BRPI1003744A2 - e-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania - Google Patents

Abstract

E-NTPDases RECOMBINANTES, USO NA PRODUçãO DE KIT DE DIAGNóSTICO PARA DETECçãO DE ANTICORPOS NAS LEISHMANIOSES CAUSADAS POR ESPéCIES DO GêNERO Leishmania. Esta invenção refere-se às proteínas da família E-NTPDases recombinantes que podem ser usadas como antígenos em kits de diagnósticos das leishmanioses animais e humanas. As proteínas da família das E-NTPDases recombinantes obtidas poderão ser empregadas na produção de Kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, usando testes do tipo imunológicos. Estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos, em programas de controle de leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. Estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos e vacinais, no desenho racional de quimioterápicos para o tratamento das leishmanioses e no desenvolvimento de anticorpos monoclonais a serem usados no diagnóstico, prognóstico ou terapia das leishmanioses.

Description

"E-NTPDases RECOMBINANTES, USO NA PRODUÇÃO DE KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS NAS LEISHMANIOSES CAUSADAS POR ESPÉCIES DO GÊNERO Leishmanian

Campo de Aplicação da Invenção

As proteínas da família das E-NTPDases recombinantes obtidas, objeto de pedido de patente, serão empregadas na produção de Kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, testes estes do tipo imunológicos. Estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos em programas de controle epidemiológico a campo das leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. Estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos, vacinais, na produção de anticorpos monoclonais e no desenho racional de drogas para a quimioterapia das leishmanioses.

Estado da Técnica

Sabe-se que as Leishmanioses compreendem um conjunto de enfermidades cujos agentes etiológicos são espécies do gênero Leishmania, que são protistas pertencentes à família Trypanosomatidae. A transmissão se dá através da picada do flebotomío fêmea. Dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção e do tipo de hospedeiro, a leishmaniose pode ser dividida classicamente em duas formas clínicas: visceral e tegumentar ou cutânea. A forma visceral se não tratada costuma ser fatal, já as formas cutâneas, apesar de raramente evoluírem para a fatalidade são mutilantes e desagradáveis especialmente quando da existência de múltiplas lesões. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) (WHO, 2009, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/WHO_CDS_NTD_IDM_2007.3_eng.pdf) a leishmaniose é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem, uma variedade de animais silvestres e domésticos. É uma doença endêmica em 88 países distribuídos em quatro continentes. Mais de 90% dos casos de Leishmaniose cutânea ocorrem no Irã, Afeganistão, Síria, Arábia Saudita, Brasil e Peru e mais de 90% dos casos da forma visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, índia e Sudão. Ainda segundo a OMS (WHO, 2009, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/WHO_CDS_NTD_IDM_2007.3_eng.pdf) o número de casos de leishmaniose cutânea (LC) vem crescendo no Brasil nos últimos anos (1988: 21.800 casos; 1999: 30.550 casos; 2000: 35.000 casos). Fato este relacionado ao desenvolvimento econômico e à mudança de hábitos e ambientais que expõem mais a população aos vetores da doença. Um dos principais reservatórios atualmente descrito é o cão, que por sua proximidade com o homem participa ativamente do processo de manutenção da leishmaniose.

A leishmaniose canina tem se tornado foco de vários estudos visto a importância do cão como animal doméstico e a sua relevância como reservatório da doença. Porém o cão não é simplesmente um reservatório de parasitos, pois o mesmo também apresenta a patologia associada à infecção tanto na forma cutânea quanto visceral.

Uma das principais ações empregadas no controle da leishmaniose canina ainda é a eliminação do cão infectado devido ao insucesso da antimonioterapia. Atualmente o tratamento de cães está proibido visto que não há eficácia completa comprovada com as drogas disponíveis.

Na prática clínica, diante da suspeita de infecção os cães passam por vários testes diagnósticos que são muitas vezes contraditórios e nem sempre tem uma correlação com o estado da doença no cão, dificultando o prognóstico e conseqüente tratamento. Este tipo de constatação levou ao desenvolvimento de técnicas mais específicas baseadas na amplificação de regiões de DNA do parasito por Reação em Cadeia pela Polimerase-PCR (Francino, O., Altet, L., Sanchez-Robert, E., Rodriguez, A., Solano-Gallego, L., Alberola, J., Ferrer, L., Sanchez, A., Roura, X., Veterinary Parasitology 137: 214-221, 2006). Apesar de usualmente demonstrar alta eficiência, o ensaio de PCR tem a desvantagem de ter alto custo e falhas em relação à extração de DNA. O diagnóstico da doença em cães tem sido muito estudado, porém ainda hoje não há um método diagnóstico considerado como padrão e cada laboratório utiliza um método próprio de escolha (Da Silva E. S., Van Der Meide W. F., Schoone G. J., Gontijo C. M. F., SchaIlig H. D. F. H., Brazil R. P., Veterinary Research Communications 30: 637-643, 2006). Diante disto novos métodos diagnósticos alternativos, mais eficientes, discriminatórios e rápidos são necessários.

A abordagem de proteínas recombinantes para serem usadas no diagnóstico tem sido o foco de muitos pesquisadores (S. Farajnia, B. Darbani, H. Babaei, Μ. H. Alimohammadian, F. Mahboudi And A.M. Gavgani, Parasitology 135, 1035-1041, 2008; Renato Porrozzi, Marcos V. Santos da Costa, Antonio Teva, Aloísio Falqueto, Adelson L. Ferreira, Claudiney dos Santos, Ana Paula Fernandes, Ricardo T. Gazzinelli, Antonio Campos-Neto and Gabriel Grimaldi, Jr., Clinicai And Vaccine Immunology 14: 544-548,2007).

As E-NTPDases são uma família específica de ecto-nucleotidases, proteínas que são descritas de maneira geral, como proteínas de membrana ecto localizadas ou solúveis (secretadas) que tem como função primária a degradação de nucleotídeos, principalmente extracelulares, tri e difosfatados (Zimmermann, H., Beaudoin, A. R., Bollen, M., Belgium, Shaker Publishing; 1-9. 1999.)

O interesse nestas enzimas se baseia em dados obtidos na literatura que sugerem a participação de ecto-nucleotidases, entre outras coisas, na virulência, infectividade e aquisição de purinas em parasitas (Barrêdo-Pinho, M., Peres-Sampaio, C. E., Chrispim, P. P. M., Belmont-Firpo, R., Lemos5A. P., Martiny, A., Vannier-Santos, Μ. A., Meyer- Fernandes, J. R. A Archives of Biochemistry and Biophysics, 391:16-24, 2001). Recentemente, estudando a infecção experimental de camundongos C57BL/6 com L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, ambas causadoras de leishmaniose tegumentar, verificou-se que os animais foram capazes de controlar a infecção por L. (V.) braziliensis, mas não por L. (L.) amazonensis. A diferença de resposta à infecção foi relacionada a um estado anérgico observado nos animais infectados por L. (L.) amazonensis (Maioli, T. U., Erica, T., Arantes, R. M. E., Fietto, J. L. R., Afonso, L. C. C., Parasitai Res 94: 207-212, 2004). Além disto, foi verificado que as células intactas de L. (L.) amazonensis foram capazes de hidrolisar uma maior quantidade de nucleotídeos extracelulares de adenosina. Considerando que o ATP extracelular é uma molécula pró-inflamatória e que um dos produtos de sua degradação, a adenosina possui efeito imunossupressor, esta diferença poderia então levar a um efeito antiinflamatório e imunossupressor, como o observado (Maioli, T. U, Erica, T., Arantes, R. M. E., Fietto, J. L. R., Afonso, L. C. C., Parasitai Res 94: 207-212, 2004). Esta foi a primeira evidência da participação de ecto-nucleotidases de um parasita no controle da resposta imunológica do hospedeiro.

Na busca feita junto ao Instituo Nacional da Propriedade Industrial - INPI foram encontradas solicitações de patentes nas áreas de imunoterapia e imunodiagnóstico, porém nenhuma destas patentes utiliza produtos relacionados ao objeto desta patente. Nesta busca foi encontrado o documento de patente PI 9406509, que refere-se a "COMPOSTOS, PROCESSO, SUA PREPARAÇÃO, USO DOS MESMOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E PROCESSO PARA PROFILAXIA E PARA TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE MALÁRIA E DOENÇAS CAUSADAS POR LEISHMANIA, TOXOPLASMA GONDII, PNEUMOCY", onde se descreve o pirrol-amidínicos de fórmula geral e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, processos para a preparação e composições farmacêuticas contendo-os úteis como antivirótico e antiparasítico. Este documento versa então sobre o uso de formulações farmacêuticas derivadas de compostos pirrol-amidinicos para tratamento e prevenção das leishmanioses. O objeto do pedido de patente em questão é diferente da patente descrita, pois utiliza proteína recombinante para ser usada em diagnóstico, prognóstico, desenvolvimento de anticorpos monoclonais, vacinação e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses. Não há inter-relação entre os mesmos. Porém é importante salientar que no caso de doenças infecciosas é desejável que se tenham métodos alternativos de diagnóstico, prevenção e tratamento visto que existe uma diversidade muito grande de resposta a quimioterapia e vacinação das populações dos hospedeiros, bem como diferentes susceptibilidades a drogas e produção de resposta imune protetora em relação aos parasitos.

Outro depósito encontrado foi o de n° PI 9807332 que trata de "ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA UTILIZAÇÃO NA TERAPIA E DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE" onde são demonstradas composições e processos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose e estimular respostas imunes em pacientes. A presente invenção não tem sobreposição com esta patente, embora ambas visem aplicações em comum. Os antígenos apresentados na patente PI9807332 são distintos das proteínas antigênicas desta patente. A aplicação em mesma área se justifica como descrito no item anterior, além disto, a própria patente em questão salienta a necessidade de desenvolvimento de alternativas no diagnóstico, tratamento e profilaxia das leishmanioses que são causadas por mais de 20 espécies diferentes de Leishmania.

O depósito de n° 2133236A1 feito no banco da Espanha refere-se a "GEN QUIMÉRICO FORMADO POR LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN LOS DETERMINANTES ANTIGÊNICOS DE CUATRO PROTEÍNAS DE L. infantum, APLICABLE PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLOGICO DE LEISHMANIOSIS CANINA Y PROTEÍNA OBTENIDA" onde se descreve os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum (LiP2a, LiP2b, LÍP2A, LiPO), que foram aplicadas em diagnóstico de Leishmaniose. Os objetos desta patente são proteínas distintas daquelas que estão sendo patenteadas neste processo, portanto como justificado anteriormente apesar da aplicação poder ser a mesma os antígenos são diferentes. No caso das Leishmanioses, como dito anteriormente, é importante que se tenham proteínas alternativas para serem usadas em diagnóstico, profílaxia e tratamento, visto que existe grande diversidade de parasitos e hospedeiros.

