BRPI0922084B1

BRPI0922084B1 - variante de subtilisina isolada de uma subtilisina de bacillus e sua composição de limpeza

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Publication number: BRPI0922084B1
Application number: BRPI0922084-4A
Authority: BR
Inventors: Wolfgang Aehle; Luis G. Cascao-Pereira; David A. Estell; Frits Goedegebuur; James T. Kellis, Jr; Ayrookaran J. Poulose; Brian F. Schmidt
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2020-12-29
Also published as: MX339402B; JP5727378B2; JP6021983B2; JP2013240328A; CA2743047A1; JP2015164423A; AR073420A1; EP2647692A3; EP2647692A2; WO2010056640A2; CN102209778B; US10093887B2; BR122013014156A2; US20150132825A1; CN103396904A; RU2011123911A; JP2012508030A; WO2010056640A3; CN104293751A; MX2011004818A

Abstract

variante de subtilisina isolada, ácido nucleico isolado, composição de limpeza e método para limpeza. a presente invenção proporciona métodos para projeto de proteína e variantes de serina protease produzidas a partir deste. especificamente, a presente invenção proporciona variantes de serina protease tendo uma ou mais substituições conforme comparadas a uma serina protease de referência. em adição, a presente invenção proporciona composições compreendendo estas variantes de serina protease. em algumas concretizações, a presente invenção proporciona composições de limpeza compreendendo pelo menos uma destas variantes de serina protease.

Description

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Nos. de Série 61/113.545, 61/113.552, 61/113.548, todos dos quais foram depositados em 11 de novembro de 2008, e 61/218.802, que foi depositado em 19 de junho de 2009, e todos dos quais são aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção proporciona métodos para projeto de proteína e variantes de serina protease produzidas a partir deste. Especificamente, a presente invenção proporciona variantes de serina protease tendo uma ou mais substituições conforme comparadas a uma serina protease de referência. Em adição, a presente invenção proporciona composições compreendendo estas variantes de serina protease. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições de limpeza compreendendo pelo menos uma destas variantes de serina protease.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Vários métodos de projeto de proteína são conhecidos na técnica. Em geral, as proteínas são modificadas de modo a obter propriedades desejadas de proteína. Em muitos métodos, a sequência de nucleotídeo de um gene clonado que codifica uma proteína que sofre mutação e o gene modificado é expresso para produzir mutantes, que são classificados por atividades de interesse. Frequentemente, as propriedades mutantes são comparadas com as propriedades da proteína tipo selvagem.

[0004] Historicamente, o processo de desenho da proteína tem sido efetuado como equivalente ao problema da descoberta no todo do espaço da proteína a uma melhor sequência para a aplicação desejada. Este problema é extremamente difícil e é “NP dura”. Na teoria da complexidade, os problemas definidos como estando na classe P são considerados fáceis e eficientes, e algoritmos de tempo polinomiais existem para sua solução. Os problemas NP-dura são problemas para os quais algoritmos de tempo polinomiais eficientes não são atualmente conhecidos, e se qualquer problema NP-dura pode ser solucionado, todos os problemas NP-duro podem ser solucionados (Ver, por exemplo, Pierce and Winfree, Protein Engineer., 15:779-782, 2002). As estratégias atuais para construção e classificação de bibliotecas geralmente envolvem geração de diversidade de sequência de proteína aleatoriamente através da sequência total, ou em modo aleatório controlado em posições definidas dentro da proteína. Estas bibliotecas geralmente têm um grande número de membros que são “negativos” com relação à propriedade primária de interesse, e requer grandes números a serem classificados de modo a encontrar os números relati- vamente pequenos de mutações positivas. Geralmente, mutações negativas são ignoradas, e a informação de sequência é somente obtida para os membros positivos.

[0005] A mutagênese de saturação (Estell et al., em World Biotech Report 1984, vol. 2, USA, Online Publications, London, pp. 181-187, 1984; e Cavidades et al., Gene, 34:315-323, 1985) é uma técnica que pode ser usada para pesquisar espaço de proteína para mutações que otimizam várias propriedades em uma proteína. Vários grupos têm desenvolvido estratégias para identificação de locais a serem mudados por mutagênese de saturação (Reetz et al., Angew. Chem. Int Edn, 44:4192-4196, 2005; Kato et al., J Mol Biol, 351:683-692, 2005; e Sandberg et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:8367-8371, 1993), mas nenhum sistema geral para a identificação do local foi proposto.

[0006] Em adição, devido a muitos métodos de projeto de proteína produzirem um grande número de opções de mutação de aminoácido, a classificação de um grande número de variantes geralmente é requerida para produzir uma propriedade de proteína desejada. Geralmente, a classificação é repetida múltiplas vezes para produzir uma variante benéfica. Desse modo, muitos métodos são trabalhosos e consomem tempo. Existe uma necessidade continuada na técnica de métodos de projeto de proteína que sejam eficientes e produzam os resultados desejados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção proporciona métodos para projeto de proteína. Especificamente, a invenção proporciona métodos utilizando bibliotecas de avaliação de local. Em particular, a presente invenção proporciona meios para uso de informação obtida sobre um número de propriedades desejadas, de modo à desenhar racionalmente e eficiente- mente bibliotecas que otimizarão aquelas propriedades. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona meios para projetar bibliotecas que sejam aperfeiçoadas para pelo menos duas propriedades desejadas. A presente invenção também proporciona variantes de serina protease tendo uma ou mais substituições conforme comparadas a uma serina protease de referência produzida usando-se os métodos de projeto de proteína aqui descritos.

[0008] A presente invenção proporciona meios para identificar posições dentro de uma sequência de aminoácido de uma proteína que sejam relevantes em aperfeiçoar propriedades desejadas da proteína. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a presente invenção proporciona meios para determinar quais mutações são desejáveis de modo à produzir proteínas com estas propriedades desejadas, bem como propriedades aperfeiçoadas. Em algumas modalidades adicionais particularmente preferidas, a presente invenção proporciona meios para identificar posições e mutações de aminoácido que têm aperfeiçoamentos de uma porcentagem particular melhor do que a proteína tipo selvagem (por exemplo, melhor do que cerca de 110% do tipo selvagem para uma propriedade). Em modalidades ainda adicionalmente preferidas, a presente invenção proporciona meios para identificar mutações que proporcionam pelo menos uma propriedade muito aperfeiçoada e pelo menos uma propriedade adicional que não é significantemente pior do que a proteína tipo selvagem (por exemplo, melhor do que 110% do tipo selvagem para uma propriedade, ainda não pior do que 90% de tipo selvagem para outra propriedade). Em modalidades ainda adicionalmente preferidas, bibliotecas são construídas baseado nesta informação. Em algumas modalidades, as bibliotecas são construídas usando-se todas das mutações identificadas, enquanto em algumas outras modalidades as bibliotecas são construídas usando-se um subconjunto das mutações identificadas. De fato, não é pretendido que as bibliotecas sejam restritas a qualquer número e/ou tipo particular de mutações.

[0009] A presente invenção proporciona métodos para projeto de proteína compreendendo as etapas de: provisão de uma biblioteca de variantes de proteína; teste da biblioteca de variantes de proteína para pelo menos uma propriedade de interesse em um teste de interesse; identificação de uma faixa de valores para pelo menos uma propriedade de interesse; identificação de um mínimo dentro da faixa de valores que é associada com um resultado favorável no teste de interesse; e provisão de uma pluralidade de variantes de proteína tendo pelo menos uma mutação acima do mínimo na faixa da menos uma propriedade de interesse, proporcionando, desse modo, uma biblioteca de variantes de proteína compreendendo pelo menos uma mutação, e em que a biblioteca é enriquecida em membros tendo um resultado favorável no teste de interesse. Em algumas modalidades, o resultado favorável corresponde a um valor de maios do que cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou cerca de 95% de um valor máximo observado no teste colocado na primeira etapa acima. Em algumas modalidades alternativas, mais do que um teste de interesse é usado nos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, a proteína é uma enzima. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima é selecionada de proteases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases.

[00010] A presente invenção também proporciona métodos para projeto de proteína compreendendo as etapas de: provisão de uma biblioteca de variantes de proteína; teste da biblioteca de variantes de proteína para pelo menos duas propriedades de interesse em um teste de interesse; identificação de uma faixa de valores para as pelo menos duas propriedades de interesse; identificação de um mínimo dentro da faixa de valores que é associada com um resultado favorável no teste de interesse; e provisão de uma pluralidade de variantes de proteína acima do mínimo da faixa das pelo menos duas propriedades de interesse, proporcionando, desse modo, uma biblioteca de variantes de proteína enriquecidas em membros tendo o resultado favorável no teste de interesse. Em algumas modalidades preferidas, o resultado favorável corresponde a um valor de mais do que cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou cerca de 95% de um valor máximo observado no teste colocado na primeira etapa acima. Em algumas modalidades preferidas, a proteína é uma enzima. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima é selecionada de pro- teases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases.

[00011] A presente invenção também proporciona métodos para projeto de proteína compreendendo as etapas de: provisão de uma proteína tipo selvagem e uma biblioteca de variantes de proteína da proteína tipo selvagem; teste da biblioteca de variantes de proteína e da proteína tipo selvagem para pelo menos uma propriedade de interesse em um teste de interesse; identificação de uma faixa de valores para pelo menos uma propriedade de interesse; identificação de um mínimo dentro da faixa de valores que é associada com um resultado favorável no teste de interesse; identificação das variantes de proteína tendo um resultado favorável conforme comparado aos resultados obtidos para o tipo selvagem, em que o resultado favorável é uma propriedade de interesse aperfeiçoada; e provisão de uma pluralidade de variantes de proteína acima do mínimo da faixa da pelo menos uma propriedade de interesse, proporcionando, desse modo, uma biblioteca de variantes de proteína aperfeiçoadas enriquecidas em membros tendo o resultado favorável no teste de interesse. Em algumas modalidades preferidas, os métodos adicionalmente compreendem a etapa de determinar o índice de desempenho, em que o índice de desempenho é determinado pela divisão do valor obtido para cada uma das variantes de proteína aperfei- çoadas e o valor obtido para a proteína tipo selvagem. Em algumas modalidades particularmente preferidas, os métodos adicionalmente compreendem a etapa de identificação das variantes de proteína aperfeiçoadas, em que as variantes de proteína aperfeiçoadas alcançam valores de índice de desempenho maiores do que cerca de 1,1 no teste de interesse. Em algumas modalidades adicionais, a proteína é uma enzima. Em algumas modalidades particularmente preferidas, a enzima é selecionada de proteases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases. Em algumas modalidades alternativas, a proteína é selecionada de anticorpos e fatores de crescimento. Em modalidades ainda adicionalmente preferidas, a proteína tipo selvagem é uma forma madura de uma enzima selecionada de proteases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases. Em algumas modalidades preferidas, a propriedade de interesse é selecionada de carga, desempenho de lavagem, desempenho de limpeza de superfície dura, estabilidade térmica, estabilidade de armazenagem, estabilidade de detergente, ligação de substrato, inibição de enzima, nível de expressão, taxa de reação, e de- gradação de substrato. Em algumas modalidades, a proteína tipo selva- gem e a variante de proteína são componentes de pelo menos uma composição de detergente. Em algumas modalidades preferidas, o desempenho de lavagem é testado em uma composição de detergente formulada em um detergente em pó ou líquido tendo um pH de entre cerca de 5 e cerca de 12,0.

[00012] A presente invenção também proporciona métodos para produção de uma variante aperfeiçoada de uma proteína de referência dentro de uma dobra de proteína, compreendendo: ensaio de variantes múltiplas de uma proteína teste dentro da dobra de proteína que se estende em uma faixa de uma propriedade de interesse em um ensaio de interesse; identificação de um mínimo dentro da faixa da propriedade de interesse que é associada com um resultado favorável no ensaio de interesse; ensaio de uma proteína de referência da dobra de proteína no ensaio de interesse; e produção de uma variante aperfeiçoada da proteína de referência por introdução de uma substituição de aminoácido é a proteína de referência tal que a variante de referência é acima do mínimo da faixa da propriedade de interesse. Em algumas modalidades preferidas, a proteína de referência e a proteína de este são diferentes. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem a etapa de determinar o índice de desempenho, em que o índice de desempenho é determinado pela divisão do valor obtido para a variante de proteína aperfeiçoada e o valor obtido para a proteína de referência. Em algumas modalidades, as proteínas de teste e as proteínas de referência são enzimas. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as enzimas são selecionadas de proteases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases. Em algumas modalidades alternativas, as proteínas de teste e de referência são selecionadas de anticorpos e fatores de crescimento. Em modalidades ainda adicionalmente preferidas, a proteína de referência é uma forma madura de uma enzima selecionada de proteases, transferases, metaloproteases, esterases, amilases, celulases, oxidases, cutinases, e lipases. Em algumas moda- lidades preferidas, a propriedade de interesse é selecionada de carga, desempenho de lavagem, desempenho de limpeza de superfície dura, estabilidade térmica, estabilidade de armazenamento, estabilidade de detergente, ligação de substrato, inibição de enzima, nível de expressão, taxa de reação, e degradação de substrato. Em algumas modalidades, as proteínas de teste e de referência são componentes de pelo menos uma composição de detergente. Em alguma modalidade alternativa, a variante de proteína aperfeiçoada é um componente de uma composição de detergente. Em algumas modalidades preferidas, o desempenho de lavagem é testado em uma composição de detergente formulada em um detergente em pó ou líquido tendo um pH de entre cerca de 5 e cerca de 12,0.

[00013] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições de limpeza compreendendo pelo menos uma variante de serina protease aqui descrita. Em algumas modalidades preferidas, a composição de limpeza é um detergente de lavanderia. Em um subconjunto destas modalidades, o detergente de lavanderia é um detergente de água fria, um detergente de baixo pH, ou um detergente compacto. Em outras modalidades, a composição de limpeza é um detergente de lavagem de prato. Em algumas modalidades, o detergente de lavagem de louça é um detergente livre de fosfato, enquanto em outras modalidades o detergente de lavagem de louça é um detergente contendo fosfato. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza adicionalmente compreendem pelo menos uma enzima adicional, que em modalidades particularmente preferidas é selecionada de uma metaloprotease neutra, uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carbohidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, e uma peroxidase. Também providos pela presente invenção são ácidos nucleicos isolados que codificam a variante serina protease, vetores de expressão compreendendo o ácido nucleico, e células hospedeiras compreendendo o vetor de expressão.

[00014] Em adição, a presente invenção proporciona métodos para produção de uma variante de serina protease de uma serina protease de Bacillus compreendendo: transformação de uma célula hospedeira com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica a variante de serina protease; e cultivo da célula hospedeira transformada sob condições adequadas para a produção da variante de serina protease. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem a etapa de coletar a variante de serina protease produzida. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma espécie de Bacillus, e em um subconjunto destas modalidades, a espécie de Bacillus é B. subtilis. Além disso, a presente invenção proporciona métodos de limpeza, compreendendo a etapa de contactar uma superfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com uma composição de limpeza compreendendo uma variante de serina protease isolada. Em alguns métodos alternativos, a presente invenção proporciona métodos de limpeza, compreendendo a etapa de contactar uma superfície e/ou um artigo compreendendo de louça com uma composição de limpeza compreendendo uma variante de serina protease isolada.

[00015] Adicionalmente a presente invenção proporciona métodos para projeto de protease compreendendo as etapas de: a) provisão de uma pluralidade bibliotecas de avaliação de local (SELs), cada uma compreendendo uma pluralidade de variantes de protease tendo substituições distintas em uma posição de aminoácido idêntica da protease; b) teste das variantes de protease das SELs e uma protease padrão em um teste de uma propriedade de interesse; c) determinação de um índice de desempenho (PI) para cada uma das variantes de protease para o teste; d) identificação de duas ou mais das posições de aminoácido como posições não restritivas, em que pelo menos uma da pluralidade de variantes de protease em cada uma das SELs tem um PI maior do que cerca de 0,5; e f) provisão de uma biblioteca de mutação múltipla compreendendo uma pluralidade de variantes multiplamente substituídas de protease, cada uma compreendendo substituições nas duas ou mais posições não restritivas. Em algumas modalidades, o teste compreende dois ou mais ensaios diferentes selecionados de en- saios de remoção de mancha (microamostra), estabilidade de ensaios de LAS, estabilidade de detergente, e ensaios de atividade específica. Em algumas modalidades adicionais, métodos adicionais e/ou alternativos encontram uso.

[00016] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona métodos para produção de uma variante de serina protease multiplamente substituída de uma protease serina de Bacillus, compreendendo: testar uma pluralidade de variantes simplesmente substituídas de serina protease em um primeiro teste de uma primeira propriedade e um segundo teste de uma segunda propriedade, em que a propriedade de uma serina protease de referência é dada um valor de 1,0 em cada teste, uma primeira ou segunda propriedade favorável tem um valor maior do que 1,0, e uma primeira ou segunda propriedade indevidamente desfavorável tem um valor menor do que cerca de 0,80 ou, em algumas modalidades preferidas, menor do que cerca de 0,60; identificação de uma substituição em pelo menos uma das variantes simplesmente substituídas de serina protease que é associada com uma primeira propriedade favorável e que não é associada com uma segunda propriedade indevidamente desfavorável; identificação de uma substituição em pelo menos uma das variantes de serina protease simplesmente substituídas é associada com uma segunda propriedade favorável e que não é associada com uma primeira propriedade indevidamente desfavorável; e introdução da substituição a partir das etapas anteriores em uma serina protease para produzir uma variante de serina protease multiplamente substituída. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem teste da variante de serina protease multiplamente substituída no primeiro teste e no segundo teste, em que uma variante de serina protease aperfeiçoada alcança um valor de mais do que cerca de 1,0 em ambos dos primeiro e segundo testes, ou um valor de mais do que 1,0 no primeiro teste e um valor de cerca de 0,80 a cerca de 1,0 no segundo teste. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem produção da(s) variante(s) de serina protease aperfei- çoada(s). Em algumas modalidades, a primeira e a segunda propriedades são negativamente correlacionadas. Em algumas modalidades, uma primeira ou segunda propriedade favorável tem um valor maior do que cerca de 1,2. Em algumas modalidades, uma primeira ou segunda propriedade indevidamente desfavorável tem um valor menor do que cerca de 0,40. Em algumas modalidades, a primeira propriedade é estabilidade, e a segunda propriedade é desempenho de lavagem. Em um subconjunto destas a estabilidade compreende estabilidade no detergente e desempenho de lavagem compreende desempenho de lavagem de tinta de leite de sangue (BMI) em detergente. Em algumas modalidades, a serina protease bacterial de referência é uma forma tipo selvagem madura de um B. amyloliquefaciens serina protease BPN’ tendo uma sequência de aminoácido colocada como SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, a serina protease bacterial de referência é um tipo selvagem de GG36 serina protease tendo uma sequência de aminoácido colocada como SEQ ID NO:2 (isto é, a serina protease bacterial de referência usada para produzir “variantes GG36”). Em algumas modalidades da presente invenção, o desempenho de lavagem é testado em uma composição de detergente em pó ou líquido tendo um pH de entre cerca de 5 e cerca de 12,0. Não é pretendido que as etapas sejam limitadas a ordem exata listada acima, visto que qualquer ordem adequada encontra uso na presente invenção. Contudo em algumas modalidades preferidas, as substituições são em posições em uma serina protease de referência tendo uma superfície acessível à solvente (SAS) de mais do que cerca de 50% ou mais do que cerca de 65%.

[00017] Em adição a presente invenção proporciona variantes de subtilisina, em que as variantes são formas maturas tendo atividade proteolítica e compreendendo uma substituição em uma ou mais (preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou more) posições selecionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 e 275, e em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00018] Em algumas modalidades preferidas, a substituição compreende uma ou mais de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X032A, X032C, X032D, X032E, X032G, X032V, X032W, X033A, X033C, X033D, X033E, X033G, X033H, X033I, X033L, X033M, X033N, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033Y, X034E, X034G, X034H, X034L, X034Q, X034S, X035A, X035F, X035H, X035I, X035K, X035L, X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, X035A, X035C, X035E, X035F, X035G, X035H, X035I, X035L, X035M, X035N, X035P, X035Q, X035R, X035T, X035V, X035W, X035Y, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038W, X038Y, X039A, X039E, X039G, X039H, X039L, X039M, X039N, X039Q, X039S, X039T, X039V, X039Y, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V, X040W, X040Y, X041C, X041D, X041E, X041N, X041P, X041Q, X041S, X042A, X042C, X042F, X042G, X042H, X042I, X042L, X042M, X042N, X042Q, X042S, X042T, X042V, X042Y, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046F, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X046W, X047A, X047C, X047E, X047F, X047G, X047H, X047K, X047L, X047M, X047N, X047P, X047Q, X047R, X047S, X047T, X047W, X048A, X048C, X048E, X048F, X048G, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049E, X049F, X049G, X049H, X049K, X049L, X049M, X049P, X049Q, X049R, X049S, X049T, X050C, X050F, X050G, X050H, X050I, X050L, X050N, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053I, X053K, X053L, X053M, X053P, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054G, X054H, X054I, X054K, X054L, X054M, X054N, X054P, X054Q, X054R, X054S, X054V, X054W, X054Y, X055A, X055C, X055E, X055F, X055G, X055H, X055I, X055K, X055L, X055M, X055N, X055P, X055Q, X055R, X055S, X055T, X055W, X055Y, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056R, X056S, X056T, X056V, X057A, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057K, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059C, X059D, X059E, X059F, X059G, X059I, X059K, X059L, X059M, X059N, X059P, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X059Y, X060A, X060C, X060D, X060F, X060G, X060K, X060L, X060M, X060N, X060P, X060Q, X060S, X060T, X060V, X060W, X060Y, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, 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X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254E, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263K, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, e X275W.

[00019] A presente invenção também proporciona composições de lavagem de louça compreendendo a variante de subtilisina, e composições de limpeza de tecido compreendendo a variante de subtilisina. Em algumas modalidades preferidas, as composições de lavagem de louça e de limpeza de tecido adicionalmente compreendem pelo menos uma enzima adicional. Em algumas modalidades preferidas, a enzima adicional é selecionada de: uma protease (por exemplo, uma metaloprotease neutra, uma serina protease tipo selvagem, ou uma segunda variante de serina protease) a lipase, a cutinase, uma amilase, a carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, e uma peroxidase. Além disso, a presente invenção proporciona métodos de lavagem de prato, compreendendo as etapas de: provisão i) da composição de lavagem de louça compreendendo a variante de subtilisina, e ii) de louça louçaem necessidade de limpeza; e contato do de louça louçacom a composição de lavagem de louça sob condições efetivas para proporcionar limpeza do artigo de prato. Similarmente, a presente invenção proporciona métodos de limpeza de tecido, compreendendo as etapas de: provisão i) da composição de limpeza de tecido compreendendo a variante de subtilisina, e ii) roupa suja em necessidade de limpeza; e contato da roupa suja com a composição de limpeza de tecido sob condições efetivas para proporcionar limpeza da roupa suja. Em modalidades ainda adicionais, a presente invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica a variante, um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico isolado em combinação operável com um promotor, e/ou células hospedeiras compreendendo o vetor de expressão são providos.

[00020] A presente invenção também proporciona variante de subtilisina isolada de um Bacillus subtilisina, em que a variante de subtilisina é uma forma madura tendo atividade proteolítica e compreendendo substituições em três ou mais posições selecionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00021] Em algumas modalidades, a variante de subtilisina é uma forma madura tendo atividade proteolítica e compreendendo substituições em três ou mais posições selecionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00022] A presente invenção também proporciona variante de subtilisina isolada, em que as variantes de subtilisina são forma maturas tendo atividade proteolítica e compreendendo substituições em três ou mais posições selecionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00023] A presente invenção adicionalmente compreende variante de subtilisina isolada compreendendo substituições em três ou mais posições selecionadas de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, 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X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, e X275W, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00024] Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada tendo um índice de desempenho maior do que 1 em pelo menos um ensaio selecionado de um ensaio de BMI, um ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou um ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de mais do que 0,8 para estabilidade de LAS ou em um ensaio de TCA, em que as variantes compreendem pelo menos uma substituição em uma ou mais posições selecionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00025] Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada tendo um índice de desempenho maior do que 1 em pelo menos um ensaio selecionado de um ensaio de BMI, um ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou um ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de mais do que 0,8 para estabilidade de LAS e/ou em um ensaio de TCA, em que as variantes compreendem pelo menos uma substituição em uma ou mais posições selecionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00026] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada tendo um índice de desempenho maior do que 0,8 em pelo menos um ensaio selecionado de um ensaio de BMI, ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou um ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de mais do que 0,8 para estabilidade de LAS e em um ensaio de TCA, em que as variantes compreendem pelo menos uma substituição em uma ou mais posições selecionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00027] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada tendo um índice de desempenho maior do que 1 em pelo menos um ensaio selecionado de um ensaio de BMI, ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de mais do que 0,8 para estabilidade de LAS/EDTA ou em um ensaio de TCA, em que as variantes compreendem pelo menos três substituições selecionadas de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028S, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030C, X030E, X030L, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, 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X211Q, X211R, X211T, X211V, X211W, X211Y, X212C, X212F, X212G, X212H, X212I, X212M, X212N, X212P, X212R, X212S, X212T, X212V, X212Y, X213A, X213C, X213D, X213E, X213F, X213G, X213I, X213K, X213L, X213M, X213N, X213Q, X213R, X213S, X213T, X213V, X213W, X213Y, X214F, X214L, X214W, X214Y, X215A, X215C, X215D, X215E, X215F, X215G, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215P, X215R, X215S, X215T, X215V, X215W, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216G, X216H, X216I, X216K, X216L, X216M, X216N, X216P, X216Q, X216R, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217E, X217F, X217G, X217I, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218F, X218G, X218H, X218I, X218M, X218N, X218Q, X218R, X218S, X218T, X218V, X218Y, X220S, X220T, X222A, X222M, X222Q, X223A, X223G, X223S, X224A, X224G, X224L, X224N, X224S, X224T, X225C, X225P, X226C, X226F, X226H, X226M, X226V, X227A, X227C, X227G, X227I, X227L, X227M, X227S, X227T, X227V, X228A, X228C, X228G, X228I, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, 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X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250F, X250I, X250L, X250M, X250Q, X250S, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, e X275W, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00028] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolados tendo a índice de desempenho maior do que 1 em pelo menos um ensaio selecionadas de a Ensaio de BMI, um ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou um Ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de maios que 0,8 para Estabilidade de LAS e em um ensaio de TCA, em que variante compreende pelo menos três substituições selecionadas de: X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, X033M, X033S, X033T, X035I, X035L, X035M, X035P, X036A, X036E, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038Y, X040A, X040D, X040E, X040I, X040L, X040P, X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X047G, X047R, X048A, X048C, X048E, X048F, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049G, X049H, X049S, X049T, X050F, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054H, X054M, X054N, X054Q, X054S, X055C, X055E, X055G, X055H, X055K, X055L, X055P, X055Q, X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109W, X109Y, X110A, X110G, X111F, X111I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X115E, X115G, X115L, X115M, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115W, X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X116V, X116W, X117A, X117C, X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, X126L, X126M, X126V, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130W, X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131K, X131P, X131Q, X132A, X132H, X132I, X132N, X132Q, X132R, X132S, X132T, X133A, X133F, X133K, X133N, X133P, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134S, X134T, X134V, X135L, X135M, X135W, X136E, X136Q, X137A, X137C, X137E, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137W, X139C, X139I, X139V, X140D, X140E, X140N, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142V, X143C, X143D, X143F, X143H, X143N, X143T, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144R, X144S, X144T, X144V, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145F, X145K, X145L, X145N, X145Q, X145R, X146D, X146G, X147I, X147L, X147T, X147V, X148C, X148I, X148L, X148M, X148N, X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159S, X160A, X160C, X160D, X160F, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166S, X166T, X167F, X167Y, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170Y, X171C, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173H, X173M, X173N, X173Q, X173T, X174A, X174S, X174T, X174V, X175L, X175M, X175V, X176A, X176S, X177C, X177V, X180T, X180V, X182A, X182D, X182E, X182Q, X183A, X183D, X183N, X183Q, X183S, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185H, X185K, X185M, X185N, X185Q, X185T, X185V, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187C, X188A, X188D, X188E, X188F, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, X203E, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204G, X204N, X204S, X206D, X206E, X206H, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, X209M, X209W, X209Y, X210A, X210C, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C, X212F, X212G, X212H, X212M, X212N, X212R, X212S, X212Y, X213A, X213D, X213E, X213N, X213Q, X213S, X213T, X215A, X215C, X215D, X215E, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215S, X215T, X215V, X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216H, X216I, X216L, X216M, X216N, X216Q, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217D, X217E, X217F, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218N, X218Q, X222C, X222M, X222S, X223A, X223S, X224A, X224N, X224S, X224T, X227A, X227C, X227V, X228A, X228G, X228S, X228V, X230A, X230G, X230N, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231S, X232A, X232L, X232M, X233A, X233C, X233E, X233G, X233I, X233L, X233N, X233Q, X233S, X233T, X233V, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X235C, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, e X275R, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00029] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada tendo um índice de desempenho maior do que 1 em pelo menos um ensaio selecionado de um ensaio de BMI, um ensaio de microamostra de gema de ovo, e/ou um ensaio de atividade de AAPF, e um índice de desempenho de mais do que 0,8 para estabilidade de LAS ou em um ensaio de TCA, em que a variante compreende pelo menos três substituições selecionadas de: X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V, X022W, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025K, X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027W, X028A, X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, 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X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, e X275R, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a variante de subtilisina compreende duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das posições recitadas acima.

[00030] Em algumas modalidades, as variantes de subtilisina compreendem uma substituição adicional em uma ou mais das posições selecionadas do grupo consistindo em: 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 e 213, e em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00031] Em algumas modalidades particularmente preferidas, a variante de subtilisina isolada descrita acima e aqui são variantes GG36. Em algumas modalidades preferidas, as variantes GG36 são variantes de SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades alternativas, as variantes de subtilisina isoladas aqui e acima descritas são variantes BPN’.

