BRPI0923433B1 - Método para produzir uma célula geneticamente modificada tendo a capacidade de produzir compostos fucosilados e método para fazer um composto fucosilado - Google Patents
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Abstract
método para produzir uma célula geneticamente modificada tendo a capacidade de produzir compostos fucosilados, célula geneticamente modificada e método para fazer o composto fucosilado. a presente invenção refere-se a um método para produzir uma célula geneticamente modificada tendo a capacidade de produzir compostos fucosilados compreendendo as etapas de: transformar a célula para expressar uma fucose quinase, transformar a célula para expressar uma fucose-1-fosfato guanililtransferase, transformar a célula para expressar uma fucosiltransferase.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a métodos para fazer compostos fucosilados e células relacionadas aos mesmos.
[0002] O leite humano é constituído por uma mistura complexa de carboidratos, proteínas, lipídios, hormônios e micronutrientes, fornecendo todos os nutrientes necessários para o desenvolvimento infantil. Além disso, o leite humano contém vários agentes de proteção. Além das imunoglobulinas, o leite humano contém uma série de oligossacarídeos complexos com propriedades protetoras. A fração oligossacarídeo do leite humano (HMO) compreende, além do principal componente do carboidrato, a lactose, mais de 130 diferentes oligossacarídeos complexos. Esta diversidade estrutural de oligossacarídeos complexos e suas ocorrências em grandes quantidades são únicas para os seres humanos. Em contraste, apenas vestígios de oligossacarídeos muito menos complexos são encontrados no leite bovino e, consequentemente, as fórmulas infantis comumente usadas não possuem estes oligossacarídeos.
[0003] Os dados clínicos mostraram que bebês amamentados têm menor incidência de diarreia, doenças respiratórias e otite média do que bebês alimentados com fórmula. Durante muito tempo, estes efeitos protetores do leite humano têm sido atribuídos à presença de imunoglobulinas secretadas, no entanto, agora têm se reconhecido que os HMOs podem ser uma importante linha de defesa contra patógenos para crianças amamentadas.
[0004] Muitos dos HMOs complexos apresentam homologia aos glicoconjugados da superfície da célula, como o antígeno do grupo histo-sanguíneo Lewis x (Lex) Gal (β1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(β1) (Newburg, 2001), que muitas vezes servem como receptores do patógeno. Assim, ao excretar imitadores solúveis, imitando as estruturas de glicoconjugados da superfície celular, a natureza desenvolveu aqui um mecanismo eficaz para prevenir infecções. Por exemplo, foi mostrado que os HMOs podem reduzir drasticamente a virulência de Escherichia coli (Cravioto et al., 1991), Vibrio cholerae (Coppa et al., 2006), Streptococcus pneumoniae (Andersson et al., 1986) ou Campylobacter jejuni (Ruiz-Palacios et al., 2003) patogênicos e também são capazes de neutralizar as toxinas, como a enterotoxina termo-estável da E.coli (Crane et al., 1994). Além dos efeitos locais mencionados no trato intestinal, os HMOs também são capazes de provocar efeitos sistêmicos em bebês, ao entrar na circulação sistêmica (Gnoth et al., 2001).
[0005] O impacto dos HMOs nas interações proteína-carboidrato, por exemplo, a ligação selectina-leucócito, pode modular respostas imune e reduzir as respostas inflamatórias (Bode, 2006, Kunz & Rudloff, 2006).
[0006] Os oligossacarídeos complexos representam o terceiro maior componente do leite humano, depois da lactose e da gordura. Quase todos eles têm em comum a lactose no final da redução, e estão decorados com fucose e/ou ácido siálico nos finais não redutores. Eles são construídos a partir de 3 a até 32 monossacarídeos e a maioria deles contém fucose, com 1 a 15 unidades de fucose. Assim, os oligossacarídeos fucosilados apresentam um grande potencial como ingredientes alimentares bioativos com atributos anti-infecciosos e prebióticos.
[0007] Fucosiltransferases (FucTs), que catalisam a transferência de resíduos de fucose do doador guanosina difosfato ativado pela L- fucose (GDP-L-fucose) para várias moléculas receptoras, são expressas em animais, plantas, fungos e bactérias (Ma et al., 2006). Elas são classificadas de acordo com o sítio da adição de fucose, portanto, α1,2, α1,3/4 e α1,6 FucTs são distinguidas. Além de FucTs humanas, que são originalmente responsáveis pela biossíntese dos HMOs e dos antígenos do grupo sanguíneo, várias FucTs bacterianas têm sido descritas. A atividade da FucT tem sido melhor documentada para o patógeno gástrico humano Helicobacter pylori, que decora seu lipopolissacarídeo (LPS) com antígenos Lewis contendo fucose (Wang et al., 2000). O papel exato dessas estruturas de antígenos Lewis durante a infecção por H. pylorinão está claro, mas a imitação molecular para enganar o sistema imune hospedeiro, a adesão e a colonização são discutidos (Bergman et al., 2006).
