BRPI1106685A2 - Técnica de vitrificação de oócitos em suporte metálico - Google Patents
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Abstract
técnica de vitrificação de oócitos em suporte metálico. a presente invenção refere-se a criopreservação de oócitos de mamíferos utilizando suporte metálico, e mais particularmente refere-se a estrutura metálica criada para vitrificação, servindo esta como suporte para manipulação, armazenamento e estocagem dos oócitos em palhetas; e a adição de copolímero bloqueador de gelo às solução crioprotetoras de vitrificação. existe no estado da técnica uma carência no método de acondionamento das microgotas vitrificadas contendo os oócitos, e além disso, a principal causa de crioinjúrias celulares é a formação de gelo intra e extra celular. em vista disto, a presente invenção abrange um suporte metálico, que facilita a manipulação das microgotas vitrificadas contendo os oócitos, poi permite o armazenamento em palhetas de 0,5 ml; e a adição de copolimero bloqueador de gelo nas soluções de vitrificação, a fim de diminuir as crioinjúrias causadas às células. a presente invenção refere-se à metodologia de criopreservação ultrarrápida, ao qual foi elaborada para ser utilizada em laboratórios de biotécnicas reprodutivas especializados.
Description
(54) Título: TÉCNICA DE VITRIFICAÇAO DE OÓCITOS EM SUPORTE METÁLICO (51) Int. Cl.: A01N 1/02 (52) CPC: A01N 1/0268,A01N 1/0221,A01N 1/0226 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS (72) Inventor(es): TIAGO VEIRAS COLLARES; JOÃO CARLOS DESCHAMPS; PRISCILA MARQUES MOURA DE LEON; VINÍCIUS FARIAS CAMPOS; FABIANA KÕMMLING SEIXAS; JOÃO CARLOS DESCHAMPS (74) Procurador(es): SILVA TRISCH DOS SANTOS ACUNHA (57) Resumo: TÉCNICA DE VITRIFICAÇAO DE OÓCITOS EM SUPORTE METÁLICO. A presente invenção refere-se a criopreservação de oócitos de mamíferos utilizando suporte metálico, e mais particularmente refere-se a estrutura metálica criada para vitrificação, servindo esta como suporte para manipulação, armazenamento e estocagem dos oócitos em palhetas; e a adição de copolímero bloqueador de gelo às solução crioprotetoras de vitrificação. Existe no estado da técnica uma carência no método de acondionamento das microgotas vitrificadas contendo os oócitos, e além disso, a principal causa de crioinjúrias celulares é a formação de gelo intra e extra celular. Em vista disto, a presente invenção abrange um suporte metálico, que facilita a manipulação das microgotas vitrificadas contendo os oócitos, poi permite o armazenamento em palhetas de 0,5 mL; e a adição de copolímero bloqueador de gelo nas soluções de vitrificação, a fim de diminuir as crioinjúrias causadas às células. A presente invenção refere-se à metodologia de criopreservação ultrarrápida, ao qual foi elaborada para ser utilizada em laboratórios de biotécnicas reprodutivas especializados.
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Relatório Descritivo “TÉCNICA DE VITRIFICAÇÃO DE OÓCITOS EM SUPORTE METÁLICO
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invençãorefere-se a criopreservação de oócitos mamíferos utilizando suporte metálico, e mais particularmente refere-se a metodologia e aestrutura metálica criada para vitrificação, servindo como suporte para manipulação, armazenamento e estocagem dos oócitos.
[002] Mais especificamente, a presente invenção refere-se à composição das soluções crioprotetoras, com a adição de bloqueadores de gelo a solução crioprotetora;à estrutura metálica utilizada na vitrificação;ao protocolo utilizado na crioproteção e à vitrificação dos oócitos.
Permitindo assim a criopreservação de gametas femininos de forma prática, rápida e eficiente. Esta metodologia de criopreservação ultrarrápida foi elaborada para ser utilizada em laboratórios de biotécnicas reprodutivas especializados. Pois, um protocolo seguro de criopreservação,além de conservar o material genético de reprodutoras de altodesempenho e de interesse zootécnico, permite a formação de banco genético, a preservação de
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2/17 espécies e utilização em biotecnologias de reprodução assistida.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Criopreservação.
