BRPI0922448A2 - inibidor com base em peptídeo penetrante celular de quinases - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO DE INIBIÇÃO DE QUINASE NO TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO INFLAMATÓRIO. A presente invenção refere-se a composições de inibição de quinase contendo uma quantidade terapêutica de um peptídeo inibidor terapêutico que inibe pelo menos uma enzima quinase, métodos para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória, e métodos para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória utilizando as composições de inibição de quinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ' ÇÃO DE INIBIÇÃO DE QUINASE NO TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO INFLAMATÓRIO". | REFERÊNCIAS CRUZADAS Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao pedido provi- sional U.S. 61/121.396, depositado em 10 de dezembro de 2008, incorpora- do aqui por referência em sua totalidade.
Í DECLARAÇÃO DE FINANCIAMENTO DO GOVERNO A invenção descrita foi feita com o apoio do governo em Grant K25HL074968 emitido pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo tem cer- tos direitos na invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a biologia de célula, peptídeos penetrante celular, composições de peptídeo penetrante celular, e métodos deusodosmesmos, e métodos de construção de proteína.
ANTECEDENTES A conformação tridimensional de uma molécula de proteína é determinada por sua sequência de aminoácido, e os detalhes da conforma- ção de uma proteína determinam sua química.
Uma proteína geralmente consiste em um esqueleto de polipeptí- deo com cadeias laterais presas. A sequência das cadeias laterais quimica- mente diferentes do aminoácido torna cada proteína distinta. A estrutura do- Í brada de uma proteína é estabilizada por interações não covalentes (por e- xemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, e atrações de van der Wa- als) que formam entre as partes diferentes da cadeia de polipeptídeo, uma parte da cadeia e outra. A estabilidade de cada forma dobrada é determinada pela força combinada de grandes números de tais ligações não covalentes.
Cada proteína tem quatro níveis de organização estrutural. A sequência de aminoácido é a estrutura primária da proteína. A estrutura se- cundária é definida por padrões de ligações de hidrogênio entre os grupos amida e carboxila do esqueleto sem consideração de ligação de hidrogênio de cadeia lateral-cadeia principal e cadeia lateral-cadeia lateral (por exem-
plo, a hélice, B-folha). A estrutura terciária, a organização tridimensional to- tal de uma cadeia de polipeptídeo, é a maneira na qual as folhas e hélices da estrutura secundária de uma proteína se dobram sobre elas mesmas pa- ra definir a estrutura tridimensional.
A estrutura quaternária se refere à es- trutura completa de uma molécula de proteina formada como um complexo de mais do que uma cadeia de polipeptídeo,
Os domínios de proteína são unidades estruturais que se do- bram mais ou menos independentemente de cada outro para formar estrutu- ras compactas globulares.
Um domínio geralmente contém entre cerca de
40ecercade 350 aminoácidos, e a unidade modular da qual muitas proteí- nas maiores são construídas.
Os domínios diferentes de uma proteína ge- ralmente estão associados com as funções diferentes.
A estrutura final do-
, brada, ou conformação, adotada por qualquer cadeia de polipeptídeo geral- ' mente é aquela na qual a energia livre é minimizada.
Y 15 1. Quinases
Quinases são um grupo ubíquo de enzimas que catalisam a rea- ção de transferência de fosforila de um doador de fosfato (geralmente ade- nosina-S' -trifosfato (ATP)) para um substrato receptor.
Embora todas as quinases catalisem essencialmente a mesma reação de transferência de fosforila, elas exibem diversidade notável em sua especificidade de substra- to, estrutura, e as séries de reação nas quais elas participam.
Uma classifi- cação recente de todas as sequências quinase disponíveis (aproximadamen- te 60,000 sequências) indica que quinases podem ser agrupadas em 25 fa- mílias de proteínas homólogas.
Estas famílias de quinase são também mon-
tadasem 12 grupos dobrados com base na similaridade da dobra estrutural.
Além disso, 22 das 25 famílias (aproximadamente 98,8% de todas as se- quências) pertencem a 10 grupos dobrados para que a dobra estrutural seja conhecida.
Das outras 3 famílias, polifosfato quinase forma um grupo dupli- cado distinto, e as 2 famílias restantes são ambas quinases de membrana integrale compreendem o grupo duplicado final.
Estes grupos dobrados não somente incluem algumas das dobras de proteína mais amplamente disper- sas, tais como dobra do tipo de Rossmann (três ou mais cepas beta parale-
las ligadas por duas alfa hélices na beta-alfa-beta-alfa-beta de ordem topo- lógica), dobra do tipo de ferredoxina (uma dobra de proteina a+B comum com uma estrutura secundária de assinatura BaBBaB ao longo de seu esque- leto), dobra de TIM-barril (significando uma dobra de proteína conservada consistindo em oito a- hélices e oito B-cepas paralelas que se alternam ao longo do esqueleto de peptídeo), e dobra de B-barril antiparalela (um beta barril é uma beta-folha grande que se torce e enrosca-se para formar uma estrutura fechada na qual a primeira cepa é hidrogênio ligado ao último), po- rém também todas as classes principais (todos a, todos B, a+B, a/B) de es- truturas de proteina. Em um grupo duplicado, o núcleo do domínio de liga- ção de nucleotídeo de cada família tem a mesma arquitetura, e a topologia do núcleo de proteína é ou idêntico ou relacionado com permutação circular.
. A homologia entre as famílias em um grupo duplicado não está implicada. ' As quinases do Grupo 1 (23,124 sequências) incorporam proteí- Y 15 na S/T-Y quinase, proteína atípica quinase, lipídeo quinase, e enzimas ATP grasp e também compreendem a proteína S/T-Y quinase, e família de prote- ina atípica quinase (22,074 sequências). Estas quinases incluem: colina qui- nase (EC 2,7.1,32); proteína quinase (EC 2.7.137); fosforilase quinase (EC
2.7.1.38); homosserina quinase (EC 2,7.1.39); 1-fosfatidilinositol 4-quinase (EC2.7167);estreptomicina 6-quinase (EC 2.7.1.72); etanolamina quinase (EC 2.7,1.82); estreptomicina 3'-quinase (EC 2.7.1.87); canamicina quinase (EC 2,7.1.95); S-metiltiorribose quinase (EC 2.7.1.100); viomicina quinase (EC 2.7.1.103); [hidroximetilglutaril-CoA reductase (NADPH>2)] quinase (EC 2,7.1.109); proteína-tirosina quinase (EC 2.7.1.112); [de-hidrogenase de iso- citrato (NADP+)] quinase (EC 2.7.1.116); [cadeia leve de miosina] quinase (EC 2.7, 1.117); higromicina-B quinase (EC 2.7.1.119); proteina dependente de cálcio/calmodulina quinase (EC 2.7.1.123); rodopsina quinase (EC
2.7.1.125); [receptor beta-adrenérgico] quinase (EC 2,7.1.126); [cadeia pe- sada de miosina] quinase (EC 2.7.1.129); [proteina Tau] quinase (EC
2.7.1.135); macrolida 2'-quinase (EC 2.7.1.136); 1-fosfatidilinositol 3-quinase (EC 2.7.1.137); subunidade de [RNA-polimerase] quinase (EC 2.7.1.141); fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinase (EC 2.7.1.153); e fosfatidilinositol-4-
fosfato 3-quinase (EC 2.7.1.154). Grupo | também compreende a família de lipídeo quinase (321 sequências). Estas quinases incluem: |- fosfatidilinositol-4-fosfato 5-quinase (EC 2,7,1 ,68); | D-mio-inositol-trifosfato 3-quinase (EC 2.7.1.127); inositol-tetracisfosfato 5-quinase (EC 2,7.1 ,140); Iosfatidilinositol-5-fosfato 4-quinase (EC 2.7.1.149); 1-fosfatidilinositol-3- fosfato 5-quinase (EC 2.7.1.150); inositol-polifosfato multiquinase (EC
2.7.1.151); e inositol-hexacifosfato quinase (EC 2.7.4.21). Grupo | também compreende as ATP-grasp quinases (729 sequências) que incluem inositol- tetracisfosfato I-quinase (EC 2.7.1.134); piruvato, fosfato diquinase (EC
27.9.1);e piruvato, água diquinase (EC 2.7.9.2). As quinases do Grupo || (17,071 sequências) incorporam as qui- nases do tipo de Rossman. O Grupo |l compreende a família de P-alça qui- : nase (7,732 sequências). Estas incluem gliconoquinase (EC 2.7.1.12); fos- , forribuloquinase (EC 2.7.1.19); timidina quinase (EC 2.7.1.21); ribosilnicoti- Y 15 namida quinase (EC 2.7.1 ,22); defosfo-CoA quinase (EC 2.7.1.24); adenilil- sulfato quinase (EC 2.7.1.25); pantotenato quinase (EC 2.7.1.33); proteina quinase (bacteriana) (EC 2.7.1.37); uridina quinase (EC 2.7.1 48); chiquima- to quinase (EC 2.7.1.71); deoxicitidina quinase (EC 2.7.1.74); deoxiadenosi- na quinase (EC 2.7,1.76); polinucleotídeo 5'-hidroxil-quinase (EC 2.7, 1.78); 6-fosfofruto-2-quinase (EC 2.7.1.105); deoxiguanosina quinase (EC 2.7.1.1 13); tetra-acildissacarídeo 4'-quinase (EC 2.7,1.130); deoxinucleosídeo qui- nase (EC 2.7.1.145); adenosilcobinamida quinase (EC 2.7.1.156); polifosfato quinase (EC 2.7.4.1); fosfomevalonato quinase (EC 2.7.4.2); adenilato qui- nase (EC 2.7.4.3); nucleosídeo-fosfato quinase (EC 2.7.4.4); guanilato qui- nase (EC 2.7.4.8); timidilato quinase (EC 2.7.4.9); nucleosideo-trifosfato- adenilato quinase (EC 2.7.4.10); (deoxi)nucleosídeo-fosfato quinase (EC
2.7.4.13); citidilato quinase (EC 2.7.4.14); e uridilato quinase (EC 2.7.4.-). Grupo ll também compreende a família fosfoenolpiruvato carboxiquinase (815 sequências). Estas enzimas incluem proteína quinase (HPr quina- se/fosfatase) (EC 2.7.1.37); fosfoenolpiruvato carbóxiquinase (GTP) (EC
4.1.1.32); e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (ATP) (EC 4.1.1.49). Grupo |l também compreende a família de fosfoglicerato quinase (1,351 sequências).
Estas enzimas incluem fosfoglicerato quinase (EC 2.7.2.3) e fosfoglicerato quinase (GTP) (EC 2.7.2.10). Grupo Il também compreende a família de aspartoquinase (2,171 sequências). Estas enzimas incluem carbamato qui- nase (EC 2.7.2.2); aspartato quinase (EC 2.7.2.4); acetilglutamato quinase (EC 27.281); glutamato 5-quinase (EC 2.7.2.1) e uridilato quinase (EC
2.7.4.-). Grupo !l também compreende a família de quinase do tipo de fosfo- frutoquinase (1,998 sequências). Estas enzimas incluem 6- fosfofrutoquina- se (EC 2.7.1.1 1); NAD(+) quinase (EC 2.7.1.23); 1-fosfofrutoquinase (EC
2.7.1.56); difosfato-fructose-6-fosfato 1-fosfotransferase (EC 2.7.1.90); esfin- ganina quinase (EC 2.7.1.91); diacilglicerol quinase (EC 2.7.1.107); e cera- mida quinase (EC 2.7,1.138). Grupo Il também compreende a família do tipo de riboquinase (2,722 sequências). Estas enzimas incluem: glicoquinase : (EC 2,7.1,2); cetoexoquinase (EC 2.7.1.3); fructoquinase (EC 2.7.1.4); 6- ' fosfofrutoquinase (EC 2.7.1. 11); riboquinase (EC 2.7.1.15); adenosina qui- x 15 nase (EC 2.7.1.20); piridoxal quinase (EC 2.7.1.35); 2-de-hidro-3- deoxigli- conoquinase (EC 2.7.1.45); hidroximetilpirimidina quinase (EC 2.7.1.49); hi- droxietiltiazol quinase (EC 2.7.1.50); 1-fosfofrutoquinase (EC 2.7.1.56); ino- sina quinase (EC 2.7.1.73); 5-de-hidro-2-deoxigliconoquinase (EC 2.7.1.92); tagatose-6- fosfato quinase (EC 2.7.1.144); fosfofructoquinase dependente deADP(EC 2.7.1.146); glicoquinase dependente de ADP (EC 2.7.1.147), e fosfometilpirimidina QUINASE (EC 2.1 A.!). Grupo 1! também compreende a família de tiamina pirofosfoquinase (175 sequências) que inclui tiamina piro- fosfoquinase (EC 2.7.6.2). Grupo Il também compreende a família de glicera- to quinase (107 sequências) que inclui glicerato quinase ((EC 2.7.1.31).
As quinases do Grupo Ill (10.973 sequências) compreendem as quinases duplicadas do tipo de ferredoxina. O Grupo Ill também compreen- de a família de nucleosídeo-difosfato quinase (923 sequências). Estas en- Zzimas incluem nucleosídeo-difosfato quinase (EC 2.7.4.6). Grupo I!l também compreende a família HPPK quinase (609 sequências). Estas enzimas in- cluem 2-amino-4-hidróxi-B6-hidroximetildi-hidropteridina pirofosfoquinase (EC
2.7.6.3). O Grupo !l! também compreende a família de guanido quinase (324 sequências). Estas enzimas incluem guanidoacetato quinase (EC 2.7.3.1);
creatina quinase (EC 2.7.3.2); arginina QUINASE (EC 2.7.3.3); e lombricina quinase (EC 2.7.3.5). Grupo Ill também compreende a família de histidina quinase (9.117 sequências). Estas enzimas incluem proteína quinase (histi- dina quinase) (EC 2.7.1.37); [piruvato de-hidrogenase (lipoamida)] quinase (EC2.7.1.99); e [3-metil-2-oxibutanoato de-hidrogenase(lipoamida)] quinase (EC 2.7.1.115).
As quinases do Grupo IV (2.768 sequências) incorporam quina- ses do tipo de ribonuclease H. Estas enzimas incluem hexoquinase (EC
2.7.1.1); glicoquinase (EC 2.7.1.2); fructoquinase (EC 2.7.1.4); ramnuloqui- nase(EC 2.7.1.5); manoquinase (EC 2.7.1.7); gliconoquinase (EC 2.7.1.12); L-ribuloquinase (EC 2.7.1.16); xiluloquinase (EC 2.7.1.17); eritrito| quinase (EC 2.7.1.27); glicerol quinase (EC 2.7.1.30); pantotenato quinase (EC : 2.7.1.33); D-ribuloquinase (EC 2.7.1.47); L-fucoloquinase (EC 2.7.1.51); L- " xiluloquinase (EC 2.7.1.53); alose quinase (EC 2.7.1.55); 2-de-hidro-3- 1 15 deoxigalactonoquinase (EC 2.7.1.58); N-acetilglicosamina quinase (EC
2.7.1.59); N-acilmanosamina quinase (EC 2.7.1.60); polifosfato-glicose fosfo- transferase (EC 2.7.1.63); beta-glicosídeo quinase (EC 2.7.1.85); acetato quinase (EC 2.7.2.1); butirato quinase (EC 2.7.2.7); quinase de ácido graxo de cadeia ramificada (EC 2.7.2.14); e propionato quinase (EC 2.7.2.-). As quinases do Grupo V (1.119 sequências) incorporam TIM B/a-barril quinases. Estas enzimas incluem piruvato quinase (EC 2,7.1.40).
As quinases do Grupo VI (885 sequências) incorporam GHMP quinases. Estas enzimas incluem galactoquinase (EC 2.7.1.6); mevalonato quinase (EC 2.7.1.36) homosserina quinase (EC 2.7.1.39); L — arabinoquinase (EC 2.7.1.46); fucoquinase (EC 2.7.1.52); chiquimato quina- se (EC 2.7.1.71); 4-(citidina S"-difosfo)-2-C-metil-D-eritriol quinase (EC
2.7.1.148); e fosfomevalonato quinase (EC 2.7.4.2) As quinases do Grupo VII (1.843 sequências) incorporam quina- ses do tipo de AIR sintetase. Estas enzimas incluem tiamina-fosfato quinase (EC2.7.4.16)e selenida, água diquinase (EC 2.7.9.3).
As quinases do Grupo VIII (565 sequências) incorporam ribofla- vina quinases (565 sequências). Estas enzimas incluem riboflavina quinase
(EC 2.7.1.26).
As quinases do Grupo IX (197 sequências) incorporam di- hidroxiacetona quinases. Estas enzimas incluem glicerona quinase (EC
2.7.1.29).
As quinases do Grupo X (148 sequências) incorporam glicerato quinases putativos. Estas enzimas incluem glicerato quinase (EC 2.7.1.31).
As quinases do Grupo XI (446 sequências) incorporam polifosfa- to quinases. Estas enzimas incluem polifosfato quinases (EC 2.7.4.1).
As quinases do Grupo XII (263 sequências) incorporam quinases de membrana integral. O Grupo XIl compreende a família de dolicol quina- se. Estas enzimas incluem dolicol quinases (EC 2.7.1.108). O Grupo XII também compreende a família de undecaprenol quinase. Estas enzimas in- : cluem undecaprenol quinases (EC 2.7.1.66).
O As quinases desempenham papéis indispensáveis em numero- ' 15 sas séries de reação de sinalização e metabólicas celulares, e elas estão entre as enzimas melhor estudadas nos níveis estruturais, bioquímicos e celulares. Apesar do fato de que todas as quinases usam o mesmo doador de fosfato (na maioria dos casos, ATP) e catalisam aparentemente a mesma reação de transferência de fosforila, elas desempenham diversidade notável em suas duplicações estruturais e mecanismos de reconhecimento de subs- trato. Isto é provavelmente devido grandemente a natureza diversa extraor- dinária das estruturas e propriedades de seus substratos.
2. Proteínas quinases ativadas por proteína quinase ativada por mitó- geno (MK2 e MK3) Diferentes grupos de proteínas quinases ativadas por MAPK (MAP-KAPKs) foram definidos a jusante de proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs). Estas enzimas transduzem sinais para alvejar proteínas que não são substratos diretos dos MAPKs e, portanto, servem para reposi- cionar a sinalização dependente de fosforilação com cascatas de MAPK pa- ra diversas funções celulares. Um destes grupos é formado pelos três MAPKAPKs: MK2, MK3 (também conhecido como 3pK), e MK5 (também designado PRAK). A proteina quinase 2 ativada por proteína quinase ativa-
. da por mitógeno (também referida como "MAPKAPK2", "MAPKAP- K2", "MK2") é uma quinase da família de proteína quinase serina/treonina (Ser/Thr)).. MK2 é altamente homólogo a MK3 (aproximadamente 75% de identidade de aminoácido). Os domínios de quinase de MK2 e MK3 são a maioria similar (aproximadamente 35% a 40% de identidade) a proteína qui- nase dependente de cálcio/calmodulina (CaMK), fosforilase b quinase, e o domínio de quinase de terminal de C (CTKD) das isoformas de quinase S6 ribossômica (RSK). O gene mk2 codifica duas transcrições alternativamente emendadas de 370 aminoácidos (MK2A) e 400 aminoácidos (MK2B). O ge- nemk3 codifica uma transcrição de 382 aminoácidos.
As proteínas MK2- e MK3 são altamente homólogas, contudo MK2A possui uma região de termi- nal de C mais curta.
O terminal de C de MK2B contém uma sequência de localização nuclear de bipartite funcional (NLS) (Lys-Lys-Xaa1o-Lys-Arg-Arg- Lys-Lys) (SEQ ID NO: 45) que não está presente nas isoformas MK2A mais curtas, indicando que a divisão alternativa determina a localização celular das isoformas MK2. MK3 possui uma sequência de localização nuclear simi- lar.
A sequência de localização nuclear encontrada em ambos MK2B e MK3 abrange um domínio D (Leu-Leu-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys) (SEQ ID NO: 46) cujo estudo tem mostrado mediar a interação específica de MK2B e MK3 com p38aep388. MK2B e MK3 também possuem um sinal de exportação nucle- ar funcional (NES) localizado no terminal de N para o domínio NLS e D.
O NES em MK2B é suficiente para ativar a exportação nuclear em seguida ao estímulo, um processo que pode ser inibido por leptomicina B.
O terminal de N da sequência para o domínio catalítico em MK2 e MK3 é rica em prolina e contém um (MK3) ou dois (MK2) sítios de ligação de domínio de homologia 3 (SH3) putativos, cujos estudos mostraram, para MK2, mediar a ligação ao domínio de SH3 de c-Abl in vitro.
Estudos recentes sugerem que este domí-
nio está envolvido na migração de célula mediada por MK2. MK2B e MK3 estão localizados predominantemente no núcleo decélulas quiescentes ao mesmo tempo em que MK2A está presente no citoplasma.
Ambos MK2B e MK3 são rapidamente exportados para o cito- plasma através de um mecanismo dependente de proteína de conservação i 9/155 de região do cromossoma (CRM1) sob estímulo de tensão. A exportação nuclear de MK2B parece ser mediada por ativação de quinase, uma vez que a mutação fosfomimética de Thr334 na alça de ativação da quinase realça a localização citoplásmica de MK2B. Sem estar limitado pela teoria, é consi- derado que MK2B e MK3 podem conter um NLS constitutivamente ativo e um NES regulado por fosforilação.
MK2 e MK3 parecem ser expressos ubiquamente, com expres- são predominante nos tecidos do coração, do músculo esqueletal, e do rim.
2.1. Ativação Vários ativadores de p38a e p38B potencialmente estimulam a atividade de MK2 e MK3. p38 media a fosforilação in vitro e fosforilação in vivo de MK2 em quatro sítios direcionados a prolina: Thr25, Thr222, Ser272, : e Thr334. Destes sítios, somente Thr25 não é conservado em MK3. Sem : estar limitado por teoria, ao mesmo tempo em que a função de Thr25 fosfori- T 15 lado é desconhecida, sua localização entre os dois sítios de ligação de do- mínio de SH3 sugere que ele pode regular as interações de proteína- proteína. Thr222 em MK2 (Thr201 em MK3) está localizado na alça de ati- vação do domínio de quinase e foi mostrado ser essencial para a atividade de MK2 e MK3 quinase. Thr334 em MK2 (Thr313 em MK3) está localizado noterminal de C para o domínio catalítico e é essencial para a atividade de quinase. A estrutura de cristal de MK2 foi resolvida e, sem estar limitado a teoria, sugere que a fosforilação de Thr334 pode servir como um desvio para importação e exportação nuclear de MK2. A fosforilação de Thr334 também pode enfraquecer ou interromper a ligação do terminal de C de MK2 ao do- —míniocatalítico, expor o NES e promover a exportação nuclear.
Estudos mostraram que, ao mesmo tempo em que, p38 é capaz de ativar MK2 e MK3 no núcleo, evidência experimental sugere que a ativa- ção e exportação nuclear de MK2 e MK3 são acoplados por um desvio con- formacional dependente de fosforilação que também dita a estabilização e localização de p38, e a localização celular de p38 propriamente dito é con- trolada por MK2 e possivelmente MK3. Estudos adicionais mostraram que p38 nuclear é exportado para o citoplasma em um complexo com MK2 em seguida a fosforilação e ativação de MK2. A interação entre p38 e MK2 po- de ser importante para a estabilização de p38 uma vez que os estudos indi- cam que os níveis de p38 são baixos em células deficientes de MK2 e a ex- pressão de uma proteína MK? cataliticamente inativa restaura os níveis de ps38.
2.2. Substratos e Funções MK?2 compartilha muitos substratos com MK3. Ambas as enzi- mas têm preferências de substrato comparáveis e substratos de peptídeo fosforilados com constantes cinéticas similares. A sequência mínima reque- rida para fosforilação eficiente por MK2 foi constada ser Hyd-Xaa-Arg-Xaa- Xaa-pSer/Thr, onde Hyd é um resíduo hidrofóbico volumoso. Evidência experimental suporta uma função para p38 na regula- : ção de biossíntese de citocina e migração de célula. A deleção alvejada do . gene mk2 em camundongos sugeriu que embora p38 medie a ativação de ç 15 muitas quinases similares, MK2 procura ser a quinase principal responsável por estes processos biológicos dependentes de p38. A perda de MK2 leva (1) a um defeito na síntese induzida por lipopolissacarídeo (LPS) de citocinas tais como fator alfa de necrose de tumor (TNFa), interleucina-6 (IL-6), e in- terferon gama (IFN-y) e (ii) a alterações na migração de fibroblastos embriô- —nicosde camundongo, células do músculo liso, e neutrófilos. De acordo com um papel para MK2 em respostas inflamatórias, os camundongos deficientes de MK2 mostram susceptibilidade aumentada a infecção de monocitogenes de Listeria e morte neuronal mediada por inflamação reduzida em seguida a isquemia focal. Uma vez que os níveis de proteína p38 também são reduzi- dos significantemente em células deficientes de MK?2, foi necessário distin- guir se estes fenótipos foram devidos somente à perda de MK2. Para obter isto, os mutantes de MK2 foram expressos em células deficientes de MK2, e os resultados indicaram que a atividade catalítica de MK2 não foi necessária para restaurar os níveis de p38, porém foi requerido regular a biossíntese de citocina.
2.3. Regulação de translação de mRNA. Estudos têm mostrado que MK2 aumenta a produção de TNFa aumentando-se a taxa de translação deste MRNA; nenhuma redução signifi- cante na transcrição, processamento, e eliminação de TNFa pode ser detec- tada em camundongos deficientes de MK2. A série de reação de p38 é co- nhecida por desempenhar um importante papel na regulação da estabilidade de mRNA, e MK? representa um alvo provável pelo qual p38 media esta função. Estudos utilizando camundongos deficientes de MK2 indicaram que a atividade catalítica de MK2 é necessária para seus efeitos na produção e migração de citocina, sugerindo quem, sem estar limitado por teoria, MK2 fosforila alvos envolvidos na estabilidade de mMRNA. De acordo com isto, MK2 foimostrado ligar e/ou fosforilar a ribonucleoproteína nuclear heterogê- nea (hnRNP) tristetraprolina AO, a proteína de ligação de poli(A) PABPI, e HuR (um membro ubiquamente expresso da família elav (visual anormal embriônico-letal em Drospholia melanogaster) de proteína de ligação de , RNA). Estes substratos são conhecidos por ligarem-se ou copurificar com ' 15 mMRNAs que contêm elementos ricos em AU na região não transladada 3', sugerindo que MK2 pode regular a estabilidade de mRNAs ricos em AU tais como TNFa. Atualmente, desconhece-se se MK3 desempenha funções si- milares, porém o tratamento de LPS de fibroblastos deficientes de MK2 completamente aboliu a fosforilação de hnRNP AO, sugerindo que MK3 não é capazde compensar para a perda de MK2.
MK3 participa com MK2 na fosforilação da quinase de fator 2 de alongamento eucariótico (eEF2). A quinase de eEF2 fosforila e inativa e- EF2. A atividade de eEF2 é crítica para o alongamento de mRNA durante a translação, e fosforilação de eEF2 em Thr56 resulta na terminação de trans- laçãodemRNA. A fosforilação de MK2 e MK3 de eEF2 quinase em Ser377 sugere que estas enzimas podem modular a atividade de eEF2 e desse mo- do regula o alongamento de translação de mMRNA.
2.4. Regulação Transcricional por MK2 e MK3. MHK?2 nuclear, similar a muitos MKs, contribui com a fosforilação de ligação de elemento de resposta de CAMP (CREB), fator de resposta de soro (SRF), e fator de transcrição ER81. A comparação de células do tipo selvagem e deficientes de MK2 revelou que MK2 é a SRF quinase principal
| 12/155 induzida pela tensão, sugerindo um papel para MK2 na resposta imediata precoce mediada por tensão. Ambos MK2 e MK3 interagem com o fator de transcrição hélice-alça-hélice básico E47 in vivo e E47 fosforilado in vitro. Descobriu-se que a fosforilação mediada por MK2 de E47 reprime a ativida- de transcricional de E47 e desse modo inibe a expressão de gene depen- dente de E47, sugerindo que MK2 e MK3 podem regular a diferenciação de célula e expressão de gene específica de tecido.
2.5. Outros alvos de MK2 e MK3. Vários outros substratos de MK2 e MK3 também foram identifi- cados, refletivos das diversas funções de MK2 e MK3 em vários processos biológicos. A proteína de sustentação 14-3-37 é um substrato MK2 fisiológi- co. Estudos indicam que 14-3-37 interage com vários componentes de sé- ries de reação de sinalização de célula, incluindo proteínas quinase, fosfata- í ses, e fatores de transcrição. Estudos adicionais mostraram que a fosforila- ; 15 ção mediada por MK2 de 14-3-37 em Ser58 compromete sua atividade de ligação, sugerindo que MK2 pode afetar a regulação de várias moléculas de sinalização normalmente reguladas por 14-3-37. Estudos adicionais mostraram que MK2 também interage com e fosforila a subunidade p16 do complexo de Arp2 e Arp3 de sete membros (p16-Arc)em Ser77. p16-Arc tem funções na regulação do citoesqueleto de actina, sugerindo que MK2 pode estar envolvido neste processo. Outros estudos mostraram que a proteína de choque térmico pequena HSP27, pro- | teina específica de linfócito LSP-l, e vimentina são fosforiladas por MK2. HSP27 é de interesse particular porque ele forma oligômeros grandes que podem agir como acompanhantes moleculares e protegem células de cho- que térmico e estresse oxidante. Sob fosforilação, HSP27 perde sua capa- cidade de formar grandes oligômeros e é incapaz de bloquear a polimeriza- ção de actina, sugerindo que a fosforilação mediada por MK2 de HSP27 ser- ve como função homeostática destinada na regulação de dinâmicos de acti- na que de outro modo são desestabilizados durante o estresse. MK3 tam- bém foi mostrado fosforilar HSP27 in vitro e in vivo, porém seu papel durante as condições estressantes ainda não foi elucidado.
de catalisar sua reação. A ligação do inibidor é reversível ou irreversível. Os inibidores irreversíveis geralmente reagem com a enzima e alteram quimi- camente (por exemplo, modificando-se os resíduos de aminoácido principais necessários para atividade enzimática) de modo que não seja mais capaz de catalisar sua reação. Em contraste, os inibidores reversíveis ligam não co- valentemente e diferentes tipos de inibição são produzidos dependendo se estes inibidores ligam a enzima, o complexo de enzima-substrato, ou ambos. Os inibidores de enzima geralmente são avaliados por sua es- pecificidade e potência. O termo "especificidade" como utilizado neste con- texto se refere à ligação seletiva de um inibidor e sua falta de ligação à ou- tras proteínas. O termo "potência" como utilizado aqui se refere a uma cons- tante de dissociação do inibidor, que indica a concentração de inibidor ne- cessária para inibir uma enzima. To Os inibidores de proteínas quinase têm sido estudado para o uso i 15 como uma ferramenta na regulação da atividade de proteína quinase. Os inibidores têm sido estudados para uso com, por exemplo, quinase depen- dente de ciclina (Cdk), MAP quinase, serina/treonina quinase, proteína tiro- sina quinase da família de Src, tirosina quinase, calmodulina (CaM) quinase, caseína: quinase, quinase de ponto de checagem (Chkl), glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), quinase de terminal de N de c-Jun (JNK), proteína qui- nase 1 ativada por mitógeno (MEK), quinase de cadeia leve de miosina (MLCK), proteína quinase A, Akt (proteína quinase B), proteína quinase C, proteína quinase G, proteína tirosina quinase, Raf quinase, e Rho quinase.
3.2. Anticorpos Os anticorpos são proteínas do soro, as moléculas das quais possuem pequenas áreas de sua superfície que são complementares aos pequenos agrupamentos químicos em seus alvos. Estas regiões comple- mentares (referidas como os sítios de combinação de anticorpo ou sítios de ligação de antígeno) das quais há pelo menos duas por moléculas de anti- corpo, e em alguns tipos de moléculas de anticorpo dez, oito, ou em algu- mas espécies tanto quanto 12 podem reagir com sua região complementar correspondente no antígeno (o epitopo ou determinante antigênico) para li-
gar várias moléculas de antígeno multivalente umas às outras para formar uma treliça.
A unidade estrutural básica de uma molécula de anticorpo inteira consiste em quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias leves idênticas (L) (cada contendo cerca de 220 aminoácidos) e duas cadeias pesadas idênti- cas (H) (cada geralmente contendo cerca de 440 aminoácidos). As duas cadeias pesadas e duas cadeias leves são mantidas juntas por uma combi- nação de ligações não covalente e covalente (dissulfeto). A molécula é composta de duas metades idênticas, cada com um sítio de ligação de antí- geno idêntico composto da região de terminal de N de uma cadeia leve e a região de terminal de N de uma cadeia pesada.
Ambas as cadeias leves e pesadas geralmente cooperam para formar a superfície de ligação de anti- geno. ' Os anticorpos humanos mostram dois tipos de cadeias leves, K : 15 eb moléculas individuais de imunoglobulina geralmente são somente uma ou a outra.
No soro normal, descobriu-se que 60% das moléculas têm K determinantes e 30 porcento À.
Descobriu-se que muitas outras espécies mostram dois tipos de cadeias leves, porém suas proporções variam.
Por exemplo, no camundongo e rato, as cadeias À compreen- dem, porém alguns percentuais do total; no cão e gato, as cadeias K são muito baixas; o cavalo não parece ter qualquer cadeia K; os coelhos podem ter 5 a 40% de A, dependendo da cepa e alótipo de b-local; e as cadeias le- ves do frango são mais homólogas a À do que K.
Nos mamíferos, há cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, 19G,elgM, cada com sua própria classe de cadeia pesada - a (para IgA), ô (para IgD), € (para IgE), y (para IgG) e yu (para IgM). Além disso, há quarto subclasses de imunoglobulinas IgG (I9G1, I9G>2, I9G3, IgG) tendo cadeias pesadas yl, y2, y3, e y4 respectivamente.
Em sua forma secretada, IgM é um pentâmero composto de cinco unidades de quatro cadeias, dando um total de 10 sítios de ligação de antígeno.
Cada pentâmero contém uma có- pia de uma cadeia J, que é covalentemente inserida entre duas regiões de cauda adjacentes.
Todas as cinco classes de imunoglobulina diferem de outras pro- teínas do soro pelo fato de que elas mostram uma ampla faixa de mobilidade eletroforética e não são homogêneas. Esta heterogeneidade — em que as moléculas de IgG individuais, por exemplo, diferem uma da outra na carga líquida-é uma propriedade intrínseca das imunoglobulinas.
Os Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser gerados fundin- do-se as células do baço de camundongo de um doador imunizado com uma linhagem de célula de mieloma de camundongo para produzir clones de hi- bridoma de camundongo estabelecidos que crescem em meios seletivos.
Uma célula de hibridoma é uma célula híbrida imortalizada resultante da fu- são in vitro de uma célula B secretora de anticorpo com uma célula de mie- loma. A imunização in vitro, que se refere à ativação primária de células B específicas de antígeno na cultura, é outro meio bem estabelecido de produ- : zir anticorpos monoclonais de camundongo.
. 15 Diversas bibliotecas de genes variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (V. e V,) de imunoglobulina de linfócitos do sangue periférico também podem ser amplificadas por amplificação de reação em cadeia de polimera- se (PCR). O genes codificando cadeias de polipeptídeo únicas nas quais os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são ligados por um espaçador de polipeptídeo (cadeia única Fv ou scFv) podem ser feitos randomicamente combinando-se o genes V de cadeia pesada e leve utilizando PCR. Uma biblioteca combinatória então pode ser clonada para exibição na superfície de bacteriófago filamentoso por fusão a uma proteína de revestimento menor na ponta do fago.
