BRPI1012787B1 - Polipeptídeo tendo atividade de amilase, seu uso e método de produção de um xarope de sacarídeo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE AMILASE. A presente invenção refere-se a polipeptídeos, mais especificamente a polipeptídeos de amilase e ácidos nucleicos que codificam estes, e seus usos, por exemplo, como exoamilases não maltogênicas na produção de alimentos ou produtos alimentícios.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos,especificamente polipeptídeos de amilase e ácidos nucleicos que codificam estes, e seus usos por exemplo, como exoamilases não maltogênicas na produção de alimentos ou produtos alimentícios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Amilases melhoradas podem resolver problemas inerentes acertos processos, tais como na conversão de amidos vegetais ou cozimento.

[0003] A cristalização da amilopectina realiza-se em grânulos deamido dias após cozimento, que leva à consistência aumentada do pão e causa o endurecimento do pão. Quando o pão endurece, o pão perde a maciez do miolo e a umidade do miolo. Como resultado, os miolos ficam menos elásticos, e o pão desenvolve uma crosta coriácea.

[0004] A hidrólise enzimática (por amilases, por exemplo) dascadeias laterais de amilopectina pode reduzir a cristalização e aumentar o antiendurecimento. A cristalização depende do comprimento das cadeias laterais de amilopectina: quanto mais longas as cadeias laterais, maior a cristalização. A maioria dos grânulos de amido é composta de uma mistura de dois polímeros: amilopectina e amilose, da qual aproximadamente 75% é amilopectina. Amilopectina é uma molécula muito grande, ramificada, consistindo em cadeias de unidades •-D-glicopiranosila unidas por ligações (1-4), onde as cadeias são ligadas por ligações •-D-(1-6) para formar ramificações. Amilose é uma cadeia linear de unidades α-D-glicopiranosila(1-4) ligadas tendo poucas ramificações α-D-(1-6).

[0005] Cozimento de produtos de panificação farináceos, tais como pão branco, pão feito de farinha de trigo e farinha de centeio peneiradas e baguetes é realizado pelo cozimento da massa de farinha de pão em temperaturas de forno na faixa de 180 a 250°C por aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante o processo do cozimento, um gradiente de temperatura abrupto (200 a 120°C) prevalece sobre as camadas de massa de farinha exteriores onde a crosta do produto cozido no forno é desenvolvida. Entretanto, devido ao vapor, a temperatura no miolo é somente aproximadamente 100°C no fim do processo de cozimento. Acima de temperaturas de aproximadamente 85°C, a inativação da enzima pode realizar-se e a enzima não terá nenhuma propriedade antiendurecimento. Somente amilases termoestáveis, dessa forma, são capazes de modificar o amido eficientemente durante o cozimento.

[0006] A atividade de endoamilase pode afetar negativamente aqualidade final do produto de pão produzindo um miolo pegajoso ou gomoso devido ao acúmulo de dextrinas ramificadas. A atividade de exoamilase é preferencial, porque realiza a modificação desejada do amido que leva ao retardamento do endurecimento, com menos dos efeitos negativos associados à atividade de endoamilase. A redução da atividade de endoamilase pode levar a maior exoespecificidade, que pode reduzir dextrinas ramificadas e produzir um pão de qualidade mais alta.

[0007] A conversão de amidos vegetais, especialmente amido demilho, a etanol é uma indústria que se expande rapidamente. Xarope de maltotetraose (G4 ou DP4) é um dos muitos produtos comercialmente importantes derivados do tratamento enzimático do amido. A conversão de amidos vegetais, especialmente amido de milho, à maltotetraose e açúcares menores, tais como glicose ou maltose, é uma indústria que se expande rapidamente.

[0008] O processo atual consiste em duas etapas sequenciaiscatalisadas por enzima que resultam na produção de glicose ou maltose. Levedura então pode ser usada para fermentar glicose a etanol.

[0009] A primeira etapa catalisada por enzima é a liquefação deamido. Tipicamente, uma suspensão de amido é gelatinizada por aquecimento rápido a 85°C ou mais. •-amilases (EC 3.2.1.1) são usadas para degradar o liquefeito viscoso a maltodextrinas. •-amilases são endo-hidrolases que catalisam a clivagem randômica de ligações •- 1,4-D-glicosídicas internas. Como •-amilases quebram o amido, a viscosidade diminui. Como a liquefação tipicamente é conduzida em altas temperaturas, •-amilases termoestáveis, tais como uma •-amilase de Bacillus sp., são preferenciais para esta etapa.

[00010] As maltodextrinas produzidas desta maneira em geral não podem ser fermentadas por levedura para formar o álcool. Uma segunda etapa de sacarificação catalisada por enzima dessa forma deve quebrar as maltodextrinas. Glicoamilases e/ou •-amilasesmaltogênicas comumente são usadas para catalisar a hidrólise de extremidades não reduzidas das maltodextrinas formadas apósliquefação, liberando D-glicose, maltose e isomaltose. Enzimas desramificadoras, tais como pululanases, podem ser usadas para auxiliar a sacarificação. Sacarificação realiza-se tipicamente sob condições acídicas em temperaturas elevadas, por exemplo, 60°C, pH 4,3.

[00011] Xarope de G4 (também referido como DP4) tem diversas propriedades vantajosas em comparação com xaropes de sacarose. Por exemplo, substituindo parcialmente sacarose por xarope de G4 em um alimento reduz a doçura do alimento sem afetar seu gosto ou sabor. O xarope de G4 tem alta retenção de umidade em alimentos e exibe produtos de reação de Maillard menos deletérios por causa de seus conteúdos mais baixos de glicose e maltose. O xarope de G4 também tem viscosidade mais alta do que sacarose, dessa forma melhorando a textura do alimento. O xarope de G4 reduz menos o ponto de congelamento de água do que sacarose ou xarope de alta frutose, portanto o xarope de G4 pode controlar melhor os pontos de congelamento de alimentos congelados. Após ingestão, o xarope de G4 também afeta menos a pressão osmótica do que a sacarose. Em conjunto, estas qualidades fazem o xarope de G4 idealmente ajustado como um ingrediente em alimentos e produtos médicos. O xarope de G4 é útil em outras indústrias, também. Por exemplo, o xarope de G4 transmite brilho e pode ser usado vantajosamente como um sizer para papel. Vide, por exemplo, Kimura et al. “Maltotetraose, a new saccharide of tertiary property”, Starch 42: 151-57 (1990).

[00012] Uma das leveduras usadas para produzir etanol é Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae contém •-glicosidase que foi mostrado utilizar mono-, di- e trissacarídeos como substratos. Yoon et al., Carbohydrate Res. 338: 1127-32 (2003). A capacidade de S.cerevisiae de utilizar trissacarídeos pode ser melhorada por suplemento de Mg2+ e superexpressão de AGT1 permease (Stambuck et al., Lett. Appl. Microbiol. 43: 370-76 (2006)), superexpressão de MTT1 e MTT1alt para aumentar a entrada de maltotriose (Dietvorst et al., Yeast 22: 77588 (2005)), ou expressão de maltase MAL32 na superfície celular (Dietvorst et al., Yeast 24: 27-38 (2007)). A etapa de sacarificação pode ser omitida completamente, se a etapa de liquefação produziu níveis suficientes de mono-, di- ou trissacarídeos e S. cerevisiae ou suas variantes geneticamente modificadas foram usadas para a etapa de fermentação.

[00013] Pseudomonas saccharophila expressa uma maltotetrao- hidrolase formadora de maltotetraose (EC 3.2.1.60; amilase formadora de G4; G4-amilase). A sequência nucleotídica do gene de P. saccharophila que codifica PS4 foi determinada. Zhou et al., “Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila,” FEBS Lett. 255: 37-41 (1989); N° de Acesso GenBank X16732. PS4 é expressa como uma proteína precursora com um peptídeo sinal N-terminal de 21 resíduos. A forma madura de PS4, como apresentada na SEQ ID NO: 10, contém 530 resíduos de aminoácido com um domínio catalítico no N-terminal e um domínio de ligação a amido no C-terminal. PS4 exibe atividade tanto endo- como exo-^- amilase. Atividade de endo-^-amilase é útil para reduzir a viscosidade do amido gelatinizado, e a atividade de exo-^-amilase é útil para quebrar maltodextrinas a sacarídeos menores.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00014] Esta invenção relaciona-se a polipeptídeos, especificamente polipeptídeos de amilase e ácidos nucleicos que codificam estes, e seus usos por exemplo, como exoamilases não maltogênicas na produção de produtos alimentícios. As amilases da presente invenção foram engendradas para ter qualidades mais benéficas. Especificamente, as amilases da invenção corrente mostram uma exoespecificidade alterada e/ou termoestabilidade alterada. Especialmente, os polipeptídeos são derivados de polipeptídeos tendo atividade de exoamilase não maltogênica, especialmente, atividade de glIcan 1,4-alfa-maltotetra- hidrolase (EC 3.2.1.60). Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm um efeito antiendurecimento melhorado comparados à amilase da SEQ ID NO: 1.

[00015] Em outro aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm uma termoestabilidade melhorada comparados à amilase da SEQ ID NO: 1.

[00016] Um polipeptídeo variante como estabelecido nas reivindicações é fornecido. Em um aspecto adicional, o uso de tal polipeptídeo variante, incluindo e como aditivos alimentícios, produtos alimentícios, produtos de panificação, composições aperfeiçoadoras, produtos de ração incluindo forragem, etc. como estabelecido nas reivindicações, são fornecidos. Ainda em um aspecto adicional, ácidos nucleicos que codificam e que se relacionam a polipeptídeos variantes, como estabelecido nas reivindicações, são fornecidos. Métodos para produção de tais polipeptídeos variantes, bem como outros aspectos, também são estabelecidos nas reivindicações.

LEGENDAS PARA A FIGURA

[00017] Os desenhos acompanhantes são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo e ilustram várias modalidades.

[00018] A figura 1 mostra desenvolvimento de consistência de pão assado com pMS1776 (SEQ ID NO: 12), pMS2020 (SEQ ID NO: 14), pMS2022 (SEQ ID NO: 15) e pMS2062 (SEQ ID NO: 16) comparado a pão assado com uma composição compreendendo SEQ ID NO: 1.

[00019] A figura 2 mostra desenvolvimento de consistência de pão assado com pMS1776 (SEQ ID NO: 12), pMS1934 (SEQ ID NO: 13), pMS2022 (SEQ ID NO: 15) e pMS2062 (SEQ ID NO: 16) comparado a pão assado com uma composição compreendendo SEQ ID NO: 1 e Novamyl 1500.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00020] Conforme esta descrição detalhada, as seguintes abreviaturas e definições aplicam-se. Deve ser observado que como usado neste pedido, as formas singulares “a”, “o”, “um” e “uma” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa forma, por exemplo, a referência “para uma enzima” inclui uma pluralidade de tais enzimas, e a referência “para a formulação” inclui a referência para uma ou mais formulações e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica, e similares.

[00021] Em um aspecto, um polipeptídeo tendo atividade de amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendoa) identidade de sequência de pelo menos 65% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88 ou 205, e/oub) identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 16, 48, 97, 105, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401, 403, 412 ou 409, e/ouc) identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G ou 399C/H, e/oud) identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 44, 96, 204, 354 ou 377, e/oue) identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende a seguinte substituição de aminoácidos: 392Scom referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1, é fornecido.

[00022] Em um aspecto, um polipeptídeo tendo atividade de amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 65% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, ou 205 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 235H/K/R, 240E, 392 K/D/E/Y ou 409E com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1, é fornecido.

[00023] A presente invenção também engloba o uso de polipeptídeos tendo um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência à sequência(s) de aminoácidos definida neste pedido ou com um polipeptídeo que define as propriedades específicas neste pedido. A presente invenção engloba, especialmente, peptídeos tendo um grau de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, definida abaixo, ou homólogos da mesma. Aqui, o termo “homólogo” significa uma entidade tendo identidade de sequência com as sequências de aminoácidos objeto ou sequências nucleotídicas objeto, onde a sequência de aminoácidos objeto preferencialmente é SEQ ID NO: 1 e a sequência nucleotídica objeto preferencialmente é SEQ ID NO: 52.

[00024] Em um aspecto, a sequência de aminoácidos homóloga e/ou a sequência nucleotídica devem fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que conserva a atividade funcional e/ou aumenta a atividade de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10, preferencialmente a atividade de um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[00025] No presente contexto, uma sequência homóloga é usada para incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 65%, 70%, 75%, 78%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, idêntica à sequência objeto. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos etc. que a sequência de aminoácidos objeto. Embora homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácidos tendo propriedades/funções químicas similares), no contexto da presente invenção é preferencial para expressar homologia em termos de identidade de sequência.

[00026] Comparações de identidade de sequência podem ser conduzidas visualmente, ou mais normalmente, com o auxílio de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis usam algoritmos de comparação complexos para alinhar duas ou mais sequências que melhor refletem os eventos evolutivos que poderiam ter levado à diferença(s) entre duas ou mais sequências. Por isso, estes algoritmos operam com um sistema de classificação recompensando o alinhamento de aminoácidos idênticos ou similares e penalizando a inserção de lacunas, extensões de lacuna e alinhamento de aminoácidos não similares. O sistema de classificação dos algoritmos de comparação inclui:i) atribuição de um escore de penalidade cada vez que uma lacuna é inserida (escore de penalidade de lacuna),ii) atribuição de um escore de penalidade cada vez que uma lacuna existente é estendida com uma posição extra (escore de penalidade de extensão),iii) atribuição de altos escores no alinhamento deaminoácidos idênticos, eiv) atribuição de escores variáveis no alinhamento de aminoácidos não idênticos.

[00027] A maioria de programas de alinhamento permite às penalidades de lacuna serem modificadas. Entretanto, é preferencial usar os valores pré-configurados usando tal programa para comparações de sequência.

[00028] Os escores dados para o alinhamento de aminoácidos não idênticos é atribuído de acordo com uma matriz de marcação também chamada de matriz de substituição. Os escores fornecidos em tais matrizes de substituição estão refletindo o fato que a probabilidade de um aminoácido que é substituído pelo outro durante a evolução varia e depende da natureza física/química do aminoácido a ser substituído. Por exemplo, a probabilidade de um aminoácido polar que é substituído por outro aminoácido polar é maior em comparação ao ser substituído por um aminoácido hidrofóbico. Por isso, a matriz de marcação atribuirá o escore maior para aminoácidos idênticos, escore menor para aminoácidos não idênticos, mas similares e escore ainda menores para aminoácidos não similares não idênticos. As matrizes de marcação mais frequentemente usadas são as matrizes PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), matrizes BLOSUM (Henikoff and Henikoff (1992)) e matriz Gonnet (Gonnet et al. (1992)).

[00029] Programas de computador adequados para realizar tal alinhamento incluem, mas não são limitados a, Vector NTI (Invitrogen Corp.) e programas ClustalV, ClustalW e ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Uma seleção de diferentes instrumentos de alinhamento está disponível no servidor ExPASy Proteomics em www.expasy.org. Outro exemplo do programa que pode realizar o alinhamento de sequência é BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que está disponível na página web do National Center for Biotechnology Information que pode ser atualmente encontrada em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e que foi primeiramente descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410.

[00030] Uma vez que o programa produziu um alinhamento, é possível calcular a % de similaridade e a % de identidade de sequência. O programa tipicamente faz isto como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[00031] Em uma modalidade, é preferencial usar o programa ClustalW para realizar alinhamentos de sequência. Preferencialmente, o alinhamento com ClustalW é realizado com os seguintes parâmetros para o alinhamento aos pares:

[00032] ClustalW2, por exemplo, é posto à disposição na Internet pelo European Bioinformatics Institute na página web EMBL-EBI www.ebi.ac.uk_ sob ferramentas - análise de sequência - ClustalW2. Atualmente, o endereço exato da ferramenta ClustalW2 é www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.

[00033] Em outra modalidade, é preferencial usar o programa Align X no Vector NTI (Invitrogen) para realizar alinhamentos de sequência. Em uma modalidade, Exp10 tem sido usado com configurações pré- configuradas:Penalidade inicial de lacuna: 10Penalidade de extensão de lacuna: 0,05Faixa de penalidade de separação de lacuna: 8 Matriz de escore: blosum62mt2

[00034] Dessa forma, a presente invenção também engloba o uso de variantes, homólogos e derivados de qualquer sequência de aminoácidos de uma proteína ou polipeptídeo como definido neste pedido, particularmente aqueles da SEQ ID NO: 1 ou aqueles da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou 10 definidos abaixo.

[00035] As sequências, particularmente aquelas de variantes, homólogos e derivados da SEQ ID NO: 1, também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma modificação silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou natureza anfipática dos resíduos enquanto a atividade de ligação secundária da substância é conservada. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos dianteiros polares não carregados tendo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[00036] A presente invenção também engloba substituição conservativa (substituição e reposição são ambas usadas neste pedido para significar a permuta de um resíduo de aminoácido existente, com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, isto é, substituição similar por similar tal como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar etc. Substituição não conservativa também pode ocorrer, isto é, de uma classe do resíduo para outra ou envolvendo alternativamente inclusão de aminoácidos não naturais, tais como ornitina (após isto referida como Z), ornitina ácido diaminobutírico (após isto referida como B), ornitina norleucina (após isto referida como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[00037] Substituições conservativas que podem ser feitas são, por exemplo, dentro dos grupos de aminoácidos básicos (Arginina, Lisina e Histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos alifáticos (Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina), aminoácidos polares (Glutamina, Asparagina, Serina, Treonina), aminoácidos aromáticos (Fenilalanina, Triptofano e Tirosina), hidroxil- aminoácidos (Serina, Treonina), grandes aminoácidos (Fenilalanina e Triptofano) e pequenos aminoácidos (Glicina, Alanina).

[00038] Substituições também podem ser feitas por aminoácidos não naturais incluem; aminoácidos alfa* e alfa-dissubstituídos*, N-alquilami- noácidos*, ácido lático*, derivados de haleto de aminoácidos naturais, tais como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I- fenilalanina*, L-alil-glcina*, β-alanina*, ácido L-α-amino butírico*, ácido L-Y-amino butírico*, ácido L-α-amino isobutírico*, ácido L-ε-amino caproico#, ácido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona*, L- norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L- tioprolina*, derivados de metil fenilalanina (Phe), tais como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metil)*, L-Phe (4-isopropil)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxil)*, ácido L- diaminopropiônico α e L-Phe (4-benzil)*. A notação * foi utilizada com o objetivo da discussão acima (relacionando-se com substituição homóloga ou não conservativa), para indicar a natureza hidrofóbica do derivado ao passo que # foi utilizada para indicar que a natureza hidrofílica do derivado, #* indica características anfipáticas.

[00039] Sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácidos da sequência incluindo grupos alquila, tais como grupos metila, etila ou propila além de espaçadores de aminoácido, tais como resíduos glicina ou β-alanina. Uma forma adicional da variação envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácido na forma peptoide, será bem entendido pelos versados na técnica. Para evitar dúvida, “a forma peptoide” é usada para referir-se a resíduos de aminoácido variantes em que o grupo substituinte do carbono α está no átomo de nitrogênio do resíduo em vez do carbono α. Os processos para preparação de peptídeos na forma peptoide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al. (1992), Horwell DC. (1995).

[00040] Em uma modalidade, o polipeptídeo variante é uma variante de amilase de Pseudomonas saccharophila (PS4) tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e tendo identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% a esta.

[00041] Em um aspecto, preferencialmente a sequência usada na presente invenção está em uma forma purificada. O termo “purificado“ significa que um dado componente está presente em um alto nível. O componente é desejavelmente o componente ativo predominante presente em uma composição.

Definições

[00042] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado ordinário na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

[00043] “Amilase” significa uma enzima que é, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação do amido. Uma atividade de amilase endointerina cliva ligações ^-D-(1 • 4) O-glicosídicas dentro da molécula de amido de uma maneira randômica. Em contraste, uma atividade amilolítica exointerina cliva uma molécula de amido da extremidade não redutora do substrato. “Atividade de amilase endoatuante”, “endoatividade”, “atividade endoespecífica” e “endoespecificidade“ são sinônimas, quando os termos se referirem aos polipeptídeos variantes como definido nas reivindicações. O mesmo é verdade para os termos correspondentes da exoatividade.

[00044] “Maltotetra-hidrolase formadora de maltotetraose; EC 3.2.1.60; amilase formadora de G4; a G4-amilase e glIcan 1,4-alfa- maltotetra-hidrolase” podem ser usados intercambiavelmente”.

[00045] No presente contexto, “PS4” é usada para designar a maltotetra-hidrolase de Pseudomonas saccharophila.

[00046] Uma “variante” ou “variantes” referem-se a polipeptídeos ou a ácidos nucleicos. O termo “variante“ pode ser usado intercambiavelmente com o termo “mutante“. Variantes incluem inserções, substituições, transversões, truncamentos, e/ou inversões em uma ou mais posições no aminoácido ou sequência nucleotídica, respectivamente. As frases “polipeptídeo variante”, “polipeptídeo”, “variante” e “enzima variante” significam um polipeptídeo/proteína que tem uma sequência de aminoácidos que foi modificada a partir da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Os polipeptídeos variantes incluem um polipeptídeo tendo certa porcentagem, por exemplo, 65%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%, da identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Como usado neste pedido, “enzimas de origem”, “sequência de origem”, “polipeptídeo de origem” significa enzimas e polipeptídeos dos quais os polipeptídeos variantes são baseados, por exemplo, SEQ ID NO: 1. Um “ácido nucleico de origem” significa uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de origem. A sequência sinal de uma “variante“ pode ser a mesma (tal como a SEQ ID NO: 11) ou pode diferenciar-se da sequência sinal da PS4 do tipo selvagem. Uma variante pode ser expressa como uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo heterólogo. Por exemplo, a variante pode compreender um peptídeo sinal de outra proteína ou uma sequência designada para auxiliar a identificação ou purificação da proteína de fusão expressa, tal como uma sequência de marcação His.

[00047] Para descrever várias variantes que são contempladas a serem englobadas pela presente descrição, a seguinte nomenclatura será adotada para facilidade de referência. Onde a substituição inclui um número e uma letra, por exemplo, 141P, então isto refere-se a {posição de acordo com o sistema de numeração/aminoácido substituído}. Consequentemente, por exemplo, a substituição de um aminoácido à prolina na posição 141 é designada como 141P. Onde a substituição inclui uma letra, um número, e uma letra, por exemplo, A141P, então isto refere-se a {aminoácido original / posição de acordo com o sistema de numeração/aminoácido substituído}. Consequentemente, por exemplo, a substituição de alanina por prolina na posição 141 é designada como A141P.

[00048] Onde duas ou mais substituições são possíveis em uma posição particular, isto será designado por letras contíguas, que podem ser opcionalmente separadas por barras “/”, por exemplo, G303ED ou G303E/D.