[003] A criopreservação é um processo onde células ou tecidos biológicos são preservados através de temperaturas muito baixas, geralmente -196°C. Por meio deste processo se consegue a suspensão dometabolismo celular e a manutenção das característicasbiológicas por um longo período de tempo, mantendo a viabilidade celular.
[004] O processo de criopreservação pode ser classificados de acordo a taxa de resfriamento utilizada. O congelamento lento atinge uma taxa de resfriamento entre
0,5°C a 1,6°C, esta metodologia requer em torno de 4 horas de processo, e foi largamente utilizado na criopreservação de embriões e oócitos. O congelamento rápido atinge taxa de resfriamento de 17°C a 30°C, este processo deve levar em torno de 2 horas de duração. Enquanto que, o congelamento ultra rápido pode atingir taxas de 20.000°C a 25.000°C, onde todo o processo leva em média 3 minutos, sendo este o método de congelamento mais utilizado atualmente para oócitos mamíferos. A taxa de resfriamento e o método de congelamento são importantes fatores a serem considerados na prevenção crioinjúrias.
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Criopreservação de oócitos.
[005] A criopreservação de oócitos é realizada em muitas espécies de mamíferos incluindo humanos, camundongos, bovinos, bubalinos, suínos e equinos.No entanto, oócito são extremamente sensíveis ao congelamento, pois são célulasgrandes, comuma baixa relação entre superfície e volume,e ainda sãorodeados dezona pelúcida, dificultando a desidratação e a permeabilidade de membrana aos crioprotetores.
[006] Oócitos no estágio imaturo, de vesícula germinativa, são menos propensos adanos cromossômicos e microtubulares durantecriopreservação. Porém, oócitos maturos, em metáfase II, também podem ser criopreservados.A vitrificação é o método de criopreservação que está ganhando notoriedade devido a melhores taxas de sucesso na criopreservação de oócitos imaturos e maturos.
[007] A criopreservação de oócitos,além de conservar o material genético de fêmeas reprodutoras de alto padrão genético, permite a formação de banco genético, a preservação de espécies em extinção e a utilização da criopreservação em biotecnologias de reprodução assistida.
Vitrificação.
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4/17 [008] A vitrificação envolve rápidas taxas de resfriamento e aquecimento em presença de concentrações altas de crioprotetores, evitando assim, a formação de cristais de gelo intracelular e extracelular, e diminuindo as crioinjúrias causadas as células. O presente método surgiu como alternativa aos métodos de congelamento lento e rápido, a fim de obter resultados mais satisfatórios de sobrevivência de oócitos e embriões.
[009] A vitrificação é uma técnica de criopreservação promissora na reprodução assistida, sendo um procedimento simples, menos oneroso, e que requer um menor tempo despendido.Durante os últimos anos, diversas técnicas de vitrificação vêm sendo desenvolvidas, com isso, inúmeros agentes crioprotetores vêm sendo utilizados em diferentes concentrações e combinações, com o objetivo de minimizar os danos causados as células.
Vitrificação em Superfície Sólida.
[010] O método de vitrificação em superfície sólida, denominado de Solíd Surface Vítrífícatíon (SSV), foi desenvolvido com o objetivo de aumentar a taxa de resfriamento durante a vitrificação. Este método é aplicado sobre uma superfície de metal, pré-congelada por imersão parcial em nitrogênio líquido, onde são
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5/17 colocadas as microgotas de solução de vitrificação contendo os oócitos ou embriões, que vitrificam ao imediato contato com a superfície de metal. Este método foi aplicado em oócitos bovinos, caprinos, suínos e equinos.
[011] A estrutura de metal descrita em patente depositada, US006982172B2 de 3 de janeiro de 2006, não prevê o armazenamento das microgotas vitrificadas. Sendo utilizado criotubos para o armazenamento das microgotas em nitrogênio líquido. Este tipo de armazenamento, além de dificultar a manipulação na armazenagem e no descongelamento, acarreta a perda de algumas microgotas contendo oócitos/embriões durante o processo de vitrificação e desvitrificação.