[00032] Em algumas modalidades ainda adicionais, a variante de subtilisina isolada compreende uma combinação de substituições selecionadas de: S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, e S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00033] Em algumas modalidades ainda adicionais, a variante de subtilisina isolada compreende uma combinação de substituições selecionadas de: S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, e S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00034] Em algumas modalidades ainda adicionais, a variante de subtilisina isolada compreende uma combinação de substituições selecionadas de: S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, e S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00035] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada compreendendo uma combinação de substituições selecionadas de: A001C/S024V/I107L, A001I/R045T/I107 R/A172T, A001K/A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I07 2C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S 164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F,A0 01K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S1 64F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G 127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L 126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I, A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V10 4I/S164F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S 164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G12 7Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/R04 5F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L12 6F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R 045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R04 5K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R 045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045 K/L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001 K/R045K/L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S1 64Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001 K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001 K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I10 7T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001 K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001 K/V104I/L126F, A001K/V104I/L126F/S164I, A001K/V104I/L126F/S16 4Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/A172R, A001L/S024D/R045 Y/I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, A001Q/R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, A001R/I107T/G127Q/A172Q, A001R/I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, A001R/R045K/I107T/G127Q, A001R/R045K/G127R, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, A001R/R045N/I10 7V/A172V, A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G12 7R, A001R/S024H/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T, A001R/S0 24H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q, A001R/S0 24N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, A001R/S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, A001R/S024R/R0 45F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R0 45K/I107T/G127Q, A001R/S024T/I107T/A172Q, A001R/S024T/R045 K/A172Q, A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R0 45N/I107T/A172Q, A001R/S024W/I107V/A172S, A001R/S024W/R045F/I1 07V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/S024W/R045K, A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024W/R045N/I107T, A001 S/A172V, A001S/S024L/I107Y/A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, A001 V/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I, G097P/Y209W/A215V/S256W, G11 8L/G127R/S132L, G118T/G127Q, I107A/G127K/A172G, I107C/A172S, I1 07P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/S164V, M119F/N185R, M119F/N185R/Y209W/S256T, M119F/N185V/Y209W, M119F/S144T/N18 5V/S256I, M119F/S144W/N185R/S256L, M119F/Y209W, M119F/Y209 W/S256I, N018K/A215I, N018K/A215R, N018K/A215V, N018K/G097 P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/S256W, N018K/G097P/N185K/Y209 W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W, N018K/G09 7P/N185R/A215R/S256W, N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018 K/G097P/N185R/S256W, N018K/G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N18 5R/Y209W/S256W, N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W, N018K/N185K, N018K/N185K/A215V/S256W, N018K/N185K/S256W, N018K/N185K/Y 209W/A215R, N018K/N185Q/A215R/S256W, N018K/N185R/Y209W/A215V/S256W, N018K/S256W, N018Q/G097P/N185 K/A215V, N018Q/G097P/N185K/Y209W, N018Q/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018Q/N185K/Y209W/A2 15V, N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W, N018Q/N185Q/A215V, N018Q/N185Q/S256W, N018Q/N185Q/Y209W/S256W, N018Q/N185R/A2 15R, N018Q/N185R/S256W, N018R/G097P/N185Q/A215I, N018R/G097 P/Y209W/A215V, N018R/G097P/Y209W/S256W, N018R/N185K/A215V/S 256W, N018R/N185Q/A215V/S256W, N018R/N185R/A215R, N018R/N185R/Y209W/S256W, N018R/Y209 W/S256W, N043E/S101E, N043E/S101F, N043E/S10 1N/N117Y, N043E/S101Y/N117I/N248K, N043E/S101Y/N1 N043F/N117I, N043F/S101E/N117I/N248K, N043I/N117Y, N043I/S101E/N248I, N043I/S101F/N117Y/N248K, N04 3I/S101N/N117Y/N248K, N043I/S101R/N248K, N043I/S101Y/N117I/N248I, N043I/S101Y/N117Y/N248K, N043S/N117Y/N248K, N043S/N248I, N043 S/S101E, N043S/S101E/N117I/N248I, N043S/S101E/N117Y/N248K, N043 S/S101E/N248K, N043S/S101F, N043S/S101F/N248K, N043S/S101N/N 117I, N043S/S101R/N117I/N248K, N043S/S101V/N117I/N248I, N043S/S 101Y, N043S/S101Y/N117I, N043S/S101Y/N117Y, N043S/S101Y/N248K, N043V/N117Y/N248I, N043V/N248I, N043V/N248K, N043V/S101E/N117 I/N248K, N043V/S101E/N248I, N043V/S101F, N043V/S101F/N117I, N043V/S101F/N117Y, N043V/S101F/N248K, N043V/S101R/N117I/N248K, N043V/S101T/N248K, N043V/S101V/N117I, N043V/S101V/N248K, N043 V/S101Y, N043V/S101Y/N117I, N043V/S101Y/N117I/N248K, N185K/A215V, N185K/Y209W/S256W, N185Q/A215R/S256W, N185Q/S256W, N185 R/S256W, N185R/Y209W/A215I, N185R/Y209W/S256W, N185V/Y209W, P052I/M119F, P052I/M119F/S144T/N185R/Y209W, P052I/M119F/S144V/Y 209W, P052I/M119F/S144Y/N185R, P052I/M119F/S144Y/N185R/Y20 9W/S256I, P052I/M119F/Y209W/S256I, P052I/N185R/Y209W/S256I, P05 2I/N185V/Y209W, P052I/N185V/Y209W/S256I, P052I/S144T, P052I/S14 4T/N185R/Y209W/S256T, P052I/S144T/N185V/Y209W/S256T, P052I/S14 4T/S256I, P052I/S144T/Y209W/S256I, P052I/S144T/Y209W/S256T, P05 2I/S144V/Y209W, P052I/S144Y/N185R/Y209W, P052I/S144Y/N185V, P05 2I/S144Y/N185V/S256T, P052I/S144Y/S256T, P052I/S144Y/Y209W/S256I, P052V/M119F/N185V/Y209W/S256I, P052V/M119F/S144T, P052V/M119F/S 144T/N185R/S256T, P052V/M119F/S144T/N185R/Y209W, P052V/M119 F/S144T/S256T, P052V/M119F/S144T/Y209W, P052V/M119F/S144V/N18 5V/S256I, P052V/N185V/Y209W/S256I, P052V/S144T, P052V/S144T/N 185V/Y209W/S256I, P052V/S144T/N185V/Y209W/S256T, P052V/S144T/Y2 09W/S256I, P052V/S144V/N185R/Y209W/S256T, P052V/S144V/N185V/Y 209W, P052V/S144V/Y209W/S256I, P052V/S144W/N185R, P052V/S144 W/N185V/Y209W, P052V/S144W/Y209W, P052V/S144Y/S256T, P052V/S1 44Y/Y209W, P052V/S256T, Q109A/G118S, Q109D/G118V/G 127H, Q109H/G118S/S132P, Q109H/G127R, Q109I/G118R, Q109I/G118S, Q10 9I/G127C, Q109I/G127T/S132Y, Q109I/S132N, Q109K/G118F/G12 7Q/S 132N, Q109L/G118L/G127Q/S132N, Q109P/G118Q, Q109R/G118V, Q109 S/G118R, Q109T/G118N, Q109V/G118F, Q109V/G127Q, Q109V/G127R, Q109V/G127R/S132N, Q109V/G127R/S132Y, R045F/I072V/L126F/S164Q, R045F/I107T, R045K/I072C/V104I/L126F/S164F, R045K/I107T, R045K/L 126F/S164F, R045L/I072S/S164I, R045N/I107A/A172R, R045N/I107T/A 172Q, R045N/I107V/A172Q, R045S/I107L, R045V/I107R/A172D, S024A/G 118I, S024A/Q109Y/G118C, S024C/Q109K/G118I, S024G/G118F/G1 27R/S132N, S024H/G118K/G127I, S024H/G118L/G127T/S132Y, S024H/G1 27R, S024H/I107K, S024H/Q109L, S024H/Q109T/G118R, S024H/Q109V/G1 27R/S132N, S024H/Q109V/G127T, S024H/S099K/G118F/G127R, S024H/S 099K/G118R/G127R/S132H, S024H/S099K/S103P, S024H/S099K/S103 P/G118F, S024H/S099K/S103R/G118A/S132P, S024H/S099Q/G118R/G1 27Q/S132H, S024H/S099Q/G118R/S132H, S024H/S099Q/S103N/G118R/G 127T/S132N, S024H/S099Q/S103N/G118T/S132H, S024H/S099Q/S103P, S024H/S099Q/S103P/G118R/S132H, S024H/S099Q/S103P/S132H, S024 H/S099Q/S132H, S024H/S099Q/S132N, S024H/S099T/G118R, S024H/S0 99T/S103N, S024H/S099T/S103N/G127R/S132N, S024H/S099T/S103N/S 132N, S024H/S099T/S103P/G118R, S024H/S099T/S103P/G118R/S132H, S024H/S099T/S103P/S132N, S024H/S103N/S132H, S024H/S103P/G12 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144W/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S 128L/P129Q/S130A/Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S13 2N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S10 3N/S132H, S099Q/S103P/G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S1 03P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099 T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/G 118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I, S101F/N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N1 17I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N 248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144W/N18 5V/Y209W/S256I, S144W/S256I, S144Y/Y209W/S256I, V104E/L126I/S164L, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00036] Em algumas modalidades ainda adicionais, a presente invenção proporciona variante de subtilisina isolada compreendendo uma combinação de substituições selecionadas de: TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S2 4W/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q 109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S16 4I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87 N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A21 5R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R /A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G11 8V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248 R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R , S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R , S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/ A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G 118R/S128L/P129Q/S130A/S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

[00037] A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam as variantes de subtilisina colocadas acima e aqui. A presente invenção adicionalmente proporciona vetores de expressão compreendendo os ácidos nucleicos que codificam a variantes de subtilisina provida acima e aqui. Em adição, a presente invenção proporciona células hospedeiras compreendendo o vetor de expressão que codifica os ácidos nucleicos que codificam as variantes de subtilisina providas acima e aqui.

[00038] A presente invenção também proporciona composições de limpeza compreendendo as variantes de subtilisina providas aqui. Em algumas modalidades, as composições de limpeza compreendem um detergente em líquido, gel, tablete, pó e/ou grânulo. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza são selecionadas de detergentes de lavageme detergentes de prato. Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpeza compreendem detergentes de lavanderia. Em algumas modalidades particularmente preferidas, as composições de limpeza são detergentes de função pesada. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza compreendem detergentes de louça selecionados de detergentes de lavagem de louça manual e automática. Em algumas modalidades preferidas adicionais, as composições de limpeza aqui providas compreendem adicionalmente pelo menos um agente de alvejamento. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza aqui providas são detergentes livres de fosfato, enquanto em algumas modalidades alternativas, as composições de limpeza aqui providas são detergentes contendo fosfato. Em algumas modalidades ainda adicionais, as composições de limpeza aqui providas são detergentes de água fria. Em algumas modalidades ainda adicionais, as composições de limpeza aqui providas compreendem adicionalmente pelo menos uma enzima adicional. Em algumas modalidades, as composições de limpeza compreendem pelo menos uma enzima adicional selecionada de hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, perhidrolasess, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β- glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e milases, ou misturas destas.

[00039] A presente invenção também proporciona métodos para limpeza, compreendendo provisão de um item a ser limpo e a uma composição compreendendo pelo menos uma composição de limpeza aqui provida, e contactando o item com a composição, sob condições efetivas para proporcionar limpeza do item. Em algumas modalidades, os métodos adicionalmente compreendem a etapa de enxaguar o item após contactar o item com a composição de limpeza. Em algumas modalidades preferidas, o item a ser limpo compreende louça. Em algumas modalidades alternativas, o item a ser limpo compreende tecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00040] A figura 1 proporciona um alinhamento de várias proteases de referência incluindo: BPN’ (SEQ ID NO:1), GC GCI-P036 (SEQ ID NO:2), GCI-P037 (SEQ ID NO:3), e GCI-P038 (SEQ ID NO:4). A menos que de outro modo especificado, as posições de substituição são dadas em relacionamento a BPN’.

[00041] A figura 2 proporciona um mapa de pHPLT-GG36.

[00042] A figura 3 proporciona um mapa de p2JH-GG36ci.

[00043] A figura 4 representa a concentração de protease conforme determinada usando um ensaio de inibição de eglin c para proteases variantes.

[00044] A figura 5 representa o desempenho de lavagem (BMI mi- croamostra) de proteases variantes.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00045] A presente invenção proporciona métodos para projeto de proteína e variantes de serina protease produzidas da mesma. Especifi- camente, a presente invenção proporciona variantes de serina protease tendo uma ou mais substituições conforme comparado a uma serina protease de referência. Em adição, a presente invenção proporciona composições compreendendo estas variantes de serina protease. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições de limpeza compreendendo pelo menos uma destas variantes de serina protease.

[00046] Para proposta prática, não é usualmente necessário encontrar a melhor sequência em um espaço de proteína de modo a criar uma proteína que seja ótima para uma aplicação particular. Para muitas aplicações, o problema a ser solucionado é identificar pelo menos uma sequência de proteína que encontre ou exceda o valor mínimo requerido para um número de propriedades. Isto requer conhecimento de mutações que sejam boas para uma propriedade particular, bem como conhecimento daquelas mutações que sejam más para qualquer das propriedades desejadas. A presente invenção proporciona meios para encontrar o objetivo pela identificação daquelas posições na proteína que possam ser alteradas para aperfeiçoar a propriedade primária e manter os valores para outras propriedades dentro dos limites desejados.

[00047] A presente invenção proporciona meios para avaliar todas as posições em uma proteína para todas as propriedades de interesse pela construção de “bibliotecas de avaliação de local” em cada local. Em modalidades preferidas, estas bibliotecas contêm 9-19 mutações em cada posição, e são usadas para avaliar cada posição para uso no projeto da proteína e construção de bibliotecas. Cada propriedade é medida relativa a enzima de referência e uma diferença de energia livre aparente para cada mutante vs. Tipo selvagem é calculada. Estes valores aparentes delta G (“isto é, ΔΔG”) são então usados para determinar aditividade.

[00048] Um modo ideal para analisar variantes seria através da diferença na energia livre para a variante versus a proteína de referência no processo de interesse. A Energia Livre de Gibbs para um processo representa a quantidade máxima de trabalho que pode ser realizada por um sistema. A mudança na energia Livre relativa a enzima de referência (ΔΔ G) é dada conforme segue;

[00049] onde kvariante é a taxa constante para a enzima variante, e kreferência é a taxa constante para a enzima de referência, R é a constante da lei do Gás e T é a temperatura absoluta. Muitos ensaios não são construídos para permitir determinação de Energias Livres verdadeiras, de modo que nós utilizamos uma quantidade ΔΔ G app = -RT ln (Pvariante/Preferência)

[00050] onde Pvariante é o valor de desempenho para a variante e Preferência é o valor de desempenho para a enzima de referência sob as mesmas condições. Os valores de ΔΔ Gapp podem ser esperados se comportarem em um modo similar ao ΔΔ G para distribuições de dados e aditividade. Contudo, desde que ΔΔ G é a quantidade máxima de trabalho que pode ser efetuada pela variante comparado à enzima de referência, a quantidade ΔΔ G app geralmente subestimará o ΔΔ G e conduzirá a resultados que parecem sinergístico em que as propriedades de duas posições aditivas podem ser maiores do que o valor prognosticado pela adição de seus valores de ΔΔ G app juntos.

[00051] Em adição, a presente invenção proporciona variantes de subtilisina e composições compreendendo estas variantes.

Definições

[00052] A menos que de outro modo indicado, a prática da presente invenção envolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecular, projeto de proteína, microbiologia, e DNA recombinante, que estejam dentro da técnica conhecida. Tais técnicas são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritos em numerosos textos e trabalhos de referência bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Todas as patentes, pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionados, ambos supra e infra, são, desse modo, expressamente incorporados aqui por referência.

[00053] A menos que de outro modo aqui definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um dos versados na técnica ao qual esta invenção pertence. Muitos dicionários técnicos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles aqui descritos encontram uso na prática da presente invenção, os métodos preferidos e materiais são aqui descritos. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais totalmente descritos por referência ao Relatório Descritivo como um todo. Também, conforme aqui usado, o singular "um", "uma" e "o" inclui referência plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente. É par ser compreendido que esta invenção não é limitada à metodologia particular, protocolos, e reagentes descritos, conforme estes podem variar, dependendo do contexto que eles são usados por aqueles versados na técnica.

[00054] A prática da presente invenção emprega, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de purificação de proteína, biologia molecular, microbiologia, técnicas de DNA recombinante e sequenciamento de proteína, todos dos quais estão dentro da técnica do assunto.

[00055] Além disso, os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tidos por referência ao relatório descritivo com um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais totalmente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Não obstante, de modo a facilitar a compreensão da invenção, um número de termos são definidos abaixo.

[00056] Conforme aqui usado, os termos “protease” e “atividade proteolítica” se referem a uma proteína ou peptídeo exibindo a capacidade de hidrolisar peptídeos ou substratos tendo ligações de peptídeo. Muitos procedimentos bem conhecidos existem para medição da atividade proteolítica (Kalisz, "Microbial Proteinases," Em: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988]). Por exemplo, atividade proteolítica pode ser determinada por ensaios comparativos que analisam a respectiva capacidade da protease de hidrolisar um substrato comercial. Substratos exemplares úteis na análise de protease ou atividade proteolítica, incluem, mas não são limitados a, di-metil caseína (Sigma C-9801), colágeno bovino (Sigma C-9879), elastina bovina (Sigma E-1625), e queratina bovina (ICN Biomedical 902111). Ensaios colorimétricos utilizando estes substratos são bem conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, WO 99/34011; e Patente dos Estados Unidos. No. 6.376.450, ambos dos quais são incorporados aqui por referência). O ensaio pNA (Vide, por exemplo, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) também encontra uso na determinação da concentração de enzima ativa para frações coletadas durante eluição de gradiente. Este ensaio mede a taxa na qual p- nitroanilina é liberada a medida qual a enzima hidrolisa o substrato sintético solúvel, succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p- nitroanilida (suc-AAPF-pNA). A taxa de produção de cor amarela a partir da reação de hidrólise é medida a 410 nm em um espectrofotômetro e é proporcional à concentração de enzima ativa. Em adição, medições de absorvência a 280 nm podem ser usadas para determinar a concentração de proteína total. A proporção de enzima ativa/proteína total dá a pureza da enzima.

[00057] Conforme aqui usado, o termo “subtilisina” refere-se a qualquer membro da família S8 serina protease conforme descrito em MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings et al., MEROPS: a base de dados de peptidase, Nucl Acids Res, 34 Database issue, D270-272, 2006). Conforme descrito na mesma, a família peptidase S8 contém a serina endopeptidase subtilisina e seus homólogos (Biochem J, 290:205-218, 1993). A família S8, também conhecida como a família subtilase, é a segunda maior família de serina peptidases, e pode ser dividida em duas subfamílias, com subtilisina (S08.001) o exemplo tipo para subfamília S8A e kexin (S08.070) o exemplo tipo para subfamília S8B. Tripeptidil-peptidase II (TPP-II; S08.090) foi primeiramente considerada ser o exemplo tipo de uma terceira subfamília, mas foi determinada para ser desclassificada. Os membros da família S8 têm uma tríade catalítica na ordem Asp, His e Ser na sequência, que é uma ordem diferente daquela das famílias S1, S9 e S10. Na subfamília S8A, os resíduos de local ativo frequentemente ocorrem nos motivos Asp- Thr/Ser-Gly (que é similar ao motivo de sequência nas famílias de endopeptidases aspárticas em clan AA), His-Gly-Thr-His e Gly-Thr-Ser- Met-Ala-Xaa-Pro. Na subfamília S8B, os resíduos catalíticos frequentemente ocorrem nos motivos Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg e Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro. Muitos membros da família S8 são endopeptidases, e são ativos em pH alcalino mediamente neutro. Muitas peptidases na família são termoestáveis. A caseína é frequentemente usada como um substrato de proteína e um substrato sintético típico é suc-AAPF. Muitos membros da família são peptidases não específicas com uma preferência para clivar após resíduos hidrofóbicos. Contudo, membros da subfamília S8B, tais como kexin (S08.070) e furin (S08.071), clivam após aminoácidos dibásicos. Muitos membros da família S8 são inibidos por inibidores de serina peptidase geral tais como DFP e PMSF. Devido a muitos membros da família se ligarem à cálcio para estabilidade, a inibição pode ser vista com EDTA e EGTA, que são frequentemente considerados serem inibidores específicos de me- tallopeptidases. Os inibidores de proteína incluem terceiro domínio de ovomucoide de peru (I01.003), inibidor de Streptomyces subtilisina (I16.003), e membros da família I13 tal como eglin C (I13.001) e inibidor de cevada CI-1A (I13.005), muitos dos quais também inibem chymotrypsin (S01.001). O subtilisin propeptídeo é em si inibitório, e o inibidor homólogo de proteinase B de Saccharomyces inibe cerevisin (S08.052). As estruturas terciárias para vários membros da família S8 foram agora determinadas. Uma estrutura típica de S8 proteína consiste em três camadas com um,a folha β de sete tranças intercalada entre duas camadas de helicoidais. Subtilisin (S08.001) é a estrutura tipo para clan SB (SB). Apesar da estrutura diferente, os locais ativos de subtilisina e quimiotripsin (S01.001) podem ser superimpostos, que sugerem que a similaridade é o resultado de evolução convergente preferivelmente do que evolução divergente.

[00058] Conforme aqui usado, os termos “protease variante” e “variante de protease” são usados em referência às proteases que são similares a uma protease de referência, particularmente em sua função, mas têm mutações em sua sequência de aminoácido que as tornam diferentes em sequência da protease tipo selvagem em de uma a 20 posições. As sequências de aminoácido na região madura de várias proteases de referência exemplares são mostradas no alinhamento da figura 1. Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção proporciona “variantes de GG36”, em que as mutações estão presentes na sequência madura de GG36 colocada em SEQ ID NO:2.

[00059] Conforme aqui usado, “o gênero Bacillus” inclui todas as espécies dentro do gênero “Bacillus,” conforme conhecido por aquelesversados na técnica, incluindo, mas não limitados a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, e B. thuringiensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a suportar reorganização taxonômica. Desse modo, é pretendido que o gênero inclui espécies que foram reclassificadas, incluindo, mas não limitadas a tais organismos como B. stearothermophilus, que é agora denominado “Geobacillus stearothermophilus”. A produção de endoesporos resistentes na presença de oxigênio é considerada a definição da característica do gênero Bacillus, embora esta característica também se aplique a recen- temente denominados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, e Virgibacillus.

[00060] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucleico”, usados aqui permutavelmente, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou deoxiribonucleotídeos. Estes termos incluem, mas não estão limitados a, um DNA de trançado simples, duplo ou triplo, DNA genômico, cDNA, RNA, híbrido de DNA-RNA, ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina, ou outras bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, bioquimicamente modificadas, quimicamente naturais. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: genes, fragmentos de gene, fragmentos cromossomais, ESTs, exons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. Em algumas modalidades, os polinucleotí- deos compreendem nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilatados e análogos de nucleotídeo, uracil, outros açúcares e grupos de ligação tais como fluororibose e tioato, e ramificações de nucleotídeo. Em modalidades alternativas, as sequências de nucleotídeo são interrompidas por componentes de não nucleotídeo.

[00061] Conforme aqui usado, os termos “construção de DNA” e “DNA de transformação” são usados permutavelmente para se referirem ao DNA usado para introduzir sequências em uma célula hospedeira ou organismo. O DNA pode ser gerado in vitro por PCR ou qualquer (quaisquer) outra(s) técnica(s) adequada(s) conhecida(s) por aqueles versados na técnica. Em modalidades particularmente preferidas, a construção de DNA compreende uma sequência de interesse (por exemplo, como uma sequência de chegada). Em algumas modalidades, a sequência é operavelmente ligada a elementos adicionais tais como elementos de controle (por exemplo, promotores, etc.). A construção de DNA pode adicionalmente compreender um marcador selecionável. Ela pode adicionalmente compreender uma sequência de chegada flanqueada por caixas de homologia. Em uma modalidade adicional, o DNA de transformação compreende outras sequências não homólogas, adicionadas às extremidades (por exemplo, sequências “stuffer” ou flancos). Em algumas modalidades, as extremidades da sequência de chegada são fechadas tal que o DNA de transformação forma um círculo fechado. As sequências de transformação podem ser tipo selvagem, mutante ou modificada. Em algumas modalidades, a construção de DNA compreende sequências homólogas para o cromossomo da célula hospedeira. Em outras modalidades, a construção de DNA compreende sequências não homólogas. Uma vez que a construção de DNA é montada in vitro, ela pode ser usada para: 1) inserir sequências heterólogas em uma sequência alvo desejada de uma célula hospedeira, e/ou 2) mutagenizar uma região do cromossomo da célula hospedeira (isto é, substituir uma sequência endógena com uma sequência heteróloga), 3) anular genes alvos, e/ou 4) introduzir um plasmídeo de replicação no hospedeiro.

[00062] Conforme aqui usado, os termos “cassete de expressão” e “vetor de expressão” se referem a construções de ácido nucleico geradas recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem transcrição do ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a porção de cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em modalidades preferidas, vetores de expressão têm a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heteróloga em uma célula hospedeira. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos são comercialmente disponíveis. A seleção de vetores de expressão adequados está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica. O termo “cassete de expressão” é usado permutavelmente aqui com “construção de DNA,” e seus equivalentes gramaticais. A seleção de vetores de expressão adequados está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica.

[00063] Conforme aqui usado, o termo “vetor” se refere a uma construção de polinucleotídeo designada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de lançadeira, plasmídeos, cassetes e similares. Em algumas modalidades, a construção de polinucleotídeo compreende uma sequência de DNA que codifica a protease (por exemplo, protease precursora ou madura) que é operavelmente ligada a uma pró-sequência adequada (por exemplo, secretória, etc.) capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado.

[00064] Conforme aqui usado, o termo "plasmídeo"se refere a uma construção de DNA de trançado duplo circular (ds) usada como um vetor de clonagem, e que forma um elemento genético de autorreplicação extracromossomal em alguns eucariotes ou procariotes, ou se integra no cromossomo hospedeiro.

[00065] Conforme aqui usado no contexto de introdução de uma sequência de ácido nucleico em uma célula, o termo "introduzido" se refere a qualquer método adequado para transferência da sequência de ácido nucleico na célula. Tais métodos para introdução incluem, mas não são limitados a, fusão de protoplasto, transfecção, transformação, conjugação, e transdução (Vide, por exemplo, Ferrari et al., “Genetics,” in Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., páginas 57-72, [1989]).

[00066] Conforme aqui usado, os termos “transformado" e "estavelmente transformado" se referem a uma célula que tem uma polisequência de (heteróloga) nucleotídeo não nativa integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissomal que é mantido por pelo menos duas gerações.

[00067] Conforme aqui usado, um ácido nucleico é “operavelmente ligado” quando ele é colocado em um relacionamento funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA que codifica um condutor secretório (isto é, um peptídeo de sinal), é operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ela afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossomo é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ela é posicionada de modo a facilitar translação. Geralmente, “operavelmente ligado” significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um condutor secretório, contíguas e em fase de leitura. Contudo, intensificadores não têm que serem contíguos. A articulação é efetuada por ligação em locais de restrição convenientes. Em tais locais não existem os adaptadores ou articuladores de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional.

[00068] Conforme aqui usado o termo “gene” se refere a um polinu- cleotídeo (por exemplo, um segmento de a DNA) que codifica um polipeptídeo e inclui regiões precedentes e seguindo as regiões de codificação, bem como sequências de intervenção (introns) entre segmentos de codificação individuais (exons).

[00069] Conforme aqui usado, “genes homólogos” se refere um par de genes de espécies diferentes, mas usualmente relacionados, que correspondem entre si e que são idênticos ou muito similares entre si. O termo envolve genes que são separados por especiação (isto é, o desenvolvimento de novas espécies) (por exemplo, genes ortólogos), bem como genes que foram separados por duplicação genética (por exemplo, genes paralogos).

[00070] Conforme aqui usado, proteínas são definidas como tendo uma “dobra” comum se elas têm as mesmas estruturas secundárias maiores no mesmo arranjo e as mesmas conexões topológicas. Proteínas diferentes com a mesma dobra têm elementos periféricos de estrutura secundária e regiões de giro que diferem em tamanho e conformação. Em alguns casos, estas regiões periféricas diferentes podem compreender metade da estrutura. As proteínas colocadas juntas na mesma categoria de dobra não têm necessariamente uma origem evolucionária comum (por exemplo, similaridades estruturais ocorrendo de físicas e químicas de proteínas que favorecem certos arranjos de acondicionamento e topologias de cadeia).

[00071] Conforme aqui usado, “homologia” refere-se a similaridade ou identidade de sequência, com identidade sendo preferida. Esta homologia é determinada usando técnicas padrões conhecidas na técnica (Vide por exemplo, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; programas tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA na Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); e Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]).

[00072] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de sequência múltiplo de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos progressivos de par. Ele pode também plotar uma árvore mostrando os relacionamentos de difusão usados para criar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). O método é similar àquele descrito por Higgins e Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Parâmetros úteis de PILEUP incluindo um peso de folga de falha de 3,00, um peso de comprimento de folga de falha de 0,10, e folgas terminais pesadas.

[00073] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990]; and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Um progrema BLAST particularmente útil é o programa WU- BLAST-2 (Vide, Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]). WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, muitos dos quais são ajustados aos valores de falha. Os parâmetros ajustáveis são ajustados com os seguintes valores: estendimento de sobreposição =1, fração de sobreposição = 0,125, limite de palavra (T) = 11. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da sequência particular e composição da base de dados particular contra qual a sequência de interesse está sendo pesquisada. Contudo, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade. Uma % de sequência do valor de identidade de aminoácido é determinada pelo número de equiparação de resíduos idênticos dividido pelo número total de resíduos da sequência “mais longa” na região alinhada. A sequência “mais longa” é a sequência tendo os resíduos mais atuais na região alinhada (folgas introduzidas por WU-Blast-2 para maximizar e a contagem de alinhamento são ignoradas).

[00074] Desse modo, "porcentagem(%) de identidade de sequência de ácido nucleico"é definida como a porcentagem de resíduos de nucleotídeo em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de nucleotídeo da sequência de partida (isto é, a sequência de interesse). Um método preferido utiliza o módulo BLASTN de WU- BLAST-2 ajustado aos parâmetros de falha, com estendimento de sobreposição e fração de sobreposição ajustados para 1 e 0,125, respectivamente.

[00075] Conforme aqui usado, “recombinante” inclui referência a uma célula ou vetor, que foram modificados pela introdução de uma sequência heteróloga de ácido nucleico ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Desse modo, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula, ou expressam genes nativos que são, de outro modo, anormalmente expressos, sub expressos ou não expressos no todo como um resultado de intervenção humana deliberada. “Recombinação”, ”recombinando” e geração de um ácido nucleico “recombinado” são geralmente o conjunto de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em que o conjunto dá ocorrência a um gene quimérico.

