BRPI1009488A2 - novo sistema de produção de fungos - Google Patents

novo sistema de produção de fungos Download PDF

Info

Publication number
BRPI1009488A2
BRPI1009488A2 BRPI1009488A BRPI1009488A BRPI1009488A2 BR PI1009488 A2 BRPI1009488 A2 BR PI1009488A2 BR PI1009488 A BRPI1009488 A BR PI1009488A BR PI1009488 A BRPI1009488 A BR PI1009488A BR PI1009488 A2 BRPI1009488 A2 BR PI1009488A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
strain
fact
endogenous
protein
secretion
Prior art date
Application number
BRPI1009488A
Other languages
English (en)
Inventor
M Pynnonen Christine
Visser Jacob
Wery Jan
Heinrich Visser Johannes
A Emalfarb Mark
J Punt Peter
T Olson Phillip
Paul Burlingame Richard
Original Assignee
Dyadic Nederland B V
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dyadic Nederland B V filed Critical Dyadic Nederland B V
Publication of BRPI1009488A2 publication Critical patent/BRPI1009488A2/pt
Publication of BRPI1009488B1 publication Critical patent/BRPI1009488B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23025—Saccharopepsin (3.4.23.25), i.e. yeast proteinase A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/926—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
    • G01N2333/928—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
    • G01N2333/93—Fungal source

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

novo sistema de produção de fungos a presente invenção fornece um novo sistema de produção de fungos que compreende uma cepa de fungos hospedeiros de chrysosporium lucknowense onde a secreção endógena de celulase é inferior a 20% da secreção endógena de celulase de chrysospori- um lucknowense cepa 18-25 uv. preferencialmente, ainda a secreção de protease endóge-na, 3-glucanase endógena e celobiohidrolase endógena é inferior a 20% da secreção de chrysosporium lucknowense cepa 18-25 uv. além disso, cepas fúngicas hospedeiras são fornecidas onde vários genes foram interrompidos. de acordo com outro aspecto da invenção um método para produção homóloga e/ou heteróloga de uma proteína pura com uma pureza superior a 75%, que compreende expressar um gene que codifica dita proteína em uma cepa de acordo com a invenção foi descrito. além disso, um método para a produção de misturas de proteínas artificiais compreendendo a expressão de genes que codificam cada uma de ditas proteínas em uma cepa de acordo com a invenção foi revelado. finalmente, um método para triagem simplificada de cepas que funcionalmente expressam uma enzima desejada pela aplicação de ditas cepas foi fornecido.

Description

Figure BRPI1009488A2_D0001
“SISTEMA DE PRODUÇÃO DE FUNGOS”
A presente invenção se refere a uma cepa de fungos hospedeiros de Chrysosporium lucknowense. A invenção refere-se ainda a um método para a produção de homólogos e/ou heterólogos de uma proteína pura, com uma pureza maior do que 75%, a um método para a produção de misturas de proteína artificial e a um método para triagem simplificada de cepas que expressam funcionalmente uma enzima desejada. A invenção refere-se ainda a uma sequência promotora isolada, apropriada para o controle transcricional da expressão gênica em Chrysosporium lucknowense e a um método para isolar uma cepa de fungos hospedeiros de Chrysosporium lucknowense onde a secreção de protease é inferior a 20% da secreção de protease de Chrysosporium lucknowense cepa UV 18-25.
Tem sido demonstrado que os fungos são excelentes para a produção de uma variedade de enzimas. Cepas como Aspergillus, Trichoderma, Penicillium e, recentemente, o fungo Chrysosporium lucknowense C1, foram aplicados na produção industrial de uma ampla variedade de enzimas. Cepas super-produtoras têm sido desenvolvidas e que secretam até 100 g/L ou mais de proteína no caldo de fermentação (vide, por exemplo, Hans Visser et al. Abstracts, J. of Biotechnology, S211-S241 (2007). A grande capacidade de secretar proteínas destes fungos os tornam hospedeiros preferenciais para a produção direcionada de enzimas específicas ou misturas de enzimas. No entanto, normalmente, estes hospedeiros secretam uma mistura de várias enzimas diferentes, criando o produto de proteína bruta indefinida e produzindo, além da atividade da enzima desejada, uma série de atividades não-relevantes ou mesmo contra-produtivas. Isto ainda é verdade para o uso de tais fungos hospedeiros para a produção de atividades de enzimas específicas por super-expressão de genes selecionados através de várias abordagens de modificação genética. Também nestes casos a enzima alvo constituirá somente uma pequena parte do total de proteínas secretadas.
Um sistema de produção microbiana capaz de secretar grandes quantidades de uma enzima específica, sem a presença de altos níveis de outras proteínas seria altamente desejável. Isto permitiría a triagem simplificada de hospedeiros que expressam funcionalmente uma enzima desejada. Isto possibilitaria a produção da enzima relativamente pura. Isto também permitiría a purificação simplificada em larga escala da enzima desejada. Estas vantagens contribuiríam enormemente para, por exemplo, a geração fácil de misturas de enzimas artificiais adaptadas para diferentes aplicações, por exemplo, hidrólise da biomassa vegetal (biocombustíveis e produtos químicos), acabamentos têxteis, aplicações na indústria de papel e celulose.
A produção relativamente limpa de enzimas extracelulares específicas a altos níveis por microorganismos que não secretam intrinsecamente altos níveis de proteína seria uma abordagem não preferencial. A capacidade limitada de secreção de enzimas de tais orga nismos impediría a produção de alto nível da enzima de interesse. O objeto da presente invenção compreende o isolamento de mutantes de urna cepa de fungos com alta capacidade de secreção que inesperadamente deixou de produzir níveis altos de muitas proteínas não desejadas, enquanto mantêm boas características de crescimento, e receptividade à modificação genética. Estas cepas mutantes poderíam ser capazes de funcionar como um hospedeiro para alto niveí de produção de enzimas especificas. A fim de aicançar o objeto pretendido da invenção, a invenção fornece uma cepa de fungo hospedeiro de Chrysosporíum /ucknowense onde a secreção de celulase endógena é inferior a 20% da secreção endógena de ceiuíase de Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25, preferencialmente menos do que 15%, mais preferencialmente menos do que 10%, especificamente menos do que 5%, mais especificamente menos do que 2%, mais especifica mente menos do que 1%, mais especifica mente menos do que 1%, mais especificamente menos do que 0,5% ou menos do que 0,1%, A cepa Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25 foi descrita no pedido internacional de patente WO 0020555. Preferencialmente, a secreção de um ou mais do grupo que consiste de protease endógena, β-glucanase endógena e ceiobiohídrolase endógena da oepa de fungo hospedeiro de acordo corn a invenção é menos do que 20%, mais preferencialmente menos do que 15%, mais preferenciaímente menos do que 10%, especifícamente menos do que 5%, mais especificamente menos do que 1% mais especiflcamente menos do que 0,5% ou 0,1% da secreção da protease endógena, β-glucanase endógena e ceíobíohídroiase endógena respectivamente de Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25. Todos os percentuais mencionados se aplicam â secreção de protease, β-glucanase e ceiobíohídroiase independentemente. Preferencialmente as cepas de acordo com a presente invenção são ainda caracterizadas de modo que a secreção de ceiobiohidroiase endógena 1 (Cbhl) esteja ausente. Mais preferencíaimente, a cepa de acordo com a presente invenção é W1L, depositado em Centraaí Bureau Schímmeícultures (CBS) sob número de acesso 122189 ou W1L#109.1 depositado no CBS sob o número de acesso 122190. Mais preferencialmente a partir das cepas, de acorde cem a presente invenção, o gene que codifica endoquitinase 1 (chil) foi interrompido. Mais preferenciaímente, um ou mais genes selecionados do grupo que consiste destes que codificam protease alcalina 1 (a/p ?), protease alcaiina 2 (a/p2), proteinase A (pep4), β-glucanase (Gial), exo-quitinase (Chi2) e iamínarinase (Laml) foram interrompidos. Especial mente, as capas de acordo com a invenção são W1L#100.1Aalplâpyr5 ou W1L#100.1AalplAchilApyr5. A invenção ainda refere-se a um método para produção homóioga e/ou heterõtoga de uma proteína pura com uma pureza superior a 75 %, preferencíaimente superior a 80%, mais preferencialmente superior a 85, 90 ou 95%, que compreende expressar um gene que codifica dita proteína em uma cepa de acordo com a invenção. Especialmente a invenção fornece um método para a produção de misturas de proteínas artificiais compreendendo a expressão de genes que codificam cada uma de ditas proteínas da mistura em uma cepa de acordo com a invenção. Desta forma misturas de proteínas podem ser preparadas para diferentes aplicações, por exemplo, hidróiise de biomassa vegetai (biocombustíveis e produtos químicos), acabamentos têxteis, aplicações na indústria de papei e celulose. Além disso., a invenção fornece um método para a 5 triaoem simplificada de cepas que expressam funcionaimente orna enzima desejada pela aplicação das cepas de acordo com a presente invenção. De acordo com outro aspecto da invenção, uma sequência promotora isolada é fornecida de forma apropriada para o controle transcricionai de expressão gênica em Ghrysosporium iucknowense, selecionado do grupo que consiste de:
a, q promotor chi1 (0,8) compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ ID
NO 25,
b. o promotor chil (1,8} compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 26.
c. o promotor hexl compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ iD NO 27, o promotor xyi6 compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 28, e, o promotor g/a compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 29 » ou uma parte transcrícionalmente ativa do mesmo.
Ainda um gene químênco compreendendo dita sequência promotora e hospedeiro * compreendendo dito promotor e o gene quiméríoo são fornecidos pela presente invenção. 20 Finalmente foi fornecido um método para isolar uma cepa de fungos hospedeiros de Cftrysosporium lucknow&nse onde a secreção de celulase e a protease é infenor a 20% da secreção de celulase e protease respeotivamente de Chrysosporium iucknowense cepa UV 18-25, compreendendo as etapas de (i) plaquear ChrysQsporíiítn lucknowense em placas de celulose inchada com ácido 25 (ASC), (ii) selecionar pelo menos uma colônia mostrando uma zona clareada de celulose reduzida, (iii) plaquear a cepa selecionada na etapa (is) em placas de leite desnatado, e (iv) selecionar pelo menos uma colônia mostrando um halo reduzido de degradação de proteína. Preferencialmente esto método compreende ainda as etapas de mutagênese antes das etapas (í) e/ou (iii),
Se neste pedido de patente os hospedeiros são definidos por comparação do nível de produção de varias enzimas com Qhrysosporíum lucknowense cepa 18-25 então, claro, a produção de urna e da mesma enzima no hospedeiro deve ser comparada com aquela de
Chrysosporíum tucknowense cepa UV 18-25.
As proteínas mencionadas neste pedido de patente como, por exemplo, protease, μ giucanase. ceiobiohidroiase, proteinase A, β-gíucanase, exo-quitinase e iaminahnase to ram detsnidas conforme descrito no WO 2009/0918537, em nome de Dyadic international Ιπα.
Para enfatizar as vantagens fornecidas pela presente invenção: esta refere-se ao isolamento de novos fungas hospedeiras que perderem sues capacidades intrínsecas de 5 seoretar altos níveis de variedade de proteínas de fundo, enquanto retêm a capacidade de secretar altos nivess de somente algumas enzimas ativas. A invenção também diz respeita á utilização destes hospedeiros para produzir enzimas específicas em altos níveis sem a coprodução de altos níveis de proteínas não-específicas. Além disso, a invenção refere-se à geração de misturas definidas de enzima adaptadas para diferentes aplicações.
A invenção agora será elucidada petos seguintes exemplos não limitantes.
Legendas das figuras mencionadas;
Figura 1: amostras de meio de UV 18-25, W1L tipo selvagem, W1D tipo selvagem e as proteases mutantes W1L# 100.1, WlD#50.g e W1D# 100.b em SDS-PAGE. Essas cepas foram cultivadas em melo #1 (meto de baixa densidade com celulose) por 282 horas, exceto IS para raia 8, que é uma amostra em meio #2 (de alta densidade). A amostra media na raia 1 foi 2 vezes a diluída e o meso de amostra na raia 8 foi 4 vezes diluída.
Figura 2: Amostras de meio de cultura em frasco de agitação de Cl oepa W1L#100.1 e derivados. Raia 1, W1LJ100.1; raia 2, W1L#l00.1Achíl; raia 3, W1#1 OO.IAalpí; raia 4, W1L#100.IÁalplÁchii.
Figura 3: Vetor de clonagem de cosmideos pAopyrGcasarpl,
Figura 4: plasmídeo pCHI4.8. O plasmídeo, que foi isolado do clone #5 de E. coli é mostrado. Este plasmídeo foi usada na construção de vetares de expressão gênica de cepa branca.
Figura õ: A super-expressâo de chi! através da introdução de copias extras do gene .25 chil em W1L#100,1< Raia 1, W1L#100,1 cepa selvagem (controle); raia 3, W1L#100.t Íchi+/pyr5]#3; raia 4. W1L#100.1 [chi+/pyrS]#9; raia 5. W1L#100.1 (chi*/pyr5]#17.
Figura 6: Plasmídeo Pcbhl-glaA (ll)-Tcbhl. Este plasmídeo foi usado na construção de vetares de expressão gênica de cepa branca.
Figura 7: O vetor de expressão do gene pPchil (1,8)-Tcbhl NOTL.
Figura 8: Um mapa esquemático do vetor de expressão do gene pCRS-pPchil(1.8)Tcbhl.
Figura 9: Análise de SDS-PAGE de amostras de cultura sobrenadante de W1L#100.L Aalpl Apyr5 (B2), e cepas transformadas expressando CL10518 de W1L#100.L Aalp!Apyr5 (B3. B4). A seta indica a posição CL10518.
Figura 10: Análise de SDS-PAGE de amostras de sobrenadante de cultura de
W1L#100 LAalptApyrS (Dl), e de cepas transformantes que expressam cbh2 de Wl LJ 100. L AalpIApyrõ (D3-D5). A seta indica a posição CBH2.
Figura 11: Análise de SDS-PAGE de amostras de sobrenadante de cultura de W1L# 1Q0.L AalplAchi1Apyr5 transformado com pyr5 somente (C), e de cepas transformadas que expressão pgx de W1L#1OO.L Aalpl AchlIApyrõ (1, 2).
Figura 12: Análise de SDS-PAGE de amostras de sobrenadante de cultura de W1L#100.LAalp1âchi1Apyr5 transformada com xyll (31. 34) e com um xylIAcbd. As setas indicam as bandas de proteínas representando as variantes xiíanase respectivas.
Figura 13: anàiise de SDS-PAGE de amostras de sobrenadante de cultura de W1L#100.L AalplAchi lApyrS transformada com meio com marcador de seleção somente (71) e com abn2 (68-70), M, marcador.
Figura 14; Anáiise dos transformant.es chil. #1, cepa de controle (transformada com marcador de seleção pyrõ somente). M, marcador. # 65, transformantes chil. A seta indica a banda de proteína Chil.
Figura 15: ge! de proteína de Aspergillus mgerPGH heterôloga purificada produzida por Cl. M, proteínas marcadoras. Os pesos moleculares de três proteínas marcadoras são indicados à esquerda do gel. Raia 1, PGII purificada.
Exemplos
Exemplo 1: Isolamento de mutantes C1 com atividade de ceiulase bastante reduzida (cepas brancas).
Cepa C1 UV 16-25 (descrita em WO/2000/020555) foi mutada usando luz UV para produzir a cepa UV26-2 (Apêndice 1 dos Exemplos). UV26-2 exibiu grandes zonas de olaréamento em placas ASC (ceiuiose inchada com ácido), indicando excesso de produção de celuíase.
UV26-2 não era um mutante estável e estrias sucessivas de UV26-2 resultaram na geração de mutantes ceiulase negativa como mostrado peia ausência de zonas clareadas nas placas ASC. Estas colônias apresentaram esporuíaçâo aumentada e cor branca, enquanto as colônias normais, produtoras de ceiulase, foram de cor creme e não apresentaram esporuíaçâo nas piacas ASC.