Soluções Crioprotetoras e bloqueadores de gelo.
[012] Para execução da criopreservação e manutenção da integridade celular é necessário a preparação celular com substâncias crioprotetoras. Apesar da breve exposição dos oócitos aos crioprotetores durante o processo de vitrificação, suas altas concentrações podem causar danos às células devido a sua toxicidade química e estresse osmótico. Macromoléculas, como açúcares, soro fetal bovino (SFB) e polímeros sintéticos, reduzem a toxicidade de soluções crioprotetoras.
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6/17 [013] Os polímeros são materiais queapresentam em sua estrutura molecular unidades relativamente simples que se repetem, formando longas cadeias, resultando em compostos de alta massa molecular.
[014] O Supercool X-1000™ (21st Century Medicine,
Inc., Rancho Cucamonga, CA, USA), é um bloqueador sintético da formação de gelo que foi utilizado na invenção patentiada por Fahy, G. & Wowk, B. US20070190517A1 em 16 de agosto de 2007, para a criopreservação de órgãos.
Este bloqueador de gelo é um copolímero de polivinil álcool (PVA) com 20% vinil acetato,que, quando adicionado em baixa concentração nas soluções de vitrificação, suprime a formação de cristais de gelo e se liga a membrana celular, protegendo as células e aumentando a taxa de sobrevivência após a desvitricação.O Supercool X-1000™ foi adicionado as soluções de vitrificação para criopreservar oócitos e embriões de camundongos.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO [015] A presente invenção tem como objetivo principal executar a vitrificação de oócitos de mamíferos através de superfície de metal, criada para a manipulação durante a vitrificação e armazenagem dos oócitos vitrificados, permitindo o acondicionamento destes em palhetas.
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Adicionalmente, a presente invenção abrange a adição de copolímero bloqueador de gelo nas soluções de vitrificação, a fim de aumentar a viabilidade dos oócitos póscriopreservação.
[016] Existe no estado da técnica uma carência no método de acondionamento das microgotas vitrificadas contendo os oócitos, pois o armazenamento tradicional utiliza microtubos. Além disso, a principal causa de crioinjúrias celulares é a formação de gelo intra e extra celular, causando principalmente danos de membrana. Para preencher tal carênciaa presente invenção mostra uma estrutura de metal que deverá ser utilizada na manipulação e armazenagem no processo de vitrificação de oócitos. E ainda a presente invenção adiciona copolímero bloqueador de gelo as soluções de vitrificação.
[017] Em vista do exposto, tem a presente invenção o objetivo de provera criopreservação de oócitos de mamíferos, facilitando o processo e tornando os resultados de viabilidade mais satisfatórios.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [018] A presente invenção refere-se a criopreservação de oócitos de mamíferos utilizando um suporte metálico e bloqueador de gelo nas soluções crioprotetoras.
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8/17 [019] Mais especificamente, a presente invenção refere-se à composição das soluções crioprotetoras, com a adição de copolímero bloqueador de gelo as soluções de vitrificação, a fim de obter uma menor taxa de crioinjúrias causadas aos oócitos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à estrutura metálica que deverá ser utilizada na manipulação, armazenamento e estocagem dos oócitos durante a vitrificação.
Soluções de Vitrifcação Crioprotetoras [020] A solução crioprotetora de vitrificação 1 (SV1) deverá ser composta por400pl de Etilienoglicol, 2ml de Soro
Fetal Bovino inativado (SFB) e 7,55mL de Meio de Cultivo de tecidos 199 (TCM-199), 0,1% do copolímero bloqueador de gelo Supercool X-1000™(21st Century Medicine, Inc., Rancho
Cucamonga, CA, USA), para um total de 10 mL de SV1.
[021] A solução crioprotetora de vitrificação 2 (SV2)deverá ser composta de 3,5mL de Etilienoglicol, 2mL de SFB inativado, 0,5g de Polivinilpirrolidona (PVP),
1,37g de Sacarose, 7,09mL de TCM-199, 0,1% do copolímero bloqueador de gelo Supercool X-1000™, para um total de 10 mL de SV2.
