BRPI1102019A2 - processo de construÇço de linhagem atenuada mutante de uma bactÉria patogÊnica, vacina, vetor vacinal e uso da referida vacina - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção para: "PROCESSO DE CONSTRUÇçO DE LINHAGEM ATENUADA MUTANTE DE UMA BACTÉRIA PATOGÊNICA, VACINA, VETOR VACINAL E USO DA REFERIDA VACINA". A presente invenção revela uma nova alternativa para a prevenção de salmonelose, a partir de mutantes capazes de promover imunização do hospedeiro. Em especial tais mutantes são nulos para os genes hupA e/ou HuB de HU e foram testados quanto a atenuação da virulência e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose, em especial a salmonelose murina, gerando resultados promissores. Adicionalmente, a presente invenção é destinada a um processo de produção desta linhagem atenuada, capaz de promover imunização, a vetores vacinais e vacinas para o tratamento de salmonelose e a seu uso no combate a tal infecção e possivelmente outras doenças, quando se tratanto de vetores multifatoriais.

Description

Relatorio Descritivo de Patente de Invengao para: "PROCESSO DE CONSTRUgAO DE LINHA6EM ATENUADA MUTANTE DE UMA BACTERIA PATOGENICA, VACINA, VETOR VACINAL E USO DA REFERIDA VACINA"·

Campo da 工ηνβηςβο

A presente invengao se refere a um processo de produgao de linhagens mutantes atenuadas, capazes de promover imunizagao, a vetores vacinais e vacinas para ο tratamento de salmonelose e a seu us ο no combate a tal infecgao. Especificamente， tais mutantes sao nulos para os genes hupA e hupB de HU e foram testados quanto a atenuagao da virulencia e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose. Fundamentos e Antecedentes da Invengao Salmonel 1 a

O genero Salmonella sp pertence a famiIia Enterobacteriaceae e e formado por bacilos gram-negativos, anaerobios facultativos e geralmente flagelados (Mastroeni e Maskell, 2006). A classificagao sorologica dessa bacteria fundamenta-se na identificagao de antigenos somaticos (O), flagelares (H) e capsulares (Vi) , este iiltimo quando presente.

Estudos de hibridagao de DNA sugerem a existencia de

duas especies de Salmonella： S· enterica e S· bongori. A especie S· enterica e subdividida em 7 subgrupos, sendo que a grande maioria das sorovariedades patogenicas para ο homem esta incluida no subgrupo 工（Boyd et al. 1996).

As s orovari edades de S · enterica patogenicas podem causar, em mamiferos, infecgoes com diferentes graus de gravidade, desde gastroenterites localizadas na mucosa intestinal ate infecgoes sistemicas graves, dependendo da sorovariedade bacteriana e do tipo de hospedeiro envOlvido (Baumler et al., 1998). S. en teri ca Typhi e ο agente causador da f ebre

tifoide, uma infecgao sistemica grave no homem (Guzman et al.,2006) · S· enterica Choleraesuis causa infecgoes sist^micas graves, principalmente em suinos, embora tambem possa causar infecgoes em humanos (Mastroeni e Maskell, 2006；Salyers e Whitt, 2002). Salmonella enterica Dublin e uma sorovariedade associada principalmente a bovinos· Como S· enterica Thyphi em humanos, a sorovariedade Dublin e invasiva e pode causar gastroenterites e septicemia nesses animais (Mastroeni e Maskell, 2006) . S. enterica Typhimurium e Enteritidis sao causas comuns de gastroenterites em humanos, mas tambem podem estar associadas a infecgoes extra-intestinais (Mastroeni e Maskell, 2006) . Em camundongos, S. enterica Typhimurium e

Enteritidis causam um tipo de infecgao muito semelhante a febre tif0ide humana. Desta forma, camundongos BALB/c sao utilizados como ο modelο murino de infeccao sistemica por S· enter!ca. Salmonelose e doenga A salmonelose e uma das doengas infecciosas mais

frequentes tanto em humanos quantο em outros animais. A infecgao por S· enterica inicia-se com a ingestao de agua ou alimentos contaminados, particularmente alimentos derivados de aves e suinos. Estes microrganisnios sao patogenos intracelulares facultativos e, uma vez ingeridos, apresentam a capacidade de aderir e invadir celulas da mucosa intestinal, preferencialmente celulas M (Jones et al. , 1994) · Uma vez ultrapassada a mucosa intestinal, S. enter!ca invade, persiste e prolifera no interior de vaciiolos de celulas do sistema reticulo endotelial podendo assim, alcangar diferentes orgaos e tecidos do hospedeiro, causando infecgao sistemica (Salyer e Whitt, 2002) . Estas infecgoes representam, ainda hoje, um grave problema de sadde piiblica, devido sua alta incidencia e gravidade, principalmente em areas subdesenvolvidas do mundo, onde as condigoes de higiene e saneamento basico sao ainda precarias (Woc-Colburn e Bobak7 2009； Boyle et al. , 2007; Coburn et al. 2007； Figueroa-Ochoa e Verdugo-Rodrigues·

2005； Graham, 2002) No Brasil a salmonelose e um problema serio de εβύάβ pdblica especialmente em regioes mais pobres (Fernandes et al. 2006, Ghilardi et al. , 2006).

A dose infectante mSdia (DI50) de S· enterica capaz de produzir infecgoes clinicas ou subclinicas em humanos esta entre IO5-IO10 organismos ingeridos. O processo infeccioso e localizado no ileo, colon e linfonodos mesentericos apos a ingestao de alimento contaminado, com ο aparecimento de sintomas tais como diarreia, v6mito e dores abdominais (revisado por Darwin e Miller, 1999). A maioria dos casos de gastroenterites ocorre em criangas com menos de 10 anos de idade, e os sintomas tendem a ser mais severos neste grupo, podendo a infecgao tornar-se sistemica.

Uma importante barreira encontrada por S· enterica no processo infeccioso, apos sua passagem pelo epitelio intestinal, sao os macrofagos da submucosa (Mastroeni e Maskell, 2006； Salyers e Whitt, 2002). Os macrofagos detectam e internalizam ο patogeno bacteriano a f im de elimina-lo do hospedeiro. As sorovariedades de S· enter!ca, capazes de causar

irafecgao sistemica, invadem os macrofagos e entao ativam mecanismos de virulencia que permitem a evasao das fung6es microbicidas do fagocito, permitindo a sobrevivencia e

replicagao no ambiente intracelular (Mastroeni e Maskell, 2006； Salyers e Whitt, 2002； Alpuche-Aranda, et al., 1994). A migragao de macrofagos infectados para outros orgaos do sistema monocitico fagocitario facilita a disseminagao da bacteria no hospedeiro.

Salmonella e Vacinas

A busca por uma vacina efetiva contra a febre tifoide compoe um importante capitulo na historia da Microbiologia. Varias estratSgias e formulagoes vacinais foram testadas tais como bacterianas, vacinas de subunidades e linhagens vivas atenuadas (revisado por Bueno et al. , 2009； Galen et al. , 2009 ； Guzman et al., 2006) . O antigeno capsular Vi purificado, livre ou conjugado com proteinas carreadoras e imunogenico quando administrado por via intramuscular ou subcutanea e tem se mostrado eficaz em alguns estudos (Guzman et al. , 2006； Strugnell e Wijburg, 2006) . Contudo, devido a suas caracteristicas e mo do de administracao, e incapaz de induzir ο sistema imune ao nivel de mucosa (MALT, do ingles mucosal associated lymphoid tissue). Desta maneira, esforgos foram canalizados no desenvoivimento de vacinas constituidas por linhagens vivas atenuadas, ideais para induzir resposta imune ao nivel do MALT.