É um primeiro objetivo da presente invenção, fornecer as proteínas da família das E-NTPDases recombinantes de três espécies de Leishmania (Leishmania major, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum) homóloga à sua proteína natural, para ser utilizada como antígeno em kits de diagnóstico das leishmanioses.

E objetivo também da presente invenção usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas seqüências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinais, desenvolvimento de anticorpos, marcadores de prognóstico e no desenho racional de drogas inibidoras das E- NTPDases que possam ser usadas na quimioterapia das leishmanioses.

O desenvolvimento de compostos antigênicos capazes de aumentar a eficiência no diagnóstico e efetivação como agente vacinai tem sido busca no âmbito geral da pesquisa em leishmaniose. A proteína GDPase recombinante, conforme visto na Figura 5, aponta como um potente antígeno. O antígeno quando utilizado em diagnóstico em teste de ELISA, foi capaz de discriminar de maneira satisfatória soros de cães contaminados com Trypanossoma cruzi dos contaminados com Leishmania sp. Desse modo o investimento neste antígeno recombinante como alvo para produção de kit de diagnóstico, bem como para as outras aplicações é muito promissor.

Descrição da Invenção

O primeiro objetivo da presente invenção é alcançado através das proteínas da família das E-NTPDases expressas de forma recombinante, sendo as seqüências SEQ. ID. N0 1, SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N0 7, SEQ. ID. N0 8, SEQ. ID. N0 9, SEQ. ID. N0 10, SEQ. ID. N0 11 e SEQ. ID. N0 12 utilizadas como antígeno.

O segundo objetivo da presente invenção é usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas seqüências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinai, marcador de prognóstico, produção de anticorpos monoclonais e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses.

A presente invenção será, a seguir, detalhadamente descrita. Figura 1.1 — ilustra o esquema do vetor de expressão pET 21b para sistema de expressão em Escherichia coli e do cassete de expressão de DNA.

Figura 1.2 - ilustra o inserto de DNA, no caso o gene gi_| 154872131, que foi clonado entre os sítios de restrição BamHI e SalI.

Figura 2.1 - ilustra a comparação das seqüências das E-NTPDases de espécies do gênero Leishmania. As regiões marcadas com quadros amarelos representam as regiões conservadas das E-NTPDases.

Figura 2.2 - idem a Figura 2.1, continuação.

Figura 3 - a parte A ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10%, mostrando proteínas de um lisado de E. coli BL21 (DE3) transfectadas com plasmídeo contendo o gene da GDPase de Leishmania major expresso em diferentes tempos. A primeira coluna mostra uma proteína NTPDase recombinante de Trypanossoma eruzi. As próximas 8 linhas mostram os produtos dos lisados de bactérias após 2 a 4 h de indução com IPTG nas concentrações de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e sem indução respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa). A parte B ilustra um resultado de Western blot mostrando a proteína GDPase de Leishmania major do lisado de E. coli reagindo com anticorpos do soro de coelhos imunizados com a NTPDase recombinante de T. cruzi. As linhas de 1 a 8 mostram a reação da proteína GDPase com o soro de coelhos imunizados com NTPDase de T. cruzi. A linha 9 mostra ausência de bandas quando não havia indução da proteína GDPase recombinante. A seta indica a reação da proteína com os anticorpos mostrando uma banda de aproximadamente 78 kDa.

Figura 4 - Ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10% mostrando a proteína GDPase de Leishmania major expressa em E. coli BL21 (DE3) após a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Níquel-agarose. A proteína GDPase recombinante de Leishmania major pode ser observada nas colunas IOe 11, após ter sido recuperada em tampão contendo 80 mM e 160 mM imidazol respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa). A proteína GDPase recombinante de Leishmania major possui 78,2 kDa.

Figura 5 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA em que se utilizou como antígeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major purificada nas concentrações de 1.5, 3, 4.5 e 30 μg/ml e como controle foi utilizado o extrato total de Leishmania sp. Iisada na concentração de 3 μg/ml, referenciadas pelos números 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente . Foram testados 8 soros de cães domésticos (Canis familiaris) na diluição de 1: 80. Sendo 3 soros de cães sabidamente positivos para Leishmania sp. (L+), 3 soros de cães sabidamente negativos para infecção por Leishmania sp. (L-) e 2 soros de cães sabidamente positivos para infecção por T. cruzi.

Figura 6 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA utilizando como antígeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major na concentração 1,5 μg/ml. Foram utilizadas 169 amostras de soros de cães, sendo 117 sabidamente positivas e 52 sabidamente negativas.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere às proteínas da família E-NTPDase recombinantes de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, obtidas a partir da seqüência nucleotídica dos genes codificantes destas proteínas com modificações destinadas a aplicações antigênicas, as quais após etapas de preparação de primers para amplificação dos genes alvos, amplificação dos genes codificantes dessas proteínas e clonagem em vetor de expressão, é finalmente expressa e posteriormente purificada por cromatografia de afinidade por Níquel. As ditas proteínas recombinantes assim purificadas podem ser usadas de forma satisfatória no imunodiagnóstico por ELISA e Western-blot, como demonstrado pelo uso da isoforma recombinante GDPase de L. major aplicada ao diagnóstico da Leishmaniose canina.

A presente invenção se refere às proteínas da família E-NTPDases recombinantes identificadas como SEQ. ID. N0 1, SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N0 6, SEQ. ID. N0 7, SEQ. ID. N0 8, SEQ. ID. N0 9, SEQ. ID. N0 10, SEQ. ID. N0 11 e SEQ. ID. N0 12 as quais poderão ser utilizadas como antígenos em diagnóstico das leishmanioses.

A SEQ. ID. N0 2 derivada do gene codificante da GDPase de L. major, apresenta uma identidade de aminoácidos de 93,74% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major quando se compara a mesma com relação aos trechos disponíveis no GenBank de 690 aminoácidos predita pelo acesso gij 154872131. Adicionalmente a GDPase de L. infantum (SEQ ID. N0 6) e L. braziliensis (SEQ ID. N0 4) apresentam identidade de 84,49% e 65,75% respectivamente em relação à GDPase recombinante de L. major, conforme visualizado na Tabela 1. Esta alta identidade mostra que são proteínas similares, da mesma família. Esta similaridade é suficiente para haver reatividade imunológica cruzada sendo possível utilizar todas estas variantes nas mesmas aplicações descritas para a GDPase, ou seja, diagnóstico, prognóstico e vacinação para as leishmanioses. O mesmo ocorre para as variantes denominadas nucleosideo difosfatases (NTPDases, descritas como SEQ ID. N0 8, SEQ ID. N0 10 e SEQ ID. N0 12), que apesar de apresentarem menor identidade comparativamente (Tabela 1) apresentam domínios conservados, conforme mostrado nas Figuras 2.1 e 2.2. Sendo assim, as NTPDases recombinantes também são objetos deste pedido de patente e poderão ser usadas nas mesmas aplicações, ou seja, no diagnóstico, prognóstico, vacinação, desenvolvimento de monoclonais e quimioterápicos para as leishmanioses.

Tabela 1 - Relação de Similaridade e Identidade da seqüência de aminoácidos da proteína GDPase de L. major recombinante modificada com as demais seqüências de aminoácidos das E-NTPDases de diferentes espécies de Leishmania.

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Números de 1 a 7 na horizontal representam as respectivas proteínas da vertical. Onde os números se cruzam fornece a identidade no quadrante de cima e similaridade no de baixo.

O gene natural das GDPase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob os acessos giJ15487213j, XP OO1562788, XP OO1463665 respectivamente. O gene de Leishmania major possui uma seqüência de 2073 nucleotídeos que codifica uma proteína de 690 aminoácidos. O gene de Leishmania braziliensis possui uma seqüência de 2076 nucleotídeos que codifica uma proteína de 691 aminoácidos. O gene de Leishmcmia infantum possui uma seqüência de 2034 nucleotídeos que codifica uma proteína de 677 aminoácidos. As seqüências de nucleotídeos recombinantes em relação às naturais apresentam modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal. À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foi removido os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionado 45 pares de base. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 719, 720 e 706 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N0 2, SEQ. ID N0 4 e SEQ. ID N0 6).

O gene natural das NTPDase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob os acessos XP 001681917, XP OO1562178, XM 001464304 respectivamente. Ambas as espécies possuem uma seqüência de 1278 nucleotídeos que codifica 425 aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos recombinantes em relação ao natural apresenta modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal. À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foram removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, exceto em Leishmania major que foram adicionados somente 39 pares de base. Esta diferença se deve ao uso de diferentes sítios de restrição usados no processo de clonagem gênica. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 452, 454 e 454 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N0 8, SEQ. ID N0 10 e SEQ. ID N° 12).

A presente invenção ainda se refere ao uso da proteína GDPase recombinante em kit de diagnóstico para as leishmanioses causadas por espécies do gênero Leishmania, compreendendo as E-NTPDases recombinantes, tal como mencionado acima, que são capazes de interagir com anticorpos específicos em amostras de soros ou sangue ou outros líquidos ou amostras de indivíduos sendo capazes de indicarem a infecção nestes indivíduos humanos ou animais.

A seguir serão descritos experimentos de demonstração que permitirão ilustrar a potencialidade da presente invenção. Resumidamente estes experimentos se baseiam em amostra contendo Leishmania major que foi submetida à extração de seu material genômico para isolamento do gene específico codificante da GDPase. Posteriormente a isso, foi feito a amplificação do gene específico por PCR sendo esse clonado em vetor de clonagem e expressão, o qual foi utilizado na transformação de células de Escherichia coli que passaram a expressar a proteína GDPase recombinante do protozoário. A proteína GDPase de Leishmania major, após purificação foi utilizada como antígeno em testes de ELISA em soros de cães visando à pesquisa de anticorpos da classe IgG contra espécies do gênero Leishmania. Esta proteína GDPase recombinante de Leishmania major, produzida em larga quantidade, poderá ser amplamente distribuída a laboratórios por todo país e desta forma, contribuir de forma relevante para o diagnóstico sorológico das leishmanioses no Brasil ou no exterior, ou ainda ser usada em kits e aplicações imunológicas vacinais e de produção de anticorpos. Todos os processos descritos neste documento se estendem também as outras isoformas das E-NTPDases das outras espécies de Leishmania descritas nas seqüências SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N0 6, SEQ. ID. N0 7, SEQ. ID. N0 8, SEQ. ID. N0 9, SEQ. ID. N0 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N0 12 as quais poderão ser também utilizadas como antígenos em diagnóstico das leishmanioses.