[0008] Devido ao grande potencial dos HMOs como suplementos alimentares de promoção da saúde, existe um forte interesse na produção econômica em grande escala. A produção biocatalítica através de processos de fermentação bacteriana é altamente favorável sobre a extração de HMOs do leite humano e a síntese química, que é trabalhosa e requer proteção múltipla e etapas de desproteção (Kretzschmar & Stahl, 1998). Durante a última década, várias tentativas de síntese de HMO usando a fermentação com E. coli recombinante ou em conversão enzimática in vitro, foram publicadas (Albermann et al., 2001, Dumon et al., 2006, Dumon et al., 2001, Dumon et al., 2004, Koizumi et al., 2000). O obstáculo na produção de oligossacarídeos fucosilados é, no entanto, a disponibilidade do nucleotídeo doador do açúcar GDP-fucose. Esta molécula de alta energia não é eficaz, nem economicamente acessível através de síntese química ou enzimática. A maioria das publicações relatando sistemas de produção para os compostos fucosilados dependes do pool da GDP-fucose endógena da E. coli, que, entretanto, é extremamente limitado e apenas usado para a síntese induzível do ácido colânico exopolissacarídeo contendo fucose (Grant et al., 1970).
[0009] Por exemplo, Albermann et al. (2001) usam enzimas recombinantes em uma síntese enzimática. A GDP-β-L-fucose é preparada pela conversão da GDP-D-manose em GDP-4-ceto-6- desóxi-D-manose. Este é tratado com uma GDP-4-ceto-6-desóxi-D- manose 3,5 epimerase-4-redutase para produzir GDP-β-L-fucose, que é purificado por HPLC preparativa.
[00010] Outra abordagem por Koizumi e colaboradores para sintetizar Lex da N-acetil-lactosamina (LacNAc) envolveu a combinação da produção de GTP do GMP suplementado por Corynebacterium ammoniagenes, da síntese de GDP-fucose através da GDP-manose e da fucosilação de LacNAc por superexpressão de H. pyloriα1,3 FucT em cepas separadas de E. coli (Koizumi et al., 2000). Uma vez que a permeabilização, e desse modo matando as células, teve que ser usada para esta abordagem de acoplamento bacteriano, um processo de fermentação contínuo e em larga escala não é possível com esta abordagem escolhida.
[00011] Há ainda a necessidade de métodos para produzir compostos fucosilados que superam, pelo menos, alguns dos inconvenientes da técnica anterior.
[00012] Uma modalidade da invenção é um método para fazer uma célula geneticamente modificada com a capacidade de produzir compostos fucosilados compreendendo as etapas de - transformar a célula para expressar uma fucose quinase - transformar a célula para expressar uma fucose-1-fosfato guanililtransferase - transformar a célula para expressar uma fucosiltransferase.
[00013] De acordo com o método da invenção, uma célula geneticamente modificada é produzida. Ela tem sido transformada para expressar uma fucosequinase, uma fucose-1-fosfato guanililtransferase e uma fucosiltransferase.
[00014] Os métodos para introduzir os genes em uma célula são conhecidos pelos especialistas.
[00015] Em uma modalidade preferida, a célula geneticamente modificada é um micro-organismo selecionado do grupo constituído pelos gêneros Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces.
[00016] Em uma modalidade preferida da invenção, as atividades da fucose quinase e da fucose-1-fosfato guanililtransferase são combinadas em uma enzima bifuncional. Os genes adequados para transformação, codificando uma fucose quinase, uma fucose-1-fosfato guanililtransferase e/ou uma fucose/quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase bifuncional podem ser obtidas a partir dos gêneros Bacteroides, Lentisphaera, Ruminococcus, Solibacter, Arabidopsis, Oryza, Physcomitrella, Vitis, Danio, Bos, Equus, Macaca, Pan, Homo, norvegicus, Mus e Xenopus.
[00017] Os genes fucosiltransferase adequados podem ser derivados de organismos selecionados do grupo dos gêneros Helicobacter, Escherichia, Yersinia, Enterococcus, Shigella, Klebsiella, Salmone-la Bacteroides, Dictyostelium, Arabidopsis, Drosophila, Homo, Bos, Mus, Rattus, Gallus, Canis e Sus.
[00018] Dependendo da fonte do gene e da célula usada para expressão, uma otimização do códon pode ser útil para aumentar a expressão.
[00019] Algumas células têm uma via catabólica de fucose. Neste caso, é recomendável a desativação destas vias catabólicas. Os métodos adequados compreendem inativar um ou vários genes selecionados do grupo consistindo de um gene fucose-1-fosfato aldolase, um gene fucose isomerase e um gene fuculose quinase.
[00020] Os compostos apropriados derivados da fucose que podem ser preparados pelas células geneticamente modificadas da presente invenção são fucosil-lactoses, de preferência 2'-fucosil-lactose, 3- fucosil-lactose ou lactodifucotetraose.
[00021] A presente invenção é uma síntese em uma célula iniciando pela fucose, em vez de uma síntese preparativa com enzimas recombinantes iniciando pela GDP-D-manose como descrito por Albermann et al. (2001).
[00022] Uma modalidade adicional da invenção é a célula geneticamente modificada obtida pelo método da invenção. Para produzir compostos fucosilados, a célula modificada geneticamente da invenção é cultivada sob condições de cultivo adequadas em um meio composto por fucose e um substrato aceptor.