A primeira vacina viva atenuada desenvolvida contra a febre tifoide e composta pela linhagem S. enterica Typhi

Ty21a. Esta linhagem foi obtida por mutagenese quimica da linhagem parental Ty2 (Germanier e Furer, 1983) . Esta vacina oral e segura, mas devido a sua grande atenuagao, requer varias doses para induzir imunidade, que frequentemente e de curta duragao (Guzman et al., 2006;

Strugnell e Wijburg, 2006).

Os resultados alcangados com a linhagem Ty21a levaram varios grupos a construirem novas linhagens vacinais de S· enter!ca, contendo delegoes em genes alvo especificos que atenuaram a virulencia. Adicionalmente, essas linhagens apresentam uma caracteristica fundamental para vacinas vivas, a estabilidade da atenuagao, uma vez que a mesma foi alcangada por delegao de um ou mais genes (revisado por Guzman et al. , 2006). Esses mutantes foram construidos inicialmente em S. enterica Typhimurium, devido a disponibilidade do modelο murino de infecgao, sendo as mutagoes promissoras transferidas para linhagens de S· enter!ca Typhi, muitas vezes a propria Ty2 (revisado por Guzman et al. , 2006) . Sendo assim, linhagens AaroAf AaroCf AaroD de S· enterica, deficientes na via biossintetica dos aminoacidos aromaticos (Tacket et al., 1997), mutantes Acya Acrpt incapazes de expressar adenilato ciclase e ο receptor para cAMP (Curtiss e Kelly, 1987； Tacket et al. , 1997),

mutantes phoP-phoQ (Hohmann et al. , 1996) entre outros· foram construidos e demonstraram-se imunogenicos, apesar da atenuagao da virulencia. No entanto, com frequencia, testes em voluntarios humanos indicaram a ocorrencia de bacteremia e/ou a necessidade de varias doses para a indugao de imunidade (Guzman et al., 2006; Strugnell e Wijburg, 2006). De fato, diversos estudos tem demonstrado ο desafio de se ajustar ο grau de atenuagao da linhagem vacinal para, de um Iado, nao comprometer a resposta imune e de outro, ser livre de efeitos colaterais. A capacidade de invadir, sobreviver e proliferar no

interior de macrofagos, polimorfonucleares e celulas dendriticas, aliada a disponibilidade de mutantes atenuados fazem de S. enterica um excelente carreador de antigenos a celulas do sistema imune. Assim7 linhagens atenuadas de S. enterica podem ser manipuladas gene ticamente de tal forma a expressar antigenos heterologos, construindo-se linhagens vacinais multifatoriais. Diferentes antigenos derivados de outras bacterias, virus, fungos, parasitas e mesmo de celulas de mamifero foram expressos em linhagens vacinais de S. enterica. Estas linhagens foram capazes de induzir resposta imune protetora nao somente contra a salmonelose, mas tambem contra ο organismo doador do antigeno heterologo (Cheminay e Hensel, 2007； Kwon et al., 2007； Loessner et

al., 2007； Mahoney et al., 2007； Atkins et al., 2006). Uma caracteristica fundamental de tais linhagens e, alem de ser muito improvavel a reversao da atenuagao, a capacidade de expressar ο antigeno heterologo de forma estavel e em quantidades suficientes para induzir ο sistema imune.

No inicio, a clonagem e expressao de antigenos em S·

enterica eram alcangadas atraves da utilizagao de plasmideos carregando genes de resistencia a antibioticos (Cardenas e Clements, 1992) . Alguns estudos demonstraram, no entanto, que na ausencia de pressoes seletivas, tais plasmideos eram instaveis e, portanto, perdidos apos poucos ciclos de replicagao in vivo (Cardenas e Clements, 1992 ； Dunstan et al. , 2003) ou ate mesmo durante ο cultivo in vi tro (Everest et al., 1995).

Para resolver tais problemas, estrategias como a utilizagao de promotores induzidos in vivo no controle de expressao do antigeno (Cheminay e Hensel, 2007； Marshall et al. , 2000), construgao de sistemas letais balanceados (Curtiss et al., 1990； Everest et al·, 1995) ou a integragao do gene heterologo no cromossomo de S· enter!ca (Hone et al., 1988; Strugnell et al., 1990； Everest et al., 1995) foram descritos·

O nucleoide bacteriano e os genes-alvo: hupA e hupB

Bacterias contem proteinas que compoem ο nucleoide

bacteriano (、xnucleoid-associates proteins", Nap) juntamente com ο DNA cromoss6mico. Diferente das histonas de eucariotos, as proteinas bacterianas parecem nao formar com ο DNA complexos analogos aos nucleossomas (Thanbichler et al. , 2005) · Dentro deste grupo encontram-se 12 proteinas sendo que as mais estudadas sao HU, FIS, IHF, HNS e DPS (Dorman, 2009； Dorman e Kane, 2009； Croinin e Dorman et al, 2007； Dorman et al., 2006; Drlica e Rouviere-Yaniv, 1987).

HU e uma proteina heterodimSrica codificada por dois genes, sendo eles hupA e hupB. Esta proteina parece nao reconhecer nenhuma sequencia especifica para a ligagao ao DNA, mas apresenta grande afinidade a regioes supercoiled ou que apresentem distorgoes na estrutura do DNA (Pinson et al · , 1999) · Swinger et al. (2004) demonstraram que essa proteina e capaz de induzir e estabilizar curvaturas de diferentes angulos no DNA. Alguns estudos sugerem que HU participe do reparo do DNA por recombinacao (Swinger et al. , 2004).

Ha poucos dados na literature sobre a proteina HU e Salmonella especificamente (Mangan et al. , 2011), embora haja mais relatos entre essa proteina e Escherichia coli. Ainda assim, os estudos descritos focaram-se no func i onamentο da proteina demons trando a regulagao de fatores de patogenicidade, mas nao investigaram a possivel

atenuagao promovida pela delegao dos genes hupA ou hupB e a indugao de protegao no modelο murino.

O gene hup A de Salmonella foi comparado ao gene hup A de E.coli por clonagem e sequenciamento, ο que revelou que as subunidades HUa dessas bacterias sao identicas e que as sequencias fora das ORFs sao altamente conservadas (Higgins Sc Hillyard, 1988).

Esses estudos revelam que a proteina HU afeta processos celulares como compactagao do DNA, replicagao, recombinagao, regulagao genica, alem de participar no crescimento termo sensivel, adaptagao na fase estacionaria de crescimento, lisogenia e transposigao do bacteri0fago Mu e e capaz de se ligar inespecif icamente ao DNA (Bi et al., 2009). Em S. enter!ca HU coordena a expressao de genes envolvidos no metabolismo central e virulencia (Mangan et al., 2011).

0 gene hupB ja foi descrito como sendo um modulador negativo na expressao de hilA, que e um gene crucial na expressao do fenotipo invasivo de Salmonella (Fahlen et al. , 2000) . No entanto, ha controversias sobre a agao de hupB, pois estudos posteriores realizados por outro grupo de pesquisa apontaram que esse gene tern uma agao positive na regulagao de hilA (Schechter et al., 2003).

Berger et al. (2009) construiram um duplo mutante AhupAAhupB de E.coli para verificar as alteragSes na estrutura gendmica promovida pela ausencia da proteina HU. Por esse estudo, foi possivel observer que a ausencia de HU provoca um rearranjo espacial no padrao de transcrigao, causando uma perturbagao da homeostase topologica que e compensada por uma maior acessibilidade de sitios de DNA pela topoisomerase. O sisterna de recombinagao λ Red

Em bacterias entericas, a obtengao de recombinantes utilizando moleculas 1ineares de DNA e um evento altamente raro, devido a instabilidade da molecula de DNA linear, que uma vez no interior da celula e rapidamente degradada pela atividade de nucleases do sistema de recombinagao RecBCD. Para contornar esta dificuldade, um sistema baseado no uso da maguinaria de recombinagao do bacteriofago λ (ο sistema XRed) foi proposto.

