ES2640978T3 - Proceso de producción de monosacáridos - Google Patents
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Abstract
Proceso de producción de un monosacárido en forma libre usando un microorganismo, en el que el proceso comprende las etapas de: a) proporcionar un microorganismo genéticamente manipulado que posee las siguientes actividades enzimáticas para la síntesis del monosacárido: i) una glucosiltransferasa específicamente capaz de transferir, a partir de un monosacárido de nucleótidos activado, el monosacárido a un sustrato aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacárido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacárido del sustrato aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacárido; en el que el microorganismo recombinante ha sido transformado para comprender al menos uno de i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y/o ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo, b) cultivar el microorganismo en un medio adecuado para hacer crecer el microorganismo, por el cual el monosacárido se produce en una forma libre, c) recuperar el monosacárido libre del medio.
Description
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DESCRIPCION
Proceso de produccion de monosacaridos
La presente invencion se refiere a un proceso de produccion de monosacaridos, en particular para producir L-fucosa u otros monosacaridos escasos, por ejemplo, acido N-acetilneurammico, por el cual se usa un microorganismo en el proceso de produccion.
Los hidratos de carbono son necesarios en todas las formas de vida, haciendose cargo de funciones vitales en el almacenamiento de energfa, funcion estructural, senalizacion, almacenamiento de informacion, etc. Para esta tarea, la naturaleza sintetiza varios monosacaridos importantes como glucosa, manosa, fructosa, fucosa, ribosa, acido sialico, etc., y varios secundarios para aplicaciones mas especializadas como, por ejemplo, D-alosa.
Mientras que algunos monosacaridos pueden obtenerse de la naturaleza en grandes cantidades y a coste razonable (por ejemplo, glucosa y fructosa), la mayona de los monosacaridos son bastante escasos y pueden encontrarse en la naturaleza solo en pequenas cantidades como, por ejemplo, L-fucosa (6-desoxi-L-galactosa).
Para la produccion de monosacaridos comercial, como fuentes se usan casi exclusivamente los oligosacaridos obtenidos de la naturaleza. Estos oligosacaridos son hidrolizados con acido y a partir de los monosacaridos liberados se purifican los azucares individuales. Debido a la alta similitud qmmica de los monosacaridos (que se diferencian principalmente entre sf solo por la orientacion de los grupos hidroxilo individuales), la separacion de monosacaridos individuales en forma pura es bastante laboriosa y costosa.
La L-fucosa representa un azucar tan raro, que actualmente se obtiene mediante la hidrolisis de oligosacaridos complejos, bien de algas o bien de origen bacteriano. Para la purificacion de monosacaridos individuales a partir de hidrolizados complejos, frecuentemente tienen que emplearse productos qmmicos perjudiciales como, por ejemplo, acetato de plomo y cantidades excesivas de disolventes organicos. Por tanto, el aislamiento de monosacaridos individuales de un hidrolizado complejo de oligosacaridos es exigente (debido a la alta similitud qmmica de los monosacaridos individuales liberados) y medioambientalmente peligroso (debido al excesivo uso de productos qmmicos toxicos, tales como carbonato de plomo). Tambien la disponibilidad de oligosacaridos ricos en un cierto azucar puede estar bastante limitada en la naturaleza y tambien ser altamente variable debido a cambios estacionales. La L-fucosa representa un monosacarido escaso tal que se obtiene tradicionalmente por la hidrolisis acida de polisacaridos que contienen fucosa. La fucosa deriva principalmente del polisacarido fucoidano, un monosulfato de fucano presente en todas las algas marinas marrones comunes que comprenden las familias Fucaceae y Laminariaceae. Hoy en dfa, la L-fucosa se obtiene en grandes cantidades principalmente por la recogida de algas marinas marrones que pertenecen a la familia Fucaceae, que pueden encontrarse en todo el mundo, pero en altas cantidades en las orillas europeas del oceano Atlantico. La recogida a gran escala de algas marinas marrones de las orillas del mar produce problemas ambientales y esta limitada por ciertas leyes de proteccion ambiental.
Por ejemplo, el documento JP 2000351790 desvela un metodo de extraccion de fucoidano y de obtencion y separacion de un oligosacarido que contiene fucosa del fucoidano extrafdo.
Ademas de la hidrolisis del fucoidano a partir de alga marina comun, recientemente una publicacion de patente mostro que la L-fucosa tambien puede obtenerse mediante la hidrolisis de polisacaridos bacterianos que contienen L-fucosa que se producen naturalmente: el documento WO 2012/034996 A1 desvela una cepa que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, cepa que es capaz de producir polisacaridos extracelulares que contienen L-fucosa. Para la produccion de L-fucosa, los polisacaridos producidos por la cepa se recuperan y se someten a hidrolisis, por ejemplo mediante tratamiento con acido sulfurico o acido clorhudrico.
El documento WO 2010/101158 A1 desvela un metodo de produccion de un monosacarido a partir de celulosa o hemicelulosa cultivando E. coli recombinante transformada con diferentes glucosidasas, tales como beta- glucosidasa, galactosidasa, etc., de Clostridium cellulovorans.
Ademas de la extraccion de L-fucosa a partir de hidrolizados de poli- u oligosacarido, se han desarrollado varias rutas de smtesis para L-fucosa a partir de otros monosacaridos, como L-arabinosa, D-galactosa, L-ramnosa, D- manosa y D-glucosa. Generalmente, los rendimientos de estas smtesis qmmicas son frecuentemente bastante pobres e implican varias etapas. Ademas de implicar varias etapas sinteticas, tiene que usarse una amplia qmmica de grupos de proteccion para la smtesis qmmica de L-fucosa. En general, la smtesis qmmica a gran escala de monosacaridos no ha demostrado ser economicamente viable en comparacion con la extraccion de la naturaleza.
Asf, actualmente, la preparacion de cualquier monosacarido en forma pura requiere un esfuerzo significativo en la purificacion de otros monosacaridos del monosacarido diana, que frecuentemente implica grandes volumenes de disolventes organicos y otros productos qmmicos perjudiciales. Como consecuencia, la exclusiva acumulacion de un unico monosacarido deseado como, por ejemplo, L-fucosa sena de inmensa ayuda. La mayona de los microorganismos estan limitados en los tipos de monosacaridos que son capaces de utilizar. Ademas, frecuentemente ejercen fuertes preferencias hacia ciertos monosacaridos en caso de que varios monosacaridos esten disponibles al mismo tiempo que la fuente de carbono.
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En vista de lo anterior, es un objeto de la presente invencion proporcionar un nuevo proceso para la produccion de un unico monosacarido deseado en forma libre, por medio del cual el monosacarido puede recuperarse rapida y eficientemente, es decir, a gran escala y rentablemente y sin efectos ambientales negativos.