[00023] Os substratos aceptores adequados são, por exemplo, um mono-, di- ou oligossacarídeo ou um peptídeo, por exemplo, lactose, 2'- fucosi-l-lactose ou 3-fucosil-lactose.
[00024] Os compostos fucosilados preferidos obtidos pelo método de produção são fucosil-lactoses, preferencialmente 2'-fucosil-lactose ou 3- fucosul-lactose ou lactodifucotetraose.
[00025] Este é o primeiro relato de síntese eficiente da GDP-fucose em E. coli a partir da L-fucose fornecida externamente e, portanto, o estabelecimento de uma "via de recuperação"da fucose em E. coli. No entanto, esta abordagem também pode ser transferida para outros organismos fáceis de cultura de interesse alimentar ou farmacêutico (por exemplo, Lactobacillus spp.). O uso desta via recém-descoberta oferece completamente nova perspectiva para a produção de oligossacarídeos, além de 2'-fucosil-lactose e 3-fucosil-lactose, sem a necessidade de recorrer a fornecimentos dispendiosos e trabalhosos da GDP-fucose (in vitro) ou endógena, altamente reguladas, ou vias biossintéticas da GDP-fucose endógenas (in vivo).
[00026] Na chamada "via de recuperação da fucose" a fucose é primeiro fosforilada em fucose-1-fosfato pela enzima fucose quinase. A fucose-1-fosfato é, então, convertida em GDP-fucose pela ação da enzima fucose-1-P-guanililtransferase. Recentemente, a primeira enzima bacteriana, Fkp, com atividades de fucose quinase e de L- fucose-1-P-guanililtransferase foi descrita (Coyne et al., 2005). A bactéria intestinal Bacteroides fragilis usa a enzima para a produção de GDP-fucose, que serve para a decoração dos polissacarídeos capsulares e das glicoproteínas com resíduos de fucose.
[00027] A figura 1 descreve as estruturas dos oligossacarídeos proeminentes complexos do leite humano (HMOs) 2'-fucosil-lactose e 3- fucosil-lactose.
[00028] A figura 2 mostra um esquema do ensaio de fotometria para determinação da atividade Fkp por reações enzimáticas acopladas e determinação da oxidação NADH; Fkp = fucose quinase/fucose-1- fosfato guanililtransferase bifuncional, PK = piruvato-quinase, LDH= L- lactato desidrogenase, PEP= Fosfoenolpiruvato.
[00029] A figura 3 mostra um esquema do ensaio de fotometria para determinação da atividade da FucT pelas reações enzimáticas acopladas e determinação da oxidação NADH; FucT= fucosiltransferase, PK = piruvato-quinase, LDH= L-lactato desidrogenase, PEP= fosfoenolpiruvato.
[00030] A figura 4 mostra a formação da proteína após a indução. Linhas de 1 a 4: expressão da Fkp solúvel total (105,7 kDa) e/ou FutAco (49,3 kDa) ou FucT2 (35,9 kDa), em extratos brutos de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP (linha 1), E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pET-futAco (linha 2), E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pETfutAco (linha 3) e E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pCAW55 (linha 4); linha 5: PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Fermentas, Alemanha); linhas de 6 a 9: expressão do Fkp insolúvel e/ou FutAco ou FucT2 em restos de células ressuspensas em 6 M de ureia de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP (linha 6), E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pET-futAco (linha 7), E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pETfutAco (linha 8) e E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA- fkp-fucP + pCAW55 (linha 9).
[00031] A figura 5 mostra uma rádio cromatografia em camada delgada (rádio-TLC) da 3H-fucose, desenvolvida com butanol: acetona: ácido acético: água (35:35:7:23) e analisada por meio de um leitor de rádio-TLC.
[00032] A figura 6 mostra uma rádio-TLC de um extrato celular de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 mostrando fucose e fuculose e fuculose-1-fosfato, entretanto, a degradação da fuculose- 1-fosfato é inibida devido ao nocaute genômico do gene fuculose-1- fosfato aldolase (FucA).
[00033] A figura 7 mostra a rádio-TLC do extrato celular de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP mostrando a GDP-fucose acumulada produzida por Fkp fucose quinase /fucose-1-fosfato guanililtransferase bifuncional de Bacteroides fragilis, bem como fucose e produtos de degradação fuculose e fuculose-1-fosfato.
[00034] A figura 8 mostra uma rádio-TLC de um extrato celular de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco mostrando a 3- fucosil-lactose acumulada produzida pelo códon otimizado pela fucosiltransferase do Helicobacter pyloriatravés da GDP-fucose fornecida pela fucose quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase bifuncional (Fkp). Fucose e produtos de degradação fuculose e fuculose-1-fosfato estão apenas minimamente presentes; a quantidade de GDP-fucose é significativamente reduzida devido à produção de 3- fucosil-lactose.
[00035] A figura 9 mostra uma análise HPAED de lisado celular da cepa de controle negativo de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 mostrando L-fucose, lactose, glicerol e L- ramnose intracelular, mas não fucosil-lactose.
[00036] A figura 10 mostra um lisado celular da cepa de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco produzindo a 3- fucosil-lactose (tempo de retenção de cerca de 11 min); além disso, os picos de L-fucose, lactose, glicerol, e L-ramnose podem ser vistos.
