BRPI9610679B1

BRPI9610679B1 - vetor de expressão recombinante, composição farmacêutica e vacina

Info

Publication number: BRPI9610679B1
Application number: BRPI9610679A
Authority: BR
Inventors: Campos Neto Antonio; C Dillon Davin; R Webb John; G Reed Steven; A W Skeiky Yasir
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2017-05-16
Also published as: ATE243750T1; DE69628844D1; EP0854924B1; AU7242796A; WO1997011180A1; EP0854924A1; US6709661B1; MX9802284A; US5834592A; PT854924E; DE69628844T2; ES2205059T3; BR9610679A

Abstract

"antígenos de leishumana para uso na terapia e diagnose da leishmaniose". apresentam-se composições e métodos para prevenção, tratamento e detecção da leishmaniose e estimulação de respostas imune em pacientes. os compostos providenciados, incluem polipeptídeos, os quais contém pelo menos uma parte imunogênica de um ou mais antígenos de leishmania, ou uma variante deste. são também providas vacinas e composição farmacêuticas compreendendo tais polipeptídeos que podem ser usados, por exemplo, para prevenção e terapia da leishmaniose, bem como, para a detecção da infecção por leismania.

Description

"VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E VACINA" CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se genericamente, a composições e métodos para a prevenção, tratamento e detecção da leishmaniose, e ainda para estimulação de respostas imune em paciente. A invenção é mais particularmente relacionada a polipeptídeos, compreendendo uma parte imunogênica de um antígeno de Leishmania ou de uma variante deste, e a vacinas e composições farmacêuticas compreendendo um ou mais de tais polipeptídeos. As vacinas e composições farmacêuticas, podem ser utilizadas, por exemplo, para prevenção e terapia da leishmaniose, bem como para a detecção de infecção por Leishmania, em pacientes e provisões de sangue.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Organismos de Leishmania são parasitas protozoários intracelulares de macrófagos que ocasionam uma ampla faixa de doenças clínicas em humanos e outros animais, principalmente cães. Em algumas infecções o parasita pode ficar latente muitos anos. Em outros casos, o hospedeiro pode desenvolver-se em uma de muitas formas de leishmaniose. Por exemplo, a doença pode ser assintomática ou pode se manifestar como leishmaniose visceral sub-clínica, que é caracterizada por sintomas suaves de desconforto geral, diarréia e hapatomegalia intermitente. Pacientes com doença sub-clinica ou assintomática, normalmente possuem baixa quantidade de anticorpos, tornando a doença difícil de detectar com técnicas padrões. Alternativamente a leishmaniose pode se manifestar como uma doença cutânea, que é um problema médico grave, mas é geralmente auto-limitativa, ou como uma doença da mucosa altamente destrutiva, que não é auto-limitativa. Por fim, e mais gravemente, a doença pode se manifestar como uma infecção visceral aguda envolvendo o baço, fígado e nódulos linfáticos, que, se não for tratada, pode ser uma doença fatal. Sintomas de leishmaniose visceral aguda incluem hepatoesplenomegalia, febre, leucopenia, anemia e hipergamaglobulinemia. A leishmaniose é um problema sério na maior parte do mundo, incluindo Brasil, China, África Oriental, índia e áreas do Oriente Médio. A doença é também endêmica na região mediterrânea, incluindo sul da França, Itália, Grécia, Espanha, Portugal e Norte da África. 0 número de casos de leishmaniose aumentou dramaticamente, nos últimos 20 anos, e milhões de casos desta doença existem agora no mundo todo. Cerca de 2 milhões de novos casos são diagnosticados cada ano, 25% dos quais, tratam-se de leishmaniose visceral. Não existem contudo, vacinas ou tratamentos eficazes atualmente disponíveis. A diagnose precisa da leishmaniose é também freqüentemente difícil de conseguir. Existem 20 espécies de Leishmanía que infectam os humanos, incluindo L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. majorr L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensisr L. tropica e L. guyanensis e não existem sinais distintos ou sintomas que indiquem de forma inquestionável a presença de infecção por Leishmanía. Métodos de detecção do parasita foram usados, mas tais métodos não são sensíveis ou práticos. Testes serológicos atuais (usando por exemplo o teste ELISA ou técnicas imunofluorescentes) e testes de pele tipicamente usam parasitas inteiros ou lisados. Tais testes são geralmente insensíveis, irreproduzíveis e afeitos à reação cruzada com uma variedade de outras doenças. Além disso, as preparações empregadas em tais testes são freqüentemente instáveis.