Este y otros objetos se logran por un proceso de produccion de un monosacarido, es decir, a gran escala, en forma libre usando un microorganismo como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, comprendiendo el proceso las etapas de:
a) proporcionar un microorganismo geneticamente manipulado que posee las siguientes actividades enzimaticas para la smtesis del monosacarido: i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un sustrato aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del sustrato aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido; en el que el microorganismo ha sido transformado para comprender al menos uno de i) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y/o ii) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo,
b) cultivar el microorganismo en un medio adecuado para hacer crecer el microorganismo, por lo que el monosacarido se produce en una forma libre,
c) recuperar el monosacarido libre del medio.
Ademas, este objeto se resuelve por un microorganismo, preferentemente un microorganismo hospedador recombinante como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, y su uso en la produccion de un monosacarido en forma libre como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, conteniendo el microorganismo i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un sustrato aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del sustrato aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido.
El objeto subyacente a la invencion se resuelve completamente de esta forma.
El proceso de los solicitantes no ha sido previamente descrito, y utiliza un microorganismo que tiene dos actividades enzimaticas espedficas, es decir, una glucosiltransferasa y una glucosidasa, en el que la glucosiltransferasa es espedficamente capaz de transferir, a partir de un monosacarido de nucleotidos activado (que esta o bien endogenamente presente o se suministra externamente), el monosacarido a un sustrato aceptor de manera que se forme un sustrato aceptor-monosacarido. En una etapa posterior, la glucosidasa libera el monosacarido del sustrato aceptor de manera que se proporcione el monosacarido libre.
Segun la invencion, el microorganismo es un microorganismo recombinante, en el que el microorganismo recombinante ha sido transformado para comprender i) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y ii) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo. En otras palabras, el microorganismo recombinante se transforma para comprender una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo.
Con el proceso recientemente proporcionado y el microorganismo recientemente proporcionado, es - por primera vez - posible producir un monosacarido deseado en una forma libre y en grandes cantidades, sin necesitar productos qmmicos o etapas de proceso elaboradas. El proceso segun la invencion representa un proceso de fermentacion microbiana, adecuado para conseguir emplear para produccion a gran escala industrial monosacaridos raros u otros, que pueden ser facilmente recuperados del medio en el que se cultiva el microorganismo.
Usando un microorganismo segun la invencion, es decir, uno que esta expresando la glucosiltransferasa, puede efectuarse la eficiente fucosilacion de un sustrato aceptor endogeno o externamente suministrado, y por la expresion simultanea de una glucosidasa puede producirse una acumulacion sin precedentes de grandes cantidades del monosacarido libre en el medio. En presencia de un sustrato aceptor, la glucosiltransferasa y glucosidasa estan asf trabajando sinergicamente juntas en la smtesis de monosacarido libre que requiere solo una cantidad catalttica de aceptor adecuado. Asf, el sustrato aceptor suministrado es fucosilado por la glucosiltransferasa y el producto glucosilado generado se recircula por la accion de la glucosidasa que acepta el producto glucosilado de la reaccion de glucosiltransferasa.
La expresion "monosacarido", como se usa en el presente documento y como generalmente es entendida en el campo de la invencion, se refiere a la unidad de hidratos de carbono mas basica. Los monosacaridos son la forma mas simple de azucar y son normalmente solidos cristalinos incoloros solubles en agua. Ejemplos de monosacaridos incluyen glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y ribosa. Los monosacaridos son los elementos estructurales de disacaridos tales como sacarosa y polisacaridos tales como celulosa y almidon. "Oligosacarido", como se usa el
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termino en el presente documento y como generalmente es entendido en el estado de la tecnica, se refiere a un polfmero de sacaridos que contiene dos monosacaridos o mas.
El termino "secuencia de acidos nucleicos que codifica..." generalmente se refiere a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, y generalmente representa un gen que codifica un cierto polipeptido o protema. El termino incluye, sin limitacion, ADN mono- y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias o regiones mono-, bi- y tri-catenarias, ARN mono- y bicatenario, y ARN que es mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moleculas tubridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, mas normalmente, bicatenarias, o tri-catenarias, o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. El termino tambien engloba polinucleotidos que incluyen una unica region continua o regiones discontinuas que codifican el polipeptido (por ejemplo, interrumpidas por fago integrado o una secuencia de insercion o edicion) junto con regiones adicionales que tambien pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.
En este contexto, el termino "polipeptido(s)" se refiere a cualquier peptido o protema que comprende dos o mas aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos o enlaces peptfdicos modificados. "Polipeptido(s)" se refiere a tanto cadenas cortas, comunmente denominadas peptidos, oligopeptidos y oligomeros, como a cadenas mas largas, generalmente denominadas protemas. Los polipeptidos pueden contener aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. "Polipeptido(s)" incluyen aquellos modificados bien por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones post-traduccionales, pero tambien por tecnicas de modificacion qrnmica. Se apreciara que el mismo tipo de modificacion puede estar presente al mismo grado o grado variable en varios sitios en un polipeptido dado, sin alterar esencialmente la actividad del polipeptido. Por tanto, un polipeptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones puede producirse en cualquier parte en un polipeptido, que incluye el esqueleto del peptido, las cadenas laterales de aminoacidos, y los extremos amino o carboxilo.
Actualmente, y en toda la presente invencion, el termino "glucosiltransferasa" designa y engloba enzimas que son responsables de la biosmtesis de disacaridos, oligosacaridos y polisacaridos, y catalizan la transferencia de restos de monosacarido a partir de un monosacarido de nucleotidos activado/azucar (el “donante de glucosilo") a una molecula aceptora de glucosilo.
Segun un aspecto de la invencion, es particularmente preferido si la glucosiltransferasa es una fucosiltransferasa bacteriana, y preferentemente la alfa-1,2-fucosiltransferasa codificada por el gen wbgL de E. coli:O126 (N.° de acceso de GenBank ADN43847).
Por consiguiente, los terminos "alfa-1,2-fucosiltransferasa" o "fucosiltransferasa", o un acido nucleico/polinucleotido que codifica una "alfa-1,2-fucosiltranferasa" o "fucosiltransferasa", se refieren a una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de fucosa de un sustrato donante, por ejemplo GDP-fucosa, a una molecula aceptora en un enlace alfa-1,2. La molecula aceptora puede ser un hidrato de carbono, un oligosacarido, una protema o glucoprotema, o un lfpido o glicolfpido, y puede ser, por ejemplo, N-acetilglucosamina, W-acetil-lactosamina, galactosa, fucosa, acido sialico, glucosa, lactosa, o cualquier combinacion de las mismas.
"Una glucosidasa" o "una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del sustrato aceptor", como se usa en toda la presente invencion y como se entiende en el campo relevante, comprende cualquier glucosido (o glucosil)hidrolasa que cataliza la hidrolisis de enlaces glucosfdicos para liberar azucares mas pequenos, tales como monosacaridos.