[00037] A figura 11 mostra uma análise HPAED de lisado celular da cepa de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pCAW55 apresentou produção de 2'-fucosil-lactose (tempo de retenção de cerca de 22 min). Além disso, L-fucose, lactose, glicerol e L-ramnose podem ser vistos.
[00038] A figura 12 a e b mostram a análise HPLC com detecção eletroquímica da expressão da GDP-fucose em E. coli JM109 (DE3) ΔfucA (Figura 12a) e E. coli JM109 (DE3) ΔfucA pCOLA-fkp-fucP (figura 12b).
[00039] Esta invenção é explicada adiante pelos seguintes exemplos não limitantes:
[00040] Para prevenir com sucesso a degradação da fucose externamente fornecida, o gene FucA, codificando para a principal enzima catabólica fuculose-1-fosfato aldolase teve que ser deletado do genoma da cepa da E. coli BW25113. Para a construção da deleção da fucA, a metodologia de (Datsenko e Wanner, 2000) foi aplicada. Para a expressão heteróloga de genes usando o promotor T7 uma T7 RNA polimerase induzível foi incorporada na cepa de deleção da E. coli BW25113 ΔfucA usando o kit de lisogenização ÀDE3 (Novagen). A cepa resultante foi, então, chamada de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3). Os plasmídeos pCOLA-fkp-fucP e pET-futAco foram construídos usando os vetores de expressão pCOLADuet-1 e pETDuet-1 (Novagen). Todos os iniciadores usados para a construção estão listados na tabela 2. O gene fkp (GeneBank n° de acesso AY849806) foi amplificado por PCR com iniciadores fkp-NcoIdireto e fkp-NotI-reverso usando o DNA genômico de Bacteroides fragilis ATCC 25285D. O gene fucP (GeneBank n° de acesso CP000948) de Escherichia coli K12 foi amplificado a partir do DNA genômico de E. coli TOP10 (Invitrogen, EUA), usando os iniciadores FucP-NdeI-direto e FucP-XhoI-reverso. Ambos o fkp e o fucP foram inseridos no primeiro e no segundo sítio de clonagem múltiplo (MCS) do pCOLADuet-1, respectivamente, usando os sítios de restrição indicados. O plasmídeo resultante foi designado como pCOLA-fkp-fucP. O gene futA (GeneBank n° de acesso AE000511) da cepa da H. pylori 26695 era um códon otimizado para a expressão na E. coli e preparado sinteticamente por GenScript Corporation (Piscataway, NJ, EUA). O gene foi amplificado usando os iniciadores FutAco-NcoI-direto e FutAco- BamHI-reverso, e inserido no primeiro MCS do pETDuet-1, rendendo o pET-futAco. A inserção correta dos genes clonados foi verificada por análise de restrição e sequenciamento usando os iniciadores recomendados pACYCDuetUP1, pET-Upstream, DuetDOWN-1, DuetUP2 e T7-Terminador listados no Manual de Vetores Duet (Novagen). O plasmídeo pCAW55 contendo o gene FucT2 codificando para α1,2-fucosiltransferase de Helicobacter pylori NCTC364 foi doado por C. Albermann (Instituto de Microbiologia, Universidade de Stuttgart) e é baseado no vetor pJOE2702 (Stumpp et al., 2000). O gene FucT2 é inserido através de sítios de restrição NdeI/PstI e controlado pelo promotor rhaPBAD induzível por L-ramnose. E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) foi transformada com os vetores de expressão por eletroporação (Dower et al., 1988). Todas as cepas bacterianas usadas neste estudo estão listadas na tabela 1. Tabela 1: Cepas de bactérias e plasmídeos utilizados.
* ApR, resistente à ampicilina, KmR, resistente à canamicina. Tabela 2: Iniciadores 
*Os sítios de restrição de reconhecimento da endonuclease estão sublinhados.
[00041] As cepas de E. coli foram inoculadas em 10 mL de caldo 2xYT (Sambrook & Russell, 2001), contendo 100 μg mL-1 de ampicilina e/ou 50 μg mL-1 de canamicina e incubadas durante a noite em um agitador rotativo a 37°C. No dia seguinte, 30 mL de caldo fresco 2xYT suplementado com os antibióticos apropriados foi inoculado 1/100 a partir da cultura deixada durante a noite, e incubado a 37°C em um agitador rotativo fornecendo boa aeração. Quando as culturas atingiram uma densidade óptica (OD600nm) de aproximadamente 0,5, indutores de isopropil-1-tio-e-D-galactopiranosídeo (IPTG) e/ou L-ramnose foram adicionados em uma concentração de 0,1 mM e 0,1%, respectivamente. As culturas foram posteriormente incubadas a 28°C durante a noite (aproximadamente 15 h), sob constante agitação. Para o ensaio de atividade fotométrica uma alíquota de cultura celular foi removida, as células foram peletizadas e ressuspensas em cinco vezes peso/volume de 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Contas de vidro foram adicionadas quatro vezes o peso da conta celular e a suspensão resultante foi centrifugada duas vezes por cinco minutos cada e, no intervalo, colocadas em gelo por mais cinco minutos. Os restos celulares foram removidos por centrifugação (13.200 rpm, 5 min, 4°C) e o extrato bruto resultante foi armazenado a 4°C.
