou “alcoxil” inclui grupos alquil, alquenil, e alquilnil covalentemente ligados a um átomo de oxigênio. Exemplos de grupos alcóxi (ou radicais alcoxila) incluem grupos metóxi, etóxi, isopropilóxi, propóxi, butóxi, e pentóxi.
[0088] O termo “éter” inclui compostos ou porções contendo um átomo de oxigênio ligado a dois átomos ou heteroátomos de carbono diferentes. Por exemplo, o termo inclui “alcóxi alquil” que se refere a um grupo alquil, alquenil, ou alquinila covalentemente ligado a um átomo de oxigênio que é covalentemente ligado a outro grupo alquil.
[0089] O termo “éster” inclui compostos e porções contendo um átomo de carbono ou um heteroátomo ligado a um átomo de oxigênio que é ligado ao átomo de carbono de um grupo carbonila. O termo “éster” inclui grupos alcóxi carbóxi, tais como metóxi carbonil, etóxi carbonil, propóxi carbonil, butóxi carbonil, pentóxi carbonil, etc. Os grupos alquil, alquenil, ou alquinil são conforme definidos anteriormente.
[0090] O termo “hidróxi” ou “hidroxila” inclui grupos com -OH ou - O-.
[0091] O termo “halogênio” inclui flúor, bromo, cloro, iodo, etc. O termo “peralogenado” se refere, em geral, a uma porção onde todos os átomos de hidrogênio são substituídos por átimos de halogênio.
[0092] Um “grupo aniônico,” conforme o uso em questão, se refere a um grupo que é negativamente carregado em um pH fisiológico. Os grupos aniônicos incluem carboxilato, sulfate, sulfonato, sulfinato, sulfamato, tetrazolil, fosfato, fosfanato, fosfinato, ou fosforotionato ou equivalentes funcionais dos mesmos. Os “equivalentes funcionais” de grupos aniônicos são destinados a incluírem bioisósteros, por exemplo, bioisósteros de um grupo carboxilato. Os bioisósteros abrangem tanto equivalentes bioisostéricos clássicos como equivalentes bioisostéricos não-clássicos. Os bioisósteros clássicos e não-clássicos são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Silverman, R. B. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1992, pp.19-23). Outro grupo aniônico consiste em um carboxilato.
[0093] O termo “funcionalidade instável” se refere a um padrão de substituição que contém uma ligação lábil, por exemplo, uma funcionalidade ou ligação que seja susceptível à hidrólise ou clivagem sob condições fisiológicas (por exemplo, soluções aquosas na faixa de pH neutro). Exemplos de funcionalidades instáveis incluem acetais e cetais.
[0094] O termos “polimorfos cristalinos” ou “polimorfos” se referem à existência de mais de uma forma cristalina para um composto, sal ou solvato do mesmo. Os polimorfos cristalinos dos compostos análogos de ácido biliático são preparados por cristalização sob diferentes condições.
[0095] O termo “R-EMCA” se refere ao composto de ácido 6a- etila-23(R)-metil cólico tendo a estrutura:
Figure img0005
[0096] Alternativamente, pode ser referido como ácido 6α-etila- (23R) -metil-3α,7α,12α triidr0xi-5β -colan-24-óico
[0097] Adicionalmente, os compostos da presente invenção, por exemplo, os sais dos compostos, podem existir sob a forma hidratada ou desidratada (o anidro) ou como solvatos com outras moléculas solventes. Exemplos não-limitantes de hidratos incluem monoidratos, diidratos, etc. Exemplos não-limitantes de solvatos incluem solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.
[0098] “Solvatos” significa formas de adição de solvente que contém quantidades estequiométricas ou não- estequiométricas de solvente. Alguns compostos têm uma tendência a manter uma razão molar fixa de moléculas solventes no estado sólido cristalino, formando, assim, um solvato. Se o solvente for água, o solvato formado é um hidrato, quando o solvente for um álcool, o solvato formato é um alcoolato. Os hidratos são formados pela combinação de uma ou mais moléculas de água com uma das substâncias nas quais a água retém seu estado molecular como H2O, sendo que tal combinação é capaz de formar um ou mais hidratos.
[0099] Notar-se-á que a estrutura de alguns dos compostos da invenção inclui átomos de carbono assimétricos. Deve-se compreender que os isômeros que surgem a partir de tal assimetria (por exemplo, todos os enantiômeros e diastereômeros) estão incluídos no escopo da invenção, exceto onde indicado em contrário. Esses isômeros podem ser obtidos sob uma forma substancialmente pura através de técnicas de separação clássicas e através de síntese estereoquimicamente controlada. Os enantiômeros (configurações R e S) são nomeados de acordo com o sistema desenvolvido por R.S. Cahn, C. Ingold, e V. Prelog.
[00100] Além disso, as estruturas e outros compostos discutidos no presente pedido incluem todos os isômeros atrópicos dos mesmos. Os isômeros atrópicos consistem em um tipo de estereoisômero no qual os átomos de dois isômeros são dispostos diferentemente no espaço. Os isômeros atrópicos devem sua existência a uma rotação restrita causada por impedimento de rotação de grandes grupos ao redor de uma ligação central. Tipicamente, esses isômeros estão presentes como uma mistura, no entanto, como resultado de recentes avanços em técnicas cromatográficas, é possível separar as misturas de dois isômeros atrópicos em casos selecionados.
[00101] Os termos “composto estável” e “estrutura estável” são destinados a indicar um composto que seja suficientemente robusto para conservar o isolamento até um grau útil de puridade a partir de uma mistura de reação, e formulação em um agente terapêutico eficaz.
[00102] Conforme o uso em questão, o termo “análogo” se refere a um composto químico que é estruturalmente similar a outro, porém, é ligeiramente diferente em composição (conforme na substituição de um átomo por um átomo de um elemento diferente ou na presença de um grupo funcional particular, ou a substituição de um grupo funcional por outro grupo funcional). Portanto, um análogo é um composto similar ou comparável em função ao composto de referência.
[00103] Conforme definido no presente documento, o termo “derivado”, por exemplo, no termo “derivados de ácido biliático”, se refere a compostos que têm uma estrutura de anel com 4 membros de núcleo comum, e são substituídos por vários grupos, conforme descrito no presente documento.
[00104] O termo “bioisóstero” se refere a um composto resultante a partir da troca de um átomo ou de um grupo de átomos por outro átomo ou grupo de átomos amplamente similares. A substituição bioisostérica pode ocorrer à base físico-química ou topológica. Exemplos de bioisósteros de ácido carboxílico incluem acil sulfonimidas, tetrazolas, sulfonatos, e fosfonatos. Consulte, por exemplo, Patani e LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176 (1996).
[00105] O termo “terapia de combinação” (ou “co-terapia”) inclui a administração de um composto da invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico destinado a proporcionar o efeito benéfico proveniente da co-ação desses agentes terapêuticos (isto é, o composto da invenção e pelo menos um segundo agente). O efeito benéfico da combinação inclui, mas não se limita a, co-ação fármaco-cinética ou fármaco-dinâmica resultante a partir da combinação de agentes terapêuticos. A administração desses agentes terapêuticos em combinação tipicamente é realizada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas dependendo da combinação selecionada). A “terapia de combinação” pode, não genericamente não é, destinada a abranger a administração de dois ou mais agentes terapêuticos como parte dos regimes monoterapêuticos separados que resultam incidental e arbitrariamente nas combinações da presente invenção. A “terapia de combinação” é destinada a abranger a administração desses agentes terapêuticos de maneira sequencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado em um momento diferente, assim como a administração desses agentes terapêuticos, ou pelo menos dois entre os agentes terapêuticos, de maneira substancialmente simultânea. A administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, administrando-se ao indivíduo uma única cápsula tendo uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em várias cápsulas únicas para cada um dos agentes terapêuticos. A administração substancialmente sequencial ou simultânea de cada agente terapêutico pode ser realizada por qualquer rota apropriada que inclui, mas não se limita a, rotas orais, rotas intravenosas, rotas intramusculares, e absorção direta através de tecidos membranares mucosais. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma rota ou por rotas diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção intravenosa enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados por via oral. Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por via oral ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção intravenosa. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é limitadamente crítica.
[00106] A “terapia de combinação” também abrange a administração dos agentes terapêuticos conforme descrito anteriormente em uma combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos e terapias não baseadas em fármacos (por exemplo, cirurgias ou tratamentos mecânicos). Quando a terapia de combinação compreender, ainda, um tratamento não baseado em fármacos, o tratamento não baseado em fármacos pode ser conduzido em qualquer momento adequado desde que um efeito benéfico proveniente da co-ação da combinação dos agentes terapêuticos e do tratamento não baseado em fármacos seja obtido. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é obtido quando o tratamento não baseado em fármacos for temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez durante dias ou até mesmo durante semanas.
[00107] Os termos “administração parenteral” e “parenteralmente administrado”, conforme o uso em questão, se referem aos modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem caráter limitativo, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal e intra-esternal.
[00108] O termo “pulmonar”, conforme o uso em questão se refere a qualquer parte, tecido ou órgão cuja função primária seja a troca de gás com o ambiente externo, por exemplo, troca O2/CO2, em um paciente. Tipicamente, o termo “pulmonar” se refere aos tecidos do trato respiratório. Portanto, a frase “administração pulmonar” se refere à administração das formulações aqui descritas em qualquer parte, tecido ou órgão cuja função primária seja a troca de gás com o ambiente externo (por exemplo, boca, nariz, faringe, orofaringe, laringofaringe, laringe, traqueia, carina, brônquio, bronquíolos, alvéolos). Por propósitos da presente invenção, o termo “pulmonar” também inclui um tecido ou uma cavidade que seja contingente ao trato respiratório, em particular, as sinuses.
[00109] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um composto da invenção, ou uma combinação de compostos consiste em uma quantidade (quantidade ou concentração) de um composto ou compostos. Em uma modalidade, quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto for administrada a um indivíduo em necessidade de tratamento, os sintomas que surgem provenientes da doença são imediatamente aliviados ou após a administração do composto uma ou mais vezes. A quantidade do composto a ser administrada a um indivíduo dependerá do distúrbio particular, do modo de administração, dos compostos co- administrados, se existirem, e das características do indivíduo, tal como saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genótipo, peso corporal e tolerância a fármacos. Os indivíduos versados na técnica serão capazes de determinar as dosagens apropriadas dependendo desses e de outros fatores.
[00110] O termo “quantidade profilaticamente eficaz” significa uma quantidade (quantidade ou concentração) de um composto da presente invenção, ou uma combinação de compostos, que é administrado para prevenir ou reduzir o risco de uma doença - em outras palavras, uma quantidade necessária para proporcionar um efeito preventivo ou profilático. A quantidade do presente composto a ser administrada a um indivíduo dependerá do distúrbio particular, do modo de administração, dos compostos co-administrados, se existirem, e das características do indivíduo, tal como saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genótipo, peso corporal e tolerância a fármacos. Os indivíduos versados na técnica serão capazes de determinar as dosagens apropriadas dependendo desses e de outros fatores.
[00111] O termo “reduzir o risco de”, conforme o uso em questão significa reduzir a probabilidade de ocorrência de uma doença do sistema nervoso central, doença inflamatória e/ou doença metabólica em um paciente, especialmente quando o paciente ou indivíduo for pré-disposto a tal ocorrência.
[00112] Um “sal farmaceuticamente aceitável” ou “sal” de um composto da invenção é um produto do composto que contém uma ligação iônica, e é tipicamente produzido reagindo-se o composto com um ácido ou uma base, adequado para administração a um indivíduo.
[00113] Conforme o uso em questão, os “sais farmaceuticamente aceitáveis” se referem a derivados dos compostos da invenção onde o composto precursor é modificado produzindo-se sais ácidos ou básicos do mesmo. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, sais ácidos orgânicos de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como ácidos carboxílicos; e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não-tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto precursor formado, por exemplo, a partir de ácidos não-tóxicos inorgânicos ou orgânicos. Por exemplo, esses sais não-tóxicos convencionais incluem, mas não se limitam a, aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos selecionados a partir de 2- acetóxi benzóico, 2-hidróxi etano sulfônico, acético, ascórbico, benzeno sulfônico, benzóico, bicarbônico, carbônico, cítrico, edético, etano dissulfônico, etano sulfônico, fumárico, glucoeptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabâmico, hidrobrômico, hidroclórico, hidroiodeto, hidróxi maléico, hidróxi naftôico, isetiônico, lático, lactobiônico, lauril sulfônico, maléico, málico, mandélico, metano sulfônico, napsílico, nítrico, oxálico, pamóico, pantotênico, fenil acético, fosfórico, poligalacturônico, propiônico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfâmico, sulfanílico, sulfúrico, tânico, tartárico, e tolueno sulfônico.
[00114] Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir do composto precursor que contém uma porção básica ou ácida através de métodos químicos convencionais. Em geral, esses sais podem ser preparados reagindo- se as formas livres ácidas ou básicas desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois; em geral, um meio não-aquoso, como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila são preferenciais. As listas de sais adequados são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA, p. 1445 (1990).
[00115] A frase “farmaceuticamente aceitável” é reconhecida na técnica. Em determinadas modalidades, o termo inclui composições, polímeros e outros materiais e/ou formas de dosagem que se encontram no escopo da avaliação médica legítima, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão benefícios/riscos razoável.
[00116] A frase “carreador farmaceuticamente aceitável” é reconhecida na técnica, e inclui, por exemplo, materiais, composições ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, tal como um filtro líquido ou sólido, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação, envolvido na condução ou transporte de qualquer composição em questão a partir de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão, ou parte do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível a outros ingredientes de uma composição em questão e não prejudicial ao paciente. Em determinadas modalidades, um carreador farmaceuticamente aceitável é não-pirogênico. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como sódio carbóxi metil celulose, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras supositórias; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tal como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tal como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tal como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tampão de fosfato; e (21) outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.
[00117] Uma “composição” ou “composição farmaceuticamente aceitável” é uma formulação contendo um composto da invenção ou sal, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos. Em uma modalidade, a composição farmacêutica se encontra em volume ou sob a forma de dosagem única. A forma de dosagem única consiste em qualquer entre uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, uma cápsula, uma bolsa IV, um tablete, uma bomba simples em um inalador de aerossol, ou um frasco. A quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, uma formulação de um composto da invenção ou sais da mesma) em uma dose única de composição é uma quantidade eficaz e varia de acordo com o tratamento particular envolvido. Um indivíduo versado na técnica avaliará que algumas vezes é necessário realizar variações de rotina à dosagem dependendo da idade e da condição do paciente. A dosagem também dependerá da rota de administração. Contempla-se uma variedade de rotas, incluindo oral, pulmonar, retal, parenteral, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, e similares. As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de um composto da presente invenção inclui pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, apliques e inalantes. Em outra modalidade, o composto ativo é misturado sob condições esterilizadas com um carreador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer preservativos, tampões, ou propelentes sejam necessários.
[00118] O termo “dose instantânea” se refere às formulações de composto que são formas de dosagem rapidamente dispersantes.
[00119] O termo “liberação imediata” definido como uma liberação de um composto a partir de uma forma de dosagem em um período de tempo relativamente breve, geralmente até cerca de 60 minutos. O termo “liberação modificada” é definido de modo a incluir uma liberação retardada, uma liberação estendida, e uma liberação pulsada. O termo “liberação pulsada” é definido como uma série de liberações de fármaco a partir de uma forma de dosagem. O termo “liberação sustentada” ou “liberação estendida” é definido como uma liberação contínua de um composto a partir de uma forma de dosagem ao longo de um período prolongado.
[00120] Um “indivíduo” inclui mamíferos, por exemplo, seres humanos, animais de estimação (por exemplo, cães, gatos, pássaros, e similares), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos, aves, e similares) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, pássaros, e similares). Tipicamente, o indivíduo é um ser humano.
[00121] Os compostos da invenção também incluem pró-fármacos ou derivados fisiologicamente equivalentes. Um “pró-fármaco” ou “derivado fisiologicamente equivalente” inclui uma forma precursora do fármaco que seja metabolicamente convertida in vivo de modo a produzir o fármaco ativo. A invenção contempla, ainda, o uso de pró- fármacos que são convertidos in vivo em compostos de modulação TGR5 usados nos métodos da invenção (consulte, por exemplo, R. B. Silverman, 1992, “The Organic Chemistry of Drug Design e Drug Action”, Academic Press, Chp. 8). Esses pró-fármacos podem ser usados para alterar a biodistribuição (por exemplo, permitir que os compostos que não cruzam tipicamente a barreira hematoencefálica cruzem a barreira hematoencefálica) ou a farmacocinética do composto de modulação TGR5. Por exemplo, um grupo aniônico, por exemplo, um carboxilato, sulfato ou sulfonato, pode ser esterificado, por exemplo, com um grupo alquila (por exemplo, um grupo metila) ou um grupo fenila, de modo a produzir um éster. Quando o éster for administrado a um indivíduo, o mesmo é clivado, de modo enzimático ou não-enzimático, redutivo ou hidrolítico, objetivando revelar o grupo aniônico. Esse éster pode ser cíclico, por exemplo, um sulfato ou sulfona cíclica, ou duas ou mais porções aniônicas podem ser esterificadas através de um grupo de ligação. Um grupo aniônico pode ser esterificado com porções (por exemplo, acilóxi metil ésteres) que são clivados de modo a revelar um composto de modulação TGR5 intermediário que se decompõe subsequentemente para produzir o composto de modulação TGR5 ativo. Em uma modalidade, o pró- fármaco é uma forma reduzida de um carboxilato, sulfato ou sulfonato, por exemplo, um álcool ou tiol, que é oxidado in vivo ao composto de modulação TGR5. Além disso, uma porção aniônica pode ser esterificada em um grupo que seja ativamente transportado in vivo, ou que seja seletivamente recolhido por órgãos alvo.
[00122] Conforme o uso em questão, o termo “conjugados de aminoácidos” se refere a conjugados dos compostos da invenção com qualquer aminoácido adequado. A taurina (NH(CH2)2SO3H) e a glicina (NHCH2CO2H) são exemplos de conjugados de aminoácidos. Os conjugados de aminoácidos adequados dos compostos apresentam a vantagem adicional de integridade acentuada em fluidos biliáticos ou intestinais. Os aminoácidos adequados não se limitam a taurina e glicina. A invenção abrange conjugados de aminoácidos dos compostos da invenção. De modo mais específico, a invenção inclui conjugados de aminoácidos do composto Ih3e. De modo ainda mais específico, a invenção inclui conjugados de taurina e glicina do composto Ih3e.
[00123] O termo “compostos da invenção” se refere a compostos tendo as fórmulas aqui descritas.
[00124] O termo “modulador TGR5” significa qualquer composto que interaja com o receptor TGR5. A interação não se limita a um composto que age como um antagonista, agonista, agonista parcial, ou agonista inverso do receptor TGR5. Em um aspecto, os compostos da presente invenção agem como um antagonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção agem como um agonista do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção agem como um agonista parcial do receptor TGR5. Em outro aspecto, os compostos da presente invenção agem como um agonista inverso do receptor TGR5. O perfil de um ligante, tradicionalmente, endógeno ou sintético, é caracterizado por sua eficácia intrínseca ‘e’ originalmente descrito por Furchgott em 1966. O mesmo é usado para expressar o grau ao qual os diferentes ligantes produzem respostas biológicas variantes enquanto ocupam o mesmo número de receptores. Em geral, o termo “agonista” significa um composto que aumenta a atividade de outra molécula ou sítio de receptor. Um agonista, por definição clássica, seja ortostérico, alostérico, inverso ou um co-agonista tem uma propriedade de se ligar ao receptor, alterar seu estado e resultado receptor em uma ação biológica. Consequentemente, o agonismo é definido como uma propriedade de um agonista ou um ligante para produzir uma ação biológica. Em contrapartida, um “antagonista” é essencialmente um agonista com alta afinidade à mesma macromolécula receptora, porém, com eficácia muito menor ou insignificantemente intrínseca, e, portanto, evita estericamente as ações biológicas de um agonista. Como uma propriedade, o antagonismo pode ser funcional ou fisiológico, onde um agonista tem uma competição direta ao sítio de receptor em efeitos anteriores e opostos através de um sistema diferente de receptor-mensageiro nos últimos. De modo mais específico, um agonista TGR5 é um ligante ou composto receptor que se liga ao TGR5 e aumenta a concentração de monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) em pelo menos 20% em células que expressam o receptor.” Em contrapartida, um antagonista TGR5 seria um composto que antagoniza ou bloqueia a atividade de um agonista, realizando, assim, uma redução na concentração de cAMP
[00125] A presente invenção se refere a compostos tendo um receptor TGR5 que modula a atividade e sei uso para tratar e/ou prevenir doenças que incluem doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças hepáticas, doenças auto-imunes, doenças cardíacas, doenças renais, cânceres, e doenças gastrointestinais Além disso, a presente invenção se refere a compostos das fórmulas aqui descritas.
COMPOSTOS E COMPOSIÇÕES
[00126] Em um aspecto, a invenção se refere a um composto de fórmula A:
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(A) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidrogênio, hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída, ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída, ou hidróxi; R8 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída; R9 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída ou tomado juntamente com R8 e R9 forma uma carbonila; R10 é R3 ou SO3H; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Em um aspecto, quando R5 for metila, R1 é hidroxila, e quando R3 for hidroxila ou NHCH2CH2SO3H, então, R4 não é hidrogênio.
[00127] Em um aspecto da invenção, RI é hidrogênio ou hidróxi. RI é hidróxi. RI é hidrogênio. R2 é a-hidróxi. RI é hidróxi e R2 é a- hidróxi. RI é hidróxi e R2 é H. RI é hidróxi e R2 é H. Pelo menos um entre R1 ou R2 é hidróxi. Pelo menos um entre R1 ou R2 é hidrogênio. RI e R2 são iguais. RI e R2 são a-hidróxi. RI e R2 são hidrogênio.
[00128] Em outro aspecto da invenção, R10 é R3. R3 é hidroxila, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H. R3 é hidroxila. R3 não é hidroxila. R3 é NH(CH2)mSO3H. R3 é NH(CH2)mSO3H e m é igual a 2. R3 é NH(CH2)nCO2H. R3 é NH(CH2)nCO2H e n é igual a 1.
[00129] Em outro aspecto da invenção, R4 é hidrogênio ou alquila não-substituída. R4 é hidrogênio. R4 é alquila não-substituída. R4 é alquila não-substituída. R4 é metila ou etila. R4 é metila. R4 é etila. R3 e R4 são iguais. R3 e R4 são diferentes. R3 e R4 são hidrogênio. R3 é hidroxila e R4 é hidrogênio. R3 é NH(CH2)mSO3H e R4 é hidrogênio. R3 é NH(CH2)mSO3H, R4 é hidrogênio, e m é igual a 2. R3 é NH(CH2)nCO2H e R4 é hidrogênio. R3 é NH(CH2)nCO2H, R4 é hidrogênio, e n é igual a 1. R3 é H e R4 é alquila não-substituída. R3 é OH e R4 é metila. R3 é OH e R4 é etila. R3 é OH e R4 é metila.
[00130] Em outro aspecto, R5 é alquila não-substituída ou substituída. R5 se encontra na configuração S. R5 se encontra na configuração R. R5 é metila ou etila. R5 é S-metila. R5 é R-metila. R5 é S-etila. R5 é R-etila. R5 é alquila substituída por fenila. R5 é benzila. R5 é S-benzila. R5 é R-benzila. R5 é arila. R5 é fenila. R4 e R5 são alquila não-substituída. R4 e R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S e R4 se encontra na configuração alfa. R4 e R5 são alquila não-substituída e R1 é hidróxi. R4 e R5 são alquila não- substituída e R2 é hidrogênio. R4 e R5 são alquila não-substituída, R1 é hidróxi, e R2 é hidrogênio.
[00131] Em um aspecto da invenção, R1, R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2 e R3 são hidrogênio. Pelo menos um entre R1, R2, R3, ou R4 é hidrogênio. Pelo menos dois entre R1, R2, R3, ou R4 são hidrogênio. Pelo menos três entre R1, R2, R3, ou R4 são hidrogênio. Pelo menos quatro entre R1, R2, R3, ou R4 são hidrogênio.
[00132] Em um aspecto da invenção, R1, R2, e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 é hidrogênio e R3 é OH. Pelo menos um entre R1, R2, ou R4 é hidrogênio e R3 é OH. Pelo menos dois entre R1, R2, ou R4 são hidrogênio e R3 é OH. R1, R2 e R4 são hidrogênio e R3 é OH.
[00133] Em outro aspecto da invenção, pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é metila. Pelo menos um entre R1 ou R7 é etila. Pelo menos um entre R1 ou R7 é propila. R1 é metila. R1 é etila. R1 é propila. R7 é metila. R7 é etila. R7 é propila. Tanto R1 como R7 são alquila não-substituída. Tanto R1 como R7 são metila. Tanto R1 como R7 são etila. R7 é hidrogênio. R7 é hidróxi. R1 é hidrogênio. R1 é hidroxila. Um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre R1 ou R7 é hidrogênio. Um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre R1 ou R7 é hidróxi. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não- substituída ou substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é metila e R5 é metila. R7 é hidróxi e tanto R1 como R5 são alquila não-substituída. R1 é hidroxila e tanto R7 como R5 são alquila não-substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não- substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração R.
[00134] Em outro aspecto, R1 é hidróxi e R7 é metila. R1 é metila e R7 é hidróxi.
[00135] R6 é alquila não-substituída. R6 é metila. R6 é etila. R6 é propila.
[00136] Em outro aspecto, R8 é hidrogênio. R8 é alquila não- substituída. R8 é metila. R8 é etila. R8 é propila. R2 é a-hidróxi e R8 é alquila não-substituída. Em outro aspecto, R8 e R9 formam uma carbonila.
