ES2232624T3 - Microinyeccion de crioprotectores para la conservacion de celulas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para tratar una célula viva, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: (a) microinyectar en el citoplasma de dicha célula un agente protector que (i) comprende un azúcar, (ii) que sustancialmente no penetra por lo que respecta a membranas celulares de mamíferos y (iii) mantiene la viabilidad de dicha célula de modo que puede almacenarse en un estado temporalmente inactivo y posteriormente restablecerse a un estado activo; (b) tratar dicha célula para hacer que entre en dicho estado inactivo; y (c) almacenar dicha célula en dicho estado inactivo.

Description

Microinyección de crioprotectores para la conservación de células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la conservación de tejido biológico utilizando la microinyección de agentes protectores intracelulares que contienen azúcar para conservar las células mediante congelación y/o secado.

Antecedentes de la invención

En los últimos años, la quimioterapia y la radioterapia de pacientes con cáncer ha conseguido cada vez más éxito y se han logrado remisiones mantenidas. Sin embargo, preocupan particularmente los efectos secundarios crónicos de estos tratamientos sobre los sistemas reproductores de los supervivientes a largo plazo. Para las mujeres, estos efectos incluyen la disminución de las células germinales ováricas y la esterilidad. Debido a la posible pérdida de la fertilidad en un futuro de aquellas expuestas al tratamiento del cáncer, se ha desarrollado una necesidad de bancos de ovocitos. La congelación de ovocitos, cuando se combina con fertilización in vitro, puede ser beneficiosa para las mujeres que desean fertilidad en un futuro que prevén la pérdida de la función gonadal debido a tratamiento de extirpación, radiación o quimioterapia. La congelación de ovocitos también puede proporcionar una posible alternativa a la congelación de embriones humanos, evitando así muchos de los problemas legales y éticos encontrados en la congelación de embriones.

La primera crioconservación con éxito de embriones humanos se consiguió en 1983 y actualmente la congelación de embriones es un procedimiento de rutina. Por el contrario, se ha informado de un éxito muy limitado con la crioconservación de ovocitos humanos. Sólo se ha informado de cinco embarazos con éxito para más de 1500 ovocitos crioconservados. Por tanto, los procedimientos actuales de congelación todavía se consideran experimentales y se necesitan nuevos enfoques para superar la dificultad encontrada por la crioconservación del ovocito humano.

Las técnicas de crioconservación habituales incluyen la penetración de crioprotectores a concentraciones de 1 a 2 M con, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol o etilenglicol, seguido de una velocidad de congelación lenta (de 0,3 a 0,5ºC/min). Normalmente, los ovocitos se dañan debido a la exposición a largo plazo en condiciones de congelación perjudiciales, que incluyen la deshidratación excesiva y las concentraciones de electrolitos elevadas. Un enfoque alternativo, denominado vitrificación (es decir, formación de material vítreo sin cristalización de hielo), utiliza altas concentraciones de mezclas crioprotectoras (de 6 a 8 M) seguidas de enfriamiento rápido con el fin de evitar los efectos letales de la congelación sobre los ovocitos.

A pesar de ser una alternativa atractiva, los procedimientos de vitrificación sufren de los efectos tóxicos y osmóticos de la alta concentración de crioprotectores sobre las células sensibles. Ninguno de estos dos enfoques (congelación-descongelación lenta y vitrificación rápida) ha dado como resultado consecuencias exitosas de manera fiable para la crioconservación de ovocitos humanos. Por tanto, existe una necesidad de una técnica fiable para el almacenamiento de ovocitos humanos. Con el fin de prever la conservación de células de mamíferos necesaria para la aplicación de células vivas como una herramienta terapéutica en los cuidados médicos clínicos, deben desarrollarse nuevos protocolos para conservar células nucleadas vivas utilizando niveles bajos de agentes de conservación no tóxicos y que presentan procedimientos simples aplicables a una variedad de células.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención es permitir el almacenamiento de células vivas en un estado inactivo y la posterior recuperación de las células hasta un estado activo. Este procedimiento implica microinyectar en el citoplasma de una célula un agente protector que no penetra sustancialmente por lo que respecta a las membranas de las células de mamíferos y que mantiene la viabilidad de la célula de modo que pueda almacenarse en un estado temporalmente inactivo y restituirla sustancialmente hasta un estado activo. La célula microinyectada se somete a condiciones que hacen que entre en un estado inactivo y se almacena en este estado inactivo. La célula almacenada puede restituirse posteriormente hasta un estado activo. Este procedimiento presenta la ventaja de que permite que otras células de mamíferos se almacenen hasta que se necesiten en condiciones que provocan efectos secundarios adversos mínimos, si se producen, en la célula.

Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para conservar células vivas que empieza con la microinyección de un agente protector que contiene una azúcar eficaz en la célula, preferiblemente un ovocito. Otras células preferidas que pueden conservarse incluyen células diferenciadas, tales como las células epiteliales, células nerviosas, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, células B, células T, eritrocitos, macrófagos, monocitos, fibroblastos o células musculares; y células indiferenciadas, tales como células madre embrionarias, mesenquimatosas o adultas. En una realización preferida, las células diferenciadas permanecen diferenciadas tras recuperarlas de un estado congelado o seco y las células indiferenciadas permanecen indiferenciadas tras recuperarlas. Las células pueden ser haploides (contenido de ADN de n en el que "n" es el número de cromosomas encontrado en el conjunto de cromosomas haploides normal de un mamífero de un género o especie particular), diploides (2n) o tetraploides (4n). Otras células incluyen aquellas de vejiga, cerebro, esófago, trompa de Falopio, corazón, intestinos, vesícula biliar, riñón, hígado, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, médula espinal, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, tráquea, uréter, uretra o útero. Las células pueden proceder de un mamífero humano o no humano, tal como un mono, simio, vaca, oveja, muflón de Canadá, cabra, búfalo, antílope, buey, caballo, burro, mula, ciervo, alce, caribú, búfalo de agua, camello, llama, alpaca, conejo, cerdo, ratón, rata, cobaya, hámster, perro o gato.

El procedimiento de la invención puede utilizar ventajosamente niveles bajos, inferiores a o iguales a aproximadamente 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 M o incluso inferiores a aproximadamente 0,4 M de agente de conservación y pueden utilizar un azúcar solo como el agente de conservación o azúcar en combinación con un crioprotector convencional o en combinación con otros azúcares intracelulares o azúcares extracelulares. Más preferiblemente, la concentración citoplasmática de los azúcares es inferior a 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 ó 0,01 M tras la microinyección y antes de la congelación o secado en la célula. La concentración extracelular de los azúcares es preferiblemente inferior a 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 ó 0,01 M tras la dilución en un medio líquido que contiene la célula. Si se hace crecer la célula sobre un soporte sólido, tal como una placa de agar, la concentración de los azúcares es preferiblemente inferior a 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 ó 0,01 M. En otras realizaciones preferidas, la concentración final de azúcar extracelular en el medio que contiene la célula es al menos 2, 3, 4, 5 ó 10 veces superior a la concentración citoplasmática de azúcar intracelular tras la microinyección y antes de la congelación o el secado de la célula. Los agentes de conservación intracelulares y extracelulares pueden ser de la misma o de distinta especie molecular.

