BRPI1003744B1 - E-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania - Google Patents
E-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania Download PDFInfo
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Abstract
e-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania. esta invenção refere-se às proteínas da família e-ntpdases recombinantes que podem ser usadas como antígenos em kits de diagnósticos das leishmanioses animais e humanas. as proteínas da família das e-ntpdases recombinantes obtidas poderão ser empregadas na produção de kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, usando testes do tipo imunológicos. estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos, em programas de controle de leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos e vacinais, no desenho racional de quimioterápicos para o tratamento das leishmanioses e no desenvolvimento de anticorpos monoclonais a serem usados no diagnóstico, prognóstico ou terapia das leishmanioses.
Description
1. As proteínas da família das E-NTPDases recombinantes obtidas, objeto de pedido de patente, serão empregadas na produção de Kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, testes estes do tipo imunológicos. Estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos em programas de controle epidemiológico a campo das leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. Estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos, vacinais, na produção de anticorpos monoclonais e no desenho racional de drogas para a quimioterapia das leishmanioses.
2. Sabe-se que as Leishmanioses compreendem um conjunto de enfermidades cujos agentes etiológicos são espécies do gênero Leishmania, que são protistas pertencentes à família Trypanosomatidae. A transmissão se dá através da picada do flebotomío fêmea. Dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção e do tipo de hospedeiro, a leishmaniose pode ser dividida classicamente em duas formas clínicas: visceral e tegumentar ou cutânea. A forma visceral se não tratada costuma ser fatal, já as formas cutâneas, apesar de raramente evoluírem para a fatalidade são mutilantes e desagradáveis especialmente quando da existência de múltiplas lesões. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) (WHO, 2009) a leishmaniose é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem, uma variedade de animais silvestres e domésticos. É uma doença endêmica em 88 países distribuídos em quatro continentes. Mais de 90% dos casos de Leishmaniose cutânea ocorrem no Irã, Afeganistão, Síria, Arábia Saudita, Brasil e Peru e mais de 90% dos casos da forma visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, Índia e Sudão. Ainda segundo a OMS (WHO, 2009) o número de casos de leishmaniose cutânea (LC) vem crescendo no Brasil nos últimos anos (1988: 21.800 casos; 1999: 30.550 casos; 2000: 35.000 casos). Fato este relacionado ao desenvolvimento econômico e à mudança de hábitos e ambientais que expõem mais a população aos vetores da doença. Um dos principais reservatórios atualmente descrito é o cão, que por sua proximidade com o homem participa ativamente do processo de manutenção da leishmaniose.
3. A leishmaniose canina tem se tornado foco de vários estudos visto a importância do cão como animal doméstico e a sua relevância como reservatório da doença. Porém o cão não é simplesmente um reservatório de parasitos, pois o mesmo também apresenta a patologia associada à infecção tanto na forma cutânea quanto visceral.
4. Uma das principais ações empregadas no controle da leishmaniose canina ainda é a eliminação do cão infectado devido ao insucesso da antimonioterapia. Atualmente o tratamento de cães está proibido visto que não há eficácia completa comprovada com as drogas disponíveis.
5. Na prática clínica, diante da suspeita de infecção os cães passam por vários testes diagnósticos que são muitas vezes contraditórios e nem sempre tem uma correlação com o estado da doença no cão, dificultando o prognóstico e conseqüente tratamento. Este tipo de constatação levou ao desenvolvimento de técnicas mais específicas baseadas na amplificação de regiões de DNA do parasito por Reação em Cadeia pela Polimerase-PCR (Francino, O., Altet, L., Sanchez-Robert, E., Rodriguez, A., Solano-Gallego, L., Alberola, J., Ferrer, L., Sanchez, A., Roura, X., Veterinary Parasitology 137: 214-221, 2006). Apesar de usualmente demonstrar alta eficiência, o ensaio de PCR tem a desvantagem de ter alto custo e falhas em relação à extração de DNA. O diagnóstico da doença em cães tem sido muito estudado, porém ainda hoje não há um método diagnóstico considerado como padrão e cada laboratório utiliza um método próprio de escolha (Da Silva E. S., Van Der Meide W. F., Schoone G. J., Gontijo C. M. F., Schallig H. D. F. H., Brazil R. P., Veterinary Research Communications 30: 637643, 2006). Diante disto novos métodos diagnósticos alternativos, mais eficientes, discriminatórios e rápidos são necessários.
6. A abordagem de proteínas recombinantes para serem usadas no diagnóstico tem sido o foco de muitos pesquisadores (S. Farajnia, B. Darbani, H. Babaei, M. H. Alimohammadian, F. Mahboudi And A.M. Gavgani, Parasitology 135, 1035-1041, 2008; Renato Porrozzi, Marcos V. Santos da Costa, Antonio Teva, Aloísio Falqueto, Adelson L. Ferreira, Claudiney dos Santos, Ana Paula Fernandes, Ricardo T. Gazzinelli, Antonio Campos-Neto and Gabriel Grimaldi, Jr., Clinical And Vaccine Immunology 14: 544-548, 2007).