[00049] Posição(ões) e substituições de aminoácidos referidas neste pedido são listadas com referência à posição correspondente e o ami- noácido correspondente da SEQ ID NO: 1. Posições equivalentes em outra sequência podem ser encontradas pelo alinhamento desta sequência com a SEQ ID NO:1 para encontrar um alinhamento com identidade percentual mais alta e após isso determinação para que o aminoácido se alinhe para corresponder a um aminoácido de uma posição específica da SEQ ID NO:1. Tal alinhamento e uso de uma sequência como uma primeira referência são simplesmente uma matéria de rotina para um versado ordinário na técnica.

[00050] “Ácidos nucleicos variantes” podem incluir sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridizar às sequências nucleotídicas apresentadas neste pedido, em particular a SEQ ID NO:52. Por exemplo, uma sequência variante é complementar a sequências capazes de hibridizar sob condições estringentes, por exemplo, 50°C e SSC 0,2X (1X SSC = NaCl a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,0), às sequências nucleotídicas apresentadas neste pedido, em particular a SEQ ID NO:52 (pMS 382 DNA). Mais particularmente, o termo variante engloba sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridizar sob condições altamente estringentes, por exemplo, 65°C e SSC 0,1X, às sequências nucleotídicas apresentadas neste pedido, em particular a SEQ ID NO:52 (pMS 382 DNA). O ponto de fusão (Tm) de um ácido nucleico variante pode ser aproximadamente 1, 2, ou 3°C menor do que a Tm do ácido nucleico do tipo selvagem. Ácidos nucleicos variantes incluem um polinucleotídeo tendo certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, da identidade de sequência com o ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO: 1.

[00051] Como usado neste pedido, o termo “expressão” refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido baseado na sequência de ácidos nucleicos de um gene. O processo inclui tanto transcrição como tradução.

[00052] “Isolado” significa que a sequência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente que a sequência está associada naturalmente e encontrada na natureza, por exemplo, sequências genômicas.

[00053] “Purificado” significa que o material está em um estado relati-vamente puro, por exemplo, pelo menos aproximadamente 90% puro, pelo menos aproximadamente 95% puro, ou pelo menos aproximadamente 98% puro.

[00054] “Termoestável” significa que a enzima conserva a atividade após exposição a temperaturas elevadas. A termoestabilidade de uma enzima pode ser medida pela sua meia-vida (t1/2), onde a metade da atividade de enzima é perdida pela meia-vida. O valor de meia-vida é calculado sob condições definidas pela media da atividade de amilase residual. Para determinar a meia-vida da enzima, a amostra é aquecida à temperatura teste por 1 a 10 min, e a atividade é medida usando um ensaio-padrão para atividade de amilase, tal como o ensaio Betamyl® (Megazyme, Irlanda).

[00055] Como usado neste pedido, “pH ótimo” significa o pH no qual os polipeptídeos variantes revelados neste pedido exibem atividade em um ensaio-padrão de atividade de amilase, medida ao longo de uma faixa de pH.

[00056] Como usado neste pedido, “polipeptídeo” é usado intercam- biavelmente com os termos “sequência de aminoácidos”, “enzima”, “peptídeo” e/ou “proteína”. Como usado neste pedido, “sequência nucleotídica” ou “sequência de ácidos nucleicos” referem-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou sequência de polinucleotídeos e variantes, homólogos, fragmentos e derivados das mesmas. A sequência nucleotídica pode ser de origem genômica, sintética ou recombinante e pode ser de fita dupla ou de fita simples, se representando a fita antissentido ou sentido. Como usado neste pedido, o termo “sequência nucleotídica“ inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético, e RNA.

[00057] “Homólogo” significa uma entidade que tem certo grau de identidade ou “homologia“ com as sequências de aminoácidos objeto e sequências nucleotídicas objeto. Uma “sequência homóloga” inclui um polinucleotídeo ou um polipeptídeo tendo uma certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, de identidade de sequência com outra sequência. A identidade percentual significa que, quando alinhada, que a porcentagem de bases ou resíduos de aminoácidos é a mesma quando comparada às duas sequências. As sequências de aminoácidos não são idênticas, onde um aminoácido é substituído, deletado, ou adicionado em comparação à sequência objeto. A identidade de sequência percentual tipicamente é medida com respeito à sequência madura da proteína objeto, isto é, após remoção de uma sequência sinal, por exemplo. Tipicamente, homólogos compreenderão os mesmos resíduos de sítio ativos que a sequência de aminoácidos objeto. Homólogos também conservam atividade de amilase, embora o homólogo possa ter propriedades enzimáticas diferentes do que a PS4 do tipo selvagem.

[00058] Como usado neste pedido, “hibridização“ inclui o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se junta a uma fita complementar pelo pareamento de bases, bem como o processo da amplificação como realizado nas tecnologias de reação de polimerase em cadeia (PCR). O ácido nucleico variante pode existir como DNA ou RNA de fita única ou dupla, um heteroduplex RNA/DNA ou um copolímero RNA/DNA. Como usado neste pedido, “copolímero“ refere-se a uma fita de ácido nucleico única que compreende tanto ribonucleotídeos como desoxirribonucleotídeos. O ácido nucleico variante pode ser otimizado pelo códon para aumentar mais a expressão.

[00059] Como usado neste pedido, um composto “sintético“ é produzido por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não é limitado a, ácidos nucleicos variantes produzidos com uso ótimo de códon de organismos hospedeiros, tais como um hospedeiro de célula de levedura ou outros hospedeiros de expressão da escolha.

[00060] Como usado neste pedido, “célula transformada” inclui células, incluindo tanto células bacterianas como fúngicas, que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A transformação tipicamente ocorre pela inserção de uma ou mais sequências nucleotídicas em uma célula. A sequência nucleotídica inserida pode ser uma sequência nucleotídica heteróloga, isto é, é uma sequência que não é natural para a célula que deve ser transformada, tal como uma proteína de fusão.

[00061] Como usado neste pedido, “operacionalmente ligado” significa que os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é alcançada sob condição compatível com as sequências de controle.

[00062] Como usado neste pedido, o termo “amido“ refere-se a qualquer material compreendendo os carboidratos de polissacarídeos complexos de plantas, tais como milho, compreendendo amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, onde X pode ser qualquer número. O termo “amido granular” refere-se ao amido bruto, isto é, não cozido, por exemplo, amido que não foi submetido à gelatinização.

[00063] O termo “liquefação“ refere-se ao estágio na conversão de amido na qual o amido gelatinizado é hidrolisado para fornecer dextrinas solúveis de baixo peso molecular. Como usado neste pedido, o termo “sacarificação“ refere-se à conversão enzimática de amido à glicose. O termo “grau de polimerização” (DP) refere-se ao número (n) de unidades de anidroglicopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos maltose e sacarose.

[00064] Como usado neste pedido, o termo “conteúdo de sólidos secos” (ds) refere-se aos sólidos totais de uma pasta fluida em uma base percentual de peso seco. O termo “pasta fluida“ refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

[00065] A frase “sacarificação e fermentação simultânea (SSF)” refere-se a um processo na produção de bioquímicos nos quais um organismo microbiano, tal como um microrganismo produtor de etanol e pelo menos uma enzima, tal como PS4 ou uma variante da mesma, está presente durante a mesma etapa do processo. SSF refere-se à hidrólise contemporânea de substratos de amido granular a sacarídeos e a fermentação dos sacarídeos em álcool, por exemplo, no mesmo vaso reator.

[00066] Como usado neste pedido “microrganismo etanologênico” refere-se a um microrganismo com capacidade de converter um açúcar ou oligossacarídeo a etanol.

1.2. Abreviaturas

[00067] As seguintes abreviaturas aplicam-se a menos que indicado de outra maneira:ADA azodicarbonamidacDNA DNA complementar CGTase ciclodextrina glIcanotransferaseDEAE dietilamino etanoldH2O água deionizadaDNA ácido desoxirribonucleicods-DNA DNA de fita duplaEC comissão de enzima para classificação de enzimaFGSC Centro de Estoque de Genética FúngicaG121F resíduo glicina (G) na posição 121 da SEQ IDNO: 2 é substituído por um resíduo fenilalanina (F), onde os aminoácidos são designados por abreviaturas de letra única comumente conhecidas na técnicaHPLC Cromatografia Líquida de Alto DesempenhomRNA ácido ribonucleico mensageiroPCR reação de polimerase em cadeiaPDB Base de Banco de dados de proteínasPEG polietilenoglicolppm partes por milhãoPS4 amilase formadora de G4 de P. saccharophilaRT-PCR reação de polimerase em cadeia viatranscriptase reversaSAS amilase formadora de G4 de P. saccharophilaSDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida do sulfato de dodecil de sódioSSC 1X NaCl a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH7,0SSF sacarificação e fermentação simultâneat % meia-vidaTm temperatura de fusão (°C) na qual 50% da proteína objeto estão fundidosΔTm aumento em °C na Tm p/v peso/volumep/p peso/peso

2. Variantes de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1

[00068] Em um aspecto, um polipeptídeo tendo uma substituição em uma ou mais posições que efetuam uma propriedade alterada, que pode ser qualquer combinação de exoespecificidade, endoespecifidade alterada ou termoestabilidade alterada, ou uma propriedade de manejo alterada, em relação à SEQ ID NO: 1, é fornecida. Tais polipeptídeos variantes também são referidos neste documento para conveniência como “polipeptídeo variante”, “variante de polipeptídeo” ou “variante“. Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm um efeito antiendurecimento melhorado em comparação à amilase da SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm uma termoestabilidade melhorada em comparação à amilase da SEQ ID NO: 1. Em modalidades altamente preferenciais, têm a vantagem adicionada de termoestabilidade mais alta, ou atividade de exoamilase mais alta ou estabilidade a pH mais alta, ou qualquer combinação.

[00069] Em um aspecto, as variantes como definidas neste pedido exibem atividade enzimática. Em um aspecto, os polipeptídeos variantes compreendem atividade de amilase. Em um aspecto adicional, os polipeptídeos variantes compreendem atividade de exoamilase. Em um aspecto adicional, os polipeptídeos variantes exibem atividade de exoamilase não maltogênica. Em um aspecto, as variantes como definidas neste pedido são a forma derivável de •-amilase de Pseudomonas saccharophila (PS4). Em um aspecto, as variantes como definidas neste pedido são uma maltotetra-hidrolase formadora de maltotetraose, também chamada de EC 3.2.1.60; amilase formadora de G4; G4-amilase ou glIcan 1,4-alfa-maltotetra-hidrolase.

[00070] Composições, incluindo aditivos alimentícios, produtos alimentícios, produtos de panificação, composições aperfeiçoadoras, produtos de ração incluindo forragem, etc. compreendendo tais polipeptídeos variantes como definidos neste pedido, tais como aqueles que têm atividade de exoamilase não maltogênica, bem como métodos de criação e utilização de tais polipeptídeos e composições, são fornecidos neste pedido.

[00071] Como observado acima, os polipeptídeos variantes podem compreender uma ou mais propriedades de manejo melhoradas, preferencialmente propriedades de cozimento melhoradas. Dessa forma, os polipeptídeos variantes são tais que os produtos alimentícios assim tratados têm uma ou mais (preferencialmente todas) de uma consistência mais baixa, uma elasticidade mais alta, uma coesividade mais alta, um esfarelamento mais baixo ou uma maleabilidade mais alta. Tal manejo melhorado ou propriedades de cozimento exibidos pelos polipeptídeos variantes são descritos em detalhes adicionais abaixo.

[00072] Além disso, um tratamento de produtos alimentícios, particularmente massas de farinha e produtos de panificação com tais polipeptídeos, e tais que os produtos alimentícios exibam as qualidades desejadas estabelecidas acima, é fornecido.

[00073] Ainda é fornecido outros usos das variantes descritas neste pedido e composições compreendendo estas variantes, tais como na preparação de detergentes, como adoçantes, xaropes, etc. As composições incluem o polipeptídeo em conjunto com pelo menos um outro componente. Especialmente, aditivos de alimentos ou de rações compreendendo os polipeptídeos, são fornecidos.

[00074] Um polipeptídeo isolado e/ou purificado compreendendo um polipeptídeo variante como definido neste pedido é fornecido. Em uma modalidade, o polipeptídeo variante é uma forma madura do polipeptídeo (SEQ ID NO: 1), em que a sequência líder de 21 aminoácidos é clivada, para que o N-terminal do polipeptídeo comece no resíduo ácido aspártico (D). Em um aspecto, as variantes incluem um domínio de ligação C-terminal de amido. Uma sequência de aminoácidos representativa de um domínio de ligação de amido compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36. Outras variantes incluem variantes em que entre um e aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos foram adicionados ou deletados com respeito a SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que qualquer número entre um e aproximadamente 25 aminoácidos foi substituído. Em um aspecto adicional, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que qualquer número entre três e doze aminoácidos foi substituído. Em um aspecto adicional, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que qualquer número entre cinco e nove aminoácidos foi substituído.

[00075] Em um aspecto, pelo menos pelo menos dois, em outro aspecto, pelo menos três, e ainda em outro aspecto, pelo menos cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 1 foram substituídos.

[00076] Em um aspecto adicional, o comprimento da variante de polipeptídeo é de 390 a 540 aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento da variante de polipeptídeo é de 410 a 440 aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento da variante de polipeptídeo é de 420 a 435 aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento da variante de polipeptídeo é de 429 a 430 aminoácidos.

[00077] Em um aspecto, a invenção relaciona-se a um polipeptídeo tendo atividade de amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo:a) identidade de sequência de pelo menos 65% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88 ou 205, e/ou b) identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 16, 48, 97, 105, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401, 403, 412 ou 409, e/ouc) identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G ou 399C/H, e/oud) identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 44, 96, 204, 354 ou 377, e/oue) identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende a seguinte substituição de aminoácidos: 392Sem que uma substituição de aminoácidos é relativa ao aminoácido correspondente da SEQ ID NO:1 e as posições são com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00078] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 248, 266, 311, 377 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D ou 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 311 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/N/I/H/F, 272D, ou 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende substituições de aminoácidos pelo menos em quatro, cinco ou em todas as seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 311 ou 409 e/ou tem pelo menos uma, ou duas das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/N/I/H/F, 272D ou 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende ainda um ou mais dos seguintes aminoácidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E/S/K/A, 229P, 307K, 309P e 334P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido ainda tem os seguintes aminoácidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 229P, 307K, 309P e 334P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem pelo menos uma das substituições de aminoácidos em a) da reivindicação 1 e compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 44, 96, 204, 354 ou 377. Em um aspecto adicional, opolipeptídeo como definido neste pedido tem identidade de sequência de pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 34Q. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 42K/F/H/I/N/A/V. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 42K/F/H/I/N. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 42K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 88. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 88L/Y/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 88L. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 88Y. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 205. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 205L/K/M/N/Q/R/V/Y. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 205L/K/M/N/Q/R/V. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 205L. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 235. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235H/K/R/Q/S. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235H/K/R/Q. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235H/K/R. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235R. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235R. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 235K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 240. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 240E/H/M/D/S. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 240E/H/M/D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 240E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 272D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 311. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 311P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 409. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 409H/Q/T/E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 100Q/K/N/R. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 100Q. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392D/E/K/Y. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 392Y. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem ambos dos seguintes aminoácidos 235R e 311P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 16. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 16/A/E/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 48. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 48/C/L. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 97. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 105. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 105/N/R. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 248. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 266. Em um aspecto adicional, opolipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 347. Em um aspecto adicional, opolipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 347/C/D/H/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 350. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 350E/H/N. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 354. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 354D/E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 362. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 362E/H/P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 364. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 364E/K/NQ. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 369. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 369I/N. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 377. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 393. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 393D/E/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 395. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 395C/E/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 396. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 396D/E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 399. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 399C/H. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 400. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 400S/W. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 401. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 401D/K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 403. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 403E/T/V. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma substituição de aminoácidos na posição 412. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 412D/N. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende ainda um ou mais dos seguintes aminoácidos 121F, 134R, 141P, 229P, ou 307K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem um ou mais dos seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D, ou 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 235R, 311P, 392D e 223S, 223K ou 223A. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende ainda um ou mais selecionados do grupo consistindo em 272D, 409E, 205L e 240E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem pelo menos quatro, cinco, seis, sete ou oito dos seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D, ou 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido 223A/K/S. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223S,235R, 311P e 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo comodefinido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223K,235R, 272D, 311P e 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, opolipeptídeo como definido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223K, 240E, 235R, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223A, T235R, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido tem um ou mais aminoácidos no N-terminal. Em um aspecto, o polipeptídeo como definido neste pedido tem o aminoácido M no N-terminal. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 34Q, 100Q, 223A/S,240E, 311P, 392D, ou 409E com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 34Q, 88K/L/Y, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/H/Q/R, 240E/D, 248H, 266T, 311P, 377D/E/P, 392K/D/Y ou 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 34Q, 42K, 88L, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/R, 240E, 311P, 392D ou 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 235R e 311P. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende a substituição de aminoácidos 42K. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K e 223S. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 223S e 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 223A, 235R, 311P e 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P e 392D. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 34Q, 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo como definido neste pedido compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 100Q, 205L, 223K, 235R,240E, 311P, 392D e 409E.

[00079] Modalidades representativas dos polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34. Modalidades representativas adicionais dos polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17. Modalidades representativas adicionais dos polipeptídeos como definidos neste pedido têm uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34. Modalidades representativas adicionais dos polipeptídeos como definidos neste pedido têm uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17, e opcionalmente um ou mais aminoácidos no N-terminal.

[00080] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência HGGDEIILQFHWN (SEQ ID NO: 37) nas posições correspondentes às posições 13-26 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00081] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4- SSW (SEQ ID NO: 38), em que X1 é S ou T, X2 é M ou L, X3 é V ou P e X4 é qualquer resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente, preferencialmente um L-aminoácido, nas posições correspondentes às posições 49-66 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00082] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência GGEGYFW (SEQ ID NO: 39) nas posições correspondentes às posições 79-85 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00083] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência VPNH (SEQ ID NO: 40) nas posições correspondentes às posições 114-117 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00084] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência CDDGD (SEQ ID NO: 41) nas posições correspondentes às posições 150-154 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00085] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência AGGFRFDFVRG (SEQ ID NO: 42) nas posições correspondentes às posições 187-197 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00086] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência FALK (SEQ ID NO: 43) nas posições correspondentes às posições 256-259 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00087] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência WREVAVTFVDNHD (SEQ ID NO: 44) nas posições correspondentes às posições 282-294 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00088] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência GYSPG (SEQ ID NO: 45) nas posições correspondentes às posições 296-300 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00089] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência GQH (SEQ ID NO: 46) nas posições correspondentes às posições 304-306 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00090] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência AYAYI (SEQ ID NO: 47) nas posições correspondentes às posições 318-322 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00091] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência SPGTP (SEQ ID NO: 48) nas posições correspondentes às posições 325-329 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00092] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência VYW (SEQ ID NO: 49) nas posições correspondentes às posições 331-333 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00093] Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido compreendem a sequência HMYDWG (SEQ ID NO: 50) nas posições correspondentes às posições 335-340 com referência à numeração de po-sição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.

[00094] Em outro aspecto, a variante de polipeptídeo como definido neste pedido tem a sequência da SEQ ID NO:1, em que qualquer número entre um e aproximadamente 25 aminoácidos foi substituído. Exemplos representativos de variantes de polipeptídeo como definido neste pedido tendo uma ou várias substituições de aminoácidos são mostrados abaixo na TABELA A:

[00095] As variantes de polipeptídeo como definido neste pedido podem ter uma termoestabilidade alterada, uma atividade de endoamilase alterada, uma atividade de exoamilase alterada, e/ou uma proporção alterada de atividade de exo- para endoamilase comparada à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10. Em um aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm um efeito antiendurecimento melhorado comparado à amilase da SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, os polipeptídeos como definidos neste pedido têm uma termoestabilidade melhorada comparados à amilase da SEQ ID NO: 1.

[00096] As variantes de polipeptídeo como definido neste pedido podem ter até 25, 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9, 8, 7, 6, 5 deleções, adições, inserções, ou substituições de aminoácidos comparadas à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[00097] A presente descrição também se relaciona a todo ou a cada estrutura de G4-amilase tendo SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8 compreendendo as substituições como ainda definido neste pedido.

[00098] Os ácidos nucleicos que codificam as variantes de polipeptídeo acima também são fornecidos. Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido é uma sequência nucleotídica que codifica a proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos de resíduos 1 a 429 da SEQ ID NO: 1 como apresentada na SEQ ID NO: 52. por exemplo, a sequência nucleotídica SEQ ID NO: 3 codifica o estrutura de amilase G4 com a SEQ ID NO: 2. Como é bem entendido por um versado na técnica, o código genético é degenerado, significando que múltiplos códons em alguns casos podem codificar o mesmo aminoácido. Ácidos nucleicos podem incluir DNA genômico, mRNA, e cDNA que codifica uma variante de polipeptídeo

2.1. Caracterização de variante de polipeptídeo

[00099] Variantes de enzima podem ser caracterizadas por suas sequências primárias de ácidos nucleicos e de polipeptídios, por modelagem estrutural tridimensional, e/ou por sua atividade específica. Características adicionais das variantes de polipeptídeos como definido neste pedido incluem estabilidade, faixa de pH, estabilidade de oxidação e termoestabilidade, por exemplo. Níveis de expressão e atividade de enzima podem ser avaliados usando ensaios-padrão conhecidos pelo versado neste campo. Em outro aspecto, as variantes demonstram características de desempenho melhoradas relativas ao polipeptídeo com a SEQ ID NO: 1, tais como estabilidade melhorada em altas temperaturas, por exemplo, 65-85°C. Em um aspecto, as variantes de polipeptídeos como definido neste pedido são vantajosas para o uso na liquefação ou outros processos que requerem temperaturas elevadas, tais como cozimento. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo termoestável como definido neste pedido pode degradar o amido em temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 85°C ou mais.

[000100] Uma característica de expressão significa um nível alterado da expressão da variante, quando a variante é produzida em uma célula hospedeira particular. A expressão geralmente relaciona-se à quantidade da variante ativa que é recuperável de um caldo de fermentação usando técnicas padrão conhecidas nesta técnica ao longo de um período de tempo dado. A expressão também pode relacionar-se à quantidade ou taxa da variante produzida dentro da célula hospedeira ou secretada pela célula hospedeira. A expressão também pode relacionar-se à taxa da tradução do mRNA que codifica a enzima variante.

[000101] Um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico que codifica qualquer uma das variantes de polipeptídeos como definidas neste pedido apresentadas neste pedido é fornecido. Adicionalmente, um ácido nucleico capaz de hibridizar ao complemento é fornecido. Em outra modalidade, a sequência para uso nos métodos e composições descritas aqui é uma sequência sintética. Inclui, mas não é limitado a, sequências feitas com o uso ótimo de códon para expressão em organismos hospedeiros, tais como leveduras.