Los agentes protectores preferidos incluyen azúcares, tales como monosacáridos, disacáridos y otros oligosacáridos. Preferiblemente, el agente es sustancialmente no permeable de modo que al menos el 50, 60, 70, 80, 90 o el 95% del agente no migre a través de la membrana plasmática hacia el interior o el exterior de la célula, mediante difusión activa o pasiva. Los azúcares preferidos presentan una temperatura de transición vítrea de la disolución concentrada congelada al máximo (Tg') que es al menos de -60, -50, -40, -30, -20, -10 ó 0ºC. Los ejemplos de tales azúcares son aquellos enumerados en la figura 14. La Tg' de otros azúcares puede determinarse de manera rutinaria utilizando procedimientos habituales tales como aquellos descritos por Levine y Slade (J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 84:2619-2633, 1988). El azúcar o el crioprotector convencional con una Tg' inferior a -50ºC puede combinarse con un azúcar con una Tg' superior a -50ºC de modo que la mezcla resultante presente una Tg' de al menos -60, -50, -40, -30, -20, -10 ó 0ºC y esta mezcla se utiliza para la crioconservación.

Monosacáridos adecuados incluyen aquellos que presentan un grupo aldehído (es decir, aldosas) o un grupo ceto (es decir, cetosas). Los monosacáridos pueden ser lineales o cíclicos y pueden existir en una variedad de conformaciones. Otros azúcares incluyen aquellos que se han modificado (por ejemplo, en los que uno o más grupos de hidroxilo se sustituyen con halógeno, restos alcoxilo, grupos alifáticos o se funcionalizan como éteres, ésteres, aminas o ácidos carboxílicos). Ejemplos de azúcares modificados incluyen \alpha- o \beta-glucósidos, tales como metil-\alpha-D-glucopiranósido o metil-\beta-D-glucopiranósido; N-glucosilaminas; N-glucósidos; ácido D-glucónico; D-glucosamina; D-galactosamina; y N-acetil-D-glucosamina. En otras realizaciones preferidas, el agente de conservación es un oligosacárido que incluye al menos 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 1000 o más monómeros. El oligosacárido puede estar compuesto por monómeros idénticos o una combinación de diferentes monómeros. Otros oligosacáridos adecuados incluyen hidroxietilalmidón, dextrano, celulosa, celobiosa y glucosa. Otros agentes de conservación adecuados incluyen compuestos que contienen un resto de azúcar y que pueden escindirse hidrolíticamente para producir un azúcar. Todavía otros agentes de conservación adecuados incluyen glucoproteínas y glucolípidos que se han modificado preferiblemente por la adición de 1, 2, 3, 4, 5 o más restos de azúcar derivados de azúcares con una Tg' de al menos -60, -50, -40, -30,
-20, -10 ó 0ºC o con un peso molecular de al menos 120 dalton. Por "resto de azúcar" se entiende un azúcar protector que incluye un grupo que puede unirse a otro compuesto. Por ejemplo, un grupo reactivo, tal como un alcohol, amina primaria o amina secundaria, en un azúcar puede reaccionar con un compuesto para formar un producto que incluye el resto de azúcar.

Otro agente de conservación extracelular adecuado es una lectina o cualquier proteína que puede unirse de manera no covalente o covalente a un azúcar que forma parte de una glucoproteína o glucolípido de la superficie celular. Esta unión puede estabilizar la membrana celular durante el almacenamiento de la célula.

Ejemplos de otros crioprotectores que pueden utilizarse en los procedimientos de la presente invención incluyen azúcares, polioles, glucósidos, polímeros y proteínas solubles con un peso molecular de al menos 120 dalton. Tal como se ilustra en las figuras 8 y 9, los compuestos con pesos moleculares mayores tienden a promover la formación de vidrio a una temperatura más elevada que la promovida por compuestos más pequeños, lo que permite almacenar las células a una temperatura de almacenamiento más elevada.

Tras el tratamiento con el agente protector microinyectado y opcionalmente, el agente protector externo, la célula está entonces preparada para el almacenamiento. En general, la célula puede prepararse para el almacenamiento mediante congelación y/o secado. Pueden emplearse congelación mediante inmersión, secado a vacío, secado con aire, así como técnicas de liofilización. Normalmente, los ovocitos se enfrían a una velocidad de 0,1 a 10ºC/min, preferiblemente, entre 0,3 y 5ºC/min y más preferiblemente entre 0,5 y 2ºC/min, inclusive. Las células somáticas se enfrían a una velocidad entre 0,1 y 200ºC/min, preferiblemente, entre 0,5 y 100ºC/min y, más preferiblemente, entre 1 y 10ºC/min o 10 y 50ºC/min, inclusive. Las células se enfrían hasta una temperatura final de al menos -60, -50, -40, -30, -20, -10, 0, 10 ó 20ºC (en orden de preferencia creciente). En otra realización preferida, el agente de conservación inhibe o previene la nucleación o el crecimiento de hielo intracelular durante la congelación de las células.

Los agentes de conservación extracelular pueden reducir el choque osmótico a las células que resulta potencialmente de la adición de una agente de conservación intracelular. Adicionalmente, los agentes de conservación extracelulares pueden estabilizar las membranas plasmáticas y proporcionan resistencia mecánica a las células durante la congelación o el secado.

Una vez la célula está lista para el almacenamiento, se almacena de una manera apropiada para su preparación. Las células congeladas pueden almacenarse a temperaturas criogénicas y las células secas pueden almacenarse secas a temperaturas ambiente u otra, según proceda. La recuperación de las células almacenadas está orientada según el procedimiento de su preparación para el almacenamiento. Las células secas se rehidratan y las células congeladas se descongelan. Preferiblemente, es viable al menos el 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o el 100% de las células recuperadas. La viabilidad celular puede medirse utilizando cualquier ensayo habitual, tal como un ensayo de "vivas/muertas" utilizando la tinción verde, calceína-AM, para indicar las células viables y la tinción roja, homodímero de etidio, para indicar las células muertas, según el protocolo del fabricante (Molecular Probes, Inc.). En otra realización preferida, al menos el 5, 10, 15, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 o el 95% de los ovocitos recuperados pueden fertilizarse utilizando técnicas de fertilización in vitro habituales (véase, por ejemplo, Summers et al., Biol. Reprod. 53:431-437, 1995). Preferiblemente, los ovocitos fertilizados evolucionan a embriones en estadio de 2 células, embriones en estadio de 4 células, embriones en estadio de mórula, embriones en estadio de blastocisto, embriones en estadio de feto o descendiente viable.

Por "embrión" se entiende una masa celular en desarrollo que no se ha implantado en la membrana uterina de un huésped materno. Por tanto, el término "embrión" puede referirse a un ovocito fertilizado, a una masa celular en desarrollo en estadio de pre-blastocisto o cualquier otra masa celular en desarrollo que se encuentra en un estadio de desarrollo previo a la implantación en la membrana uterina de un huésped materno y previo a la formación de un tubérculo genital. Un embrión puede presentar múltiples estadios de desarrollo celular. Por ejemplo, un embrión unicelular puede denominarse un cigoto; una masa esférica sólida de células que resultan de un embrión dividido puede denominarse una mórula y un embrión que presenta un blastocele puede denominarse un blastocisto.

Por "feto" o "fetal" se entiende una masa celular en desarrollo que se ha implantado en la membrana uterina de un huésped materno. Un feto puede presentar características definitorias tales como un tubérculo genital que una persona con habilidad habitual en la materia identifica fácilmente.

Las células de mamífero pueden cultivarse in vitro mediante incubación de las células en un medio hipertónico que presenta una osmolaridad superior a 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 o más mOsm. Preferiblemente, el medio incluye uno o más de los componentes enumerados en la figura 7 o uno o más de los agentes de crioconservación de la presente invención. Preferiblemente, el medio contiene nutrientes tales como aminoácidos, azúcares, lactato o piruvato. Este medio puede utilizarse para cultivar cualquier célula de mamífero, incluyendo las células preferidas anteriormente enumeradas. En varias realizaciones preferidas, este medio se utiliza para cultivar células antes, durante o después de la crioconservación.