Experimentos De Demonstração

Isolamento e Clonagem da região codificante da GDPase de Leishmattia major

A cepa utilizada para extração genômica foi a MHOM/IL/80/Friedlin de Leishmcmia major. Para a extração de DNA genômico (DNAg) aproximadamente 1x10^8 células foram recolhidas por centrifugação a 13.000 χ g por 2 a 3 min, descartando o sobrenadante foi adicionado 500 a 700 μl de fenol equilibrado ao "pellet" e deixado a temperatura ambiente (T. A.) por 5 a 10 min. Em seguida foi adicionado de 200 a 400 μl de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril e homogeneizado no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13.000 χ g por 10 a 12 min e recuperado a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 μl, de uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamilico (25:24.1) e homogeneizada no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13 .000 χ g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 μl de clorofórmio e homogeneizado no vortex. Sendo posteriormente centrifugada a 13.000 χ g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa como descrito anteriormente. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume de uma solução de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e dois volumes de etanol 100% gelado homogeneizando sem vortexar. O homogeneizado foi deixado precipitando por 2 a 3 h no freezer -80 °C, sendo posteriormente centrifugado a 13.000 χ g por 20 a 30 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado, adicionando ao precipitado de 250 a 500 μl de etanol 70% gelado e a amostra foi centrifugada a 13.000 χ g por 5 a 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o "pellet" colocado para secar com a tampa do frasco aberta. Posteriormente o "pellet" de DNA seco foi suspendido em 50 a 60 μl de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril. O DNA genômico foi estocado a - 20°C e utilizado para isolamento da região codificante do gene da GDPase (gij 154872131) contendo 2073 pares de bases por reação da polimerase em cadeia (PCR).

Para tanto foram utilizados o oligonucleotídeo direto 5'CGGGATCCCATGCCAATGACTGACG3' que anela no genoma de Leishmania major e insere um sítio de restrição para BamH I na extremidade 5' para inserção posterior no vetor de expressão em bactéria pET-21b e oligonucleotídeo reverso 5'GCGTCGACGGTAAGAGAGAGGAGTGA3', que cria um sítio para Sal I no final da região codificante. Para amplificação do gene foi usado um aparelho termociclador (Programmable Thermal Controller-PTC-100™). A reação foi realizada em um volume total de aproximadamente 50 μl, utilizando 4 μl do DNAg; 5,0 μl de tampão 1,5 mM MgSO4 (fornecido pelo fabricante da Taq DNA Polimerase); 2,4 μl, do mix de 2,5mM dNTPs (dCTP, dTTP, dGTP, dATP); 2 μl dos oligonucleotídeos em uma concentração de pmol/UL; 0,5 μL de Taq DNA Polimerase e água ultrapura estéril qsp. O programa utilizado consistiu em 33 ciclos: 94°C por 4 min; 94°C por 30 seg; 50 0C por 1 min; 72°C por 1 min; 72°C por 5 min; 4°C até retirada dos tubos. Os produtos finais das reações de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em IX TAE (1 mM EDTA; 40 mM Tris-Acetato; em água deionizada) e corado em solução de brometo de etídio (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., 1989), para a verificação da formação de uma banda majoritária correspondente ao tamanho do amplicon alvo com aproximadamente 2,1 kb. A eletroforese foi feita a aproximadamente 80 V, utilizando como tampão de corrida TAE. A banda de cerca de 2,1 kb foi purificada do gel de agarose utilizando o Kit "PureLink Quick Gel Extraction" (invitrogen ) conforme instruções do fabricante. Foi utilizado o sistema TOPO (Invitrogen1 M) para a subclonagem inicial do gene.

A banda do amplicon foi suspensa em um volume total de aproximadamente 20 μL de água ultra-pura estéril e 5 a 10 μL desta solução foi usada na ligação feita a aproximadamente 16°C por 10 a 12 h, de acordo com manual do fabricante (TOPO® TA Cloning® Kit for subcloning - Invitrogen). A mistura de ligação (~6 μL) contendo vetor TOPO + amplicon da GDPase, foi adicionada a aproximadamente 100 μL de solução contendo bactérias E. coli TOP 10F', previamente tornadas competentes (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A mistura foi incubada em gelo por 45 a 60 min, submetida a choque térmico (42°C) por 1 a 5 min e colocada novamente no gelo. Adicionaram-se 1 a 5 mL de LB-Liquido (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7.5) seguido de incubação a 37°C por 40 min com agitação de 180 rpm em Shaker TE-420. O volume total dessa mistura foi dividido em três alíquotas e plaqueado em meio sólido LB-Agar (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, 1,5% select Agar pH 7.5) contendo ampicilina (5 a 10 mg/mL"1) e incubadas por 12 a 14 ha 37°C.

Os clones resistentes a ampicilina foram recuperados e utilizados para confirmação da presença do plasmídeo contendo o gene de interesse por PCR e análise de restrição (utilizando BamH I e Sal I) a partir do plasmídeo extraído por minipreparação plasmidial de acordo com (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um dos clones isolados e confirmado foi então submetido a sequenciamento automático parcial usando iniciadores flanqueadores da região de clonagem em aparelho Mega-Bace de acordo com instruções do fabricante. Os clones que continham a construção foram estocados em meio LB-líquido em tubos de microcentrífuga com 20% de glicerol e mantidos a -80°C.

Extração do DNA plasmidial

O DNA plasmidial (DNAp) foi extraído pelo método da Iise alcalina (Sambrook J„ Fritsch E. F. and Maniatis T., Coíd Spring HarborLaboratory Press, 1989) como descrito a seguir. Para isso, os clones positivos da transformação com o vetor TOPO, foram crescidos em tubos de rosca individuais contendo 3 mL de LB e 30 μl de ampicilina (5 a 10 mg/mL"1) por 12 a 14 h a 37°C em 180 a 200 rpm. Após o crescimento um volume de 1,5 mL de cada cultura foi transferido para tubos de microcentrífuga, e as células foram coletadas por centrifiigação (Centrífuga 5415C- EPPENDORF) a 12000 χ g por 1 a 5 min.

O sedimento celular foi lavado com 0,5 a 1 mL de STE (0,1 NaCl, 10 mM Tris.Cl,1 mM EDTA, pH 8.0) para retirada de inibidores de endonucleases. Após a centrifugação foram adicionados de 200 a 300 μl da solução 1 (25 mM Tris.Cl pH 8.0, 10 mM de EDTA e 5mM de D-Glicose) gelada e suspenso vagarosa e completamente o "pellet". Em seguida foram adicionados de 200 a 300 μl da solução Π (NaOH 0,2M, SDS 1%) preparada na hora, e os tubos foram invertidos lentamente por 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 a 10 min. Após isso, 150 a 300 μl da solução III (3 M Kac, 2 M Hac pH 8.0) gelada foram adicionados e os tubos foram invertidos lentamente 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 min. Em seguida os tubos foram centrifugados por 12000 χ g por 5 a 10 min e transferidos os sobrenadantes para outros tubos novos onde foram adicionados 5 μl de RNAse A (10 μg/uL) e mantidos os tubos a 37°C em banho-maria por 30 a 50 min. A cada tubo foram adicionados 550 a 700 μί de fenol: clorofórmio (1:1), e os tubos foram invertidos lentamente por cerca de 5 a 10 vezes e centrifugados a 12000 χ g por 5 a 10 min. Esse procedimento se repetiu mais uma vez. A fase aquosa foi transferida para tubos novos. Em seguida adicionou-se 550 a 700 μl de clorofórmio e foi realizada nova centrifugação a 12000 χ g por 5 a 10 min. A fase superior foi transferida para novos tubos, onde foram adicionados 550 a 700 μl de isopropanol gelado. Os tubos foram invertidos lentamente e mantidos a -70°C por 10 a 20 min. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12000 χ g por 5 a 10 min, o sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min sobre papel toalha. O precipitado foi lavado com 200 a 400 μl de etanol 70% gelado e centrifugado a 12000 χ g por 5 a 10 min. O sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min. Após estar secos, o DNA plasmidial foi suspenso em 20 a 30 μl de H2O deionizada. Os clones foram selecionados por análise de restrição utilizando BamH I e Sal I e confirmados por sequenciamento parcial.

Transferência da região codiflcante da proteína GDPase recombinante para vetor de expressão em sistema procarioto pET-21b

O vetor de amplificação TOPO contendo o gene, foi submetido à digestão com BamH I e Sal I. Após a digestão, a mistura do vetor TOPO foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1%.

O inserto relativo à região codificante completa da GDPase foi purificado com kit "PureLink Quick Gel Extraction" (invitrogen ) e ligado, de forma análoga a descrita na subclonagem em TOPO, no vetor pET-21b previamente digerido com as mesmas enzimas e purificado também pelo mesmo kit. A Figura 1.2 mostra um esquema da construção pET-21b-GDPase.

Bactérias E. coli TOP 10F', previamente tornadas competentes como descrito acima, foram transformadas com o produto de ligação e foram incubadas em meio líquido LB conforme descrito acima (isolamento do clone contendo o TOPO). A seleção dos clones foi feita por análise de restrição e sequenciamento. Os clones positivos foram estocados em tubos de microcentrifuga, contendo 15 a 30 % de glicerol, e mantidos a temperatura de -70°C.

Expressão da proteína GDPase recombinante e análise em gel de SDS A expressão total das proteínas recombinantes foi feita, em média escala, em 250 mL de LB. O cassete de expressão do vetor pET-21b, destacando os sítios de clonagem e seqüência de 6 resíduos de histidina na porção carboxi-terminal da proteína recombinante, está esquematizado na Figura 1.2.

Bactérias competentes, da linhagem E. coli BL21(DE-3), foram transformadas com a construção pET-21b-GDPase, de modo análogo ao realizado com vetor TOPO. O gene gij 15487213| codifica um RNAm para a produção de uma proteína de 78,2 kDa cuja seqüência de aminoácidos predita está descrita na SEQ. ID. N0 2.