Segun un aspecto de la invencion, es particularmente preferido si la glucosidasa es una glucosidasa bacteriana, preferentemente una a-L-fucosidasa bacteriana. Segun una realizacion de la invencion, se usa el gen de 1,2-a-L- fucosidasa afcA de Bifidobacterium bifidum (N.° de acceso de GenBank: AY303700), optimizado en codones para la expresion en E. coli.
Dentro del alcance de la presente invencion, tambien estan comprendidas variantes polimorficas de acido nucleico/polinucleotido y polipeptido, alelos, mutantes, fragmentos funcionalmente equivalentes y homologos entre especies de las glucosiltransferasas y glucosidasas que se mencionan en toda la invencion por aquellos terminos, en particular aquellos que tienen una secuencia de aminoacidos que tiene mas de aproximadamente el 60 % de identidad de secuencia de aminoacidos, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, preferentemente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor identidad de secuencia de aminoacidos, preferentemente con respecto a una region de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o mas aminoacidos, en particular, y por ejemplo, con la secuencia de aminoacidos de la alfa-1,2-fucosiltransferasa codificada por el gen wbgL de E. coli:Ol26 (acc. N.° ADN43847) o con la secuencia de aminoacidos del gen de 1,2-a-L-fucosidasa afcA de Bifidobacterium bifidum. El experto en la materia reconocera facilmente tras la lectura de la invencion que puede emplearse cualquier otra glucosiltransferasa o glucosidasa, en tanto que estas enzimas cumplan sus actividades enzimaticas en el microorganismo. Eventualmente, las secuencias de la glucosiltransferasa y/o la glucosidasa tendran que ser optimizadas en los codones con respecto al microorganismo en el que van a introducirse.
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Dentro del contexto de la presente invencion, "funcionalmente equivalente", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido capaz de presentar una actividad in vivo sustancialmente similar como el producto del gen de alfa-1,2-fucosiltransferasa codificado por la secuencia del gen de alfa-1,2-fucosiltransferasa descrita anteriormente o del producto del gen de fucosidasa como se describio anteriormente, como se juzga por cualquiera de varios criterios, que incluyen, pero no se limitan a, antigenicidad, es decir, la capacidad para unirse a un anticuerpo anti-alfa-1,2-fucosiltransferasa o 1,2-a-L-fucosidasa, inmunogenicidad, es decir, la capacidad para generar un anticuerpo que es capaz de unirse a una protema o polipeptido de alfa-1,2-fucosiltransferasa o fucosidasa, ademas de actividad enzimatica.
El polipeptido de glucosiltransferasa y/o el polipeptido de glucosidasa, como se mencionaron en toda la invencion, pueden producirse por tecnologfa de ADN recombinante usando tecnicas muy conocidas en la tecnica. Pueden usarse metodos que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia para construir vectores de expresion que contienen, por ejemplo, alfa-1,2-fucosiltransferasa y/o 1,2-a-L-fucosidasa, secuencias codificantes y senales de control transcripcional-traduccional apropiadas. Estos metodos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Actualmente, y en toda la invencion, "recombinante" significa ADN geneticamente manipulado preparado por genes de trasplante o de corte y empalme de una especie en las celulas de un microorganismo hospedador de una especie diferente. Tal ADN llega a ser parte de la constitucion genetica del hospedador y se replica.
"Microorganismo" designa y engloba actualmente cualquier organismo microscopico que comprende o bien una unica celula, agrupaciones de celulas, o bien organismos relativamente complejos multicelulares, que es adecuado para ser empleado en el proceso segun la invencion, y particularmente incluye bacterias y levadura. Un microorganismo, como se emplea segun la invencion, puede cultivarse en un medio lfquido, y generalmente necesita una fuente de carbono en el medio para crecer y duplicarse.
Por consiguiente, "un microorganismo hospedador recombinante" se designa para significar cualquier microorganismo que contiene una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa o una glucosidasa, o que codifica una glucosiltransferasa y una glucosidasa, en el que las secuencias de acidos nucleicos que codifican estas enzimas son secuencias de acidos nucleicos extranas a/que no existen de forma natural en la celula (hospedadora) recombinante y en el que la secuencia extrana/que no se produce naturalmente en dicho microorganismo esta integrada en el genoma de la celula del microorganismo hospedador. Asf, "que no existe de forma natural" significa que la secuencia de acidos nucleicos es extrana a dicha celula de microorganismo hospedador, es decir, las secuencias de acidos nucleicos son heterologas con respecto a la celula hospedadora de microorganismo. La secuencia heterologa puede ser establemente introducida, por ejemplo por transfeccion, transformacion o transduccion, en el genoma de la celula del microorganismo hospedador, en la que pueden aplicarse tecnicas que dependeran de la celula hospedadora en la que va a introducirse la secuencia. Un experto en la materia conoce diversas tecnicas y se desvelan, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, arriba. Asf, la celula hospedadora en la que se ha introducido la secuencia heterologa producira las protemas heterologas que estan codificando las secuencias de acidos nucleicos segun la invencion.
Para la produccion recombinante, celulas hospedadoras pueden ser geneticamente manipuladas para incorporar sistemas de expresion o porciones de los mismos y las secuencias de acidos nucleicos de la invencion. La introduccion de una secuencia de acidos nucleicos en la celula hospedadora de microorganismo puede efectuarse por los metodos descritos en muchos manuales de laboratorio estandar, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), y Sambrook et al., 1989, arriba.
Asf, las secuencias de acidos nucleicos segun la invencion pueden, por ejemplo, estar comprendidas en un vector que va a transformarse/transfectarse establemente o introducirse de otro modo en las celulas de microorganismo hospedador.
Puede usarse gran variedad de sistemas de expresion para producir los polipeptidos de la invencion. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosomicos, episomicos y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriofago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de insercion, de elementos cromosomicos de levadura, de virus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos geneticos de plasmido y bacteriofago, tales como cosmidos y fagemidos. Las construcciones del sistema de expresion pueden contener regiones de control que regulan, ademas de engendrar, la expresion. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar los polinucleotidos y para sintetizar un polipeptido en un hospedador puede usarse para la expresion a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresion por cualquiera de una variedad de tecnicas muy conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook et al., arriba.
Como se usa en el presente documento, el termino "recuperar" significa aislar, recoger, purificar, recolectar o separar de otro modo del cultivo de microorganismos el monosacarido producido por el microorganismo segun la invencion.
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En toda la invencion, es particularmente preferido si el monosacarido libre que va a producirse es L-fucosa o un acido neurammico.
La L-fucosa es una desoxiazucar de hexosa y se encuentra - ademas de otros oligosacaridos fucosilados - que es de gran interes para aparatos qmmicos, farmaceuticos, cosmeticos y nutricionales. Ademas de su uso para la produccion de derivados fucosilados que son conocidos por sus propiedades antialergicas y emulsionantes, la L- fucosa tambien es un componente comun de los oligosacaridos de leche humana (HMO), tales como 2'-fucosil- lactosa.
