BRPI1006850B1 - Processo para determinar a susceptibilidade para contrair infecção nosocomial - Google Patents

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Alain LePape
Guillaume Monneret
Alexandre Pachot
Bruno Mougin
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bioMérieux
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Abstract

processo para determinar a susceptibilidade para contrair infecção nosocominal em um paciente e para estabelecer um prognóstico de evolução de síndrome séptica e uso de reagente específico de produto de expressão do gene s100a9 e/ou do gene s100a8. a presente invenção refere-se a um processo para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial em um paciente e um processo para estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica em um paciente, segundo os quais: a) se dispõe de uma amostra biológica do paciente e se extrai material biológico de amostra biológico; b) se dispõe de pelo menos um reagente específico de um produto de expressão de pelo menos um gene-alvo escolhido dentre os genes-alvo s100a9 e s100a8; c) se determina a expressão de pelo menos um dos genes-alvo a100a9 e s100a8, uma superexpressão em relação a um valor limite determinado, sendo uma indicação de uma susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial e uma indicação de um mau prognóstico de evolução de uma síndrome séptica.

Description

PROCESSO PARA DETERMINAR A SUSCEPTIBILIDADE PARA CONTRAIR INFECÇÃO NOSOCOMIAL
[001] A presente invenção refere-se a um processo para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial em um paciente. A invenção tem também por objeto um processo para o estabelecimento de um prognóstico de evolução de um choque séptico em um paciente.
[002] As infecções nosocomiais constituem um real problema de saúde pública. Na França, estimam-se entre 500 000 e 800 000 o número de pacientes que contraem a cada ano uma infecção nosocomial. O aparecimento das infecções nosocomiais está ligado a diferentes fatores, tais como as técnicas médicas utilizadas, mas também à susceptibilidade do paciente a contrair essa infecção nosocomial. Assim, os pacientes tendo um sistema imunitário deficiente, as pessoas desnutridas, os recém-nascidos, as pessoas idosas, as pessoas com síndrome séptica, os grandes queimados, as pessoas em estado traumático podem ser mais pré-dispostos do que outros a contrair uma infecção nosocomial.
[003] A síndrome séptica, resposta sistêmica à infecção, representa uma das primeiras causas de mortalidade nos serviços de reanimação. Pode resultar de uma infecção bacteriana, viral, micósica ou parasitária. Essas síndromes sépticas podem ser classificadas em função de sua gravidade. Distingue-se por ordem crescente de gravidade a SIRS (Systemic Inflammatiry Response Syndrome), a sepse, a sepse severa e o choque séptico. Um grupo de especialistas propôs assim em 2001 critérios de definições dessas quatro síndromes clínicas[1]:
  • • a SIRS é uma resposta sistêmica inflamatória desencadeada por uma variedade de causas infecciosas ou não.
[004] Dentre os estados de SIRS desencadeados por causas não infecciosas, podem-se citar os estados traumáticos, as queimaduras, as pancreatites, as síndromes respiratórias agudas. Uma resposta sistêmica inflamatória manifestando-se por pelo menos dois dos seguintes sinais: a) temperatura superior a 38 °C ou inferior a 36 °C; b) ritmo cardíaco superior a 90 batimentos por minuto; c) ritmo respiratório superior a 20 respirações por minuto; d) número de leucócito superior a 12000/mm3 ou inferior a 4000/mm3,
  • • a sepse é uma síndrome de resposta sistêmica inflamatória em relação com uma infecção,
  • • uma sepse severa é uma sepse associada a uma hipotensão arterial e/ou hipoperfusão e/ou disfuncionamento de pelo menos um órgão,
  • • o choque séptico é uma sepse severa associada a uma hipotensão persistente e pode ser qualificado:
  • • pela presença de um local infeccioso identificado,
  • • por uma hipotensão persistente apesar dos enchimentos adequados e dos tratamentos vasopressores.
[005] De maneira geral, os sinais de uma sepse, de uma sepse severa e de um choque séptico são próximos, e a diferença entre essas três situações reside principalmente na importância da perturbação de todas as funções vitais. Quando de um choque séptico, se observa principalmente uma queda de pressão arterial, taquicardia, po-lipneia, veios marmóreos cutâneos, hipo- ou hipertermia, tremores. Esses sinais são acompanhados também de um disfuncionamento de órgãos-"alvo" com uma alteração de função de órgão à distância do foco infeccioso (rins, pulmões, sistema nervoso central, aparelho digestivo e os sistemas da coagulação do sangue), traduzindo-se por uma oligurua (< 0,5 ml/kg/h), insuficiência renal por hipoxemia, trom-bopenia, agitação, confusão.
[006] Os pacientes em síndrome séptica são também mais ou menos sensíveis às infecções nosocomiais, isto é, as infecções em relação com uma permanência em um estabelecimento de saúde. Essa sensibilidade tem um impacto considerável sobre a sobrevida e o bom restabelecimento desses pacientes.
[007] A evolução de uma síndrome séptica a partir do estado de sepse para um estado de sepse severa, depois de choque séptico não é sistemático, já que aproximadamente 64% dos pacientes sépticos desenvolvem uma sepse severa, e 23% dos pacientes em sepse severa evoluem em choque séptico. Antes dessa etapa última de choque séptico, tratamentos devem ser prescritos ao paciente a fim de interromper e de inverter o processo fisiopatológico. É preciso também restaurar um estado hemodinâmico satisfatório e assegurar uma ventilação eficaz. É preciso também levar de fronte o tratamento sintomático do choque e um tratamento antibiótico adaptado desde que possível em função dos dados bacteriológicos.
[008] Aparece que se certos pacientes que desenvolvem uma síndrome séptica, e notadamente um choque séptico, podem ser reanimados por uma tomada em carga-padrão, tal como um tratamento antibiótico de largo espectro colocado antes dos resultados das análises bacteriológicas, indicando a fonte infecciosa, de outros pacientes, desenvolvendo uma síndrome séptica muito mais grave, necessitam de uma colocação de terapêuticos pesados, como a proteína C ativada. Além do custo muito elevado, esse gênero de terapêutica expõe os pacientes a riscos de efeitos indesejáveis muito importantes (distúrbios da coagulação...). Portanto, é muito importante alvejar, de maneira eficaz, os pacientes capazes de se beneficiarem desse tratamento.
[009] Dessa forma, o conhecimento da etiologia da resposta sistêmica inflamatória e a determinação da susceptibilidade do paciente que apresenta uma resposta sistêmica inflamatória a contrair uma in- fecção nosocomial são essenciais para propor um tratamento adaptado ao paciente. Um outro dado importante para o paciente é de poder estabelecer um prognóstico o mais precoce possível de evolução do choque séptico.
[0010] Atualmente, não existe teste que permita determinar a susceptibilidade de um paciente para desenvolver uma infecção nosocomial, em particular um paciente que apresente uma resposta sistêmica inflamatória, ligada ou não a uma infecção. Os inventores colocaram em evidência, de maneira inesperada, que a análise da expressão dos genes S100A9 e/ou S100A8 é particularmente adaptada para a determinação dessa susceptibilidade e que, além disso, ela é apropriada para o estabelecimento de um prognóstico de evolução de um choque séptico.
[0011] Antes de ir mais adiante, as seguintes definições são dadas, a fim de melhor compreender a invenção.
[0012] Entende-se por síndrome séptica, uma resposta sistêmica à infecção. Essa síndrome séptica pode estar em um estado de SIRS, sepse, sepse severa ou de choque séptico. Preferencialmente, a síndrome séptica é um choque séptico.
[0013] Entende-se por infecção nosocomial, qualquer infecção contraída em um estabelecimento de saúde 48 horas após a admissão e que não estava presente na admissão do paciente nesse estabelecimento.
[0014] Entende por genes-alvo, o gene S100A9 e o gene S100A8, em particular o gene S100A9 referenciado em GenBank sob o número de acesso NM_002965.3 e o gene S100A8 referenciado em GenBank sob o número de acesso NM_002964.3.
[0015] Entende-se por produto de expressão do gene S100A9 e do gene S100A8, o mensageiro de ARN ou um fragmento de ARNm, o ADNc ou um fragmento de ADNc, uma proteína ou um fragmento de proteína.
[0016] Entende-se por amostra biológica, qualquer material oriundo do paciente, capaz de conter um material biológico, permitindo detectar a expressão de um gene. Este pode ser notadamente uma amostra de sangue, de soro, de saliva ou de tecido ou de células circulantes do paciente. Dispõe-se dessa amostra biológica por qualquer tipo de coleta conhecido do técnico, tal como notadamente uma coleta de sangue.
[0017] Entende-se por material biológico qualquer material que permita detectar a expressão de um gene, conforme notadamente um ácido nucleico ou uma proteína, ou sua sequência codificante. O ácido nucleico pode ser notadamente um ARN (ácido ribonucleico) tal como um ARNm (mensageiroARN). De acordo com um modo preferido de realização da invenção, o material biológico é um ácido nucleico, e ainda mais preferencialmente um ARNm.