Um total de 45 nucleotídeos extra, correspondentes a 15 aminoácidos a mais na extremidade carboxi-terminal da proteína recombinante foram adicionados à proteína final pela ligação do gene alvo com o vetor pET-21b, que codifica 9 aminoácidos de ligação entre a proteína GDPase e a cauda de hexa-histidina mais 6 de histidinas. Na porção aminoterminal um total de 14 aminoácidos foram inseridos.

Em seguida, realizou-se um pré-inoculo em 5 a 7 mL de meio líquido LB contendo 50 μl de ampicilina (5 a 10 mg/mL"1) a partir do clone preservado em glicerol. Este pré- inoculo foi incubado por 16 a 20 h a 37°C sob agitação. Uma alíquota de 2,5 a 5 mL de cultura foi coletada e inoculada em um volume total de 250 mL de LB-líquido contendo 2,5 mL de ampicilina (5 a 10 mg/mL"1). Essa mistura foi incubada a 37°C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua DOeoo (densidade ótica). Para indução da proteína recombinante modificada usou-se IPTG (isopropyl β-D- thiogalactopyranoside). No momento em que a DOeoo atingiu cerca de 0,6 a 0,8, foram adicionados aos tubos de cada clone aproximadamente 0,3 mM de IPTG. A incubação prosseguiu por 2 a 4 h a 37°C sob agitação.

Após a indução a cultura foi centrifugada 3000 χ g e o sedimento obtido foi mantido no gelo por 15 a 30 min e suspenso em tampão de Iise (50 mM Tris (pH 8.0), 300 mM NaCl, em água destilada), na proporção de 3 a 5 mL por grama de sedimento, contendo 30 a 50 μί de PMSF (100 mg/mL), 50 a 100 μl de aprotinina (1 mg/mL), 50 a 100 μl de pepstatina (1 mg/mL). Em seguida foi adicionado 1 a 5 mg/mL de lisozima e manteve-se no gelo por 30 a 50 min.

Procedeu-se então o rompimento final das células por sonicação por 6 a 10 vezes por 10 a 20 segundos na potência 200 W com intervalo de 10 a 20 segundos no gelo entre cada sonicação. Em seguida adicionou-se 0,1% Triton e o material foi centrifugado por 30 a 50 min a 20400 χ g a 4°C, sendo armazenado tanto o "pellet" (fração insolúvel) quanto o sobrenadante (fração solúvel) a - 20 0C para posterior purificação da proteína recombinante.

Para determinar a melhor concentração do IPTG a ser usada como padrão para expressão da proteína recombinante, as colônias foram inoculadas em 4 mL de meio liquido LB contendo 40 μL de ampicilina (5 a 10 mg/ml/1) e incubadas a 37°C por 12 a 14 h sob agitação. Uma alíquota de 250 a 500 μl de cultura foi coletada e diluída para um volume total de 5 a 10 mL em 11 tubos. Essa mistura foi incubada a 37°C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua DO600.

Quando a cultura atingiu DOeoo de aproximadamente 0,6 a 0,8, aliquotou-se 1 a 5 mL da cultura (controle não induzido), em seguida foram adicionados aos outros tubos, IPTG na concentração seriada de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 e 1 mM. A incubação prosseguiu por 2a4ha37°C sob agitação. Ao final deste tempo 1 mL de cada cultura foi coletado (controles induzidos) e feita a leitura de DO600. As amostras (controles induzidos e não induzido) foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e o sedimento bacteriano misturado com tampão de amostra de SDS-PAGE (62,5 mM Tris.HCl pH 6.8, 10% SDS, 0,01% azul de bromofenol (ABF), 10% glicerol e 20 mM de β-mercaptoetanol). As amostras foram aquecidas a 100 0C por 5 a 10 min. Os lisados bacterianos foram analisados por SDS-PAGE 10% de acordo com Laemmli, U. K., Nature. 227(259): 680-5, 1970. Foi utilizado o sistema de eletroforese vertical Mini-PROTEAN® (BIO-RAD) pequeno (lmm de espessura). As amostras foram aplicadas na DOeoo 3,0 a 5,0, para um volume total de 20 μl por canaleta, e após a eletroforese o gel foi corado com Comassie blue. O padrão de peso molecular utilizado foi o PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Figura 3, na parte A).

Purificação da proteína GDPase recombinante e análise em gel de SDS

Para purificação da proteína recombinante foram empregadas as amostras do sobrenadante (solúvel). Estas amostras foram mantidas sobre agitação na presença de 500 a 700 μL da resina HIS-Selectm Nickel AfFinity Gel devidamente preparada segundo o fabricante, em tubos de 15 mL por 1 a 3 horas a 4°C. Posteriormente o material foi passado em uma coluna, contendo lã de vidro na extremidade abaixo para impedir perda da resina, e as proteínas não ligadas à coluna foram recuperadas no volume separado da resina. O fluxo foi dependente somente da pressão atmosférica não sendo padronizado.

Após a saída de todo material líquido visível da coluna, manualmente preparada pela imobilização da resina de afinidade a uma seringa de 10 mL, a esta foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 1 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM MgCl2). Esse procedimento se repetiu por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM Imidazol, 5 mM MgCI2). Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume de 2 a 4 mL do tampão de lavagem 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 10 mM Imidazol, 5 mM MgCl2). Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes. Posteriormente as proteínas mais fortemente ligadas à resina foram eluídas em tampão de eluição. Um volume de 1,5 a 3 mL do tampão de eluição 1 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCI2, 80 mM Imidazol, 5 mM MgCl2), foi adicionado. Após término desta eluição, um volume de 1 a 3 mL do tampão de eluição 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 160 mM Imidazol, 5 mM MgCb) e finalmente um volume de 1 a 3 mL de tampão de eluição 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 250 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) se procedeu como o primeiro. O processo de eluição 3 se repetiu por mais uma vez. As amostras de todos os passos de purificação foram coletadas em tubos de microcentrifuga e estocadas a 4°C e analisadas em gel de SDS 10% corado com Comassie blue. As amostras foram aplicadas em um volume total de 20 μl (Figura 4).

Western Blot

Várias amostras do processo de purificação foram submetidas à eletroforese SDS- PAGE 10% e transferidas sob corrente elétrica para membrana de nitrocelulose sob a condição de transferência de 200-250 mA por 2 a 4 h em sistema de transferência vertical Mini-PROTEAN^ 3 Cell Assembly Guide. Após a transferência a membrana foi corada com Ponceau S (Ponceau 0,2% em ácido acético 1,0%) por 10 a 30 min para visualização das bandas protéicas e marcação da região das bandas do padrão de massa molecular. Em seguida a membrana foi descorada com água destilada e colocada em solução de bloqueio com incubação por 1 a 3 hora em temperatura ambiente utilizando o tampão TBS-T (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl; 0,1% Tween 20) contendo 5% de leite desnatado.

Posteriormente a membrana passou por uma rápida lavagem em tampão TBS (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl) e em seguida foi feita a incubação com o anticorpo primário anti- rNTPDase de T. cruzi 1.1000 diluídos em tampão TBS-T por cerca de 16 a 20 h à 100 rpm. Posteriormente a membrana passou por 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob leve agitação constante. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase, na diluição de 1:20.000. A membrana foi deixada sob agitação a 100 a 200 rpm por 1 a 3 horas. Em seguida, a membrana passou por mais 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob as mesmas condições de agitação. A revelação foi realizada com substrato diaminobenzidina (DAB) em solução contendo 50 mM Tris (pH 7,6); 10 mg DAB; 10 μί H2O2 (20%) na ausência de luz por aproximadamente 10 min. Após a revelação a membrana foi tirada com auxílio de uma pinça, parada a reação com água, seca sob papel toalha e a imagem foi digitalizada (Figura 3, parte B).

Ensaios de ELISA indireto usando a GDPase recombiante de L· major como antígeno

Nos experimentos de ELISA para análise da reatividade da proteína recombinante purificada foram utilizados 8 soros de cães previamente diagnosticados, sendo 3 soros positivos de cães infectados com Leishmania sp., 3 soros de animais negativos e 2 soros positivos de cães infectados com T. cruzi.

Para adsorção da rGDPase, placas de micro-diluição foram expostas a uma solução contendo 1,5, 3, 4,5 e 30 μg da proteínaGDPase recombinante purificada em tampão 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 9.6 e incubadas overnight a 4°C. Os sítios inespecíficos foram bloqueados incubando-se a placa com solução de bloqueio contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) em PBS por uma hora a 37°C. Posteriormente, a placa foi lavada 3 a 6 vezes com PBS-T (PBS com 0,05% Tween-20) para retirar o excesso de solução de bloqueio. Após as lavagens, o soro foi adicionado na diluição de 1:80. A reação contendo o soro foi incubada por 1 a 3 horas por 37°C. A lavagem prosseguiu da mesma maneira como descrito anteriormente. A reação com o anticorpo anti-IgG de cão conjugado a peroxidase na diluição 1:5000, foi incubada por 1 a 3 horas por 37°C. A placa foi novamente lavada conforme descrito acima. A reação da proteína GDPase recombinante com anticorpos foi evidenciada através de revelação com 5 a 10 mg/mL de o- fenilenodiamina (OPD) e 0,01% H2O2, em tampão citrato-fosfato (0,1 M ácido cítrico, 0,2 M fosfato de sódio pH 5,0), por 15 a 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 32 a 40 μl, de uma solução 2,5 M H2SO4. A intensidade da reação, relacionada à intensidade da coloração, foi determinada pela leitura de absorbância a 490nm (Labsystems iEMS). A análise dos dados foi feita no programa Excell (Figura 5) onde se pode ver o reconhecimento positivo com maior leitura de absorbância dos soros sabidamente positivos para leishmaniose em relação aos soros negativos e de cães com doença de Chagas.

A GDPase recombinante foi posteriormente usada em ensaio com maior número de amostras (Figura 6) mostrando um bom reconhecimento específico na maioria dos soros positivos e negativos utilizados no teste. Análises estatísticas destes dados mostraram Especificidade de 90,3%, Precisão de 72,1% e Sensibilidade de 44,1 %.