Duas colônias brancas (UV26-2W1 e UV26-2W2) foram escolhidas a partir das piacas ASC, junto com duas colônias normais e a produção de ceiulase foi avaliada usando um procedimento de triagem em frasco de agitação. As colônias brancas produziram 6 e 4 U/mi de atividade de ceiulase AzoCMC, enquanto as duas colônias normais produziram 278 e 294 U/ml de atividade de celuíase. Isso confirmou as colônias brancas como sendo mutantes celulase-negativas.
Exemplo 2: isolamento e análise de cepas de protease deficientes de UV26-2W1L e OBÍO··· ” — ~ ”
A purificação da cepa UV26-2W1 em piacas de meio RM-ASP (Apêndice 2 dos Exemplos) resultou na identificação de dois tipos de coiônias: colônias com esporos coloridos pela luz tipo UV 18-25 (UV26-2W1L também indicado como cepa W1L), e colônias com esporos coloridos escuros (rosa) (UV26-2W1D também indicado como cepa W1D).
Em experimentos adicionais os lotes de esporos de ambas W1L e W1D foram irradiados com UV (Apêndice 1 dos Exemplos) e usados em um procedimento de seleção direta para mutantes deficientes de protease (Braaksma et at, 2068). Ciones positivos foram analisados em placas de leite desnatado para suas atividades de protease.
Apôs várias rodadas de purificação e seleção em placas de leite desnatado, duas mutantes d® W1L (W1L#50,c e WI#100.1) e três mutantes de W1D (W1D#50.g, WDfôQ.n e W1D#100.b) com uma halo reduzido em placas de leite desnatado foram selecionados para o cultivo para ensaios de degradação in vitro. Em um primeiro experimento de cultivo estas cepas mutantes e suas parentes foram cultivadas em meio #2 (Apêndice 1 dos Exemplos) por 240 horas a 35CC. Aparentemente, a atividade baixa de celulase nestas cepas não permitiu o crescimento em meio a base de celulose de alta densidade. Nos experimentos de cultivo a seguir, W1L#50.c, W1#100.1, W1D#50.g e W1D#100.b e seus parentes foram cultivadas em meio de celulose de baixa (#1) e alta (#2) densidade por 240 horas a 35SC. Ainda UV 18-25 também foi considerado como controle. As cepas parentes 2W1D, 2W1L e UV 18-25 foram ainda cultivadas em meio #2. Nenhuma das cepas W1L ou W1D cresceu em meio #2 de alta densidade de celulose. No meio #1 pode ser observado um bom crescimento para as cepas ‘brancas’ e suas mutantes deficientes de protease, embora a celulose no meio tenha sido mal usada pelas cepas ‘brancas’. Inesperadamente, observou-se que a cepa parente UV26-2W1D, que mostrou um fenétipo de crescimento instável em placas de agar, fez uso da celulose no meio.
As amostras de meio da cepa parente W1L mostraram menos atividade protease em píacas de leite desnatado em comparação com amostras de meio de cepa parente W1D e UV 18-25 (Tabela 1). isto é contrário ao que foi observado quando as cepas foram cultivadas diretamente em placas leite desnatado. Nesse caso, um halo grande poderia ser detectado ao redor da colônia de UV 18-25 e de W1L após 72 horas de crescimento a 30úC, enquanto um pequeno halo só poderia ser detectado após 144 horas para W1D. As amostras de meio de protease mutante WW#50.g mostraram um pequeno halo em placas de leite até 162 horas de cultivo. Após 188 horas de cultivo, os halos foram semelhantes, como observado para sua cepa parente.
’ Tamanho relativo do halo ί (horas de cultivo) ΐ Cepa
W1L parente wíl#íoõ7í......
Figure BRPI1009488A2_D0002
i Atividade ; de proI tease
U/mi..............
643 ++4- ί +++ j +++ j 119
ΐ.„L.I
WlUHOQA&alpI nd 1 nd i nd i nd i nd i nd i nd 46
W1D parente ”WÍD#5ãg + +4- J + +4· · 4·++ : +++ j + 4-4 j + 4·+ ; 4·?4·4· ; Π0 J:·:*·:·········
WÍD#Í0Õ,b + + j ++ : ++ : + + : ++ 2 -+-+. 3 + + : ftd
4++ i +++· t ++4-1 * +++ j +++ j +++ j +++ :
Tabela 1: Análise de meio de cepas parentes W1L e W1D e suas proteases mutantes selecionadas: WiL#10QJ, WIDÜ50 g e WlD#1Q0.b, UV 18-25 foi tomado como controle. Atividades de protease de amostras de meio de WIL W1L1T1QO.1 e W1L#100.1Aalpl foram ainda determinados. Estas cepas foram cultivadas no meio (baixa ceiulose/lactose/pharmamedia). O pH foi medido e o meio foi colocada em placas para determinar sua atividade de protease. Q tamanho relativo do halo é uma medida para a atividade de protease no meio; nd ~ não determinado.
Análise de amostras de meio de 282 horas destas cepas em gel de SDS-PAGE mostrou que as cepas brancas' produziram muito menos proteína do que UV 18-25 (Fig. 1). Em particular, as duas principais proteínas 50/70 kDa (Cbh!) estavam ausentes nestes sobrenadantes de cultura. Nas cepas brancas as proteínas ’principais1 são as de 75 e 45 kDa. Estas proteínas estão presentes no meto de UV 18-25 como proteínas secundárias,
A partir desta primeira triagem para muíantes sem protease em um UV26-2W1 de fundo as cepas W!D#50.g e W1L#100.1 foram selecionados para análise posterior.
Exemplo 3: Comparação das atividades enzimáticas extra celulares entre UV 18-25 eW1L#100.1.
As atividades enzimáticas diferentes no conteúdo de proteína extraceluiar das amostras de UV 18-25 e W1L&100.1 foram determinadas (Tabela 2). Com base nestes dados foi concluído que W1L#100.1 secreta muito pouco de atividade de celulase específica (menos de 1 % de UV 18-25) e tem muito pouca ou nenhuma atividade de protease detectávei quando comparado a UV 18-25.
i Atividades i UV18-25 W1L#100.l
ί L?MC£IS& í o( 20 I 0..04
i las©) i
I 8eta-glucanase | 10.2 i 0,53
I Celibiohidrolase i 0,72 i 0.09
| Protease (pH 5) i 0,06
i Protease (pH 7) i 0,05 | ΟΌ0 .-.-4
i Protease (pH 9) i 0,04 i 0,00
Tabela 2: Atividades especificas das amostras (U/mg de prot&lna). As atividades de protease foram medidas em três diferentes valoras de pH. Além disso, os níveis de hidrolases podando outras especificidades de substrato (por exemplo, hemi-oeluiose) foram reduzidos também.
Exemple 4: Outra redução de nívei de proteína; identificação de proteínas princi5 pais.
Como descrito acima, a cepa branca é desprovida do espectro de enzimas ceiuioiiticas extraceluiar quando comparado à sua cepa parental Assim, o conteúdo de proteína extraceíuiar em cuituras de cepa branca, como anaiisada por SDS-PAGE, é baixo. Esta característica da cepa é benéfica em reiação à produção de proteínas e purificação, jà que a 10 quantidade relativa de qualquer proteína-alva, expresso em cada cepa serà aita. Além disso, a ausência (quase) de atividade celulase torna a cepa branca uma cepa hospedeira ideai para testes de celuiases novas ou modificadas. O mesmo é váiido para xiianases como nenhuma atividade xilanase principal foi detectâvel.
Para reduzir ainda mais o nível de fundo de proteínas, várias bandas de proteínas 15 principais presentes em um gel SDS-PAGE de um W1L&100.1 e culturas de cepas derivadas foram excisadas e identificadas por sequenciamento N-terminal e/ou análise de MS-MS. A proteína mais abundante fos a Chi! endoquitinase (identificador de gene: CL06081, peptídeos MVYDYAG, MPIYGRS e MFXEASA). Outras proteínas principais foram identificadas como giíooamiiase (Giai, CL09507. peptídeos TGGWSW WPVI..K (SEQ ID No !) e 20 WGSSSEL(I)GNWDTGR (SEQ ID NO 2)), exo-quitínase (Chi2, CL00367, peptídeos TIDAMAWSK (SEQ ID No 3), NFLPV ADILR (SEQ ID No 4), GAYHPSQTYSPEDVEK (SEQ ID NO 5), e SWQLVYQHDPTAGLTAEEAK (SEQ ID No 6) e uma lamínarinase (Laml,
CL08253, peptídeos PQYESAGSWPSSFLSVR (SEQ ID No 7) e VSGQVELTDFLVSTQGR (SEQ ID No 8), Ainda uma protease aicaiina Aipí (CL04253) foi identificada em caldo de cul25 tura de W1L#100.1. Alpl degrada proteínas extraceiulares, e pode degradar as proteínas de interesse.
Exemplo 5; Outra redução do nívei de proteína; interrupção dos genes ohi1, chi2, slat elarnl.
O vetor pChí3-4 (vide Exemplo 9, Isolamento do gene que codifica endoquitinase 1) 30 foi utilizada para a construção do vetar de interrupção de gene. Um fragmenta de 1,1-kb .Mscl/Siul foi substituída com o marcador de seieçãa amdS-rep ou a marcador de seleção pyr5-rep, resultando na vetores pLchil-amdS e pAchil-pyr5, respectivamente. O fragmento de interrupção Lchi 1-amdS fc-i ssolado de pAchil-amdS por digestão com EcaRI. O fragmento de interrupção &.chil-pyr5 foi isolada de pLchil-pyrS par digestão com Smal. A íransfor35 rnação da cepa W1L&100.1 Ápyr5#172-12 usando os fragmentas de interrupção resultou em 215 transformantes &.chlt-pyr5 e 32 transformantes Lchi 1-amdS. Todos os transformantes obtidos foram purificados e anaiisados com hibridização de colônia. Análise de Southern destes transformantes confirmou o isolamento de um transformanie W1L#10Q.1 com um gene chi interrompido (WIL#100.1 Apyr5Ae/?/Fpyr5#46 (pyr5*))<
Culturas em frasco de agitação ern meio Cl de baixa densidade foram realizadas a partir de uma seleção de cepas mutantes W1L#100.1A»yr5ácf?/1. As amostras foram anali5 sadas em SDS-PAGE para avaliar os perfis de proteínas para a ausência de uma proteína Chil (Fig. 2, raia 2 versus raia 1). Como mostrado nenhuma proteína de 45 kDa Chit é observada na cepa mutante &chi1.
Os restantes mais importantes de proteínas extracelulares em cepa branca W1L#i00.1AaipiÁchil e cepas derivadas correspondem a gíiccamilase (Gial), exo-quitinase 10 (Chi2) e íamínarinase (Lami). Estas enzimas foram purificadas a partir do meio de cultura.
As atividades enzimáticas destas proteínas foram verificadas usando (entre outros) amido, quitosana e laminanna, respectivamente, como substratos. Aiém disso, dados de análises de espectrometria de massa (vide Exemplo 4) combinados com dados de sequência do genome de Cl revelaram os genes correspondentes. A fim de reduzir ainda mais a proteína 15 extraceluiar de fundo, genes que codificam Gíal, Chi2< e Lam1 foram interrompidas e, assim, inativados. A interrupção foi baseada na troca do promotor do gene e parte da sequência de codificação 5’ por um marcador de seleção amdS via recombinação homóloga usando aproximadamente sequências de 1,5 kbp upstream a downstream que flanqueíam estes genes promotores e parte da sequência de codificação 5'. Os vetores de interrupção gene, 20 portanto, continham o cassete de expressão amdS mais estas sequências de genes homólogos de fianqueamenío de 1,5 kb. Cepas brancas W1L#100.1 àaipl&chíl e cepas derivadas foram transformadas com os vetores de interrupção de g/af e chi2 e /am7 as transformantes foram tríadas para o genótipo correto usando PCR. Como tai, as cepas brancas com um conteúdo/composição de proteína extracelular ainda mais reduzido foram obtidas. Prote25 ínas-alvo produzidas por essas cepas foram mais de 80% puras no líquido de cultura bruto livre de céíutas.
Exemplo 6: Outra redução da atividade de protease: interrupção específica de genes que codificam c-roteases.
Em gerai, os genes que codificam protease foram interrompidos utilizando fragmen30 tos de DNA que continham marcadores de seleção (amdS, pyr4 ou pyr 5) flanqueados por aproximadamente 1,5 kb de fragmentos de DNA grandes homólogos às regiões up e downstream do gene a ser interrompido. Após a introdução destes fragmentos de DNA de interrupção no hospedeiro branco, uma recombinação homóloga trocou o gene a ser interrompido para o fragmento marcador de seleção. Transformantes correspondentes foram seteoio35 nados como tal. Genes que foram interrompidos desta forma codificaram de forma desvantajosa (em relação a estabilidade da proteína aivo) atividades de protease, por exemplo, aipt, alp2, pep4) ou proteína de fondo significativa (ch/1) ou deviam ser usados como mar cador de seleção (pyr4< pyr5). Através desta abordagem numerosos cepas brancas Cl foram construídas que podem ser utilizadas como hospedeiros para a expressão da proteína-alvo (Tabela 3)..
WIL
WIL SüP#S2 6.14
WIL $LiP#S2 6S
WIL# 100.1
wÍL#100.lÁpyrS
W|L#l00d Aalpl
W1L# 100 J Aalp 1 Apyr5
W1L# i 00.1 Apep4 Apyr5
W1L# 100.1 Aalp 1 Apep4
W|L#l00J Aalpl Apep4 <ipyô
WIL# 100 1 Aalpl Aalp2 Apyr5
WIUIOOJ Achil
WIL# 100.1 Aalpl Achi!
W1L# 100.1 Aalp 1 Achi I Apyr5
W1L# 100.1 Aalp 1 Achi 1 Aalpz
WHJH0O.I Aalpl AchH AalpS Apyr5
WIL#W0.l Aalpl Achil Apep4 W11# 100.1 Aalp I Aohí 1 Agh I Alam 1 Achi2Apyr5
Tahe/a 3: Cepa W1L e derivados
Exemplo 7' identificação dos promotores fortes para a expressão do gene: gene que codifica quiíinase (ch/7 j.
Várias bandas de proteínas principais foram isoladas de amostras de fermentação de Wfl#100,1 cu&vadas em mete de celulose de baixa densidade, a fim de identifier e isolar os promotores fortes que podem ser usados para a expressão do gene na cepa W1L e seus denvados. O sequenciamento N-fermlnal de uma mistura de peptideos obtida após tratamento de CNBr da proteína principal de 45 kDa de Wl L#100.1 resultou na identificação de quatro peptídeos diferentes. Três destes peptídeos (MVYAG, MPIYGRS e MFXEASA) apresentaram homologia com uma endoquitlnase de Aphanoctedium albumfTrichoderma harzianum (CHI__APHAL P32470).
Com base em trás dessas sequências de peptídeos, os primers foram desenhados a fim de obter fragmentos de PCR contendo uma parte do gene que codifica endoquítinase (Tabeia 4). Os primers de PCR foram desenhados com base no uso oodon preferenciai de C1.
í Primer Região i Posição Sequência deduzida
i EndochitpeplC I·???/ k :K ........ s k :: Λ Λ < MVYDYAG (SEQ iD s 240aa ATGGTSTACGACTACGCB
No. 9) GC (SEQ ID No 10)
i Endochitpep2C MPÍYGRS (SEQ ID j 290aa ATGCCSÀTCTACGGVCG
No 11) (SEQ ÍD No. 12)
I Endochit- á :K t CGRCCGTAGATSGGCAT
i pep2revC (SEQ ID No 13)
i Endochit- MFXEASA (SEQ ID 1 380aa GCSSWVGCCTCCCAGAAC
ί pep3revC No. 14) AT (SEQ ID No 15)
1 Primer baseado em uma região homóloga conservada de endoquitlnase
Endochitàc !>G!DO^lv7WlDp6^ GAYGGYATCGAYRTSGAY
No 16) TGG (SEQ ID No 17)
Taibe/a 4: Primers desenhados de endoquitlnase putative com base no uso de côdea Cf
As reações de PCR com esses primers foram realizados utilizando DNA cromossômico de UV 18-25 DNA como modelo. Fragmentos de PCR foram cionados e análise da sequência mostrou que um dos fragmentos de PCR clonados obtidos com Endochitpeplc e Endochítpep2revc (173 pb> continha uma parte de um gene codificando endoquitlnase (chili). Análise de hibridização de DNA cromossômíco de UV 18-25 digerida Ba/nHI e H/nrflII com este fragmento de chil como sonda mostrou um sinal ciaro de hibridização, confirmando que o fragmento de PCR originou DNA de C1. Este fragmento foi usado para cíonar o gene completo da biblioteca de gene de cosmldeos Cl ordenados. A sequência de fragmento (SEQ ÍD No 18) foi como a seguir:
ATGGGCTACGACTACGCCGGCTCGTGGAGCACCGCGGCGGGACACCAGGCC AACCTGTACCCGACCGCCGACGCGGGCAGGACGCCCTTCTCGACCGACAAGGCCCTG TCCGACTACGTCGCCGCCGGCGTCGACCCGGCCAAGATCGTGCTCGGCATGCCCATCT um lucknowense UV 18-25 em E. coli.