[0018] A coleta do material biológico da amostra biológica pode ser realizada por todos os protocolos de extração de ácidos nucleicos ou proteínas bem conhecidos do técnico.
[0019] A título indicativo, a coleta de ácido nucleico pode notadamente ser realizada por:
• uma etapa de lise das células presentes na amostra biológica, a fim de liberar os ácidos nucleicos contidos nos envoltórios proteicos e/ou lipídicos dos micro-organismos (como restos celulares que perturbam as reações posteriores). A título de exemplo, podem-se aplicar os métodos de lise, tais como descrito nos pedidos de patente:
  • ○ WO-A-00/05338 sobre a lise mista magnética e mecânica,
  • ○ WO-A-99/5304 sobre a lise elétrica, e
  • ○ WO-A-99/15321 sobre a lise mecânica.
[0020] O técnico poderá utilizar outros métodos de lise bem conhecidos, tais como os choques térmicos ou osmóticos, ou lises químicas por agentes caotrópicos, tais como os sais de guanídio (US-A-5,234,809).
  • • uma etapa de purificação, permitindo a separação entre os ácidos nucleicos e os outros constituintes celulares ampliados na etapa de lise. Essa etapa permite geralmente concentrar os ácidos nucleicos. A título de exemplo, podem-se utilizar partículas magnéticas eventualmente revestidas de oligonucleotídeos, por adsorção ou cova-lência (vide, a esse respeito, Patentes US-A-4,672,040 e US-A-5,750,338), e assim purificar os ácidos nucleicos que se fixaram sobre essas partículas magnéticas, por uma etapa de lavagem. Essa etapa de purificação dos ácidos nucleicos é particularmente interessante, caso se deseje amplificar posteriormente esses ácidos nucleicos. Um modo de realização particularmente interessante dessas partículas magnéticas é descrito nos pedidos de patentes: WO-A-97/45202 e WO-A-99/35500. Um outro exemplo interessante de método de purificação dos ácidos nucleicos é a utilização de sílica, seja sob a forma de coluna, seja sob a forma de partículas inertes (2) ou magnéticas (Merck: MagPrep□ Sílica, Promega: MagneSil® Paramagnetic particles). Outros métodos muito difundidos se baseiam sobre resinas trocadoras de íons em coluna ou em formato particular para magnético (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Um outro método muito pertinente, mas não exclusivo para a invenção é aquele da adsorção sobre um suporte de óxido metálico (Société Xtrana: matrice Xtra-Bind®). Essa etapa de extração pode ser feita em autômatos. O autômato easyMAG® é particularmente adaptado.
[0021] Entende por reagente específico um reagente que reage com o material biológico a fim de colocar em evidência, de maneira direta ou indireta a expressão de um gene-alvo, que pode ser determinado pela análise dos ARNm oriundos desse gene, ou pela análise da proteína codificada por esse gene.
[0022] A título indicativo, quando se deseja determinar a expres- são de um gene-alvo pela análise da proteína codificada por esse gene, esse reagente específico compreende pelo menos um anticorpo específico da proteína codificada por esse gene-alvo.
[0023] A título indicativo, quando se deseja determinar a expressão de um gene-alvo pela análise dos ARNm transcritos a partir desse gene, esse reagente específico compreende pelo menos um iniciador de amplifação específica do ADN complementar desse ARNm (fala-se então de iniciador de amplificação específica de um gene-alvo). O ADN complementar de um ARNm pode ser obtido segundo um protocolo bem conhecido do técnico. A título indicativo, extraem-se os ARN totais (compreendendo os ARN ribo-somais, os ARN de transferência, os ARNm) da amostra biológica. Realiza-se em seguida uma reação de transcrição inversa com o auxílio de uma enzima transcriptase inversa que permite obter, a partir de um fragmento de ARN, um fragmento complementar de ADN (ADNc). A realização dessa etapa é bem conhecida do técnico. Quando se deseja mais particularmente obter unicamente os ADN complementares dos mensageiros de ADN, realiza-se essa etapa enzimática em presença de fragmentos nucleotídi-cos, compreendendo unicamente bases timina (polyT), que se hibridam por complementaridade sobre a sequência polyA dos diferentes ARNm, a fim de formar um complexo polyT-polyA que serve então de ponto de partida à reação de transcrição inversa realizada pela enzima transcriptase inversa. São obtidos então diferentes ADN complementares dos diferentes mensageiros de ARN inicialmente presentes na amostra biológica. Na sequência da exposição, designa-se por ADNc, um ADNc complementar de um mensageiro de ARN.
[0024] Por iniciador de amplificação, entende-se um fragmento nucleotídico, compreendendo de cinco a cem motivos nucleotídicos, preferencialmente de 15 a 25 motivos nucleotídicos e possuindo uma especificidade de hibridização em condições determinadas para a ini- ciação de uma polimerização enzimática, por exemplo, em uma reação de amplificação enzimática.
[0025] Por reação de amplificação enzimática, entende-se um processo que gera múltiplas cópias de um fragmento nucleotídico alvo com o auxílio de iniciadores de amplificação específicos pela ação de pelo menos uma enzima. Essas reações de amplificação são bem conhecidas do técnico e podem-se citar notadamente as seguintes técnicas: PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Sequence Replication) com o pedido de patente WO-A-90/06995, NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), e TMA (Transcription Mediated Amplification) com a patente US-A-5,399,491.
[0026] Fala-se então de amplicons para designar os polinucleotídeos gerados por uma técnica de amplificação enzimática. Preferencialmente, quando a amplificação enzimática é uma PCR, o reagente específico compreende pelo menos dois iniciadores de amplificação específicos, a fim de amplificar uma região particular do ADN complementar do ARNm oriundo do gene-alvo. Quando a amplificação enzimática é uma PCR realizada após uma reação de transcrição inversa, fala-se de RT-PCR.
[0027] Por sonda de hibridização, entende-se um fragmento nucleotídico compreendendo de 5 a 100 motivos nucleotídicos, notadamente de 6 a 35 motivos nucleotídicos, possuindo uma especificidade de hibridização em condições determinadas para formar um complexo de hibridização com um fragmento nucleotídico alvo. Na presente invenção, o fragmento nucleotídico alvo pode ser uma sequência nucleotídica compreendida em um mensageiro de ARN ou uma sequência nucleotídica compreendida em um ADN complementar obtido por transcrição inversa desse mensageiro de ARN.
[0028] Por hibridização, entende-se o processo no decorrer do qual, em condições apropriadas, dos fragmentos nucleotídicos, tais como, por exemplo, uma sonda de hibridização e um fragmento nucleotídico alvo, tendo sequências suficientemente complementares são capazes de formar um duplo filamento com ligações hidrogênios estáveis e específicas. Um fragmento nucleotídico "capaz de se hibridizar" com um polinucleotídeo é um fragmento que pode se hibridizar com esse polinucleotídeo em condições de hibridização, que podem ser determinadas em cada caso de forma conhecida, as condições de hibridização são determinadas pela estringência, isto é, o rigor das condições operacionais. A hibridização será tanto mais específica, quanto mais ela for efetuada com mais forte estringência. A estringência é definida notadamente em função da composição em bases de um duplex sonda/alvo, assim como pelo grau de mesaemparelhamento entre dois ácidos nucleicos. A estringência pode também ser função dos parâmetros da reação, tais como a concentração e o tipo de espécies iônicas presentes na solução de hibridização, a natureza e a concentração de agentes desnaturantes e/ou a temperatura de hibridização. A estringência das condições nas quais uma reação de hibridização deve ser realizada dependerá principalmente das sondas de hibridização utilizadas. Todos esses dados são bem conhecidos e as condições apropriadas podem ser determinadas pelo técnico Em geral, segundo o comprimento das sondas de hibridização utilizadas, a temperatura para a reação de hibridização está compreendida entre aproximadamente 20 e 70 °C, em particular entre 35 e 65 °C em uma solução salina a uma concentração de aproximadamente 0,5 a 1 M. Realiza-se em seguida uma etapa de detecção da reação de hibridização.
[0029] Por detecção, entende-se seja uma detecção direta por um método físico, seja um método de detecção com o auxílio de um marcador. Numerosos métodos de detecção existem para a detecção dos ácidos nucleicos[4, 5].