La presente invención proporciona numerosas ventajas relacionadas con la crioconservación de células. Por ejemplo, estos procedimientos pueden aplicarse generalmente a la conservación de cualquier célula de cualquier mamífero. Estas células pueden almacenarse en un estado congelado o seco durante cualquier duración de tiempo hasta que se necesitan. Adicionalmente, estos procedimientos de crioconservación implican la utilización de concentraciones relativamente bajas de agentes de conservación no tóxicos que producen efectos secundarios adversos mínimos, si se producen, en las células almacenadas. Además, los agentes de conservación reducen o eliminan la formación de hielo intracelular durante la congelación que, de otra forma, dañaría las células. Si se desea, pueden utilizarse tanto agentes de conservación intracelulares como extracelulares para reducir la presión osmótica producida por la adición de un agente de conservación intracelular a las células. Los agentes de conservación extracelulares también pueden estabilizar las membranas plasmáticas y proporcionar resistencia mecánica a las células durante la congelación o el secado. Además, la presente invención puede permitir una elevada temperatura de almacenamiento (preferiblemente, superior a -60ºC) comparada con los crioprotectores convencionales (normalmente inferior a -80ºC) debido a la alta Tg' de azúcares.

Breve descripción de los dibujos

La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada, considerada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra las etapas en el procedimiento de la invención.

La figura 2 es un diagrama de flujo esquemático que enumera una realización del protocolo de crioconservación de la presente invención. Un experto en la materia puede modificar este protocolo para la conservación de otras células utilizando otros agentes de crioconservación, velocidades de enfriamiento, etapas de dilución y medios.

La figura 3A es un gráfico que muestra el volumen de ovocitos de ratón en medio DMEM/F-12 isotónico antes de la microinyección, DMEM/F-12 con trehalosa extracelular 0,1 M (medio hipertónico) antes de la microinyección y DMEM/F-12 con trehalosa extracelular 0,1 M (medio hipertónico) tras la microinyección de trehalosa 0,1 M. Las figuras 3B-3D son imágenes de microscopia de contraste de fases de los ovocitos en cada una de las tres condiciones anteriormente enumeradas.

Las figuras 4A-4D son imágenes de microscopia de campo claro de ovocitos humanos en medio DMEM/F-12 isotónico antes de la microinyección, DMEM/F-12 con trehalosa extracelular 0,15 M (medio hipertónico) antes de la microinyección, DMEM/F-12 con trehalosa extracelular 0,15 M (medio hipertónico) durante la microinyección y DMEM/F-12 con trehalosa extracelular 0,15 M (medio hipertónico) tras la microinyección de trehalosa 0,15 M, respectivamente.

La figura 5 es un gráfico de barras que ilustra la calibración de una micropipeta utilizada para la microinyección de un agente de crioconservación de la invención.

Las figuras 6A y 6B son diagramas de fase de DMSO y trehalosa.

La figura 7 es una tabla que enumera los componentes de medios HTF, HTF isotónico modificado y HTF hipertónico modificado.

La figura 8 es una tabla que enumera el porcentaje de ovocitos de ratón en metafase II con o sin trehalosa intracelular que se fertilizaron y evolucionaron a blastocistos mientras se cultivaban en medios HTF modificado isotónico o HTF modificado hipertónico.

Las figuras 9A y 9B son un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de supervivencia para ovocitos de ratón en metafase II con trehalosa intracelular 0 ó 0,10-0,15 M en presencia de varias concentraciones de trehalosa extracelular.

La figura 10 muestra la supervivencia de ovocitos de ratón en metafase II enfriados tras cultivo durante la noche.

La figura 11 muestra la supervivencia de los ovocitos humanos enfriados tras cultivo durante la noche.

La figura 12A es un gráfico de un conjunto de curvas que muestran el volumen de agua normalizado en ovocitos como una función de la temperatura para diferentes velocidades de enfriamiento. La figura 12B es un gráfico que muestra el tiempo de deshidratación calculado como una función de la temperatura. El tiempo de deshidratación se define como el tiempo necesario para que un ovocito disminuya un 50% su volumen a una temperatura dada.

La figura 13 es un gráfico de un conjunto de curvas que muestran la incidencia acumulada de hielo intracelular como una función de la temperatura en presencia y ausencia de agentes de conservación.

La figura 14 es una tabla que enumera el peso molecular y la temperatura de transición vítrea para azúcares con una temperatura de transición vítrea superior a -55ºC (Levine y Slade, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1, 84; 2619-2633, 1988). Muchos de estos azúcares están disponibles comercialmente a partir de fuentes, tales como Sigma y British Sugar.

La figura 15 es un gráfico que muestra la relación monotónica entre Tg' y el peso molecular de varios azúcares y crioprotectores habituales.

La figura 16 es una foto de microscopia de campo claro de una microgota antes y tras la inyección de disolución de trehalosa.

La figura 17 es un gráfico del volumen de inyección (pl) para varios tiempos de inyección (mseg.) para una presión de inyección de 3 PSI para una microgota inyectada con disolución de trehalosa.

La figura 18 son fotos de imágenes fluorescentes de ovocitos que se han inyectado una vez ("1X") o dos veces ("2X") con el azúcar fluorescente, el dextrano marcado con Oregon-green, tal como se describe en la presente memoria.

La figura 19 es un gráfico de una curva patrón de intensidad de fluorescencia para diferentes concentraciones del dextrano marcado con OG dentro de las microgotas.

Descripción detallada

Un procedimiento para conservar tejido biológico de la invención, ilustrado en la figura 1 y figura 2, comienza con la selección o aislamiento de las células o tejido que deben conservarse (10). Aunque el procedimiento de la invención puede utilizarse para la conservación de cualquier material biológico que presenta membranas lipídicas, es mucho más útil para la conservación de células nucleadas vivas y, en particular, células de mamíferos tales como ovocitos, difíciles de conservar de otro modo.

Los ovocitos pueden obtenerse aislando oviductos y/u ovarios y liberando los ovocitos. Los ovocitos se transfieren a hialuronidasa, una enzima que rompe las células extra. Los ovocitos se lavan entonces dos veces en una mezcla (Gibco) de medio Eagle modificado por Dulbecco tamponado con HEPES/nutriente F-12 (DMEM/F-12) y BSA (albúmina sérica bovina). Los ovocitos se transfieren entonces a HTF modificado, isotónico, cubierto con aceite mineral probado en embriones (Sigma) o cualquier otro medio adecuado. El medio DMEM/F-12 se enriquece con 4 mg/ml de BSA. Si se desea, también puede incubarse a los ovocitos con azúcar extracelular a la misma concentración que la cantidad planeada para la microinyección. Por ejemplo, para inyectar azúcar 0,1 M, puede equilibrarse los ovocitos en DMEM/F-12 con azúcar 0,1 M. Tal como se ilustra en las figuras 3A-3C, la hiperosmoticidad de la disolución de azúcar DMEM/F-12+ produce la reducción del volumen de los ovocitos de ratón. Esta disminución del volumen celular puede cuantificarse mediante medición visual del diámetro de las células utilizando microscopia de contraste de fases. La disminución del volumen celular facilita la determinación de cuánto azúcar se microinyecta posteriormente en los ovocitos. Por ejemplo, el hinchamiento de las células durante la microinyección hasta su volumen isotónico inicial (es decir, el volumen celular antes del equilibrio con el azúcar externo) indica que la concentración de azúcar inyectado se aproxima a la de la concentración de azúcar extracelular (figuras 3A-3D). Se obtuvieron resultados similares cuando se incubaron ovocitos humanos en trehalosa celular extracelular 0,15 M, lo que produce la disminución de su volumen y a continuación se inyectaron con trehalosa hasta que el volumen de los ovocitos volvió a su volumen inicial en medios isotónicos, que indicaron que se había inyectado trehalosa 0,15 M (figuras 4A-D). Alternativamente, los ovocitos pueden equilibrarse opcionalmente con cualquier otro soluto sustancialmente no-permeable, tal como un NaCl, para disminuir su volumen celular antes de la microinyección. La disminución inicial del volumen celular puede dar como resultado un volumen final más pequeño de los ovocitos microinyectados comparado con los ovocitos no incubados en un medio hipertónico antes de la microinyección. Este volumen final más pequeño puede minimizar cualquier posible efecto adverso por el hinchamiento de los ovocitos. Este procedimiento general para la preparación general de células para microinyección también puede utilizarse para otros tipos de células.