A técnica de seleção guiada é com base no embaralhamento de gene de imunoglobulina V com os genes de imunoglobulina V de roedores. O método envolve (i) embaralhar um repertório de cadeias leves À humanas com o domínio de região variável de cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal de camundongo reativo com um antígeno de interesse; (ii) sele- cionarFabs meio humanos neste antígeno (iii) utilizar os genes de cadeia leve À selecionados como "domínios de acoplamento" para uma biblioteca de cadeias pesadas humanas em um segundo embaralhamento para isolar os fragmentos de Fab do clone tendo genes humanos de cadeia leve; (v) transfectar as células de mieloma de camundongo por eletroporação com vetores de expressão de célula de mamífero contendo os genes; e (vi) ex- pressar os genes V do Fab reativo com o antígeno como uma molécula de anticorpo A, IgG1 completa no mieloma de camundongo.
Como utilizado aqui, o termo "anticorpo" inclui, por modo de e- xemplo, ambos os anticorpos de ocorrência natural e de ocorrência não na- tural. Especificamente, o termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais e anticorpos monocionais, e fragmentos dos mesmos. Além disso, o termo "anticorpo" inclui anticorpos quiméricos e anticorpos completamente sintéti- cos, e fragmentos dos mesmos. Um epitopo ou determinante antigênico é um sítio de antigênico em uma molécula. Os epitopos/determinantes antigênicos sequenciais es- : sencialmente são cadeias lineares. Em estruturas ordenadas, tais como po- . 15 límeros ou proteínas helicoidais, os determinantes/epitopos antigênicos es- sencialmente seriam emplastros ou regiões limitadas dentro ou sobre a su- perfície da estrutura envolvendo cadeias laterais de aminoácido de diferen- tes porções da molécula que poderiam chegar perto uma da outra. Estes são determinantes conformacionais. Como utilizado aqui, um epitopo pode serum sítio de ligação de determinante antigênico/antígeno em um peptídeo de inibição de quinase. O epitopo pode ser sequência primária, secundária, ou terciária relacionada.
O princípio de complementariedade, que geralmente é compara- do com o ajuste de uma chave em uma fechadura, envolve forças de ligação relativamente fracas (ligações de hidrogênio e hidrofóbicas, forças van der Waals, e interações iônicas), que são capazes de atuar eficazmente somen- te quando as duas moléculas de reação podem se aproximar muito uma da outra e mesmo tão perto que os átomos constituintes de projeção ou grupos de átomos de uma molécula podem se ajustar em recessos ou depressões de complementariedade na outra. As interações de antígeno-anticorpo mos- tram um grau elevado de especificidade, que se manifesta em muitos níveis. Trazido para o nível molecular, especificidade significa que os sítios de com-
binação de anticorpos com um antígeno têm uma complementaridade de modo algum similar aos determinantes antigênicos de um antígeno não rela- cionado. Sempre que determinantes antigênicos de dois antígenos diferen- tes têm alguma similaridade estrutural, algum grau de ajuste de um determi- nanteno sítio de combinação de alguns anticorpos ao outro pode ocorrer, e que este fenômeno dá origem a reações cruzadas. As reações cruzadas são de grande importância no entendimento da complementaridade ou es- pecificidade de reações de antígeno-anticorpo, especificidade imunológica ou complementaridade torna possível a detecção de pequenas quantidades deimpurezas/contaminações entre os antígenos.
A especificidade das interações entre certos anticorpos e proteí- nas quinases foi estudada para uso na regulação da atividade de proteína quinase. Os anticorpos foram isolados para uso com, por exemplo, séries de : reação de MAP quinase, proteína quinase A, proteína quinase B, proteína : 15 quinaseG, serina/treonina quinases, glicogênio-sintase quinases-3 (GSK- 3), séries de reação de proteína quinase ativada por estresse (SAP), e tirosina quinases. Adicionalmente, os anticorpos foram isolados para uso com inibi- dores de proteína quinase e substratos de proteína quinase.
3.3. Peptídeos de Bloqueio Um peptídeo é um composto químico que é composto de uma cadeia de dois ou mais aminoácidos por meio dos quais o grupo carboxila de um aminoácido na cadeia é ligado ao grupo amino do outro através de uma ligação de peptídeo. Os peptídeos foram utilizados entre outras coisas no estudo de estrutura e função de proteína. Os peptídeos sintéticos podem ser utilizados entre outras coisas como sondas para observar onde as inte- rações de proteina-peptídeo ocorrem. Os peptídeos inibidores podem ser utilizados entre outras coisas em pesquisa clínica para examinar os efeitos de peptídeos na inibição de proteínas quinases, proteínas de câncer e outros distúrbios. O uso de vários peptídeos de bloqueio foi estudado. Por exem- plo, a quinase regulada por sinal extracelular (ERK), uma proteína quinase MAPK, é essencial para a proliferação e diferenciação celular. A ativação de
MAPKs requer um mecanismo de cascata por meio do qual MAPK é fosfori- lado por um MAPKK a montante (MEK) que é então, sucessivamente fosfori- lado por uma terceira quinase MAPKKK (MEKK). O peptídeo inibidor de ERK funciona como uma isca de MEK ligando-se ao ERK. Ele contém os 13 aminoácidos de terminal de amino (GMPKKKPTPIQLN) [SEQ ID NO: 1] de MEKI e se liga ao ERK. Isto bloqueia a ativação de ERK por MEK uma vez que ERK é incapaz de interagir com MEK. O peptídeo inibidor de ERK tam- bém contém uma sequência de transdução de proteína (PTD) (DRQI- KIWFONRRMKWKK) [SEQ ID NO: 2] derivada de Antennapedia que torna a célulade peptídeo permeável.
Outros peptídeos de bloqueio incluem peptídeo inibidor relacio- nado com autocamtida-2 (AIP). Este peptídeo sintético é um inibidor alta- mente específico e potente de proteina quinase |l dependente de ' Ca?*/calmodulina (CaMKII). AIP é um análogo não fosforilável de autocam- . 15 tida-2, um substrato de peptídeo altamente seletivo para CaMKII. AIP inibe CaMKII com um ICs9 de 100 nM (ICs595 é a concentração de um inibidor reque- rido para obter 50% de inibição). A inibição de AIP é não competitiva com respeito a syntide-2 (substrato de peptídeo CaMKII) e ATP porém competiti- vo com respeito a autocamtida-2. A inibição é não afetada pela presença ou ausência de Ca2+/calmodulina. A atividade de CaMKII é inibida completa- mente por AIP (1 uM) ao mesmo tempo em que PKA, PKC e CaMKIV são não afetados. A sequência de aminoácido de AIP é: KKALRRQE A VD AL (Ly s-Lys- Ala-Leu- Arg-Arg- Gin-Glu-Ala-Val-Asp- Ala-Leu) [SEQ ID NO: 3]. Outros peptídeos de bloqueio incluem peptídeo inibidor (CIP) de proteina quinase 5 de divisão de célula (Cdk5), Cdk5 fosforila a proteína de microtúbulo tau em fosfoepitopos específicos de Mal de Alzheimer quando se associa com p25. p25 é um ativador truncado, que é produzido do ativa- dor p35 fisiológico Cdk5 sob exposição aos peptídeos amiloide B (AP). Em infecções neuronais com CIP, CIPs seletivamente inibem a atividade de p25/Cdk5 e suprime a forforilação anormal tau em neurônios corticais. As razões para a especificidade demonstrada por CIP não são completamente entendidas.
Os peptídeos de bloqueio adicionais foram estudados para qui- nase 2 extracelular-regulada (ERK2), ERK3, p38/HOG;], proteína quinase C, caseína quinase Il, Ca?*/calmodulina quinase IV, caseína quinase Il, Cdka4, Cdk5, proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK), serina/treonina- proteina quinase PAK3, fosfoinositídeo (PI)-3 quinase, PI-5 quinase, PSTAI- RE (a sequência altamente conservada cdk), quinase ribossômica S6, GSK- 4, quinase de centro germinal (GCK), SAPK (proteína quinase ativada por tensão), SEKI (quinase de sinalização de tensão), e quinase de adesão focal (FAK).
3.44. Domínios de Transdução de Proteína Os domínios de transdução de proteína (PTDs) são uma classe de peptídeos capaz de penetrar a membrana de plasma de células de mamí- fero e de transportar os compostos de muitos tipos e pesos moleculares a- ' través da membrana. Estes compostos incluem moléculas efetoras, tais : 15 como as proteínas, DNA, peptídeos conjugados, oligonucleotídeos, e pe- quenas partículas tais como lipossomas. Quando os PTDs são quimicamen- te ligados ou fundidos a outras proteínas, as proteinas de fusão resultantes ainda são capazes de entrar nas células. Embora o mecanismo exato de transdução seja desconhecido, a internalização destas proteínas não é a- creditada ser mediada pelo receptor ou mediada pelo transportador. PTDs são geralmente 10-16 aminoácidos em comprimento e podem ser agrupados de acordo com sua composição, tal como, por exemplo, peptídeos ricos em arginina e/ou lisina. O uso de PTDs capazes de transportar moléculas efetoras em —célulastornou-se crescentemente atrativo no desígnio de fármacos uma vez que eles promovem a captação celular de moléculas de carga. Estes peptí- deos de penetração de célula, geralmente categorizados como anfipáticos (significando ter a terminação tanto polar quanto não polar) ou catiônicos dependendo de sua sequência, fornecem uma tecnologia de liberação não invasiva para macromoléculas. PTDs também geralmente são referidos co- mo "peptídeos de Trojan", "sequências de translocação de membrana", ou "proteínas permeáveis de célula" (CPPs). PTDs também podem ser utiliza-
dos para ajudar novos inibidores de HSP27 quinase a penetrar as membra- nas celulares (vide, os Pedidos dos Estados Unidos No. de Série 11/972.459, intitulado "Polypeptic Inhibitors of HSP27 Kinase and Uses The- reof,;" depositado em 10 de janeiro de 2008, e No. de Série 12/188.109, inti- tulado"Kinases Inhibitors and Uses Thereof," depositado em 7 de agosto de 2008, incorporado por referência em sua totalidade aqui).
3.4.1. Proteínas Contendo PTD Viral As primeiras proteínas a serem descritas como tendo proprieda- des de transdução foram de origem viral. Estas proteínas ainda são os mo- delos mais comumente aceitos para a ação de PTD. O Transativador de HIV-I de Transcrição (TAT) e proteina HSV-I| VP 22 são as proteínas conten- do PTD virais melhor caracterizadas. TAT (produto de gene transativador de HIV-I) é um polipeptídeo ] de 86 aminoácidos, que atua como um poderoso fator de transcrição do ge- : 15 noma de HIV-I integrado. TAT age no genoma viral estimulando a replica- ção viral em células latentemente infectadas. As propriedades de transloca- ção da proteina TAT permitem que ela ative as células infectadas quiescen- tes e a proteína pode estar envolvida na preparação de células não infecta- das para infecção subsequente regulando-se muitos genes celulares, inclu- indoas citocinas. O PTD mínimo de TAT é a proteina de 9 aminoácidos de sequência RKKRRQORRR (TATa49.57) [SEQ ID NO: 4). Os estudos utilizando um fragmento mais longo de TAT demonstraram transdução bem sucedida de proteínas de fusão até 120 kDa. A adição de múltiplos TAT-PTDs bem como derivados de TAT sintéticos foi demonstrada mediar a translocação de membrana. As proteínas de fusão contendo TAT PTD foram utilizadas como frações terapêuticas em experimentos envolvendo câncer, transportando uma proteína morta para dentro de células, e os modelos de doença de dis- túrbios neurodegenerativos. VP22? é a proteína de tegumento HSV-lI, uma parte estrutural do víriondeHSV. VP22 é capaz de translocação independente de receptor e se acumula no núcleo. Esta propriedade de VP22 classifica a proteina como um peptídeo contendo PTD. As proteínas de fusão compreendendo VP22 de tamanho natural foram translocadas eficientemente através da membrana de plasma.
3.4.2, Homeoproteínas com Propriedades de Translocação Intercelular As homeoproteínas são altamente conservadas, transativando os fatores de transcrição envolvidos e processos morfológicos. Elas se li- gam ao DNA através de uma sequência específica de 60 aminoácidos. O homeodomínio de ligação de DNA é a sequência mais altamente conservada da homeoproteína. Várias homeoproteínas foram descritas para exibir a ati- vidade do tipo de PTD; elas são capazes de translocação eficiente através de membranas celulares de uma maneira independente de energia e inde- pendente de endocitose sem especificidade do tipo celular. A proteína de Antennapedia (Antp) é um fator de transativação capaz de translocação através das membranas celulares; a sequência míni- ' ma capaz de translocação é um peptídeo de 16 aminoácidos corresponden- : 15 do à terceira hélice do homeodomínio da proteína (HD). A internalização desta hélice ocorre a 4ºC, sugerindo que este processo não é dependente de endocitose. Os peptídeos até 100 aminoácidos produzidos como proteí- nas de fusão com AntpHD penetram as membranas celulares. Outros ho- meodomínios capazes de translocação incluem homeodomínio Fushi tarazu (Ft))e Engrailed (En). Muitos homeodomínios compartilham uma terceira hélice altamente conservada.
3.4.3. PTDs Sintéticos Vários peptídeos de PTD foram sintetizados. Muitos destes peptí- deos sintéticos são com base em peptídeos existentes e bem documentados, aomesmo tempo em que outros são selecionados para seus resíduos básicos e/ou carga positiva, que geralmente são acreditados serem cruciais para a fun- ção de PTD. Os peptídeos sintéticos incluem, porém não estão limitados a, PTD4 (YARAAARQARA) [SEQ ID NO: 5); PTD-5 (RRQORRTSKLMKR) [SEQ ID NO; 6); MST (AAVLLPVLLAAR) [SEQ ID NO: 7]; L-R9 (RRRRRRRRR) [SEQ IDNO:8];e Peptídeo 2 (SGWFRRWKK,) [SEQ ID NO: 9).
3.4.4. PTDs Humanos PTDs humanos podem envolver emissões de imunogenicidade
231155 | potenciais em introdução em um paciente humano. Os peptídeos com se- quências PTD incluem: Hoxa-5, Hox- A4, Hox-B5; Hox-B6, Hox-B7, HOX-D3, GAX, MOX-2, e FtZPTD. Estas proteínas todas compartilham a sequência encontrada em AntpPTD (RQIKWFQNRRMKWKK) [SEQ ID NO; 10]. Ou- tros PTDs incluem llhota-1, interleucina-lB, fator de necrose de tumor, e a sequência hidrofóbica de peptídeo de sinal de fator de crescimento de fibro- blasto de Kaposi (K-FGF ou FGF-4), que é capaz de translocação indepen- dente de energia, receptor, e endocitose. Os PTDs não confirmados incluem membros da família do Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGF).
4 Distúrbios: Distúrbios Inflamatórios O termo "inflamação" como utilizado aqui se refere ao processo fisiológico pelo qual os tecidos vascularizados respondem à lesão. Vide, por exemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 4º Ed., William E. Paul, ed. Lip- : pincott-Raven Publishers, Filadélfia (1999) em 1051-1053, incorporado aqui . 15 por referência. Durante o processo inflamatório, as células envolvidas na desentoxicação e reparo são mobilizadas para o sítio comprometido por me- diadores inflamatórios. A inflamação é geralmente caracterizada por uma forte infiltração de leucócitos no sítio da inflamação, particularmente neutrófi- los (células polimorfonucleares). Estas células promovem o dano do tecido liberando-se substâncias tóxicas na parede vascular ou no tecido ileso. Tra- dicionalmente, a inflamação foi dividida em respostas aguda e crônica.
O termo "inflamação aguda" como utilizado aqui se refere à res- posta rápida, breve (minutos a dias), relativamente uniforme à lesão aguda caracterizada por acúmulos de fluido, proteínas de plasma, e leucócitos neu- trofíicos. Em inflamação aguda, a remoção dos estímulos para o recruta- mento de monócitos (que se tornam macrófagos sob ativação apropriada) no tecido inflamado, e macrófagos existentes saem do tecido através de linfáti- cos. Os exemplos de agentes prejudiciais que causam inflamação aguda incluem, porém não estão limitados a, patógenos (por exemplo, bactérias, vírus, parasitas), corpos estranhos de exógenos (por exemplo, asbestos) ou endógenos (por exemplo, cristais de urato, complexos imunes), fontes, e agentes físicos (por exemplo, queimaduras) ou químicos (por exemplo, cáus-
ticos). O termo "inflamação crônica" como utilizado aqui se refere à in- flamação que é de duração mais longa e que tem uma terminação vaga e indefinida.
A inflamação crônica ocorre quando a inflamação aguda persiste, ou através de depuração incompleta do agente inflamatório inicial ou como um resultado de múltiplos eventos agudos ocorrendo no mesmo local.
A inflamação crônica, que inclui o influxo de linfócitos e macrófagos e cresci- mento de fibroblasto, pode resultar na cicatrização de tecido em sítios de atividade inflamatória prolongada ou repetida.
Em inflamação crônica, os macrófagos existentes são presos no lugar, e a proliferação de macrófagos é estimulada.
Independentemente do agente iniciador, as alterações fisiológi- cas que acompanham a inflamação aguda abrange quatro características : principais: (1) vasodilatação, que resulta em um aumento líquido no fluxo . 15 sanguíneo, é uma das primeiras respostas físicas à lesão de tecido aguda; (2) em resposta aos estímulos inflamatórios, células endoteliais que forram os vênulos se contraem, alargando as junções intracelulares para produzir aberturas, levando a permeabilidade vascular aumentada que permite o va- zamento de proteínas de plasma e células sanguíneas para fora dos vasos sanguíneos; (3) inflamação geralmente é caracterizada por uma forte infiltra- ção no sítio da inflamação, particularmente neutrófilos (células polimorfonu- cleares). Estas células promovem a lesão de tecido liberando-se substân- cias tóxicas na parede vascular ou no tecido ileso; e (4) febre, produzida por pirogêneos liberados de leucócitos em resposta aos estímulos específicos.
Durante o processo inflamatório, mediadores inflamatórios solú- veis da resposta inflamatória trabalham juntos com os componentes celula- res de um modo sistêmico na tentativa de conter e eliminar os agentes cau- sadores do sofrimento físico.
O termo "mediadores inflamatórios" como utili- zado aqui se refere aos mediadores moleculares do processo inflamatório.
Estas moléculas solúveis, difusíveis agem tanto localmente no sítio do dano e infecção do tecido quanto em sítios mais distantes.
Alguns mediadores inflamatórios são ativados pelo processo inflamatório, ao mesmo tempo em que outros são sintetizados e/ou liberados de fontes celulares em resposta a inflamação aguda por outros mediadores inflamatórios solúveis. Os exem- plos de mediadores inflamatórios da resposta inflamatória incluem, porém não estão limitados a, proteases de plasma, complemento, cininas, coagula- çãoe proteínas fibrinolíticas, mediadores de lipídeo, prostaglandinas, leuco- trienos, fator de ativação de plaquetas (PAF), peptídeos e aminas, incluindo, porém não limitado a, histamina, serotonina, e neuropeptídeos, citocinas pró- inflamatórias, incluindo, porém não limitado a, interleucina-1, interleucina-4 (IL), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (11-8), fator de necrose de tumor (TNF), interferon-gama, e interleucina 12 (IL- 12).
Vários distúrbios associados com a inflamação sustentam uma variedade de doenças. Estes incluem, porém não estão limitados a, asma, doenças autoimunes, prostatite crônica, glomerulonefrite, doença inflamató- í ria do intestino (IBD), doença inflamatória pélvica (PID), lesão de reperfusão, artrite reumatoide, vasculite e hipersensibilidades. i Asma Asma é uma doença crônica envolvendo o sistema respiratório no qual as vias aéreas podem se contrair esporadicamente, ficam inflama- das, e são cobertas com quantidades excessivas de mucos, geralmente em resposta a um ou mais ativadores. Estes ativadores podem incluir, porém não estão limitados a, exposição a um estímulo ambiental tal como, porém não limitado a, alérgenos, fumaça, ar frio ou quente, perfume, pelo de ani- mal, ar úmido, dificuldade de exercício ou esforço ou emocional. O estreita- mento das vias aéreas apresenta sintomas tais como, porém não limitado a, respiração difícil, deficiência de respiração aperto no peio, tosse, dispneia, e estridor. Níveis de soro elevados de IL-6 em pacientes com asma compara- do com pacientes de controle normais estavam implicados na patofisiologia de asma brônquica. Yokoyama, A. e outros, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 151(5): 1354-58 (1995). Estudos também sugeriram, com base na observa- ção que níveis significantes de TNF-a e IL-6 foram detectados no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) de pacientes com asma, ao mesmo tempo em que níveis de IL-18 em pacientes BALF de pacientes com asma assin-
tomática, ativação de macrófagos alveolares e células T (Broide, D.H., e ou- tros J.
Allergy Clin.
Immunol. 89(5):958-67, 1992). Doenças Autoimunes Espondilite ancilosante (AS, doença de Bechterew, síndrome de Bechterew, doença de Marie Strumpell) é uma artrite crônica, inflamatória e doença autoimune.
Principalmente afeta as articulações da coluna vertebral € o sacroílio na pelve, causando eventual fusão da coluna vertebral.
Estudos reportaram que TNF-a e I1L-6 só aumentados em pacientes AS (ao mesmo tempo em que os níveis de IL-18 não são) e que IL-6 está estritamente cor- relacionada com a atividade da doença (Gratacos, J., e outros Br.
J.
Rheu- matol. 33(10):927-931. 1994). Os sintomas de AS incluem, porém não estão limitados a, dor crônica e rigidez na parte inferior da coluna vertebral ou al- gumas vezes em toda a coluna vertebral, geralmente com dor referida a uma : ou outra nádega ou parte posterior da coxa da articulação sacroilíaca, infla- : 15 mação dos olhos (iridocíclite, uveite) causando vermelhidão, dor nos olhos, perda de visão, flutuantes, fotofobia, fatiga náuseas, aortite, fibrose pulmonar apical, e ectasia das bainhas da raiz do nervo sacral.
A diabete tipo 1 é uma doença autoimune por meio da qual as células ilhota do pâncreas são atacadas por células T, o que torna o corpo incapaz de produzir insulina.
Foi reportado que insulate destrutiva de célula B está associada com a expressão aumentada de IL-1 e TNF-a.
Também, a expressão transgênica de citocinas em células 8 ilhotas pancreáticas de ca- mundongos não propensos a diabete e camundongos diabéticos não obesos (NOD) sugeriu papéis patogênicos para IFNa, IFNy, IL-2 e I1L-10 no desen- volvimento de diabete melito dependente de insulina (IDDM) e papéis prote- tores para IL-4, IL-6 e TNF-a (Rabinovitch, A.
Diabetes Metab.
Rev. 14:129- 151, 1998). Os sintomas de diabete tipo 1 incluem, porém não estão limita- dos a, poliúria, polidipsia e perda de peso.
A síndrome de Guilliame-Barre é uma polineuropatia desmielini- zante inflamatória aguda (um distúrbio autoimune que afeta o sistema nervo- so periférico). Frequentemente é severo, e geralmente exibe como uma pa- ralisia ascendente observada pela fraqueza nas pernas que se espalha para os membros superiores e o rosto ao longo com perda completa dos reflexos do tendão profundos. Estudos reportaram que a expressão diferencial de IL- i IB, IL-6, e TNF-a em um modelo animal da doença defende um papel princi- pal destas citocinas (Zhu, J., e outros Clin. Immunol. Immunopathol, 84(1):85-
94.1997). Ossintomas de síndrome de Guilliame-Barre incluem, porém não estão limitados a, fraqueza simétrica que geralmente afeta os membros infe- riores primeiro, e rapidamente progride de um modo ascendente, "pernas de borracha" com ou sem disestesias, fraqueza bubar (disfagia orofaríngea), dificuldades respiratórias, fraqueza facial, perda sensorial (propriocepção), amplas flutuações na pressão sanguínea, hipertensão ortostática, e arritmias cardíacas.
Lúpus é uma doença do tecido conjuntivo autoimune crônica, que afeta qualquer parte do corpo, causando inflamação e lesão do tecido.
' Lúpus mais geralmente prejudica o coração, articulações, pele, pulmões, : 15 vasos sanguíneos, fígado, rins e sistema nervoso. Estudos mostraram que IL-6 e TNF-a ativamente são sintetizados nos rins de pacientes com nefrite do lúpus (Herrera-Esparza, R., e outros Lúpus. 7(3): 154-158, 1998). Estu- dos adicionais reportaram que a expressão de TNF-a e IL- IB são elevadas em modelos de animais de nefrite do lúpus (Boswell, J., e outros J. Immunol.
141(9):3050-3054, 1988). Os sintomas de lúpus incluem, porém não estão limitados a, fadiga, febre, ganho ou perda de peso, dores nas articulações, rigidez, inchaço, eritema malar na face, lesões na pele, feridas da boca, alo- pecia, encurtamento da respiração, dor no peito, olhos secos e fenômeno de Raynaud.
Esclerose múltipla (MS) é uma doença autoimune que afeta os neurônios mielinados do cérebro e medula espinhal. MS é causada por da- no a bainha de mielina; impulsos nervosos são tornados lentos ou parados quando sua cobertura é danificada. Estudos reportaram expressão aumen- tada de TNF-a em casos de MS (Cannella, D., e outros Ann. Neurol.
37(4):424-435, 2004) e de IL-6 em lesões de pacientes de MS (Lock, C, e outros Nature Medicine, 8:500-508, 2002). Os sintomas de esclerose múlti- pla incluem, porém não estão limitados a, perda de equilíbrio, espasmos musculares, entopecimento ou sensação anormal em qualquer área, pro- blemas no movimento dos braços e pernas e ao andar, tremor em um ou mais braços ou pernas, constipação, vazamento de fezes, incontinência, vi- são dupla, desconforto nos olhos, dor facial, e perda de audição.
Psoríase é uma doença autoimune crônica, não contagiosa que afeta a pele e as articulações. Geralmente causa manchas vermelhas, es- camosas que aparecem na pele. Estas placas psoriáticas são áreas de in- flamação e produção de pele excessiva. A pele rapidamente se acumula nestes sítios e assume uma aparência branca prateada. As placas podem afetar qualquer área, incluindo o cotovelo, o joelho, o couro cabeludo, e os órgãos genitais. Estudos reportaram níveis elevados de TNF-a, IL- IB e IL-6 em pacientes de psoríase (Mizutani, H.. e outros J. Dermatol. Sci, 14(2); 145-
153. 1997). , Escleroderma é uma doença do tecido conjuntivo generalizada que envolve alterações na pele, vasos sanguíneos, músculos e órgãos inter- nos. Estudos reportaram que IL-6 foi detectada mais frequentemente em soros de controles, e que TNF-a foi detectado nos mesmos níveis em ambos os grupos de pacientes, ao mesmo tempo em que IL-18 não foi detectado em nenhum dos dois grupos (Needleman, B. W,, e outros Artrite Rheum. 35(1:67-72,1992). Os sintomas da pele incluem, porém não estão limitados a, branqueamento, coloração azulada ou vermelhidão dos dedos das mãos e dos pés em resposta ao calor e frio (fenômeno de Raynaud), perda de cabe- lo, escurecimento da pele, a pele fica anormalmente escura ou clara, en- grossamento da pele e mãos e antebraços cintilantes, e ulcerações nas pon- tasdos dedos das mãos ou dos pés. Os sintomas ósseos e musculares in- cluem, porém não estão limitados a, dor nas articulações, dormência e dor nos pés, dor, rigidez e inchaço dos dedos das mãos e articulações, dor no punho. Sintomas adicionais incluem, porém não estão limitados a, constipa- ção, diarreia, tosse seca, chiado, e dificuldade de deglutição. A doença de Sjorgen (doença de Mikulicz, síndrome seca) é um distúrbio autoimune no qual as células imunes atacam e restauram as glân- dulas exócrinas que produzem lágrimas e saliva. Os estudos mostraram que os níveis de IL- IB, IL-6 e TNF-a são significantemente diferentes entre paci- entes com doença de Sjorgen e controles saudáveis normais (Szodoray, P., e outros Scand.
J, Immunol, 59(6):592-599). Os sintomas de doença de Sjorgen incluem, porém não estão limitados a, boca seca, olhos secos, res- secamento da pele, ressecamento nasal e ressecamento vaginal.
Glomerulonefrite Glomerulonefrite (nefrite glomerular, GN) é uma doença renal caracterizada por inflamação dos vasos sanguíneos pequenos (glomérulos) dos rins.
Estudos reportaram que as citocinas inflamatórias IL-| e TNF-a ca- da desempenha um papel no processo imune/inflamatório em glomerulone- frite e que o bloqueio de sua ação reduz a doença (Atkins, R.C.. Nephrology. 7(s)):S82-S6, 2007); Johnson, RJ., Nephron. 73(4):506-514, 1996). Estudos adicionais reportaram que IL-6 também desempenha um papel em glomeru- " lonefrite (Takemura, T., e outros Virchows Archiv. 424(5):459-464, 1994). Os sintomas de glomerulonefrite incluem, porém não estão limitados a, e- dema, pressão sanguínea elevada, e a presença de células sanguíneas vermelhas na urina.
Dor Pélvica Crônica Urológica As síndromes de dor pélvica crônica urológica referem-se a sin- - 20 dromes de dor associadas com a bexiga (isto é, cistite intersticial (IC), sín- drome da bexiga dolorida (PBS)) e a glândula da próstata (prostatite crônica (CP), síndrome da dor pélvica crônica (CPPS)). Prostatite crônica/síndrome da dor pélvica crônica (CP/CPPS) é caracterizada por dor pélvica ou perineal sem evidência de infecção do trato urinário, durando mais do que 3 meses.
Estudos reportaram que os níveis de IL-IB, TNF- a e I1L-6 foram elevados significantemente em grupos tendo CPPS inflamatório e não inflamatório comparado com um grupo de controle (Orhan, L, e outros Int.
J.
Urol. 8(9):495-9, 2001; Alexander, R.B., e outros Urology. 52(5):744-749, 1998; Jang, T.L., e Schaeffer, AJ,, World J.
Urol. 21(2):95-99, 2003). Os sintomas destas síndromes podem aumentar e diminuir.
A dor pode variar de descon- forto suave a debilitante, e pode radiar das costas e reto, tornando difícil sen- tar.
Disúria (dificuldade ou dor à micção), artralgia (dor em uma articulação),
. mialgia (dor nos músculos), fadiga inexplicável, dor abdominal, dor em quei- mação constante no pênis, e frequência podem todos estar presentes.
A uri- nação frequente e urgência aumentada podem sugerir cistite intersticial (in- flamação centralizada na bexiga ao invés da próstata). A ejaculação pode ser dolorosa, uma vez que a próstata contrai durante a emissão de sémen, embora a dor pós-ejaculatória mediada pelo nervo e músculo seja mais co- mum.
Alguns pacientes reportam baixa libido, disfunção sexual e dificulda- des eréteis.
A dor após a ejaculação é uma queixa muito específica que dis- tingue CP/CPPS de homens com hiperplasia prostática benigna (BPH) ou homens normais.
Doença Inflamatória do Intestino (IBD) O termo "Doença Inflamatória do Intestino (IBD)" se refere a um grupo de condições inflamatórias do intestino grosso e intestino pequeno. í 1BDs incluem doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Outras formas : 15 delBD incluem colite colagenosa, colite linfocítica, colite isquêmica, colite, síndrome de Behcet, colite infecciosa e colite indeterminada.
Muitos destes distúrbios podem apresentar os sintomas de dor abdominal, vômito, diarreia, hematoquesia (sangue vermelho brilhante), perda de peso e várias queixas associadas ou doenças como artrite, pioderma gangrenoso, e colangite es- - 20 clerosante primária.
Diagnose é geralmente por colonoscopia com biopsia de lesões patológicas.
Estudos reportaram que as citocinas tais como IL-6, IL-I e TNF-a desempenham um papel central na modulação do sistema imune intestinal e que as concentrações mucosais e sistêmicas de muitas citocinas pró- e antiinflamatórias são elevadas em IBD (Rogler, G., e Andus, T.
World dJ Surg 22(4):382-9, 1998). Estudos também mostraram níveis elevados de TNF-a, IL- IB e IL-6 em pacientes de Crohn e que as concentrações de IL-IB e IL-6 no fluido sobrenadante de culturas de biopsia são positivamente corre- lacionadas com o grau de envolvimento do tecido medido por graduação tanto endoscópica quanto histológica (Reimund, J., e outros Gut, 39:684- 689,1996). Doença Inflamatória Pélviva (PID) A doença inflamatória pélvica (PID) se refere à inflamação do ú-
tero feminina, tubos falopianos, e/ou ovários quando progride para a forma- ção de cicatriz com adesões aos órgãos e tecidos próximos.
PID pode levar a necrose de tecido e formação de abscesso.
Os estudos reportaram que IL- IB, IL-6 e TNF-a são significantemente elevados em pacientes PID antes dotratamento antibiótico (em relação ao pós-tratamento) e que estas citoci- nas podem desempenhar um importante papel na patogênese de PID (Lee, S.
A., e outros Clin.
Chem.
Lab, Med. 46(7):997-1003, 2008). Lesão de Reperfusão A lesão de reperfusão se refere ao dano ao tecido causado quando o fornecimento de sangue retorna para o tecido após um período de isquemia.
A ausência de oxigênio e nutriente de sangue cria uma condição na qual a restauração da circulação resulta na inflamação e dano oxidativo através da indução de tensão oxidativa diferente da restauração da função É normal.
Os estudos reportaram que IL-6 previne o fígado contra isquemia : 15 quente/lesão de reperfusão através da sub-regulação de TNF-a (Camargo, C, e outros Hepatology. 26(6): 1513-1520, 2003). Os sintomas incluem, po- rém não estão limitados a, níveis elevados de glóbulos brancos, apoptose, e acúmulo de radical livre.
Artrite Reumatoide (RA)
- 20 Artrite reumatoide (RA) é um distúrbio crônico, sistêmico autoi- mune que mais geralmente causa inflamação e lesão de tecido nas articula- ções (artrite) e bainhas do tendão, juto com anemia.
RA também pode pro- duzir inflamação difusa nos pulmões, pericárdio, pleura e na esclera dos o- lhos, e também lesões nodulares, mais comuns no tecido subcutâneo sob a pele.
RA pode ser uma condição dolorosa e incapacitante, que pode levar a perda substancial do funcionamento e mobilidade.
Estudos reportaram que os níveis de IL-IB, IL-6 e TNF-a são elevados no soro de pacientes de artrite juvenil e RA (Ziolkowska, M., e outros J.
Immunol. 164:2832-2838, 2000). Os sintomas de RA podem se manifestar nas articulações (inchaço, dor,
dormência, uma sensação de queimação localizada, rigidez e movimento restrito); pele (nódulo reumatoide); pulmões (fibrose, síndrome de Caplan, efusões pleurais); rins (anlioidose renal); coração e vasos sanguíneos (ate-
rosclerose, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral); e olhos (epis- clerite, ceratoconjuntivite seca). Vasculite "Vasculite" se refere a um distúrbio caracterizado por destruição inflamatória de vasos sanguíneos (artérias e veias). Estudos reportaram que TNF-a, IL-l, e IL-6 são alvos biológicos potenciais para o tratamento de vas- culite sistêmica (Levine, S. M., e Stone, J.H. Best Prac. Res. Clin. Rheuma- tol. 15(2):315-333, 2001. Os sintomas de vasculite geralmente são sistêmi- cos com disfunção única ou de multiórgão. Estes sintomas podem incluir fadigam fraqueza, febre, artralgias, dor abdominal, hipertensão, insuficiência renal, e disfunção neurológica. Os sintomas adicionais podem incluir mono- neurite múltiplo, púrpura palpável (manchas roxas na pele) e síndrome pul- monar-renal. Vasculite por hipersensibilidade (HSV) é uma vasculite secun- . dária devido a uma resposta imune às substâncias exógenas. Estudos re- . 15 portaram que IL-6 e TNF-a do soro é significantemente mais elevado em paciente de HSV ativo do que em um grupo de controle saudável (Nalbant, S., e outros Rheumatol. Int. 22(6):244-248, 2002).