Para a construção da biblioteca de cosmideo de Cl o vetor de clonagem de cosmídeo não comercial, pAOpyrGcosarpl (Fig. 3) foi utilizado. Este vetor carrega o marcador de seleção de Aspergillus oryzae pyrG que permite a transformação de uma ampla gama de cepas fúngicas. Além disso, para a transformação altamente eficiente de várias espécies de Aspergillus (para o qual uma grande coleção de cepas mutantes está disponível para clonagem de complemeníação do gene Cl correspondente) o replicador AMA1 esta presente neste vetor. Um sítio de clonagem exclusivo de SamHI permite a clonagem de DNA genômico de Sau3A parcialmente digerido de Chrysosporium cepa UV 18-25.
Uma biblioteca de cosmideo de UV 18-25 foi construída em E. coli e armazenada como estoques de glicerol em -80‘C. O tamanho médio de inserção foi de 20-35 kb. No total, 6800 clones foram obtidos, o que representa uma cobertura do genoma de cerca de 5 vezes. Para ordenar estes clones em placas de 384 poços, diluições dos estoques em glicerol foram semeadas em placas LB-ágar, contendo ampicilina. 7680 colônias individuais foram colhidas manualmente e inoculadas em vinte placas de 384 poços. Estas vinte placas de 384 poços representam a biblioteca ordenada de cosmideo de UV 18-25 em E. coli
As colônias individuais nas vinte piacas de 384 poços foram marcadas em filtros de náilon (Hybond), usando um Staccato 384-pintool (Zymarks). A biblioteca de cosmídeos ordenada foí marcada em octuplicada (num total de 160 filtros). Estes filtros foram colocados em placas de meio LB-ampicilína e incubados a 37>5C para permitir que as colônias crescessem nos filtros. Posteriormente, as colônias foram lisadas e o DNA cosmideo foi ligado aos filtros usando procedimentos padrões.
Exemplgjjsglamentodo.gene^
O fragmento de PCR de 173-bp de chi1 foi usado como uma sonda radioativa marcada para a hibridização de filtros duplicados da biblioteca de cosmideo. A hibridização da biblioteca de gene cosmideo usando este fragmento chi1 resultou em três clones positivos. O DNA foi isolado a partir desses clones e análise de restrição seguida de análise de Southern foi conduzida. Um fragmento de 4,8 kb Hfodlll e um fragmento de 3,4 kb 8g/il mostraram hibridização utilizando a sonda chi1, Os fragmentos 4,8 kb Hfoolll e 3,4 kb 8glll contendo o gene chi1 foram isoladas e subclonados em pMTL24, resultando nos vetores pCHi4.8 (Fig. 4) e pChi3-4, respectivamente. Posteriormente, um sub-clone Sg/ll foi utilizado para anáiise de sequência para obter mais dados de sequência. A sequência completa do gene chH de 18-25 UV foi obtida. O tamanho do gene chH é 1529bp no quai dois introns de 111 bp e 138bp estão presentes.
Exemplo 10: A superexpressão do endoquitinase em W1L#100.1.
Para a superexpressão de endoquitlnase o fragmento Sg/ií 3,4kb contendo o gene chit foi isolado de pChi3-4. Cepas muiti-cópias de chil putatívos em W1L#100.1Apyr5 foram geradas por co-transformacão do fragmento 3,4 kb £?g/íl da chí1 e do fragmento de seleção apyrã e as transformantes corretas foram confirmadas por híbndação de colônia, Culturas em frasco de agitação em meio C1 de baixa densidade foram realizadas a partir de urna seieçào de oepas multi-cópias de W1L#100.1. As amostras foram analisadas em SDSPAGE para avaliar os perfis de proteínas para a superexpressão de Qhil (Fig. 5). Três das cepas multi-cópias de chi1 (raias 3, 4, 5) mostraram uma banda de 45 kDa mais forte comparada à cepa parente (raia 1) indicando superexpressão de quitinase e a utilidade do promotor de chit para alta expressão gênica.
Portanto, um vetor geral de clonagem expressando C1 (pPchíl (0<8)-Tcbhl NOTL)foi construído contendo o promotor chi (Pchí) para dirigir a superexpressão de genes clonados. Inicialmente, o sítio EcoR1 upstream op Pchii em PCHI#4,8 foi removido por um digestão parcial de EcoRI e tratamento do fragmento linear com Klenow gerando &4.8Δ pCHUEcoRI. A partir deste vetor o fragmento 1,9-kb SachSphi foi clonado sítio correspondente de pPt> bhl-gíaA (ll)-Tcòh/(Fig, 6). No vetor resultante, pPchi-Tcbhl Afofl#7.1. os genes-alvo podem ser inseridos nos sítios Ncol-EcoRI. Cassetes de expressão para transformação em cepas C1 podem ser isolados a partir destes oonstrutos como fragmentos Wofl.
A sequência promotora de 0,8 kb chí1 em pCHI#4.8 podería ser mais do que suficiente para conduzir a expressão de chit. No entanto, um promotor chi1 mais longo também foi gerado, amplificando o fragmento de um Pstl-H/hdll! (upstream do sitio Hindi II na posição -775 em relação ao códon iniciador ATG). usando um clones cosmídeos positivos previamente identificados como modelo de DNA. O fragmento resultante foi clonado em pGEM-TEasy e sequenciados. A partir deste plasmídeo o fragmento Pstl-Hmdll! foi isolado e clonado nos sítios correspondentes de pPchíl-xyll-Tcbhl gerando pPchi1(1,8)-xyl1-Tcbh1, no qual o tamanho promotor é de 1,8 kb. O fragmento foi também clonado no sítio correspondente de pPcWf-TobM A/ofl#7..1, gerando a expressão geral do vetor pPch;T(1.8)-Td)M Notl (Fig. 7).
Os níveis de expressão de gene direcionados pelo promotor de quitinase estendido (Pchil (1.8)) e pelo promotor quitinase inicialmente usado (PchU (0.8)) foram comparados pela expressão de dois genes repórteres, xyi1 & alp1. Transformantes de cepa branca foram geradas que expressaram xyll (que codifica uma xilanase) ou atp1 (que codifica uma protease alcalina) (Tabela 5).
Repórter i 0,8 kb Pchíl i Atividade repórter i 1,8 kb Pchíl 1 Atividade repórter
Alp 1(R19) 1 0.7(A) | 1,9 (B)
Xyl1 (R14) 1 Ϊ22 (C) j 1Ϊ75 (D) ..................................__
Tabela 5: Comparação dos promotores Pch/1 curto e estendido em termos do nível de expressão da proteína repórter Atividade repórter atividade de xilanase é expressa co14 mo U/ rn! & atividade de protease alcalina camo U/ mg de proteína. A ~ IVfL^lOO./íPcrt/T^^-a^pyróJ#^ δ * vyiL#/00.//PcWÔ)-a/p//pyr5J#22, C
WiLitWÕ.IAaipl[Pchil-xylllii95. D = WlUtlOCiláalp 1IPcHil(l 8)-xyl1J#A7.
Surpreendentemente, a expressão do gene repórter foi maior no caso do promotor chil estendido (1,8 kb), que indica a necessidade de regiões mais upstream. Em conclusão, um sistema de expressão baseado em Pchil foi desenvolvido para alto nivel de expressão de genes in cepas Brancas Cl.
Exemplo 11; Identificação de outros promotores fortes para a expressão de gene.
Uma abordagem diferente para pesquisar promotores fortes foi realizada com a de10 teoçào quantitativa dos níveis de RNA mensageiro de W1L ou W1L1Ô0.1 RNA. As amostras de RNA foram isoladas de micélío, que foram amostradas em momentos diferentes durante um processo de fermentação em batelada alimentada. Um número de genes foi identificado como sendo fortemente expresso, Para verificar o nível de expressão desses genes, as amostras de RNA também foram separadas em gel, borradas e hibridizadas para sondas es15 pacificas para estes genes (Tabela 6).
Cepa/alimantação WILfoíicose chil | pep4 I hís2a I hexl ............... ........... i cb hi
Lote 0 4 2 21 0 0,3 0
Dia 1 de aliment. 47 5 3 15 8 1 o:
Dia 2 de aliment. 52 3 3 17 8 1 0
W1L#100.l/xtlose
Lota 0 0.2 0 12 0 0 0'
Dia 1 de aliment. 40 3 2 12 3 19 0
Dia 2 de aliment. 36 4 6 17 5 21 0
W Ϊ L#1 ÕÕdfoiicose ............................ ..........—............ .................................
Lote 0 0 1 3 23 0 0,1 Q:
Dia 1 de aliment. 51 05 2 17 7 0,2 0
Dia 2 de aliment. 59 0 2 2 14 8 1 0:
Tabela &: Quantificação dos sinais de expressão da diferentes ganes em fermentações de bateiada controladas. S/ha/s de hibridízaçâo da sonda foram quantificados utilizando um densitômetro. O sinal da sonda no Northern blot foi correlacionado com o sinai da sonda de DNA genõmico de Cl em um Southern blot. Portanto, os valoras na feba/a repre20 sentam o nivel do sinal de hibridização do Northern em relação ao nivel do sinal de hibridização do Southern blot (que foi fixado em i). As sequências de gene são dadas abaixo.
O promotor cbh1, que é um promotor forte em cepas UV 18.25, não é ativo nas cepas brancas. O promotor chil foi o mais forte tanto sob condições da alimentação de glicose quanto xílose. O promotor next è um forte promotor constitutivo durante todas as fases de fermentação e em ambas as condições de alimentação de açúcar. O promotor xytô é altamente ativo sob a condição de alimentação apenas de xiiose. Os promotores pep4, hís2a e bg!1 são moderadamente ativos. Para a expressão de genes de alto nive! nas oepas brancas os promotores chi1, hext e xyiô são muito úteis. Promotores alternativos que também 5 geram alta expressão são .as dos genes pep4, his2a e bgíl. Experiências adicionais de Northern também indicaram que os promotores dos genes xy!4 e xyl8 podem ser usadas para a expressão de genes de alto nível nas cepas brancas quando cuííivadas em xiiose. Glicoamílase (GlaL identificador de gene: CL09507) demonstrou ser uma proteína principal em cepas Cl brancas. O promotor glai é. portanto, também um bom candidato a ser utilizado para a 10 expressão de aíto nível de genes de interesse em cepas brancas. Foi demonstrado que glícoamiiase foi aítamente abundante em uma cepa branca que cresceu na presença de amido. Isto indicou que o promotor glal é forte e induzivel por amido e seus produtos de degradação. como a maltose.
As sequências de nucleotídeos de Pchi 1 (0,8).. Pchi 1 (1,8), Phexl, Pxyl6 e PGIA 1 15 são apresentados abaixo. Notar que os códons de iniciação ATG das regiões de codificação correspondentes são apresentados em negrito e itálico.
Exemplo 12: Sistema de expressão de gene de cepa branca
Dois vetores de expressão foram projetados para expressão de genes no W1L e derivados: pPchíl (1,8)-Tcb.hi Not1 foi oomo descrito acima. Aiém disso, PCRs Pchii-Tcbhi 20 (Fig. 8) foi construído, colocando a sequência repetida C1 na frente do promotor Pchi! em pPchii (1,8)-10^ Not1. Estes vetores foram projetados de tal forma que eles também podem ser combinados, resultando em um únioo vetor que contém vários cassetes de expressão. Os cassetes múltiplos podem ser excisados do vetor como um únioo fragmento de DNA linear.
Muitos genes foram danados e expressos em W1L ou derivados. O procedimento geral foi o seguinte:
- Genes foram identificados pela purificação e caracterização dos produtos gene (genética reversa) e/ou pela mineração genoma. Os genes foram amplificados por PCR ou sintetizados químicamente. A amplificação de genes por PCR foi realizada usando polimera30 ses de DNA PCR proofreading (Phusion ou Supertaq plus). Qs genes amplificados foram cionados em vetores de clonagem PCR, ou seja, pGEM-T-Easy (Promega) ou pJetl (Fermentas) e sequencíados para verificar a regularidade da sequência. Posteriormente, os genes foram hberados do vetor de clonagem PCR e ligados nos sítios Ncol e EcoRI do(s) vetorfes) de expressão.
- Cuidado especial foi tomado na concepção dos pnmers PCR. O códon ATG de i~ nício do gene a ser expresso era parte do sítio de restrição Λ/col nos vetores de expressão da cepa branca. Portanto, os primers PCR 5'(ATG) continham sítios de restrição, que são compatíveis ao sito restrito Ncol do vetor Estes sítios foram, ou seja, próprio Nool (CiCATGG), ou sítios compatíveis que foram cortados dentro do sitio de reconhecimento (RspHI. TjCATGA; Pc/1, AjCATGT ), qu sitios compatíveis que são cortados fora do sítio de reconhecimento (Bsal, GGTCTQ1/5); BspMI, ACCTGC(4/3); Esp31, CGTCTC(VS)).
- Em alguns casos, sítios adicionais de restrição para aqueles que seriam usados pare clonagem de genes foram encontrados nos genes. Nestes oases, os genes foram amplificados por fusão em PCR, onde a fusão de dois fragmentos de PCR foi selecionada para ocorrer no sítio de restrição adicionai nâo desejado. O sitio de restrição indesejado foi removido usando primers de fusão contendo mutações de substituição na sequência do sítio de 10 restrição indesejado. Caso o sítio de restrição indesejado estivesse presente dentro de uma região de codificação de proteína, o nucleotídeo substituído foi selecionado de tai maneira que o códon mutante que codificasse o mesmo aminoácido que o códon original.
- Os cassetes de expressão foram liberados a partir da estrutura do vetor DNA de co// DNA peia restrição A'oti. O cassete de expressão foi posteriormente transformado em derivados W1L simultaneamente com um marcador de seleção, ou seja, pyr5 ou amdS em experimentos de co-transformação.
- Transformantes que produzem positivos e elevados foram selecionados por SDSPAGE ou anáíise de ensaio de enzimas do meio de crescimento. Melhores produtores foram aplicados em fermentações para a produção de grande quantidade do produto do gene de- sejado.
- As seguintes proteínas foram produzidas usando o sistema de expressão de gene da copa branca e os genes correspondentes,
No pedido de patente intemaoíonai WO 2009/018537 foi descrito:
Abfi, Abf2, Abni. Axel, 8gii (--BgiSA), Cbhí, Cbh2, Cbh4, Ghii, Eg2, Eg5, FaeAI, Fa25 eA2, FaeB2, Gali (~Gai53A), Glal (~G!al5A): Pmel, Xyll , Xyii(od), Xyi2, Xyi3, Xyi3-cbd (~xyl3(cd)J. Xy!4, Xyi5: Xyl6.
No pedido de patente internacional WO 2009/033071 foí descrito:
Genes AbO, Abn2, Abn3f Abn4, Abn5, Abn7, Abn9, Agui, Axe2, Axe3, 8ga2, Bxll, Bxi2, Abf5{antígamente conhecido como 8x!3)< GH61 (identificadores de gene; CL09768. 30 CL10518. CL05022, CL04725, CL04750, CL06230, GL05366). Gin, Pgx 1, Rgal, Rgxí, Xgli,
Xyi7, Xyl8, Xyl9, XyílO, Xyil 1.