[00137] Em um aspecto, R10 é R3. R3 é hidroxila. Pelo menos um entre R8 ou R9 é hidrogênio. R8 e R9 são hidrogênio. Pelo menos um entre R8 ou R9 é alquila não-substituída. Pelo menos um entre R8 ou R9 é metila. Pelo menos um entre R8 ou R9 é etila. Em outro aspecto, R10 é SO3H.
[00138] Em outro aspecto da presente invenção, quando R2, R4 e R6 forem hidrogênio, R3 for hidroxila, e um entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, o outro entre R1 ou R7 não é metila. Em outro aspecto, quando R2 for a-OH; R3 é hidroxila; R4 e R6 forem hidrogênio; e um entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, o outro entre R1 ou R7 não é metila. Em outro aspecto, a presente invenção não inclui os compostos a seguir: ácido 3α,7α-diidr0xi-7β-metil-5β-colan0ico, ácido 3a,7|3-diidróxi-7a-metil-5|3-colanóico, ácido 3a-hidróxi-7s-metil- 5β-colanóico, ácido 3α,7β ,12a-triidróxi-7a-metil-5|3-colan-24-óico; ácido 3a,7a,12a-triidróxi-73-metil-53-colan-24-óico; e ácido 3a,12a- diidr0xi-7ε-metil-5β-colan-24-0ico.
[00139] Em outro aspecto da presente invenção, quando R3 for hidroxila e um entre R1 e R7 for metila e o outro entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, R2, R4 e R6 não são todos hidrogênio. Em outro aspecto, quando R2 for α-OH, R3 é hidroxila, e quando um entre R1 e R7 for metila e o outro entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, R4 e R6 não são todos hidrogênio.
[00140] De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona um composto de fórmula I:
Figure img0007
(I) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R4 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída, ou halogênio; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Em um aspecto, quando R5 for metila, R1 é hidroxila, e R3 for hidroxila ou NHCH2CH2SO3H, então R4 não é hidrogênio.
[00141] Em um aspecto, a presente invenção proporciona compostos onde R1 é hidrogênio ou hidróxi. R1 é hidróxi. R1 é hidrogênio. RI é a-hidróxi. RI é β-hidróxi.
[00142] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona compostos onde RI é halogênio. RI é flúor. RI é a-flúor. RI é β -flúor. A estereoquímica de RI nas configurações a e β é mostrada abaixo:
Figure img0008
[00143] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona compostos onde R2 é a-hidróxi. R2 é hidrogênio. Ri é β-hidróxi e R2 é a-hidróxi. Ri é β-hidr0xi e R2 é H. Ri é a-hidróxi e R2 é H.
[00144] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona compostos onde pelo menos um entre Ri ou R2 é hidróxi. Em outro aspecto, pelo menos um entre Ri ou R2 é hidrogênio. Ri e R2 são iguais. Ri e R2 são a-hidróxi. Ri e R2 são hidrogênio.
[00i45] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona compostos onde R3 é hidrogênio, hidroxila, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H. R3 é hidroxila. R3 não é hidroxila. R3 é NH(CH2)mSO3H. Em outro aspecto, R3 é NH(CH2)mSO3H e m é igual a 2. R3 é NH(CH2)nCO2H. Em outro aspecto, R3 é NH(CH2)nCO2H e n é igual a i.
[00146] Em outro aspecto, R4 é hidrogênio ou alquila. R4 é hidrogênio. R4 é alquil inferior. R4 é alquil inferior e o grupo de alquil inferior se encontra na configuração alfa. R4 na configuração alga significa que R4 tem a estereoquímica mostrada na estrutura abaixo.
Figure img0009
[00147] Em outro aspecto, R4 é halogênio. R4 é flúor. R4 é halogênio e o halogênio se encontra na configuração alfa. R4 é a-flúor.
[00148] Em outro aspecto, R4 é metila ou etila. R4 é metila. R4 é etila. R4 é α-metila. R4 é α-etila. R3 e R4 são iguais. R3 e R4 são diferentes. R3 e R4 são hidrogênio. R3 é NH(CH2)mSO3H e R4 é hidrogênio. R3 é hidroxila e R4 é hidrogênio. Em outro aspecto, R3 é NH(CH2)mSO3H, R4 é hidrogênio e m é igual a 2. R3 é NH(CH2)nCO2H e R4 é hidrogênio. Em outro aspecto, R3 é NH(CH2)nCO2H, R4 é hidrogênio e n é igual a 1.
[00149] Em outro aspecto, R3 é OH e R4 é alquila. R3 é OH e R4 é alquil inferior. O alquil inferior se encontra na configuração alfa. R3 é OH e R4 é metila. R3 é OH e R4 é etila. R3 é OH e R4 é α-metila. R3 é OH e R4 é α-etila.
[00150] Em outro aspecto, R5 é alquila não-substituída ou substituída. R5 é alquil inferior não-substituído ou substituído. R5 se encontra na configuração S. R5 se encontra na configuração R. R5 é metila ou etila. R5 é S-metila. R-metila. R5 é S-etila. R-etila. R5 é alquil substituído por fenila. R5 é alquil inferior substituído por fenila. R5 é benzila. R5 é S-benzila. R5 é R-benzila.
[00151] Em outro aspecto, R5 é arila. R5 é fenila.
[00152] Em outro aspecto, R4 e R5 são alquila não-substituída. R4 e R5 são alquil inferior não-substituído. R4 e R5 são alquil inferior não- substituído e R5 se encontra na configuração S. R4 e R5 são alquil inferior não-substituído e R4 se encontra na configuração alfa. Em outro aspecto, R4 e R5 não são hidrogênio.
[00153] Em outro aspecto, R4 e R5 são alquil inferior não-substituído e Ri é a-hidróxi. R4 e R5 são alquil inferior não-substituído e R2 é hidrogênio. R4 e R5 são alquil inferior não-substituído, Ri é a-hidróxi, e R2 é hidrogênio.
[00i54] Em outro aspecto, R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos. R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel com 3 membros. O anel com 3 membros tem a estereoquímica a seguir:
Figure img0010
[00155] O anel com 3 membros tem a estereoquímica a seguir:
Figure img0011
[00156] Em outro aspecto, R1, R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2 e R3 são hidrogênio. Em outro aspecto, R1, R2, e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 é hidrogênio e R3 é OH.
[00157] Em outro aspecto, pelo menos um entre R1, R2, R3, ou R4 é hidrogênio. Em outro aspecto, pelo menos dois entre R1, R2, R3, ou R4 são hidrogênio. Em outro aspecto, pelo menos três entre R1, R2, R3, ou R4 são hidrogênio. Em outro aspecto, R1, R2, R3, e R4 são hidrogênio. Em outro aspecto, pelo menos um entre R1, R2, ou R4 é hidrogênio e R3 é OH. Em outro aspecto, pelo menos dois entre R1, R2, ou R4 são hidrogênio e R3 é OH. Em outro aspecto, R1, R2, e R4 são hidrogênio e R3 é OH. Em outro aspecto, a presente invenção não se aplica quando R5 for metila, R4 for hidrogênio, e R2 for H ou OH.
[00158] Em outro aspecto da presente invenção, o composto é selecionado a partir dos Compostos Ia, Ib, Ic, Ig, Ih, Ii, Io, Ip, Iq, Ia1, Ib1, Ic1, Ig1, Ih1, Iil, Il1, Im1, In1, Io1, Ip1, Iq1, Ia2, Ib2, Ic2, Id2, Ie2, If2, Ig2, Ih2, Ii2, Il2, Im2, In2, Io2, Ip2, Iq2, Ia3, Ib3, Ic3, Id3, Ie3, If3, Ig3, Ih3, Ii3, Il3, Im3, In3, Ia4, Ib4, Ic4, Id4, Ie4, If4, Ig4, Ih4, Ii4, Il4, Im4, In4, Ia5, Ib5, Ic5, Id5, Ie5, If5, Ig5, Ih5, Ii5, Il5, Im5, In5, Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e,Ig3e, Ih3e, Ii3e, Il3e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, Il4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, Il5e, Im5e, Io5, Ip5, Iq5, e Ir5.
[00159] Em outro aspecto da presente invenção, o composto não é selecionado a partir dos Compostos Id, Ie, If, Id1, Il, Im, e In. Em outro aspecto, o composto não é selecionado a partir de Iel e If1.
[00160] Outro aspecto da presente invenção inclui uma composição ou medicamento que compreende um composto de fórmula I:
Figure img0012
mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, sendo que Ri é hidrogênio, hidróxi, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a- hidróxi; R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R4 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída, ou halogênio; R5 é alquil inferior não-substituído ou substituído, ou arila; R6 é hidrogênio ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Em outro aspecto, a presente invenção inclui uma composição ou medicamento que compreende um composto de fórmula I com a condição de que quando R5 for metila, R1 for hidroxila, e R3 for hidróxi ou NHCH2CH2SO3H, então, R4 não é hidrogênio.
[00161] Outro aspecto da invenção inclui compostos de Formula IA:
Figure img0013
hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidróxi, hidrogênio, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída, ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída, ou hidróxi; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Em um aspecto, quando R5 é metila, R1 é hidroxila, e R3 é hidróxi ou NHCH2CH2SO3H, então, R4 não é hidrogênio.
[00162] Em um aspecto, R1 é hidrogênio ou hidróxi. R1 é hidróxi. R1 é hidrogênio. R1 é hidróxi e R2 é a-hidróxi. R1 é hidróxi e R2 é H. R1 é hidróxi e R2 é H. Pelo menos um entre R1 ou R2 é hidróxi. Pelo menos um entre R1 ou R2 é hidrogênio. R1 e R2 são iguais. R1 é hidroxila e R2 é a-hidróxi. R1 e R2 são hidrogênio.
[00163] Em um aspecto, R3 é hidrogênio, hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H. R3 é hidróxi. R3 não é hidróxi. NH(CH2)mSO3H. R3 é NH(CH2)mSO3H e m é igual a 2. NH(CH2)nCO2H. R3 é NH(CH2)nCO2H e n é igual a 1.
[00164] Em outro aspecto, R4 é hidrogênio ou alquila substituída. R4 é hidrogênio. R4 é alquila não-substituída. R4 é alquila não-substituída. R4 é metila ou etila. R4 é metila. R4 é etila. R3 e R4 são iguais. R3 e R4 são diferentes. R3 e R4 são hidrogênio. R3 é OH e R4 é hidrogênio.
[00165] Em outro aspecto, R3 é NH(CH2)mSO3H e R4 é hidrogênio. R3 é NH(CH2)mSO3H, R4 é hidrogênio, e m é igual a 2. R3 é NH(CH2)nCO2H e R4 é hidrogênio. R3 é NH(CH2)nCO2H, R4 é hidrogênio, e n é igual a 1. R3 é OH e R4 é alquila não-substituída. R3 é OH e R4 é alquila não-substituída. R3 é OH e R4 é metila. R3 é OH e R4 é etila. R3 é OH e R4 é metila.
[00166] Em um aspecto, R5 é alquila não-substituída ou substituída. R5 se encontra na configuração S. R5 se encontra na configuração R. R5 é metila ou etila. R5 é S-metila. R5 é R-metila. R5 é S-etila. R5 é R- etila. R5 é substituído por fenila. R5 é benzila. R5 é S-benzila. R5 é R- benzila. Em outro aspecto, R5 é arila. Por exemplo, R5 é fenila.
[00167] R4 e R5 são alquila não-substituída. R4 e R5 são alquila não- substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. R4 e R5 são alquila não-substituída. R4 e R5 são alquila não-substituída e R1 é hidróxi. R4 e R5 são alquila não-substituída e R2 é hidrogênio. R4 e R5 são alquila não-substituída, R1 é hidróxi, e R2 é hidrogênio.
[00168] Em um aspecto, R1, R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2, R3, e R4 são hidrogênio. R2 e R3 são hidrogênio. Pelo menos um entre R1, R2, R3, ou R4 é hidrogênio. Pelo menos dois entre R1, R2, R3, ou R4 é hidrogênio. Pelo menos três entre R1, R2, R3, ou R4 é hidrogênio. R1, R2, R3, e R4 é hidrogênio.
[00169] Em um aspecto, R1, R2, e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 e R4 são hidrogênio e R3 é OH. R2 é hidrogênio e R3 é OH. Pelo menos um entre R1, R2, ou R4 é hidrogênio e R3 é OH. Pelo menos dois entre R1, R2, ou R4 é hidrogênio e R3 é OH. Todos entre R1, R2, e R4 são hidrogênio e R3 é OH.
[00170] Em outro aspecto, pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é metila. Pelo menos um entre R1 ou R7 é etila. Pelo menos um entre R1 ou R7 é propila. Tanto R1 como R7 são alquila não-substituída. Tanto R1 como R7 são metila. Tanto R1 como R7 são etila. R1 e R7 são iguais. R1 e R7 são diferentes. R7 é hidrogênio. R7 é hidróxi. Um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre R1 ou R7 é hidrogênio. Um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre R1 ou R7 é hidróxi. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não- substituída ou substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é metila e R5 é metila.
[00171] Tanto R1 como R5 são alquila não-substituída e R7 é hidróxi. Tanto R7 como R5 são alquila não-substituída e R1 é hidróxi. R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração R.
[00172] Em outro aspecto, R1 é hidróxi e R7 é metila. R1 é metila e R7 é hidróxi.
[00173] R6 é alquila não-substituída. R6 é metila. R6 é etila. R2, e R6 são hidrogênio. R2 e R6 são hidrogênio e R5 é alquila não-substituída. R2 e R6 são hidrogênio, R5 é alquila não-substituída, e pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída.
[00174] Em um aspecto, o composto é selecionado a partir dos Compostos Ia6, Ib6, Ic6, Ig6, Ih6, Ii6, Io6, Ip6, Iq6, Ia7, Ib7, Ic7, Ig7, Ih7, Ii7, Il7, Im7, In7, Io7, Ip7, Iq7, Ia8, Ib8, Ic8, Id8, Ie8, If8, Ig8, Ih8, Ii8, Il8, Im8, In8, Io8, Ip8, Iq8, Ia9, Ib9, Ic9, Id9, Ie9, If9, Ig9, Ih9, Ii9, Il9, Im9, In9, Ia10, Ib10, Ic10, Id10, Ie10, If10, Ig10, Ih10, Ii10, Il10, Im10, In10, Ia11, Ib11, Ic11, Id11, Ie11, If11, Ig11, Ih11, Ii11, Il11, Im11, In11, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, Il9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic10e, Id10e, Ie10e, If10e, Ig10e, Ih10e, Ii10e, Il10e, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, Ie11e, If11e, Ig11e, Ih11e, Ii11e, Il11e, Im11e, e In11e.
[00175] Em outro aspecto da presente invenção, quando R2, R4, e R6 são hidrogênio, R3 é hidroxila, e um entre R1 e R7 é hidrogênio ou hidroxila, então, o outro entre R1 ou R7 não é metila. Em outro aspecto, quando R2 é α-OH; R3 é hidroxila; R4 e R6 são hidrogênio; e um entre R1 e R7 é hidrogênio ou hidroxila, então, o outro entre R1 ou R7 não é metila. Em outro aspecto, a presente invenção não inclui os compostos a seguir: ácido 3α,7α-diidr0xi-7β-metil-5β-colanóico, ácido 3α,7β- diidr0xi-7a-metil-5β-colan0ico, ácido 3a-hidróxi-7í:-metil-5|3-colanóico, ácido 3a,7|3,12a-triidróxi-7a-metil-5|3-colan-24-óico; ácido 3α,7α,12α- triidróxi-7|3-metil-5|3-colan-24-óico; e ácido 3a,12a-diidróxi-7í:-metil-5|3- colan-24-óico.
[00176] Em outro aspecto da presente invenção, quando R3 for hidroxila e um entre R1 e R7 for metila e o outro entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, R2, R4 e R6 não são hidrogênio. Em outro aspecto, quando R2 for α-OH, R3 for hidroxila, e um entre RI e R7 for metila e o outro entre R1 e R7 for hidrogênio ou hidroxila, então, R4 e R6 não são hidrogênio.
[00177] Outro aspecto da invenção inclui uma composição ou medicamento que compreende um composto de fórmula IA:
Figure img0014
(IA), ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não- substituída ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R5 é alquila não- substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila não- substituída ou substituída, ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída, ou hidróxi; e m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5.
[00178] Em um aspecto da invenção, quando R5 é metila, R1 é hidroxila, e R3 é hidroxila ou NHCH2CH2SO3H, então, R4 não é hidrogênio.
[00179] Outro aspecto da presente invenção inclui um composto de Fórmula II:
Figure img0015
(II) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída, ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída, ou hidróxi; e R8 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída. Em um aspecto, quando R5 é metila e R1 é hidroxila, então, R4 não é hidrogênio.
[00180] Em um aspecto, R1 é hidrogênio ou hidróxi. R1 é hidróxi. R1 é hidrogênio. Ri é β-hidr0xi. R2 é a-hidróxi. Ri é hidróxi e R2 é a- hidróxi. R1 é hidróxi e R2 é H. Pelo menos um entre R1 ou R2 é hidróxi. Pelo menos um entre Ri ou R2 é hidrogênio. Ri e R2 são iguais. Ri é hidroxila e R2 é a-hidróxi. Ri e R2 são hidrogênio.
[00i8i] Em outro aspecto, R4 é hidrogênio ou alquila não- substituída. R4 é hidrogênio. R4 é alquila não-substituída. R4 é alquila não-substituída. R4 é metila ou etila. R4 é metila. R4 é etila.
[00i82] Em um aspecto, R5 é alquila não-substituída ou substituída. R5 se encontra na configuração S. R5 se encontra na configuração R. R5 é metila ou etila. R5 é S-metila. R5 é R-metila. R5 é S-etila. R5 é R- etila. R5 é substituído por fenila. R5 é benzila. R5 é S-benzila. R5 é R- benzila. R5 é arila. R5 é fenila. R4 e R5 são alquila não-substituída. R4 e R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. R4 e R5 são alquila não-substituída e Ri é hidróxi. R4 e R5 são alquila não-substituída e R2 é hidrogênio. R4 e R5 são alquila não-substituída, Ri é hidróxi e R2 é hidrogênio.
[00i83] Em um aspecto, Ri, R2, e R4 são hidrogênio. R2 e R4 são hidrogênio. R2 é hidrogênio. Pelo menos um entre Ri, R2, ou R4 é hidrogênio. Pelo menos dois entre Ri, R2, ou R4 é hidrogênio. Todos entre Ri, R2, ou R4 é hidrogênio.
[00i84] Em um aspecto, Ri ou R7 é alquila não-substituída. Ri ou R7 é metila. Ri ou R7 é etila. Ri ou R7 é propila. Tanto Ri como R7 são alquila não-substituída. R7 é hidrogênio. R7 é hidróxi. Um entre Ri ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre Ri ou R7 é hidrogênio. Um entre Ri ou R7 é alquila não-substituída e o outro entre Ri ou R7 é hidróxi. Pelo menos um entre Ri ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída. Pelo menos um entre Ri ou R7 é metila e R5 é metila. R7 é hidróxi e tanto Ri como R5 são alquila não- substituída. Ri é hidróxi e tanto R7 como R5 são alquila não- substituída. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não-substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. Pelo menos um entre R1 ou R7 é alquila não- substituída e R5 é alquila não-substituída ou substituída, sendo que R5 se encontra na configuração R. R7 é hidróxi e tanto R1 como R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. R7 é hidróxi e tanto R1 como R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração R. R1 é hidróxi e tanto R7 como R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração S. R1 é hidróxi e tanto R7 como R5 são alquila não-substituída, sendo que R5 se encontra na configuração R. R1 é hidróxi e R7 é metila. R1 é metila e R7 é hidróxi.
[00185] Em outro aspecto, R6 é alquila não-substituída. R6 é metila. R6 é etila. R8 é hidrogênio.
[00186] Rε é alquila não-substituída. Rε é metila. Rε é etila. R2 é a- hidróxi e R8 é alquila não-substituída.
[00187] Em outro aspecto da invenção, o composto é selecionado a partir dos Compostos Ia12, Ib12, Ic12, Ig12, Ih12, Ii12, Io12, Ip12, Iq12, Ia13, Ib13, Ic13, Ig13, Ih13, Ii13, Il13, Im13, In13, Io13, Ip13, Iq13, Ia14, Ib14, Ic14, Id14, Ie14, If14, Ig14, Ih14, Ii14, Il14, Im14, In14, Io14, Ip14, Iq14, Ia15, Ib15, Ic15, Id15, Ie15, If15, Ig15, Ih15, Ii15, Il15, Im15, In15, Ia16, Ib16, Ic16, Id16, Ie16, If16, Ig16, Ih16, Ii16, Il16, Im16, In16, Ia17, Ib17, Ic17, Id17, Ie17, If17, Ig17, Ih17, Ii17, Il17, Im17, In17, Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, Ii15e, Il15e, Im15e, In15e, Ia16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If16e, Ig16e, Ih16e, Ii16e, Il16e, Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, Il17e, Im17e, e In17e.
[00188] Outro aspecto da invenção inclui a composição ou medicamento que compreende um composto de fórmula II:
Figure img0016
(II), ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, alquila substituída ou não- substituída ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R4 é hidrogênio, alquila substituída ou não-substituída, ou halogênio; R5 é alquila não- substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio, alquila não- substituída ou substituída, ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila substituída ou não- substituída, ou hidróxi; e R8 é hidrogênio ou alquila substituída ou não- substituída. Em um aspecto, quando R5 é metila, R1 é hidroxila, e R3 é hidroxila ou NHCH2CH2SO3H, então, R4 não é hidrogênio.
[00189] Outro aspecto da invenção inclui um composto de acordo com a fórmula III:
Figure img0017
(III) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é hidrogênio, hidróxi, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; R7 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída ou hidróxi; R8 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída; R9 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída ou R8 e R9 tomados juntamente com o átomo de carbono ao qual os mesmos são ligados formam uma carbonila; R10 é R3 ou SO3H; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5.
[00190] Outro aspecto da invenção inclui um composto de acordo com a fórmula IIIA:
Figure img0018
[00191] Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é hidroxila. Outro aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R8 e R9 tomados juntamente com o átomo de carbono ao qual os mesmos são ligados formam uma carbonila e R10 é R3. Em um aspecto, R3 é selecionado a partir de hidróxi, NH(CH2)2SO3H, e NHCH2CO2H. Em um aspecto, R3 é hidróxi. Em um aspecto, R3 é NH(CH2)2SO3H. Em um aspecto, R3 é NHCH2CO2H. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R6 é hidrogênio. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 é alquila não-substituída. Em um aspecto, R5 é metila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S e R5 é metila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R7 é hidrogênio.
[00192] Um aspecto da invenção inclui um composto selecionado a partir dos Compostos Ig3e, Ih3e, Ii3e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, Ig5e, Ih5e, e Ii5e.
[00193] Outro aspecto da invenção inclui um composto de acordo com a fórmula IIIB:
Figure img0019
(IIIB) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R3 é hidróxi, NH(CH2)mSo3H, ou NH(CH2)nCo2H; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R8 é hidrogênio, alquila não-substituída ou substituída; R9 é hidrogênio, alquila não- substituída ou substituída ou R8 e R9 tomados juntamente com o átomo de carbono ao qual os mesmos são ligados formam uma carbonila; R10 é R3 ou SO3H; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró- fármaco dos mesmos, sendo que R5 é alquila não-substituída. Em um aspecto, R5 é metila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou sal, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S. Um aspecto da invenção inclui um composto ou sal, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S e R5 é metila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R8 e R9 tomados juntamente com o átomo de carbono ao qual os mesmos são ligados formam uma carbonila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R10 é R3. Em um aspecto, R3 é selecionado a partir de hidróxi, NH(CH2)2SO3H, e NHCH2CO2H. Em um aspecto, R3 é hidróxi. Em um aspecto, R3 é NH(CH2)2SO3H. Em um aspecto, R3 é NHCH2CO2H.
[00194] Outro aspecto da invenção inclui um composto de acordo com a fórmula IIIC:
Figure img0020
(IIIC) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R3 é selecionado a partir de hidróxi, NH(CH2)2SO3H, e NHCH2CO2H. Em um aspecto, R3 é hidróxi. Em um aspecto, R3 é NH(CH2)2SO3H. Em um aspecto, R3 é NHCH2CO2H. Um aspecto da invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 é alquila não-substituída. Em um aspecto, R5 é metila. Um aspecto da invenção inclui um composto ou sal, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S. Um aspecto da invenção inclui um composto ou sal, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S e R5 é metila.
[00195] Outro aspecto da invenção inclui um composto de acordo com a fórmula IV:
Figure img0021
(IV) ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que: R1 é hidrogênio, hidróxi, ou halogênio; R2 é hidrogênio ou a-hidróxi; R3 é hidróxi, NH(CH2)mSO3H, ou NH(CH2)nCO2H; R5 é alquila não-substituída ou substituída, ou arila; R6 é hidrogênio ou R5 e R6 tomados juntamente com os átomos de carbono aos quais estes se ligam formam um anel tendo 3, 4, 5, ou 6 átomos; m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e
[00196] n é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, ou 5.
[00197] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é hidróxi. Em outro aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é alfa hidróxi. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é beta hidróxi. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R1 é metila.
[00198] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 é alquila não-substituída. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 é metila. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração R. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R5 se encontra na configuração S.
[00199] Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R6 é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R2 é hidrogênio. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R2 é alfa hidróxi. Em um aspecto, a invenção inclui um composto ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos, sendo que R3 é hidroxila.