5. Distúrbios: Fibrose Fibrose é a formação ou desenvolvimento de tecido conectivo fi- - 20 brosoem excesso em um órgão ou tecido como um resultado de lesão ou inflamação de uma parte, ou de interferência com seu fornecimento de san- gue. Pode ser uma consequência da resposta de cicatrização normal levan- do a uma cicatriz, ou pode ser um processo reativo anormal. Há vários tipos de fibrose incluindo, porém não limitado a, fibro- se císticado pâncreas e pulmões, fibrose de injeção, fibrose endomiocárdi- ca, fibrose pulmonar idiopática do pulmão, fibrose mediastinal, mileofibrose, fibrose retroperitoneal, e fibrose sistêmica nefrogênica. A fibrose cística (CF, mucovidose, mucovisidose) é um distúrbio recessivo autossômico herdado. É um dos distúrbios genéticos fatais mais comuns nos Estados Unidos, afetando cerca de 30.000 indivíduos, e é mais prevalecente na população Caucasiana, ocorrendo em um a cada 3.300 nascidos vivos. O gene envolvido na fibrose cística, que foi identificado em
1989, codifica para uma proteína chamada de reguladora da condução de transmembrana de fibreose cística (CFTR), CFTR normalmente é expressa por epitélios exócrinos por todo o corpo e regula o movimento de íons de cloreto e glutationa dentro e fora das células.
Nos pacientes de fibrose císti- ca,asmutações no gene de CFTR levam a alterações ou perda total da fun- ção de proteína de CFTR, resultando em defeitos em propriedades de osmo- laridade, pH e redox de secreções exócrinas.
Nos pulmões, CF se manifes- ta sozinho pela presença de uma secreção mucosa espessa que obstrui as vias aéreas.
Em outros órgãos exócrinos, tais como as glândulas sudorífe- ras, CF pode não se manifestar sozinho por um fenótipo obstrutivo, porém de preferência por composição de sal anormal das secreções (portanto, o teste de osmolaridade de transpiração clínico para detectar os pacientes de CF). A causa predominante da doença e morte em pacientes de fibrose cis- í tica é doença pulmonar progressiva.
A espessura de muco de CF, que blo- queiaas passagens das vias aéreas, é acreditada provir de anormalidades na osmolaridade de secreções, bem como da presença de quantidades massivas de DNA, actina, proteases e enzimas pró-oxidativas se originando de um subgrupo de células inflamatórias, chamadas neutrófilos.
Na verdade, a doença pulmonar CF é caracterizada por reações inflamatórias mediadas - 20 por neutrófilo hiperativo precoce, para ambos os patógenos virais e bacteria- nos.
A síndrome hiperinflamatória de pulmões de CF tem vários fundamen- tos, entre os quais um desequilíbrio entre as quimiocinas pró-inflamatórias, principalmente IL-8, e citocinas anti-inflamatórias, principalmente IL- 10, foi reportado desempenhar um papel principal.
Vide, Chmiel e outros Clin Rev Alergy Immunol. 3(1):5-27 (2002). Estudos reportaram que os níveis de TNF-a, IL-6 e IL-IB foram mais elevados no fluido de lavagem broncoaveolar de pacientes de fibrose cística, do que em fluido de lavagem broncoalveolar de controle saudável (Bondfield, T.L., e outros Am.
J.
Resp.
Crit.
Care Med. 152(1):211 1-2118, 1995). A fibrose de injeção (IF) é uma complicação de injeção intra- muscular geralmente ocorrendo no quadríceps, tríceps e músculos glúteos de lactantes e crianças na qual os pacientes são incapazes de completa-
mente flexionar o músculo afetado.
Tipicamente é sem dor, porém progres- sivo.
Estudos reportaram que a osteopontina de glicoproteína (OPN) de- sempenha um papel na remodelagem de tecido (Liaw, L., e outros J.
Clin.
Invest. 101(7):1469-1478, 1998) e que este mediador pró-inflamatório induz a superregulação de IL-IB em monócitos humanos e uma produção realçada acompanhante de TNF-a e IL-6 (Naldini, A., e outros J.
Immunol. 177:4267- 4270, 2006; Weber, G.F., e Cantor, H.
Citocina Growth Factor Reviews. 7(3):241-248, 1996). A doença endomiocardíaca (síndrome hiperosinofílica (HS)) é um processo de doença caracterizado por uma contagem de eosinófilo per- sistentemente elevada (>1500 eosinófilos/mm?) no sangue.
HS afeta simul- taneamente muitos órgãos.
Estudos reportaram que IL-IB, IL-6 e TNF-a são expressos em níveis elevados em pacientes de miocardite induzida por vírus 7 (Satoh, M,, e outros Virchows Archiv. 427(5):503-509, 1996). Os sintomas : 15 podem incluir cardiomiopatia, lesões da pele, doença tromboembólica, doen- ça pulmonar, neuropatia, hepatoesplenomegalia (aumento coincidente do fígado e baço), e tamanho ventricular reduzido.
O tratamento pode incluir a utilização de corticosteroides para reduzir os níveis de eosinófilos. | A fibrose pulmonar idiopática (IPF, alveolite fibrosante criptogê- - 20 nica) é uma doença pulmonar intersticial progressiva crônica de causa des- conhecida.
Está associado com um padrão histológico de pneumonia inters- tícial usual e pode ser caracterizado por deposição anormal e excessivo de tecido fibrótico no interstício pulmonar com inflamação associada mínima.
Os estudos reportaram aumentos significantes na liberação de TNF-a e IL-6 em pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF) (Zhang, Y., e outros J.
Immunol. 150(9):4188-4196, 1993), que foi atribuído ao nível de expressão de IL-IB (Kolb, M., e outros J.
Clin.
Invest. 107(12): 1529-1536, 2001). Os sintomas incluem dispneia (respiração difícil), porém também inclui tosse não produtiva, baqueteamento (uma desfiguração dos dedos), e estalos (som de estalonos pulmões durante a inalação). Fibrose mediastinal (MF) é caracterizada por fibrose invasiva, calcificada centralizada nos linfonodos que bloqueia os vasos principais e vias aéreas. MF é uma complicação tardia de histoplasmose. Os estudos em modelos de murino de fibrose reportaram que IL- 1 B e TNF-a são signi- ficantemente elevados (Ebrahimi, B., e outros Am. J. Pathol. 158:2117-2125, 2001).
Mielofibrose (metaplasia mieloide, mielofibrose idiopática crôni- ca, mielofibrose primária) é um distúrbio da medula óssea na qual a medula óssea sofre de fibrose. Mielofibrose leva a insuficiência da medula óssea progressiva. A sobrevivência media é de cinco anos e a causa de morte in- clui infecção, hemorragia, falha do órgão, hipertensão portal, e transforma- ção leucêmica. Foi reportado que os níveis de TNF-a e IL-6 são elevados em modelos de animais de mielofibrose induzida por vírus (Bousse-Kerdiles, M., e outros Ann. Hematol. 78:434-444, 1999). Fibrose Retroperitoneal (doença de Ormond) é uma doença a- 7 presentando a proliferação de tecido fibroso no retroperitôneo. O retroperi- : 15 tôneoé o compartimento do corpo contendo os rins, aorta, trato renal, e ou- tras estruturas. Foi reportado que IL, IL-6 e TNF-a têm funções importan- tes na patogênese de fibrose retroperitoneal (Demko, T., e outros J. Am. Soc. Nephrol. 8:684-688, 1997). Os sintomas de fibrose retroperitoneal po- dem incluir, porém não estão limitados a, dor lombar, insuficiência renal, hi- - 20 pertensão, e trombose venosa profunda. Fibrose sistêmica nefrogênica (NSF, dermopatia fibrosante ne- frogênica) envolve fibrose da pele, articulações, olhos e órgãos internos. NSF pode estar associado com à exposição ao gadolineo. Os pacientes de- senvolveram grandes áreas de pele endurecida com plaquetas e nódulos fibróticos. Contraturas de flexão com uma limitação acompanhante de varia- ção de movimento também pode ocorrer, NSF mostra uma proliferação de fibroblastos dérmicos e células dendríticas, feixes de colágeno espessos, fibras elásticas aumentadas, e depósitos de mucina. Alguns relatos sugeri- ram que um estado pró-inflamatório fornece um fator de predisposição para causar a fibrose sistêmica nefrogênica (Saxena, S., e outros Int. Urol. Nep- hrol. 40:715-724, 2008), e que o nível de TNF-a é elevado em modelos de animais de fibrose sistêmica nefrogênica (Steger-Hartmann, T., e outros Ex-
per. Tox. Pathol. 61(6):537-552, 2009).
6. Distúrbios: Disfunção Celular Endotelial A disfunção celular endotelial (disfunção endotelial) se refere a disfunção fisiológica de processos bioquímicos normais realizados pelo en- —dotélio, tais como mediação de coagulação, de adesão de plaqueta, de fun- ção imune, e de controle de volume e teor de eletrólito dos espaços intra- vasculares e extravasculares. A disfunção endotelial pode resultar de pro- cessos de doença, tais como, por exemplo, choque séptico, hipertensão, hipercolesterolemia, e diabete bem como de fatores ambientais, tais como de tabagismo, produtos do tabaco. Estudos reportaram que sob a influência de citocinas, tais como IL-6, IL- IB, e TNF-qa, a dilatação dependente de en- dotélio pode ser comprometida e o endotélio pode perder sua capacidade de responder aos hormônios circulantes ou autacoides. Este efeito pode favo- 7 recer uma predisposição ao espasmo dos vasos, trombose ou aterogenese : 15 (Vila, E. e Salaices, M. Am. J, Physiol. Heart Circ. Physiol. 288:H1016- H1021, 2005). Além disso, estudos sugeriram que a superexpressão de IL- 6, como regulado por IL- IB and TNF-a, tem um importante papel na disfun- ção celular endotelial (Kornman, K. e outros J. Perio. Res. 34(7):353-357 (2006); Libby, P., e outros Circulation. 86 (6 Suppl): 11147-52 (1992)).
- 20 A disfunção endotelial pode ser caracterizada pela incapacidade das artérias e arteríolas dilatar em resposta a um estímulo apropriado. Por exemplo, células endoteliais disfuncionais (tendo vasodilatação reduzida) são incapazes de produzir óxido nítrico (NO) na mesma medida como célu- las endoteliais saudáveis. Esta diferença é detectável por uma variedade de métodos incluindo iontoforese de acetilcolina, administração intra-arterial de vários agentes vasoativos, aquecimento localizado da pele e oclusão arterial temporária inflando-se um manguito de pressão sanguínea para pressões elevadas. O teste também ocorre nas próprias artérias coronárias, entretan- to este procedimento invasivo normalmente não é realizado a menos que hajauma razão clínica para cateterização intracoronariana. Estas técnicas são consideradas estimular o endotélio a liberar NO que difunde no músculo liso vascular circundante causando a vasodilação.
37/155 | Os sistemas que permitem a liberação de proteínas recombinan- tes biologicamente ativas e terapêuticos de peptídeo foram o objetivo de numerosos estudos. Os sistemas para liberação localizada de agentes tera- pêuticos permitem que os efeitos biológicos de tais agentes alcancem maior eficácia.
Desafios persistem para liberar proteínas recombinantes para alvos desejados in vivo. A despeito dos desenvolvimentos na área de peptí- deos de transdução de proteína, os métodos de liberação clássicos de ge- nes de codificação de proteína através de vírus adenoassociado, adenoví- rus, lentivírus, vetores do vírus do herpes, e vetores de expressão de plas- mídeo continuam sendo a escolha preferida para expressão de proteínas.
A expressão de gene mediada por vetor viral é considerada o método mais eficiente e confiável para expressar as proteínas funcionais de : novo em tipos celulares mitoticamente ativos ou pós-mitoticamente bloquea- dosdevido à capacidade natural de tais vetores de liberar os genes específi- i cos para células permissivas. Todavia, vetores virais invariavelmente são requeridos em grandes doses para obter níveis de expressão terapêuticos das proteínas pretendidas. Além disso, os vetores virais podem integrar com o material de cromatina hospedeiro. Estas propriedades exercem efeitos - 20 prolongados sobre os sistemas genéticos do hospedeiro, e, portanto, a segu- rança continua uma questão seria para sua aplicação clínica final.
Um método alternativo, seguro é produzir proteínas recombinan- tes exogenamente e em seguida liberá-las sistemicamente ou por injeções localizadas nos órgãos alvos. Entretanto, a liberação e biodisponibilidade de proteínas recombinantes em células ou tecidos também precisa de melho- ramentos. Embora vários estudos tenham sugerido o potencial de PTD na descoberta de fármaco e transdução de proteínas até 120 kDa em diferentes células, as questões sobre potência de transdução de proteína mediada por PTD ainda continuam não resolvidas. Na verdade, alguns estudos demons- traram falhas em transdução de proteína de fusão mediada por PTD in vi- tro/in vivo bem como uma capacidade de induzir uma resposta imune. Além disso, alguns estudos mostraram que a expressão intracelular de proteínas
Cá 38/155 : de fusão de PTD ou outras proteínas não secretórias pode não obter a mesma biodistribuição como proteína recombinante, e a entrada de PTD através da barreira hematoencefálica continua elusiva.
A invenção descrita fornece peptídeos inibidores terapêuticos paraa inibição de quinases, uso de uma classe de peptídeos que inclui do- mínios terapêuticos e domínios de transdução de proteína como inibidores da atividade de quinase, e usos de PTDs como agentes terapêuticos para uma variedade de distúrbios.
SUMÁRIO A invenção descrita fornece composições de inibição de quinase contendo uma quantidade terapêutica de um peptídeo inibidor terapêutico que inibe pelo menos uma enzima quinase, métodos para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende a expressão de citocina inflama- tória, e métodos para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia com- preende expressão de citocina inflamatória utilizando as composições de inibição de quinase.
De acordo com um aspecto, a invenção descrita fornece uma composição de inibição de quinase para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória, a composição compreendendo (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptí- deo inibidor terapêutico, onde a quantidade terapeuticamente eficaz do pep- tídeo inibidor terapêutico inibe pelo menos uma enzima quinase, onde o pep- tídeo inibidor terapêutico compreende um primeiro domínio e um segundo domínio, onde o primeiro domínio compreende um domínio de transdução de proteina e está localizado próximo ao segundo domínio, onde o segundo domínio compreende um domínio terapêutico e está localizado próximo ao primeiro domínio, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável, onde a composição diretamente ou indiretamente reduz a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória. De acordo com uma modalidade, o peptídeo inibi- dorterapêutico é um peptídeo cuja sequência de aminoácido tem identidade substancial com a sequência de aminoácido Y ARRAAARQ ARAKAL AR- QLG V AA [SEQ ID NO; 71]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido KALNRQLG V AA [SEQ ID NO: 13). De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução do peptídeo inibidor tera- pêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido WLRRI- — KAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido YARAAARQ ARA [SEQ ID NO: 5]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido F AKL A ARL YRKA [SEQ ID NO: 43]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido FAKLAARL YRKA- LARQLGV AA [SEQ ID NO: 12]. De acordo com outra modalidade, o domí- " nio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identida- de substancial com a sequência de aminoácido KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêuti- co é um peptídeo cuja sequência de aminoácido tem identidade substancial com a sequência de aminoácido KAFAKLAARL YRKAL ARQLGV A A [SEQ i ID NO: 15]. De acordo com outra modalidade, o polipeptídeo compreende - 20 pelomenos um variante que é pelo menos 90% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, e SEQID NO: 15 e que inibe a excreção de TNF-a.
De acordo com outra modalidade, o poli- peptídeo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idên- tico a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, eSEQID NO: 15 e que inibe a excreção de I1L-18. De acordo com outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15 e que inibe a excreção de I1L-6. De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é uma proteína quinase ativada por proteina quinase ativada por mitógeno.
De acordo com outra modalida- de, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ativa- da por mitógeno 2. De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno 3. De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase depen- dente de Ca?**/calmodulina.
De acordo com outra modalidade, o distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamató- riaé pelo menos um distúrbio selecionado do grupo consistindo em asma, espondilite ancilosante, diabete Tipo |, síndrome de Guilliame-Barre, lúpus, psoríase, escleroderma, doença de Sjorgen, prostatite crônica, glomerulone- frite, doença inflamatória do intestino, doença inflamatória pélvica, lesão de reperfusão, artrite reumatoide, vasculite, vasculite por hipersensibilidade, choque endotóxico, pancreatite, doença inflamatória localizada, aterosclero- se, mal de Alzheimer, isquemia, hiperplasia íntima, estenose, restenose, lei- omioma, espasmos do músculo liso, angina, angina de Prinzmetal, braqui- cardia, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insuficiência renal, acidente vascu- " lar cerebral, hipertensão pulmonar, toxemia de gravidez, doença de Ray- ' 15 naud,uremia hemolítica, fissura anal, acalasia, impotência, enxaqueca, vas- culopatia, insuficiência cardíaca congestiva, miocárdio atordoado, disfunção diastólica, gliose, doença pulmonar obstrutiva crônica, osteopenia, artrite degenerativa, sepse, cirrose, fibrose intersticial, colite, apendicite, gastrite, laringite, meningite, otite, lesão cerebral traumática, lesão da medula espi- - 20 nhal, neuropatia periférica, esclerose múltipla, síndrome cardiometabólica, esteatoepatite não alcoólica, fibrose cística do pâncreas e pulmões, fibrose de injeção, fibrose endomiocardiana, fibrose pulmonar idiopática do pulmão, fibrose mediastinal, mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose sistêmica nefrogênica, câncer de mama, câncer de próstata e disfunção da célula en- dotelial De acordo com outra modalidade, a pelo menos uma citocina infla- matório é pelo menos uma dentre IL-6, TNFa, e IL- IB.
De acordo com outra modalidade, a composição está disposta sobre ou dentro de um dispositivo médico.
De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece um método para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória, o método compreendendo as etapas de (a) fornecer uma composição de inibição de quinase, onde a composição de
.- inibição de quinase compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo inibidor terapêutico, onde a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico inibe pelo menos uma enzima quina- se, onde o peptídeo inibidor terapêutico compreende um primeiro domínio e um segundo domínio, onde o primeiro domínio compreende um domínio de transdução de proteína localizado próximo ao segundo domínio, onde o se- gundo domínio compreende um domínio terapêutico localizado próximo ao primeiro domínio, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável; (b) adminis- trar a composição de inibição de quinase a um paciente em necessidade da mesma, desse modo inibindo pelo menos uma enzima quinase; e (c) reduzir a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória, por meio da qual tra- tando o distúrbio.
De acordo com uma modalidade, o peptídeo inibidor tera- pêutico é um peptídeo cuja sequência de aminoácido tem identidade subs- tancial com a sequência de aminoácido YARRAAARQARAKALARQLGVAA [SEQID NO: 71]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido KALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 13]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor tera- pêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido WLRRI- KA WLRRIKA [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, o domí- nio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identida- de substancial com a sequência de aminoácido YARAAAROQARA [SEQ ID NO: 5]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de pro- teíina do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a se- — quênciade aminoácido F AKL AARL YRKA [SEQ ID NO: 43]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoá- cido F AKL A ARL YRKAL ARQL GVAA [SEQ ID NO: 12]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico tem identidade substancial com a sequência de aminoácido KA- FAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo cuja sequência de aminoácido tem identidade substancial com a sequência de aminoácido KAF AKLAARL YRKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 15]. De acordo com outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13,eSEQIDNO:15 e que inibe a excreção de TNF-a.
De acordo com outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15 e que inibe a excreção de IL-18. De acordo com outra modalidade, o polipeptideo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15 e que inibe a ex- creção de IL-6. De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é uma proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno.
De a- 7 cordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno 2. De acordo com outra modali- | dade, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ati- vada por mitógeno 3. De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase dependente de Ca?*/calmodulina.
De acordo com outra modalidade, o distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expres- - 20 sãode citocina inflamatória é pelo menos um distúrbio selecionado do grupo consistindo em asma, espondilite ancilosante, diabete Tipo |, Síndrome de Guilliame-Barre, lúpus, psoríase, escleroderma, doença de Sjorgen, prostati- te crônica, glomerulonefrite, doença inflamatória do intestino, doença infla- matória pélvica, lesão de reperfusão, artrite reumatoide, vasculite, vasculite por hipersensibilidade, choque endotóxico, pancreatite, doença inflamatória localizada, aterosclerose, mal de Alzheimer, isquemia, hiperplasia íntima, estenose, restenose, leiomioma, espasmos do músculo liso, angina, angina de Prinzmetal, braquicardia, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insuficência renal, acidente vascular cerebral, hipertensão pulmonar, toxemia de gravi- dez, doençade Raynaud, uremia hemolítica, fissura anal, acalasia, impotên- cia, enxaqueca, vasculopatia, insuficiência cardíaca congestiva, miocárdio atordoado, disfunção diastólica, gliose, doença pulmonar obstrutiva crônica,
. osteopenia, artrite degenerativa, sepse, cirrose, fibrose intersticial, colite, apendicite, gastrite, laringite, meningite, otite, lesão cerebral traumática, le- são da medula espinhal, neuropatia periférica, esclerose múltipla, síndrome cardiometabólica, esteatoepatite não alcoólica, fibrose cística do pâncreas e pulmões, fibrose de injeção, fibrose endomiocardiana, fibrose pulmonar idio- pática do pulmão, fibrose mediastinal, mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose sistêmica nefrogênica, câncer de mama, câncer de próstata, e dis- função da célula endotelial. De acordo com outra modalidade, a pelo menos uma citocina inflamatória é pelo menos uma das IL-6, TNFa, e IL- IB. De acordo com outra modalidade, administração da etapa (a) é implantando-se um dispositivo bioquímico, onde a composição fica disposta sobre ou dentro do dispositivo. De acordo com outra modalidade, a etapa de administração (a) é parenteralmente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 mostra um plote de atividade (% relativo ao controle) versus concentração de peptídeo inibidor (uM). A Figura 1 descreve SEQ ID NOs: 5, 30, 67-70 e 16, respectivamente, em ordem de aparência.
Figura 2 mostra um plote de atividade (% relativo ao controle) versus concentração de peptídeo inibidor (uM). A Figura 2 descreve SEQ ID NOs:14,12,15,11e16, respectivamente, em ordem de aparência.
Figura 3 mostra um plote de velocidade de reação (RFU/s) ver- sus concentração de peptídeo inibidor de MK2 (uM). RFU/s = unidades de fluorescência relativa por segundo. A Figura 3 descreve SEQ ID NOs: 22-28 e 13, respectivamente, em ordem de aparência.
Figura 4 mostra um plote de velocidade de reação (RFU/s) ver- sus concentração de peptídeo inibidor MK2 (uy). RFU/s = unidades de fluo- rescência relativa por segundo. A Figura 4 descreve “KALNRQLGVAA” como SEQ ID NO: 13.
S Figura 5 mostra um plote de velocidade de reação (RFU/s) ver- sus concentração de peptídeo inibidor MK2 (uM). RFU/s = unidades de fluo- TSPQUE-SE página ASH Ea ET Ea Es E RE EEE ETR Re RO OT ATTETRETEEo,
43a/155 rescência relativa por segundo.
A Figura 5 descreve SEQ ID NOs: 29-30, 14 e 13, respectivamente, em ordem de aparência.
Figura 6 mostra um plote de velocidade de reação versus (RFU/s) concentração de peptídeo inibidor MK2 (uM). RFU/s = unidades de fluorescência relativa por segundo.
A Figura 6 descreve SEQ ID NOs: 32, 31, 5 e 13, respectivamente, em ordem de aparência.
Figura 7 mostra um plote da concentração média de IL-6 (pg/ml/10º células) contra tempo.
YARA = YARAAARQ ARAKALARQLGV /
AA [SEQ ID NO: 11]. 1 — significantemente mais elevado do que 1 ng/mL de amostras tratadas com IL-18. * = significantemente menor do que 1 ng/ml de amostras tratadas com IL-18B. As barras de erro representam desvio pa- drão entre as três amostras. Figura 8 mostra um plote da concentração média de IL-6 (Pg/ml/ 10º células) contra tempo. YARA = YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11); FAK = FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]. * - significantemente menor do que 1 ng/mL de amostras tratadas com TNF-a. As barras de erro representam desvio padrão entre as três amostras, Figura 9 mostra um plote da concentração média de IL-6 (Pg/ml/10º células) contra tempo. YARA = YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11); FAK = FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]. * = significantemente menor do que 10 ng/mL de amostras tratadas com TNF- a. As barras de erro representam desvio padrão entre as três amostras. Figura 10 mostra um gráfico da concentração média de IL-IB (pg/ml) de cada grupo de tratamento (i) MK2i a ImM (peptídeo inibidor tera- pêutico YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11J)) com TNF-a (5 ng/ml); (ii) MK2i a 3 mM com TNF-a (5 ng/ml); (iii) MK2i a 1 mM com TNF-a (10 ng/ml); e (iv) MK2i a 3 MM com TNF-a (10 ng/ml). - 20 Figura 11 mostra um gráfico da concentração média de IL-6 (pg/ml) de cada grupo de tratamento (i) controle negativo (média somente); (ii) TNF-a (5 ng/ml); (iii) TNF-a (10 ng/ml); (iv) TNF-a (5 ng/1) e MK2i (peptí- deo inibidor terapêutico a 1 MM YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11)); (v) TNF-a (10 ng/ml) e MK2i (1 mM); (vi) TNF-a (5 ng/ml) e MK2i (3 mM);e(vii) TNF-a (10 ng/ml) e MK2i (3 mM).
DESCRIÇÃO DETALHADA A invenção descrita fornece composições de inibição de quinase terapêuticas e métodos úteis para inibir proteínas quinases ativadas por pro- teínas quinases ativadas por mitógeno. “GLOSSÁRIO As abreviações utilizadas aqui para aminoácidos são aquelas abreviações que são convencionalmente utilizadas: A= Ala= Alanina;
R'=Arg=Arginina; N=Asn=Asparagina; D=Asp=Ácido aspártico; C=Cys=Cisteina; Q-GIn=Glutamina; E=Glu-Ácido glutâmico; G=Gly=Glicina; H=His=Histidina; I=lle=Isoleucina; L-Leu=Leucina; K=Lys=Lisina; M YMet=Metionina; F=Phe=Fenilalanina; P=Pro=Prolina; S=Ser=Serina; T=Thr=Treonina; W=Trp=Triptofano; Y=Tyr=Tirosina; V=Val=Valina. Os a- minoácidos podem ser L- ou D-aminoácidos. Um aminoácido pode ser subs- títuído por um aminoácido sintético que é alterado apara aumentar a meia vida do peptídeo ou aumentar a potência do peptídeo, ou aumentar a biodis- ponibilidade do peptídeo.
O termo "administrador" como utilizado aqui se refere a distribui ção, fornecimento, aplicação, aplicação, divisão ou contribuição. Os termos "administrar" ou "administração" são utilizados alternadamente e incluem administração in vivo, bem como administração diretamente ao tecido ex ' vivo. Geralmente, as composições podem ser administradas sistemicamen- te ou oralmente, bucalmente, parenteralmente, topicamente, por inalação ou insuflação (isto é, através da boca ou através do nariz), ou retalmente em formulações de unidade de dosagem contendo portadores, adjuvantes e veí- culos farmaceuticamente aceitáveis convencionais não tóxicos, como dese- jado, ou podem ser localmente administrados por meios tais como, porém - 20 nãolimitados a, injeção, implantação, enxertia, aplicação tópica, ou parente- ralmente. O termo "parenteral" como utilizado aqui se refere a introdução no corpo por modo de uma injeção (isto é, administração por injeção), incluindo, por exemplo, subcutaneamente (isto é, uma injeção embaixo da pele), intra- muscularmente (isto é, uma injeção dentro de um músculo), intravenosa- mente (istoé, uma injeção dentro de uma veia), intratecalmente (isto é, uma injeção dentro do espaço ao redor da medula espinhal ou sob a membrana aracnoide do cérebro), injeção intraesternal ou técnicas de infusão. Uma composição parenteralmente administrada é liberada utilizando uma agulha, por exemplo, uma agulha cirúrgica. O termo "agulha cirúrgica" como utiliza- do aqui, se refere a qualquer agulha adaptada para liberação de composi- ções fluidas (isto é, capazes de fluir) em uma estrutura anatômica seleciona- da. Preparações injetáveis, tais como suspensões oleaginosas ou aquosas injetáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com a técnica conheci- da utilizando agentes umectantes ou dispersantes e agentes de suspensão adequados. A administração adicional pode ser realizada, por exemplo, in- travenosamente, pericardialmente, oralmente, através de implante, transmu- cosalmente, transdermicamente, intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intralinfaticamente, intralesionalmente, ou epiduralmente. A administração pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes, e/ou durante um ou mais períodos prolonga- dos. Os termos "administração tópica" e "topicamente administrando" como utilizado aqui são utilizados alternadamente para se referir a liberação de um peptídeo, ácido nucleico, ou um vetor compreendendo o peptídeo ou o ácido nucleico em uma ou mais superfícies de um tecido ou célula, incluindo su- ' perfície epiteliais.
- 15 Administração tópica, ao contrário da administração transdérmi- ca, geralmente fornece um efeito sistêmico ao invés de local. Os termos "administração tópica" e "administração transdérmica" como utilizado aqui, a menos que de outro modo declarado ou implicado, são utilizado alternada- mente.
- 20 O termo "associado" e suas várias formas gramaticais como uti- lizado aqui se refere a ligação, conexão, ou combinação com, ou diretamen- te, indiretamente, ativamente, inativamente, inertemente, não inertemente, completamente ou incompletamente.
O termo "biocompatível" como utilizado aqui se refere a causar nenhuma irritação, lesão, reação tóxica ou reação imunológica no tecido cli- nicamente relevante ao tecido vivo com base em uma avaliação de ris- co/benefício clínica. O termo "biodegradável" como utilizado aqui se refere ao mate- rial que degradará ativamente ou passivamente com o passar do tempo por processos químicos simples, por ação de enzimas corporais ou por outros mecanismos similares no corpo humano. O termo "veículo" como utilizado aqui se refere a um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação a qual não cause irritação significante a um organismo e não anule a atividade biológica e propriedades da composi- ção da invenção descrita.
Os veículos devem ser de pureza suficientemente elevadae de toxicidade suficientemente baixa para torna-los adequados pa- ra administração a um paciente sendo tratado.
O veículo pode ser inerte, ou pode possuir benefícios farmacêuticos, benefícios cosméticos ou ambos.
O termo "condição" como utilizado aqui se refere a uma varieda- de de estados de saúde e é pretendido incluir distúrbios ou doenças causa- das por qualquer mecanismo subjacente ou distúrbio, lesão, e a promoção de órgãos e tecidos saudáveis.
O termo "contatar" como utilizado aqui se refere a levar ou colo- cara em contato.
O termo "contato" como utilizado aqui se refere a um esta- ' do ou condição de tocar ou de proximidade imediata ou local.
Contatar uma - 15 composição a um destino alvo, tal como, porém não limitado a, um órgão, tecido, célula ou tumor, pode ocorrer por qualquer meio de administração : conhecido pelo técnico versado.
O termo "elemento regulador controlável" como utilizado aqui se refere às sequencias de ácido nucleico capazes de afetar a expressão dos - 20 ácidos nucleicos, ou o produto de peptídeo ou proteína da mesma.
Os ele- mentos reguladores controláveis podem ser operavelmente ligados aos áci- dos nucleicos, peptídeos, ou proteínas da presente invenção.
Os elementos reguladores controláveis, tais como, porém não limitado a, sequências de controle, necessitam ser contíguos com os ácidos nucleicos, peptídeos, ou proteinas cuja expressão eles controlam contanto que eles funcionem para dirigir a expressão dos mesmos.
Desse modo, por exemplo, sequências ainda transcritas não transladadas intervenientes podem estar presente en- tre uma sequência promotora e um ácido nucleico da presente invenção e a sequência promotora pode ainda ser considerada "operavelmente ligada" à sequência de codificação.
Outras tais sequências de controle incluem, po- rém não estão limitadas a, sinais de poliadenilação, sinais de terminação, e sítios de ligação de ribossoma.
48/155 | O termo "liberação controlada" é pretendido referir-se a qualquer formulação contendo fármaco na qual a maneira e perfil da liberação de fár- maco da formulação são controlados. Isto se refere às formulações de libe- ração imediata bem como não imediata, com formulações de liberação não imediata incluindo, porém não limitado a, formulações de liberação prolon- gada e liberação retardada.
O termo "citocina" como utilizado aqui se refere a pequenas substâncias de proteína solúveis secretadas por células que têm uma varie- dade de efeitos sobre outras células. As citocinas mediam muitas funções fisiológicas importantes incluindo crescimento, desenvolvimento, cura de ferida, e a resposta imune. Elas agem ligando-se aos seus receptores espe- cíficos de célula localizados na membrana celular, que permite que uma cascata de transdução de sinal distinta comece na célula, o que eventual- " mente levará às alterações bioquímicas e fenotípicas nas células-alvo. Ge- - 15 ralmente, as citocinas agem localmente. Elas incluem as citocinas Tipo |, que abrangem muitas das interleucinas, bem como vários fatores de cresci- ' mento hematopoiéticos; citocinas tipo Il, incluindo os interferons e interleuci- na-10; moléculas relacionadas com o fator de necrose de tumor ("TNF"), in- i cluindo TNFa e linfotoxina; membros da superfamília de imunoglobulina, in- - 20 cluindo interleucina 1 ("IL-I"); e as quimiocinas, uma família de moléculas que desempenha um papel crítico em uma grande variedade de funções i- munes e inflamatórias. A mesma citocina pode ter diferentes efeitos em uma célula dependendo do estado da célula. As citocinas geralmente regulam a expressão de, e ativam as cascatas de, outras citocinas.
O termo "liberação retardada" é utilizada aqui em seu sentido convencional para referir-se a uma formulação de fármaco na qual há um atraso no tempo entre a administração da formulação e a liberação do fár- maco dela. "Liberação retardada" pode ou não envolver liberação gradual de fármaco durante um período prolongado de tempo, e desse modo pode ounão pode ser "liberação prolongada".