Entonces se microinyectan las células objetivo (30) con un agente de bioconservación. El equipo y los procedimientos de microinyección están bien caracterizados en la técnica y con la invención puede utilizarse el equipo de microinyección conocido para su utilización en la inyección de pequeñas moléculas en el interior de células. En una etapa de microinyección a modo de ejemplo, los ovocitos pueden microinyectarse a una presión de 10 psi durante 30 milisegundos. Otro ejemplo de una técnica de microinyección habitual es el procedimiento descrito por Nakayama y Yanagimachi (Nature Biotech. 16:639-642, 1998).

Para la microinyección de agentes de conservación, se fabricaron pipetas de inyección a partir de capilares de vidrio de pared fina de borosilicato (B100-75-10, Sutter, Novato, CA). En primer lugar, las pipetas se estiraron utilizando un estirador horizontal de micropipetas (modelo P-97, Sutter), de modo que tenían un vástago largo (\sim 1,3 cm). Para obtener una punta afilada con un diámetro interior de aproximadamente 0,5 \mum, las pipetas de inyección se biselaron en un ángulo de 40º sobre una máquina de biselar micropipetas de Sutter modificada (BV-10, Sutter), lo que permite una velocidad de rotación variable de la placa abrasiva.

Si se desea, la micropipeta utilizada para microinyección del agente de crioconservación puede calibrarse antes de la inyección (figura 5). Para esta calibración, se inyectó una microgota de medio DMEM/F-12 suspendida en una disolución de dimetilpolisiloxano con una disolución de azúcar de interés. Preferiblemente, la microgota presenta un tamaño similar a la de las células que van a microinyectarse. Por ejemplo, se utilizaron microgotas con un diámetro de 70-100 para calibrar una micropipeta para la microinyección de ovocitos. Para medir diferentes volúmenes de inyección a partir de una pipeta de inyección facilitada, se inyectaron varias microgotas variando el tiempo y la presión de inyección. Se tomaron imágenes de cada microgota utilizando microscopia de campo claro antes y después de la inyección para calcular el aumento del volumen de las gotas y por tanto, el volumen de inyección (figura 16). Como las microgotas son esferas casi perfectas, los volúmenes de gotas se calcularon de manera fiable utilizando el diámetro de las gotas. Por ejemplo, el volumen puede calcularse a partir de una imagen de sección transversal utilizando la fórmula V = 0,75226 (A)^{3/2}, en la que A es el área de sección transversal de la microgota. Con el fin de determinar volúmenes de inyección muy pequeños, se utilizaron diez microinyecciones consecutivas en una microgota para producir un volumen medible. Este aumento total del volumen se dividió entre diez para obtener el volumen promedio por inyección. Para una pipeta de inyección facilitada, la presión de inyección y la duración del impulso (es decir, la duración de la inyección) fueron dos factores principales que afectaron a los volúmenes de inyección. Para calibrar las pipetas de inyección, se fijó la presión de inyección en un valor apropiado y se varió la duración del impulso. El volumen de inyección varió linealmente como una función de la duración creciente del impulso (figura 17). Variando la duración del impulso y recogiendo suficientes puntos de información, se generó una pendiente para una pipeta de inyección facilitada. Esta pendiente fue particularmente útil para elegir diferentes volúmenes de inyección para los experimentos reales. Tras la calibración, se lavaron las micropipetas con agua destilada aspirando y soplando el agua hacia afuera. A continuación, se eliminó cualquier dimetilpolisiloxano restante mediante inmersión de las micropipetas en cloruro de metileno (Fisher, Pittsburgh, PA) y lavando después las micropipetas con agua destilada y etanol puro. Las micropipetas se prepararon posteriormente para la microinyección real en las células exponiéndolas a vapores de hexametildisilazano en un desecador durante varias horas para evitar la fijación de restos celulares a la pipeta.

Se confirmó la precisión de esta técnica de pre-calibración utilizando una técnica alternativa que supone la microinyección de dextrano marcado con Oregon-Green (OG) (Molecular Probes, Eugene, OR) en ovocitos, así como microgotas. Para la microinyección de ovocitos, se colocaron 80 \mul de medio DMEM/F-12 y 20 \mul de disolución de dextrano marcado con OG (1 mM) preparada en Tris 10 mM (pH 7,4), en una placa de cultivo de plástico de Falcon de 60 x 10 mm (Fisher) y se cubrieron con el aceite mineral. A continuación, se transfirieron los ovocitos a la gota de inyección. Antes de la microinyección, tanto la pipeta de sujeción como la de inyección se inclinaron de modo que su parte de punta fue horizontal al plano focal. La pipeta de sujeción estaba llena con el medio y conectada a una jeringuilla manual (Sutter) a través de un tubo de plástico relleno con aceite mineral. De manera similar, la pipeta de inyección estaba conectada al inyector de pico a través de un tubo de plástico y la disolución de dextrano se aspiró en el interior de la pipeta de inyección. Después, se aplicó una presión de equilibrio positiva ligera al sistema durante todo el procedimiento de microinyección para evitar la succión del medio exterior en el interior de la pipeta de inyección. Durante la microinyección, se sujetó un ovocito con el eje en la posición de las 12 o las 6, sobre la punta de la pipeta de sujeción aplicando succión a través de la jeringuilla manual, mientras se insertaba la pipeta de inyección en el ovocito por el lado opuesto. Se utilizó un piezoinyector (PM-20, Stoelting) para facilitar la penetración de la pipeta de inyección mediante un rápido movimiento de empuje. A continuación, se inyectó la disolución de dextrano marcado con OG en el ovocito utilizando parámetros de tiempo y presión apropiados. De manera similar, se inyectaron las microgotas de medio DMEM/F-12 con la disolución de dextrano marcado con OG utilizando los mismos parámetros de tiempo y presión y la pipeta de microinyección. Tras la microinyección, se capturaron las imágenes de fluorescencia de ovocitos y microgotas inyectados utilizando un microscopio invertido TMD de Nikon equipado con lámpara de arco de mercurio de alta presión, conjunto de filtros selectivos de fluoresceína y una cámara CCD. Para minimizar los errores debidos a las posibles fluctuaciones en la salida de la lámpara de arco de mercurio, se capturó cada imagen de fluorescencia promediando 64 fotogramas. La figura 18 representa las imágenes típicas de fluorescencia de ovocitos capturadas tras la microinyección, tal como se describió anteriormente. La intensidad de fluorescencia de las imágenes capturadas se midió sobre un pequeño punto en el centro de la célula o gota utilizando el paquete de soporte lógico Metamorph (Universal Imaging Co., West Chester, PA) en un ordenador personal. A continuación, se generó una curva patrón utilizando diferentes concentraciones del dextrano marcado con OG en el interior de la microgotas (figura 19). Se calcularon las concentraciones de dextrano microinyectado en los ovocitos y las microgotas utilizando la curva patrón. Finalmente, se calcularon los volúmenes de inyección a partir de las concentraciones de dextrano encontradas en los ovocitos y microgotas microinyectados. La valoración de los volúmenes de inyección demostró que la inyección en microgotas refleja volúmenes de inyección en ovocitos con una sensibilidad en el intervalo de pl (figura 5).