7. As E-NTPDases são uma família específica de ecto-nucleotidases, proteínas que são descritas de maneira geral, como proteínas de membrana ecto localizadas ou solúveis (secretadas) que tem como função primária a degradação de nucleotídeos, principalmente extracelulares, tri e difosfatados (Zimmermann, H., Beaudoin, A. R., Bollen, M., Belgium, Shaker Publishing; 1-9. 1999.)
8. O interesse nestas enzimas se baseia em dados obtidos na literatura que sugerem a participação de ecto-nucleotidases, entre outras coisas, na virulência, infectividade e aquisição de purinas em parasitos (Barrêdo-Pinho, M., Peres- Sampaio, C. E., Chrispim, P. P. M., Belmont-Firpo, R., Lemos,A. P., Martiny, A., Vannier-Santos, M. A., Meyer-Fernandes, J. R. A Archives of Biochemistry and Biophysics, 391:16-24, 2001). Recentemente, estudando a infecção experimental de camundongos C57BL/6 com L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, ambas causadoras de leishmaniose tegumentar, verificou-se que os animais foram capazes de controlar a infecção por L. (V.) braziliensis, mas não por L. (L.) amazonensis. A diferença de resposta à infecção foi relacionada a um estado anérgico observado nos animais infectados por L. (L.) amazonensis (Maioli, T. U., Erica, T., Arantes, R. M. E., Fietto, J. L. R., Afonso, L. C. C., Parasitol Res 94: 207-212, 2004). Além disto, foi verificado que as células intactas de L. (L.) amazonensis foram capazes de hidrolisar uma maior quantidade de nucleotídeos extracelulares de adenosina. Considerando que o ATP extracelular é uma molécula pró-inflamatória e que um dos produtos de sua degradação, a adenosina possui efeito imunossupressor, esta diferença poderia então levar a um efeito antiinflamatório e imunossupressor, como o observado (Maioli, T. U, Erica, T., Arantes, R. M. E., Fietto, J. L. R., Afonso, L. C. C., Parasitol Res 94: 207-212, 2004). Esta foi a primeira evidência da participação de ecto-nucleotidases de um parasita no controle da resposta imunológica do hospedeiro.
9. Na busca feita junto ao Instituo Nacional da Propriedade Industrial - INPI foram encontradas solicitações de patentes nas áreas de imunoterapia e imunodiagnóstico, porém nenhuma destas patentes utiliza produtos relacionados ao objeto desta patente. Nesta busca foi encontrado o documento de patente PI 9406509, que refere-se a “COMPOSTOS, PROCESSO, SUA PREPARAÇÃO, USO DOS MESMOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E PROCESSO PARA PROFILAXIA E PARA TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE MALÁRIA E DOENÇAS CAUSADAS POR LEISHMANIA, TOXOPLASMA GONDII, PNEUMOCY”, onde se descreve o pirrol-amidínicos de fórmula geral e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, processos para a preparação e composições farmacêuticas contendo-os úteis como antivirótico e antiparasítico. Este documento versa então sobre o uso de formulações farmacêuticas derivadas de compostos pirrol-amidinicos para tratamento e prevenção das leishmanioses. O objeto do pedido de patente em questão é diferente da patente descrita, pois utiliza proteína recombinante para ser usada em diagnóstico, prognóstico, desenvolvimento de anticorpos monoclonais, vacinação e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses. Não há inter-relação entre os mesmos. Porém é importante salientar que no caso de doenças infecciosas é desejável que se tenham métodos alternativos de diagnóstico, prevenção e tratamento visto que existe uma diversidade muito grande de resposta a quimioterapia e vacinação das populações dos hospedeiros, bem como diferentes susceptibilidades a drogas e produção de resposta imune protetora em relação aos parasitos.
10. Outro depósito encontrado foi o de n° PI 9807332 que trata de “ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA UTILIZAÇÃO NA TERAPIA E DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE” onde são demonstradas composições e processos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose e estimular respostas imunes em pacientes. A presente invenção não tem sobreposição com esta patente, embora ambas visem aplicações em comum. Os antígenos apresentados na patente PI 9807332 são distintos das proteínas antigênicas desta patente. A aplicação em mesma área se justifica como descrito no item anterior, além disto, a própria patente em questão salienta a necessidade de desenvolvimento de alternativas no diagnóstico, tratamento e profilaxia das leishmanioses que são causadas por mais de 20 espécies diferentes de Leishmania.
11. O depósito de n° 2133236A1 feito no banco da Espanha refere-se a “GEN QUIMÉRICO FORMADO POR LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN LOS DETERMINANTES ANTIGÊNICOS DE CUATRO PROTEÍNAS DE L. infantum, APLICABLE PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLOGICO DE LEISHMANIOSIS CANINA Y PROTEÍNA OBTENIDA” onde se descreve os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum (LiP2a, LiP2b, LiP2A, LiP0), que foram aplicadas em diagnóstico de Leishmaniose. Os objetos desta patente são proteínas distintas daquelas que estão sendo patenteadas neste processo, portanto como justificado anteriormente apesar da aplicação poder ser a mesma os antígenos são diferentes. No caso das Leishmanioses, como dito anteriormente, é importante que se tenham proteínas alternativas para serem usadas em diagnóstico, profilaxia e tratamento, visto que existe grande diversidade de parasitos e hospedeiros.