[00200] Um aspecto da invenção inclui um composto selecionado a partir dos Compostos Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e,Ig3e, Ih3e, Ii3e, Il3e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, Il4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, Il5e, Im5e, In5e, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, Il9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic10e, Id10e, Ie10e, If10e, Ig10e, Ih10e, Ii10e, Il10e, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, Ie11e, If11e, Ig11e, Ih11e, Ii11e, Il11e, Im11e, In11e, Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, Ii15e, Il15e, Im15e, In15e, Ia16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If16e, Ig16e, Ih16e, Ii16e, Il16e, Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, Il17e, Im17e, e In17e.
[00201] A invenção inclui o Composto Ih3e:
Figure img0022
, ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos. Em um aspecto, a invenção inclui o conjugado de taurina do Composto Ih3e:
Figure img0023
ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos. Em um aspecto, inclui o conjugado de glicina do Composto Ih3e:
Figure img0024
ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos. Em um aspecto, inclui o conjugado de glicina do Composto Ih3e: ou pró-fármaco dos mesmos.
[00202] Um aspecto da invenção inclui os Compostos Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e,Ig3e, Ih3e, Ii3e, Il3e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, Il4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, Il5e, Im5e, e In5e.
[00203] Um aspecto da invenção inclui os Compostos Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, Il9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic10e, Id10e, Ie10e, If10e, Ig10e, Ih10e, Ii10e, Il10e, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, Ie11e, If11e, Ig11e, Ih11e, Ii11e, Il11e, Im11e, e In11e.
[00204] Um aspecto da invenção inclui os Compostos Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, Ii15e, Il15e, Im15e, In15e, Ia16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If16e, Ig16e, Ih16e, Ii16e, Il16e, Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, Il17e, Im17e, e In17e.
[00205] Em um aspecto, a invenção inclui um composto da invenção, sendo que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.
[00206] Um aspecto da invenção inclui uma composição que compreende um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00207] A presente invenção inclui, também, compostos radiomarcados da invenção. Os compostos radiomarcados podem ser preparados utilizando-se técnicas convencionais. Por exemplo, os compostos radiomarcados da invenção podem ser preparados reagindo-se o composto da invenção com gás trítio na presença de um catalisador apropriado para produzir compostos radiomarcados tendo as fórmulas descritas no presente documento. Em uma modalidade, os compostos da invenção são tritiados. Uso e Métodos
[00208] A invenção inclui o uso de um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, hidrato, ou um pró-fármaco dos mesmos, na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção de doenças em um indivíduo. A invenção também inclui um método de tratamento ou prevenção de doenças em um indivíduo administrando-se um composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos.
[00209] Um aspecto da invenção inclui o uso ou método, sendo que a doença é selecionada a partir de doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças hepáticas, doenças auto-imunes, doenças cardíacas, doenças renais, cânceres, e doenças gastrointestinais.
[00210] Em um aspecto, a invenção inclui uma doença metabólica selecionada a partir de obesidade, diabetes, diabesidade, síndrome metabólica, resistência à insulina, que inclui resistência à insulina pré- diabética, hipertensão, e dislipidemia. Em um aspecto, a doença metabólica é a obesidade. Em outro aspecto, a doença metabólica é o diabetes. Em um aspecto, o diabetes é selecionado a partir de pré- diabetes e diabetes tipo II. Em um aspecto, a doença metabólica é a síndrome metabólica. Em um aspecto, a doença metabólica é a resistência à insulina. Em um aspecto, a doença metabólica é a dislipidemia. Em um aspecto, a doença metabólica é a diabesidade. O termo “diabesidade” se refere a uma condição onde o indivíduo tem tanto diabetes como peso em excesso.
[00211] Em um aspecto, a invenção inclui uma doença inflamatória selecionada a partir de alergia, osteoartrite (OA), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), apendicite, asma bronquial, pancreatite, brotoeja alérgica, e psoríase.
[00212] Em um aspecto, a invenção inclui uma doença auto-imune selecionada a partir de artrite reumatóide, esclerose múltipla, e diabetes tipo I.
[00213] Em um aspecto, a invenção inclui uma doença gastrointestinal selecionada a partir de doença inflamatória intestinal (doença de Crohn, colite ulcerativa), síndrome do intestino curto (colite pós-radiação), colite microscópica, síndrome do intestino irritável (malabsorção), e sobrecrescimento bacteriano.
[00214] Em um aspecto, a invenção inclui doenças renais selecionadas a partir de nefropatia diabética, falha renal crônica, nefrite glomerular, nefosclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, glomerulopatia crônica do transplante, nefrite intersticial crônica, e doença nefrológica policística.
[00215] Em um aspecto, a invenção inclui cânceres selecionados a partir de câncer colorretal, câncer de fígado, carcinoma heptacelular, colangiocarcinoma, câncer renal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer na próstata, e insulanoma.
[00216] Em um aspecto, a invenção inclui doenças hepáticas selecionadas a partir de esteato-hepatite não-alcoólica, doença hepática gordurosa não-alcoólica, hepatite viral crônica, doença hepática alcoólica, hepatite induzido por fármacos, hemocromatose, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, hipertensão portal, dessaturação biliar, doença de Gaucher, doença de Wilson, deficiência αl-antitripsina, nutrição parenteral total (TPN), colelitíase, colelitíase associada a TPN e sepse.
[00217] Em um aspecto, a invenção inclui a doença auto-imune eritematosa.
[00218] Em um aspecto, a invenção inclui doenças cardíacas selecionadas a partir de falha cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, aterosclerose, angina peitoral, arteriosclerose e doença cerebrovascular (hemorragia, derrame, infarto cerebrovascular).
[00219] Em um aspecto, a invenção inclui um uso ou método, sendo que o composto da invenção é um agonista TGR5. Em um aspecto, a razão de seletividade entre TGR5 EC50 e FXR EC50 é menor que 0,05.
[00220] Em um aspecto, a invenção inclui um uso ou método, sendo que o composto ou composição é administrado ao indivíduo por via oral, parental, intravenosa, ou tópica. Em um aspecto, o indivíduo é um ser humano.
[00221] Um aspecto da invenção inclui um uso ou método que compreende administrar em um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto da invenção. Em um aspecto, a invenção inclui um uso ou método que compreende administrar em um indivíduo em necessidade do mesmo. A presente invenção inclui um uso ou método que compreende administrar em um indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz do composto da invenção.
[00222] Os compostos e composições da presente invenção podem ser administrados através de várias rotas, por exemplo, oral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, ou intraperitoneal. As rotas referidas de administração de composições farmacêuticas são oral, subcutânea, e intravenosa em doses diárias de cerca de 0,01 a 5000 mg, de preferência, 5 a 500 mg, do ligante FXR para um adulto de 70 kg por dia. A dose apropriada pode ser administrada em uma dose diária única ou como doses divididas apresentadas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro, ou mais subdoses por dia.
[00223] Para preparação de composições farmacêuticas contendo um composto da invenção, utilizam-se carreadores farmaceuticamente inertes e aceitáveis. O carreador farmacêutico pode ser sólido ou líquido. As preparações na forma sólida incluem, por exemplo, pós, tabletes, grânulos dispersíveis, cápsulas, comprimidos, e supositórios. Um carreador sólido pode ser uma ou mais substâncias que também possam agir como diluentes, agentes atomatizantes, solubilizadores, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes, ou agentes de desintegração de tabletes; as mesmas também podem ser um material de encapsulação.
[00224] Em pós, o carreador é genericamente um sólido finamente dividido que se encontra em uma mistura com o componente ativo finamente dividido, por exemplo, um composto da invenção. Em tabletes, o ingrediente ativo é misturado com o carreador tendo as propriedades aglutinantes necessárias em proporções adequadas e compactados no formato e tamanho desejados.
[00225] Para preparação de composições farmacêuticas sob a forma de supositórios, uma cera com baixo ponto de fusão, tal como uma mistura de glicerídeos de ácido graxo e manteiga de cacau é primeiramente derretida e o ingrediente ativo é disperso na mesma, por exemplo, através de agitação. A mistura homogênea derretida é, então, despejada em moldes com dimensões convenientes e deixada resfriar e solidificar.
[00226] Os pós e tabletes contêm, de preferência, entre cerca de 5% a cerca de 70%, em peso, do ingrediente ativo do composto da invenção. Os carreadores adequados incluem, por exemplo, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, lactose, açúcar, pectina, dextrina, amido, tragacanto, metil celulose, sódio carbóxi metil celulose, uma cera com baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, e similares.
[00227] As composições farmacêuticas podem incluir a formulação do composto ativo com o material de encapsulação como um carreador que proporciona uma cápsula na qual o composto da invenção (com ou sem outros carreadores) é circundado pelo carreador, de tal modo que o carreador esteja em associação com o composto. De modo semelhante, as pílulas também podem ser incluídas. Os tabletes, pós, pílulas, e cápsulas podem ser usados como formas de dosagem sólida para administração oral.
[00228] As composições farmacêuticas líquidas incluem, por exemplo, soluções adequadas para administração oral ou parenteral, suspensões, e emulsões adequadas para administração oral. As soluções de água esterilizada do componente ativo ou as soluções estéreis do componente ativo em solventes que compreendem água, água tamponada, solução salina, PBS, etanol, ou propileno glicol são exemplos de composições líquidas adequadas para administração parenteral. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme necessário para condições fisiológicas aproximadas, tal como agentes de ajuste e tamponamento de pH, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, detergentes, e similares.
[00229] As soluções estéreis podem ser preparadas dissolvendo-se o componente ativo (por exemplo, um composto da invenção) no sistema de solvente desejado, e, então, passar a solução resultante através de um filtro de membrana para esterilizá-lo ou, alternativamente, dissolvendo-se o composto estéril em um solvente previamente esterilizado sob condições estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso, ou liofilizada, sendo que a preparação liofilizada é combinada a um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações serão, tipicamente, entre 3 e 11, com mais preferência, de 5 a 9, e, com a máxima preferência, 7 e 8.
[00230] As composições farmacêuticas contendo os compostos da invenção podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas em uma quantidade suficiente para curar, reverter, ou pelo menos parcialmente desacelerar ou conter os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para curar, reverter, ou pelo menos parcialmente desacelerar ou conter o sintoma da doença e suas complicações é definida como uma “dose terapeuticamente eficaz.” Em aplicações profiláticas, as composições são administradas em uma quantidade suficiente para prevenir os sintomas da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para prevenir o sintoma da doença e suas complicações é definida como uma “dose profilaticamente eficaz.”
[00231] As quantidades eficazes para uso terapêutico dependerão da gravidade da doença ou da condição e peso e estado geral do paciente, porém, variam genericamente de cerca de 0,1 mg a cerca de 2.000 mg do composto por dia para um paciente de 70 kg, com dosagens de cerca de 5 mg a cerca de 500 mg do composto por dia para um paciente de 70 kg sendo mais comumente usadas.
[00232] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas contendo os compostos da invenção são administradas a um paciente susceptível ou, de outro modo, em tendo risco de desenvolver doenças, em uma quantidade suficiente para retardar ou prevenir o princípio dos sintomas da doença. Essa quantidade é definida como sendo uma “dose profilaticamente eficaz.” Neste uso, as quantidades precisas do composto novamente dependem do estado de saúde e do peso do paciente, porém, variam genericamente de cerca de 0,1 mg a cerca de 2.000 mg para um paciente de 70 kg por dia, mais comumente, de cerca de 5 mg a cerca de 500 mg para um paciente de 70 kg por dia.
[00233] As administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com níveis de dosagem e padrão sendo selecionados pelo médico terapeuta. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade de um composto da invenção suficiente para tratar ou prevenir eficazmente a doença no paciente.
[00234] A invenção também proporciona kits para prevenção ou tratamento de doenças de acordo com o uso e método da presente invenção. Em um aspecto, a invenção inclui um kit para tratar ou prevenir doenças em um indivíduo, sendo que o kit compreende um composto da invenção ou um sal, solvato, hidrato, ou pró-fármaco dos mesmos. Tipicamente, os kits incluem uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz de um composto da invenção, assim como instruções contendo materiais informacionais de como dispensar a composição farmacêutica, incluindo a descrição do tipo de pacientes que podem ser tratados, a programação (por exemplo, dose e frequência) e a rota de administração, e similares.
[00235] Alguns compostos representativos compostos da invenção são mostrados abaixo.
[00236] Os compostos a seguir Ia-Ir5 pertencem pelo menos à fórmula I:
[00237] Ia: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00238] Ib: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00239] Ic: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00240] Id: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[0024i] Ie: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00242] If: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00243] Ig: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00244] Ih: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00245] Ii: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00246] Il: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00247] Im: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00248] In: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00249] Io: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00250] Ip: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[0025i] Iq: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00252] Iai: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00253] Ibi: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00254] Ic1: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00255] Idl: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00256] Ie1: R1 = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00257] Ifl: Ri = βdOH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00258] Igi: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00259] Ihi: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00260] Iii: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[0026i] Ili: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00262] Imi: Ri = β-OH, R2=αα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00263] Ini: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00264] Ioi: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00265] Ipi: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00266] Iqi: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00267] Ia2: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00268] Ib2: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00269] Ic2: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00270] Id2: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[0027i] Ie2: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00272] If2: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00273] Ig2: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00274] Ih2: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00275] Ii2: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00276] Il2: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00277] Im2: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[00278] In2: Ri = β-OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00279] Io2: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00280] Ip2: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H
[0028i] Iq2: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H
[00282] Ia3: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00283] Ib3: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00284] Ic3: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00285] Id3: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00286] Ie3: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00287] If3: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00288] Ig3: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00289] Ih3: Ri = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00290] Ii3: Ri = α-OH, R2=0 α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[0029i] Il3: Ri = β-OH, R2=Q α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00292] Im3: Ri = β-OH, R2=Q α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00293] In3: Ri = β-OH, R2=Q α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00294] Ia4: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00295] Ib4: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00296] Ic4: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00297] Id4: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00298] Ie4: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00299] If4: Ri = βdOH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00300] Ig4: Ri = α-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00301] Ih4: Ri = α-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00302] Ii4: Ri = α-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00303] Il4: Ri = β-OH, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00304] Im4: Ri = β-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00305] In4: Ri = β-OH, R2= Qα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00306] Ia5: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00307] Ib5: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00308] Ic5: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00309] Id5: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[003i0] Ie5: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[003ii] If5: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00312] Ig5: Ri = α-OH, R2=0 α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00313] Ih5: Ri = α-OH, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00314] Ii5: Ri = α-OH, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00315] Il5: R1 = β-OH, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00316] Im5: R1 = β-OH, R2=0 α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H
[00317] In5: R1 = β-OH, R2=0α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H
[00318] Ib3e: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00319] Ic3e: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00320] Id3e: R1 = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00321] Ie3e: R1 = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00322] If3e: R1 = β-OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00323] Ig3e: R1 = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00324] Ih3e: R1 = α-OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00325] Ii3e: R1 = α-OH, R2=Q α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00326] Il3e: R1 = β-OH, R2=Q α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00327] Im3e: Ri = β-OH, R2= □ α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00328] In3e: Ri = β-OH, R2=d α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00329] Ia4e: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00330] Ib4e: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00331] Ic4e: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00332] Id4e: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00333] Ie4e: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00334] If4e: Ri = βQOH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00335] Ig4e: Ri = α-OH, R2=Q α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00336] Ih4e: Ri = α-OH, R2=Q α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00337] Ii4e: Ri = α-OH, R2= Qα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00338] Il4e: Ri = β-OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00339] Im4e: Ri = β-OH, R2= □α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00340] In4e: Ri = β-OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00341] Ia5e: Ri = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00342] Ib5e: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00343] Ic5e: R1 = α-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00344] Id5e: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00345] Ie5e: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00346] If5e: Ri = β-OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00347] Ig5e: Ri = α-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[00348] Ih5e: Ri = α-OH, R2= Qα-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00349] Ii5e: Ri = α-OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
[00350] Il5e: Ri = β-OH, R2=Q α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H
[0035i] Im5e: Ri = β-OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H
[00352] In5e: Ri = β-OH, R2= Qα-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H
Figure img0025
Figure img0026
[00353] Os compostos a seguir In6-In11e pertencem pelo menos à fórmula IA:
[00354] Ia6: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=Me
[00355] Ib6: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00356] Ic6: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00357] Id6: R1 = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00358] Ie6: R1 = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00359] If6: R1 = Me R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00360] Ig6: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[0036i] Ih6: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00362] Ii6: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00363] Il6: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, Re = H, R7=OH
[00364] Im6: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00365] In6: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00366] Io6: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00367] Ip6: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00368] Iq6: Ri = H, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00369] Ia7: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00370] Ib7: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[0037i] Ic7: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00372] Id7: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00373] Ie7: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00374] If7: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00375] Ig7: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00376] Ih7: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00377] Ii7: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00378] Il7: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00379] Im7: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00380] In7: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[0038i] Io7: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00382] Ip7: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00383] Iq7: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00384] Ia8: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00385] Ib8: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00386] Ic8: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00387] Id8: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00388] Ie8: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00389] If8: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00390] Ig8: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[0039i] Ih8: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00392] Ii8: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00393] Il8: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00394] Im8: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00395] In8: Ri = Me, R2 = α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00396] Io8: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00397] Ip8: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00398] Iq8: Ri = H, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00399] Ia9: Ri = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00400] Ib9: Ri = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[0040i] Ic9: Ri = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00402] Id9: Ri = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00403] Ie9: Ri = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00404] If9: Ri = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00405] Ig9: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00406] Ih9: Ri = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00407] Ii9: Ri = OH, R2=α α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00408] Il9: Ri = Me, R2=D α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00409] Im9: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00410] In9: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[004ii] Iai0: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[004i2] Ibi0: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[004i3] Ici0: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[004i4] Idi0: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[004i5] Iei0: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[004i6] Ifi0: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00417] Ig10: Ri = OH, R2= □α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00418] Ih10: Ri = OH, R2=Q α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00419] Ii10: Ri = OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00420] Il10: Ri = Me, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00421] Im10: Ri = Me, R2= □α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00422] In10: Ri = Me, R2=π α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00423] Ia11: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00424] Ib11: R1 = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00425] Ic11: R1 = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00426] Id11: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00427] Ie11: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00428] If11: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00429] Ig11: Ri = OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00430] Ih11: R1 = OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00431] Ii11: R1 = OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00432] Il11: R1 = Me, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00433] Im11: R1 = Me, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00434] In11: R1 = Me, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00435] Ia9e: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00436] Ib9e: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00437] Ic9e: Ri = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00438] Id9e: R1 = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00439] Ie9e: R1 = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00440] If9e: R1 = Me, R2 = H, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00441] Ig9e: R1 = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00442] Ih9e: R1 = OH, R2 = α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00443] Ii9e: R1 = OH, R2= α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00444] Il9e: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00445] Im9e: Ri = Me, R2= □α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00446] In9e: Ri = Me, R2=α α-OH, R3 = OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00447] Iai0e: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00448] Ibi0e: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00449] Ici0e: Ri = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00450] Idi0e: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[0045i] Iei0e: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00452] If10e: Ri = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00453] Ig10e: Ri = OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00454] Ih10e: Ri = OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00455] Ii10e: Ri = OH, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00456] Il10e: R1 = Me, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00457] Im10e: R1 = Me, R2= dα-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00458] In10e: R1 = Me, R2= α-OH, R3 = NHCH2CH2SO3H, R4 = α- Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00459] Ia11e: R1 = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00460] Ib11e: R1 = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00461] Ic11e: R1 = OH, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00462] Id11e: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00463] Ie11e: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00464] If11e: R1 = Me, R2 = H, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[00465] Ig11e: R1 = OH, R2=α α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00466] Ih11e: Ri = OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me
[00467] lille: Ri = OH, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me
[00468] lille: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH
[00469] Imiie: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH
[00470] Inlle: Ri = Me, R2=d α-OH, R3 = NHCH2CO2H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH
[0047i] Os compostos a seguir Iai2-Ini7e pertencem peio menos à fórmuia II:
[00472] Iai2: Ri = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00473] Ibi2: Ri = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00474] Ici2: Ri = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00475] Idi2: Ri = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00476] Iei2: Ri = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00477] Ifi2: Ri = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00478] Igi2: Ri = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00479] Ihi2: Ri = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00480] Iii2: Ri = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00481] Il12: Ri = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00482] Im12: R1 = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00483] In12: R1 = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00484] Io12: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00485] Ip12: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00486] Iq12: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00487] Ia13: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00488] Ib13: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00489] Ic13: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00490] Id13: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00491] Ie13: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00492] If13: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00493] Ig13: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00494] Ih13: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00495] Ii13: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00496] Il13: Ri = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, Re = H, R7=OH, R8 = H
[00497] Im13: Ri = Me, R2=d α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, Re = H, R7=OH, R8 = H
[00498] In13: R1 = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00499] Io13: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00500] Ip13: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00501] Iq13: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00502] Ia14: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00503] Ib14: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00504] Ic14: R1 = OH, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00505] Id14: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00506] Ie14: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00507] If14: R1 = Me, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00508] Ig14: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00509] Ih14: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00510] Ii14: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00511] Il14: Ri = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00512] Im14: R1 = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00513] In14: R1 = Me, R2 = α-OH, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00514] Io14: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00515] Ip14: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00516] Iq14: R1 = H, R2 = H, R4 = H, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00517] Ia15: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00518] Ib15: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00519] Ic15: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00520] Id15: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00521] Ie15: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00522] If15: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00523] Ig15: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00524] Ih15: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00525] Ii15: Ri = OH, R2= Qα-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00526] Il15: Ri = Me, R2=D α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00527] Im15: Ri = Me, RSFD α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00528] In15: Ri = Me, R2= Qα-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00529] Ia16: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00530] Ib16: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00531] Ic16: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00532] Id16: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00533] Ie16: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00534] If16 R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00535] Ig16:R1 = OH, R2= Qα-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00536] Ih16: R1 = OH, R2= Qα-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00537] Ii16: R1 = OH, R2=Q α-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00538] Il16: R1 = Me, R2= □α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00539] Im16: R1 = Me, R^α α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00540] In16: R1 = Me, R2= α-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00541] Ia17: Ri = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00542] Ib17: Ri = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00543] Ic17: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00544] Id17: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00545] Ie17: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00546] If17: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00547] Ig17: R1 = OH, RSFD α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00548] Ih17: R1 = OH, R2=D α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00549] Ii17: R1 = OH, R2=α α-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00550] Il17: R1 = Me, R2=α α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00551] Im17: R1 = Me, R2= □α-OH, R4 = α-Me, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00552] In17: R1 = Me, R2=α α-OH, R4 = α-Me, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00553] Ia15e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00554] Ib15e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00555] Ic15e: Ri = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00556] Id15e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00557] Ie15e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00558] If15e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00559] Ig15e: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00560] Ih15e: R1 = OH, R2 = α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00561] Ii15e: Ri = OH, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00562] Il15e: Ri = Me, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00563] Im15e: R1 = Me, R2=α α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00564] In15e: R1 = Me, R2=α α-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00565] Ia16e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00566] Ib16e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00567] Ic16e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00568] Id16e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00569] Ie16e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00570] If16e: Ri = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, Re = H, R7=OH, R8 = H
[00571] Ig16e :Ri = OH, R2= dα-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, Re = H, R7 = Me, R8 = H
[00572] Ih16e: Ri = OH, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, Re = H, R7 = Me, R8 = H
[00573] Ii16e: R1 = OH, R2= dα-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, Re = H, R7 = Me, R8 = H
[00574] Il16e: R1 = Me, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00575] Im16e: R1 = Me, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00576] In16e: R1 = Me, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00577] Ia17e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00578] Ib17e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00579] Ic17e: R1 = OH, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00580] Id17e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00581] Ie17e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00582] If17e: R1 = Me, R2 = H, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00583] Ig17e: R1 = OH, R2=α α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00584] Ih17e: Ri = OH, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00585] Ii17e: Ri = OH, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7 = Me, R8 = H
[00586] Il17e: Ri = Me, R2= dα-OH, R4 = α-Et, R5 = (S,R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00587] Im17e: Ri = Me, R2=d α-OH, R4 = α-Et, R5 = (S) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00588] In17e: R1 = Me, R2= Qα-OH, R4 = α-Et, R5 = (R) Me, R6 = H, R7=OH, R8 = H
[00589] Todas as publicações e documentos de patente citados se encontram aqui incorporados a título de referência como se cada publicação ou documento fosse específica e individualmente indicado como estando aqui incorporado a título de referência. A citação das publicações e documentos de patente não é destinada como uma admissão pertinente à técnica anterior, nem constitui qualquer admissão quanto aos conteúdos ou data dos mesmos. Visto que a invenção foi descrita por meio de uma descrição escrita, os indivíduos versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição anterior e os exemplos abaixo servem para propósitos de ilustração e sem caráter limitativo das reivindicações descritas mais adiante. EXEMPLO 1: Síntese de Moduladores TGR5
[00590] Os compostos da invenção, e os derivados relacionados, podem ser sintetizados através de métodos conhecidos aos indivíduos versados na técnica. Os métodos detalhados destinados à sintetização desses compostos são descritos abaixo. Consulte, também, WO 02/072598, WO 2004/0007521, EP 1568706 e EP 135782. No caso do composto onde R1 é hidrogênio, R2 e R3 são hidróxi e R4 é um grupo alquil inferior, o composto de fórmula (I) pode ser obtido de acordo com o esquema a seguir:
Figure img0027
[00591] O metil quenodeoxicolanoato (1) foi protegido nas posições 3 e 7 pelo tratamento com 3,4-diidro-2H-piran em dioxano na presença de uma quantidade catalítica de ácido p-toluenossulfônico (p-TSA) de modo a produzir o análogo correspondente 3α,7α-tetraidropiraniloxi (2). A reação de 2 com iodeto de metila (ou com um haleto de alquila apropriado), a -78 °C utilizando-se diisopropilamida de lítio como uma base e tetraidrofurano (THF) como solvente, seguido pelo tratamento com HCl metanólico proporcionou o 23-metil-3α,7α-diidr0xi-5β-colan- 24-oato de metila correspondente (3). A hidrólise com álcali do éster de metila 3 e a purificação por cromatografia instantânea proporcionou o ácido 23( S )-metil-3α,7α-diidr0xi-5β-colan-24-0ico desejado (Ib) e o ácido 23( R )-metil-3a,7a-diidróxi-5e-colan-24-óico (Ic).