3. Produção das variantes de polipeptídeos como definido neste pedido

[000102] As variantes de polipeptídeo são fornecidas neste pedido podem ser produzidas sinteticamente ou pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, de acordo com os procedimentos bem conhecidos na técnica. A variante de polipeptídeo expressa como definido neste pedido opcionalmente é isolada antes do uso. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo como definido neste pedido é purificada após expressão. Os métodos de modificação genética e produção recombinante de variantes de polipeptídeo são descritos, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 7.371.552, 7.166.453; 6.890.572; e 6.667.065; e nos Pedidos de Patente Americana Publicados N° 2007/0141693; 2007/0072270; 2007/0020731;2007/0020727; 2006/0073583; 2006/0019347; 2006/0018997;2006/0008890; 2006/0008888; e 2005/0137111. Os ensinamentosrelevantes destas descrições, incluindo sequências polinucleotídicas que codificam o polipeptídeo, iniciadores, vetores, métodos de seleção, células hospedeiras, purificação e reconstituição de variantes de polipeptídeos expressas, e caracterização de variantes de polipeptídeos como definido neste pedido, incluindo tampões úteis, faixas de pH, concentrações de Ca2+, concentrações de substrato e concentrações de enzima de ensaios enzimáticos, são neste pedido incorporados por referência.

[000103] Em outra modalidade, células hospedeiras adequadas incluem uma bactéria gram-positiva selecionada a partir do grupo consistindo em Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans, ou S. murinus; ou uma bactéria gram-negativa, em que a dita bactéria gram- negativa é Escherichia coli ou uma espécie de Pseudomonas. Em um aspecto, a célula hospedeira é um B. subtilis ou B. licheniformis. Em uma modalidade, a célula hospedeira é B. subtilis, e a proteína expressa é engendrada para compreender uma sequência sinal de B. subtilis, como apresentadas em detalhes adicionais abaixo. Em um aspecto, a célula hospedeira expressa o polinucleotídeo como estabelecido nas reivindicações.

[000104] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é geneticamente engendrada para expressar uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido com uma sequência de aminoácidos tendo identidade de pelo menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao polipeptídeo da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido terá uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de ácidos nucleicos tendo identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% a um ácido nucleico que codifica a proteína da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos tem identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao ácido nucleico da SEQ ID NO: 52.

3.1. Vetores

[000105] Em um aspecto, a invenção relaciona-se a um vetor compre-endendo um polinucleotídeo. Em um aspecto, da invenção uma célula bacteriana compreende o vetor. Em algumas modalidades, um construto de DNA que compreende um ácido nucleico que codifica uma variante é transferido para uma célula hospedeira em um vetor de expressão que compreende sequências reguladoras operacionalmente ligadas a uma sequência de codificação. O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser integrado em um genoma de célula hospedeira fúngica e replicado quando introduzido na célula hospedeira. O FGSC Catalogue of Strains, Universidade do Missouri, lista vetores adequados. Exemplos adicionais de expressão adequada e/ou vetores de integração são fornecidos em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Bennett et al., MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991), pp. 396-428; e Patente Americana No. 5.874.276. Vetores exemplares incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 e pENTR/D, pDONTM201, pDONRTM221, pENTRTM, pGEM®3Z e pGEM®4Z. Exemplar para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19, que permitem replicação em E. coli, e pE194, por exemplo, que permite a replicação em Bacillus.

[000106] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma variante é operacionalmente ligado a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos não restritivos adequados de promotores incluem promotores cbh1, cbh2, egl1 e egl2. Em uma modalidade, o promotor é aquele que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando P. saccharophila é o hospedeiro, o promotor é o promotor nativo P. saccharophila. Um “promotor induzível” é promotor que é ativo sob-- regulação ambiental ou em desenvolvimento. Em outra modalidade, o promotor é aquele que é heterólogo à célula hospedeira.

[000107] Em algumas modalidades, a sequência de codificação é operacionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica uma sequência sinal. Um peptídeo de sinal representativo é a SEQ ID NO: 11, que é a sequência sinal nativa do precursor de PS4. Em outras modalidades, o DNA que codifica a sequência sinal é substituído por uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência sinal de uma espécie além de P. saccharophila. Nesta modalidade, o polinucleotídeo que codifica a sequência sinal é imediatamente a montante e na estrutura do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. A sequência sinal pode ser selecionada das mesmas espécies que a célula hospedeira. Em um exemplo não limitante, a sequência sinal é uma sequência sinal de ciclodextrina glIcanotransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) de Bacillus sp., e os polipeptídeos variantes revelados neste pedido são expressos em uma célula hospedeira de B. subtilis. Um resíduo de metionina pode ser adicionado ao N-terminal da sequência sinal.

[000108] Em modalidades adicionais, uma sequência sinal e uma sequência promotora compreendendo um construto de DNA ou vetor a ser introduzido em uma célula hospedeira fúngica são derivadas da mesma fonte. Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de terminação. Em uma modalidade, a sequência de terminação e a sequência promotora são derivadas da mesma fonte. Em outra modalidade, a sequência de terminação é homóloga à célula hospedeira.

[000109] Em algumas modalidades, um vetor de expressão inclui um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem aqueles que conferem a resistência a agentes antimicrobianos, por exemplo, higromicina ou fleomicina. Marcadores seletivos nutritivos também são adequados e incluem amdS, argB e pyr4. Em uma modalidade, o marcador seletivo é o gene amdS, que codifica a enzima acetamidase; ele permite a células transformadas crescer em acetamida como uma fonte de nitrogênio. O uso de um gene amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito em Kelley et al., EMBO J. 4: 475-479 (1985) e Penttila et al., Gene 61: 155-164 (1987).

[000110] Um vetor de expressão adequado compreendendo um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifica uma variante pode ser qualquer vetor que é capaz de replicação autonomamente em um dado organismo hospedeiro ou integração no DNA do hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um plasmídeo. Em algumas modalidades, dois tipos de vetores de expressão para obter a expressão de genes são contemplados. O primeiro vetor de expressão compreende sequências de DNA nas quais o promotor, região de codificação, e terminador todos se originam do gene a ser expresso. Em algumas modalidades, o truncamento gênico é obtido pela deleção de sequências de DNA indesejadas, por exemplo, DNA que codifica o domínio de ligação a amido C-terminal, para deixar o domínio a ser expresso no controle das suas próprias sequências reguladoras transcricionais e traducionais. O segundo tipo de vetor de expressão é pré-montado e contém as sequências necessárias para a transcrição de alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região de codificação de um gene ou parte do mesmo é inserida neste vetor de expressão de uso geral, tal que esteja sob controle trans- cricional do promotor de construto de expressão e sequências terminadoras. Em algumas modalidades, os genes ou parte dos mesmos são inseridos a jusante do promotor cbh1 forte.

3.2. Transformação, expressão e cultura de células hospedeiras

[000111] A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE- dextrina; incubação com DNA em fosfato de cálcio precipitado; bombardeio de alta velocidade com microprojéteis recobertos com DNA; e fusão de protoplasto. Técnicas de transformação gerais são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Ausubel et al. (1987), supra, chapter 9; Sambrook et al. (2001), supra; e Campbell et al., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). A expressão da proteína heteróloga em Trichoderma é descrita, por exemplo, na Patente Americana No. 6.022.725; Patente Americana No. 6.268.328; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991); Harkki et al., BioTechnol. 7: 596-603 (1989); EP244.234; e EP 215.594. Em uma modalidade, os transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetor pelo qual o ácido nucleico que codifica uma variante está estavelmente integrado em um cromossomo da célula hospedeira. Os transformantes então são purificados por técnicas conhecidas.

[000112] Em um exemplo não limitante, os transformantes estáveis incluindo um marcador amdS são distinguidos de transformantes instáveis pela sua taxa de crescimento mais rápida e formação de colônias circulares com um traçado liso, em vez de irregular em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos, um teste adicional de estabilidade é conduzido pela cultura dos transformantes em meio sólido não seletivo, por exemplo, um meio sem acetamida, coleta de esporos deste meio de cultura e determinação da porcentagem destes esporos que posteriormente germinam e crescem em meios seletivos contendo acetamida. Outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para selecionar transformantes.

3.3. Identificação de atividade

[000113] Para avaliar a expressão de uma variante em uma célula hospedeira, ensaios podem medir a proteína expressa, mRNA correspondente, ou atividade de •-amilase. Por exemplo, ensaios adequados incluem Northern e Southern blotting, RT-PCR (reação de polimerase em cadeia via transcriptase reversa), e a hibridização in situ, usando uma sonda hibridizante apropriadamente marcada. Ensaios adequados também incluem medida da atividade em uma amostra. Ensaios adequados de exoatividade da variante incluem, mas não são limitados a, ensaio Betamyl® (Megazyme, Irlanda). Ensaios adequados da endoatividade da variante incluem, mas não são limitados a, o ensaio azul de Phadebas (Pharmacia and Upjohn Diagnostics AB). Os ensaios também incluem análise por HPLC do liquefeito preparado na presença da variante. HPLC pode ser usada para medir a atividade de amilase pela separação de sacarídeos DP-3 e DP-4 de outros componentes do ensaio.

Propriedades de Manejo Melhoradas

[000114] Os polipeptídeos variantes descritos neste pedido preferencialmente têm propriedades melhoradas quando comparados à SEQ ID NO:1, tal como uma ou mais de termoestabilidade melhorada, estabilidade melhorada ao pH ou exoespecificidade melhorada. Os polipeptídeos variantes descritos neste pedido preferencialmente também têm propriedades melhoradas de manejo, tais que um produto alimentício tratado com um polipeptídeo variante tem uma ou todas de consistência mais leve, elasticidade maior, coesividade maior, esfarelamento menor, ou maleabilidade maior em comparação a um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO:1.

[000115] Sem desejar estar ligados por qualquer teoria particular, acredita-se que as mutações nas posições particulares têm efeitos individuais e cumulativos sobre as propriedades de um polipeptídeo compreendendo tais mutações.

Termoestabilidade e Estabilidade de pH

[000116] Preferencialmente, o polipeptídeo variante é termoestável; preferencialmente, tem termoestabilidade mais alta do que SEQ ID NO:1.

[000117] No trigo e outros cereais, as cadeias laterais externas na amilopectina estão na faixa de DP 12-19. Dessa forma, a hidrólise enzimática das cadeias laterais de amilopectina, por exemplo, por polipeptídeos variantes como descrito tendo atividade de exoamilase não maltogênica, pode reduzir marcadamente suas tendências de cristalização.

[000118] O amido no trigo e outros cereais usados para fins de cozimento está presente na forma de grânulos de amido que geralmente são resistentes ao ataque enzimático por amilases. Dessa forma a modificação de amido é principalmente limitada ao amido danificado e progride muito lentamente durante o processamento da massa de farinha e cozimento inicial até a gelatinização iniciar a aproximadamente 60C. Por conseguinte, somente amilases com um alto grau de termoestabilidade são capazes de modificar o amido eficientemente durante o cozimento. E geralmente a eficiência de amilases é aumentada com a termoestabilidade crescente. Em razão da enzima ser mais termoestável, maior o tempo que pode ser ativa durante o cozimento e dessa forma mais efeito antiendurecimento ela fornecerá.

[000119] Consequentemente, o uso de polipeptídeos variantes como descrito aqui quando adicionados ao amido em qualquer estágio de seu processamento em um produto alimentício, por exemplo, antes, durante ou após cozimento no pão pode retardar ou impedir ou diminuir a retrogradação. Tal uso é descrito em detalhes adicionais abaixo.

[000120] Como usado neste pedido, o termo “termoestável“ relaciona- se à capacidade da enzima de conservar a atividade após exposição a temperaturas elevadas. Preferencialmente, o polipeptídeo variante é capaz de degradar o amido em temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C ou mais. Apropriadamente, a enzima conserva sua atividade após exposição a temperaturas de até aproximadamente 95°C.

[000121] A termoestabilidade de uma enzima, tal como uma exoamilase não maltogênica é medida pela sua meia-vida. Dessa forma, os polipeptídeos variantes descritos aqui têm meias-vidas extensas em relação à enzima de origem em preferencialmente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais,preferencialmente em temperaturas elevadas de 55°C a aproximadamente 95°C ou mais, preferencialmente a aproximadamente 80°C.

[000122] Como usado aqui, a meia-vida (t1/2) é o tempo (em minutos) durante o qual a metade da atividade de enzima é inativada sob condições de calor definidas. Em modalidades preferenciais, a meia- vida é analisada a 80 graus C. Preferencialmente; a amostra é aquecida por 1 a 10 minutos a 80°C ou mais. O valor da meia-vida então é calculado pela medida da atividade de amilase residual, por qualquer um dos métodos descritos aqui. Preferencialmente, o ensaio de meia- vida é conduzido como descrito em mais detalhes nos Exemplos.

[000123] Preferencialmente, os polipeptídeos variantes descritos aqui são ativos durante o cozimento e hidrolisam o amido durante e após gelatinização dos grânulos de amido que começa em temperaturas de aproximadamente 55 graus C. Quanto mais termoestável exoamilase não maltogênica for, maior o tempo que pode ser ativa e dessa forma mais efeito antiendurecimento ela fornecerá. Entretanto, durante o cozimento acima de temperaturas de aproximadamente 85 graus C, pode acontecer inativação da enzima. Se isto acontecer, a exoamilase não maltogênica pode ser gradualmente inativada para que não haja substancialmente nenhuma atividade após processo de cozimento no pão final. Por isso, preferencialmente exoamilases não maltogênicas adequadas para uso como descrito têm uma temperatura ótima acima de 50 graus C e abaixo de 98 graus C.

[000124] A termoestabilidade dos polipeptídeos variantes descritos neste pedido pode ser melhorada usando engenharia de proteínas para se tornar mais termoestáveis e dessa forma melhor ajustados para os usos descritos neste pedido; por isso, englobamos o uso de polipeptídeos variantes modificados para se tornar mais termoestáveis pela engenharia de proteínas.

[000125] Preferencialmente, o polipeptídeo variante é estável a pH; mais preferencialmente, tem uma estabilidade a pH mais alta do que a SEQ ID NO:1. Como usado neste pedido o termo “pH estável“ relaciona- se à capacidade da enzima de conservar a atividade ao longo de uma larga faixa de pH. Preferencialmente, o polipeptídeo variante é capaz de degradar o amido em um pH de de aproximadamente 5 a aproximadamente 10,5. Em uma modalidade, o grau da estabilidade de pH pode ser analisado medindo a meia-vida da enzima em condições de pH específicas. Em outra modalidade, o grau da estabilidade de pH pode ser analisado pela medida da atividade ou da atividade específica da enzima em condições de pH específicas. As condições de pH específicas podem ser qualquer pH de pH 5 a pH 10,5.

[000126] Dessa forma, o polipeptídeo variante pode ter uma meia-vida mais longa, ou atividade mais alta (dependendo do ensaio) quando comparado à SEQ ID NO:1 sob condições idênticas. Os polipeptídeos variantes podem ter 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou meia-vida mais longa quando comparados à SEQ ID NO:1 sob condições de pH idênticas. Alternativamente, ou além disso, podem ter tal atividade mais alta quando comparados à SEQ ID NO:1 sob condições de pH idênticas.

Exoespecificidade

[000127] É conhecido que algumas exoamilases não maltogênicas podem ter algum grau de atividade de endoamilase. Em alguns casos, pode ser necessário reduzir ou eliminar este tipo de atividade uma vez que a atividade de endoamilase possivelmente pode afetar negativamente a qualidade final do produto de pão pela produção de um miolo pegajoso ou gomoso devido ao acúmulo de dextrinas ramificadas.

[000128] A exoespecificidade pode ser utilmente medida pela determinação da proporção da atividade de amilase total pela atividade de endoamilase total. Esta proporção é referida neste documento como um “índice de exoespecificidade”. Em modalidades preferenciais, uma enzima é considerada uma exoamilase se ela tiver um índice de exoespecificidade de 20 ou mais, isto é, sua atividade de amilase total (incluindo atividade de exoamilase) é 20 vezes ou maior do que sua atividade de endoamilase. Em modalidades altamente preferenciais, o índice de exoespecificidade de exoamilases é 30 ou mais, 40 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais, ou 100 ou mais. Em modalidades altamente preferenciais, o índice de exoespecificidade é 150 ou mais, 200 ou mais, 300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais ou 600 ou mais.

[000129] A atividade de amilase total e a atividade de endoamilase podem ser medidas por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade de amilase total pode ser medida pela análise do número total de extremidades redutoras liberadas de um substrato de amido. Alternativamente, o uso de um ensaio de Betamyl é descrito em detalhes adicionais nos Exemplos, e para conveniência, a atividade de amilase como analisada nos Exemplos é descrita em termos de “Unidades de Betamyl” nas Tabelas.

[000130] A atividade de endoamilase pode ser analisada pelo uso de um Conjunto Phadebas (Pharmacia and Upjohn). Este faz uso de um amido interligado marcado de azul (marcado com um corante azo); somente os cortes internos na molécula de amido liberam a marcação, enquanto os cortes externos não fazem dessa forma. A liberação do corante pode ser medida por espectrofotometria. Consequentemente, o Conjunto Phadebas mede a atividade de endoamilase, e para conveniência, os resultados de tal ensaio são referidos neste documento como “unidades Phadebas”.

[000131] Em uma modalidade altamente preferencial, por isso, o índice de exoespecificidade é expresso em termos de Unidades Betamyl / Unidades de Phadebas, também referido como “B/Phad”.

[000132] A exoespecificidade também pode ser analisada de acordo com os métodos descritos na técnica anterior, por exemplo, na nossa Publicação de Patente Internacional N° WO99/50399. Isto mede a exoespecificidade por meio de uma proporção entre a atividade de endoamilase à atividade de exoamilase. Dessa forma, em um aspecto preferencial, o polipeptídeo variante descrito aqui terá menos de 0,5 unidade de endoamilase (EAU) por unidade da atividade de exoamilase. Preferencialmente, as exoamilases não maltogênicas que são adequadas para uso de acordo com a presente invenção têm menos de 0,05 EAU por unidade da atividade de exoamilase e mais preferencialmente menos de 0,01 EAU por unidade da atividade de exoamilase.

[000133] O polipeptídeo variante descrito aqui terá preferencialmente exoespecificidade, por exemplo, medida por índices de exoespecificidade, como descrito acima, consistente com as que são exoamilases. Além disso, preferencialmente tem exoespecificidade mais alta ou aumentada quando comparado à SEQ ID NO:1. Dessa forma, por exemplo, o polipeptídeo variante pode ter 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou índice de exoespecificidade maior quando comparado à SEQ ID NO:1, preferencialmente sob condições idênticas. Podem ter 1,5x ou mais, 2x ou mais, 5 x ou mais, 10 x ou mais, 50 x ou mais, 100 x ou mais, quando comparado à SEQ ID NO:1, preferencialmente sob condições idênticas.

3.4. Métodos para purificação de variantes

[000134] Em geral, uma variante produzida na cultura celular é secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, pela remoção de componentes não desejados do meio de cultura celular. Em alguns casos, uma variante pode ser recuperada de um lisado celular. Em tais casos, a enzima é purificada das células nas quais foi produzida usando técnicas rotineiramente empregadas por versados na técnica. Exemplos incluem, mas não são limitados a, cromatografia de afinidade, métodos cromatográficos de troca iônica, incluindo cromatografia por interação de troca iônica de alta resolução, hidrofóbica, particionamento em duas fases, precipitação em etanol, HPLC em fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação em sulfato de amônio e filtração em gel usando Sephadex G-75, por exemplo.

4. Composições e usos de variantes

[000135] Uma variante de polipeptídeo produzida e purificada pelos métodos descritos acima é útil para uma variedade de aplicações industriais. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo como definido neste pedido é útil em um processo de conversão de amido, particularmente em um processo de liquefação de um amido, por exemplo, amido de milho, amido de trigo ou amido de cevada. O produto final desejado pode ser qualquer produto que pode ser produzido pela conversão enzimática do substrato de amido. Por exemplo, o produto desejado pode ser um xarope rico em sacarídeos úteis para fermentação, particularmente maltotriose, glicose, e/ou maltose. O produto final então pode ser usado diretamente em um processo de fermentação para produzir o álcool combustível ou para bebida (isto é, álcool potável). O versado conhece várias condições de fermentação que podem ser usadas na produção de etanol ou outros produtos finais de fermentação. Um organismo microbiano capaz de fermentar maltotrioses e/ou açúcares menos complexos, tais como S. cerevisiae ou uma variante geneticamente modificada da mesma, é particularmente útil. Variantes adequadas geneticamente alteradas de S. cerevisiae particularmente úteis para fermentação de maltotrioses incluem variantes que expressam AGT1 permease (Stambuck et al., Lett. Appl. Microbiol. 43: 370-76 (2006)), MTT1 e MTT1alt (Dietvorst et al., Yeast 22: 775-88 (2005)), ou MAL32 (Dietvorst et al., Yeast 24: 2738 (2007)). As variantes de polipeptídeos presentes também são úteis em composições e métodos da preparação de alimentos, onde as enzimas que expressam a atividade de amilase em altas temperaturas são desejadas.

[000136] O desejo de usar uma variante particular de polipeptídeo dependerá das propriedades totais exibidas pela variante de polipeptídeo quanto às exigências de uma aplicação particular. Como uma matéria geral, as variantes de polipeptídeos úteis para um processo de conversão de amido têm a atividade de endoamilase substancial em comparação com PS4 do tipo selvagem ou SEQ ID NO:1, e/ou têm uma atividade de exo- ou endoamilase mais baixa comparada com PS4 do tipo selvagem ou SEQ ID NO:1. Tais variantes de polipeptídeos podem ser particularmente úteis em um processo de liquefação, quando usadas sozinhas ou em combinação com outras variantes de amilase, onde a clivagem interna de complexos de sacarídeos ramificados reduz a viscosidade do substrato. Espera-se que algumas variantes de polipeptídeo úteis para liquefação, entretanto, tenham uma atividade de endoamilase comparável ou ainda mais baixa do que PS4 do tipo selvagem. Variantes de polipeptídeo úteis incluem aquelas com mais ou menos atividade de exoamilase do que PS4 do tipo selvagem ou polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, dependendo da aplicação. As composições podem incluir uma ou uma combinação de variantes de amilase, cada uma das quais pode exibir um conjunto diferente de propriedades.

4.1. Preparação de substratos de amido

[000137] Aqueles versados na técnica conhecem bem métodos disponíveis que podem ser usados para preparar substratos de amido para o uso nos processos revelados neste pedido. Por exemplo, um substrato de amido útil pode ser obtido de tubérculos, raízes, troncos, legumes, cereais ou grão inteiro. Mais especificamente, o amido granular vem de plantas que produzem altas quantidades de amido. Por exemplo, o amido granular pode ser obtido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. O milho contém amido de aproximadamente 60 a 68%; a cevada contém amido de aproximadamente 55 a 65%; o painço contém amido de aproximadamente 75 a 80%; o trigo contém amido de aproximadamente 60 a 65%; e o arroz polido contém amido de 70 a 72%. Substratos de amido especificamente contemplados são amido de milho, amido de trigo e amido de cevada. O amido de um grão pode ser moído ou inteiro e inclui sólidos de milho, tais como núcleos, farelo e/ou espigas de milho. O amido pode ser amido cru altamente refinado ou matéria-prima de processos de refinaria de amido. Vários amidos também estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, o amido de milho está disponível de Cerestar, Sigma e Katayama Chemical Industry Co. (Japão); o amido de trigo está disponível de Sigma; o amido de batatas- doces está disponível de Wako Pure Chemical Industry Co. (Japão); e o amido de batatas está disponível de Nakaari Chemical Pharmaceutical Co (Japão).