Datsenko e Wanner (2000) descreveram a construgao e ο emprego de um sistema baseado no bacteriofago λ para a construgao de linhagens mutantes de bacterias entericas. Este sistema e composto por plasmideos acessorios, sendo ο plasmideo pkD3 utilizado na construgao de cassetes de recombinagao por PCR (Datsenko e Wanner. 2000).

Durante a busca de anterioridade, ο documentο US 2004/101531 reivindica a delegao dos genes cya e crp de Salmonella. Embora a estrategia da presente inveneao tenha sido similar, a delegao ocorreu em outros genes, hup A e hupBf ο que corxferiu atenuagao da bacteria e consequente aplicagao da mesma como vetor vacinal· Portanto, nota-se que uma estrategia de imunizagao baseada no si1enciamentο genico de HU nao f oi descrita nem sequer sugerida pelo referido documento.

0 pedido de patente brasileiro PI 0006291-0, deposit ado em 27 de dezembro de 2000 em nome de Intervet International B. V. e intitulado： nBacteria do Genero Salmonella, Vacina para a Protegao de Animais contra a Salmonelose, Uso de uma Bacteria, e, Processo para a Preparagao de uma Vacina", se refere a bacterias de Salmonella para usο como uma vacina. A invengao tambem diz respeito a vacinas com base nas ditas bacterias, que sao dteis para a prevengao da patogenese microbiana. Alem disso, ο referido documento diz respeito ao uso de tais bacterias ou a fabricagao de tais vacinas. 2 O Como pode ser observado, ο referido documento PI

0006291-0 diz respeito somente a atenuagao promovida pela delegao de outro gene, isto e, ο gene recA.

A patente americana US 7,045,122, depositada em 15 de

novembro de 2001, em nome de AKZO NOBEL N.V e intitulada： 、、Salmonella Vaccine" refere-se a cepas vivas atenuadas de Salmonella c omp r e endendo uma primeira mutagao atenuante, que nao sao capazes de produzir RecA funcional. A invengao tambem relata que estas bacterias sao para uso em vacinas.

Como pode ser observado, ο referido documento US

7,045,122 tambem diz respeito somente a atenuagao promovida pela delegao de um gene, isto e, ο gene recA·

〇 pedido de patente internacional WO/2010/096888, depositado em 25 de fevereiro de 2010, em nome de Universidade Estadual de Campinas 一 UNICAMP e intitulado： “Vacinas Compreendendo Linhagens Atenuadas f Processo de Construgao de Linhagens Atenuadas, Vetores Vacinais e seu Uso no Tratamento da Salmonelose" revela uma nova alternativa para a prevengao de salmonelose, a partir de mutantes capazes de promover imunizagao do hospedeiro. Em especial tais mutantes sao nulos para os genes himA e himD de 工HF e foram testados quanto a atenuagao da virulencia e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose, em especial a salmonelose murina.

Como pode ser observado, no referido documento WO/2010/096888 a atenuagao e promovida pela delegao dos genes ihfA ou ihfB.

O documento de patente americano US 2004/101531 descreve vacinas e composig5es imunogenicas que utilizam bacterias patogenicas vivas atenuadas, tal como Salmonella, para distribuir antigenos ectopicos para ο sistema imune da mucosa dos animais vertebrados. As bacterias patogenicas atenuadas sao preparadas para secretar ο antigeno para ο espago periplasmico das bacterias ou para dentro das bacterias·

Como pode ser observado, no referido documento US 2004/101531 e descrito a delegao dos genes cya e crp de Salmonella.

O emprego de linhagens bacterianas vivas atenuadas como vacina esta historicamente associado a indugao de resposta imunolcSgica· efetiva e persistente. O vetor vacinal e constituido por uma bacteria que expressa antigenos (proteinas) de outras espScies de microorgariismos obtidos atraves do metodo de DNA recombinante. Quando apresentados ao sistema imune do hospedeiro (organismo alvo) estes microorganismos estimulam a produgao de anticorpos contra a doenga de interesse, sem que ela cause sintomas ou danos graves ao hospedeiro.

Embora estudos venham demonstrando estrategias de imunizagao baseada no silenciamento genico, em nenhum dos casos foi revelado e η em sequer sugerido um processo que

permita uma estrategia de imunizagao baseada no silenciamento genico de HU.

E sabido que mutagoes atenuadoras diferentes conferem propr i edades biolcSgicas, como imunogeni c i dade, dif erentes . Sumario da Invengao Para solucionar os problemas acima mencionados, a

presente invengao propiciara vantagens significativas em relagao aos processos de imunizagao baseada no silenciamento genico de HU, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relagao custo/beneficio mais favoravel.

A presente invengao se refere em um primeiro aspecto, a construgao de mutantes nulos de S. enter!ca para os genes (hupA e/ou hupB) codificadores de HU (Heat Unstable Protein) com ο intuito de desenvolver linhagens atenuadas quanto a virulencia, mas capazes de causar infecgao transitoria e induzir ο sistema imune de forma efetiva, constituindo-se em potenciais linhagens vacinais.

E um objeto da presente invengao uma bacteria atenuada compreendendo pelo menos um gene codificador de HU silenciado em uma bacteria patogenica.

A presente invengao refere-se tambem a uma vacina baseada em bacterias atenuadas compreendendo pelo menos um gene codificador de HU silenciado em uma bacteria

patogenica, capaz de induzir e estimular uma resposta imune no hospedeiro vertebrado. Breve Descrigao dos Anexos

A estrutura e operagao da presente invengao, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referencia aos desenhos em anexo e a seguinte descricao:

O Anexo Ieum gel de agarose 1% mostrando ο cassete de recombinagao gerado por PCR utilizando os primers hupA-f e hupA-r；

O Anexo 2a e 2b e um gel de agarose 1 % mostrando ο

produto de amplificagao por PCR do gene cat presente em ST662AhupA :C3. t θ ST662AhupB ： Cd. t, coin os iniciadores hupADTIf e hupADTIr e hupBDTf e hupBDTr, respectivamente；

O Anexo 3 e um gel de agarose 1% demons trando a excisao do gene cat das linhagens ST662AhupA： cat e ST662AhupB：cat para a construgao do duplo mutante ST662Ah upAAh upB ；

O Anexo 4 e um gel de agarose 1% demons trando os produtos de amplificagao por PCR das regioes referentes aos genes hupA e hupB, respectivamente；

O Anexo 5 e um esquema demonstrando a delegao dos genes hupA e hupB e a posigao dos iniciadores de detecgao,

representados como setas. Descrigao Detalhada da Invengao

Exnbora a presente invengao possa ser suscetivel a diferentes modalidades, e mostrada nos desenhos e na seguinte discussao detalhada, uma modalidade preferida com ο entendimento de que a presente modal idade deve ser considerada uma exemplificagao dos principios da invencao e nao pretende limitar a presente invengao ao que foi ilustrado e descrito agui.

O Anexo Ieum Gel de agarose 1% com ο fragmento gerado por PCR, correspondente ao cassete de recoinbinagao do gene hup A para a construgao da linhagem mutante. Da esquerda para a direita, as amostras referem-se ao Marcador de Peso Molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas)； controle negativo e ο cassete de recombinagao do gene hupA, com cerca de 1200 pb, compreendendo ο gene cat e regioes flanqueadoras compostas por sitios FRT (FLP Recognition Targets) e regioes adjacentes aos gene-alvo.