12. É um primeiro objetivo da presente invenção, fornecer as proteínas da família das E-NTPDases recombinantes de três espécies de Leishmania (Leishmania major, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum) homóloga à sua proteína natural, para ser utilizada como antígeno em kits de diagnóstico das leishmanioses.
13. É objetivo também da presente invenção usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas sequências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinais, desenvolvimento de anticorpos, marcadores de prognóstico e no desenho racional de drogas inibidoras das E-NTPDases que possam ser usadas na quimioterapia das leishmanioses.
14. O desenvolvimento de compostos antigênicos capazes de aumentar a eficiência no diagnóstico e efetivação como agente vacinal tem sido busca no âmbito geral da pesquisa em leishmaniose. A proteína GDPase recombinante, conforme visto na Figura 5, aponta como um potente antígeno. O antígeno quando utilizado em diagnóstico em teste de ELISA, foi capaz de discriminar de maneira satisfatória soros de cães contaminados com Trypanossoma cruzi dos contaminados com Leishmania sp. Desse modo o investimento neste antígeno recombinante como alvo para produção de kit de diagnóstico, bem como para as outras aplicações é muito promissor.
15. O primeiro objetivo da presente invenção é alcançado através das proteínas da família das E-NTPDases expressas de forma recombinante, sendo as sequências SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 utilizadas como antígeno.
16. O segundo objetivo da presente invenção é usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas sequências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinais, marcador de prognóstico, produção de anticorpos monoclonais e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses.
17. A presente invenção será, a seguir, detalhadamente descrita.
18. Figura 1.1 - ilustra o esquema do vetor de expressão pET 21b para sistema de expressão em Escherichia coli e do cassete de expressão de DNA.
19. Figura 1.2 - ilustra o inserto de DNA, no caso o gene gi_|15487213|, que foi clonado entre os sítios de restrição BamHI e SalI.
20. Figura 2.1 - ilustra a comparação das sequências das E-NTPDases de espécies do gênero Leishmania. As regiões marcadas com quadros amarelos representam as regiões conservadas das E-NTPDases.
21. Figura 2.2 - idem a Figura 2.1, continuação.
22. Figura 3 - a parte A ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS- PAGE) 10%, mostrando proteínas de um lisado de E. coli BL21 (DE3) transfectadas com plasmídeo contendo o gene da GDPase de Leishmania major expresso em diferentes tempos. A primeira coluna mostra uma proteína NTPDase recombinante de Trypanossoma cruzi. As próximas 8 linhas mostram os produtos dos lisados de bactérias após 2 a 4 h de indução com IPTG nas concentrações de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e sem indução respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa). A parte B ilustra um resultado de Western blot mostrando a proteína GDPase de Leishmania major do lisado de E. coli reagindo com anticorpos do soro de coelhos imunizados com a NTPDase recombinante de T. cruzi. As linhas de 1 a 8 mostram a reação da proteína GDPase com o soro de coelhos imunizados com NTPDase de T. cruzi. A linha 9 mostra ausência de bandas quando não havia indução da proteína GDPase recombinante. A seta indica a reação da proteína com os anticorpos mostrando uma banda de aproximadamente 78 kDa.
23. Figura 4 - Ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10% mostrando a proteína GDPase de Leishmania major expressa em E. coli BL21 (DE3) após a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Níquel- agarose. A proteína GDPase recombinante de Leishmania major pode ser observada nas colunas 10 e 11, após ter sido recuperada em tampão contendo 80 mM e 160 mM imidazol respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa). A proteína GDPase recombinante de Leishmania major possui 78,2 kDa.
24. Figura 5 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA em que se utilizou como antígeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major purificada nas concentrações de 1.5, 3, 4.5 e 30 μg/ml e como controle foi utilizado o extrato total de Leishmania sp. lisada na concentração de 3 μg/ml, referenciadas pelos números 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente . Foram testados 8 soros de cães domésticos (Canis familiaris) na diluição de 1: 80. Sendo 3 soros de cães sabidamente positivos para Leishmania sp. (L+), 3 soros de cães sabidamente negativos para infecção por Leishmania sp. (L- ) e 2 soros de cães sabidamente positivos para infecção por T. cruzi.
25. Figura 6 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA utilizando como antígeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major na concentração 1,5 μg/ml. Foram utilizadas 169 amostras de soros de cães, sendo 117 sabidamente positivas e 52 sabidamente negativas.
26. A presente invenção se refere às proteínas da família E-NTPDase recombinantes de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, obtidas a partir da sequência nucleotídica dos genes codificantes destas proteínas com modificações destinadas a aplicações antigênicas, as quais após etapas de preparação de primers para amplificação dos genes alvos, amplificação dos genes codificantes dessas proteínas e clonagem em vetor de expressão, é finalmente expressa e posteriormente purificada por cromatografia de afinidade por Níquel. As ditas proteínas recombinantes assim purificadas podem ser usadas de forma satisfatória no imunodiagnóstico por ELISA e Western-blot, como demonstrado pelo uso da isoforma recombinante GDPase de L. major aplicada ao diagnóstico da Leishmaniose canina.
27. A presente invenção se refere às proteínas da família E-NTPDases recombinantes identificadas como SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 as quais poderão ser utilizadas como antígenos em diagnóstico das leishmanioses.