[000138] Maltodextrinas são úteis como substratos de amido em modalidades da presente invenção. Maltodextrinas compreendem produtos de hidrólise de amido tendo aproximadamente 20 ou menos unidades de dextrose (glicose). Maltodextrinas comerciais típicas contêm misturas de polissacarídeos incluindo de aproximadamente três a aproximadamente dezenove unidades de dextrose ligadas. Maltodextrinas são definidas pelo FDA como produtos tendo uma equivalência de dextrose (DE) de menos de 20. São geralmente reconhecidos como ingredientes alimentícios seguros (GRAS) para consumo humano. A equivalência de dextrose (DE) é uma medida de poder reduzido comparada a um padrão de dextrose (glicose) de 100. Mais alta a DE, maior a extensão da despolimerização do amido, resultando em um tamanho de polímero médio menor (polissacarídeo), e maior a doçura. Uma maltodextrina particularmente útil é MALTRIN® M040 obtida do amido de milho, disponível em Grain Processing Corp. (Muscatine, Iowa): DE 4,0-7,0; densidade de volume 0,51 g/cc; 6,38% de conteúdo de água medido por peso.

[000139] O substrato de amido pode ser um amido bruto do grão inteiro moído, que contém frações não amido, por exemplo, resíduos de germe e fibras. A moagem pode compreender moagem úmida ou moagem seca. Na moagem úmida, o grão inteiro é embebido em água ou ácido diluído para separar o grão em suas partes componentes, por exemplo, amido, proteína, germe, óleo, fibras do núcleo. A moagem úmida separa eficientemente o germe e a farinha (isto é, grânulos de amido e proteína) e é especialmente adequada para a produção de xaropes. Na moagem seca, os núcleos inteiros são moídos em um pó perfeito e processados sem fracionar o grão em suas partes componentes. O grão moído seco dessa forma compreenderá quantidades significantes de compostos de carboidrato não amido, além do amido. A maior parte do etanol vem da moagem seca. Alternativamente, o amido a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, por exemplo, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99,5% puro.

4.2. Sacarificação, gelatinização e liquefação de amido

[000140] Como usado neste pedido, o termo “liquefação“ ou “liquefazer“ significa um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas de cadeia mais curtas e menos viscosas. Este processo envolve gelatinização do amido simultaneamente ou seguido pela adição de uma variante de polipeptídeo como descrito neste pedido. Uma variante de polipeptídeo termoestável como descrito neste pedido é preferencialmente usada para esta aplicação. Enzimas induzem liquefação adicional podem opcionalmente ser adicionadas.

[000141] Em algumas modalidades, o amido ou substrato de maltodextrina preparado como descrito acima é transformado em pasta fluida com água. O amido ou pasta fluida de maltodextrina pode conter amido como uma porcentagem em peso de sólidos secos de aproximadamente 10 a 55%, aproximadamente 20 a 45%, aproximadamente 30 a 45%, aproximadamente 30 a 40%, ou opcionalmente aproximadamente 30 a 35%. As •-amilases, por exemplo, alfa-amilases bacterianas, incluindo alfa-amilases de Bacillus, são normalmente fornecidas, por exemplo, em aproximadamente 1500 unidades por kg de matéria seca de amido, por exemplo. Para otimizar a estabilidade e atividade da •-amilase, o pH da pasta fluida pode ser ajustado ao pH ótimo da variante de polipeptídeo usada. Outras •- amilases podem ser adicionadas e podem requerer condições ótimas diferentes. A •-amilase bacteriana que permanece na pasta fluida após liquefação pode ser desativada reduzindo o pH em uma etapa de reação subsequente ou removendo cálcio da pasta fluida.

[000142] A pasta fluida do amido mais a variante de polipeptídeo podem ser bombeadas continuamente por um forno em sistema contínuo, que é vapor aquecido de aproximadamente 85°C a até 105°C. Gelatinização ocorre muito rapidamente sob estas condições, e a atividade enzimática, combinada com forças de cisalhamento significantes, começa a hidrólise do substrato de amido. O tempo de residência no forno em sistema contínuo é muito breve. O amido em parte gelatinizado pode ser passado em uma série de tubos de fixação em aproximadamente 85-105°C e mantido por aproximadamente 5 min. para completar o processo de gelatinização. Estes tanques podem conter defletores para impedir a retromistura. Como usado neste pedido, o termo “liquefação secundária“ refere-se à etapa de liquefação subsequente à liquefação primária, quando se permite que a pasta fluida resfrie à temperatura ambiente. Esta etapa de resfriamento pode ser aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos, por exemplo, aproximadamente 90 minutos a 120 minutos.

[000143] Uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido pode ser adicionada ao amido liquefeito obtido pelo processo acima ou a uma pasta fluida de maltodextrina em aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 kg/MTDS. 1 kg/MTDS = 0,1% por peso de sólidos dissolvidos. Em uma modalidade, um polipeptídeo como definido neste pedido pode ser adicionado a um amido liquefeito ou pasta fluida de maltodextrina em um nível de tratamento em uma faixa de aproximadamente 0,001% por peso a aproximadamente 0,01% por peso baseado em sólidos dissolvidos. Em uma modalidade típica, um polipeptídeo como definido neste pedido pode ser adicionado a um amido liquefeito ou pasta fluida de maltodextrina em um nível de tratamento em uma faixa de aproximadamente 0,0025% por peso a aproximadamente 0,01% por peso baseado em sólidos dissolvidos. Em uma modalidade, o polipeptídeo como definido neste pedido é imobilizado, e o substrato de maltodextrina ou amido liquefeito é passado sobre o polipeptídeo imobilizado como definido neste pedido e convertido no produto em uma reação contínua. Nesta modalidade, o polipeptídeo como definido neste pedido pode ser imobilizado com enzimas adicionais, tais como uma pululanase.

[000144] A produção de maltotetraose pode compreender ainda contato do amido liquefeito ou outra fonte de maltodextrinas com uma isoamilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, ou qualquer combinação das mesmas.

[000145] Também é fornecido um método de produção de um xarope de sacarídeo (por exemplo, maltotetraose), compreendendo adição de uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido ou uma composição compreendendo a variante a um amido liquefeito e sacarificação do amido liquefeito para formar o xarope de sacarídeo. A variante de polipeptídeo como definida neste pedido pode ser adicionada ao amido liquefeito em uma faixa de aproximadamente 0,001% por peso a aproximadamente 0,1% por peso baseado em sólidos dissolvidos. Em uma modalidade, a variante é adicionada ao amido liquefeito em uma faixa de aproximadamente 0,0025% por peso a aproximadamente 0,01% por peso baseado em sólidos dissolvidos. As unidades da concentração também são expressas neste pedido como kg de variante de polipeptídeo por tonelada métrica de sólidos secos (MTDS), onde 1 kg/MTDS = 0,1% por peso de sólidos dissolvidos. A solução de amido liquefeita pode ser uma pasta fluida do amido liquefeito em aproximadamente 20-35% p/p de sólidos secos. O amido pode ser obtido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. O amido liquefeito pode ser sacarificado em aproximadamente 55°C a aproximadamente 65°C tal como em aproximadamente 60°C a aproximadamente 65°C. O amido liquefeito pode ser sacarificado em aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente em pH 7,0. Uma pululanase, isoamilase, pululanase, protease, celulase, hemicelulase, lipase, cutinase, ou qualquer combinação das mesmas, pode ser adicionada com a variante de polipeptídeo ao amido liquefeito. Em uma modalidade, o xarope de sacarídeo pode ser fermentado para produzir etanol. O xarope de sacarídeo produzido pelo método pode compreender pelo menos aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, ou aproximadamente 60% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.

[000146] Em outro aspecto, um método de produção de um xarope de sacarídeo, incluindo a adição de uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido e uma alfa-amilase ao amido granular e hidrólise do amido granular para formar o xarope de sacarídeo é fornecido. Em uma modalidade, o amido granular liquefeito é produzido por uma alfa- amilase. Em uma modalidade, o amido granular liquefeito é um liquefeito produzido de ácido. Em uma modalidade, a variante de polipeptídeo como definido neste pedido é adicionada ao amido granular em uma faixa de aproximadamente 0,001% por peso a aproximadamente 0,1% por peso baseado em sólidos dissolvidos. Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo como definido neste pedido é adicionada ao amido granular em uma faixa de aproximadamente 0,0025% por peso a aproximadamente 0,01% por peso baseado em sólidos dissolvidos. O amido granular pode ser obtido do amido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas.

[000147] Em uma modalidade particular, o amido granular é sacarificado em 55°C a 65°C tal como 60°C a 65°C. Em outra modalidade o amido granular é sacarificado em pH 5,0 a pH 7,0. É idealizado que o método também possa incluir a fermentação do xarope de sacarídeo para produzir etanol.

[000148] Em uma modalidade, o método inclui uma etapa de adição de uma enzima tendo atividade desramificadora ao amido granular. A enzima tendo atividade desramificadora pode incluir mas não é limitada a uma isoamilase, uma pululanase, uma isopululanase, uma neopululanase ou qualquer combinação das mesmas. Também é idealizado que o método possa incluir opcionalmente uma etapa adicional de adição de uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma pectate liase ou qualquer combinação das mesmas ao amido granular.

[000149] Em uma modalidade, o xarope de sacarídeo inclui pelo menos 35% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total. Alternativamente, o xarope de sacarídeo inclui pelo menos 45% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo desacarídeo total. Em outra modalidade, o xarope de sacarídeo inclui pelo menos 50% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo desacarídeo total. Em uma modalidade adicional, o xarope de sacarídeo inclui de 45% por peso a 60% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.

[000150] É idealizado que a variante de polipeptídeo como definida neste pedido do método possa ser imobilizada.

[000151] Em outro aspecto, um método é fornecido para produção de IMO, incluindo adição de a) uma variante de polipeptídeo como definida neste pedido, b) uma alfa-amilase, e c) uma transglucosidase ao amido na forma de um amido liquefeito ou amido granular e sacarificação do amido para formar IMO. É idealizado que IMO possa ser formado em um número de IMO de pelo menos 30, pelo menos 40 e/ou pelo menos 45. Em uma modalidade, o amido é obtido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas.

[000152] Em outro aspecto, um método é fornecido para produção de IMO, incluindo adição de a) uma variante de polipeptídeo, b) uma alfa- amilase, e c) uma transglucosidase ao amido na forma de um amido liquefeito ou amido granular e sacarificação do amido para formar IMO. Qualquer uma de diversas enzimas transgucosidase (TG) podem ser usadas, por exemplo, TRANSGLUCOSIDASE L-500® (Danisco US Inc., Genencor Division).

[000153] É idealizado que IMO pode ser formado em um número de IMO de pelo menos 30, pelo menos 40 e/ou pelo menos 45. Em uma modalidade, o amido é obtido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas.

4.3. Processos de fermentação

[000154] Levedura tipicamente a partir de Saccharomyces spp. é adicionada à massa e a fermentação é contínua durante 24-96 horas, tal como tipicamente 35-60 horas. A temperatura está entre aproximadamente 26-34°C, tipicamente aproximadamente 32°C, e o pH é de aproximadamente pH 3-6, tipicamente em torno de aproximadamente pH 4-5.

[000155] Em uma modalidade, um processo de fermentação em batelada é usado em um sistema fechado, onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação e não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo(s) microbiano desejado. Neste método, permite-se que a fermentação ocorra sem a adição de qualquer componente ao sistema. Tipicamente, uma fermentação em batelada é qualificada como um “batelada“ com respeito à adição da fonte de carbono, e muitas vezes tentativas são feitas para controlar fatores, tais como concentração de oxigênio e pH. As composições de biomassa e metabólito do sistema em batelada modificam-se constantemente até o momento da fermentação ser terminada. Dentro das culturas em batelada, células progridem através de uma fase lag estática a uma fase log de alto crescimento e finalmente a uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, as células na fase estacionária consequentemente morrem. Em geral, as células na fase log são responsáveis pela maioria da produção do produto.

[000156] Uma variação adequada no sistema em batelada padrão é o sistema de “fermentação descontínuo alimentado”. Nesta variação de um sistema em batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos enquanto a fermentação progride. Os sistemas descontínuos alimentados são úteis quando a repressão de catabólito provavelmente inibe o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas do substrato no meio. A medida da concentração de substrato real em sistemas descontínuos alimentados é difícil e por isso é estimada com base nas modificações de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases residuais, tais como CO2. Fermentações em batelada e descontínuas alimentadas são comuns e bem conhecidas na técnica.

[000157] A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual do meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, onde as células estão principalmente em crescimento na fase log. A fermentação contínua permite modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, é mantido em uma taxa fixa e permite-se que todos outros parâmetros sejam moderados. Em outros sistemas, diversos fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida pela turbidez de meios, é mantida constante. Sistemas contínuos empenham-se em manter as condições estacionárias de crescimento constantes. Dessa forma, a perda celular devido ao meio que é retirado deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento celular nafermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores decrescimento de processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa da formação de produto, são bem conhecidos na técnica da microbiologia industrial.

[000158] Após fermentação, a massa é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo da descrição pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível; etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial. O grão que restou da fermentação, é tipicamente usado para forragem, na forma líquida ou seca. Os detalhes adicionais de como realizar liquefação, sacarificação, fermentação, destilação e recuperação de etanol são bem conhecidos pelo versado. De acordo com o processo da descrição, sacarificação e fermentação podem ser realizadas simultaneamente ou separadamente.

5. Composições e métodos de cozimento e preparação de alimento

[000159] Em um aspecto, composições, incluindo aditivos alimentícios, produtos alimentícios, produtos de panificação, composições aperfeiçoadoras, produtos de ração incluindo forragem, etc. compreendendo tais variantes alteradas como descritas neste pedido, tais como aquelas tendo atividade de exoamilase não maltogênica, bem como métodos de criação e utilização de tais polipeptídeos e composições são fornecidos.

[000160] Como observado acima, os polipeptídeos variantes como descrito neste pedido podem compreender uma ou mais propriedades de manejo melhoradas, preferencialmente propriedades de cozimento melhoradas. Dessa forma, polipeptídeos variantes como descritos neste pedido podem fornecer os produtos alimentícios assim tratados tendo uma ou mais (de preferencialmente todas de) uma consistência mais suave, uma elasticidade mais alta, uma coesividade mais alta, um esfarelamento mais baixo ou uma maleabilidade mais alta. Tais propriedades melhoradas de manejo ou cozimento exibidas pelos polipeptídeos variantes como descrito neste pedido são descritas em detalhes adicionais abaixo. Em um aspecto, uma variante, na qual a meia-vida (t1/2), preferencialmente a 60 graus C, é aumentada em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, comparada à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é fornecida.

[000161] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido, na qual um produto alimentício tratado com a variante tem uma ou mais, preferencialmente todas as seguintes propriedades: (a) consistência mais suave; (b) elasticidade mais alta; (c) coesividade mais alta; (d) esfarelamento mais baixo; e (e) maleabilidade mais alta comparada a um produto alimentício que foi tratado com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é fornecido.

[000162] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido, na qual a elasticidade, coesividade ou maleabilidade do produto alimentício é independentemente aumentada em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, comparada a um produto alimentício que foi tratado com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é fornecida.

[000163] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido, na qual cada uma de elasticidade, coesividade e maleabilidade de um produto alimentício tratado com a variante é aumentada comparada a um produto alimentício que foi tratado com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é fornecida.

[000164] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido, na qual a consistência ou esfarelamento do produto alimentício é independentemente reduzido em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, em relação a um produto alimentício que foi tratado com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, é fornecida.

[000165] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido, na qual cada um de consistência e esfarelamento de um produto alimentício tratado com o polipeptídeo é reduzido em comparação a um produto alimentício que foi tratado com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. é fornecida.

[000166] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido compreendendo um fragmento de pelo menos 20 resíduos de um polipeptídeo como estabelecido nas reivindicações, nas quais o polipeptídeo tem atividade de exoamilase não maltogênica, é fornecida.

[000167] Em um aspecto, uma variante como descrita neste pedido tem atividade de exoamilase não maltogênica. Tal atividade pode ser determinada pelos métodos descritos em US 6.667.065 que é incorporado por referência neste pedido.

[000168] Em um aspecto, o tratamento de produtos alimentícios, particularmente massas de farinha e produtos de panificação com tais polipeptídeos, e tal que os produtos de alimento exibam as qualidades desejadas estabelecidas acima, é fornecido.

[000169] Em um aspecto, um processo de tratamento de um amido compreendendo contato do amido com uma variante como descrito neste pedido e permitir o polipeptídeo gerar do amido um ou mais produtos lineares, é fornecido. Em um aspecto, o uso de uma variante como descrito neste pedido na preparação de um produto de alimentos ou rações, é fornecido. Em um aspecto, o processo de preparação de um produto de alimentos ou rações compreendendo mistura de uma variante como descrita neste pedido com um ingrediente de alimentos ou rações, é fornecido. Em um aspecto, o uso, ou um processo, no qual o produto alimentício compreende uma massa de farinha ou um produto de massa de farinha, preferencialmente um produto de massa de farinha processado, é fornecido. Em um aspecto, uso ou processo, no qual o produto alimentício é um produto de panificação, é fornecido. Em um aspecto, um processo de produção de um produto de panificação compreendendo: (a) fornecimento de um meio de amido; (b) adição ao meio de amido de uma variante como descrito neste pedido; e (c) aplicação de calor ao meio de amido durante ou após etapa (b) para produzir um produto de panificação, é fornecido. Em um aspecto, um produto de alimentos, produto de rações, produto de massa de farinha ou produto de panificação obtido por um processo como definido nas reivindicações, é fornecido.

[000170] Em um aspecto, o uso de uma variante como descrito neste pedido, em um produto de massa de farinha para retardar ou reduzir o endurecimento, preferencialmente retrogradação prejudicial, do produto da massa de farinha, é fornecido.

[000171] Em um aspecto, o uso de uma variante como descrito neste pedido, em um produto de massa de farinha para melhorar uma ou mais de consistência, elasticidade, coesividade, esfarelamento ou maleabilidade do produto de massa de farinha, é fornecido.

[000172] Em um aspecto, uma combinação de uma variante como descrito neste pedido, em conjunto com uma ou mais do seguinte:(a) alfa-amilase maltogênica também chamada de glIcan 1,4- •-malto-hidrolase (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus, ou uma variante, homólogo, ou mutantes da mesma que tem atividade de alfa-amilase maltogênica;(b) uma xilanase de panificação (EC 3.2.1.8), por exemplo, de Bacillus sp., Aspergillus sp., Thermomyces sp. ou Trichoderma sp.;(c) α-amilase (EC 3.2.1.1) de Bacillus amyloliquefaciens ou de Aspergillus sp. ou uma variante, homólogo, ou mutantes das mesmas que tem atividade de alfa-amilase; e(d) uma lipase, tal como glicolipase de Fusarium heterosporum, é fornecida.

[000173] As variantes como descritas neste pedido preferencialmente compreendem uma ou mais propriedades de manejo melhoradas comparadas a um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tais como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. As propriedades de manejo melhoradas podem, em modalidades preferenciais, compreender propriedades de cozimento melhoradas.

[000174] Dessa forma, a variante como descrita neste pedido está em um aspecto tal que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tenha um manejo melhorado ou preferencialmente propriedade de cozimento comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. A propriedade de manejo ou de cozimento pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em: consistência, elasticidade, coesividade, esfarelamento e maleabilidade.

[000175] Estas propriedades de manejo podem ser testadas por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, consistência, elasticidade e coesividade podem ser determinadas pela análise de fatias de pão pela Análise de Perfil de Textura usando, por exemplo, um Analisador de Textura, como por exemplo, descrito em 11.Consistência

[000176] As variantes descritas aqui estão em um aspecto tal que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tenha a consistência mais suave em comparação a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000177] A consistência está em modalidades preferenciais inversamente correlacionada à maciez do produto alimentício; dessa forma, uma maciez mais alta pode refletir uma consistência mais suave, e vice-versa.

[000178] A consistência pode ser medida pelo “Protocolo de Avaliação de Consistência” estabelecido no exemplo 11.

[000179] Em um aspecto, as variantes descritas neste pedido são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou mais consistência mais suave comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Um produto alimentício tratado com os polipeptídeos variantes revelados neste pedido pode ter uma consistência 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x ou mais suave comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.Elasticidade

[000180] Em um aspecto, as variantes descritas neste pedido são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem uma elasticidade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000181] A elasticidade pode ser medida pelo “Protocolo de Avaliação de Elasticidade” estabelecido em 11.

[000182] Dessa forma em um aspecto, as variantes descritas neste pedido são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou elasticidade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante pode ter uma elasticidade 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x ou mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Coesividade

[000183] Em um aspecto, as variantes descritas neste pedido são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem coesividade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000184] A coesividade pode ser medida pelo “Protocolo de Avaliação de Coesividade” estabelecido em 11.

[000185] Dessa forma em um aspecto, as variantes descritas aqui são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante como revelado neste pedido tem 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou coesividade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante pode ter uma coesividade 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x ou mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.Esfarelamento

[000186] Em um aspecto, as variantes descritas aqui são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem esfarelamento mais baixo comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000187] Esfarelamento pode ser medido pelo “Protocolo de Avaliação de Esfarelamento” estabelecido no Exemplo 13.

[000188] Dessa forma em um aspecto, as variantes descritas aqui são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou esfarelamento mais baixo comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante pode ter um esfarelamento 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x ou mais baixo comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Maleabilidade

[000189] Em um aspecto, as variantes descritas aqui são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem maleabilidade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000190] Maleabilidade é preferencialmente medida pelo “Protocolo de Avaliação de Maleabilidade” estabelecido no Exemplo 14.

[000191] Dessa forma, as variantes descritas aqui são tais que um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante tem 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% ou maleabilidade mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Um produto alimentício tratado com o polipeptídeo variante pode ter uma maleabilidade 1,1x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x ou mais alta comparado a um produto alimentício que foi tratado com um polipeptídeo de origem ou um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1.

[000192] Em um aspecto, o uso dos polipeptídeos variantes descritos neste pedido em combinação com uma xilanase para melhora da maleabilidade é fornecido.

[000193] Além disso, um método para preparação de um produto alimentício, o método compreendendo: (a) obtenção de uma exoamilase não maltogênica; (b) introdução de uma mutação em uma ou mais das posições da exoamilase não maltogênica como estabelecido neste documento; (c) mistura do polipeptídeo resultante com um ingrediente alimentício é fornecido.

[000194] Os polipeptídeos variantes podem ser usados para aumentar o volume de produtos de panificação, tais como pão. Não desejando estar ligados por nenhuma teoria particular, acredita-se que isto resulta da redução da viscosidade da massa de farinha durante o aquecimento (tal como cozimento) em consequência da amilase que encurta as moléculas de amilose. Isto permite ao dióxido de carbono gerado pela fermentação aumentar o tamanho do pão com menos impedimento.