O termo "doença" ou "distúrbio" como utilizado aqui geralmente se refere a um prejuízo da saúde ou uma condição de funcionamento anor-
mal. Os distúrbios relevantes à invenção descrita podem incluir, porém não estão limitados a, doenças inflamatórias, fibrose, choque endotóxico, pan- creatite, asma, doença inflamatória localizada, doença cardiovascular ate- rosclerótica, Mal de Alzheimer, doença oncológica, isquemia neural, artrite reumatoide, Doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, hiperplasia íntima, estenose, reestenose, aterosclerose, tumores da célula do músculo liso e metástase, espasmo do músculo liso, angina, angina de Prinzmetal, isquemia, bradicardia, hipertensão, hipertrofia cardíaca, insuficiência renal, acidente vascular cerebral, hipertensão pulmonar, toxemia de gravidez, parto prematuro, pré-eclampsia, eclampsia, Doença de Raynaud ou fenômeno, uremia hemolítica, fissura anal, acalasia, impotência, enxaqueca, lesão mus- cular isquêmica associada com espasmo do músculo liso, vasculopatia, bra- diarritmia, insuficiência cardíaca congestiva, miocárdio atordoado, hiperten- í são pulmonar, disfunção diastólica, gliose (significando a proliferação de as- - 15 trócitos, o que pode incluir a deposição de matriz extracelular (ECM) em á- reas danificadas do sistema nervoso central), doença pulmonar obstrutiva ' crônica (significando doenças do trato respiratório caracterizadas por obstru- ção ou limitação do fluxo de ar; inclui, porém não limitado a bronquite crôni- ca, e enfisema), osteopenia, disfunção endotelial, inflamação, artrite degene- - 20 rativa, espondilite ancilosante, Doença de Sjorgen, doença de Guilliame- Barre, doença infecciosa, sepse, choque endotoxêmico, psoríase, enterite por radiação, escleroderma, cirrose, fibrose intersticial, colite, apendicite, gastrite, laringite, meningite, pancreatite, otite, lesão de reperfusão, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, neuropatia periférica, escle- rose múltipla, Lúpus, alergia, doenças cardiometabólicas obesidade, diabete metlito tipo Il, diabete melito Tipo |, e NASH/cirrose.
O termo "domínio" como utilizado aqui se refere a uma unidade estrutural de uma proteína que duplica mais ou menos independentemente para formar uma estrutura compacta globular. O termo "fármaco" como utili- zado aquise refere a um agente terapêutico ou qualquer substância, exceto comida, utilizada na prevenção, diagnóstico, alívio, tratamento ou cura de doença.
O termo "hibridização" se refere à ligação de duas moléculas de ácido nucleico de filamento único a cada outra através de pareamento de base.
Os nucleotídeos se ligarão ao seu complemento sob condições nor- mais, então dois filamentos perfeitamente complementares se ligarão (ou 'anelarão') a cada outra facilmente.
Entretanto, devido às geometrias mole- culares diferentes dos nucleotídeos, uma única inconsistência entre os dois filamentos tornará a ligação entre eles mais energicamente desfavorável.
Os efeitos de incompatibilidade de base podem ser medidos quantificando- se a taxa na qual dois filamentos se anelam, isto pode fornecer informação como ara a similaridade em sequência de base entre os dois filamentos sen- do anelados.
O termo "hidrogel" como utilizado aqui se refere a uma substân- cia resultante de uma estrutura sólida, semissólida, pseudoplástica ou plásti- ” ca contendo um componente aquoso necessário para produzir uma massa - 15 gelatinosa ou como geleia.
O hidrogel incorpora e retém quantidades signifi- cantes de HzO, que eventualmente alcançarão um teor de equilíbrio na pre- ' sença de um ambiente aquoso.
O termo "hidrofílico" como utilizado aqui se refere a um material ou substância tendo uma afinidade para substâncias polares, tal como água. - 20 Os termos "no corpo", "volume vazio", "cavidade de ressecção", "escavação", "sítio de injeção", sítio de deposição" ou "sítio de implante", como utilizados aqui são pretendidos incluir todos os tecidos do corpo sem limite, e podem se referir aos espaços formados aqui de injeções, incisões cirúrgicas, remoção de tumor ou tecido, lesões do tecido, formação de abs- cesso, ou qualquer outra cavidade similar, espaço, ou cavidade formada desse modo por ação de avaliação clínica, tratamento ou resposta fisiológica a doença ou patologia como exemplos não limitantes dos mesmos.
Os termos "inibindo", "inibir" ou "inibição" como utilizados aqui são utilizados para se referir a redução da quantidade ou taxa de um pro- cesso, para interromper o processo completamente, ou diminuir, limitar, ou bloquear a ação ou função do mesmo.
A inibição pode incluir uma redução ou diminuição da quantidade, taxa, ação, função, ou processo em pelo me-
nos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelomenos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% quando com- parado com uma substância de referência, onde a substância de referência é uma substância que não é inibida.
O termo "lesão" como utilizado aqui se refere ao dano ou prejuí- zo a uma estrutura ou função do corpo causado por uma força ou agente externo,que pode ser físico ou químico.
O termo "isolado" se refere ao material, tal como um ácido nucle- ico, um peptídeo, ou uma proteína, que é; (1) substancialmente ou essenci- almente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem 7 com ele quando encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Os . 15 termos "substancialmente ou essencialmente livre" são utilizados para se referir a um material, que é pelo menos 80% livre de componentes que nor- , malmente acompanham ou interagem com ele quando encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. O material isolado opcionalmente compre- i ende o material não encontrado com o material em seu ambiente natural; ou - 20 (2)seo material não está em seu ambiente natural, o material foi sintetica- mente (não naturalmente) alterado por intervenção humana deliberada para uma composição e/ou colocado em um local na célula (por exemplo, geno- ma ou organela subcelular) não nativa para um material encontrado neste ambiente. A alteração para produzir o material sintético pode ser realizada —nomaterial com, ou removido, de seu estado natural. Por exemplo, um áci- do nucleico de ocorrência natural se torna um ácido nucleico isolado se for alterado, ou se for transcrito de DNA que foi alterado, por meios de interven- ção humana realizada na célula da qual se origina. Vide, por exemplo, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, Patente dos Estados Unidos No. 5.565.350; /n Vivo Homologous Se- quence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling e outros, POCT/US93/03868.
Do mesmo modo, um ácido nucleico de ocorrência natural (por exemplo, um promotor) se torna isolado se for introduzido por meios de ocorrência não natural a um local do genoma não nativo para aquele ácido nucleico. Os ácidos nucleicos que são "isolados" como definido aqui também são referi- dos como ácidos nucleicos "heterólogos".
O termo "quinase" como utilizado aqui se refere a um tipo de en- zima que transfere os grupos de fosfato de moléculas doadoras de energia elevada para moléculas-alvo específicas ou substratos. Os grupos doadores de energia elevada podem incluir, porém não estão limitados a ATP.
O termo "atividade de quinase" como utilizado aqui se refere a fosforilação mediada por quinase de um substrato de quinase. O termo "substrato de quinase" como utilizado aqui se refere a um substrato que pode ser fosforilado por uma quinase. O termo "lábil" em suas várias formas gramaticais como utilizado 7 aqui se refere a estar apto ou provável de mudar. Um composto lábil é um - 15 capazde mudar o estado ou ficar inativo. O termo "lipofílico" como utilizado aqui se refere a preferir ou ' possuir uma afinidade para um ambiente não polar comparado com um am- biente polar ou aquoso. O termo "liberação polongada", como utilizado aqui, significa que . 20 um implante é construído e disposto para liberar níveis terapêuticos de um ingrediente ativo durante pelo menos 7 dias, ou cerca de 30 a cerca de 60 dias. O termo "célula de mamífero" como utilizado aqui se refere a uma célula derivada de um animal da classe Mammalia. Como utilizado a- qui as células de mamífero podem incluir células normais, anormais, e transformadas. Os exemplos de células de mamífero utilizadas na invenção descrita, incluem, porém não estão limitados a, neurônios, células epiteliais, células musculares, células sanguíneas, células imunes, células tronco, os- teócitos, células endoteliais, e células do blasto. O termo "modular" como utilizado aqui significa regular, alterar, adaptar, ou ajustar a uma certa medida ou proporção. O termo "normal" se refere a um padrão, modelo, mediano ou médio de um grande grupo.
O termo "paciente saudável normal" se refere a um paciente tendo nenhum sintoma ou outra evidência de um distúrbio inflamatório.
O termo "ácido nucleico" se refere a um polímero de deoxirribo- nucleotídeo ou ribonucleotídeo na forma de filamento único ou duplo, e a menos que de outro modo limitado, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais pelo fato de que eles hibridizam para ácidos nucleicos de filamento único de uma maneira similar aos nucleo- tídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo).
O termo "nucleotídeo" se refere a um composto químico que consiste em uma base heterocíclica, um açúcar, e um ou mais grupos fosfa- to. Nos nucleotídeos mais comuns a base é um derivado de purina ou piri- midina, e o açúcar é a pentose deoxirribose ou ribose. Os nucleotídeos são , os monômeros de ácidos nucleicos, com três ou mais junções para formar - 15 um ácido nucleico. Os nucleotídeos são as unidades estruturais de RNA, DNA, e vários cofatores, incluindo, porém não limitados a, COoA, FAD, DMN, ' NAD, e NADP. As purinas incluem adenina (A), e guanina (G); as pirimidi- nas incluem citosina (C), timina (T), e uracila (U).
A frase "operavelmente ligado" se refere a uma primeira se- - 20 quência(s) ou domínio estando posicionado suficientemente próximo a uma segunda sequência(s) ou domínio de modo que a primeira sequência(s) ou domínio possa exercer influência sobre a segunda sequência(s) ou domínio ou uma região sob o controle daquela segunda sequência ou domínio. O termo "partículas" como utilizado aqui se refere a um constitu- inte extremamente pequeno (por exemplo, nanopartículas, micropartículas, ou em alguns casos maiores) que pode conter no total ou em parte a com- posição de inibição de quinase como descrito aqui.
O termo "peptídeo" como utilizado aqui se refere a dois ou mais aminoácidos unidos por uma ligação de peptídeo.
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoáci- do. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoá- cido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de a- minoácido de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporado em uma pro- teína tal proteina é especificamente reativa aos anticorpos extraídos da mesma proteína, porém consistindo totalmente em aminoácidos de ocorrên- cia natural. Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteina" também são inclusivos de modificações incluindo, porém não limitado a, glicosilação, li- gação de lipídeo, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glu- tâmico, hidroxilação e ADP- ribosilação. Será apreciado, como é bem co- nhecido e como notado acima, que os polipeptídeos podem não ser comple- tamente lineares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser ramificados co- mo um resultado e ubiquitinação, e eles podem ser circulares, com ou sem , ramificação, geralmente como um resultado de eventos pós-translacionais, - 15 incluindo evento de processamento natural e eventos realizados por manipu- lação humana que ocorrem naturalmente. Os polipeptídeos circulares, rami- ' ficados e ramíificados circulares podem ser sintetizados por processo natural de não translação e por métodos completamente sintéticos, também. i O termo "peptidomimético" como utilizado aqui se refere a uma - 20 pequena cadeia como proteína designada para imitar um peptídeo. Um pep- tidomimético tipicamente surge da modificação de um peptídeo existente para alterar as propriedades da molécula.
O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" como utilizado aqui se refere a uma ou mais cargas sólidas ou líquidas compatíveis, diluen- tes ou substâncias de encapsulação que são adequadas para administração a um humano ou outro animal vertebrado.
O termo "polímero" como utilizado aqui se refere a qualquer dos vários compostos químicos feitos de moléculas idênticas menores (chama- das monômeros) unidas. Os polímeros geralmente têm pesos moleculares elevados. Os processos pelos quais as moléculas são unidas para formar polímeros são chamados "polimerização".
O termo "polinucleotídeo" se refere a um deoxirribopolinucleotíi-
deo, ribopolinucleotídeo, ou análogos dos mesmos que têm a natureza es- sencial de um ribonucleotídeo natural pelo fato de que eles hibridizam, em condições de hibridização rigorosas, para substancialmente a mesma se- quência de nucleotídeo como nucleotídeos de ocorrência natural e/ou permi- teatranslaçãonomesmo aminoácido(s) como o nucleotídeo(s) de ocorrên- cia natural.
Um polinucleotídeo pode ser de tamanho natural ou uma subse- quência de um gene regulador ou estrutural nativo ou heterólogo.
A menos que de outro modo indicado, o termo inclui referência à sequência especifi- cada bem como a sequência complementar da mesma.
Desse modo, DNAs —ouRNAs com esqueletos modificados para estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" uma vez que o termo é pretendido aqui.
Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, tal como inosina, ou ba- ses modificadas, tais como bases tritiladas, para citar apenas dois exemplos, ' são polinucleotídeos como o termo é utilizado aqui.
Será apreciado que uma - 15 grande variedade de modificações tenha sido feita para DNA e RNA que servem para muitos propósitos úteis conhecidos por aqueles de experiência Ú na técnica.
O termo polinucleotídeo como é empregado aqui abrange tais formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de ' polinucleotídeos, bem como as formas químicas de DNA e RNA característi- - 20 cos de vírus e células, incluindo entre outras coisas, células simples e com- plexas.
O termo "sequência primária" como utilizado aqui se refere a uma sequência de aminoácido.
O termo "profármaco" como utilizado aqui significa um peptídeo ou derivado, que está em uma forma inativa, e, que é convertido para uma forma ativa por conversão biológica em seguida a administração a um paci- ente.
Os seguintes termos são utilizados aqui para descrever as rela- ções de sequência entre dois ou mais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos: (a)"sequência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de sequência", (d) "percentual de identidade de sequência", e (e) "identidade substancial".
O termo "sequência de referência" se refere a uma sequência u- tiizada como uma base para a comparação de sequência.
Uma sequência de referência pode ser um subgrupo ou a totalidade de uma sequência es- pecificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA de tamanho natu- —ralou sequência de gene, ou o cCDNA completo ou sequência de gene.
O termo "janela de comparação" se refere a um segmento contí- guo e especificado de uma sequência de polinucleotídeo, onde a sequência de polinucleotídeo pode ser comparada com uma sequência de referência e onde a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços vazios) compara- das com a sequência de referência (que não compreende adições ou dele- ções) para alinhamento ideal das duas sequências.
Geralmente, a janela de comparação é pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, e 1 opcionalmente podem ser pelo menos 30 nucleotídeos contíguos em com- - 15 primento, pelo menos 40 nucleotídeos contíguos em comprimento, pelo me- nos 50 nucleotídeos contíguos em comprimento, pelo menos 100 nucleotí- Ú deos contíguos em comprimento, ou mais.
Aqueles versados na técnica en- tendem que para evitar uma similaridade elevada com uma sequência de referência devido a inclusão de espaços vazios na sequência de polinucleo- . 20 tídeo, uma penalidade de espaço vazio tipicamente é introduzida e é subtra- ida do número de combinações.
Os métodos de alinhamento de sequência para comparação são bem conhecidos na técnica.
O alinhamento ideal das sequências para com- paração pode ser conduzido pelo algoritmo de homologa local de Smith e Waterman, Adv.
Appl.
Math. 2:482 (1981); pelo algoritmos de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J.
Mol.
Biol. 48:443 (1970); pela pesquisa para o método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc.
Natl.
Acad.
Sci, 85:2444 (1988); por implementações computadorizadas destes algoritmos, incluindo, porém não limitados a: CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programa Wisconsin Genetics, Genetics Computer Grupo (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., USA; o programa
CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, e outros, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, e outros, Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), e Pearson, e outros, Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). A família de BLAST de programas, que pode ser utilizada para pesquisas de similaridade de banco de dados, inclui: BLASTN para sequência de consulta de nucleotídeo contra sequências de banco de dados de nucleotídeo; BLASTX para as sequências de consulta de nucleotí- deo contra sequências de banco de dados de nucleotídeo; BLASTP para sequências de consulta de proteína contra sequências de banco de dados de nucleotídeo; TBLASTN para sequências de consulta de proteína contra sequências de banco de dados de nucleotídeo; e TBLASTX para sequências de consulta de nucleotídeo contra sequências de banco de dados de nucleo- ' tídeo.
Vide, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, e - 15 outros, Eds,, Greene Publishing and Wiley- Interscience, Nova lorque (1995). A menos que de outro modo declarado, os valores de identida- ' de/similaridade de sequência fornecidos aqui se referem ao valor obtido utili- zando o BLAST 2.0 adequado de programas utilizando parâmetros básicos.
Altschul e outros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). O software para - 20 realizar as análises de BLAST está publicamente disponível, por exemplo, através do National Center for Biotechnology-Information (http://www.hecbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de sequência de classificação elevada (HSPs) identificando-se pala- vras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que corresponde ou satisfaz algum escore T de limiar de valor positivo quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de da- dos.
T é referido como o limiar de escore de palavra vizinho (Altschul e ou- tros, supra). Estas palavras HITs vizinhas iniciais agem como sementes pa- ra começar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-os.
As palavras HIT então são prolongadas e ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto que o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado.
Os escores cumulativos são calculados utilizando, para se-
quências de nucleotídeo, os parâmetros M (escores de recompensa para um par de resíduos de combinação; sempre >0) e N (escore de penalidade para resíduos de combinação imperfeita; sempre<0). Para sequências de amino- ácido, uma matriz de classificação é utilizada para calcular o escore cumula- tivo A extensão da palavra HITS em cada direção é detida quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obti- do; o escore cumulativo vai para zero ou mais baixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou a extre- midade de cada uma da sequência é alcançada.
Os parâmetros de algorit- moBLASTW,T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamen- to.
O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como pa- drão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectação (E) de 10, uma redução de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos. " Para sequência de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um - 15 comprimento de palavra (W) de 3, uma expectação (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUMG6?2 (vide, Henikoff & Henikoff (1989) Proc.
Natl.
Acad. ] Sci.
USA 89: 10915). Além de calcular o percentual da identidade de sequência, o al- i goritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre - 20 duas sequências (vide, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90:5873-5787 (1993)) Uma medição de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas sequên- cias de nucleotídeo ou aminoácido poderia ocorrer por acaso.
As pesquisas de BLAST assumem que as proteínas podem ser moldadas como sequên- cias aleatórias.
Entretanto, muitas proteínas reais compreendem regiões de sequências não aleatórias que podem ser tratos homopoliméricos, repeti- ções de período curto, ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos.
Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre proteínas —nãorelacionadas ainda que outras regiões da proteína sejam totalmente dis- similares.
Vários programas de filtro de baixa complexidade podem ser em- pregados para reduzir tais alinhamentos de baixa complexidade.
Por exem-
plo, o SEG (Wooten e Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) e XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) filtros de baixa complexidade podem ser empregados sozinhos ou em combinação. Como utilizado aqui, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo se refere aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é utilizada em referência às proteínas, é reconhecido que as posições do resíduo que são não idênti- cas geralmente diferem por substituições de aminoácido conservadoras, isto é, onde os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto não alteram as propriedades funcionais da mo- " lécula. Onde sequências diferem em substituições conservadoras, a porcen- . 15 tagem de identidade de sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. As sequências que diferem por ' tais substituições conservadoras são ditas ter "similaridade de sequência" ou "similaridade". Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por a- queles de experiência na técnica. Tipicamente isto envolve classificar uma - 20 substituição conservadora como um desequilíbrio parcial em vez de um de- sequilíbrio total, desse modo aumentando a porcentagem de identidade de sequência. Desse modo, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é dado um escore de 1 e à substituição não conservadora é dado um escore de zero, a uma substituição conservadora é dado um escore entre zero e 1. A classificação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Biol, Sci., 4:11- 17 (1988) por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelli- genetics, Mountain View, Calif., USA).
Como utilizado aqui, "percentual de identidade de sequência" significa o valor determinado comparando-se duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação, onde a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou de-
leções (isto é, espaços vazios) quando comparada com a sequência de refe- rência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências.
A porcentagem é calculada determinando-se o núme- ro de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir várias posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
O termo "identidade substancial" de sequências de polinucleotí- deo significa que um polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 70% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência e pelo menos 95% de identidade de sequência, comparada a uma sequência de referência ' utilizando um dos programas de alinhamento descrito utilizando parâmetros . 15 padrões.
Alguém de experiência reconhecerá que estes valores podem ser ajustados apropriadamente para determinar a identidade correspondente de ' proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeo levando-se em conta a degeneração do códon, similaridade de aminoácido, posicionamento da estrutura de leitura e similares.
A identidade substancial de sequência de - 20 aminoácidos para estes propósitos normalmente significa identidade de se- quência de pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%. Outra indicação que as sequências de nucleotídeo são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam para cada outra em condições severas.
Entretanto, os ácidos nucleicos que não hibridizam para cada outro em condições severas são ainda substanci- almente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancial- mente idênticos.
Isto pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada utilizando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético.
Uma indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo que o primeiro ácido nucleico codifica é imunologicamente reativo cruzado com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico.
Os termos "identidade substancial" no contexto de um peptídeo indica que um peptídeo compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade de sequência com uma sequência de referência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência coma sequência de referência em uma janela de comparação especificada. Opcionalmente, o alinhamento ideal é conduzido utilizando o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970). Uma indicação que duas sequências de peptídeo são substancial- mente idênticas é que um peptídeo é imunologicamente reativo com os anti- corpos aumentados contra o segundo peptídeo. Desse modo, um peptídeo é substancialmente idêntico uma vez que um segundo peptídeo, por exem- plo, onde os dois peptídeos diferem somente por uma substituição conser- vadora. Os peptídeos que são "substancialmente similares" compartilham ' sequências como notado acima exceto que as posições de resíduo que não . 15 —sãoidênticas podem diferir por mudanças de aminoácido conservador. O termo "domínio de transdução de proteína" (também referida , como "PTD", "peptídeo Trojan", "sequência de translocação de membrana", "proteína permeável a célula", "CPP") como utilizado aqui se refere a uma ' classe de peptídeos geralmente capaz de penetrar a membrana plasmática - 20 de célulasde mamífero. PTDs geralmente são 10-16 aminoácidos em com- primento, e são capazes de transportar os compostos de muitos tipos e pe- sos moleculares através de células de mamífero. Estes compostos incluem, porém não estão limitados a, moléculas efetoras, tais como proteínas, DNA, peptídeos conjugados, oligonucleotídeos, e partículas pequenas tais como lipossomas. Quando PTDs são quimicamente ligados ou fundidos a outras proteínas para formar as proteínas de fusão, estas proteínas de fusão ainda são capazes de penetrar a membrana plasmática e entrar nas células. O termo "reduzir" ou "redução" como utilizado aqui se refere a uma redução ou diminuição no grau, intensidade, estado, condição ou ex- tensão.
O termo "sequência reguladora" (também referida como uma "região reguladora" ou "elemento regulador") se refere a um promotor, real-
çador ou outro segmento de DNA onde as proteínas reguladoras, tais como fatores de transcrição, se ligam preferencialmente a expressão do gene de controle e desse modo expressão de proteína.
Os termos "sujeito" ou "indivíduo" ou "paciente" são utilizado al- ternadamente para se referir a um membro de uma espécie animal de ori- gem de mamífero, incluindo, porém não limitado a, um camundongo, um ra- to, um gato, uma cabra, uma ovelha, cavalo, hamster, furão, ornitorrinco, porco, um cão, uma cobaia, um coelho e um primata, tal como, por exemplo, um macaco, símio, ou humano.
O termo "liberação prolongada" (também referido como "libera- ção estendida") é utilizado aqui em seu sentido convencional para se referir a uma formulação de fármaco que fornece liberação gradual de um fármaco durante um período prolongado de tempo, e que preferivelmente, embora " não necessariamente, resulta em níveis sanguíneos substancialmente cons- - 15 tantes de um fármaco durante um período de tempo prolongado. O termo "sintoma" como utilizado aqui se refere a um sinal ou ' uma indicação de distúrbio ou doença, especialmente quando experimenta- do por um indivíduo como uma alteração da função, sensação, ou aparência i normal. - 20 O termo "síndrome" como utilizado aqui se refere a um padrão de sintomas indicativos de alguma doença ou condição.
O termo "agente terapêutico" como utilizado aqui se refere a um fármaco, uma molécula, um ácido nucleico, proteína, metabólito, peptídeo, composição ou outra substância que fornece um efeito terapêutico. O termo "ativo" como utilizado aqui se refere ao ingrediente, componente ou constitu- inte das composições da presente invenção responsáveis pelo efeito tera- pêutico pretendido. Os termos "agente terapêutico" e "agente ativo" são uti- lizados alternadamente aqui.
O termo "componente terapêutico" como utilizado aqui se refere auma dosagem terapeuticamente eficaz (isto é, dose e frequência de admi- nistração) que elimina, reduz, ou previne a progressão de uma manifestação de doença particular em uma porcentagem de uma população. Um exemplo de um componente terapêutico comumente utilizado é o ED50 que descreve a dose em uma dosagem particular que é terapeuticamente eficaz para uma manifestação de doença particular em 50% de uma população.
O termo "domínio terapêutico" como utilizado aqui se refere a um peptídeo, segmento de peptídeo, ou variante ou derivado dos mesmos, com identidade substancial com o peptídeo KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13], ou segmento do mesmo.
Os domínios terapêuticos geralmente não são capazes de penetrar a membrana plasmática de células de mamífero e quando contatados com uma enzima quinase, inibem a enzima quinase tal que a atividade de quinase da enzima quinase é reduzida.
Um domínio te- rapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima qui- nase seja cerca de 99% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da " enzima quinase seja cerca de 95% daquela de uma enzima quinase não ini- - 15 bida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a ati- vidade da enzima quinase seja cerca de 90% daquela de uma enzima qui- ' nase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 85% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima - 20 quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 80% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 75% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cercade 70% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio te- rapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima qui- nase seja cerca de 80% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 75% daquela de uma enzima quinase não ini- bida Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a ati- vidade da enzima quinase seja cerca de 70% daquela de uma enzima qui- nase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 65% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 60% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 55% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 50% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio te- rapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima qui- nase seja cerca de 45% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 40% daquela de uma enzima quinase não ini- bida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a ativi- . dade da enzima quinase seja cerca de 35% daquela de uma enzima quinase BR 15 nãoinibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que ' a atividade da enzima quinase seja cerca de 30% daquela de uma enzima ] quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 25% daquela de uma ' enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima . 20 quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 20% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 15% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de10%daquelade uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêuti- co pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 9% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 8% daquela de uma enzima quinase não inibida.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 7% daquela de uma enzima quinase não inibi- da.
Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atívi-
dade da enzima quinase seja cerca de 6% daquela de uma enzima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 5% daquela de uma enzima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase talquea atividade da enzima quinase seja cerca de 4% daquela de uma en- zima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 3% daquela de uma enzima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 2% da- quelade uma enzima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode ini- bir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 1% daquela de uma enzima quinase não inibida. Um domínio terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja 7 cerca de 0,1% daquela de uma enzima quinase não inibida. Um domínio - 15 terapêutico pode inibir uma enzima quinase tal que a atividade da enzima quinase seja cerca de 0,01% daquela de uma enzima quinase não inibida. Ú O termo "peptídeo inibidor terapêutico" como utilizado aqui se re- fere a um peptídeo compreendido de um primeiro domínio e um segundo domínio. O primeiro domínio compreende um domínio de transdução de - 20 proteína (PTD) e está localizado próximo ao segundo domínio. O segundo domínio, localizado próximo ao primeiro domínio, compreende um domínio terapêutico. O termo "proximal" como utilizado aqui se refere a muito perto ou próximo, como no espaço, tempo, ou ordem.
O termo "efeito terapêutico" como utilizado aqui se refere a uma consequência de tratamento, os resultados do qual são julgados serem de- sejáveis e benéficos. Um efeito terapêutico pode incluir, diretamente ou indi- retamente, a interrupção, redução, ou eliminação de uma manifestação de doença. Um efeito terapêutico pode também incluir, diretamente ou indire- tamente, a interrupção, redução ou eliminação da progressão de uma mani- festação de doença. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade eficaz" de um ou mais dos agentes ativos da presente invenção é uma quantidade que é suficiente para fornecer um efeito terapêutico. Ge-
ralmente, uma quantidade eficaz dos agentes ativos que pode ser emprega- da de acordo com a invenção descrita varia de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Entretanto, os níveis de dosagem são com base em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de lesão, a idade, peso, sexo, condição médica do paciente, a gravidade da condição, a rotina de administração, e o agente ativo particular empregado. Desse modo, o regime de dosagem pode variar amplamente, porém pode ser determinado rotineiramente por um médico utilizando os métodos pa- drões.
Métodos existem para a transdução e a transfecção de ácidos nucleicos dentro das células. Os termos "transdução", ou "transduzir" como utilizados aqui são utilizados alternadamente para se referir ao processo de cruzamento de membranas biológicas. O cruzamento de membranas bioló- - gicas pode ser de uma célula com outra, do ambiente extracelular com o . 15 ambiente intracelular, ou através de uma membrana de célula ou membrana ' nuclear. Os materiais que podem passar por transdução incluem, porém " não estão limitados a, proteínas, proteínas de fusão, peptídeos, polipepti- deos, aminoácidos, DNA viral, e DNA bacteriano.
: O termo "tratar" ou "tratamento" como utilizado aqui se refere à . 20 realização de um ou mais dos seguintes: (a) redução da gravidade de um distúrbio; (b) limitação do desenvolvimento de sintomas característicos de um distúrbio sendo tratado; (c) limitação da piora de sintomas característicos de um distúrbio sendo tratado; (d) limitação da recorrência de um distúrbio em paciente que previamente tiveram o distúrbio; e (e) limitação de recor- —rênciade sintomas em pacientes que foram previamente sintomáticos para o distúrbio.
O termo "variante" e suas várias formas gramaticais como utili- zado aqui se refere a uma sequência de nucleotídeo ou uma sequência de aminoácido com identidade substancial com uma sequência de nucleotídeo de referência ou sequência de referência de aminoácido, respectivamente. As diferenças nas sequências podem ser o resultado de alterações, natural- mente ou por desígnio, na sequência ou estrutura. As alterações naturais podem surgir durante o curso da replicação ou duplicação normal na nature- za de uma sequência de ácido nucleico particular. As alterações designadas podem ser especificamente designadas e introduzidas na sequência para propósitos específicos. Tais alterações específicas podem ser feitas in vitro utilizando uma variedade de técnicas de mutagênese. Tais variantes de se- quência geradas especificamente podem ser referidas como "mutantes: ou "derivados" da sequência original.
Um técnico versado provavelmente pode produzir variantes de polipeptídeo tendo únicas ou múltiplas substituições, deleções, adições, ou substituições de aminoácido. Estas variantes podem incluir entre outras coi- sas: (a) variantes nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são substi- tuídos com aminoácidos conservadores ou não conservadores; (b) variantes nos quais um ou mais aminoácidos são adicionados; (c) variantes nos quais ' pelo menos um aminoácido inclui um grupo substituinte; (d) variantes nos . 15 quais uma proteína alvo é fundida com outro peptídeo ou polipeptídeo tal como um par de fusão, um rótulo de proteína ou outra fração química, que : pode conferir propriedades úteis à proteína alvo, tal como, por exemplo, um epitopo para um anticorpo. As técnicas para obter tais variantes, incluindo ' técnicas genéticas (supressões, deleções, mutações, etc.), químicas, e en- - 20 zimáticas são conhecidas pelo técnico versado. Como utilizado aqui, o ter- mo "mutação" se refere a uma alteração da sequência de DNA em um gene ou cromossomo de um organismo resultando na criação de um novo carac- tere ou traço não encontrado no tipo origem, ou o processo pelo qual uma tal alteração ocorre em um cromossomo, ou através de uma alteração na se- —quência de nucleotídeo do DNA codificando para um gene ou através de uma alteração na disposição física de um cromossomo. Três mecanismos de mutação incluem substituição (permuta de um par de base para outro), adição (a inserção de uma ou mais bases em uma sequência), e deleção (perda de um ou mais pares de base). O termo "substituição" é utilizado aqui para se referir àquele no qual uma base ou bases são permutadas para outra base ou bases no DNA. As substituições podem ser substituições sinônimas ou substituições não sinônimas.
Como utilizado aqui, "substituições sinônimas" se referem às substituições de uma base para outra em um exon de um gene codificando para uma proteína, tal que a sequência de aminoácido produzida não seja modificada.
O termo "substituições não sinônimas" como utilizado aqui se refere às substituições de uma base para outra em um exon de um gene codificando para uma proteína, tal que a sequência de aminoácido produzida seja modificada.
Os termos "deleção" e "mutação por deleção" são utilizados al- ternadamente aqui para se referir àquele no qual uma base ou bases são perdidasdo DNA.
O termo "adição" como utilizado aqui se refere à inserção de uma ou mais bases, ou de um ou mais aminoácidos, em uma sequência.
O seguinte representa grupos de aminoácidos que são substitui- ' ções conservadoras para uma outra: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); - 15 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Ácido glutã- ] mico (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K);5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina " (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). Composições: Peptídeos Inibidores de Quinase Terapêuticos : De acordo com um aspecto, a invenção descrita fornece uma - 20 composição de inibição de quinase para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende a expressão de citocina inflamatória, a composi- ção compreendendo (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ini- bidor terapêutico, onde a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico inibe pelo menos uma enzima quinase, onde o peptídeo inibidor terapêutico compreende um primeiro domínio e um segundo domí- nio, onde o primeiro domínio compreende um domínio de transdução de pro- teina (PTD) e está localizado proximal ao segundo domínio, onde o segundo domínio, localizado proximal ao primeiro domínio, compreende um domínio terapêutico, onde a composição diretamente ou indiretamente reduz a ex- pressão de pelo menos uma citocina inflamatória.
De acordo com uma mo- dalidade, o primeiro domínio está localizado 5' ao segundo domínio.
De a-
cordo com outra modalidade, o segundo domínio está localizado 3' ao pri-
meiro domínio.
De acordo com uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,00001 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,0001 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra mo- dalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêu- tico é de uma quantidade de cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal a cerca 7 de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quanti- - 15 dade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma ' quantidade de cerca de 0,01 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg ' de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuti- camente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cer- ca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal. - 20 De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor tera- pêutico é de uma quantidade de cerca de 10 mg/kg de peso corporal a cerca de100mg/Kkgde peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quanti- dade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 20 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeutica- mente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de30 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do pep- tídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 40 mg/kg de pe-
so corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor tera- pêutico é de uma quantidade de cerca de 50 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quanti- dade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 60 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeutica- mente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 70 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do pep- tídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 80 mg/kg de pe- so corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor tera- ' pêutico é de uma quantidade de cerca de 90 mg/kg de peso corporal a cerca - 15 de100 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quanti- dade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma " quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 90 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade : terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantida- - 20 dede cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 80 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeutica- mente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 70 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 60 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 50 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor tera- pêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 40 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,0000011 mg/kg de peso corporal a cerca de 30 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantida- dede cercade 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeutica- mente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,0000011 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 1 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de ' peso corporal a cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra - 15 modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor tera- pêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal , a cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de i uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de - 20 0,01mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantida- de terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quan- tidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuti- camente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cer- cade 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 0,0001 mg/kg de peso corporal.
De acordo com outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico é de uma quantidade de cerca de 0,000001 mg/kg de peso corporal a cerca de 0,00001 mg/kg de peso corpo- ral.