Os Anexos 2a e 2b e uma construgao dos mutantes AhupA e AhupB de S. enterica. Gel de agarose 1% com os produtos de PCR utilizando-se respectivamente os primers hupADT e hupBDT (primers de detecgao) para confirmagao da mutagenese. O controle positivo corresponde a linhagem

selvagem 662ST, com amplificagao do gene integro e regioes f lanqueadoras, gerando fragmento de 396 pb para hup A e 371 pb para hupB, enquanto os mutantes apresentam banda de aproximadamente 1.2 kb, equivalente ao gene cat e regioes f lanqueadoras. MPM： Marcador de Peso Molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ； CN： Controle Negative* (sem DNA) ； CP: Controle Positivo (DNA genomico da linhagem selvagem).

O Anexo 3 mostra a eliminaeao do cassete de resistencia ao cloranfenicol em mutantes AhupA e AhupB de S. entericaf demonstrando as "cicatrizes" de cerca de 100 pb, correspondentes tambem aos sitios FRT. Foram utilizados os primers hupADTl para as linhagens mutantes AhupA e hupBDT para os mutantes AhupB · MPM — Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ； CN — Controle negativo； CmR - linhagens portadoras do gene cat. O Anexo 4 e um gel de agarose 1 % demons trando os

produtos de PCR para regioes flanqueadoras ao gene hupA e hupB, respectivamente. Da esquerda para a direita： Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas)； Controle negativo； Controle positivo para hupA, composto por DNA genomico da linhagem selvagem 662ST, com fragmento referente ao gene integro hupA (importante salientar que neste caso os iniciadores hupADT2 foram utilizados, gerando

fragmento de 702 pb para hupA)； Linhagem 662STAhupA, com fragmento amplificado pelos primers hupADT2, referente ao gene cat e regi5es flanqueadoras； Linhagem duplo mutante 6 6 2 S TAh upAAhupB, amplificado pelos primers hupADT2； Controle positivo, composto pelo DNA genomicο da linhagem selvagem 662ST, com fragmento referente ao gene integro hupB； Linhagem 662STAhupBf com fragmento amplificado pelos primers hupBOT, referente ao gene cat e regioes flanqueadoras； Linhagem duplo mutante 6 6 2 SΤΔΛupAAhupB, amplificado pelos primers hupBOT. O Anexo 5 e um esquema demonstrative) das etapas de

construgao das linhagens mutantes AhupA e AhupB e posigao dos primers de detecgao hupADT e hupBOT t representados como setas. Inicialmente ο gene-alvo esta integro, demonstrado em branco. Posteriormente, ο gene-alvo e substituido pelo gene cat (cloranphenicol acetyl transferase), tambem demons tracio em branco. Na Ultima etapa, ο gene de resistencia ao antibiotico cloranfenicol e eliminado, restando apenas uma ”cicatriz" composta por sitios FRT (regiao hachurada)· Modalidade Preferencia1 da Invengao Bacteria Patogenica

As bacterias patogenicas de acordo com a presente

invengao sao bacterias capazes de provocar doengas e/ou morte em seus hospedeiros. Exemplos de bacterias patogenicas incluem, sem limitagoes, bacterias gram negatives, em especial membros das familias Enterobacteriaceae f Vibrionaceae, Franci sellaceae,

Legionallales, Pseudomonadacea ou Pasteurellaceae, incluindo os generos Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia spp., Yersinia spp., e Vibrio spp.

Em especial, bacterias patogenicas da presente invengao sao escolhidas dentre as especies que possuem em seu genoma pelo menos um gene codif icador de HU, preferencialmente, mas nao exclusivamente, S. enterica sorovar Typhimurium (662ST). Gene codificador de HU

O gene codif icador de HU da presente invengao e uma sequencia de DNA que apresenta homologia de pelo menos 80% com pelo menos uma sequencia escolhida dentre hup A ou hupB, as quais sao escolhidas dentre as espdcies que possuem em s eu genoma pelo menos um gene codi f i cador de HU, preferencialmente, mas nao exclusivamente, S. enterica sorovar Typhimurium (662ST). Bacteria Atenuada

Para efeitos da presente invengao, entende-se como bacteria atenuada uma bacteria patogenica que possui pelo

menos um gene codificador de HU silenciado. Por ttSilenciamento" entende-se um processo de delegao de determinada sequencia do genoma de uma bacter i a. Em especial, ο silenciamento foi proporcionado por um cassete de recombinagao.

Cassete de recombinagao

O cassete de recombinagao, de acordo com a presente invengao, e um cassete compreendendo pelo menos uma sequencia capaz de silenciar pelo menos um gene codificador de HU em uma bacteria patogenica.

O cassete de recombinagao e composto por iniciadores,

que possuem 2 partes continuas, sendo a primeira uma sequencia de aproximadament e 4 O bases homo1ogas ao gene alvo e a segunda aproximadamente 20 bases homologas a uma regiao presente nos plasmideos a serem utilizados.

As regioes de homologia com ο gene codificador de HU

foram selecionadas a partir da sequencia do banco de dados do projeto Genoma S. enterica (NC—003197) (Washington University, St. Louis, USA) e escolhidas de modo que fossem proximas aos codons de iniciagao e terminagao do gene.

O cassete de recombinagao compreende ainda genes

acessorios, como genes de resistencia a antibioticos. Processo de Transformagao e Recombinagao

O processo de recombinagao das bacterias da presente

invengao e um processo que se baseia no sistema de recombinagao XRed. O sistema de recombinagao XRed do bacteriof ago λ inclui 3 genes: γ, β e exo (presentes no plasmideo pKD46), que codificam respectivamente as proteinas Gam, Bet e Exo.

Gam inibe ο sistema ExoV do hospedeiro, enquanto Bet e

Exo promovem a recombinagao de fragmentos lineares no DNA alvo .

Os plasmideos acessorios contem genes de resistencia a antibioticos (KmR ou CmR) flanqueados por sitios FRT (FLP recombinase recognition targets) , formando ο modulo de recombinagao. Assim, estes plasmideos sao utilizados na criagao do cassete de recombinagao.

Para a geragao do cassete de recombinagao, sequencias de aproximadamente 40 pb homologas ao gene alvo sao geradas nas extremidades desse modulo por PCR. Assim, ο cassete de recombinagao e ο modulo flanqueado por sequencias homologas ao gene alvo·

Para a geragao de mutantes, ο plasmideo ρKD46 e transformado por eletroporagao na linhagem hospedeira e os transfοrmantes sao submetidos a eletroporagao com ο cassete de recombinagao. A expressao dos genes γ, β e exo inibe a degradagao da fita linear de DNA, permitindo a recombinagao

do cassete. Esta recombinaeao obedece a homologia de DNA conferida pelas sequencias flanqueadoras, de tal forma que a recombinagao envoivera sequencias homologas·

Os recombinantes sao entao selecionados utilizando-se as marcas de resistencias carreadas pelo modulo de recombinagao· Essas construgoes permitem uma subsequente remogao do cassete de resistencia pela FLP recombinase expressa por um gene plasmidial, no caso ο plasmideo pCP20. Desta forma, e possxvel construir delegoes ou insergoes de genes em bacterias entericas, utilizando fragmentos de DNA

lineares, gerados por PCR.