[0030] Por marcador, entende-se um traçador capaz de gerar um sinal. Uma lista não limitativa desses traçadores compreende as enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo, por colorimetria, fluorescência ou luminescência, como a peroxidase de raiz forte, a fosfatase alcalina, a betagalactosidase, a glicose-6- fosfato desidrogenase; os cromóforos como os compostos fluorescentes, luminescentes ou corantes; os grupamentos com densidade eletrônica detectáveis por microscopia eletrônica ou por suas propriedades elétricas como a condutividade, pelos métodos de amperometria ou de voltametria, ou por medidas de impedância; os grupamentos detectáveis por métodos ópticos como a defração, a ressonância plasmon de superfície, a variação de ângulo de contato por métodos físicos, como a espectroscopia de força atômica, o efeito, etc; as moléculas radioativas, como 32P, 35S ou 125I. Assim, o polinucleotídeo pode ser marcado durante a etapa de amplificação enzimática, por exemplo, utilizando um nucleotídeo trifosfato marcado pela reação de amplificação. O nucleotídeo marcado será um desóxi-ribonucleotídeo nos sistemas de amplificação, gerando um ADN, como a PCR, ou um ribonucleotídeo nas técnicas de amplificação que geram um ARN, como os técnicos TMA ou NASBA. O polinucleotídeo pode também ser marcado após a etapa de amplificação, por exemplo, hibridizando uma sonda marcada segundo a técnica de hibridização intercalada descrita no documento WO-A-91/19812.
[0031] No sentido da presente invenção, a sonda de hibridização pode ser uma sonda dita de captura. Nesse caso, o fragmento nucleotídico alvo pode ser previamente marcado por meio de um marcador. A sonda dita de captura é imobilizada ou imobilizável sobre um suporte sólido por qualquer meio apropriado, isto é, direta ou indiretamente, por exemplo, por covalência ou adsorção. Realiza-se então uma reação de hibridização entre essa sonda de detecção e o fragmento nucleotídico alvo marcado.
[0032] A sonda de hibridização pode também ser uma sonda dita de detecção. Nesse caso, a sonda de hibridização pode ser marcada por meio de um marcador. Realiza-se então uma reação de hibridização entre essa sonda de captura e o fragmento nucleotídico alvo.
[0033] Que se utiliza uma sonda dita de captura ou uma sonda dita de detecção, a reação de hibridização pode ser realizada sobre um suporte sólido que inclui todos os materiais sobre os quais pode ser imobilizado um ácido nucleico. Materiais de síntese ou materiais naturais, eventualmente modificados quimicamente, podem ser utilizados como suporte sólido, notadamente os polissacrídeos, tais como os materiais à base de celulose, por exemplo, o papel, derivados de celulose, tais como o acetato de celulose e a nitrocelulose ou o dextrano, polímeros, copolímeros, notadamente à base de monômeros do tipo estireno, fibras naturais, tais como o algodão, e fibras sintéticas, tais como o náilon; materiais minerais, tais como a sílica,o quartzo, vidros, cerâmicas; látex; partículas magnéticas; derivados metálicos, géis, etc. O suporte sólido pode estar sob a forma de uma placa de microtitulação, de uma membrana conforme descrito no pedido WO-A-94/12670, de uma partícula ou de um biochip.
[0034] Na presente invenção, a determinação da expressão do gene S100A9 e do gene S100A8 pode ser analisada pela expressão dos ARNm que são transcritos em um tempo determinado. Nesse caso, o material biológico é um ácido nucleico, e o reagente específico pode ser indiferentemente um iniciador de amplificação ou uma sonda de hibridização, tais como definidas anteriormente.
[0035] Pode-se determinar a expressão de um gene-alvo da seguinte maneira:
  • 1) após terem sido extraídos os ARN totais de uma amostra biológica, realiza-se uma etapa de transcrição inversa, tal como descrita anteriormente, a fim de obter os diferentes ADN complementares dos diferentes mensageiros de ARN inicialmente presentes na amostra biológica (ou ADNc);
  • 2) amplificam-se especificamente os ADNc. Nesse caso, o reagente específico utilizado compreende pelo menos um iniciador de amplificação específico do gene-alvo, tal como definido anteriormente. Essa etapa pode ser realizada notadamente por uma reação de amplificação de tipo PCR ou por qualquer outra técnica de amplificação apropriada; e
  • 3) determina-se a expressão do gene-alvo, quantificando os ADNc. Os ADNc podem ser quantificados notadamente pela utilização de uma faixa de quantificação obtida por uma reação de amplificação conduzida até à saturação. A fim de considerar a variabilidade de eficácia enzimática que pode ser observada, quando das diferentes etapas (transcrição inversa,.PCR...), pode-se normalizar a expressão do gene-alvo dos diferentes grupos de pacientes, pela determinação simultânea da expressão de um gene dito de família, cuja expressão é similar nos diferentes grupos de pacientes. Realizando-se uma relação entre a expressão do gene-alvo e a expressão do gene de família, corrige-se assim qualquer variabilidade entre as diferentes experiências. O técnico poderá se referir notadamente às seguintes publicações [6,7].
[0036] Pode-se também determinar a expressão de um gene-alvo da seguinte maneira:
  • 1) após ter extraído os ARN totais de uma amostra biológica, realiza-se uma etapa de transcrição inversa, tal como descrita anteriormente, a fim de obter as diferentes ADN complementares dos diferentes mensageiros de ARN inicialmente presentes na amostra biológica (ou ADNc);
  • 2) imobiliza-se os ADNc sobre uma membrana;
  • 3) determina-se a expressão do gene-alvo, hibridizando-se os ADNc com sondas de hibridização específicas do gene-alvo previamente marcadas. Essas técnicas de hibridização são bem conhecidas do técnico, e pode-se citar notadamente a técnica de Northern blot. Essa reação de hibridização pode ser realizada após uma etapa de amplificação específica dos ADN complementares dos mensageiros de ARN de um gene-alvo, quando notadamente o gene é ligeiramente expresso.
[0037] A expressão de um gene-alvo pode ser analisada pela expressão das proteínas codificadas pelo gene-alvo. Nesse caso, o material biológico é uma proteína e várias técnicas de detecção com ou sem ligante podem ser utilizadas. A espectrometria de massa pode ser utilizada como técnica de detecção sem ligante. O reagente específico pode ser um anticorpo específico da proteína codificada pelo gene-alvo para um sistema de detecção com ligante.
[0038] Os anticorpos recombinantes, específicos da proteína traduzida do gene-alvo podem ser obtidos segundo processos clássicos conhecidos do técnico, a partir de organismos procariotas, tais como bactérias, ou a partir de organismos eucariotas, tais como levedos, células de mamíferos, de plantas, de insetos ou de animais, ou por sistemas de produção extracelular.
[0039] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, segundo as técnicas clássicas conhecidas do técnico, tais como a técnica dos hibridomas, cujo princípio geral é lembrado a seguir.
[0040] Em uma primeira etapa, imuniza-se um animal, geralmente um rato (ou células em cultura no âmbito de imunizações in vitro) com um antígeno alvo de interesse, cujos linfócitos B são então capazes de gerar anticorpos contra esse antígeno. Esses linfócitos geradores de anticorpos são em seguida fundidos com células mielomatosas "imortais" (murinos no exemplo) para dar origem a hibridomas. A partir da mistura heterogênea das células assim obtida, efetua-se então uma seleção das células capazes de gerar um anticorpo particular e se multiplicar indefinidamente. Cada hibridoma é multiplicado sob a forma de clone, cada um levando à produção de um anticorpo monoclonal, cujas propriedades de reconhecimento face o antígeno de interesse poderão ser testadas, por exemplo, em ELISA, por imunotransferência em um ou duas dimensões, em imunofluorescência, ou com o auxílio de um biocaptador. Os anticorpos monoclonais, assim selecionados, são na sequência purificados notadamente segundo a técnica de cromatografia sobre coluna de sílica-gel de afinidade.
[0041] Fragmentos de anticorpos podem, por exemplo, ser obtidos por proteólise. Assim, eles podem ser obtidos por digestão enzimática, resultando em fragmentos de tipo Fab (tratamento com papaína[8]) ou de tipo F(ab)'2 (tratamento com a pepsina [9]). Eles podem também ser preparados por via recombinante [10]. Um outro fragmento de anticorpo que convém aos fins da invenção compreende um fragmento Fv que é um dímero constituído da associação não covalente do domínio variável leve (VLC) e do domínio variável pesado (VH) do fragmento Fab, portanto, da associação de duas cadeias polipeptídicas. A fim de melhorar a estabilidade do fragmento Fv, devido à dissociação das duas cadeias polipeptídicas, esse fragmento Fv pode ser modificado por engenharia genética, inserindo uma ligação peptídica adaptada entre o domínio VL e o domínio VH[11]. Fala-se então de fragmento scFV (single chain Fragment Variable), pois é constituído de uma única cadeia polipeptídica. A utilização de uma ligação peptídica composta preferencialmente de 15 a 25 ácidos aminados permite ligar a extremidade C-terminal de um domínio na extremidade N-terminal do outro domínio, constituindo assim uma molécula monométrica dotada de propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo sob sua forma completa. As duas orientações dos domínios VL e VH convêm (VL-ligação-VH e VH-ligação-VL), pois elas apresentam propriedades funcionais idênticas. Naturalmente, qualquer fragmento conhecido do técnico e apresentando as características imunológicas definidas acima é con- veniente para fins da invenção.
[0042] Quando o material biológico é uma proteína oriunda da expressão de um gene, pode-se determinar a expressão deste, detectando ou quantificando essa proteína por western Blot ou ELISA, ou qualquer outro método conhecido do técnico, tal como um método de quimiluminescência, a partir do material biológico.