De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKA- WLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]. De acordo com outra modalidade,
o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido FAKLAARL YRKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 12]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido KAF AKLAARL YRKALARQLGV AAISEQID NO: 15]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo ten- do a sequência de aminoácido YARAAARQARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO:16]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARG- QRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência ' de aminoácido YARAAARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]. De acordo - 15 com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um ] peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARASARGQRAKALNRQLAVA ' [SEQ ID NO: 19]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor tera- pêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YA- ' RAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20]. De acordo com outra moda- - 20 lidade, o peptídeo inibidor terapêutico da invenção é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido Y ARAA ARGQRAKALNRO LGVAA [SEQ ID NO:
21). De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da in- venção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLGV AA [SEQID NO: 13]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KAANRQLG- VAA [SEQ ID NO: 22]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêu- tico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALAR- QLGV AA [SEQ ID NO: 23]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNAQLGV AA [SEQ ID NO: 24]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de amino-
ácido KALNRALGVAA [SEQ ID NO; 25]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de ami- noácido KALNRQ AGV AA [SEQ ID NO: 26]. De acordo com outra modali- dade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLA V AA [SEQ ID NO: 27]. De acordo com outra moda- lidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: 28]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a se- quência de aminoácido KALNRQLGVA [SEQ ID NO: 29]. De acordo com outramodalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KAANRQLGV AA [SEQ ID NO: 22]. De ' acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um do- - 15 mínio tendo a sequência de aminoácido KALNAQLGVAA [SEQ ID NO; 24]. i De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um ' domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQ AGV AA [SEQ ID NO: 26]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é ] um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLGAAA [SEQ ID NO: - 20 28]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLGV AA [SEQ |D NO: 13). De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da inven- ção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALARQLGV AA [SEQ ID NO: 23]. De acordo com outra modalidade o domínio terapêutico da in- venção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRALGVAA [SEQ ID NO: 25]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico da invenção é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLA V
AA [SEQ ID NO: 27]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKA WLRRIKA [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLRRIKA [SEQ ID NO; 32]. De acordo com outra modalida- de, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido YARAA ARQ ARA [SEQ ID NO: 5]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido YGRKKRROQRRR [SEQ ID NO; 33]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKA WLRRI [SEQ ID NO: 34]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido FAKLAARL YR [SEQ ID NO: 35]. De acordo com outra modali- dade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido K AF AKL AARL YR [SEQ ID NO: 36]. De acor- do com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico " é um domínio tendo a sequência de aminoácido YARAAARQARA [SEQ ID - 15 NO:5]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido FA- " KLAARL YRKA [SEQ ID NO: 43]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência Ú de aminoácido KAF AKLAARL YRKA [SEQ ID NO: 44].
. 20 De acordo com outra modalidade, o primeiro domínio está locali- zado 5' ao segundo domínio. De acordo com outra modalidade, o segundo domínio está localizado 3' ao primeiro domínio. De acordo com outra moda- lidade, o primeiro domínio é operavelmente ligado ao segundo domínio. De acordo com outra modalidade, o segundo domínio é operavelmente ligado aoprimeiro domínio.
De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno. De acordo com algumas tais modalidades, a enzima quinase é MK2. De acordo com algu- mas tais modalidades, a enzima quinase é MK3. De acordo com outra moda- lidade, a enzima quinase é CaMK.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- Tio é fibrose.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- , rio é a disfunção da célula endotelial. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é choque endotóxico. O choque endotóxico (choque séptico) é uma con- dição na qual o sistema circulatório é incapaz de fornecer circulação ade- quada para os tecidos corporais devido à presença de uma substância in- flamatória. Estudos reportaram que os níveis de soro de TNF-a determinam o curso fatal ou não fatal de choque endotóxico (Mozes, T., e outros Immu- nol. Lett. 27(2): 157- 62, 1991), ao mesmo tempo em que o níveis de IL-6 em pacientes com choque séptico são significantemente elevados (Waage, A., e outros J. Exp. Med. 169:333-338, 1989). Os sintomas de choque endotóxico incluem, porém não estão limitados a, febre moderada, falta de fome, de- pressão física e mental moderada, frequência cardíaca aumentada, baixa ' pressão de pulso, desidratação, e diarreia. - 15 De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- ' rio é pancreatite. Pancreatite é inflamação do pâncreas. A pancreatite agu- : da é súbita ao mesmo tempo em que a pancreatite crônica é caracterizada por dor abdominal recorrente ou persistente com ou sem esteatorreia ou di- i abete melitu. Há evidência considerável que as citocinas pró-inflamatórias - 20 (por exemplo, TNF-a, IL- IB) desempenham um papel central na patofisiolo- gia de pancreatite aguda e podem mediar a complicação sistêmica de pan- creatite aguda atuando-se como mediadores proximais, que induzem a pro- dução de ouros mediadores incluindo IL-6 e 1L-8. IL- IB e TNF-a foram impli- cados como agentes levando à progressão de doença e IL-6 e IL-8 como indicadores de gravidade (Pooran, N., e outros J. Clin. Gastroenterol. 37(3):263-266, 2003). Os sintomas pancreatite incluem, porém não estão limitados a, dor abdominal superior grave, com radiação através das costas, náuseas, vômito, flutuações na pressão sanguínea (alta ou baixa), frequên- cia cardíaca elevada, dor abdominal, e ruídos intestinais podem ser reduzi- dos.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é asma.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é doença inflamatória localizada.
Estudos reportaram que IL-6 e TNF-a circulantes desempenham um importante papel na indução de uma resposta local inflamatória (Xing, Z.
J.
Clin, Invest 101 (2):311-320, 1998). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é doença cardiovascular aterosclerótica (aterosclerose, ASVD). ASVD é uma condição na qual uma parede da artéria se expande como o resultado de uma formação de materiais graxos, tal como colesterol.
É uma síndrome afetando os vasos sanguíneos arterianos (uma resposta inflamatória crônica nas paredes das artérias) parcialmente devido ao acúmulo de células san- guíneas brancas de macrófago e promovido por lipoproteínas de baixa den- sidade sem remoção adequada de gorduras e colesterol dos macrófagos por lipoproteínas de alta densidade funcionais.
Os estudos envolveram IL-18B 7 como uma proteína reguladora no desenvolvimento e sequelas clínicas de - 15 aterosclerose (Moyer, C.F., e outros Am.
J.
Pathol. 138(4);951-960, 1991). ' Estudos adicionais reportaram que IL-6 e TNF-a também estão associados ' com fatores de risco de aterosclerose (Haddy, N., e outros Aterosclerose. 70(2):277-283. 2003). Os sintomas de doença cardiovascular aterosclerótica incluem, porém não estão limitados a, ataque cardíaco, morte cardíaca súbi- - 20 ta(mortee uma hora a partir do início dos sintomas), doença oclusiva arteri- al periférica, aterogênese (o processo desenvolvido de placas ateromatosas)
e estenose.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é mal de Alzheimer.
Mal de Alzheimer (AD) é uma forma de demência.
ADé caracterizada pela perda de neurônios e sinapses no córtex cerebral e certas regiões subcorticais.
Esta perda resulta em atrofia maciça das regi- ões afetadas, incluindo degeneração no lobo temporal e lobo parietal, e par- tes do córtex frontal e giro cingulado.
A causa e progressão de AD não são bem entendidos, porém geralmente acredita-se envolver novelos neurofibri- larese amiloide-B.
Alguns estudos sugeriram que a gênese de amiloide em AD resulta de uma reação de fase aguda mediada por IL-I8/IL-6 no cérebro (Vandenabeele, P. e Fiers, W.
Immunol.
Today. 12(7):217-9. 1991). Estudos T——
77I155 adicionais sugeriram uma correlação entre o nível de expressão de TNF-a e IL- IB e comprometimento cognitivo (Alvarez, X., e outros Mol. Chem. Neuro- pathol. 29(2- 3):237-252. 1996). Os sintomas de AD incluem, porém não es- tão limitados a, perda de memória, confusão, irritabilidade, agressão, altera- çõesno humor, e morte.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é uma doença oncológica. As doenças oncológicas incluem, porém não estão limitados a, cânceres derivados do epitélio tais como, porém não limi- tado a, câncer de mama e câncer de próstata. De acordo com algumas mo- dalidades, o distúrbio é câncer de mama. De acordo com algumas modali- dades, o distúrbio é câncer de próstata. Câncer de mama é um câncer que se forma em tecidos da ma- ma, geralmente os dutos (tubos que levam o leite para o mamilo) e lóbulos 7 (glândulas que produzem o leite). Há quatro estágios de câncer de mama, - 15 Estágio O (carcinoma in situ) inclui carcinoma lobular in situ ("LCIS") e carci- ' noma dutal in situ ("DCIS"), onde as células cancerosas estão presentes no " revestimento de um lóbulo ou duto, respectivamente. Estágio 1 é um estágio anterior ao câncer de mama invasivo onde o tumor é não mais do que 2 cm de um lado ao outro e as células de câncer não se espalham além da mama. - 20 No Estágio ll, o tumor é (i) não mais do que 2 cm em diâmetro e o câncer se espalhou para os linfonodos sob o braço; (ii) entre 2-4 cm em diâmetro e o câncer pode ter se espalhado para o linfonodo no braço; ou (iii) o câncer é maior do que 5 cm em diâmetro e o câncer não se espalhou para os linfono- dos no braço. O Estágio pode ser um tumor maior, porém o câncer não se espalhou para além da mama e próximo dos linfonodos. É câncer localmente avançado. No Estágio IIIA, o tumor pode ou não ser menor do que 5 cm em diâmetro e se espalhou para o linfonodo no braço. No Estágio IIIB, o tumor cresceu na parede torácica ou na pele da mama e o câncer se espalhou pa- ra os linfonodos além do esterno. No Estágio II!IC, o tumor é qualquer tama- nho esse espalhou para os linfonodos no braço, além do esterno, e abaixo ou acima da clavícula. O Estágio IV é câncer metastático distante onde o câncer se espalhou para outras partes do corpo. Estudos reportaram que os níveis de IL-6 são elevados em pacientes com câncer de mama metastático (Zhang, GJ. , e Adachi, |. Anticancer Res. 19(2B):1427-1432, 1999) e que TNF-a pode potencializar a capacidade de IL-6 estimular a síntese de estro- gênio em tumores de mama (Reed, MJ., e Purohit, A.
Endocrine Rev. 18(5):701-715, 1997). Estudos adicionais reportaram que IL-IB associado com tumor está presente no microambiente de tumor e pode desempenhar um papel pivotal na regulação do crescimento de tumor de mama e metásta-
se (Kurtzman, S.
H., e outros Oncology Reports. 6(1):65-70, 1998). Câncer de próstata é um câncer que se forma nos tecidos da próstata (uma glândula no sistema reprodutor masculino encontrado abaixo da bexiga e na gente do reto). Há quatro estágios de câncer de próstata.
No Estágio 1, o câncer não pode ser sentido durante um exame retal digital, e não pode ser visto em um sonograma.
É encontrado por acaso quando a 7 cirurgia é realizada por outra razão.
O câncer do Estágio 1 é somente na - 15 próstataeograué G1 (ou o escore Gleason não é maior do que 4). No Es- ' tágio Il, o tumor é mais avançado ou um grau maior do que o Estágio 1, po- ' rém o tumor não se estende além da próstata.
Pode ser sentido durante um exame retal digital, ou pode ser visto em um sonograma.
No Estágio Ill, o Ú tumor se estende além da próstata e pode ter invadido as vesículas semi- - 20 nais, porém ainda não se espalhou para os linfonodos.
No Estágio IV, o tu- mor pode ter invadido a bexiga, reto, ou estruturas próximas (além das vesí- culas seminais). Pode ter se espalhado para os linfonodos, ossos ou para outras partes do corpo.
Estudos reportaram que os níveis de soro de IL-6 e TNF-a foram significantemente mais elevados em pacientes com doença —metastática do que aqueles em pacientes com doenças localizadas, e estes níveis de ambas as citocinas foram diretamente correlacionados com a ex- tensão da doença (Michalaki, V., e outros Br.
J.
Cancer. 90(12):2312-6, 2004). Estudos adicionais reportaram que IL- IB é requerida para angiogêne- se in vivo e invasividade de diferentes células de tumor (Voronov, E., e ou- tros, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 100(5):2645-2650, 2003). Um homem com câncer de próstata pode não ter qualquer sintoma.
Para homens que têm os sintomas, os sintomas comuns incluem, porém não estão limitados a, pro-
blemas urinários, impotência, sangue na urina ou sémen, e dor frequente nas costas, quadris ou coxas.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é isquemia.
Isquemia é uma restrição no fornecimento de sangue, ge- ralmente devido aos fatores nos vasos sanguíneos, com disfunção de tecido resultante.
Estudos reportaram que os níveis de IL-6, IL-Iê e TNF-a são crescentes durante o período de recirculação inicial após isquemia (Saito, K., e outros Neurosci.
Lett. 206(2-3): 149- 152, 1996). Os sintomas de isquemia incluem, porém não estão limitados a, uma carência de oxigênio e glicose no fornecimento de sangue.
De acordo com algumas tais modalidades, o dis- túrbio é isquemia neural.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é artrite reumatoide (RA). De acordo com algumas tais modalidades, o ' distúrbio inflamatório é doença de Crohn.
De acordo com algumas tais mo- - 15 —dalidades,o distúrbio inflamatório é doença inflamatória do intestino. ] De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- " rio é hiperplasia íntima.
Hiperplasia íntima é um engrossamento da Túnica Íntima (a camada mais interna de uma artéria ou veia) de um vaso sanguí- Ú neo como uma complicação de um procedimento de reconstrução ou endar- - 20 terectomia (a extração cirúrgica de um revestimento arterial grosso, encrus- tado de gordura, para abrir ou alargar a artéria para circulação sanguínea melhorada). Envolve a estimulação coordenada das células do músculo liso por fatores mecânicos, celulares e humorais para induzir um programa de ativação celular que leva a proliferação, migração, e deposição de matriz extracelular.
A hiperplasia íntima é a resposta universal de um vaso à lesão.
Estudos reportaram que a superexpressão de IL-6, quando regulada por IL- IB e TNF-a, desempenha um importante papel nas células associadas ao ateroma (Kornman, K. e outros J.
Perio.
Res. 34(7):353-357. 2006; Libby, P., e outros Circulation. 86(6 Suppl):11147-52. 1992)). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é estenose.
Estenose é o estreitamento anormal em um vaso sanguíneo ou outro órgão ou estrutura tubular.
A síndrome resultante depende da es-
trutura afetada. Estudos reportaram que a superexpressão de IL-6, quando regulado por IL-IB e TNF-a, desempenha um importante papel nas células associadas ao ateroma (Id). Os sintomas de estenose podem incluir, porém não estão limitadas a, cianose (coloração azul da pele e membranas muco- sas, alterações atróficas tais como perda de cabelo, e pele brilhante, tempe- ratura corpórea diminuída, pulso diminuído, parestesia, e paralisia. De acor- do com algumas tais modalidades, o distúrbio é reestenose (reocorrência de estenose).
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioé tumores da célula do músculo liso e metástase. Vários tumores da cé- lula do músculo liso, e a metástase do mesmo, foram estudados. Estes in- cluem leiomioma. Estes neoplasmos geralmente são neoplasmas benignos do músculo liso que não são pré-malignos e que podem ocorrer em qualquer ' órgão, tal como o útero, intestino delgado e o esôfago. Fibroides uterinos - 15 são leiomiomata do músculo liso uterino. Embora benignos, os fibroides ute- ] rinos podem levar ao sangramento menstrual excessivo, anemia e infertili- ' dade. Leiomiomas da pele incluem leiomioma cutâneo solitário, leiomiomas cutâneo múltiplo (ou pilar) surgindo dos arredores do músculo pilorum, an- Ú gioleiomiomas (leiomiomas vasculares), leiomiomas dartoicos (ou genitais) - 20 se originando nos músculos dartos das genitálias, aréolas e mamilos, e an- giolipoleiomioma. Estudos reportaram que a cavidade uterina em leiomioma, adenomiose e grupo do pólipo endometrial contêm níveis elevados de citoci- nas, tais como IL- IB e TNF-a (Inagaki, N., e outros Eur. J. Obst. Gyn. 11 1(2): 197-203, 2003). Estudos adicionais reportaram que IL-6 também é ex- presso em leiomioma (Luo, X e outros, Endocrinology. 146(3): 1097-1118, 2005).
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é espasmo do músculo liso. Um espasmo do músculo liso é a contração involuntária súbita de um músculo liso (ou grupo de músculos). Estudos re- portaram que a reatividade vascular na resistência das artérias está relacio- nada com o equilíbrio entre IL-IB, IL-6 e TNF-a (Vila, E. e Salaices, M. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288:H1016-H1021, 2005).
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é angina (angina do peito). Angina é dor no peito grave devido a isque- mia do miocárdio.
Estudos reportaram que níveis elevados de IL-6 são co- muns em angina instável e estão associados com pobre prognose (Biasucci, L,e outros Circulation. 94: 874-877. 1996). Adicionalmente, estudos repor- taram uma associação entre o nível de expressão de IL-6 e TNF-a com mor- talidade coronária (Koukkunen, H., e outros Annals Med. 33(1):37-47. 2001). Os sintomas de angina incluem, porém não estão limitados a, desconforto no peito, dor no peito, uma pressão, peso, aperto, compressão, queimação ou sensação de sufocamento, epigástrio, dor nas costas, dor na área da nuca, dor nos joelhos, dor nos ombros, náuseas, vômito, e palidez.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é Angina de Prinzmetal (angina variante). Angina de Prinzmetal ocorre ' em pacientes com artérias coronárias normais ou aterosclerose insignifican- - 15 te.
Os sintomas incluem, porém não estão limitados àqueles de angina, e ' tipicamente ocorre em repouso (ao invés de durante o esforço) em ciclos. " De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é bradicardia (bradiarritmia). Bradicardia se refere a uma frequência car- díaca em repouso de abaixo de 60 batidas por minuto.
Estudos reportaram - 20 que níveis aumentados de IL-IB, IL-6 e TNF-a estão associados com bradi- cardia (Fukuhara, Y., e outros Toxicol. 41(1):49-55. 2003). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é bradiarritmia, De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é hipertensão.
Hipertensão se refere a pressão sanguínea elevada (pres- são sanguínea alta). Estudos reportaram que níveis aumentados de IL-IB, IL-6 e TNF-a estão associados com bradicardia (Fukuhara, Y., e outros To- xicol. 41(1):49-55. 2003). Sintomas de hipertensão incluem, porém não estão limitados a, dor de cabeça, sonolência, confusão, distúrbios visuais, náu- seas, vômito, crises epiléticas, irritabilidade, e angústia respiratória.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é hipertrofia cardíaca (aumento do coração). A hipertrofia ventricular é o aumento dos ventrículos no coração.
A hipertrofia ventricular geralmente está associada com alterações patológicas devido à hipertensão (ou outros estados da doença). Estudos reportaram que IL-IB e TNF-a são suficientes para estimular as respostas de crescimento hipertrófico e sugeriram que a superexpressão de IL-6 pode levar a hipertrofia cardíaca (Yokoyama, T., e outros Circulation. 95:1247-1252. 1997). Os sintomas de hipertrofia cardíaca podem incluir, porém não estão limitados a, dor de cabeça, sonolência, con- fusão, distúrbios visuais, náuseas, vômito, crises epiléticas, irritabilidade e angústia respiratória.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioé insuficiência renal.
Insuficiência renal (falha dos rins) resulta quando os rins não funcionam adequadamente.
Estudos reportaram a associação de IL- IB e TNF-a (Descamps-Latscha, B., e outros J.
Immunol. 154(2):882-892. 1995) e de IL-6 aumentado (Herbelin, A., e outros Kidney Internat'l. 39:954- ' 960. 1991) com insuficiência renal.
Sintomas de insuficiência renal incluem, - 15 porém não estão limitados a, níveis elevados de ureia no sangue, acúmulo ' de fosfatos no sangue, náuseas, vômito, perda de peso, urinação noturna, ' prurido, ritmos cardíacos anormais, inchaço das pernas, tornozelos ou pés, e dor nas costas ou laterais. : De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- - 20 rioé acidente vascular cerebral.
Um acidente vascular cerebral é a perda da função cerebral devido ao distúrbio no fornecimento de sangue para o cére- bro.
Estudos reportaram que os níveis de soro de IL-6 e TNF-a aumentam após acidente vascular cerebral (Ferrarese, C, e outros J.
Cerebral Blood Flow Metabol. 19: 1004-1009, 1999) e que o nível de expressão de IL-IêB é super-regulado após isquemia cerebral focal (Wang, X., e outros Strocke. 28:155-162, 1997). Sintomas de acidente vascular cerebral incluem, porém não estão limitados a, hemiplagia, entorpecimento, redução na sensação sensória ou vibratória, cheiro alterado, queda das pálpebras, problemas de equilíbrio, afasia, apraxia, déficits de memória e vertigem.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é hipertensão pulmonar.
Hipertensão pulmonar se refere a um aumento na pressão sanguínea na artéria pulmonar, veia pulmonar, ou capilares pul-
monares. Estudos reportaram que os níveis de TNF-a são elevados, com nenhuma diferença nos níveis de soro de IL-6, em pacientes com hiperten- são pulmonar (Joppa, P., e outros Chest. 130(2):326-333. 2006). Sintomas de hipertensão pulmonar incluem, porém não estão limitados a, falta de ar, tonturas, desmaios, edema periférico, e insuficiência cardíaca.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é toxemia de gravidez. Toxemia de gravidez (distúrbio hipertensivo de gravidez) coletivamente se refere à pré-eclampsia e eclampsia. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é pré-eclampsia.
—Pré-eclampsia é uma condição onde a hipertensão surge na gravidez em associação com quantidades significantes de proteína na urina. Estudos reportaram que os níveis plasmáticos de IL-6 e TNF-a foram aumentados na mulher com pré-eclampsia comparado com aquelas em gravidez no terceiro 7 trimestre normal (Conrad, K. e outros Am. J. Repro. Immunol. 40(2): 102-111 - 15 ,1998) Além disso, os níveis de IL-IB pareceram inalterados entre os gru- ' pos objetos (ld). Os sintomas incluem, porém não estão limitados a, pres- . são sanguínea elevada, dano generalizado ao endotélio maternal, rins e fi- gado. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é Ú eclampsia. Eclampsia é caracterizada pelo aparecimento de crises epiléti- - 20 castônico-clônicas (grande mal). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é de parto prematuro.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é doença/fenômeno de Raynaud. Doença de Raynaud é um distúrbio vascular que afeta o fluxo sanguíneo para as extremidades (os dedos das —mãos,dedos dos pés, nariz e orelhas) quando exposto às temperaturas frias ou em resposta a tensão psicológica. Estudos reportaram que IL-6 e TNF-a (Rychlik, W., e outros, Int. Angiol. 25(4):436. 2006) desempenham um papel na patogênese de fenômeno de Raynaud. Os sintomas de doença de Ray- naud incluem, porém não estão limitados a, cianose, e palidez. A doença de Raynoud é diagnosticada se os sintomas são idiopáticos, ao mesmo tempo em que o fenômeno de Raynoud ocorre secundário a uma grande variedade de outras condições, tal como, porém não limitado a, distúrbios do tecido conectivo, lúpus eritematoso sistêmico, artrite, e outras doenças reumáticas.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é uremia hemolítica.
Estudos reportaram que TNF-a e IL-| desempenha- ram papel importante na indução do mediador inflamatório verocitotoxina-1 durante a síndrome urêmica hemolítica (van de Kar, N.C., e outros Blood. 80(11):2755-2764, 1992). Estudos adicionais reportaram que os níveis de 1L-6 também ficam elevados (Karpman, D., e outros Ped.
Nephrol. 9(6)::694- 699, 1995). Uremia hemolítica é uma doença caracterizada por anemia he- molítica (rompimento anormal de células sanguíneas vermelhas), insuficiên- ciarenal aguda (uremia) e baixa contagem de plaqueta (trombocitopenia). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é fissura anal.
Uma fissura anal é uma laceração ou quebra natural na pele do canal anal.
A maioria das fissuras anais é causada pelo estiramento . da mucosa anal além de sua capacidade.
As fissuras anais superficiais ou - 15 pouco profundas geralmente se cicatrizarão sozinhas.
Algumas fissuras a- . nais se tornam crônicas e profundas e não cicatrizarão.
A causa mais co- ' mum de não cicatrização é o espasmo do músculo esfíncter anal interno que resulta no fornecimento prejudicado de sangue para a mucosa anal.
Estudos Ú reportaram que a mucosa retal IL-IB, IL-6 e soro IL-6 e TNF-a foram maiores . 20 em pacientes com doença de Crohn perianal, do que em paciente com do- ença de Crohn do intestino delgado e controles de saúde (Ruffolo, C, e ou- tros Infl.
Bowel Dis. 14(10):1406- 1412, 2008). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é acalasia.
Acalasia (acalasia esofágica, acalasia cardiae, cardioespas- mo, aperistaltismo esofágico) é um distúrbio da motilidade esofágica.
A ca- mada do músculo liso do esôfago perde o peristaltismo normal e o esfíncter esofágico inferior não relaxa apropriadamente em resposta a deglutição.
Es- tudos reportaram que IL-6 e IL- IB são produzidos em quantidades significan- temente grandes na mucosa de pacientes de esfagite comparado com aque- lasde pacientes de controle (Rieder, F., e outros Gastroenterol. 132(1):154- 165, 2007). Os sintomas incluem, porém não estão limitados a, disfagia, regurgitação, perda de peso, tosse e dor no peito.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é impotência. A disfunção erétil (ED) é uma disfunção sexual caracteriza- da pela incapacidade de desenvolver ou manter uma ereção do pênis. Uma ereção ocorre como um efeito hidráulico devido ao sangue que entra e fica retido nos corpos similares a esponja dentro do pênis. Estudos reportaram que níveis sanguíneos aumentados de IL-6, IL-IB e TNF-a em pacientes de ED se correlacionaram negativamente com o desempenho sexual (Vlacho- poulos, C, e outros Eur. Heart. J. 27(22):2640-2648. 2006). ED pode ser um sintoma de cardiovascular doença.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é enxaqueca. Uma enxaqueca é uma síndrome neurológica caracterizada por dores de cabeça severas, náuseas e percepções corpóreas alteradas. Estudos reportaram níveis de soro aumentados de IL-6 e TNF-a durante a- ' taques de enxaqueca (Peterlin, B., e outros, Cephalagia. 27(5);435-446. - 15 2007). Uma cefaleia hemicrânia é unilateral e pulsante, durante de 4 horas a - 72 horas; os sintomas incluem, porém não estão limitados a, náusea, vômito, ' fotofobia, e fonofobia.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- i rio é lesão muscular isquêmica associada com espasmo do músculo liso. - 20 Estudos reportaram que IL-1, IL-6 e TNF-a causam um efeito inotrópico ne- gativo e induz a apoptose no miocárdio submetido a reperfusão isquêmica (Saini, H.K., e outros Exp. Clin. Cardiol. 10(4):213-222, 2005). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é vasculopatia. Vasculopatia se refere a um grupo heterogêneo de distúr- bios caracterizados pela destruição inflamatória de vasos sanguíneos. Tanto as artérias como as veias podem ser afetadas. Estudos reportaram que 1IL-6 é um importante fator de risco para a vasculopatia coronária relacionada com o transplante cardíaco (Densem, C, e outros J. Heart Lung Transp, 24(5):559-565, 2005). Sintomas de vasculopatia incluem, porém não estão limitados a, febre, perda de peso, púrpura, livedo reticular, mialgia ou miosi- te, artralgia ou artrite, mononeurite múltipla, cefaleia, acidente vascular cere- bral, tinido, acuidade visual reduzida, perda visual aguda, infarto do miocár-
dio, hipertensão, gangrena, sangramento nasal, tosse com sangue, infiltra- dos pulmonares, dor abdominal, fezes com sangue, e glomerulonefrite. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é insuficiência cardíaca congestiva (CHF). Insuficiência cardíaca conges- tivaé uma condição na qual o coração é incapaz de manter uma circulação adequada de sangue no corpo. Estudos reportaram que pacientes com CHF aumentaram os níveis de IL-6 e TNF-a quando comparado com paciente saudáveis normais (Aukrust, P. e outros Am. J. Cardiol. 83(3):376-382. 1999). Os sintomas típicos de CHF incluem, porém não estão limitados a, deficiência respiratória, tosse, inchaço dos pés e tornozelos, inchaço do ab- dômen, ganho de peso, pulso irregular ou rápido, fadiga, fraqueza, arritmias, anemia, e hipertiroidismo.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- . rio é miocárdio atordoado ou hibernante. O termo "isquemia miocárdica crô- - 15 nica (CMI)" como utilizado aqui se refere a um estado subagudo ou crônico ' prolongado de isquemia miocárdica devido ao estreitamento de um vaso ' sanguíneo coronário no qual o miocárdio "hiberna", significando que o mio- cárdio sub-regula ou reduz sua contratilidade, e, portanto sua demanda de : oxigênio miocárdico, para combinar com perfusão reduzida, desse modo . 20 preservando a viabilidade celular e prevenindo a necrose miocárdica. Este miocárdio hibernante é capaz de retornar para a função normal ou próxima do normal na restauração de um fornecimento de sangue adequado. Uma vez que o fluxo sanguíneo coronário foi restaurado para o normal ou próximo do normal e isquemia é resolvida, entretanto, o miocárdio hibernante ainda nãocontrai. Este desequilíbrio da função de fluxo resultando em um retorno lento da função cardíaca após a resolução de isquemia foi chamado de ator- doamento. A duração de tempo para a função retornar é muito variável, va- riando de dias a meses, e é dependente de vários parâmetros, incluindo a duração do insulto isquêmico original, da gravidade de isquemia durante o insulto original, e a adequação do retorno do fluxo arterial. Vários estudos forneceram evidência para inflamação no miocárdio hibernante. Heusch, G. e outros, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288: 984-99 (2005). Estudos também reportaram que citocinas proinflamatórias tais como IL-6 e TNF-a são elevadas após revascularização coronária não complicada e podem con- tribuir com a isquemia miocárdica pós-operatória e anormalidades da parede segmentar (Rankin, J.
J.
Thorac.
Cardiovas.
Surg. 108:626-35. 1994). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é a disfunção diastólica.
Disfunção diastólica se refere a uma anormali- . dade no preenchimento do coração (isto é, ventrículo esquerdo) durante a diástole.
A diástole é aquela fase do ciclo cardíaco quando o coração (isto é, ventrículo) não está contraindo, porém está atualmente relaxado e en- chendo de sangue, isto é, sendo retornado para ele, ou do corpo (no ventri- culo direito) ou dos pulmões (no ventrículo esquerdo). Estudos envolveram IL-6, IL-Iê e TNF-a na mediação de depressão miocárdica em sepse sistêmi- ca e outras formas de disfunção cardíaca (Kelly, R., e Smith, T.
W.
Circulati- ' on, 95:778-781, 1997). Sintomas incluem, porém não estão limitados a, e- - 15 dema pulmonar, hipertensão, estenose aórtica, tecido cardíaco com cicatriz, e diabete. ' De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é gliose (significando uma proliferação de astrócitos, que pode incluir de- i ] posição de matriz extracelular (ECM) em áreas danificadas do sistema ner- . 20 voso central). Estudos reportaram que IL-1 e IL-6 reforçaram a formação de cicatriz glial, ao mesmo tempo em que TNF-a, que não induz liberação de IL- 6, não induz gliose (Woiciechowsky, C, e outros Med.
Sci.
Monit. 10(9): BR325-330. 2004). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioéadoença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (significando doenças do trato respiratório caracterizadas pela limitação ou obstrução do fluxo de ar; que inclui, porém não está limitado a, bronquite crônica e enfisema). Os ní- veis aumentados de IL-6, IL-IB e TNF-a foram medidos na saliva de pacien- tes com COPD (Chung, K.
Eur.
Respir.
J. 18:50s-59S, 2001). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é osteopenia.
Osteopenia é uma condição onde a densidade mineral ós- sea (que indica o quanto denso e forte o osso é) é menor do que aquela de um paciente saudável normal, porém não baixa o suficiente para ser classifi- cada como osteoporose. Osteopenia pode ser definida como um escore T de densidade mineral óssea entre -1,0 e -2,5 como medido por absorciome- tria de raios X de energia dual (DEXA). Estudos reportaram que IL-IB, IL-6 e TNF-a desempenham um papel na indução de reabsorção óssea (Rifas, L. Calcif. Tissue Int. 64:1-7. 1999).
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é artrite degenerativa (osteoartrite, OA). Osteoartrite é um tipo de artrite que é causada pelo rompimento e perda eventual de cartilagem de uma ou mais articulações. Osteoartrite geralmente afeta as mãos, pés, medula ós- sea e articulações portando peso grande tal com os quadris e os joelhos. Estudos reportaram que as alterações inflamatórias crônicas com produção de citocinas pró-inflamatórias (IL- la, IL-IB, TNF-a) são uma característica de . membranas sinoviais de pacientes com OA precoce (Smith, M.D., e outros, - 15 dJ. Rhematol. 24(2):365-371, 1997). Sintomas de osteoartrite incluem, porém ' não estão limitados a, dor nas articulações afetadas após uso repetitivo, in- 7 Chaço, calor, e ranger das articulações afetadas. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- Ú rio é espondilite ancilosante. De acordo com algumas tais modalidades, o - 20. distúrbio inflamatório é doença de Sjorgen. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é Síndrome de Guilliame-Barre. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é esclero- derma.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioésepse. Sepse é uma condição caracterizada por um estado inflamató- rio de todo o corpo (síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS)) e a presença de uma infecção conhecida ou suspeita. O corpo pode desenvol- ver sua resposta inflamatória aos micróbios no sangue, urina, pulmões, pele ou outros tecidos. Estudos envolveram IL-6 e TNF-a como mediadores prin- cipaisna inflamação, morbidez, e mortalidade associados com sepse (Leon, L, e outros Am. J. Physiol. Regul. integr. Comp. Physiol. 275:R269-R277. 1998). Os sintomas de sepse incluem, porém não estão limitados a, inflama-
ção aguda presente em todo o corpo, febre, contagem elevada de glóbulos brancos, náuseas e vômito, frequência cardíaca elevada, e frequência respi- ratória elevada.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio é choque endotoxêmico.
Septicemia é uma doença sistêmica com toxicidade devidoa invasão da corrente sanguínea por bactérias virulentas provenien- tes de um banco local de infecção.
Os sintomas incluem, porém não estão limitados a, calafrios, febre, e fadiga.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é psoríase.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é enterite de radiação.
Enteropatia de radiação (enterite de radiação) é uma inflamação (inchaço) do revestimento do intestino delgado devido à te- rapia de radiação.
Estudos reportaram que os níveis de mRNA de IL-IB e ' TNF-a aumentam após a irradiação, e que a expressão de IL-6 se torna ele- - 15 vada (Linard, C, e outros Int.
J.
Rad.
Oncol.
Biol.
Phy.58(2):427-434. 2004). O sintomas de enterite de radiação incluem, porém não estão limitados a, " anorexia, diarreia, náuseas, vômito e perda de peso.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- ' rio é cirrose.
Cirrose é a formação de cicatriz no fígado e má função biliar - 20 como um resultado de doença biliar crônica (CLD). Estudos reportaram que níveis de soro de IL-IB, TNF-a e IL-6 foram elevados em pacientes com do- ença biliar crônica, e que o grupo cirrótico de paciente de CLD mostrou ní- veis mais elevados de soro de IL-IB, IL-6 e TNF-a do que os casos não cirró- ticos (Tilg, H., e outros Gastroenterology. 103(1):264-74. 1992). Os sintomas de cirrose incluem, porém não estão limitados a, sangramento de hemorroi- da, confusão, impotência, icterícia, náuseas e vômito, perda de peso, incha- ço, indigestão abdominal, febre, dor abdominal, e diminuição da diurese.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é fibrose intersticial.
A doença pulmonar intersticial, ou I1LD, inclui mais do que 180 distúrbios pulmonares crônicos, os quais podem ser crônicos, não malignos (não cancerosos), e não infecciosos.