[00592] Preparação de ácido 23( R)- e 23( S )-metil-3α,7α-diidr0xi-5β- colan-24-óico (Ib, Ic) a) 3α,7α-ditetraidropiraniloxi-5β-colan-24-oato de metila (2)
[00593] Adicionou-se ácido p-toluenossulfônico (78 mg, 0,41 mmol), 3,4-diidro-2H-pirano (20,1 mL, 0,098 mol) a uma solução de 3α,7α- diidr0xi-5β-colan-24-oato de metila e (1) (2,0 g, 4,9 mmol) em dioxano (6 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos. Então, adicionou-se H2O (50 mL) e a mistura foi parcialmente concentrada sob vácuo e extraída com EtOAc (3 x 50 mL). As frações orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1 x 50 mL), secas (Na2SO4) e evaporadas sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel. A eluição com petróleo leve/acetato de etila 80/20 proporcionou 2,5 g do composto puro 2 (rendimento de 90%).
[00594] 1H-NMR (CDCls) δ: 0,64 (s, 3H, CH3-I8), 0,89 (s, 3H, CH3- 19), 0,92 (d, 3H, CH3-21), 3,31-3,67 (m, 4H, -CHOCH-), 3,65 (s, 3H, CO2CH3), 3,67 (m, 1H, CH-3), 3,88 (brs, 1H, CH-7), 4,67 (brs, 1H, -O- CH-O-), 4,73 (brs, 1H, -O-CH-O-). b) 23( RS )-metil-3α,7α-diidr0xi-5β-colan-24-oato de metila (3)
[00595] Adicionou-se, por gotejamento, n-butiI Iítio (4,3 mL, 2,2 M de solução em hexano) a -78 °C a uma solução de diisopropilamina (1,4 mL, 10,1 mmol) em THF seco (50 mL). O sistema foi mantido a- 78°C durante 30 minutos adicionais e, então, adicionou-se, por gotejamento, 3α,7α,12α-tetraidropiraniIoxi-5β-coIan-24-oato de metila (2) (1,8 g, 3,2 mmol) dissolvido em THF seco (14 mL) à mistura. Após 20 minutos, adicionou-se lentamente iodeto de metila (1,4 mL, 22,0 mmol) dissolvido em THF seco (7 mL) e permitiu-se que a mistura aquecesse até a temperatura ambiente de um dia para o outro. Os solventes foram removidos sob vácuo e acidificados por HCl a 10% e extraídos com EtOAc (5 x 50 mL), lavados com uma solução de Na2S2O3 a 5% (2 x 50 mL), secos (em Na2SO4 anidro), filtrados, e evaporados sob vácuo. O resíduo bruto foi, então, tratado com uma solução de 2N HCl em MeOH (50 mL) durante 12 horas. O resíduo foi evaporado sob vácuo e recolhido com EtOAc (100 mL), lavado com uma solução de NaHCO3 saturado (2 x 50 mL), seco (Na2SO4) e evaporado sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia instantânea em coluna de sílica gel. A eluição com petróleo leve/acetato de etila 70/30 proporcionou 1,1 g (2,7 mmol) do composto puro 3 (rendimento de 84%).
[00596] 1H-NMR (CDCls) δ: 0,62 (s, 3H, CH3-I8), 0,87 (s, 3H, CH3- 19), 0,92 (d, 3H, CH3-21), 2,38 (m, 1H, CH-23), 3,27-3,40 (m, 1H, CH- 3), 3,55 (brs, 1H, CH-7), 3,63 (s, 3H, CO2CH3). c) Ácido 23( R )-Metil-3a,7a-diidróxi-5[3-colan-24-óico (Ib) e ácido 23( S )- MetiI-3α,7α-diidr0xi-5β-coIan-24-0ico (Ic)
[00597] Dissolveu-se 0,97 g (2,3 mmol) de 23-metil-3a,7a-diidróxi- 5β-coIan-24-oato de metiIa em MeOH (25 mL) e adicionado com NaOH a 10% em MeOH (5,7 mL, 14,2.mmol). A mistura foi refluxada durante 16 horas. A mistura foi acidificada com 3N HCl e extraída com EtOAc (3 x 20 mL). As frações orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1 x 50 mL), secas (Na2SO4) e evaporadas sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia instantânea em coluna de sílica gel. A eluição com CHCl3:MeOH (95/5) proporcionou 1,5 g (65%) de ácido 23(S)-Metil-3a,7a-diidróxi-5|3-colan-24-óico e 330 mg de ácido 23(R)-Metil-3a,7a-diidróxi-5|3-colan-24-óico.
[00598] Ácido 23(S)-Metil-3α,7α-diidrδxi-5β-colan-24-óico (Ib): pf: 125-126 °C. 1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 0,44 (s, 3H, CH3-18), 0,69 (s, 3H, CH3-19), 0,73-0,76 (d, 3H CH3-21), 0,93-0,97 (d, 3H, -CH3), 2,36 (m, 1H, CH-23), 3,15-3,38 (m, 1H, CH-3), 3,62 (brs, 1H, CH-7), 13C- NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 11,55, 18,43, 18,87, 20,49, 22,69, 28,15, 28,57, 30,14, 32,65, 34,43, 34,61, 34,94, 35,23, 37,06, 39,17, 39,60, 40,81, 41,40, 42,57, 46,54, 50,29, 56,63, 68,24, 71,62, 179,99.
[00599] Ácido 23(R)-Metil-3a,7a-diidrδxi-5β-colan-24-óico (Ic): pf: 163-164 °C. 1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 0,43 (s, 3H, CH3-18), 0,65 (s, 3H, CH3-19), 0,65-0,69 (d, 3H CH3-21), 0,83-0,86 (d, 3H, -CH3), 2,20 (m, 1H, CH-23), 3,09-3,15 (m, 1H, CH-3), 3,58 (brs, 1H, CH-7), 13C- NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 11,94, 16,40, 18,30, 20,93, 23,06, 23,89, 28,85, 30,52, 33,08, 34,16, 34,91, 35,38, 35,68, 37,14, 39,49, 39,64, 40,04, 40,17, 41,92, 43,05, 50,69, 57,10, 68,51, 72,01, 181,09. EXEMPLO 2: Preparação de ácido 23(S)- e 23(R)-metil-6a-metil- 3a,7g-diidróxi-53-colan-24-óico (Ib3, Ic3)
[00600] Os compostos a seguir foram preparados por alquilação de ácido 6a-metil-3a,7a-diidr0xi-5β-colan-24-0ico de acordo com o procedimento do Exemplo 1.
[00601] Ácido 23( S )-Metil-6a-metil-3a,7a-diidr0xi-5β-colan-24-0ico (Ib3): pf: 98-100 °C. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,63 (s, 3H, CH3-18), 0,89 (s, 3H, CH3-19), 0,92-1,00 (m, 6H, CH3-21 e CH3-6), 1,15-1,19 (d, 3H, - CH3), 2,45-2,73 (m, 1H, CH-23), 3,31-3,52 (m, 1H, CH-3), 3,58 (brs, 1H, CH-7), 13C-NMR (CDCh)D δ: 11,76, 15,72, 18,58, 18,88, 20,63, 23,11, 23,65, 28,19, 30,21, 30,47, 32,64, 33,79, 33,97, 34,61, 35,42, 35,66, 37,03, 39,60, 40,01, 40,71, 42,71, 47,35, 50,44, 56,60, 72,34, 72,87, 182,37.
[00602] Ácido 23(R)-Metil-3a,7a-diidr0xi-5β-colan-24-óico (Ic3): pf: 89-90 °C. 1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,88 (s, 3H, CH3-19), 0,88-0,92 (m, 3H, CH3-6), 0,95-0,99 (d, 3H, CH3-21), 1,08-1,14 (d, 3H -CH3), 2,35 (m, 1H, CH-23), 3,29-3,48 (m, 1H, CH-3), 3,57 (brs, 1H, CH-7), 13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 11,70, 15,66, 16,02, 18,00, 20,61, 23,09, 23,60, 28,51, 30,39, 32,61, 33,72, 33,92, 35,38, 35,65, 36,33, 39,57, 39,94, 42,77, 47,30, 50,39, 56,53, 72,22, 72,83, 180,50. EXEMPLO 3: Preparação de ácido 23( R)- e 23( S )-metil- 3a,7a,12a-triidr0xi-5β-colan-24-0ico (Ih, Ii)
[00603] Os compostos a seguir foram preparados pela alquilação do ácido 3a,7a,,12a-triidr0xi-5β-colan-24-óico de acordo com o procedimento do Exemplo 1.
[00604] Ácido 23( S )-Metil-3a,7aD ,12a-triidr0xi-5β-colan-24-0ico (Ih): pf: 237-239 °C. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,63 (s, 3H, CH3-18), 0,87 (s, 3H, CH3-19), 0,96-0,98 (m, 3H, CH3-21), 1,07-1,11 (d, 3H, -CH3), 2,44-2,73 (m, 1H, CH-23), 3,35-3,50 (m, 1H, CH-3), 3,82 (brs, 1H, CH-7) 3,95 (brs, 1H, CH-12), 13C-NMR (DMSO) δ: 12,72, 17,60, 19,24, 19,24, 23,00, 23,19, 26,59, 27,78, 28,88, 30,72, 34,77, 35,22, 35,66, 37,19, 41,84, 46,19, 47,27, 49,01, 66,69, 70,88, 71,45, 178,25.
[00605] Ácido 23( R )-Metil-3α,7αd ,12a-triidr0xi-5β-colan-24-0ico (Ii): pf: 221-223 °C. 1H-NMR (CDCl3) δ: 0,63 (s, 3H, CH3-18), 0,87 (s, 3H, CH3-19), 0,96-0,98 (m, 3H, CH3-21), 1,07-1,11 (d, 3H, -CH3), 2,44-2,73 (m, 1H, CH-23), 3,35-3,50 (m, 1H, CH-3), 3,82 (brs, 1H, CH-7) 3,95 (brs, 1H, CH-12), 13C-NMR (DMSO) δ: 12,76, 16,88, 17,31, 23,04, 23,24, 26,62, 28,12, 28,94, 30,81, 33,97, 34,80, 35,28, 35,71, 37,20, 41,85, 46,29, 47,44, 66,67, 70,86, 71,45, 178,77. EXEMPLO 4: Preparação de ácido 23(R)- e 23(S)-metil-6α-metil- 3a,7aD,12a-triidr6xi-5β-colan-24-6ico (Ih3, Ii3)
[00606] Os compostos a seguir foram preparados pela alquilação do ácido 6α-metil-3α,7αQ ,12a-triidr0xi-5β-colan-24-óico de acordo com o procedimento do Exemplo 1.
[00607] Ácido 23( S )-Metil-6α-metil-3α,7αD ,12a-triidr0xi-5β-colan- 24-óico (Ih3): pf: 131-134 °C. 1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 0,65 (s, 3H, CH3-18), 0,87 (s, 3H, CH3-19), 0,97-1,00 (m, 3H, CH3-21), 1,14-1,18 (d, 3H, -CH3), 1,23 (m, 1H, CH-6), 2,52 (m, 1H, CH-23), 3,32-3,50 (m, 1H, CH-3), 3,55 (brs, 1H, CH-7) 3,94 (brs, 1H, CH-12), 13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 12,43, 145,66, 17,62, 18,92, 22,70, 23,14, 26,21, 27,45, 28,01, 30,03, 33,44, 34,11, 34,42, 35,30, 36,71, 39,97, 40,45, 41,73, 46,45, 47,25, 72,13, 72,76, 73,01,180,53.
[00608] Ácido 23( R )-Metil-6α-metil-3α,7αD ,12α-triidr0xi-5β-colan- 24-óico (Ii3): pf: 109-110 °C, 1H-NMR (CD3OD) δ: 0,72 (s, 3H, CH3-18), 0,91 (s, 3H, CH3-19), 1,07-1,11 (m, 6H, -CH3 e CH3-21), 2,37-2,53 (m, 1H, CH-23), 3,15-3,42 (m, 1H, CH-3), 3,53 (brs, 1H, CH-7) 3,97 (brs, 1H, CH-12), 13C-NMR (CD3OD) δ: 11,61, 15,04, 15,32, 16,15, 22,04, 22,75, 26,27, 27,62, 28,18, 29,61, 32,91, 33,74, 34,31, 35,06, 35,18, 36,56, 39,70, 40,25, 41,68, 46,19, 46,31, 71,76, 71,77, 72,62, 180,11. EXEMPLO 5: Preparação de ácido 23(R)- e 23(S)-metil-3a-hidr0xi-5β- colan-24-óico (Ip, Iq)
[00609] Os compostos a seguir foram preparados pela alquilação do ácido 3a-hidróxi-5|3-colan-24-óico de acordo com o procedimento do Exemplo 1.
[00610] Ácido 23( S )-Metil-3α-hidrδxi-5β-colan-24-óico (Ip): pf: 161162 °C. 1H-NMR (CDCI3+CD3OD) δ: 0,60 (s, 3H, CH3-18), 0,88 (s, 3H, CH3-19), 0,92-1,01 (m, 3H, CH3-21), 1,13-1,16 (d, 3H, -CH3), 2,55 (m, 1H, CH-23), 3,60 (m, 1H, CH-3), 13C-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 11,97, 18,52, 18,87, 20,73, 23,30, 24,14, 26,34, 27,10, 28,15, 30,18, 34,48, 34,50, 35,23, 35,74, 36,06, 37,01, 40,13, 40,34, 40,74, 41,99, 42,68, 56,43, 56,75, 71,70, 181,42.
[00611] Ácido 23( R )-Metil-3a-hidr0xi-5β-colan-24-0ico (Iq): pf: 152153 °C. 1H-NMR (CDCl3+CD3OD) δ: 0,63 (s, 3H, CH3-18), 0,89 (s, 3H, CH3-19), 0,94-1,03 (m, 3H, CH3-21), 2,45 (m, 1H, CH-23), 3,59 (m, 1H, CH-3), 13C-NMR (CD3OD) δ: 11,98, 15,97, 18,00, 20,75, 23,31, 24,14, 26,34, 27,11, 28,48, 30,26, 33,68, 34,50, 35,26, 35,77, 36,15, 36,46, 39,59, 40,13, 40,36, 42,01, 42,79, 56,45, 56,76, 71,71,181,02. EXEMPLO 6: Preparação de ácido 23(S)-metil-3a,7a,12a-triidróxi-6a- etila-5β-colan-24-0ico (Ih3e)
Figure img0028
[00612] Reagentes e condições: a) pTSA, MeOH, ultra-som, quant. b) CH2(OCH3)2, P2O5, CHCI3, 97%. c) LDA, Mel, -78°C. d) MeOH, HCl, 45°C. e) MeOH, NaOH, 45°C, 41%. Rendimento geral: 39,7%.
[00613] Síntese de 23(S)-metil-3a,7a,12a-triidróxi-6a-etila-5e-colan- 24-oate (2):
[00614] Adicionou-se a uma solução de 1 (2,78 g, 6,37 mmol) em MeOH (120 mL), pTSA (0,12 g, 0,63 mmol), e a mistura foi tratada com ultra-som por 90’. A mistura foi, então, concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi diluído com AcOEt (120 mL), lavado com H2O (3x100 mL), salmoura (100 mL), seco com Na2SO4 anidro, e concentrado sob pressão reduzida de modo a proporcionar 2 (rendimento quantitativo) que foi usado para a próxima etapa sem purificação adicional.
[00615] 1H-NMR (CDClβ) δ 0,63 (3H, s, 18-CH3), 0,84-0,88 (6H, s, 19-CH3 + CH3CH2), 0,97 (3H, d, J = 6,62 Hz, 21-CH3), 3,30 (1H, m, 3- CH), 3,48 (3H, s, COOCH3), 3,62 (1H, m, 7-CH), 3,97 (1H, m, 12-CH).
[00616] Metil 3a,7a,12a-triidróxi-6a-etila-5e-24-oate (3):
[00617] Adicionou-se a, em porções, uma solução de 2 (2,50 g, 5,55 mmol) em CHCl3 (60 mL) e dimetóxi metano (34,10 mL, 166,66 mmol), P2O5 (14,18 g, 99,90 mmol), e a suspensão resultante foi mecanicamente agitada por 45’. A mistura foi, então, decantada, e a camada orgânica tratada com NaHCO3 10% (50 mL) por 10’. A camada orgânica foi, então, separada, e a camada aquosa foi extraída com CHCl3 (3x50 mL). As camadas orgânicas coletadas foram lavadas com salmoura (100 mL), seca com Na2SO4 anidro, e concentradas sob pressão reduzida de modo a proporcionar 3 (3,14 g, 97%), que foi usado para a próxima etapa sem purificação adicional.
[00618] 1H-NMR (CDCls) δ: 0,67 (3H, s, 18-CH3), 0,88-1,04 (9H, m, 19-CH3 + CH3CH2 + 21-CH3), 3,30 (1H, m, 3-CH), 3,30-3,40 (7H, m, 3- CH + 2 x CH3OCH2O), 3,45 (3H, s, CH3OCH2O), 3,50 (1H, m, 7-CH), 3,66 (3H, s, COOCH3), 3,79 (1H, m, 12-CH), 4,57 - 4,75 (6H, m, 3 x CH3OCH2O).
[00619] Ácido 23(S)-metil-3a,7a,12a-triidróxi-6a-etila-5e-colan-24- óico (Ih3e):
[00620] Adicionou-se, por gotejamento, a uma soIução de diisopropiI amina (0,56 mL, 4,026 mmoI) em THF recentemente destiIado (15 mL) resfriado a -78°C e sob atmosfera de N2, 11BuLi 2,5N em hexano (1,53 mL, 3,840 mmoI). A reação foi agitada a -78°C por 30’ e, então, uma solução de 3 (350 mg, 0,60 1 mmol) dissolvida em THF recentemente destiIado (7 mL) foi adicionada por gotejamento. A soIução resuItante foi agitada a -78°C por 90’. Adicionou-se iodometano (0,56 mL, 9,015 mmoI), a mistura de reação foi agitada a - 78°C por 60’, e, então, lentamente aquecida até a temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi, então, concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resuItante foi diIuído com H2O (30 mL) e extraído com AcOEt (3x30 mL). As camadas orgânicas coIetadas foram Iavadas com saImoura (30 mL), secas com Na2SO4 anidro, e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi, então, tratado com uma soIução de MeOH/HCI 37% (20 mL, 20:1 voI/voI) a 45°C por 8 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resuItante foi diIuído com H2O (30 mL) e extraído com AcOEt (3x30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 mL), secas com Na2SO4 anidro, e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi tratado com uma solução de NaOH 10% em MeOH (15 mL) a 45°C por 24h. A mistura foi, então, concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi diluído com H2O (20 mL), lavado com iPr2O (3x1 5 mL), acidificado com HCl 3N, e finamente extraído com CHCl3 (3x20 mL). As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura (100 mL), secas com Na2SO4 anidro, e concentradas. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de média pressão (coluna: “RP-1 8 Lobar B”, MeOH/H2O a partir de 5:5 a 6:4, 50 psi) de modo a proporcionar 4 (47 mg, 4 1%).
[00621] Pf: 195-197°C
[00622] 1H-NMR (CDCh + CD3OD) δ: 0,63 (3H, s, 18-CH3), 0,84 0,88 (6H, m, 19-CH3 + CH3CH2), 0,98 (3H, d, J = 6,60 Hz, 21-CH3), 1,10 (3H, d, J = 6,80 Hz, CH(CH3)COOH), 2,61 (m, 1H, CH(CH3)COOH), 3,35 (1H, m, 3-CH), 3,65 (1H, m, 7-CH), 3,92 (1H, m, 12-CH).
[00623] 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD) δ: 11,51, 12,34, 17,52, 19,19, 22,09, 22,67, 23,11, 26,65, 27,40, 28,05, 29,83, 33,31, 34,56, 35,06, 35,40, 38,67, 39,90, 41,11, 41,39, 41,69, 45,10, 46,39, 47,32, 70,65, 71,79, 72,90, 182,07. EXEMPLO 7: Síntese de compostos Io5, Ip5, Iq5, e Ir5
Figure img0029
(i) EDA, Rh2(OAc)4, CH2Cl2, temperatura ambiente; (ii) (a) NaOH, EtOH, refluxo, (b) MPLC
[00624] Ácidos 3α,7α-Diidr0xi-22,23-metileno-5β-colan-24-0ico (Io5, Ip5, Iq5, e Ir5).
[00625] Adicionou-se, letamente por gotejamento, diazoacetato de etila (0,478 g, 1,19 mmol) em CH2C12 seco (15 mL) a uma suspensão agitada de 3α,7α-diacet0xi-5-norcolan-22,23-ena (1) (0,6 g, 1,39 mmol) na presença de tetraacetato de diródio (II) (9 mg, 0,02 mmol) em CH2C12 seco (15 mL) sob nitrogênio em temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada e lavada com H20 (20 mL), seca (Na2SO4), e evaporada sob vácuo, proporcionando, assim, uma mistura de quatro ésteres diastereoisoméricos 2. Os ésteres 2 foram sucessivamente dissolvidos em EtOH (15 mL) e tratados com uma solução de 10 N NaOH (10 mL) em refluxo por 4 horas, resfriados, despejados em H2O gelada (50 mL), acidificados com 2 N HC1, e extraídos com EtOAc (3 x 15 mL). A fase orgânica foi lavada com salmoura (10 mL), seca (Na2SO4), e concentrada sob vácuo. O resíduo foi submetido à cromatografia em sílica gel. A eluição com CH2C12/MeOH 96/4 com AcOH 0,1% produziu 0,087 g (rendimento de 15%) de ácido (22S,23S)-3α,7α-diidr0xi-22,23-metileno-5β-colan-24- óico (Io5) e 0,065 g (rendimento de 11,5%) de ácido (22R,23R)-3α,7α- diidr0xi-22,23-metileno-5β-colan-24-0ico (Iq5). A eluição com CH2C12/MeOH 95,5/4,5 com 0,1% AcOH produziu 0,18 g (rendimento de 32%) de ácido (22S,23R)-3α,7α-diidr0xi-22,23-metileno-5β-colan- 24-óico (Ip5) e 0,15 g (rendimento de 26,7%) de ácido (22R, 23S)- 3α,7α-diidr0xi-22,23-metileno-5β-colan-24-0ico (Ir5) como sólidos brancos.
[00626] Io5. Pf: 148-150°C [α]20D +5,16 (c 1, EtOH), 1H NMR (CD3OD e CDC13) δ: 0,67 (s, 3H, 18-CH3), 090 (s, 3H, 19-CH3), 0,96 (d, J=6,68 Hz, 3H, 21-CH3), 3,40-3,50 (m, 1H, 3-CH), 3,85 (m, 1H, 7- CH), 13C NMR (CDC13) δ: 12,20, 16,80, 17,08, 20,80, 21,00, 23,15, 24,10, 28,30, 30,80, 31,30, 33,30, 34,80, 34,90, 35,40, 35,70, 39,80, 39,90, 41,80, 43,40, 50,55, 58,20, 68,90, 72,30, 177,00.
[00627] Iq5. PF: >230°C. [α]20D-38,19 (c 1,1, CH3C1/MeOH 1:1), 1H NMR (CD3OD e CDC13) δ: 0,50 (s, 3H, 18-CH3), 0,86 (s, 3H, 19-CH3), 0,96 (d, J= 6,40 Hz, 3H, 21-CH3), 3,40-3,60 (m, 1H, 3-CH), 3,80 (m, 1H, 7-CH), 13C NMR (CDC13) δ: 12,00, 12,50, 20,90, 21,00, 21,10, 23,00, 23,80, 27,10, 30,50, 31,00, 32,10, 33,10, 34,80, 35,30, 35,60, 39,50, 39,70, 39,85, 41,80, 43,00, 50,40, 58,50, 68,60, 72,00, 176,90.
[00628] Ip5. Pf: 221-225°C. [α]20D-40,22 (c1, EtOH), 1H NMR (CD3OD e CDC13) δ: 0,56 (s, 3H, 18-CH3), 0,86 (s, 3H, 19-CH3), 1,16 (d, J= 6,60 Hz, 3H, 21-CH3), 3,10-3,30 (m, 1H, 3-CH), 3,85 (m, 1H, 7- CH), 13C NMR (CDC13) δ: 12,10, 18,30, 18,55, 20,00, 20,90, 23,10, 24,00, 28,20, 30,70, 31,70, 33,20, 34,80, 35,40, 35,70, 39,80, 40,10, 41,80, 43,15, 50,40, 57,80, 68,90, 72,20, 178,40.
[00629] Ir5. Pf: 136-140°C. [α]20D +13,66 (c 1, EtOH), 1H NMR (CD3OD e CDC13) δ: 0,56 (s, 3H, 18-CH3), 0,86 (s, 3H, 19-CH3), 0,96 (d, J=6,66 Hz, 3H, 21-CH3), 3,40-3,60 (m, 1H, 3-CH), 3,80 (m, 1H, 7- CH), 13C NMR (CDC13) δ: 12,00, 13,50, 19,90, 20,90, 22,50, 23,10, 24,00, 28,00, 30,70, 31,60, 33,20, 34,90, 35,40, 35,65, 39,70, 39,73, 41,80, 43,10, 50,40, 58,00, 68,80, 72,20, 177,60. EXEMPLO 8: Atividade TGR5 e FXR in vitro
[00630] A potência e a eficácia dos compostos da invenção no receptor TGR5 foram avaliadas utilizando-se ensaios in vitro.