[00076] Em algumas modalidades preferidas, sequências de DNA mutante são geradas com mutagênese de saturação local em pelo menos um códon. Em outra modalidade preferida, mutagênese de saturação local é realizada para dois ou mais códons. Em uma modalidade adicional, sequências de DNA mutante têm mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 55%, mais do que cerca de 60%, mais do que cerca de 65%, mais do que cerca de 70%, mais do que cerca de 75%, mais do que cerca de 80%, mais do que cerca de 85%, mais do que cerca de 90%, mais do que cerca de 95%, ou mais do que cerca de 98% de homologia com a sequência tipo selvagem. Em modalidades alternativas, DNA mutante é gerado in vivo usando qualquer procedimento mutgênico conhecido tal como, por exemplo, radiação, nitrosoguanidina e similar. A sequência de DNA desejada é então isolada e usada nos métodos aqui providos.

[00077] Conforme aqui usado, os termos "amplificação"e "amplificação de gene" se referem a um processo pelo qual sequências de DNA específicas são desproporcionalmente replicadas tal que o gene amplificado torna-se presente um número de cópia mais alto do que estava inicialmente presente no genoma. Em algumas modalidades, a seleção de células por crescimento na presença de uma droga (por exemplo, um inibidor de uma enzima inibível) resulta na amplificação de ou o gene endógeno que codifica o produto de gene requerido para crescimento na presença do fármaco ou por amplificação de sequências exógenas (isto é, entrada) que codificam este produto de gene, ou ambos.

[00078] “Amplificação” é um caso especial de replicação de ácido nucleico envolvendo especificidade de gabarito. Ela é para ser contrastada com replicação de gabarito não específica (isto é, replicação que é dependente do gabarito, mas não dependente de um gabarito específico). A especificidade do gabarito é aqui distinguida de fidelidade de replicação (isto é, síntese da polisequência correta de nucleotídeo) e especificidade de nucleotídeo (ribo- ou deoxiribo-). A especificidade de gabarito é frequentemente descrita em termos de especificidade “alvo”. As sequências alvos são "alvos" no sentido que elas são procuradas serem classificadas se outro ácido nucleico. Técnicas de amplificação foram designadas principalmente para esta classificação.

[00079] Conforme aqui usado, o termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de restrição purificada ou produzido sinteticamente, que é capaz de agir como um ponto de iniciação de síntese quando colocado sob condições em que a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a um trançado de ácido nucleico é induzido, (isto é, na presença de nucleotídeos e um agente de indução tal como DNA polimerase e a uma temperatura e pH adequados). O iniciador é preferivelmente de trançado simples para eficiência máxima na amplificação, mas pode alternativamente ser de trançado duplo. Se de trançado duplo, o iniciador é primeiro tratado para separar seus tran- çados antes de ser usado para preparar produtos de extensão. Prefe- rivelmente, o iniciador é um oligodeoxiribonucleotídeo. O iniciador deve ser suficientemente longo para preparar a síntese de produtos de extensão na presença do agente de indução. Os comprimentos exatos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte de iniciador e o uso do método.

[00080] Conforme aqui usado, o termo "sonda" refere-se a um oligonucleotídeo (isto é, uma sequência de nucleotídeos), se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de restrição purificada ou produzida sinteticamente, recombinantemente ou por amplificação de PCR, que é capaz de hibridizar a outro oligonucleotídeo de interesse. Uma sonda pode ser de trançado simples ou de trançado duplo. As sondas são úteis na detecção, identificação e isolamento de sequências de gene particulares. É contemplado que qualquer sonda usada na presente invenção será etiquetada com qualquer "molécula relatora", de modo que é detectável em qualquer sistema de detecção, incluindo, mas não limitado a, enzima (por exemplo, ELISA, bem como ensaios histoquímicos à base de enzima), sistemas fluorescentes, radioativos, e luminescentes. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer sistema de detecção particular ou etiqueta.

[00081] Conforme aqui usado, o termo "alvo" quando usado na referência à reação de cadeia de polimerase, se refere a região de ácido nucleico ligada pelos iniciadores usados para reação de cadeia polimerase. Desse modo, o "alvo"é procurado ser classificado de outras sequências de ácido nucleico. Um ”segmento"é definido como uma região de ácido nucleico dentro da sequência alvo.

[00082] Conforme aqui usado, o termo "reação de cadeia polimerase" (PCR) se refere aos métodos das Patente dos Estados Unidos Nos. 4.683.195 4.683.202, e 4.965.188, desse modo incorporadas por referência, que incluem métodos para aumentar a concentração de um segmento de uma sequência alvo em uma mistura de DNA genômico sem clonagem ou purificação. Este processo para amplificação da sequência alvo é bem conhecido na técnica.

[00083] Conforme aqui usado, o termo "reagentes de amplificação" se refere aqueles reagentes (deoxiribonucleotídeo trifosfatos, tampão, etc.), necessários para amplificação, exceto para iniciadores, gabarito de ácido nucleico e a enzima de amplificação. Tipicamente, os reagentes de amplificação juntos com outros componentes de reação são colocados e contidos em um vaso de reação (tubo de teste, microcavidade, etc.).

[00084] Conforme aqui usado, os termos "endonucleases de restrição"e "enzimas de restrição"se referem a enzimas bacteriais, cada uma da qual DNA de trançado duplo cortado em ou perto de uma sequência de nucleotídeo específica.

[00085] Um "local de restrição"se refere a uma sequência de nucleotídeo reconhecida e clivada por uma dada endonuclease de restrição e é frequentemente o local para inserção de fragmentos de DNA. Em certas modalidades da invenção locais de restrição são projetados no marcador seletivo e nas extremidades 5' e 3' da construção de DNA.

[00086] “Recombinação homóloga” significa a troca de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA ou cromossomos emparelhados no local de sequência de nucleotídeos idênticas ou quase idênticas. Em uma modalidade preferida, integração cromossomal é recombinação homóloga.

[00087] Conforme aqui usado “aminoácido” se refere a peptídeo ou sequências de proteína ou porções destas. Os termos “proteína,” “peptídeo,” e “polipeptídeo” são usados permutavelmente.

[00088] Conforme aqui usado, “proteína de interesse” e “polipeptídeo de interesse” se referem a uma proteína/polipeptídeo que é desejada e/ou sendo avaliada. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é expressa intracelularmente, enquanto em outras modalidades, ela é um polipeptídeo secretado. Em modalidades particularmente preferidas, estas enzimas incluem as serina proteases da presente invenção. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um polipeptídeo secretado que é fundido a um peptídeo de sinal (isto é, uma extensão amino-terminal em uma proteína a ser secretada). Quase todas as proteínas secretadas usam uma extensão de proteína amino-terminal que desempenha um papel crucial no alvejamento a e translocação de proteínas precursoras através da membrana. Esta extensão é proteoliticamente removida por uma peptidase de sinal durante ou imediatamente em seguida a transferência de membrana.

[00089] Um polinucleotídeo é referido para "codificar" um RNA ou um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o RNA, o polipeptídeo ou um fragmento deste. O trançado de antissenso de tal ácido nucleico é também referido para codificar as sequências. Conforme é conhecido na técnica, um DNA pode ser transcrito por um RNA polimerase para produzir RNA, mas um RNA pode ser transcrito reverso por transcriptase reversa para produzir um DNA. Desse modo um DNA pode codificar um RNA, e vice-versa.

[00090] “Cepa hospedeira” ou “célula hospedeira” se refere a um hospedeiro adequado para um vetor de expressão compreendendo DNA de acordo com a presente invenção.

[00091] Uma enzima é "sobreexpressa" em uma célula hospedeira se a enzima é expressa na célula a um nível mais alto que o nível em que ela é expressa em uma célula tipo selvagem correspondente.

[00092] Os termos "proteína"e "polipeptídeo" são usados permutavelmente aqui. O código de 3 letras para aminoácidos conforme definido em conformidade com a IUPAC-IUB Joint Commission em Nomenclatura Bioquímica (JCBN) é usado através desta descrição. É também compreendido que um polipeptídeo pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeo devido a degeneração do código genético.

[00093] Uma “prossequência” é uma sequência de aminoácido entre a sequência de sinal e protease madura que é necessária para a secreção da protease. A clivagem da prossequência resulta em uma protease ativa madura.

[00094] O termo "sequência de sinal" ou “peptídeo de sinal” se refere a qualquer sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos que possam participar na secreção das formas maturas ou precursoras da proteína. Esta definição de sequência de sinal é uma definição funcional, significativa para incluir todas aquelas sequências de aminoácido codificadas pela porção N-terminal do gene de proteína, que participa na efetuação da secreção de proteína. Elas são frequentemente, mas não universalmente, ligadas à porção N-terminal de uma proteína ou à porção N-terminal de uma proteína precursora. A sequência de sinal pode ser endógena ou exógena. A sequência de sinal pode ser aquela normalmente associada com a proteína (por exemplo, protease), ou pode ser de um gene que codifica outra proteína secretada. Uma sequência de sinal exógena exemplar compreende os primeiros sete resíduos de aminoácido da sequência de sinal de Bacillus subtilis subtilisina fundidos ao restante da sequência de sinal do subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

[00095] O termo “sequência de sinal híbrida” se refere a sequências de sinal em que parte da sequência é obtida a partir do hospedeiro de expressão para a sequência de sinal do gene a ser expresso. Em algumas modalidades, sequências sintéticas são utilizadas.

[00096] O termo forma “madura” de uma proteína ou peptídeo refere- se a forma funcional final da proteína ou peptídeo.

[00097] O termo forma "precursora" de uma proteína ou peptídeo se refere a uma forma madura da proteína tendo uma pró-sequência operavelmente ligada ao terminal amino ou carbonil da proteína. O precursor pode também ter uma sequência de "sinal" operavelmente ligada ao terminal amino da prossequência. O precursor pode também ter polinucleotídeos adicionais que são envolvidos na atividade pós- translacional (por exemplo, polinucleotídeos clivados destes para deixar a forma madura de uma proteína ou peptídeo).

[00098] “Enzima que ocorre naturalmente” se refere a uma enzima tendo a sequência de aminoácido não modificada idêntica àquela encontrada na natureza. Enzimas que ocorrem naturalmente incluem enzimas nativas, aquelas enzimas naturalmente expressas ou encontradas no micro-organismo particular.

[00099] Os termos "derivado de" e “obtidos de” se referem a não somente uma protease produzida ou produtível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma protease codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo tal sequência de DNA. Adicionalmente, o termo se refere a uma protease que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da protease em questão. Para exemplificar, "proteases derivadas de Bacillus" se referem àquelas enzimas tendo atividade proteolítica que são naturalmente produzidas por Bacillus, bem como para serina proteases similares àquelas produzidas por fontes de Bacillus, mas que através do uso de técnicas de engenharia genética são produzidas por organismos de não Bacillus transformados com um ácido nucleico que codifica as serina proteases.

[000100] Um “derivado” dentro do escopo desta definição geralmente retém a atividade proteolítica característica observada na forma tipo selvagem, nativa ou de referência à extensão que o derivado é útil para propostas similares como a forma tipo selvagem, nativa ou de referência. Os derivados funcionais de serina protease envolvem peptídeos que ocorrem naturalmente, produzidos sinteticamente ou recombinantemente ou fragmentos de peptídeo que têm as características gerais da serina protease da presente invenção.

[000101] O termo "derivado funcional" se refere a um derivado de um ácido nucleico que tem as características funcionais de um ácido nucleico que codifica serina protease. Os derivados funcionais de um ácido nucleico que codifica serina protease da presente invenção envolve ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente, produzidos sinteticamente ou recombinantemente ou fragmentos e codificam característica de serina protease da presente invenção. O ácido nucleico tipo selvagem que codifica serina proteases de acordo com a invenção inclui alelos que ocorrem naturalmente e homólogos baseados na degeneração do código genético conhecido na técnica.

[000102] O termo "idêntico"no contexto de dois ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo se refere aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima, conforme medida usando-se um do seguinte comparação de sequência ou algoritmos de análise.

[000103] O termo "alinhamento ótimo"se refere ao alinhamento que dá a mais alta porcentagem de classificação de identidade.

[000104] “Porcentagem de identidade de sequência”, “porcentagem de identidade de sequência de aminoácido”, “porcentagem de identidade de sequência de gene”, e/ou "porcentagem de identidade de ácido nucleico/polinucleotídeo de sequência", com relação a dois aminoácidos, polinucleotídeo e/ou sequências de gene (conforme apropriado), se referem a porcentagem de resíduos que são idênticos nas duas sequências quando as sequências estão otimamente alinhadas. Desse modo, 80% de identidade de sequência de aminoácido significa 80% dos aminoácidos em duas sequências de polipeptídeo otimamente alinhadas são idênticas.

[000105] A frase "substancialmente idêntico"no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos, desse modo, se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que compreende pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos cerca de 85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, preferivelmente pelo menos cerca de 95%, preferivelmente pelo menos cerca de 97%, preferivelmente pelo menos cerca de 98%, e preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência conforme comparado a uma sequência de referência usando-se os programas ou algoritmos (por exemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) usando-se parâmetros padrões. Uma indicação que dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo cruzado com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, os polipeptídeos que diferem por substituições conservativas de aminoácido são imunologicamente reativos cruzados. Desse modo, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem somente por uma substituição conservativa. Outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam entre si sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a alta).

[000106] A frase "equivalente", neste contexto, se refere a enzimas de serina proteases que são codificadas por um polinucleotídeo capaz de hibridizar ao polinucleotídeo tendo a sequência conforme mostrada em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:5, sob condições de média a máxima estringência. Por exemplo, sendo equivalente significa que uma serina protease madura equivalente compreende pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, e/ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência a serina protease madura BPN’ ou GG36 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

[000107] O termo "isolado" ou "purificado" se refere a um material que é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele está ocorrendo naturalmente). Por exemplo, o material é referido para ser "purificado" quando ele está presente em uma composição particular em uma concentração mais alta ou mais baixa do que existe em um organismo que ocorre naturalmente ou organismo tipo selvagem ou em combinação com componentes não normalmente presentes sob expressão de um organismo que ocorre naturalmente ou organismo tipo selvagem. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que ocorre naturalmente presente em um animal vivo não é isolado, mas a mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separado de algum ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Em algumas modalidades, tais polinucleotídeos são parte de um vetor, e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos são parte de uma composição, e ainda ser isolado em que tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural. Em modalidades preferidas, um ácido nucleico ou proteína é referida para ser purificada, por exemplo, se ela ocorre a essencialmente uma faixa em um gel ou mancha eletroforética.

[000108] O termo "isolado", quando usado em referência a uma sequência de DNA, se refere a uma sequência de DNA que foi removida de seu ambiente genético natural e está, desse modo, livre de outras sequências de codificação estranha ou indesejada, e está em uma forma adequada para uso dentro dos sistemas de produção de proteína geneticamente projetados. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas de seu ambiente natural e incluem clones de cDNA e genômicos. As moléculas de DNA isoladas da presente invenção estão livres de outros genes com as quais elas são ordinariamente associadas, mas podem incluir regiões não transladadas 5' e 3' que ocorrem naturalmente tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente a um versado na téc- nica(vide, por exemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985]). O termo "uma sequência de DNA isolada"é alternativamente referida como uma "uma sequência de DNA clonada".

[000109] O termo "isolado," quando usado em referência a uma proteína, se refere a uma proteína que é encontrada em uma condição outra do que seu ambiente nativo. Em uma forma preferida, a proteína isolada é substancialmente livre de outras proteínas, particularmente outras proteínas homólogas. Uma proteína isolada é mais do que cerca de 10% pura, preferivelmente mais do que cerca de 20% pura, e ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 30% pura, conforme determinado por SDS-PAGE. Aspetos adicionais da invenção envolvem a proteína em uma forma altamente purificada (isto é, mais do que cerca de 40% pura, mais do que cerca de 60% pura, mais do que cerca de 70% pura, mais do que cerca de 80% pura, mais do que cerca de 90% pura, mais do que cerca de 95% pura, mais do que cerca de 97% pura, e ainda mais do que cerca de 99% pura), conforme determinado por SDS-PAGE.

[000110] Conforme aqui usado, o termo, “mutagênese combinatorial” se refere a métodos em que bibliotecas de variantes de uma sequência de partida são geradas. Nestas bibliotecas, as variantes contêm um ou várias mutações escolhidas de um conjunto predefinido de mutações. Em adição, os métodos proporcionam meios para introduzir mutações aleatórias que não eram membros do conjunto predefinido de mutações. Em algumas modalidades, os métodos incluem aqueles colocados no Pedido de Patente dos Estados Unidos No. De Série 09/699.250, depositado em 26 de outubro de 2000, desse modo incorporado por referência. Em modalidades alternativas, métodos de mutagênese combinatorial envolvem kits comercialmente disponíveis (por exemplo, QUIKCHANGE® Multisite (Stratagene).

[000111] Conforme aqui usado, o termo “biblioteca de mutantes” refere-se a uma população de células que são idênticas em muitos de seu genoma, mas incluem homólogos diferentes de um ou mais genes. Tais bibliotecas podem ser usadas, por exemplo, para identificar genes ou operons com traços aperfeiçoados.

[000112] Conforme aqui usado, o termo “gene de partida” se refere a um gene de interesse que codifica uma proteína de interesse que é para ser aperfeiçoada e/ou mudada usando-se a presente invenção.

[000113] Conforme aqui usado, o termo “alinhamento de sequência múltiplo” (“MSA”) se refere a sequências de homólogos múltiplos de um gene de partida que são alinhadas usando-se um algoritmo (por exemplo, Clustal W).

[000114] Conforme aqui usado, os termos “sequência de consenso” e “sequência canônica” se referem a uma sequência arquetípica de aminoácido contra qual todas as variantes de uma proteína ou sequência de interesse particular são comparadas. Os termos também se referem a uma sequência que coloca os nucleotídeos que são mais frequentemente presentes em uma sequência de DNA de interesse. Para cada posição de um gene, a sequência de consenso concede o aminoácido que é mais abundante naquela posição no MSA.

[000115] Conforme aqui usado, o termo “mutação de consenso” se refere a uma diferença na sequência de um gene de partida e uma sequência de consenso. Mutações de consenso são identificadas por comparação das sequências do gene de partida e a sequência de consenso resultando de um MSA. Em algumas modalidades, mutações de consenso são introduzidas no gene de partida tal que elas se tornam mais similares à sequência de consenso. As mutações de consenso também incluem mudanças de aminoácido que mudam um aminoácido em um gene de partida a um aminoácido que é mais frequentemente encontrado em um MSA naquela posição relativa a frequência daquele aminoácido no gene de partida. Desse modo, o termo mutação de consenso compreende todas as mudanças de aminoácido simples que substituem um aminoácido do gene de partida com um aminoácido que é mais abundante do que o aminoácido no MSA.

[000116] Conforme aqui usado, o termo “choque inicial” se refere a uma variante que foi identificada por classificação de uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial. Em modalidades preferidas, colisões iniciais têm características de desempenho aperfeiçoadas, conforme comparadas ao gene de partida.

[000117] Conforme aqui usado, o termo “colisão aperfeiçoada” se refere a uma variante que foi identificada por classificação de uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial.

[000118] Conforme aqui usado, os termos “aperfeiçoamento de mutação” e “intensificação de desempenho de mutação” se referem a uma mutação que conduz a desempenho aperfeiçoado quando ela é introduzida no gene de partida. Em algumas modalidades preferidas, estas mutações são identificadas por sequenciamento de colisões que foram identificadas durante a etapa de classificação do método. Em muitas modalidades, mutações que são mais frequentemente encontradas nas colisões são similarmente às mutações aperfeiçoadas, conforme comparado a uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial não classificada.

[000119] Conforme aqui usado, o termo “biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial aumentada” se refere a uma biblioteca de CCM que é designada e construída baseado nos resultados de classificação e/ou sequenciamento de uma etapa anterior de mutagênese e classificação de CCM. Em algumas modalidades, a biblioteca de CCM aumentada é baseada na sequência de uma colisão inicial resultante de uma etapa posterior de CCM. Em modalidades adicionais, a CCM aumentada é designada tal que mutações que foram frequentemente observadas em colisões iniciais de etapas anteriores de mutagênese e classificação são favorecidas. Em algumas modalidades preferidas, isto é acompanhado pela otimização de iniciadores que codificam redução de desempenho de mutações ou pelo aumento da concentração de iniciadores que codificam intensificação de desempenho de mutações relativa a outros iniciadores que foram usados nas bibliotecas de CCM anteriores.

[000120] Conforme aqui usado, o termo “redução de desempenho de mutações” se refere a mutações na biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial que são menos frequentemente encontradas em colisões resultantes de classificação conforme comparado a uma biblioteca de mutagênese de consenso combinatorial não classificada. Em modalidades preferidas, o processo de classificação remove e/ou reduz a abundância de variantes que contêm “redução de desempenho de mutações”.

[000121] Conforme aqui usado, o termo “ensaio funcional” se refere a um ensaio que proporciona uma indicação de uma atividade de proteína. Em modalidades particularmente preferidas, o termo se refere a sistemas de ensaio em que uma proteína é analisada para sua capacidade de funcionar em sua capacidade usual. Por exemplo, no caso de enzimas, um ensaio funcional envolve determinar a eficiência da enzima na catalização de uma reação.

[000122] Conforme aqui usado, o termo “propriedade alvo” se refere a propriedade do gene de partida que é para ser alterada. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer propriedade alvo particular. Contudo, em algumas modalidades preferidas, a propriedade alvo é a estabilidade de um produto de gene (por exemplo, resistência a desnaturação, proteólise ou outros fatores degradativos), enquanto em outras modalidades, o nível de produção em um hospedeiro de produção é alterado. De fato, é contemplado que qualquer propriedade de um gene de partida encontrará uso na presente invenção.

[000123] O termo “propriedade” ou equivalentes gramaticais deste no contexto de um ácido nucleico, conforme aqui usado, se refere a qualquer característica ou atributo de um ácido nucleico que pode ser selecionado ou detectado. Estas propriedades incluem, mas não são limitadas a, uma propriedade que afeta a ligação a um polipeptídeo, uma propriedade conferida em uma célula compreendendo um ácido nucleico particular, uma propriedade que afeta transcrição de gene (por exemplo, resistência de promotor, reconhecimento de promotor, regulação de promotor, intensificador de função), uma propriedade que afeta processamento de RNA (por exemplo, união de RNA, estabilidade de RNA, conformação de RNA, e modificação pós-transcricional), uma propriedade que afeta translação (por exemplo, nível, regulação, ligação de mRNA a proteínas ribossomais, modificação pós-translacional). Por exemplo, um local de ligação para um fator de transcrição, polimerase, fator regulatório, etc., de um ácido nucleico, pode ser alterado para produzir características desejadas ou para identificar características indesejadas.

[000124] O termo “propriedade” ou equivalentes gramaticais deste no contexto de um polipeptídeo (incluindo proteínas), conforme aqui usado, se refere a qualquer característica ou atributo de um polipeptídeo que podem ser selecionados ou detectados. Estas propriedades incluem, mas não são limitadas a, estabilidade oxidativa, especificidade de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, estabilidade alcalina, perfil de atividade de pH, resistência a degradação proteolítica, proporção de KM, kcat, kcat/kM, dobramento de proteína, induzindo uma resposta imune, capacidade de se ligar a um ligante, capacidade de se ligar a um receptor, capacidade de ser secretado, capacidade de ser revelado na superfície de uma célula, capacidade de oligomerizar, capacidade de sinalizar, capacidade de estimular proliferação de célula, capacidade de inibir proliferação de célula, capacidade de induzir apoptose, capacidade de ser modificado por fosforilação ou glicosilação, e/ou capacidade de tratar doença, etc.

[000125] Conforme aqui usado, o termo “classificação” tem seu signifi- cado usual na técnica e é, em geral um processo de multietapa. Na primeira etapa, um ácido nucleico mutante ou polipeptídeo variante deste é provido. Na segunda etapa, uma propriedade do ácido nucleico mutante ou polipeptídeo variante é determinada. Na terceira etapa, a propriedade determinada é comparada a uma propriedade do ácido nucleico precursor correspondente à propriedade do polipeptídeo que ocorre naturalmente correspondente ou a propriedade do material de partida (por exemplo, a sequência inicial) para a geração do ácido nucleico mutante.

[000126] Será aparente ao versado na técnica que o procedimento de classificação para obtenção de um ácido nucleico ou proteína com uma propriedade alterada depende da propriedade do material de partida, a modificação da qual a geração do ácido nucleico mutante é pretendida facilitar. O versado na técnica, portanto, apreciará que a invenção não é limitada a qualquer propriedade específica a ser classificada para e que a seguinte descrição de propriedades lista exemplos ilustrativos somente. Métodos para classificação de qualquer propriedade particular são geralmente descritos na técnica. Por exemplo, pode-se medir ligação, pH, especificidade, etc., antes de e após mutação, em que uma mudança indica uma alteração. Preferivelmente, as classificações são realizadas em uma maneira de alta produção, incluindo amostras múltiplas sendo classificadas simultaneamente, incluindo, mas não limitada a, ensaios utilizando, descrição de fago, e substratos múltiplos e/ou indicadores.

[000127] Conforme aqui usado, em algumas modalidades, classificações envolvem etapas de seleção em que variantes de interesse são enriquecidas de uma população de variantes. Exemplos destas modalidades incluem a seleção de variantes que conferem uma vantagem de crescimento ao organismo hospedeiro, bem como descrição de fago ou qualquer outro método de descrição, onde variantes podem ser capturadas de uma população de variantes baseada em sua ligação ou propriedades catalíticas. Em uma modalidade preferida, uma biblioteca de variantes é exposta a estresse (calor, protease, desnaturação) e, subsequentemente, variantes que estão ainda intactas são identificadas em um classificador ou enriquecidas por seleção. É pretendido que o termo envolve qualquer meio adequado para seleção. De fato, não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer método particular de classificação.

[000128] Conforme aqui usado, o termo “randomização alvo” se refere a um processo que produz uma pluralidade de sequências onde uma ou várias posições foram randomizadas. Em algumas modalidades, a randomização é completa (isto é, todos os quatro nucleotídeos, A, T, G, e C podem ocorrer em uma posição randomizada. Em modalidades alternativas, a randomização de um nucleotídeo é limitada a um subconjunto dos quatro nucleotídeos. A randomização alvo pode ser aplicada a um ou vários códons de uma sequência, codificando para uma ou várias proteínas de interesse. Quando expressas, as bibliotecas resultantes produzem populações de proteína em que uma ou mais posições de aminoácido podem conter uma mistura de todos os 20 aminoácidos ou um subconjunto de aminoácidos, conforme determinado pelo esquema de randomização do códon randomizado. Em algumas modalidades, os membros individuais de uma população resultante de randomização alvo diferem no número de aminoácidos, devido a inserção ou anulação alvo ou aleatória de códons. Em modalidades adicionais, aminoácidos sintéticos são incluídos nas populações de proteína produzidas. Em algumas modalidades preferidas, a maioria de membros de uma população resultante de uma randomização alvo mostra maior homologia de sequência à sequência de consenso do que o gene de partida. Em algumas modalidades, a sequência codifica uma ou mais proteínas de interesse. Em modalidades alternativas, as proteínas têm funções biológicas diferentes. Em algumas modalidades preferidas, a sequência de resultado compreende pelo menos um marcador selecionável. Esta sequência pode codificar uma ou mais proteínas de interesse. Ela pode ter outra função biológica. Em muitos casos a sequência de resultado incluirá um marcador selecionável, tal como um gene que confere resistência a um antibiótico.

[000129] Os termos “sequência modificada” e “genes modificados” são usados permutavelmente aqui se referir a uma sequência que inclui uma anulação, inserção ou interrupção de sequência de ácido nucleico que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades preferidas, o produto de expressão da sequência modificada é uma proteína truncada (por exemplo, se a modificação é uma anulação ou interrupção da sequência). Em algumas modalidades particularmente preferidas, a proteína truncada retém atividade biológica. Em modalidades alternativas, o produto de expressão da sequência modificada é uma proteína alongada (por exemplo, modificações compreendendo uma inserção na sequência de ácido nucleico). Em algumas modalidades, uma inserção conduz a uma proteína truncada (por exemplo, quando a inserção resulta na formação de um códon de parada). Desse modo, uma inserção pode resultar em ou uma proteína truncada ou uma proteína alongada como um produto de expressão.

[000130] Conforme aqui usado, os termos “sequência mutante” e “gene mutante” são usados permutavelmente e se referem a uma sequência que tem uma alteração em pelo menos um códon que ocorre em uma sequência tipo selvagem de célula hospedeira. O produto de expressão da sequência mutante é uma proteína com uma sequência de aminoácido alterada relativa ao tipo selvagem. O produto de expressão pode ter uma capacidade funcional alterada (por exemplo, atividade enzimática intensificada).

[000131] Os termos “iniciador mutagênico” ou “oligonucleotídeo muta- gênico” (usados permutavelmente aqui) são pretendidos para se referirem a composições de oligonucleotídeo que correspondem a uma porção da sequência de gabarito e que são capazes de se hibridizarem. Com relação aos iniciadores mutagênicos, o iniciador não se equiparará precisamente ao ácido nucleico de gabarito, a desequiparação ou desequiparações no iniciador sendo usadas para introduzir a mutação desejada na biblioteca de ácido nucleico. Conforme aqui usado, “iniciador não mutagênico” ou “oligonucleotídeo não mutagênico” se refere a composições de oligonucleotídeo que se equipararão precisamente ao ácido nucleico gabarito. Em uma modalidade da invenção, somente iniciadores mutagênicos são usados. Em outra modalidade preferida da invenção, os iniciadores são designados de modo que para pelo menos uma região n qual um iniciador mutagênico foi incluído, existe também iniciador não mutagênico incluído na mistura de oligonucleotídeo. Pela adição de uma mistura de iniciadores mutagênicos e iniciadores não mutagênicos correspondentes a pelo menos um dos iniciadores mutagênicos, é possível produzir uma biblioteca de ácido nucleico resultante em que uma variedade de modelos mutacionais combinatoriais são apresentados. Por exemplo, se é desejado que alguns dos membros da biblioteca de ácido nucleico mutante retenham sua sequência precursora em certas posições enquanto outros membros são mutantes em tais locais, os iniciadores não mutagênicos proporcionam a capacidade de obter um nível especí- fico de membros não mutantes dentro da biblioteca de ácido nucleico para um dado resíduo. Os métodos da invenção empregam oligonucleotídeos mutagênicos e não mutagênicos que estão geralmente entre cerca de 10-50 bases de comprimento, ou mais preferivelmente, cerca de 15-45 bases de comprimento. Contudo, pode ser necessário usar iniciadores que são ou mais curtos do que cerca de 10 bases ou mais longos do que cerca de 50 bases para obter o resultado de mutagênese desejado. Com relação a iniciadores mutagênicos e não mutagênicos correspondentes, não é necessário que os oligonucleotídeos correspondentes sejam de comprimento idêntico, mas somente que exista sobreposição na região correspondente à mutação a ser adicionada. Iniciadores podem ser adicionados em uma proporção predefinida de acordo com a presente invenção. Por exemplo, se é desejado que a biblioteca resultante tenha um nível significante de uma certa mutação específica e uma quantidade menor de uma mutação diferente no mesmo ou local diferente, pelo ajuste da quantidade de iniciador adicionado, é possível produzir a biblioteca inclinada desejada. Alternativamente, pela adição de quantidades menores ou maiores de iniciadores não mutagênicos, é possível ajustar a frequência com que a(s) mutação (ões) correspon- dente(s) é/são produzida(s) na biblioteca de ácido nucleico mutante.