Suporte Metálico
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9/17 [022] A estrutura metálicadeverá ser construída a partir de chapas de alumínio, com a finalidade de ser utilizada para a vitrificação em superfície sólida de oócitos mamíferos. A estrutura finalizada deverá medir 16,4 cm de comprimento, 20 cm de largura, 13 cm dealtura e 4,5 cm de profundidade. Esta estrutura contém poros com 3 mm de diâmetro que permitem a instalação de seis palhetas francesas de 0,5 mL.Para execução da vitrificação utilizando a presente invenção descrita, o suporte metálico deverá ser colocado em caixa térmica e ainda submerso em nitrogênio líquido. Quando submersa em nitrogênio líquido a estrutura de alumínio atinge de -176°C a -180°C. A Figura 1 ilustra a estrutura metálica utilizada para a vitrificação de oócitos mamíferos.
[023] As microgotas vitrificados deverão ser armazenados nas palhetas com auxílio de pinça préviamente congelada no nitrogênio líquido. A Figura 2 ilustra a microgota vitrificada contendo os oócitos, que deverá ser armazenada nas palhetas encaixadas na estrutura metálica.
Após o processo de vitrificação, as palhetas deverão serdesencaixadas e em seguida seladas para o armazenamento em nitrogênio líquido.
Vitrificação de Oócitos em Suporte Metálico
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10/17 [024] Para execução do protocolo de vitrificação proposto na presente invenção, os oócitos deverão ser préviamente coletados e selecionados para a ciropreservação. Os oócitos em estágio imaturo e maturo poderão ser utilizados nesta metodologia proposta, assim como deverão estar com as cálulas do cumulus (coroa radiada) ao seu redor.Além disso, de forma prévia a execução da criopreservação, as soluções de vitrificação deverão ser confecionadas com antecedência e deverão estar aquecidas a 37°C no momento de início da vitrificação.
[025] Para início do protocolo de vitrificação, o grupo de ocócitos que serão criopreservados deverão ser colocados na solução de vitrificação crioprotetora 1, em uma gota de 100 pL de SV1 (descrita no ítem Soluções de
Vitrificação Crioprotetoras). Estes oócitos deverão permanecer na SV1 durante 10 a 15 minutosem placa aquecadora a 37°C. Em seguida,os oócitos, em grupo de 3 a 4 oócitos, deverão ser transferidos, em um volume máxino de
10pL, para a solução de vitrificação crioprotetora 2.
Deverão ser preparadas 3 gotas da SV2 (descrita no ítem
Soluções de Vitrificação Crioprotetoras) de 60 pL cada para que os oócitos, em grupo de 3 a 4, sejam passados em três tempos de 30 segundos cada nestas três gotas de SV2. Estas passagens em SV2 deverão ser finalizadas em uma microgota
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11/17 de 3 pL de SV2 contendo os oócitos, coletada com auxílio de micropipeta e ponteira de até 10 pL, a microgota deverá ser colocada diretamente na estrutura de alumínio (descrita no ítem Suporte Metálico), que estará dentro de caixa térmica e submersa em nitrogênio líquido. As microgotas vitrificadas deverão ser colocadas nas palhetas encaixadas na estrutura, isto deverá ser realizado com auxílio de pinça préviamente congelada em nitrogênio líquido, empurrando as microgotas através dos poros da estrutura metálica e desta forma os oócitos são armazendos em palhetas. Após término do processo de vitrificação, as palhetas deverão ser desencaixadas do suporte metálico com auxílio de pinça e seladas com material atóxico, para armazenamento em raques no interior de botijões de nitrogênio líquido.
Desvitrificação de Oócitos [026] Para a desvitrificação dos oócitos mamíferos, deverá ser preparada préviamente uma solução de trealose a
0,3 M. No momento da desvitrificação esta solução deverá estar a 37°C para o requecimento dos oócitos vitrificados.
As palhetas deverão ser retiradas das raques ainda submersas em nitrogênio líquido, em seguida uma das extremidades da palheta deverá ser cortada e esta
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12/17 extremidade deverá ser voltada rapidamente para uma gota de
500 μL da solução de trealose 0,3 M. As microgotas vitrificadas deverão cair na solução de trealose aquecida, permanecendo a 37°C durante 3 minutos.Após este período, osoócitos vitrificados/desvitrificados deverão ser lavados em três gotas de 60 μL cada de TCM-199 adicionado de 10% de
SFB inativado, aquecido a 37°C, para a completa remoção das soluções crioprotetoras.