[00042] Para a produção in vivo de fucosil-lactose, as células foram lavadas com um volume de cultura de solução salina tamponada de fosfato pH 7,4 (PBS) (Sambrook & Russell, 2001), e ressuspensas em 30 mL de meio mineral M9 modificado; para a receita M9 padrão (Sambrook & Russell, 2001), as seguintes substâncias foram adicionadas: 20 mM de L-fucose, 20 mM de lactose, 0,5% de glicerol, 0,5 mM de guanosina e 1x solução de vitamina GIBCO MEM (100X) (Invitrogen, EUA). Indutores L-ramnose (0,1%) e IPTG (0,1 mM) também foram adicionados a todas as culturas, independentemente de qual cepa foi cultivada para evitar diferentes condições de cultura. Novamente, as culturas foram incubadas a 28°C durante a noite (aproximadamente 15 h), sob constante agitação. As culturas foram centrifugadas e os sobrenadantes foram decantados e armazenados a -20°C. As células foram posteriormente lavadas com PBS, ressuspensas em água destilada, e permeabilizadas em autoclave (100°C, 5 min). Para remover os restos de células, as amostras foram centrifugadas (8500 rpm, 30 min) e o lisado celular claro foi armazenado a -20°C.
[00043] A expressão de proteínas heterólogas foi verificada por SDS- PAGE (Sambrook & Russell, 2001). Os extratos protéicos foram preparados em 1x tampão carregado de gel SDS e géis de poliacrilamida foram corados com Coomassie Brilliant Blue.
[00044] Para determinar a atividade Fkp, a atividade da fucose quinase da enzima foi medida pela quantidade de ADP decorrentes da ATP, usada como substrato pelo piruvato quinase (PK), enquanto desfosforilando fosfoenolpiruvato (PEP), ao passo que o piruvato resultante foi então convertido em L-lactato pela L-lactato desidrogenase (LDH), sob o consumo NADH. As reações correspondentes são resumidas na figura 2. Cada reação de 1000 μL foi realizada em 65 mM de tampão MOPS (pH 7,5) contendo 10 mM de L-fucose, 15 mM de PEP, 5 mM de MgSO4, 0,2 mM de cada ATP e NADH, e 5 U de cada PK e LDH. Após a adição de 25 μL de extrato bruto, a oxidação de NADH em NAD foi monitorada através da diminuição da absorção a 340 nm usando um Bio espectrofotômetro V- 630 (JASCO GmbH, Alemanha).
[00045] Analogamente, a atividade da FucT (como mostrado na figura 3) medida pelo GDP decorrente (do doador GDP-L-fucose), que foi fosforilada para GTP por PK sob conversão do PEP em piruvato. LDH catalisou a reação final da redução de piruvato em L-lactato com o consumo concomitante de NADH. Os extratos celulares (25 μL) foram testados em uma reação de 1000 μL contendo 10 mM de lactose, 100 μM de GDP-L-fucose, 5 mM de MgSO4, 0,2 mM de cada ATP e NADH, e de 5 U de cada PK e LDH, em 50 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5). A diminuição de NADH foi monitorada a 340 nm.
[00046] As amostras foram analisadas por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho (HPAED) usando um detector amperométrico pulsado Decade II da Antec Leyden (Holanda) e uma coluna CarboPac PA20 (Dionex, Alemanha) conectada a um sistema HPLC (Shimadzu, Alemanha). A sensibilidade do detector foi ajustada em 50 μA com um potencial de pulso aplicado de 0,05-V. Mono-, di- e oligossacarídeos eluídos com 10 mM de hidróxido de sódio a um fluxo de 0,4 mL min-1. Após eluição isocrática de 30 min com 10 mM de NaOH, a coluna foi lavada por 20 min com 200 mM de NaOH para obter tempos de retenção constantes e, posteriormente, regenerada com 10 mM de NaOH por 20 min.
[00047] As células de E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) foram transformadas com os vetores pCOLADuet-1, pETDuet-1, pCOLA-fkp- fucP e pET-futAco para gerar as seguintes cepas: E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET futAco.
[00048] A cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 serviu como controle de vetor vazio nos experimentos de alimentação. Todas as três cepas foram então usadas para os experimentos de alimentação com fucose rotulada trítio. Para os experimentos de alimentação, as células foram cultivadas alimentação em 3 ml de meio 2xYT contendo 20 μl L-5,6-3H-fucose (40-60 Ci/mmol e 1 mCi/mL), 50 mM de lactose e 1 mM de IPTG. De acordo com os vetores de expressão usados, o meio 2xYT foi suplementado com 100 μg ml-1 de ampicilina e/ou 50 μg mL-1 de canamicina. As culturas de E. coli de 3 mL foram incubadas em temperatura ambiente durante a noite. As células foram então coletadas por centrifugação e separadas do meio de cultura, os grânulos de células obtidos foram ressuspensos em 200 mL de ddH2O e fervidos por 5 min. Após o resfriamento em gelo por 10 min, os restos celulares foram coletados por centrifugação a 13000 rpm por 10 min. Dos sobrenadantes de células de E. coli assim obtidos, 20 μL de cada cultura foram aplicados a uma placa de TLC de gel de sílica (gel de sílica 60). Para o desenvolvimento da placa de TLC uma mistura de solventes consistindo em butanol: acetona: ácido acético: água (35:35:7:23) foi empregada. A análise de rádio-TLC foi então realizada com um leitor de rádio-TLC (Raytest). Para a determinação dos valores Rf de material de referência não radioativo a placa TLC foi pulverizada com uma solução de anisaldeído (5 mL conc. H2SO4, 100 ml de etanol, 1,5 ml de ácido acético, 2 mL de anisaldeído) e aquecida.