[000132] Conforme aqui usado, a frase “mutações contíguas” refere- se a mutações que são apresentadas dentro do mesmo iniciador de oligonucleotídeo. Por exemplo, mutações contíguas podem ser adjacentes ou perto entre si, contudo, elas serão introduzidas nos ácidos nucleicos gabaritos mutantes resultantes pelo mesmo iniciador.

[000133] Conforme aqui usado, a frase “mutações descontíguas” se refere a mutações que são apresentadas em iniciadores de oligonucleotídeo separados. Por exemplo, mutações descontíguas serão introduzidas nos ácidos nucleicos gabaritos mutantes resultantes por iniciadores de oligonucleotídeo preparados separadamente.

[000134] Os termos “sequência tipo selvagem” ou “gene tipo selvagem” são usados permutavelmente aqui para se referirem a uma sequência que é nativa ou ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência tipo selvagem se refere a uma sequência de interesse que é o ponto de partida de um projeto de produção de proteína. A sequência tipo selvagem pode codificar ou uma proteína homóloga ou heteróloga. Uma proteína homóloga é uma em que a célula hospedeira se produziria sem intervenção. Uma proteína heteróloga é uma em que a célula hospedeira não se produziria, mas com a intervenção.

[000135] Conforme aqui usado, o termo “anticorpos” se refere a imunoglobulinas. Anticorpos incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas obtidas diretamente de qualquer espécie da qual é desejável produzir anticorpos. Em adição, a presente invenção envolve anticorpos modificados. O termo também se refere a fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade de se ligar ao epítope que o anticorpo intacto se liga e inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos anti-idiotipo (anti-ID). Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, regiões de determinação de complementaridade (CDRs), regiões variáveis de fragmento de cadeia simples (scFv), região variável de cadeia pesada (VH), região variável de cadeia pesada (VL). Anticorpos policlonais e monoclonais são também envolvidos pela presente invenção. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

[000136] Conforme aqui usado, a frase “alteração em especificidade de substrato” se refere a mudanças na especificidade do substrato de uma enzima. Em algumas modalidades, uma mudança na especificidade do substrato é definida como uma mudança em kcat e/ou Km para um substrato particular, resultante de mutações da enzima ou alteração das condições de reação. A especificidade do substrato de uma enzima é determinada pela comparação das eficiências catalíticas que ela exibe com substratos diferentes. Estas determinações encontram uso particular na avaliação da eficiência de enzimas mutantes, conforme é geralmente desejado para produzir enzimas variantes que exibem maiores proporções de kcat/Km para substratos de interesse. Contudo, não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer composição de substrato particular ou especificidade de substrato.

[000137] Conforme aqui usado, “propriedade de superfície” é usado em referência à carga eletrostática, bem como propriedades tais como a hidrofobicidade e hidrofilicidade exibida pela superfície de uma proteína.

[000138] Conforme aqui usado, a frase “é independentemente selecionado do grupo consistindo em ...” significa que porções ou elementos que são selecionados do grupo de referência Markush podem ser os mesmos, podem ser diferentes ou qualquer mistura de elementos conforme indicado no seguinte exemplo:

[000139] Uma molécula tendo grupos 3 R em que cada grupo R é independentemente selecionado do grupo consistindo em A, B e C. Aqui os três grupos R podem ser: AAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB, ou ABC.

[000140] Em referência a composições químicas, o termo “substituído”, conforme aqui usado, significa que a composição orgânica ou radical ao qual o termo é aplicado é: (a) Feito insaturado pela eliminação de pelo menos um elemento ou radical; ou (b) pelo menos um hidrogênio no composto ou radical é recolocado com uma porção contendo um ou mais átomos de (i) carbono, (ii) oxigênio, (iii) enxofre, (iv) nitrogênio ou (v) halogênio; ou (c) ambos (a) e (b).

[000141] As porções que podem substituir hidrogênio conforme descrito em (b) imediatamente acima, que contêm somente átomos de carbono e hidrogênio, são porções de hidrocarboneto incluindo, mas não limitadas a, alquila, alquenila, alquinila, alquildienila, ciloalquila, fenila, alquil fenila, naftila, antrila, fenantrila, fluorila, grupos esteroides, e combinações destes grupos entre si e com grupos hidrocarbonetos polivalentes tais como grupos alquileno, alquilideno e alquilidino. Porções contendo átomos de oxigênio que podem substituir hidrogênio conforme descrito em (b) imediatamente acima incluem, mas não são limitadas a, grupos hidróxi, acil ou ceto, éter, epóxi, carbóxi, e grupos contendo éster. Porções contendo átomos de enxofre que podem substituir hidrogênio conforme descrito em (b) imediatamente acima, mas não são limitadas a, os ácidos contendo enxofre e grupos ácido éster, grupos tioéter, grupos mercapto e grupos tioceto. Porções contendo nitrogênio que podem substituir hidrogênio conforme descrito em (b) imediatamente acima, mas não são limitadas a, grupos amino, o grupo nitro, grupos azo, grupos amônia, grupos amida, grupos azido, grupos isocianato, grupos ciano e grupos nitrila. Porções contendo átomos de halogênio que podem substituir hidrogênio conforme descrito em (b) imediatamente acima incluem grupos de cloro, bromo, flúor, iodo e qualquer das porções previamente descritas onde um hidrogênio ou um grupo alquil pendente é substituído por um grupo halo para formar uma porção substituída estável.

[000142] É compreendido que qualquer das porções acima (b)(i) a (b)(v) pode ser substituída entre si em uma substituição monovalente ou por perda de hidrogênio em uma substituição polivalente para formar outra porção monovalente que pode substituir hidrogênio no composto orgânico ou radical.

[000143] O termo “oxidação estável"se refere a proteases da presente invenção que retêm uma quantidade especificada de atividade enzimática sobre um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante processo proteolítico, de hidrolização, de limpeza ou outro processo da invenção, por exemplo, enquanto expostas a ou contactadas com agentes de alvejamento, ou agentes de oxidação. Em algumas modalidades, as proteases retêm pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de atividade proteolítica após contato com um agente de alvejamento ou oxidação sobre um dado período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 1 minuto, cerca de 3 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 8 minutos, cerca de 12 minutos, cerca de 16 minutos, cerca de 20 minutos, etc. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida conforme descrito nos exemplos.

[000144] O termo "quelator estável"se refere a proteases da presente invenção que retêm uma quantidade especificada de atividade enzimática sobre um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante o processo proteolítico, de hidrolização, de limpeza ou outro processo da invenção, por exemplo, enquanto expostas a ou contactadas com agentes de quelação. Em algumas modalidades, as proteases retêm pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de atividade proteolítica após contato com um agente de quelação sobre um período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 100 minutos, etc. Em algumas modalidades, a estabilidade do quelator é medida conforme descrito nos exemplos.

[000145] Os termos "termicamente estável"e “termoestável” se referem a proteases da presente invenção que retêm uma quantidade especificada de atividade enzimática após exposição a temperaturas especificadas sobre um dado período de tempo sob condições prevalecentes durante o processo proteolítico, de hidrolização, de limpeza ou outro processo da invenção, por exemplo, enquanto expostas a temperaturas alteradas. As temperaturas alteradas incluem temperaturas aumentadas ou diminuídas. Em algumas modalidades, as proteases retêm pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de atividade proteolítica após exposição a temperaturas alteradas sobre um dado período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 60 minutos, cerca de 120 minutos, cerca de 180 minutos, cerca de 240 minutos, cerca de 300 minutos, etc. Em algumas modalidades, a termo estabilidade é determinada conforme descrito nos exemplos.

[000146] O termo “estabilidade intensificada” no contexto de uma oxidação, quelator, protease estável térmica ou de pH se refere a uma atividade proteolítica retida mais alta sobre o tempo conforme comparada a outras serina proteases (por exemplo, subtilisina proteases) e/ou enzimas tipo selvagem.

[000147] O termo “estabilidade diminuída” no contexto de uma oxidação, quelator, protease estável térmica ou de pH se refere a uma atividade proteolítica retida inferior sobre o tempo conforme comparado a outras serina proteases (por exemplo, subtilisina proteases) e/ou enzimas tipo selvagem.

[000148] O termo "atividade de limpeza" se refere a desempenho de limpeza alcançado pela protease sob condições prevalecentes durante o processo proteolítico, de hidrolização, de limpeza ou outro processo da invenção. Em algumas modalidades, o desempenho de limpeza é determinado pela aplicação de vários ensaios de limpeza concernentes a manchas sensíveis à enzima, por exemplo, grama, sangue, leite, ou proteína de ovo conforme determinado por várias metodologias cromatográficas, espectrofotométrica ou outras metodologias quantitativas após sujeição das manchas a condições de lavagem padrões. Ensaios exemplares incluem, mas não estão limitados àqueles descritos no WO 99/34011, e Patente dos Estados Unidos 6.605.458 (ambos dos quais são aqui incorporados por referência), bem como aqueles métodos incluídos nos exemplos.

[000149] O termo “quantidade efetiva de limpeza” de uma protease refere-se a quantidade de protease descrita aqui antes que alcança um nível desejado de atividade enzimática em uma composição de limpeza específica. Tais quantidades efetivas são prontamente determinadas por um versado na técnica e são baseadas em muitos fatores, tais como a protease particular usada, a aplicação de limpeza, a composição específica da composição de limpeza, e se uma composição líquida ou seca (por exemplo, granular, barra) é requerida, etc.

[000150] O termo "materiais adjuntos de limpeza”, conforme aqui usado, significa qualquer material líquido, sólido ou gasoso selecionado para o tipo particular de composição de limpeza desejado e a forma do produto (por exemplo, composição líquida, em grânulo, em pó, barra, pasta, spray, tablete, gel; ou espuma), cujos materiais são também preferivelmente compatíveis com a enzima protease usada na composição. Em algumas modalidades, composições granulares estão na forma "compacta", enquanto em outras modalidades, as composições líquidas estão na forma "concentrada".

[000151] O termo “desempenho intensificado” no contexto de atividade de limpeza se refere a uma atividade de limpeza aumentada ou maior de certas manchas sensíveis à enzima tais como ovo, leite, grama ou sangue, conforme determinado pela avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão e/ou ciclos de lavagem múltiplos.

[000152] O termo “desempenho diminuído” no contexto de atividade de limpeza se refere a uma atividade de limpeza diminuída ou menor de certas manchas sensíveis a enzima tais como ovo, leite, grama ou sangue, conforme determinado pela avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão.

[000153] O termo “desempenho comparativo” no contexto de atividade de limpeza se refere a pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% da atividade de limpeza de uma protease comparativa ou de referência (por exemplo, proteases comercialmente disponíveis), incluindo mas não limitada a, protease OPTIMASE™ (Genencor), produtos de protease PURAFECT™ (Genencor), protease SAVINASE™ (Novozymes), BPN’-variantes (vide por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. Re 34.606), protease RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ (Novozymes), proteases MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ (Genencor; vide também, Patente dos Estados Unidos No. Re 34.606, e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.700.676; 5.955.340; 6.312.936; e 6.482.628), e produtos de protease variante B. lentus (por exemplo, aqueles descritos em WO 92/21760, WO 95/23221 e/ou WO 97/07770). O desempenho de limpeza pode ser determinado por comparação das proteases da presente invenção aquelas subtilisina proteases em vários ensaios de limpeza concernentes a manchas sensíveis a enzima tais como grama, sangue ou leite conforme determinado por metodologias espectrofotométricas ou analíticas usuais após condições de ciclo de lavagem padrão.

[000154] Conforme aqui usado, “composições de limpeza” e “formulações de limpeza” se referem a composições que encontram uso na remoção de compostos indesejados de itens a serem limpos, tais como tecido, louças, lente de contato, outros substratos sólidos, cabelo (xampus), pele (sabões e cremes), dentes (enxaguantes bucal, pastas de dente) etc. O termo envolve quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo particular de composição de limpeza desejado e a forma do produto (por exemplo, composição líquida, gel, grânulo, ou spray), considerando-se que a composição é compatível com a protease e outra(s) enzima(s) usada(s) na composição. As seleções específicas de materiais de composição de limpeza são prontamente feitas considerando-se a superfície, item ou tecido a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante uso

[000155] O termo adicionalmente se refere a qualquer composição que é adequada para limpeza, alvejamento, desinfecção, e/ou esterilização de qualquer objeto e/ou superfície. É pretendido que os termos incluem, mas não são limitados a, composições detergentes (por exemplo, detergentes de lavagem líquido e sólido e detergentes de tecido fino; formulações de limpeza de superfície dura, tais como para vidro, madeira, cerâmica e partes superiores e janelas de contador de metal; limpadores de carpete; limpadores de forno; desodorizadores de tecido; amaciadores de tecido; bem como detergentes de louça).

[000156] De fato, o termo “composição de limpeza”, conforme aqui usado, inclui, a menos que de outro modo indicado, toda proposta de forma granular ou pó ou agentes de lavagem de função pesada, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem de todas as propostas na forma líquida, de gel ou de pasta, especialmente os assim denominados tipos líquido de função pesada (HDL); detergentes de tecido fino líquidos; agentes de lavagem de louça manual ou agentes de lavagem de louça de função leve, especialmente aqueles do tipo alto espumamento; agentes de lavagem de louça à máquina, incluindo os vários tipos de auxílio de enxágue em tablete, granular, líquido para uso doméstico e institucional; agentes de limpeza e desinfecção líquidos, incluindo tipos lavagem de mão antibacteriais, barras de limpeza, enxaguantes bucal, limpadores dentais, xampus de carro, xampus de carpete, limpadores de banheiro; xampus de cabelo e/ou enxaguatórios de cabelo para humanos e outros animais; géis para banho e banhos de espuma e limpadores de metal; bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de alvejar e "stain-stick" ou tipos de pré-tratar.

[000157] Conforme aqui usado, "composições de limpeza de tecido" incluem composições de detergente de lavanderia manual ou à máquina incluindo composições aditivas de lavanderia e composições adequadas para uso no ensaboamento e/ou pré-tratamento de tecidos manchados (por exemplo, roupas, linhos, e outros materiais têxteis).

[000158] Conforme aqui usado, "composições de limpeza de não tecido” incluem composições de limpeza de superfícies não têxteis (isto é, tecido), incluindo, mas não limitadas a, composições de detergente de lavagem de louça, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e composições de limpeza pessoal.

[000159] Conforme aqui usado, os termos "composição detergente” e “formulação detergente” são usados em referência a misturas que são pretendidas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sólidos. Em modalidades preferidas, o termo é usado em referência a detergentes usados para limpar pratos, talheres, etc. (por exemplo, “detergentes de prato” ou “detergente de lavagem de pratos”). Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composição de detergente particular. De fato, é pretendido que em adição a detergentes que contêm pelo menos uma protease da presente invenção, o termo envolve detergentes que contêm tensoativos, transferase(s), enzimas hidrolíticas, óxido reductases, construtores, agentes de alvejamento, ativadores de alvejamento, agentes de anil e corantes fluorescentes, inibidores de massa, agentes de mascaramento, ativadores de enzima, antioxidantes, e solubilizadores.

[000160] Conforme aqui usado, "composição de lavagem de louça"se refere a todas as formas de composições para limpeza de louça, incluindo talheres, incluindo, mas não limitada a formas granulares e líquidas. Em algumas modalidades, a composição de lavagem de louça é uma composição de “lavagem de louça automática” que encontra uso em máquinas de lavagem de louça automáticas. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer tipo particular ou composição de louça. De fato, a presente invenção encontra uso em limpeza de de louça (por exemplo, pratos, incluindo, mas não limitado a, pratos, taças, copos, recipientes, etc.) e talheres (por exemplo, utensílios, incluindo, mas não limitado a, colheres, facas, garfos, utensílios de serviço, etc.) de qualquer material, incluindo, mas não limitado a, cerâmicas, plásticos, metais, porcelana, vidro, acrílicos, etc. O termo “louça” é usado aqui em referência a ambos louças e talheres.

[000161] Conforme aqui usado, o termo “alvejamento” se refere ao tratamento de um material (por exemplo, tecido, lavanderia, polpa, etc.) ou superfície por um comprimento suficiente de tempo e sob pH apropriado e condições de temperatura para efetuar um brilho (isto é, branqueamento) e/ou limpeza do material. Exemplos de químicos adequados para alvejamento incluem, mas não são limitados a, ClO2, H2O2, perácidos, NO2, etc.

[000162] Conforme aqui usado, "desempenho de lavagem” de uma protease variante se refere a contribuição de uma protease variante a lavagem que proporciona desempenho de limpeza adicional ao detergente sem a adição da protease variante à composição. O desempenho de lavagem é comparado sob condições de lavagem relevantes.

[000163] O termo "condições de lavagem relevantes"é usado aqui para indicar as condições, particularmente temperatura de lavagem, tempo, mecânicas de lavagem, concentração de água de sabão, tipo de detergente e dureza de água, realmente usados em domicílios em um segmento de mercado de louça ou detergente de lavanderia.

[000164] O termo "desempenho de lavagem aperfeiçoado" é usado para indicar que um resultado final melhor é obtido na remoção de mancha sob condições de lavagem relevantes, ou que menos protease variante, em base de peso, é necessária para obter o mesmo resultado final relativo a protease tipo selvagem ou de origem de partida correspondente.

[000165] Conforme aqui usado, o termo “desinfecção” se refere a remoção de contaminantes a partir das superfícies, bem como a inibição ou morte de micróbios nas superfícies de itens. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer superfície particular, item, ou contaminante(s) ou micróbios a serem removidos.

[000166] A forma "compacta" das composições de limpeza aqui é melhor refletida por densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal de carga inorgânica. Os sais de carga inorgânica são ingredientes convencionais de composições de detergente na forma de pó. Em composições de detergente convencionais, os sais de carga estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente cerca de 17 a cerca de 35% por peso da composição total. Em contraste, em composições compactas, o sal de carga está presente em quantidades não excedendo cerca de 15% da composição total. Em algumas modalidades, o sal de carga está presente em quantidades que não excedem cerca de 10%, ou, mais preferivelmente, cerca de 5%, por peso da composição. Em algumas modalidades, os sais de carga inorgânica são selecionados de sais de metal alcalino e metal alcalino terroso de sulfatos e cloretos. Em algumas modalidades, um sal de carga preferido é sulfato de sódio.

Composições de Limpeza

[000167] A menos que de outro modo notado, todos os níveis de componente ou composição aqui providos são produzidos em referência ao nível ativo daquele componente ou composição, e são exclusivos de impurezas, por exemplo, solventes residuais ou sub- produtos, que podem estar presentes em fontes comercialmente disponíveis. Os pesos de componentes de enzima são baseados na proteína ativa total. Todas as percentagens e proporções são calculadas por peso a menos que de outro modo indicado. Todas as percentagens e proporções são calculadas baseados na composição total a menos que de outro modo indicado. Nas composições detergentes exemplificadas, os níveis de enzimas são expressos por enzima pura por peso da composição total e a menos que de outro modo especificado, os ingredientes de detergente são expressos por peso das composições totais.

[000168] Conforme aqui indicado, em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem materiais adjuntos incluindo, mas não limitados a, tensoativos, construtores, alvejantes, ativadores de alvejante, catalisadores de alvejante, outras enzimas, sistemas de estabilização de enzima, quelantes, iluminadores óticos, polímeros de liberação de solo, agentes de transferência de corante, dispersantes, supressores de água de sabão, corantes, perfumes, corantes, sais de carga, hidrótropos, fotoativadores, fluorescedores, condicionadores de tecido, tensoativos hidrolizáveis, conservantes, antioxidantes, agentes de anti- encolhimento, agentes de antipregueamento, germicidas, fungicidas, pontilhamentos de cor, cuidar com prata, agentes de antideslustre e/ou anti-corrosão, fontes de alcalinidade, agentes de solubilização, transportadores, auxiliares de processamento, pigmentos, e agentes de controle de pH (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos. Nos. 6.610.642, 6.605.458, 5.705.464, 5.710.115, 5.698.504, 5.695.679, 5.686.014 e 5.646.101, todas das quais são incorporadas aqui por referência). Concretizações de materiais de composição de limpeza específicos são exemplificados em detalhes abaixo. Em modalidades em que os materiais adjuntos de limpeza não são compatíveis com as proteases variantes da presente invenção nas composições de limpeza, em seguida métodos adequados de manter os materiais adjuntos de limpeza e a(s) protease(s) separada(s) (isto é, não em contato entre si) até que combinação dos dois componentes é apropriada são usados. Tais métodos de separação incluem qualquer método adequado co- nhecido na técnica (por exemplo, coberturas de gel, encapsulamento, tabletes, separação física, etc.).

[000169] As composições de limpeza da presente invenção são vantajosamente empregadas, por exemplo, em aplicações de lavanderia, limpeza de superfície dura, aplicações de lavagem de prato, bem como aplicações cosméticas tais como dentaduras, dentes, cabelo e pele. Em adição, devido as vantagens únicas de eficiência aumentada em soluções de temperatura inferior, as enzimas da presente invenção são idealmente adequadas para aplicações de lavanderia. Além disso, as enzimas da presente invenção encontram uso em composições granulares e líquidas.

[000170] As proteases variantes da presente invenção também encontram uso em produtos aditivos de limpeza. Em algumas modalidades, aplicações de limpeza de solução de baixa temperatura encontram uso. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona produtos aditivos de limpeza incluindo pelo menos uma enzima da presente invenção é idealmente adequada para inclusão em um processo de lavagem quando eficiência de alvejamento adicional é desejada. Tais exemplos incluem, mas não são limitados a aplicações de solução de limpeza de baixa temperatura. Em algumas modalidades, o produto aditivo está em sua forma mais simples, uma ou mais proteases. Em algumas modalidades, o aditivo é acondicionado na forma de dosagem para adição a um processo de limpeza. Em algumas modalidades, o aditivo é acondicionado na forma de dosagem para adição a um processo de limpeza onde uma fonte de peroxigênio é empregada e eficiência de alvejamento aumentada é desejada. Qualquer forma unitária de dosagem simples adequada encontra uso com a presente invenção, incluindo, mas não limitada a, pílulas, comprimidos, coberturas de gel, ou outras unidades de dosagem simples tais como pós ou líquidos pré-medidos. Em algumas modalidades, carga(s) ou material(is) transportador(es) é/são incluído(s) para aumentar o volume de tais composições. Carga ou materiais transportadores adequados incluem, mas não são limitados a, vários sais de sulfato, carbonato e silicato, bem como talco, argila e similares. Carga ou materiais transportadores adequados para composições líquidas incluem, mas não são limitados a, água ou alcoóis primário e secundário de baixo peso molecular incluindo polióis e dióis. Exemplos de tais alcoóis incluem, mas não são limitados a, metanol, etanol, propanol e isopropanol. Em algumas modalidades, as composições contêm de cerca de 5% a cerca de 90% de tais materiais. Cargas acídicas encontram uso para reduzir pH. Alternativamente, em algumas modalidades, o aditivo de limpeza inclui ingredientes adjuntos, conforme mais totalmente descritos abaixo.

[000171] As presentes composições de limpeza e aditivos de limpeza requerem uma quantidade efetiva de pelo menos uma das variantes de protease aqui providas, sozinhas ou em combinação com outras proteases e/ou enzimas adicionais. O nível requerido de enzima é alcançado pela adição de uma ou mais variantes de protease da presente invenção. Tipicamente as presentes composições de limpeza compreenderão pelo menos cerca de 0,0001 peso por cento, de cerca de 0,0001 a cerca de 10, de cerca de 0,001 a cerca de 1, ou ainda de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 peso por cento de pelo menos uma das proteases variantes da presente invenção.

[000172] As composições de limpeza aqui são tipicamente formuladas tal que, durante uso em operações de limpeza aquosa, a água de lavagem terá um pH de cerca de 5,0 a cerca de 11,5, ou ainda de cerca de 7,5 a cerca de 10,5. Formulações de produto líquido são tipicamente formuladas para ter um pH líquido de cerca de 3,0 a cerca de 9,0, ou ainda de cerca de 3 a cerca de 5. Os produtos de lavanderia granulares são tipicamente formulados para ter um pH de cerca de 9 a cerca de 11. Técnicas para controlar o pH em níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, álcalis, ácidos, etc., e são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[000173] Composições de limpeza de baixo pH tipicamente têm um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5, e são tipicamente livres de tensoativos que hidrolisam em tal ambiente de pH. Tais tensoativos incluem tensoativos de sódio alquil sulfato que compreendem pelo menos uma porção de óxido de etileno, ou ainda de cerca de 1 a cerca de 16 moles de óxido de etileno. Tais composições de limpeza tipicamente compreendem uma quantidade suficiente de um modificador de pH, tal como hidróxido de sódio, monoetanolamina ou ácido hidroclórico, para proporcionar tal composição de limpeza com um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5. Tais composições tipicamente compreendem pelo menos uma enzima estável ácida. Em algumas modalidades, as composições são líquidas, enquanto em outras modalidades, elas são sólidas. O pH de tais composições líquidas é tipicamente medido como um pH líquido. O pH de tais composições sólidas é medido como uma solução de sólidos 10% de referida composição em que o solvente é água destilada. Nestas modalidades, todas as medições de pH são tomadas a 20°C, a menos que de outro modo indicado.

[000174] Em algumas modalidades, quando a(s) protease(s) variante é/são empregadas em uma composição granular ou líquido, é desejável para a protease variante estar na forma de um artigo encapsulado para proteger a protease variante de outros componentes da composição granular durante armazenagem. Em adição, o encapsulamento é também um meio de controlar a disponibilidade da protease variante durante o processo de limpeza. Em algumas modalidades, o encapsulamento intensifica o desempenho da(s) protease(s) variante e/ou enzimas adicionais. Neste particular, as proteases variantes da presente invenção são encapsuladas com qualquer material de encapsulamento adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o material de encapsulamento tipicamente encapsula pelo menos parte do catalisador para a(s) protease(s) variantes da presente invenção. Tipicamente, o material de encapsulamento é solúvel em água e/ou dispersível em água. Em algumas modalidades, o material de encapsulamento tem uma temperatura de transição do vidro (Tg) de 0oC ou mais alta. A temperatura de transição do vidro é descrita em mais detalhes em WO 97/11151. O material de encapsulamento é tipicamente selecionado de consistindo em carboidratos, gomas naturais ou sintéticas, chitin, chitosan, celulose e derivados de celulose, silicatos, fosfatos, boratos, polivinil álcool, polietileno glicol, ceras de parafina, e combinações destes. Quando o material de encapsulamento é um carboidrato, ele é tipicamente selecionado de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e combinações destes. Em algumas modalidades típicas, o material de encapsulamento é um amido (Vide, por exemplo, EP 0 922 499; US 4.977.252; US 5.354.559 e US 5.935.826). Em algumas modalidades, o material de encapsulamento é uma microesfera produzida de plástico tal como termoplásticos, acrilonitrila, metacrilonitrila, poliacrilonitrila, polimetacrilonitrila e misturas destes; micro esferas comercialmente disponíveis que encontram uso incluem, mas não são limitados a, aqueles fornecidos por EXPANCEL® (Stockviksverken, Sweden), e PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL®, e SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA).

[000175] Conforme descrito aqui, as proteases variantes da presente invenção encontram uso particular na indústria de limpeza, incluindo, mas não limitadas a detergentes de lavageme louça. Estas aplicações colocam as enzimas sob vários estresses ambientais. As proteases variantes da presente invenção proporcionam vantagens sobre muitas enzimas atualmente usadas, devido a sua estabilidade sob várias condições.

[000176] De fato, existem uma variedade de condições de lavagem incluindo formulações de detergentes variantes, volumes de água de lavagem, temperaturas de água de lavagem, e comprimentos de tempo de lavagem, a qual proteases envolvidas na lavagem são expostas. Em adição, formulações de detergente em áreas geográficas diferentes têm concentrações diferentes de seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, detergentes europeus tipicamente têm cerca de 4500-5000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem, enquanto detergentes japoneses têm aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente os Estados Unidos, detergentes tipicamente têm cerca de 975 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

[000177] Um sistema de concentração de detergente baixa inclui detergentes onde menos do que cerca de 800 ppm dos componentes de detergente estão presentes na água de lavagem. Detergentes japoneses são tipicamente considerados sistema de concentração de detergente baixa conforme eles têm aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

[000178] Uma concentração de detergente média inclui detergentes onde entre cerca de 800 ppm e cerca de 2,000 ppm dos componentes de detergente estão presentes na água de lavagem. Os detergentes da América do Norte são geralmente considerados serem sistemas de concentração de detergente médio visto que eles têm aproximadamente 975 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem. O Brasil tipicamente tem aproximadamente 1,500 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

[000179] Um sistema de concentração de detergente alta inclui deter- gentes onde mais do que cerca de 2,000 ppm dos componentes de detergente estão presentes na água de lavagem. Os detergentes europeus são geralmente considerados serem sistemas de concentração de detergente alta visto que eles têm aproximadamente 4,500-5,000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem.

[000180] Os detergentes da América Latina são geralmente detergentes de construtores de fosfato de água de sabão altos e a faixa de detergentes usada na América latina pode cair em ambas concentrações de detergente média e alta visto que elas variam de 1,500 ppm a 6,000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Conforme mencionado acima, o Brasil tipicamente tem aproximadamente 1,500 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem. Contudo, outras geografias de detergente de construtor de água de sabão altos, não limitadas a outros países da América latina, podem ter sistemas de concentração de detergente altos até cerca de 6000 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

[000181] À luz do precedente, é evidente que concentrações de composições de detergente em soluções de lavagem típicas através de todo o mundo variam de do que cerca de 800 ppm de composição de detergente ("geografias de concentração de detergente baixa"), por exemplo, cerca de 667 ppm no Japão, a entre cerca de 800 ppm a cerca de 2000 ppm ("geografias de concentração de detergente médias"), por exemplo, cerca de 975 ppm nos Estados Unidos e cerca de 1500 ppm no Brasil, a mais do que cerca de 2000 ppm ("geografias de concentração de detergente altas"), por exemplo, cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em geografias de construtor de fosfato de água de sabão altos.