Tal como se describió anteriormente, otro enfoque que también se utilizó para determinar la concentración del azúcar inyectado implicó la comparación del volumen de un ovocito en medio hipertónico (es decir, trehalosa 0,1 M) antes y después de la microinyección. Como la contribución de TRIS 10 mM a la osmolaridad total del tampón de inyección (que también incluye normalmente azúcar 800 ó 1000 mM) es desdeñable, la reexpansión de los ovocitos reducidos en una mezcla medio/azúcar 0,10 M tras la microinyección de azúcar puede atribuirse a la introducción de azúcar en las células. Por tanto, la magnitud de la reexpansión tras la microinyección indica la concentración intracelular del azúcar inyectado. De hecho, los ovocitos de ratón individuales mostraron respuesta volumétrica similar a la misma cantidad de trehalosa inyectada. Un experimento de este tipo se resume en las figuras 3B-3D que presenta un ovocito típico en un volumen isotónico (figura 3B), un ovocito reducido en medio hipertónico antes de la microinyección de trehalosa (figura 3C) y un ovocito nuevamente expandido en medio hipertónico tras microinyección de trehalosa igual a la concentración de trehalosa extracelular (figura 3D).

Para conseguir una concentración citoplasmática de azúcar deseada tras microinyección y antes de cualquier concentración del azúcar intracelular debido a congelación o secado de la célula, tanto el volumen del agente de conservación que se inyecta a la célula, la concentración inicial del azúcar en el agente de conservación o ambos pueden ajustarse. Por ejemplo, para conseguir una concentración citoplasmática de azúcar relativamente alta tras microinyección, puede inyectarse un volumen relativamente grande de agente de conservación o puede inyectarse una concentración de azúcar relativamente alta. Alternativamente, si se desea una concentración citoplasmática de azúcar inferior, puede disminuirse el volumen de agente de conservación que se inyecta, puede reducirse la concentración del azúcar en el agente de conservación o pueden realizarse ambos cambios. El volumen de agente de conservación que se inyecta puede elegirse de modo que el volumen no sea tan grande como para que el aumento resultante del volumen del citoplasma produzca la lisis de la célula. Adicionalmente, el volumen de agente de conservación puede elegirse de modo que no sea demasiado pequeño como para ser medido e inyectado con precisión.

De manera similar, para conseguir una concentración extracelular de azúcar deseada tras dilución en un medio líquido que contiene la célula, tanto el volumen del agente de conservación que se añade al medio, la concentración inicial del azúcar en el agente de conservación que se añade al medio o ambos pueden ajustarse. Por tanto, la concentración extracelular de azúcar puede aumentarse añadiendo un volumen más grande o una disolución más concentrada al medio líquido. Para un agente de conservación que se añade a una célula que ha crecido sobre un medio sólido, tal como agar, la concentración extracelular de azúcar deseada puede conseguirse poniendo en contacto la célula con un agente de conservación que contiene azúcar en la concentración deseada.

Un agente de bioconservación útil en este procedimiento incluye cualquier agente químico que presenta propiedades crioprotectoras y es normalmente no permeable. En particular, el agente de bioconservación puede incluir azúcares o bien solos o bien mezclados junto con otros agentes de bioconservación habituales. Los azúcares de carbohidratos, tales como trehalosa, sacarosa, fructosa y rafinosa, pueden microinyectarse hasta concentraciones inferiores o iguales a aproximadamente 1,0 M y más preferiblemente, inferiores o iguales a aproximadamente 0,4 M. En otra realización preferida, la concentración se encuentra entre 0,05 y 0,20 M, inclusive. Adicionalmente, puede añadirse un azúcar extracelular o agente de bioconservación tradicional antes del almacenamiento. Si las células se incubaron en una disolución hipertónica antes de la microinyección, puede permitirse que el soluto sustancialmente no permeable permanezca en los medios tras la microinyección o puede eliminarse de los medios lavando las células con medios que contienen una concentración inferior, o ninguna, de este soluto.

Determinados azúcares o polisacáridos que normalmente no atraviesan las membranas celulares porque son demasiado grandes para pasar a través de la membrana tienen propiedades fisioquímicas y biológicas superiores para los fines de crioconservación. Aunque estos azúcares normalmente no atraviesan las membranas celulares por sí solos, utilizando el procedimiento de la invención, estos azúcares normalmente no penetrantes pueden microinyectarse intracelularmente para dar como resultado un efecto beneficioso.

Los azúcares no penetrantes, que presentan un efecto estabilizante o conservante sobre las células que son especialmente útiles como el agente de conservación en el presente procedimiento incluyen sacarosa, trehalosa, fructosa, dextrano y rafinosa. Entre estos azúcares, se ha demostrado que la trehalosa, un disacárido de glucosa no reductor es excepcionalmente eficaz para estabilizar las estructuras celulares a bajas concentraciones. La trehalosa es el azúcar más preferido para su utilización con el presente procedimiento. Presenta una capacidad excepcional para estabilizar y conservar proteínas, virus y bacterias, así como una capacidad inusual para formar vidrios estables a temperaturas elevadas. La trehalosa presenta propiedades fisicoquímicas para su utilización como un agente crioprotector celular (CPA) de ovocitos, que es muy superior a los agentes habituales. Además, la trehalosa contenida en muchos productos alimenticios es relativamente no tóxica y puede utilizarse en protocolos de crioconservación que no requieren eliminación de CPA, lo que da como resultado un producto final que puede infundirse. La sacarosa, que presenta propiedades similares a las de la trehalosa y que está ampliamente disponible y es relativamente barata, también puede preferirse para determinadas aplicaciones. También hay ventajas en la utilización de dextrano o bien solo o bien en combinación con otros azúcares, tales como trehalosa o sacarosa. El dextrano presenta una temperatura de transición vítrea (Tg') muy alta, pero no presenta algunas de las ventajas que están presentes en la sacarosa o trehalosa, tales como la capacidad para estabilizar los componentes biológicos. Por tanto, una mezcla de trehalosa y dextrano o mezcla de sacarosa y dextrano puede presentar beneficios añadidos.

La adición de glucolípidos o glucoproteínas extracelulares también puede estabilizar la membrana celular. Aunque no se pretenda limitar la invención a ninguna teoría particular, se plantea como hipótesis que los grupos de azúcar en los glucolípidos pueden formar enlaces hidrógeno con los grupos de cabeza hidrófilos de los fosfolípidos de membrana, estabilizando la membrana frente al estrés inducido por la congelación. Adicionalmente, es posible que los glucolípidos puedan incorporarse en la bicapa lipídica y aumentar la integridad de la membrana.

Tras la microinyección del agente de conservación, las células están listas para el almacenamiento 40. Puede emplearse una variedad de procedimientos de congelación y/o secado para preparar las células para el almacenamiento. En particular, en la presente memoria se describen tres enfoques: protocolos de secado a vacío o con aire 50, de liofilización 60 y de congelación-descongelación 70. Los procedimientos de secado presentan la ventaja de que el material biológico estabilizado puede transportarse y almacenarse a temperatura ambiente.