Lista de Abreviaturas [027] SSV:Solid Surface Vitrification - Vitrificação em Superfície Sólida
SFB: Soro Fetal Bovino
PVA:Polivinil Álcool
SV1: Solução Crioprotetora de Vitrificação 1
SV2: Solução Crioprotetora de Vitrificação 2
TCM-199: Meio de Cultivo de Tecidos 199
PVP:Polivinilpirrolidona
EXEMPLOS [028] Para permitir uma melhor compreensão da presenteinvenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados exemplos de possíveis variações na criopreservação de oócitos mamíferos
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13/17 por vitrificação utilizando suporte metálico.
EXEMPLOS
-Vitrificação utilizando suporte metálico.
[029] De acordo com as potenciais aplicações da presente invenção e de forma somente ilustrativa, sem a intenção de limitar em qualquer circunstância a abrangência da presente invenção, é descrita a seguir uma das possíveis formas de criopreservação de oócitos e embriões mamíferos por vitrificação utilizando suporte metálico:
EXEMPLO 1
- Criopreservação de oócitos por vitrificação em suporte metálico utilizando a adição de copolímero bloqueador de gelo às soluções crioprotetoras de vitrificação.
[030] Soluções de vitrificação:A solução crioprotetora de vitrificação 1 (SV1) deverá ser composta por:400pL de
Etilienoglicol, 2mL de Soro Fetal Bovino inativado (SFB) e
7,55mL de Meio de Cultivo de tecidos 199 (TCM-199) e0,1% do copolímero bloqueador de gelo Supercool X-1000™. A solução crioprotetora de vitrificação 2 (SV2) deverá ser composta por: 3,5 ml de Etilienoglicol, 2ml de SFB inativado, 0,5g de Polivinilpirrolidona (PVP), 1,37g de
Sacarose, 7,09ml de TCM-199 e 0,1% do copolímero bloqueador de gelo Supercool X-1000™.
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14/17 [031] Vitrificação:Para a criopreservação de oócitos em estágio imaturo e maturo com a presença das células do cumulus. As soluções SV1 e SV2, adicionados de 0,1% do copolímero bloqueador de gelo, deverão estar aquecidas a
37°C. Os oócitos deverão ser colocados em gota de 100 pL de
SV1, permanecendo de 10 a 15 minutosa 37°C. Em seguida, grupos de 3 a 4 oócitos deverão ser transferidos para SV2, em três gotas de 60 pL cada, permanecendo três tempos de segundos. Este período deverá ser finalizado em microgota de 3 pL de SV2 contendo os oócitos, que será depositada diretamente no suporte metálico submerso em nitrogênio líquido. Logo após, as microgotas vitrificadas deverão ser colocadas nas palhetas encaixadas na estrutura, que serão desencaixadas do suporte e seladas, e desta forma os oócitos são armazendos em palhetas.
[032] Desvitrificação: uma extremidade da palheta deverá ser cortada ainda em submersão no nitrogênio líquido, e na seque em seguida esta extremidade deverá ser voltada rapidamente para uma gota de 500 pL da solução de trealose 0,3 M aquecida a 37°C para que as microgotas caiam nesta solução, permanecendo durante 3 minutos. Após este período, os oócitos vitrificados/desvitrificados deverão ser lavados em três gotas de 60 pL cada de TCM-199 adicionado de 10% de SFB inativado.
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15/17
EXEMPLO 2
- Criopreservação de oócitos por vitrificaçãoem suporte metálico.
[033] Soluções de vitrificação:A solução crioprotetora de vitrificação 1 (SV1) deverá ser composta por: 400μL de
Etilienoglicol, 2mL de Soro Fetal Bovino inativado (SFB) e
7,6mL de Meio de Cultivo de tecidos 199 (TCM-199) . A solução crioprotetora de vitrificação 2 (SV2) deverá ser composta por: 3,5 mL de Etilienoglicol, 2mL de SFB inativado, 0,5 g de Polivinilpirrolidona (PVP), 1,37g de
Sacarose, 7mL de TCM-199 e 0,1% do copolímero bloqueador de gelo Supercool X-1000™.