[000182] As concentrações das soluções de lavagem típicas são determinadas empiricamente. Por exemplo, nos Estados Unidos, uma máquina de lavagem típica mantém um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Consequentemente, de modo a obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente dentro da solução de lavagem, cerca de 62,79 g de composição de detergente deve ser adicionado a 64,4 L de solução de lavagem. Esta quantidade é a quantidade típica medida na água de lavagem pelo consumidor usando- se a taça de medição provida com o detergente.

[000183] Como um exemplo adicional, geografias diferentes usam temperaturas de lavagem diferentes. A temperatura da água de lavagem no Japão é tipicamente menor do que aquela usada na Europa. Por exemplo, a temperatura da água de lavagem na América do Norte e Japão está tipicamente entre cerca de 10 e cerca de 30°C (por exemplo, cerca de 20°C), pelo que a temperatura da água de lavagem na Europa está tipicamente entre cerca de 30 e cerca de 60°C (por exemplo, cerca de 40°C). Contudo, no interesse de economizar energia, muitos consumidores estão mudando para usar lavagem de água fria. Em adição, em algumas regiões adicionais, água fria é tipicamente usada para aplicações de lavanderia, bem como para lavagem de prato. Em algumas modalidades, a “lavagem com água fria” da presente invenção utiliza lavagem à temperaturas de cerca de 10°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 20°C a cerca de 30°C, ou de cerca de 15°C a cerca de 25°C, bem como todas as outras combinações dentro da faixa de cerca de 15°C a cerca de 35°C, e todas as faixas dentro de 10°C a 40°C.

[000184] Como um exemplo adicional, geografias diferentes tipicamente têm dureza de água diferente. A dureza de água é usualmente descrita em termos dos grãos por galão misturados Ca2+/Mg2+. A dureza é uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. Muita água nos Estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. Água moderadamente dura (60-120 ppm) à dura (121-181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão (partes por milhão convertidos a grãos por galão dos Estados Unidos é ppm # dividido por 17,1 grãos iguais por galão) de minerais de dureza.

[000185] A dureza de água européia é tipicamente maior do que cerca de 10,5 (por exemplo cerca de 10,5 a cerca de 20,0) grãos por galão misturados Ca2+/Mg2+ (por exemplo, cerca de 15 grãos por galão misturados Ca2+/Mg2+). A dureza da água da América do Norte é tipicamente maior do que a dureza da água japonesa, mas menor do que a dureza da água européia. Por exemplo, a dureza da água da América do Norte pode estar entre cerca de 3 a cerca de 10 grãos, cerca de 3 a cerca de 8 grãos ou cerca de 6 grãos. A dureza da água japonesa é tipicamente mais baixa do que a dureza da água da América do Norte, usualmente menor do que cerca de 4, por exemplo, cerca de 3 grãos por galão misturados Ca2+/Mg2+.

[000186] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção proporciona proteases variantes que mostram desempenho de lavagem surpreendente em pelo menos um conjunto de condições de lavagem (por exemplo, temperatura da água, dureza da água, e/ou concentração do detergente). Em algumas modalidades, as proteases variantes da presente invenção são comparáveis em desempenho de lavagem para outras subtilisinas proteases. Em algumas modalidades, as proteases variantes da presente invenção exibem desempenho de lavagem intensificado conforme comparado a subtilisina proteases atualmente comercialmente disponíveis. Desse modo, em algumas modalidades preferidas da presente invenção, as proteases variantes aqui providas exibem estabilidade oxidativa intensificada, estabilidade térmica intensificada, capacidades de limpeza intensificadas sob várias condições, e/ou estabilidade de quelator intensificada. Em adição, as proteases variantes da presente invenção encontram uso em composições de limpeza que não incluem detergentes, novamente ou sozinho ou em combinação com construtores e estabilizadores.

[000187] Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza compreendem pelo menos uma protease variante da presente invenção em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% por peso da composição e o restante (por exemplo, cerca de 99,999% a cerca de 90,0%) compreendendo materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção compreendem pelo menos uma protease variante em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% por peso da composição e o restante da composição de limpeza (por exemplo, cerca de 99,9999% a cerca de 90,0%, cerca de 99,999% a cerca de 98%, cerca de 99,995% a cerca de 99,5% por peso) compreendendo materiais adjuntos de limpeza.

[000188] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem uma ou mais enzimas detergentes adicionais que proporcionam desempenho de limpeza e/ou cuidado de tecido e/ou benefícios de lavagem de louça. Exemplos de enzimas adequadas incluem, mas não são limitadas a, hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, queratinases, reductases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, laccase, e amilases, ou misturas destas. Em algumas modalidades, uma combinação de enzimas é usada (isto é, um “coquetel”) compreendendo protease similar a enzimas aplicáveis convencionais, lipase, cutinase e/ou celulase em conjunto com amilase é usada.

[000189] Em adição às variantes de protease aqui providas, qualquer outra protease adequada encontra uso nas composições da presente invenção. Proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbial. Em algumas modalidades particularmente preferidas, proteases microbiais são usadas. Em algumas modalidades, mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos. Em algumas modalidades, a protease é uma serina protease, preferivelmente uma protease microbial alcalina ou uma protease similar à tripsina. Exemplos de proteases alcalinas incluem subtilisinas, especialmente aqueles derivados de Bacillus (por exemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168). Exemplos adicionais incluem aquelas proteases mutantes descritas nas Patentes dos Estados Unidos Nos. RE 34.606, 5.955.340, 5.700.676, 6.312.936 e 6.482.628, todas das quais são incorporadas por referência. Exemplos de protease adicionais incluem, mas não são limitados a, tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina), e a Fusarium protease descrita em WO 89/06270. Em algumas modalidades, enzimas protease comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™, e PURAFAST™ (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, ELASE® e ESPERASE® (Novozymes); e BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany. Várias proteases são descritas em WO95/23221, WO 92/21760, Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2008/0090747, e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.801.039, 5.340.735, 5.500.364, 5.855.625, US RE 34.606, 5.955.340, 5.700.676, 6.312.936 e 6.482.628, e várias outras patentes. Em algumas modalidades adicionais, metaloproteases encontram uso na presente invenção, incluindo, mas não limitadas a, a metaloprotease neutra descrita em WO 07/044993.

[000190] Em adição, qualquer lipase adequada encontra uso na presente invenção. Lipases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas de origem bacterial ou fungal. Mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são envolvidos pela presente invenção. Exemplos de lipases úteis incluem Humicola lanuginosa lipase (vide, por exemplo, EP 258 068, e EP 305 216), Rhizomucor miehei lipase (vide por exemplo, EP 238 023), Candida lipase, tal como C. antarctica lipase (por exemplo, a C. antarctica lipase A ou B; Vide, por exemplo, EP 214 761), Pseudomonas lipases tais como P. alcaligenes lipase e P. pseudoalcaligenes lipase (vide, por exemplo, EP 218 272), P. cepacia lipase (Vide, por exemplo, EP 331 376), P. stutzeri lipase (vide, por exemplo, GB 1.372.034), P. fluorescens lipase, Bacillus lipase (por exemplo, B. subtilis lipase [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. stearothermophilus lipase [vide por exemplo, JP 64/744992]; e B. pumilus lipase [vide por exemplo, WO 91/16422]).

[000191] Além disso, um número de lipases clonadas encontram uso em algumas modalidades da presente invenção, incluindo, mas não limitadas a, Penicillium camembertii lipase (vide, Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991]), Geotricum candidum lipase (vide, Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]), e várias Rhizopus lipases tais como R. delemar lipase (Vide, Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), uma R. niveus lipase (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) e R. oryzae lipase.

[000192] Outros tipos de enzimas lipolíticas tais como cutinases também encontram uso em algumas modalidades da presente invenção, incluindo, mas não limitadas a, a cutinase derivada de Pseudomonas mendocina (Vide, WO 88/09367), e a cutinase derivada de Fusarium solani pisi (Vide, WO 90/09446).

[000193] Lipases adequadas adicionais incluem lipases comercialmente disponíveis tais como M1 LIPASE™, LUMA FAST™, e LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® e LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); e LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan).

[000194] Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem lipases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de lipase adicional por peso da composição e o restante de materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem lipases a um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de lipase por peso da composição.

[000195] Em algumas modalidades da presente invenção, qualquer amilase adequada encontra uso na presente invenção. Em algumas modalidades, qualquer amilase (por exemplo, alfa e/ou beta) adequada para uso em soluções alcalinas também encontram uso. Amilases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas de origem bacterial ou fungal. Mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. As amilases que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, α-amilases obtidas de B. licheniformis (vide, por exemplo, GB 1,296,839). Amilases comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA®, e BAN™ (Novozymes), bem como POWERASE™, RAPIDASE® e MAXAMYL® P (Genencor).

[000196] Em algumas modalidades da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem amilases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de amilase adicional por peso da composição e o restante de materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem amilases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de amilase por peso da composição.

[000197] Em algumas modalidades adicionais, qualquer celulase adequada encontra uso nas composições de limpeza da presente invenção. Celulases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas de origem bacterial ou fungal. Mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Celulases adequadas incluem, mas não são limitadas a, Humicola insolens cellulases (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.435.307). Celulases especialmente adequadas tendo benefícios de cuidado de cor (vide, por exemplo, EP 0 495 257). Celulases comercialmente disponíveis que encontram uso na presente invenção incluem, mas não são limitadas a, CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation). Em algumas modalidades, celulases são incorporadas como porções ou fragmentos de celulases maturas tipo selvagem ou variante, em que uma porção do N-terminal é anulada (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.874.276). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem celulases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de celulase adicional por peso da composição e o restante de materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem celulases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de celulase por peso da composição.

[000198] Qualquer mananase adequada para uso em composições detergentes também encontra uso na presente invenção. Mananases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas de origem bacterial ou fungal. Mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Várias mananases são conhecidas que encontram uso na presente invenção (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 6.566.114, Patente dos Estados Unidos No. 6.602.842, e Patente dos Estados Unidos No. 6.440.991, todas das quais são incorporadas aqui por referência). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem mananases em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de mananase adicional por peso da composição e o restante de materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem mananases em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de mananase por peso da composição.

[000199] Em algumas modalidades, peroxidases são usadas em combinação com peróxido de hidrogênio ou uma fonte deste (por exemplo, um percarbonato, perborato ou persulfato) nas composições da presente invenção. Em algumas modalidades alternativas, oxidases são usadas combinação com oxigênio. Ambos tipos de enzimas são usadas para "alvejamento da solução"(isto é, para prevenir transferência de um corante de têxtil de um tecido tingido a outro tecido quando os tecidos são lavados juntos em um licor de lavagem), preferivelmente junto com um agente de intensificação (Vide, por exemplo, WO 94/12621 e WO 95/01426). Peroxidases/oxidases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas de origem de planta, bacterial ou fungal. Mutantes quimicamente ou geneticamente modificados são incluídos em algumas modalidades. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção adicionalmente compreendem enzimas de peroxidase e/ou oxidase em um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10% de peroxidase e/ou oxidase adicionais por peso da composição e o restante de materiais adjuntos de limpeza por peso de composição. Em outros aspectos da presente invenção, as composições de limpeza da presente invenção também compreendem enzimas de peroxidase e/ou oxidase em um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2%, cerca de 0,005% a cerca de 0,5% de enzimas de peroxidase e/ou oxidase por peso da composição.

[000200] Em algumas modalidades, enzimas adicionais encontram uso, incluindo, mas não limitadas a, per-hidrolases (Vide, por exemplo, WO 05/056782). Em adição, em algumas modalidades particularmente preferidas, as misturas das enzimas acima mencionadas são envolvidas aqui, em particular uma ou mais protease adicional, amilase, lipase, mananase, e/ou pelo menos uma celulase. De fato, é contemplado que várias misturas destas enzimas encontrarão uso na presente invenção. É também contemplado que os níveis variantes da(s) protease(s) variante(s) e uma ou mais enzimas adicionais podem ambos independentemente variar a cerca de 10%, o restante da composição de limpeza sendo materiais adjuntos de limpeza. A seleção específica de materiais adjuntos de limpeza são prontamente feitas por consideração da superfície, item, ou tecido a serem limpos, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza durante uso (por exemplo, através do uso de detergente de lavagem).

[000201] Exemplos de materiais adjuntos de limpeza adequados incluem, mas não são limitados a, tensoativos, construtores, alvejantes, ativadores de alvejamento, catalisadores de alvejamento, outras enzimas, sistemas de estabilização de enzima, quelantes, clareadores óticos, polímeros de liberação de solo, agentes de transferência de corante, agentes de inibição de transferência de corante, materiais catalíticos, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes de dispersão poliméricos, agentes de remoção de solo de argila, agentes de elastização de estrutura, dispersantes, supressores de água de sabão, corantes, perfumes, sais de carga, hidrótropos, fotoativadores, fluorescedores, condicionadores de tecido, amaciadores de tecido, transportadores, hidrótropos, auxilia- dores de processamento, solventes, pigmentos, tensoativos hidrolizá- veis, conservantes, antioxidantes, agentes de antiencolhimento, agentes de antipregueamento, germicidas, fungicidas, pontilhamentos de cor, cuidar com prata, agentes de antideslustre e/ou anticorrosão, fontes de alcalinidade, agentes de solubilização, transportadores, auxiliadores de processamento, pigmentos, e agentes de controle de pH (Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.610.642, 6.605.458, 5.705.464, 5.710.115, 5.698.504, 5.695.679, 5.686.014 e 5.646.101, todas das quais são incorporadas aqui por referência). Concretizações de materiais de composição de limpeza específicas são exemplificadas em detalhe abaixo. Em modalidades em que os materiais adjuntos de limpeza não são compatíveis com as proteases variantes da presente invenção nas composições de limpeza, em seguida métodos adequados de manter os materiais adjuntos de limpeza e a(s) protease(s) separados (isto é, não em contato entre si) até que combinação dos dois componentes seja apropriada são usados. Tais métodos de separação incluem qualquer método adequado conhecido na técnica (por exemplo, coberturas de gel, encapsulamento, tabletes, separação física, etc.).

[000202] Em algumas modalidades preferidas, uma quantidade efetiva de uma ou mais protease(s) variante(s) aqui provida(s) é/são incluída(s) nas composições úteis para limpeza de uma variedade de superfícies em necessidade de remoção de mancha proteinácea. Tais composições de limpeza incluem composições de limpeza para tais aplicações como limpeza de superfícies duras, tecidos e pratos. De fato, em algumas modalidades, a presente invenção proporciona composições de limpeza de tecido, enquanto em outras modalidades, a presente invenção proporciona composições de limpeza de não tecido. Notavelmente, a presente invenção também proporciona composições de limpeza adequadas para cuidado pessoal, incluindo cuidado oral (incluindo dentrifícios, pastas de dente, enxaguantes bucais, etc., bem como composições de limpeza de dentadura), composições de limpeza de pele e cabelo. É pretendido que a presente invenção envolva composições detergentes em qualquer forma (isto é, líquida, granular, barra, semissólida, géis, emulsões, tabletes, cápsulas, etc.).

[000203] Por meio de exemplo, várias composições de limpeza em que as proteases variantes da presente invenção encontram uso são descritos em maiores detalhes abaixo. Em algumas modalidades em que as composições de limpeza da presente invenção são formuladas como composições adequadas para uso nos métodos de lavagem de máquina de lavanderia, as composições da presente invenção preferivelmente contêm pelo menos um tensoativo e pelo menos um composto construtor, bem como um ou mais materiais adjuntos de limpeza preferivelmente selecionados de compostos poliméricos orgânicos, agentes de alvejamento, enzimas adicionais, supressores de água de sabão, dispersantes, dispersantes de cal-sabão, agentes de suspensão de solo e antirredeposição e inibidores de corrosão. Em algumas modalidades, composições de lavanderia também contêm agentes amaciadores (isto é, como materiais adjuntos de limpeza adicionais). As composições da presente invenção também encontram uso como produtos aditivos de detergente na forma sólida ou líquida. Tais produtos aditivos são pretendidos suplementar e/ou melhorar o desempenho de composições detergentes adicionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza. Em algumas modalidades, a densidade das composições de detergente de lavanderia aqui varia de cerca de 400 a cerca de 1200 g/litro, enquanto em outras modalidades, ela varia de cerca de 500 a cerca de 950 g/litros de composição medida a 20°C.

[000204] Em modalidades formuladas como composições para uso em métodos de lavagem de louça manual, as composições da invenção preferivelmente contêm pelo menos um tensoativo e preferivelmente pelo menos um material adjunto de limpeza adicional selecionado de compostos poliméricos orgânicos, agentes de intensificação, íons de metal do grupo II, solventes, hidrótropos e enzimas adicionais.

[000205] Em algumas modalidades, várias composições de limpeza tais como aquelas providas na Patente dos Estados Unidos No 6.605.458 encontram uso com as proteases variantes da presente invenção. Desse modo, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease variante da presente invenção é uma composição de limpeza de tecido granular compacto, enquanto em outras modalidades, a composição é uma composição de limpeza de tecido granular útil na lavagem de tecidos coloridos, em modalidades adicionais, a composição é uma composição de limpeza de tecido granular que proporciona amaciamento através da capacidade de lavagem, em modalidades adicionais, a composição é composição de limpeza de tecido líquida de função pesada. Em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease variante da presente invenção são composições de limpeza de tecido tais como aquelas descritas nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6.610.642 e 6.376.450. Em adição, as proteases variantes da presente invenção encontram uso nas composições granulares de detergente de lavanderia de utilidade particular sob condições de lavagem Européia ou Japonesa (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos. No 6.610.642).

[000206] Em algumas modalidades alternativas, a presente invenção proporciona composições de limpeza de superfície dura compreendendo pelo menos uma protease variante aqui provida. Desse modo, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease variante da presente invenção é uma composição de limpeza de superfície dura conforme aquela descrita nas Patentes dos Estados Unidos. Nos 6.610.642, 6.376.450 e 6.376.450.

[000207] Em modalidades ainda adicionais, a presente invenção proporciona composições de lavagem de louça compreendendo pelo menos uma protease variante aqui provida. Desse modo, em algumas modalidades, as composições compreendendo pelo menos uma protease variante da presente invenção é uma composição de limpeza de superfície dura tal como aquela nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6.610.642 e 6.376.450. Em algumas modalidades ainda adicionais, a presente invenção proporciona composições de lavagem de louça compreendendo pelo menos uma protease variante aqui provida. Em algumas modalidades adicionais, as composições compreendendo pelo menos uma protease variante da presente invenção compreendem composições de cuidado oral tais como aquelas nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6.376.450 e 6.376.450. As formulações e descrições dos compostos e materiais adjuntos de limpeza contidos nas Patentes dos Estados Unidos antes mencionadas Nos 6.376.450, 6.605.458, 6.605.458 e 6.610.642, encontram uso com as proteases variantes aqui providas.

[000208] As composições de limpeza da presente invenção são formuladas em qualquer forma adequada e preparadas por qualquer processo escolhido pelo formulador, exemplos não limitativos dos quais são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 5.879.584, 5.691.297, 5.574.005, 5.569.645, 5.565.422, 5.516.448, 5.489.392 e 5.486.303, todas das quais são incorporadas aqui por referência. Quando uma composição de limpeza de baixo pH é desejada, o pH de tal composição é ajustado via a adição de um material tal como monoetanolamina ou um material acídico tal como HCl.

[000209] Enquanto não essencial para a proposta da presente invenção, a lista não limitativa de adjuntos ilustrada daqui por diante são adequadas para uso nas presentes composições de limpeza. Em algumas modalidades, estes adjuntos são incorporados, por exemplo, para auxiliar ou intensificar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato a ser limpo, ou para modificar a estética da composição de limpeza conforme é o caso com perfumes, corantes, ou similares. É compreendido que tais adjuntos são em adição às proteases variantes da presente invenção. A natureza precisa destes componentes adicionais, e níveis de incorporação destes dependerá da forma física da composição e da natureza da operação de limpeza para qual é para ser usada. Materiais adjuntos adequados incluem, mas não são limitados a, tensoativos, construtores, agentes de quelação, agentes de inibição de transferência de corante, auxiliadores de deposição, disper- santes, enzimas adicionais, e estabilizadores de enzima, materiais catalíticos, ativadores de alvejamento, agrupadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré- formados, agentes de dispersão poliméricos, agentes de remoção de solo de argila/antiredeposição, clareadores, supressores de água de sabão, corantes, perfumes, agentes de elastização de estrutura, amaciadores de tecido, transportadores, hidrótropos, auxiliadores de processamento e/ou pigmentos. Em adição à descrição abaixo, exemplos adequados de tais outros adjuntos e níveis de uso são encontrados nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.576.282, 6.306.812 e 6.326.348, incorporadas por referência. Os ingredientes adjuntos antes mencionados podem constituir o equilíbrio das composições de limpeza da presente invenção.

[000210] Em algumas modalidades, as composições de limpeza de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos um tensoativo e/ou um sistema de tensoativo em que o tensoativo é selecionado de tensoativos não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos zwitteriônicos, tensoativos não iônicos semi-polares e misturas destes. Em algumas modalidades de composição de limpeza de pH abaixo (por exemplo, composições tendo um pH líquido de cerca de 3 a cerca de 5), a composição tipicamente não contém alquil sulfato etoxilatado, conforme é acreditado que tal tensoativo pode ser hidrolisado por tais composições de teores acídicos. Em algumas modalidades, o tensoativo está presente em um nível de cerca de 0,1% a cerca de 60%, enquanto em modalidades alternativas, o nível é de cerca de 1% a cerca de 50%, enquanto em ainda modalidades adicionais, o nível é de cerca de 5% a cerca de 40% por peso da composição de limpeza.

[000211] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem um ou mais construtores de detergente ou sistemas de construtor. Em algumas modalidades incorporando pelo menos um construtor, as composições de limpeza compreendem pelo menos cerca de 1%, de cerca de 3% a cerca de 60%, ou ainda de cerca de 5% a cerca de 40% de construtor por peso da composição de limpeza. Os construtores incluem, mas não são limitados a, sais de metal alcalino, de amônia e de alcanolamônia de polifosfatos, silicatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino terroso e de metal alcalino, aluminosilicatos, compostos de policarboxilato, éter hidroxipolicarboxilatos, copolímeros de anidrido maleico com etileno ou vinil metil éter, 1, 3, 5-trihidroxi benzeno-2, 4, ácido 6-trisulfônico, e ácido carboximetiloxisuccínico, os vários sais de metal alcalino, de amônia e amônia substituída de ácidos poliacéticos tais como etilenodiamina ácido tetraacético e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatos tais como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, benzeno ácido 1,3,5- tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico e sais solúveis destes. De fato, é contemplado que qualquer construtor adequado encontrará uso em várias modalidades da presente invenção.

[000212] Em algumas modalidades, os construtores formam complexos de íon de dureza solúvel em água (por exemplo, construtores sequestrantes), tais como citratos e polifosfatos (por exemplo, sódio tripolifosfato e sódio tripolifosfato hexa-hidrato, tripolifosfato de potássio, e tripolifosfato de sódio e potássio misturados, etc.). É contemplado que qualquer construtor adequado encontrará uso na presente invenção, incluindo aqueles conhecidos na técnica (vide, por exemplo, EP 2 100 949).

[000213] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção contêm pelo menos um agente de quelação. Agentes de quelação adequados incluem, mas não são limitados a, agentes de quelação de cobre, ferro e/ou manganês e misturas destes. Em modalidades em que pelo menos um agente de quelação é usado, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 15%, ou ainda de cerca de 3,0% a cerca de 10% de agente de quelação por peso da composição de limpeza objeto.

[000214] Em algumas modalidades ainda adicionais, as composições de limpeza aqui providas contêm pelo menos um auxiliador de deposição. Auxiliadores de deposição adequados incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol, polipropileno glicol, policarboxilato, polímeros de liberação de solo tais como ácido politeleftálico, argilas tais como kaolinita, montmorilonita, atapulgita, illita, bentonita, halloisita, e misturas destes.

[000215] Conforme aqui indicado, em algumas modalidades, agentes de antiredeposição encontram uso em algumas modalidades da presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, tensoativos não iônicos encontram uso. Por exemplo, em modalidades de lavagem de louça automática, tensoativos não iônicos encontram uso para proposta de modificação de superfície, em particular para material laminado para evitar formação de película e manchamento e para aperfeiçoar brilho. Estes tensoativos não iônicos também encontram uso na prevenção da redeposição de solos. Em algumas modalidades preferidas, o agente de antiredeposição é um tensoativo não iônico conforme conhecido na técnica (Vide por, exemplo, EP 2 100 949).

[000216] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção incluem um ou mais agentes de transferência de corante. Agentes de inibição de transferência de corante polimérico incluem, mas não são limitados a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N- vinilimidazole, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazoles ou misturas destes. Em modalidades em que pelo menos um agente de inibição de transferência de corante é usado, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5%, ou ainda de cerca de 0,1% a cerca de 3% por peso da composição de limpeza.

[000217] Em algumas modalidades, silicatos são incluídos dentro das composições da presente invenção. Em algumas tais modalidades, silicatos de sódio (por exemplo, por exemplo, disilicato de sódio, metasilicato de sódio e filosilicatos cristalinos) encontram uso. Em algumas modalidades, os silicatos estão presentes em um nível de cerca de 1% a cerca de 20%. Em algumas modalidades preferidas, os silicatos estão presentes em um nível de cerca de 5% a cerca de 15% por peso da composição.

[000218] Em algumas modalidades ainda adicionais, as composições de limpeza da presente invenção também contêm dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem, mas não são limitados a, os ácidos homo- ou co-poliméricos ou seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxil separados entre si por não mais do que dois átomos de carbono.

[000219] Em algumas modalidades adicionais, as enzimas usadas nas composições de limpeza são estabilizadas por qualquer técnica adequada. Em algumas modalidades, as enzimas aqui empregadas são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de cálcio e/ou magnésio nas composições acabadas que proporcionam tais íons para as enzimas. Em algumas modalidades, os estabilizadores de enzima incluem oligossacarídeos, polissacarídeos e sais de metal divalente inorgânico, incluindo metais alcalinos terrosos, tais como sais de cálcio. É contemplado que várias técnicas para estabilização de enzima encontrarão uso na presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, as enzimas aqui empregadas são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proporcionam tais íons para as enzimas, bem como outros íons de metal (por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), Estanho (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II), e oxovanádio (IV). Cloretos e sulfatos também encontram uso em algumas modalidades da presente invenção. Exemplos de oligossacarídeos e polissacarídeos adequados (por exemplo, dextrins) são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, por exemplo, WO 07/145964). Em algumas modalidades, inibidores de protease reversíveis também encontram uso, tais como compostos contendo boro (por exemplo, borato, 4-formil fenil ácido borônico) e/ou a tripeptídeo aldeído encontram uso para adicionalmente aperfeiçoar a estabilidade, conforme desejado.

[000220] Em algumas modalidades, alvejantes, ativadores de alvejamento e/ou catalisadores de alvejamento estão presentes nas composições da presente invenção. Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem composto(s) de alvejamento inorgânico(s) e/ou orgânico(s). Os alvejantes inorgânicos incluem, mas não são limitados a, sais de perhidrato (por exemplo, perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato, e sais de persilicato). Em algumas modalidades, sais inorgânicos de peridrato são sais de metal alcalino. Em algumas modali- dades, sais de peridrato inorgânicos são incluídos como o sólido cristalino, sem proteção adicional, embora em algumas outras modalidades, o sal é revestido. Qualquer sal adequado conhecido na técnica encontra uso na presente invenção (Vide, por exemplo, EP 2 100 949).

[000221] Em algumas modalidades, ativadores de alvejamento são usados nas composições da presente invenção. Os ativadores de alvejamento são tipicamente precursores de perácido orgânico que intensificam a ação de alvejamento no curso de limpeza a temperaturas de 60°C e abaixo. Os ativadores de alvejamento adequados para uso aqui incluem compostos que, sob condições de per-hidrólise, dão ácidos alifáticos peroxoicarboxílico tendo preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono, em particular de cerca de 2 a cerca de 4 átomos de carbono, e/ou opcionalmente, ácido perbenzoico substituído. Ativadores de alvejamento adicionais são conhecidos na técnica e encontram uso na presente invenção (Vide, por exemplo, EP 2 100 949).

[000222] Em adição, em algumas modalidades e conforme adicional- mente descrito aqui, as composições de limpeza da presente invenção compreende adicionalmente pelo menos um catalisador de alvejamento. Em algumas modalidades, o manganês triazaciclononano e complexos relacionados encontra uso, bem como complexos de cobalto, cobre, manganês e ferro. Catalisadores de alvejamento adicionais encontram uso na presente invenção (Vide, por exemplo, US 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521, e EP 2 100 949).

[000223] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção contêm um ou mais complexos de metal catalítico. Em algumas modalidades, um catalisador de alvejamento contendo metal encontra uso. Em algumas modalidades preferidas, o catalisador de alvejamento de metal compreende um sistema de catalisador compreendendo um cátion de metal de transição de atividade catalítica de alvejamento definida, (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio, ou manganês), um cátion de metal auxiliar tendo pouca ou nenhuma atividade catalítica de alvejamento (por exemplo, cátions de zinco ou alumínio), e a sequestrado tendo constantes de estabilidade definidas para os cátions catalíticos e de metal auxiliar, particularmente ácido etilenodiaminatetra-acético, ácido etilenodiaminatetra (ácido metilenofosfônico) e sais solúveis em água destes são usados (Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.430.243). Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção são catalisadas por meio de um composto de manganês. Tais compostos e níveis de uso são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.576.282). Em modalidades adicionais, catalisadores de alvejamento de cobalto encontram uso em composições de limpeza da presente invenção. Vários catalisadores de alvejamento de cobalto são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.597.936 e 5.595.967), e são prontamente preparados por procedimentos conhecidos.

[000224] Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza da presente invenção incluem um complexo de metal de transição de um ligante rígido macropolicíclico (MRL). Como uma matéria prática, e não por meio de limitação, em algumas modalidades, as composições e processos de limpeza providos pela presente invenção são ajustados para proporcionar na ordem de pelo menos uma parte por centena de milhão das espécies de MRL ativas no meio de lavagem aquoso, e em algumas modalidades preferidas, proporciona de cerca de 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, mais preferivelmente de cerca de 0,05 ppm a cerca de 10 ppm, e mais preferivelmente de cerca de 0,1 ppm a cerca de 5 ppm, do MRL no licor de lavagem.