[00049] Uma vez que a lactose foi usada como substrato receptor para fucosiltransferases, a cepa da E. coli deficiente em β-galactosidase (lacZ) BW25113 foi escolhida para contornar o problema da degradação rápida da lactose (Datsenko e Wanner, 2000). A L-fucose também pode ser efetivamente degradada pela E. coli do tipo selvagem, através de isomerização para fuculose, fosforilação para fuculose-1-fosfato e posterior clivagem retro-aldol de fuculose-1-fosfato para glicerina-3- fosfato e L-lactaldeído. Para evitar a degradação da fucose fornecida, o gene fucA, que codifica a enzima catabólica principal da via de degradação da fucose, fuculose-1-fosfato aldolase (FucA), foi deletado no genoma da cepa da E. coli BW25113. A cepa resultante da E. coli BW25113 ΔfucA foi incapaz de crescer na fucose, assim como na lactose como única fonte de carbono em placas M9 mínimas. A lisogenização com ÀDE3 fago recombinante resultou em cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) compatível com o uso de vetores de expressão conduzidos pelo promotor T7. A capacidade de ativação de nucleotídeos da fucose para GDP-fucose é muito limitada na natureza e também foi durante muito tempo apenas conhecida de vários mamíferos (humanos, suínos, camundongos). A ativação do nucleotídeo da fucose é mediada aqui por duas etapas enzimáticas sucessivas, primeiro a fosforilação da fucose para fucose-1-fosfato, catalisada pela fucose quinase e seguida pela conversão da fucose-1- fosfato em GDP-fucose, catalisada pela guanililtransferase, respectivamente. Enquanto que em mamíferos a via de recuperação da fucose compreende duas distintas reações catalisadas por enzimas, as recém-descobertas proteínas bacterianas e vegetais compreendem ambas as atividades enzimáticas. Expressão heteróloga da fucose quinase humana em E. coli resultou apenas em atividade muito pouco detectável (Hinderlich et al., 2002). Os estudos bioquímicos mostraram que a fucoquinase mamífera representa uma enzima altamente regulada (Park et al., 1998). Para examinar se a recém-descoberta enzima Ffkp B. fragilis é mais adequada para a ativação da fucose e para fornecer de forma eficiente a GDP-fucose para a síntese de oligossacarídeos fucosilados em E. coli, o gene do DNA genômico de B. fragilis foi amplificado e clonado em um vetor de expressão bacteriano para expressão heteróloga.
[00050] Para a síntese de 2'- e 3-fucosil-lactose, as seguintes fucosiltransferases foram escolhidas para a coexpressão: o gene futA de H. pylori 26695 ( Appelmelk et al, 1999), codificando uma α1,3- fucosiltransferase, e o gene α1,2’-fucosiltransferase fucT2 de H. pylori NCTC364 (Albermann et al., 2001). Antes do início do processo de clonagem, o uso de códons de futA foi otimizado para a expressão em E. coli e o gene foi, então, sintetizado pela GenScript Corporation (EUA). O gene resultante futAco foi inserido no vetor de expressão pETDuet-1, e a expressão foi testada com e sem coexpressão de Fkp e FucP. Usando as condições de indução padrão, Fkp, FucP e FutAco ou FucT2 foram coexpressados. A formação da proteína foi analisada após a indução com IPTG e/ou L-ramnose com SDS-PAGE (vide figura 4), documentando a produção solúvel pronunciada da proteína Fkp, enquanto que a indução da proteína fucose permease (FucP) localizada na membrana poderia, como esperado, não ser detectada no citoplasma celular por SDS-PAGE. No entanto, os produtos dos genes de futAco e fucT2 provaram ser localizados principalmente em corpos de inclusão, com apenas uma pequena fração solúvel detectável.
[00051] Os extratos brutos obtidos de culturas induzidas foram testados para a atividade da fucose quinase e da fucosiltransferase usando enzimas auxiliares em ensaios enzimáticos acoplados, como descritos acima. Aparentemente, existe um histórico considerável de uma atividade oxidase NADH e/ou de fosfatase em E. coli BW25113 ΔfucA (DE3), que foi responsável por resultados não reprodutíveis e baixa atividade medida da fucose quinase e da fucosiltransferase das diferentes cepas. Portanto, decidiu-se determinar a atividade enzimática, monitorando a formação do produto intracelular (GDP- fucose e fucosil-lactose).