[000195] Dessa forma, os produtos alimentícios compreendendo ou tratados com polipeptídeos variantes são expandidos em volume quando comparados a produtos que não foram assim tratados, ou tratados com polipeptídeos de origem, tais como um polipeptídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10, preferencialmente SEQ ID NO:1. Em outras palavras, os produtos alimentícios têm um maior volume de ar por volume do produto alimentício. Alternativamente, ou além disso, os produtos alimentícios tratados com polipeptídeos variantes como descrito neste pedido têm uma densidade mais baixa, ou peso (ou massa) por proporção de volume. Em modalidades particularmente preferenciais, os polipeptídeos variantes são usados para aumentar o volume do pão. O aumento de volume ou expansão são benéficos porque reduz a gomosidade ou conteúdo de amido dos alimentos. Alimentos leves são preferidos pelos consumidores, e a experiência do cliente é aumentada. Em modalidades preferenciais, o uso de polipeptídeos variantes aumenta o volume em 10%, 20%, 30% 40%, 50% ou mais.

[000196] Os polipeptídeos variantes e os ácidos nucleicos descritos aqui podem ser usados como - ou na preparação de - um alimento. Especialmente, podem ser adicionados a um alimento, isto é, como um aditivo alimentício. O termo “alimento“ é destinado a incluir tanto o alimento preparado, bem como um ingrediente de um alimento, tal como uma farinha. Em um aspecto preferencial, o alimento é para o consumo humano. O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou o modo de aplicação e/ou o modo de administração.

[000197] Os polipeptídeos variantes e ácidos nucleicos podem ser usados como um ingrediente alimentício. Como usado neste pedido, o termo “ingrediente alimentício” inclui uma formulação, que é ou pode ser adicionada a alimentos funcionais ou gêneros alimentícios e inclui formulações que podem ser usadas em níveis baixos em uma larga variedade de produtos que requerem, por exemplo, acidificação ou emulsificação. O ingrediente alimentício pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou o modo de aplicação e/ou o modo da administração.

[000198] Os polipeptídeos variantes e ácidos nucleicos revelados neste pedido podem ser - ou podem ser adicionados a - suplementos alimentícios. Os polipeptídeos variantes e ácidos nucleicos revelados neste pedido podem ser - ou podem ser adicionados a - alimentos funcionais. Como usado neste pedido, o termo “alimento funcional” significa o alimento que é capaz de fornecer não somente um efeito nutritivo e/ou uma satisfação de sabor, mas é também capaz de entregar um efeito benéfico adicional ao consumidor. Embora não haja nenhuma definição legal de um alimento funcional, a maioria dos partidos com um interesse nesta área aceitam que são alimentos vendidos como tendo efeitos de saúde específicos.

[000199] Os polipeptídeos variantes também podem ser usados na produção de um produto alimentício ou gêneros alimentícios. Gêneros alimentícios típicos incluem produtos de leite, produtos de carne, produtos de aves, produtos de peixe e produtos de massa de farinha. O produto de massa de farinha pode ser qualquer produto de massa de farinha processado, incluindo massas de farinha fritas, fritas por imersão, gratinadas, assadas, cozidas no vapor e fervidas, tais como bolos de arroz e pão cozido no vapor. Em modalidades altamente preferenciais, o produto alimentício é um produto de panificação.

[000200] Preferencialmente, os gêneros alimentícios são um produto de panificação. Os produtos (assados) de panificação típicos incluem o pão - tal como pães, baguetes, pães doces, bagels, bases de pizza etc. pastéis, roscas salgadas, tortilha, bolos, biscoitos, bolachas, biscoitos finos etc.

[000201] Os produtos alimentícios preferencialmente beneficiam-se de uma ou mais das propriedades melhoradas de manejo ou cozimento dos polipeptídeos variantes descritos neste pedido. As propriedades melhoradas de manejo ou cozimento podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em: consistência melhorada, elasticidade melhorada, coesividade melhorada, maleabilidade melhorada e esfarelamento melhorado.

[000202] Ainda em um aspecto, um método de modificação de um aditivo alimentício compreendendo uma exoamilase não maltogênica, o método compreendendo a introdução de uma mutação em uma ou mais das posições da exoamilase não maltogênica como estabelecido neste documento é fornecido. O mesmo método pode ser usado para modificar um ingrediente alimentício, ou um suplemento alimentar, um produto alimentício ou gêneros alimentícios.

[000203] Em um aspecto, o uso de polipeptídeos variantes que são capazes de retardar o endurecimento de meios de amido, tais como géis de amido é fornecido. Os polipeptídeos variantes são especialmente capazes de retardar a retrogradação prejudicial do amido.

[000204] A maioria dos grânulos de amido são compostos de uma mistura de dois polímeros: uma amilose essencialmente linear e uma amilopectina altamente ramificada. A amilopectina é uma molécula muito grande, ramificada consistindo em cadeias de unidades α-D- glicopiranosila juntadas por ligações (1-4), em que as ditas cadeias são ligadas por ligações α-D-(1-6) para formar ramificações. A amilopectina está presente em todos os amidos naturais, constituindo aproximadamente 75% da maioria dos amidos comuns. A amilose é essencialmente uma cadeia linear de unidades α-D-glicopiranosila (1-4) ligadas tendo poucas ramificações α-D-(1-6). A maioria dos amidos contém aproximadamente 25% de amilose.

[000205] Os grânulos de amido aquecidos na presença de água sofrem uma transição de fase ordem-desordem chamada de gelatinização, onde o líquido é absorvido pelos grânulos que se avolumam. As temperaturas de gelatinização variam para amidos diferentes. No resfriamento do pão recentemente assado no forno, a fração de amilose, dentro de horas, sofre retrogradação para desenvolver uma rede. Este processo é benéfico em que cria uma estrutura do miolo desejável com um grau baixo de consistência e propriedades de corte melhoradas. A cristalização da amilopectina realiza-se mais gradualmente dentro dos grânulos de amido gelatinizados durante os dias após cozimento. Neste processo, acredita-se que a amilopectina reforça a rede de amilose na qual os grânulos de amido são introduzidos. Este reforço leva à consistência aumentada do miolo do pão. Este reforço é uma das causas principais do endurecimento do pão.

[000206] É conhecido que a qualidade dos produtos cozidos no forno gradualmente se deteriora durante o armazenamento. Como consequência da recristalização do amido (também chamada retrogradação), a capacidade de manter a água do miolo é modificada com implicações importantes nas propriedades organolépticas e dietéticas. O miolo solta a maciez e a elasticidade e fica firme e esfarelada. O aumento na consistência do miolo muitas vezes é usado como uma medida do processo de endurecimento de pão.

[000207] A taxa de retrogradação prejudicial da amilopectina depende do comprimento das cadeias laterais da amilopectina. Dessa forma, a hidrólise enzimática das cadeias laterais de amilopectina, por exemplo, por polipeptídeos variantes como descrito neste pedido tendo atividade de exoamilase não maltogênica, pode reduzir marcadamente suas tendências de cristalização.

[000208] Consequentemente, em um aspecto, o uso de polipeptídeos variantes como descrito neste pedido quando adicionado ao amido em qualquer estágio de seu processamento em um produto alimentício por exemplo, antes durante ou após cozimento no pão pode retardar ou impedir ou diminuir a retrogradação. Tal uso é descrito em detalhes adicionais abaixo.

[000209] Em um aspecto, um método de melhora da capacidade de uma exoamilase não maltogênica para prevenir endurecimento, preferencialmente retrogradação prejudicial, de um produto de massa de farinha, o método compreendendo introdução de uma mutação em uma ou mais das posições da exoamilase não maltogênica como estabelecido neste documento é fornecido.

[000210] Para avaliação do efeito antiendurecimento dos polipeptídeos variantes, tal variante tendo a atividade de exoamilase não maltogênica descrita neste pedidoi, a consistência do miolo pode ser medida 1, 3 e 7 dias após cozimento por meio de um Analisador Universal de Textura de Alimentos Instron 4301 ou equipamento similar conhecido na técnica.

[000211] Outro método usado tradicionalmente na técnica e que é usado para avaliar o efeito sobre a retrogradação do amido de um polipeptídeo variante, tal como uma variante tendo atividade de exoamilase é baseado em DSC (calorimetria de varredura diferencial). Aqui, a entalpia de fusão da amilopectina que sofre retrogração em miolo de pão ou miolo de uma massa de farinha do sistema de modelamento de cozimento com ou sem enzimas (controle) é medida. O equipamento de DSC aplicado pode ser Mettler-Toledo DSC 820 corrido com um gradiente de temperatura de 10°C por min. de 20 a 95°C. Para a preparação das amostras 10-20 mg do miolo são pesados e transferidos em panelas de alumínio do Mettler-Toledo que então são hermeticamente seladas.

[000212] As massas de farinha do sistema de modelamento podem conter farinha de trigo padrão e quantidades ótimas de água ou tampão com ou sem a variante de polipeptídeo. São misturados em um Farinógrafo Brabender de 10 ou 50 g por 6 ou 7 min., respectivamente. As amostras das massas de farinha são colocadas em tubos teste de vidro (15*0,8 cm) com uma tampa. Estes tubos teste são submetidos a um processo de cozimento em um banho de água que começa com 30 min. incubação a 33°C seguido por aquecimento de 33 a 95°C com um gradiente de 1,1°C por min. e finalmente uma incubação de 5 min. a 95°C. Posteriormente, os tubos são armazenados em um termostato a 20°C antes da análise por DSC.

[000213] Em uma modalidade, as variantes descritas aqui têm uma entalpia de fusão reduzida, comparada ao controle. Em uma modalidade adicional, as variantes têm entalpia de fusão reduzida 10% ou mais. Ainda em um aspecto adicional, têm entalpia de fusão reduzida 20% ou mais, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais quando comparadas ao controle.

[000214] Em um aspecto, o uso de polipeptídeos variantes na preparação de produtos alimentícios, especialmente, os produtos de amido são fornecidos. O método compreende a formação do produto de amido adicionando uma enzima exoamilase não maltogênica, tal como um polipeptídeo variante, a um meio de amido. Se o meio de amido for uma massa de farinha, então a massa de farinha é preparada pela mistura em conjunto de farinha, água, exoamilase não maltogênica que é um polipeptídeo variante como descrito neste pedido e opcionalmente outros ingredientes possíveis e aditivos.

[000215] O termo “amido“ deve ser tomado para significar o amido por si ou um componente do mesmo, especialmente amilopectina. O termo “meio de amido“ significa qualquer amido de compreendendo meio adequado. O termo “produto de amido” significa qualquer produto que contém ou é baseado ou é derivado do amido. Preferencialmente, o produto de amido contém ou é baseado ou é derivado do amido obtido da farinha de trigo. O termo “farinha” como usado neste pedido é um sinônimo da farinha finamente triturada de trigo ou outro grão. Preferencialmente, entretanto, o termo significa a farinha obtida do trigo por si e não de outro grão. Dessa forma, e a menos que de outra maneira expresso, as referências para “farinha de trigo” como usado neste pedido preferencialmente significam referências para a farinha de trigo por si bem como para a farinha de trigo quando presente em um meio, tal como uma massa de farinha.

[000216] Uma farinha preferencial é farinha de trigo ou farinha de centeio ou misturas de farinha de centeio e trigo. Entretanto, a massa de farinha compreendendo farinha derivada de outros tipos de cereais tais como, por exemplo, de arroz, milho, cevada e sorgo também é contemplada. Preferencialmente, o produto de amido é um produto de panificação. Mais preferencialmente, o produto de amido é um produto de pão. Ainda mais preferencialmente, o produto de amido é um produto de pão farináceo assado em forno. O termo “produto de pão farináceo assado” refere-se a qualquer produto cozido no forno baseado em uma massa de farinha obtenível misturando farinha, água, e um agente de fermentação sob condições de formação de massa de farinha. Componentes adicionais podem ser naturalmente adicionados à mistura de massa de farinha.

[000217] Dessa forma, se o produto de amido é um produto de pão farináceo assado em forno, então o processo compreende a mistura - em qualquer ordem adequada - farinha, água, e um agente de fermentação sob condições de formação de massa de farinha e ainda adição de um polipeptídeo variante como descrito neste pedido, opcionalmente na forma de uma mistura para bolo. O agente de fermentação pode ser um agente químico de fermentação, tal como bicarbonato de sódio ou qualquer cepa de Saccharomyces cerevisiae (Levedura de Padeiro).

[000218] O polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ser adicionado em conjunto com qualquer ingrediente de massa de farinha incluindo água ou mistura de ingrediente de massa de farinha ou com qualquer aditivo ou mistura de aditivos. A massa de farinha pode ser preparada por qualquer método de preparação de massa de farinha convencional comum na indústria de panificação ou em qualquer outra indústria que produz produtos baseados em massa de farinha.

[000219] Cozimento de produtos farináceos de pão tais como, por exemplo, pão branco, pão feito da farinha de trigo e farinha de centeio peneirada, baguetes e similares é tipicamente realizado pelo cozimento da massa de farinha de pão em temperaturas de forno na faixa de de 180 a 250°C por aproximadamente 15 a 60 minutos. Durante o processo da cozimento, um gradiente elevado de temperatura (200 a 120°C) está prevalecendo nas camadas de massa de farinha exteriores onde a crosta característica do produto cozido no forno é desenvolvida. Entretanto, devido ao consumo de calor devido à geração a vapor, a temperatura no miolo está somente perto de 100°C no fim do processo de cozimento.

[000220] Um processo de produção de um produto de pão compreendendo: (a) fornecimento de um meio de amido; (b) adição de um polipeptídeo variante ao meio de amido como descrito neste documento; e (c) aplicação de calor ao meio de amido durante ou após a etapa (b) para produzir um produto de pão é fornecido. Um processo de produção de um produto de pão compreendendo adição de um polipeptídeo variante a um meio de amido como descrito também é fornecido.

[000221] Em um aspecto, o polipeptídeo variante pode ser adicionado como uma preparação líquida ou como uma composição pulverulenta seca compreendendo a enzima como o único componente ativo ou em mistura com um ou mais ingredientes de massa de farinha adicional ou aditivo de massa de farinha.

[000222] Em um aspecto adicional, as composições aperfeiçoadoras, que incluem composições de melhora de pão e composições de melhora de massa de farinha são fornecidas. Estas compreendem um polipeptídeo variante, opcionalmente em conjunto com um ingrediente adicional, ou uma enzima adicional, ou ambos.

[000223] Em um aspecto, uma composição aperfeiçoadora de uma massa de farinha, na qual a composição aperfeiçoadora compreende uma variante como estabelecida em qualquer uma das reivindicações, e pelo menos um ingrediente de massa de farinha adicional ou aditivo de massa de farinha, é fornecida.

[000224] Em um aspecto, uma composição compreendendo uma farinha e uma variante como estabelecida em qualquer uma das reivindicações, é fornecida.

[000225] Em um aspecto adicional, o uso de tal pão e composições de melhora de massa de farinha no cozimento é fornecido. Em um aspecto adicional, um produto cozido no forno ou massa de farinha obtida da composição de melhora de pão ou composição de melhora de massa de farinha é fornecido. Em outro aspecto, um produto cozido no forno ou massa de farinha obtida do uso de uma composição de melhora de pão ou uma composição de melhora de massa de farinha é fornecido.

[000226] Uma massa de farinha pode ser preparada pela mistura de farinha, água, uma composição de melhora de massa de farinha compreendendo polipeptídeo variante (como descrito acima) e opcionalmente outros ingredientes e aditivos.

[000227] A composição de melhora de massa de farinha pode ser adicionada em conjunto com qualquer ingrediente de massa de farinha incluindo farinha, água ou outros ingredientes opcionais ou aditivos. A composição de melhora de massa de farinha pode ser adicionada antes da farinha ou água ou outros ingredientes opcionais e aditivos. A composição de melhora de massa de farinha pode ser adicionada após farinha ou água, ou outros ingredientes opcionais e aditivos. A massa de farinha pode ser preparada por qualquer método de preparação de massa de farinha convencional comum na indústria de panificação ou em qualquer outra indústria que produz produtos baseados em massa de farinha.

[000228] A composição de melhora de massa de farinha pode ser adicionada como uma preparação líquida ou na forma de uma composição de pó seco compreendendo a composição como o único componente ativo ou em mistura com um ou mais outros ingredientes de massa de farinha ou aditivo.

[000229] A quantidade do polipeptídeo variante que é adicionado está normalmente em uma quantidade que resulta na presença na massa de farinha finalizada de 50 a 100.000 unidades por kg de farinha, preferen-cialmente 100 a 50.000 unidades por kg de farinha. Preferencialmente, a quantidade está na faixa de 200 a 20.000 unidades por kg de farinha. Alternativamente, o polipeptídeo variante é adicionado em uma quantidade que resulta na presença na massa de farinha finalizada de 0,02 - 50 ppm da enzima baseada na farinha (0,02 - 50 mg de enzima por kg de farinha), preferencialmente 0,2 - 10 ppm.

[000230] No presente contexto, 1 unidade da exoamilase não maltogênica é definida como a quantidade da enzima que libera produtos de hidrólise equivalentes a 1 μmol de açúcar redutor por min. quando incubada a 50 graus C em um tubo teste com 4 ml de amido de milho ceroso a 10 mg/ml em MES a 50 mM, cloreto de cálcio a 2 mM, pH 6,0 como descrito a seguir.

[000231] A massa de farinha como descrita aqui geralmente compreende farinha de trigo ou farinha fina de trigo e/ou outros tipos de farinha, farinha fina ou amido, tais como farinha de milho, amido de milho, farinha fina de milho, farinha de arroz, farinha de centeio, farinha fina de centeio, farinha fina de aveia, farinha de aveia, farinha de soja, farinha de sorgo, farinha fina de sorgo, farinha de batatas, farinha fina de batatas ou amido de batatas. A massa de farinha pode ser fresca, congelada, ou em parte cozida no forno.

[000232] A massa de farinha pode ser uma massa de farinha fermentada ou uma massa de farinha a ser submetida à fermentação. A massa de farinha pode ser fermentada de vários modos, tal como pela adição de agentes químicos de fermentação, por exemplo, bicarbonato de sódio ou adição de uma levedura (fermento de massa de farinha), mas é preferencial fermentar a massa de farinha adicionando uma cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro), por exemplo, uma cepa comercialmente disponível de S. cerevisiae.

[000233] A massa de farinha pode compreender gordura, tal como gordura granulada ou reduzida. A massa de farinha pode compreender ainda um emulsificante adicional tal como mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, ésteres de ácido lático de monoglicerídeos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, estearatos de polioxetileno ou lisolecitina.

[000234] Uma pré-mistura compreendendo farinha em conjunto com a combinação como descrito neste pedido é ainda fornecida. A pré- mistura pode conter outros aditivos aperfeiçoadores da massa de farinha e/ou aperfeiçoadores de pão, por exemplo, qualquer um dos aditivos, incluindo enzimas, mencionados neste pedido.

[000235] A fim de melhorar ainda as propriedades do produto assado no forno e transmitir qualidades distintas ao produto assado no forno, os ingredientes de massa de farinha adicionais e/ou os aditivos de massa de farinha podem ser incorporados na massa de farinha. Tipicamente, tais componentes adicionados podem ainda incluir ingredientes de massa de farinha, tais como sal, grãos, gorduras e óleos, açúcar ou adoçante, fibras dietéticas, fontes proteicas, tais como leite em pó, glúten de soja ou ovos e aditivos de massa de farinha, tais como emulsificantes, outras enzimas, hidrocoloides, agentes de sabor, agentes oxidantes, minerais e vitaminas.

[000236] Os emulsificantes são úteis como reforços de massa de farinha e suavizantes de miolo. Como reforços de massa de farinha, os emulsificantes podem fornecer tolerância quanto ao tempo de descanso e tolerância ao choque durante a revisão. Além disso, os reforços de massa de farinha melhorarão a tolerância de uma dada massa de farinha a variações no tempo de fermentação. A maioria dos reforços de massa de farinha também melhoram o crescimento no forno que significa o aumento no volume da experiência para os assados. Por fim, os reforços de massa de farinha emulsionarão quaisquer gorduras presentes na mistura de receita.

[000237] Emulsificantes adequados incluem lecitina, estearato de polioxietileno, mono- e diglicerídeos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de ácido acético de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de ácido lático de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de ácido cítrico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos comestíveis, ésteres diacetil de ácido tartárico de mono- e diglicerídeos de ácidos graxos comestíveis, ésteres de sacarose de ácidos graxos comestíveis, estearoil-2-lactilato de sódio e estearoil-2- lactilato de cálcio.

[000238] O aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional pode ser adicionado em conjunto com qualquer ingrediente de massa de farinha incluindo farinha, água ou outros ingredientes ou aditivos opcionais, ou composição de melhora de massa de farinha. O aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional pode ser adicionado antes da farinha, água, outros ingredientes e aditivos opcionais ou composição de melhora de massa de farinha. O aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional podem ser adicionados após farinha, água, outros ingredientes e aditivos opcionais ou composição de melhora de massa de farinha.

[000239] O aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional pode ser convenientemente uma preparação líquida. Entretanto, o aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional pode estar convenientemente na forma de uma composição seca.

[000240] Em um aspecto, o aditivo ou ingrediente de massa de farinha adicional é pelo menos 1% do peso do componente de farinha da massa de farinha. Em um aspecto adicional, o aditivo de massa de farinha adicional ou ingrediente é pelo menos 2%, preferencialmente pelo menos 3%, preferencialmente pelo menos 4%, preferencialmente pelo menos 5%, preferencialmente pelo menos 6%. Se o aditivo for uma gordura, então tipicamente a gordura pode estar presente em uma quantidade de 1 a 5%, tipicamente 1 a 3%, mais tipicamente aproximadamente 2%.

[000241] Para o uso comercial e caseiro da farinha para produção de pães e alimentos, é importante manter um nível apropriado de atividade de •-amilase na farinha. Um nível de atividade que é muito alto pode resultar em um produto que é pegajoso e/ou pastoso e por isso não negociável. A farinha com atividade de •-amilase insuficiente pode não conter açúcar suficiente para função apropriada da levedura, resultando em pão seco, que esfarela ou produtos assados. Consequentemente, uma variante como descrita neste pedido, por si mesmo ou em combinação com outra •-amilase(s) ou outra variante, pode ser adicionada à farinha para aumentar o nível de atividade de •-amilase endógena na farinha. A variante nesta modalidade pode ter uma condição favorável de temperatura na presença do amido nas faixas de aproximadamente 30-90°C, 40-80°C, 40-50°C, 45-65°C, ou 50-60°C, por exemplo. A condição favorável de pH em uma solução de 1% do amido solúvel pode estar entre o pH 4,5 a 6,0, por exemplo.