La figura 6 muestra un diagrama de fases de un crioprotector penetrante convencional (DMSO) frente a un azúcar común (trehalosa). Normalmente, los ovocitos cargados con DMSO de 1 M a 2 M se enfrían a una velocidad de enfriamiento muy lenta (de 0,3 a 0,5ºC/min) hasta una temperatura intermedia (de -60ºC a -80ºC) antes de sumergirlos en nitrógeno líquido para el almacenamiento. Como resultado de la lenta velocidad de enfriamiento, los ovocitos presentan suficiente tiempo para deshidratarse y siguen estrechamente la curva de fusión de equilibrio (Tm) de la disolución crioprotectora (por ejemplo, DMSO) descendiendo hasta un intervalo de temperatura entre -30ºC y -50ºC. Como la permeabilidad de la membrana plasmática al agua disminuye exponencialmente como una función de la temperatura decreciente a temperaturas inferiores a -50ºC, la deshidratación celular se vuelve desdeñable para cualquier fin práctico. A medida que se disminuye adicionalmente la temperatura hasta la temperatura de almacenamiento, la disolución no congelada en el interior de los ovocitos se concentra más hasta que la temperatura alcanza la curva de Tg en el punto Tg' y después, la disolución se transforma en vidrio. Como resultado, la fracción del agua celular que permanece en la célula cristaliza durante el enfriamiento posterior hasta las temperaturas de almacenamiento (normalmente inferiores a la temperatura de transición vítrea, Tg'). Se cree que la formación de hielo en el interior de las células da como resultado la muerte celular si la fracción de agua celular transformada en fase de hielo supera un determinado límite (normalmente el 5%). Por otro lado, el diagrama de fases de trehalosa es tal que las curvas de Tm y Tg se cruzan entre sí en una temperatura muy alta por debajo de cero (aproximadamente -30ºC) en comparación con DMSO (aproximadamente -80ºC). Como resultado, puede congelarse el ovocito y deshidratarlo acercándose mucho a su temperatura de transición vítrea mientras la permeabilidad al agua de la membrana permanezca alta y se sumerge posteriormente en nitrógeno líquido para vitrificar la muestra. La muestra puede almacenarse entonces a esta temperatura. Este procedimiento permite que los ovocitos superen el denominado efecto "cuello de botella" observado por debajo de -50ºC con la mayoría de los crioprotectores penetrantes convencionales. También pueden observarse resultados beneficiosos aplicando a la célula azúcares extracelulares, además de los azúcares intracelulares.

El material suspendido puede almacenarse entonces 90, 100 a temperaturas de crioconservación, por ejemplo, dejando los viales en LN_{2} durante la cantidad de tiempo deseada. Preferiblemente, las células se almacenan a una temperatura igual o inferior a la Tg' del crioprotector, de modo que las células permanezcan en el estado vítreo. Las temperaturas de almacenamiento preferidas son al menos 5, 10, 15, 20, 30 ó 40ºC por debajo de Tg'. Las células también se mantienen preferiblemente a una temperatura relativamente constante durante el almacenamiento. Preferiblemente, la temperatura de almacenamiento cambia en menos de 20, 10, 5 ó 3ºC durante el almacenamiento. Las células suspendidas pueden recuperarse entonces del almacenamiento 110 descongelando 120 en un baño de agua a 37ºC con agitación continua, suave durante 5 minutos.

Los protocolos para el secado a vacío o con aire 50 y para la liofilización 60 de proteínas están bien caracterizados en la técnica [Franks et al., "Materials Science and the Production of Shell-Stable Biologicals," BioPharm, octubre de 1991, pág. 39; Shalaev et al., "Changes in the Physical State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product Quality", Cryobiol. 33, 14-26 (1996).] y pueden utilizarse tales protocolos para preparar suspensiones celulares para el almacenamiento con el procedimiento de la invención. Además del secado con aire, otros procedimientos de secado por convección que pueden utilizarse para eliminar el agua de las suspensiones celulares incluyen el flujo convectivo de nitrógeno u otros gases. En una realización preferida, el gas utilizado para el secado por convección no contiene oxígeno que puede ser perjudicial para determinadas células.

Un protocolo de secado a vacío con evaporación 130 a modo de ejemplo útil con el procedimiento de la invención puede incluir colocar 20 \mul cada vez en pocillos sobre placas de 12 pocillos y secar a vacío durante 2 horas a temperatura ambiente. Naturalmente, podrían utilizarse otros procedimientos de secado, incluyendo el secado de las células en viales. Las células preparadas de esta manera pueden almacenarse secas 140 y rehidratarse 160 diluyéndolas en DMEM o cualquier otro medio adecuado.

Un procedimiento de la invención que utiliza la liofilización 60 para preparar las células para el almacenamiento 40 comienza con la congelación 80 de la suspensión celular. Aunque pueden utilizarse procedimiento de congelación de la técnica anterior, el procedimiento sencillo de congelación mediante inmersión descrito en la presente memoria para el procedimiento de congelación-descongelación también puede utilizarse para la etapa 80 de congelación en el protocolo de liofilización.

Tras la congelación, puede emplearse un procedimiento de secado en dos fases 150. En la primera fase, se añade energía de sublimación para evaporar el agua congelada. Cuando se liofilizan células, el criterio primario para seleccionar la temperatura de la fase de secado primaria es que debe ser inferior a la temperatura de transición de fase vítrea de la disolución concentrada congelada para evitar el colapso y reacciones químicas no deseadas. En general, debe utilizarse la temperatura más alta posible que no dañará la muestra, de modo que la sublimación ocurra rápidamente. Normalmente, el secado primario ocurre a una temperatura constante mantenida por debajo de la temperatura de transición vítrea para la disolución concentrada congelada.

El secado secundario se lleva a cabo después de que el hielo cristalino puro en la muestra se haya sublimado. El secado secundario no puede tener lugar a menos que la temperatura se eleve por encima de la temperatura de transición de fase vítrea del soluto concentrado congelado; sin embargo, es crucial que la temperatura de la muestra no se eleve por encima de la temperatura de colapso, por encima de la cual se cree que la muestra colapsa mecánicamente debido al flujo viscoso.

Las células liofilizadas pueden almacenarse 140 e hidratarse 160 de la misma manera que la anteriormente descrita para el secado a vacío. Entonces pueden recuperarse células viables 170.

Tras la recuperación de células a partir de un estado congelado o seco, puede eliminarse opcionalmente cualquier crioconservación externa del medio de cultivo. Por ejemplo, el medio puede diluirse mediante la adición de los medios correspondientes con una concentración inferior de agente de crioconservación. Por ejemplo, las células recuperadas pueden incubarse durante aproximadamente cinco minutos en medios que contienen una concentración inferior de azúcar a la utilizada para el almacenamiento de células. Para esta incubación, los medios pueden contener el mismo azúcar que el que se utilizó como el agente de crioconservación; un agente de crioconservación diferente, tal como galactosa; o cualquier otro soluto sustancialmente no permeable. Para minimizar cualquier choque osmótico inducido por la disminución en la osmolaridad de los medios, la concentración de agente de crioconservación extracelular puede disminuirse lentamente realizando esta etapa de dilución múltiples veces, cada vez con una concentración inferior de agente de crioconservación (figura 2). Estas etapas de dilución pueden repetirse hasta que no queda agente de crioconservación extracelular presente o hasta que la concentración de agente de crioconservación o la osmolaridad de los medios se reduzca hasta un nivel deseado.

Para las células que se dividen de manera relativamente rápida, tales como fibroblastos, la concentración interna de azúcar disminuye rápidamente a medida que el azúcar se divide entre las células madre e hijas. Por tanto, la osmolaridad interna de las células puede disminuir hasta un nivel próximo al de un medio isotónico tradicional, permitiendo el cultivo de las células recuperadas en un medio isotónico sin hinchamiento significativo o efectos adversos producidos por una diferencia ente la osmolaridad interna y externa de las células.