[0043] A técnica ELISA ("Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay") é uma dosagem imunoenzimática sobre suporte sólido. Esse teste entra no âmbito mais geral das EIA ("Enzyme Immunoassays") na qual a dosagem é acoplada a uma reação catalisada por uma enzima. A técnica utiliza um ou dois anticorpos. O anticorpo de detecção dá formação de complexos imunes (antígeno / anticorpos) é acoplado à enzima e pode gerar a emissão de um sinal por um substrato cromógeno ou fluorógeno. A técnica Western Blot é um teste para detectar uma proteína específica em uma amostra com o auxílio de anticorpo específico dessa proteína compreendendo as seguintes etapas, tal como descritas a seguir.
[0044] A primeira etapa é uma eletroforese sobre gel, que permite separar as proteínas da amostra segundo o seu tamanho.
[0045] As proteínas no gel são então transferidas sobre uma membrana (nitrocelulose, PVDF...) por pressão ou por aplicação de uma corrente elétrica, as proteínas fixando-se na membrana, graças a interações hidrófobas e iônicas.
[0046] Após saturação dos locais de interação não específica, um primeiro anticorpo, específico da proteína a estudar (anticorpo primário) é incubado na membrana.
[0047] A membrana é em seguida enxaguada a fim de retirar os anticorpos primários não ligados não ligados, depois incubada com anticorpos ditos secundários, que vão se ligar aos anticorpos primários. Esse anticorpo secundário é habitualmente ligado a uma enzima que permite a identificação visual da proteína estudada sobre a membrana. O acréscimo de um substrato marcado da enzima gera uma reação colorida que é visível sobre a membrana.
[0048] A análise da expressão do gene S100A9 e/ou do gene S100A8 permite determinar a susceptibilidade de um paciente para contrair uma infecção nosocomial, em particular um paciente que apresenta uma resposta sistêmica inflamatória, e de estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica. Pode-se, por exemplo, analisar a expressão de pelo menos um gene-alvo em um paciente do qual não se conhece a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial, e comparando com valores de expressão média conhecidos do gene-alvo de pacientes sensíveis e valores de expressão média conhecidos do gene-alvo de pacientes não sensíveis, determinar seu paciente é capaz de contrair uma infecção nosocomial. Do mesmo, pode-se, por exemplo, analisar a expressão de pelo menos um gene-alvo e comparando-a com médias de expressão conhecida do gene-alvo estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica, incluindo um prognóstico de sobrevivência ou de morte.
[0049] A invenção tem, portanto, por objeto um processo para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial em um paciente, segundo o qual:
  • a) se dispõe de uma amostra biológica de um paciente e se extrai material biológico da amostra biológica;
  • b) se dispõe de pelo menos um reagente específico de um produto de expressão de pelo menos um gene-alvo escolhido dentre os genes-alvo S100A9 e S100A8;
  • c) se determina a expressão de pelo menos um dos genes-alvo S100A9 e S100A8, uma superexpressão em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de uma susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial.
[0050] Pode-se na etapa c) determinar a expressão do gene-alvo S100A9 e do gene-alvo S100A8, uma superexpressão do gene-alvo S100A9 em relação a um valor limite determinado e uma superexpressão do gene-alvo S100A8 em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de uma susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial.
[0051] O técnico possui diferentes possibilidades para determinar um valor limite. Pode-se citar como exemplo a determinação do índice de Youden.
[0052] O índice de Youden corresponde a uma medida da taxa global de não erro. Ele varia entre 0, para um teste que não permite a discriminação de duas populações, e um, para um teste que permite uma discriminação perfeita das duas populações. O máximo do índice de Youden corresponde ao valor limite para o qual o número de falsos resultados (falso negativo ou falso positivo) é menor. Quanto mais o índice de Youden estiver próximo de um, mais os desempenhos diagnósticos serão bons[12].
[0053] Em particular, a amostra biológica é coletada em um paciente que apresenta uma resposta sistêmica inflamatória associada ou não a uma infecção. A amostra biológica pode ser uma amostra de sangue e o material biológico extraído pode ser, dentre outros, um ácido nucleico. De preferência, são extraídos os ARN totais da amostra biológica e a determinação da expressão do gene-alvo é realizada pela análise da expressão dos ARNm.
[0054] Em um modo de realização preferida do processo da invenção o reagente específico compreende pelo menos um iniciadore de amplificação ou pelo menos uma sonda de hibridização específica do produto de expressão de gene-alvo S100A9 e/ou do gene-alvo S100A8; ou pelo menos um anticorpo específico do produto de expressão do gene-alvo S100A9 e/ou do gene-alvo S100A8.
[0055] O processo é notadamente apropriado para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial em um paciente em síndrome séptica, isto é, apresentando uma resposta sistêmica inflamatória em uma infecção, tal como SIRS, sepse, sepse severa e choque séptico.
[0056] O reagente específico de um produto de expressão do gene S100A9 e/ou do gene S100A8 é, portanto, utilizado, para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial, em particular, um paciente que apresenta uma resposta sistêmica inflamatória associada ou não para uma infecção. O reagente pode compreender pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A9, pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A8, pelo menos um iniciador de amplificação específica do gene-alvo S100A9, pelo menos um iniciador de amplificação específica do gene-alvo S100A8, pelo menos um anticorpo específico da molécula S100A9 ou pelo menos um anticorpo específico da molécula S100A8.
[0057] A análise da expressão do gene S100A9 e/ou S100A8 permite também estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica (prognóstico incluindo a sobrevida e a morte)
[0058] Também, a invenção propõe um processo para o estabelecimento de um prognóstico da evolução de uma síndrome séptica em um paciente, segundo o qual:
  • a) se dispõe de uma amostra biológica de um paciente e se extrai material biológico da amostra biológica;
  • b) se dispõe de pelo menos um reagente específico de um produto de expressão de pelo menos um gene-alvo escolhido dentre os genes-alvo S100A9 e S100A8;
  • c) se determina a expressão de pelo menos um dos genes-alvo S100A9 e S100A8, uma sub-expressão em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de um prognóstico da evolu-ção da síndrome séptica e uma super-expressão em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de um mau prognóstico da evolução da síndrome séptica.
[0059] Pode-se na etapa c) determinar a expressão do gene-alvo S100A9 e do gene-alvo S100A8, uma subexpressão do gene-alvo S100A9 em relação a um valor limite determinado e uma subexpressão do gene-alvo S100A8 em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de um bom prognóstico da evolução da síndrome séptica;
[0060] uma superexpressão do gene-alvo S100A9 em relação a um valor limite determinado e uma superexpressão do gene-alvo S100A8 em relação a um valor limite determinado em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de um mau prognóstico de evolução da síndrome séptica.
[0061] Está ao alcance do técnico determinar um valor limite. Pode-se citar como exemplo a determinação do índice de Youden. O índice de Youden corresponde a uma medida da taxa global de não erro. Ele varia entre 0, para um teste que não permite a discriminação de duas populações, e um, para um teste que permite uma discriminação perfeita das duas populações. O máximo do índice de Youden corresponde ao valor limite para o qual o número de falsos resultados (falso negativo ou falso positivo) é o menor. Quanto mais próximo de um estiver o índice de Youden, mais os desempenhos diagnósticos são bons[12].
[0062] A amostra biológica pode ser uma amostra de sangue e o material biológico coletado pode ser, entre outros, um ácido nucleico. De preferência, são extraídos os ARN totais da amostra biológica e a determinação da expressão do gene-alvo é realizada pela análise da expressão dos ARNm.
[0063] Em um modo de realização preferido do processo da inven- ção o reagente específico compreende pelo menos um iniciador de amplificação ou pelo menos uma sonda de hibridização específica do produto de expressão do gene-alvo S100A9 e/ou do gene-alvo S100A8; ou pelo menos um anticorpo específico do produto de expressão do gene-alvo S100A9 e/ou do gene-alvo S100A8.
[0064] O reagente específico de um produto de expressão do gene S100A9 e/ou do gene S100A8 é, portanto, utilizado para estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica em um paciente (incluindo um prognóstico de sobrevida ou de morte). O reagente pode compreender pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A9, pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A8, pelo menos um iniciador de amplificação específica do gene-alvo S100A9, pelo menos um iniciador de amplificação específica do gene-alvo S100A8, pelo menos um anticorpo específico da molécula S100A9 ou pelo menos um anticorpo específico S100A8.
FIGURAS
[0065] A figura 1 representa a correlação da expressão gênica de S100A8 e S100A9 (n=86). Ela mostra a forte correlação que existe entre as expressões gênicas das moléculas S100A9 e S100A8 com um coeficiente > a 0,90 (r=0,9134). As expressões gênicas das moléculas S100A9 e S100A8 possuem uma capacidade similar de discriminar os pacientes capazes de contrair uma susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial e de estabelecer um prognóstico de evolução da síndrome séptica.