Em especial, ο processo de transformagao da presente invengao compreende as etapas de:

a) expressao das proteinas Gam, Bet e Exo do bacteriofago λ presentes no plasmideo pKD46, promovendo a

recombinagao de fragmentos lineares no DNA alvo； e

b) troca alelica do gene codif icador de HU pelo cassete de recombinagao compreendendo um gene acesscSrio,·

c) eliminagao do gene acess0rio presente no cassete de recombinagao.

Linhasrens bacterianas selecionadas para mutagenese

Para este estudo foi selecionada uma linhagem selvagem virulenta de S. enter i ca, da sorovariedade Typhimuirium (662ST).

As amostras selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 Μ, segundo protocolo descrito por Sambrook e Russell (2001) e incorporado a qui, por referenda, em sua totalidade.

Teste de sensibi 1 i dade das lihhagens de S· enterica Typhimurium a antibioticos

A susceptibilidade das linhagens selecionadas foi testada para os axitibi0ticos ampicilina, canamicina, cloramphenicol, estreptomicina e tetraciclina. Para isso, foi utilizado ο metodo de microdiluieao. Neste teste foi possivel observer uma Concentragao

工nibit0ria Minima (MIC) inferior a 10yg/mL para os antibicSticos ampicilina, cloranf enicol, estreptomicina e tetraciclina e MIC num irxtervalo de 10-25 pg/mL para canamicina. Este teste indicou que plasmxdeos com marcas de resistencia a ampicilina e ao cloranfenicol podem ser utilizados.

Sistema utilizado para mutagenese

A mutagenese dos genes hup A e hup B foi obtida pelo sistema λ Red conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000) e incorporada aqui, em sua totalidade, por referenda. Este sistema e constituido das linhagens e plasmideos demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1 - Linhagens bacterianas com seus respectivos plasmídeos pertencentes ao sistema λ Red.

Linhagem Plasmídio Referência BT 340 pCP2 0 Datsenko e Wanner, 2000 BW25141 pKD3 Datsenko e Wanner, 2000 BW25141 pKD4 Datsenko e Wanner, 2000 BW25113 pKD46 Datsenko e Wanner, 2 000

Extração e purificação de plasmídeos

Do estoque à -8O0C foi retirada uma amostra de cada cepa contendo os plasmídeos. A linhagem BW25113/pKD46 foi semeada em meio LB ágar contendo ampicilina (10(^g/mL); BW25141/pKD3 e BT340/pCP2 0 foram semeadas em meio LB ágar contendo ampicilina (100pg/mL) e cloranfenicol (25yg/mL).

Para extração e purificação dos plasmídeos pKD46 e pCP20, a temperatura de incubação utilizada foi 302 C, uma vez que tais plasmídeos contêm origem de replicação termo- sensível. Após a extração, os mesmos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 0,8% segundo o protocolo de Sambrook e Russell (2001), incorporada aqui, por referência, em sua totalidade. Iniciadores utilizados para gerar os cassetes de recombinação

Os iniciadores para essa metodologia são compostos de 2 partes contínuas, sendo a primeira uma seqüência de aproximadamente 40 bases homólogas ao gene alvo e a segunda bases homólogas a uma região presente no plasmídeo pKD3.

A região utilizada para amplificar a seqüência contida no plasmídeo foi selecionada através do programa Primer 3 (http://frodo.wi .mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), baseado na seqüência do plasmídeo pKD3 (AY048742) (Datsenko e Wanner, 2 001). Desse modo, foram desenhados os iniciadores hupA-f, hupA-r, hupB-f e hupB-r, descritos na Tabela 2.

Tabela 2. Iniciadores utilizados na construção do cassete de recombinação

Primers Seqüência (5'-3') hupA-f (SEQ ID 1) TAGCAAGCGATAAACACATTGTAAGGATAACTTATGAACAAGGTGT AGGCTGGAGCTGCTTC hupA-r (SEQ ID 2) TTCGATAAAACTGTTCACAGTTATGCGTCTTACTTAACTGCCATAT GAATATCCTCCTTAGTTC hupB-f (SEQ ID 3) GGTGCGATATAAATTATAAAGAGGAAGAGAAGAGTGAATAAAGTGT AGGCTGGAGCTGCTTC hupB-r (SEQ ID 4) CTTTGTCACATCCCCCGAGGGGATCACGCTTAGTTTACCGCCATAT GAATATCCTCCTTAGTTC

Construção do cassete de recombinação por PCR

Para a construção do cassete de recombinação foram utilizados os iniciadores descritos anteriormente, para a amplificação de uma região do plasmídeo pKD3. As reações foram realizadas em volume final de 50 μΐ; contendo 2 0 pmol de cada iniciador, 20 a 3 0 ng de DNA plasmidial, ImM de cada dNTP, 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCl2 em tampão apropriado provido com a enzima.

Para a reação de PCR, o DNA plasmidial foi desnaturado por aquecimento a 942 C por 2 minutos, e a amplificação realizada em 30 ciclos constituída dos seguintes passos: (1) denaturação a 94s C por 30 segundos; (2) "anelamento" a 562 C por 3 0 segundos; (3) extensão a 722 C por 1 minuto e 3 0 segundos. Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (Sambrook e Russell, 2001).

Assim, os primers hupA-f, hupA-r, hupB-f e hupB-r foram utilizados para amplificar uma região de aproximadamente 1,2 Kbp (Anexo 1) do plasmídeo pKD3. A região amplificada foi utilizada para compor o cassete de recombinação com os genes hupA e hupB, respectivamente. Para fins ilustrativos, demonstra-se no Anexo 1 o cassete de recombinação gerado por PCR utilizando os primers hupA-f e hupA-r.

Sequenciamento de nucleotídeos

2 0 0 sequenciamento de nucleotídeos foi realizado

conforme protocolos padrões. Os resultados são apresentados abaixo.

Sobreposição do sequenciamento do duplo mutante AhupAAhupB com os primers hupBDT "forward" e "reverse": TCGTACTTCGAAGGATTCAGGTGCGATATAAATTATAAAGAGGAAGAGAAGAGTGAATA AAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTGGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGA ATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGCGGTAAACTAAGCGTGATCCCCTCGGGGGAT GTGACAAAGTACAAGGGCGCATCAAC (SEQ ID No. 1) A sobreposição das bases sequenciadas a partir dos

primers hupBDT f e r (sublinhados) condizem a regiões flanqueadoras do gene hupB, não mais existente na linhagem duplo recombinante AhupAAhupBl conforme confirmado pela presença de uma cicatriz do plasmídio pKD3 no lugar desse gene (Box cinza).

Duplo mutante AhupAAhupB sequenciado com primer hupADT2 f:

GGCTCAGGGCAGACCTGCGCGAGGCTGGCGAGAGCA-TATCGGTATAAATTTTCAGCAA TGACACCAGAAAACGTGATTTACGTCTGATTTGTCGTGCCATAAGGCTTCCCTTATGCC CCCCGTCTGGTCTACATTTGGGAGGC-AAAAAAAGTGGCTATCGGTGCGTGTATGCAGG AGAGTGCTTTTCTGGCATTTCC-TCGCACTC-ATGCTTAGCAAGCGATAAACACATTGT AAGGATAACTTATGAACAAGGTGTAGGCT6GAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTA GAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCT GCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCA 2 0 CAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATA ATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAAT CAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAAC CCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTG TAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTT 2 5 GCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCT TTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAGATG-GAATAA-GC CG-ATAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGTCTTAAAAGGCGTATATCA (SEQ ID No. 2) Neste caso a seqüência é maior, pois no local do gene hupA foi inserido o gene cat e regiões plasmidiais flanqueadoras (-1,2 kb) . No box cinza, está destacada a seqüência correspondente à região flanqueadora ao gene hupA de Salmonella, que logo em seguida é interrompida por seqüências presentes no plasmídio pKD3, correspondentes ao Pl e ao gene cat. Os traços simbolizam bases não identificadas no sequenciamento.