28. A SEQ. ID. N° 2 derivada do gene codificante da GDPase de L. major, apresenta uma identidade de aminoácidos de 93,74% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major quando se compara a mesma com relação aos trechos disponíveis no GenBank de 690 aminoácidos predita pelo acesso gi_|15487213|. Adicionalmente a GDPase de L. infantum (SEQ ID. N° 6) e L. braziliensis (SEQ ID. N° 4) apresentam identidade de 84,49% e 65,75% respectivamente em relação à GDPase recombinante de L. major, conforme visualizado na Tabela 1. Esta alta identidade mostra que são proteínas similares, da mesma família. Esta similaridade é suficiente para haver reatividade imunológica cruzada sendo possível utilizar todas estas variantes nas mesmas aplicações descritas para a GDPase, ou seja, diagnóstico, prognóstico e vacinação para as leishmanioses. O mesmo ocorre para as variantes denominadas nucleosídeo difosfatases (NTPDases, descritas como SEQ ID. N° 8, SEQ ID. N° 10 e SEQ ID. N° 12), que apesar de apresentarem menor identidade comparativamente (Tabela 1) apresentam domínios conservados, conforme mostrado nas Figuras 2.1 e 2.2. Sendo assim, as NTPDases recombinantes também são objetos deste pedido de patente e poderão ser usadas nas mesmas aplicações, ou seja, no diagnóstico, prognóstico, vacinação, desenvolvimento de monoclonais e quimioterápicos para as leishmanioses.Tabela 1 - Relação de Similaridade e Identidade da sequência de aminoácidos da proteína GDPase de L. major recombinante modificada com as demais sequências de aminoácidos das E-NTPDases de diferentes espécies de Leishmania.
Números de 1 a 7 na horizontal representam as respectivas proteínas da vertical. Onde os números se cruzam fornece a identidade no quadrante de cima e similaridade no de baixo.
29. O gene natural das GDPase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob os acessos gi_|15487213|, XP_001562788, XP_001463665 respectivamente. O gene de Leishmania major possui uma sequência de 2073 nucleotídeos que codifica uma proteína de 690 aminoácidos. O gene de Leishmania braziliensis possui uma sequência de 2076 nucleotídeos que codifica uma proteína de 691 aminoácidos. O gene de Leishmania infantum possui uma sequência de 2034 nucleotídeos que codifica uma proteína de 677 aminoácidos. As sequências de nucleotídeos recombinantes em relação às naturais apresentam modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal. À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foi removido os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionado 45 pares de base. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 719, 720 e 706 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N° 2, SEQ. ID N° 4 e SEQ. ID N° 6).
30. O gene natural das NTPDase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob os acessos XP_001681917, XP_001562178, XM_001464304 respectivamente. Ambas as espécies possuem uma sequência de 1278 nucleotídeos que codifica 425 aminoácidos. A sequência de nucleotídeos recombinantes em relação ao natural apresenta modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal. À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foram removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, exceto em Leishmania major que foram adicionados somente 39 pares de base. Esta diferença se deve ao uso de diferentes sítios de restrição usados no processo de clonagem gênica. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 452, 454 e 454 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N° 8, SEQ. ID N° 10 e SEQ. ID N° 12).
31. A presente invenção ainda se refere ao uso da proteina GDPase recombinante em kit de diagnóstico para as leishmanioses causadas por espécies do gênero Leishmania, compreendendo as E-NTPDases recombinantes, tal como mencionado acima, que são capazes de interagir com anticorpos específicos em amostras de soros ou sangue ou outros líquidos ou amostras de indivíduos sendo capazes de indicarem a infecção nestes indivíduos humanos ou animais.
32. A seguir serão descritos experimentos de demonstração que permitirão ilustrar a potencialidade da presente invenção. Resumidamente estes experimentos se baseiam em amostra contendo Leishmania major que foi submetida à extração de seu material genômico para isolamento do gene específico codificante da GDPase. Posteriormente a isso, foi feito a amplificação do gene específico por PCR sendo esse clonado em vetor de clonagem e expressão, o qual foi utilizado na transformação de células de Escherichia coli que passaram a expressar a proteína GDPase recombinante do protozoário. A proteína GDPase de Leishmania major, após purificação foi utilizada como antígeno em testes de ELISA em soros de cães visando à pesquisa de anticorpos da classe IgG contra espécies do gênero Leishmania. Esta proteína GDPase recombinante de Leishmania major, produzida em larga quantidade, poderá ser amplamente distribuída a laboratórios por todo país e desta forma, contribuir de forma relevante para o diagnóstico sorológico das leishmanioses no Brasil ou no exterior, ou ainda ser usada em kits e aplicações imunológicas vacinais e de produção de anticorpos. Todos os processos descritos neste documento se estendem também as outras isoformas das E-NTPDases das outras espécies de Leishmania descritas nas seqüências SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 as quais poderão ser também utilizadas como antígenos em diagnóstico das leishmanioses.