[0066] A figura 2 ilustra a diferença significativa da expressão do gene S100A8 (p=0,0461) entre os pacientes que sobreviveram e os que não sobreviveram sobre coletas feitas entre D7 e D10, após o início do choque séptico. Legenda : HV = voluntários sadios; S = pacientes que sobreviveram; NS = pacientes que não sobreviveram.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Estudo da expressão do gene S100A9 Amostras
[0067] Um grupo de 44 voluntários sadios (S) e um grupo de 148 pacientes atingidos de uma síndrome séptica (SEP) são coletados no J1, no J2 ou no J3, após choque séptico (H0 sendo a injeção do tratamento vasopressor) foram utilizados, a fim de comparar a expressão do gene S100A9 no sangue periférico. Distinguia-se então um grupo de 44 pacientes sadios (S), e um grupo de 148 pacientes que desenvolvem um choque séptico (SEP).
Extração dos ARN e síntese dos ADNc
[0068] Para cada paciente, a amostra biológica era uma coleta sanguínea, regularmente obtida durante os 10 primeiros dias segundo o início da síndrome séptica desenvolvida pelos pacientes SEP. Uma coleta foi também feita segundo um mesmo protocolo nos pacientes sadios (S). Essas coletas foram feitas diretamente em tubos PAXge-neTM Blood RNA (PreAnaLytiX, Frankin Lakes, USA).
[0069] Após a etapa de coleta sanguínea e a fim de obter uma lise total das células, os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 4 horas, depois conservados a -20 °C até à extração do material biológico. Mais precisamente, nesse protocolo, os ARN totais foram extraídos com o auxílio dos kits Paxgene Blood RNA® (PreAnalytiX), respeitando as recomendações do fabricante. Em resumo, os tubos foram centrifugados (10 minutos, 3000 g) a fim de obter um resíduo de ácidos nucleicos. Esse resíduo foi lavado e retomado em um tampão contendo a proteinase K necessária à digestão das proteínas (10 minutos, a 55 °C). Uma nova centrifugação (5 minutos, 19000 g) foi feita para eliminar os restos celulares e etanol foi acrescentado, a fim de otimizar as condições de fixação dos ácidos nucleicos. Os ARN totais foram especificamente fixados sobre as colunas PAXgene RNA spin column e, antes da purificação destes, uma digestão do ADN contami- nador foi feita com o auxílio do RNAc free DNAse set® (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
[0070] Para cada extração, a qualidade dos ARN totais foi verificada por eletroforese capilar, utilizando o quite RNA 6000 Nano Chip® (Agilent technologies). O instrumento utilizado é o bioanalisador 2100. Uma reação de transcrição inversa (RT) foi realizada em um volume final de 20 μL. O ARN total (0,5 μg) foi misturado com 1 μΙ de polyT a 50 μM e 1 μL de tampão de recozimento, depois incubado durante 5 minutos, a 65 °C. Após resfriamento no gelo, a solução foi misturada com 10 μl de 2 x First Strand Reaction Mix e 2 μL de Superscript III/RNase® fora enzima Mix RT (15 U/μΙ), todos esses produtos sendo oriundos do Superscript First Strand Synthesis Super Mix TM RT-PCR System (invitrogen). A transcrição inversa foi feita durante 50 minutos a 50 °C, depois parada por uma incubação de 5 minutos a 85 °C. Para concluir, cada solução de ADNc foi diluída a 1/10 na água DEPC.
Preparo de faixas de aferição de quantificação
[0071] A partir de um pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 153-179 do gene-alvo S100A9 (GenBank n° NM_002965.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de iniciadores a seguir:
[0072] Iniciador sentido: 5'TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1)
[0073] Iniciador antissentido: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(SEQ ID NO : 2)
Análise da expressão dos ARNm por PCR em tempo real.
[0074] Os ARNm do gene-alvo S100A9 retranscritos em ADNc, conforme descrito acima, foram quantificados por PCR quantitativa em tempo real, utilizando o LightCycler® (Roche). As reações PCR foram feitas com o auxílio do kit fast-Start® DNA Máster SYBR Green I realtime PCR (Roche Molecular Biochemicals). Cada PCR foi feito em um volume final de 20 μΙ contendo 3,6 μΙ de água, 2,4 μΙ de MgCl2, 2 μΙ de SYBR Green mix (Fast Start DNA máster SYBR Green + Taq DNA polymerase) e 1 μl de cada iniciador (10 μM) e 10 μl de solução de ADNc. Os iniciadores utilizados são aqueles descritos anteriormente.
[0075] Após uma etapa de desnaturação de 10 minutos a 95 °C, a amplificação é feita com o auxílio de 40 ciclos de um protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos, a 95 °C, 10 segundos de hibridização 68-58 °C, seguido de uma extensão de 16 segundos a 72 °C). No fim de cada ciclo, a fluorescência emitida pelo SYBR Green foi medida.
[0076] Para confirmar a especificidade da amplificação, os produtos PCR constituíram sistematicamente o objeto de uma análise de curva de fusão (LightCycler®- Roche). Para isto, os produtos PCR foram tratados por uma temperatura crescente de 58 a 98 °C com um aumento de 0,1 °C/segundo. Para cada produto PCR, um único pico foi obtido, quando da análise da curva, caracterizado por uma temperatura de fusão específica.
[0077] A combinação de iniciadores necessários à quantificação do gene de família CPB foi fornecida por Search-LC (Heidelberg, Alemanha; referência 488116).
[0078] A quantidade de ARNm-alvo relativa à quantidade de ARNm do gene da família ciclofilin B foi analisada pela técnica de quantificação relativa com o LightCycler Relative Quantification Sof-tware®(Roche Molecular Biochemicals). O "Second Derivative Maximum Method" do programa LightCyclerTM (Roche) foi utilizado para determinar automaticamente o "Crossing Point" (Cp) para cada amostra. O valor do Cp foi definido como o número de ciclos para o qual a fluorescência era significativamente diferente do ruído de fundo.
[0079] Cinco diluições em séries a 1/10 foram feitas em quadrupli-cata com cada padrão, a fim de gerar uma curva de aferição, expressando o Cp em função do logaritmo do número de cópias. As diluições de padrão foram otimizadas, a fim de que a curva de aferição abranja o nível de expressão esperado para o gene-alvo e o gene de família. As curvas padrões relativas, descrevendo a eficácia de PCR para o gene-alvo e o gene de família, foram geradas e utilizadas para realizar uma quantificação com o LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Resultados obtidos
[0080] Os resultados obtidos são apresentados na tabela 1 abaixo.
Tabela 1
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[0081] O valor _ p do teste de Mann-whitney entre os sadios e os pacientes atingidos por um choque séptico é < 0,0001.
[0082] A expressão do marcador S100A9 nos três primeiros dias do choque séptico era significativamente superexpressa em relação aos doadores sadios.
Exemplo 2 - Estudo da expressão do gene S100A8 Amostras
[0083] Um grupo de 32 voluntários sadios (S) e um grupo de 86 pacientes atingidos por um síndrome séptica (SEP) é coletadas entre D7 e D10, após choque séptico (H0 sendo a injeção do tratamento vasopressor) foram utilizados, a fim de comparar a expressão do gene S100A8 no sangue periférico. Distinguia-se então um grupo de 32 pacientes sadios (S), e um grupo de 86 pacientes que desenvolveram um choque séptico (SEP).
Extracão dos ARN e síntese dos ADNc
[0084] Para cada paciente, a amostra biológica era uma coleta sanguínea, regularmente obtida durante os 10 primeiros dias segundo o início da síndrome séptica desenvolvida pelos pacientes SEP. Uma coleta foi também feita segundo um mesmo protocolo nos pacientes sadios (S). Essas coletas foram feitas diretamente em tubos PAXge-neTM Blood RNA (PreAnaLytiX, Frankin Lakes, USA).
[0085] Após a etapa de coleta sanguínea e a fim de obter uma lise total das células, os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 4 horas, depois conservados a -20 °C até à extração do material biológico. Mais precisamente, nesse protocolo, os ARN totais foram extraídos com o auxílio dos quites Paxgene Blood RNA® (PreAnalytiX), respeitando as recomendações do fabricante. Em resumo, os tubos foram centrifugados (10 minutos, 3000 g) a fim de obter um resíduo de ácidos nucleicos. Esse resíduo foi lavado e retomado em um tampão contendo a proteinase K necessária à digestão das proteínas (10 minutos, a 55 °C). Uma nova centrifugação (5 minutos, 19000 g) foi feita para eliminar os restos celulares e etanol foi acrescentado, a fim de otimizar as condições de fixação dos ácidos nucleicos. Os ARN totais foram especificamente fixados sobre as colunas PAXgene RNA spin column e, antes da purificação destes, uma digestão do ADN contami-nador foi feita com o auxílio do RNAc free DNAse set® (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
[0086] Para cada extração, a qualidade dos ARN totais foi verificada por eletroforese capilar, utilizando o quite RNA 6000 Nano Chip® (Agilent technologies). O instrumento utilizado é o bioanalisador 2100. Uma reação de transcrição inversa (RT) foi realizada em um volume final de 20 μL. O ARN total (0,5 μg) foi misturado com 1 μΙ de polyT a 50 μM e 1 μL de tampão de recozimento, depois incubado durante 5 minutos, a 65 °C. Após resfriamento no gelo, a solução foi misturada com 10 μl de 2 x First Strand Reaction Mix e 2 μL de SuperScript III/RNase® out enzima Mix RT (15 U/μΙ), todos esses produtos sendo oriundos do SuperScript First Strand Synthesis Super Mix TM RT-PCR System (invitrogen). A transcrição inversa foi feita durante 50 minutos a 50 °C, depois parada por uma incubação de 5 minutos a 85 °C. Para concluir, cada solução de ADNc foi diluída a 1/10 na água DEPC.