Estes resultados em conjunto mostram de forma clara a potencialidade de uso de proteínas da família E-NTPDase de Leishmania como antígenos para o diagnóstico da Leishmnaiose. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS

<120> "E-NTPDases RECOMBINANTES, USO NA PRODUÇÃO DE KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS NAS LEISHMANIOSES CAUSADAS POR ESPÉCIES DO GÊNERO Leishmania"

<130> 01 -2010 <160> 12

<210> 1

<211> 2160

<212> DNA

<213> Leishmaniamajor

<400> 1 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgccaat gactgacggc 60 cgcgtcccag gcggcaagtt acggaggagc atgagtcgcg tcgttcttgc cttcttcgcc 120 gctgtgcttt tcgtcgtctt tctcacggcg tacgaagtcg gcgttggcac tgccaacccg 180 cttcagtctc ggcacatgca gctcacgcag aacgccgtga agaagagtga ggaaaatcta 240 gtgaactgcc gcgaggtcaa cacggattta agaagtggtg gtgacgtcaa tgtcgcacgg 300 gcgatggcgg agatgaggcg gcagagagag gagctgatga acatcgtcgc gctggagcgt 360 gagcgtgtag tgtcggcgcg tagtctgctg caggtttgcg aggatgagct agcgagcgac 420 ctcagcgtac tcttcggtgt cgctgaccat aacttcactg cgcgcctccg gtcgttggag 480 aaaaagcgga aacacttgga gggtttgcac tcgatgctca acacggaccc gtttggtgca 540 gtgcagctgc gcagcagcag cgaaatccgc gcgctgcagg cggctctctt tcacgagatg 600 cgcgccagca agaagaaagc agaaaacggt gtggcgagcg gcgcggcgtg cgcgaagtct 660 tcggtcaagt actccgtcgt gttcgatatt ggcagcactg gaaatcgtgt tcatgtctac 720 aagtacagag tggcacctgc cacgcgtacc gctgccgcgg ccggcagtga gctcagcgac 780 atcgacctcg tcgaggagtt atttgagcta aatcacaaag cccttagcga gctcgagaat 840 tcggtgcagg atgcgccgga ggctttatgg gagctcttcg tgaaagccaa ggactttgta 900 ccggcggagc tgcacgcatg cacggcggcc gagttcaagg ctaccgcggg gctgcgcatg 960 ctggggatgg agaaggccaa cgaaattctt gccggcattc gcgcgcgcta ccgcaacgag 1020 acgttctggt tgcgcggcaa cgcatcagtt cgcatcttgg atgcctgcga ggagggccca 1080 atggcgtggc tgacagtaaa ctacttactg ggggcattct ccaggggtgc aacggcaacc 1140 gactcgacgg tggccgtcat cgatctcggc ggcggctcca cgcaaatcgt cttcgaaccc 1200 ggcgagagca ctttccacgg gatgcgcacc gatttccgct acgcggcaac cttgggcagc 1260 cggtcagtga gagcctacca gcacagctac gaaggctacg gcctgcacgc ggccaccaag 1320 aagctgcttt accacataca aggcaagagc caagagaagc cgggcggtgg caccgccacc 1380 aacacagcaa tgacgaccac cacgacagca ccggcaaacg gcggtgacga ggtcctgcct 1440 gtttggaagg ctctgagaaa cctgggtgca gacgggagaa gcgagcgagg cgacatcgtc 1500 accaagagag cgccgccgat gccaccgcca gacgcggagg cgatggaggc gttcccgtgc 1560 ttcgctgtcg gctacgaaga cccactaggg gtgaagaacg tcaagagaaa caatgccgag 1620 gagccggtta tgcccccgaa cttccaggct tgcgcgaacc ttttccgcga tcggttgctg 1680 aagccagtgg ggctgacatg tgaggcagtc aactgcggca tcgctggtgt catgcagcca 1740 ccgctgacca acttcaccgg tgaaatctac gcgttttcgt tcatctttga tctgctggtt 1800 ttggcgaaca gctccctggt gccagcgggg gctgctgtgt cgaaggaaaa gtttgaggtg 1860 aagctgccgg acctagcgaa gatcgcggag ggtcactgcg ccgccttctc cctcacccgt 1920 atcgccgagg cgaccgccaa ggggggcctc ggtagcctaa agccggagta cgagtgtatg 1980 tattactcct acgtgtacgc gcttctccgc tacggttacg aggtgccaga ggaccgcgtg 2040 ctgcacgtgg cgaagaagat ccgcggctac gagaccgcct ggtc.cc.tcgg cgcctcactc 2100 ctctctctta ccgtcgacaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga 2160

<210> 2 <211> 719 <212> PRT

<213> Leishmaniamajor <400> 2

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Pro 15 10 15

Met Thr Asp Gly Arg Val Pro Gly Gly Lys Leu Arg Arg Ser Met Ser 20 25 30

Arg Val Val Leu Ala Phe Phe Ala Ala Val Leu Phe Val Val Phe Leu

35 40 45

Thr Ala Tyr Glu Val Gly Val Gly Thr Ala Asn Pro Leu Gln Ser Arg 50 55 60

His Met Gln Leu Thr Gln Asn Ala Val Lys Lys Ser Glu Glu Asn Leu 65 70 75 80

Val Asn Cys Arg Glu Val Asn Thr Asp Leu Arg Ser Gly Gly Asp Val 85 90 95

Asn Val Ala Arg Ala Met Ala Glu Met Arg Arg Gln Arg Glu Glu Leu 100 105 110

Met Asn Ile Val Ala Leu Glu Arg Glu Arg Val Val Ser Ala Arg Ser 115 120 125

Leu Leu Gln Val Cys Glu Asp Glu Leu Ala Ser Asp Leu Ser Val Leu 130 135 140

Phe Gly Val Ala Asp His Asn Phe Thr Ala Arg Leu Arg Ser Leu Glu 145 150 155 160

Lys Lys Arg Lys His Leu Glu Gly Leu His Ser Met Leu Asn Thr Asp 165 170 175

Pro Phe Gly Ala Val Gln Leu Arg Ser Ser Ser Glu Ile Arg Ala Leu 180 185 190

Gln Ala Ala Leu Phe His Glu Met Arg Ala ser Lys Lys Lys Ala Glu 195 200 205

Asn Gly Val Ala Ser Gly Ala Ala Cys Ala Lys Ser Ser Val Lys Tyr 210 215 220

Ser Val Val Phe Asp Ile Gly Ser Thr Gly Asn Arg Val His Val Tyr 225 230 235 240

Lys Tyr Arg Val Ala Pro Ala Thr Arg Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ser 245 250 255

Glu Leu Ser Asp Ile Asp Leu Val Glu Glu Leu Phe Glu Leu Asn His 260 265 270

Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Asn Ser Val Gln Asp Ala Pro Glu Ala 275 280 285

Leu Trp Glu Leu Phe Val Lys Ala Lys Asp Phe Val Pro Ala Glu Leu 290 295 300

His Ala Cys Thr Ala Ala Glu Phe Lys Ala Thr Ala Gly Leu Arg Met 305 310 315 320

Leu Gly Met Glu Lys Ala Asn Glu Ile Leu Ala Gly Ile Arg Ala Arg 325 330 335

Tyr Arg Asn Glu Thr Phe Trp Leu Arg Gly Asn Ala Ser Val Arg Ile 340 345 350

Leu Asp Ala Cys Glu Glu Gly Pro Met Ala Trp Leu Thr Val Asn Tyr 355 360 365

Leu Leu Gly Ala Phe Ser Arg Gly Ala Thr Ala Thr Asp Ser Thr Val 370 375 380

Ala Val Ile Asp Leu Gly Gly Gly Ser Thr Gln Ile Val Phe Glu Pro 385 390 395 400

Gly Glu Ser Thr Phe His Gly Met Arg Thr Asp Phe Arg Tyr Ala Ala 405 410 415

Thr Leu Gly Ser Arg Ser Val Arg Ala Tyr Gln His Ser Tyr Glu Gly 420 425 430

Tyr Gly Leu His Ala Ala Thr Lys Lys Leu Leu Tyr His Ile Gln Gly 435 440 445

Lys Ser Gln Glu Lys Pro Gly Gly Gly Thr Ala Thr Asn Thr Ala Met 450 455 460

Thr Thr Thr Thr Thr Ala Pro Ala Asn Gly Gly Asp Glu Val Leu Pro 465 470 475 480

Val Trp Lys Ala Leu Arg Asn Leu Gly Ala Asp Gly Arg Ser Glu Arg 485 490 495

Gly Asp Ile Val Thr Lys Arg Ala Pro Pro Mer Pro Pro Pro Asp Ala 500 505 510

Glu Ala Met Glu Ala Phe Pro Cys Phe Ala Val Gly Tyr Glu Asp Pro 515 520 525

Leu Gly Val Lys Asn Val Lys Arg Asn Asn Ala Glu Glu Pro Val Met 530 535 540 Pro Pro 545

Lys Pro

Val Met

Ser Phe

Ala Gly 610

Leu Ala 625

Ile Ala

Tyr Glu

Tyr Glu

Gly Tyr 690

Val Asp

705

Asn Phe

Val Gly

Gln Pro 580

Ile Phe 595

Ala Ala

Lys Ile

Glu Ala

Cys Met 660

Val Pro 675

Glu Thr

Lys Leu

Gln Ala 550

Leu Thr 565

Pro Leu

Asp Leu

Val Ser

Ala Glu 630

Thr Ala 645

Tyr Tyr

Glu Asp

Ala Trp

Ala Ala 710

Cys Ala

Cys Glu

Thr Asn

Leu Val 600

Lys Glu 615

Gly His

Lys Gly

Ser Tyr

Arg Val 680

Ser Leu 695

Ala Leu

Asn Leu

Ala Val 570

Phe Thr 585

Lcu Ala Lys Phe

Cys Ala

Gly Leu 650

Val Tyr 665

Leu His Gly Ala Glu His

Phe Arg 555

Asn Cys

Gly Glu

Asn Ser

Glu Val 620

Ala Phe 635

Gly Ser

Ala Leu

Val Ala

Ser Leu 700

His His

715

Asp Arg

Gly Ile

Ile Tyr 590

Ser Leu 605

Lys Leu

Ser Leu

Leu Lys

Leu Arg 670

Lys Lys 685

Leu Ser His His

Leu Leu 560

Ala Gly 575

Ala Phe

Val Pro

Pro Asp

Thr Arg 640

Pro Glu 655

Tyr Gly Ile Arg Leu Thr His

<210> 3

<211> 2166

<212> DNA

<213> Leishmaniabraziliensis

<400> 3

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ttcacagctg gcaagccgct gagaggcatg atgcttgttg cctttgtcat cactgcgtac cagtcccgtc acatacagct cgcgcagaac ggctgccgcg aggccaatgc gaatttaaag atcgcggaga tggcacggca gaaagcggag cgtgtcgtgt cggcgcgtag tttgttgcag cgtacactct tcggcaccgc ccaccgcaac agacgggctc atctgaagtc cgagcacgag