[000225] Em algumas modalidades, metais de transição preferidos no presente catalisador de alvejamento de metal de transição incluem, mas não são limitados a, manganês, ferro e cromo. MRLs preferidos também include, mas não são limitados a, ligantes ultrarrígidos especiais que são cruzados em ponte (por exemplo, 5,12-dietil-1,5,8,12-tetra-azabici- clo[6.6.2]hexadecano). MRLs de metal de transição adequados são prontamente preparados por procedimentos conhecidos (vide, por exemplo, WO 2000/32601, e Patente dos Estados Unidos No. 6.225.464).

[000226] Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem agentes de cuidado de metal. Agentes de cuidado de metal encontram uso na prevenção e/ou redução do embaçamento, corrosão e/ou oxidação de metais, incluindo alumínio, aço inoxidável e metais não ferrosos (por exemplo, prata e cobre). Agentes de cuidado de metal adequados incluem aqueles descritos no EP 2 100 949, WO 9426860 e WO 94/26859). Em algumas modalidades, o agente de cuidado de metal é um sal de zinco. Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,1% a cerca de 5% por peso de um ou mais agente de cuidado de metal.

[000227] Conforme indicado acima, as composições de limpeza da presente invenção são formuladas em qualquer forma adequada e preparadas por qualquer processo escolhido pelo formulador, exemplos não limitativos dos quais são descritos nas Patentes dos Estados Unidos. Nos 5.879.584, 5.691.297, 5.574.005, 5.569.645, 5.516.448, 5.489.392, e 5.486.303, todas das quais são aqui incorporadas por referência. Em algumas modalidades em que uma composição de limpeza de baixo pH é desejada, o pH de tal composição é ajustado via a adição de um material acídico tal como HCl.

[000228] As composições de limpeza aqui descritas encontram uso na limpeza de um local (por exemplo, uma superfície, louça, ou tecido). Tipicamente, pelo menos uma porção do local é contactada com uma modalidade da presente composição de limpeza, na forma líquida ou diluída em um licor de lavagem, e, em seguida, o local é opcionalmente lavado e/ou enxaguado. Para proposta da presente invenção, “lavagem” inclui, mas não é limitada a, purificação e agitação mecânica. Em algumas modalidades, as composições de limpeza são tipicamente empregadas em concentrações de cerca de 500 ppm a cerca de 15,000 ppm na solução. Quando o solvente de lavagem é água, a temperatura da água varia tipicamente de cerca de 5°C a cerca de 90°C e, quando o local compreende um tecido, a proporção de massa de água para tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

EXPERIMENTAL

[000229] A presente invenção é descrita em detalhe adicional nos seguintes exemplos que não são de qualquer modo pretendidos limitar o escopo da invenção conforme reivindicada.

[000230] Na descrição experimental que se segue, as seguintes abreviações se aplicam: PI (inibidor de proteinase), ppm (partes per milhão); M (molar); mM (milimolar); μM (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); mmol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); gm (gramas); mg (miligramas); μg (microgramas); pg (picogramas); L (litros); ml e mL (mililitros); μl e μL (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μm (micrômetros); nm (nanômetros); U (unidades); V (volts); MW (peso molecular); seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) e hr(s) (hora/horas); °C (graus Centígrados); QS (quantidade suficiente); ND (não feito); rpm (revoluções por minuto); H2O (água); dH2O (água de ionizada); (HCl (ácido hidroclórico); aa (aminoácido); bp (par base); kb (par de kilobase); kD (kilodaltons); cDNA (copia ou DNA complementar); DNA (ácido deoxiribonucleico); ssDNA (DNA de trançado simples); dsDNA (DNA de trançado duplo); dNTP (deoxiribonucleotídeo trifosfato); RNA (ácido ribonucleico); MgCl2 (cloreto de magnésio); NaCl (cloreto de sódio); w/v (peso para volume); v/v (volume para volume); g (gravidade); OD (densidade ótica); ppm (partes por milhão); solução tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS); SOC (2% Bacto-Triptona, 0,5% de Extrato de Levedura de Bacto, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl); Caldo Terrific (TB; 12 g/l Bacto-Triptona, 24 g/l de glicerol, 2,31 g/l de KH2PO4, e 12,54 g/l de K2HPO4); OD280 (densidade ótica a 280 nm); OD600 (densidade ótica a 600 nm); A405 (absorvência a 405 nm); Vmáx (a velocidade inicial máxima de uma reação catalisada por enzima); PAGE (poliacrilamida gel eletroforese); PBS (salina tamponada por fosfato [150 mM de NaCl, 10 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,2]); PBST (PBS + 0,25% de TWEEN®-20); PEG (polietileno glicol); PCR (reação de cadeia de polimerase); RT- PCR (PCR de transcrição reversa); SDS (sódio dodecil sulfato); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); HEPES (N-[2-Hidroxietil]piperazina- N-[2-ácido etanosulfônico]); HBS (salina tamponada de HEPES); Tris-HCl (tris[Hidroximetil]aminometano-hidrocloreto); Tricina (N-[tris- (hidroximetil)-metil]-glicina); CHES (2-(N-ciclo-hexilamino) etano-ácido sulfônico); TAPS (3-{[tris-(hidroximetil)-metil]-amino}-ácido propanosulfônico); CAPS (3-(ciclo-hexilamino)-propano-ácido sulfônico; DMSO (dimetil sulfóxido); DTT (1,4-ditio-DL-treitol); SA (ácido sinapínico (s,5-dimetoxi-4-hidroxi ácido cinâmico); TCA (ácido tricloroacético); Glut e GSH (glutationa reduzida); GSSG (glutationa oxidada); TCEP (Tris[2-carboxietil] fosfina); Ci (Curies); mCi (miliCuries); μCi (microCuries); HPLC (cromatografia líquida de alta pressão); RP-HPLC (cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa); TLC (cromatografia de camada delgada); MALDI-TOF (desorção a laser auxiliada por matriz—tempo de vôo); Ts (tosil); Bn (benzil); Ph (fenil); Ms (mesil); Et (etil), Me (metil); Taq (Thermus aquaticus DNA polimerase); Klenow (fragmento de DNA polimerase I grande (Klenow)); EGTA (etileno glicol-bis(β-aminoetil éter) N, N, N', N'-ácido tetra-acético); EDTA (ácido etilenodiaminatetracético); bla (gene de resistência a β-lactamase ou ampicilina); HDL (líquido de alta densidade); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ);Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY e Bad Kreuznach, Germany); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, the Netherlands); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio- Synthesis, Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island , NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences e/ou Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OU); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL ou Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); e Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

[000231] Conforme aqui usado, em algumas listas, uma condução “0” é indicada, de modo a proporcionar uma designação de três números para cada local (por exemplo, “001” é o mesmo como “1”, de modo que “A001C” é o mesmo como “A1C”). Em algumas listas, a condução “0” não é incluída. Em adição, conforme aqui usado, “X” se refere a qualquer aminoácido.

[000232] Nas composições detergentes exemplificadas aqui providas, os níveis de enzimas são expressos pela enzima pura por peso da composição total e, a menos que de outro modo especificado, os ingredientes detergentes são expressos por peso das composições totais. As identificações de componente abreviadas aqui têm os seguintes significados: Abreviação LAS Ingrediente : Sódio linear C11-13 alquil benzeno sulfonato. NaC16-17HSAS : Sódio C16-17 altamente solúvel alquil sulfato TAS : Sódio de sebo alquil sulfato. CxyAS : Sódio C1x - C1y alquil sulfato. CxyEz : C1x - C1y predominantemente linear álcool primário condensado com uma média de z moles de óxido de etileno. CxyAEzS : C1x - C1ysódio alquil sulfato condensado com uma média de z moles de óxido de etileno. Nome da molécula adicionada nos exemplos. Não iônico : Álcool graxo misturado etoxilatado/propoxilatado por exemplo Plurafac LF404 sendo um álcool com um grau médio de etoxilação de 3,8 e um grau médio de propoxilação de 4,5. QAS : R2.N+(CH3)2(C2H4OH) com R2 = C12-C14. Silicato : Silicato de Sódio amorfo (proporção de SiO2:Na2O = 1,6-3,2:1). Abreviação Ingrediente Metasilicato : Metasilicato de sódio (proporção de SiO2:Na2O = 1,0). Zeólito A : Aluminosilicato hidratado de fórmula formula Na12(A1O2SiO2)12. 27H2O SKS-6 : Silicato em camada cristalina de fórmula δ- Na2Si2O5. Sulfato : Sulfato de sódio anidro. STPP : Tripolifosfato de Sódio. MA/AA : Copolímero aleatório de 4:1 acrilato/maleato, peso molecular médio cerca de 70.000-80.000. AA : Polímero de poliacrilato de sódio de peso molecular médio de 4.500. Policarboxilato : Copolímero compreendendo mistura de monômeros carboxilatados tais como acrilato, maleato e metiacrilato com um MW variando entre 2.000-80.000 tal como Sokolan comercialmente disponível de BASF, sendo um copolímero de ácido acrílico, MW 4.500. BB1 : 3-(3,4-Di-hidroisoquinolinium)propano sulfonato BB2 1-(3,4-di-hidroisoquinolinium)-decano-2-sulfato PB1 : Sódio perborato mono-hidrato. PB4 : Sódio perborato tetra-hidrato de fórmula nominal NaBO3.4H2O. Percarbonato : Sódio percarbonato de fórmula nominal 2Na2CO3.3H2O2 . TAED : Tetraacetil etileno diamina. NOBS : Nonanoiloxibenzeno sulfonato na forma do sal de sódio. Abreviação Ingrediente DTPA : Dietileno triamina ácido pentaacético. HEDP : 1,1-hidroxietano ácido difosfônico. DETPMP : Dietiltriamina penta (metileno) fosfonato, comercializado por Monsanto sob a marca comercial Dequest 2060. EDDS : Etilenodiamina-N,N'-ácido disuccínico, (S,S) isômero na forma de seu sal de sódio Diamina : Dimetil aminopropil amina; 1,6-hezano diamina; 1,3-propano diamina; 2-metil-1,5-pentano diamina; 1,3-pentanodiamina; 1-metil-diamino- propano. DETBCHD 5, 12- dietil-1,5,8,12-tetra-azabiciclo [6,6,2] hexadecano, dicloreto, Mn(II) SALT PAAC : Penta-amina acetato sal de cobalto(III). Parafina : Óleo de parafina vendido sob a marca comercial Winog 70 por Wintershall. Parafina : Um óleo de parafina ou cera em que alguns dos Sulfonato átomos de hidrogênio foram substituídos por grupos sulfonato. Aldose oxidase : Enzima oxidase vendida sob a marca comercial Aldose Oxidase por Novozymes A/S Galactose oxidase : Galactose oxidase de Sigma nprE : A forma recombinante de metalloprotease neutra expressa em Bacillus subtilis (Vide por exemplo, WO 07/044993) PMN : Metalloprotease neutral purificada de Bacillus amyloliquefacients. Abreviação Ingrediente Amilase : Uma enzima amilolítica adequada, tal como aquela vendida sob as marcas comerciais PURAFECT ® Ox descrita em WO 94/18314, WO96/05295 vendida por Genencor; NATALASE®, TERMAMYL®, FUNGAMYl® e DURAMYL™, todas disponíveis de Novozymes A/S. Lipase : Uma enzina lipolítica tal como aquela vendida sob as marcas comerciais LIPOLASE®, LIPOLASE® Ultra por Novozymes A/S e Lipomax™ por Gist-Brocades. Celulase : Uma enzima celulítica adequada tal como aquela vendida sob as marcas comerciais CAREZYME®, CELLUZYME®, e/ou ENDOLASE® por Novozymes A/S. Pectin Liase : Uma pectin liase adequada, tal como aquela vendida sob os nomes comerciais PECTAWAY® e PECTAWASH®disponíveis de Novozymes A/S. PVP : Polivinilpirrolidona com um peso molecular médio de 60.000 PVNO : Polivinilpiridina-N-Óxido, com um peso molecular médio de 50.000. PVPVI : Copolímero de vinilimidazole e vinilpirrolidona, com um peso molecular médio de 20.000. Antiespuma de : Disódio 4,4'-bis(2-sulfoestiril)bifenil. Abreviação Silicone 1 Mais Ingrediente : Controlador de espuma polidimetilsiloxano com Brilhante copolímero de siloxano-oxialquileno como agente dispersante com uma proporção de referido controlador de espuma para referido agente de dispersão de 10:1 a 100:1. Suds : 12% de Silicone/sílica, 18% de estearil álcool, Suppressor SRP 1 70% de amido na forma granular. : Poliésteres capeados anionicamente terminais. PEG X : Polietileno glicol de um peso molecular de x. PVP K60 ® : Homopolímero de vinilpirrolidona (MW médio 160.000) Jeffamine ® ED- 2001 : Polietileno glicol capeado de Huntsman Isachem ® AS : Um álcool alquil sulfato ramificado de Enichem MME PEG : Monometil éter polietileno glicol (MW 2000) de (2000) DC3225C Fluka Chemie AG. : Silicone supr4essor de água de sabão, mistura de Óleo de silicone e Sílica de Dow Corning. TEPAE : Tetreaetilenopentaamina etoxilato. BTA : Benzotriazole. Betaína : (CH3)3N+CH2COO- Açúcar : D-glicose de grau de indústria ou açúcar de grau de alimento CFAA : C -C alquil N-metil glucamida TPKFA : C12-C14 ácidos graxos de corte total de topo. Argila : Um silicato de alumínio hidratado em uma fórmula geral AhO3SiO2^xH2O. Tipos: Kaolinite, montmorilonita, atapulgita, illite, bentonita, halloysite. Abreviação Ingrediente pH : Medido como uma solução 1% em água destilada a 20°C.

EXEMPLO 1 Ensaios

[000233] No seguinte exemplo, vários ensaios foram usados conforme colocado abaixo para facilidade de leitura. Quaisquer desvios dos protocolos providos abaixo são indicados.

A. Ensaio de TCA para Determinação de Teor de Proteína em Placas de Microtitulação de 96 cavidades (“Ensaio de TCA”)

[000234] Para BPN’ (por exemplo, uma protease de referência) e variantes desta, este ensaio foi iniciado usando-se sobrenadante de cultura filtrado de placas de microtitulação crescidas 3-4 dias a 33 °C com oscilação a 230 rpm e aeração umidificada. Uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 cavidades fresca (MTP) foi usada para o ensaio. Primeiro, 100 μL/cavidade de N HCl 0,25 N foi colocado em cada cavidade. Em seguida, 50 μL de caldo de cultura filtrado foi adicionado. A difusão de luz/absorvência a 405 nm (usar modo de mistura de 5 segundos na leitora da placa) foi então determinada, de modo a proporcionar uma leitura de “intervalo”. Para o teste, 100 μL/cavidade de 15% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) foi colocado nas placas e incubado entre 5 e 30 min à temperatura ambiente. A difusão de luz/absorvência a 405 nm (usar modo de mistura de 5 segundos na leitora de placa) foi então determinada.

[000235] O Ensaio de TCA para determinação do teor de proteína de GCI-P036 e variantes desta foi realizado usando-se sobrenadante de cultura filtrado de placas de microtitulação desenvolvidas aproximadamente 3 dias a 37°C com oscilação a 300 rpm e aeração umidificada. Neste ensaio, 100 μL de uma solução de HCl 0,25 M foi adicionado a cada cavidade de uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 cavidades. Subsequentemente, alíquotas de 25 μL dos sobrenadantes de cultura filtrados (contendo a proteases) foram adicionados às cavidades. A difusão de luz/absorvência a 405 nm (usando modo de mistura de 5 segundos na leitora de placa) foi, em seguida, determinada, de modo a proporcionar a leitura de “intervalo”. Após esta medição, 100 μL de uma solução de TCA 30% (p/v) foi adicionado a cada cavidade e as placas de microtitulação foram incubadas entre 5 e 15 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, a difusão de luz/absorvência resultante a 405 nm (usando o modo de mistura a 5 segundos na leitora de placa) foi determinada. O equipamento usado foi um Robô Biomek FX (Beckman Coulter) e uma Leitora SpectraMAX (type 340; Molecular Devices) MTP; os MTP’s foram de Costar (type 9017).

[000236] Os cálculos foram realizados por subtração do intervalo (nenhum TCA) a partir da leitura de teste com TCA para proporcionar uma medida relativa do teor de proteína nas amostras. Se desejado, uma curva padrão pode ser criada por calibração das leituras de TCA com ensaios de AAPF de clones com fatores de conversão conhecidos. Contudo, os resultados do TCA são lineares com relação a concentração de proteína de 50 a 500 microgramas de proteína por ml (ppm) e podem, desse modo, serem plotados diretamente contra o desempenho da enzima para a proposta de escolha de variantes de bom desempenho. O difusor de turbidez/luz aumenta nas amostras que se correlacionam a quantidade total de proteína precipitável no sobrenadante de cultura.

B. Ensaio de AAPF Protease em Placas de Microtitulação de 96 cavidades (“Ensaio AAPF”)

[000237] De modo a determinar a atividade de protease das proteases e variantes destas da presente invenção, a hidrólise de N-succinil-L- alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA) foi medida. As soluções de reagente usadas foram: 100 mM de Tris/HCl, pH 8,6, contendo 0,005% de TWEEN®-80 (Tris tampão de diluição); 100 mM de tampão Tris, pH 8,6, contendo 10 mM de CaCl2 e 0,005% de TWEEN®- 80 (Tris/tampão de Ca); e 160 mM de suc-AAPF-pNA em DMSO (solução de estoque de suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Para preparar uma solução de operação de suc-AAPF-pNA, 1 ml de solução de estoque de suc-AAPF-pNA foi adicionado a 100 ml de Tris/tampão de Ca e misturada bem por pelo menos 10 segundos. O ensaio foi realizado por adição de 10 μl de solução diluída de protease a cada cavidade, imediatamente seguido pela adição de 190 μl 1 mg/ml de solução de operação de suc-AAPF-pNA. As soluções foram misturadas por 5 segundos, e a mudança de absorvência no modo cinético (20 leituras em 5 minutos) foi lida a 410 em uma leitora de MTP, a 25°C. A atividade de protease foi expressa como AU (atividade=ΔOD^min-1ml-1).

Método de Hidrólise de AAPF

[000238] A termo estabilidade de serina proteases foi determinada por ensaio de atividade de protease usando o ensaio de AAPF após incubação de variantes de protease a 68oC por 1 hora. Sob as condições do ensaio, a atividade residual da protease de referência (por exemplo, tipo selvagem GG36 = GCI-P036) foi cerca de 50%. O equipamento usado foi: MTPs de fundo em F (Costar No. 9017), Biomek FX e/ou Robô Biomek FXp (Beckman Coulter), Leitora Spectramax Plus 384 MTP (Molecular Devices), Incubadora/oscilador iEMS (1 mm de amplitude) (Thermo/Labsystems), Sealing tape (Nunc No. 236366), e banho de gelo. Tampão de glicina foi preparado por dissolução de 3,75g de glicina (Merck No. 1.04201.1000) em 960 mL de água. 1 ml de 5% Tween 80 (Sigma No. P-8074) e 10 ml de uma solução de estoque de 1000 mM de CaCl2 (Merck No. 1.02382.1000) (29,4 g dissolvido a 200 ml) foi adicionado a esta solução. O pH foi ajustado para 10,5 com NaOH 4N e o volume trazido até 1000 ml. As concentrações finais de glicina, CaCl2 e TWEEN®-80 foram: 50 mM, 10 mM e 0,005% respectivamente. As incubadoras foram ajustadas a 68oC (para incubação) e a 25oC (para o ensaio de AAPF). 90 μl e 190 μl de tampão de glicina foi adicionado a diluição vazia e placas de incubação respectivamente. 10 μl de sobrena- dante foi, em seguida, adicionado à placa de diluição, seguido por adição de 10μl da placa de diluição para a placa de incubação. Em seguida, 10 μl de mistura a partir da placa de incubação foi adicionado a uma placa pré-aquecida contendo substrato de suc-AAPF-pNA. A placa de suc-AAPF-pNA foi lida em Leitora MTP a 410 nm (t = medição 0). A placa de incubação foi coberta com fita e incubada por 1 hora a 68°C e 400 rpm. No final da incubação, a placa foi removida da incubara e resfriada em gelo por pelo menos 5 minutos. 10 μl de mistura a partir da placa de incubação foi transferida para a placa contendo substrato de suc-AAPF-pNA e a placa lida a 410 nm (t= medição de 60). A percentagem de atividade residual foi calculada como: % de atividade residual: (mOD.min-1 a t=60) / (mOD.min-1 a t=0) x 100

C. Ensaio de Estabilidade de LAS/EDTA (“Ensaio de LAS/EDTA” ou “Ensaio de LAS-EDTA” ou “Ensaio de LAS”

[000239] A estabilidade de LAS/EDTA foi medida após incubação da protease teste na presença de LAS/EDTA respectivamente, como uma função da atividade residual determinada usando o ensaio de AAPF.

[000240] A estabilidade de variantes de protease na presença de um tensoativo aniônico representativo (LAS= alquilbeno sulfonato linear, sódio dodecilbenzenosulfonato-DOBS) e di-sódio EDTA foi medida após incubação sob condições definidas e a atividade residual foi determinada usando-se o ensaio de AAPF. Os reagentes usados foram dodecillbenzeno sulfonato, sal de sódio (DOBS, Sigma No. D-2525), TWEEN®-80 (Sigma No. P-8074), di-sódio EDTA (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), tampão sem estresse: 50 mM de HEPES (11,9 g/l) + 0,005% de TWEEN®-80, pH 8,0, Tampão sem estresse: 50 mM de HEPES (11,9 g/l), 0,1% (p/v) de DOBS (1 g/l), 10 mM de EDTA (3,36 g/l), pH 8,0, protease de referência e sobrenadantes de cultura variante de protease, contendo 200 - 400 μg/ml de proteína. O equipamento usado foi MTP com fundo em V ou em U como placas de diluição (Greiner 651101 e 650161 respectivamente), MTP de fundo em F (Corning 9017) para tampão sem estresse e LAS/EDTA, bem como para placas de suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter), Leitora Spectramax Plus 384 MTP (Molecular Devices), Incubado- ra/Oscilador iEMS (1 mm de amplitude) de Thermo Electron Corporation, fita de vedação: Nunc (236366)

[000241] A incubadora/oscilador iEMS (Thermo/Labsystems) foi ajustada a 29°C. Os sobrenadantes de cultura foram diluídos em placas contendo tampão sem estresse a uma concentração de ~ 25 ppm (placa de diluição master). 20 μl de amostra a partir da placa de diluição master foi adicionado às placas contendo 180 μl de tampão sem estresse para dar uma concentração de incubação final de 2,5 ppm. Os conteúdos foram misturados e mantidos a temperatura ambiente e um ensaio de AAPF foi realizado nesta placa. 20 μl de amostra a partir da placa de diluição master foi também adicionado às placas contendo 180 μl de tampão de estresse (50 mM de HEPES (11,9 g/l), 0,1% (p/v) de DOBS (1 g/l), 10 mM de EDTA (3,36 g/l), pH 8,0). As soluções foram misturadas e imediatamente colocadas em oscilador iEMS a 29°C por 30 minutos a 400 rpm. Em seguida a 30 minutos de incubação, um ensaio de AAPF foi realizado na placa de estresse. A estabilidade das amostras foi determinada pelo cálculo da proporção da atividade de AAPF residual e inicial conforme segue: Atividade residual (%) = [mOD.min-1 estressado]*100 / [mOD. min- não estressado].

D. Ensaios de Desempenho de Limpeza

[000242] O desempenho de remoção de mancha das variantes de protease foi determinado em detergentes comercialmente disponíveis. A inativação de calor de fórmulas de detergente comercial serve para destruir a atividade enzimática de quaisquer componentes de proteína enquanto retêm as propriedades de componentes não enzimáticos. Desse modo, este método foi adequado para a preparação de detergentes comprados para uso no teste das variantes de enzima da presente invenção.

Microamostras:

[000243] Microamostras de %” de diâmetro circular foram ordenadas e distribuídas por CFT (Vlaardingen, The Netherlands). As microamostras simples ou duas microamostras foram colocadas verticalmente em cada cavidade de um MTP de 96 cavidades para expor a área de superfície total (isto é, não plana no fundo da cavidade).

Ensaio de Microamostra de BMI

[000244] Microamostras contendo leite de sangue e tinta (BMI) de 0,25 polegada de diâmetro circular foram obtidas de CFT Vlaardingen. Antes do corte das amostras, o tecido (EMPA 116) foi lavado com água. Uma microamostra foi verticalmente colocada em cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades de modo a expor a área de superfície total (isto é, não plana no fundo da cavidade). A solução de detergente desejada foi preparada conforme aqui descrito. Após equilibrar o Thermomixer a 25°C, 190 μl de solução de detergente foi adicionada a cada cavidade da MTP contendo microamostras. A esta mistura, 10 μl da solução de enzima diluída foi adicionado de modo que a concentração final de enzima foi 1 μg/ml (determinada do ensaio de BCA). A MTP foi vedada com fita e colocada na incubadora por 30 minutos, com agitação a 1400 rpm Abaixando-se a incubação sob as condições apropriadas, 100 μl da solução de cada cavidade foi transferido em uma MTP fresca. A nova MTP contendo 100 μl de solução/cavidade foi lida a 405 nm usando-se uma leitora MTP SpectraMax. Os controles de intervalo, bem como um controle contendo duas microamostras e detergente, mas nenhuma enzima foram também incluídos.

Ensaio de Microtitulação de Ovo Cozido

[000245] Por esta razão, placas de substrato de gema de ovo de 96 cavidades foram preparadas de gemas de ovo de galinha. As gemas de ovo de galinha foram separadas das claras, liberadas da membrana sac, e diluídas em 20% (vol/peso) com Milli-Q water. A gema diluída foi agitada por 15 min a temperatura ambiente usando-se um agitador magnético. Cinco μL foi cuidadosamente pipetado no centro de cada cavidade de uma placa de fundo em V de 96 cavidades (Costar #3894) usando-se uma pipeta de 8 canais. As placas foram cozidas a 90°C por 1 hora e resfriadas à temperatura ambiente. As placas de substrato de ovo cozido foram armazenadas à temperatura ambiente e usadas dentro de uma semana de preparação. Detergentes de louça automáticos foram preparados conforme descrito aqui e pré- aquecidos a 50°C. Uma alíquota de 190 μL de detergente foi adicionada a cada cavidade da placa de 96 cavidades usando-se uma pipeta de 8 canais. Dez μL de enzima diluída foi adicionada a cada cavidade usando-se um dispositivo de pipetação de 96 canais. A placa foi cuidadosamente vedada com um vedador de folha adesiva e incubada a 50°C com oscilação por 30 minutos. 120 μL da mistura de reação foi transferida para uma nova placa de fundo plano de 96 cavidades, e a absorvência/difusão de luz foi determinada a 405 nm. A absorvência/difusão de luz a 405 nm é proporcional a remoção de gema de ovo.

Ensaio de microamostra de gema de ovo (“CS-38 Ensaio de Microamostra”; ou “EGG” ou “Prato”)

[000246] Detergentes de louça automáticos foram preparados conforme descrito aqui. O equipamento usado inclui uma incubadora/oscilador New Brunswick Innova 4230 e uma leitora SpectraMAX (type 340) MTP. As MTPs foram obtidas de Costar (tipo 9017). Gema de ovo envelhecida com amostras de pigmento (CS-38) foram obtidas de Center for Test Materials (Vlaardingen, Netherlands). Antes do corte de microamostras circulares de 0,25 polegada, o tecido foi lavado com água. Uma microamostra foi colocada em cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. O detergente de este foi equilibrado a 50°C. 190 μl de solução de detergente foi adicionada a cada cavidade da MTP, contendo microamostras. A esta mistura, 10 μl da solução de enzima diluída foi adicionado. A MTP foi vedada com folha adesiva e colocada na incubadora por 30 minutos, com agitação. Em seguida a incubação, 100 μl da solução de cada cavidade foi transferido em uma MTP fresca. Esta MTP foi lida a 405 nm usando-se uma leitora de MTP SpectraMax. Os controles de intervalo, bem como controles contendo microamostras e detergente, mas nenhuma enzima, foram também incluídos.

“Amostra Pré-lavada”

[000247] Este tipo de microamostra foi pré-lavado em água deionizada por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a etapa de pré-lavagem, as amostras foram postas no topo de papéis toalhas para secagem. As amostras secadas a ar foram, em seguida, puncionadas usando-se um molde circular de %” em uma prensa de expulsão. Finalmente duas microamostras foram postas em cada cavidade de uma MTP de 96 cavidades verticalmente para expor a área de superfície total (isto é, não plana no fundo da cavidade).

Detergentes

[000248] Para América do Norte e (NA) e Oeste Europeu (WE) detergentes de lavagem de líquido de trabalho (HDL), inativação de calor foi realizada por colocação de um detergente líquido pré-pesado (em uma garrafa de vidro) em um banho de água a 95°C por 2 horas. Todos os detergentes usados nos exemplos eram detergentes comercialmente disponíveis comprados de lojas de supermercado locais. As enzimas presentes nestes detergentes foram inativadas por tratamento de calor, conforme descrito aqui. O tempo de incubação para inativação de calor do detergente de lavanderia granular de máquina (HDG) da América do Norte (NA) e Japonês (JPN) foi 8 horas e que para o Oeste Europeu (WE) o detergente HDG foi 5 horas. O tempo de incubação para inativação de calor de detergentes de auto lavagem de louça (ADW) da NA e WE foi 8 horas. Ambos detergentes não aquecidos e aquecidos foram ensaiados dentro de 5 minutos de dissolução do detergente para determinar precisamente a porcentagem desativada. A atividade de enzima foi testada pelo ensaio de AAPF.

[000249] Para testar a atividade de enzima em detergentes inativados por calor, soluções de operação de detergentes foram produzidas de estoques inativados por calor. Quantidades apropriadas de dureza de água (6 gpg ou 12 gpg) e tampão foram adicionados às soluções de detergente para se equiparar às condições desejadas. As soluções foram misturadas por centrifugação ou inversão das garrafas. A tabela 1-1 proporciona informação com relação a alguns dos detergentes comercialmente disponíveis e condições de teste usadas aqui. Em alguns experimentos, detergentes adicionais e/ou outros comercialmente disponíveis foram usados conforme descrito nos se- guintes exemplos.

* Abreviações: Procter & Gamble (P&G); e Reckitt Benckiser (RB).