As doenças pulmonares intersticiais são designadas para o tecido entre os sacos de ar dos pulmões chamados interstício, que é o tecido afetado pela fibrose (formação de cica- triz). As doenças pulmonares intersticiais também podem ser chamadas de fibrose pulmonar intersticial ou fibrose pulmonar. Estudos reportaram que níveis elevados de expressão de IL-IB são acompanhados por um aumento localdelL-6elNF-ae uma resposta de tecido inflamatória aguda vigorosa com evidência de lesão de tecido (Kolb, M., e outros J. Clin. Invest 107(12):1529-1536, 2001). Os sintomas e curso de cada destas doenças podem variar de pessoa para pessoa, porém a ligação comum entre as mui- tas formas de ILD é que eles todos começam com uma inflamação, por e- xemplo, bronquiolite (inflamação que envolve os bronquíolos (vias aéreas pequenas)); alveolite (inflamação que envolve os alvéolos (sacos de ar)); ou vasculite (inflamação que envolve os pequenos vasos sanguíneos (capila- res)). Mais do que 80 por cento das doenças pulmonares intersticiais são " diagnosticadas como pneumoconiose, um doença induzida por fármaco, ou - 15 pneumonite por hipersensibilidade. Os outros tipos de são sarcoidose; fibro- se pulmonar idiopática; bronquiolite obliterante; histiocitose X; pneumonia ' eosinofílica crônica; doença vascular de colágeno; vasculite granulomatosa; síndrome de Goodpasture, e proteinose alveolar pulmonar. : De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- . 20 rioécolite. Colite é inflamação (inchaço) do intestino grosso (cólon). Colite pode ter muitas causas diferentes tais como, por exemplo, infecções crônicas e agudas, distúrbio inflamatórios (colite ulcerativa, doença de Crohn, colite linfocítica e colagenosa), carência de fluxo sanguíneo (colite isquêmica) e radiação passada do intestino grosso. Estudos reportaram que a inibição de TNF-aem modelos de animal de colite leva aos níveis reduzidos de IL-| e IL- 6 e severidade reduzida de colite (Neurath, M., e outros Eur. J. Immunol. 27(7): 1743-1750, 2005). Os sintomas de colite incluem, porém não estão limitados a, hemorragia abdominal, dor abdominal, fezes com sangue, desi- dratação, diarreia e gases intestinais aumentados.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é apendicite. Apendicite é inflamação do apêndice. O apêndice é uma pequena bolsa presa ao intestino grosso. Estudos reportaram que níveis elevados de IL-6 mostram a melhor tendência na diagnose de apendicite aguda (Paajanen, H., e outros Scan. J. Clin. Lab. Invest. 62(8):579-584, 2002). Estudos adicionais reportaram que TNF-a está presente junto com níveis baixos de IL-6 no fluido peritoneal de pacientes com apendicite (Fer- —nando,A, e outros Ann. Surg. 237(3):408-416, 2003). Os sintomas de apen- dicite incluem, porém não estão limitados a, dor abdominal, febre, apetite reduzido, náuseas, vômito, calafrios, e constipação. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é gastrite. Gastrite é uma inflamação do revestimento do estômago. As causas comuns de gastrite incluem, por exemplo, álcool, tabagismo, e infec- ção bacteriana. Estudos reportaram que a produção de TNF-a e IL-6 pela mucosa gástrica humana foi significantemente maior em pacientes infecta- dos com Helicobacter pylori, todos dos quais tiveram gastrite crônica, do que . em pacientes que tinham H. pylori negativo com mucosa gástrica histologi- - 15 camente normal (Crabtree, J., e outros Gut. 32: 1473-1477, 1991). Os sin- ' tomas de gastrite incluem, porém não estão limitados a, dor abdominal, indi- " gestão abdominal, fezes escuras, perda de apetite, náuseas, vômito, exan- gue no vômito ou material como café moído. Ú De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- - 20 rioélaringite. Laringite é inflamação da laringe. Laringite geralmente está associada com rouquidão de perda da voz. A laringe está localizada na par- te de cima da traqueia e contém as cordas vocais. Quando as cordas vocais ficam inflamadas ou infectadas, elas incham. Isto pode causar rouquidão, e pode algumas vezes bloquear as vias aéreas. Estudos reportaram que IL- IB,IL-6e TNF-a são aumentados em casos onde a laringite é induzida por intubação nasogástrica (Lima-Rodrigues, M., e outros Larynscope.l 18(1):78-
86. 2008). Sintomas de laringite incluem febre, rouquidão, e glândulos ou linfonodos inchados no pescoço. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioé meningite. Meningite é inflamação das membranas cobrindo o cérebro e medula espinhal que afeta o fluido cerebroespinhal. Estudos reportaram que formas recombinantes de IL-6 e TNF-a podem induzir meningite ou le-
são da barreira hematoencefálica, e sugerem que a geração in sito de IL-| no fluido cerebroespinhal (com ou sem TNF) é capaz de mediar tanto a inflama- ção meníngea quanto a lesão da barreira hematoencefálica vista em várias infecções do sistema nervoso central (Quagliarello, V., e outros J.
Clin.
In- vest,87(4): 1360-1366, 1991). Os sintomas de meningite incluem, porém não estão limitados a, febre, calafrios, alterações do estado mental, náuseas e vômito, fotofobia, cefaleia grave, meningismo, agitação e respiração rápi- da.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rioéotite Otite se refere a infecção ou inflamação do ouvido.
Otite pode afetar as partes internas e externas do ouvido.
A condição é classificada de acordo com se ela ocorre subitamente e durante um tempo curto (aguda) ou repetidamente durante um período longo de tempo (crônica). Estudos repor- ] taram que os níveis de IL-IB e TNF-a ficam elevados em modelos de animal - 15 deotite média (Sato, K., e outros Ann.
Otol.
Rhinol.
Laryngol. 108(6):559-63, i 1999). Estudos adicionais reportaram níveis elevados de IL-6 em paciente ' com otite média com efusão (Jang, C. e Kim, Y.
Int.
J.
Ped.
Otorhinol. 66(1 ):37, 2002). Os sintomas incluem, porém não estão limitados a, calafrios, Ú diarreia, drenagem do ouvido, dor de ouvido, ruído ou zumbido nos ouvidos, ' 20 febre, perda da audição, irritabilidade, náuseas e vômito.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é lesão por reperfusão.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é lesão cerebral traumática.
A lesão cerebral traumática é causada por um golpe ou choque na cabeça ou por um traumatismo craniano penetrante que rompe a função normal do cérebro.
Nem todos os golpes ou choques na cabeça resultam em uma lesão cerebral traumática.
A gravidade da le- são cerebral traumática pode variar de "suave" (uma breve alteração no es- tado mental ou consciência) para grave (um período prolongado de incons- ciênciaou amnésia após a lesão). Estudos reportaram que níveis tanto de IL-6 quanto de TNF-a ficam elevados em pacientes com lesão cerebral traumática grave (Csuka, E., e outros J.
Neuroimmunol. 101(2):21 1-21, T—— Ôqn
1999). Os sintomas de lesão cerebral traumática incluem, porém não estão limitados a, cefaleias ou dor no pescoço, dificuldade de recordar, concentrar ou tomar decisões, fadiga, alterações no humor, náuseas, fotofobia, visão desfocada, zumbido nos ouvidos, e perda de sentido do estado ou cheiro.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é lesão da medula espinhal.
A lesão ou trauma da medula espinhal é o dano à medula espinhal que pode resultar da lesão direta na medula propri- amente dita ou indiretamente do dano aos ossos, tecidos ou vasos sanguí- neos circundantes.
Estudos reportaram que os níveis de expressão de TNF- afll-6ell-IBficam elevados na medula espinhal lesionada (Hayashi, M., e outros J.
Neurotrauma. 17(3):203-18, 2000). Os sintomas de lesão da medu- la espinhal incluem, porém não estão limitados a, fraqueza e perda sensória em e abaixo do ponto da lesão, dificuldades respiratórias, perda do controle
. da bexiga e intestino normais, entorpecimento, espasticidade, e dor. - 15 De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- : rio é neuropatia periférica.
O termo "neuropatia periférica" se refere ao dano ' ao sistema nervoso periférico.
Foi reportado que IL-6 é superexpressado após axotomia experimental e que os níveis de IL-l e TNF-a progressiva- mente aumentam após a lesão (esmagamento do nervo) (Creange, A., e - 20 outros Eur.
Citocina Network. 8(2): 145-51, 1997). Os sintomas estão rela- cionados com o tipo de nervo afetado e podem ser vistos durante um perío- do de dias, semanas, ou anos.
A fraqueza muscular é o sintoma mais co- mum de dano do nervo motor.
Outros sintomas podem incluir cãibras dolo- rosas e fasciculações (contrações musculares descontroladas visíveis na pele), perda muscular, degeneração óssea, e alterações na pele, cabelo e unhas.
O dano do nervo sensório causa uma variação mais complexa de sintomas porque os nervos sensórios têm uma faixa maior, mais altamente especializada de funções.
As fibras sensórias maiores inclusas na vibração de registro de mielina, toque leve, e sentido da posição.
O dano às fibras sensórias grandes perdem a capacidade de sentir vibrações e toques, resul- tando em um sentido geral de entorpecimento, especialmente nas mãos e pés.
As fibras sensórias menores sem bainhas de mielina transmitem dor e Ta sensações de temperatura.
Os sintomas de dano do nervo autonômico são diversos e dependem de quais órgãos ou glândulas são afetados.
Sintomas comuns de dano do nervo autonômico incluem uma incapacidade de suar normalmente, que pode levar à intolerância ao calor; uma perda do controle da bexiga, que pode causar infecção ou incontinência; e uma incapacidade de controlar os músculos que se expandem ou contraem os vasos sanguí- neos para manter os níveis seguros de pressão sanguínea.
Uma perda de controle sobre a pressão sanguínea pode causar vertigens, tonturas, ou mesmo desmaio quando uma pessoa se move subitamente de uma posição sentada para uma posição de pé (uma condição conhecida como hipotensão postural ou ortostática). Os sintomas gastrointestinais frequentemente a- companham neuropatia autonômica.
Os nervos que controlam as contra- ções do músculo intestinal geralmente funcionam mal, levando a diarreia, ' constipação ou incontinência. . 15 De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é esclerose múltipla.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúr- " bio inflamatório é lúpus (lúpus eritematoso sistêmico). De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- | rio é síndrome cardiometabólica.
Síndrome cardiometabólica (Síndrome X, . 20 CMS) é definida como a presença de quaisquer três das seguintes condi- ções: (i) excesso de peso em torno da cintura; (ii) níveis elevados de triglice- rídeos; (iii) níveis baixos de HDL (colesterol bom); (iv) pressão sanguínea elevada; e (v) níveis elevados de glicose no sangue em jejum.
A prevalência crescente de CMS foi relacionada com a obesidade, que aumentou entre muitos grupos de idade.
Atualmente é aceito que CMS prediga a mortalida- de cardiovascular e/ou o desenvolvimento de diabete melito tipo 2. CMS é também complicado por modificações na composição corporal e redistribui- ção de gordura e geralmente está associado com a sensibilidade de insulina alterada.
Muitas pessoas com diabete têm várias destas condições ao mesmo tempo.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio infla- matório é obesidade.
Obesidade foi definida pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) como um índice de massa corporal (BMI) de 30 e acima.
O Índice de Ta massa Corporal é uma relação padronizada de peso para altura, e geralmen- te é utilizado como um indicador geral de saúde. BMI pode ser calculado dividindo-se o peso (em quilogramas) pelo quadrado da altura (em metros). Um BM! entre 18,5 e 24,9 é considerado normal para a maioria dos adultos. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamatório é diabete metlito do tipo Il. A diabete tipo 2 (diabete melito não dependente de insulina (NIDDM), diabete de início adulto) é um distúrbio metabólico que é princi- palmente caracterizado por resistência a insulina (células não respondem apropriadamente quando a insulina está presente), deficiência de insulina relativa e hiperglicemia. IL-6 não somente transmite sensibilidade á insulina, porém também é um determinante principal da produção hepática de proteí- na reativa a C (a fonte mais importante deste marcador inflamatório). Um estudo em pacientes de diabete tipo 2 mostrou que níveis circulantes de IL-6 ] se correlacionam fortemente com a área de gordura visceral (VFA), e que o - 15 enrijecimento da artéria carótida (um índice de aterosclerose) se correlacio- nou tanto com VFA quanto com os níveis de IL-6 e proteína reativa a C, su- " gerindo que IL-6 derivada de adipócito intra-abdominal pode estar envolvida na aterosclerose acelerada de pacientes de diabete do tipo 2 (Despres, J, ] Eur. Heart J. Suppl. 8(B):B4-B12, 2006). Os sintomas de diabete tipo 2 in- - 20 cluem,porém não estão limitados a, poliúria e polidispia.
De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é diabete melito tipo |. De acordo com algumas tais modalidades, o distúrbio inflamató- rio é esteatoepatite não alcoólica (NASH). NASH é inflamação gordurosa do fígado quando não devido ao uso de álcool excessivo. Em NASH, a gordura se forma no fígado e eventualmente causa tecido de cicatriz. NASH pode levar a cirrose. Estudos reportam que os níveis de TNF-a são aumentados em paciente com NASH (Bahceicoglu, H., e outros Hepatoenterology. 52(65): 1549-53, 2005). Estudos adicionais reportaram níveis de IL-6 eleva- dos (Kugelmas, M., e outros Hepatology. 38(2):413-9. 2003) e níveis de IL-IB (Brun, P., e outros Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292:G518- G525, 2007) em paciente de NASH. Os sintomas de NASH incluem, porém não estão limitados a, fadiga, mal-estar, e desconforto abdominal do qua- drante superior direito do baço. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do pep- tídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a — sequência de aminoácido KALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 13]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do pep- tídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a sequência de aminoácido KALARQLGV AA [SEQ ID NO: 23]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a sequência de aminoácido WLRRIKA WLRRIKA [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de - proteína do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade - 15 substancial com a sequência de aminoácido WLRRIKA WLRRI [SEQ ID NO: 34). 7 De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 85% Ú de identidade de sequência de aminoácido com um peptídeo inibidor tera- : 20 pêutico, em que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a se- quência de aminoácido WLRR1KAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ |D NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase. Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 86% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase. Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isola- do codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 87% de identidade de se- —quênciade aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], onde o polipeptídeo
TE inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais mo- dalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo tendo pelo me- nos 88% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a se- quênciade aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], onde o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 89% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 14], onde o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isola- do codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de se- . quência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo - 15 inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], onde o polipeptídeo inibe a ' atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalida- des, o ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo tendo pelo menos Ú 91% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor te- . 20 rapêutico, em que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a se- quência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 92% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isola- do codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 93% de identidade de se- quênciade aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, em que o peptí- deo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais mo- dalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo tendo pelo me- nos 94% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a se- — quênciade aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], onde o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, em que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isola- do codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de se- - quência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo - 15 inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe ' a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalida- des, o ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo tendo pelo menos Ú 97% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor te- ' 20 rapêutico, em que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a se- quência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequência de aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, em que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase.
Em algumas tais modalidades, o ácido nucleico isola- do codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 99% de identidade de se- — quênciade aminoácido com o peptídeo inibidor terapêutico, onde o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKA WLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO; 14], em que o polipeptídeo inibe a atividade de quinase de uma enzima quinase. Em algumas tais modalida- des, o peptídeo inibidor terapêutico tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14] é operavelmente ligado a um elemento regulador controlável. De acordo com outra modalidade, o peptí- deo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequên- cia de aminoácido FAKLAARL YRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo ' tendoa sequência de aminoácido KAF AKLAARL YRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARQARAKALAR- QLGVAA [SEQ ID NO: 11]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo . inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARA- - 15 AARQ ARAKALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 16]. De acordo com outra moda- lidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de ' aminoácido YARAAARGOQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a Ê sequência de aminoácido YARAASARGQRAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]. ' 20 De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um pep- tídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARGOQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor tera- pêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARGAORA- KALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20]. De acordo com outra modalidade, o peptí- deo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARGORAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21].
De acordo com outra modalidade, a composição de inibição de quinase, em que é desejável liberar a composição localmente, pode ser for- mulada para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apre- sentadas na forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multidose, com um conservante adicionado. As composi-
ções podem adotar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilizante e/ou dispersante. As formula- ções farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, as sus- pensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Os veículos ou solventes lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. As sus- pensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a vis- cosidade da suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos para ' permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Alternativamen- - 15 te, os compostos ativos podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes do ' uso.
As composições farmacêuticas (isto é, composições de inibição | de quinase) também podem compreender excipientes ou veículos de fase de ' 20 gelousólida adequados. Os exemplos de tais veículos ou excipientes inclu- em, porém não estão limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vá- rios açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina, e polímeros tais co- mo polietileno glicóis. As formas de preparação farmacêutica líquida e sólida adequa- dassão, por exemplo, microencapsuladas, e se apropriado, com um ou mais excipientes, encocleados, revestidos em partículas de ouro microscópicas, contidas nos lipossomas, péletes para implantação no tecido, ou secas so- bre um objeto a ser esfregado no tecido. Tais composições farmacêuticas também podem estar na forma de grânulos, contas, pós, comprimidos, com- primidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, sus- pensões, cremes, gotas ou preparações com liberação prolongada de com- postos ativos, em cujos excipientes de preparação e aditivos e/ou auxiliares tais como desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes umectantes, lubrificantes, ou solubilizantes são geralmente utilizados como descrito acima. As composições farmacêuticas são adequadas para uso em uma variedade de sistemas de liberação de fármaco. Para uma breve revi- sãode métodos para liberação de fármaco, vide Langer 1990 Science 249, 1527-1533, que está incorporado aqui por referência.
A composição de inibição de quinase, e opcionalmente outros te- rapêuticos, podem ser administrados per se (líquido) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando utilizado em remédios os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, porém os sais não farmaceuticamente aceitáveis podem convenientemente ser utilizados para preparar sais farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, porém não estão limitados àqueles preparados dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílicos, p-tolueno sulfônico, - 15 tartárico, cítrico, metano sulfônico, fórmico, malônico, sucínico, naftaleno-2- sulfônico, e benzeno sulfônico. Além disso, tais sais podem ser preparados " como sais de metal alcalino ou alcalinoterrosos, tais como sais de sódio, po- tássio, ou cálcio do grupo de ácido carboxílico. Por "sal farmaceuticamente Ú aceitável" é entendido aqueles sais que estão no escopo do diagnóstico mé- . 20 dico seguro, adequado para uso em contato com os tecidos de humanos e animais menores sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida e ou- tros e são comensurados com uma relação de risco/benefício razoável. Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, P, H. Stahl, e outros descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em deta- lhes em "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Wiley VCH, Zurich, Alemanha: 2002). Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento final e purificação dos compostos descritos na presente invenção ou separadamente reagindo-se uma função de base livre com um ácido orgânico adequado. Os sais de adição de ácido representativos inclu- em, porém não estão limitados a, acetato, adipato, alginato, citrato, asparta- to, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, canforato, canforsufo- nato, digliconato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, fuma-
: 102/155 rato, cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, 2- hidroxietanossulfona- to(isetionato), lactato, maleato, metanossulfonato, nicotinato, 2- naftalenossulfonato, —“oxalato, pamoato, pectinato, persulfato 3- fenilpropionate, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenossulfonato e undecanoato.
Além disso, os grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com tais agentes como haletos de alquila inferior tal como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila propila, e butila; sulfatos de dialquila como sulfatos dimetila, dietila, dibutila e diamila; haletos de cadeia longa tais como clore- tos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila; haletos de ari- lalquila como brometos de benzila e fenetila e similares.
Os produtos diper- síveis ou solúveis em água ou óleo são desse modo obtidos.
Os exemplos de ácidos que podem ser empregados para formar sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem tais ácidos inorgânicos como ácido - 15 clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, e ácido fosfórico e tais ácidos orgânicos como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico, e ácido cítrico. " Os sais de adição básicos podem ser preparados in situ durante isolamento e purificação final de compostos descritos na invenção reagindo-se uma fra- Ú ção contendo ácido carboxílico com uma base adequada tal como o hidróxi- ' 20 do, carbonato ou bicarbonato de um cátion de metal farmaceuticamente a- ceitável ou com amônia ou uma amina orgânica primária, secundária, ou terciária.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados a, cátions com base em metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos tais como sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e simila- rese cátions de amina e amônia quaternária não tóxica incluindo amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina e similares.
Outras aminas orgânicas re- presentativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etile- nodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina e similares.
Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser obtidos utilizando procedimentos padrões bem conhecidos na técnica, por exemplo, reagindo- se um composto suficientemente básico tal como uma amina com um ácido
Ta adequado proporcionando um ânion fisiologicamente aceitável. Os sais de metal de álcali (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou metal alcalinoterroso (por exemplo, cálcio ou magnésio) de ácidos carboxílicos também podem ser feitos.
As formulações podem ser apresentadas convenientemente em forma de dosagem de unidade e podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos inclu- em a etapa de trazer em associação um peptídeo de inibição de quinase, ou um éster, sal, hidrato, solvato ou profármaco farmaceuticamente aceitável do mesmo ("composto ativo") com o veículo que constitui um ou mais agentes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e in- timamente levando-se em associação o agente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e em seguida, se necessá- rio, formando o produto na formulação desejada.
- 15 O agente farmacêutico ou um éster, sal, hidrato, solvato, ou pro- fármaco farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser misturado com 7 outros materiais ativos que não transmitem a ação desejada, ou com materi- ais que suplementam a ação desejada. As soluções ou suspensões utiliza- ' das para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea, intratecal, ou tópica . 20 podem incluir, porém não estão limitadas, por exemplo, aos seguintes com- ponentes; um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicot ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil para- benos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agen- tes de quelação tais como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade tal como dextrose ou cloreto de sódio. A preparação parental pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico. Os veículos particulares administrados intravenosamente são salina fisiológica ou salina tamponada por fosfato (PBS).
As composições farmacêuticas para injeção parenteral compre- endem soluções, dispersões, suspensões ou emulsões farmaceuticamente aceitáveis estéreis aquosas ou não aquosas e pós estéreis para reconstitui- ção em dispersões ou soluções injetáveis estéreisó. Uma "solução" geral- mente é considerada como uma mistura homogênea de duas ou mais subs- tâncias. É frequentemente, embora não necessariamente, um líquido. Em uma solução, as moléculas do soluto (ou substância dissolvida) são unifor- memente distribuídas entre aquelas do solvente. Como utilizado aqui, "sis- tema disperso" ou "dispersão" se refere a um sistema de duas fases no qual uma fase é distribuída como partículas ou gotículas no segundo, ou fase contínua. O termo "suspensão" como utilizado aqui se refere às prepara- ções de substâncias finamente divididas, não dissolvidas dispersas em veí- culos líquidos. O material particulado de uma suspensão pode sedimentar lentamente do veículo líquido no qual ele é disperso; portanto, as suspen- sões devem ser bem agitadas antes do uso para garantir distribuição unifor- me de sólido no veículo e desse modo dosagem uniforme e apropriada. , 15 Como utilizado aqui "emulsão" se refere a um sistema coloide no qual tanto a fase dispersa quanto o meio de dispersão são líquidos imiscíveis onde o ' líquido disperso é distribuído em pequenos glóbulos em todo o corpo do lí- quido de meio de dispersão. Uma emulsão básica estável contém pelo me- ' nos os dois líquidos e um agente emulsificante. Os tipos comuns de emul- . 20 sões são de óleo em água, onde o óleo é o líquido disperso e uma solução aquosa, tal com água, é o meio de dispersão, e água em óleo, onde, inver- samente, uma solução aquosa é a fase dispersa. Também é possível prepa- rar emulsões que são não aquosas.
Os exemplos de portadores, diluentes, solventes ou veículos a- quosos e não aquosos adequados incluem água, etanol, polióis (propileno glicol, polietileno glicol, glicerol, e similares), misturas adequadas dos mes- mos, óleos vegetais (tal como, óleo de oliva) e ésteres orgânicos injetáveis tal com oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como licitina, pela conservação do tamanho de partícularequerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos. Estas composições podem também conter adjuvantes incluindo agentes conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agen-
tes dispersantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser ga- rantida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, para- benos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio esimilares. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pelo uso de agentes de retardamento de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agen- tes de suspensão, como, por exemplo, alcoóis de isostearila etoxilados, sor- bitol de polioxietileno e ésteres de sorbitan, celulose microcristalina, meta- hidróxido de alumínio, bentonita, agar-agar, tragacanto, e misturas dos mesmos.
As formas de depósito injetáveis são feitas formando-se matrizes microencapsuladas do fármaco em polímeros biodegradáveis tais como poli- , 15 lactideo-poliglicolida. Dependendo da relação de fármaco para polímero e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação de fár- . maco pode ser controlada. Tais formulações de ação longa podem ser for- muladas com materiais hidrofóbicos ou poliméricos adequados (por exem- Ú plo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permuta de íon, : 20 ou como derivados frugalmente solúveis, por exemplo, como um sal frugal- mente solúvel. Os exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações injetáveis de depósito são também preparadas capturando-se o fármaco em lipossomas ou microemul- sões que são compatíveis com os tecidos corpóreos.
As formulações localmente injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéreo exatamente antes do uso. As preparações injetáveis, porexemplo, suspensões oleaginosas ou aquosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando agentes de dispersão e umectação adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução, suspensão ou emulsão inje- tável estéril em um diluente não tóxico, parenteralmente aceitável ou solven- te tal como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U. S. Pe solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, os óleos estéreis, fixos convencionalmente são empregados ou como um meio solvente ou de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo suave pode ser empre- gado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos gra- xos tais como ácido oleico são utilizados na preparação de injetáveis.
As formulações para administração parenteral (incluindo, porém não limitado a, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intrate- cal e intra-articular) incluem soluções de injeção estéril aquosas e não aquo- sas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos, que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e . 15 suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresenta- ' das em recipientes de dose de unidade ou de multidose, por exemplo, fras- cos e ampolas seladas, e podem ser armazenadas em uma condição liofili- ' zada requerendo a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, salina, á- . 20 gua parinjeção, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. Outro método de formulação das composições descritas aqui envolve conjugar os compostos descritos aqui para um polímero que realça a solubilidade aquosa. Os exemplos de polímeros adequados incluem, po- rém não estão limitados a um polietileno glicol, ácido poli-(d-glutâmico), áci- do poli-(1- glutâmico), ácido poli-(I- glutâmico), ácido poli-(d- aspártico), áci- do poli-(1- aspártico), ácido poli-(l-aspártico) e copolímeros dos mesmos. Os poliácidos glutâmicos tendo pesos moleculares entre cerca de 5.000 a cerca de 100.000, com pesos moleculares entre cerca de 20.000 e cerca de
80.000 podem ser utilizados e com pesos moleculares entre cerca de 30.000 e cerca de 60.000 também podem ser utilizados. O polímero é conjugado Ta através de uma ligação de éster a uma ou mais hidroxilas de um peptídeo inibidor terapêutico inventivo utilizando um protocolo como essencialmente descrito pela Patente dos Estados Unidos Nº 5.977.163, que está incorpora- do aqui por referência. Os agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% em peso/volume); ácido cítrico e um sal (1-3% em pe- so/volume); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% em peso/volume); e ácido fosfó- rico e um sal (0,8-2% em peso/volume). Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% em peso/volume); clorobutanol! (0,3- 0,9% em peso/volume); parabenos (0,01-0,25% em peso/volume) e timero- sal (0,004- 0,02% em peso/volume). Em algumas modalidades, a composição de inibição de quinase é uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas descritas com a presente invenção contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz - 15 deuma composição de inibição de quinase e opcionalmente outros agentes terapêuticos incluídos em um veículo farmaceuticamente aceitável. O ingre- ' diente ativo pode ser uma composição de inibição de quinase, um peptídeo inibidor terapêutico, um PTD, ou um domínio terapêutico, ou combinações : dos mesmos. Os componentes das composições farmacêuticas também ' 20 são capazes de ser misturada de uma maneira tal que não haja nenhuma interação que substancialmente transmita a eficiência farmacêutica deseja- da. O agente terapêutico(s), incluindo a composição de inibição de quinase, pode ser fornecido em partículas. As partículas podem conter o a- gente terapêutico(s) em um núcleo cercado por um revestimento. O agente terapêutico(s) também pode ser disperso em todas as partículas. O agente terapêutico(s) também pode ser absorvido em pelo menos uma superfície das partículas. As partículas podem ser de qualquer ordem de liberação de cinéticos, incluindo liberação de ordem zero, liberação de primeira ordem, liberação de segunda ordem, liberação retardada, liberação prolongada, libe- ração imediata, etc., e qualquer combinação dos mesmos. A partícula pode incluir, além do agente terapêutico(s), quaisquer destes materiais rotineira-
E mente utilizados na técnica de farmácia e medicina, incluindo, porém não limitado ao material erosível, não erosível, biodegradável, ou não biodegra- dável ou combinações dos mesmos. As partículas podem ser microcápsulas que contêm a composição de inibição de quinase em uma solução ou em um estado semissólido. As partículas podem ser de virtualmente qualquer for- ma.
Ambos os materiais poliméricos não biodegradáveis e biodegra- dáveis podem ser utilizados na fabricação de partículas para a liberação do agente terapêutico(s). Tais polímeros podem ser polímeros naturais ou sin- téticos. O polímero é selecionado com base no período de tempo durante o qual a liberação é desejada. Os polímeros de bioadesivos de interesse par- ticular incluem hidrogéis bioerosíveis como descrito por Sawhney e outros em Macromolecules (1993) 26, 581-587, os ensinamentos do qual estão in- corporados aqui. Estes incluem ácidos poli-ialurônicos, caseína, gelatina, - 15 glutina, polianidretos, ácido poliacrílico, alginato, quitosana, poliímetil meta- crilatos), poli(etilmetacrilatos), poli(butilmetacrilato), polilisobutilmetacrilato), ] poli(hexilmetacrilato), poli(fisodecilmetacrilato), poli(lauril metacrilato), po- liffenilmetacrilato), poli(metilacrilato), poli(fisopropilacrilato), poli(lisobutilacri- : lato), e poli(octadecilacrilato).
' 20 O agente(s) terapêutico pode estar contido em sistemas de libe- ração controlada. Para prolongar o efeito de um fármaco, geralmente é de- sejável retardar a absorção do fármaco de injeção subcutânea, intratecal, ou intramuscular. Isto pode ser realizado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco desse modo depende de sua taxa de dissolução que, sucessivamente, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco parente- ralmente administrado é realizada dissolvendo-se ou suspendendo-se o fár- maco em um veículo de óleo.
O uso de um implante de liberação prolongada em longo prazo pode ser particularmente adequado para o tratamento de condições crôni- cas. Os implantes de liberação prolongada em longo prazo são bem conhe- Ta cidos por aqueles comumente versados na técnica e incluem alguns dos sis- temas de liberação descritos aqui.
Em outra modalidade, a composição de inibição de quinase também compreende um gel, composto sólido ou semissólido de liberação lenta, onde o gel, composto sólido ou semissólido de liberação lenta com- preende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo inibidor terapêutico e um revestimento. O revestimento pode ser de qualquer mate- rial desejado, preferivelmente um polímero ou mistura de diferentes políme- ros. Opcionalmente, o polímero pode ser utilizado durante o estágio de gra- nulação para formar uma matriz com o ingrediente ativo para obter um pa- drão de liberação desejado do ingrediente ativo. O gel, composto sólido ou semissólido de liberação lenta é capaz de liberar o agente ativo durante um período desejado de tempo. O gel, composto sólido ou semissólido de libe- ração lenta pode ser implantado em proximidade junto a um local desejado, . 15 pormeio do qual a liberação do agente ativo produz um efeito farmacológico localizado. 7 Em outra modalidade, a composição de inibição de quinase também compreende um sistema de liberação de semissólido que utiliza um ' sistema de liberação semissólido, biodegradável, biocompatível ou um muiti- . 20 particulado biodegradável, biocompatível disperso e suspenso em um siste- ma de liberação de semissólido, biodegradável, biocompatível biodegradável para injeção, deposição, ou implantação em ou sob o corpo para facilitar os efeitos terapêuticos locais. Em algumas tais modalidades, o agente terapêu- tico é uma composição de inibição de quinase, um peptídeo inibidor terapêu- tico, um PTD, um domínio terapêutico, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Em outra modalidade, o sistema de liberação de semissólido compreende parcialmente ou no total um semissólido biocompatível, biode- gradável, viscoso onde o semissólido compreende um hidrogel.. Em uma modalidade, mono-oleato de glicerila, a seguir referido como GMO, é o sis- tema de liberação de semissólido ou hidrogel pretendido. Entretanto, muitos hidrogéis, polímeros, composições de hidrocarboneto e derivados de ácido graxo tendo propriedades físicas/químicas similares com respeito a viscosi- dade/rigidez podem funcionar como um sistema de liberação de semissólido. Por exemplo, polissacarídeos sulfatados, tal como, porém não limitado a, heparina, podem ser utilizados.
Em uma modalidade, o sistema de gel é produzido aquecendo- se GMO acima de seu ponto de fusão (40-50ºC) e adicionando-se um tam- pão de base aquosa quente ou solução de eletrólito, tal como, por exemplo, tampão de fosfato ou salina normal, que desse modo produz uma estrutura tridimensional. O tampão de base aquosa pode ser compreendido de outras soluções aquosas ou combinações contendo os solventes semipolares. GMO fornece um hidrogel predominantemente com base em |i- pídeo, o qual tem a capacidade de incorporar materiais lipofílicos. GMO também fornece canais aquosos internos que incorporam e liberam compos- tos hidrofílicos. É reconhecido que em temperatura ambiente (aproximada- - 15 mente 25ºC), o sistema de gel pode exibir diferenciamento de fases que compreende uma grande faixa de medições de viscosidade. Em uma modalidade, duas fases de sistema de gel são utiliza- das devido a suas propriedades em temperatura ambiente e temperatura Ú fisiológica (cerca de 37ºC) e pH (cerca de 7,4). Na duas fases de sistema de gel a primeira fase é uma fase lamelar de aproximadamente 5% a aproxi- madamente 15% de teor de HO e aproximadamente 95% a aproximada- mente 85% de teor de GMO. A fase lamelar é um fluido moderadamente viscoso, que pode ser facilmente manipulado, derramado e injetado. A se- gunda fase é uma fase cúbica consistindo em aproximadamente 15% a a- proximadamente 40% de teor de HO e aproximadamente 85%-60% de teor de GMO. Tem um teor de água em equilíbrio em aproximadamente 35% em peso a aproximadamente 40% em peso. O termo "teor de água em equili- brio" como utilizado aqui se refere ao teor de água máximo na presença de água em excesso. Desse modo a fase cúbica incorpora água em aproxima- damente 35% em peso a aproximadamente 40% em peso. A fase cúbica é altamente viscosa. A viscosidade pode ser medida, por exemplo, através de um viscômetro de Brookfield. A viscosidade excede 1,2 milhão de centipoise T————
(cp); onde 1,2 milhão cp é a medida máxima de viscosidade obtenível atra- vés da configuração de xícara e peso de pêndulo do viscômetro de Brookfi- eld.
Em algumas tais modalidades, um agente terapêutico pode ser incorpo- rado no semissólido para fornecer um sistema para liberação prolongada, contínua do mesmo.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um peptídeo inibidor terapêutico.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um PTD.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um domínio terapêutico.
Em algumas tais modalidades, outros agentes terapêuticos, agentes biologicamente ativos, fármacos, medicamentos e ina- tivos podem ser incorporados no semissólido para fornecer um efeito local biológico, fisiológico ou terapêutico no corpo em várias taxas de liberação.
Em algumas modalidades, formulações alternativas semissóli- das, modificadas e métodos de produção são utilizado tal que a natureza lipofílica do semissólido seja alterada, ou alternativamente, os canais aquo- . 15 sos contidos no semissólido são alterados.
Desse modo, vários agentes terapêuticos em concentrações variantes podem difundir do semissólido em - diferentes taxas, ou ser liberado dos mesmos com o passar do tempo atra- vés dos canais aquosos do semissólido.