Para cultivar células recuperadas que no se dividen o que se dividen lentamente, tales como ovocitos, la utilización de un medio hipertónico puede evitar o reducir el hinchamiento de las células que, en caso contrario, puede producirse si se volvieran a llevar a un medio isotónico. Por tanto, se desarrolló un medio hipertónico para cultivar determinadas células recuperadas utilizando un enfoque doble. En primer lugar, se modificó un medio de cultivo habitual denominado HTF (medio de líquido tubárico humano) para minimizar la concentración de electrolitos (véase la figura 7, componentes marcados con flechas descendentes) y para aumentar otros nutrientes y aminoácidos (véase la figura 7, componentes marcados con flechas ascendentes). La osmolaridad de este medio se determinó utilizando un osmómetro. Como la osmolaridad de este medio fue aproximadamente de 285 mOsm, que se aproxima a la osmolaridad interna normal de las células, este medio se denomina HTF modificado, isotónico. En segundo lugar, el contenido de agua del medio se redujo para aumentar equitativamente las concentraciones de cada componente para conseguir una osmolaridad final de 320 mOsm. Este medio se denomina HTF modificado, hipertónico (véase la figura 7, última columna).

Para probar la capacidad de los medios HTF modificados, isotónico e hipertónico para soportar la fertilización y el desarrollo de ovocitos, se utilizaron estos medios para cultivar ovocitos frescos de ratón en metafase II que no se habían crioconservado. Tal como se ilustra en la figura 8, los ovocitos de ratón de control sin trehalosa intracelular, cultivados en medios HTF modificado, isotónico o HTF modificado, hipertónico, presentaban una alta frecuencia de fertilización (90%) y desarrollo al estadio de blastocisto (superior al 85%). Los ovocitos de ratón inyectados con trehalosa 0,07 M también mostraron una alta frecuencia de fertilización y desarrollo en blastocisto en medio HTF modificado, hipertónico. Para una trehalosa intracelular de 0,15 M, las frecuencias de fertilización y formación de blastocisto fueron reducidas, pero todavía significativas. Si se desea, la composición e hipertonicidad del medio de cultivo puede optimizarse adicionalmente para aumentar el número de blastocistos o descendientes viables que se forman. Por ejemplo, un medio de cultivo que presenta una osmolaridad superior (tal como 330, 340, 350, 360, 370 ó 380 mOsm) puede imitar mejor el líquido oviductal (que puede presentar una osmolaridad de al menos 360 mOsm) y por tanto promover más el desarrollo de descendientes viables (Van Winkle et al., J. Expt. Zool. 253:215-219, 1990). Cualquier otro medio hipertónico adecuado con una osmolaridad de al menos 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 o más mOsm puede utilizarse en procedimientos preferidos para cultivar células in vitro. Estos procedimientos pueden utilizarse para cultivar células con o sin azúcar intracelular. Estos medios preferidos también pueden utilizarse antes, durante o después del almacenamiento de células crioconservadas.

Las figuras 9A y 9B son un conjunto de gráficos que muestran la supervivencia de ovocitos de ratón enfriados en metafase II tras el cultivo durante la noche en medio HTF modificado, hipertónico como una función de la concentración de trehalosa extracelular a -15º y -30º, respectivamente. Estos experimentos se llevaron a cabo utilizando una velocidad de enfriamiento de 1ºC/min, con o sin aproximadamente de 0,10 a 0,15 M de trehalosa intracelular. La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo de vivas/muertas descrito en la presente memoria. Adicionalmente, se utilizó microscopia óptica para determinar visualmente si los ovocitos viables presentaban una membrana intacta y carecían de signos de degeneración y fragmentación. Tanto a -15 como a -30ºC, la adición de aproximadamente de 0,10 a 0,15 M de trehalosa en el interior de los ovocitos aumentó drásticamente la tasa de supervivencia. Además, a -30ºC, la ausencia de trehalosa interna dio como resultado unos pocos ovocitos viables tras la congelación. La cantidad extracelular de trehalosa produjo un efecto drástico, dependiente de la dosis sobre la supervivencia. A medida que se aumentó la cantidad extracelular de trehalosa en la disolución de congelación desde 0,15 M (aproximadamente la misma cantidad que la trehalosa intracelular) hasta 0,30 M ó 0,50 M, la tasa de supervivencia mejoró desde aproximadamente el 18 hasta el 55 o el 85%, respectivamente. Este resultado muestra el beneficio de la utilización tanto de agentes de crioconservación internos como externos durante el enfriamiento de las células.

La figura 10 muestra la supervivencia de ovocitos de ratón enfriados en metafase II tras el cultivo durante la noche en medio HTF modificado, isotónico. La figura 11 muestra la supervivencia de ovocitos humanos enfriados tras el cultivo durante la noche en medio HTF más trehalosa extracelular 0,1 M. La supervivencia celular se midió utilizando el ensayo vivas/muertas. También se utilizó microscopia óptica para determinar visualmente si los ovocitos viables presentaban una membrana intacta y carecían de signos de degeneración y fragmentación. La Tg' marcada entre corchetes en la figura 10 y figura 11 muestra las posibles temperaturas de almacenamiento a largo plazo cuando está presente trehalosa tanto intra como extracelularmente. En la figura 10, los ovocitos se enfriaron a una velocidad de enfriamiento muy lenta hasta una temperatura intermedia (-60ºC). Los ovocitos sin trehalosa dieron como resultado una tasa de supervivencia del 0%. Los ovocitos cargados con trehalosa extracelular 0,50 M experimentaron algo de mejora frente al control, pero sufrieron una disminución constante en la tasa de supervivencia a medida que la temperatura descendía. Por otro lado, los ovocitos cargados con trehalosa intracelular 0,15 M y extracelular 0,50 M, mantuvieron una tasa de supervivencia entre el 80 y el 100%. Comparados con el control y con ovocitos en una disolución de trehalosa extracelular, los ovocitos que contenían trehalosa intracelular experimentaron un aumento significativo en la tasa de supervivencia.

La figura 12A es un gráfico con múltiples curvas que ilustran el contenido de agua de ovocitos de ratón como una función de la temperatura para diferentes velocidades de enfriamiento, basadas en las siguientes ecuaciones bien establecidas para la velocidad del transporte de agua durante la congelación (Karlsson et al., Human Reproduction 11:1296-1305, 1996; Toner et al., J. of Membrane Biology 115:261-272, 1990).

\frac{dV}{dT} = \frac{LpRT}{Bv_{w}} A(1na^{ex}_{w} - 1na^{in}_{w})

en la que R es la constante de gas; T es la temperatura; B es la velocidad de enfriamiento; v_{w} es el volumen molar parcial de agua y a_{w}^{ex} y a_{w}^{in} son las actividades de agua en las disoluciones externa e intracelular, respectivamente. Lp es la permeabilidad de agua facilitada por

Lp = Lpg \ exp \left[- \frac{ELp}{R} (\frac{1}{T} - \frac{1}{T_{R}}) \right]

en la que Lpg es la permeabilidad de agua de referencia a T_{R}; ELp es la dependencia de energía o temperatura de activación de la permeabilidad del agua y T_{R} es la temperatura de referencia (normalmente, 0ºC).

Tal como se ilustra en estas curvas, la magnitud de la deshidratación de ovocitos depende de la velocidad de enfriamiento. Por ejemplo, velocidades de enfriamiento muy lentas pueden dar como resultado un exceso de deshidratación de los ovocitos. Alternativamente, velocidades de enfriamiento muy rápidas (por ejemplo, 30 ó 60ºC/min) pueden dar como resultado una deshidratación mínima. Por tanto, se prefieren velocidades de enfriamiento intermedias, tales como aquellas entre 0,1 y 5ºC/min. Para estas velocidades, el modelo de transporte de agua predice que el volumen de agua intracelular disminuirá inicialmente y después se acercará asintóticamente a un valor constante. Tal como se ilustra en esta figura, la permeabilidad del agua es una función exponencial de la temperatura con una energía de activación, ELp de 14,5 kcal/mol para ovocitos de ratón. Por tanto, a medida que se reduce la temperatura durante la congelación, Lp disminuye precipitadamente y alcanza casi el cero para temperaturas inferiores a -50ºC/min. Debido a semejanzas entre la dependencia de la temperatura de Lp (es decir, el valor de ELp) para ovocitos de ratones y ovocitos de otros mamíferos, tales como ratas, bovinos y humanos, se espera un comportamiento de deshidratación similar para otros ovocitos. Por ejemplo, ELP es de 14,70 kcal/mol para ovocitos humanos, comparada con 14,5 kcal/mol para ovocitos de ratón (Paynter et al., Human Reproduction 14:2338-2342, 1999).