33. A cepa utilizada para extração genômica foi a MHOM/IL/80/Friedlin de Leishmania major. Para a extração de DNA genômico (DNAg) aproximadamente 1x108 células foram recolhidas por centrifugação a 13.000 x g por 2 a 3 min, descartando o sobrenadante foi adicionado 500 a 700 μL de fenol equilibrado ao “pellet” e deixado a temperatura ambiente (T. A.) por 5 a 10 min. Em seguida foi adicionado de 200 a 400 μL de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril e homogeneizado no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperado a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 μL de uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e homogeneizada no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 μL de clorofórmio e homogeneizado no vortex. Sendo posteriormente centrifugada a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa como descrito anteriormente. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume de uma solução de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e dois volumes de etanol 100% gelado homogeneizando sem vortexar. O homogeneizado foi deixado precipitando por 2 a 3 h no freezer -80 °C, sendo posteriormente centrifugado a 13.000 x g por 20 a 30 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado, adicionando ao precipitado de 250 a 500 μL de etanol 70% gelado e a amostra foi centrifugada a 13.000 x g por 5 a 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” colocado para secar com a tampa do frasco aberta. Posteriormente o “pellet” de DNA seco foi suspendido em 50 a 60 μL de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril. O DNA genômico foi estocado a - 20 °C e utilizado para isolamento da região codificante do gene da GDPase (gi_|15487213|) contendo 2073 pares de bases por reação da polimerase em cadeia (PCR).
34. Para tanto foram utilizados o oligonucleotídeo direto SEQ ID N° 13 que anela no genoma de Leishmania major e insere um sítio de restrição para BamH I na extremidade 5’ para inserção posterior no vetor de expressão em bactéria pET- 21b e oligonucleotídeo reverso SEQ ID N° 14, que cria um sítio para Sal I no final da região codificante. Para amplificação do gene foi usado um aparelho termociclador (Programmable Thermal Controller-PTC-100TM). A reação foi realizada em um volume total de aproximadamente 50 μL, utilizando 4 μL do DNAg; 5,0 μL de tampão 1,5 mM MgSO4 (fornecido pelo fabricante da Taq DNA Polimerase); 2,4 μL do mix de 2,5mM dNTPs (dCTP, dTTP, dGTP, dATP); 2 μL dos oligonucleotídeos em uma concentração de 20 pmol/μL; 0,5 μL de Taq DNA Polimerase e água ultrapura estéril qsp. O programa utilizado consistiu em 33 ciclos: 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 seg; 50 °C por 1 min; 72 °C por 1 min; 72 °C por 5 min; 4 °C até retirada dos tubos. Os produtos finais das reações de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em 1X TAE (1 mM EDTA; 40 mM Tris-Acetato; em água deionizada) e corado em solução de brometo de etídio (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., 1989), para a verificação da formação de uma banda majoritária correspondente ao tamanho do amplicon alvo com aproximadamente 2,1 kb. A eletroforese foi feita a aproximadamente 80 V, utilizando como tampão de corrida TAE. A banda de cerca de 2,1 kb foi purificada do gel de agarose utilizando o Kit “PureLinkTM Quick Gel Extraction” (invitrogenTM) conforme instruções do fabricante. Foi utilizado o sistema TOPO (InvitrogenTM) para a subclonagem inicial do gene.
35. A banda do amplicon foi suspensa em um volume total de aproximadamente 20 μL de água ultra-pura estéril e 5 a 10 μL desta solução foi usada na ligação feita a aproximadamente 16 °C por 10 a 12 h, de acordo com manual do fabricante (TOPO® TA Cloning® Kit for subcloning - Invitrogen). A mistura de ligação (~6 μL) contendo vetor TOPO + amplicon da GDPase, foi adicionada a aproximadamente 100 μL de solução contendo bactérias E. coli TOP 10F’, previamente tornadas competentes (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A mistura foi incubada em gelo por 45 a 60 min, submetida a choque térmico (42 °C) por 1 a 5 min e colocada novamente no gelo. Adicionaram-se 1 a 5 mL de LB-Líquido (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7.5) seguido de incubação a 37 °C por 40 min com agitação de 180 rpm em Shaker TE-420. O volume total dessa mistura foi dividido em três alíquotas e plaqueado em meio sólido LB-Agar (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, 1,5% select Agar pH 7.5) contendo ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) e incubadas por 12 a 14 h a 37 °C.
36. Os clones resistentes a ampicilina foram recuperados e utilizados para confirmação da presença do plasmídeo contendo o gene de interesse por PCR e análise de restrição (utilizando BamH I e Sal I) a partir do plasmídeo extraído por minipreparação plasmidial de acordo com (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um dos clones isolados e confirmado foi então submetido a sequenciamento automático parcial usando iniciadores flanqueadores da região de clonagem em aparelho Mega-Bace de acordo com instruções do fabricante. Os clones que continham a construção foram estocados em meio LB-líquido em tubos de microcentrífuga com 20% de glicerol e mantidos a -80 °C.