As substâncias hidrofílicas podem ] ser utilizadas para alterar a consistência do semissólido ou liberação de a- : 20 gente terapêutico por alteração de viscosidade, fluidez, tensão de superfície, ou a polaridade do componente aquoso.
Por exemplo, monoestearato de glicerila (GMS), que é estruturalmente idêntico a GMO com a exceção de uma ligação dupla no Carbono 9 e Carbono 10 da fração de ácido graxo em vez de uma ligação única, não gelifica sob aquecimento e adição de um componente aquoso, como GMO.
Entretanto, porque GMS é um tensoativo, GMS é miscível em H2O até aproximadamente 20% em peso/peso.
O termo "tensoativo" como utilizado aqui se refere a um agente ativo de superfície, desse modo sendo miscível em HO em concentrações limitadas bem como substâncias polares.
Ao aquecer e agitar, a combinação de 80% de H,0/20% de GMS produz uma pasta dispersível tendo uma consistência assemelhando-se a loção para as mãos.
A pasta então é combinada com GMO fundido para formar o gel de fase cúbica possuindo uma viscosidade elevada com declarado até agora. Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um peptídeo inibidor terapêutico. Em algumas tais modalida- des, o agente terapêutico é um PTD. Em algumas tais modalidades, o agen- te terapêutico é um domínio terapêutico.
Em outra modalidade, a gelatina hidrolizada, tal como comerci- almente disponível GelfoamG, é utilizada para alterar o componente aquoso. Aproximadamente 6,25% a 12,50% de concentração de Gelfoam8& em peso pode ser colocado em aproximadamente 93,75% a 87,50% de concentração de H2O respectivamente em peso ou outro tampão de base aquosa. Ao a- quecere agitar, a combinação de H2O (ou outro tampão aquoso)/Gelfoam&O produz uma substância gelatinosa espessa. A substância resultante é com- binada com GMO, por meio da qual um produto então formado dilata-se e forma um gel translúcido altamente viscoso, sendo menos maleável em comparação com o gel de GMO líquido sozinho.
' 15 Em outra modalidade, polietileno glicóis (PEG's) podem ser utili- zados para alterar o componente aquoso para ajudar na solubilização de - fármaco. Aproximadamente 0,5% a 40% de concentração de PEG's (de- pendendo do peso molecular de PEG) em peso colocou-se em aproximada- ' mente 99,5% a 60% de concentração de HO respectivamente em peso ou . 20 outrotampão de base aquosa. Ao aquecer e agitar, a combinação de HO (ou outro tampão aquoso)/PEG produz um líquido viscoso para uma subs- tância semissólida. A substância resultante é combinada com GMO, por meio do qual um produto então formado se dilata e forma um gel altamente viscoso.
Sem estar preso a teoria, é postulado que o agente terapêutico se libera do semissólido até difusão, concebivelmente de uma maneira bifá- sica. Uma primeira fase envolve, por exemplo, um fármaco lipofílico contido na membrana lipofílica difunde dele no canal aquoso. A segunda fase en- volve a difusão do fármaco do canal aquoso no ambiente externo. Sendo lipofílico, o fármaco pode se orientar dentro do gel de GMO em uma estrutu- ra de bi-camada de lipídeo proposta. Desse modo, a incorporação de mais do que aproximadamente 7,5% do fármaco, por exemplo, uma composição de inibição de quinase, em peso em GMO causa uma perda da integridade da estrutura tridimensional por meio da qual o sistema de gel não mais man- tém a fase cúbica semissólida, e reverte para o líquido de fase lamelar vis- cosa. Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um peptídeo inibidor terapêutico. Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um PTD. Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um domínio terapêutico. Em outra modalidade, cerca de 1 a cerca de 45% de agente te- rapêutico é incorporado em peso em um gel de GMO em temperatura fisio- lógica sem rompimento da estrutura tri-dimensional normal. Como um resul- tado, este sistema permite a capacidade de flexibilidade significantemente aumentada com dosagens de fármaco. Uma vez que o sistema de liberação é maleáel, pode ser liberado e manipulado em um sítio de implante, como para aderir e conformar para contornar as paredes, espaços ou outras lacu- nas vazias no corpo bem como completamente preencher todas as lacunas . 15 vazias existentes. O sistema de liberação garante a distribuição de fármaco e liberação de fármaco uniforme em todo o sítio de implante. A facilidade de - liberação e manipulação do sistema de liberação em um espaço é facilitada através de um aparato de liberação de semissólido. Um aparato de libera- ' ção de semissólido facilita a liberação alvejada e controlada do sistema de : 20 liberação.
Em uma modalidade, o componente multiparticulado é compre- endido de sistemas biocompatíveis, biodegradáveis, poliméricos ou não po- liméricos utilizados para produzir estruturas sólidas incluindo, porém não limitadas com incomparáveis, péletes, cristais, aglomerados, microesferas, ounanopartículas.
Em outra modalidade, o componente multiparticulado compre- ende poli(láctico-co-glicolida) (PLGA's). PLGA's são materiais de polímero biodegradável utilizados para liberação de agente terapêutico controlada e prolongada no corpo. Tais sistemas de liberação oferecem eficácia terapêu- ticarealçada e toxicidade total reduzida quando comparados com dosagem frequente periódica, sistêmica. Sem estar preso à teoria, é postulado que o sistema de PLGA's consistindo em diferentes relações molares das subuni-
dades monoméricas facilitarão maior flexibilidade na construção de perfis de liberação exatos para acomodar a liberação de agente terapêutico alvejado através de alterações na taxa de degradação de polímero.
Em uma modalidade, a composição de PLGA é suficientemente pura para ser biocompatível e continuar biocompatível sob biodegradação.
Em uma modalidade, o polímero de PLGA é designado e configurado em microesferas tendo um agente terapêutico ou fármaco capturado nele, por meio do qual o agente terapêutico é subsequentemente liberado dele.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um agente de inibição de quinase.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um peptídeo inibidor terapêutico.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um PTD.
Em algumas tais modalidades, o agente terapêutico é um domínio terapêutico.
Em outra modalidade, o componente multiparticulado é compre- BR 15 endido de poli d,i(lactic-co-caprolactona). Isto fornece um material de polí- mero biodegradável utilizado para liberação controlada e prolongada de a- ' gente terapêutico no corpo com um mecanismo de liberação de fármaco si- milar àquele dos polímeros de PLGA.
Em uma modalidade, as microesferas Ú multiparticuladas também são produzidas utilizando materiais não poliméri- : 20 cos biodegradáveis e/ou biocompatíveis tais como GMS.
Em outra modalidade, o componente multiparticulado é também modificado por métodos utilizados para encapsular ou revestir os componen- tes multiparticulados utilizando polímeros da mesma composição com a mesma ou diferente substância de fármaco, diferentes polímeros com a mesma ou diferente substância de fármaco, ou com múltiplos processos em camada contendo nenhum fármaco, o mesmo fármaco, um fármaco diferen- te, ou múltiplas substâncias de fármaco.
Isto permite a produção de um sis- tema de multicamada (encapsulado) multiparticulado com uma grande faixa de perfis de liberação de fármaco para agentes de fármaco únicos ou múlti- —plos simultaneamente.
Em outra modalidade, os materiais de revestimento que controlam a taxa de difusão física de fármaco do multiparticulado podem ser utilizados sozinhos ou junto com as modalidades acima mencionadas e Ta modalidades imaginadas.
Em outra modalidade, a composição de inibição de quinase também compreende um sistema de liberação que utiliza PLGA. O polímero de PLGA contém ligações de éster, que são lábeis a hidrólise. Quando HO penetrao polímero e PLGA, as ligações de éster, portanto são hidrolisadas, e os monômeros, sendo solúveis em água, são removidos do polímero de PLGA, desse modo facilitando liberação física do fármaco capturado, por exemplo, porém não limitado a, uma composição de inibição de quinase, com o passar do tempo. Em algumas tais modalidades, outras classes de polímeros sintéticos biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizadas para a liberação controlada e prolongada de agente terapêutico no corpo, incluindo polianidridos, polifosfatos, polidioxanona, celulósicos e acrílicos que estendidos como exemplos não limitantes. Em algumas tais modalida- des, os materiais não poliméricos podem ser utilizados para liberação de . 15 agente terapêutico controlada e prolongada no corpo, incluindo, porém não limitado a esteróis, ésteres de ácido graxo de sacarose, ácidos graxos, e - ésteres de colesterila, que são estendidos como exemplos não limitantes. Em outro aspecto, a composição de inibição de quinase também ' compreende um sistema de liberação de semissólido, que age como um veí- : 20 culo para liberação local de agentes terapêuticos, compreendendo uma substância sólida ou semissólida lipofílica, hidrofílica, ou anfofílica, aquecida acima de seu ponto de fusão e, por conseguinte, seguido por inclusão de um componente aquoso quente para produzir uma composição gelatinosa de viscosidade variável com base no teor de água. O agente terapêutico é in- corporado e disperso no componente lipofílico fundido ou o componente de tampão aquoso antes de mistura e formação do sistema semissólido. A composição gelatinosa é colocada no aparato de liberação de semissólido para colocação subsequente, ou deposição. Sendo maleável, o sistema de gel é facilmente liberado e manipulado através do aparato de liberação de semissólido em um sítio de implante, onde ele adere e se conforma ao con- torno do sítio de implantação, espaços ou outros espaços vazios no corpo bem como completamente enchendo todos os espaços vazios existentes. Ta
Alternativamente, um componente multiparticulado, compreendido de um sistema polimérico ou não polimérico biocompatível, é utilizado para produzir microesferas tendo um agente terapêutico capturado nela.
Em seguida aos métodos de processamento finais, as microesferas são incorporadas no sis- tema semissólido e subsequentemente colocadas no aparato de liberação de semissólido para ser facilmente liberada dele em um sítio de implante ou espaço comparável, por meio do qual o agente terapêutico é subsequente- mente liberado dele por (a) mecanismo de liberação de fármaco.
Em outro aspecto, a presente invenção também fornece um dis- positivo biomédico compreendendo pelo menos um peptídeo inibidor tera- pêutico isolado, em que o um ou mais peptídeo inibidor terapêutico isolado está/estão dispostos sobre ou dentro do dispositivo.
Em algumas tais moda- lidades, o pelo menos um peptídeo inibidor terapêutico é pelo menos um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consis- . 15 tindoem peptídeos tendo uma sequência de aminoácido de
WLRRIKA WLRRIKALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 14], FAKLAARLYRKA- - LARQLGVAA [SEQ ID NO; 12], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15], YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11], YARAAARQA- ' RAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 16], YARAMARGQARAKALARQLAVA [SEQ : 20 ID NO: 171, YARAMARGOARAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18], YARAA- ARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19], YARAMARGQARAKALNRQLGVA
[SEQ ID NO: 20] and YARAMARGQRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]. De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece um ácido nucleico isolado que especificamente hibridiza para mMRNA codificando um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido de PTD.
O termo "especificamente hibridiza" como utilizado aqui se refere ao processo por meio do qual um ácido nucleico distintivamente ou definidamente forma pares de base com regiões complementares de pelo menos um filamento de DNA que foi não originalmente pareado com o ácido nucleico.
Por exemplo, um ácido nucleico que pode ligar ou hibridizar com pelo menos uma porção de um mRNA de uma célula codificando um peptídeo compreendendo uma sequência de CPP pode ser considerado um ácido nucleico que especifica-
mente hibridiza.
Um ácido nucleico que seletivamente hibridiza sofre hibridi- zação, em condições de hibridização severas, da sequência de ácido nuclei- co para uma sequência-alvo de ácido nucleico especificada a um grau detec- tavelmente maior (por exemplo, pelo menos 2 vezes além da base) do que sua hibridização para sequências de ácido nucleico não alvo e para a exclu- são substancial de ácidos nucleicos não alvos.
Seletivamente a hibridização de sequências tipicamente tem cerca de pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, ou pelo menos 100% de identidade de sequência (isto é, complementariedade) com cada outra De acordo com outra modalidade, a presente invenção fornece um ácido nucleico isolado que especificamente hibridiza para mMRNA codificando um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido de peptídeo inibidor terapêutico.
Os métodos de extração de RNA são bem conhecidos na técni- . 15 caesão descritos, por exemplo, em J.
Sambrook e outros, "Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold S- - pring Harbor, N.
Y,, 1989), vol. 1, ch. 7, "Extraction, Purification, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Celis," incorporados aqui por sua refe- ' rência.
Outros métodos de isolamento e extração são também bem conhe- : 20 cidos, por exemplo, em F.
Ausubel e outros, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2007). Tipicamente, o isolamento é realizado na presença de agentes caotrópicos, tais como cloreto de guanidíneo ou tiocianato de guanidíneo, embora outros detergentes e agentes de extração alternativamente possam ser utilizados.
Tipicamente, o MRNA é isolado do RNA extraído por cromatografia em oligo(dT)-celulose ou outro meio croma- tográfico que tenha a capacidade de ligar a porção 3' poliadenilada de molé- culas de mRNA.
Alternativamente, porém menos preferivelmente, o RNA total pode ser utilizado.
Entretanto, é geralmente preferido isolar po- II(A)RNA de fontes de mamífero.
Métodos: Métodos de Inibição de Quinases que Ativam Citocinas De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio inflamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória, o método compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição de inibição de quinase, onde a quantidade te- rapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico inibe pelo menos uma enzima quinase, onde a composição de inibição de quinase compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo inibidor terapêuti- co, onde o peptídeo inibidor terapêutico compreende um primeiro domínio e um segundo domínio, onde o primeiro domínio compreende um domínio de transdução de proteína (PTD) localizado próximo ao segundo domínio, onde o segundo domínio compreende um domínio terapêutico localizado próximo do primeiro domínio; (b) administrar a composição de inibição de quinase a um paciente em necessidade da mesma, desse modo inibindo pelo menos uma enzima quinase; e (c) reduzir a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória, desse modo tratando o distúrbio inflamatório.
De acordo com uma modalidade, o distúrbio inflamatório cuja pa- . 15 tofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória é pelo menos um distúrbio selecionado do grupo consistindo em asma, espondilite ancilosante, ] Diabete Tipo |, Síndrome de Guilliame-Barre , lúpus, psoríase, escleroderma, Doença de Sjorgen, prostatite crônica, glomerulonefrite, doença inflamatória : do intestino, doença inflamatória pélvica, lesão de reperfusão, artrite reuma- toide, vasculite, vasculite por hipersensibilidade, choque endotóxico, pancre- atite, doença inflamatória localizada, aterosclerose, mal de alzheimer, is- quemia, hiperplasia íntima, estenose, restenose, leiomioma, espasmos do músculo liso, angina, angina de Prinzmetal, braquicardia, hipertensão, hiper- trofia cardíaca, insuficência renal, acidente vascular cerebral, hipertensão pulmonar, toxemia de gravidez, doença de Raynaud, uremia hemolítica, fis- sura anal, acalasia, impotência, enxaqueca, vasculopatia, insuficiência car- díaca congestiva, miocárdio atordoado, disfunção diastólica, gliose, doença pulmonar obstrutiva crônica, osteopenia, artrite degenerativa, sepse, cirrose, fibrose intersticial, colite, apendicite, gastrite, laringite, meningite, otite, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, neuropatia periférica, escle- rose múltipla, síndrome cardiometabólica, esteatoepatite não alcoólica, fibro- se cística do pâncreas e pulmões, fibrose de injeção, fibrose endomiocardia-
na, fibrose pulmonar idiopática do pulmão, fibrose mediastinal, mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose sistêmica nefrogênica, câncer de mama, cân- cer de próstata, e disfunção da célula endotelial. De acordo com outra modalidade, o primeiro domínio está locali- zado5S ao segundo domínio. De acordo com outra modalidade, o segundo domínio está localizado 3' ao primeiro domínio. De acordo com outra moda- lidade, o primeiro domínio está operavelmente ligado ao segundo domínio. De acordo com outra modalidade, o segundo domínio é operavelmente liga- do ao primeiro domínio.
De acordo com outra modalidade, a enzima quinase é proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno. De acordo com algumas tais modalidades, a enzima quinase é MK2. De acordo com algu- mas tais modalidades, a enzima quinase é MK3. De acordo com outra moda- lidade, a enzima quinase é CaMK.
. 15 De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do pep- tídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a - sequência de aminoácido KALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 13]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do pep- ' tídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a : 20 sequência de aminoácido KALARQLGV AA [SEQ ID NO: 23]. De acordo com outra modalidade, a sequência de aminoácido do domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é KAANRQLGV A A [SEQ ID NO: 22]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALARQLGV AA [SEQ ID NO: 23). De acordo com outra modalidade, o do- mínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a se- quência de aminoácido KALNAQLGVAA [SEQ ID NO: 24]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRALGV AA [SEQ ID NO: 25].
De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQAGV AA ISEQ ID NO: 26]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNROQLA VAA [SEQ ID NO: 27]. De acordo com outra modalidade, o do- mínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a se- quência de aminoácido KALNRQLGA AA [SEQ ID NO: 28]. De acordo com outramodalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLGV A [SEQ ID NO: 29]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KKKALNRQLG- VAA [SEQ ID NO: 30]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêu- ticodo peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de ami- noácido KA ANRQLG V AA [SEQ ID NO: 22]. De acórdo com outra modalida- de, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNAQLGV AA [SEQ ID NO: 24]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico . 15 é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQAGV AA [SEQ ID NO: 26]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo - inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNR- QLG AAA [SEQ ID NO: 28]. De acordo com outra modalidade, o domínio te- ' rapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de : 20 aminoácido KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13]. De acordo com outra modali- dade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALARQLGV AA [SEQ ID NO: 23]. De a- cordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor tera- pêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRALGV AA [SEQIDNO:25]. De acordo com outra modalidade, o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KALNRQLA VAA [SEQ ID NO: 27]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a sequência de aminoácido WLRRIKA WLRRIKA [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, o domínio de transdução de proteína do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo identidade substancial com a sequência de aminoácido WLRRIKA WLRRI [SEQ ID NO: 34].
De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLR- RIKA WLRRIK A [SEQ ID NO: 31]. De acordo com outra modalidade, PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLRRIKA [SEQ ID NO: 32]. De acordo com outra modalida- de, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5). De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido YGRKKRRORRR [SEQ |D NO: 33]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quina- se terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido WLRRIKA ' 15 WLRRI [SEQ ID NO: 34]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibi- dor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de a- - minoácido FAKLAARL YR [SEQ ID NO: 35]. De acordo com outra modali- dade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo S a sequência de aminoácido KAF AKLAARL YR [SEQ ID NO: 36]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é i um domínio tendo a sequência de aminoácido YARAAARQARA [SEQ |D NO: 5]. De acordo com outra modalidade, o PTD do inibidor de peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido FA- KLAARL YRKA [SEQ ID NO: 43]. De acordo com outra modalidade, o PTD doinibidorde peptídeo quinase terapêutico é um domínio tendo a sequência de aminoácido KAFAKLAARLYRKA [SEQ ID NO: 44]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido WLRRIKAWLRRIKALNR- QLGVAA [SEQ ID NO: 14]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido FA- KLAARL YRKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 12]. De acordo com outra moda- lidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido KAF AKLAARL YRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15]. De acor- do com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo ten- do a sequência de aminoácido Y ARAA ARQ ARAKAL ARQL GVAA [SEQ ID NO: 11]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARQARAKALNR- QLGVAA [SEQ ID NO: 16]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARA- AARGQRAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17]. De acordo com outra modali- dade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAMARGOARAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAMARGQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor terapêutico é um pep- tídeo tendo a sequência de aminoácido YARAAARGQRAKALNRQLGVA [SEQID NO: 20]. De acordo com outra modalidade, o peptídeo inibidor tera- pêutico é um peptídeo tendo a sequência de aminoácido de YARAAARG- - QRAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21]. De acordo com outra modalidade, a composição de inibição de ' quinase também compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. De acordo com outra modalidade, a composição de inibição de quinase é administrada parenteralmente. De acordo com outra modalidade, a composição de inibição de quinase é administrada através de um dispositi- vo biomédico compreendendo pelo menos um peptídeo inibidor terapêutico isolado, onde o um ou mais peptídeos inibidores terapêuticos isolados são dispostos sobre ou dentro do disposítivo. Em algumas tais modalidades, o pelo menos um peptídeo inibidor terapêutico é pelo menos um peptídeo ten- do uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em
WLRRIKA WLRRIKALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 14], FAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12], KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 15], YARAMARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11), YARAAMARQARAKALNRQLGVAA
[SEQ ID NO: 16), YARAMARGARAKALARQLAVA [SEQ ID NO: 17], YARAMARGOARAKALARQLGVA [SEQ ID NO: 18), TARAMARGQAQRAKALNRQLAVA [SEQ ID NO: 19], YARAMARGOQRAKALNRQLGVA [SEQ ID NO: 20] e YARAMARGARAKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 21].
Os métodos gerais em genéticos moleculares engenharia gené- tica úteis na presente invenção são descritos nas edições atuais de Molecu- lar Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, e outros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzy- mology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Die- go, CA), "Guide to Proteína Purification" in Methods in Enzymology (M.P.
Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, e outros 1990. Academic Press, San Diego, . 15 CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed, (R.l.
Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), e Gene Transfer and Expression - Protocols, pp. 109-128, ed. EJ. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.). Reagentes, vetores de clonagem, e kits para manipulação genética : estão disponíveis a partir de vendedores comerciais tais como BioRad, Stra- tagene, Invitrogen, ClonTech and Sigma-Aldrich Co.
Onde um valor de faixas é fornecido, é entendido que cada valor intermediário, para o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente dite de outro modo, entre o limite superior e inferior de tal faixa e qualquer outro estado ou valor intermediário em tal faixa declarada é abrangido na invenção. Os limites superior e inferior destas faixas meno- res que podem independente ser incluídos nas faixas menores são também abrangidos na invenção, são submetidos a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Onde a faixa declarada inclui um ou ambos dos limites, faixas excluindo ambos destes limites incluídos são também incluí- dasnainvenção.
A menos que definido de outro modo, os termos técnicos e cientí- ficos utilizados aqui têm os mesmos significados como geralmente entendido por alguém comumente versado na técnica a qual esta invenção pertence. Embora qualquer método e materiais similares ou equivalentes àqueles des- critos aqui possa ser utilizado na prática ou teste da presente invenção, méto- dos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações men- cionadas aqui são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais junto com os quais as publicações são citadas.
i Deve ser notado que como utilizado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um, uma ", "um, uma ", "e" e "o, a", incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo.
Todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo signifi- cado.
As publicações descritas aqui são fornecidas somente para sua descrição antes da data de depósito da presente invenção. Nada aqui é pa- ra ser considerado como uma admissão que a presente invenção não é inti- . 15 tulada para preceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de - publicação atuais que podem precisar ser confirmadas independentemente.
EXEMPLOS , Os seguintes exemplos são apresentados para fornecer aqueles de experiência ordinária na técnica com uma descrição completa de como fazer e utilizar a presente invenção, e não é pretendido limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção nem eles pretendem re- presentar que os experimentos abaixo são todos ou os experimentos somen- te realizados. Esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aosnúmeros utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), porém alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outro modo, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio ponderado, temperatura é em graus Centígrados, e pres- são é em ou próxima da atmosférica. Métodos Síntese e Purificação de Peptídeo Os peptídeos foram sintetizados em resina Rink-amida ou Knorr-
amida (Synbiosci Corp.) utilizando química FMOC padrão em um Sintetizador de Peptídeo Symphonyº (Protein Technologies, Inc.). O reagente de acopla- mento para os aminoácidos (Synbiosci Corp.) foi hexafluorfosfato de 2-1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio/maleimida — de —N-metila (HB- TU/NMM). Em seguida a síntese, o peptídeo foi clivado da resina com um coquetel com base em ácido trifluoroacético, precipitado em éter, e recupera- do por centrifugação. O peptídeo recuperado foi secado em vácuo, ressus- penso em água purificada de MÍlliQ, e purificado utilizando uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC)(AKTA Explorer, GE Healthcare) equipado comuma coluna prep.-escala 22/250 CI 8 (Grace Davidson). Um gradiente de acetonitrila com uma concentração constante de 0,1% de ácido trifluoroacéti- co ou 0,1% de ácido acético foi utilizado para obter purificação. O peso mole- cular desejado foi confirmado por espectrometria de massa de desabsorção / ionização a laser assistida por matriz de tempo de trajetória utilizando um . 15 Analisador de MALDI TOF/TOFTM 4800 Plus (Applied Biosystems). Exemplo 1. Determinação de Aminoácidos Essenciais de Peptídeos Ini- - bidores Terapêuticos de MK2 Os aminoácidos essenciais de peptídeos inibidores terapêuticos , de MK2 foram identificados utilizando substituições de aminoácido Ala e D. 100 uM de KALNRQLGV AA [SEQ ID NO: 13] inibiu 73% de atividade de MK?2. Primeiro, cada aminoácido no domínio terapêutico (KALNRQLGV AA) [SEQ ID NO: 13] independentemente foi substituído com Ala. Em seguida, cada aminoácido no domínio terapêutico do peptídeo independentemente foi substituído com seu D-aminoácido.
Ensaioda Atividade de Quinase com Base em Fluorescência O ensaio de quinase de Omnia? para o kit MAPKAP-K2 (Invitro- gen, Carisbad, CA), foi utilizado para determinar a velocidade da reação pa- ra MK2 na presença e ausência de cada dos peptídeos listados na tabela 1. O kit contém um tampão de reação proprietário aos quais os seguintes foram adicionados (concentrações finais são determinadas): ATP a 1 mM, DTT a 0,2 mM, peptídeo substrato modificado por MAPKAP-K2 Sox a 10 uM, 5 ng de MK2, e o peptídeo inibidor de interesse (volume final de 50 ul). MK2 é humano foi adquirido de Invitrogen. As reações foram realizadas a 30 ºC nos poços de uma placa de 96 poços de baixa ligação de proteína fornecida com o kit, e leituras de fluorescência (excitação = 360 ran, emissão = 485 nra) foram tomadas a cada 30 segundos durante 20 minutos utilizando um Espectrofotômetro SpectraMax M5 (Molecular Devices). A velocidade da reação foi determinada para cada cavidade de reação da declividade de um plot de unidades de fluorescência relativa versus tempo. Cada peptídeo ini- bidor foi testado pelo menos em quatro concentrações, 12,5, 25, 50 e 100 umol, em triplicada.
Na Tabela 1, "a" representa que os resultados mostrados são para 100 uM para todos os peptídeos; "b" representa o percentual de altera- ção em MK2 na velocidade de reação versus o peptídeo não substituído (KALNRQLGV AA) [SEQ ID NO: 13] em uma concentração de 100 UM; "c" representa o erro reportado como o desvio-padrão entre as três amostras.
Tabela1. Peptídeos testados em ensaio de atividade de quinase com base em fluorescência % of KALNRQLGVAA” Peptídeo Inibidor Testado” [ISEQ ID NO: 13] Velocidade de Reação (+VoSD)* KALARQLGVAA MO uurvnag ERRENSROLOUAR O EO ABR do SEE
KALNRQLGAVAA outras modificações
KALNRQLOVA RA AREA e QU WIRRIKA(Máofimcelonal). — | BOA) WERRIKAWLRRIKA NETO Co YGRKKRRORRR +47
As varreduras de D-aminoácido e Ala mostraram que o Asn não foi essencial para inibição de MK2 (vide, tabela 1, figura 3 e figura 4).
Figura 3 mostra um plot de velocidade de reação (unida- de/segundo de fluorescência) (RFLVs)) versus concentração de peptídeo inibidor MK2 (UM) onde os peptídeos inibidores incorporam as substituições de alanina. A substituição do Asp e Ala realçou a inibição de MK2. A substi- tuição de Ala para Gly levemente aumentou a inibição. A varredura de Ala também mostrou que Arg, Gln ed Val foram essenciais para a inibição de MK2. Embora os dois Leu tenham sido aminoácidos menos essenciais, sua remoção diminuiu a eficácia do peptídeo inibidor terapêutico.
Figura 4 mostra um plot de velocidade de reação (RFU/s) versus concentração de peptídeo inibidor MK2 (uM) onde os peptídeos inibidores incorporam as substiuições de aminoácido D. Nenhuma substituição de ami- noácido D substancialmente realçou a inibição de MK2; a maioria das substi- . 15 tuições de aminoácido D substancialmente diminuiu a eficácia do peptídeo inibidor MK2.
Figura 5 mostra um plot de velocidade de reação (RFU/s) versus concentração de peptídeo inibidor MK2 (UM) onde o peptídeo inibidor foi ' modificado. Tabela 1 e figura 5 mostram que a inibição de MK2 não foi real- cada pelo Ala de terminal de C (100 UM) e a inibição foi levemente aumen- tada por dois Lys adicionais no peptídeo inibidor. Entretanto, a inibição de MK2 é diminuída, em concentrações menores de peptídeo inibidor, sob re- moção do Ala de terminal de C ou adição de dois Lys de terminal de N. Exemplo 2. Inibição por PTD de MK2 A inibição de MK2 por PTDs foi demonstrada utilizar três PTDs : 1) WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31]; 2) YeRKKRRORRR [SEQ ID NO: 33]; e 3) YARAAARQARA [SEQ |D NO: 5]. Figura 6 mostra um plot de velocidade de reação (RFU/s) versus concentração de inibidor de MK2 (uM) onde o peptídeo inibidor é um domí- niode transdução de proteína. A tabela 1 e figura 4 mostram que a inibição de MK2 foi menos afetada por peptídeo de PTD YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5] independente da concentração de peptídeo de PTD. A atividade de
MK? foi inibida por peptídeo de PTD YGRKKRROQRRR [SEQ ID NO: 33] a- través de uma ampla faixa de concentração de peptídeo de PTD (de 61% de inibição em 100 uM de PTD a 48% de inibição em PTD a 25 uM). MK?2 foi potencialmente inibido pelo peptídeo de PTD WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO:31]; este peptídeo de PTD forneceu inibição mais elevada de MK2 do que os peptídeos de domínio terapêuticos. Tabela 1 também mostra a com- binação do peptídeo de PTD WLRRIKAWLRRIKA [SEQ ID NO: 31] e o do- mínio terapêutico KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 13] fornece um efeito inibi- dor sinérgico.
Exemplo3. Modificações para o Domínio Terapêutico afeta ICs, O domínio terapêutico dos peptídeos inibidores terapêuticos foi modificado para afetar o valor de ICso. Os peptídeos inibidores terapêuticos modificados então foram analisados com ensaios radiométricos. Determinação de Atividade de Quinase e ICso Radiométrico : 15 Um serviço de ensaio radiométrico comercial (Millipore, Billerica, MA) foi utilizado para testar a especificidade e potência de peptídeos con- - tendo um domínio de transdução acoplado e domínio terapêutico, a seguir "peptídeos completos". Nestes ensaios, se a quinase não é inibida por um ] peptídeo inibidor, um substrato positivamente carregado é fosforilado com um grupo de fosfato radiorrotulado de um ATP. O substrato positivamente carregado é preso a uma membrana de filtro negativamente carregada, quantificado com um contador de cintilação, e comparado com um controle de atividade de 100%. As concentrações de ATP em 15 uM do Knh evidente para ATP foram escolhidas uma vez que uma concentração de ATP próxima de kKnh pode permitir que as quinases tenham a mesma quantidade relativa de atividade de fosforilação.
” 129/155 . Tabela 2. Mostra as composições de tampão para as quinases incluídas na tela; (h) = humano, (m) = camundongo, (r) = rato, e (y) = levedura.
180 mM HEPES, 3.6 mM DTT, 0.07% Bri--35 | AMPK (1) 20 mM TIEPES, 0.03% Triton X-100 | PKCRI (h), PKCS (h 20 mM MOPS, 1 mM EDTA, 0.01% Brij-35, 5% | AbI (h), Aurora-A (h), BTK (h), CAMEI (h), Glicerol, 0.1% de B-mercaptoetanol, 1 mg/ml. — | CDK1/cyclinB (h), CHK1 (h), CIIK2 (h), BSA CKIS (h), e-Kit (h), DYRK2 (h), EGFR (h), EphA2 (h), FGFR1 (h), GSK3B$ (b), IRAKA (E), JAK3 (h), KDR (h), Lek (b), LIMKI1 (h), Met (h), MLCK (h), PDGFRB (h), PhKy2 É (E), Pim-1 (b), PKA (h), PKBB (h), PKGla(h), PKGIB (h), Ret (h), ROCK-I (h), R$k2 (h), Ste (1-530) (h), Tie2 (h), TrkA (b), “mercaptoetanol, | mg/mL BSA
0.1% de B-mercaptoetanol, 1 mg/ml BSA SO MM TRIS, 0,1 mM EGTa, 0.1 MM Na;VO,s, | 1IGF-IR (h), MAPK1 (h), SAPK2a (b), Syk
0.1% de B-mercaptoetanol, 1] mg/ml BSA h Os protocolos para cada ensaio quinase são com segue: (1) AbI(h) Em um volume de reação final de 25 ul, Ab! (h) (5-10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, EAIYAAPF AKKK (SEQ ID NO: 48) a 50 uM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica aproximadamente 500 cpm/pmol, concentração como requerido).
Areação é iniciada pela adição da mistura de MGATP. Pós a incubação du- rante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em um esteira de filtroP30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da se- cageme contagem de cintilação.
(2) AMPK (1) Em um volume de reação final de 25 ul, AMPK (r) (5- 10 mU) é incubado com HEPES a 32 mM pH 7,4, DTT a 0,65 mM, 0,012% de Brij-35, AMP a 200 UM, AMARAASAAALARRR (SEQ ID NO: 49) a 200 uM, Acetato deMga10mM e [y ”P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração como requerido). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após a incubação durante 40 minutos em temperatura
: ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (3) Aurora-A(h) Em um volume de reação final de 25 ul, Aurora-A (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, LRRASLG (SEQ ID NO: 50) a 200 uM (Kemptide), Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (ativi- dade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requeri- da). Areação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adi- ção de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 50 MM e uma vez em metanol antes dasecagem e contagem de cintilação.
(4) BTK (h) Em um volume de reação final de 25 ul, BTK (h) (5-10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KVEKIGEGTYGVVYK (SEQ ID NO: 51) a 250 uM (Cdc2 peptídeo), Acetato de Mg a 10 mM ed [y*P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lava- dostrêsvezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(5) CaMKI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, CaMKI (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, CaCl; a 0,5 mM, 16 — uomL de calmodulina, KKLNRTLSFAEPG (SEQ ID NO: 52) a 250 uM, Ace- tato de Mg a 10 MM e [y **P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição
: da mistura de M9ATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mMeumavezem metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (6) CDKi/ciclinB (h) Em um volume de reação final de 25 ul, CDKI/ciclinB (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,1 mg/mL de histona HI, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica apro- ximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é inicia- da pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 pl. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida mancha- dos em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e conta- gem de cintilação.