Aipi: A sequência de DNA Alpí é dada por SEQ ID NO 30. A seqüência de aminoácido Aipi é dada em SEQ ID NO 31
O gene aipi foi expresso e Alpl apresentou atividade de protease (Tabela 5). O “kit 35 de detecção colorimétrica de protease” (Sigma, número do produto PC0100) foi usado para determinar a atividade de protease de Aipi.
Exemplo 13. Expressão de genes que codificam as famíiias de proteína GH61 Ci.
:::17
Um gene que codifica a proteína GH61 (identificador CL 10518) foi super expresso em cepas Cl W1L#100.L AalplApyr5 e WlL#100.1AalpiAcfeiApyr5. Amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por SDS-PAGE e bandas de proteínas foram coradas com Coomassie azul brilhante (C88), A proteína CL10513 ê ± 26 kDa (Fig. 9). Um padrão 5 de fermentação em batelada alimentada foi realizado, que rendeu 13 g de proteína por litro de filtrado de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas BCA
A análise funcional desta proteína foí descrita no pedido de patente internacional WO .2009/033071.
Exemplo 14; Expressão de um gene que codifica células de Cl; cbh2.
O gene que codifica CBH2 (identificador CL09854) foi super expresso em Cl cepa
W1L&100.L AaiplÁpyrô. As amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por SDSPAGE e as bandas de proteína foram coradas com coomassie azul brilhante (CBB). A proteína CBH2 migra em cerca de 55 kDa (Fig. 10), Um padrão de fermentação em batelada alimentada foi realizado, que rendeu 10 g de proteína por litro de filtrado de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas 8CA.
A análise funcional desta proteína foi descrita no pedido de patente internacional WO 2009/018537.
Exemplo 15: Expressão de gene pgx que codifica exo-poiiqaíacturonase de Cl.
O gene que codifica PGX (identificador CL 10389) foi super expresso em Cl cepa
W1L#100.L AaiplAchiiApyrS. As amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por
SDS-PAGE e as bandas de proteína foram coradas com coomassie azul brilhante (CBB). A proteína PGX migra em cerca de 60 kDa (Fig. 11). Um padrão de fermentação em batelada alimentada foi realizado, que rendeu 9 g de proteína por litro de filtrado de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas BCA.
O ensaio a seguir foí usado para medir a atividade da poiígaiacturonase. Este ensaio mede a quantidade de açucares redutores liberados do ácido poligalacturõnico (PGA) peía ação de uma polígaiacturonase. Uma unidade de atividade foi definida como 1 pmole de açúcares redutores liberados por minuto nas condições de reação especificadas.
Reaqentes
- Tampão acetato de sódio (0,2 M, pH 5,0) é preparado como a seguir. 16,4 g de acetato de sódio anidro ou 27,2 g de acetato de sódio * 3H;O é dissolvido em água destilada de modo que o volume final da solução seja 1009 mL (Solução A). Em um frasco separado, 12,0 g (11,44 mL) de ácido acètico glacial é misturado com água destilada para gerar o volume total de 1000 mL (Solução B), Q tampão finai 0,2 M de acetato de sódio, pH 5,0, é pre35 parado peía mistura da solução A com B solução até que o pH da soiução resultante seja igual a 5,0.
-Ácido poligalacturõnico (PGA) foi adquirido da Sigma (St. Louis, EUA).
- Reagents A: 10 g de ácido p-hidroxibenzoico hídrazida (PAH8AH) suspenso em ml de água. 10 mL de ácido clorídrico concentrado foram adicionados e o volume é ajustado para 200 ml. Reagente B: 24,9 g de citrato trissódico foram dissolvidas em 500 ml de água. 2,2 g de cloreto de cálcio foram adicionadas, bem como 40 g de hidróxido de sódio. O volume foí ajustado para 2 L com água. Ambos os reagentes foram armazenados em temperatura ambiente. Reagents de Trabalho: 10 mi de reagente A foram adicionados em 90 ml de reagente B. Esta solução foi preparada todos os dias, e armazenada em gela entre os USOS. .................................... ............ ..................
Usando os reagentes acima, o ensaio é realizado conforme abaixo detalhada.
Amostra de Enzima
- SO pL de PGA (10,0 mg/mL em tampão acetato de sódio 0,2 M pH 5,0) foram misturados com 30 pL de tampão acetato de sódio 0,2 M pH 5,0 e 20 pL da amostra de enzima e incubada a 40'C por 75 minutos. A 25 mL desta mistura de reação, 125 mL da solução de trabalho foram adicionados. As amostras foram aquecidas por 5 minutos a 99dC. Após resfriamento, as amostras foram analisadas através da medição da absorbância a 410 nm (ΑΛ) como As (amostra de enzima).
Branco do substrata
- 50 pL de PGA (10,0 mg/mL em tampão de acetato de sódio 2 M pH 5,0) foram misturados com 50 pL de tampão de acetato de sódio 0,2 M pH 5,0 e incubados a 40 C por 75 minutos. A 25 mL desta mistura de reação, 125 ml da solução de trabalho foram adicionados.
As amostras foram aquecidas por 5 minutos a 99°C. Após resfriamento, as amostras foram analisadas através da medição da absorbância a 410 nm (A4«) como Α$β (amostra de branco de substrata).
Cálculo de Atividade
A atividade é calculada como a seguir: determinar a atividade de poligalacturonase por referência a uma curva padrão de ácido galacturônico.
Atividade (Ul/ml) ~ ΔΑ*1δ / SC * DF, onde - As (amostra enzima) - ASs (branco de substrato), SC é a inclinação da curva padrão e DF è o fator de diluição da enzima.
Ο ΔΑ,ηο de Pgxl (CL 10.389) foi encontrado como sendo 0,78 com uma DF de 1 para enzima produzida em culturas de placa de microtítulação. Nenhuma curva padrão foi analisada, portanto, nenhuma atividade de confiança pode ser calculada. A única conclusão a tirar é que a enzima mostrou-se ativa para o ácido poligalacturônica e, portanto, sugere-se que se trata de uma poligalacturonase.
A análise funcional desta proteína foi descrita no pedido de patente internacional WO 2009/033071.
Exemplo 16: Expressão de um gene que codifica a xilanase CS com e sem o seu domínio de ligação de carboidratos: Xyl1 .
O gene que codifica Xyíl (identificador CL00649) foi super expresso em CS cepa W1L&100.L AalplAchilApyr5. Duas variantes Xyl1 foram produzidas: tanto Xyl1 de compríS mento total ou Xyl 1 sem seu domínio de ligação de carboidrato (cbd). Amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por SDS-PAGE e bandas de proteínas foram coradas com Coomassie Azul Brilhante (CBB) (Fig. 12}. A proteína Xyíl migra em cerca de 40 kDa, enquanto o seu homólogo menos CBD migra em cerca de 30 kDa. Fermentações em bateíada alimentada padrões foram realizadas, o que rendeu 33g de proteína por litro de filtrado 10 de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas Bradford. Atividades de xilanase destes filtrados alcançaram até 3.500 U/mL.
O ensaio a seguir è usado para medir a atividade de xilanase para arabínoxíiano de trigo AZO. Este substrato é insolúvel em soluções tamponades, mas rapidamente se hidrata para formar partículas de gel que são facilmente e rapidamente nidrolisadas por endo15 xilanases específicas liberando fragmentos solúveis marcados por corantes,
Reagentes
- Tampão acetato de sodío (0,2 M< pH 5,0) é preparado como a seguir. 16,4 g de acetato de sòdlo anidro ou 27,2 g de acetato de sódio * 3H2O é dissolvido em água destilada de modo que o volume final da solução seja 1000 mL (Solução A). Em um frasco separado,
12,0 g (11.44 mL) de ácido acético giacial é misturado com água destilada para gerar o volume total de 1000 mL (Solução B). O tampão final 0,2 M de acetato de sódio, pH 5,0, é preparado pela mistura da solução A com B solução até que o pH da solução resultante seja igual a 5.0.
- Arabinoxílano de trigo AZO (AZO-WAX) de Megazyme (Bray. Irlanda, Caí. # 125 AWAXP) é usado como substrato do ensaio. 1 g de AZO-WAX é suspenso em 3 ml de etanol e ajustado para 100 mL com 0.2 M de tampão acetato de sódio pH 5,0 usando agitador magnético. Etanol a 96% é usado para terminar a reação enzimática.
Usando os reagentes acima, o ensaio é realizado conforme abaixo detalhado. Exemplo de enzima
- 0,2 mL de solução estoque 10 mg/ml AZO-WAX foi pré-aquecido a 4CFC por 10 minutos. Esta solução pré-aquecida foi misturada com 0,2 mL da amostra da enzima (préaquecida a 40’0 por 10 min) e incubadas a 40'5C por 10 minutos. Depois de exatamente 10 minutos de incubação. 1,0 mL de etanol 96% foi adicionado e, em seguida, a absorvância a 590 nm (Assí!) foi medida como As (amostra de enzima).
Branco do substrato
- 0,2 mL de solução estoque 10 mg/ml AZO-WAX foi pré-aquecida á 40cC por 10 minutos. Esta solução estoque pré-aquecida foi misturada com 200 uL de tampão acetato de sódio 0,2M pH 5,0 (prè-aquecida a 40çC por 10 min) e incubadas a 40’C por 10 minutes.
Depois de exatamente 10 minutos de incubação. 1,0 ml de etanol 96% foi adicionada e. em seguida, a absorvância a 590 nm (A5gc) foi medida como (branco do substrato).
Cálculo da Atividade
A Atividade è calculada da seguinte forma: determinar a atividade de endo-xilanase por referência a uma curva padrão, produzida a partir de uma endo-xilanase, com atividade conhecida para AZO-WAX,
Atividade (Uí/ml) - ΔΑ?«> / SC * DF, onde ΔΑ*® - AS (amostra enzima) - Ags (branco de substrato), SC é a inclinação da 10 curva padrão e DF è o fator de diluição da enzima.
A anáíise funcional desta proteína foi descrita no pedido de patente internacional WO 2009/018537.
Exemplo 17: Expressão gene abn2 que codifica arabínase 2 de Ci.
O gene que codifica Abn2 (identificador CL03602) foi super expresso em Cl cepa
WlL#100.LAalplApyr5. As amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por SDSPAGE e as bandas de proteína foram coradas com coomassie azul brilhante (CBS). A proteína Abn2 migra em cerca de 50 kDa (Fig. 13). Um padrão de fermentação em batelada alimentada foi realizado, que rendeu 7 g de proteína por litro de filtrado de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas BCA.
A análise funcionai desta proteína foi descrita no pedido de patente internacional
WO 2009/033071.
Exemplo 18: Expressão do pene chi1 que codifica endo-quitinase Ci.
O gene que codifica Chil (identificador CL06081) foi super expresso em Cl cepa W1L#100.LAaíplApyr5. As amostras de sobrenadante de cultura foram analisadas por SDS25 PAGE e as bandas de proteína foram coradas com coomassie azul brilhante (C8B). A proteína Chi1 migra em cerca de 40 kDa (Fig. 14). Um padrão de fermentação em batelada alimentada foi realizado, que rendeu 12 g de proteína por litro de filtrado de fermentação, com base em um ensaio de determinação de proteínas SCA.
A anáiíse funcional desta proteína foi descrita no pedido de patente internacional 30 WO 2009/018537.
Exemplo 19: Expressão de um gene heteróloqo: poli-gaiacturonase II de Aspergillusnig&r,
O gene que codifica polí-galacturonase il de Aspergillus niger (número de acesso X58893) foi expresso em Cl cepa W1L#100.1àalplâchilâpyr5. Após a fermentação a enzima 35 foi purificada utilizando cromatografia de troca iônica e cromatografia por exclusão de tamanho. A endo-PGll purificada migrou em cerca de 40 kDa em gei de SDS-PAGE (Fig. 15).
Esta enzima heteróloga era funcional como foi mostrado pela atividade em áoido poli-gaíacturêníco utilizando o seguinte ensaio.
Ensaio de açúcares redutores: método PAHBAH
Soluções Estoque;
- Substrato: 1% (p/v) de ácido poiigaiacturôníco em H?O.
Reagente A: Ácidc· p-hidroxibenzóico hídrazida (PAHBAH) (10 gramas) é adicionado a 60 ml de água e misturado. A este é adicionado 10 mi de HCI concentrado e o volume è completado até 200 ml.
Reagente B: Dissolver o citrato trissódico (24,9 g) em 500 mi de água, adicionar cloreto de cálcio (2,20 g) e dissolver, adicionar hidróxido de sódio (40,0 g) e dissolver. Ajus10 tar o volume para 2 litros. A solução deve ser clara. Ambos os reagentes foram armazenados em temperatura ambiente,
- Reagente de Trabalho; Adicionar 10 ml de reagente A em 90 ml de reagente B. Esta solução foi preparada todos os dias, e armazenada em gelo entre os usos.
Ensaio:
1.50 μ L de substrato
2. 30 mL 0,2 M HAc/NaOH pH 5,0
3. 20 pl de amostra / enzima (micropiaca não diluído; fermentador>20 x diluída)
4. incubara 37’C por 10 minutos
5. 25μΙ de mistura do ensaio + 125 pL de Reagente de Trabalho (em microplacas 20 de PCR) ou 50μI de mistura do ensaio + 250 pL de reagente de trabalho (em tubo de 1.5 ml)
6. Aquecer a 99C por 5 minutos em Thermal PCR Cycler (micropiaca de PCR) ou em água fervente (tubo de 1,5 ml)
7. Transferir de 100 pl para micropiaca NUNC e medir a extinção a 410nm
Exemplo 20: Geração de misturas de enzimas artificiais para sacarificação eficiente 25 de biomassa vegetal.
Uma mistura de enzima artificiai foi criada pela mistura de proteína bruta Cl UV 13 25Aalpl com proteína bruta a partir de cepas brancas que expressam Cl-p-glícosidase Bgll, Cl-arabinofuranosidase Abf3 e Abn7, Cl-xiíanase Xyí2 e Cl-P-xylosidase Bxll, sendo WLL#100.LAalp!Apyr5 [Bgli/pyr5], WLL#100.LâalplÁchilApyr5 [AbO/pyr5).
WLL#100.Làalp!âchilÁpyr5 [Abn7/pyr5). Wí L#100.LÁalplÁpyr5 [Xyl2/pyr5], e WLL#100. LAalplAchil [Bxll/AmdS], respectivamente. A relação entre os diferentes componentes em uma base de proteína foi de 10 (UVl8-25Áaipl): 1 (proteínas de cepa branca).
A eficiência de sacarificação da proteína bruta da UV18-25Aalpi só foi testada no substrato fareío de trigo e em comparação com a eficiência da mistura artificial. 10 mg de 35 proteína/g de farelo de trigo de matéria seca foram utilizadas. As condições s foram as seguintes: temperatura 50uC, pH 5,0, o tempo de 72 horas.
Foi demonstrado que a mistura cie enzimas a partir UV18-25Aalpl sozinha liberou aproximadamente 30% da giioose, aproximadamente 5% da xiiose e 12% da arabinose do fareio de trigo. A mistura artificiai liberou pelo menos 60% da glicose, 60% da xilose e 25% da arabinose do farelo de trigo.
Exemplo 21: Construção de bibliotecas de genes em cepa Cl branca W1L#100.lAalplÁchi&pyr5 e triagem de xilanases.
Uma biblioteca de genes de DNA genômico de Cl cepa UV 13-25 foi construído em cepa C1 W1L#l00. IAalp1Áchi1Apyr5 pelos métodos descritos anteriormente por Verdoes et al. (2007). A biblioteca foi triada para atividade de xílanase como descrito no Exemplo 4 no capítulo 4, que gerou vários clones positivos que expressaram diferentes xilanases. Análise de SDS-page revelou a presença de bandas de proteína extras nos clones positivos. PCR usando diferentes combinações de primers com base na sequência de xilanases Cl conhecidas e o vetor de sequência revelou a presença de três diferentes Cl-xilanases. Este resultado foi confirmado pela análise de Southern.