Duplo mutante AhupAAhupB sequenciado com o primer hupADT2r (seqüência complementar e invertida):

CAAACCCTTTAGG-AAATAGGCCAGGTTT-CACCGTAACACG--ACATCTTGCGAATAT ATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTC AGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCAC CGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGA ATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAAT ATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAAT GTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCC ATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGA TCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTC 2 0 GCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCT GCGAAGTGATCTTCTGTC-CAGGT AGGCGCGCCGAAGTTCCTAT AC (SEQ ID No 3) .

Nesse sequenciamento foram detectadas apenas bases referentes ao plasmídio pKD3, já que o início e o final da seqüência apresentaram baixa qualidade no eletroferograma e por isso foram desconsideradas. As regiões de alinhamento com o plasmidio correspondem a uma região do gene ca t (nucleotídeos 263 a 993 do plasmidio).

Transformação das linhagens de S. enterica Typhimurium com o plasmídeo pKD46

A transformação das linhagens selecionadas com o plasmídeo pKD46 foi realizada por eletroporação, seguindo protocolo descrito em Ausubel et ai. (2007), incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

O eletroporador (Eletroporador Bio Rad. Gene Pulser II, Hercules - CA, USA) foi ajustado para 1,5 KV, 25 pF e 200 ohms e cubetas de 0,1 cm foram utilizadas. As amostras foram eletroporadas então incubadas por 1 hora em meio SOC. Posteriormente as culturas foram plaqueadas em meio LB ágar provido de ampicilina (100 ug/mL) e incubadas à 30aC durante a noite.

A presença do plasmídeo foi avaliada pela análise do perfil plasmidial por eletroforese em gel de agarose. As linhagens selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M segundo protocolo proposto por Sambrook e Russell (2001). Troca alélica dos genes hupA e hupB pelo cassete de recombinação

Para a etapa de recombinação gênica foi utilizada a linhagem 662ST/pKD46, como descrito anteriormente, e o cassete de recombinação gerado por PCR.

0 preparo das células competentes foi feito partindo- se de um pré-inóculo com 5 mL de meio LB provido de ampicilina (100 yg/mL), que foi incubado durante a noite à 3 0 aC. Desta cultura 0,5 mL foram inoculados em 50 mL de meio LB com o mesmo antibiótico e ImM de L-arabinose (Sigma), usado como indutor da expressão dos genes γ, β, e exo, sendo esta nova cultura crescida à 30 sC sob agitação (150 rpm) até atingir D.06oo de 0,7. Os frascos foram resfriados em banho de gelo por 15 minutos e as culturas foram centrifugadas por 10 minutos à 5000 g (4e C) . O precipitado foi ressuspendido em 4 mL de água deionizada esterilizada previamente resfriada a 4 sC e centrifugado novamente nas mesmas condições. Esta etapa de lavagem foi repetida três vezes utilizando-se glicerol 10% e o sedimento formado após a última lavagem foi ressuspendido em 400 pL e distribuído em alíquotas de 90 pL pelo protocolo de Sambrook e Russell (2 001) e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

Foram selecionados três tubos contendo as alíquotas aos quais foram adicionados 10 pL do produto gerado pela PCR; esses foram colocados em gelo por 1 minuto. O eletroporador foi ajustado para 1,5 KV, 25 yF e 200 ohms e as amostras eletroporadas e recolhidas em meio SOC, onde foram incubadas à 37a C por 1 hora e depois plaqueadas em meio LB-ágar com cloranfenicol (25ug/mL). As culturas foram incubadas durante a noite à 37 2C. Das colônias crescidas, foram selecionadas algumas para a confirmação por PCR, sendo denominadas 662STAhupACmR e 662STÁhupBCmR. As colônias selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M segundo protocolo proposto por Sambrook e Russell (2001), e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade. Em seguida, o plasmídio pKD46 foi curado.

Eliminação do gene cat de resistência ao antibiótico

Para a eliminação do gene de resistência ao antibiótico, foram utilizadas células competentes preparadas das linhagens 662STAhupACmR e 662STAhupBCmR e o plasmídeo pCP20. A eletroporação foi feita conforme descrito anteriormente e os transformantes foram selecionados em placas de LB-ágar com ampicilina (100 pg/mL). As placas foram incubadas durante a noite à 30 aC. Algumas das colônias crescidas foram selecionadas para confirmação por PCR e denominadas 662STàhupA e 662STkhupB. Estas linhagens foram estocadas em glicerol 2, 5M como descrito anteriormente por Sambrook e Russell (2001) e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade. Detecção e caracterização das mutações em hupA e hupB por PCR

Detecção do gene cat

0 gene cat (chloramphenicol acetyl transferase) nos mutantes de S. enterica foi inicialmente detectado por PCR. Foi desenhado um par de iniciadores internos a este gene, tendo-se como base a seqüência do plasmídeo pKD3 (AY048742) (Datsenko e Wanner, 2001) e constituinte do cassete de recombinação. Estes foram desenhados com o software Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Os iniciadores estão demonstrados na Tabela 3.

Tabela 3 - Seqüência dos iniciadores utilizados para detecção do gene cat

Iniciador Seqüência Referência cmDT - f (SEQ ID 5) 5'-GAACTTCGGAATAGGAACTTCA-3' Mendes et al., não publicado cmDT - r (SEQ ID 6) 5'-TGTGACGGAAGATCACTTCG-3 ' Mendes et al., não publicado

* Estes primers já constaram de tuna publicação.

As reações foram realizadas em volume final de 50 pL

contendo 2 0 pmol de cada iniciador, 20 a 3 0 ng de DNA genômico de cada transformante, ImM de cada dNTP, 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCl2 em tampão apropriado provido com a enzima. Para a reação de PCR, o DNA genômico foi desnaturado por aquecimento a 94 eC por 2 minutos e a amplificação realizada em 35 ciclos constituída dos seguintes passos: (1) denaturação a 94 2C por 3 0 segundos; (2) "anelamento" a 55 aC por 3 0 segundos; (3) extensão a 72 2C por 1 minuto. Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% utilizado o protocolo descrito por Sambrook e Russell (2001), incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

Detecção das mutações por iniciadores externos aos genes hupA e hupB

Foram construídos dois pares de iniciadores externos aos genes hupA e um par a hupB para a detecção das mutagêneses (Tabela 4). Esses foram desenhados com o auxílio do software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www.cgi) , baseado na seqüência de S. enterica Typhimurium LT2 (NC_003197).

Tabela 4 - Seqüência dos iniciadores externos aos genes 2 0 hupA e hupB

Primers Seqüência (5'-3') hupADTl-f (SEQ ID 4) AGTGCTTTTCTGGCATTTCC hupADTl-r (SEQ ID 5) ACAGACAAAAGGGGC TGATG ■hupADT2-f (SEQ ID 6) CGACTGCGAAGAACGTGATA .hupADT2-r (SEQ ID 7) AAAGCCGCTGGCAGTAAAC hupEDT-f (SEQ ID 8) TCGTACTTCGAAGGATTCAGG hupEDT-r (SEQ ID 9) GTTGATGCGCCCTTGTACTT

Transdução com bacteriófago P22

A seleção de recombinantes de S. enterica por eletroporação muitas vezes seleciona linhagens contendo LPS (lipopolissacarídeos) incompletos, já que estes são mais facilmente transformáveis, mas são mais sensíveis ao sistema imune e muitas vezes incapazes de estabelecer uma infecção sistêmica em camundongos.