Segun una realizacion preferida, el sustrato aceptor es o bien endogeno para dicho microorganismo o se anade al medio en el que se cultiva el microorganismo. Un sustrato aceptor endogeno puede ser, por ejemplo, cualquier disacarido o monosacarido, una protema glucosilada o un lipopolisacarido presente en el microorganismo.
Segun un aspecto de la invencion, el sustrato aceptor se anade externamente a dicho microorganismo o al microorganismo cultivado en un medio, y preferentemente se anade lactosa o lactulosa.
En una realizacion preferida, el microorganismo se cultiva en un medio que contiene una fuente de carbono que esta seleccionada de glicerol, sacarosa, glucosa, fructosa, melaza, lactosa, xilosa, celulosa, gas de smtesis o monoxido de carbono. En este contexto debe entenderse que cualquier otro sustrato de fermentacion - preferentemente de bajo coste - puede emplearse como fuente de carbono, y el experto en la materia sera facilmente capaz de emplear una fuente de carbono adecuada dentro de la presente invencion con el fin de hacer crecer el microorganismo para producir el monosacarido deseado a gran escala.
Segun un aspecto de la invencion, el proceso es un proceso de fermentacion discontinuo o continuo.
Asf, segun un aspecto de la invencion, es decir, en un proceso continuo, una fuente de carbono se anade constantemente al medio durante la etapa de cultivo del microorganismo, por ejemplo un microorganismo recombinante.
Anadiendo constantemente la fuente de carbono durante la etapa de cultivo, se lleva a cabo una produccion constante y eficaz del monosacarido.
Segun otro aspecto, es decir, en un proceso discontinuo, el proceso no incluye las etapas de anadir externamente sustancias durante el proceso de fermentacion.
Segun otro aspecto de la invencion, el monosacarido se recupera del sobrenadante del microorganismo hospedador recombinante cultivado, sobrenadante que se obtiene centrifugando el microorganismo hospedador cultivado para obtener un sobrenadante y un sedimento de microorganismo hospedador.
Con el proceso recientemente proporcionado, es posible recuperar el monosacarido producido del medio en el que se cultiva el microorganismo hospedador, ya que el monosacarido que se produce en una celula de microorganismo se transporta en el medio, haciendo asf facilmente posible recuperar el monosacarido del sobrenadante, una vez las celulas del microorganismo se han separado del medio de cultivo.
Segun otra realizacion preferida del proceso segun la invencion, antes de aislar el monosacarido en la etapa c), se anade una beta-galactosidasa al medio en el que se cultiva el microorganismo hospedador y/o se induce la produccion endogena de una beta-galactosidasa en el microorganismo.
Por medio de esta caractenstica puede lograrse que otros monosacaridos - ademas del monosacarido deseado -, cuyos otros monosacaridos se producen en el microorganismo durante la smtesis del monosacarido deseado, y cuyos otros monosacaridos interfieren con la etapa de purificacion del monosacarido deseado, puedan ser metabolizados, de manera que la etapa de recuperacion del monosacarido deseado sea adicionalmente mejorada y facilitada. Segun la invencion, esto puede lograrse induciendo una beta-galactosidasa de otro modo desregulada hacia el fin del proceso; esto significa que durante la smtesis del monosacarido deseado la beta-galactosidasa esta desregulada y puede inducirse, por ejemplo por temperatura o anadiendo un inductor, por ejemplo tetraciclina, al final del proceso de fermentacion. Alternativamente o ademas, la enzima beta-galactosidasa (o cualquier otra enzima metabolizadora de oligo- o monosacaridos) puede ser externamente anadida al medio al final del proceso segun la invencion, que es particularmente preferido cuando el gen endogeno que codifica beta-galactosidasa ha sido inactivado o delecionado. Como resultado, oligo- y o monosacaridos no deseados no pueden acumularse y no interfieren con la recuperacion del monosacarido deseado. En este contexto, debe entenderse que, ademas de la beta-galactosidasa, otras enzimas metabolicas tambien pueden ser reguladas en la forma mencionada en el microorganismo con el fin de metabolizar de otro modo oligo- y monosacaridos no deseados interferentes, y un experto en la materia reconocera facilmente - tras la lectura de la invencion - otras vfas o enzimas adecuadas para regular/activar o suministrar, que dependera del aceptor que va a degradarse.
"Beta-galactosidasa", como se usa en el presente documento y como generalmente es entendido dentro del campo de la invencion, es una enzima hidrolasa que cataliza la hidrolisis de beta-galactosidos en monosacaridos.
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"Regulado", dentro del presente contexto con referencia a un gen, se entiende generalmente como un gen cuya expresion puede ser regulada de una forma controlada, por ejemplo regulada por disminucion o por incremento, es decir, la cantidad de la protema sintetizada codificada por el gen regulado es diferente, por ejemplo desregulado/regulado por disminucion o regulado por incremento, de la del gen de otro modo no regulado.
Anadiendo la enzima beta-galactosidasa al medio y/o el sobrenadante, el sustrato aceptor todavfa presente en el medio puede escindirse - en caso donde se usa lactulosa: el enlace glucosfdico de la lactulosa se escinde y son liberadas galactosa y fructosa - y los monosacaridos resultantes pueden ser eficazmente metabolizados por la cepa de E. coli usada. Asf, el disacarido suministrado, preferentemente lactulosa o lactosa, puede ser eficientemente eliminado del medio de cultivo. En este caso, la beta-galactosidasa que esta con el tiempo naturalmente presente en el microorganismo, por ejemplo tal como Escherichia coli, puede inactivarse mediante una desactivacion genica, o inactivacion genica similar.
Por tanto, segun otro aspecto de la invencion, antes de recuperar el monosacarido del sobrenadante, el sobrenadante se trata con beta-galactosidasa y entonces se pone en contacto con los microorganismos hospedadores cultivados.
Segun un aspecto de la invencion, el proceso segun la invencion comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar, en un medio adecuado para hacer crecer un microorganismo, un microorganismo hospedador recombinante que ha sido transformado para comprender a) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y b) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo, en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido que va a producirse,
b) anadir un sustrato aceptor al medio en el que se cultiva el microorganismo hospedador, en el que el sustrato aceptor es un disacarido, preferentemente lactosa o lactulosa,
c) cultivar el microorganismo hospedador recombinante en dicho medio por el cual el monosacarido se produce en una forma libre,
d) recuperar el monosacarido libre del medio.
Como se ha mencionado anteriormente, y como ya se describio a proposito del proceso segun la invencion, la invencion tambien se refiere a un microorganismo hospedador recombinante que se transforma que es capaz de crecer en una unica fuente de carbono y contener a) una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de glucosiltransferasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo hospedador, y b) una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo.
Las definiciones usadas y expuestas anteriormente para terminos espedficos a proposito del proceso tambien se aplican para el microorganismo recombinante presentado en el presente documento.