Apêndice 1 dos Exempíos: Procedimento de mutação UV para cepas C 1
1. Espalhar a cepa parente em placas PDA (agar dextrose batata) e incubar a 35'O por 14 dias para obter esporos.
2. Raspar os esporos em salina 0,9% e filtrar através de algodão para remover mícélios. Diluir a suspensão resultante de esporos de 1x1esporos/mi, utilizando solução salina. Remover uma pequena aiíquota da suspensão de esporos, diluir em salina e espalhar em placa PDA para determinar a contagem de esporos viáveis inicial.
3. Adicionar 10 mí de suspensão de esporos a uma piaca de Petri de vidro estéril contendo um clipe de papel e agitar em uma placa de agitação magnética. Remover o tampo de vidro e irradiar com luz UV para obter 90-99,9% de morte. Usar uma lâmpada PenRay como a fonte de íuz UV (254 nm) e aquecer por peio menos 10 minutos antes de irradiar a suspensão de esporos.
4. Espalhar a piaca para placas seletivas ASC (Apêndice 2 dos Exemplos) com luzes da saia apagada, usando um volume para obter menos de 30 colônias em cada piaca.
5. Inverter as piacas, colocar em sacos de plástico vermelho e incubar a 30^0 por 6-7 dias para crescer e permitir que as zonas clareadas se desenvolvam.
6. Determinar o % de morte para a mutação como a diferença entre a contagem de placa iniciai viável e uma contagem de placa em PDA após a irradiação UV.
Apêndice 2 dos Exemplos: Meio
Places de AgarASC Seletivas
i Componente Quantidade
i Água deionizada 800 i Mi
| k2HPÕ4 1,0 ............|
i KCI 0.1 ............si
NaCI 0,1 G
MgSO4.7H3O 0,3 G
FeCI;,.6H;.O 0,016 G
(NH4)2SO4 1,9 G
20gZI ASC 200 Ml
Noble Agar .............-................................... 15 G
Ajustar o pH para 7,5 com HCI e esterilizar 30 minutos a 121 °C. Após a esterilização adicionar 20 ml de 25 g/ί de DOC (ácido deoxícólico), estéril filtrado. Verter cerca de 20 mifplaca. Espalhar os esporos mutados com UV para as placas ASC e incubar por 7-14 dias para permitir o crescimento da colônias e limpeza de celulose.
Meio RM-ASP
Componente Quantidade
8aeto Peptona É 9
Extrato Bacto Levedura 1 S
50x AspA(+N) 20 mL
Glicose 10 9
1000x elementos traços 1 ml
MgSO4.7H2O 0,493 9
Água Avolumar para IL
Ajustar o pH para 6.5 antes da autoclavação. Esterilizar glicose separadamente como uma solução a 50%.
50x AspA (+N)
Componente Quantidade
NaNOj (ou(NH4)2SO4) 300 (ou 233) 9
KCI 26 g
Wm 76 g
KOH 10 N 22,5 ml
Água Avolumar para 1L.
10OOx Elementos traços
Componente Quantidade
ZnSO4.7H2O 2,2 g
h3bõ4 1,1 g
MnSO4.H2O 0,427 ........ ' g
FeSO,..7HiO 0,5 9
CoCl2.6H20 0,17 9
CuSOa,5H.Q 0,16 9
Na2Mo04.2H20 0,15 g
EDTA 5 g
Água Avolumar para 1 L
Meto efe celulose de baixa e a/ta densidade
Componente (g/L) Meio de celulose de baixa densidade (#1) Meio de celulose de alta densidade (#2)
BísTrís 15,7 15,7
K2HPO4 0,22 0,66 .
kh2po4 0,08 |24
(NH4)2SOa 4 12
Na3Citrato,H2O Bi............................to ............................/....................i fill................i:............fff............................................/
MgSÕ4.7H2Õ 0,03 w
CaCI2 0,4 0,8
Extrato de Levedura 0$5 0,15
Pharmamedia 5 15
Lactose HSO 5 15
Celulose 2080
Ajustar a pH 7,0, sequência cM: Vide WO 2009/018537,
Sequência de pep4 DNA (SEQ ID No 19);
1 gotggctcaccgttatttgctcccgcaggaagtccaggtcctectcgoagttggacaaaa tctgcttegcagcoígcaactttgactcaaggagGgcGtcggcctcgtcgattgggtaag
121 acagcatgacgtíggGctgccaaatgtcagcctctagaagcacactcccactctcgttgg
181 aaaggticctaccccaagccacaagtaaacctcgtccgtcggcggtatctcggccttcgc
241 atagagsgtgtcgttcaattcgaatgttgtctotatcggatcagattcgccctgccacaa
301 tcaaccgccgatcagcaccatggccgdcatcgagagtggcaacgcctogcccíaccgte
361 ctaagdtcaaaaagoggaGagcctccagcgttttccgaatgtcgggcattttgtccttt
421 agtcccgctacGGtccgctgcaggttdgdccatgaaGtggtatttccigcacgccgac
481 cacgtatcagccgaacgccgtccgtGaaggctggatttcaatdtaaccgggagagdca
541 cgcaatoatctcttggaacogacgcagcgtcggctcaaGatctgctcgtgacgtgacata
601 gtcdcgacdtgtcgacgaatggcgcatacggaatgccacgaggattggagggtgtggc
661 gtccGtgtctGgtgGaggtggíGagtcagoaataacagccagagtgcatatgctagaatg
721 gcgcccgcgggggagggaaagittggttaccttgcígctgcttccitgtctgtgctcgcc 781 atotiggacaaaüctcacatgttgcagtggaaggatactgcaagcgactgttaaccGga 841 gccaacggagtgacgtcgggtttggtacctagtttaggtcaagccgttctcaagctgctg 901 gccaaaaattcatggcggggtcgagtgggcagcgaggtactcctcgíagggagcaaggtg
10 961 aagatgíggggtagcaggggtcgacgctacaaagtsctttgtatccggattgcígtgtgg 1021 tacgaagcgcccgtgtgttggatgctctctgtatgtacggagtactgtacctttctcGat 1081 gcgctgcccGattctctatttgghgcacctgcttcgttcgtagtgtatgtacagcagta 1141 caactatctacgaGaccigcaotgactagtgcgtagaattctttagmctcgagtacgg 1201 cgctaacgcttcgcgcagGaagcaccttcitctgaUgtgitactgtgctcaaacctcgc 1261 cagccagctgcggtgctccacaagcccggccgigcccaaccgccattfgcatcccggtc-c 1321 catgaatctgtggacgacccatccctctctgtacGgcgtcgcggtatcagcccagaatga 1381 lagcgggaagaoaaacgcagfgatícggattacgctcgcaggaaatggggggagtagGtt 1441 gatagctctcoacggcgagggtgtctcaggctgaggtgtcaactagttgtatgtacacíc 1501 aggacgaggcattcígcgttítgaaacaccaatettccaataccggaggtgttgtatgca
15 1561 ggatcacttgaatatgUtgcacccattattaclglacGtggatgattcggacagggcga 1621 gcatgattggtcgouaagttHgtGaccgcattcgcagcgtcggcgggaagcagccaogí 1681 agagcactgccaaacgtttcaagagacaccccatatggagtaaattggagtaatctgtat 1741 ccttcagagccgtGaatcaaactattgtttetcagcaggatggcccgttgGtcatggggg 1801 atgtacccíggíaggtag tícgtígttgatgacUccttggalgagcctg ctgcgcatga
20 1861 aggtgcGggggccccaggttgggtgcctaaaactaactgíaaacagacgcacggtggcga 1921 cgacgtagecgaaccggtotagcgagctttccccggccactacgtaatcggggcgatgca 1981 ctgcaggaaGacctcacacctgacctacoccottcgcctccgcaioogtcccaacccgct 2041 tcccoaaactttooatcaactacttcGgagacícgacaícaccttttcgogtcgtgtcíc 2101 atcgtcgttatcatcaccatcggcgatagatttgttcgcitcgatcgtagcatcgccttg
25 2161 acttcoattcgtcottoacgccgaccgaccggaccagacagtcg cccaaaAT GAAGGAT G 2221 CTTTTTTGCTGACCGCAGCTGTGCTGCTCGGCTCCGCCCAGGGAGCAGTTCACAAAAT GA 2281
30 35 AGCTGCAGAAGATCCCTCTCTCTGAGCAGCTTgtscgtctgaccccgttcaagcacgcgt 2341 cagcggctactgaccttatcgcgtccagGAGGCGGTTCCCATCAACACCCAGCTCGAGCA 2401 TCTCGGCCAAAAATACATGGGGTTGCGCCCACGTGAATCTCAAGCCGATGCCATCTTTA A 2461 GGGCATGGTTGCCGACGTCAAGGGCAACCATCCTATTCCCATCTCCAACTTCATGAACG
C
2521 ACAGTgtatgtgacgccactgtggtggcatggatggctcgtcctcaattcggagactgac
2581 actggagcaccctagACTTCTCCGAGATCACGATTGGAACACCCCCTCAGTCATTCAAGG
2641
TGGTCCTCGATACCGGTAGCTCCAACCTGTGGGTTCCATCAGTCGAGTGCGGCTCGAT
TG
2701 .............. ........................................ ........................
CTTGTTACCTGCACTGGAAGTATGACTCATCTGCCTCGTCCACCTACAAGAAGAACGGA
A.·
2761
CCTCGTTCGAGATCCGCTACGGGTCAGGCAGCCTGAGCGGGTTTGTCTCTCAGGACAC
AG
2821
TGTCCATCGGCGATATCACTATCCAGGGCCAGGACTTTGCCGAGGCGACCAGCGAGCC
CG
2881
GTCTTGCCTTTGCCTTTGGCCGTTTCGACGGTATCCTTGGCCTTGGCTACGACCGGATC
T
2941
CAGTCAACGGCATCGTCCCGCCTTTTTACAAGATGGTCGAGCAGAAGCTCATCGATGAG
C
3001
CCGTCTTCGCCTTCTACCTGGCCGATACCAATGGCCAGTCTGAGGTTGTCTTTGGCGGT
G
3061
TTGACCACGACAAGTACAAGGGCAAGATCACCACCATTCCGTTGAGGCGCAAGGCCTA
CT
3121
GGGAGGTTGACTTCGATGCCATTTCTTACGGCGACGACACTGCCGAGCTTGAGAACAC
TG
3181
GCATCATCCTGGACACCGGTACTTCTCTGATCGCTCTGCCCAGCCAGCTCGCCGAGAT
GC
3241
TCAACGCTCAGATCGGCGCTAAGAAGAGCTACACTGGCCAGTACACCATCGACTGCAA
CA
3301
AGCGCGACTCCCTCAAGGATGTCACGTTCAACCTGGCTGGCTACAATTTCACGCTCGG CO 3361
5 CCTACGACTACGTTCTCGAGGTCCAGGGCAGCTGCATTTCTACCTTTATGGGCATGGAT T 3421 TCCCGGCTCCTACTGGGCCACTTGCGATCCTGGGCGATGCCTTCCTCCGGAGGTATTA CT
10 3481 CCATTTATGACCTTGGCGCCGACACCGTCGGTCTGGCTGAGGCCAAGtgattgaaggatg 3541 ggcggGagggaaagaogatgggtaatacggggagtctgggaatcgggctUggactglgg 3601 tctgtatctagttgctcaagagagttgtcgtttgaíttígttataggatctgtcíaggaa 3661 ccttagcaggagtgaaattthtegtgtacgagcateggcgggctgaagtggtttgataa
15 3721 caagletggacUgagtacgcaggcaghgcacaatctgcttcgccgaggagagcaaagg
3781 cgtcctctUgaaaaagGCtacctacgcgtcacaggggfataattttitgagttfgacct 3841 acgccctgtcccataccaaccgcgtcccaatcixcgtcaacccltgcaatgtcattaccc
3901 gtggatgtatcacgtagcagaagccgacatcGcacacgcttcaacdtcctalccagaca 3961 atgacaiggtaagctcattiittaaaggtcgGcgtoctGCctcccttcacgtgattcatt
20 4021 ttccttgcgccttgtggcgcatcccctgacttoatgocgtacggatcaaagggtgcaaac 4081 ttgccoçgc-acctcttttctgcagccatcatcatcaccatoategccgtttgtcgcctgc 4141 gcagcatgtagcacggacgacgccttgctgtagteaaacggctcctgctcggcatcgtea 4201 tcatggGGítCGtccigtícgoccgaggíctgttcgtcggctgccgaggtcgcgacggag 4261 gcagatgictgctgctgctgctgatgdgctgGtictgggctttcttggcggctegaagt
25 4321 gccttcctggcttgagGCttgagHcctttgctcccUtatgteiCGgttttgagcGagt 4381 tgatctgccaagagctgagGacgcttgaactcttctcgagcagccncttggcttgtttG 4441 ttigcctgcttggcggocttgicatcaccaccctcaaciicctgctogacactaggagac 4501 ttegggtggtctitgoctgcggaaciatctccacccatetcgatgtcggaaaotgcttog 4561 get teggat getgactcaacatcaacat ccct agacttccgctttogaGcagccitcaga
30 4621 gigaaaccttcttcUcgagaacagggagaccctiggtgtcttgttcagcgacacgccig Sequência de aminoácido Pep4 (SEQ !D No 20): 1 MKDAFLLTAA VLLGSAQGAV HKMKLQKIPL SEQLEAVPÍN TQLEHLGQKY MGLRPRESQA 61 DAiFKGMVAD VKGNHPIPIS NFMNAQYFSE (TíGTPPQSF KWLDTGSSN
35 LWVPSVECGS 121 IACYLHSKYD SSASSTYKKN GTSFEIRYGS GSLSGFVSQD TVSiGDITiQ GQDFAEATSE
181 PGLAFAFGRF DGlLGLGYDR ISVNGIVPPF YKMVEQKLID EPVFAFYLAD
TNGQSEWFG
241 GVDHDKYKGK MTTÍPLRRKA YWEVDFDAIS YGDDTAELEN TGHLDTGTS
LlALPSQlAE
301 MLNAQIGAKK SYTGQYTIDC NKRDSLKDVT FNLAGYNFTL GPYDYVLEVQ GSCÍSTFMGM
361 DFPAPTGPLA ILGDAFLRRY YSiYDLGADT VGLAEAK
Sequência de DNA his2a (SEQ ID No .21):
cattcatggg tttgaggccc gattttgaac gtatatccta ggctatattc ggggtaagat actggaagcg ctgggccgga igactagcta tttcaagtgc ccaagagccc atcataccta