(7) CHKI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, CHKI (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKVSRSGL- YRSPSMPENLNRPR (SEQ ID NO: 53) a 200 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*P-ATP] (atividade específica aproximada, 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul dareaçãosão em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lava- dos três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(8) CK 15 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, CK1 5 (h) (5-10 mU) é - 30 incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 02 mM, KRR- RALS(p)VASLPGL (SEQ ID NO: 54) a 200 pM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração
. quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lava- dostrês vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (9) CK2 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, CK2 (h) (5-10 mU) é in- cubado com HEPES a 20 mM pH 7,6, NaCl a 0,45 M, EDTA a 0,1 mM, DTT aS5mM, 0,1% de Triton X-100, RRRDDDSDDD (SEQ ID NO: 55) a 165 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*º*P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (10) c-Kit (h) Em um volume de reação final de 25 ul, c-Kit (h) (5-10 mU) é in- —cubadocom MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, MnCk; a 10 mM, 0,1 mg/mL de poli(Glu, Tyr) 4: 1, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (ativida- de específica aproximada 500 copm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul deuma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro A e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (11) DYRK2 (h) Em um volume de reação final de 25 ul., DYRK2 (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 2 mg/mL de caseína, Acetato de Mg a 10 mM e [y- **P-ATP] (atividade específica aproximada 500
Ê cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira defilttoP30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (12) EGFR (h) Em um volume de reação final de 25 ul, EGFR (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, MnCk; a 10 mM, 0,1 mg/mL de poli(Glu, Tyr) 4:1, Acetato de Mg a 10 MM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de Mg9ATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- damanchados em uma esteira de filtro A e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (13) EphA2 (h) Em um volume de reação final d 25 ul, EphA2 (h) (5-10 mU) é in- —cubadocomMOPS a8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,1 mg/mL poli(Glu, Tyr) 4:1, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*º*P-ATP] (atividade específica aproximada, 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela a- dição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em tempera- tura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 pl de uma solução de áci- do fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma es- teira de filtro A e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (14) FGFRI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, FGFRI (h) (5-10 mU) é —incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56) a 250 uM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À
: reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação. (15) FIt3 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, FIt3 (h) (5-10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, EAIYAAPFAKKK (SEQ IDNO:48)a50 uM, Acetato de Mg a 10 mMe [y-*P-ATP] (atividade especí- fica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em seguida —manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (16) GSK3B (h) Em um volume de reação final de 25 ul, GSK3B (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, YRRAAVPPSPSLS- RHSSPHOS(p)EDEEE (SEQ ID NO: 57) a 20 UM (peptídeo fosfo GS2), Ace- tato de Mg a 10 mM e [y-*P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 uL da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 50 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (17) IGF-IR (h) Em um volume de reação final de 25 ul, IGF-I R (h) (5-10 mU) é incubado com Tris a 50 mM pH 7,5, EGTA a 0,1 mM, Na;VO, a 0,1 mM, 0,1% de B-mercaptoetanol, KXKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 56) a 250 UM,
MnCk a 10 mM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minu- tos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida man- chados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e con- tagem de cintilação. (18) IRAKA (h)
Em um volume de reação final de 25 ul, IRAK4 (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,33 mg/mL de prote- ína básica de mielina, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade es- pecífica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A rea- ção é iniciada pela adição da mistura de MGATP.
Após incubação durante
40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação,
(19)JAK3(h)
Em um volume de reação final de 25 ul, JAK3 (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, GGEEBEY- FELVKKKK (SEQ ID NO: 58) a 500 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P- ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após in- cubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da rea- ção são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol
- 30 antesdasecagem e contagem de cintilação. (20) KDR (h) Em um volume de reação final de 25 ul, KDR (h) (5-10 mU) é é: incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,33 mg/mL de prote- ína básica de mielina, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade es- pecífica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A rea- ção é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(21)Lck(h) Em um volume de reação final de 25 ul, Lck (h) (5-10 mU) é in- cubado com Tris a 50 MM pH 7,5, EGTA a 0,1 MM, Na;VO, a 0,1 mM, KVE- KIGEGTYGVVYK (SEQ ID NO: 51) a 250 uM (Cdc2 peptídeo), Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e umavezem metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(22) LIMKI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, LIMKI (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,6 mg/mL de cofilina, Acetato de Mg a 10 mM e [y- ?P-ATP] (atividade específica aproximada 500 —cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de Mg9ATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 - 30 mMeumavezem metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (23) MAPKI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, MAPKI (h) (5-10 mU) é
. incubado com Tris a 25 mM pH 7,5, EGTA a 0,02 mM, peptídeo de 250 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y- *P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação, (24) MEKI (h) Em um volume de reação final de 25 ul, MEKI (h) (1-5 mU) é in- cubado com Tris a 50 mM pH 7,5, EGTA a 02 mM, 0,1% de B- mercaptoetanol, 0,01% de Brij-35, 1 uM de MAPK?2 inativo (m), Acetato de Mg a 10 mM e ATP frio (concentração quando requerida). A reação é inicia- da pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, 5 ul. desta mistura de incubação é utilizado par iniciar um ensaio de MAPK2 (m).
(25) Met (h) Em um volume de reação final de 25 ul, Met (h) (5- 10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKSPGEYVNIEFG (SEQIDNO: 56) a 250 uM, Acetato de Mg a 10 MM e [y- P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação.
(26) MLCK (h) Em um volume de reação final de 25 ul, MLCK (h) (5-10 mU) é —incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, CaCl; a 0,5 mM, 16 Vpg/mL de calmodulina, 250 uM de KKLNRTLSFAEPG (SEQ ID NO: 52), AÀ- cetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica aproximada, 500
. cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma estei- radefiltroP30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (27) PDGFRBE (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PDGFRB (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 0,1 mg/mL de po- ticGlu, Tyr) 4:1, MnClz 10 MM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (ativi- dade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requeri- da). A reação é iniciada pela adição da mistura de M9ATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adi- ção de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%, 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro A e lavados três vezes du- rante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (28) PhKy2 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PhKy2 (h) (5-10 mU) é —incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, 250 uM KKLNRTLS- FAEPG (SEQ ID NO: 52), Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 com/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação duran- te 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul deuma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação. (29) Pim-1 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, Pim-1 (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKRNRTLTV (SEQ ID NO: 59) a 100 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade espe-
é cífica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchado sem uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(30) PKA (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PKA (h) (5-10 mU) é in- cubadocom MOPS a8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, LRRASLG (SEQ ID NO: 50) a 30 uM (Kemptide), Acetato de Mg a 10 MM e [y- P-ATP] (atividade específica aproximada, 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 50 MM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação.
131) PKBB (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PKBRB (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, GRPRTSSFAEGKK (SEQ ID NO: 60) a 30 JM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica aproximada, 500 com/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%, 10 ul. da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação.
: 30 (32) PKCBI(h) Em um volume de reação final de 25 ul, PKCBI! (h) (5-10 mU) é incubado com HEPES a 20 mM pH 7.4, 0,03% de Triton X-100, CaCl;z a 0,1 mM, 0,1 mg/mL de fosfatidilserina, 10 ug/mL de diacilglicerol, 0,1 mg/mL de histona H1, Acetato de Mg a 10 mM e [y- P-ATP] (atividade específica apro- ximada 500 com/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de Mg9ATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solu- ção de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em áci- do fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(33) PKC5(h) Em um volume de reação final de 25 ul, PKCô (h) (5- 10 mU) é incubado com HEPES a 20 mM pH 7,4, 0,03% de Triton X-100, 0,1 mg/mL de fosfatidilserina, 10 pg/ml de diacilglicerol, ERMRPRKRQGSVRRRV (SEQ ID NO: 61) a 50 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de M9ATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 “minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação, (34) PKGla (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PKG 1 a (h) (5- 10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, cGMP a 10 uM, RRRLSFAEPG (SEQ ID NO: 62) a 200 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P- ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após in- cubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da rea- —çãosãoem seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
í. (35) PKGI B (h)
Em um volume de reação final de 25 ul, PKGI B (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, cGMP a 10 uM, RRRLSFAEPG (SEQ ID NO: 62) a 200 JM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-
ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após in- cubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 uL da rea- ção são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação. (36) Ret (h) Em um volume de reação final de 25 ul, Ret (h) (5-10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKSPGEYVNIEFG (SEQID NO: 56) a 250 uM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação. (37) ROCK- (h) Em um volume de reação final de 25 ul, ROCK- (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KEAKEKRQEQIA- KRRRLSSLRASTSKSGGSOQK (SEQ ID NO: 63) a 30 uM, Acetato de Mg à 10 MM e [y*ºP-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, con- centração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP.
Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e
. uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação, (38) Rsk2 (h) Em um volume de reação final de 25 ul, Rsk2 (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKNRTLSVA (SEQ IDNO:64)a30uM, Acetato de Mg a 10 MM e [y-**P-ATP] (atividade especí- fica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MGATP. Após incubação durante 40 mi- nutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida man- —chados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e con- tagem de cintilação.
(39) SAPKa (h) Em um volume de reação final de 25 ul, SAPK2a (h) (5-10 mU) é incubado com Tris a 25 mM pH 7,5, EGTA a 0,02 mM, 0,33 mg/mL de pro- teína básica de mielina, Acetato de Mg a 10 mM e [y-*ºP-ATP] (atividade es- pecífica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A rea- ção é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(40) SRC (1-530) (h) Em um volume de reação final de 25 ul, SRC (1-530) (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, GGEEEEY- FELVKKKK (SEQ ID NO: 58) a 500 mM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P- ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/ pmol, concentração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após in- —cubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 uL da rea- ção são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três
. vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(41) Syk (h) Em um volume de reação final de 25 ul, Syk (h) (5-10 mU) é in- cubado com Tris a 50 MM pH 7,5, EGTA a 0,1 MM, Na;VO,s a 0,1 mM, 0,1% de B- mercaptoetanol, 0,1 mg/ mL de poli(Glu, Tyr) 4:1, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**PATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concen- tração quando requerida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro A e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(42) Tie2 (a) Em um volume de reação final de 25 ul, Tie2 (h) (5-10 mU) é in- cubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, MnCl, a 0,5 MM, 0,1 mg/mL de poli(Glu, Tyr) 4:1, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 com/pmol, concentração quando requerida). À reação é iniciada pela adição da mistura de Mg9ATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul da reação são em segui- da manchados em uma esteira de filtro A e lavados três vezes durante 5 mi- nutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
(43) TrkA(h) Em um volume de reação final de 25 ul, TrkA (h) (5-10 mU) é incubado com MOPS a 8 mM pH 7,0, EDTA a 0,2 mM, KKKSPGEYVMEFG (SEQ ID NO: 56) 250 UM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando requerida). À reaçãoé iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 uL de uma solução de ácido fosfórico a 3%. 10 ul. da reação são em segui-
: da manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 75 mM e uma vez em metanol antes da seca- gem e contagem de cintilação. (44) PRAK (h) Em um volume de reação final de 25 ul, PRAK (h) (5- 10 mU) é incubado com Na B-glicerofosfato a 50 mM pH 7,5, EGTA a 0,1 mM, KKLR- RTLSVA (SEQ ID NO: 65) Aa 30 uM, Acetato de Mg a 10 mM e [y-**P-ATP] (atividade específica aproximada 500 cpm/pmol, concentração quando re- querida). A reação é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Após incu- —bação durante 40 minutos em temperatura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 ul. de uma solução de ácido fosfórico a 3%, 10 ul da reação são em seguida manchados em uma esteira de filtro P30 e lavados três ve- zes durante 5 minutos em ácido fosfórico a 50 MM e uma vez em metanol antes da secagem e contagem de cintilação.
Os valores de ICso para inibidores de peptídeo foram determina- dos utilizando o serviço Millipore's ICBoProfiler Express. O valor de IC50 foi estimado de uma curva de 10 pontos de diluições de meio log. Para peptí- deos testados para especificidade, a concentração dos peptídeos que inibi- ram aproximadamente 95% da atividade de MK2 foi escolhido para perfil contrauma bateria de quinases relacionadas com MK2, viabilidade de célu- la, ou doença humana de serviço de Milliporequinase/Vo/z/er. Em ambos os ensaios, os compostos foram fornecidos em sulfóxido de dimetila (DMSO). A cada atividade de quinase a medição foi conduzida em duplicata.
A figura 1 mostra curvas e valores de ICs,5 para variantes de pep- tídeo inibidor terapêutico com o mesmo PTD (Y ARAAARGQ ARA) [SEQ ID NO: 37] comparado com o Peptídeo de PTD independente YARAAARGQ ARA [SEQ ID NO: 37] e o peptídeo de domínio terapêutico independente KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]. Todas as variantes de peptídeo inibi- dor terapêutico demonstraram os valores de ICso menores do que o peptídeo de domínio terapêutico KKKALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 30]. A substituição de Asn para Ala e/ou substituição de Gly para Ala produziu alterações meno- res nos valores de IC5o para o peptídeo inibidor terapêutico. Remoção do Ala
: Tabela 4. Efeito de Peptídeos Permeantes de célula em 43 quinases diferentes.
* 3" WLRRIKAWLRRI- | WLRRIKAWLRRI- KAFAKLAARL Leoncentraçãos
EESC CCR FEIO CO O O nO 7, BR A Ca 4663) Ea of) BAR fee E OGIA o OES ER a Ba 66) | IRES A AM Do Am BRR ee DU o rn MO A Re A ns Ap tora SARA e OM e DIO] eee SEIB o ERA aan ade OIL A ÓMA RR E ROC OO O OO OA OO O O OO ga OO Variantes de peptídeo inibidor terapêutico adicionais foram ensaiados para atividade contra várias quinases humanas representativas de várias famílias de quinase. Estas quinases incluem: MK2; MK3; CaMKI (proteína quinase depen- dentede cálcio/calmodulina-); PRAK (p38 proteína quinase regulada/ativada, tam-
bém conhecido como proteína quinase ativada por proteína quinase ativada por mitógeno 5 (MAPKAPKS)); SAPK2a (p380); quinase associada com IRAKA (ILA receptor (IL-IR)); MLCK (quinase de cadeia leve de miosina); PKBB (proteína qui- nase B); PCKô (proteína quinase C); e ROCK (serina/treonina quinase associada akRho). A concentração selecionada produziu entre 0-10% de atividade de MK2 com base nos dados de ICso; YARAAARQ ARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] pode estar em uma concentração levemente mais elevada, e toda a inibição de quinase pode ser maior do que o esperado para a concentração listada; erro é reportado como o desvio-padrão entre 2 amostras.
Tabela 5 mostra diferenças na especificidade entre os peptídeos inibidores terapêuticos, AU do peptídeo inibidor terapêutico inibiu ambos MK2, MK3 e CaMKl.
Variantes de peptídeo inibidor terapêutico com Ala substituída para Asn demonstrou maior inibição de CaMKI do que MK2. O peptídeo inibidor terapêutico demonstrou efeito mínimo sobre a atividade de ' 15 PRAK.
Peptídeo FAKLAARL YRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12] inibiu a atividade de SAPK2a.
O peptídeo inibidor terapêutico WLRRIKAWLRRI- - KALNRQLGVAA [SEQ ID NO: 14] demonstrou menos especificidade.
Tabela 5. Efeito de 5 Variantes de Peptídeo Inibidor Completos em 10 Quinases Humanas ' sequência WLRRIKA | FAKLAARLY | KAFAKLAA | YARAAARQ | YARAAA de peptí deo WLRRIKAL | RLARQOLGVA | RLYRLARQ | ARALARQL | ÇGARALN . NRQLGVAA A LGVAA GVAA QLGVA/ | seemae a Concentração de inibidor 100 100 300 atividade de quinase me | 3m ] sm ] sm ] 1; | 16 ve | sao | om | nm 5 | 6) 801) 16) so) 66(9) 560) 1050 [rox | om | sm | mm | 2; | 50
Os variantes de peptídeo inibidor terapêutico incorporando o peptídeo de PTD YARAAARQARA [SEQ ID NO: 5], porém diferindo em ter Ala substituída para Asn no domínio terapêutico, forneceu maior inibição das quinases IRAK4, PKBB, MLCK, ROCK-I e p38a do que o variante com a substituiçãode Asn. Exemplo 6. Atividade de peptídeo inibidor terapêutico contra interleuci- na-6 e fator de necrose de tumor-a A atividade de inibição de peptídeo inibidor terapêutico contra as citocinas Interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose de tumor-a (TNF-a) foi de- terminada.
6.1. Síntese de Peptídeo Peptídeos foram sintetizado em resina Rink-amida ou Knorr- amida (Synbiosci Corp., Livermore, CA) utilizando química FMOC padrão em um Symphony& Peptide Synthesizer (Protein Technologies, Inc., Tuscon, AZ). O reagente de acoplamento para os aminoácidos (Synbiosci Corp.) foi HBTU/NMM (Anaspec, Freemont, CA/Sigma, St. Louis, MO). Em seguida à . síntese, o peptídeo foi clivado da resina com um coquetel com base em áci- do trifluoroacético (95% de ácido trifluoroacético, 2,5% de água, 1,25% de - triisopropilsilano, e 1,25% de etanodiol), precipitado em éter, e recuperado por centrifugação. O peptídeo recuperado foi seco em vácuo, ressuspenso ' em água purificada MilliQ, e purificado utilizando um FPLC (AKTA Explorer, GE Healthcare, Piscataway, NJ) equipado com uma coluna prep.-escala 22/250 CI 8 (Grace Davidson, Columbia, MD). Um ácido acético foi utilizado para obter purificação. O peso molecular desejado foi confirmado pela es- pectrometria de massa MALDI de tempo de trajetótria utilizando um Analisa- dor 4800 Plus MALDI TOF/TOFQO (Applied Biosystems, Foster City, CA).
6.2. Tratamento e Cultura de Célula Mesotelial Uma linhagem celular de células mesoteliais pleurais (CRL- 9444) foi adquirida de American Type Culture Collection. As células foram —mantidase semeadas em Meio 199 com Earle's BSS e L-glutamina a 0,75 mM (Mediatech, Inc., Manassa, VA), 1,25 g/L de bicarbonato de sódio (Sig- ma, St. Louis, MO), fator de crescimento epidérmico a 3,3 nM (MBL Interna-
tional, Woburn, MA), hidrocortisona a 40 nM (Sigma), insulina a 870 nM (M- BL International), HEPES a 20 mM (Sigma), mistura B de elementos traço (Mediatech, Inc.), 10% de soro bovino fetal (FBS) (Hyclone, Waltham, MA) e 1% de penicilina/estreptomicina (Mediatech, Inc.). Antes do tratamento das células com peptídeo inibidor terapêutico, as células foram permitidas se aclimatar em meios livres de soro consistindo em somente Meio 199 com BSS de Earle.
L-glutamina, bicarbonate de sódio, HEPES, mistura de ele- mentos traço B, e penicilina/estreptomicina (concentrações e fornecedores como acima) durante 24 horas antes do tratamento com inibidores de citoci- nage/oupeptídeo.
As citocinas com ou sem peptídeo inibidor ou o inibidor de proteína quinase comercialmente disponível Roterlina (IC;so=S uM) (Tocris Bioscience, Ellisville, MO)) também sempre foram adicionados simultanea- mente neste meio de formulação.
Para todos os experimentos de cultura de célula, a sequência de peptídeo inibidor MK2 de penetração de célula YA- “15 RAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11] foi utilizada. ] 6.3. Análise de Interleucina-6 - Geralmente acredita-se que citocinas proinflamatórias tais como interleucina (IL)-I, IL-6 e fator de necrose de tumor-a (TNF-a) são liberados - na cavidade abdominal após cirurgia abdominal.
Estas citocinas podem de- sempenhar um papel na formação/reformação de adesão.
Estudos reporta- Ú ram que IL-l e TNF-a são ambos citonas pró-inflamatórias importantes na fase inicial de cura de ferida e são produzidos por macrófagos ativados no fluido peritoneal, ao mesmo tempo em que IL-6 é expresso por macrófagos ativados e sua produção é superregulada por IL-| durante o processo infla- —matório.
Além disso, estudos reportaram que ambos IL-| e TNF-a são induto- res potentes de IL-6. Estas citocinas são consideradas serem importantes uma vez que elas interagem extensivamente com a série de reação fibrinoli- tica e pode contribuir diretamente ou indiretamente com a remodelagem da matriz extracelular.
Estudos reportaram que ambos |IL-IB e TNF-a super- regulam o nível de expressão de IL-6 e IL-8 em células mesoteliais.
Adicio- nalmente, IL-IB foi mostrado superregular o nível de expressão de TNF-a, IL- 6 e IL-8 em macrófagos.
Consequentemente, a quantificação do nível de expressão de IL-6 induzida por IL-IB ou TNF-a em células mesoteliais ou macrófagos é utilizada como um sistema de ensaio modelo para determinar a atividade de peptídeo inibidor terapêutico. A análise de 1L-6 foi realizada com um kit IL-6 ELISA (PeproTe- ch,Inc, Rocky Hill/ NJ. Resumidamente, a placa foi preparada como se- gue. O anticorpo de captura (anti-hiL-6 de cabra purificado por afinidade de antígeno + 2,5 mg de D-manitol) foi diluído com salina tamponada de fosfato (PBS) para uma concentração de 1 ug/ml e adicionada a cada poço da pla- ca. A placa foi selada e incubada em temperatura ambiente durante a noite. Os poços em seguida foram aspiradas para remover o líquido, e lavadas 4 vezes utilizando tampão de lavagem (300 ul por poço def 0,05% de Tween- 20 em PBS). Após a última lavagem, a placa foi invertida para remover o tampão residual, e secas em uma toalha de papel. O tampão de bloqueio (300 ul por poço de 1% de BSA em PBS) foi adicionado, a placa incubada durante pelo menos 1 hora em temperatura ambiente, aspirado elevada 4 Vezes.
- Padrões (de 2 ng/ml a zero) e amostras foram preparados em di- luente, imediatamente adicionados a cada poço em triplicata, e incubados b. em temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas em um agitador de placa ajustado para 300 rom. Os poços em seguida foram aspirados, lava- : dos 4 vezes, anticorpo de detecção (anti-hiL-6 de cabra purificada por afini- dade de antígeno biotinilado + 2,5 mg de D-manitol; 0.25 pg/ml) adicionado (100 ul) a cada poço, e a placa incubada em temperatura ambiente durante 2 horas em um agitador de placa ajustado para 300 rpm. Em seguida a incu- bação, a placa foi aspirada, lavada 4 vezes, conjugado de rábano picante peroxidase (HRP) adicionado ((5,5 ul: 10994,5 ul de diluente) (100 ul) a cada poço, incubado durante 30 minutos em temperatura ambiente em um agita- dor de placa ajustado para 300 rpm, aspirado, e lavado 4 vezes. A cada po- ço em seguida foi adicionada Solução de Substrato Líquido ABTS (Sigma) (100yul)) A placa ffoiincubada em temperatura ambiente para o desenvolvi- mento de cor em um agitador de placa ajustado para 300 rpm. A absorção foi medida em 405 nm e 650 nm (650 ran foi a correção de comprimento de onda subtraído de cada 405 nm de medição) utilizando um Leitor de Micro- placa Spectramax M5 (Dispositivo Molecular) a cada 5 minutos durante 50 minutos. A mancha nuclear Hoeschst 33342 (Invitrogen) foi utilizada para quantificar o número de célula na base de quantidade de DNA. Todos os resultados foram executados em triplicata e normalizados para o número de célula.
Resultados são apresentados como média + desvio-padrão. As análises de unilaterais ANOVA foram utilizadas para determinar aumentos ou diminuições estatisticamente significantes em parâmetros de interesse.
Diferenças significantes foram analisadas com comparações post hoc de Tukey HSD. Um nível significance de a = 0,05 foi utilizado em análises de citocina.
6.4. Requlação de Expressão de IL-6 com Indução por IL- IB As células mesoteliais foram incubadas com IL-IB (1 ng/ml) (para induzir expressão de IL-6) e/ou concentrações diferentes de peptídeo inibi- dor terapêutico. O Rottlerin inibidor de proteína quinase comercialmente - disponível foi introduzido como um inibidor de ambos MK2 e PRAK. A figura 7 mostra um plot da concentração média de IL-6 - (Pg/ml/105 células) contra o tempo. Estes resultados mostram que peptídeo inibidor terapêutico YARAAMARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] inibiu ; a expressão de IL-6 induzida por IL-IB em células mesoteliais. Estes resul- tados também mostram que a concentração superior do peptídeo inibidor terapêutico YARAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11] (3 mM) e Rottlerin (1 uM) significantemente reduziram a expressão de IL-6 induzida porliLB. Os resultados também mostram que uma redução significante de expressão de IL-6 induzida por IL-IB pelo peptídeo inibidor terapêutico Y ARAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11] (3 mM) ocorre antes (em 6 horas) do que aqueles provocados por Rottlerin (12 horas).
6.5. Requlação de Expressão de IL-6 com Indução por TNF-a As células mesoteliais foram incubadas com TNF-a (para induzir expressão de IL-6) e/ou concentrações diferentes de um peptídeo inibidor terapêutico (VYARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] ou FAKLA-
ARLYRKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 12)). O inibidor de proteína quinase comercialmente disponível Rottlerin foi utilizada como um inibidor de MK2. A figura 8 mostra um plot da concentração média de IL-6 (pg/ml/105 células) contra o tempo.
Estes resultados mostram que ambos os peptídeos inibidores terapêuticos reduziram o nível de expressão de IL-6 induzida por TNF-a (1 ng/ml) e também sugerem que o efeito dos peptídeos inibidores terapêuticos pode ser dependente da dose.
Os resultados tam- bém mostram que o inibidor de proteína quinase foi ineficaz na redução do nível de expressão de IL-6 induzida por TNF-a (1 ng/ml), A figura 9 mostra um plot da concentração média de IL-6 (Pg/mlI/ 105 células) contra o tempo.
Estes resultados mostram que ambos os peptídeos inibidores terapêuticos reduziram o nível de expressão de IL-6 induzida por TNF-a (10 ng/ml) e também sugerem que o efeito dos peptí- deos inibidores terapêuticos pode ser dependente da dose.
Os resultados também mostram que o inibidor de proteína quinase Rottlerin inicialmente : (de 6-12 horas) afetou a redução mínima do nível de expressão de IL-6 in- - duzida por TNF-a (10 ng/ml). Exemplo 7. Efeito de MK2i na Produção de IiL-lp - O efeito inibidor de proteína inibidora terapêutica tendo a se- —quênciade aminoácido YARAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11] í na produção de IL- IB foi estudado em células neurais.
As culturas primárias de astrócito cortical foram estabelecidas.
Os astrócitos de rato primários foram isolados de córtices de rato Sprague Dawley embriônico de 18 dias.
As células foram isoladas seguindo-se o pro- tocolo de Traumatismo Crâniano sugerido e cresceram para confluência em pratos petro de poli-lisina (PDL) de 100 mm.
Resumidamente, os córtex de rato foram triturados com auxílio de uma pipeta de 1 ml até que a maioria dos pedaços de córtex grandes fosse dispersa.
Após os fragmentos de teci- do maiores terem sido permitidos sedimentar, o sobrenadante foi coletado, emum tubo cônico de 15 ml, e peletizado por centrifugação em 1100 rpm durante 1 minuto.
O sobrenadante resultante foi descartado e o pélete res- suspenso em meio neurobasal (10% de soro de cavalo, glutamina a 3 mM).
Os astrócitos em seguida foram semeados nas placas de petri e crescidos até que ficassem confluentes (80-95%) após o que foram passados. Os as- trócitos foram passados 1:4, cresceram para 80-95% de confluência, em se- guida enxaguados duas vezes com PBS. Os tipos de tratamento diferentes foram aplicados a cada placa de petri correspondente durante 18-22 horas. Houve um total de 1 ml de meios (meio neurobasal com 10% de soro de ca- valo, glutamina a 3 mM) mais tratamento em cada placa de petri. O controle positivo compreendeu tratar as células com TNF-a (ou 5 ng/ml ou 10 ng/ml); como um controle negativo, as células foram expostas ao meio celular sem qualquer tratamento. Os grupos de tratamento consistiram em (i) MK2i a 1 mM (peptídeo inibidor terapêutico YARAAARQ ARAKALARQLGV AA [SEQ ID NO: 11)) com TNF-a (5 ng/ml); (ii) MK2i a 3 mM com TNF-a (5 ng/ml); (iii) MK2i a 1 MM com TNF-a (10 ng/ml TNF-a0); e (iv) MK2i a 3 mM com TNF-a (10 ng/ml). As citocinas com ou sem peptídeo inibidor terapêutico foram sempre adicionadas simultaneamente nesta formulação de meio. i Após 18-22 horas, as células foram enxaguadas com PBS, ras- - padas em um pequeno tubo centrífugo utilizando um tampão de lise (ureia a 8 M ea, 4% de CHAPS, DTT a 10 mM), e rompidas utilizando-se um Disrup- - tor Genie (Scientific Industries, Bohemia, NY) durante 2 horas. As células foram peletizadas por centrifugação em 17 krpm durante 15 minutos, o so- : brenadante (lisado celular) coletado e a concentração de proteína total quan- tificada (Pierce BCA Protein Assay kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).
A figura 10 mostra um gráfico da concentração de IL-IB média (pg/ml) de cada grupo de tratamento (i) MK2i 1 mM (peptídeo inibidor tera- pêutico YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: HJ) com TNF-a (5 ng/ml); (ii) MK2i a 3 mM com TNF-a (5 ng/ml); (iii) MK2i a 1 mM com TNF-a (10 ng/ml); e (iv) MK2i a 3 mM com TNF-a (10 ng/ml). Estes resultados mostram que TNF-a aumentou a concentração de IL-IB, como esperado, e o — peptídeo inibidor terapêutico foi capaz de inibir o nível de expressão de IL-IB em culturas de astrócito cortical primário de uma maneira dependente da dose. Os resultados sugerem que o peptídeo inibidor terapêutico ativamente limitará a cicatrização glial que é devido a expressão de citocina inflamatória induzida.
Exemplo 8. Efeito de Inibição de MAPKAP QUINASE 2 (MK2i) na Produ- ção de IL-6 O efeito inibidor de proteína inibidora terapêutica tendo sequên- cia de aminoácido YARAAMARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 11] na produção de IL-6 foi estudado em uma cultura tripla consistindo em neurô- nios, astrócitos, e microglia. O meio celular foi preparado como segue. Re- sumidamente, o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (6,68 g) e bicarbonato de sódio (1,85 g) foram adicionados a água desionizada destila- da (DDi) (500 ml!); a suspensão foi esterilizada por filtro e, em seguida su- plementada com penicilina/estreptomicina (500 ul), soro bovino fetal (FBS) (50 ml), e soro humano (HS) (50 ml). O meio preparado foi adicionado (1 ml) ao tecido, e o tecido triturado 10 vezes durante 30 segundos através de uma ponta de pipeta estéril. A suspensão celular foi filtrada através de um filtro i de náilon e coletado. A suspensão foi filtrada foi centrifugada em 1100 rpm - durante 1 minuto e o pélete ressuspenso. As células El 8 foram semeadas (1 x 10º células/ml) para suportar a diferenciação em neurônios, astrócitos, e - microglia. Após uma semana na cultura, algumas células foram fixadas e —sondadas para B-3 tubulina (um biomarcador para neurônios), proteína ácida fibrilar glial (GFAP, um biomarcador para astrócitos) e molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado 1 (Ibal, um biomarcador para microglia) para validar a presença de todos os três tipos de célula. Os anticorpos primários utilizados incluíram anti-lbal de coelho(1:200; Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA), anti-GFAP de galinha (1:200; Millipore Corp., Billerica, MA), e anti-B-3-tubulina de camundongo conjugado para Alexa Fluor 488 (1:200; Millipore Corp., Billerica, MA). Os anticorpos secundários incluíram anti- coleho de cabra Alexa Fluor 633 (1:200; Invitrogen, Carisbad, CA), e antiga- linha de cabra Alexa Fluor 555 (1:200; Invitrogen, Carisbad, CA). Os nú- cleos foram rotulados com Hoescht 33342 (Invitrogen, Carisbad, CA). O controle positivo compreendeu tratar as células com TNF-a (ou 5 ng/ml ou 10 ng/ml); como um controle negativo, as células foram expostas ao meio celular sem qualquer tratamento. Os grupos de tratamento consistiram em () MK2i a 1 mM (peptídeo inibidor terapêutico YARAAARQ ARAKALAR- QLGV AA [SEQ ID NO: 11)) com TNF-a (5 ng/ml); (ii) MK2i a 3 mM com TNF-a (5 ng/ml); (iii) MK2i a 1 MM com TNF-a (10 ng/ml TNF-a); e (iv) MK2i a3mMcom TNF-a (10 ng/ml). Citocinas com ou sem peptídeo inibidor tera- pêutico foram sempre adicionadas simultaneamente nesta formulação de meio. A figura 11 mostra um gráfico da concentração média de IL-6 (pg/ml) de cada grupo de tratamento (i) controle negativo (somente o meio); (ii) TNF-a (5 ng/ml); (iii) TNF-a (10 ng/ml); (iv) TNF-a (5 ng/1) e MK2i (peptí- deo inibidor terapêutico a 1 MM YARAAARQARAKALARQLGVAA [SEQ ID NO: 111); (v) TNF-a (10 ng/ml) e MK2i (1 MM); (vi) TNF-a (5 ng/ml) e MK2i (3 mM); e (vii) TNF-a (10 ng/ml) e MK2i (3 mM). Estes resultados mostram que TNF-a (5 ng/ml!) aumentou o nível de expressão de IL-6 ns culturas celu- lares e que todas as culturas celulares tratadas com o peptídeo inibidor tera- : pêutico tiveram níveis reduzidos de expressão de IL-6.
' Ao mesmo tempo em que a presente invenção foi descrita com referência às modalidades específicas da mesma deve ser entendido por - aqueles versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equi- valentes podem ser substituídos sem afastar-se do espírito e escopo da in- 7 venção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adotar uma situação particular, material, composição de material, processo, etapa ou etapas do processo, para o espírito e escopo objetivo da presente invenção. Todas tais modificações são pretendidas estarem no escopo das reivindica- çõesanexasaesta.

Claims (10)

  1. | 112
    REIVINDICAÇÕES " 1. Composição de inibição de quinase para tratar um distúrbio in- flamatório cuja patofisiologia compreende expressão de citocina inflamatória, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ini- bidor terapêutico, em que a quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo inibidor terapêutico inibe pelo menos uma enzima quinase, em que o peptídeo inibidor terapêutico compreende um primeiro domínio e um segundo domínio, em que o primeiro domínio compreende um domínio de transdu- ção de proteína e está localizado próximo ao segundo domínio, i em que o segundo domínio compreende um domínio terapêutico e está localizado próximo ao primeiro domínio, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável compreendendo uma solução aquosa estéril, em que a composição reduz direta ou indiretamente a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória selecionada do grupo consistindo em IL-6, TNF-a, e IL-1B; e (c) um recipiente de multidose ou dose única para a composição.
  2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo com uma se- quência de aminoácido que apresenta identidade substancial à sequência de aminoácido YARAAMARQARAKALARQLGVAA.
  3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada —pelofatode que o domínio terapêutico do peptídeo inibidor terapêutico apre- senta identidade substancial à sequência de aminoácido KALARQLGVAA.
  4. 4, Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de transdução do peptídeo inibidor terapêutico apresenta identidade substancial à sequência de aminoácido WLRRIKA- —WLRRIKA.
  5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico apresenta identidade substancial à sequência de aminoácido ] YARAAARQARA.
  6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada | À pelo fato de que o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico apresenta identidade substancial à sequência de aminoácido FAKLAARLYR.
  7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo inibidor terapêutico apresenta identidade subs- . tancial à sequência de aminoácido FAKLAARLYRKALARQLGVAA.
  8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de transdução de proteína do peptídeo inibidor terapêutico apresenta identidáde substancial à sequência de aminoácido KAFAKLAARLYR.
  9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada —pelofato de que o peptídeo inibidor terapêutico é um peptídeo com uma se- quência de aminoácido que apresenta identidade substancial à sequência de aminoácido KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA.
  10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende pelo menos um variante que é pelo menos 90% idêntico a pelo menos uma das SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 15.
    mM “e SRPRBRO É Teses |
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