Segun una realizacion preferida, el microorganismo - usado en el proceso segun la invencion y reivindicado en el presente documento - esta seleccionado de una bacteria o una levadura, y mas preferentemente, el microorganismo hospedador es una cepa de Escherichia coli o una cepa de Saccharomyces sp.
La bacteria Escherichia coli y la levadura Saccharomyces sp. tienen la ventaja de que estos microorganismos pueden cultivarse facilmente y economicamente en instalaciones de laboratorio, y las bacterias y levadura han sido ampliamente investigadas durante mas de 60 anos.
Por consiguiente, en una realizacion preferida, el microorganismo hospedador usado en el proceso segun la invencion y reivindicado de otro modo en el presente documento esta seleccionado del grupo que consiste en bacterias y levadura, y es preferentemente una cepa de Escherichia coli.
Se prefiere ademas en una realizacion de la presente invencion si el microorganismo hospedador recombinante se transforma ademas para o bien carecer de un gen que codifica beta-galactosidasa - o bien comprender un gen que codifica beta-galactosidasa desregulada -, y L-fucosa isomerasa, L-fuculosa cinasa y UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa.
Esta realizacion tiene la ventaja que se previene la degradacion intracelular del monosacarido producido L-fucosa y la produccion de acido colanico y en el caso de la beta-galactosidasa no se degrada la molecula aceptora.
En otra realizacion preferida, el microorganismo hospedador recombinante se transforma ademas para contener genes que permiten que el microorganismo hospedador recombinante crezca sobre sacarosa o glicerol como unica fuente de carbono, y es particularmente preferido si la agrupacion de genes csc de Escherichia coli W (acc. N.° CP0021851) se integra en el genoma del microorganismo hospedador, cuya agrupacion de genes comprende los genes de sacarosa permasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa, y un represortranscripcional (genes cscB, cscK, csc.A y cscR, respectivamente), que permiten que el microorganismo transformado crezca sobre sacarosa como unica fuente de carbono.
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Segun una realizacion preferida del proceso o el microorganismo de la invencion, y como se ha mencionado anteriormente, el acido nucleico que codifica un polipeptido de glucosiltransferasa es una 2-fucosiltransferasa, y una 1,2-alfa-L-fucosidasa. Para la definicion de esta enzima, vease anteriormente.
A este respecto, se observa que las realizaciones enumeradas como preferidas para el proceso segun la invencion se aplican todas para el microorganismo reivindicado, si procede.
Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere al uso de un microorganismo que posee las siguientes actividades enzimaticas para la smtesis del monosacarido: i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un sustrato de monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido, y la invencion se refiere ademas al uso del microorganismo recombinante segun la invencion para la produccion de un monosacarido, en particular de L-fucosa.
Se observa que las definiciones expuestas anteriormente para describir ciertos terminos del proceso segun la invencion deben aplicarse al microorganismo, recombinante o no modificado, como se reivindica y describe en el presente documento.
Alternativamente, el metodo de produccion de monosacaridos puede aplicarse en sistemas libres de celulas, por el cual las enzimas segun la invencion, el (los) sustrato(s) de aceptor, y, segun sea el caso, otros componentes de la mezcla de reaccion, que incluyen otras glucosiltransferasas y enzimas accesorias, se combinan por mezcla en un medio de reaccion acuoso. Las enzimas pueden utilizarse libres en disolucion, o pueden unirse o inmovilizarse a un soporte tal como un polfmero y los sustratos pueden anadirse al soporte. El soporte puede estar relleno, por ejemplo, en una columna.
En particular, la presente invencion se refiere a un proceso en el que una cepa de Escherichia coli recombinante se usa como microorganismo hospedador recombinante, en el que en la cepa de Escherichia coli recombinante el gen de L-fucosa isomerasa y el gen de L-fuculosa cinasa han sido delecionados, y en el que la cepa de Escherichia coli recombinante ha sido transformada para comprender a) genes que permiten que la cepa de E. coli crezca en sacarosa o glicerol como unica fuente de carbono, codificando los genes, respectivamente, sacarosa permasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa y un represor transcripcional, b) un gen que codifica una 2-fucosiltransferasa, y c) un gen que codifica una 1,2-alfa-fucosidasa.
Ventajas adicionales siguen a partir de la descripcion de las realizaciones y los dibujos adjuntos.
Huelga decir que las caractensticas anteriormente mencionadas y las caractensticas que deben todavfa ser explicadas mas adelante pueden usarse no solo en las combinaciones respectivamente especificadas, sino tambien en otras combinaciones o por sf mismas, sin apartarse del alcance de la presente invencion.
Varias realizaciones de la invencion se ilustran en las figuras y se explican en mas detalle en la siguiente descripcion. En las figuras:
La Fig. 1
la Fig. 2 la Fig. 3
la Fig. 4
la Fig. 5
la Fig. 6 Ejemplos
muestra un dibujo esquematico de la vfa/proceso empleado en la presente invencion (A) y la parte esquematica esencial de la via para la produccion a modo de ejemplo de L-fucosa segun la invencion (B);
una tabla que enumera los cebadores de oligonucleotidos usados para generar fragmentos de ADN para generar el microorganismo segun la invencion;
un cromatograma (cromatograffa en capa fina) que muestra la presencia de L-fucosa de la realizacion a modo de ejemplo en el sobrenadante de microorganismos segun la invencion, cultivados sobre sacarosa (A) o glicerol (B);
cromatogramas de HPLC que muestran la produccion de L-fucosa por el microorganismo recombinante segun la invencion cultivado sobre glicerol (A) o sacarosa (B). Picos con los tiempos de retencion 2,2 minutos, 4,6 minutos y 9,8 minutos se corresponden con L-fucosa, lactulosa y maltotriosa (patron interno), respectivamente.
cromatogramas de HPLC que muestran el efecto de la adicion de beta-galactosidasa al medio de fermentacion, mostrando la Fig. 5A el cromatograma de HPLC de medio de fermentacion antes de la adicion de beta-galactosidasa, y mostrando la Fig. 5B el cromatograma de HPLC despues de la adicion de beta-galactosidasa; y
espectro de RMN 1H de la L-fucosa purificada obtenida a partir de la fermentacion bacteriana.
Como se muestra esquematicamente en la Fig. 1A, el proceso segun la invencion - y el microorganismo usado en el proceso - utiliza un monosacarido activado por nucleotido presente en el microorganismo, y transfiere - mediante la
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actividad enzimatica de la glucosiltransferasa - el resto de monosacarido a un aceptor - que puede estar endogenamente presente en el microorganismo y/o ser externamente suministrado - para formar un sustrato aceptor-monosacarido o complejo. Por actividad enzimatica de la glucosidasa (hidrolasa), el monosacarido se libera del sustrato aceptor-monosacarido y puede ser recuperado en forma libre (vease la Fig. 1A).