Para realizar a transdução a bactéria recombinante doadora foi cultivada em 3 ml de LB sem antibiótico durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, uma alíquota de 100 μL do fago foi adicionada a 900 μL de LB fresco, atingindo a densidade de aproximadamente IO9 UFC/mL. Essa alíquota de 1 ml foi adicionada ao pré-inóculo cultivado, com uma densidade bacteriana de aproximadamente IO9 UFC/mL.

A cultura foi então novamente cultivada na estufa a 37 0C durante a noite. Nesse mesmo dia, a linhagem selvagem 662ST também foi cultivada em 3 ml de LB na estufa a 37 0C durante a noite. Como controle, o bacteriófago foi plaqueado em LB Ágar, para verificação de contaminação bacteriana.

No terceiro dia, a cultura com a bactéria doadora e o fago foi centrifugada a 5000 g por 10 minutos a 4 °C, para que as bactérias sedimentassem, separando-se do fago. Para garantir o isolamento de fagos e bactérias, o sobrenadante foi cuidadosamente filtrado e armazenado em um novo recipiente. Como controle o sobrenadante foi estriado em LB Ágar para verificar se não houve resquício de bactérias. Alíquotas de fagos e bactérias selvagens receptoras

foram misturadas, seguindo-se as seguintes proporções: 10 μΐ de fago + 100 μΐ de bactéria; 50 μΐ de fago + 100 μΐ de bactéria; 50 μΐ de fago + 50 μΐ de bactéria e 10 μΐ de fago + 50 μΐ de bactéria. Os recipientes contendo fagos e bactérias foram incubados a 37 0C por 20 minutos para a adsorção. Após esse período, as alíquotas foram plaqueadas em LB Ágar com cloranfenicol para a seleção das bactérias transduzidas. No dia seguinte, as colônias crescidas foram repicadas para os meios seletivos SS, MacConkey com cloranfenicol e novamente para LB com cloranfenicol e novo PCR de confirmação com os primers Cmdt e hupAãt ou hupBãt foi realizado.

Caracterização dos mutantes AhupA, AhupB e AhupAAhupB de S. enterica

Curva de crescimento in vitro

As linhagens recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio LB e incubadas à 37 sC durante a noite. No dia seguinte, 500 μL do pré-inóculo foi adicionado à 50 mL de meio LB 1% glicose e a nova cultura incubada à 37 2C sob agitação (150 rpm), sendo retiradas alíquotas a cada hora, durante cinco horas e diluições seriadas foram plaqueadas em triplicata sobre LB-ágar para contabilização no dia seguinte.

A comparação das curvas exibidas pelas linhagens apresentou algumas diferenças no crescimento. Determinação da Dose Letal Média (DL50) por via oral em Camundongos

Para determinação da DL50 por via oral, as linhagens 662ST, 662STAhupA, 662STAhupB e 662STAhupAAhupB foram cultivadas em meio LB a 37 2C durante a noite. No dia seguinte, 0,5 mL dessas culturas foram inoculados em 50 mL de meio LB-glicose 1% e incubado a 37 sC sob agitação (150rpm) até que atingissem o título desejado. As células foram sedimentadas por centrifugação (5000g por 5 min) e lavadas no mesmo volume de tampão salina-fosfato (PBS, pH 7,4). Este passo foi repetido uma segunda vez e o sedimento ressuspendido em PBS (mesmo volume inicial). Diluições seriadas foram preparadas em PBS e usadas para infectar camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas. As diluições foram plaqueadas em meio LB-ágar para a determinação da UFC. O inóculo via oral foi feito utilizando agulha de gavagem modelo IC800 (INSIGHT, Ribeirão Preto-SP, Brasil).

A quantidade de bactérias inoculadas variou de acordo com cada grupo, de IO2 à IO9 UFC/mL, sendo utilizados três camundongos por diluição. Os animais foram acompanhados por 3 0 dias após a administração do inóculo.

Os valores de DL50 por via oral em camundongos BALB/c foram calculados pelo método "Moving Average Interpolation" (Welkos e 0'Brien, 1994). 2 0 Tabela 5 - DL50 de linhagens de S. enterica inoculadas por via oral em camundongos BALB/c

Linhagem DL50 (CFU.mL-1) Referência 662ST 1,5 χ IO4 Presente invenção 662STAhupA 3,2 χ IO7 Presente invenção 662STAhupB 3,5 χ IOb Presente invenção 662STAhupAAhupB > IO8 Presente invenção

É importante salientar que de experimento para experimento existe alguma variação nos valores de DL50, uma vez que este é um experimento que envolve várias variáveis biológicas.

Desafio via oral

A capacidade de desencadear resposta imune contra S. enterica foi testada em dois momentos: No primeiro, os animais foram imunizados com uma única dose de S. enterica e desafiados 2 8 dias após a mesma. Em um segundo experimento, animais foram imunizados

oralmente com duas doses da linhagem duplo mutante nos dias 0 e 14 e desafiados com a linhagem selvagem no 3 0° dia após a segunda dose. Os experimentos posteriores de desafio prosseguiram para a linhagem duplo mutante, já que esta apresentou os resultados mais promissores.

A dose (UFC) utilizada foi de IO8 para a linhagem duplo mutante, dose esta estabelecida a partir dos ensaios prévios. Os animais foram desafiados com doses de IO7 CFU de linhagem ST662. Para estes experimentos foram utilizados 7 camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade por grupo. Os animais foram acompanhados por 3 0 dias após o desafio e avaliados quanto à sua sobrevivência.

Nas imunizações duplas com 662STAhupAAhupB todos os animais sobreviveram ao desafio com a linhagem selvagem enquanto que o grupo com imunização única apresentou uma taxa de 85% após 30 dias de experimento. Os animais do grupo placebo, inoculados com PBS, morreram entre o 52 e o IO2 dia após serem desafiados com as linhagens selvagens.

Algumas variações na taxa de sobrevivência dos camundongos com imunização dose única foram observadas entre diferentes experimentos.

Como pode ser observada, a presente invenção possibilita o uso de um vetor vacinai vivo para o

desenvolvimento de vacinas contra a salmonelose e outras doenças, com propriedades imunogênicas próprias, já que as linhagens atenuadas desenvolvidas podem ser empregadas na entrega de antígenos heterólogos ao sistema imune do hospedeiro.

Adicionalmente, a presente invenção possibilita a

utilização como vacina viva para induzir proteção contra salmonelose; um potencial uso como vetor vacinai multifatorial, ou seja, as linhagens atenuadas podem expressar antigenos de outras doenças; alem da utilização BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade por grupo. Os animais foram acompanhados por 30 dias após o desafio e avaliados quanto à sua sobrevivência.

Nas imunizações duplas com 662STÁhupAAhupB todos os animais sobreviveram ao desafio com a linhagem selvagem enquanto que o grupo com imunização única apresentou uma taxa de 85% após 3 0 dias de experimento. Os animais do grupo placebo, inoculados com PBS, morreram entre o 5a e o 10a dia após serem desafiados com as linhagens selvagens.

Algumas variações na taxa de sobrevivência dos camundongos com imunização dose única foram observadas entre diferentes experimentos.

Como pode ser observada, a presente invenção possibilita o uso de um vetor vacinai vivo para o

desenvolvimento de vacinas contra a salmonelose e outras doenças, com propriedades imunogênicas próprias, já que as linhagens atenuadas desenvolvidas podem ser empregadas na entrega de antígenos heterólogos ao sistema imune do hospedeiro.

Adicionalmente, a presente invenção possibilita a

utilização como vacina viva para induzir proteção contra salmonelose; um potencial uso como vetor vacinai multifatorial, ou seja, as linhagens atenuadas podem expressar antígenos de outras doenças; alem da utilização na terapia contra o câncer.