[000242] Os grãos, tais como cevada, aveia, trigo, bem como componentes vegetais, tais como milho, lúpulo e arroz, também são usados para preparação de cerveja, tanto na preparação de cerveja industrial como caseira. Os componentes usados na preparação de cerveja podem ser não maltados ou podem ser maltados, isto é, parcialmente germinados, resultando em um aumento nos níveis de enzimas, incluindo •-amilase. Para preparação de cerveja bem sucedida, níveis adequados de atividade de enzima •-amilase são necessários para assegurar os níveis apropriados de açúcares da fermentação. Uma variante, por si mesma ou em combinação com outra •-amilase(s), consequentemente pode ser adicionada aos componentes usados para a preparação de cerveja.

[000243] Como usado neste pedido, o termo “farinha” significa grão de cereal moído ou triturado. O termo “farinha“ também pode significar Sagu ou produtos de tubérculo que foram esmagados ou triturados. Em algumas modalidades, a farinha também pode conter componentes além do cereal ou matéria vegetal moídos ou triturados. Um exemplo de um componente adicional, embora não destinado a ser limitante, é um agente de fermentação. Grãos de cereal incluem trigo, aveia, centeio e cevada. Produtos de tubérculo incluem farinha de tapioca, farinha de mandioca e pó de manjar. O termo “farinha” também inclui farinha de milho triturada, farinha de milho, farinha de arroz, farinha integral, farinha com fermento, farinha de tapioca, farinha de mandioca, arroz triturado, flor enriquecida e pó de manjar.

[000244] Como usado neste pedido, o termo “estoque“ significa grãos e componentes vegetais que são esmagados ou quebrados. Por exemplo, a cevada usada na produção de cerveja é um grão que foi grosseiramente triturado ou esmagado para produzir uma consistência apropriada para produzir uma massa para fermentação. Como usado neste pedido, o termo “estoque” inclui qualquer um dos tipos acima mencionados de plantas e grãos em forma esmagada ou grosseiramente triturada. Os métodos descritos neste pedido podem ser usados para determinar níveis de atividade de •-amilase tanto em farinhas como estoque.

[000245] Uma ou mais enzimas adicionais podem ser usadas em combinação com os polipeptídeos variantes como descrito neste pedido. Tais combinações, por exemplo, podem ser adicionadas ao alimento, preparação de massa de farinha, gêneros alimentícios ou composição de amido.

[000246] Amilases de panificação podem ser de um fungo, bactéria ou planta. Pode uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1). A alfa-amilase pode ser uma alfa-amilase fúngica de Aspergillus ou Trichoderma, por exemplo, de Aspergillus oryzae. Ou pode ser uma alfa-amilase do Bacillus, por exemplo, B. amyloliquefaciens ou B. licheniformis. Ou pode ser uma beta-amilase vegetal (EC 3.2.1.2), por exemplo, beta-amilase de malte de cevada ou soja. Ou pode ser uma exoamilase usada para antiendurecimento, exoamilase por exemplo, não maltogênica (EC 3.2.1.60) desenvolvido de maltotetra-hidrolase de Pseudomonas saccharophila (SEQ ID NO: 10) ou amilase maltogênica (EC 3.2.1.133) desenvolvida de Bacillus stearothermophilus como descrito mais abaixo.

[000247] Em um aspecto, a amilase adicional é uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glIcan 1,4-alfa-malto- hidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina à maltose em configuração alfa. Uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus (EP 120693) está comercialmente disponível sob nome comercial Novamyl (Novozymes, Dinamarca) e é largamente usada na indústria de panificação como um agente antiendurecimento devido à sua capacidade de reduzir retrogradação do amido. Novamyl é descrita detalhadamente na Publicação de Patente Internacional WO 91/04669. A alfa-amilase maltogênica Novamyl compartilha várias características com ciclodextrina glIcanotransferases (CGTases), incluindo homologia de sequência (Henrissat B, Bairoch A; Biochem. J., 316, 695-696 (1996)) e formação de produtos de transglicosilação (Christophersen, C., et al., 1997, Starch, vol. 50, N° 1, 39-45). Novamyl podecompreender em particular Novamyl 1500 MG. Outros documentos que descrevem Novamyl e seus usos incluem Christophersen, C., Pedersen, S., and Christensen, T., (1993) Method for production of maltose an a limit dextrin, the limit dextrin, and use of the limit dextrin. Dinamarca, e WO 95/10627. É ainda descrito na Patente Americana N° 4.598.048 e na Patente Americana N° 4.604.355. Exemplos preferenciais de amilases antiendurecimento são exoamilases, por exemplo, exoamilase não maltogênica ou G4-amilase (EC 3.2.1.60) desenvolvida de maltotatrao-hidrolase de Pseudomonas saccharophila tendo SEQ ID NO: 1 ou amilase maltogênica (EC 3.2.1.133) desenvolvida de Bacillus stearothermophilus tendo SEQ ID NO: 51.

[000248] Uma amilase antiendurecimento reduz endurecimento após cozimento e leva a uma redução do aumento de consistência e uma redução na diminuição de elasticidade do dia 1 ao dia 7 após em relação a um controle sem enzima. Uma amilase antiendurecimento pode ser analisada fazendo um teste de cozimento e usando análise de textura para determinar consistência e desenvolvimento de elasticidade ao longo do tempo. Análise de textura é descrita no exemplo 11.

[000249] Enzimas adicionais podem ser selecionadas a partir de, por exemplo, qualquer combinação do seguinte: (a) Novamyl, ou uma variante, homólogo, ou mutantes da mesma tendo atividade de alfa- amilase maltogênica; (b) uma xilanase, tal como GRINDAMYL® POWERBake 900 (Danisco A/S); (c) α-amilase bacteriana, tal como Max-Life U4 (Danisco A/S); e (d) uma lipase, tal como GRINDAMYL® POWERBake 4050 (Danisco A/S).

[000250] Em uma modalidade, um polipeptídeo variante como descrito neste pedido é usado em combinação com pelo menos uma enzima selecionada a partir da lista consistindo em oxidorredutases, hidrolases, lipases, esterases, glicosidases, amilases, pululanases, xilanases, celulases, hemicelulases, enzimas degradantes de amido, proteases e lipoxigenases. Em uma modalidade, a composição compreende pelo menos um polipeptídeo variante como descrito neste pedido e uma amilase maltogênica de Bacillus, como revelado em WO91/04669. Uma modalidade compreende um polipeptídeo variante como descrito neste pedido e farinha.

[000251] Enzimas adicionais que podem ser adicionadas à massa de farinha incluem oxidorredutases, hidrolases, tais como lipases e esterases bem como glicosidases similares à α-amilase, pululanase e xilanase. Oxidorredutases, tais como, por exemplo, glicose oxidase e hexose oxidase, podem ser usadas para fortificação da massa de farinha e controle do volume dos produtos assados no forno e xilanases e outras hemicelulases podem ser adicionadas para melhorar propriedades de manejo da massa de farinha, consistência do miolo e volume do pão. As lipases são úteis como reforços de massa de farinha e suavizantes do miolo e α-amilases e outras enzimas amilolíticas podem ser incorporadas na massa de farinha para controlar o volume do pão e reduzir mais a consistência do miolo.

[000252] Enzimas adicionais que podem ser usadas podem ser sele-cionadas a partir do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma enzima degradante de amido, uma protease, uma lipoxigenase.

[000253] Uma variante como definida neste pedido pode ainda ser adicionada sozinha ou em uma combinação com outras amilases, incluindo outras variantes de amilase, para prevenir ou retardar o endurecimento, isto é, a consolidação do miolo de produtos assados. A quantidade da amilase antiendurecimento estará tipicamente na faixa de 0,01-10 mg de proteína enzimática por kg de farinha, por exemplo, 0,5 mg/kg de ds. Amilases antiendurecimento adicionais que podem ser usadas em combinação com um polipeptídeo variante como descrito neste pedido incluem uma endoamilase, por exemplo, uma endoamilase bacteriana de Bacillus. A amilase adicional pode ser uma •-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), por exemplo, de Bacillus. Novamyl® é uma •-amilase maltogênica exemplar de B. stearothermophilus cepa NCIB 11837 e é descrita em Christophersen et al., Starch 50: 39-45 (1997). Outros exemplos de endoamilases antiendurecimento incluem •- amilases bacteriano derivadas de Bacillus, tais como B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens. A amilase antiendurecimento pode ser uma exoamilase, tal como •-amilase, por exemplo, de fontes vegetais, tais como soja, ou de fontes microbianas, tais como Bacillus.

[000254] A composição de cozimento compreendendo um polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ainda compreender fosfolipase. Fosfolipase pode ter atividade A1 ou A2 para remover ácido graxo dos fosfolipídeos, formando um lisofosfolipídeo. Pode ou não ter atividade de lipase, isto é, atividade sobre substratos de triglicerídeo. Fosfolipase tipicamente tem uma condição favorável de temperatura na faixa de 30 a 90°C, por exemplo, 30 a 70°C. Fosfolipases adicionadas podem ser de origem animal, por exemplo, de pâncreas, por exemplo, pâncreas bovino ou porcino, veneno de cobra ou veneno de abelha. Alternativamente, a fosfolipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, leveduras ou bactérias, tais como o gênero ou espécies. Fontes exemplares de fosfolipases incluem Aspergillus, A. niger; Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiella, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris; Providencia, P. stuartii; Salmonella, S. typhimurium; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, S. flexneri; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia, Y. enterocolitica; Fusarium, e F. oxysporum (cepa DSM 2672, por exemplo).

[000255] A fosfolipase é adicionada em uma quantidade que melhora a maciez do pão durante o período inicial após cozimento, particularmente nas primeiras 24 horas. A quantidade de fosfolipase estará tipicamente na faixa de aproximadamente 0,01-10 mg de proteína enzimática por kg de farinha, por exemplo, 0,1-5 mg/kg. A atividade de fosfolipase geralmente estará na faixa de aproximadamente 20-1000 Unidades de Lipase (LU) / kg de farinha, onde uma Unidade de Lipase é definida como a quantidade da enzima necessária para a liberação 1 μmol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7,0, com goma arábica como emulsificante e tributirina como substrato.

[000256] As composições da massa de farinha geralmente compreendem farinha de trigo ou farinha fina de trigo e/ou outros tipos de farinha, farinha fina ou amido, tais como farinha de milho, amido de milho, farinha de centeio, farinha fina de centeio, farinha de aveia, farinha fina de aveia, farinha de soja, farinha de sorgo, farinha fina de sorgo, farinha de batatas, farinha fina de batatas ou amido de batatas. A massa de farinha pode ser fresca, congelada ou pré-assada. A massa de farinha pode ser uma massa de farinha fermentada ou uma massa de farinha a ser submetida à fermentação. A massa de farinha pode ser fermentada de vários modos, tal como por adição de agentes químicos de fermentação, por exemplo, bicarbonato de sódio ou por adição de uma levedura, isto é, fermentando a massa de farinha. A massa de farinha também pode ser fermentada adicionando uma cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro), por exemplo, uma cepa comercialmente disponível de S. cerevisiae.

[000257] A massa de farinha também pode compreender outros ingredientes de massa de farinha convencionais, por exemplo, proteínas, tais como leite em pó, glúten, e soja; ovos (por exemplo, ovos inteiros, gemas de ovo ou claras de ovo); um oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou persulfato de amônio; um aminoácido, tal como L-cisteína; um açúcar; ou um sal, tal como cloreto de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio. A massa de farinha ainda pode compreender gordura, por exemplo, triglicerídeo, tal como gordura granulada ou redutora. A massa de farinha ainda pode compreender um emulsificante tal como mono- ou diglicerídeos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, ésteres de ácido lático de monoglicerídeos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, estearatos de polioxietileno, ou lisolecitina. Especialmente, a massa de farinha pode ser feita sem a adição de emulsificantes.

[000258] Opcionalmente, uma enzima adicional pode ser usada em conjunto com amilase antiendurecimento e fosfolipase. A enzima adicional pode ser uma segunda amilase, tal como uma amiloglicosidase, uma •-amilase, uma ciclodextrina glIcanotransferase, ou a enzima adicional pode ser uma peptidase, em particular uma exopeptidase, uma transglutaminase, uma lipase, uma celulase, uma hemicelulase, em particular uma pentosanase, tal como uma xilanase, uma protease, uma proteína dissulfeto isomerase, por exemplo, uma proteína dissulfeto isomerase como revelada em WO 95/00636, por exemplo, uma glicosiltransferase, uma enzima ramificadora (enzima ramificadora 1,4-^-glIcan), uma 4-^-glIcanotransferase (dextrina glicosiltransferase) ou uma oxidorredutase, por exemplo, um peroxidase, uma lacase, uma glicose oxidase, uma piranose oxidase, uma lipo-oxigenase, uma L-aminoácido oxidase ou um carboidrato oxidase. A enzima(s) adicional pode ser de qualquer origem, incluindo mamífera e vegetal, e particularmente de origem microbiana (bacteriana, levedura ou fúngica) e pode ser obtida por técnicas convencionalmente usadas na área.

[000259] Xilanase é tipicamente de origem microbiana, por exemplo, derivada de uma bactéria ou fungo, tal como uma cepa de Aspergillus, em particular de A. aculeatus, A. niger (cf. WO 91/19782), A. awamori (por exemplo, WO 91/18977), ou A. tubigensis (por exemplo, WO 92/01793); de uma cepa de Trichoderma, por exemplo, T. reesei, ou de uma cepa de Humicola, por exemplo, H. insolens (por exemplo, WO 92/17573). Pentopan® e Novozym 384® são preparações de xilanase comercialmente disponíveis produzidas de Trichoderma reesei. A amiloglicosidase pode ser uma amiloglicosidase de A. niger (tal como AMG®). Outros produtos de amilase úteis incluem Grindamyl® A 1000 ou A 5000 (disponível em Danisco, Dinamarca) e Amilase® H ou Amilase® P (disponível em Gist-Brocades, Holanda). A glicose oxidase pode ser uma glicose oxidase fúngica, em particular uma glicose oxidase de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Uma protease exemplar é Neutrase®. Uma lipase exemplar pode ser derivada de cepas de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus ou Pseudomonas, em particular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa), Rhizomucor miehei, Candida antarctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar ou Rhizopus arrhizus ou Pseudomonas cepacia. Em modalidades específicas, a lipase pode ser Lipase A ou Lipase B derivada de Candida antarctica como descrito em WO 88/02775, por exemplo, ou a lipase pode ser derivada de Rhizomucor miehei como descrito em EP 238.023, por exemplo, ou Humicola lanuginosa, descrita em EP 305.216, por exemplo, ou Pseudomonas cepacia como descrito em EP 214.761 e WO 89/01032, por exemplo.

[000260] O processo pode ser usado para qualquer tipo de produto assado preparado da massa de farinha, tanto de uma característica suave ou quebradiça, de tipo branco, leve ou escuro. Exemplos são pão, particularmente pão branco, de farinha integral ou de centeio, tipicamente na forma de pães ou baguetes, tais como, mas não limitados a, pão baguette tipo francês, pão de pita, tortilha, bolos, panquecas, biscoitos, bolachas, massas de torta, pão fresco, pão cozido no vapor, pizza e similares.

[000261] Em outra modalidade, um polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ser usado em uma pré-mistura, compreendendo farinha em conjunto com uma amilase antiendurecimento, uma fosfolipase e um fosfolipídeo. A mistura para bolo pode conter outros aditivos aperfeiçoadores de massa de farinha e/ou aperfeiçoadores de pão, por exemplo, qualquer um dos aditivos, incluindo enzimas, acima mencionados. Em um aspecto, o polipeptídeo variante como descrito neste pedido é um componente de uma preparação de enzima compreendendo uma amilase antiendurecimento e uma fosfolipase, para uso como um aditivo de cozimento.

[000262] A preparação de enzima é opcionalmente em forma granular ou pó aglomerado. A preparação pode ter uma distribuição de tamanho de partícula estrito com mais de 95% (por peso) das partículas na faixa de 25 a 500 μm. Granulados e pós aglomerados podem ser preparados por métodos convencionais, por exemplo, pulverizando o polipeptídeo variante como descrito neste pedido para um veículo no granulador de leito fluidizado. O veículo pode consistir de núcleos particulados que têm um tamanho de partícula adequado. O veículo pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, um sal (tal como NaCl ou sulfato de sódio), um açúcar (tal como sacarose ou lactose), um álcool de açúcar (tal como sorbitol), amido, arroz, farinha grossa de milho ou soja.

[000263] Outro aspecto contempla o envolvimento de partículas compreendendo um polipeptídeo variante como descrito neste pedido, isto é, partículas de •-amilase. Para preparar as partículas de •-amilase envelopadas, a enzima é contatada com um lipídio de classe alimentícia em quantidade suficiente para suspender todas as partículas de •- amilase. Os lipídios de classe alimentícia, como usados neste pedido, podem ser quaisquer compostos naturalmente orgânicos que são insolúveis em água, mas são solúveis em solventes orgânicos não polares, tais como hidrocarboneto ou dietil éter. Lipídios de classe alimentícia adequados incluem, mas não são limitados a, triglicerídeos em forma de gorduras ou em forma de óleos que são saturados ou insaturados. Exemplos de ácidos graxos e combinações dos mesmos que compõe os triglicerídeos saturados incluem, mas não são limitados a, butírico (derivado da gordura do leite), palmítico (derivado de gordura animal e vegetal), e/ou esteárico (derivado de gordura animal e vegetal). Exemplos de ácidos graxos e combinações dos mesmos que compõe os triglicerídeos insaturados incluem, mas não são limitados a, palmito- leico (derivado de gordura animal e vegetal), oleico (derivado de gordura animal e vegetal), linoleico (derivado de óleos vegetais), e/ou linolênico (derivado do óleo de linho). Outros lipídios de classe alimentícia adequados incluem, mas não são limitados a, monoglicerídeos e diglicerídeos derivados dos triglicerídeos discutidos acima, fosfolipídeos e glicolipídeos.

[000264] O lipídio de classe alimentícia, particularmente em forma líquida, é contatado com uma forma em pó de partículas de •-amilase de tal maneira que o material lipídico recobre pelo menos uma porção da superfície de pelo menos uma maioria, por exemplo, 100% das partículas de •-amilase. Dessa forma, cada partícula de •-amilase é individualmente envelopada em um lipídio. Por exemplo, todas ou substancialmente todas partículas de •-amilase são fornecidas em um filme de envelopamento fino, contínuo, de lipídio. Isto pode ser realizado primeiro vertendo uma quantidade de lipídio em um recipiente, e em seguida transformando em uma pasta fluida de partículas de •-amilase para que o lipídio completamente umidifique a superfície de cada partícula de •-amilase. Após um período curto de agitação, as partículas de •-amilase envelopadas, carregando uma quantidade substancial de lipídios em suas superfícies, são recuperadas. A espessura do revestimento aplicado dessa forma às partículas de •-amilase pode ser controlada pela seleção do tipo de lipídio usado e pela repetição da operação a fim de acumular um filme mais espesso, quando desejado.

[000265] O armazenamento, manejo e incorporação do veículo de entrega carregado podem ser realizados por meio de uma mistura empacotada. A mistura empacotada pode compreender a •-amilase envelopada. Entretanto, a mistura empacotada pode conter ainda ingredientes adicionais como necessário pelo fabricante ou padeiro. Após, a •-amilase envelopada ser incorporada na massa de farinha, o padeiro continua através do processo de produção normal daquele produto.

[000266] As vantagens de envelopar as partículas de •-amilase são duplas. Em primeiro lugar, o lipídio de classe alimentícia protege a enzima da desnaturação térmica durante o processo de cozimento daquelas enzimas que são lábeis ao calor. Consequentemente, enquanto a •-amilase é estabilizada e protegida durante os estágios de teste e cozimento, é liberada do revestimento protetor no produto assado final, onde ela hidrolisa as ligações glicosídicas em poliglicanos. O veículo de entrega carregado também fornece uma liberação sustentada da enzima ativa no assado. Isto é, após processo de cozimento, •-amilase ativa é constantemente liberada do revestimento protetor em uma taxa que contraria, e por isso reduz a taxa de mecanismos de endurecimento.

[000267] Em geral, a quantidade de lipídio aplicada às partículas de •-amilase pode variar de alguns por cento do peso total de •-amilase a muitas vezes o peso, dependendo da natureza do lipídio, maneira na qual é aplicado às partículas de •-amilase, a composição da mistura de massa de farinha a ser tratada, e a severidade da operação de mistura da massa de farinha envolvida.

[000268] O veículo de entrega carregado, isto é, a enzima envelopada em lipídio, é adicionado aos ingredientes usados para preparar um assado em uma quantidade eficaz para estender o prazo da validade do assado. O padeiro computa a quantidade de •-amilase envelopada, preparada como discutido acima, que deverá alcançar o efeito antiendurecimento desejado. A quantidade da •-amilase envelopada necessária é calculada baseada na concentração da enzima envelopada e na proporção de •-amilase à farinha especificada. Foi encontrado que uma larga faixa de concentrações é eficaz, embora, como foi discutido, as melhorias observáveis em antiendurecimento não correspondam linearmente com concentração de •-amilase, mas acima de certos níveis mínimos, grandes aumentos em na concentração de •- amilase produz pouca melhora adicional. A concentração de •-amilase de fato usada em uma produção particular de panificação pode ser muito mais alta do que o mínimo necessário a fim de fornecer ao padeiro alguma segurança contra erros inadvertidos abaixo da medida pelo padeiro. O limite mais baixo da concentração enzimática é determinado pelo efeito antiendurecimento mínimo que o padeiro deseja alcançar.

[000269] Um método de preparação de um assado pode compreender: (a) preparação de partículas de •-amilase recobertas de lipídio, onde substancialmente todas as partículas de •-amilase são recobertas; (b) mistura de uma massa de farinha contendo a farinha; (c) adição da •-amilase recoberta com lipídio à massa de farinha antes da mistura ser completada e terminação da mistura antes que o revestimento de lipídio seja removido da •-amilase; (d) verificação da massa de farinha; e (e) cozimento da massa de farinha para fornecer o assado, onde a •-amilase é inativa durante os estágios de mistura, verificação e cozimento é ativa no assado.

[000270] A •-amilase envelopada pode ser adicionada à massa de farinha durante o ciclo de mistura, por exemplo, perto do final do ciclo de mistura. A •-amilase envelopada é adicionada em um ponto no estágio de mistura que permite a distribuição suficiente da •-amilase envelopada em todas as partes da massa de farinha; entretanto, o estágio de mistura é terminado antes que o revestimento protetor fique despido da partícula(s) de •-amilase. Dependendo de tipo e do volume da massa de farinha, e ação do misturador e velocidade, em qualquer ponto de um a seis minutos ou mais poderia ser necessário misturar a •-amilase envelopada na massa de farinha, mas dois a quatro minutos é a média. Dessa forma, várias variáveis podem determinar o procedimento exato. Em primeiro lugar, a quantidade de •-amilase envelopada deve ter um volume total suficiente para permitir a •-amilase envelopada ser expandida em todas as partes da mistura da massa de farinha. Se a preparação de •-amilase envelopada for altamente concentrada, óleo adicional pode ser necessário a ser adicionado à pré- mistura antes da •-amilase envelopada ser adicionada à massa de farinha. As receitas e processos de produção podem requerer modificações específicas; entretanto, bons resultados geralmente podem ser alcançados quando 25% do óleo especificado em uma fórmula de massa de farinha de pão são mantidos fora da massa de farinha e são usados como um veículo de um concentrado envolvendo •-amilase quando adicionado perto do final do ciclo de mistura. No pão ou outras mercadorias assadas, particularmente aquelas que têm um conteúdo de gordura baixo, por exemplo, pães de estilo francês, uma mistura de •-amilase envelopada de aproximadamente 1% do peso de farinha seco é suficiente para misturar a •-amilase envelopada apropriadamente com a massa de farinha. A faixa de porcentagens adequadas é ampla e depende da fórmula, produto final e exigências de metodologia de produção do padeiro individual. Em segundo lugar, a suspensão de •-amilase envelopada deve ser adicionada à mistura com tempo suficiente para mistura completa na massa de farinha, mas não para tempo tal que a ação mecânica excessiva retire o revestimento de lipídio protetor das partículas de •-amilase envelopada.