[00631] A Tabela 1 mostra que os compostos da invenção são moduladores TGR5 potentes e seletivos. A introdução de um grupo alquila na posição C-23 de ácido biliático proporciona seletividade para o receptor TGR5 em relação ao FXR. Isto fica evidente pela observação dos resultados biológicos obtidos para CDCA, 6-MeCDCA e 6,23-diMe-CDCA (mistura de isômeros 23-R,S) em FXR e TGR5 conforme mostrado na Tabela 1. 6,23-diMe-CDCA é 100 vezes mais potente em TGR5 em relação ao receptor FXR. Para uma descrição da aglutinação de receptor TGR5 que utiliza um ensaio in vitro, consulte, por exemplo, Kawamata, J. Biol. Chem 2003, Vol. 278 No. 11, p. 9435-9440). A atividade em FXR foi ensaiada por transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) para recrutamento do peptídeo SRC-1 em FXR humana utilizando-se um ELiSA isento de células. Consulte, Blanchard et al. WO 00/37077. Tabela 1: EC50 (μM) de Compostos Exemplificadores no Receptor FXR e TGR5
Figure img0030
Figure img0031
[00632] As Tabelas 2 e 3 mostram compostos adicionais avaliados para atividade de TGR5. A atividade de luciferase foi determinada em células CHO que expressam estavelmente hTGR5 ou co-transfectada transientemente com um vetor de expressão hTGR5 e um gene repórter de luciferase conduzido pelo elemento responsivo por cAMP (CRE). Alguns dos compostos foram submetidos a um ensaio repórter de luciferase classificação em relação à capacidade de ativar o receptor de ácido biliático nuclear FXR. Tabela 2.
Figure img0032
*Os dados representam valores médios de pelo menos três experimentos independentes de ensaios repórteres de luciferase ativada por CRE em células CHO transfectadas por TGR5. As unidades se encontram em μM para EC50 e % de valor 10 μM LCA para Eficácia. Tabela 3. Atividadesa de TGR5 e FXR
Figure img0033
a Os dados representam os valores médios de pelo menos três experimentos independentes.
[00633] O valor para eficácia é expresso como % de atividade vs. 10 μM LCA (TGR5) ou 10 μM 6ECDCA (FXR). b Patamar do nível de ativação não alcançado; a concentração máxima testada foi de 125 μM para Ib e 100 mM para Ii.
[00634] Os dados nas Tabelas 2 e 3 podem ser determinados utilizando-se métodos conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito abaixo. Plasmídeos
[00635] O clone de Coleta Genética em Mamíferos NIH MGC:40597 (também denominado como pCMVSPORT6/hTGR5 ou pTGR5) e pcDNA3.1(+) foram obtidos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). pCRE-Luc e pCMVβ foram obtidos a partir de Clontech (Palo Alto, CA, EUA). pCMX-hFXR e pCMX-mRXRα foram presenteados pelo Dr. David J. Mangelsdorf (Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center). pEcREx7-Luc foi presenteado pelo Dr. Richard A. Heyman (X-ceptor Therapeutics, CA, EUA). Cultura Celular
[00636] As células do ovário de hamster chinês (CHO), células NCI-H716, células Hep3B e células COS1 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). O meio de cultura celular, soro e suplementos foram fornecidos por Invitrogen ou Sigma-Aldrich. Todas as células CHO foram mantidas em um meio essencial mínimo α (α-MEM) suplementado com 10%(v/v) de soro bovino fetal (FBS) e 100μM de aminoácidos não-essenciais (NEAA). As células NCI-H716 foram mantidas em suspensão em RPMI- 1640 suplementado com 10%(v/v) FBS, 10mM de HEPES e 1mM de piruvato de sódio. As células Hep3B foram mantidas em um meio de Eagle suplementado com 10%(v/v) FBS e 100μM NEAA. As células COS1 foram mantidas em um meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10%(v/v) FBS. Todo o meio de cultura celular foi suplementado com 100units/m1 de penicilina e 100μg/mL de sulfato de estreptomicina. As células foram desenvolvidas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, passadas a cada 2 a 6 dias e recentemente colocadas em placas para cada experimento. Transfecções Transientes
[00637] As células CHO foram colocadas em placas com 96 poços em uma densidade de 3,5x104 células/poço, submetidas à cultura por 24 horas, e, então, transfectadas com 150ng de plasmídeo de expressão TGR5 humana (h) (pCMVSPORT6/hTGR5) e 100ng de plasmídeo repórter de luciferase ativado por elemento responsivo cAMP (CRE)- (pCRE-Luc) em cada poço utilizando-se o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 6 horas de incubação, as células foram lavadas uma vez com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o meio foi trocado por DMEM contendo 0,1%(w/v) de albumina sérica bovina (BSA). Após a incubação durante outras 18 horas, as células foram tratadas por 5 horas com diferentes concentrações de cada composto em DMEM puro contendo 0,1%(w/v) BSA. Após o tratamento, as células foram lisadas com 50μl de tampão de lise (25mM Tris-Cl (pH7,6), 2mM EDTA, 1mM de ditiotreitol (DTT), 10%(v/v) de glicerol e 1%(v/v) de triton X-100) por um ciclo congelamento-derretimento e submetidas a ensaios de luciferase, conforme descrito abaixo.
[00638] As células COS1 foram colocadas em placas com 96 poços em uma densidade de 2,5 x104 células/poço em DMEM suplementado com 10%(v/v) de FBS removido por carvão vegetal, submetido à cultura por 24 horas, e, então, transfectadas com 25ng de plasmídeo de expressão hFXR (pCMX-hFXR), 25ng de plasmídeo de expressão do receptor α X retinóide (RXRα) de camundongo (m) (pCMX- mRXRa), 50ng de plasmídeo repórter (pEcREx7-Luc) e 50ng de of pCMVβ como o controle interno em cada poço, utilizando-se o reagente Lipofectamine 2000. Após 24 horas, as células foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com diferentes concentrações de cada composto em DMEM puro suplementado com 10%(v/v) de FBS removido por carvão vegetal durante 24 horas. Após o tratamento, as células foram lisadas com 50μl de tampão de lise através de um ciclo de congelamento-derretimento e submetidas a ensaios de luciferase e β- galactosidase, conforme descrito abaixo. Os valores de luciferase normalizados foram determinados dividindo-se a atividade de luciferase pela atividade de β-galactosidase. Ensaios de Luciferase e β-galactosidase
[00639] Para ensaios de luciferase, 20μl de lisato celular foram misturados com 100μl de tampão de reação de luciferase [235μM de luciferina, 265μM de ATP e 135μM de co-enzima A (CoA)] e a luminescência foi determinada com CentroXS3 LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha). Para ensaios de β- galactosidase, 10μl de lisato celular foram misturados com 100μl de Tampão Z [60mM de Na2HPO4, 10mM de KC1, 1mM de MgSO4, 50mM de β-mercaptoetanol e 0,75mg/mL de o-nitrofenil-β-D- galactopiranosida (ONPG)] e incubado a 37°C durante 0,5 a 3 horas. As reações foram interrompidas adicionando-se 50μl de Tampão de Interrupção (1M de Na2CO3) e a densidade óptica a 420nm foi determinada. Estabelecimento de células CHO que expressam estavelmente o TGR5 humano (células CHO-TGR5)
[00640] As células CHO foram transfectadas com 3,8μg de hTGR5 plasmídeo de expressão (pCMVSPORT6/hTGR5), 3,8μg de plasmídeo repórter de luciferase ativado por CRE (pCRE-Luc) e 0,4μg de plasmídeo de expressão genética resistente à neomicina [pcDNA3.1(+)] utilizando- se Lipofectamine 2000. Os transfectantes foram selecionados com 400μg/mL G418 de sulfato e clones únicos foram desenvolvidos em uma placa de 96 poços, independentemente. As linhagens celulares CHO de expressão TGR5 foram submetidas à triagem através de tratamentos LCA, seguidos por ensaios de luciferase. Análise de produção cAMP
[00641] As células NCI-H716 foram colocadas em placas de 96 poços revestidos com 0,75mg/m1 de Matrigel (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante logo antes do uso, em uma densidade de 6x104 células/poço em DMEM suplementado com 10%(v/v) de FBS, 100 unidades/m1 de penicilina e 100μg/m1 de sulfato de estreptomicina, e submetidas à cultura por 24 horas, o que permitiu uma adesão das células ao fundo da placa. As células CHO- TGR5 foram colocadas em placas de 96 poços em uma densidade de 3,5 x 104 células/poço em α-MEM suplementado com 10%(v/v) de FBS, 100μM de NEAA, 100 de unidades/mL de penicilina e 100μg de sulfato de estreptomicina, e submetidas à cultura por 24 horas. As células foram lavadas duas vezes com PBS e o meio foi trocado por um meio de ensaio cAMP [DMEM contendo 0,1%(w/v) de BSA e 0,5mM de 3-isobutil-1-metil xantina (IBMX)]. Após a incubação durante 30 minutos a 37°C, as células foram tratadas com cada composto em um meio de ensaio cAMP puro durante 30 minutos. Após o tratamento, o meio foi descartado e as quantidades de cAMP determinadas utilizando-se um kit de triagem cAMP (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Concentrações 50% eficazes (EC50) e Determinação de Eficácia
[00642] Os ensaios foram realizados três ou quatro vezes para cada condição. Os valores EC50 foram determinados por análises Probit. A eficácia foi determinada calculando-se os percentuais de 10 μM de LCA para um estudo de agonista TGR5 e 10 μM de 6α-Et-CDCA para um estudo de agonista FXR, respectivamente. Após subtrair o valor médio da condição basal (tratada por veículo), os valores foram aplicados a EC50 e/ou às determinações de eficácia. O cálculo do EC50 médio e a comparação do EC50 entre os diferentes compostos foram realizados após a transformação logarítmica. Análise estatística
[00643] A análise estatística foi realizada por um teste t de Student e p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela3A.
Figure img0034
[00644] Os dados na Tabela 3A foram gerados utilizando-se os métodos descritos abaixo. Ensaio FRET (Detecção de níveis cAMP intracelulares).
[00645] O ensaio de aglutinação de receptor foi realizado medindose o nível de AMP cíclico (cAMP) utilizando-se um ensaio FRET. As linhagens celulares intestinais humanas (NCI-H716) foram colocadas em placas de 96 poços revestidas com 0,75 mg/mL de Matrigel (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante logo antes do uso, em uma densidade de 12x103 células/poço em DMEM suplementado com 10 % (v/v) de FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina, e submetidas à cultura por 24 horas, permitindo uma de células ao fundo da placa. As células foram lavadas duas vezes com PBS e o meio foi trocado por um meio de ensaio cAMP [OPTIMEM contendo 0,1% (w/v) de BSA e 1 mM de 3- isobutil-1-metil xantina (IBMX)]. Após a incubação por 60 minutos a 37°C, as células foram tratadas com concentrações crescentes de composto Ih3 em tampão de estímulo (5 mM de HEPES, 0,1% de BSA em HBSS pH 7,4) contendo o quelato de európio- Streptavidin e o anticorpo conjugado ALEXA Fluor 647 anti-cAMP (PerkinElmer) durante 1 hora em temperatura ambiente. O nível de cAMP intracelular foi determinado com um hit Lance (PerkinElmer). Utilizou-se ácido litocólico como o ligante de controle. Utilizou-se o fator Z’ para validar os ensaios. Curvas de regressão não-linear, sem restrições, foram realizadas utilizando-se uma equação de quatro parâmetros e o Software GraphPad Prism (GraphPad Inc.), de modo a obter os valores EC50. Ensaio Alphascreen
[00646] A atividade em FXR foi ensaiada utilizando-se uma tecnologia Alphascreen em um ensaio co-ativador de recrutamento. O AlphaScreen consiste em um ensaio químico à base de microesferas usado para estudar as interações biomoleculares. A aglutinação das moléculas capturadas nas microesferas leva a uma transferência de energia a partir de uma microesfera para outra, produzindo essencialmente um sinal luminescente. Quando os parceiros interagirem, a energia química é transferida a partir das microesferas Doadoras para Aceptoras e se produz um sinal. Mediante a estimulação dos ácidos biliáticos, o GST-FXR-LBD interage com o peptídeo Src-1. Revestido com Anti-GST
[00647] As microesferas Aceptoras foram usadas para capturar o GST-fusão FXR-LBD enquanto o peptídeo biotinilado-SRC-1 foi capturado pelas microesferas Doadoras de estreptavidina. Mediante uma iluminação em 680 nm, a energia química é transferida a partir das microesferas Doadoras até as Aceptoras através do complexo estreptavidina-Doadora/Src-1-Biotina/GSTFXR-LBD/Anti-GST- Aceptorra e se produz um sinal. O ensaio foi realizado em Optiplates de 384 poços de baixo volume e brancas (PerkinElmer) utilizando-se um volume final de 25 μl contendo concentrações finais de 10 nM de proteína FXR-LBD marcada com GST purificada, 30 nM de peptídeo Src-1 biotinilado, 20 μg/mL de microesferas aceptoras anti-GST e 10 μg/mL de microesferas doadoras de estreptavidina (PerkinElmer). O tampão de ensaio continha 50 mM de Tris (pH 7.4), 50 mM de KCl, 0,1% de BSA, e 1 mM de DTT. Os tempos de estímulo com 1 μl de ligantes (solubilizados em 100% de DMSO) foram fixados em 30’ em temperatura ambiente. A concentração de DMSO em cada poço foi mantida em uma concentração final de 4%. Após a adição da mistura de detecção (microesferas aceptoras e doadoras), as placas foram incubadas no escuro durante 4 horas em temperatura ambiente e, então, lidas em um analisador de microplaca Envision (PerkinElmer). As curvas de resposta de dosagem foram realizadas três vezes e o fator Z’ usado para validar os ensaios. As curvas de regressão não- linear, sem restrições, foram realizadas utilizando-se uma equação de quatro parâmetros e um Software GraphPad Prism (GraphPad Inc.), de modo a obter os valores EC50. Cultura Celular, Transfecção e ensaio de Luciferase
[00648] As células HEPG2 e HEK293T foram submetidas à cultura em E-MEM e DMEM respectivamente, sejam suplementadas com 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina e 10% de soro bovino fetal. (alto teor de glicose) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram desenvolvidas em 37°C em 5% de CO2. Todas as transfecções foram realizadas utilizando-se um reagente de Transfecção 5:2 Fugene HD (μl) em DNA (μg) respectivamente (Roche). Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células HEK293T ou HepG2 foram semeadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 10.000 ou 15.000 células/poço, respectivamente. As transfecções transientes foram realizadas utilizando-se 100 ng de vetor repórter pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] (Promega), 40ng de pGL4.74 (Renilla), como um controle interno para eficiência de transfecção, e 10 ng de plasmídeo de expressão pCMV-SPORT6-hTGR5. O clone de Coleção Genética de Mamíferos NIH MGC:40597 (Invitrogen). O vetor pGEM foi adicionado de modo a normalizar as quantidades de DNA transfectado em cada ensaio (2 μg). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram estimuladas com concentrações crescentes de composto Ih3e por 18 horas. As culturas de controle receberam apenas o veículo (0,1% de DMSO). As células foram, então, lisadas adicionando-se 75 μl de Reagente de Luciferase Dual-Glo (Promega) em 75 μl do meio contendo células/poço. A atividade de luciferase de renilla foi medida adicionando-se um volume de reagente Dual-Glo Stop & Glo e um meio de cultura original. As atividades de luciferase foram expressas como uma razão entre a unidade de luciferase e a unidade de luciferase de renilla. Cada ponto de dados é a média de três ensaios. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Tabela 3A. Comparação direta de ácido cólico de 6-etil vs. 23- metil substituído por 6-metil
Figure img0035
* Os resultados mostrados na Tabe a 3A foram gerados utilizando-se os procedimentos descritos diretamente acima.
[00649] Os compostos tendo um grupo alfa-etila na posição C-6 no anel de ácido biliático são preferenciais. De modo mais específico, os compostos tendo um grupo alfa-etila na posição C-6 do ácido cólico 23-metila são os mais preferenciais. Conforme mostrado na Tabela 3A anterior, os compostos tendo um grupo alfa-etila na posição C-6 são surpreendente e inesperadamente mais potentes do que o derivado de C-6 alfa-metila correspondente. EXEMPLO 9: Atividades metabólicas de ácido oleanólico e ácido 6-etil, 23-metil-cólico (Ih3e) em um modelo de camundongo com obesidade induzida por dieta
[00650] O objetivo do estudo consiste em definir se os agonistas TGR5 (ácido oleanólico (OA) ou ácido 6 etila, 23-metil cólico (Ih3e) corrigem o desenvolvimento de obesidade resistência à insulina associada in vivo. Para testar esta possibilidade, OA/ Ih3e foram administrados através de administração alimentar durante 16 semanas em camundongos macho C57BL6J que foram previamente submetidos a uma dieta hiperlipídica durante 10 semanas. II- Protocolo
[00651] Em um estudo anterior, observou-se OA como um agonista TGR5 seletivo que não causou aversão alimentar. Os animais tratados com uma dose de 100 mg/kg/dia de OA apresentaram, no entanto, alguns sinais de toxicidade, enquanto uma dose menor foi bem tolerada. Portanto, o OA foi administrado na dose de 50 mg/kg/d neste estudo.
[00652] Os estudos in vitro identificaram o Ih3e como um ligante TGR5 potente e seletivo. Não foram esperados problemas com Ih3e, que foi administrado em uma concentração ~ 50 vezes menor.
[00653] Para este estudo, 48 camundongos macho C57BL6J (5 semanas de idade) foram divididos em dois grupos: um grupo de 24 (grupo 1, 2&3) animais recebeu dieta à base de ração, enquanto os outros 24 receberam uma dieta hiperlipídica durante um período de 10 semanas (grupo 4,5&6). Os animais foram, então, analisados durante um período de 16 semanas. Cinco grupos de 10 animais foram atribuídos da seguinte forma: 1: dieta à base de ração 2: dieta à base de ração + OA 50 mg/kg/dia 3: dieta à base de ração + 6Et23MeCA (Ih3e) 30 mg/kg/dia 4: dieta hiperlipídica 5: dieta hiperlipídica + OA 50 mg/kg/dia 6: dieta hiperlipídica + 6Et23MeCA (Ih3e) 30 mg/kg/dia
[00654] Durante todo o estudo, o peso corporal e a ingestão de alimentos foram monitorados duas vezes por semana.
[00655] Semana-2: Analisou-se a composição corporal, para todos os grupos, através de absorciometria com raios x de dupla energia (dexascan).
[00656] Semana-1: Os níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina foram medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 horas e os camundongos foram, então, submetidos às dietas indicadas (Dia 0).
[00657] Semana 2: Os níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina foram medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 horas (Dia 14).
[00658] Semana 4: Determinou-se a tolerância à glicose submetendo-se todos os animais a um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT). Os animais foram colocados em jejum durante 12 horas antes deste teste.
[00659] O gasto de energia noturna dos grupos 1, 4, 5 e 6 (dieta à base de ração, dieta hiperlipídica e dieta hiperlipídica OA / 6Et23MeCDCA (Ih3e) foi medido por calorimetria indireta.
[00660] Semana 8: A composição do peso corporal foi novamente analisada por dexascan para todos os grupos.
[00661] Os níveis séricos de transaminases, glicose, triglicerídeos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina foram medidos em todos os grupos após um período de jejum de 12 horas (Dia 56).
[00662] Semana 9: A atividade de um ciclo de 24 horas dos grupos 4, 5 e 6 (camundongos submetidos à dieta hiperlipídica) foi estudada durante um período de 30 horas.
[00663] Semana 10: A medição da pressão sanguínea e da frequência cardíaca foi realizada nos grupos 4, 5 e 6.
[00664] Semana 11: A temperatura retal de todos os animais foi medida em temperatura ambiente às 10:00 am.
[00665] A medida da atividade de um ciclo de 24 horas foi realizada nos grupos 1, 2, 3 e 4.
[00666] Semana 12: A tolerância à glicose foi analisada realizando- se um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) nos grupos 4, 5 e 6. Durante o IPGTT, coletou-se sangue para analisar os níveis de insulina. Os animais foram colocados em jejum 12 horas antes desses testes.
[00667] As fezes foram coletadas em todos os grupos durante um período de tempo de 24 horas e o teor de lipídeos fecais foi medido.
[00668] Semana 16: Realizou-se um teste a frio em todos os animais medindo-se a temperatura corporal dos animais expostos à 4°C.
[00669] Três dias após, os animais foram sacrificados. Durante o sacrifício, coletou-se sangue e o mesmo foi analisado para: lipídeos plasmáticos (TC, TG, HDL-C, FFAs); funções hepáticas (ALAT, ASAT, Pase alcalina, Y-GT); glicose e insulina; perfis de lipoproteínas dos grupos selecionados de plasma (cromatografia por exclusão de tamanho).
[00670] O fígado, o intestino delgado, os tecidos adiposos (WAT e BAT), o pâncreas, o coração e os músculos foram coletados, pesados e mantidos para análises futuras que incluem: histologia padrão (coloração HE, coloração de succinato desidrogenase, coloração em óleo red-O e morfologia celular); teor de lipídeos nos tecidos; microscopia de elétrons em BAT e músculos para análise de mitocôndrias; isolamento de RNA para estudos de expressão de genes selecionados envolvidos no metabolismo e homeostase energética por RT-PCR quantitativo; extração de proteínas para o estudo das modificações pós-translacionais, tal como acetilação de proteínas de interesse (por exemplo, PGC-1α). III- Procedimentos detalhados A- Procedimento animal e dietas Alojamento e manuseio dos animais
[00671] Os camundongos foram alojados em grupos (5 animais / jaula) em condições específicas isentas de patógenos com um ciclo de luz acesa e apagada de 12 horas:12 horas (às 7:00), em uma temperatura (20-22°C) e viveiro com umidade controlada, de acordo com as especificações da Comunidade Europeia. Permitiu-se que os animais tivessem livre acesso à água e alimentos. Água de beber
[00672] A composição química da água canalizada foi regularmente analisada para verificar a ausência de substancias tóxicas em potencial no Institut d’Hydrologie, ULP, Strasbourg. A água de beber foi tratada com HCl e HClO4 de modo a manter o pH entre 5 e 5,5 e a concentração de colina entre 5 e 6 ppm. Dieta
[00673] A dieta padrão à base de ração para roedores foi obtida a partir de UAR e a dieta hiperlipídica foi obtida a partir de Research Diet. Os camundongos foram alimentados, seja com a dieta à base de ração (16% de proteínas, 3% de gorduras, 5% de fibras, 5% de resíduos) ou com a dieta hiperlipídica (20% de proteínas, 20% de carboidratos, 60% de gorduras). O ácido oleanólico e 6Et23MeCDCA (Ih3e) foram misturados com a dieta à base de ração em pó ou com a dieta hiperlipídica em pó nas seguintes proporções: 0,5g de OA/kg de alimento para um tratamento de 50mg/kg/dia e 0,08g de 6Et23MeCA (Ih3e) /kg de alimento para um tratamento de 10 mg/kg/dia. Os péletes foram, então, reconstituídos. Os grupos de controle receberam péletes de alimento conforme proporcionado pela companhia. Devido à consistência da dieta hiperlipídica, não se adicionou água na mistura com OA. No caso da dieta à base de ração, que é mais difícil de se reconstituir, uma quantidade mínima de água foi adicionada ao pó de modo a reconstituir os péletes, que foram, então, secos à ar. Novos lotes de alimentos foram preparados semanalmente. Coleta de sangue
[00674] O sangue foi coletado a partir da cavidade óssea retro- orbital sob anestesia ou a partir da veia caudal. Anestesia
[00675] Para o experimento de varredura dexa, os animais foram anestesiados com uma mistura de cetamina (200 mg/kg) / Xilasina (10 mg/kg) administrada por injeção intra-peritoneal.