Como un monosacarido a modo de ejemplo, se produjo L-fucosa a partir de sacarosa o de glicerol en una cepa de Escherichia coli recombinante. La Fig. 1B muestra una porcion de la via esquematica para la produccion de L- fucosa. En el microorganismo, se sintetizo GDP-fucosa mediante la via de novo y la lactulosa sirvio de aceptor de sustrato a modo de ejemplo, en una reaccion catalizada por 2-fucosiltransferasa. La hidrolisis del enlace glucosfdico por una 1,2-a-L-fucosidasa libera la L-fucosa (vease la Fig. 1B).
Desarrollo de la cepa de produccion de L-fucosa de E. coli
Primero, se inactivo lacZ en BL21(DE3) de E. coli (Novagen) (vease la Fig. 2A Tabla 1) por mutagenesis usando oligonucleotidos de discordancia como se describe por Ellis et al., 2001. Se amplifico el operon gal (galETKM) a partir de K12 TG1 de E. coli usando los cebadores 605 y 606 (todos los cebadores usados se enumeran en la Tabla 2 de la Fig. 2B) y se insertaron en el locus galM ybhJ de BL21(DE3) lacZ de E. coli por recombinacion homologa facilitada usando el plasmido auxiliar de recombinasa roja pKD46 (Datsenko y Warner, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). A continuacion, se inactivo araA por mutagenesis de oligonucleotidos. En la cepa BL21(DE3) lacZ Gal+araA de E. coli se selecciono el gen wcaJ. Se realizaron deleciones genomicas segun el metodo de Datsenko y Warner ((2000), vease anteriormente). WcaJ probablemente codifica una UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1- fosfato transferasa que cataliza la primera etapa en la smtesis de acido colanico (Stevenson et al., "Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acids, J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996)); la produccion de acido colanico competina por la GDP-fucosa con la reaccion de fucosiltransferasa. Para prevenir la degradacion intracelular de L-fucosa, genes que codifican la L-fucosa isomerasa (fucl) y L-fuculosa cinasa (fucK) han sido delecionados del genoma de la cepa BL21 (DE3) lacZ Gat araA AwcaJ de E. coli.
Usando el plasmido pINT2-lacY-aadA (secuencia 1 del apendice) como molde, se amplifico el gen transportador de lactosa lacY, originalmente de K12 TG1 de E. coli (acc. N.° ABN72583), junto con el promotor precedente Ptet y el gen de resistencia a estreptomicina flanqueado por el sitio FRT, con los cebadores 1119 y 1120. El producto de PCR resultante llevo en ambos sitios los sitios de reconocimiento del extremo del mosaico de 19 pb para la transposasa EZ-Tn5. Se uso el transposon EZ-Tn5 <Ptet-lacY-FRT-aadA-FRT> para producir un transposoma EZ-Tn5 con transposasa EZ-Tn5™ (Epicentre, EE.UU.), con el que se transformaron celulas electrocompetentes de BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK de E. coli. El gen de resistencia se elimino de los clones de resistencia a estreptomicina por la FLP recombinasa codificada en el plasmido pCP20 (Datsenko y Warner, vease anteriormente). La agrupacion de genes csc de E. coli W (acc. N.° CP002185.1) comprende cuatro genes para sacarosa permasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa, y un represor transcripcional (genes cscB, cscK, cscA y cscR, respectivamente), que permite que la cepa crezca sobre sacarosa como la unica fuente de carbono. Esta agrupacion de csc se integro en el genoma de la cepa que aloja BL21 (DE3) lacY de E. coli por transposicion usando el plasmido pEcomar- cscABKR (secuencia 2 del apendice). Los genes csc se flanquearon por las repeticiones terminales invertidas espedficamente reconocidas por el elemento similar a marinero la transposasa Himar1 (Bigot et al., "Conservation of Palindromic and Mirror Motifs within Inverted Terminal Repeats of mariner-like Elements", J. Mol. Biol. 351:108-116 (2005)) que esta codificado en pEcomar y se transcribe bajo el control de ParaB. Para la transposicion mediada por las celulas de transposasa de marinero que alojan el plasmido respectivo, se cultivaron en medio 2 'YT (Sambrook y Russel, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) que contiene 100 pg/ml de ampicilina y se indujeron con L- arabinosa 100 mM durante al menos 16 h a 30 °C. Los clones que contienen los casetes de transposon se seleccionaron en placas de M9-agar (Sambrook y Russel, vease anteriormente) que conteman 1 % de sacarosa, en el caso de insercion de la agrupacion de csc, o en agar 2' YT que contiene el antibiotico respectivo. BL21 (DE3):: (Ptet-lacY)(cscBKAR) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK de E. coli fue capaz de crecer sobre sacarosa como la unica fuente de carbono. El gen de 2-fucosiltransferasa wbgL de E. coli:O126 (acc. N.° ADN43847) se optimizo en codones para la expresion en E. coli y se preparo sinteticamente por GenScript Cooperation (EE.UU.). Usando el plasmido pINT2-wbgLco-neo (secuencia 3 del apendice) como molde, se amplifico el gen wbgLco junto con el promotor precedente Ptet y el gen de resistencia a kanamicina flanqueado por el sitio FRT con los cebadores 1119 y 1120; el transposon EZ-Tn5 <Ptet-wbgLco-FRT-neo-FRT> resultante se integro mediado por la transposasa EZ- Tn5™.
Para potenciar la smtesis de novo de GDP-fucosa, se expresaron en exceso genes que codifican fosfomanomutasa (manB), manosa-1-fosfato guanosiltransferasa (manC), GDP-manosa-4,6-deshidratasa (gmd) y GDP-L-fucosa sintasa (wcaG) de K12 DH5a de E. coli en la cepa BL21 (DE3) de E. coli; el operon manCB esta bajo el control de Ptet, el operon gmd, wcaG se transcribio desde el promotor Pt5. El casete de transposon <Ptet-manCB-PT5-gmd, wcaG-FRT-dhfr-FRT> se inserto de pEcomar C9-manCB-gmd, wcaG-dhfr (secuencia 4 del apendice) mediado por el mutante C9 hiperactivo de la transposasa de marinero Himar1 (Lampe et al., "Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)). Finalmente, el gen de 1,2-a-L- fucosidasa afcA (el codon se optimiza para la expresion en E. coli y se sintetiza por GeneScript Cooperacion) de
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Bifidobacterium bifidum se inserto como el transposon <Ptet-afcAco-FRT-tet-FRT> en la cepa por transposicion usando pEcomar-afcAco-tet (secuencia 5 del apendice) y la transposasa de marinero.