[00052] O objetivo deste experimento foi a verificação da produção de 3-fucosil-lactose da fucose e da lactose através da produção da GDP-fucose pela Fkp enzima bifuncional da via de recuperação da fucose da Bacteroides fragilis. A cepa de controle negativo da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1, bem como a Fkp e fucose permease expressando a cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP e Fkp, fucose permease e α1,3-fucosiltransferase expressando a cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco foram tratadas como descrito acima. Os extratos celulares derivados dessas cepas foram aplicados a uma placa de TLC, desenvolvidos como descritos acima e analisados por leitor de rádio- TLC. Além disso, L-fucose padrãomarcada com 3H foi aplicada em uma placa de TLC e desenvolvida (vide figura 5). Padrões não radioativos para a L-fucose e a L-fuculose-1-fosfato, GDP- L-fucose, bem como 3- fucosil-lactose foram analisados de forma similar por TLC e subsequentemente marcados por solução anisaldeído (dados não mostrados).
[00053] Os resultados do experimento de controle negativo (vide Figura 6) mostraram os produtos da primeira e segunda etapa catabólica do metabolismo da fucose, ou seja, L-fuculose (produzida a partir da fucose por fucose isomerase) e L-fuculose-1-fosfato (produzida a partir da fuculose por quinase fuculose). Posterior degradação da fucose é efetivamente inibida pelo nocaute do gene FucA, que codifica a enzima fuculose-1-fosfato aldolase, que catalisa a reação de clivagem retroaldol de fuculose-1-fosfato para L-lactaldeído e di-hidroxiacetona fosfato.
[00054] As células de E. coli coexpressando fucose quinase /fucose- 1-fosfato guanililtransferase fkp bifuncional de Bacteroides fragilis mostram a produção de GDP-fucose (vide figura 7), que é aparentemente acumulada nas células e só podem, minimamente, desviar para outras vias metabólicas, cujos produtos apareceriam, caso contrário, no rádio-TLC.
[00055] Os extratos de células da cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco mostram produção de 3-fucosil- lactose e apenas uma pequena quantidade de GDP-fucose (vide figura 8). Este resultado é consistente com o objetivo inicial do experimento, ou seja, para mostrar a produção de 3-fucosil-lactose através do fornecimento da GDP-fucose pela via de recuperação bifuncional da enzima Fkp da Bacteroides fragilis. A quantidade de produtos de degradação da fucose, fuculose e fuculose-1-fosfato é também bastante reduzida, devido ao consumo de GDP-fucose na produção de fucosil- lactose e a oscilação resultante do equilíbrio de reação da fuculose-1- fosfato e fuculose para fucose, que é constantemente retirado da reação pela produção da GDP-fucose.
[00056] A cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) abrigando pCOLA- fkp-fucP e o gene futAco ou fucT2 em um vetor de expressão individual, bem como a E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) contendo os vetores vazios pCOLADuet-1 e pETDuet-1 (controle negativo) foram cultivadas em caldo 2xYT, e a expressão da proteína foi induzida com IPTG e/ou L- ramnose por 15 horas a 28°C. As células foram posteriormente lavadas com PBS e ressuspensas em meio M9 modificado suplementado com L-fucose, lactose e guanosina, IPTG e L-ramnose. Depois de uma fase de fermentação (28°C, 15 h), as células foram colhidas, os sobrenadantes foram coletados e os lisados celulares preparados, como descrito acima.
[00057] A análise via HPAED apresentou tempos de retenção na coluna HPLC usada de cerca de 3 min para o padrão de L-fucose, aprox. 17 min para o padrão de lactose, aprox. 11 min para o padrão de 3- fucosil-lactose e de aprox. 22 min para o padrão usado de 2'-fucosil- lactose (dados não mostrados). O glicerol, ou seja, como fonte de carbono, parte do meio de cultura, foi registrado com um tempo de retenção de aproximadamente 1,5 min e o L-ramnose indutor com um tempo de retenção de 5,5 min. Ambas as substâncias são detectadas no meio intracelular durante a análise de lisados celulares.
[00058] Os lisados celulares da cepa de controle negativo da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 mostraram L-fucose e lactose intracelular, mas, como esperado, sem fucosil-lactose (vide figura 9). Além das moléculas mencionadas acima, o meio fornecido de carbono de fonte de glicerol e o L-ramnose indutor de transcrição também são detectados na análise.
[00059] A análise HPAED do lisado celular da cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco, coexpressando o gene fkp da B. fragilis e o gene fucose permease da E. coli em combinação com o códon otimizado do gene α1,3 -fucosiltransferase da Helicobacter pylori, mostrou a produção intracelular de 3-fucosil- lactose (pico em cerca de 11 min, ver fig. 10). A L-fucose e a lactose também são componentes do lisado celular, bem como o glicerol e a L- ramnose.
[00060] O lisado celular da cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA fkp-fucP pCAW55 apresentou produção intracelular de 2'fucosil- lactose (vide fig. 11), devido à coexpressão de α1,2-fucosiltransferase FucT2. Além disso, L-fucose, lactose, glicerol e L-ramnose podem ser vistos no lisado celular, assim como no lisado celular de controle negativo e 3-fucosil-lactose que produz a cepa da E. coli BW25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco.
[00061] Estes resultados mostram claramente a produção de 3- e 2'- fucosil-lactose em células recombinantes de E. coli a partir de L-fucose e lactose fornecidas externamente. Pela expressão heteróloga da proteína fkp de B. fragilis, catalisando a reação de duas etapas de fosforilação da fucose e transferência da fucose-1-fosfato guanilato, a produção eficiente de GDP-fucose foi obtida. O códon otimizado α1,3- fucosiltransferase FutAco inicialmente derivado de Helicobacter pylori ou α1,2-fucosiltransferase FucT2 de Helicobacter pylori, respectivamente, pode converter a GDP-fucose fornecida em 2'- e 3- fucosil-lactose.