Enzimas e Equipamento

[000250] Amostras de GCI-P036 e variantes destas foram obtidas de caldo de cultura filtrado de culturas desenvolvidas em placas de MTP. O equipamento usado foi um Robô Biomek FX (Beckman Coulter), a uma Leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices), uma incubadora/oscilador iEMS (Thermo/Labsystems); MTPs de fundo em F (Costar type 9017 usados para leitura de placas de reação após incubação); e MTPs de fundo em V (Greiner 651101 usado para pré- diluição de sobrenadante). Neste ensaio, as proteases hidrolisam o substrato e liberam pigmento e artigos insolúveis do substrato. Desse modo, a taxa de turbidez é uma medida de atividade de enzima.

[000251] O desempenho de remoção de mancha de serina proteases de referência e variantes destas em microamostras foi determinado em uma escala de MTP em detergente comercialmente disponível (Calgonit 5 in1). Microamostras CS-38 (gema de ovo com pigmento, envelhecida por aquecimento), obtidas de CFT Vlaardingen foram usadas como substrato. Duas amostras foram usadas por cavidade. Tabletes de ADW de Calgonit 5in1 foram usados para preparar a solução de detergente. Para inativar a atividade de e protease presente nos tabletes, um tablete de 21 g foi dissolvido em Milli-Q water aquecido em um banho de água a uma temperatura de 60°C. A solução foi resfriada a temperatura ambiente e o volume de água ajustado para 700 mL. A solução foi adicionalmente diluída com água alcançar uma concentração final de 3 g/l. A dureza da água foi ajustada para 21°GH por adição de 1,46 ml da mistura Ca/Mg (mistura Ca/Mg [(3:1), 1,92 M de CaCl2 = 282,3 g/L de CaCl2.2H20; 0,64 M de MgCl2 = 130,1 g/L de MgCl2.6H2O), 15000 gpg]. As amostras de enzima foram pré-diluídas em 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005% de solução de TWEEN®-80 e testadas a concentrações apropriadas.

[000252] A incubadora foi ajustada na temperatura desejada de 50oC. 72 μl de tampão de diluição foi adicionado à placa de fundo em V vazia (isto é, a “placa de diluição”), seguido por 8 μl de sobrenadante. 9 μl da placa de diluição foi adicionado às placas contendo as microamostras incubadas em 171 μl de solução de detergente. 9 μl da placa de diluição foi adicionado às placas contendo as microamostras para dar uma diluição total de sobrenadante de 200X. A placa de microamostra (com detergente e enzima) foi coberta com fita e colocada na incubadora/oscilador por 30 minutos a 1400 rpm. Em seguida a incubação, 75 μl da mistura de reação foi transferido para uma placa de fundo em F vazia e a absorvência foi lida em uma Leitora de MTP a 405 nm após de-borbulhamento com um, secador a ar. Controles de intervalo, contendo uma ou duas microamostras e detergente sem a adição de protease de referência contendo amostras foram também incluídos no teste.

[000253] O desempenho de remoção de mancha das serina proteases de referência e variantes destas em microamostras foi também determinado em uma escala de MTP em detergente comercialmente disponível (Calgonit 5 in1). Os reagentes usados foram: 5 mM de HEPES, pH 8,0 ou 5 mM de MOPS, pH 7, tampão, 3:1 Ca: Mg para dureza de água média. (CaCh: MgCl2^6H2O); 15000 grãos por galão (gpg) de estoque diluído para 6 gpg, 2 BMI (sangue/leite/tinta) amostras por placa: amostras de algodão EMPA-116 BMI processadas por CFT: pré-enxaguadas e puncionadas 2 amostras por cavidade, e detergente fora da prateleira inativado por calor TIDE® 2X Coldwater em que a falta de atividade de protease foi confirmada. Em alguns experimentos aqui descritos, as seguintes soluções foram usadas, conforme indicado nos exemplos.

[000254] A incubadora foi ajustada na temperatura desejada (16°C ou 32°C). Para o teste, 10 μL de amostras da placa de diluição master de ~10 ppm de enzima foi adicionado às placas de BMI 2-amostras com 190 μL de soluções de detergente de operação listadas acima. O volume foi ajustado para dar a concentração final de 0,5 ppm para variantes nas placas de ensaio. As placas foram imediatamente transferidas para iEMS incubadoras e incubadas por 30 minutos com 1400 rpm de oscilação em dada temperatura. Em seguida a incubação, 100 μL de sobrenadante foi transferido em uma nova placa de 96 cavidades e a absorvência foi medida em Leitora de MTP a 405nm e/ou 600nm. Controles de cavidade contendo 1 ou 2 microamostras e detergente sem a adição de amostras de protease foram também incluídos no teste. A medição a 405 nm proporciona um valor mais alto e remoção de vestígios de pigmento, enquanto se mede a 600 nm vestígios de turbidez e limpeza.

Cálculo da Atividade de Remoção de Mancha para Todos os Métodos de Ensaio de Microamostra:

[000255] O valor de absorvência obtido foi corrigido para o valor de intervalo (substrato sem enzima), proporcionando uma medição da atividade hidrolítica. Para cada amostra (variante) o índice de desempenho foi calculado. O índice de desempenho compara o desempenho da variante (valor atual) e a enzima padrão (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os valores teóricos podem ser calculados, usando-se os parâmetros da equação de Langmuir da enzima padrão.

E. Atividade Específica Relativa de Proteases e Variantes Destas

[000256] De modo a discriminar as variantes de protease, a atividade específica relativa foi calculada usando-se suc-AAPF-pNA como um substrato, que capacitou a comparação e ranqueamento das variantes versus protease tipo selvagem ou padrão. A atividade específica no substrato de suc-AAPF-pNA foi determinada por divisão da atividade proteolítica pelos valores medidos de TCA de cada amostra, usando-se os ensaios descritos acima. Usando-se estes valores, a atividade específica relativa foi calculada (atividade específica de variante/atividade específica de protease de referência).

F. Ensaio de Inibição de Eglin C

[000257] Conforme descrito aqui, a concentração de serina protease e atividade específica foi determinada por titulação com um inibidor. Eglin c da sanguessuga Hirudo medicinalisé um inibidor de proteína de ligação hermética de subtilisinas (Heinz et al., Biochemistry, 31: 8755- 66, 1992), e pode, portanto, ser usado para medir concentração de enzima, que, por sua vez, permite que a atividade específica seja calculada. Brevemente, mede-se a quantidade de inibição de enzima produzida por várias concentrações conhecidas de eglin c. A partir desta informação, a concentração de eglin c requerida para inibição completa é calculada. Isto é equivalente à concentração de enzima na amostra.

[000258] A atividade de protease foi medida usando-se o ensaio cromogênico de AAPF descrito acima. O gene para eglin c foi sintetizado e expresso em E. coli por métodos padrões. Suas propriedades e potência inibitória foram as mesmas conforme eglin c comprada de Sigma. A concentração de uma solução de estoque de eglin c foi determinada pela medição da inibição de uma amostra de Bacillus lentus subtilisina de atividade específica conhecida. Em seguida a amostra de eglin c calibrada foi usada para determinar a concentração e atividade específica de variantes de subtilisina. Estes valores foram usados para criar placas de estoque de enzima de 96 cavidades normalizadas, onde todas as variantes foram diluídas a uma concentração comum.

G. Índice de desempenho

[000259] O índice de desempenho compara o desempenho da variante (valor atual) a protease padrão ou de referência (valor teórico) na mesma concentração de proteína. Em adição, os valores teóricos podem ser calculados usando-se os parâmetros da equação de Langmuir da protease padrão. Um índice de desempenho (PI) que é maior do que 1 (PI>1) identifica uma melhor variante conforme comparado ao padrão (por exemplo, tipo selvagem), enquanto um PI de 1 (PI=1) identifica uma variante que realiza o mesmo como o padrão, e um PI que é menos do que 1 (PI<1) identifica uma variante que realiza pior do que o padrão. Desse modo, o PI identifica padrões, bem como variantes que são menos desejáveis para uso sob certas circunstâncias.

EXEMPLO 2 Produção de GCI-P036 Protease em B. subtilis

[000260] Neste Exemplo, experimentos conduzidos para produzir GCI-P036 protease em B. subtilissão descritos. A transformação de vetor de expressão que codifica GCI-P036 e variantes deste em células de B. subtilis (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]) foi realizada conforme descrito anteriormente (Vide, por exemplo, WO 2002/014490).

Produção de GCI-P036 Protease - pAC-GCI-P036ci

[000261] Métodos exemplares para produzir GCI-P036 (também referidos aqui como “B. lentus subtilisina” e “GG36”) em B. subtilis são providos. O plasmídeo de expressão pAC-GG36ci foi montado usando- se o gene aperfeiçoado de códon GCI-P036 fundido no oitavo códon da sequência de sinal aprE sob o controle do promotor aprE de consenso e o terminador transcricional de BPN’. Na sequência provida abaixo, a fonte em negrito e em itálico indicam o promotor aprE de consenso, a fonte padrão indica a sequência de sinal, a fonte sublinhada indicaa sequência pro, fonte em negrito indica o DNA que codifica a protease madura GCI-P036, e a fonte em negrito em itálico indica o terminador de BPN’. A região de codificação da protease madura GCI-P036 é flanqueada por locais de restrição KpnI e XhoI para proposta de clonagem: atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattca cagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgaga agcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcat ccgctgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgag tttgtagaacaagttgaggcaaatgacgaggtagccattctctctgaggaagaggaagtcgaaat tgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgc gttagagctcgatccagctatttcttatattgaagagg atg cagaagtaactacaatggcgcaatc ggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacag gttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgt ggtggagctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcac tcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccaa gcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctatt gcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggat ctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttctt gttgtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcga acgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtat ggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttc aacatatgccagcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgca cttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatac ggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctg caactcgttaaaagcttaactcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat (SEQ ID NO:5).

[000262] A sequência de aminoácido da proteína precurssora de GCI- P036 é provida abaixo. Nesta sequência, o peptídeo de sinal é mostrado em itálico (começando com uma N-terminal formilmetionina), a pró- sequência é sublinhada, e a sequência de protease madura de GCI- P036 é mostrada em negrito: MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA AEEAKEKYLIGFNEQ EAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVD ALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGIS RVQAPAAHNRGLTGSGVK VAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALN NSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHV ANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARY ANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYAS LNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTN LYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:6).

[000263] A sequência de aminoácido da protease madura de GCI- P036: AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHP DLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSA ELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSAT LEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNN NRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGA AALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:2).

[000264] Os elementos de plasmídeo pAC-GG36ci incluem: pUB110 = fragmento de DNA de plasmídeo pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15:93-103, 1986), pBR322 = fragmento de DNA de plasmídeo pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977), pC194 = fragmento de DNA de plasmídeo pC194 (Horinouchi et al., J Bacteriol, 150:815-825, 1982). AS características do plasmídeo são conforme segue: Ori para B. subtilis = origem de replicação de pUB110, CAT = gene de resistência à cloranfenicol de pC194, origem pMB1 = origem de replicação de pBR322, bla = beta-lactamase de pBR322, Promotor de aprE curto = promotor transcricional de consenso, Peptídeo de Sinal= peptídeo de sinal, Pró Peptídeo = GCI-P036 pró região, Peptídeo Maturo GG36ci = GCI-P036 maturo (recolocado pelas regiões de codificação para cada variante expressa neste trabalho), Terminador de BPN’ = terminador transcricional de subtilisina BPN’.

Produção de Protease GCI-P036 - pHPLT-GCI-P036

[000265] Métodos adicionais para produzir a protease de referência GCI-P036 em B. subtilissão descritos. O gene sintético que codifica precursor de protease GCI-P036 foi montado de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR. O fragmento foi clonado em suporte de plasmídeo pHPLT (Patente dos Estados Unidos No. 5.024.943) usando- se locais de restrição BsmBI e HindIII. A sequência de aminoácido da protease madura GCI-P036 (SEQ ID NO:2) de pHPLT-GCI-P036 é idêntica àquela de pAC-GG36ci. O vetor de expressão pHPLT B. subtilis contém o promotor B. licheniformis LAT (Plat), e elementos adicionais de pUB110 (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986) incluindo um gene de replicase (reppUB), um gene de resistência de neomycin/kanamycin (neo) e um marcador de resistência de bleomycin (bleo). O DNA de plasmídeo foi purificado a partir da bactéria transformada usando-se kit Pure Yield™ Plasmid Midiprep (Promega), e a concentração de DNA foi determinada por espectroscopia de UV conforme conhecido na técnica. A construção de vetor final foi verificada por sequenciamento de DNA do gene GCI-P036 e mostrou 100% de congruência de sequência à sequência esperada. A sequência de DNA do gene protease GCI-P036 de pHPLT-GCI-P036 é mostrada abaixo com os locais de clonagem SacI e HindIII sublinhados: GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCG CACTACTCATTTCTGTTGCTTTCAGTTCATCGATCGCATCGGCTGC TGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAA GCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTC GCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCAT GAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAG ATGTGGACGCGCTTGAGCTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAG AGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGA ATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACA GGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTC ATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGG AACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCC GGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTA GCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAG CGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGG CAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCC CTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTT CTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAG GCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCG GAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATG GCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGC ACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATG GCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAG AACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATA CGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTT GTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAAAGCTT (SEQ ID NO: 7).

Proteases Recombinantes - Escala 2 ml

[000266] Clones de B. subtilis contendo vetores de expressão de protease foram replicados com um replicador de 96 cavidades de aço de estoques de glicerol em placas de cultura de 96 cavidades (BD, 353075) contendo 200 μl de meio LB + 25 μg/ml de cloranfenicol, desenvolvidas durante a noite a 37°C, 220 rpm em um encerramento umidificado. Uma alíquota de 200 μl da cultura durante a noite foi usada para inocular 2000 μl de meio definido + 25μg/ml de cloranfenicol em 5 ml de tubos de cultura plásticos. O meio de cultivo foi um meio semidefinido enriquecido baseado no tampão de MOPS, com uréia como fonte de nitrogênio maior, glicose como a fonte de carbono principal, e suplementado com 1% de soytone para crescimento de célula robusta. Os tubos de cultura foram incubados a 37°C, 220 rpm, por 60 horas. Em seguida esta incubação, os caldos de cultura foram centrifugados em mais do que 8000 x RCF. A solução de sobrenadante foi decantada em 15 ml de tubos cônicos de polipropileno para armazenagem. Nenhuma purificação adicional ou concentração foi realizada. Os estoques de sobrenadante foram formulados a 40% de concentração final de propileno glicol para estabilidade de longo prazo e armazenados a 4oC.

Proteases Recombinantes - Escala de Placa de Microtitulação (MTP)

[000267] Alternativamente, as proteases variantes foram produzidas por crescimento dos transformantes de B.subtilis em placas de microtitulação de 96 cavidades (MTP) em 200 μL de um meio definido à base de MOPS (“MBD”). O meio de MBD foi produzido essencialmente conforme conhecido na técnica (Vide, Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747, 1974), exceto que NH4Cl2, FeSO4, e CaCl2 foram deixados do meio base, 3 mM de K2HPO4 foi usado, e o meio base foi suplementado com 60 mM de uréia, 75 g/L de glicose, e 1% de soytone. Também os micronutrientes foram produzidos como um estoque 100X contendo em um litro, 400 mg de FeSO4.7H2O, 100 mg de MnSO4.H2O, 100 mg de ZnSO4.7H2O, 50 mg de CuCl2.2H2O, 100 mg de CoCl2.6H2O, 100 mg de NaMoO4.2H2O, 100 mg de Na2B4O7.10H2O, 10 ml de 1M CaCl2, e 10 ml de citrato de sódio 0,5 M. As placas foram incubadas a 37oC por 68 horas, as células foram separadas por centrifugação, e as proteínas de interesse foram obtidas do meio de cultura.

EXEMPLO 3 Geração de Variantes de GCI-P036

[000268] Neste exemplo, métodos usados para produzir as variantes de protease são descritos. Geração de Bibliotecas de Avaliação de Local de GCI-P036 (SELs)

[000269] A produção de SEL foi realizada por GENEART usando-se um processo proprietário (WO 2004/059556A3). Métodos e dispositivos para otimização de uma sequência de nucleotídeo para a proposta de expressão de uma proteína por PCR, e a manufatura de moléculas de DNA utiliza tecnologia própria ou licenciada por GENEART (Patentes Européias Nos. 0 200 362 e 0 201 184; e Patentes US Nos. 4.683.195. 4.683.202 e 6.472.184). A construção de GCI-P036 SEL descrita neste exemplo foi realizada por GENEART usando-se seus métodos e plataforma de tecnologia par otimização de gene, síntese de gene e geração e análise de biblioteca.

[000270] GCI-P036 SELs foram produzidos por GENEART em posições pré-selecionadas pelos inventores. O plasmídeo de DNA pHPLT-GCI-P036 (vide, figura 2) foi digerido com enzimas de restrição SacI e HindIII, liberando um fragmento de 3,9kb que foi subsequentemente purificado de um gel de agarose usando-se um kit de purificação de gel Qiagen. Cada aminoácido da sequência madura foi mutado em pelo menos 16 aminoácidos diferentes. Para construir GCI-P036 SELs, três reações de PCR foram realizadas: duas reações de mutagênese para introduzir o códon que sofreu mutação de interesse na sequência de DNA madura GCI-P036, e uma terceira reação para fundir os dois produtos de PCR de mutagênese juntos para construir o vetor de expressão de pHPLT-GCI-P036 tendo os códons que sofreram mutação na sequência madura de GCI-P036.

[000271] O método de mutagênese foi baseado na aproximação de mutação específica de códon em que a criação de todas as mutações possíveis uma vez que em um trio de DNA específico foi realizado usando- se um iniciador de oligonucleotídeo de avanço e reverso com um comprimento de 25 até 45 nucleotídeos usando-se uma sequência NNS de DNA tripla especificamente designada ((A,C,T ou G), (A,C,T ou G), (C ou G)) que corresponde com a sequência do códon a ser mutada e garantir incorporação aleatória de nucleotídeos no códon específico de interesse. Dois iniciadores adicionais que são usados para construir uma biblioteca de avaliação de local inclui um iniciador à montante contendo um local de SacI, e um iniciador à jusante contendo um local de HindIII. A construção de cada SEL começa com duas amplificações de PCR primárias usando- se o iniciador de SacI de avanço e um iniciador de mutagênese reversa de GCI-P036 específico, e para a segunda reação de PCR o iniciador de HindIII reverso e um iniciador de mutagênese de avanço de GCI-P036 específico (igual às posições de códon maturas de GCI-P036 para os iniciadores de mutagênese de avanço e reverso).

[000272] A introdução das mutações na sequência de GCI-P036 madura foi realizada usando-se Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes catalog no. F-530L). Todas as reações de PCR foram executadas de acordo com os protocolos do fabricante que foram fornecidos com a polimerase. As condições de PCR foram conforme segue: para PCR 1 primário: Iniciador FW SacI e um iniciador de mutagênese reverso de GCI-P036 específico - ambos 1 μL (10 μM); e para PCR 2 primário: Iniciador RV HindIII e um iniciador de mutagênese de avanço de GCI-P036 específico - ambos 1 μL (10 μM).

[000273] As sequências de iniciador usadas neste exemplo são providas abaixo:

[000274] Cada reação incluiu: 10 μL de tampão 5X Phusion HF, 1 μL de 10 mM de mistura de dNTP, 0,75 μL de Phusion DNA polimerase (2 unidades/ μL), 1 μL de DMSO, 1 μL de pHPLT-GCI-P036 gabarito DNA (0,1 - 1 ng/ μL), e dH2O a 50 μL de volume total.

[000275] PCR foi completado usando-se um ciclizador térmico MJ Research PTC-200 Peltier com o seguinte programa: 30 segundos 98°C, 30X (10 segundos 98°C, 20 segundos 55°C, 1 minuto 72°C) e 5 minutos 72°C. As reações produziram dois fragmentos de aproximadamente 2 a 3 kb tendo aproximadamente sobreposição de 30 nucleotídeos circundando o códon maturo de GCI-P036 de interesse.

[000276] Os fragmentos foram fundidos em uma terceira reação usando-se os dois fragmentos antes mencionados e os iniciadores de avanço e reverso de SacI-Fw e HindIII-Rv. A reação de PCR de fusão foi efetuada em uma solução contendo: 1 μL cada de iniciadores de SacI-Fw e HindIII-Rv (10 μM), 10 μL de tampão 5X Phusion HF, 1 μL de 10 mM de mistura de dNTP, 0,75 μLof de Phusion™ DNA polymerase (2 unidades/ μL), 1 μLof de DMSO, 1 μL de mistura de reação de PCR 1 primário, 1 μL de mistura de reação de PCR 2 primário, e dH2O para ajustar o volume final a 50 μL. O programa de fusão de PCR foi conforme segue: 30 segundos 98°C, 30X (10 segundos 98°C, 20 segundos 55°C, 40 segundos 72°C) e 5 minutos 72°C, usando-se um ciclizador térmico MJ Research PTC-200 Peltier. O fragmento amplifi- cado linear de 859 bp que codifica o gene GCI-P036 foi purificado (usando-se kit de purificação de PCR QIAGEN® Qiaquick, catálogo no. 28106) e digerido com enzima de restrição de SacI e HindIIII para criar extremidades coesivas em ambos os lados do fragmento de fusão. Cerca de 50 ng de plasmídeo pHPLT-GCI-P036 foi digerido com enzimas de restrição de SacI e HindIIII. O fragmento de suporte de vetor de 3,9 kb foi isolado e ligado com 50 ng do fragmento digerido de 859 bp que codifica a enzima variante, usando-se T4 DNA ligase (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante para clonagem de extremidades coesivas. Subsequentemente, a mistura de ligação foi usada para transformar células de B. subtilis (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]) conforme descrito (WO 2002/014490).

[000277] Para cada biblioteca, 96 colônias simples foram captadas e desenvolvidas em meio líquido de TSB (triptona e caldo à base de soja) sob seleção de neomicin para isolamento subsequente do DNA e análise de sequência de gene. Os números da biblioteca variaram de 1 até 269, com cada número representando o códon da sequência madura de GCI-P036 que sofreu mutação. Cada biblioteca continha um máximo de 19 variantes de GCI-P036.

Geração de Bibliotecas de Mutação Múltipla de GCI-P036 (MML)

[000278] Cada biblioteca de mutação múltipla de GCI-P036 sintética contém uma mistura de genes GCI-P036 em que dois ou mais códons selecionados são recolocados por sequências de DNA específicas. A clonagem dos genes combinatoriais de GCI-P036 genes foi realizada por Sloning BioTechnology GmbH usando-se a Tecnologia Slonomax. As Tabelas 3-1 e 3-2 abaixo listam as substituições presentes nos membros das MML numeradas de acordo com a sequência de referência de GCI-P036 e a sequência de referência de BPN’ respectivamente.

EXEMPLO 4 Desempenho de variantes de GCI-P036

[000279] Experimentos conduzidos para determinar o desempenho de remoção de mancha de várias variantes de GCI-P036 de substituição simples em um Ensaio de BMI (TIDE 2X® Cold; 32°C, pH8) e ensaio de microamostra de CS-38 (CALGONIT®; WE ADW) são descritos. Os índices de desempenho para estabilidade de LAS/EDTA, atividade de AAPF e teor de proteína foram também determinados. Todos os ensaios foram realizados usando-se os métodos do exemplo 1.

[000280] A tabela 4-1 mostra valores de índice de desempenho para 4.210 variantes de subtilisina GCI-P036 em 269 posições. O desempenho da variante GCI-P036 foi comparado a enzima tipo selvagem de GCI-P036. Estas variantes com um índice de desempenho maior do que 1 (PI >1) têm desempenho aperfeiçoado. Os índices de desempenho menores do que ou iguais a 0,05 foram fixados em 0,05 e indicados em negrito na tabela. Para a medida de estabilidade, se o índice de desempenho de atividade nos ensaios de estabilidade foi menos do que ou igual a 0,05, o índice de desempenho de estabilidade associado foi designado o valor ND, para não determinado. Também, variantes para qual os valores não foram determinados são listados como ND.

[000281] O índice de desempenho (PI) é a proporção de desempenho da variante para a protease de origem ou de referência. Vários termos colocados abaixo são usados para descrever a mutação: mutações acima têm um PI > 1; mutações neutras têm um PI > 0,5, mutações não nocivas têm um PI > 0,05; mutações danosas têm um PI = 0,05; mutações combináveis são aquelas mutações para qual a variante tem valores de índice de desempenho = 0,5 para pelo menos uma propriedade, e >0,05 para todas as propriedades. As mutações combináveis são mutações que podem ser combinadas para distribuir proteínas com índices de desempenho apropriados para uma ou mais propriedades desejadas. As posições nas quais as mutações ocorrem são classificadas conforme segue. Posições não restritivas têm > 20% de mutações neutras para pelo menos uma propriedade; e Posições restritivas têm < 20% de mutações neutras para atividade e estabilidade.

[000282] Estes dados encontram uso na engenharia de qualquer subtilisina/subtilase. Mesmo se a subtilase a ser projetada tenha um aminoácido diferente daquele de subtilisina GCI-P036 em uma posição particular, estes dados encontram uso na descoberta de uma substituição que alterará as propriedades desejadas por identificação da melhor escolha para substituição(ões), incluindo substituição(ões) ao aminoácido tipo selvagem de GCI-P036.

EXEMPLO 5 Avaliação Comparativa de Dados de Variante de GCI- P036

[000283] Neste Exemplo, os resultados de experimentos conduzidos para determinar expressão de proteína, atividade de remoção de mancha, estabilidade de LAS/EDTA e atividade de AAPF (testes de propriedades de interesse) de variantes de GCI-P036 e GCI-PO36 são comparados. Conforme descrito, a funcionalidade das variantes de GCI- P036 é quantificada como um índice de desempenho (PI), que é a proporção do desempenho de uma variante a uma protease de referência. As classificações do PI aqui usadas incluem: mutações superiores (PI > 1,0); Mutações neutras (PI > 0,5); Mutações não nocivas (PI > 0,05); e Mutações nocivas (PI < 0,05).

[000284] Nas classificações iniciais de variantes de GCI-PO36, pelo menos uma mutação nas seguintes posições foi associada com um índice de desempenho maior do que 1,0 (PI > 1,0) para pelo menos uma propriedade: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275 (por exemplo, mutações superiores). As mutações nestas posições podem ser combinadas para aperfeiçoar a atividade ou estabilidade ou expressão.

[000285] Em particular, as seguintes substituições em GCI-P036 foram associadas com um resultado favorável em pelo menos um teste de interesse (por exemplo, melhor do que a enzima tipo selvagem). Estas mutações são especialmente úteis para aperfeiçoar as propriedades individuais. Conforme indicado aqui, nesta lista, a condução “0” é incluída para proporcionar uma designação de três números para cada local (por exemplo, “001” é a mesma como “1”, de modo que “A001C” é a mesma como “A1C”). Em adição, conforme indicado aqui, “X” se refere a qualquer resíduo de aminoácido.

[000286] X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011S, X011T, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, X029K, X029S, X029T, X029V, X030C, X030D, X030E, X030F, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X032C, X032D, X032G, X033A, X033C, X033D, X033E, X033G, X033H, X033I, X033L, X033M, X033N, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033Y, X034E, X034G, X034S, X035A, X035F, X035H, X035I, X035K, X035L, X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, X036A, X036C, X036E, X036F, X036G, X036H, X036I, X036L, X036M, X036N, X036P, X036Q, X036R, X036S, X036T, X036V, X036W, X036Y, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M, X038N, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038W, X038Y, X039A, X039E, X039G, X039H, X039N, X039Q, X039S, X039T, X039V, X039Y, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V, X040W, X040Y, X041C, X041D, X041E, X041N, X041Q, X042A, X042C, X042F, X042G, X042H, X042I, X042L, X042M, X042N, X042Q, X042S, X042T, X042V, X042Y, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046F, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X046W, X047A, X047C, X047E, X047F, X047G, X047H, X047K, X047L, X047M, X047N, X047Q, X047R, X047S, X047T, X047W, X048A, X048C, X048E, X048F, X048G, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049E, X049F, X049G, X049H, X049K, X049L, X049M, X049P, X049Q, X049R, X049S, X049T, X050C, X050F, X050H, X050I, X050L, X050N, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053I, X053K, X053L, X053M, X053P, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, X054G, X054H, X054I, X054K, X054L, X054M, X054N, 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X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248M, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250E, X250F, X250G, X250H, X250I, X250L, X250M, X250N, X250Q, X250S, X250V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X251S, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252P, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254D, X254G, X254N, X254P, X254S, X254T, X254V, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257A, X257C, X257E, X257F, X257G, X257H, X257I, X257K, X257L, X257M, X257P, X257S, X257T, X257V, X257W, X257Y, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I, X263L, X263M, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264P, X264Q, X264S, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266W, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267M, X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, X275W, X275W. Em contraste, não existem mutações identificadas em classificações iniciais de posições 64, 65 e 70 que foram associadas com um índice de desempenho maior do que 1,0 (PI>1,0) por pelo menos uma propriedade.

[000287] Nas classificações de variantes de GCI-PO36, pelo menos uma mutação nas seguintes 248 posições foi associada com um índice de desempenho maior do que 1 para ou BMI, ensaio de microamostra de CS-38 ou atividade de AAPF, e tinha um índice de desempenho de mais do que 0,8 para Estabilidade de LAS ou em um ensaio de TCA: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275. As mutações nestas posições podem ser combinadas para aperfeiçoar a atividade, enquanto mantém ou estabilidade ou expressão. As mutações nestas posições podem também ser combinadas para produzir variantes com estabilidade ou expressão aperfeiçoadas, enquanto retém ou intensifica a atividade.

[000288] A seguinte lista proporciona as substituições com um índice de desempenho maior do que 1 para ou BMI, ensaio de microamostra de CS-38, ou atividade de AAPF, e que tinha um índice de desempenho de mais do que 0,8 para Estabilidade de LAS ou em um Ensaio de TCA (conforme aqui usado, “X” se refere a qualquer aminoácido). Estas variantes podem ser combinadas para aperfeiçoar a atividade, enquanto mantém ou intensifica a estabilidade ou expressão, ou para aperfeiçoar a estabilidade ou expressão, enquanto mantém ou intensifica a atividade: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G, X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V, X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, 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X242D, X242F, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V, X243W, X244A, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244P, X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V, X244W, X244Y, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245R, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246E, X246F, X246G, X246H, X246I, X246L, X246M, X246N, X246Q, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X247A, X247C, X247D, X247E, X247F, X247G, X247H, X247I, X247K, X247L, X247M, X247N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248K, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248W, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249R, X249S, X249T, X249V, X249W, X249Y, X250A, X250C, X250F, X250I, X250L, X250M, X250Q, X250S, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, e X275W.

[000289] Em classificações de variantes de GCI-PO36, pelo menos uma mutação nas seguintes 204 posições foi associada com um índice de desempenho maior do que 0,8 para ou BMI, EGG ou atividade de AAPF, e tinha um índice de desempenho de mais do que 0,8 ambos em Estabilidade de LAS e em um Ensaio de TCA: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, e 275.