Condiciones de cultivo para la produccion de L-fucosa
A: Uso de sacarosa como fuente de carbono
Se cultivo BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-Pjs- gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli en un fermentador de 3 l (New Brunswick, Edison, EE.UU.) a partir de 800 ml de medio de sales minerales (Samain et al., "Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes", J. Biotech. 72:33-47 (1999)) que contema 3 % de sacarosa como fuente de carbono y los antibioticos tetraciclina 7,5 pg/ml, kanamicina 15 pg/ml y trimetoprim 10 pg/ml. El cultivo se inicio con un 2,5 % (v/v) de inoculo. Se anadio la lactulosa como aceptor en la reaccion de fucosiltransferasa en varias etapas a una concentracion final de 33,75 mM. El cultivo se alimento continuamente con sacarosa. Las celulas se cultivaron en aproximadamente 66 ha una DO 660 nm de 141 y produjeron fucosa 366 mM (datos no mostrados).
B: Uso de glicerol como fuente de carbono
Se cultivo BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(PtermanCB-Pj5- gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli en un fermentador de 3 l (New Brunswick, Edison, EE.UU.) a partir de 800 ml de medio de sales minerales (Samain et al., vease anteriormente) que contema 3 % de glicerol como fuente de carbono y los antibioticos tetraciclina 7,5 pg/ml, kanamicina 15 pg/ml y trimetoprim 10 pg/ml. El cultivo se inicio con un 2,5% (v/v) de inoculo. Se anadio la lactulosa como aceptor en la reaccion de fucosiltransferasa en varias etapas a una concentracion final de 31,5 mM. El cultivo se alimento continuamente con glicerol. Las celulas se cultivaron en aproximadamente 64 h a una DO 660 nm de 212 y produjeron fucosa 78 mM (datos no mostrados).
Deteccion de L-fucosa
Se analizo el sobrenadante de las celulas en crecimiento por cromatograffa en capa fina CCF usando placas de CCF de gel de sflice (gel de sflice 60). Se uso una mezcla de butanol:acetona:acido acetico:H2O (35/35/7/23 (v/v/v/v)) como fase movil. Para la deteccion de las sustancias separadas, la CCF se empapo con el reactivo timol (se disolvieron 0,5 g de timol en 95 ml de etanol, se anadieron 5 ml de acido sulfurico) y se calento.
Se realizo analisis por cromatograffa lfquida de alta resolucion usando un detector del mdice de refraccion (RID-10A) (Shimadzu, Alemania) y una columna Luna NH2 (10 pm, 250 x 4,6 mm) (Phenomenex, EE.UU.) conectada a un sistema de HPLC (Shimadzu, Alemania). La elucion se realizo isocraticamente con acetonitrilo:H2O (80/20 (v/v)) como eluyente a 35 °C y un caudal de 3 ml/min. Se aplicaron 20 pl de la muestra a la columna. Se calculo la concentracion de L-fucosa a partir de una curva patron. Para esto se anadieron 10 % (v/v) de maltotriosa 100 mM a las muestras de HPLC como patron interno antes de filtrarse (tamano de poro 0,22 pm) y se aclararon por extraccion en fase solida en una matriz de intercambio ionico (Strata ABW, Phenomenex).
Se detecto L-fucosa en el sobrenadante de BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(PtetrlaclY)(cscBKAR)(Pter wgbLco-neo)(Ptet-manCB-Pj5-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli cultivado en sacarosa, y glicerol, respectivamente, usando lactulosa como aceptor, como se muestra por CCF (Fig. 3) y HPLC (Fig. 4 y 5).
La Fig. 3 muestra los resultados de la cromatograffa en capa fina (CCF) para el microorganismo cultivado en glicerol (A) o cultivado en sacarosa (B) en presencia de lactulosa de sustrato aceptor: Carril 1 (ambas, Fig 3A y 3B): En el sobrenadante de BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB- Pj5-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli se detecto L-fucosa por CCF como se verifico con sustancias de referencia autenticas (S: L-fucosa (Glucom, Dinamarca), lactulosa (Sigma, Alemania).
Carril 2 (ambas, Fig. 3A y Fig. 3B): Se hidrolizo enzimaticamente lactulosa y los monosacaridos resultantes se degradaron por la cepa bL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet- manCB-Pj5-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli a 37 °C.
La Fig. 4 muestra la produccion de fucosa por BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet- lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-Pj5,-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli como se ha determinado por HPLC, en la que en la Fig. 4A se muestra el sobrenadante de BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-Pj5-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli cultivado en glicerol; la muestra se tomo 64 h despues del inicio de la fermentacion. Picos con los tiempos de retencion de 1,9, 2,1, 4,6 y 9,8 minutos se corresponden con glicerol, L-fucosa, lactulosa y maltotriosa (patron interno), respectivamente. El metodo de medicion de HPLC se describe anteriormente.
En la Fig. 4B se muestran los resultados del analisis de HPLC para el sobrenadante de BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-Pj5-gmd, wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli cultivado en sacarosa; la muestra se tomo 66,3 h despues del inicio de la fermentacion. Picos con tiempos de
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retencion de 2,2, 4,6 y 9,8 minutes se corresponden con L-fucosa, lactulosa y maltotriosa (patron interno), respectivamente. El metodo de medicion de HPLC se describe anteriormente.
Hidrolisis de lactulosa por beta-galactosidasa y degradacion de monosacaridos por la cepa BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd. wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco- tet) de E. coli
Se obtuvo sobrenadante esteril de los cultivos productores de L-fucosa de la cepa BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK AnagB AnagA::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd. wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli cultivada con sacarosa, y glicerol, respectivamente, por centrifugacion y filtracion (0,22 pm de tamano de poro). Los sobrenadantes se diluyeron 1:10 en medio de sales minerales fresco. Se anadio beta-galactosidasa (comprada de Sigma Aldrich) a una concentracion de 10 unidades ml-1 y se realizo la hidrolisis a 37 °C durante 3 h. La cepa BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(PterlacY)(cscBKAR)(Ptet-wgbLco-neo)(Ptet-manCB-PT5-gmd. wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli se cultivo en medio rico en 2YT que contema los antibioticos respectivos a 37 °C a una DO 660 nm de aproximadamente 5. Se recogieron celulas de 10 ml de cultivo en condiciones esteriles por centrifugacion y se resuspendieron en 2 ml del sobrenadante que contema p-galactosidasa. Las celulas vivas degradaron los monosacaridos resultantes de la hidrolisis enzimatica en 16 h a 37 °C.
La Fig. 5 muestra el analisis de HPLC de la hidrolisis enzimatica in vitro de lactulosa y la degradacion de los monosacaridos por BL21 (DE3) lacZ Gal+araA AwcaJ AfucI AfucK::(Ptet-lacY)(cscBKAR)(Pte-wgbLco-neo)(Ptet- manCB-PT5-gmd. wcaG-dhfr)(Ptet-afcAco-tet) de E. coli. en la que la Fig. 5A muestra los resultados con el sobrenadante del cultivo cultivado en sacarosa (recogido a las 66,3 h); antes de que se anadiera la p-galactosidasa y despues del tratamiento con beta-galactosidasa y degradacion. Fig. 5B. Picos con tiempos de retencion de 2,1, y 4,4 minutos se corresponden con L-fucosa y lactulosa, respectivamente.