Preparo de faixas de aferição de quantificação
[0087] A partir de um pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 129-280 do gene-alvo S100A8 (GenBank n° NM_002964.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de iniciadores a seguir:
[0088] Iniciador sentido: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3' (SEQ ID NO : 3)
[0089] Iniciador antissentido: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3' (SEQ ID NO : 4)
Análise da expressão dos ARNm por PCR em tempo real.
[0090] Os ARNm do gene-alvo S100A8 retranscritos em ADNc, conforme descrito acima, foram quantificados por PCR quantitativa em tempo real, utilizando o LightCycler® (Roche). As reações PCR foram feitas com o auxílio do fast-Start® DNA Máster SYBR Green I tempo real PCR quite (Roche Molecular Biochemicals). Cada PCR foi feito em um volume final de 20 μΙ contendo 3,6 μΙ de água, 2,4 μΙ de MgCl2, 2 μΙ de SYBR Green mix (Fast Start DNA máster SYBR Green + Taq DNA polymerase) e 1 μΙ de cada iniciador (10 μΜ) e 10 μl de solução de ADNc. Os iniciadores utilizados são aqueles descritos anteriormente.
[0091] Após uma etapa de desnaturação de 10 minutos a 95 °C, a amplificação é feita com o auxílio de 40 ciclos de um protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos, a 95 °C, 10 segundos de hibridização 68-58 °C, seguido de uma extensão de 16 segundos a 72 °C). No fim de cada ciclo, a fluorescência emitida pelo SYBR Green foi medida.
[0092] Para confirmar a especificidade da amplificação, os produtos PCR constituíram sistematicamente o objeto de uma análise de curva de fusão (LightCycler® - Roche). Para isto, os produtos PCR foram tratados por uma temperatura crescente de 58 a 98 °C com um aumento de 0,1 °C/segundo. Para cada produto PCR, um único pico foi obtido, quando da análise da curva, caracterizado por uma temperatura de fusão específica.
[0093] A combinação de iniciadores necessários à quantificação do gene de família CPB foi fornecida por Search-LC (Heidelberg, Alemanha; referência 488116).
[0094] A quantidade de ARNm-alvo relativa à quantidade de ARNm do gene da família ciclofilin B foi analisada pela técnica de quantificação relativa com o LightCycler Relative Quantification Software® (Roche Molecular Biochemicals). O "Second Derivative Maximum Method" do programa LightCyclerTM (Roche) foi utilizado para determinar automaticamente o "Crossing Point" (Cp) para cada amostra. O valor do Cp foi definido como o número de ciclos para o qual a fluorescência era significativamente diferente do ruído de fundo.
[0095] Cinco diluições em séries a 1/10 foram feitas em quadrupli-cata com cada padrão, a fim de gerar uma curva de aferição, expressando o Cp em função do logaritmo do número de cópias. As diluições de padrão foram otimizadas, a fim de que a curva de aferição abranja o nível de expressão esperado para o gene-alvo e o gene de família. As curvas padrões relativas, descrevendo a eficácia de PCR para o gene-alvo e o gene de família, foram geradas e utilizadas para realizar uma quantificação com o LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Resultados obtidos
[0096] Os resultados obtidos são apresentados na tabela 2 abaixo.
Tabela 2
Figure img0002
[0097] O valor_p do teste de Mann-whitney entre os sadios e os pacientes atingidos por um choque séptico é < 0,0001.
[0098] A expressão do marcador S100A8 nos dias D7 a D10 após o choque séptico era significativamente superexpressa em relação aos doadores sadios.
Exemplo 3 - Estudo do valor prognóstico de sobrevida de S100A8 nos pacientes em choque séptico Amostras
[0099] O estudo foi feito sobre um coorte de 86 pacientes que desenvolveram um choque séptico, e admitido em um serviço de reanimação cirúrgico ou médico do centro hospitalar Lyon-Sud. Esses pacientes foram avaliados no J7, J8, J9 ou J10, após choque séptico (H0 sendo o início do tratamento vasopressor).
Extração dos ARN e síntese dos ADNc
[00100] Para cada paciente, a amostra biológica era uma coleta sanguínea, que foi coletada diariamente durante os 10 primeiros dias segundo o início da síndrome séptica (pacientes SEP). Essas coletas foram feitas diretamente em tubos PAXgeneTM Blood RNA (PreA-naLytiX, Frankin Lakes, USA).
[00101] Após a etapa de coleta sanguínea e a fim de obter uma lise total das células, os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 4 horas, depois conservados a -20 °C até à extração do material biológico. Mais precisamente, nesse protocolo, os ARN totais foram extraídos com o auxílio dos quites Paxgene Blood RNA® (PreAnalytiX), respeitando as recomendações do fabricante. Em resumo, os tubos foram centrifugados (10 minutos, 3000 g) a fim de obter um resíduo de ácidos nucleicos. Esse resíduo foi lavado e retomado em um tampão contendo a proteinase K necessária à digestão das proteínas (10 minutos, a 55 °C). Uma nova centrifugação (5 minutos, 19000 g) foi feita para eliminar os restos celulares e etanol foi acrescentado, a fim de otimizar as condições de fixação dos ácidos nucleicos. Os ARN totais foram especificamente fixados sobre as colunas PAXgene RNA spin column e, antes da purificação destes, uma digestão do ADN contami- nador foi feita com o auxílio do RNAc free DNAse set® (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
[00102] Para cada extração, a qualidade dos ARN totais foi verificada por eletroforese capilar, utilizando o quite RNA 6000 Nano Chip®(Agilent technologies). O instrumento utilizado é o bioanalisador 2100. Uma reação de transcrição inversa (RT) foi realizada em um volume final de 20 μL. O ARN total (0,5 μg) foi misturado com 1 μΙ de oligo (dT) 50 μM e 1 μL de tampão de recozimento, depois incubado durante 5 minutos, a 65 °C. Após resfriamento no gelo, a solução foi misturada com 10 μl de 2 x First Strand Reaction Mix e 2 μL de SuperScript III/RNaseTM out enzima Mix RT (15 U/μΙ), todos esses produtos sendo oriundos do Superscript First Strand Synthesis Super Mix®RT-PCR System (invitrogen). A transcrição inversa foi feita durante 50 minutos a 50 °C, depois parada por uma incubação de 5 minutos a 85 °C. Para concluir, cada solução de ADNc foi diluída a 1/10 na água DEPC.
Preparo de faixas de aferição de quantificação
[00103] A partir de um pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 129-280 do gene-alvo S100A8 (GenBank n° NM_002964.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de iniciadores a seguir:
[00104] Iniciador sentido: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3' (SEQ ID NO : 3)
[00105] Iniciador antissentido: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3' (SEQ ID NO : 4)
Análise da expressão dos ARNm por PCR quantitativa em tempo real.
[00106] Os ARNm do gene-alvo S100A8 retranscritos em ADNc, conforme descrito acima, foram quantificados por PCR quantitativa em tempo real, utilizando o LightCycler®2.0 (Roche). As reações PCR foram feitas com o auxílio do fast-Start® DNA Máster SYBR Green I tempo real PCR quite (Roche Molecular Biochemicals). Cada PCR foi feito em um volume final de 20 μΙ contendo 3,6 μΙ de água, 2,4 μΙ de MgCl2, 2 μΙ de SYBR Green mix (Fast Start DNA máster SYBR Green + Taq DNA polymerase) e 1 μΙ de cada iniciador (10 μΜ) e 10 μΙ de solução de ADNc. Os iniciadores utilizados são aqueles descritos anteriormente.
[00107] Após uma etapa de desnaturação de 10 minutos a 95 °C, a amplificação é feita com o auxílio de 40 ciclos de um protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos, a 95 °C, 10 segundos de hibridização 68-58 °C (0.5 °C / ciclo), seguido de uma extensão de 16 segundos a 72 °C). No fim de cada ciclo, a fluorescência emitida pelo SYBR Green foi medida.
[00108] Para confirmar a especificidade da amplificação, os produtos PCR constituíram sistematicamente o objeto de uma análise de curva de fusão (LightCycler® 2.0 - Roche). Para isto, os produtos PCR foram tratados por uma temperatura crescente de 58 a 98 °C com um aumento de 0,1 °C/segundo. Para cada produto PCR, um único pico foi obtido, quando da análise da curva, caracterizado por uma temperatura de fusão específica.