37. O DNA plasmidial (DNAp) foi extraído pelo método da lise alcalina (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) como descrito a seguir. Para isso, os clones positivos da transformação com o vetor TOPO, foram crescidos em tubos de rosca individuais contendo 3 mL de LB e 30 μL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) por 12 a 14 h a 37 °C em 180 a 200 rpm. Após o crescimento um volume de 1,5 mL de cada cultura foi transferido para tubos de microcentrífuga, e as células foram coletadas por centrifugação (Centrífuga 5415C- EPPENDORF) a 12000 x g por 1 a 5 min. O sedimento celular foi lavado com 0,5 a 1 mL de STE (0,1 NaCl, 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) para retirada de inibidores de endonucleases. Após a centrifugação foram adicionados de 200 a 300 μL da solução I (25 mM Tris.Cl pH 8.0, 10 mM de EDTA e 5mM de D-Glicose) gelada e suspenso vagarosa e completamente o “pellet”. Em seguida foram adicionados de 200 a 300 μL da solução II (NaOH 0,2M, SDS 1%) preparada na hora, e os tubos foram invertidos lentamente por 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 a 10 min. Após isso, 150 a 300 μL da solução III (3 M Kac, 2 M Hac pH 8.0) gelada foram adicionados e os tubos foram invertidos lentamente 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 min. Em seguida os tubos foram centrifugados por 12000 x g por 5 a 10 min e transferidos os sobrenadantes para outros tubos novos onde foram adicionados 5 μL de RNAse A (10 μg/uL) e mantidos os tubos a 37 °C em banho-maria por 30 a 50 min.
38. A cada tubo foram adicionados 550 a 700 μL de fenol: clorofórmio (1:1), e os tubos foram invertidos lentamente por cerca de 5 a 10 vezes e centrifugados a 12000 x g por 5 a 10 min. Esse procedimento se repetiu mais uma vez. A fase aquosa foi transferida para tubos novos. Em seguida adicionou-se 550 a 700 μL de clorofórmio e foi realizada nova centrifugação a 12000 x g por 5 a 10 min. A fase superior foi transferida para novos tubos, onde foram adicionados 550 a 700 μL de isopropanol gelado. Os tubos foram invertidos lentamente e mantidos a -70 °C por 10 a 20 min. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12000 x g por 5 a 10 min, o sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min sobre papel toalha. O precipitado foi lavado com 200 a 400 μL de etanol 70% gelado e centrifugado a 12000 x g por 5 a 10 min. O sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min. Após estar secos, o DNA plasmidial foi suspenso em 20 a 30 μL de H20 deionizada. Os clones foram selecionados por análise de restrição utilizando BamH I e Sal I e confirmados por sequenciamento parcial.
39. O vetor de amplificação TOPO contendo o gene, foi submetido à digestão com BamH I e Sal I. Após a digestão, a mistura do vetor TOPO foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1%.
40. O inserto relativo à região codificante completa da GDPase foi purificado com kit “PureLinkTM Quick Gel Extraction” (invitrogenTM) e ligado, de forma análoga a descrita na subclonagem em TOPO, no vetor pET-21b previamente digerido com as mesmas enzimas e purificado também pelo mesmo kit. A Figura 1.2 mostra um esquema da construção pET-21b-GDPase.
41. Bactérias E. coli TOP 10F’, previamente tornadas competentes como descrito acima, foram transformadas com o produto de ligação e foram incubadas em meio líquido LB conforme descrito acima (isolamento do clone contendo o TOPO). A seleção dos clones foi feita por análise de restrição e sequenciamento. Os clones positivos foram estocados em tubos de microcentrifuga, contendo 15 a 30 % de glicerol, e mantidos a temperatura de -70 °C.
42. A expressão total das proteínas recombinantes foi feita, em média escala, em 250 mL de LB. O cassete de expressão do vetor pET-21b, destacando os sítios de clonagem e sequência de 6 resíduos de histidina na porção carboxi- terminal da proteína recombinante, está esquematizado na Figura 1.2.
43. Bactérias competentes, da linhagem E. coli BL21(DE-3), foram transformadas com a construção pET-21b-GDPase, de modo análogo ao realizado com vetor TOPO. O gene gi_|15487213| codifica um RNAm para a produção de uma proteína de 78,2 kDa cuja sequência de aminoácidos predita está descrita na SEQ. ID. N° 2.
44. Um total de 45 nucleotídeos extra, correspondentes a 15 aminoácidos a mais na extremidade carboxi-terminal da proteína recombinante foram adicionados à proteína final pela ligação do gene alvo com o vetor pET-21b, que codifica 9 aminoácidos de ligação entre a proteína GDPase e a cauda de hexa- histidina mais 6 de histidinas. Na porção aminoterminal um total de 14 aminoácidos foram inseridos.
45. Em seguida, realizou-se um pré-inoculo em 5 a 7 mL de meio líquido LB contendo 50 μL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) a partir do clone preservado em glicerol. Este pré-inoculo foi incubado por 16 a 20 h a 37 °C sob agitação. Uma alíquota de 2,5 a 5 mL de cultura foi coletada e inoculada em um volume total de 250 mL de LB-líquido contendo 2,5 mL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1). Essa mistura foi incubada a 37 °C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua DO600 (densidade ótica). Para indução da proteína recombinante modificada usou-se IPTG (isopropyl β-D- thiogalactopyranoside). No momento em que a DO600 atingiu cerca de 0,6 a 0,8, foram adicionados aos tubos de cada clone aproximadamente 0,3 mM de IPTG. A incubação prosseguiu por 2 a 4 h a 37 °C sob agitação.