6. Composições de desengomagem têxtil e uso

[000271] Também são contemplados composições e métodos de tratamentos de tecidos (por exemplo, para desengomar um tecido) usando um polipeptídeo variante como descrito neste pedido. Em um aspecto, um método de desengomagem de tecidos, compreendendo contato do polipeptídeo variante como descrito neste pedido com um tecido durante um tempo suficiente para desengomar o tecido, é fornecido.

[000272] Os métodos de tratamento de tecido são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente Americana N° 6.077.316). Por exemplo, em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contato do tecido com um polipeptídeo variante como descrito neste pedido em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão.

[000273] Em um aspecto, um polipeptídeo variante como descrito neste pedido é aplicado durante ou após tecelagem de um tecido, ou durante o estágio de desengomagem, ou uma ou mais etapas adicionais de processamento de tecido. Durante a tecelagem de tecidos, os fios são expostos a estiramento mecânico considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura muitas vezes são recobertos com amido de desengomagem ou derivados de amido para aumentar sua força elástica e prevenir a quebra. Um polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ser aplicado durante ou após tecelagem para remover estes amidos de desengomagem ou derivados de amido. Após a tecelagem, um polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ser usado para remover o revestimento de desengomagem antes de processamento adicional do tecido para assegurar um resultado homogêneo e resultado da prova de lavagem.

[000274] Um polipeptídeo variante como descrito neste pedido pode ser usado sozinho ou com outros reagentes químicos de desengomagem e/ou enzimas de desengomagem para desengomar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos detergentes, por exemplo, em composições aquosas. Um polipeptídeo variante como descrito neste pedido também pode ser usado em composições e métodos para produzir um visual lavado em tecido de brim tingido de índigo e artigos de vestuário. Para a produção da roupa, o tecido pode ser cortado e costurado em roupa ou artigos de vestuário, que são posteriormente terminados. Especialmente, para a produção da calça de brim, os métodos de acabamento enzimático diferentes foram desenvolvidos. O acabamento do artigo de vestuário de brim normalmente é iniciado com uma etapa de desengomagem enzimática, durante a qual os artigos de vestuário são submetidos à ação de enzimas amilolíticas para fornecer a maciez ao tecido e fazer o algodão mais acessível às etapas de acabamento enzimáticas subsequentes. Um polipeptídeo variante como revelado neste pedido pode ser usado em métodos de acabamento de artigos de vestuário de brim (por exemplo, “um processo que empedra bio”), desengomagem enzimática e fornecimento de maciez a tecidos, e/ou processo de acabamento.Modalidades adicionais da invenção1. Um polipeptídeo tendo atividade de amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendoa. identidade de sequência de pelo menos 65% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88 ou 205, e/oub. identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 16, 48, 97, 105, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401, 403, 412 ou 409, e/ouc. identidade de sequência de pelo menos 78% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G ou 399C/H, e/oud. identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 44, 96, 204, 354 ou 377, e/oue. identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende a seguinte substituição de aminoácidos: 392Sem que uma substituição de aminoácidos é relativa ao aminoácido correspondente da SEQ ID NO:1 e as posições são com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.2. Um polipeptídeo tendo atividade de amilase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 65% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, ou 205 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 235H/K/R, 240E, 392 K/D/E/Y ou 409E em que uma substituição de aminoácidos é quanto ao aminoácido correspondente da SEQ ID NO:1 e as posições são com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.3. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 1, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 248, 266, 311, 377 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D ou 392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.4. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 3, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 311 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/N/I/H/F, 272D, ou 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.5. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 3 a 4, em que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos pelo menos em quatro, cinco ou em todas as seguintes posições: 88, 205, 235, 240, 311 ou 409 e/ou tem pelo menos uma, ou duas das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/N/I/H/F, 272D ou 392 K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G.6. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o polipeptídeo compreende ainda um ou mais dos seguintes aminoácidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E/S/K/A, 229P, 307K, 309P ou 334P.7. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o polipeptídeo tem ainda os seguintes aminoácidos 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 229P, 307K, 309P e 334P.8. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, em que o polipeptídeo tem pelo menos uma das substituições de aminoácidos em b) da modalidade 1 e compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 44, 96, 204, 354 ou 377.9. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 8 tendo identidade de sequência de pelo menos 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.10. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 34Q.11. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 10, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 42K/F/H/I/N/A/V.12. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 10, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 42K/F/H/I/N.13. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 12, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 42K.14. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 13, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 88.15. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 14, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 88L/Y/K.16. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 15, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 88L.17. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 16, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 88Y.18. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 17, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 205.19. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 18, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 205L/K/M/N/Q/R/V/Y.20. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 205L/K/M/N/Q/R/V.21. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 20, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 205L.22. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 e 2 a 21, em que o polipeptídeo compreende umasubstituição de aminoácidos na posição 235.23. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 e 2 a 22, em que o polipeptídeo tem o aminoácido235H/K/R/Q/S.24. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 23, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 235H/K/R/Q.25. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 24, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 235H/K/R.26. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 25, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 235R.27. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 25, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 235H.28. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 25, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 235K.29. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 28, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 240.30. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 29, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 240E/H/M/D/S.31. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 29, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 240E/H/M/D.32. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 29, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 240E.33. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 32, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 272D.34. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 33, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 311.35. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 34, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 311P.36. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 35, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 409.37. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 36, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 409H/Q/T/E.38. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 37, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 409E.39. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 38, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 100Q/K/N/R.40. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 39, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 100Q.41. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 e 2 a 39, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T/G.42. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 41, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392D/E/K/Y/N/Q/R/S/T.43. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 2 ou 41, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392D/E/K/Y.44. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 43, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392D.45. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 43, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392E.46. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 43, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392K.47. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 43, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 392Y.48. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 47, em que o polipeptídeo tem ambos dos seguintes aminoácidos 235R e 311P.49. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 48, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 16.50. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 49, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 16/A/E/K.51. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 50, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 48.52. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 51, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 48/C/L.53. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 52, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 97.54. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 53, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 105.55. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 54, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 105/N/R56. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 55, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 248.57. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 56, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 266.58. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 57, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 347.59. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 58, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 347/C/D/H/K.60. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 59, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 350.61. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 60, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 350E/H/N. 62. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 61, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 354.63. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 62, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 354D/E.64. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 63, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 362.65. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 64, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 362E/H/P.66. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 65, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 364.67. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 66, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 364E/K/NQ.68. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 67, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 369.69. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 68, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 369I/N.70. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 69, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 377.71. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 70, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 393.72. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 71, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 393D/E/K.73. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 72, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 395.74. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 73, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 395C/E/K.75. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 74, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 396.76. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 75, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 396D/E.77. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 76, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 399.78. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 77, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 399C/H.79. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 78, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 400.80. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 79, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 400S/W.81. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 80, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 401.82. Polipeptídeo de acordo com a modalidade 81, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 401D/K.83. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 82, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 403.84. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 83, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 403E/T/V.85. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 84, em que o polipeptídeo compreende uma substituição de aminoácidos na posição 412.86. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 85, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 412D/N.87. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 86, em que o polipeptídeo compreende ainda um ou mais dos seguintes aminoácidos 121F, 134R, 141P, 229P, ou 307K.88. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 87, em que o polipeptídeo tem um ou mais dos seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D, e 409E.89. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 88, em que o polipeptídeo compreende os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 235R, 311P, 392D e 223S, 223K ou 223A.90. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 89 compreendendo ainda um ou mais selecionados do grupo consistindo em 272D, 409E, 205L ou 240E.91. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 90, em que o polipeptídeo tem pelo menos quatro, cinco, seis, sete ou oito dos seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 235R, 240E, 272D, 311P, 392D, ou 409E.92. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 91, em que o polipeptídeo tem o aminoácido 223A/K/S.93. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 92, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P e 392D.94. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 93, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223K, 235R, 272D, 311P e 392D.95. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 94, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 223S, 235R, 311P, 392D e 409E.96. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 95, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P, 392D e 409E.97. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 96, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223K, 240E, 235R, 311P, 392D e 409E.98. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 97, em que o polipeptídeo tem os seguintes aminoácidos 42K, 88L, 205L, 223A, T235R, 311P, 392D e 409E.99. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 98 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ IDNO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO:34.100. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 99 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17.101. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 100 selecionado de uma sequência de aminoácidos do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, e opcionalmente um ou mais aminoácidos adicionais no N-terminal.102. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 101 selecionado de uma sequência de aminoácidos do grupo consistindo na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17, e opcionalmente um ou mais aminoácidos adicionais no N-terminal.103. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 101 a 102 em que o dito um ou mais aminoácidos adicionais no N-terminal é um M.104. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 103, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas seguintes posições: 88, 205, 235 ou 409 e/ou uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 34Q, 100Q, 223A/S, 240E, 311P, 392D ou 409E com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.105. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 34Q, 88K/L/Y, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/H/Q/R, 240E/D, 248H, 266T, 311P, 377D/E/P, 392K/D/Y ou 409E.106. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 105, em que o polipeptídeo compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 34Q, 42K, 88L, 100Q, 205L, 223A/S/K, 235K/R, 240E, 311P, 392D ou 409E.107. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 106, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 235R e 311P.108. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 107, em que o polipeptídeo compreende a substituição de aminoácidos 42K.109. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 108, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K e 223S.110. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 109, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 223S e 392D.111. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 110, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 223A, 235R, 311P e 392D.112. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 111, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E.113. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 112, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E.114. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 113, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 205L, 223S, 235R, 311P e 392D.115. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 114, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 34Q, 42K, 88L, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E.116. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 115, em que o polipeptídeo compreende as seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 88L, 100Q, 205L, 223K, 235R, 240E, 311P, 392D e 409E.117. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 116 compreendendo ainda um domínio de ligação a amido no C-terminal.118. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 117 em que o domínio de ligação a amido são os resíduos da SEQ ID NO: 36.119. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 118 tendo um ligador fusionado no C-terminal.120. O polipeptídeo de acordo com a modalidade 119, em que o ligador são os resíduos da SEQ ID NO: 35.121. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 120 tendo atividade de exoamilase.122. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 121 tendo atividade de exoamilase não maltogênica.123. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasmodalidades 1 a 122, em que o polipeptídeo exibe termoestabilidade melhorada quando comparado à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.124. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 123, no qual a meia-vida (t1/2), preferencialmente a 60 graus C, é aumentada em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, relativa à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.125. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 124, no qual um produto alimentício tratado com o polipeptídeo tem uma ou mais, preferencialmente todas as seguintes propriedades: (a) alta resiliência; (b) elasticidade mais alta; (c) coesividade mais alta; (d) esfarelamento menor; e (e) maleabilidade maior em comparação com um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.126. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 125, no qual resiliência, coesividade ou maleabilidade do produto alimentício tratado com o polipeptídeo é independentemente aumentada em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, em relação a um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.127. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 126, no qual cada um de resiliência, coesividade ou maleabilidade de um produto alimentício tratado com o polipeptídeo é aumentada comparado a um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.128. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 127, no qual a consistência ou o esfarelamento do produto alimentício tratado com o polipeptídeo é independentemente reduzido em 15% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, ainda mais preferencialmente 100% ou mais, em relação a um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.129. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 128, no qual cada um de consistência e esfarelamento de um produto alimentício tratado com o polipeptídeo é reduzido comparado a um produto alimentício que foi tratado com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 10.130. Uso de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129 como um aditivo de alimentos ou rações.131. Um processo para tratamento de um amido compreendendo contato do amido com um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129 e permitindo o polipeptídeo gerar do amido um ou mais produtos lineares.132. Uso de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129 na preparação de um produto de alimentos ou rações. 133. Um processo de preparação de um produto de alimentos ou rações que compreende mistura de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129 com um ingrediente de alimentos ou rações.134. Uso de acordo com a modalidade 130, ou um processo de acordo com a modalidade 133, no qual o produto alimentício compreende uma massa de farinha ou um produto de massa de farinha, preferencialmente um produto de massa de farinha processada.135. Um uso ou processo de acordo com qualquer uma das modalidades 130 a 133, no qual o produto alimentício é um produto de panificação.136. Um processo para produção de um produto de panificação compreendendo: (a) fornecimento de um meio de amido; (b) adição ao meio de amido de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129; e (c) aplicação de calor ao meio de amido durante ou após a etapa (b) para produzir um produto de panificação.137. Um produto alimentício, produto de ração, produto de massa de farinha ou um produto de panificação obtido por um processo de acordo com qualquer uma das modalidades 130 a 136.138. Uma composição aperfeiçoadora de uma massa de farinha, na qual a composição aperfeiçoadora compreende um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129, e pelo menos um ingrediente da massa de farinha adicional ou aditivo de massa de farinha.139. Uma composição compreendendo uma farinha e um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129.140. O uso de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129, em um produto de massa de farinha para retardar ou reduzir endurecimento, preferencialmente retrogradação prejudicial, do produto da massa de farinha. 141. O uso de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129, em um produto de massa de farinha para melhorar uma ou mais de consistência, elasticidade, coesividade, esfarelamento ou maleabilidade do produto de massa de farinha.142. Uma combinação de um polipeptídeo como descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 129, em conjunto com um ou mais dos seguintes:a. alfa-amilase maltogênica também chamada glican 1,4-*- malto-hidrolase (EC 3.2.1.133) de Bacillus stearothermophilus, ou uma variante, homólogo, ou mutantes do mesmo que tem atividade de alfa- amilase maltogênica;b. uma xilanase de panificação (EC 3.2.1.8) de, por exemplo, Bacillus sp., Aspergillus sp., Thermomyces sp. ou Trichoderma sp.;c. α-amilase (EC 3.2.1.1) de Bacillus amyloliquefaciens ou uma variante, homólogo, ou mutantes do mesmo que tem atividade de alfa-amilase; ed. uma lipase, tal como glicolipase de Fusarium heterosporum.143. Uso de uma combinação de acordo com a modalidade 142 para uma aplicação de acordo com qualquer modalidade precedente.144. Um produto de alimentos ou rações produzido por tratamento com uma combinação de acordo com a modalidade 142.145. Um ácido nucleico capaz de codificar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129.146. Um ácido nucleico de acordo com a modalidade 145 tendo uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 78% idêntica à SEQ ID NO: 52.147. Um ácido nucleico compreendendo um fragmento de pelo menos 60 resíduos de um ácido nucleico de acordo com a modalidade 145 ou 146 que é capaz de codificar um polipeptídeo tendo atividade de exoamilase não maltogênica.148. Um plasmídeo compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 145 a 147.149. Um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades 145 a 147, ou capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129.150. Uma célula hospedeira compreendendo, preferencialmente transformada com, um plasmídeo de acordo com a modalidade 148 ou um vetor de expressão de acordo com a modalidade 149.151. Uma célula capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129.152. Uma célula hospedeira de acordo com a modalidade 150, ou uma célula de acordo com a modalidade 151, que é uma célula bacteriana, fúngica ou de levedura.153. Um método de expressão de um polipeptídeo, o método compreendendo obtenção de uma célula hospedeira ou uma célula de acordo com a modalidade 150, 151 ou 152 e expressão do polipeptídeo da célula ou célula hospedeira, e opcionalmente purificação do polipeptídeo.154. Um método de produção de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129, o método compreendendo introdução de uma substituição de aminoácidos na SEQ ID NO: 1 tendo atividade de exoamilase não maltogênica, a substituição de aminoácidos sendoa. em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 16, 48, 88, 97, 105, 205, 235, 240, 248, 266, 311, 347, 350, 362, 364, 369, 393, 395, 396, 400, 401, 403, 412 e 409 e/ou b. uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K/A/V/N/I/H/F, 34Q, 100Q/K/N/R, 272D, 392 K/D/E/Y/N/Q/R/T/G ou 399C/H e/ouc. em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo consistindo em: 44, 96, 204, 354 e 377 e/oud. a seguinte substituição de aminoácidos: 392S.155. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 compreendendo a sequência DGF-X1-AIW-X2-P- X3-PWRD-X4-SSW (SEQ ID NO: 38), em que X1 é S ou T, X2 é M ou L, X3 é V ou P e X4 é qualquer resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente, preferencialmente um L-aminoácido, nas posições correspondentes às posições 49-66 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.156. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 compreendendo a sequência GGEGYFW (SEQ ID NO: 39) nas posições correspondentes às posições 79-85 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.157. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 156 compreendendo a sequência VPNH (SEQ ID NO: 40) nas posições correspondentes às posições 114-117 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.158. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 157 compreendendo a sequência CDDGD (SEQ ID NO: 41) nas posições correspondentes às posições 150-154 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.159. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 158 compreendendo a sequência AGGFRFDFVRG (SEQ ID NO: 42) nas posições correspondentes às posições 187-197 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.160. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 159 compreendendo a sequência FALK (SEQ ID NO: 43) nas posições correspondentes às posições 256-259 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.161. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 160 compreendendo a sequência WREVAVTFVDNHD (SEQ ID NO: 44) nas posições correspondentes às posições 282-294 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.162. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 161 compreendendo a sequência GYSPG (SEQ ID NO: 45) nas posições correspondentes às posições 296-300 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.163. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 162 compreendendo a sequência GQH (SEQ ID NO: 46) nas posições correspondentes às posições 304-306 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.164. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 163 compreendendo a sequência AYAYI (SEQ ID NO: 47) nas posições correspondentes às posições 318-322 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.165. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 164 compreendendo a sequência SPGTP (SEQ ID NO: 48) nas posições correspondentes às posições 325-329 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.166. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 165 compreendendo a sequência VYW (SEQ ID NO: 49) nas posições correspondentes às posições 331-333 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.167. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 166 compreendendo a sequência HMYDWG (SEQ ID NO: 50) nas posições correspondentes às posições 335-340 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.168. O polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 167 compreendendo a sequência HGGDEIILQFHWN (SEQ ID NO: 37) nas posições correspondentes às posições 13-26 com referência à numeração de posição da sequência mostrada como a SEQ ID NO: 1.169. Um método de produção de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 167, o método compreendendo introdução de uma substituição de aminoácidos na SEQ ID NO: 1 tendo atividade de exoamilase não maltogênica, a substituição de aminoácidos que está em uma ou mais das seguintes posições: 88, ou 205 e/ou sendo uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 42K, 235H/K/R, 240E, 392 K/D/E/Y ou 409E.170. Um método de produção de um xarope de sacarídeo, compreendendo adição de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 129 e 155 a 167 a um amido granular liquefeito para formar o xarope de sacarídeo. 171. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é produzido por uma alfa-amilase.172. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é um ácido produzido liquefeito.173. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é obtido do amido de milho, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas.174. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é sacarificado de 55°C a 65°C.175. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é sacarificado de 60°C a 65°C.176. O método da modalidade 170, em que o amido granular liquefeito é sacarificado no pH 5,0 ao pH 7,0.177. O método da modalidade 170, compreendendo ainda uma etapa de adição de uma enzima tendo atividade desramificadora para o amido granular liquefeito.178. O método da modalidade 177, em que a enzima tendo atividade desramificadora é uma isoamilase, uma pululanase, uma isopululanase, uma neopululanase ou qualquer combinação das mesmas.179. O método da modalidade 177, opcionalmente compreendendo uma etapa adicional de adição de uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma pectato liase ou qualquer combinação das mesmas para o amido granular.180. O método da modalidade 170, em que o xarope de sacarídeo compreende pelo menos 35% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.181. O método da modalidade 180, em que o xarope de sacarídeo compreende pelo menos 45% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.182. O método da modalidade 181, em que o xarope de sacarídeo compreende pelo menos 50% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.183. O método da modalidade 182, em que o xarope de sacarídeo compreende de 40% por peso a 60% por peso de maltotetraose baseado no conteúdo de sacarídeo total.

Exemplos Exemplo 1. Clonagem de PS4 e G4-amilases

[000275] Pseudomonas sacharophila é cultivada durante a noite em meios LB e DNA cromossômico é isolado por métodos padrão (Sambrook J, 1989). Um fragmento de 2190 bp contendo região de leitura aberta de PS4 (Zhou et al., 1989) é amplificado de DNA cromossômico de P. sacharophila por PCR usando os iniciadores P1 e P2 (vide Tabela 3). O fragmento resultante é usado como um molde em uma PCR aninhada com iniciadores P3 e P4, amplificando a região de leitura aberta de PS4 sem sua sequência sinal e introduzindo um sítio NcoI na extremidade 5’ do gene e um sítio BamHI na extremidade 3'. Em conjunto com o sítio NcoI, um códon de uma metionina N-terminal é introduzido, permitindo à expressão intracelular de PS4. O fragmento de 1605 bp é clonado em pCRBLUNT TOPO (Invitrogen) e a integridade do construto analisado pelo sequenciamento. O vetor de lançadeira de Bacillus E.coli pDP66K (Penninga et al., 1996) é modificado parapermitir à expressão de PS4 sob controle do promotor P32 e a sequência sinal de ctgase. O plasmídeo resultante, pCSmta é transformado em B. subtilis.

[000276] Um segundo construto de expressão é produzido no qual o domínio de ligação a amido de PS4 é removido. Em uma PCR com iniciadores P3 e P6 (Tabela 3) em pCSmta, uma versão truncada do gene mta é gerada. O gene mta completo em pCSmta é trocado pela versão truncada que resultou no plasmídeo pCSmta-SBD.

[000277] Amilases G4 de Pseudomonas sp. AM1 (2006), Pseudomonas sp. 7193, Pseudomonas mendocina (cepa ymp) e Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396) foram clonadas em um vetor de expressão de Bacillus com a sequência sinal por síntese gênica (GeneScript; NJ, EUA) das sequências que codificam as proteínas maduras com um M adicionado no N-terminal como mostrado nas SEQ ID NO 3, 5, 7 e 9.