[00676] Para a punção de veia, os animais foram anestesiados por inalação de uma mistura de isoflurano-O2. B-Bioquímica
[00677] Os testes foram realizados com uma estação de trabalho laboratorial automatizada Olympus AU-400 utilizando-se reagentes comerciais (Olympus). Análise de lipídeos e lipoproteínas
[00678] Os triglicerídeos séricos, o colesterol total e HDL foram determinados por ensaios enzimáticos. O teor de colesterol HDL sérico foi determinado após a precipitação de lipoproteínas contendo apo B com ácido fosfotungstico/Mg (por exemplo, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). O nível de ácidos graxos livres foi determinado com um kit disponível junto à Wako (por exemplo, Neuss, Alemanha) conforme especificado pelo fornecedor. Exploração Metabólica e endócrina
[00679] A concentração de glicose no sangue foi medida por um analisador Precision Q.I.D (por exemplo, sistema Medisense), utilizando-se eletrodos Medisense Precis (por exemplo, Abbot Laboratories, Medisense products, Bedford, EUA). Este método foi validado, comparando-se os valores do analisador Precision Q.I.D com as medições clássicas de glicose. O método Precision Q.I.D foi escolhido uma vez que o mesmo requer uma quantidade mínima de sangue e, portanto, pode ser empregado para múltiplas medições, como durante um IPGTT. A insulina plasmática (por exemplo, Mercodia, Uppsala, Suécia) foi determinada por ELISA de acordo com as especificações do fabricante. Teste C-Metabólico Perfis de Lipoproteína
[00680] Os perfis de lipoproteína foram obtidos por cromatografia líquida rápida de proteína, que permite a separação das três classes principais de lipoproteínas VLDL, LDL, e HDL. Teste de Tolerância à Glicose Intraperitoneal (IPGTT) - Teste de tolerância à glicose oral
[00681] O IPGTT foi realizado em camundongos que foram submetidos a jejum de um dia para o outro (12 horas). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente (IPGTT) com uma solução de 20 % de glicose em solução salina estéril (NaCl a 0,9%) em uma dose de 2g de glicose/kg do peso corporal. O sangue foi coletado a partir da veia caudal, para monitoramento de glicose e insulina, antes e 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 minutos após a administração da solução de glicose. A área incremental da curva de glicose foi calculada como uma medida de sensibilidade à insulina, enquanto os níveis de insulina correspondentes indicam as reservas secretórias de insulina. Gasto energético
[00682] O gasto energético foi avaliado através de calorimetria indireta medindo-se o consumo de oxigênio com o aparelho Oxymax (por exemplo, Columbus Instruments, Columbus, OH, EUA) durante 12 horas. Este sistema consiste em um circuito aberto com ar entrando e saindo das jaulas de plástico (um camundongo por jaula). Permitiu-se que os animais tivessem livre acesso a alimentos e água. Um sensor de CO2 e O2 bastante preciso mediu a diferença em concentrações de O2 e CO2 em ambos os volumes de ar, que proporcionou a quantidade de oxigênio consumido em um período de tempo desde que o fluxo de ar que entrou na jaula fosse constante. Os dados provenientes do aparelho foram processados em um computador conectado, analisados, e apresentados em um arquivo de Excel exportável. Os valores foram expressos como mL.kg-1.h-1, que é comumente conhecido como o VO2. Determinação do teor de gordura corporal por varredura Dexa
[00683] As análises Dexa foram realizadas pelo Densitômetro Série PIXIMUS de resolução ultra alta (0,18 x 0,18 mm pixels, GE Medical Systems, Madison, WI, EUA). A densidade mineral óssea (BMD in g/cm2) e a composição corporal foram determinadas utilizando-se o software PIXIMUS (versão 1,4x, GE Medical Systems). D- Medição da pressão sanguínea não-invasiva e pulso
[00684] O Sistema de Análise de Pressão Sanguínea Visitech BP- 2000 consiste em um sistema de pletismografia de cauda automatizado por computador que é usado para coletar várias medições em 4 camundongos acordados simultaneamente sem intervenção do operador. Os camundongos foram colocados em câmaras escuras individuais em uma plataforma aquecida com suas caudas enroladas através de uma pletismografia de cauda. O sistema mede a pressão sanguínea determinando-se a pressão da pletismografia na qual o fluxo de sangue até a cauda foi eliminado. Um sensor fotoelétrico detecta o pulso do espécime. O sistema gera resultados que corresponderam precisamente à pressão intra-arterial média simultaneamente na artéria carótida. Este permite que valores reproduzíves da pressão sanguínea sistólica e da frequência cardíaca sejam obtidos. Isto requer treinamento dos animais por uma semana no sistema. E- Atividade em um ciclo de 24 horas
[00685] A atividade locomotora espontânea foi medida utilizando-se caixas individuais, cada uma composta por um piso deslizante, uma jaula separável, e equipada com captores infravermelhos que permitem a medição da atividade locomotora ambulatória e para trás. As caixas foram ligadas a um computador utilizando-se uma interface eletrônica (por exemplo, Imetronic, Pessac, França). Os camundongos foram testados durante 32 horas com o intuito de medida a habituação ao aparelho, assim como as atividades noturnas e diurnas. A quantidade de água consumida foi medida durante o período de teste utilizando-se um medidor de lambidas automatizado.
[00686] Os resultados do estudo são mostrados nas Figuras 1 a 9. A Figura 1 mostra o impacto do composto Ih3e sobre o ganho de peso corporal em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e à base de ração. O ganho de peso corporal foi medido durante 16 semanas. Os camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e apresentaram menos ganho corporal do que os camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o veículo. A Figura 2 mostra que o composto Ih3e aperfeiçoa o perfil metabólico dos camundongos submetidos à dieta hiperlipídica. Os resultados da análise do plasma sanguíneo e da frequência cardíaca nos camundongos com obesidade induzida por dieta tratados com o composto Ih3e são mostrados na Figura 2, incluindo os níveis de glicose no sangue, enzimas hepáticas (LDH, ASAT, e ALAT) e lipídeos plasmídeos (colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, e triglicerídeos). Os camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e apresentaram níveis menores de glicose no sangue, enzimas hepáticas, e lipídeos plasmáticos em relação aos camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o veículo. A frequência cardíaca dos camundongos altamente alimentados tratados com o composto Ih3e também apresentou uma frequência cardíaca em comparação com os camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o veículo. A Figura 3 mostra que o composto Ih3e aperfeiçoa a tolerância à glicose em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica. Após 10 semanas, os níveis de insulina plasmática aumentaram tanto nos camundongos submetidos à dieta à base de ração como nos camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e em comparação aos camundongos tratados com o veículo, conforme mostrado na Figura 3A. Após 12 semanas, os níveis de glicose se mostraram menores nos camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e conforme mostrado na Figura 3B. A Figura 4 mostra os resultados de teste de tolerância à glicose oral (OGTT) como níveis de glicose durante um período de 200 minutos em camundongos submetidos a uma dieta à base de ração tratados com o composto Ih3e. A Figura 5 (gráficos A-D) mostra a liberação de insulina in vivo após uma refeição teste. A Figura 5A mostra a liberação de insulina durante 30 minutos. A Figura 5B mostra um aumento na liberação de insulina comparada ao nível basal de insulina. Os níveis de insulina atingiram níveis superiores em ~12 minutos em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e em comparação com os camundongos tratados com o veículo. As Figuras 5C e 5D mostram o aumento na liberação de insulina comparado aos níveis basais de insulina. O aumento em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e foi maior nos pontos de tempo de 15 e 30 minutos, conforme mostrado na Figura 5D. As Figuras 6 (gráficos A-D) e 7 (gráficos A-C) mostram que os camundongos tratados com o composto Ih3e têm um aumento na razão de troca respiratória (RER) mediante HFD (dieta hiperlipídica) que pode ser explicado de acordo com sua sensibilidade aperfeiçoada à insulina mantendo sua capacidade de oxidar glicose. A Figura 8 (gráficos A e B) mostram a atividade locomotora e a ingestão de alimentos/água de camundongos alimentados com uma dieta hiperlipídica tratados e de camundongos alimentados com uma dieta à base de ração tratados em comparação ao veículo tratado. A ingestão de alimentos/água para camundongos alimentados com uma dieta hiperlipídica e tratados com o composto Ih3e mostrou um ligeiro aumento na ingestão verses os camundongos tratados com o veículo. A Figura 9 (gráficos A-C) mostra as alterações no peso dos órgãos. As Figuras 9B e 9C mostram o percentual de alteração no peso corporal, fígado, rins, coração, , peri WAT, epi WAT, Sc WAT, e BAT comparados ao peso em camundongos alimentados com uma dieta à base de ração. Em todos os órgãos, os camundongos submetidos à dieta hiperlipídica tratados com o composto Ih3e apresentaram uma alteração percentual reduzida. EXEMPLO 10: Propriedades Físico-Químicas Solubilidade em Água
[00687] Os BA sólidos (sob a forma protonada para o composto Ih3e) foram suspensos em 5 mL de 0,1 M HCl. As soluções saturadas, após incubação por 1 semana, foram filtradas em um filtro Millipore (0,22 μpm) e a concentração de BA foi medida por HPLC-ESI-MS/MS utilizando-se uma coluna C18 (150mm x 2mm i.d., 4μm) e fases móveis de água contendo 15mM de ácido acético com pH 5 e acetonitrila. A taxa de vazão foi de 150 μl/min. A aquisição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de monitoramento de reação múltipla utilizando-se a fonte ESI em ionização negativa. A solubilidade em água foi expressa como μmol/litro.
[00688] A solubilidade em água do composto Ih3e é igual a 99 pM um valor maior que o diidróxi BA correspondente e comparável àquele de CA (consulte a Tabela 4). Tabela 4.
Figure img0036
a Ws: solubilidade em água se refere ao BA como uma espécie protonada e, portanto, não avaliada para TCDCA, e TUDCA que são altamente solúveis (hs). b CMC: Concentração Micelar Crítica determinada em uma solução de água e 0,15 M de NaCl. c ST CMC: Tensão superficial em CMC em uma solução de água e 0,15 M de NaCl. d LogPA: coeficiente de partição 1-octanol-água dos ácidos biliáticos estudados como espécies ionizadas. *: valores da literatura.
[00689] A presença de um grupo 23-metila no composto Ih3e não compromete a solubilidade em água. O composto Ih3e exibe um valor de solubilidade na faixa de BA de ocorrência natural e os análogos sintéticos previamente estudados. Além disso, determinada a aglutinação de albumina relativamente boa do composto Ih3e, a circulação do composto Ih3e no sangue pode ser facilitada, favorecendo, assim, o medicamento sistêmico de TGR5 em tecidos periféricos, como músculos e tecido adiposo marrom. Os exemplos 9, 16 e 17 suportam, ainda, esta hipótese. Concentração Micelar Crítica (CMC)
[00690] A detergência, isto é, a tendência de formar micelas foi avaliada para todas as moléculas carregadas que são solúveis em água como sal de Sódio (2 unidades até o pKa). A concentração micelar crítica (CMC) foi determinada pelas medições de tensão superficial (ST) utilizando-se um método de pressão máxima por bolhas que proporciona valores de tensão superficial ligeiramente afetados por impurezas potenciais, assim como os métodos estáticos. O tensiômetro era um Sensadyne 6000 (Chem-Dyne Research Corp., Milwaukee, WI, EUA) equipado com duas sondas de vidro de 0,5 e 4,0 mm de diâmetro conectadas a uma fonte de nitrogênio. A frequência de bolhas era de 1 bolha/segundo em água destilada a 26°C (P=2,7 atm) e a calibração foi realizada com água duplamente destilada e metanol. A tensão superficial de soluções de sais sódicos BA em NaCl 0,15 M foi medida em várias concentrações dentro da faixa de 0,13 a 50 mM. Os valores de tensão superficial foram graficamente representados em relação ao logaritmo da concentração de sal biliático; as linhas de regressão correspondentes às duas partes da curva (fases monoméricas e micelares) foram calculadas utilizando-se o método dos mínimos quadrados, e a interseção das linhas foi tomada como o valor CMC. A partir das curvas ST vs concentração, o valor da tensão superficial em CMC (equilíbrio entre os monômeros e espécies de multímeros) também foi calculado proporcionando informações sobre o pó detersivo que é relacionado ao tamanho das micelas com uma capacidade de redução de tensão superficial associada.
[00691] O CMC foi avaliado pelas medições de tensão superficial em condições não-equilibradas, isto é, em condições onde as impurezas afetam ligeiramente os resultados de tensão superficial (Figura 10).
[00692] O composto Ih3e apresenta um baixo CMC, porém, uma detergência moderada e uma capacidade de redução de tensão superficial, conforme mostrado pelos valores de tensão superficial em CMC (baixa detergência significa baixa toxicidade à membrana ou às células). Coeficiente de partição de octanol/água
[00693] Visto que o sulfato e os análogos sulfonados sempre são ionizados em todos os valores de pH, o coeficiente de partição de octanol/água foi medido para todas as moléculas sob a forma ionizada e, portanto, os análogos carbóxi foram estudados em pH alto. O coeficiente de partição 1-octanol/água (log P) foi avaliado utilizando-se um procedimento convencional de agitação de frasco. Os experimentos foram realizados em uma solução de sal biliático 0,1 mM tamponada em pH 8 com 0,1 M de tampão de fosfato de modo a garantir uma ionização completa do BA; os valores de log P se refere ao BA sob a forma ionizada, não às espécies protonadas, e a concentração inicial de cada BA estava abaixo de seu próprio valor de CMC. O tampão aquoso foi previamente pré-saturado com 1-octanol, 5 mL de 1-octanol pré-saturado com água foi, então, adicionado e as amostras deixadas se equilibrarem durante 2 semanas sob agitação contínua em temperatura ambiente Após a centrifugação, as duas fases foram cuidadosamente separadas. A concentração de BA na fase aquosa foi medida com HPLC-ESIMS/MS utilizando-se uma coluna C18 (150mm x 2mm i.d., 4μm) e, como fases móveis, água contendo 15 mM de ácido acético pH 5 e acetonitrila. A taxa de vazão foi de 150 μal/min e a coluna mantida em 45°C. A aquisição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de monitoramento múltiplo utilizando-se a fonte ESI em ionização negativa.
[00694] O composto Ih3e carboxilado com três grupos hidroxila na posição 3α,7α e 12α apresenta uma lipofilicidade ligeiramente maior em relação ao análogo natural CA, 1,4 vs 1,1 como resultado da presença de uma etila na posição 6 e uma metila na posição 23. Aglutinação de albumina
[00695] A extensão da aglutinação de albumina foi avaliada por diálise em equilíbrio em uma razão fixa de BA-albumina. O BA foi dissolvido em uma concentração de 100 μM em uma solução salina de albumina bovina sérica a 5% (pH 7,2) e deixado descansar durante 24 horas a 25°C. Dialisaram-se dois mililitros desta solução em sacos de celulose tendo um peso molecular de corte de 12-14.000 em relação a 25 mL de solução salina. O sistema foi equilibrado por agitação mecânica suave durante 72 horas a 25°C. As concentrações de BA da solução dialisada (correspondente à fração não-ligada livre) e da solução de partida foram determinadas com HPLC-ESI-MS/MS nas mesmas condições da análise prévia.
[00696] O percentual de aglutinação de albumina foi calculado a partir da concentração de BA inicial e a partir da concentração não- ligada na fração dialisada. Os dados são reportados na Tabela 4.
[00697] O percentual de aglutinação de albumina do composto Ih3e é ligeiramente maior do que CA e deriva a partir da presença dos grupos 23 metila e 6 etila. EXEMPLO 11: Estabilidade metabólica in vitro em culturas de fezes humanas Estabilidade em Bactérias Intestinais. Exemplo 11a: 7a-desidroxilação.
[00698] As fezes humanas frescas homogeneizadas (500 mg) foram transferidas em frascos esterilizados aos quais adicionaram-se 5 mL de meio de glicose à base de carne moída esterilizada (Scott Lab., Fiskville, RI). Então, adicionou-se BA em uma concentração final de 0,05 mM. Os frascos foram incubados a 37°C; então, em 0, 1, 2, 4, 8 e 24 horas após a adição do BA, a reação foi interrompida com 150 μL de 30% de KOH. As amostras foram centrifugadas em 3500 rpm por 10 minutos; a partir do sobrenadante, o BA foi isolado por extração em fase sólida C-18 e analisado por TLC e HPLC-ES-MS/MS.
[00699] Uma cromatografia em camada delgada (TLC), que utiliza placas de sílica gel com espessura de 0,25 mm (Merck, Darmstat, Alemanha), foi empregada como o primeiro teste de triagem. O sistema de solvente usado para a separação de BA conjugado foi composto por ácido propiônico /acetato de isoamil / água /N-propanol (3:4:1:2, v/v/v/v; solvente I), e aquele do BA não-conjugado foi composto por ácido acético / tetracloreto de carbono /isopropil éter / acetato de isoamil / água /N-propanol/benzeno (1:4:6:8:2:2, v/v/v/v/v/v; solvente II). O BA separado foi revelado com uma solução de etanol a 5% de ácido fosfomolibdico.
[00700] O composto Ih3e era bastante estável quando incubado em culturas de fezes humanas e até mesmo após 24 horas, mais de 85 % do composto foram recuperados. Em contrapartida, o análogo natural de referência CDCA apresentou um tempo de meia-vida de quase uma hora e após 8 horas de incubação estava quase completamente metabolizado (7-desidroxilado) de modo a formar ácido litocólico.
[00701] Após uma incubação longa para Ih3e, a 7-desidroxilação e a formação intermediária de um derivado 7-oxo foram praticamente abolidas. Exemplo 11b:
[00702] Sabe-se que as bactérias intestinais hidrolisam a ligação de amido C24 de BAs conjugados de taurina e glicina e remove o grupo 7α-hidroxila de CA, levando à formação dos BAs secundários lipofílicos tóxicos, tal como o ácido deoxicólico (DCA) (Ridlon, J.M., et al., J. Lipid Res. 2006, 47, 241-259). Objetivando determinar a sensibilidade do composto Ih3e à 7-desidroxilação mediada pela flora intestinal, sua estabilidade metabólica foi avaliada em uma cultura líquida de fezes humanas conforme descrito em Roda, A., et al., J. Lipid Res. 1994, 35, 2268-2279. O composto Ih3e não aparenta ser sensível a este processo e se mostrou ser altamente estável com mais de 95% do composto não-modificado após 12 horas de incubação. Por comparação, mais de 50% de CA (ácido cólico) foram metabolizados após 1 hora e até 90% dentro de 8 horas (Figura 15). É provável que a estabilidade estendida do composto Ih3e seja relacionada à alquilação da posição C6 que proporciona um impedimento estérico ao processo de 7a-desidroxilação bacteriano. Estabilidade da Cadeia Lateral
[00703] De acordo com esses resultados, a cadeia lateral do composto Ih3e não foi modificada por atividades enzimáticas bacterianas intestinais.
[00704] Esses dados sugerem que a presença do grupo etila na posição C-6 protege o grupo 7-hidroxila em relação à oxidação ou remoção por impedimento estérico. Além disso, composto Ih3e é bastante estável para um metabolismo de cadeia lateral. Não foram encontrados metabólitos secundários por HPLC-ES-MS/MS. Esses dados sugerem que no conteúdo intestinal inferior na presença de bactérias anaeróbicas esses análogos sejam estáveis. EXEMPLO 12: Secreção Biliar e metabolismo do composto Ih3e em fistula biliar de ratos após administração duodenal (id) e femoral (iv) Exemplo 12A: Objetivo e Argumentação
[00705] As modificações estruturais dos ácidos biliáticos podem afetar sua absorção hepática, transportes e secreção hepática e absorção intestinal. Portanto, o conhecimento da secreção biliar após a administração iv e id junto ao seu metabolismo é um ponto chave na seleção de composto para estudos adicionais.
[00706] Objetivando avaliar o modo e a eficiência da absorção intestinal do composto Ih3e, o composto foi administrado tanto de modo intravenoso (infusão femoral) e como oral (infusão duodenal) na mesma dose e sua taxa de secreção biliar foi avaliada em um modelo de fistula biliar de ratos.
[00707] As diferenças na área sob a curva da secreção biliar vs tempo entre a administração iv e id considera sua absorção intestinal e proporciona informações sobre sua biodisponibilidade. Além disso, o metabolismo hepático e intestinal também pode ser bastante diferente e, portanto, determinou-se a secreção biliar do composto Ih3e e seus metabólitos hepáticos principais. Efeito Colerético - Infusão Duodenal
[00708] O modelo de fistula biliar de ratos foi desenvolvido nas instalações laboratoriais da Universidade de Bologna. O composto Ih3e foi administrado em uma dose de 1 μmol/kg/min (1 hora de infusão) em um grupo de ratos através de infusão duodenal (id). Os ratos tinham uma fistula biliar para coletar amostras de bile em diferentes momentos antes, durante, e após a infusão. Para o experimento de infusão duodenal, 6 ratos (250±10 g) foram tratados. As amostras de bile foram coletadas a cada 15 minutos durante quatro horas. Além disso, 3 ratos de controle foram tratados com uma solução salina sob as mesmas condições para tempos e amostragem (ratos de controle duodenal).
[00709] A infusão duodenal do composto Ih3e aumentou significativamente a taxa de vazão de bile que alcançou o valor máximo de cerca de 120 μL/min/kg. Este fenômeno se iniciou durante o período e continuou durante pelo menos 3 horas.
[00710] O composto Ih3e apresentou um efeito colerético potente e acredita-se que este esteja relacionado à sua estrutura; um grupo metila na posição C-23 evita parcialmente a conjugação e esta molécula pode ser submetida a uma trajetória de derivação cole- hepática. Por motivos de comparação, a infusão duodenal de CDCA aumentou ligeiramente o fluxo de bile, não excedendo 80 μL/min/kg. - Infusão Intravenosa
[00711] Para um experimento de infusão femoral, 6 ratos foram tratados. A Figura 12 mostra o fluxo de bile durante o estudo. A infusão femoral se iniciou após 75 minutos de estado fixo e continuou por 60 minutos. Coletaram-se amostras de bile a cada 15 minutos durante quatro horas. Além disso, 3 ratos foram tratados com 3% de uma solução salina BSA sob as mesmas condições para tempos e amostragem (ratos de controle femoral). O fluxo de bile durante a infusão iv de 3% de veículo salino BSA (controle, n=1) manteve um valor variando de 40 a 80 μL/min/kg durante todo o período do experimento.
[00712] A infusão iv do composto Ih3e aumentou significativamente a taxa de vazão de bile e o fenômeno se iniciou 15 minutos após o início do período de infusão e continuou por pelo menos duas horas. O efeito colerético foi bastante similar àquele alcançado no experimento de infusão id. Secreção biliar
[00713] Analisaram-se as amostras de bile coletadas durante os experimentos iv e id para determinar a secreção biliar do composto Ih3e e seus metabólitos. Análise de HPLC-ES-MS/MS.
[00714] Obteve-se um pó cristalino puro do composto Ih3e a partir do laboratório R. Pellicciari de Perugia. Prepararam-se soluções de estoque em metanol em 1 mmol/L e prepararam-se soluções de trabalho diluindo-se volumes apropriados da solução primária. O metanol e a acetronitrila apresentara uma pureza de grau HPLC. A amônia tinha 30% e o ácido acético 99,8%. Todos os reagentes foram obtidos a partir de Carlo Erba Reagents. A água com grau HPLC foi preparada por um sistema Milli-Q. Preparação de amostras
[00715] As amostras de bile de ratos foram colocadas em temperatura ambiente, brevemente agitadas, e diluídas em 1:100 v/v (amostras de bile a partir de orinfusão duodenal) e 1:100 ou 1:200 v/v (amostras de bile a partir de infusão femoral) com 15 mM de tampão de acetato de amônia (pH = 5,0):acetonitrila=70:30 (v/v). A solução final foi transferida em um frasco de auto-amostragem, e 10 μL foram injetados na coluna cromatográfica. Método de HPLC- ESI-MS/MS
[00716] As amostras de bile de ratos foram analisadas por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida (HPLC- MS/MS) utilizando-se uma fonte de eletro-aspersão (ESI) em um modo de ionização negativa.
[00717] Para cromatografia líquida, utilizou-se um módulo de separação Waters Alliance 2695 acoplado a um auto-amostrador. O auto-amostrador foi mantido em 7°C. A separação foi realizada em uma coluna Synergi Hydro-RP C18 (150x2,0mm i.d., 4 μm de tamanho de partícula), protegida por uma pré-coluna SecurityGuard ODS 4x2,0mm i.d., ambos fornecidos junto à Phenomenex. O analito foi eluido utilizando-se 15 mM de tampão de acetato de amônia (pH = 5,00) como uma fase móvel A e acetonitrila como a fase móvel B. A fase móvel B aumentou de 30% para 64% em 10 minutos, então, para 100% em 10 minutos, e mantida constante por 10 minutos. A taxa de vazão era de 150 μL/min e a coluna mantida a 45°C. O efluente de coluna foi introduzido em uma fonte de ESI conectada a um espectrômetro de massa quádruplo triplo (Quattro-LC, Micromass) que opera em um modo de aquisição de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM). Utilizou-se nitrogênio como gás nebulizador em uma taxa de vazão de 100 L/h e como gás de dessolvação em 930 L/h. As temperaturas de bloqueio e dessolvação de fonte iônica foram respectivamente ajustadas para 80°C e 180°C. A voltagem capilar era de 3,0 kV. Utilizou-se o software MassLynx versão 4.0 para aquisição e processamento de dados. Além disso, a utilização de espectrometria de massa em experimentos de configuração MS único ou tandem MS/MS foi realizada para identificar os metabólitos. Quantificação
[00718] Uma curva de calibração de 5 pontos foi preparada diariamente e injetada em duplicata. As amostras de calibração foram obtidas na faixa de concentração de 0,1 a 20 μmol/L preparada na fase móvel. Os parâmetros de curva de calibração linear foram obtidos a partir do gráfico da área de pico de analito versus a concentração de analito utilizando-se uma análise de regressão dos quadrados mínimos (peso = 1/x2). Os coeficientes de correlação eram >0,981.
[00719] Os metabólitos conjugados de taurina do composto Ih3e também foram estimados. Os fatores corretivos, levando-se em consideração as diferentes respostas em ES-MS/MS entre as espécies isentas e conjugadas de taurina, foram estimados e aplicados aos valores de área obtidos a partir dos cromatogramas de conjunto de dados HPLC-MRM. Finalmente, as curvas de calibração obtidas para os ácidos biliáticos livres foram usadas para estimar os metabólitos conjugados de taurina. Farmacocinética (secreção biliar) dos análogos administrados: comparação iv versus id
[00720] Os dados se referem à taxa de secreção do composto recuperado em bile como tal após a infusão duodenal e femoral em uma dose de 1umol/Kg/min.
[00721] A Tabela 5 mostra os valores de concentração e secreção para o composto Ih3e obtidos a partir das amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos). Tabela 5. Valores de concentração e secreção do composto Ih3e obtidos a partir de amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos)
Figure img0037
[00722] A Tabela 6 mostra os valores de concentração e secreção obtidos a partir de amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão femoral (1 hora variando de 75 a 135 minutos). Tabela 6. Valores de concentração e secreção do composto Ih3e obtidos a partir de amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão femoral (1 hora variando de 75 a 135 minutos).