[00109] A combinação de iniciadores necessários à quantificação do gene de família CPB foi fornecida por Search-LC (Heidelberg, Alemanha; referência 488116).
[00110] A quantidade de ARNm-alvo relativa à quantidade de ARNm do gene da família ciclofilin B foi analisada pela técnica de quantificação relativa com o LightCycler Relative Quantification Software® (Roche Molecular Biochemicals). O "Second Derivative Maximum Method" do programa LightCyclerTM (Roche) foi utilizado para determinar automaticamente o "Crossing Point" (Cp) para cada amostra. O valor do Cp foi definido como o número de ciclos para o qual a fluorescência era significativamente diferente do ruído de fundo.
[00111] Cinco diluições em séries a 1/10 foram feitas em quadrupli-cata com cada padrão, a fim de gerar uma curva de aferição, expres- sando o Cp em função do logaritmo do número de cópias. As diluições de padrão foram otimizadas, a fim de que a curva de aferição abranja o nível de expressão esperado para o gene-alvo e o gene de família. As curvas-padrão relativas, descrevendo a eficácia de PCR para o gene-alvo e o gene de família, foram geradas e utilizadas para realizar uma quantificação com o LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Análise dos resultados
[00112] A fim de determinar se a expressão do gene S100A8 é correlacionada com a sobrevida do paciente, um teste de Mann Whitney foi feito. A figura 2 ilustra a diferença significativa de expressão do gene S100A8 (p=0,0461) entre os pacientes que sobreviveram e aqueles que não sobreviveram sobre amostras realizadas entre D7 e D10, após o início do choque séptico.
Exemplo 4 - Estudo da expressão do gene S100A9 para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial de pacientes Amostras
[00113] O estudo foi feito sobre um coorte de 93 pacientes que desenvolveram um choque séptico, e admitido em um serviço de reanimação cirúrgico ou médico do centro hospitalar Lyon-Sud. Esses pacientes foram avaliados no J7, J8, J9 ou J10, após choque séptico (H0 sendo o início do tratamento vasopressor).
[00114] Dentre esses pacientes que desenvolveram um choque séptico 27 pacientes contraíram secundariamente no choque uma infecção nosocomial e 66 não contraíram infecção nosocomial nos 53 dias de observação desse coorte.
Extração dos ARN e síntese dos ADNc
[00115] Para cada paciente, a amostra biológica era uma coleta sanguínea, que foi regularmente obtida durante os 10 primeiros dias segundo o início da síndrome séptica (pacientes SEP). Uma coleta foi também feita secundo um mesmo protocolo nos indivíduos sadios (S). Essas coletas foram feitas diretamente em tubos PAXgeneTM Blood RNA (PreAnaLytiX, Frankin Lakes, USA).
[00116] Após a etapa de coleta sanguínea e a fim de obter uma lise total das células, os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 4 horas, depois conservados a -20 °C até à extração do material biológico. Mais precisamente, nesse protocolo, os ARN totais foram extraídos com o auxílio dos quites Paxgene Blood RNA® (PreAnalytiX), respeitando as recomendações do fabricante. Em resumo, os tubos foram centrifugados (10 minutos, 3000 g) a fim de obter um resíduo de ácidos nucleicos. Esse resíduo foi lavado e retomado em um tampão contendo a proteinase K necessária à digestão das proteínas (10 minutos, a 55 °C). Uma nova centrifugação (5 minutos, 19000 g) foi feita para eliminar os restos celulares e etanol foi acrescentado, a fim de otimizar as condições de fixação dos ácidos nucleicos. Os ARN totais foram especificamente fixados sobre as colunas PAXgene RNA spin column e, antes da purificação destes, uma digestão do ADN contami-nador foi feita com o auxílio do RNAc free DNAse set® (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
[00117] Para cada extração, a qualidade dos ARN totais foi verificada por eletroforese capilar, utilizando o quite RNA 6000 Nano Chip® (Agilent technologies). O instrumento utilizado é o bioanalisador 2100®. Uma reação de transcrição inversa (RT) foi realizada em um volume final de 20 μL. O ARN total (0,5 μg) foi misturado com 1 μΙ de oligo (dT) 50 μM e 1 μL de tampão de recozimento, depois incubado durante 5 minutos, a 65 °C. Após resfriamento no gelo, a solução foi misturada com 10 μl de 2 x First Strand Reaction Mix e 2 μL de SuperScript III/RNaseTM out enzima Mix RT (15 U/μΙ), todos esses produtos sendo oriundos do SuperScript First Strand Synthesis Super Mix® RT-PCR System (invitrogen). A transcrição inversa foi feita durante 50 minutos a 50 °C, depois parada por uma incubação de 5 minutos a 85 °C. Para concluir, cada solução de ADNc foi diluída a 1/10 na água DEPC.
Preparo de faixas de aferição de quantificação
[00118] A partir de um pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 153-179 do gene-alvo S100A9 (GenBank n° NM_002965.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de iniciadores a seguir:
[00119] Iniciador sentido: 5'-TCAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1)
[00120] Iniciador antissentido: 5'- AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(SEQ ID NO : 2)
Análise da expressão dos ARNm por PCR em tempo real.
[00121] Os ARNm do gene-alvo S100A9 retranscritos em ADNc, conforme descrito acima, foram quantificados por PCR quantitativa em tempo real, utilizando o LightCycler® (Roche). As reações PCR foram feitas com o auxílio do fast-Start® DNA Máster SYBR Green I tempo real PCR quite (Roche Molecular Biochemicals). Cada PCR foi feito em um volume final de 20 μΙ contendo 3,6 μΙ de água, 2,4 μΙ de MgCl2, 2 μΙ de SYBR Green mix (Fast Start DNA máster SYBR Green + Taq DNA polymerase) e 1 μΙ de cada iniciador (10 μΜ) e 10 μΙ de solução de ADNc. Os iniciadores utilizados são aqueles descritos anteriormente.
[00122] Após uma etapa de desnaturação de 10 minutos a 95 °C, a amplificação é feita com o auxílio de 40 ciclos de um protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos, a 95 °C, 10 segundos de hibridização 68-58 °C, seguido de uma extensão de 16 segundos a 72 °C). No fim de cada ciclo, a fluorescência emitida pelo SYBR Green foi medida.
[00123] Para confirmar a especificidade da amplificação, os produtos PCR constituíram sistematicamente o objeto de uma análise de curva de fusão (LightCycler® 2.0 - Roche). Para isto, os produtos PCR foram tratados por uma temperatura crescente de 58 a 98 °C com um aumento de 0,1 °C/segundo. Para cada produto PCR, um único pico foi obtido, quando da análise da curva, caracterizado por uma temperatura de fusão específica.
[00124] A combinação de iniciadores necessários à quantificação do gene de família CPB foi fornecida por Search-LC (Heidelberg, Alemanha; referência 488116).
[00125] A quantidade de ARNm-alvo relativa à quantidade de ARNm do gene da família ciclofilin B foi analisada pela técnica de quantificação relativa com o LightCycler Relative Quantification Software® (Roche Molecular Biochemicals). O "Second Derivative Maximum Method" do programa LightCyclerTM (Roche) foi utilizado para determinar automaticamente o "Crossing Point" (Cp) para cada amostra. O valor do Cp foi definido como o número de ciclos para o qual a fluorescência era significativamente diferente do ruído de fundo.
[00126] Cinco diluições em séries a 1/10 foram feitas em quadrupli-cata com cada padrão, a fim de gerar uma curva de aferição, expressando o Cp em função do logaritmo do número de cópias. As diluições de padrão foram otimizadas, a fim de que a curva de aferição abranja o nível de expressão esperado para o gene-alvo e o gene de família. As curvas padrões relativas, descrevendo a eficácia de PCR para o gene-alvo e o gene de família, foram geradas e utilizadas para realizar uma quantificação com o LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Resultados das análises univariada e multivariada
[00127] A fim de determinar as variáveis que influem sobre a sobrevinda de uma infecção nosocomial, uma análise univariada, depois uma análise multivariada são realizadas. A análise univariada é realizada, efetuando-se uma regressão logística do estatuto atingido ou não atingido de uma infecção nosocomial em função de diferentes variáveis e sobre o marcador S100A9 em ARNm nos dias D7 a D10, após o início do choque séptico. Em seguida uma regressão logística multivariada é realizada sobre as variáveis, apresentando um nível de significatividade (p) < 0,15 com a análise univariada. Um método de seleção "backward" (na partida todas as variáveis são consideradas no modelo, depois elas são retiradas uma a uma) é aplicado com um limite de significatividade a 0,05. Os resultados são apresentados na tabela 3 a seguir. A razão ímpar (O.R.) e seu interalo de confiança 95% são indicados para cada resultado.