Salmonella enterica vem sendo utilizada como agente biológico no tratamento de alguns tipos de tumores sólidos. Isso porque esta bactéria apresenta tropismo para massas tumorais. 0 tratamento de diferentes tumores com S. enterica tem resultado em diminuição ou mesmo desaparecimento da massa tumoral. No entanto, para este tipo de emprego, a linhagem deve ser atenuada. Assim, as linhagens mutantes desenvolvidas da presente invenção apresentam o potencial de serem utilizadas na terapia de tumores. No entanto, estudos específicos são necessários para verificar este potencial e indicar outras modificações nas linhagens de S. enterica que eventualmente sejam necessárias.

A linhagem duplo mutante (662STAhupAAhupB) ainda

apresenta a vantagem adicional de menor probabilidade de reversão da atenuação para os níveis de patogenicidade da linhagem selvagem, já que dois genes foram nocauteados. Essa vantagem não está presente em linhagens com mutação 2 0 única, já que a reaquisição do gene perdido poderia recuperar a virulência total da linhagem.

A presente invenção tem utilização como vacina viva para induzir proteção contra salmonelose ou como potencial uso como vetor vacinai multifatorial, ou seja, as linhagens atenuadas podem expressar antígenos de outros patógenos.

Adicionalmente a presente invenção pode ser utilizada na terapia contra o câncer. Salmonella enterica vem sendo utilizada como agente biológico no tratamento de alguns tipos de tumores sólidos. Isso porque esta bactéria apresenta tropismo para massas tumorais. 0 tratamento de diferentes tumores com S. enterica tem resultado em diminuição ou mesmo desaparecimento da massa tumoral. No entanto, para este tipo de emprego, a linhagem deve ser atenuada. Assim, as linhagens mutantes desenvolvidas da presente invenção apresentam o potencial de serem utilizadas na terapia de tumores.

Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de construção da linhagem atenuada de Salmonella enterica podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outro são também totalmente pretendidos e contemplados. Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas. Referências

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Claims (39)

1. Processo de construção de linhagem atenuada mutante de uma bactéria patogênica caracterizado pelo fato de que compreendem as seguintes etapas: a) expressão das proteínas Gam, Bet e Exo do bacteriófago λ presentes no plasmídeo pKD46, promovendo a recombinação de fragmentos lineares no DNA alvo; b) troca alélica do gene codificador de HU pelo cassete de recombinação compreendendo um gene acessório; e c) eliminação do gene acessório presente no cassete de recombinação.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria patogênica é selecionado do grupo compreendido por Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Francisellaceae, Legionallales, Pseudomonadacea ou Pasteurellaceae, incluindo os gêneros Salmonella spp., Shigella spp., Eseheriehia spp., Yersinia spp., e Vibrio spp

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria patogênica ainda ser escolhida dentre Salmonella spp., Shigella spp., Eseheriehia spp., Yersinia spp., e Vibrio spp.

4. . Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a bactéria patogênica é preferencialmente a bactéria S. enterica sorovar Typhimurium (ST662).

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene codificador de HU é uma seqüência de DNA que apresenta homologia de pelo menos 80% com pelo menos uma seqüência escolhida dentre hupA ou hupB.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de recombinação compreende pelo menos uma seqüência capaz de silenciar pelo menos um gene codificador de HU em uma bactéria patogênica.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o cassete de recombinação é composto por iniciadores.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os referidos iniciadores possuem 2 (duas) partes contínuas, sendo a primeira uma seqüência de aproximadamente 40 bases homólogas ao gene alvo e a segunda aproximadamente 20 bases homólogas a uma região presente nos plasmídeos a serem utilizados.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as regiões de homologia com o gene codificador de HU foram selecionadas a partir da seqüência do banco de dados do projeto Genoma S. enterica (NC_003197) e escolhidas de modo que fossem próximas aos códons de iniciação e terminação do gene.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para a geração do cassete de recombinação, seqüências de aproximadamente 40 pb homólogas ao gene alvo são geradas nas extremidades desse módulo por PCR.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cassete de recombinação é o módulo flanqueado por seqüências homólogas ao gene alvo.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos genes acessórios podem ser genes de resistência a antibióticos.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os antibióticos são selecionados dos grupos compreendidos por ampicilina, canamicina, cloramphenicol, estreptomicina e tetraciclina.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para a geração de mutantes, o plasmídeo pKD46 é transformado por eletroporação na linhagem hospedeira e os transformantes são submetidos à eletroporação com o cassete de recombinação.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão dos genes γ, β e exo inibe a degradação da fita linear de DNA, permitindo a recombinação do cassete por recombinação homóloga.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os recombinantes são selecionados utilizando-se as marcas de resistências carreadas pelo módulo de recombinação.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a remoção do cassete de resistência é feito por uma enzima.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida enzima é preferencialmente a FLP recombinase.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a referida recombinase é expressa por um gene plasmidial.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transformação das linhagens selecionadas com o plasmídeo foi realizada por eletroporação.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que gera uma linhagem duplo mutante.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida linhagem duplo mutante e constituída por 662STAhupAAhupB.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 1 a 21, caracterizado pelo fato de que ainda apresenta uma menor probabilidade de reversão total da atenuação.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o iniciador é composto por uma seqüência homóloga a um gene codificador de HU.

25. Vetor vacinai caracterizado pelo fato de que o possui pelo menos um gene codificador de HU nocauteado e é capaz de estimular uma resposta imune contra uma infecção por uma bactéria patogênica.

26. Vetor vacinai, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato da resposta imune ser humoral e/ou celular.

27. Vetor vacinai, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que carrega antígenos, constituindo de linhagens vacinais multifatoriais.

28. Vacina conforme definida pelas reivindicações 1 a 27 caracterizada pelo fato de que compreender uma linhagem atenuada mutante de uma bactéria patogênica, onde a atenuação corresponde à deleção de um ou ambos os genes codificadores de HU.

29. Vacina, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a bactéria patogênica é selecionada do grupo que compreende Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Francisellaceae, Legionallales, Pseudomonadaeea, Pasteurellaeeae e combinações dos mesmos.

30. Vacina, de acordo com as reivindicações 28 e 29, caracterizada pelo fato de que a bactéria patogênica é selecionada dentre Salmonella spp., Shigella spp., Eseheriehia spp., Yersinia spp., Vibrio spp e combinações das mesmas.

31. Vacina, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a bactéria patogênica é preferencialmente S. enteriea, sorovar Typhimurium (662ST).

32. Vacina, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o gene codificador de HU é uma seqüência genômica que apresente homologia de pelo menos 80% com pelo menos uma seqüência escolhida dentre hupA ou hupB.

33. Uso da vacina conforme definido pelas reivindicações 28 a 32 caracterizado pelo fato de que é para induzir proteção contra doenças bacterianas.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a referida doença bacteriana é preferencialmente salmonelose.

35. Uso da vacina conforme definido pelas reivindicações 28 a 32 caracterizado pelo fato de ser como um potencial uso como vetor vacinai multifatorial expressando antígenos de outras doenças.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o duplo mutante AhupAAhupB com os primers hupBDT compreende a SEQ ID No. 1

37. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o duplo mutante AhupAAhupB sequenciado com primer hupADT2f compreende a SEQ ID No. 2.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o duplo mutante AhupAAhupB sequenciado com o primer hupADT2r compreende a SEQ ID No. 3 .

39. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência dos iniciadores externos aos genes hupA e hupB compreende as SEQ ID Nos 4, 5, 6, 7, 8 e 9.