121 acKgtggcc taagatctag ccaaatcatt cahggttac occagactcg acgaacctga
181 tattcgaatc cagggcaagt caaatcgccg agiaagactt gacaaacccg gaacccaaga
241 actgcgcaat ctgggagcag gtttccgacc agcatggaaa caccccgatg gaaaacccac
301 acatacgggg atggggacta aegceggaca aateaaaaac cctggaggat tgggtaacga
361 tggggaaglg ogacgggcac tcaacccttc aagcgitgca ggaccttgta cagccaagca
421 gaatgacgga aeccgatgag caaacccgga atctgatgat cctggaaoag aatcatctgt
481 cttgggtacc gaogttggag tgagsgtgtg caaattagca ggatcaagca actatectac
541 ctaaatcagg tcgatcagtt atcagccctt gcaaaccaga cttgatggag ggaagaggtg
601 aaagctgtga ttgagggagg aagctgagaa ttggtggtgg ttgttttgct cagccagggt
661 gtaggacgag aagaacgcgt tcgagattic ggagagcagg ctgtectaga gcattatttt
721 cctggccttg agcaaactta agccagtttt tttttccccg tcgggaggga agtcgetitg
781 aatttgaagc ttgcgggcgc agagctcggc tccataagca fcaaatcaaa tgagcctgaa
841 gcagtcgacc gaUtttttt latctgggtg laatogcaac catgcacata accgttttgg
901 gactagctcc aacagctccg atcaacaacc tgagaaaggc gcgagtgatc cgtgatccca
961 cacccttacg cgaaaactac ttaactccca cctcccccac cgcgggtcaa cttcticcaa
1021 ctcccactca accaacitcc gttttcccat caatcactgc attcgcgcgt caagctcttc
1081 ctcgccctta caccaaccac ataacttttt tatcctttga caaggaccat caatcaaaAT
1141 GACTGGCGGC GGCAAGTCCG GTGGC/3AGGC GAGCGGTTCC
AAGAACGCGC AATCgtaggt
1201 gcccttUcg cgtcatetac ccgcgccttc gtgcagttgg gcatggttca gccttgaact
1261 ccagatgccc güccggtgc tcttacagtt ggctaactlt ttgtagTCGT TCATCTAAGG
1321 CCGGTCTTGC
GTTCCCTGTC
GGTCGTGTCC
ACCGCCTTQT
CCGGAAGGGC AACTACGCCC
1381 AGCGTGTCGG
TGCCGGTGCT
CCCGTTTACC
TGGCTGCCGT
TCTCGAGTAT CTTGCCGCTG
1441 AAATTCTGGA
GCTGGCTGGC
AACGCCGCTC
GCGACAACAA
GAAGACGCGT ATCATCCCGC
< 1501 GTCACTTGCA ACTCGCTATC AGGAACGATG AGGAGTTGAA CAAGCTTCTC GGGCACGTCA 1561 CCATCGCCCA GGGTGGTGTC CTTCCCAACA TCCACGAGAg tacgttgcct tacoagacga
5 1621 tctctaatgc gcaaatctaa ctttgtttoc agACCTTCTG CCGAAGAAGA CCGGCAAGAC 1681 CGGCAAGAAC TTGTCGCAGG AGCTCígaít ttegcggttg ggtttttitg ctttatttto 1741 tggtcggcac gdgggUca tgataioggg gtcacggttt cgggtcattg gttgcttttt 1801 gogcgtgttt gggcigtaca ttaattcoal gatgggcatg gtcatggtta tgaatgagaa
10 1861 tatcGtctga acatecaaai cclgacacag tttgctcgag tfgatgtctg cattggaagc 1921 gactcgttga cggtaccgcg tagagtcttg tcgcttacga aattcttgca tcgcacagat 1981 tacccagtag tgccatagta cictttaaga Igaiaagtgc attigagcco ggoatcgcac 2041 agactttccc atgccttgat ataigcgaat tcctatglac aagagaiteg tcgcgaaaga 2101 gcccgtcaaa acttgagcgg ggggggagct gcaaaagcct gtcagctaat tcgagtgaga
15 2161 cgcgcaaagc aagccaactt acgatccagg tggggcgccg ggaggtttct ctcgtatttc Sequência de aminoácido His2A (SEQ iD No 22): 1 MTGGGKSGGK ASGSKNAQSR SSKAGLAFPV GRVHRLLRKG NYAQRVGAGA PVYLAAVLEY 61 LAAEILELAG NAARDNKKTR IIPRHLQLAI RNDEELNKLL GHVTIAQGGV
20 LPNIHQNLLP 12'1 KKTGKTGKNL SQEL Sequência de DNA hex! (SEQ iD No 23): 1 gtcaacttacíccgagtctcgcatcgagítcgatactgagcaccgtacícacaaotccgt 61 caitgacgttgctgagggcgagtatcgtgcccgtglccagcccaaocacogcaagcaagc
25 121 tiocgtagtcggtaccaccgteaacggatcgcggttcagccacagccgcaaggccagcag 181 caeca ectccacccaoacogacgagtacaccgtcgatccccctagccaccgccccgtcla 241 caagaaggagtcggttgaagtcgccggtacoactgttgacccccctgctectcgttcgac 301 ctaccacgagcaggtgaacattgttgaagagaccgttgacgcteacogttacgctcctca 361 acccaacaacaacaacaagATGGGCTACTACGACGAGGACGgtaagoatcttccttcccc
30 421 tttgatgttgltccttacccgtgacatccatcggicgtatgctttcttagccacacacaa 481 gtgttglgacaagtgccgtgctcacgccgatatcag GCCACTACCACTCTTTCCGCCAT G 541 GATTGCACAAGTTGGCTGACCGTATTGCGCATCCTGAAGGCCATGACCGCGTTGAGGT GA
35 601 GCGAGGTTCGTGAGACCCGCCGCACCCGCGCTCCGTCTTCGGAGGCGTACACGCCGA AGA
661
CGGTCACCATTCCGTGCCACCACATCCGCCTCGGCGACATCCTGATCCTCCAGGGCCG
CO
721
CCTGCCAGGTCATCCGTATCTCGACCTCGGCTGCCACTGGCCAGCACCGCTATCTTGG
TG
781
TCGACCTCTTCACCAAGCAGCTCCATGAGGAGTCGTCGTTCGTCTCGAACCCTGCTCCC
A
841
GCGTCGTCGTCCAGACGATGCTTGGCCCTGTTTTCAAGCAGTACCGCGTCCTCGACAT
GC
901
AGGACGGCCACATCGTCGCCATGACCGAGACGGGCGATGTCAAGCAGAACCTGCCCG
TCA
961
TCGACCAGAGCAACCTCTGGGGCCGCCTCAAGCAGGCCTTCGAGACTGGCCGCGGCA
GCG
1021
TCCGTGTCCTGGTCGTTTCTGACAACGGCAACGAGATGGCTGTTGACATGAAGGTCGTC
C
1081 ACGGCTCGCGCCT CTAAgtcaagccggGaggctttcatgcaagctttggggcíacgagfò
1141 gggcggcattgggtttgogtttgatgcaicttggttacggcgtgtatgtcatttgaagat
1201 tgaaagctgcgccttggícgactcctggcgccggatggatatacaígttcctcgggagga
1261 tatgaaggtUcatgtcgctagttteaqgígíatatgatgactgtaatggatggaígítt
1321 atggccaactttgcgattgatatcttgaaccttUttcíggtcgtgtgagtgaacagtga
1381 ttaagígagagtgaggtatgcaccgtttatcacaaggttgccttgatateccaccKcaa
1441 cgggcgtggggaatcgaagtccctcccctaGagtaagtagcctctcngaatgatctgaa
1501 acgcaaccoctccgagccactacGacaGcíaactacgaaacaaccactttcctgttccag
1561 gaagatccagttctcccgctaccct cccct cccgccgíicaggügtacgct tat ct ccc
1621 aaccíaatottcgagaggtctaatGagtacacactf aacagtgoatcctgacatagctaa
1681 ccatcatcactctagttcaítagccgícccgccatcccgtcaattacattcccggctgtl
Sequência de amineacido Hexl (SEQ ID No 24):
MGYYDEDGHY HSFRHGLHKL ADRiAHPEGH DRVEVSEVRE TRRTRAPSSE
AYTPNTVTiP
CHHiRLGDIL ILQGRPCQVí RISTSAATGQ HRYLGVDLFT KQLHEESSFV
SNPAPSWVQ
121 TMLGPVFKQY RVLDMQDGHl VAMTETGDVK QNLPVIDQSN LWGRLKOAFE TGRGSVRVLV
181 VSDNGNEMAV DMKWHGSRL bgil; vide WO 2009/018537. Notar qua bgü ~ Bgl3A.
xyi6: vide WO 2000/018537.
cbhi: vide WO 2009/018537. Notar quo cbnl ~ CBHia .
Pchíl(0.8) (SEO I No 25):
AGCTTGACCCTTTCAGAGCTAGGTTTCATTAGGCCTTCGAAAACAACCCAAGGC GGCGTC
GCAACCATCACAACCGGCCGATAACCAGATCTCGGTAGGTCCGATAAGGATCCAAAATG
G
TGTCGGCTGACGTTGCATGTGCCCAGGCAGGAGGATGATCCCCAGGGTTGTTGCCGGC AG
CTCCCGCACGTCGGGGAGGGGGAGGGGGAGGGGAAAGCCCTAACTAACGTTCGTTCT
ATC
ACGGGCCGACCGGGCCATGCTTTCGGCTTGTGAGCGGTGGGGTCAAGGGCAACAAGA
AAT
GGTAAGTGCGGGACGAAGACACGCGGGCATGAGGTCTCAGGGTGACCTGCGCAAAAC
CAA .. ........................................ ..........
GTCCCACTCGCCATGCCTCCAGCAGCAACGTTGCCGTAGAAGGGTCAGGGGGTTTGTT
GT
AGACCCACGACCATGCTGCCGGCGAGCGGAGGGTTGGCTTGCTACAGGCGCTGAAGG
GTC
AACTCGGTGCCCAAAGTGGCTACCAAGCGTGCCATCAAGGGAAATGAGATGATGGTGG
CT
CGTGGGCAAAGAAAAGACAAGGGAGGTGACTCTAGAGAGATGCTCTCGAGTTCACGGG TA.....
TAAGAGCACTGTGATCGTTCACAAAGCCGGCGTACTCCTCTAGAGCATCTATCATCAAC
A
TCACCAGAAAGGTCNTAGACCAGGTGGTTGCCATATCCAGTCGCAAAAGAGCCAAAGA
GO
GAAGGAGCACGAAAGCACAGCCCAATCATTQCCTGCTTTGCTACTTCTTCTCCACCATG
PchH(1.8)(SEQ1DNo26):
GTCCCTTACCTATGGGCTCCTAGTCTCGTTCCTCTTTTTGATAGATTTGTATTTT
GCAAC
GTTGCAAAATGAGACATTTCAATCATATGTAGCCGCCAGCTACTGTTAGCGTACTCAGC
G
TTGGCCAAACGGCGGTTTTTCTGGGTAGCACTGTGCCGCGTGCCCCTGAGCCGTGCGT CG
CGGAAACCCCGTTAAGTAGCAAGTATGTTACCGCCGAGACCGACAATGCTGTTGGTTAC
G
TCGCTGGTCCATGATTGCAATCTAGATATCGTGCGGGGCTTTTGCAATCGGTTTTCCCT
A
CCCAGTTTCTTCTTTTGGACACTTTCTCTTTTGGAAAATGCCGAAATGATGCGGCTCGCT CACGCCCCGAAGTCCCGAGCTGGGGCTAGATCCGTGATTGCAACGCGGTGCGAACGC GAG............................ ..................................
TGGGGCAG ACCTCGCTCAGCCTTGGTCGTGCCGGAATGGCGGGTACCTTTACCAGGTC GG
GATCAATTACATAGGATGCCATGTGCGTGGATTTGATTGCATCGCTGTCCCTTTTGTATG TGTCCGAGAGCGAGAOATCAACGCGAAAACCGGAATGCTCCCAACGTCGCTCTCTGTT GA
TAGGGTGTTTTTTTTTCTTCTGCTCCATATCATCTGTCTTGAACTAAGTGATCATCTGCT
GTCACGTCCCGCCCAATGATTGTAAAGAATGATAAGTGATGCTCGCCGGGGCCAGGCT GT' GTGAAAGTTCCCTCTTTGGTTGACGATCAGGTAGCGQCAACGTTGATTGGGCCGCCCG TA
AAATCCGACCCTGTCTCCTTTCGTTGCAAGTCTCCGCGAGACCGTGCCAAGCATGTTCT
C
CGGATCCCTCAATTACATAAGGTTTGGCTCCAGGGTAGGTCTGGAAGCTACCCACCTCG
G
CCAAGCAACCAATCACAACCAGACCTCGCGGCGTTTCGACCTTCCTGGTTTGTCTCAGG
G
CTGGCCAACGTCCTCCCGTGGCGGGTGCCTGGTGATCGCAGGTCGCAGGCGAGTGCC GGG
CACGCGGAGCCCCCGTCAAAGCTTGACCCTTTCAGAGCTAGGTTTCATTAGGCCTTCGA
A
AACAACCCAAGGCCCCGTCGCAACCATCACAACCGGCCGATAACCAGATCTCGGTAGG
TC
CGATAAGGATCCAAAATGGTGTCGGCTGACGTTGCATGTGCCCAGGCAGGAGGATGAT CG
CCAGGGTTGTTGCCGGCAGCTCCCGCACGTCGGGGAGGGGGAGGGGGAGGGGAAAG
CCCT
AACTAACGTTCGTTCTATCACGGGCGGACCGGGCCATGCTTTCGGCTTGTGAGCGGTG
GG
GTCAAGGGCAACAAGAAATGCTAAGTGCGGGACGAAGACACGCGGGCATGAGGTCTCA GG
GTGACCTGCGCAAAACCAAGTCCCACTCGCCATGCCTCCAGCAGCAACGTTGCCGTAG AA
GGGTCAGGGGGTTTGTTGTAGACCCACGACCATGCTGCCGGCGAGCGGAGGGTTGGC
TTG
CTACAGGCGCTGAAGGGTCAACTCGGTGCCCAAAGTGGCTACCAAGCGTGCCATCAAG GG
AAATGAGATGATGGTGGCTCGTGGGCAAAGAAAAGACAAGGGAGGTGACTCTAGAGAG AT
GCTCTCGAGTTCACGGGTATAAGAGCACTGTGATCGTTCACAAAGCCGGCGTACTCCTC
T
AGAGCATCTATCATCAACATCACCAGAAAGGTCNTAGACCAGGTGGTTGCCATATCCAG
T
CGCAAAAGAGCCAAAGAGCGAAGGAGCACGAAAGCACAGCCCAATCATTCCCTGCTTT
GC TACTTCTTCTCCACCATG
Phexl (SEQ ID No 27): GATCCTAAGTAAGTAAACGAACCTCTCTGAAGGAGGTTCTGAGACACGCGCGA
TTCTTCT
GTATATAGTTTTATTTTTCACTCTGGAGTGCTTCGCTCCACCAGTACATAAACGTTTTTT
TTCACGTAACAAAATGGCTTCTTTTCAGACCATGTGAACCATCTTGATGCCTTGACCTCT TCAGTTCTCACTTTAACGTANTTCGCGTTAGTCTGTATGTCCCAGTTGCATGTAGTTGAG ATAAATACCCCTGGAAGTGGGTCTGGGCCTTTGTGGGACGGAGCCCTCTTTCTGTGGT
CT
GGAGAGCCCGCTCTCTACCGCGTACCTTCTTACCACAGTACACTACTCACACATTGCTG
A
ACTGACCCATCATACCGTACTTTATCCTGTTAATTCGTGGTGCTGTC6ACTATTCTATTT GCTCAAATGGAGAGCACATTCATCGGCGCAGGGATACACGGTTTATGGACCCCAAGAG TG
TAAGGACTATTATTAGTAATATTATATGCCTCTAGGCGCCTTAACTTCAACAGGCGAGCA CTACTAATCAACTTTTGGTAGACCCAATTACAAACGACCATACGTGCCGGAAATTTTGGG ATTCCGTCCGCTCTCCCCAACCAAGCTAGAAGAGGCAACGAACAGCCAATCCCGGTGC
TA ATTAAATTATATGGTTCATTTTTTTTAAAAAAATTTTTTCTTCCCATTTTCCTCTCGCTT
TTCTTTTTCGCATCGTAGTTGATCAAAGTCCAAGTCAAGCGAGCTATTTGTGCTATAGCT
CGGTGGCTATAATCAGTACAGCTTAGAGAGGCTGTAAAGGTATGATACCACAGCAGTAT T
CGCGCTATAAGCGGCACTCCTAGACTAATTGTTACGGTGTACAGAAGTAGGTAATAAAA
G
CGTTAATTGTTCTAAATACTAGAGGCACTTAGAGAA6CTATCTAAATATATATTGACCCT
AGCTTATTATCCCTATTAGTAAGTTAGTTAGCTCTAACCTATAGATAGATGCATGCGGCC
GCAGGTACCAGGCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTC
GT
TTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCAC A
TCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAA
GA.......... ............
GTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGC GGG
TGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCT
TT
CGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATC
G
GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTG A
TTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGA C .20 GTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCC
TATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAA
AAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAAT
TTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGMCCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA
CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGA
AAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCA
TTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT
CAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGA G
AGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC
GCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATT
CT
CAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGAC A
GTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACT
T
CTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC
..AT
GTAACTCGCCTTGAWGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGC * GT
GACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACT A
CTTACTCTAGCTTCCCGGCAACT/ATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATTVTVAGTTGC
AGGA
CCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCG
GT
GAGCGTGGGTGTGGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTA
TC
GTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGC r
GAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATA
CTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTT
GATAATCTCATGACC AAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACGCC
GTAGAAAAGATCAAAGGAWTTGTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATGTGCTGCTTG
CAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC
CTTTTTCCGAAGGTAACTGGCrrCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGT
G
TAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCT
G
CTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGA
G
TCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGC
AGA
CAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTAT
GA
GAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG
GW
GGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTC
CT
GTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGC
GG
AGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCGTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCC
T
TTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCC
3€ : TTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGA ♦ GC
GAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATT
GAT
TAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAA
AÂTGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGT
ATGTTGTGTGGMTTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGA
T
TACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCG
GT
GGCGGCCGCTCTAGAACTAGTACGGCGTGCAAGTAGTGTCTTTCTTTGCACTCCCGCC
GT
CCCAGAAGACGCCGCAACAAGCTGAGCTTGCTGGAAGCCGAACAAAGGCGTTACAGAG
CA
CAAACATAGTGGCAGTGTÁGGAACTCTAACTGGGACCAAAACTACGGGCCCGGCAGAA
AC
GTTCCCCGGCCCGAAGCGAAGGCGAACGTCGAAAAGGAAGACCGGGACCGCTCGTCC
GAG
GATTAGCCACGAAGTTCCAGACCAAGTATAGGAGTAAACGCTCGCTCGTCAAAACAATT
G
TCACCAATCAGCACCACATCGGCACATAACAACCGGTTGCGGAACTCGCATGTGAACAA
C
AAGCGGCTCCGGGGGAGTGATCGGCTCGGGCGGATGACCCGGACTCTTCCGCGCAGC
AAC
TCGGCGTGTTGTTGACGGCAGTACTCCGTAGTTGCCATGACTVACAGTCAATGGCGTGC
TT
CACAAGGTGGAGAGCCGAGAAAGCACCTCGGCATGTACGAGTATGTAGATAGTGTATC
AA
GCAGGAAGATGGGGGTTACTTTATCTCAATCAGATGCCTGTAAGCGAGAGCCGAGAGC
CT
GCCCTGTTGTTGACACAATTCTGGCCTGATACGAGTGACAAGCGCTGGGACGGCGGCT
GG
GGTCTTTTGCTCGCGGCTTCAGCTCAATTCCAATCCTGGGCCGGTGCCGAACGGCCCA
AT
CGC G A G C GCC QAC G AAA TCG G AG GTC G AGG AAAG AA G G CTG G G CG A G ACG C G G CG A
GZX/Axoj
CTGTGGCAAAATGGCCAATTGAGGTTCTGGGTCGGCTGGTGATCAACCATGCATTTCCC
A
GCCCGCAGATTCTCTTTCTCTCTCGTGCAGCAGCGGCACCAGCAGCAGCAGCAGCCAG
GTTTGACCAACCTCTCCGCCCAGCCACCGATAGTAAAGATGCTGCCTGCGTATTCTGGG
TGCAGGAGTTCCAAGATCTTTCGGTCTGGCCACCAGCTGTCACGTCACCCTCCACCTTT
GACGACGTTGCTGGAAAATTCGAAGCCTTCACTAAGATAACTATGCCGTAGCACTTGCA
G
CCCCGGAAGCTGCAAGTTGATTCTTGGAGGGCTCTCTCCACCACCAATACGGGAGATC
TG
GCCCCGCACTTGAGGAGGCTGGAGTCTCGGATCGCCCACTTCGCGTCGCCCTGGGCC
CTG
GGCCGTGGGGTGATGGGCCCGTTGCCGTGGTGGATGGCAGGAGCTTTTCAGCTCTCAA
TG
GGCGAATGGTACTCCGTAGGTCGGAGTGGCTGGAAGGGGCGGAACGGACAGGGGGAG
GTT
GGGGAAAATGCTCCGCAGGAAGAGCAGGGAGTGGGGAGCTGCGGTCGGCCCTGTGGA
GCG
CGTGCAGGGCCAGCTAATCCAATTCGGGCCACAATAAACAAGAGAGGGCCCCACATCA
TG
TAAACAGAGGCTCAGAAGCTCCTGCCACACTGGGAGGGTTTQGAAGTCTGACGACTGC a A
ATGGACCCCAGCCATCGCGAGCACACAGCAGTTCGCACGCTCCCATTGGGTTCCTCAT
CA
CGCAGTCGCTCTCCCCGCCAACCAGCGCOAGGTCCGGGAACAGCGGCGCAAATGCGT
ATT
TGAGGGCGCCTCGCTCGAGCAACCTGTGCCTGACCTTCTCCTCCTCCTTCTGCACCTTG
C
ATQTCGTCGCGTCCACTCGCAGGCAACCACACATCCTCCTCCTCTCCCAAAACCCCCCC G
CTTTTTCTTTCCCTTGTTGGAATTCGATTGAAAAAGAAGACGGGTCCGTCTAGAGACCGC
CTTCTCACCTTTGTCTCGACTTCTTTCTAGGAAAAGAAGCAAGAGTGATTCTTCTTGTGG
ACCTTGTGGTTCAGGGAAGGTCGAGGAGAAGATTGCCTCTGCCCCCAAAGTCGCCAAC
CT
GGACTTTGAAGCACGTGTTCCGGTCCCTTTCAGTGTCTTCCCGTCCTCGTACAGGGAGT
C
CGAGACCGCCACCCAAACCCACTCCCACGAAGAGGTTGAGATCAAGCTCCCCCAGCTC GC
CGGACGGGAAGGTCAACACTCTTCATTCCAAGCCCAAGCACATCTTCCTCCCAGCGGA GA
GGGTCGCTTCAGAGAAGAAGAGGTCCGCATCACTCGTCAAGAGGAACATCACCGCCGT cc
CGGCATCCGTGAAGAGTTCGTTCACCGCGAGGAGCGTCACCGGTAAGTTTAGTTTTTGT T
TTGATTCACCACCCATTGTCTTCCCCGCCTTTTTCTTTTTCTTCCCTTGCTCTCTTGCCC CTGTCTAGTGTAGGGCATTGCCAAGGCCATCTTCACACACACACACCCCCCCCCCCCC
CC
ACXCTOAGCTGGGGGGGGGGGTGGCCTGGGTTGACCAAGGGACGGTGAAGACTACTA CTA
CTTGAGCCACTCAAACCCATGCATGACACAGGGTTTTCCTTTTTCTTTTCTCTTTTCCTT
TAACTAACCAACCACTCCAACATTAGCCCTCAGTCAACCTACTCCGAGTCTCGCATCGA
G
TTCGATACTGAGCACCGCACTCACAACTCCGTCATTGACGTTGCTGAGAGCGAGTATCG
T
GCCCGTGTCCAGCCCAACTACCGCAAGGAAGCTTCCGTAGTCGGTACCACCGTCGACG GA
TCCCGCTTCAGCCACAGCCGCAAGGCCAGCAGCACCACCTCCACCCACACCGACGAGT
AC
ACCGTCGATCCCCCTAGCCACCGCCCCGTCTACAAGAAGGAGTCGGTTGAAGTCGCCG
G'T........ ............ ........................................
ACCACTGTTGACCCCCCTGCTCCTCGTTCGACCTACCACGAGCAGGTGAACATTGTTGA
A GAGACCGTTGACGCTCACCGTTACGCTCCTCAACCCAACAACAACAACACCA TG
Pxyl6 (SEQ ID No 28):
GCGGCCGCTTCCCCATGAATGGCAACCGGGCTGATGACCTGTGTGGGAAGAA
ATGGGGTT
GGGTCGGGCAATGGGAAGAAAACGGAAAGAGGGAAGGAAACATGCCTGTAGTCGAGG
CTG
AGAGTGTACGTACGTCCGTACATTCCAGTAACCAGGCGAGAATGAGCAATGATACCCCG Q
ATTTCTTGGATAATTAACTCGTTCCAGAGCACGACTTACGCAGCACTACTCCGTACTGTT GGAGCGCTTAGCACGCTGGAAACTTGGCAGCCGTCCGAAGCCGCTCGGCCCCATCCT
CTC
3$
GCTGGTAGCTAGTGTAGTCCCGTGCTTTACAACGCGGCTATACAGCCCGTACAGTTGTA
A
AGTACCTACATACATGGACTACTATTATTATCCTTCTAGAGTGGGTTCCGAATTCCAGGG
AAGATCTTCCTATGGCTATCTGGCTGAAACTTGGGGGAGGAGTGCGGAAGGGGGGAGG 5 GG
AACGAGCGTCCAGATTGCATACGACCGGGGAATGCGGGACCCTAAGCGAACCAGGAAC cc
GGTTATTGCACTCGGAATTGCCGCAGAICCCTGCGnCCACCCGCTCGAACGGTCAAC
AT
TAACTAATCTGTAGTGGAGTTACTGTTGACTTTCTGACTCGTGTCACTGGTCCTCGCCCA
AGTTGGAAAACAGAATTGCATTTTTGTCCTTTTGTTCGGAGCTTTCGAGGAATAATTCGA
TTGTAGGTATGGAGTAATTATGGAGTATACACGGCCCAGGGGCGCTACACACACCATCG c
CGAGAATGGGAGGTCGAGCTCGCGACGCTCAGGATCCCATCGATATTTTCCCTTATCCC
T
GCTCTCACTAGCGCGCAGAGGCGCCTCCGCGCGGGGATGCCGGTTGTTGCCGGCGTG
CTT
TTTATQCGCTGCCCTTGGTTGCTCATTTCCCGGTTCTTGGGTCGCTTGCCAAGCAGCTC
G
GGCGGAGAAGAATACCACAGGAGGGAGCATCGGGGCGCGAAGGGCATTGCAGTATGC
GGA
CGAGATGCTTCAACACCATCATGGACCTGTCCGGAACTCCCAAGAACAGGCGACGCCA
AG
GACGGAGTAGACCTCCCCGGTCCGTCTTCTCTCTGCCTGGCAATTTAGCCAAAAATCCG
A
CCCGACTTGCGACGATTCGTACCTCCTAGCGCGTGCGCGCTGAAGCAGTGGCGAGAGT
CG
CAAGGCATGGGCCCGAGTGTGGCTGGCATCGTCAAACGTGATCGGCCCGTCGAGCGT
GCG
TGTATAAATGCATCAAGGAGCGACTGCCCCCCCATCAATAACCACCCGGTTGCTTGAGT
Q
TCTCGCACTCGCGGCCCCTTCTTCTCTGCTTCGCACGCATCTCGCTGTCTCGCTGTCTC
G
CTGTCTCACTGTCTCGCTGTCTCACTGTCTCGCTGTGTGACTGTGTCGCTGTCTCACTGT
CTCACTCGTCCATCAGAGCAAAACCÁTG
Pglai (SEQ ID No 29):
TAGTAGTTGTCAAGCTTGGCAGCGAGAGTCCCGAGGCGGTAGATGAGAGAAAA
AAGGACC
GATGTTGACTTCCATGCCATCGATGGCGTCGTCTCGGCTAGACGTCGTCGGCGTTATTC
T
GGGGGAGGCAATCCCGGGTGAGGAGAGAAATAGACGCGTCGCCATCTAGCAGCCATC
ACT
CAGTGGCATCACCTGCGCGTTGACTTGCCTTCGAAGGCTCTCCTGAGCCGAGCATGTG
AT
TACGATGTATAAGACCTGCATTGAGCTCGACGTTCCCGAGCGTCGGCGCGAGCTTCCA
AT
TCGGTTGAGGCTCCGGCGGCTTCCCCCGGTTTCCTGCTGGACTAGCTGCCGTGGCGG
GGG
GACGGCAGAGCGACTCCGACGCGCCCCATGCGAGCAACGGCCCGATTTTCGATGAGA TCT
GCGGGGCGCCGGAGTGGCAGCAGTTCGTCAGCTTGGCAGGCACGGCTCCCCACCTTC
TTC
CTTCTTCCACACTAGGCCCTCCCACAAGCGACCAGATGCTTGTTAAGTACGCAGTAGTG
T
CTCGGCTCGCCCAGAGAACAATGGCACGCCGATCTGTCTAATGACCAAGAGCCACGGT
TG
GAGACCATCCATTGGACTGGAGGGQCTGCGAGGGATCACGCCGAACCCATGTCATGCT AC
TCTTTCTGTTCACCCCCGGAGATGGGGTGAAACTGCGCGTTTACTQGCGGCTCAGCATG
T
GCTCACGTTGGGTAGGTCCCGCAAAGTCAGAGGTAGGGAGGTACTTTGTAGGCACAAA
TO
ATGTACAGGTTCGTACCTGAGGTAGCTATCTGGCCTCAGGCACAGGAGGCCCGTTCGA
GG
AGAGAGAGGAAGAGCAACCAAGAATAGTCAAGGATATTATTACTCTTTCCCTGGTATTTC
TGGACATTTTGTCCA6GATTTTGTTCGCCCTTTAATTTTGAACAATTATGCTCCCGTCGG
CTCCGATCCACGCCTCTTAACTGTCCTTTAGCCTTTCGCCTCTATTTCCTTGAATTTCAA
TTCTCCCAAGGGCCCTGCTTTCTACAGCAAAGAATCCGTACCCTACTCTCTTTCGCGCA
AGAGTGAGGGAGCAACAGGGATTGCGAAATGCACAGCAGAGTTTGTGTAACTTCGGCA
GG
TCTTCCCCACATTCAGATGCATGTTACTGGAGAATGCGGAGAAGTTATAGTCTGGGGTA
TAGGTATAACGCTGGTACTCCCGAGGTAGGTAGCAACCTTGGCTGACCTTGGGAAGCG
AG
GGCGCTTGTGACGCTGACGATCCAGAAGCAGGCCGCCGATAGTATACGTGGAGACGGT
GC
TTCTTGCTATAAGCGCTCAACTCCGCTACCCATGTTCACCGTCTTCCCCTTGGACGACG
G
CATCACTCCGATACCCATGTCTCCTGGGTAGCTCCGAGTAGTCGCCCGAGCGCCCTTC
TO
CCCCCTCCCCCTTTCTCCTAATAAACGGCCGAGTCGGGCAGCCTCGACGTTGCACCGT
AG
CGTCGCAGCCTGCGTAGAAGCACGCGTAGAAGCACCGAGCTCCAAGCTCCAAGACGC
CAA
AAGCCGCCGCGAAGTGGCCGTCGGCCCTTCCCCGCATGCGCAGCTCCGGCACCAGGT
COG
AAACGCTCCATCACCCCATATCCCAGTCAGAACAGCGGCTGCTTTCCGGATTTGGAAGT
C
TGGAGGTCGCGAATGAAGGCTCGCGTTCGACTATAATAACAGCTCCGGATGGCAGGCC
TC
GTTGCCCAGCTCCAGGACCACCTCCCATCCGTAAACGGATCTGGCCTCGTCACGCCCG
CCATG
Sequência de Alpl DNA compreende (SEQ ID No 30):
ATGCACTTCTCCACCGCTCTCCTGGCCTTCCTGCCCGCCGCCCTCGCGGCCCCTACTG
CCGAGACCCTCGAC
AAGCGCGCCCCGATCCTGACTGCTCGCGCTGGCCAGGTCGTCCCGGGCAAGTACATC
ATCAAGCTCCGCGAC
GGAGCCAGCGACGATGTCCTTGAGGCCGCCATCGGCAAGCTCCGCTCCAAGGCCGAC CACGTCTACCGCGGC
AAGTTCAGGGGCTTTGCCGGCAAGCTCGAGGATGACGTCCTTGACGCCATCCGTCTTC
TCCCCGAAgtgagt ccgcgtcccggaaagaaatagagcgagcgggggagagagtgaagggcgaaaagagoogtgttttgttaaccg cttgtcttttctttctetcttgcaatagGTCGAGTACGTCGAGGAGGAGGCCATCTTCACCATCAACGCG
TA
CACCTCGCAGTCCAACGCCCCCTGGGGCCTTGCGCGCCTCTCGTCCAAGACCGCGGG
CTCCACCACCTACAC
CTACGACACCAGCGCCGGCGAGGGCACCTGTGCCTATGTGATCGACACGGGCATCTAC
ACTAGCCACTCCgt afgtctcgcggttacctcccctttcggaagaaggggcatccatatgctgacccctcctgatcacagGACTTC
GGCGGCCGTGCCACTTTCGCCGCCAACTTCGTCGACAGCTCTAACACCGATGGCAACG
4.2
GCGACGGCACCCAC
GTCGCCGGCACCATCGGCGGCACCACGTACGGTGTTGCCAAGAAGACCAAGCTCTACG
CCGTCAAGGTTCTC
GGCTCCGACGGCTCTGGCACCACgtatgcctcgcacccgcgcaoccgcacacccgcccggccgttatcitct gactgacattcctctttclcctctetagTTCTGGTGTCATTGCTGGCATCAACTTCGTCGCTGACGACGC GC
CCAAGCGCAGCTGCCCCAAGGGCGTCGTCGCCAACATGTCGCTCGGCGGTAGCTACT
CGGCCTCCATCAACA
ACGCCGCCGCCGCCCTCGTCAGGTCGGGCGTCTTCCTGGCCGTCGCCGCCGGCAACG
AGAACCAGAACGCCG CCAACTCGTCGCCCGCCTCCGAGGCGTCCGCCTGCACCGTCGGCGCCACCGACAGGA ACGACGCCAAGGCCA GCTACTCCAACTACGGCAGCGTCGTCGATATCCAGGCCCCCGGCTCCAACATCCTGAG CACCTGGATCGGCA
GCACCT CT GCT ACCgtaagccccccctccccccacccacccccagcctttggcgacattcccgccccgtatt tatttctccggggtgggggagaaacaasacaaaatagctaacatgagatgcactctcagAACACCATCTCGG
GTACCTCGATGGCCTCCCCCCACATTGCCGGCCTCGGTGCCTACCTCCTGGCCCTCGA
GGGCTCCAAGACCC
CTGCCGAGCTCTGCAACTACATCAAGTCGACCGGCAACGCCGCCATCACTGGCGTTCC
CAGCGGCACCACCA ACCGCATCGCCTTCAACGGCAACCCCTCTGCCtga
Sequência de aminoácido A!pl (SEQ ID No 31):
MHFSTALLAF LPAALAAPTA ETLDKRAPIL TARAGQWPG KYIIKLRDGA SDDVLEAAIG
KLRSKADHVY RGKFRGFAGK LEDDVLDAIR LLPEVEYVEE EAIFTINAYT
SQSNAPWGLA
121 RLSSKTAGST TYTYDTSAGE GTCAYVIDTG IYTSHSDFGG RATFAANFVD SSNTDGNGHG
181 THVAGTIGGT TYGVAKKTKL YAVKVLGSDG SGTTSGVIAG INFVADDAPK RSCPKGWAN
241 MSLGGSYSAS INNAAAALVR SGVFLAVAAG NENQNAANSS PASEASACTV
GATDRNDAKA
301 SYSNYGSWD IQAPGSNiLS TWIGSTSATN TISGTSMASP HIAGLGAYLL
ALEGSKTPAE
361 LCNYIKSTGN AAITGVPSGT TNRIAFNGNP SA
Lista de referências
Braaksma. M, and P. J. Punt. 2006. AspergWus as a ceil factory for protein production: controlling protease activity in fungal production, p. 441-455. In G. H. Goldman and S.