Tabela 3
Figure img0003
OR : Razão Ímpar
Cl : intervalo de confiança
P : limite de significatividade
[00128] Como sobressai da tabela 3, a análise multivariada revela que uma expressão do marcador S100A9 ≥ 6, 1 de 7 a 10 dias, após o início do choque séptico aumentam significativamente a probabilidade de sobrevinda de uma infecção nosocomial (razão ímpar a 6, 2).
Exemplo 5 - Estudo de correlação da expressão do gene S100A9 e da expressão do gene S100A8. Amostras
[00129] O estudo foi feito sobre um coorte de 86 pacientes que desenvolveram um choque séptico, e admitido em um serviço de reanimação cirúrgico ou médico do centro hospitalar Lyon-Sud. Esses pacientes foram avaliados no J7, J8, J9 ou J10, após choque séptico (H0 sendo o início do tratamento vasopressor).
Extração dos ARN e síntese dos ADNc
[00130] Para cada paciente, a amostra biológica era uma coleta sanguínea, que foi coletada diariamente durante os 10 primeiros dias segundo o início da síndrome séptica (pacientes SEP). Essas coletas foram feitas diretamente em tubos PAXgeneTM Blood RNA (PreA-naLytiX, Frankin Lakes, USA).
[00131] Após a etapa de coleta sanguínea e a fim de obter uma lise total das células, os tubos foram deixados à temperatura ambiente durante 4 horas, depois conservados a -20 °C até à extração do material biológico. Mais precisamente, nesse protocolo, os ARN totais foram extraídos com o auxílio dos quites Paxgene Blood RNA® (PreAnalytiX), respeitando as recomendações do fabricante. Em resumo, os tubos foram centrifugados (10 minutos, 3000 g) a fim de obter um resíduo de ácidos nucleicos. Esse resíduo foi lavado e retomado em um tampão contendo a proteinase K necessária à digestão das proteínas (10 minutos, a 55 °C). Uma nova centrifugação (5 minutos, 19000 g) foi feita para eliminar os restos celulares e etanol foi acrescentado, a fim de otimizar as condições de fixação dos ácidos nucleicos. Os ARN totais foram especificamente fixados sobre as colunas PAXgene RNA spin column® e, antes da purificação destes, uma digestão do ADN contamina-dor foi feita com o auxílio do RNAc free DNAse set®(Qiagen Ltd, Crawley, UK).
[00132] Para cada extração, a qualidade dos ARN totais foi verificada por eletroforese capilar, utilizando o kit RNA 6000 Nano Chip® (Agilent technologies). O instrumento utilizado é o bioanalisador 2100®. Uma reação de transcrição inversa (RT) foi realizada em um volume final de 20 μL. O ARN total (0,5 μg) foi misturado com 1 μΙ de oligo (dT) 50 μM e 1 μL de tampão de recozimento, depois incubado durante 5 minutos, a 65 °C. Após resfriamento no gelo, a solução foi misturada com 10 μl de 2 x First Strand Reaction Mix e 2 μL de SuperScript III/RNase out enzima Mix RT (15 U/μΙ), todos esses produtos sendo oriundos do SuperScript First Strand Synthesis Super Mix® RT-PCR System (invitrogen). A transcrição inversa foi feita durante 50 minutos a 50 °C, depois parada por uma incubação de 5 minutos a 85 °C. Para concluir, cada solução de ADNc foi diluída a 1/10 na água DEPC.
Preparo das faixas aferição de quantificação
[00133] A partir de um pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 153-179 do gene-alvo S100A9 (GenBank n° NM_002965.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de inciadores a seguir:
[00134] Iniciador sentido: 5'TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3' (SEQ ID NO : 1)
[00135] Iniciador antissentido: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(SEQ ID NO : 2)
[00136] A partir de pool de ADNc proveniente de indivíduos sadios, a amplificação da região 129-280 do gene-alvo S100A8 (GenBank n° NM_002964.3) foi realizada por PCR (Polymerase Chain Reaction), conduzida até saturação, utilizando o par de inciiadores a seguir:
[00137] Inciiador sentido: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3' (SEQ ID NO : 3)
[00138] Iniciador antissentido: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3' (SEQ ID NO : 4)
Análise da expressão dos ARNm por PCR quantitativa em tempo real.
[00139] Os ARNm do gene-alvo S100A9 e S100A8 retranscritos em ADNc, conforme descrito acima, foram quantificados por PCR quantitativa em tempo real, utilizando o LightCycler® 2.0 (Roche). As reações PCR foram feitas com o auxílio do kit fast-Start® DNA Máster SYBR Green I tempo real PCR (Roche Molecular Biochemicals). Cada PCR foi feito em um volume final de 20 μΙ contendo 3,6 μΙ de água, 2,4 μΙ de MgCI2, 2 μΙ de SYBR Green mix (Fast Start DNA máster SYBR Green + Taq DNA polymerase) e 1 μl de cada inciador (10 μM) e 10 μl de solução de ADNc. Os inciiadores utilizados são aqueles descritos anteriormente.
[00140] Após uma etapa de desnaturação de 10 minutos a 95 °C, a amplificação é feita com o auxílio de 40 ciclos de um protocolo de "touch-down" PCR (10 segundos, a 95 °C, 10 segundos de hibridização 68-58 °C (0.5 °C / ciclo), seguido de uma extensão de 16 segundos a 72 °C). No fim de cada ciclo, a fluorescência emitida pelo SYBR Green foi medida.
[00141] Para confirmar a especificidade da amplificação, os produtos PCR constituíram sistematicamente o objeto de uma análise de curva de fusão (LightCycler® 2.0 - Roche). Para isto, os produtos PCR foram tratados por uma temperatura crescente de 58 a 98 °C com um aumento de 0,1 °C/segundo. Para cada produto PCR, um único pico foi obtido, quando da análise da curva, caracterizado por uma temperatura de fusão específica.
[00142] A combinação de iniciadores necessários à quantificação do gene de família CPB foi fornecida por Search-LC (Heidelberg, Ale- manha; referência 488116).
[00143] A quantidade de ARNm-alvo relativa à quantidade de ARNm do gene da família ciclofilin B foi analisada pela técnica de quantificação relativa com o LightCycler Relative Quantification Software® (Roche Molecular Biochemicals). O "Second Derivative Maximum Method" do programa LightCyclerTM (Roche) foi utilizado para determinar automaticamente o "Crossing Point" (Cp) para cada amostra. O valor do Cp foi definido como o número de ciclos para o qual a fluorescência era significativamente diferente do ruído de fundo.
[00144] Cinco diluições em séries a 1/10 foram feitas em quadrupli-cata com cada padrão, a fim de gerar uma curva de aferição, expressando o Cp em função do logaritmo do número de cópias. As diluições de padrão foram otimizadas, a fim de que as curvas de aferição abranjam o nível de expressão esperado para o gene-alvo e o gene de família. As curvas padrões relativas, descrevendo a eficácia de PCR para o gene-alvo e o gene de família, foram geradas e utilizadas para realizar uma quantificação com o LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Análises dos resultados
[00145] A fim de determinar se a expressão do gene S100A9 é correlacionada com a expressão do gene S100A8, uma análise de correlação foi realizada. Os resultados apresentados na figura 1 mostram que existe uma forte correlação entre as expressões gênicas dessas duas moléculas, com um coeficiente de Spearman > 0,90. As expressões gênicas das moléculas S100A9 e S100A8 possuem, portanto, uma capacidade similar de discriminar os pacientes capazes de contrair uma infecção nosocomial e estabelecer um prognóstico de evolução de uma síndrome séptica.

Claims (10)

  1. Processo para determinar a susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial em um paciente que desenvolveu choque séptico, caracterizado pelo fato de que:
    • (a) uma amostra biológica é obtida de um paciente e um ácido nucleico ou uma proteína é extraído da amostra biológica;
    • (b) pelo menos um reagente específico de um produto de expressão de um gene-alvo, que é o gene-alvo S100A9, é preparado;
    • (c) a expressão de pelo menos o gene-alvo S100A9 é determinada, uma superexpressão em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de uma suscetibilidade para contrair uma infecção nosocomial.
  2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene-alvo S100A8 é determinada na etapa (c), por uma superexpressão do gene-alvo S100A8 em relação a um valor limite determinado sendo uma indicação de uma susceptibilidade para contrair uma infecção nosocomial.
  3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica foi coletada de um paciente que apresenta uma resposta sistêmica inflamatória associada ou não a uma infecção.
  4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra sanguínea.
  5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A9 compreende dois iniciadores de amplificação específicos do gene-alvo S100A9.
  6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A8 compreende dois iniciadores de amplificação específicos do gene-alvo S100A8.
  7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A9 compreende pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A9.
  8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A8 compreende pelo menos uma sonda de hibridização específica do gene-alvo S100A8.
  9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A9 compreende pelo menos um anticorpo específico da molécula S100A9.
  10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o reagente específico do produto de expressão do gene S100A8 compreende pelo menos um anticorpo específico da molécula S100A8.
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