[000290] As mutações nestas posições podem ser combinadas para aperfeiçoar a atividade enquanto mantém ou estabilidade e/ou expressão. As mutações nessas posições podem também ser combinadas para produzir variantes com estabilidade e/ou expressão aperfeiçoadas, enquanto retém ou intensifica a atividade.

[000291] A seguinte lista proporciona as substituições com um índice de desempenho maior do que 0,8 para ou BMI, ensaio de microamostra de CS-38 ou Ensaio de atividade de AAPF, e que tinha um índice de desempenho de mais do que 0,8 para Estabilidade de LAS e em um Ensaio de TCA (conforme aqui usado, “X” se refere a qualquer aminoácido). Estas variantes podem ser combinadas para aperfeiçoar a atividade, enquanto mantém ou intensifica a estabilidade e/ou expressão, ou para aperfeiçoar a estabilidade e/ou expressão, enquanto mantém ou intensifica a atividade: X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, 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X040V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M, X043N, X043R, X043S, X043T, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L, X044M, X044N, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X047G, X047R, X048A, X048C, X048E, X048F, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y, X049A, X049G, X049H, X049S, X049T, X050F, X050H, X050I, X050L, X050T, X050V, X050Y, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, X053M, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053W, X053Y, X054A, X054C, X054D, X054E, X054F, 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X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R.

EXEMPLO 6 Avaliação Comparativa de Dados de Protease Variante

[000292] Neste Exemplo, os resultados dos experimentos conduzidos para determinar desempenho de limpeza, estabilidade de LAS/EDTA, atividade de AAPF e teor de proteína (testes de propriedades de interesse) de BPN’, GCI-P036 e proteases variante são comparados. Os detergentes usados e condições usadas são providos no Exemplo 1. Nas seguintes Tabelas, os resultados de “EGG” se referem aos resultados do ensaio de microamostra de CS-38 em CALGONIT® (WE ADW) conforme descrito na Tabela 1-1. Conforme descrito, a funcionalidade das proteases variantes é quantificada como um índice de desempenho (PI), que é a proporção de desempenho de uma variante para uma protease de referência. As classificações de PI aqui usadas incluem: Mutações superiores (PI > 1,0); Mutações neutras (PI > 0,5); Mutações não nocivas (PI > 0,05); e Mutações noci vas (PI < 0,05). AS variantes de BPN’ foram produzidas e ensaiadas conforme descrito em PCT/09/046066 e PCT/US09/046156, incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[000293] “Locais produtivos” são aqueles tendo pelo menos uma Mutação superior para qualquer propriedade. Locais “produtivos, não restritivos” são aqueles tendo >20% de mutações neutras (PI > 0,5) e pelo menos uma mutação superior (PI > 1,0) para qualquer propriedade testada (além da expressão de proteína). Na Tabela 6-1 abaixo, os resultados para variantes que contêm locais que encontram a definição de um local produtivo, não restritivo são mostrados como uma porcentagem (%) de variantes testadas que encontram a definição de uma Mutação superior (PI > 1).

[000294] Locais “altamente produtivos” são aqueles tendo ≥20% de mutações superiores (PI > 1) para pelo menos uma propriedade outra que a expressão de proteína (por exemplo, conforme indicado em um Ensaio de TCA). Na Tabela 6-2 abaixo, os resultados para variantes que contêm locais que encontram a definição de um local altamente produtivo são mostrados como uma porcentagem (%) de variantes testadas que encontram a definição de uma Mutação superior (PI > 1).

[000295] Locais “restritivos” são aqueles locais que têm menos do que 20% de mutações neutras para atividade e estabilidade. Na Tabela 6-3 abaixo, os resultados para variantes que contêm locais que encontram a definição de um local restritivo são mostrados como uma porcentagem (%) de variantes avaliadas que encontram definição de uma mutação neutra (PI > 0,5).

[000296] Brevemente, conforme determinado durante desenvolvimento da presente invenção, 10 posições na região madura e região de duas subtilisinas de referência são posições restritivas para atividade e estabilidade. Desse modo as 265 posições restantes na região madura de duas subtilisinas de referência são posições não restritivas (> 20% de mutações neutras) para atividade e estabilidade.

EXEMPLO 7 Avaliação de Remoção de Mancha por Variantes de Biblioteca Combinatorial de GCI P036

[000297] Neste Exemplo, os resultados para variantes de GCI-P036 foram testados para seu desempenho de remoção de mancha em detergente de lavagem de prato e líquido automático de aplicações de lavanderia são providos. A clonagem da biblioteca combinatorial foi realizada por Sloning BioTechnology usando-se a Tecnologia Slonomax. A preparação de amostras de protease variante foi realizada conforme descrito acima. Brevemente, bibliotecas variantes combinatoriais foram testadas em microamostra de sangue, leite, tinta (BMI) e ensaios de microamostra de CS-38 em detergentes representando várias geografias de mercado (por exemplo, pH diferente, temperatura, e/ou dureza de água), em ambas aplicações de lavanderia e lavagem de prato automática (ADW). Conforme descrito anteriormente, a funcionalidade de variantes de protease foi quantificada como um índice de desempenho (PI), que é a proporção de desempenho de uma variante para aquela de uma protease de referência. As substituições são listadas relativas a protease de referência de GCI- P036 usando-se numeração de BPN’ e o PI é determinado no relacionamento do GCI-P036 de referência. Dado é mostrado nas Tabelas 7-1 a 7-5.

[000298] Variantes de GCI-P036 foram testadas para seu desempenho de remoção de limpeza em aplicações de limpeza. A clonagem da biblioteca combinatorial foi realizada por Sloning BioTechnology usando-se a Tecnologia Slonomax. A preparação de amostras de protease variante foi realizada conforme previamente descrito. Brevemente, as variantes de MML foram testadas em ensaios de microamostras de CS-38 em microamostra de sangue, leite, tinta (BMI), usando-se os métodos do Exemplo 1. Conforme descrito anteriormente, a funcionalidade de variantes de protease foi quanti- ficada como um índice de desempenho (PI), que é a proporção de desempenho de uma variante àquela de uma protease de referência. As substituições são listadas relativas a protease de referência de GCI- P036 usando-se numeração de BPN’ e o PI é determinado no relacionamento ao GCI-P036 de referência. Os resultados são mostrados nas Tabelas 7-6 e 7-7.

Avaliação de Estabilidade de LAS/EDTA por Biblioteca de Variantes de Mutação Múltipla (MML) de GCI-P036

[000299] Variantes de GCI-P036 foram testadas para sua estabilidade após incubação em uma composição contendo estabilidade de LAS e EDTA. A clonagem da biblioteca combinatorial foi realizada por Sloning BioTechnology usando-se a Tecnologia Slonomax. A preparação de amostras de protease variante foi realizada conforme descrito acima. Brevemente, variantes de MML estavam em um ensaio de estabilidade de LAS/EDTA usando-se os métodos do Exemplo 1. Conforme descrito anteriormente, a funcionalidade de variantes de protease foi quantificada como um índice de desempenho (PI), que é a proporção de desempenho de uma variante àquela de uma protease de referência. As substituições são listadas relativas a protease de referência de GCIP036 usando-se numeração de BPN’ e o PI é determinado em relacionamento ao GCI-P036 de referência. Os resultados são mostrados na Tabela 7-8.

Avaliação de Teor de Proteína de Culturas de Variante de Biblioteca de Mutação Múltipla (MML) Expressando GCI-P036

[000300] Expressão recombinante de variantes de GCI-P036 foi medida por avaliação do teor de proteína de culturas no Ensaio de TCA do Exemplo 1. A clonagem da biblioteca combinatorial foi realizada por Sloning BioTechnology usando-se Tecnologia Slonomax. A preparação de amostras de protease variante foi realizada conforme descrito acima. Brevemente, variantes de MML foram testadas em um Ensaio de TCA usando-se os métodos do Exemplo 1. Conforme descrito anteriormente, a funcionalidade de variantes de protease foi quantificada como um índice de desempenho (PI), que é proporção de desempenho de uma variante àquela de uma protease de referência. As substituições são listadas relativas a protease de referência de GCI-P036 usando-se numeração de BPN’ e o PI é determinado no relacionamento ao GCI- P036 de referência. Os resultados são mostrados na Tabela 7-9.

EXEMPLO 8 Avaliação de Remoção de Mancha por Variantes de Biblioteca de Mutação Múltipla (MML) de GCI-P036

[000301] Os resultados de experimentos conduzidos para determinar atividade de remoção de mancha (ensaio de microamostra para determinar desempenho de limpeza em detergentes de lavagem de prato automática usando-se amostras de CS-38), estabilidade de LAS/EDTA, termo estabilidade, e determinação de proteína por um Ensaio de TCA (testes de propriedades de interesse) de variantes de GCI-P036 são mostrados na Tabela 8-1. Os resultados foram obtidos usando-se os métodos descritos no Exemplo 1, com as seguintes modificações para o ensaio de desempenho de remoção de mancha. Os detergentes de testes foram inativados por calor (CALGONIT® 5 em 1 e CASCADE® Complete) e a MTP foi vedada com folha adesiva e colocada em uma incubadora IEMS por 30 minutos com agitação a temperaturas indicadas.

[000302] Para teste do desempenho de remoção de mancha e estabi- lidade de clones variantes 1-44, sobrenadantes de cultura filtrados diluídos foram usados. Para clones 100-105, amostras purificadas em concentrações diferentes foram usadas. A média de valores de PI para clones 100-105 calculada a dosagens de 4ppm e 6 ppm é mostrada na Tabela 8-1. Para clones 47-50 e clone 106, concentrado filtrado ultraformulado (UFC) de amostras foram usados. Caldos de cultura de células de Bacillus subtilis expressando clones 47-50 foram centrifugados a 9000xg por 30 minutos e o sobrenadante filtrado através de um filtro Seitz-EKS Depth (Pall) em um funil Buchner, seguido por filtração de filtro estéril Seitz-EKS Depth sob pressão e armazenados a 4°C. O sobrenadante livre de célula resultante foi concentrado com uma unidade de filtração PALL UF, usando-se um filtro com um corte de 10 kDa. O concentrado ultrafiltrado resultante foi formulado pela adição de 51% (P/P) de propileno glicol e 1,2 % (P/P) de formato de sódio. Ácido fórmico foi usado para abaixar o pH para 6,0.

[000303] Conforme descrito anteriormente, as funcionalidades de variantes de GCI-P036 foram quantificadas como um índice de desempenho (Pi), que é a proporção de desempenho de uma variante para uma proteína de origem GCI-P036. ND indica “não determinado.”

Exemplo 9 Avaliação de Remoção de Mancha por Variantes de Biblioteca de Mutação Múltipla (MML) em Estudos de Aplicação de Lavanderia

[000304] Os resultados dos experimentos conduzidos para determinar a atividade de remoção de mancha (ensaio de microamostra para determinar desempenho de limpeza em aplicações de lavanderia) de variantes de GCI-P036 (clones 8, 47, 49 conforme descrito no Exemplo 8) são mostrados na Tabela 9-1. Os resultados foram obtidos usando-se os métodos descritos no Exemplo 1. Os detergentes de teste usados foram inativados por calor P&G TIDE® 2X (NA HDL) e P&G TIDE® (NA HDG). O desempenho de limpeza de microamostras manchadas de BMI foi testado usando-se 0,2 ppm das variantes a 25°C por 30 minutos com 1400 rpm de oscilação em um volume de 200 μL. Conforme descrito anteriormente, as funcionalidades de variantes de GCI-P036 foram quantificadas como um índice de desempenho (Pi), que é a proporção de desempenho de uma variante para uma proteína de GCI-P036 de origem. Proteínas de subtilisina FNA (BPN’-Y217L) e GCI-P036- S87N-G118V-S128L-P129Q-S130A foram também testadas.

Exemplo 10 Variantes de Protease com Titulações de Produção Aumentadas

[000305] Mutações dentro da região madura de GCI-P036 foram selecionadas baseado nos ganhos benéficos em titulação de proteína ou desempenho de lavagem de microamostra observado durante a superclassificação efetuada nas placas de microtitulação. As amostras de protease testadas nos exemplos anteriores foram obtidas usando-se um sistema de expressão de plasmídeo de replicação. Para a expressão das 45 variantes descritas neste exemplo, um gene etiquetado GCI- P036ci, que codifica a proteína GCI-P036 tipo selvagem, foi usado. Este gene sintético “ci” consiste em uma versão aperfeiçoada de códon baseada no uso de códon FNA (uma proteína expressa a níveis muito altos. Os ácidos nucleicos que codificam estas variantes foram introduzidos no gabarito de gene GCI-P036ci conforme descrito abaixo, para gerar uma série de plasmídeos no suporte p2JH (p2JH-GCI- P036ci, FIG. 3), um sistema de vetor de integração tratável para produção de proteína em grande escala. Este sistema de expressão de Bacillus de integração foi usado para avaliar as variantes listadas na Tabela 9-1 usando-se caldo de cultura de culturas de frasco de oscilar. A expressão de proteína e desempenho de microamostra foi novamente avaliado. Desde que certas variantes reveladas diminuam a atividade de protease versus o substrato suc-AAPF-pNA quando comparado ao tipo selvagem, um ensaio de titulação de eglin c foi usado para determinação da concentração de protease. Os resultados obtidos para eglin c e Ensaio de BMIs são mostrados na FIG. 4 e FIG. 5, respectivamente.

Plasmídeo de Integração

[000306] O plasmídeo de integração p2JH-GCI-P036ci foi montado usando-se um gene sintético de códon aperfeiçoado de GCI-P036 (GCI- P036ci), fundido nos oito códons da sequência de sinal AprE, sob o controle do promotor AprE e terminador FNBase (Wells et al., Acid nucleics Res, 11:7911-25, 1983). Na sequência de GCI-P036ci de p2JH- GCI-P036ci provida abaixo, a fonte em negrito e em itálico indica promotor AprE, a fonte padrão indica a região de sequência de sinal, a fonte sublinhada indica a região de sequência pro GCI-P036, a fonte com face em negrito indica o DNA que codifica região de protease madura GCI-P036, e a fonte em itálico sublinhada indica terminador FNBase. AATTCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTC GTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAA ATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGTTAAACAGCGG CGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCA TCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTT CTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAA AAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAG GTCATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGG AGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGAACATT TACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCG AGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGAT AAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCT ATTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTG AATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTG TGGATCGTCGCGTCGACCGCATTGCTGATTTCTGTTGCTTTTAGCT CATCCATCGCATCCGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAAT TGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGT TGAGGCAAATGACGAGGTAGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGT CGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTCTGTCC GTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGTTAGAGCTCGATCCA GCTATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACTACAATGGCGC AATCGGTACCATGGGGAATTAGCAGAGTACAAGCCCCAGCTGC ACATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCT TGATACCGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGG AGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGCAATG GACATGGCACTCATGTTGCCGGCACAATCGCGGCTCTTAACAAT TCAATTGGTGTTCTTGGCGTAGCGCCAAGCGCAGAACTATACGC TGTTAAAGTATTAGGAGCAAGCGGTTCAGGCTCTGTCAGCTCTAT TGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTT GCTAATCTTAGTTTAGGATCTCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAG CAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGC GGCCTCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCC GTTATGCGAACGCTATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAAC AACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGT CGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACTTACCCAGGTTCAACAT ATGCCAGCTTAAACGGTACATCAATGGCTACTCCTCATGTTGCA GGTGCGGCTGCACTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAA TGTACAAATCCGCAATCATCTTAAGAATACGGCAACTAGCTTAG GAAGCACAAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCT GCAACTCGTTAAAAGCTTAACTCGAGATAAAAAACCGGCCTTGGC CCCGCCGGTTTTTT (SEQ ID NO:8).

[000307] As características de p2JH-GCI-P036ci incluem: CAT = gene de resistência a cloranfenicol de pC194, origem pMB1 = origem de replicação de pBR322, bla = beta-lactamase de pBR322, promotor aprE = promotor transcricional, Peptídeo de Sinal = peptídeo de sinal, Pro Peptídeo = GCI-P036 pro região, GCI-P036ci Peptídeo Maturo = maturo GCI-P036, FNBase Termo = Terminador FNBase. A sequência de aminoácido do precursor GCI-P036 e prótese madura GCI-P036 é provida acima como SEQ ID NOS: 6 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Geração de Variantes Adicionais de GCI-P036

[000308] Mutagênese direcionada de local usando-se Kit Multi-site QuickChange (Stratagene) foi efetuada usando-se o plasmídeo p2JH- GCI-P036ci como um gabarito e conjuntos de iniciadores específicos de local, de avanço (F) e reverso (R) com as sequências mostradas na Tabela 9-2. Cinco microlitros do produto que sofreu mutação foi usado para transformar quimicamente células competentes de Top10 E.coli (Invitrogen) e colocados em LA + 50 ppm de carbenicillin para crescimento para seleção. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C.

[000309] Cinco transformantes por mutação foram selecionados e classificados para a presença de inserto usando-se contas de PCR (GE/Amersham) conforme instruções do fabricante. As sequências de iniciadores de PCR de inserção foram conforme segue: iniciador de avanço = ISH-PCR-GCI-P036-5832F 5’-acaaataggg gttccgcgca-3’ (SEQ ID NO: 97); e iniciador reverso = ISH-PCR-GCI-P036-1902R 5’- cgcaagaattg attggctcc-3’ (SEQ ID NO: 98). As condições de ciclização foram conforme segue: início quente a 95°C por 2 min, 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 min, reforço de iniciador a 53°C por 1 min, alongamento a 72°C por 1 min, em seguida manter a 4°C. Cinco microlitros de produto de PCR foi analisado por eletroforese de gel de agarose. Os produtos de PCR do tamanho de fragmento esperado de ~2 Kb foram purificados e sequenciados. Os clones com mutações verificadas foram expandidos para plasmídeo preps usando-se Kit QiaPrep Spin Miniprep (Qiagen).

[000310] Plasmídeos purificados foram sequenciados e 5 μl de plasmídeo foi transformado em células competentes de B. subtilis (fenótipo: ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::[xylR,pxylA-comK]), incubados por uma hora em oscilador a 37°C (250 rpm), em seguida colocados em LA + 1,6 de Leite Skim + 5 ppm de cloranfenicol e incubados durante a noite a 37°C. Dois transformantes (por mutação) que mostraram halos foram captados e subcultivados em LA + 1,6 de Leite Skim + 25 ppm de cloranfenicol para selecionar amplificação de gene adicional.

[000311] Colônias simples de placas frescas (pós-amplificação) foram captadas e transferidas em 5 ml de caldo de LB + 25 ppm de cloranfenicol e incubadas em um oscilador a 37°C (250 rpm) por 6-7 horas para gerar uma pré-cultura. Estoques congelados foram produzidos por mistura de 800 μl de alíquotas de pré-cultura com 400 μl de 50% (v/v) de glicerol estéril. Frascos de oscilar contendo 25 mL de meio semidefinido (carne de soja tamponada por fosfato e meio à base de ureia, contendo sais) foram inoculados com 1 mL de pré-cultura, e incubados em oscilador a 37°C (250 rpm) por 48 horas. Amostras foram tomadas a 18, 24, 42 e 48 horas para análise por SDS-PAGE, AAPF, ensaio de inibição de EglinC, e ensaio de desempenho de lavagem de BMI conforme descrito no Exemplo 1 acima.

Análise de Proteína

[000312] A análise de expressão de proteína em frascos de oscilar foi realizada por SDS-PAGE, com tituladores baseados em uma curva padrão de GCI-P036 purificado de concentração de proteína conhecida. Para SDS-PAGE, 10 μL de HCl 2M foi adicionado a 45 μl de sobrenadante de cultura e incubado em gelo por 10 minutos. Em seguida, 50 μL de 2X de tampão de amostra de glicina foi adicionado a cada amostra e 10 μL de cada mistura de amostra foi carregado em um 10 Bis-Tris gel e operado em tampão de MES a 200V por 30 min. O gel foi lavado três vezes em água deionizada, em seguida manchado com mancha SimplyBlue Safe (Invitrogen) por uma hora e a mancha retirada com água deionizada durante a noite.

[000313] A expressão de proteína foi também monitorada por um ensaio de inibição de eglin c. No caso de certas mutações, foi inferido que a mutação conduzida a uma redução de atividade de protease contra o substrato sintético suc-AAPF-pNA, quando uma estimativa da quantidade da variante por SDS PAGE não foi comparável a atividade da variante no substrato suc-AAPF-pNA. Por esta razão, ligação de eglin c foi também medida para eliminar inclinação potencial do ensaio de AAPF.

[000314] As atividades específicas relativas de variantes foram calculadas pela divisão da atividade específica de mutantes pela atividade específica do controle tipo selvagem. Tituladores de protease corrigidos (normalizados) foram obtidos pela divisão de tituladores de ensaio de atividade de AAPF por atividade específica relativa do mutante obtida pelo ensaio de inibição de eglin C. Tituladores de proteína normalizados para proteases de variante múltipla são mostrados na FIG. 4.

[000315] A análise de desempenho de variante por ensaio de lavagem de BMI foi conduzida conforme descrito no Exemplo 1, exceto que uma microamostra foi usada por cavidade e as proteases variantes foram dosadas a 0,5 ppm e incubadas a temperatura ambiente. As microamostras EMPA 116 BMI foram usadas como uma fonte de mancha, e pó de detergente de referência de ECE não-fosfato foi usado para teste de desempenho de limpeza sob condições alcalinas. A solução tampão foi produzida em 2 mM de carbonato de sódio (Na2CO3, MW = 105,99 g/mol, anidro) a pH 10,5. As concentrações finais de componentes de tampão foram conforme segue: 6 gpg de dureza de água, 6,16 g/L de detergente em pó de ECE-2 não-fosfato, 1,6 g/L de perborato de sódio tetra-hidrato (PB4), e 0,24 g/L de tetra-acetil etileno diamina (TAED). Diluições de enzima baseadas em titulações corrigidas de análise de inibição de EglinC foram realizadas em 10 mM de NaCl + 0,005 de tampão TWEEN®80. Os resultados para o ensaio de BMI são mostrados na FIG. 5. Várias proteases variantes (G95P, S126M, Q, e R, S9L e A106C com numeração de GCI-P036 = G97P, S128M, Q, e R, S9L e A108C com numeração de BPN’) mostraram produção aumentada em culturas líquidas mantendo desempenho de lavagem comparável a protease de referência de GCI-P036.

EXEMPLO 11 Geração de Variantes de Escada de Carga de GCI-P036

[000316] Este Exemplo descreve a produção de escada de carga de GCI-P036 e bibliotecas de carga combinatoriais. O teste das proteases variantes da presente invenção foi feito em comparação com uma protease(s) de referência para determinar um índice de desempenho (PI) para as proteases variantes.

Escadas de Carga

[000317] Variantes múltiplas de proteína estendendo-se por uma faixa de propriedades físicas de interesse são selecionadas de bibliotecas existentes ou são geradas por técnicas de mutagênese direcionada de local conforme conhecido na técnica (Ver, por exemplo, Pedidos dos Estados Unidos Nos. de Série 10/576.331, 11/581.102, e 11/583.334). Este conjunto definido de proteínas de sonda é, em seguida, ensaiado em um teste de interesse. Variantes de escada de carga de protease exemplares são mostradas nas seguintes Tabelas e ensaiadas conforme descrito aqui. Nestas tabelas, a mudança de carga é relativa à protease de referência, que neste exemplo é a protease tipo selvagem.

Geração de Bibliotecas de Carga Combinatorial de GCI-P036 (CCL)

[000318] O plasmídeo de pAC-GG36ci contendo o gene de códon aperfeiçoado foi usado para gerar CCL por DNA 2.0. Cepa de Bacillus subtilis(genótipo: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK- phleo) foi usada para transformações. Em adição, bibliotecas posicionais em cada um dos quatro locais em GCI-P036 protease que são mostradas na Tabela 10-2 foram produzidas. As variantes foram supridas como estoques de glicerol em placas de 96 cavidades.

[000319] O GCI-P036 CCL foi designado por identificação de quatro resíduos de aminoácidos de cavidade distribuída, de superfície exposta, polar não-carregados fora do local ativo. Estes resíduos são Ser-85, Gln-107, Ser-182, e Asn-242 (resíduos 87, 109, 188, e 248 em numeração de BPN’). Uma biblioteca combinatorial de 81 membros (G- 1 a G-81) foi criada por produção de todas as combinações de três possibilidades em cada local: tipo selvagem, arginina, ou ácido aspártico.

EXEMPLO 12 Desempenho de Remoção de Mancha de Variantes de Carga de GCI-P036

[000320] Neste Exemplo, os resultados para variantes de GCI-P036 testadas em microamostra de sangue, leite, tinta (BMI) e ensaio de microamostra de gemas de ovo cozidas em detergentes representando várias geografias de mercado (por exemplo, pH diferente, temperatura, e/ou dureza de água), em ambas aplicações de lavanderia e lavagem de prato automática (ADW) são providos. As geografias de mercado representadas nas Tabelas deste exemplo incluem NA (América do Norte), WE (Oeste Europeu), e WE (ADW), conforme descrito na Tabela 1-1. Na Tabela 12-1, os resultados para prato (isto é, “PI Prato”) são para ensaios conduzidos usando-se o ensaio de microtitulação de ovo cozido em CALGONIT® (Reckitt-Benckiser), a 40°C 12 gpg, pH 10, conforme descrito no Exemplo 1.

EXEMPLO 13 Composições detergentes de lavanderia líquido

[000321] Neste Exemplo, várias formulações para composições deter- gentes de lavanderia líquidos são providas. As seguintes composições detergentes de lavanderia líquido da presente invenção são preparadas conforme mostrado abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

#1: Adicionar solução aquosa de HCl 1 N para ajustar o pH líquido da fórmula na faixa de cerca de 3 a cerca de 5.

[000322] O pH dos Exemplos acima 13(I)-(II) é cerca de 5 a cerca de 7, e de 13(III)-(V) é cerca de 7,5 a cerca de 8,5.

EXEMPLO 14 Composições detergentes Líquido para Lavagem de Prato Manual

[000323] Neste Exemplo, várias formulações de detergente líquido de lavagem de prato manual são providas. As seguintes composições detergentes líquido de lavagem de prato manual da presente invenção são providas abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

O pH dos Exemplos 14(I)-(VI) é cerca de 8 a cerca de 11

EXEMPLO 15 Composições detergentes de lavagem de prato Líquida Automática

[000324] Neste Exemplo, várias formulações de detergente líquido de lavagem de prato automática são providas. As seguintes composições detergentes líquido de lavagem de prato automática da presente invenção são providas abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

EXEMPLO 16 Composições de Lavanderia Granulares e/ou em Tabletes

[000325] Este Exemplo proporciona várias formulações para detergentes de lavanderia granulares e/ou em tabletes. As seguintes composições de lavanderia da presente invenção, que podem estar na forma de grânulos ou tabletes são providas abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por peso. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

* Perfume, corante, abrilhantador / SRP1 / Na carboxi- metilcelulose/ fotoalvejamento / MgSO4 / PVPVI/ supressor de água de sabão/PEG molecular alto/argila.

EXEMPLO 17 Detergentes de lavanderia líquidos

[000326] Este Exemplo proporciona várias formulações para detergentes de lavanderia líquidos. As seguintes formulações de detergente de lavanderia líquido da presente invenção são providas abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

EXEMPLO 18 Detergente de lavagem de pratos de alta densidade

[000327] Este Exemplo proporciona várias formulações para detergente de lavagem de pratos de alta densidade. Os seguintes detergentes de lavagem de pratos de alta densidade compactos da presente invenção são providos abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo forumlador, baseado em suas necessidades.

*Abrilhantador / corante / SRP1 / Na carboximetilcelulose/ fotoalvejador / MgSO4 / PVPVI/ supressor de água de sabão /PEG molecular alto/argila.

[000328] O pH dos Exemplos 18(I) a (VI) é de cerca de 9,6 a cerca de 11,3.

EXEMPLO 19 Composições Detergentes em Tabletes

[000329] Este Exemplo proporciona várias formulações de detergente em tabletes. As seguintes composições detergentes em tabletes da presente invenção são preparadas por compressão de uma composição detergente de lavagem de prato granular a uma pressão de 13KN/cm2 usando-se uma prensa rotativa de 12 cabeças padrão. Em cada um,a destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

*Abrilhantador / SRP1 / Na carboximetilcelulose/ fotoalvejamento / MgSO4 / PVPVI/ supressor de água de sabão /PEG molecular alto/argila.

[000330] O pH dos Exemplos 19(I) a 19(VII) é de cerca de 10 a cerca de 11.5; pH de 19(VIII) é de 8-10. O peso do tablete dos Exemplos 19(I) a 19(VIII) é de cerca de 20 gramas a cerca de 30 gramas.

EXEMPLO 20 Detergentes de Limpeza de Superfície Dura Líquidos

[000331] Este Exemplo proporciona várias formulações para detergentes de limpeza de superfície dura líquidos. As seguintes composições detergentes de limpeza de superfície dura líquidos da presente invenção são providas abaixo. Em cada uma destas formulações, pelo menos uma variante de protease aqui provida é incluída a uma concentração de cerca de 0,0001 a cerca de 10 peso por cento. Em algumas concretizações alternativas, outras concentrações encontrarão uso, conforme determinado pelo formulador, baseado em suas necessidades.

O pH dos Exemplos 20(I) a (VII) é de cerca de 7,4 a cerca de 9,5.

Claims

1. Variante de subtilisina isolada de uma subtilisina de Bacillus, caracterizada pelo fato de que é uma forma madura tendo atividade proteolítica e de SEQ ID NO: 2, e em que a dita variante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com as substituições S87R, G118R, S128L, P129Q, S130A, N76D, S188D, e N248R, em que as posições são numeradas por correspondência com a sequência de aminoácido de B. amyloliquefaciens subtilisina BPN’ colocada como SEQ ID NO:1.

2. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de subtilisina como definida na reivindicação 1.

3. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um detergente líquido, em gel, em tablete, em pó e/ou granulado.

4. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é detergente de lavanderia ou detergente para lavar louça.

5. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende um detergente de lavanderia.

6. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o detergente de lavanderia é detergente de função pesada.

7. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos um agente de alvejamento.

8. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é um detergente isento de fosfato ou um detergente para água fria.

9. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos uma enzima adicional.

10. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a enzima adicional é selecionada a partir de hemicelulases, celulases, peroxidases, proteases, metaloproteases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, perhidrolasess, cutinases, pectinases, pectato liases, mananases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e milases, ou misturas destas.