La figura 12B es un gráfico que ilustra el tiempo de deshidratación calculado, necesario para reducir el volumen de un ovocito en un 50% para una temperatura facilitada. Este gráfico se generó utilizando las ecuaciones de transporte de agua anteriormente enumeradas e indica claramente que el transporte de agua se reduce significativamente a temperaturas bajas, especialmente a temperaturas inferiores a -50ºC. Por tanto, las células se enfrían preferiblemente utilizando los procedimientos de la invención para una temperatura final de al menos -50, -40, -30, -20 ó -10ºC para dejar que la deshidratación continúe a una velocidad significativa. Después de que se complete la deshidratación, las células pueden almacenarse a esta temperatura o a una temperatura inferior para mantener las células es un estado vítreo hasta que se necesiten.

Las figura 13 es un gráfico con un conjunto de curvas que muestran el porcentaje de ovocitos que presentan hielo intracelular a varias temperaturas. Para este ensayo, se utilizaron procedimientos habituales de criomicroscopio para enfriar los ovocitos a una velocidad de 3,5ºC/min (Cosman et al., Cryo-Letters 10:17-38, 1989). Se observaron los ovocitos utilizando un criomicroscopio para determinar si se había formado hielo intracelular. La presencia de hielo intracelular se detectó fácilmente debido al color negro que aparece por la dispersión de la luz por los cristales de hielo. Se utilizó este ensayo para probar los ovocitos de control incubados sólo en medio isotónico, los ovocitos incubados en medio con trehalosa extracelular 0,1 M y ovocitos inyectados con trehalosa 0,1 M e incubados en medio con trehalosa extracelular 0,1 M. Tal como se ilustra en la figura 13, la trehalosa extracelular redujo la incidencia de formación de hielo intracelular en los ovocitos. La frecuencia de hielo intracelular se redujo adicionalmente mediante la presencia de trehalosa intracelular además de trehalosa extracelular. Si se desea, la cantidad de hielo intracelular puede reducirse adicionalmente mediante el aumento de la concentración de azúcar intracelular o extracelular que se utiliza. La capacidad de la trehalosa para reducir significativamente el hielo interno permite velocidades de enfriamiento más rápidas. En el campo de la criobiología, se ha establecido que cuanto más rápida es la velocidad de enfriamiento sin formación de hielo intracelular letal, mayor es la posibilidad de supervivencia celular.

La figura 14 es una tabla que enumera azúcares con una temperatura de transición vítrea superior a
-55ºC. Tal como se ilustra en esta tabla, los azúcares con pesos moleculares superiores tienden a presentar temperaturas de transición vítrea superiores. Los polímeros lineales también tienden a presentar temperaturas de transición vítrea superiores que los polímeros ramificados con mismo peso molecular. Si se compara hexámeros de glucosa unidos por \alpha-(1-4) lineales y cíclicos, un oligómero cíclico (ciclodextrina, Tg' =
-9ºC) presentó una temperatura de transición vítrea superior que un oligómero lineal (maltohexosa, Tg' =
-14,5ºC) (Levine y Slade, véase anteriormente).

En la figura 15 se muestra un gráfico de Tg' como una función del peso molecular para algunos azúcares y crioprotectores habituales. En una figura más completa en Levine y Slade (véase anteriormente) para 84 azúcares pequeños, la relación monotónica entre Tg' creciente y peso molecular dio como resultado una correlación lineal de r = -0,93. Por tanto, para azúcares con un peso molecular de al menos 120 dalton, su Tg' es de al menos -50ºC.

Claims (25)

1. Procedimiento para tratar una célula viva, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

(a)

microinyectar en el citoplasma de dicha célula un agente protector que (i) comprende un azúcar, (ii) que sustancialmente no penetra por lo que respecta a membranas celulares de mamíferos y (iii) mantiene la viabilidad de dicha célula de modo que puede almacenarse en un estado temporalmente inactivo y posteriormente restablecerse a un estado activo;

(b)

tratar dicha célula para hacer que entre en dicho estado inactivo; y

(c)

almacenar dicha célula en dicho estado inactivo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de (d) tratar dicha célula para restablecerla en un estado activo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha célula es una célula de mamífero.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha célula es un ovocito, una célula epitelial, célula nerviosa, célula epidérmica, queratinocito, célula hematopoyética, melanocito, condrocito, célula B, célula T, eritrocito, macrófago, monocito, fibroblasto, célula muscular, célula madre embrionaria o célula madre adulta.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto dicha célula con un agente protector extracelular que sustancialmente no penetra por lo que respecta a membranas de células de mamífero y que estabiliza la membrana celular de dicha célula.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector comprende al menos un azúcar seleccionado de entre el grupo constituido por sacarosa, trehalosa, fructosa, dextrano, rafinosa, glucosa, sorbitol, manitol, lactosa, maltosa y estaquiosa.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector comprende al menos un azúcar con una temperatura de transición vítrea superior a -50ºC o en el que dicho agente protector comprende un glucolípido o una glucoproteína que comprende al menos un resto de azúcar derivado de un azúcar con una temperatura de transición vítrea superior a -50ºC.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector comprende al menos un azúcar con un peso molecular superior a 120 dalton.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector comprende al menos un azúcar con una temperatura de transición vítrea superior a -30ºC y un peso molecular superior a 120 dalton.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración citoplasmática de dicho azúcar es inferior o igual a aproximadamente 1,0 M tras la etapa (a) o antes de la etapa (b).

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la concentración citoplasmática de dicho azúcar es inferior o igual a aproximadamente 0,2 M tras la etapa (a) o antes de la etapa (b).

12. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho agente protector extracelular comprende un azúcar extracelular.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha célula se mantiene en un medio líquido y en el que la concentración extracelular de dicho azúcar extracelular es inferior o igual a 1,0 M tras la dilución en dicho medio líquido o en el que dicha célula se mantiene sobre un medio sólido y en el que la concentración de dicho azúcar extracelular es inferior o igual a aproximadamente 1,0 M tras la administración de dicha célula.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende congelar dicha célula hasta una temperatura criogénica.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha célula se congela por inmersión.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha célula se enfría a una velocidad comprendida entre 0,3 y 6ºC por minuto hasta una temperatura final que es de al menos -50ºC.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha célula está a una velocidad comprendida entre 0,3 y 3ºC por minuto hasta una temperatura final que está comprendida entre -50ºC y -10ºC.

18. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la etapa (d) comprende descongelar dicha célula.

19. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende secar dicha célula hasta un nivel suficiente como para permitir su almacenamiento en seco.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la etapa (b) comprende liofilizar dicha célula o en el que la etapa (b) comprende secar a vacío o por convección dicha célula.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la etapa (d) comprende rehidratar dicha célula.

22. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se emplea únicamente dicho agente protector.

23. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de la etapa (a) se mantiene dicha célula en un medio hipertónico que presenta una osmolaridad superior a 300 mOsm.

24. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que tras la etapa (d) se cultiva dicha célula en un medio hipertónico que presenta una osmolaridad superior a 300 mOsm.

25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que a dicho agente de conservación se añade una mezcla de crioprotector penetrante.