ggtcgcggat ccatggcagt ggttggcggc 60

ggccgcatcg tccttggcct cttcgccgtc 120

caagtcggcg ttagcaccgc caacccacgt 180

gccgtggcga agagcgaggc aatgctgact 240

aacagcggta gtgtcaaggg tgcacaagcg 300

ctgacgagta ctgtcgcact ggagcgtgag 360

gcgtgcgagg atgggctggc aagcgaacac 420

accacggcgc acctcctgtg gttgaaacag 480

aagctcaccg agggtccact cggtgtagtc 540 gagccgcgcc gcagcagcgg catccgcgca cctagcactg gtttagctgg aaacggtgtg gccaagtact ccgttgtgtt cgatattggc tacagggtga accctctcac gcagatctct gacctcgtcg gggagctgtt cgagctgaat gtgcaggatg ccccggaagc cttgtgggag gcagagttgc acgcatgcac accaatcgag gggttggaga aagccacaga gattcttgct ttctggctgc gcggcagcgc gccagtccgc gcgtggctga cggtgaactt tttactaggg tcgacggcgg ctatcattga catcggtggc gaagacacgt tctacaaaat gcgcgcagac tcggtgaaag tgtatcagca cagctacgaa ctgctttttc atattcaagg caagcgccaa gccacgacga cggcacggac cagcggcgat cgcaacgtga gcgccaatga cagcaaagac gcgccgccga aaactctacc gtggctacag tgcttcgctg tcggctacga ggaccagctc ggagaacccg ctaggcaccc tgacttccag ctgaaaccgg tggggctgac atgcgaggag ccgccgctgg ccaacttcac cggtgacatc gccatggcga acaactctct agcgccagtg gtgaagctgc ctgacctggc aaagattggg cggattgccg aggcgaccgc aaagggcggc atgtattact cctacacgta cgcgctgctc gtgctgcacg tggcaaagaa gatcagcggc ctcatctctg tcacctaagt cgacaagctt cactga

ctgcaggcgg ctctccttca agaaatacac 600 gagaaccgca aggcgtgcgt ggacgctgtg 660 agcactggca atcgtgtcca tgtctacaag 720 gcctcagcgc ctgatgagct cagcaaaatc 780 tacaaagccc ttagtgagct caacaatccg 840 cttttcgcga aggccaagaa cttcgtgccg 900 ttcaaggcta ctgcgggact gcgcatgctg 960 gagattcgtg ctcgctaccg caaggaaacg 1020 atcttggatt cccacgagga gggcctgatg 1080 acatttgcca ggaacactga ggcaacagcc 1140 ggctccacgc agatcgtctt cgagcctggt 1200 gtgcgtggct cggcaacgtt gggcggccgg 1260 ggctacggtc tgcacgcagc caccaaggcg 1320 gagaggccgg gcggcggctc cgctacccgc 1380 gacagcaccc catccgtcgg gaatggtgtc 1440 gaagaagacg aaaacatgat caccgacaca 1500 ttggatacgg aggcggtgga cgcattcccc 1560 ggggtgcgga acactaagag aaacgacgcc 1620 gcttgcgcga accttttccg cgaccggttg 1680 gtcaactgcg gcgtcgcggg tgtcttccag 1740 tacgcgtttt catttctttt tgatcttctg 1800 ggggctgcag tatcgaacga taagttcgag 1860 gagcgtcact gcgcggcctt ctccctcacc 1920 ctcggtagtc tgaagccaga gtacgagtgc 1980 cgatatgggt acgaggtgcc ggagggccgc 2040 tacgagaccg cctggccctt gggtgcctca 2100 gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac 2160

2166

<210> 4 <211> 720 <212> PRT

<213> Leishmania braziliensis <400> 4

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Ala 1 5 10 15

Val Val Gly Gly Phe Thr Ala Gly Lys Pro Leu Arg Gly Met Gly Arg 20 25 30

Ile Val Leu Gly Leu Phe Ala Val Met Leu Val Ala Phe Val Ile Thr 35 40 45

Ala Tyr Gln Val Gly Val Ser Thr Ala Asn Pro Arg Gln Ser Arg His 50 55 60

Ile Gln Leu Ala Gln Asn Ala Val Ala Lys Ser Glu Ala Met Leu Thr 65 70 75 80

Gly Cys Arg Glu Ala Asn Ala Asn Leu Lys Asn Ser Gly Ser Val Lys 85 90 95

Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Met Ala Arg Gln Lys Ala Glu Leu Thr 100 105 110

Ser Thr Val Ala Leu Glu Arg Glu Arg Val Val Ser Ala Arg Ser Leu 115 120 125

Leu Gln Ala Cys Glu Asp Gly Leu Ala Ser Glu His Arg Thr Leu Phe 130 135 140

Gly Thr Ala His Arg Asn Thr Thr Ala His Leu Leu Trp Leu Lys Gln 145 150 155 160

Arg Arg Ala His Leu Lys Ser Glu His Glu Lys Leu Thr Glu Gly Pro 165 170 175

Leu Gly Val Val Glu Pro Arg Arg Ser Ser Gly Ile Arg Ala Leu Gln 180 185 190

Ala Ala Leu Leu Gln Glu Ile His Pro Ser Thr Gly Leu Ala Gly Asn 195 200 205

Gly Val Glu Asn Arg Lys Ala Cys Val Asp Ala Val Ala Lys Tyr Ser 210 215 220

Val Val Phe Asp Ile Gly Ser Thr Gly Asn Arg Val His Val Tyr Lys 225 230 235 240

Tyr Arg Val Asn Pro Leu Thr Gln Ile Ser Ala Ser Ala Pro Asp Glu 245 250 255

Leu Ser Lys Ile Asp Leu Val Gly Glu Leu Phe Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270

Ala Leu Ser Glu Leu Asn Asn Pro Val Gln Asp Ala Pro Glu Ala Leu 275 280 285

Trp Glu Leu Phe Ala Lys Ala Lys Asn Phe Val Pro Ala Glu Leu His 290 295 300 Ala Cys Thr Pro Ile Glu Phe Lys Ala Thr Ala Gly Leu Arg Met Leu 305 310 315 320

Gly Leu Glu Lys Ala Thr Glu Ile Leu Ala Glu Ile Arg Ala Arg Tyr 325 330 335

Arg Lys Glu Thr Phe Trp Leu Arg Gly Ser Ala Pro Val Arg Ile Leu 340 345 350

Asp Ser His Glu Glu Gly Leu Met Ala Trp Leu Thr Val Asn Phe Leu 355 360 365

Leu Gly Thr Phe Ala Arg Asn Thr Glu Ala Thr Ala Ser Thr Ala Ala 370 375 380

Ile Ile Asp Ile Gly Gly Gly Ser Thr Gln Ile Val Phe Glu Pro Gly 385 390 395 400

Glu Asp Thr Phe Tyr Lys Met Arg Ala Asp Val Arg Gly Ser Ala Thr 405 410 415

Leu Gly Gly Arg Ser Val Lys Val Tyr Gln His Ser Tyr Glu Gly Thr 420 425 430

Gly Leu His Ala Ala Thr Lys Ala Leu Leu Phe His Ile Gln Gly Lys 435 440 445

Arg Gln Glu Arg Pro Gly Gly Gly Ser Ala Thr Arg Ala Thr Thr Thr 450 455 460

Ala Arg Thr Ser Gly Asp Asp Ser Thr Pro Ser Val Gly Asn Gly Val 465 470 475 480

Arg Asn Val Ser Ala Asn Asp Ser Lys Asp Glu Glu Asp Glu Asn Met 485 490 495

Ile Thr Asp Thr Ala Pro Pro Lys Thr Leu Pro Trp Leu Gln Leu Asp 500 505 510

Thr Glu Ala Val Asp Ala Phe Pro Cys Phe Ala Val Gly Tyr Glu Asp 515 520 525

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Arg His Pro Asp Phe Gln Ala Cys Ala Asn Leu Phe Arg Asp Arg Leu 545 550 555 560

Leu Ile Pro Val Gly Leu Thr Cys Glu Glu Val Asn Cys Gly Val Ala 565 570 575

Gly Val Phe Gln Pro Pro Leu Ala Asn Phe Thr Gly Asp Ile Tyr Ala 580 585 590

Phe Ser Phe Leu Phe Asp Leu Leu Ala Met Ala Asn Asn Ser Leu Ala 595 600 605

Pro Val Gly Ala Ala Val Ser Asn Asp Lys Phe Glu Val Lys Leu Pro 610 615 620 Asp Leu Ala Lys Ile Gly Glu Arg His Cys Ala Ala Phe Ser Leu Thr 625 630 635 640

Arg Ile Ala Glu Ala Thr Ala Lys Gly Gly Leu Gly Ser Leu Lys Pro 645 650 655

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Gly Tyr Glu Val Pro Glu Gly Arg Val Leu His Val Ala Lys Lys Ile 675 680 685

Ser Gly Tyr Glu Thr Ala Trp Pro Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ser Val 690 695 700