46. Após a indução a cultura foi centrifugada 3000 x g e o sedimento obtido foi mantido no gelo por 15 a 30 min e suspenso em tampão de lise (50 mM Tris (pH 8.0), 300 mM NaCl, em água destilada), na proporção de 3 a 5 mL por grama de sedimento, contendo 30 a 50 μL de PMSF (100 mg/mL), 50 a 100 μL de aprotinina (1 mg/mL), 50 a 100 μL de pepstatina (1 mg/mL). Em seguida foi adicionado 1 a 5 mg/mL de lisozima e manteve-se no gelo por 30 a 50 min.
47. Procedeu-se então o rompimento final das células por sonicação por 6 a 10 vezes por 10 a 20 segundos na potência 200 W com intervalo de 10 a 20 segundos no gelo entre cada sonicação. Em seguida adicionou-se 0,1% Triton e o material foi centrifugado por 30 a 50 min a 20400 x g a 4 °C, sendo armazenado tanto o “pellet” (fração insolúvel) quanto o sobrenadante (fração solúvel) a - 20 °C para posterior purificação da proteína recombinante.
48. Para determinar a melhor concentração do IPTG a ser usada como padrão para expressão da proteína recombinante, as colônias foram inoculadas em 4 mL de meio liquido LB contendo 40 μL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) e incubadas a 37 °C por 12 a 14 h sob agitação. Uma alíquota de 250 a 500 μL de cultura foi coletada e diluída para um volume total de 5 a 10 mL em 11 tubos. Essa mistura foi incubada a 37 °C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua DO600.
49. Quando a cultura atingiu DO600 de aproximadamente 0,6 a 0,8, aliquotou- se 1 a 5 mL da cultura (controle não induzido), em seguida foram adicionados aos outros tubos, IPTG na concentração seriada de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 e 1 mM. A incubação prosseguiu por 2 a 4 h a 37 °C sob agitação. Ao final deste tempo 1 mL de cada cultura foi coletado (controles induzidos) e feita a leitura de DO600. As amostras (controles induzidos e não induzido) foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e o sedimento bacteriano misturado com tampão de amostra de SDS-PAGE (62,5 mM Tris.HCl pH 6.8, 10% SDS, 0,01% azul de bromofenol (ABF), 10% glicerol e 20 mM de β-mercaptoetanol). As amostras foram aquecidas a 100 °C por 5 a 10 min. Os lisados bacterianos foram analisados por SDS-PAGE 10% de acordo com Laemmli, U. K., Nature. 227(259): 680-5, 1970. Foi utilizado o sistema de eletroforese vertical Mini- PROTEAN® (BIO-RAD) pequeno (1mm de espessura). As amostras foram aplicadas na DO600 3,0 a 5,0, para um volume total de 20 μl por canaleta, e após a eletroforese o gel foi corado com Comassie blue. O padrão de peso molecular utilizado foi o PageRulerTM Unstained Protein Ladder (Figura 3, na parte A).
50. Para purificação da proteína recombinante foram empregadas as amostras do sobrenadante (solúvel). Estas amostras foram mantidas sobre agitação na presença de 500 a 700 μL da resina HIS-SelectTM Nickel Affinity Gel devidamente preparada segundo o fabricante, em tubos de 15 mL por 1 a 3 horas a 4 °C. Posteriormente o material foi passado em uma coluna, contendo lã de vidro na extremidade abaixo para impedir perda da resina, e as proteínas não ligadas à coluna foram recuperadas no volume separado da resina. O fluxo foi dependente somente da pressão atmosférica não sendo padronizado.
51. Após a saída de todo material líquido visível da coluna, manualmente preparada pela imobilização da resina de afinidade a uma seringa de 10 mL, a esta foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 1 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM MgCl2). Esse procedimento se repetiu por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM Imidazol, 5 mM MgCl2). Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume de 2 a 4 mL do tampão de lavagem 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 10 mM Imidazol, 5 mM MgCl2). Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes.Posteriormente as proteínas mais fortemente ligadas à resina foram eluídas em tampão de eluição. Um volume de 1,5 a 3 mL do tampão de eluição 1 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 80 mM Imidazol, 5 mM MgCl2), foi adicionado. Após término desta eluição, um volume de 1 a 3 mL do tampão de eluição 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 160 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) e finalmente um volume de 1 a 3 mL de tampão de eluição 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 250 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) se procedeu como o primeiro. O processo de eluição 3 se repetiu por mais uma vez. As amostras de todos os passos de purificação foram coletadas em tubos de microcentrifuga e estocadas a 4°C e analisadas em gel de SDS 10% corado com Comassie blue. As amostras foram aplicadas em um volume total de 20 μl (Figura 4).
52. Várias amostras do processo de purificação foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE 10% e transferidas sob corrente elétrica para membrana de nitrocelulose sob a condição de transferência de 200-250 mA por 2 a 4 h em sistema de transferência vertical Mini-PROTEAN® 3 Cell Assembly Guide. Após a transferência a membrana foi corada com Ponceau S (Ponceau 0,2% em ácido acético 1,0%) por 10 a 30 min para visualização das bandas protéicas e marcação da região das bandas do padrão de massa molecular. Em seguida a membrana foi descorada com água destilada e colocada em solução de bloqueio com incubação por 1 a 3 hora em temperatura ambiente utilizando o tampão TBS-T (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl; 0,1% Tween 20) contendo 5% de leite desnatado.