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Tabela 6A. Valores de concentração e secreção de Tauro-Ih3e estimados a partir de amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos)
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Tabela 6B. Valores de concentração e secreção de Tauro-Ih3e estimados a partir de amostras de bile de ratos coletadas durante a infusão femoral (1 hora variando de 75 a 135 minutos)
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[00723] A secreção biliar do composto Ih3e após a administração foi eficiente e o composto recuperado em bile em uma porcentagem relativamente alta. O perfil cinético indicou que o composto foi eficientemente absorvido pelo fígado e secretado em bile parcialmente como tal e, da mesma forma, até uma extensão menor, metabolizado para mais compostos polares (Figuras 13, 14a e 14b). Sem se ater a nenhuma teoria particular, acredita-se que a presença do grupo metila na posição C-23 impede o processo de conjugação com taurina e glicina que consiste em parte relevante para uma secreção eficiente de quase todo o BA carboxilado de ocorrência natural; isto é fundamental para diidróxi BA e, até uma extensão menor, para triidróxi BA. A extensão de sua recuperação em bile também se refere à dose administrada. Após a administração id, a recuperação em bile era ligeiramente menor que a recuperação após a administração iv sugerindo que o composto não seja eficientemente absorvido pelo intestino (Figuras 13, 14c e 14d). Considerando as propriedades físico- químicas, espera-se que este composto possa ser absorvido por um mecanismo de difusão passiva (LogP=1,44) e um mecanismo ativo não pareceu estar envolvido. A presença de três grupos hidroxila permite que a molécula em um lado seja eficientemente absorvida pelo fígado e parcialmente secretada em bile. Isto também evita que a molécula seja absorvida pelo intestino. Exemplo 12B
[00724] Os resultados na Tabela mostrada abaixo revelam que o composto Ih3e tem um efeito colerético potente, com a taxa máxima de secreção biliar (SV0) sendo significativamente maior que aquela de CDCA e CA. Tabela. Parâmetros de Secreção Lipídica Biliar após a infusão iv e id em uma Dose de 1 (μmol/min)/kg bw durante 1 hora de BAsa
Figure img0042
αOs dados representam os valores médios e os desvios- padrão de seis experimentos independentes. O veículo usado para a administração id foi uma solução salina. O veículo usado para a administração iv era uma solução salina BSA a 3%, pH 7,2. SV0: taxa máxima de secreção biliar ((μL/ min)/kg bw). SBA: taxa máxima de secreção BA ((μmol/min)/kg bw). % isenta: porcentagem da dose administrada recuperada na bile das moléculas. % conjugada: porcentagem da dose administrada recuperada como BA conjugado.
[00725] Consequentemente, os resultados na tabela anterior mostram que o composto Ih3e são resistentes à conjugação, com mais de 90% do composto sendo secretado na bile em sua forma não- conjugada após infusão intravenosa ou intraduodenal. Em contrapartida, CDCA e CA não podem ser secretados em bile, exigindo uma etapa de conjugação. Portanto, contempla-se que o grupo metila C23(S) do composto Ih3e evita a ativação carboxil CoA e uma conjugação subsequente, favorecendo, assim, sua trajetória de derivação cole-hepática com uma absorção ductular e um efeito colerético potente.
[00726] Objetivando estudar adicionalmente a influência da configuração do grupo metila C23 no efeito de amidação e colerético de cadeia lateral do composto, também realizaram-se análises similares no outro epímero, isto é, ácido 6a-etil-23(R)-metil cólico (R- EMCA na tabela anterior). A inspeção da taxa máxima de secreção biliar (SV0) mostra que o efeito colerético de R-EMCA ainda é maior que CA, embora menor que o composto Ih3e. Como resultado, esses dados sugerem que a orientação do grupo metila C-23 seja importante para a conjugação do grupo carboxila, com a porção metila deficientemente ajustada no bolso catalítico da enzima de conjugação no caso do epímero C23(S). No geral, esses resultados mostram que o composto Ih3e é eficientemente absorvido e submetido a uma ciclagem entero-hepática embora com uma conjugação hepática relativamente pequena. A baixa taxa de conjugação também pode permitir que o composto Ih3e escape do afastamento de primeira passagem hepática e alcance a circulação sanguínea sistêmica. Metabolismo Hepático
[00727] Para uma triagem preliminar, a busca dos possíveis metabólitos foi realizada com base nos compostos esperados de acordo com os experimentos e dados anteriores e nas propriedades estruturais e físico-químicas do composto Ih3e.
[00728] O composto Ih3e é principalmente secretado como um composto parente (não-modificado) e foi apenas ligeiramente metabolizado pelo fígado. O metabólito principal era o conjugado de taurina e o mono glucuronida estava presente em uma quantidade baixa. O metabolismo é similar para ambas as administrações iv e id. Considerando a recuperação na bile, espera-se identificar outros metabólitos.
[00729] A presença do grupo metila na posição C-23 impere o processo de conjugação com taurina e glicina que é, em parte, necessário para uma secreção eficiente de quase todos os BAs carboxilados de ocorrência; isto é fundamental para diidróxi BA e, até uma extensão menor, para triidróxi BA visto que já são bastante polares. A formação de glucuronidas pode se tornar relevante se forem administradas doses maiores.
[00730] A Figura 14a mostra o composto Ih3e e seus metabólitos principais identificados na bile utilizando-se espectrometria de massa no experimento iv. Os dados são reportados como valores de área absoluta (n = 5). A Figura 14b é uma exibição em zoom da Figura 14a. A Figura 14c mostra o composto Ih3e e seus metabólitos principais identificados na bile utilizando-se espectrometria de massa no experimento di. Os dados são reportados como valores de área absoluta. A Figura 14d é uma exibição em zoom da Figura 14c.
[00731] Em resumo, o composto Ih3e é moderadamente hidrofílico e tem uma detergência moderada. Sua absorção hepática parece ser eficiente. A secreção biliar também é eficiente considerando que o composto é secretado principalmente não-modificado e, até uma extensão limitada, conjugado com taurina. A absorção intestinal também é eficiente, mesmo se não for completa, e a molécula não requer um metabolismo hepático extensivo na dose administrada a ser secretada na bile. A presença do grupo metila na posição C-23 evita uma conjugação extensiva com taurina para secreção biliar. Portanto, existe um aumento no tempo de ressonância hepática da molécula que é submetida a uma trajetória de derivação cole-hepática, responsável por seu efeito colerético potente. EXEMPLO 13: Toxicidade in vitro em célula HepG2
[00732] Os compostos da invenção foram avaliados para determinação de toxicidade in vitro utilizando-se um ensaio de célula HepG2. A citotoxicidade de célula HepG2 foi determinada monitorando-se a redução de ATP e a apoptose de célula HepG2 foi determinada monitorando-se a ativação de caspase-3. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Citotoxicidade
[00733] A viabilidade celular foi medida utilizando-se um Perkinelmer ATP-Lite 1 STEP. ATP é um marcador para viabilidade celular porque está presente em todas as células metabolicamente ativas e a concentração declina muito rapidamente quando as células forem submetidas à necrose ou apoptose. As células HepG2 (1x104) foram semeadas em uma placa com 96 poços e estimuladas com diluições diluídas 10 vezes a partir de 1 nM a 300 μM do composto Ih3e durante 4 horas a 37°C. As placas foram equilibradas em temperatura ambiente durante 10 minutos e 100 μl de Reagente ATP- Lite 1 STEP foram adicionadas a 100 μl do meio de cultura contendo células. A luminescência foi lida com Victor Light (PerkinElemr). O sinal experimental foi subtraído a partir do segundo plano. Utilizou-se tamoxifeno como o controle positivo de citotoxicidade celular, enquanto o controle negativo eram as células não-tratadas. Apoptose
[00734] As caspases participam no controle molecular de apoptose e o Substrato TruPoint Caspase-3 permite um ensaio de fluorescência sensível, robusto e homogêneo discriminado no tempo da atividade caspase-3. As células hepatócitas humanas (HepG2) foram semeadas (1x104) em uma placa de 96 poços com meio de HepG2 sem piruvato de sódio. As células foram estimuladas 4 horas a 37°C com diluições seriais do composto Ih3e de teste a partir de 1nM a 300 μM em triplicata. Utilizou-se estaurosporina como controle positivo de células apoptóticas. Os controles negativos eram: 1. Células não-estimuladas; 2. Meio sozinho sem células; 3. Células incubadas sem o substrato caspase. O tampão de lise e o Substrato Caspase-3 foram adicionados às células e 1 hora e 24 horas após a fluorescência foi medida com EnVision. Necrose
[00735] A necrose celular foi analisada medindo-se a liberação de Lactato Desidrogenase (LDH) a partir das células necróticas utilizando- se um Ensaio de Integridade de Membrana Homogênea Promega’s CytoTox ONE. As células HepG2 (1X104) foram semeadas em uma placa de 96 poços. Após 18 horas de incubação, meio livre sem Piruvato de Sódio e isento de Soro foi substituído e o composto Ih3e foi adicionado em resposta de dose a partir de 0,1 μM a 500 μM. utilizou-se Triton a 1 % como o controle de liberação máximo de LDH. Utilizou-se tamoxifeno como o indutor de necrose. As células posicionadas em placas foram colocadas de volta à incubadora por 4 horas adicionais. O sobrenadante foi transferido em uma placa nova e o mesmo volume de Reagente CytoTox-ONE foi adicionado à placa. Após 1 hora de incubação, a fluorescência foi lida através do leitor de placa com múltiplos rótulos EnVision com um comprimento de onda de excitação de 560 nm e uma emissão de 590 nm. Tabela 7.
Figure img0043
EXEMPLO 14: Ensaios de Seletividade NR
[00736] A seletividade dos compostos da invenção foi avaliada utilizando-se métodos de ensaio conhecidos na técnica. De modo específico, utilizaram-se os seguintes métodos de ensaio:
[00737] FXR e LXR: Recrutamento Co-ativador (alphascreen);
[00738] TGR5: nível cAMP em linhagem celular intestinal humana (NCI-H716);
[00739] PXR: Ensaio de Competição de ligantes (Ensaio de aglutinação)
[00740] CAR: Recrutamento Co-ativador (Lanthascreen) A Tabela 8 mostra os resultados desses ensaios. Ensaio Co-ativador TR-FRET
[00741] O ensaio Lanthascreen (Invitrogen) foi usado para um ensaio de seletividade de receptor nuclear. O kit usa um anticorpo anti-GST marcado com térbio, um peptídeo co-ativador marcado com fluoresceína, e um domínio de aglutinação por ligante NR que é marcado com glutationa-S-transferase (GST) em um formato de ensaio homogêneo de mistura e leitura. Os ensaios foram realizados em uma placa de 384 micro-poços (PerkinElmer). Uma reação de ensaio total de 20 incluiu 5 nM de NRs marcados com GST, 125 nM de peptídeo corregulador, 5 nM de anticorpo marcado com TB-anti-GST (S transferase marcado com térbio-anti-glutationa), 5 mM de DTT e concentração variável do composto Ih3e no tampão de ensaio fornecido por Invitrogen. O controle negativo era desprovido do composto Ih3e, porém, continha todo o restante contido no poço agonista. Após 1 hora de incubação no escuro, as medições TR-FRET foram realizadas no Envision. A razão de emissão 520/495 foi graficamente representada em relação às concentrações de ligante variável. Os dados foram analisados utilizando- se GraphPad Prism que utiliza a equação de curva sigmóide com uma inclinação variável para obter os valores EC50. Tabela 8. Ensaios de Seletividade NR
Figure img0044
FXR, LXR, CAR, PPARδ, VDR: Ensaio de Recrutamento Co-ativador; TGR-5: nível cAMP em linhagem celular intestinal humana, NCI-H716; PXR: Ensaio de competição de ligantes; Petição 870210007956, de 22/01/2021, pág. 144/225 EXEMPLO 15: Estabilidade do Composto
[00742] A estabilidade do composto Ih3e foi determinada utilizando- se métodos conhecidos na técnica. A concentração de fração celular era igual a 1mg/mL ao longo de um curso de tempo de 0-15-30-60120-240-360-1440 minutos. Os controles positivos eram testosterona (1000 ng/mL); 7-hidróxi coumarina (1296 ng/mL); ácido benzóico (2440 ng/mL) ao longo de um curso de tempo de 0-10-20-40-60-120. O método analítico usado foi a separação LC/MS em coluna C18 por polaridade gradiente; a aquisição foi realizada em um Monitoramento Iônico Único. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 9. Tabela 9.
Figure img0045
Exemplo 16: Liberação de GLP-1 ex vivo
[00743] A Figura 16 mostra que o composto Ih3e induz de modo dramático e dose-dependente a liberação de GLP-1 ex vivo. A Figura 16 mostra o impacto de 1 hora de exposição à concentração indicada do composto Ih3e na liberação GLP-1 ex vivo em explantes ileais isolados dos camundongos macho TGR5-Tg de 18 semanas de idade alimentados com HF (n = 4). Os dados são representados como média + SE: teste t de Student não-emparelhado, (*) P < 0,05, explantes ileais tratados com o composto Ih3e vs explantes ileais tratados com o veículo.
[00744] Os Procedimentos Experimentais a seguir são utilizados nos Exemplos 17 a 21. Produtos Químicos e Reagentes
[00745] Todos os reagentes bioquímicos foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich, exceto onde indicado em contrário. O inibidor de DPP4 (DPP4i) sitagliptina foi presenteado pelo Dr. C. Ullmer (Hoffmann-La Roche). O composto Ih3e foi sintetizado conforme descrito previamente (Macchiarulo et al., 2008; Pellicciari et al., 2007). Cultura Celular
[00746] Os experimentos in vitro foram realizados em células STC-1 ou NCI-H716 tratados com o veículo (DMSO) ou composto Ih3e. O composto Ih3e foi avaliado por sua atividade agonística em TGR5 conforme descrito previamente (Macchiarulo et al., 2008, J. Chem. Inf. Model. 48, 1792; Pellicciari et al., 2007, J. Med. Chem. 50, 4265-4268). A produção de cAMP foi realizada conforme descrito (Sato et al., 2008, J. Med. Chem. 51, 1831; Watanabe et al., 2006, Nature 439, 484). A atividade de Cox foi avaliada seguindo-se a oxidação de citocromo c (Sigma) completamente reduzido em 550 nm (Feige et al., 2008b, Cell Metab. 8, 347). A razão de ATP/ADP e a liberação de GLP-1 foram medidas de acordo com as instruções do fabricante (Biovision e Millipore, respectivamente). Os adipócitos marrons primários foram preparados conforme descrito previamente (Watanabe et al., 2006, Nature 439, 484), e os explantes ileais foram preparados de acordo com um método estabelecido (Cima et al., 2004, J. Exp. Med. 200, 1635-1646). Quantificação de Cálcio Intracelular
[00747] As células NCI-H716 (40.000 células) foram semeadas em placas negras de 96 poços revestidas com Matrigel (BD Biosciences). Setenta e duas horas após a transfecção, a células foram lavadas duas vezes em tampão de ensaio (HBSS1x, 20mM HEPES [pH 7.4]) e testadas para determinação do cálcio intracelular com Fluo-4 AM de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Bioquímica e Histoquímica
[00748] Os parâmetros plasmáticos e o teor lipídico hepático e fecal foram medidos conforme descrito (Mataki et al., 2007, Mol. Cell. Biol. 27, 8330-8339). As colorações de hematoxilina e eosina (H&E), vermelho Sirius, e vermelho red O em óleo foram realizadas conforme descrito (Mark al., 2007, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29B, 24), e os micrófagos foram tomados em microscópios convencionais (Leica) com uma câmera CCD. Para seções pancreáticas, as ilhotas foram dimensionadas e contadas a partir de quatro seções alternadas coletadas por HE separadas de 150 μM utilizando-se um software ImageJ (cinco animais por grupo). A coloração imunofluorescente de insulina foi realizada conforme descrito (Fajas et al., 2004, J. Clin. Invest. 113, 1288). Adicionalmente, as ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão de colagenase de pâncreas proveniente de camundongos TGR5-Tg alimentados com HF de acordo com os procedimentos disponíveis online (por exemplo, consulte JOVE (Journal of Visualized Experiments website)). A insulina foi extraída após uma incubação O/N a -20°C em etanol ácido e medida por ELISA em amostras diluídas em PBS de acordo com as instruções do fabricante (Mercodia). A liberação de GLP-1 foi medida in vitro, ex vivo, e in vivo de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Medição do Consumo de Oxigênio
[00749] O consumo de oxigênio celular foi medido utilizando-se um analisador Seahorse Bioscience XF24 com dez réplicas biológicas por condição (Feige et al., 2008b, Cell Metab. 8, 347). Experimentos Animais
[00750] Os animais foram alojados e criados de acordo com procedimentos padronizados (Argmann e Auwerx, 2006b). Camundongos macho com idade compatível foram usados para todos os experimentos. Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs), isto é, camundongos TGR5-Tg e TGR5—/—, foram gerados conforme descrito nos Dados Suplementares. DIO em camundongos GEMMs ou C57BL/6J (Charles River) foi induzido alimentando-se camundongos de 8 semanas de idade com uma dieta HF (60% de calorias/gorduras, D12492; Research Diets) durante pelo menos 8 semanas, conforme mencionado no texto e nas legendas das figuras. Nos experimentos de intervenção alimentar, o composto Ih3e foi misturado com a dieta (Feige et al., 2008a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29B, 25) em uma dosagem suficiente para alcançar uma dose in vivo de 30 mg/kg/d. Realizaram-se experimentos em fenótipos de camundongos de acordo com os protocolos EMPRESS (consulte, por exemplo, o website Empress (European Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screening)) e foram voltados para avaliar a ingestão de alimentos e água, a composição corporal (Argmann et al., 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29A, 23), o gasto energético (Argmann et al., 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29A, 23), a homeóstase de glicose e lipídeo (Argmann et al., 2006b, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29A, 22); Heikkinen et al., 2007, Curr. Protoc. Mol. Capítulo 29, Unidade 29B, 23; Mataki et al., 2007, Mol. Cell Biol. 27, 8330), e plasma biochemistry (Argmann e Auwerx, 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, Unidade 29A, 22). Coletaram-se e processaram-se tecidos e sangue para histopatologia, análises químicas sanguíneas, e expressão genética de acordo com procedimentos padronizados (Argmann e Auwerx, 2006a; Feige et al., 2008b; Mark et al., 2007; Watanabe et al., 2006). Realizaram-se estudos de clamp euglicêmico hiperinsulinêmico conforme descrito (Feige et al., 2008b), com pequenas modificações incluindo uma alteração no bolo de insulina inicial (30 mU/kg) e taxa de infusão de insulina (10 mU/min/kg). Os níveis plasmáticos GLP-1 foram medidos por ELISA (Millipore) no sangue coletado por punção retro-orbital. Os experimentos com camundongos db/db (Charles River) foram realizados em animais de 14 semanas de idade alimentados com um CD na presença ou ausência do composto Ih3e (30 mg/kg/d) durante 6 semanas (Feige et al., 2008a). Perfil da Expressão Genética
[00751] O perfil da expressão genética foi realizado por PCR quantitativo em tempo real (Feige et al., 2008b; Watanabe et al., 2006). As sequências primárias usadas foram previamente publicadas, exceto aquelas usadas para o gene Kir6.2: R-5' AGATGCTAAACTTGGGCTTG (SEQ ID NO. 1), F-5' TAAAGTGCCCACACCACTC (SEQ ID NO. 2). Estatísticas
[00752] As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste t de Student não-emparelhado. Os dados são expressos como média ± SEM, e P valores menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Exemplo 17: Expressão de mRNA TGR5
[00753] Uma ligação entre BAs e o gasto energético in vivo (Watanabe et al., 2006, Nature, 439, 484-489) foi previamente estabelecida, portanto, especulou-se que a ativação da sinalização de TGR5 influenciaria a atividade mitocondrial de um modo mais geral. Com o intuito de encontrar o suporte inicial para este hipótese, a expressão de mRNA TGR5 foi analisada através do banco de dados de mRNA hepático GeneNetwork na população de referência genética BxD conforme encontrado no website da Univeristy of Tennessee GeneNetwork. Uma ampla faixa de variação em expressão de mRNA TGR5 era evidente entre as diferentes cepas de camundongos BxD. Curiosamente, a expressão de mRNA TGR5 era altamente correlacionada de modo significativo à expressão de vários genes que codificam para subunidades de complexos envolvidos em fosforilação oxidativa, tal como citocromo c oxidase (Cox) (por exemplo, CoxVI1a; Figura 17A) e síntese de ATP (Atp6v0b, subunidade B da ATPase H+ de transporte V0; Atpaf2, fator 2 de montagem complexa FI mitocondrial de sintase de ATP; Atp1 a3, polipetídeo alfa 3 de transporte ATPase Na+/K+; Atp6v1 b2, subunidade B da ATPase H+ de transporte V1 isoforma 2). De acordo com esta observação, o tratamento de células STC-1 com o composto Ih3e resultou em um aumento dependente de cAMP na atividade Cox (Figura 17B), que foi associado a um aumento no consumo de oxigênio celular (Figura 17C) e um aumento na razão de ATP/ADP (Figura 17D). Este resultado foi confirmado na linhagem celular enteroendócrina humana NCI-H716, na qual o tratamento com o composto Ih3e aumento a produção de ATP de maneira dependente de cAMP. Curiosamente, a expressão TGR5 também era consideravelmente correlacionada àquela de Kir6.2, um componente do canal de potássio ATP-dependente (KATP) (Figura 17E). Essas correlações foram adicionalmente corroboradas pela interferência de RNA TGR5 em células STC-1, que resultou em uma quadra concomitante na expressão de CoxIV e Kir6.2 mRNAs (Figura 17F). Exemplo 18. A ativação da via de sinalização de TGR5 aumenta os níveis intracelulares de cálcio e estimula a liberação de GLP-1 em células L enteroendócrinas
[00754] Em células β pancreáticas, estabelece-se que um aumento na razão de ATP/ADP derivada a partir do metabolismo de glicose fecha os canais KATP, resultando na despolarização da membrana plasmática. Sucessivamente, esta despolarização de membrana abre os canais de cálcio regulados por voltagem (Cav), causando um influxo de cálcio. Então, o aumento resultante no cálcio intracelular aciona a interação direta entre as proteínas exocitóticas situadas na membrana granular contendo insulina e aquelas localizadas na membrana plasmática (Yang e Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676), levando à liberação subsequente de insulina (Nichols, 2006, Nature, 440, 470-476). Recentes constatações suportam a hipótese que os canais KATP e Cav também representam um papel essencial na liberação de GLP-1 a partir de células L enteroendócrinas (Reimann e Gribble, 2002, Diabetes 51, 2757-2763; Reimann et al., 2008, Cell Metab. 8, 532-539). De maneira fascinante, na população de referência BxD, verificou-se que a expressão TGR5 se correlacionou à expressão de Cav2.2 (Figura 18A), cuja expressão foi previamente descrita em células enteroendócrinas (Reimann et al., 2005, J. Physiol. 563, 161-175) e que participa na liberação de insulina estimulada por cálcio em células 3 pancreáticas (Yang e Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676). Juntamente a este fato, o composto Ih3e aumentou robustamente o influxo de cálcio na linhagem celular enteroendócrina humana NCI-H716, um efeito foi potenciado pela superexpressão de TGR5 e, em contrapartida, aliviado pela interferência de RNA TGR5 (Figuras 18B e 18C) ou pela adição do inibidor de adenilato ciclase MDL-1 2330A(MDL) (Figura 18D). Além disso, a presença de glicose aprimorou o aumento dependente de TGR5 em cálcio intracelular (Figura 18E). Este efeito se correlacionou a um aumento na liberação de GLP-1 a partir das células NCI-H716 (Figura 18F), que foi inibida por MDL-12-330A.
[00755] A liberação de GLP-1 mediada por TGR5 acionada pelo composto Ih3e foi adicionalmente confirmada nas células STC-1 enteroendócrinas de camundongos onde o impacto do composto Ih3e na liberação de GLP-1 foi aprimorado pela superexpressão de TGR5, enquanto foi evitado pela interferência de RNA (Figura 18G) ou por MDL-12-330A, enfatizando-se, ainda, a dependência de cAMP da liberação de GLP-1 mediada por TGR5 (Figura 18H). Juntamente tomados, esses dados demonstram que o TGR5 regula uma via principal que domina a liberação de GLP-1 a partir das células L enteroendócrinas. Exemplo 19. A Superexpressão de TGR5 modula a Secreção de GLP- 1 In Vivo
[00756] Objetivando avaliar, adicionalmente, o papel o da sinalização de TGR5 aperfeiçoada, avaliou-se o impacto da superexpressão transgênica de TGR5 in vivo no contexto de DIO em camundongos. Os camundongos transgênicos TGR5 (TGR5-Tg) foram gerados por injeção de oócito do cromossomo artificial bacteriano (BAC) RP23-278N1. Através de PCR quantitativo em tempo real, os camundongos TGR5-Tg mostraram ter seis cópias integradas do clone RP23-278N1 1 BAC, levando a uma expressão de mRNA TGR5 robusta, restrita à maioria dos tecidos que expressam normalmente o TGR5. A tolerância à glicose foi acentuadamente aperfeiçoada em camundongos TGR5-Tg submetidos durante 10 semanas a uma dieta hiperlipídica (HF) comparados a ninhadas de controle alimentadas com HF (Figura 19A), enquanto nenhuma diferença foi notada em camundongos submetidos a uma dieta à base de ração (CD) (dados não mostrados). Ao contrário destas expectativas, não se observaram diferenças em ganho de peso corporal entre camundongos selvagens e TGR5-Tg em uma dieta CD ou HF, demonstrando que o aperfeiçoamento da tolerância à glicose em camundongos TGR5-Tg pode não ser atribuído a efeitos contraditórios de perda de peso. A ausência de ganho de peso em camundongos TGR5-Tg, após um aumento no gasto energético, foi explicada por uma redução da atividade locomotora. Visto que os camundongos nocaute receptores de GLP-1 exibem uma hiperatividade acentuada (Hansotia et al., 2007, J. Clin. Invest. 117, 143-152), administrou-se o agonista receptor de GLP-1 Ex-4 a camundongos selvagens com a finalidade de avaliar se a redução na atividade locomotora em camundongos TGR5-Tg pode ser ligada à secreção de GLP-1. O Ex-4 reduziu de modo eficiente e dose-dependente a atividade locomotora em camundongos. Curiosamente, em 1 nmol/Kg, notou-se uma redução significativa na atividade locomotora enquanto os camundongos ainda estavam se alimentado apropriadamente.