Thr Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 705 710 715 720

<210> 5

<211> 2124

<212> DNA

<213> Leishmaniainfantum

<400> 5

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgagtcg cgtctttgtt 60 gccttcttcg ctgctgtgct tttcgtcgtc tttctcaccg cgtacgaagt cggcgttggc 120 accgccaacc cgcttcagtc gcggcacatg cagctcacgc agaacgcagt gaagaagagt 180 gaggcaaatc tagtgaactg ccgcgaggtc aacgcggatt taaagagcgg tggtggcgtc 240 aatgccgcac aggcgattgc ggagatgagg cggcagagag aggagctgat gaacatcgtc 300 gcgctggagc gtgagcgtgt agtgtcggcg cgtagtctgc tgcaggtttg cgaggatgag 360 ctagccagcg acctcagtgt actcttcggt gtcgccgacc acaacttcac tgcgcgcatc 420 cggtcgttgg aggaaaagcg gaaacatttg gagggtttgc actcgatgct caacacgacc 480 ccgtttggtg cagtggagct gcgccgcagc agcgaaatcc gtgcactgca ggcggctctc 540 tttcacgaga tgcgcgccag caagaagaaa gcagaaaacg gtgtggcgaa cggcgaagcg 600 tgcacgaaga cttcggacaa gtactccgtc gtgttcgaca tcggcagcac tggaaatcgt 660 gtccatgtct acaagtacag agtggcccct gccacgcata ccgctgctgc ggccggcagt 720 gagctcagcg acatcgacct cgtcgaggag ttgtttgagc taaatcacaa agcccttagc 780 gagctcgata atccggtgca ggatgcgccg gaagccttat gggagctctt catgaaagcc 840 aagtactttg taccggcgga gctgcacgca tgcacggcag tcgagttcaa ggctaccgcg 900 ggactgcgca tgctggggat ggagaaggcc accgaaattc ttgacgggat tcgcgcgcgc 960 taccgcaacg aaacgttctg gttgcgcggc aatgcaccgg ttcgcatctt ggatgcctgc 1020 gaggagggcc caatggcgtg gctcacggta aactacttac tgggggtatt ctccaggggt 1080 acaaaggcaa ccgcctcgac ggtggccgtc atcgacctcg gaggcggctc cacgcagatc 1140 gtcttcgaac ccggcgagag cgcgttccac gggatgcgca ccgatttgcg ctactcggca 1200 accttgggca gccggtctgt gagtgcctac caacacagct acgaaggcta cggcctgcac 1260 gcggccacca aggagc.tgct tttccacatt caaggcaaga gccaagagaa gccgggaggc, 1320 ggtaccacca ccagcacagc aacgacgacc accacgacaa caccggcaaa cagcggcgac 1380 aaggctctgt ctgtttggaa cgttctggga aacctgggtg cagacgggag cagcgagcga 1440 gacgacatcg tcaccaagag agcgccgccg atgccaccac cgccactgcc ggacgcggag 1500 gcggtggagg cgttcccctg cttcgctgtc ggctacgaag acccgctagg ggtgaagaac 1560 atcaagaaaa acaataccgg ggagccggct atgcccccga acttccaggc ttgcgcgaac 1620 cttttccgcg atcggctgct aaagccagtg gggctgacat gtgaggcggc caactgcggc 1680 atcgctggtg tcatgcagcc accgctgacc aacttcaccg gggaaatcta cgtgttttcg 1740 ttcatctttg atctgctggc cttggcgaac agctccctgg tgccagcggg ggctgccgtg 1800 tcaagggaaa agtttgaggt gaagctgccg gacctagcga cgattgcgga gggtcactgc 1860 gccgccttct ccctcacccg tatcgccgag gcgaccgcca aggagggcct cggtagcctg 1920 aagccggagt acgagtgcat gtattactcc tacgtgtacg cgcttctccg ctacgggtac 1980 gaggtgccag aggatcgcgt gctgcacgtg gtgaagaaga tccgcggcta cgagaccgcc 2040 tggtccctcg gcgcctcact cctctctctt acctaagtcg acaagcttgc ggccgcactc 2100 gagcaccacc accaccacca ctga 2124

<210> 6 <211> 706 <212> PRT

<213> Leishmania infantum <400> 6

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Arg Val Phe Val Ala Phe Phe Ala Ala Val Leu Phe Val Val Phe Leu 20 25 30

Thr Ala Tyr Glu Val Gly Val Gly Thr Ala Asn Pro Leu Gln Ser Arg 35 40 45

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Val Asn Cys Arg Glu Val Asn Ala Asp Leu Lys Ser Gly Gly Gly Val 65 70 75 80 Asn Ala

Met Asn

Leu Leu

Phe Gly 130

Glu Lys 145

Pro Phe

Gln Ala

Asn Gly

Ser Val 210

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Glu Leu Lys Ala

Leu Trp

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Tyr Arg

Leu Asp

Leu Leu

Ala Val 370

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Ala Gln

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Gln Val 115

Val Ala

Arg Lys

Gly Ala

Ala Leu 180

Val Ala 195

Val Phe

Arg Val

Ser Asp

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Cys Thr

Met Glu

Asn Glu

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Gly Val 355

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Ala Ile 85

Ala Leu

Cys Glu

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His Leu 150

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Asn Gly

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Glu Leu

Phe Met

Ala Val

Lys Ala 310

Thr Phe 325

Glu Glu

Phe Ser

Leu Gly

Phe His 390

Ala Glu

Glu Arg

Asp Glu 120

Asp Phe 135

Glu Gly

Leu Arg

Glu Met

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Gly Ser 215

Ala Thr

Leu Val

Asp Asn

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Thr Glu

Trp Leu

Gly Pro

Arg Gly 360

Gly Gly 375

Gly Met

Met Arg 90

Glu Arg 105

Leu Ala

Thr Ala

Leu His

Arg Ser 170

Arg Ala 185

Cys Thr

Thr Gly

His Thr

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Lys Tyr

Lys Ala

Ile Leu

Arg Gly 330

Met Ala 345

Thr Lys Ser Thr Arg Thr

Arg Gln

Val Val

Ser Asp

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Ser Met 155

Ser Glu

Ser Lys

Lys Thr

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Ala Ala 235

Leu Phe

Gln Asp

Phe Val

Thr Ala 300

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Asn Ala

Trp Leu

Ala Thr

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Asp Leu

395

Arg Glu

Ser Ala 110

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Arg Ser Leu Asn

Ile Arg

Lys Lys 190

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Val His

Ala Ala

Glu Leu

Ala Pro 270

Pro Ala 285

Gly Leu

Ile Arg

Pro Val

Thr Val 350

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Val Phe Arg Tyr

Glu Leu 95

Arg Ser

Val Leu

Leu Glu

Thr Thr 160

Ala Leu 175

Ala Glu

Lys Tyr

Val Tyr

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Glu Ala

Glu Leu

Arg Met

Ala Arg 320

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Asn Tyr

Thr Val

Glu Pro

Ser Ala 400 Thr Leu

Tyr Gly

Lys Ser

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Asp Asp

Pro Asp

Glu Asp

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Tyr Val

Leu Val

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Lys Pro

Arg Tyr

Lys Ile

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Gly Ser

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Asn Val

Ile Val

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Met Pro

Leu Lys

Gly Val

Phe Ser 580

Pro Ala 595

Asp Leu

Arg Ile

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Arg Ser 405

Ala Ala

Lys Pro

Thr Thr

Leu Gly 470

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Ala Val

Gly Val

Pro Asn

Pro Val 550

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Phe Ile

Gly Ala

Ala Thr

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Glu Val Tyr Glu Asp Lys

Val Ser

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Arg Ala

Glu Ala

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Gly Leu

Pro Pro

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Ala Thr

Met Tyr

Pro Glu

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Asn Ser

Gly Ala

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Ala Lys

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Ala Ala

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Leu Phe

Thr Thr

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Asp Gly 475

Met Pro

Cys Phe

Lys Asn

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Asn Phe

Ala Leu

Glu Lys

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Tyr Val

Val Leu

Leu Gly

Leu Glu 700

Ser Tyr

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Lys Ala

Ser Ser

Pro Pro

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Leu Phe

Ala Asn

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Ala Ala

Leu Gly

Tyr Ala

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His His

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Ala Thr

Leu Ser

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Gly Tyr

Gly Glu

Arg Asp

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Val Lys

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<211> 1362

<212> DNA

<213> Leishmania major

<400> 7

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<210> 8

<211> 452

<212> PRT

<213> Leishmania major <400> 8

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Pro Tyr Ser Ser Val Arg Arg Met Thr Gln Gln Ser Lys Arg Leu Arg 20 25 30

Val Ala Ser Thr Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Ile Phe Gly Phe Leu 35 40 45

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His Val Phe Gln Tyr Glu Arg Gly Arg Thr Gly Phe Val Leu Leu Arg 85 90 95

Glu Arg Phe Lys Arg Ala Glu Pro Asp Leu Ser Ser Phe Ala Thr Asp 100 105 110

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Gly Ala Ser Ile Ile Ser Gly Ala Gln Glu Gly Val Tyr Gly Trp Leu 180 185 190

Thr Val Asn Tyr Leu Leu Asp Arg Leu Asp Thr Asp Val Ala Thr Val 195 200 205

Ala Thr Ile Asp Met Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Val Phe Glu Thr 210 215 220

Thr Pro Thr Ser Gly Glu Trp Leu Pro Phe Asn Tyr Ala Tyr Gln Leu 225 230 235 240

Arg Thr Pro Lys Arg Thr Ile Ala Met Tyr Gln His Ser Tyr Leu Gly 245 250 255

Leu Gly Met Asn Glu Ala Lys Lys Arg Leu Met Thr Leu Phe Ala Glu 260 265 270

Ala Asn Gly Thr Leu Ser Phe Pro Cys Phe Pro Arg Gly Tyr Thr Lys 275 280 285

Arg Val Asn Gly Val Glu Leu Arg Asn Ser Asp Ala Thr Asp Phe Asn 290 295 300

Ala Cys Ala Gly Leu Phe Arg Glu His Val Ile Thr Thr Ser Thr Cys 305 310 315 320 Lys Phe Asp Ala

Ser Arg Arg His 340

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Ala Pro Glu Glu 385

Leu Thr Tyr Gly

Asn Arg Ile Glu 420

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Pro Ile Tyr Ala

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Leu Gly Leu Ser 405

Gly Met Ala Val

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Gly Val Pro Gln 330

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Gln Val Tyr Val

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Leu Ala Ala Ala

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Arg Arg Thr Thr

Met Tyr Ser Phe 400

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<210> 9

<211> 1368

<212> DNA

<213> Leishmania braziliensis

<400> 9

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<210> 10 <211> 454 <212> PRT

<213> Leishmania braziliensis <400> 10

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Arg 1 5 10 15

Pro Tyr Ser Ser Val Arg Arg Met Thr Gln Gln Ser Glu Arg Leu Arg 20 25 30

Val Ile Gly Val Leu Val Leu Ser Arg Phe Val Leu Phe Gly Phe Val 35 40 45

Ile Tyr Ser Glu Ser Pro Trp Phe Ser Pro Cys Asn Ser Pro Tyr Ser 50 55 60

Asn Val Tyr Asp Ile Val Ile Asp Ala Gly Ser Thr Gly Ser Arg Val 65 70 75 80

His Val Phe Gln Tyr Glu Arg Ser Ser Thr Gly Val Ile Leu Leu Arg 85 90 95

Glu Arg Phe Lys Arg Ile Glu Pro Gly Leu Ser Ser Phe Ala Thr Asp 100 105 110

Gln Glu Gly Ala Lys Gln Ser Leu Ala Gly Leu Leu Arg Phe Ala Glu 115 120 125

Lys Ala Val Pro Arg Ser Tyr Gln Arg Cys Thr Ser Val Thr Leu Lys 130 135 140

Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu Ala Asp Gln Gln Val Leu 145 150 155 160