[034] Vitrificação:Para a criopreservação de oócitos em estágio imaturo e maturo com a presença das células do cumulus. As soluções SV1 e SV2 deverão estar aquecidas a
37°C. Os oócitos deverão ser colocados em gota de 100 μL de
SV1, permanecendo de 10 a 15 minutosa 37°C. Em seguida, grupos de 3 a 4 oócitos deverão ser transferidos para SV2, em três gotas de 60 μL cada, permanecendo três tempos de segundos. Este período deverá ser finalizado em microgota de 3 μL de SV2 contendo os oócitos, que será depositada diretamente no suporte metálico submerso em nitrogênio líquido. Logo após, as microgotas vitrificadas
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16/17 deverão ser colocadas nas palhetas encaixadas na estrutura, que serão desencaixadas do suporte e seladas, e desta forma os oócitos são armazendos em palhetas.
[035] Desvitrificação: uma extremidade da palheta deverá ser cortada ainda em submersão no nitrogênio líquido, e na seque em seguida esta extremidade deverá ser voltada rapidamente para uma gota de 500 pL da solução de trealose 0,3 M aquecida a 37°C para que as microgotas caiam nesta solução, permanecendo durante 3 minutos. Após este período, os oócitos vitrificados/desvitrificados deverão ser lavados em três gotas de 60 pL cada de TCM-199 adicionado de 10% de SFB inativado.
[036] Figura 1. Ilustração da visão frontal do suporte metálico utilizado na vitrificação de oócitos de mamíferos. O suporte deverá ser utilizado para a manipulação e armazenagem em palhetas das microgotasvitrificadas contendo os oócitos. A estrutura deverá medir 16,4 cm de comprimento, 20 cm de largura, 13 cm dealtura e 4,5 cm de profundidade. Esta estrutura contém poros com 3 mm de diâmetro que permitem o encaixe de seis palhetas de 0,5 mL.
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17/17 [037] Figura 2. Ilustração da visão superior do suporte metálico utilizado na vitrificação de oócitos de mamíferos. A seta indica microgota contendo os oócitos, que foi depositada e vitrificada no suporte. Os seis poros (3 mm de diâmetro cada)permitem o encaixe de palhetas de 0,5 mL. A microgota será acondicionada na palheta com auxílio de pinça préviamente congelado no nitrogênio líquido.
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1/2
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES1. Método de vitrificação de oócitos de mamíferos caracterizado por:(a) utilização de estrutura metálica que permite um melhor manuseio durante o processo e possibilita uma maior viabilidade dos oócitos no final do processo;(b) óocitos de mamíferos;(c) adição de copolímero bloqueador de gelo X-1000 ao meio de vitrificação que possibilita uma maior viabilidade dos oócitos no final do processo de vitrificação;(d) uma solução de vitrificação que contenha os seguintes crioprotetores: etilenoglicol, DMSO, sacarose;
- 2. Método de vitrificação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar oócitos de eqüinos, bovinos, ovinos, suínos, caprinos, humanos, coelhos, caninos e roedores;
- 3. Método de vitrificação de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado por vitrificar oócitos em seu estágio imatura, de vesícula germinativa, e no estágio maturo, de metáfase II;
- 4. Estrutura metálica conforme reivindicação 1, caracterizada pela utilização de palhetas para a vitrificação dos oócitos;
- 5. Método de vitrificação de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por vitrificar os oócitos e embriões citados na reivindicação 2;Petição 870170092827, de 29/11/2017, pág. 3/252/2
- 6. Método de vitrificação de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por possibilitar a vitrificação dos embriões transgênicos das espécies citadas na reivindicação 2.Petição 870170092827, de 29/11/2017, pág. 4/251/2Desenhos
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| BRPI1106685A BRPI1106685A8 (pt) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | técnica de vitrificação de oócitos em suporte metálico |
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Publications (2)
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Country Status (1)
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2011
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