La Figura 6 muestra el espectro de RMN 1H de la L-fucosa purificada obtenida por fermentacion microbiana. Para la medicion se disolvieron 20 mg de sustancia en 0,7 ml de DMSO deuterado.
Los resultados presentados muestran que con la cepa de microorganismos a modo de ejemplo el monosacarido L- fucosa a modo de ejemplo puede ser eficientemente producido en forma libre a gran escala.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Jennewein Biotechnologie GmbH
<120> Proceso de produccion de monosacaridos
<130>2827P105EP
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 1
5
10
15
20
25
30
35
ttactcagca ataaactgat attccgtcag gctgg 35
<210>2 <211> 86 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador <400>2
ttgataatct cgcgctcttc gtcggtagtg ctgaccttgc
<210> 3 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador <400> 3
ctgtctctta tacacatctc ctgaaattgg ccagatgatt aattcctaat ttttgttg 58
<210> 4 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Cebador <400> 4
ctgtctctta tacacatctc agcattacac gtcttgagcg attgtgtagg 50
agcagtcaga ctttccatat agagcgtaat ttccgttaac 60
cggagg 8 6
Claims (20)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Proceso de produccion de un monosacarido en forma libre usando un microorganismo, en el que el proceso comprende las etapas de:a) proporcionar un microorganismo geneticamente manipulado que posee las siguientes actividades enzimaticas para la smtesis del monosacarido: i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un sustrato aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del sustrato aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido; en el que el microorganismo recombinante ha sido transformado para comprender al menos uno de i) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y/o ii) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo,b) cultivar el microorganismo en un medio adecuado para hacer crecer el microorganismo, por el cual el monosacarido se produce en una forma libre,c) recuperar el monosacarido libre del medio.
- 2. El proceso de la reivindicacion 1, caracterizado por que el sustrato aceptor es endogeno a dicho microorganismo o se anade al medio en el que se cultiva el microorganismo.
- 3. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el sustrato aceptor esta seleccionado de un disacarido, preferentemente lactulosa o lactosa, un monosacarido, un polisacarido, una protema glucosilada o un lipopolisacarido.
- 4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el microorganismo se cultiva en un medio que contiene una fuente de carbono que esta seleccionada de glicerol, sacarosa, melaza, xilosa, celulosa, gas de smtesis.
- 5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, el proceso es un proceso discontinuo o continuo.
- 6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el monosacarido se recupera de sobrenadante del microorganismo cultivado, sobrenadante que se obtiene centrifugando el microorganismo hospedador cultivado para obtener un sobrenadante y un sedimento de microorganismo.
- 7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que antes de recuperar el monosacarido en la etapa c), se anade una beta-galactosidasa al medio en el que se cultiva el microorganismo hospedador, y/o se induce la produccion endogena de una beta-galactosidasa en el microorganismo.
- 8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, antes de recuperar el monosacarido del sobrenadante, el sobrenadante se trata con beta-galactosidasa y entonces se pone en contacto con los microorganismos hospedadores cultivados.
- 9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el monosacarido producido esta seleccionado de L-fucosa, glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y ribosa.
- 10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:a) proporcionar, en un medio adecuado para hacer crecer un microorganismo, un microorganismo hospedador recombinante que ha sido transformado para comprender a) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosiltransferasa que no existe de forma natural en el microorganismo, y b) una secuencia de acidos nucleicos que codifica una glucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo, en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido que va a producirse,b) anadir un sustrato aceptor al medio en el que se cultiva el microorganismo hospedador, en el que el sustrato aceptor es un disacarido, preferentemente lactosa o lactulosa,c) cultivar el microorganismo hospedador recombinante en dicho medio por el cual el monosacarido se produce en una forma libre,d) recuperar el monosacarido libre del medio.
- 11. Microorganismo hospedador recombinante que se transforma para ser capaz de crecer sobre un unica fuente de carbono y para contener a) una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de fucosiltransferasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo hospedador, y b) una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de fucosidasa que no existe de forma natural en dicho microorganismo.5101520253035
- 12. El microorganismo hospedador recombinante segun la reivindicacion 11, caracterizado por que el microorganismo hospedador recombinante se transforma ademas para carecer de un gen que codifica L-fucosa isomerasa, L-fuculosa cinasa y UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa.
- 13. El microorganismo hospedador recombinante segun la reivindicacion 11 o 12, caracterizado por que se transforma ademas para contener genes que permiten que el microorganismo hospedador recombinante crezca sobre sacarosa o glicerol.
- 14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o microorganismo hospedador recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por que el microorganismo esta seleccionado de una bacteria y una levadura.
- 15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o microorganismo hospedador recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por que el microorganismo hospedador es una cepa de Escherichia coli o una cepa de Saccharomyces sp.
- 16. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o 14 y 15, o el microorganismo hospedador recombinante segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por que el acido nucleico que codifica una glucosiltransferasa es una fucosiltransferasa bacteriana.
- 17. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 16, o el microorganismo hospedador recombinante segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado por que el acido nucleico que codifica un polipeptido de glucosidasa es una 1,2-alfa-L-fucosidasa bacteriana.
- 18. El proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 a 17, caracterizado por que se usa una cepa de Escherichia coli recombinante como microorganismo hospedador recombinante, para la produccion de L-fucosa, en el que en la cepa de Escherichia coli recombinante los genes que codifican beta-galactosidasa, L-fucosa isomerasa, L-fuculosa cinasa y UDP-glucosa:undecaprenil fosfato glucosa-1-fosfato transferasa, han sido delecionados o desregulados, y en el que la cepa de Escherichia coli recombinante ha sido transformada para comprender a) genes que permiten que la cepa de Escherichia crezca sobre sacarosa como la unica fuente de carbono, codificando los genes, respectivamente, sacarosa permasa, fructocinasa, sacarosa hidrolasa y un represor transcripcional, b) un gen que codifica una 2-fucosiltransferasa, y c) un gen que codifica una 1,2-alfa-fucosidasa.
- 19. Uso de un microorganismo transformado para poseer las siguientes actividades enzimaticas para la smtesis de un monosacarido: i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un sustrato de monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido, en la produccion de un monosacarido seleccionado de glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y ribosa.
- 20. Uso de un microorganismo transformado para poseer las siguientes actividades enzimaticas para la smtesis de un monosacarido: i) una glucosiltransferasa espedficamente capaz de transferir, a partir de un sustrato de monosacarido de nucleotidos activado, el monosacarido a un aceptor para formar un sustrato aceptor-monosacarido, y ii) una glucosidasa capaz de liberar el monosacarido del aceptor; en el que el microorganismo es incapaz de metabolizar el monosacarido, en el que el microorganismo hospedador recombinante es cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la produccion de L-fucosa.
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