[00062] A elevação do teor intracelular da GDP-fucose devido à expressão de Fkp foi mostrada pelo cultivo paralelo de uma cepa de E. coli expressando a Fkp de um plasmídeo e uma cepa de E. coli não contendo uma cópia da Fkp. A cepa da E. coli JM109 ΔfucA (DE3) foi, neste caso, usada como uma cepa controle sem Fkp. A cepa expressando Fkp foi a mesma cepa da E. coli JM109 (DE3) ΔfucA, desta vez contendo o plasmídeo pCOLA-fkp-fucP, e produzindo, assim, os genes codificando para fucose quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase fkp e fucose permease FucP. Enquanto os genes foram clonados em sítios de clonagem múltiplos (MCS) 1 e 2 do vetor pCOLADuet-1 (Novagen, Reino Unido), a expressão de ambos os genes pode ser induzida pela adição de IPTG, como ambos os MCS são flanqueados por um promotor T7/operador no lado 5'.
[00063] Ambas as cepas foram cultivadas em duplicata em 30 ml de meio 2YT, suplementado com canamicina para a cepa com pCOLA-fkp- fucP para manutenção do plasmídeo, em 37°C e 220 rpm. A indução da expressão da fkp foi iniciada em OD660D = 0,5 pela adição de 1 mM IPTG e as duas cepas foram abastecidas com 20 mM de fucose e, então, cultivadas por mais 3 horas a 37°C e 220 rpm. As células foram peletizadas por centrifugação e grânulos foram ressuspensos em 5 v/p de água destilada. Estas suspensões celulares foram incubadas a 95°C por 10 minutos para lisar as células. Os fragmentos (debris) celulares foram removidos por centrifugação e os sobrenadantes foram analisados por HPLC.
[00064] A análise HPLC foi realizada através da detecção eletroquímica com um detector amperométrico pulsado Decade II (Antec Leyden, Holanda). 20 mM de hidróxido de sódio + 825 mM de acetato de sódio foi usado como eluente em uma coluna CarboPac PA20 (Dionex, EUA). A GDP-fucose foi eluída com um tempo de retenção de 16,0 minutos. Tabela 3: Teor intracelular da GDP-fucose da E. coli JM109 (DE3) ΔfucA com e sem expressão de fucose quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase Fkp de pCOLA-fkp-fucP.
[00065] A figura 12a mostra a análise HPLC das células de E. coli JM109 (DE3) ΔfucA para a expressão da GDP-fucose sem expressão da proteína FKP.
[00066] A figura 12b é uma análise das células de E. coli JM109 (DE3) ΔfucA pCOLA-fkp-fucP que coexpressam a proteína Fkp juntamente com o importador FucP da fucose. O pico em 16,0 min corresponde à GDP-fucose, como verificado com um padrão autêntico. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Albermann, C., W. Piepersberg & U. F. Wehmeier, (2001) Synthesis of the milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose using recombinant bacterial enzymes. Carbohydr Res 334: 97-103. Andersson, B., O. Porras, L. A. Hanson, T. Lagergard & C. Svanborg- Eden, (1986) Inhibition of attachment of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae by human milk and receptor oligosaccharides. J Infect Dis 153: 232-237. Appelmelk, B. J., S. L. Martin, M. A. Monteiro, C. A. Clayton, A. A. McColm, P. Zheng, T. Verboom, J. J. Maaskant, D. H. van den Eijnden, C. H. Hokke, M. B. Perry, C. M. Vandenbroucke-Grauls & J. G. 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Claims (9)
1. Método para produzir uma célula geneticamente modificada tendo a capacidade de produzir compostos fucosilados, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de - transformar a célula para expressar uma fucose quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase bifuncional a partir da expressão do gene fkp, - transformar a célula para expressar uma fucosiltransferase a partir da expressão dos genes futAco ou fucT2, - inativar o gene fucA, que codifica fuculose-1-fosfato aldolase, em que a célula geneticamente modificada é um microorganismo selecionado do grupo consistindo nos gêneros Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fucose quinase e a fucose-1-fosfato guanililtransferase são combinadas em uma enzima bifuncional.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fucose quinase/fucose-1-fosfato guanililtransferase bifuncional é derivada de Bacteroides fragilis.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fucosiltransferase é derivada de Helicobacter pylori.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o composto fucosilado é uma fucosil-lactose, preferencialmente 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose ou lactodifucotetraose.
6. Método para fazer um composto fucosilado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar uma célula de micro- organismo geneticamente modificada obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sob condições de cultivo adequadas em um meio compreendendo fucose e um substrato aceptor.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o substrato aceptor é um mono-, di- ou oligossacarídeo ou um peptídeo.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o substrato aceptor é lactose, 2’-fucosil- lactose ou 3-fucosil-lactose.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto fucosilado é uma fucosil-lactose, preferencialmente 2'-fucosil-lactose ou 3-fucosil-lactose, ou lactodifucotetraose.
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