Exemplo 2. Mutagênese sítio-dirigida

[000278] Mutagênese sítio-dirigida foi usada para produzir o polipeptídeo variante como revelado neste pedido. Mutações foram introduzidas em um ácido nucleico que codifica pMS 382 tendo a SEQ ID: 1, usando o método Quick Change® (Stratagene, Califórnia), de acordo com as instruções fornecidas com o conjunto com algumas modificações. Resumidamente, uma colônia única foi escolhida e inoculada com 3 ml de LB (Base de Caldo Lennox L 22 g/l, Sigma) suplementada com canamicina 50 μg/ml (Sigma) em um tubo Falcon de 10 ml. Após incubação noturna a 37°C em 200 rpm, a cultura foi girada em 5000 rpm por 5 min. O meio foi removido e o molde de DNA de fita dupla foi preparado usando colunas QIAGEN (QIAGEN). Os iniciadores foram projetados de acordo com o protocolo dos fabricantes. Por exemplo, a TABELA 1 lista iniciadores que foram usados para gerar novas variantes baseadas na sequência nucleotídica de pMS382 como mostrado na SEQ ID NO: 52.

[000279] Após, PCR foi realizada para sintetizar a fita mutante. A mistura de reação de PCR continha o seguinte:184. • l tampão 10 X de reação Multi QuickChange0,75 • l QuickSolution185. • l iniciadores (10 pmol de iniciadores de 28 a 35 nt; 7 pmol de iniciadores de 24 a 27 nt; ou 5 pmol de iniciadores de 20 a 23 nt)1 • l mistura de dNTPX • l molde de ds-DNA (200 ng)1 • l mistura de enzima QuickChange Multi (2,5 U> l) (DNA polimerase PfuTurbo)X • l dH2O (a um volume final de 25 • l)

[000280] A reação de PCR foi realizada em um ciclador térmico Eppendorf por 35 ciclos de desnaturação (96°C por 1 min), anelamento de iniciador (62,8°C por 1 min), e alongamento (65°C por 15 min), e em seguida mantida a 4°C. Para cada reação de amplificação, 2 • l da enzima de restrição DpnI (10 U / • l) foram adicionados, e a mistura foi incubada a 37°C por ~3 horas.

[000281] O DNA tratado com DpnI então foi usado para transformar células XL10-Gold® Ultracompetent (Stratagene). As células XL10- Gold® foram descongeladas sobre gelo. Para cada reação de mutagênese, 45 • l de células foram adicionadas a um tubo Falcon pré- resfriado. Posteriormente, 2 • l da mistura de beta-mercaptoetanol foram adicionados a cada tubo. A mistura foi incubada em gelo por 10 min com giro de cada 2 min. Então, 1,5 μl de DNA tratado com DpnI foi adicionado a cada alíquota de células, e a mistura foi incubada em gelo por 30 min. A amostra foi submetida a um pulso do calor de 30 segundos a 42°C, e foi colocada em gelo por outros 2 min. 0,5 ml de caldo NZY+ pré-aquecido foi adicionado a cada amostra, e a incubação foi transportada a 37°C por 1 hora com agitação em 225-250 rpm. 200 μl de cada reação de transformação foram plaqueados em placas LB (Ágar Lennox 33,6 L g/l, Sigma) suplementado com amido 1% e canamicina 50 μg/ml. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. As colônias individuais que abrigam as mutações desejadas foram identificadas pelo sequenciamento de DNA e submetidas aos preps de plasmídeo para coletar plasmídeos com as mutações desejadas.

Exemplo 3. Transformação em Bacillus subtilis.

[000282] Bacillus subtilis (cepa DB104A; Smith et al., Gene 70, 351361 (1988)) é transformado com DNA de plasmídeo mutado de acordo com o seguinte protocolo.A. Meios de inserção de protoplastos e transformação

[000283] SMM 2 x por litro: 342 g de sacarose (1 M); 4,72 g demaleato de sódio (0,04 M); 8,12 g de MgCh^6H20 (0,04 M); pH 6,5 com NaOH concentrado. Distribuir em porções de 50 ml e autoclava-se por 10 min.

[000284] 4 x YT (1/2 NaCl) 2 g de extrato de levedura + 3,2 g deTriptona + 0,5 g de NaCl por 100 ml.SMMP misturam-se volumes iguais de SMM 2 x e YT 4 x.PEG 10 g de polietilenoglicol 6000 (BDH) ou 8000 (Sigma)em 25 ml de SMM 1 x (autoclava-se por 10 min.).B. Meios de plaqueamento/regeneraçãoágar ágar mínimo Difco 4%. autoclava-se por 15 min.succinato de sódio 270 g/1 (1 M), pH 7,3 com HCl. autoclava-sepor 15 min.tampão fosfato 3,5 g K2HPO4 + 1,5 g KH2PO4 por 100ml.autoclava-se por 15 min.MgCl2 20,3 g de MgCl2«6H2O por 100 ml (1 M).ácidos casamino 5% (p/v) solução. autoclava-se por 15 min.extrato de levedura 10 g por 100 ml, autoclava-se por 15 min.glicose solução a 20% (p/v). Autoclava-se por 10 min.

[000285] Meio de regeneração de DM3: mistura-se a 60°C (banho de água; garrafa de 500 ml):250 ml de succinato de sódio50 ml de ácidos casamino25 ml de extrato de levedura50 ml de tampão fosfato 15 ml de glicose10 ml de MgCl2100 ml de ágar fundido

[000286] Adicionam-se antibióticos apropriados: cloranfenicol e tetraciclina, 5μg/ml; eritromicina, 1 μg/ml. A seleção em canamicina é problemática em meio DM3: concentrações de 250 μg/ml podem ser necessárias.C. Preparação de protoplastos

[000287] Usa-se plástico sem detergente ou artigos de vidro em todas as partes.

[000288] Inoculam-se 10 ml de meio YT 2 x em um frasco de 100 ml de uma colônia única. Cultiva-se uma cultura noturna a 25-30°C em um agitador (200 rev/min).

[000289] Dilui-se a cultura noturna 20 vezes em 100 ml de meio YT fresco 2 x (frasco de 250 ml) e cultiva-se até OD600 = 0,4-0,5 (aproximadamente 2 h) a 37°C em um agitador (200-250 rev/min).

[000290] Coletam-se as células por centrifugação (9000 g, 20 min,4°C).

[000291] Remove-se o sobrenadante com pipeta e ressuspender as células em 5 ml de SMMP + 5 mg de lisozima estéril filtrada.

[000292] Incuba-se a 37°C em um agitador com banho d'água (100 rpm).

[000293] Após 30 min e após isso em intervalos de 15 min, examinam- se amostras de 25 μl por microscopia. Continua-se a incubação até que 99% das células estejam inseridas com protoplastos (aparência globular). Coletam-se os protoplastos por centrifugação (4000 g, 20 min, RT) e pipeta-se o sobrenadante. Ressuspende-se o precipitado suavemente em 1-2 ml de SMMP.

[000294] Os protoplastos agora estão prontos para o uso. As porções (por exemplo, 0,15 ml) podem ser congeladas a -80°C para uso futuro (adição de glicerol não é necessária). Embora isto possa resultar em um pouco de redução da transformabilidade, 106 transformantes por ug de DNA podem ser obtidos com protoplastos congelados).D. Transformação

[000295] Transfere-se 450 μl de PEG a um microtubo.

[000296] Mistura-se 1 a 10 μl de DNA (0,2 μg) com 150 μl de protoplastos e adiciona-se a mistura ao microtubo com PEG. Mistura-se imediatamente, mas suavemente.

[000297] Deixa-se por 2 min à temperatura ambiente, e em seguida adiciona-se 1,5 ml de SMMP e mistura-se.

[000298] Coletam-se os protoplastos por microcentrífuga (10 min, 13.000 rpm (10.000-12.000 g)) e verte-se o sobrenadante. Removem- se as gotículas restantes com um tecido.

[000299] Adicionam-se 300 μl de SMMP (não cria-se vórtice) e incubase por 60 a 90 min a 37°C em um agitador com banho d'água (100 rpm) para permitir à expressão de marcadores de resistência a antibióticos. (Os protoplastos ficam suficientemente ressuspensos pela ação de agitação com banho d'água.) Fazer diluições apropriadas em SSM 1 x e placa de 0,1 ml em placas DM3.

Exemplo 4. Fermentação de Variantes em Frascos de agitação.

[000300] O substrato do frasco de agitação é preparado pela dissolução do seguinte em água:Extrato de Levedura 2% (p/v)Farinha de Soja 2% (p/v)NaCl 0,5% (p/v)Fosfato Dipotássico 0,5% (p/v)Agente antiespumante 0,05% (p/v).

[000301] O substrato é ajustado ao pH 6,8 com hidróxido de sódio ou ácido sulfúrico 4N antes de autoclavagem. 100 ml do substrato são colocados em um frasco de 500 ml com um defletor e autoclavado por 30 minutos. Posteriormente, 6 ml do xarope de dextrose estéril são adicionados. O xarope de dextrose é preparado misturando um volume de dextrose 50% p/v com um volume de água seguida por autoclavagem por 20 minutos.

[000302] Os frascos de agitação são inoculados com as variantes e incubados por 24 horas a 35°C e 180 rpm em uma incubadora. Após, as células de incubação são separadas do caldo por centrifugação (10.000 g por 10 minutos) e finalmente, o sobrenadante está livre de células por microfiltração em 0,2 μm. O sobrenadante sem células é usado para testes aplicados e ensaios.Tabela 1. Iniciadores usados para gerar variantes baseadas na se-quência nucleotídica de pMS382 como mostrado na SEQ ID NO: 52.

Exemplo 5. Ensaios de Amilase Ensaio de Betamyl

[000303] Uma unidade Betamyl é definida como atividade que degrada 0,0351 mmol por 1 min. de maltopentaose acoplada a PNP para que 0,0351 mmol de PNP por 1 min. possam ser liberados pela alfa-glicosidase em excesso na mistura de ensaio. A mistura de ensaio contém 50 ul de Na-citrato a 50 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 6,5 com 25 ul de amostra de enzima e 25 ul de substrato de Betamyl (Glc5-PNP e alfa- glicosidase) de Megazyme, Irlanda (1 frasco dissolvido em 10 ml de água). A mistura de ensaio é incubada por 30 min. a 40C e em seguida interrompida pela adição de 150 ul de Tris a 4%. A absorvância em 420 nm é medida usando um leitor ELISA e a atividade de Betamyl é calculada baseada na Atividade = A420 * d em unidades Betamyl/ml da amostra da enzima analisada. Para dosagem em testes de cozimento, 1 BMK = 1000 unidades Betamyl é usado.

Ensaio de endoamilase

[000304] O ensaio de endoamilase é idêntico ao ensaio de Phadebas corrido de acordo com o fabricante (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB).

Exoespecificidade

[000305] A proporção da atividade de exoamilase à atividade de Phadebas foi usada para avaliar a exoespecificidade.

Exemplo 6. Determinações de estabilidade ao calor deprocedimento baseadas em atividade residual

[000306] As amostras de enzima em diluições apropriadas sãoincubadas em tampão Na-acetato a 50 mM, pH 5,0 com NaCl a 0,5 M à temperatura ambiente (controle) ou por 4 minutos a 80°C (amostra aquecida), e imediatamente a seguir, o controle e amostra aquecidos são analisados usando o ensaio de Betamyl. A atividade residual é calculada como a atividade de Betamyl da amostra aquecida dividida pela atividade de Betamyl da amostra controle.

Exemplo 7. Efeitos estabilizantes de mutações

[000307] Usando o procedimento descrito no Exemplo 6, os efeitos estabilizantes das mutações Q42K, R88L, S205L, E223S, Q311P,Tabela 3. Efeito estabilizante de A392DTabela 4. Efeito estabilizante de S205L, S223A e S205L combinadosTabela 5. Efeito estabilizante de N34Q e G100QTabela 6. Efeito estabilizante de Q240E

Exemplo 10. Receita para Testes de Cozimento

[000308] Os testes de cozimento foram realizados com uma esponja de pão branco padrão e receita de massa de farinha para torrada americana. A massa de farinha da esponja é preparada a partir de 1500 g da farinha “Gold Metal” da General Mills, EUA, 890 g de água, 40 g de óleo de soja, 7,5 g de GRINDSTED® SSL P55 Veg, 10 g de emulsificante DIMODAN® PH300, 26 g de levedura seca e ácido ascórbico (concentração final 20ppm). A esponja é misturada por 1 min. com baixa velocidade e posteriormente 3 min. com velocidade 2 em um misturador espiral de Hobart. A esponja é posteriormente fermentada por 3 horas a 25°C, UR 85%.

[000309] A seguir, 500 g de farinha “Gold Metal”, 14 g de levedura seca, 5 g de propionato de cálcio, 240 g de Xarope de Milho de Alta Frutose (42%), 5 g de propionato de cálcio, 250 g de ácido ascórbico e água (concentração final 30 ppm) e 40 g de sal são adicionados à esponja. A massa de farinha resultante é misturada por 0,5 min. com baixa velocidade e em seguida 10,5 min. em alta velocidade em um misturador espiral de Hobart.

[000310] A massa de farinha é descansada por 5 min. à temperatura ambiente, e em seguida partes de 794 g de massa de farinha são escaladas, moldadas em um moldador de grão cruzado e transferidas para panelas. Após 60 min. verificação a 43°C em UR 80% as massas de farinha são assadas por 21 min. a 200°C em um Forno Reed Rack.

Exemplo 11. Protocolo de Avaliação de Firmeza, Elasticidade e CoesividadeAnálise de Perfil de Textura de Pão

[000311] Consistência, elasticidade e coesividade são determinadas pela análise de fatias de pão pela Análise de Perfil de Textura usando um Analisador de Textura de Sistemas Micro Estáveis, Reino Unido. O cálculo de consistência, elasticidade e coesividade é feito de acordo com o padrão pré-ajustado fornecido pelo Sistema Micro Estável, Reino Unido. A sonda usada é redonda de alumínio de 50 mm.

[000312] A consistência é determinada na compressão de 40% durante a primeira compressão. A figura é a força necessária para comprimir a fatia a 40% da espessura total. Quanto mais baixo o valor, mais suave o pão. A consistência é expressa, por exemplo, em gramas.

Exemplo 12. Avaliação de efeitos antiendurecimento de polipeptídeos variantes de amilase G4

[000313] O pão foi assado como descrito no Exemplo 10 com pMS1776, pMS1934, pMS2020, pMS2022 e pMS2062 em dosagens que variam de 7,5 a 20 BMK/kg correspondendo a 7.500 a 20.000 unidades Betamyl/kg.

[000314] A consistência do pão é testada de acordo com o protocolo estabelecido no Exemplo 11 em vários tempos após o cozimento. Como controles, o pão assado com dosagens padrão de 600 ppm de Novamyl 1500 e/ou 416,66 ppm de uma composição compreendendo SEQ ID NO: 1 também foi assado.

[000315] As figuras 1 e 2 mostram os resultados da consistência. Quanto aos controles com dosagens-padrão a 600 ppm de Novamyl 1500 e/ou 416,66 ppm de uma composição compreendendo a SEQ ID NO: 1 uma redução muito mais forte da taxa de consistência do dia 3 ao dia 10 após cozimento ser obtida com pMS1776, pMS1934, pMS2020, pMS2022 e pMS2062. Estes também pães foram fortemente melhorados em elasticidade e coesividade em relação aos controles.

[000316] Isto indica que o(s) polipeptídeo(s) variante(s) como descrito neste pedido melhorou(aram) altamente os efeitos antiendurecimento em comparação a Novamyl 1500 e uma composição compreendendo a SEQ ID NO: 1.

Exemplo 13. Protocolo de Avaliação de Esfarelamento (Resistência ao Esfarelamento)

[000317] Duas fatias de pão são colocadas em um pedaço de papel. Cada fatia é dividida em 4 quadrados por cortes verticais e horizontais subsequentes da fatia.

[000318] O dilaceramento é feito separando o miolo com os dedos. Primeiro a fatia é rasgada do meio da superfície de pão superior ao meio da superfície de pão inferior. A seguir, cada metade da fatia original é rasgada do lado da crosta ao interior da fatia. As pequenas porções do miolo, que são separadas dos 4 quadrados, são removidas agitando cada parte após um corte pelo menos 3 vezes pelo movimento da mão para cima e para baixo.

[000319] O peso das pequenas porções do miolo separadas é deter-minado como uma medida de esfarelamento. Este ensaio pode ser referido como “Protocolo de Avaliação de Esfarelamento”.

Exemplo 14. Protocolo de Avaliação de Maleabilidade

[000320] A torrada é cortada usando um cortador de pão automático com a espessura de fatia ajustada em 15 mm. A fatia é dobrada à mão do topo da fatia em direção ao fundo, para que a direção do sulco seja de um lado a outro.

[000321] A maleabilidade é visualmente avaliada usando o seguinte sistema de marcação:

[000322] Este ensaio pode ser referido como “Protocolo de Avaliação de maleabilidade”.

Exemplo 15. Preparação de xarope de DP4 Materiais:

[000323] Amido de milho granular liquefeito (34%ds, 9.1DE) tratado com alfa-amilase bacteriana SPEZYME FRED® (Danisco US Inc., Genencor Division).

[000324] Pululanase (OPTIMAX L-1000, Danisco US Inc., Genencor Division)

Experimental:

[000325] O amido liquefeito foi ajustado a pH 5,2 com NaOH e em seguida cada um de 100 g de liquefeito foi incubado a 60 C para sacari-ficação de DP4 pela dosagem de enzimas em 0,03 BMK/gds. A pululanase quando usada foi dosada em 0,5 ASPU/gds. A reação foi realizada até 40 horas, interrompida para amostragem periódica para verificar DP4 de pico. Quando DP4 de pico foi observada, a reação foi interrompida pelo aquecimento em água fervente. Resultados:Tabela 1.Produção de açúcar

[000326] Como mostrado na Tabela 1, os resultados indicaram quePMS2062 produziu DP4 como um produto de açúcar principal. Como também indicado, adição de pululanase (PU) (PMS2062 + PU) resultou na redução mais rápida de açúcares superiores (vide, por exemplo, DP11 +), enquanto o nível de DP4 foi minimamente afetado.SEQUÊNCIASSEQ ID NO: 1. Sequência de proteína madura de pMS382SEQ ID NO: 2. Proteína madura de amilase G4 de Pseudomonas sp.AM1 (2006) com M adicionado no N-terminal (proteína de Q1EJP2):SEQ ID NO: 3. Sequência de DNA de nucleotídeo que codifica amilase G4 de Pseudomonas sp. AM1 (2006) (Q1EJP2) com M adicionado noN-terminal (DNA de Q1EJP2):SEQ ID NO: 4. Proteína madura de amilase G4 de Pseudomonas sp.7193 com M adicionado no N-terminal (proteína de A5CVD5):SEQ ID NO: 5. Sequência de DNA de codificação de nucleotídeo[amilase G4 de Pseudomonas sp. 7193 (A5CVD5) com M adicionado no N-terminal (DNA de A5CVD5): SEQ ID NO: 6. Proteína madura da amilase G4 de Pseudomonas mendocina (cepa ymp) com M adicionado no N-terminal (proteína deA4XX23):SEQ ID NO: 7. Sequência de DNA do nucleotídeo que codifica a amilase G4 de Pseudomonas mendocina (cepa ymp) (A4XX23) com M adicionado no N-terminal: (DNA de A4XX23):SEQ ID NO: 8. Proteína madura da amilase G4 de Hahella chejuensis(cepa KCTC 2396) com M adicionado no N-terminal (proteína de Q2SEA8):SEQ ID NO: 9. Sequência de DNA que codifica o nucleotídeo de amilaseG4 de Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396) com M adicionado no N-terminal (DNA de Q2SEA8):SEQ ID NO: 10. Proteína madura glIcan 1,4-alfa-maltotatrao-hidrolase de >gi|77787|pir||S05667 (EC 3.2.1.60) sem a sequência sinal -Pseudomonas saccharophilaSEQ ID NO: 11. Peptídeo sinal de glican 1,4-alfa-maltotatrao-hidrolase(EC 3.2.1.60) - Pseudomonas saccharophilaSEQ ID NO: 12. Sequência de proteína madura de pMS1776SEQ ID NO: 13. Sequência de proteína madura de pMS1934SEQ ID NO: 14 Sequência de proteína madura de pMS2020SEQ ID NO: 15 Sequência de proteína madura de pMS2022SEQ ID NO: 16 Sequência de proteína madura de pMS2062SEQ ID NO: 17 Sequência de proteína madura de pMS2171SEQ ID NO: 18 Sequência de proteína madura de pMS465:SEQ ID NO: 19 Sequência de proteína madura de pMS1042:SEQ ID NO: 20 Sequência de proteína madura de pMS1104SEQ ID NO: 21 Sequência de proteína madura de pMS1153:SEQ ID NO: 22 Sequência de proteína madura de pMS1286:SEQ ID NO: 23 Sequência de proteína madura de pMS1284:SEQ ID NO: 24 Sequência de proteína madura de pMS1290: SEQ ID NO: 25 Sequência de proteína madura de pMS1484:SEQ ID NO: 26 Sequência de proteína madura de pMS1579:SEQ ID NO: 27 Sequência de proteína madura de pMS1105:SEQ ID NO: 28 Sequência de proteína madura de pMS1723: SEQ ID NO: 29 Sequência de proteína madura de pMS2104:SEQ ID NO: 30 Sequência de proteína madura de pMS2138:SEQ ID NO: 31 Sequência de proteína madura de pMS2124:SEQ ID NO: 32 Sequência de proteína madura de pMS2177: SEQ ID NO: 33 Sequência de proteína madura de pMS2178:SEQ ID NO: 34 Sequência de proteína madura de pMS2118:SEQ ID NO: 35. Sequência LigadoraGSGDGGGNDGGSEQ ID NO: 36: Sequência de PS4 SBD:SEQ ID NO: 37HGGDEIILQFHWNSEQ ID NO: 38DGF-X1-AIW-X2-P-X3-PWRD-X4-SSWSEQ ID NO: 39GGEGYFW SEQ ID NO: 40VPNHSEQ ID NO: 41CDDGDSEQ ID NO: 42AGGFRFDFVRGSEQ ID NO: 43FALKSEQ ID NO: 44WREVAVTFVDNHDSEQ ID NO: 45GYSPGSEQ ID NO: 46GQHSEQ ID NO: 47AYAYISEQ ID NO: 48SPGTPSEQ ID NO: 49VYWSEQ ID NO: 50HMYDWGSEQ ID NO: 51: Novamyl:SEQ ID NO: 52: Sequência nucleotídica de pMS382:

[000327] Observação: o N-terminal derivado desta sequência nucleotídica é DQA... Entretanto, o construto final pode ser expandido na extremidade 5' com atg para codificar M no N-terminal.

Claims (7)

1. Polipeptídeo tendo atividade de amilase, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, com as substituições de aminoácidos Q42K, R88L, E223S, T235R, Q311P e A392D, opcionalmente, compreendendo ainda uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em N34Q, G100Q, S205L, Q240E, H272D e S409E, com referência à numeração da posição da sequência apresentada como SEQ ID NO: 1; em que o polipeptídeo possui termostabilidade melhorada em comparação com a amilase da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos que consiste na SEQ ID NO: 12.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ter um ligador fusionado no C-terminal.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ter atividade de exoamilase.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ter atividade de exoamilase não maltogênica.

6. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser como um aditivo de alimentos ou rações.

7. Método de produção de um xarope de sacarídeo, caracterizado pelo fato de que compreende adição de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 a um amido granular liquefeito para formar o xarope de sacarídeo.