Leu Asp Ala Ala Gln Gln Thr Leu Lys Ala Phe Pro Phe Gln Ser Arg 165 170 175 Gly Ala Ser Ile Val Ser Gly Ala Gln Glu Gly Val Tyr Gly Trp Leu 180 185 190

Thr Val Asn Tyr Leu Leu Asn Arg Leu Asp Lys Glu Gly Ala Thr Val 195 200 205

Ala Thr Ile Asp Met Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Val Phe Glu Thr 210 215 220

Lys Phe Thr Ser Gly Glu Trp Leu Pro Phe Asn Tyr Ala His Gln Leu 225 230 235 240

Arg Thr Pro Lys Arg Thr Ile Ala Met Tyr Gln His Ser Tyr Leu Gly 245 250 255

Leu Gly Leu Asn Glu Ala Lys Lys Thr Leu Met Thr Leu Phe Ala Lys 260 265 270

Val Asn Gly Thr Ser Pro Phe Ser Cys Phe Pro Arg Arg His Thr Glu 275 280 285

His Leu Asn Gly Val Glu Leu Arg Asn Gly Asp Ser Thr Asp Phe Asp 290 295 300

Val Cys Val Asn Leu Phe Arg Glu His Val Ile Thr Lys Pro Ile Cys 305 310 315 320

Arg Phe Asp Ala Cys Gly Ala Arg Gly Val Pro Gln Pro Pro Leu Pro 325 330 335

Ser Lys Gln His Pro Ile Tyr Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Asp Arg Leu 340 345 350

Tyr His Phe Arg Ser Glu Gly Phe Pro Val Tyr Val Ser Ser Tyr Lys 355 360 365

Glu Leu Gly Arg Glu Val Cys Gln Arg Glu Ser Ala Asp His Thr Thr 370 375 380

Thr Pro Lys Glu Thr Thr Cys Met Glu Leu Ala Tyr Leu Tyr Ser Phe 385 390 395 400

Leu Thr His Gly Leu Gly Leu Ser Asp Asp Arg Thr Leu Glu Val Pro 405 410 415

Asn Arg Ile Glu Gly Ile Ala Val Ser Trp Ser Leu Gly Cys Ser Leu 420 425 430

Ser Phe Val Leu Lye Met Glu Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 435 440 445

His His His His His His 450

<210> 11

<211> 1368

<212> DNA

<213> Leishmaniainfantum <400> 11 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgcgacc gtactcctcg 60 gtgcggcgca tgactcaaca gtcgaagcga ctgcgcatcg ccggcaccct tgtgcttagc 120 gcgcttgtta tcttcggttt cctcgtttac tatcaaagcc ctctgctctc cccatgtgac 180 tcggcgtacg cgaatgtata cgacgtcgtc atcgacgccg gcagcactgg ctcacgtgtg 240 catgtgttcc aatacgagcg cggccgcacc ggtctcgtac ttctgagaga gcgcttcaaa 300 cgagtagagc cgggtctatc ctcttttgcc accgacccag acggcgccaa ggagtcgctt 360 gcggggctgc tgcgcttcgc ggataaggtg gtcccgcaaa gctaccagaa gtgcaccttc 420 gtcaccctca aggccaccgc cggccttcgg ctcctacctg agtccgtcca gcaggtgctg 480 ctggacgctg cccagcacac actcaacgca tctccatttc agtctcgtgg tgcctccatc 540 atctctggcg ctcaagaggg cgtctacggg tggctgacgg tgaactacct gctgaacagg 600 ctcgacacgg acgttgccac cgtcgcgacc atcgacatgg gaggtgcctc gacacaggtc 660 gtcttcgaga cgacgcccac gtctggagaa tggctgccct tcaactatgc ccaccagctg 720 cgcacaccaa agcgcacgat caccatgtat cagcacagct atctcggcct tgggatgaac 780 gaggcgaaga agaagcttat gatgtcattc gccgaagcga acgggacgtc gtctttcccg 840 tgcttcccga gagggtatgc gaagcgcctg aacgatgtgg aacttcgaaa cagtgacgcc 900 acggactttg acgcgtgtgc aggactattt cgcgaacatg tcataacaaa gacgacctgc 960 aagtttgatg cctgtggcgc ccgcggcgtg ccgcagccgc tgtttccgtc aaggcggcat 1020 ctcatctacg ccttctccta cttttacgac cgactctacc acttcagcaa ggaggggagc 1080 ccggtctacg tctcgtcgta caaggaggtc gggcaagagg tgtgccaccg ggaatctgcg 1140 aggcggacca ccgcccctga ggaaacggcc tgcatggagc tggcgtacat gtacagcttc 1200 ttgacatacg gcctagggct tagtgacgcc acggctctca cggtgcccaa ccgcatcgag 1260 ggtatggcgg tttcctggtc tcttggctcc tctctctcct tcctgctcaa gatggaatga 1320 gtcgacaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactga 1368

<210> 12 <211> 454 <212> PRT

<213> Leishmaniainfantum <400> 12

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Arg 1 5 10 15 Pro Tyr Ser Ser Val Arg Arg Met Thr Gln Gln Ser Lys Arg Leu Arg 20 25 30

Ile Ala Gly Thr Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Ile Phe Gly Phe Leu 35 40 45

Val Tyr Tyr Gln Ser Pro Leu Leu Ser Pro Cys Asp Ser Ala Tyr Ala 50 55 60

Asn Val Tyr Asp Val Val Ile Asp Ala Gly Ser Thr Gly Ser Arg Val 65 70 75 80

His Val Phe Gln Tyr Glu Arg Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu Leu Arg 85 90 95

Glu Arg Phe Lys Arg Val Glu Pro Gly Leu Ser Ser Phe Ala Thr Asp 100 105 110

Pro Asp Gly Ala Lys Glu Ser Leu Ala Gly Leu Leu Arg Phe Ala Asp 115 120 125

Lys Val Val Pro Gln Ser Tyr Gln Lys Cys Thr Phe Val Thr Leu Lys 130 135 140

Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu Ser Val Gln Gln Val Leu 145 150 155 160

Leu Asp Ala Ala Gln His Thr Leu Asn Ala Ser Pro Phe Gln Ser Arg 165 170 175

Gly Ala Ser Ile Ile Ser Gly Ala Gln Glu Gly Val Tyr Gly Trp Leu 180 185 190

Thr Val Asn Tyr Leu Leu Asn Arg Leu Asp Thr Asp Val Ala Thr Val 195 200 205

Ala Thr Ile Asp Met Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Val Phe Glu Thr 210 215 220

Thr Pro Thr Ser Gly Glu Trp Leu Pro Phe Asn Tyr Ala His Gln Leu 225 230 235 240

Arg Thr Pro Lys Arg Thr Ile Thr Met Tyr Gln His Ser Tyr Leu Gly 245 250 255

Leu Gly Met Asn Glu Ala Lys Lys Lys Leu Met Met Ser Phe Ala Glu 260 265 270

Ala Asn Gly Thr Ser Ser Phe Pro Cys Phe Pro Arg Gly Tyr Ala Lys 275 280 285

Arg Leu Asn Asp Val Glu Leu Arg Asn Ser Asp Ala Thr Asp Phe Asp 290 295 300

Ala Cys Ala Gly Leu Phe Arg Glu His Val Ile Thr Lys Thr Thr Cys 305 310 315 320

Lys Phe Asp Ala Cys Gly Ala Arg Gly Val Pro Gln Pro Leu Phe Pro 325 330 335

Ser Arg Arg His Leu Ile Tyr Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Asp Arg Leu 340

345

350

Tyr His Phe Ser Lys Glu Gly Ser Pro Val Tyr Val Ser Ser Tyr Lys 355 360 365

Glu Val Gly Gln Glu Val Cys His Arg Glu Ser Ala Arg Arg Thr Thr 370 375 380

Ala Pro Glu Glu Thr Ala Cys Met Glu Leu Arg Tyr Met Tyr Ser Phe 385 390 395 400

Leu Thr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser Asp Ala Thr Ala Leu Thr Val Pro 405 410 415

Asn Arg Ile Glu Gly Met Ala Val Ser Trp Ser Leu Gly Ser Ser Leu 420 425 430

Ser Phe Leu Leu Lys Met Glu Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 435 440 445

His His 450

His His His His

Claims (8)

1. "E-NTPDases RECOMBINANTES DO GÊNERO Leishmanian caracterizadas por serem homólogas as proteínas naturais, obtidas a partir da seqüência nucleotídica dos genes codificantes destas proteínas, incluindo as SEQ. ID. N0 1, SEQ. ID. N0 2, SEQ. ID. N0 3, SEQ. ID. N0 4, SEQ. ID. N0 5, SEQ. ID. N0 6, SEQ. ID. N0 7, SEQ. ID. N0 8, SEQ. ID. N0 9, SEQ. ID. N0 10, SEQ. ID. N0 11 e SEQ. ID. N0 12, e quaisquer variação distinta das referidas seqüências, desde que destinadas a conservarem as suas propriedades antigênicas;

2. "E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania major", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 1 e SEQ. ID. N0 2, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania major, apresentando uma identidade de aminoácidos de 93,74% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 719 aminoácidos;

3. "E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania braziliensis", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 3 e SEQ. ID. N0 4, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania braziliensis, apresentando uma identidade de aminoácidos de 65,75% em relação à proteína GDPase recombinante da Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 720 aminoácidos;

4. "E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania infantum", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 5 e SEQ. ID. N0 6, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania infantum, apresentando uma identidade de aminoácidos de 84,49% em relação à proteína GDPase recombinante da Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 706 aminoácidos;

5. "NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania major", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 7 e SEQ. ID. N0 8, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania major, apresentando uma identidade de aminoácidos de 23,09% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 39 pares de base, possuindo 452 aminoácidos;

6. "NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania braziliensis", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 9 e SEQ. ID. N0 10, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania braziliensis, apresentando uma identidade de aminoácidos de 23,09% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 454 aminoácidos;

7. "NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania infantum", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N0 11 e SEQ. ID. N0 12, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania infantum, apresentando uma identidade de aminoácidos de 22,13% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 454 aminoácidos;

8. "USO DAS E-NTPDases RECOMBINANTES DEFINmAS NAS REIVINDICAÇÕES 1 a 7", caracterizado por ser utilizado na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero Leishmaniay em compostos vacinais, em desenvolvimento de anticorpos monoclonais, em marcadores de prognóstico, no desenho racional de drogas inibidoras das E-NTPDases que possam ser usadas na quimioterapia das leishmanioses.