A. Osmani (ed.), The Aspergilli: Genomics, Medicai Aspects, Biotechnology, and Research Methods, CRC Press, Boca Raton.
Verdoes, J, C, Punt. PJ. , Burlingame, R., Bartels, J,, van Dijk, R., Slump, E.,
Means, M.< Joosten, R. and Emalfarb, M,, 2007. A dedicated vector for efficient library con5 struction and high throughput screening in the hypha! fungus Ghrysosporium luckncwense. Industrial Biotechnology 3,43-57.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Cepa de fungo hospedeiro de Chrysosporíum lucknowense, CARACTERIZADA pelo fato de que a secreção endógena de celulase é menos do que 20% da secreção de celulase endógena de Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25.
  2. 2. Cepa de fungo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a secreção de um ou mais grupo que consiste de protease endógena, βglucanase endógena e celobiohidrolase endógena é menos do que 20 % da secreção de protease endógena, β-glucanase endógena e celobiohidrolase endógena respectivamente de Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25.
  3. 3. Cepa, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA adicionalmente pelo fato de que a secreção de celobiohidrolase endógena 1 (Cbhl) está ausente.
  4. 4. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que é W1L depositada no CBS sob o número de acesso 122189 de ou W1L#100.1 depositado na CBS sob o número de acesso 122190.
  5. 5. Cepa, de qualquer com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, adicionalmente CARACTERIZADA pelo fato de que o gene que codifica endoquitinase 1 (chi1) foi interrompido.
  6. 6. Cepa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA adicionalmente pelo fato de que um ou mais genes selecionados do grupo que consiste destes que codificam protease 1 alcalina 1 (a/p 1), protease 2 alcalina (a/p2), proteinase A (pep4), β-glicoamilase (G/a/), exo-quitinase (Chi2) e laminarinase (Lam1) foram interrompidos.
  7. 7. Cepa, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que é W1L#100.1ÁalplApyr5 ou W1L#100.1AalplAchilApyr5.
  8. 8. Método para produção de homólogos e/ou heterólogos de uma proteína pura, com uma pureza superior a 75%, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende expressar um gene que codifica dita proteína na cepa conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
  9. 9. Método para a produção de misturas de proteínas artificiais, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a expressão de genes que codificam cada uma de ditas proteínas da mistura em uma cepa conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
  10. 10. Método para triagem simplificada de cepas, CARACTERIZADO pelo fato de que funcionalmente expressam uma enzima desejada pela aplicação de cepas, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
  11. 11. Sequência de promotor isolado apropriado para o controle transcricional da expressão de gene em Chrysosporíum lucknowense, CARACTERIZADO pelo fato de ser selecionada do grupo que consiste em:
    o promotor chi 1(0.8) compreendendo a sequência de nucieotídeos SEQ ID NO 25, o promotor chi 7(1.8), CARACTERIZADA pelo fato de compreender a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 26, o promotor hex1 compreendendo a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 27, o promotor xy!6 compreende a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 28, o promotor gla compreende a sequência de nucieotídeos de SEQ ID NO 29 ou uma parte transcricionalmente ativa do mesmo.
  12. 12. Gene quimérico, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a sequência de promotor conforme definida na reivindicação 11.
  13. 13. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a sequência promotora isolada conforme definida na reivindicação 1 ou o gene quimérico conforme definido na reivindicação 12.
  14. 14. Método para isolar uma cepa de fungos hospedeiros de Chrysosporíum lucknowense CARACTERIZADO pelo fato de que a secreção de celulase e de protease é menos do que 20% da secreção de celulase e protease respectivamente de Chrysosporíum lucknowense cepa UV 18-25, compreendendo as etapas de (i) plaquear Chrysosporíum lucknowense em placas de celulose inchadas com ácido (ASC), (ii) selecionar pelo menos uma colônia mostrando uma zona de clareamento de celulose reduzida, (iii) plaquear a cepa selecionada na etapa (ii) em placas de leite desnatado, e (iv) selecionar pelo menos uma colônia mostrando um halo de degradação de proteína reduzido.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente as etapas de mutagênese antes das etapas (i) e/ou (iii).
BRPI1009488-1A 2009-03-16 2010-03-16 Cepa de fungo hospedeiro e métodos para produção homóloga e/ou heteróloga de uma proteína pura com uma pureza superior a 75%, para produção de misturas artificiais de proteínas e para triagem simplificada de cepas que expressam 5 funcionalmente uma enzima desejada BRPI1009488B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPEP09003750 2009-03-16
EP09003750 2009-03-16
PCT/NL2010/000045 WO2010107303A2 (en) 2009-03-16 2010-03-16 New fungal production system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI1009488A2 true BRPI1009488A2 (pt) 2019-08-27
BRPI1009488B1 BRPI1009488B1 (pt) 2020-09-15

Family

ID=42338768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI1009488-1A BRPI1009488B1 (pt) 2009-03-16 2010-03-16 Cepa de fungo hospedeiro e métodos para produção homóloga e/ou heteróloga de uma proteína pura com uma pureza superior a 75%, para produção de misturas artificiais de proteínas e para triagem simplificada de cepas que expressam 5 funcionalmente uma enzima desejada

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9175296B2 (pt)
EP (2) EP3421597B1 (pt)
CN (1) CN102421895B (pt)
BR (1) BRPI1009488B1 (pt)
CA (1) CA2755417C (pt)
DK (2) DK3421597T3 (pt)
ES (2) ES2678450T3 (pt)
IL (2) IL215116A (pt)
MX (1) MX2011009636A (pt)
WO (1) WO2010107303A2 (pt)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2807702C (en) 2010-08-20 2018-07-24 Codexis, Inc. Use of glycoside hydrolase 61 family proteins in processing of cellulose
WO2012024662A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Codexis, Inc. Expression constructs comprising fungal promoters
WO2012061432A1 (en) 2010-11-02 2012-05-10 Codexis, Inc. Compositions and methods for production of fermentable sugars
ES2604114T3 (es) 2010-11-02 2017-03-03 Codexis, Inc. Cepas de hongos mejoradas
DK2726651T3 (en) 2011-06-28 2019-01-28 Codexis Inc PROTEIN INVARIANT GENERATION BY REGION SHUFFLING
EP2748317B1 (en) 2011-08-22 2017-04-19 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
WO2013048661A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Codexis, Inc. Fungal proteases
BR112014015030A2 (pt) 2011-12-20 2017-06-13 Codexis Inc variantes da endoflucanase 1b (eg1b)
RU2645252C2 (ru) 2012-01-05 2018-02-19 Глюкос Финланд Ой Клетка нитчатых грибов с дефицитом протеаз и способы ее применения
EP2852610B1 (en) 2012-05-23 2018-07-11 Glykos Finland Oy Production of fucosylated glycoproteins
US8980578B2 (en) 2012-06-11 2015-03-17 Codexis, Inc. Fungal beta-xylosidase variants
SG11201600115SA (en) 2013-07-10 2016-02-26 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
SG11201700446XA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
CN108699578A (zh) 2015-03-11 2018-10-23 杰能科国际有限公司 裂解性多糖单加氧酶的酶活性
US20190002846A1 (en) 2015-06-24 2019-01-03 Genencor International B.V. Polypeptides having demethylating activity
WO2017093451A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Basf Se Method of producing proteins in filamentous fungi with decreased clri activity
BR112018009729A8 (pt) * 2015-12-02 2019-02-26 Basf Se método para produzir um polipeptídeo recombinante, fungo filamentoso myceliophthora thermophila e uso de uma construção de ácido nucleico
DK3419992T3 (da) 2016-02-22 2021-02-15 Danisco Us Inc Svampesystem til proteinproduktion med højt udbytte
ES2647322B1 (es) * 2016-05-20 2018-10-05 Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S.A. Célula hospedadora Myceliophthora thermophila con actividad celulolítica mejorada y composiciones enzimáticas obtenidas por la misma
CA3073646A1 (en) * 2017-08-21 2019-02-28 Dyadic International Inc. Production of flu vaccine in myceliophthora thermophila
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
CN113302298B (zh) 2018-11-09 2025-02-25 银杏生物制品公司 罗汉果甙的生物合成
CN117417834A (zh) * 2022-07-19 2024-01-19 中国科学院成都生物研究所 一种金孢菌菌株及其发酵制备具有杀虫活性化合物的方法
WO2025262103A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Basf Se Superior promoters for fungal protein production

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811381A (en) * 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
KR100618495B1 (ko) * 1998-10-06 2006-08-31 마크 아론 에말파브 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
MXPA02010155A (es) 2000-04-13 2004-08-19 Mark Aaron Emalfarb Nuevas secuencias reguladoras de expresion y productos de expresion en el campo de hongos filamentosos.
AU5354401A (en) * 2000-04-13 2001-10-30 Emalfarb, Mark Aaron High-throughput screening of expressed DNA libraries in filamentous fungi
US20040121442A1 (en) * 2002-05-05 2004-06-24 Ilan Chet Fungal chitinase, polynucleotide sequences encoding same, promoters of same, and uses thereof
DK2305801T3 (en) * 2002-08-16 2017-10-09 Danisco Us Inc Hitherto UNKNOWN HYPOCREA JECORINA-CBH1 CELLULASES
EP1627049B1 (en) 2003-05-29 2010-02-17 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
EP2505651A3 (en) * 2006-12-10 2013-01-09 Dyadic International, Inc. Isolated fungus with reduced protease activity
US8551751B2 (en) 2007-09-07 2013-10-08 Dyadic International, Inc. BX11 enzymes having xylosidase activity
US7923236B2 (en) 2007-08-02 2011-04-12 Dyadic International (Usa), Inc. Fungal enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI1009488B1 (pt) 2020-09-15
US20120107856A1 (en) 2012-05-03
US9175296B2 (en) 2015-11-03
WO2010107303A2 (en) 2010-09-23
CA2755417C (en) 2018-11-13
CA2755417A1 (en) 2010-09-23
US20150376629A1 (en) 2015-12-31
CN102421895B (zh) 2016-08-03
MX2011009636A (es) 2011-11-29
DK3421597T3 (da) 2021-01-25
IL215116A (en) 2017-01-31
IL247068A0 (en) 2016-09-29
EP3421597B1 (en) 2020-10-28
WO2010107303A3 (en) 2010-12-16
IL215116A0 (en) 2011-12-29
US10415045B2 (en) 2019-09-17
ES2678450T3 (es) 2018-08-10
EP3421597A1 (en) 2019-01-02
DK2408910T3 (en) 2018-07-30
EP2408910A2 (en) 2012-01-25
CN102421895A (zh) 2012-04-18
ES2845200T3 (es) 2021-07-26
EP2408910B1 (en) 2018-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI1009488A2 (pt) novo sistema de produção de fungos
CN105802854B (zh) 一种纤维素酶高产菌株及其应用
PT98419B (pt) Processo para a preparacao de sequencias de adn que codificam para xilanases, de construcoes de adn que contem essas sequencias, paraa transformacao de hospedeiros microbianos com essas construcoes, para a preparacao de xilanases por expressao nesses hospedeiros e para a degradacao de xilano por accao dessas xilanases
CN110423705A (zh) 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法
BR112012033404B1 (pt) célula recombinante, método para a preparação de um polipeptídeo, composição, método para o tratamento de um substrato que compreende material de carboidrato e uso de um polipeptídeo
KR20150113170A (ko) 탄수화물 분해 폴리펩티드 및 이의 용도
CN109661402A (zh) 真菌的高水平蛋白质生产系统
WO1995004815A1 (en) SECRETION OF CLOSTRIDIUM CELLULASE BY $i(E. COLI)
MX2012014990A (es) Polipeptido que tiene actividad suolenina y sus usos.
CN111876338A (zh) 利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株及构建方法
EP4403630A1 (en) High temperature resistant mannanase mutant
CN101532028A (zh) 一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法
NO316388B1 (no) Rekombinant DNA-molekyl fra Aspergillus niger, og en ekspresjonskassett ogen hybridvektor inneholdende denne
CN104726481A (zh) 一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因、氨基酸序列及其应用
KR101547296B1 (ko) 메타게놈 유래 신규 셀룰라아제 및 이의 제조방법
CN109355274B (zh) 一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶
US20210284983A1 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad ph activity spectrum
KR101547333B1 (ko) 메타게놈 유래 신규 셀룰라아제
KR102092429B1 (ko) 저온에서 강화된 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드
KR20030085679A (ko) 자일라나제를 코딩하는 유전자와 그 형질전환체를 이용하여 생산된 재조합 자일라나제
RU2796447C1 (ru) Штамм Komagataella phaffii T07/pPZL-4x-OA-xyl-AsOr, обладающий способностью продуцировать ксиланазу из грибов вида Aspergillus oryzae
CN108342400A (zh) 重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用
JPH03180174A (ja) バチルス・スフエリカスにおけるビオチンの発現の改良方法
KR0179653B1 (ko) 진균 발현 시스템
CN117568314A (zh) 一种高稳定性葡聚糖酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: DYADIC INTERNATIONAL (USA), INC. (US)

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: DANISCO US INC. (US)

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/09/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.