[00757] Curiosamente, e de acordo com as expectativas, a tolerância à glicose em camundongos TGR5-Tg foi associada a uma secreção de GLP-1 robusta e à liberação de insulina em resposta a uma carga de glicose oral (Figura 19B). A significância da secreção de GLP-1 aperfeiçoada foi enfatizada pelo fato de que as medições dos níveis GLP-1 plasmáticos foram realizadas sem uma administração oral preliminar de um inibidor dipeptidil peptidase-4 (DPP4) aos camundongos. Esta liberação de GLP-1 aperfeiçoada em camundongos TGR5-Tg ajuda a explicar a atividade locomotora reduzida nesses camundongos. Com o intuito de investigar adicionalmente o impacto da superexpressão de TGR5 na secreção de GLP-1, os camundongos alimentados com HF foram subsequentemente submetidos a uma refeição teste para estimular a liberação de BA a partir da vesícula biliar. Curiosamente, o impacto da superexpressão de TGR5 sobre a secreção de insulina e GLP-1 foi mais pronunciado, de modo pós-prandial, do que após um simples desafio de glicose (Figura 19C). Especula-se que esses efeitos ocorram devido ao fluxo de BA aumentado acionado pela refeição teste comparada ao desafio de glicose. De acordo com esta hipótese, o tratamento de explantes ileais a partir de camundongos TGR5-Tg e camundongos de controle com ácido litocólico (LCA) confirmou que os BAs proporcionam um excelente sinal para induzir a liberação de GLP- 1 no contexto de uma alta expressão de TGR5 (Figura 19D). Além disso, esses dados estão de acordo com os resultados obtidos em células STC-1 transfectadas por mTGR5- onde a liberação de GLP-1 também foi estimulada pela expressão aumentada de TGR5 (Figura 19G). Especula-se que no contexto de explantes ileais em camundongos selvagens, a rápida degradação de GLP-1 pela enzima DPP4 pode mascarar o aumento moderado na liberação de GLP-1 acionada por LCA.
[00758] O impacto de GLP-1 em função pancreática foi extensivamente documento durante a última década e varia a partir dos efeitos secretagogos de insulina à promoção da sobrevivência e proliferação de ilhotas pancreáticas (Drucker, 2006, Cell Metab. 3, 153-165). Neste contexto, a coloração imunofluorescente de insulina em seções pancreáticas revelou que, em oposição às ilhotas hipertróficas com baixo teor de insulina, conforme observado em camundongos de controle alimentados com HF, as ilhotas de camundongos TGR5-Tg alimentados com HF não eram hipertróficos e colorados mais intensivamente para insulina (Figura 19E). De acordo com esses dados, a contagem e o dimensionamento de ilhotas pancreáticas confirmaram que a expressão de TGR5 resulta na manutenção de um perfil de distribuição normal de ilhotas (Figura 19F), provavelmente devido aos níveis GLP-1 plasmáticos aperfeiçoados. Além disso, o teor de insulina das ilhotas pancreáticas isoladas era significativamente maior em camundongos TGR5-Tg alimentados com HF do que em camundongos de controle (Figura 19G).
[00759] Com o intuito de estabelecer um papel de sinalização de TGR5 na manutenção de homeostase de glicose, avaliou-se que a tolerância à glicose de camundongos deficientes de TGR5 em linhagem germinativa (TGR5-/-), gerada por camundongos de criação nos quais o alelo de TGR5 foi flanqueado com camundongos transgênicos CMV-Cre. Em direta contraposição ao que se observou em camundongos TGR5-Tga , tolerância à glicose foi prejudicada em camundongos TGR5-/- submetidos a uma dieta de HF durante 8 semanas (Figura 19H), enquanto nenhuma diferença foi observada em camundongos alimentados com CD (dados não mostrados). A secreção de GLP-1 foi, então, testada submetendo-se camundongos TGR5+/+ e TGR5-/- a uma carga de glicose oral 30 minutos após a administração de uma solução salina ou de um composto Ih3e sozinho, ou em combinação com o inibidor DPP4 (DPP4i), sitagliptina. A pré-administração do composto Ih3e aumentou moderadamente a liberação de GLP-1 após um desafio de glicose em camundongos TGR5+/+ (Figura 19I). No entanto, este efeito foi mais consideravelmente pronunciado quando o DPP4i foi co-administrado como uma consequência de sua capacidade de prolongar a meia-vida de GLP-1 plasmático (Drucker e Nauck, 2006, Lancet, 368, 1696 1705) (Figura 19I). Em contrapartida, os efeitos do composto Ih3e sobre os níveis GLP-1 plasmáticos foram aliviados em camundongos TGR5-/- (Figura 19J). Juntamente, esses dados enfatizaram o papel essencial da sinalização de TGR5 no controle da liberação de GLP-1 e demonstra, ainda, a especificidade do composto Ih3e agonista semi- sintético in vivo. Exemplo 20. O composto Ih3e agonista TGR5 aumenta o gasto energético e reduz a esteatose hepática e a obesidade mediante uma alimentação hiperlipídica
[00760] Considerando um perfil aperfeiçoado de glicose e insulina em camundongos TGR5-Tg, avaliou-se, posteriormente, o potencial terapêutico do composto Ih3e misturado em uma dose de 30 mg/kg/dia (mkd) com a dieta em um estudo de intervenção em camundongos C57BL/6J nos quais a diabesidade foi induzida por uma alimentação à base de HF durante 14 semanas. Conforme esperado, o perfil de HPLC de BAs plasmáticos confirmou a presença do composto Ih3e apenas nos camundongos tratados (Figura 20A). Os níveis plasmáticos do composto Ih3e se encontravam na faixa de CA e ácido 3-muricólico. É notável que o tratamento com o composto Ih3e não afetou nem a composição de BA plasmático nem o perfil de expressão das enzimas envolvidas na síntese de BA, cuja expressão se encontra principalmente sob controle de receptores nucleares. A total ausência de alterações no nível de expressão de genes alvo clássicos de FXR no fígado, tal como colesterol 7α-hidroxilase (CYP7A1) e a bomba de exportação de sais biliares (BSEP) (Thomas et al., 2008, Nat. Rev. Drug Discovery 7, 678-693), confirmou, ainda, a especificidade do composto Ih3e em relação ao TGR5.
[00761] Após 10 semanas de tratamento com o composto Ih3e, uma atenuação significativa de ganho de peso corporal de cerca de 15%, em associada a uma redução aguda em massa gordurosa, foi observada em camundongos tratados com Ih3e alimentados com HF em relação aos camundongos de controle alimentados com HF (Figuras 20B e 20C). O aumento na massa do fígado e coxim de gordura também foi atenuado em camundongos tratados com Ih3e- alimentados com HF (Figura 20D). Conforme notado em estudos anteriores com CA (Watanabe et al., 2006, Nature, 439, 484-489), a redução em massa de BAT foi relacionada a uma diminuição de tecido adiposo branco (WAT) na região interescapular (Figura 20D e dados não mostrados). As alterações metabólicas entre os camundongos de controle alimentados com HF e os camundongos tratados com Ih3e alimentados com HF não foram causadas por um consumo reduzido de calorias (Figura 20E) ou perda de energia fecal, porém, ao invés disso, eram a consequência de um gasto energético aumentado, conforme indicado pela medição do consumo de O2 e pela produção de CO2 durante a calorimetria indireta (Figura 20F). Durante o período escuro, o quociente respiratório de camundongos tratados com Ih3e foi significativamente reduzido, de acordo com a queima de gordura aumentada (Figura 20F). O perfil de expressão genética de BAT confirmou que a ativação da via de sinalização de TGR5 aciona o aumento de vários genes mitocondriais envolvidos no gasto energético junto a uma indução da expressão genética de deiodinase tipo 2 (Figura 20G). A ativação da cadeia respiratória mitocondrial pelo composto Ih3e foi adicionalmente evidenciada medindo-se o consumo de O2 em adipócitos marrons primários isolados a partir de camundongos C57BL/6J tratados por 12 horas com o composto Ih3e. Além do agente de desacoplamento, carbonilcianida-ptrifluorometóxi fenil hidrazona (FCCP), aumentou o consumo basal de O2 em todas as condições, porém, foi significativamente mais pronunciada naqueles tratados com o composto Ih3e (Figura 20H). Além do gasto energético aumentado, a função hepática também foi aperfeiçoada, conforme evidenciado pela redução na esteatose hepática, que foi avaliada por coloração red O em óleo (Figura 20I) e pela quantificação bioquímica do teor de lipídeos hepáticos (Figura 20J). Além disso, os níveis plasmáticos de enzimas hepáticas foram consideravelmente reduzidos comparados aos camundongos de controle alimentados com HF, correlacionado-se com a ausência de fibrose hepática em seções hepáticas de camundongos tratados com Ih3e colorados com vermelho Sirius (Figuras 20I e 20K). O aperfeiçoamento na função hepática também foi refletida pela queda significativa em triglicerídeos plasmáticos e ácidos graxos não-esterificados (NEFAs) em camundongos tratados o composto Ih3e alimentados com HF (Figura 20L). Exemplo 21. O Composto Ih3e Agonista TGR5 aperfeiçoa a Sensibilidade à Insulina em Camundongos Obesos
[00762] Determinou-se a capacidade de o composto Ih3e aperfeiçoar a homeostase de glicose. Tanto em camundongos DIO como em camundongos db/db, um modelo ambiental e genético de diabesidade, respectivamente, o tratamento com o composto Ih3e (30 mkd) misturado com a dieta aperfeiçoou consideravelmente a tolerância à glicose após um desafio oral com glicose (Figuras 21A e 21C), junto a um aperfeiçoamento do perfil de secreção de insulina estimulado por glicose (Figuras 21B e 21D, painel inferior). Este recurso é consistente a um aperfeiçoamento mediado por GLP-1 em funções pancreáticas. Além disso, os níveis de glicose e insulina em jejum foram reduzidos tanto em camundongos DIO como em camundongos db/db que foram tratados com o composto Ih3e (Figuras 21B e 21D, painel superior). Com o intuito de caracterizar adicionalmente o impacto do composto Ih3e sobre a sensibilidade de homeostase de glicose e insulina, realizou-se um clamp euglicêmico hiperinsulinêmico de glicose nesses camundongos DIO. De acordo com a tolerância à glicose aperfeiçoada, a taxa de infusão de glicose necessária para manter a euglicemia em camundongos DIO tratados com o composto Ih3e era virtualmente idêntica àquela observada em camundongos de controle alimentados com CD (Figura 21E). Embora os camundongos alimentados com HF resistentes à insulina apresentem uma produção endógena aumentada de glicose hepática, junto a uma redução da taxa de eliminação de glicose e à supressão da produção de glicose por insulina, o tratamento com o composto Ih3e dos camundongos alimentados com HF normalizou estes parâmetros aos valores observados em camundongos alimentados com CD (Figura 21E). A medição da absorção de 14C-deoxiglicose estimulada por insulina durante o clamp euglicêmico hiperinsulinêmico de glicose indicou que o aperfeiçoamento na homeostase de glicose pelo composto Ih3e pode ser principalmente atribuído à resistência reduzida à insulina no fígado e nos músculos (Figura 21F). Esses efeitos se correlacionaram com a normalização na expressão de genes-chave envolvidos na homeostase de glicose hepática (Figura 21G).
[00763] Objetivando atribuir a especificidade do composto Ih3e em relação ao TGR5 in vivo, o impacto de um tratamento de 4 semanas com o composto Ih3e em 30 mkd sobre a tolerância à glicose foi comparado em camundongos TGR5 ' e TGR5, saciado por uma alimentação de HF durante 9 semanas. Mesmo durante este curto período de tempo, o composto Ih3e aperfeiçoou significativamente a tolerância à glicose em camundongos TGR5+/+ alimentados com uma dieta à base de HF (Figura 6A), junto a uma normalização de secreção de insulina durante o desafio oral com glicose (Figura 6B). Esses efeitos foram aliviados em camundongos TGR5-/-, proporcionando, assim, argumentos adicionais para suportar a especificidade do composto Ih3e para TGR5 (Figuras 22A e 22B). Exemplo 22. Farmacocinética e Metabolismo em Fístula Biliar de Ratos após Administração IV para os compostos Ih3e e Ii3e
[00764] A diferença entre os dois diasteroisômeros puros, Ih3e e Ii3e, é que o grupo metila C-23 é orientado de modo diferente, gerando, assim, as formas 23S e 23R. Esta modificação de estrutura pode, em partem modificar as propriedades físico-químicas, o metabolismo e a farmacocinética dos dois compostos. A introdução de um grupo metila C-23 na cadeia lateral diferentemente orientada produziu dois isômeros, onde o grupo carbóxi também é diferentemente orientado e sua reatividade no processo de amidação ou na desconjugação da forma amidada pode ser diferente entre os dois diasteroisômeros. A orientação diferente do grupo carbóxi também é responsável por um equilíbrio hidrofóbico/hidrofílico diferente das duas moléculas que podem resultar em diferentes propriedades biológicas e metabolismo. Com a finalidade de esclarecer este ponto, os dois isômeros puros foram administrados por infusão femoral (i.v.) a um modelo de fistula biliar de ratos em uma dose única de 1 μmol/min/kg bw por 1 hora e as amostras biliares foram coletadas durante 3 horas. O efeito sobre o fluxo biliar, sobre a secreção biliar do presente composto e do metabólito principal também foi avaliado. Fluxo Biliar. Efeito Colerético Métodos
[00765] Este estudo foi realizado pela administração dos dois compostos através infusão femoral (iv); 6 ratos (peso corporal 267 ± 12 g) foram tratados com cada diasteroisômero em uma dose de 1 μmol/min/kg. A indução femoral se iniciou após 75 minutos de um estado fixo e continuou durante 60 minutos. Coletaram-se amostras de bile a cada 15 minutos durante 2 horas. Além disso, 3 ratos foram tratados com uma solução salina de BSA a 3% sobre as mesmas condições para tempos e amostragens (ratos de controle femoral). Resultados
[00766] O fluxo biliar durante a infusão iv do veículo salino de BSA de controle a 3% manteve um valor variando de 40 a 60 μL/min/kg durante todo o período dos experimentos. A infusão iv do composto Ih3e aumentou significativamente a taxa de fluxo biliar e este fenômeno se iniciou 15 minutos após o início do período de infusão e continuou durante pelo menos 2 horas após o término do período de infusão (Figura 23). A infusão iv do composto Ii3e também aumentou a taxa de fluxo biliar, porém, este efeito é significativamente menor que aquele observado para o composto Ih3e isomérico (Figura 23).
[00767] Farmacocinética (Secreção Biliar) dos Isômeros Administrados após a Infusão iv
[00768] As amostras de bile coletadas em diferentes momentos durante os experimentos iv foram analisadas de modo a determinar as secreções biliares dos isômeros administrados e seus metabólitos principais recuperados na bile. Materiais
[00769] O pó cristalino puro de cada composto foi obtido a partir do laboratório R. Pellicciari’s na Universidade de Perugia. As soluções de estoque foram preparadas em metanol em 1 mmol/L e as soluções de trabalho foram preparadas diluindo-se volumes apropriados da solução primária. O metanol e a acetonitrila apresentaram uma pureza de grau HPLC. A amônia tinha 30% e o ácido acético 99,8%. Todos os reagentes foram obtidos a partir de Carlo Erba Reagents. A água com grau HPLC foi preparada por um sistema Milli-Q. Preparação de amostras
[00770] As amostras de bile de ratos foram colocadas em temperatura ambiente, brevemente agitadas, e diluídas em 1:100 ou 1:200 v/v com 15 mM de tampão de acetato de amônia (pH = 5,0):acetonitrila (70:30; v/v). A solução final foi transferida em um frasco de auto-amostragem, e 10 μL foram injetados na coluna cromatográfica. Quando as amostras foram encontradas em faixa de linearidade, as mesmas foram diluídas e re-analisadas. Método de HPLC- ESI-MS/MS
[00771] As amostras de bile de ratos foram analisadas por HPLC- MS/MS utilizando-se uma fonte ESI em um modo de ionização negativa. Para cromatografia líquida, utilizou-se um módulo de separação Waters Alliance 2695 acoplado a um auto-amostrador. O auto-amostrador foi mantido em 7°C. A separação foi realizada em uma coluna Synergi Hydro-RP C18 (150x2,0mm i.d., 4 μm de tamanho de partícula), protegida por uma pré-coluna SecurityGuard ODS 4x2,0mm i.d., ambos fornecidos junto à Phenomenex. O analito foi eluido utilizando-se 15 mM de tampão de acetato de amônia (pH = 5,0) como uma fase móvel A e acetonitrila como uma fase móvel B. A fase móvel B aumentou de 30% para 64% em 10 minutos, então, para 100% em 10 minutos, e mantida constante por 10 minutos. A taxa de vazão era de 150 μL/min e a coluna mantida a 45°C. O efluente de coluna foi introduzido em uma fonte de ESI conectada a um MS quádruplo triplo (Quattro-LC, Micromass) que opera em um modo de aquisição de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM). Utilizou-se nitrogênio como gás nebulizador em uma taxa de vazão de 100 L/h e como gás de dessolvação em 930 L/h. As temperaturas de bloqueio e dessolvação de fonte iônica foram respectivamente ajustadas para 80°C e 180°C. A voltagem capilar era de 3,0 kV. Utilizou-se o software MassLynx versão 4.0 para aquisição e processamento de dados. Além disso, a utilização de espectrometria de massa em experimentos de configuração MS único ou tandem MS/MS foi realizada para identificar os metabólitos. Quantificação
[00772] Uma curva de calibração de 5 pontos foi preparada diariamente e injetada em duplicata. As amostras de calibração foram obtidas na faixa de concentração de 0,1 a 20 μmol/L preparada na fase móvel. Os parâmetros de curva de calibração linear foram obtidos a partir do gráfico da área de pico de analito versus a concentração de analito utilizando-se uma análise de regressão dos quadrados mínimos (peso = 1/x2). Os coeficientes de correlação eram >0,994. Os metabólitos conjugados de taurina dos compostos Ih3e e Ii3e também foram estimados mesmo se os padrões não estivessem disponíveis. Um fator corretivo, levando-se em consideração as diferentes respostas em ES-MS/MS entre as espécies isentas e conjugadas de taurina, foram estimados e aplicados aos valores de área obtidos a partir dos cromatogramas de conjunto de dados HPLC-MRM. Finalmente, as curvas de calibração obtidas para o BA livre foram usadas para estimar os metabólitos conjugados de taurina. Resultados da Secreção Biliar do Composto Ih3e
[00773] A secreção biliar do composto Ih3e após a administração foi eficiente e o composto foi recuperado na bile em um percentual relativamente alto da dose administrada. O perfil cinético indica que o composto Ih3e foi eficientemente absorvido pelo fígado e secretado na bile principalmente não-modificado e, também, até uma extensão menor conjugada com taurina (Figura 24); outros metabólitos secundários incluindo as foram identificados na bile em quantidades mínimas (Figuras 26 e 27).
[00774] A presença do grupo metila na posição C-23 impede o processo de conjugação fisiológico com taurina e glicina que é relevante para secreção eficiente de quase todos os BA carboxilados de ocorrência natural; isto é crucial para o diidróxi-BA e, até uma extensão menor, para triidróxi-BA. A extensão de sua recuperação na bile também se refere à dose administrada como se tivesse sido observada para ácido cólico (Roda A. et al. Hepatology. 8,15716,1988).
[00775] Levando-se em consideração as propriedades físico- químicas do composto Ih3e, espera-se que este composto seja absorvido por um mecanismo de difusão passiva (Log P = 1,44) e um mecanismo ativo não pareceu estar envolvido. A presença de três grupos hidroxila permite que a molécula seja eficientemente absorvida pelo fígado e secretada na bile. O grupo 6-etila também evita a 7- desidroxilação bacteriana intestinal, conforme mostrado no relatório anterior. Resultados da Secreção Biliar do Composto Ii3e
[00776] A secreção biliar do composto Ii3e após a infusão iv é reportada na Figura 25. O perfil cinético indica que o composto é metabolizado pelo fígado mais extensivamente que o composto Ih3e. O composto parente é secretado na bile como tal até uma extensão menor como o conjugado de taurina.: Em relação a seu composto Ih3e diasteroisômero, a porcentagem de conjugação é maior e a taxa de secreção máxima da forma não-conjugada é menor. Isto sugere que o isômero C-23(R) apresenta uma geometria de cadeia lateral e uma orientação mais adequada para o processo de amidação em relação ao isômero (S) que é secretado como uma forma não-conjugada em uma porcentagem maior. A conjugação com taurina contribui para aperfeiçoar a recuperação do composto Ii3e na bile que é aproximadamente igual a 70-80% da dose administrada. Outros metabólitos secundários que incluem glucuronidas foram identificados na bile em uma quantidade mínima (Figuras 28 e 29). Metabolismo Hepático Métodos
[00777] Utilizando-se os dados obtidos a partir dos experimentos anteriores, assim como as propriedades estruturais e físico-químicas dos análogos estudados, uma triagem preliminar foi realizada para buscar por metabólitos possíveis. Composto Ih3e
[00778] Esta molécula foi principalmente secretada como um parente composto (não-modificado) e foi apenas ligeiramente metabolizado pelo fígado. O metabólito principal era a espécie conjugada de taurina e, em níveis muito baixos, a espécie mono- glucuronida foi detectada (Figuras 26 e 27).
[00779] A presença do grupo metila na posição C-23 impere o processo de conjugação com taurina e glicina que é necessário para uma secreção eficiente de quase todos os BAs caboxilados de ocorrência natural; isto é crucial para diidróxi BA e, até uma extensão menor, para triidróxi BA visto que são bastante polares. A formação de glucuronidas pode se tornar relevante se administradas em doses maiores. Composto Ii3e
[00780] Esta molécula foi principalmente secretada como um composto parente (não-modificado) e também foi metabolizada pelo fígado de modo a formar a espécie conjugada de taurina e, em níveis muito baixos, a espécie mono-glucuronida (Figuras 27 a 29).
[00781] A presença do grupo metila na posição C-23 impere o processo de conjugação com taurina e glicina que é necessário para uma secreção eficiente de quase todos os BAs caboxilados de ocorrência natural; isto é crucial para diidróxi BA e, até uma extensão menor, para triidróxi BA visto que são bastante polares. A formação de glucuronidas pode se tornar relevante se a molécula for administrada em doses maiores.
[00782] O composto Ii3e é secretado na bile em uma porcentagem maior que o composto Ih3e diasteroisômero sob a forma conjugada de taurina, 20-30% vs 5-10% e considera-se a geometria de cadeia lateral diferente e uma lipofilicidade ligeiramente maior do composto Ii3e.
[00783] O composto Ih3e é moderadamente hidrofílico e tem uma detergência intermediária. Sua absorção hepática parece ser eficiente. A secreção biliar também é eficiente considerando que o composto é principalmente secretado não-modificado e, até uma extensão limitada, conjugado com taurina. A absorção intestinal ocorre através do mecanismo passivo como BA não-conjugado de ocorrência natural e a cinética é àquela do ácido cólico ligeiramente menor que os ácidos biliáticos diidróxi (Aldini R. et al. Steroids 61, 590-7, 1996).
[00784] O composto Ih3e não requer um metabolismo hepático extensivo na dose administrada a ser secretada na bile. A presença do grupo metila na posição C-23 (S) evita a conjugação extensiva com taurina e a molécula pode ser eficientemente secretada não- modificada. Um tempo de residência hepática aumentado da molécula resulta a partir de uma absorção ductular visto que esta molécula é submetida a uma trajetória de derivação cole-hepática, que é responsável por seu efeito colerético potente.
[00785] O composto Ii3e é o diasteroisômero do composto Ih3e. O composto Ii3e é caracterizado por uma hidrofilicidade ligeiramente menor como resultado da geometria de cadeia lateral diferente. Portanto, o grupo carbóxi C-23 é diferentemente orientado e leva em consideração o diferente equilíbrio hidrofílico-hidrofóbico da molécula. Como uma consequência de sua alta lipofilicidade, a molécula requer uma conjugação mais extensiva com taurina em relação ao composto Ih3e. A geometria de cadeia lateral do último composto provavelmente reduz um BA com uma especificidade de substrato inferior em relação à enzima responsável pela conjugação mediada pelo processo de ativação CoA. O resultado final é que o composto Ii3e é secretado na bile em uma porcentagem conjugada maior do que o composto Ih3e. Outras Modalidades
[00786] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior é destinada a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens, e modificações se encontram no escopo das reivindicações a seguir. Os indivíduos versados na técnica compreenderão que várias alterações na forma e detalhes podem ser realizados sem que se divirja do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações em anexo.

Claims (11)

1. Composto Ih3e, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura química:
Figure img0046
ou um sal farmacêuticamente aceitável, ou hidrato, ou conjugado de aminoácido glicina ou taurina dos mesmos.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um conjugado de aminoácido glicina.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um conjugado de aminoácido taurina.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é
Figure img0047
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um sal farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 1, 4 ou 5 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. Uso do composto como na reivindicação 1, 4 ou 5, ou de um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que é na produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças selecionadas a partir do grupo consistindo em doenças metabólicas, doenças inflamatórias, doenças renais, doenças autoimunes, doenças cardíacas, doenças hepáticas, câncer, doenças gastrointestinais.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença é diabetes.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença é obesidade.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença é diabesidade.
11. Kit para tratamento ou prevenção de doenças em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende um composto, como definido na reivindicação 1, 4, ou 5 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
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