53. Posteriormente a membrana passou por uma rápida lavagem em tampão TBS (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl) e em seguida foi feita a incubação com o anticorpo primário anti-rNTPDase de T. cruzi 1:1000 diluídos em tampão TBS-T por cerca de 16 a 20 h à 100 rpm. Posteriormente a membrana passou por 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob leve agitação constante. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase, na diluição de 1:20.000. A membrana foi deixada sob agitação a 100 a 200 rpm por 1 a 3 horas. Em seguida, a membrana passou por mais 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob as mesmas condições de agitação. A revelação foi realizada com substrato diaminobenzidina (DAB) em solução contendo 50 mM Tris (pH 7,6); 10 mg DAB; 10 μL H2O2 (20%) na ausência de luz por aproximadamente 10 min. Após a revelação a membrana foi tirada com auxílio de uma pinça, parada a reação com água, seca sob papel toalha e a imagem foi digitalizada (Figura 3, parte B).
54. Nos experimentos de ELISA para análise da reatividade da proteína recombinante purificada foram utilizados 8 soros de cães previamente diagnosticados, sendo 3 soros positivos de cães infectados com Leishmania sp., 3 soros de animais negativos e 2 soros positivos de cães infectados com T. cruzi.
55. Para adsorção da rGDPase, placas de micro-diluição foram expostas a uma solução contendo 1,5, 3, 4,5 e 30 μg da proteínaGDPase recombinante purificada em tampão 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 9.6 e incubadas overnight a 4 °C. Os sítios inespecíficos foram bloqueados incubando-se a placa com solução de bloqueio contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) em PBS por uma hora a 37 °C. Posteriormente, a placa foi lavada 3 a 6 vezes com PBS-T (PBS com 0,05% Tween-20) para retirar o excesso de solução de bloqueio. Após as lavagens, o soro foi adicionado na diluição de 1:80. A reação contendo o soro foi incubada por 1 a 3 horas por 37 °C. A lavagem prosseguiu da mesma maneira como descrito anteriormente. A reação com o anticorpo anti-IgG de cão conjugado a peroxidase na diluição 1:5000, foi incubada por 1 a 3 horas por 37 °C. A placa foi novamente lavada conforme descrito acima. A reação da proteína GDPase recombinante com anticorpos foi evidenciada através de revelação com 5 a 10 mg/mL de o-fenilenodiamina (OPD) e 0,01% H2O2, em tampão citrato-fosfato (0,1 M ácido cítrico, 0,2 M fosfato de sódio pH 5,0), por 15 a 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 32 a 40 μL de uma solução 2,5 M H2SO4. A intensidade da reação, relacionada à intensidade da coloração, foi determinada pela leitura de absorbância a 490nm (Labsystems iEMS). A análise dos dados foi feita no programa Excell (Figura 5) onde se pode ver o reconhecimento positivo com maior leitura de absorbância dos soros sabidamente positivos para leishmaniose em relação aos soros negativos e de cães com doença de Chagas.
56. A GDPase recombinante foi posteriormente usada em ensaio com maior número de amostras (Figura 6) mostrando um bom reconhecimento específico na maioria dos soros positivos e negativos utilizados no teste. Análises estatísticas destes dados mostraram Especificidade de 90,3%, Precisão de 72,1% e Sensibilidade de 44,1 %.
57. Estes resultados em conjunto mostram de forma clara a potencialidade de uso de proteínas da família E-NTPDase de Leishmania como antígenos para o diagnóstico da Leishmnaiose.
Claims (8)
1. “E-NTPDases RECOMBINANTES DO GÊNERO Leishmania” caracterizadas por serem selecionadas do grupo que consiste das SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12;
2. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania major”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 1 e SEQ. ID. N° 2, derivadas do gene codificante da GDPase de Leishmania major, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 45 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 719 aminoácidos;
3. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania braziliensis”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 3 e SEQ. ID. N° 4, derivadas do gene codificante da GDPase de Leishmania braziliensis, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 45 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 720 aminoácidos;
4. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania infantum”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 5 e SEQ. ID. N° 6, derivadas do gene codificante da GDPase de Leishmania infantum, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 45 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 706 aminoácidos;
5. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania major”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 7 e SEQ. ID. N° 8, derivadas do gene codificante da NTPDase de Leishmania major, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 39 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 452 aminoácidos;
6. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania braziliensis”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 9 e SEQ. ID. N° 10, derivadas do gene codificante da NTPDase de Leishmania braziliensis, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 45 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 454 aminoácidos;
7. “E-NTPDase RECOMBINANTE DA Leishmania infantum”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12, derivadas do gene codificante da NTPDase de Leishmania infantum, conter em sua porção aminoterminal 42 pares de bases e na porção carboxiterminal 45 pares de bases no lugar dos três últimos nucleotídeos (códon de parada), possuindo 454 aminoácidos;
8. “USO DAS E-NTPDases RECOMBINANTES DEFINIDAS NAS REIVINDICAÇÕES 1 a 7”, caracterizado por ser para a produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero Leishmania.
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