Consequentemente, existe uma necessidade na técnica quanto a vacinas para prevenir a leishmaniose em humanos e cães e para composições terapêuticas aperfeiçoadas para o tratamento da leishmaniose. Existe também uma necessidade quanto a métodos melhorados de detectar infecção por Leishmanía em pacientes e em suprimentos de sangue. A presente invenção preenche essas necessidades e ainda provê outras vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Resumidamente, a presente invenção provê composições e métodos para prevenção, tratamento e detecção da leishmaniose, bem como para estimulação de respostas imune em pacientes. Em um aspecto, são providos polipeptideos, compreendendo pelo menos uma parte imunogênica de um antigeno de Leíshmanía ou de uma variante de tal antigeno, que difira somente em substituições e/ou modificações conservadoras. Em uma modalidade deste aspecto, o antigeno de Leishmania possui a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, o antigeno de Leishmania possui a sequência de aminoácido descrita em SEQ ID NO:4. São também providenciadas, sequências de DNA codificando os polipeptideos acima, vetores de expressão recombinante compreendendo essas sequências de DNA e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com tais vetores de expressão.

Em aspectos relacionados, a presente invenção propicia composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma parte imunogênica de um antigeno de Leishmania (ou uma variante desse antigeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras) como aqui descrito e um veiculo fisiologicamente aceitável. Além disso, vacinas que compreendem pelo menos uma parte imunogênica de um antigeno de Leishmania (ou uma variante de tal antigeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras) como aqui descrito e um intensificador da resposta imune não específico, são também providos. Em uma modalidade desses aspectos, o antígeno de Leishmania tem a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade o antígeno de Leishmania tem a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO: 4 .

Em modalidades adicionais relacionadas, as composições farmacêuticas e vacinas compreendem pelo menos dois polipeptídeos diferentes, selecionados de um grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de um antígeno de Leishmania com a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO:2, ou uma variante de tal antígeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras ; (b) um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de um antígeno de Leishmania com a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID N0:4, ou uma variante de tal antígeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras; (c) um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de um antígeno de Leishmania com a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO: 6 ou uma variante de tal antígeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras; (d) um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de um antígeno de Leishmania com a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO:8 ou uma variante de tal antígeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras; (e) um polipeptideo compreendendo uma parte imunogênica de um antigeno de Leishmania com a sequência de aminoácido ditada na SEQ ID NO:10 ou uma variante de tal antigeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras.

Em outras modalidades relacionadas, as composições farmacêuticas e as vacinas compreendem antigenos de Lelshmania_solúveis.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos para induzir imunidade protetora contra leishmaniose em um paciente, compreendendo a administração a um paciente, de uma composição farmacêutica ou vacina como descrito acima.

Em aspectos adicionais, são providos métodos e kits de diagnóstico para detectar infecção por Leishmania em um paciente. O método compreende: (a) colocar em contato células da derme do paciente com uma composição farmacêutica , como acima descrito; e (b) detectar uma resposta imune na pele do paciente, e a partir dai, detectar infecção por Leishmania o paciente. Os kits de diagnóstico compreendem: (a) uma composição farmacêutica como descrito acima; e (b) um aparelho suficiente para contatar a composição farmacêutica com as células da derme do paciente.

Em mais aspectos, a presente invenção provê métodos para estimular uma resposta imune celular e/ou humoral em um paciente, compreendendo administrar a um paciente uma composição farmacêutica ou vacina como acima descrito.

Em um aspecto relacionado, são providos métodos para tratar um paciente sofrendo de uma doença sensível à estimulação por IL-12, compreendendo administrar ao paciente, uma composição farmacêutica ou vacina conforme descrito acima.

Esses e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes com referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Todas as referências aqui apresentadas estão ora incorporadas por referência em sua totalidade, como se fossem, cada uma delas incorporadas individualmente.

Descrição Sucinta dos Desenhos A figura 1 mostra a estimulação da proliferação de células T obtidas de camundongos BALB/c imunizados contra L. donovani (representados por índice de estimulação )por macrófagos infectados com L. donovani após incubação durante 24, 48 e 72 horas. A figura 2 ilustra perfis de HPLC representativos de peptídeos isolados de Moléculas MHC classe II de macrófagos P388D1. 0 painel A mostra peptídeos isolados de macrófagos não infectados e o painel B mostra peptídeos isolados de macrófagos infectados com L. donovani. As setas no painel B indicam picos de peptídeo presentes somente na preparação de macrófago infectado. A figura 3 ilustra a expressão e purificação de Ldp23 como uma proteína de fusão recombinante. 0 painel A mostra um gel SDS-PAGE manchado com azul de Coomassie de E. coli lisada sem e com indução IPTG, respectivamente, faixa 1 e faixa 2 da expressão de Ldp23. A seta indica a proteína de fusão recombinante. 0 painel B mostra a proteína de fusão seguinte à excisão de um preparado de gel SDS-PAGE, eletroeluição , diálise contra PBS e SDS-PAGE analítico. A figura 4 apresenta uma análise de mancha Setentrional de RNA total preparado de L.donovani, L. major,, L. amazonensls e L. pifanoi com um gene Ldp23 rotulado P32. 1, 2 e 3 referem-se ao RNA obtido de promastigotos na fase de crescimento logarítmica, promastigotos na fase de crescimento estacionária e formas amastigotas, respectivamente. A figura 5 mostra uma análise de manchamento Ocidental de antígenos de promastigoto de L. donovani incubados com soro de coelho pré-imune (faixa A) ou com antisoro de coelho anti-Ldp23 (faixa B). A figura 6 ilustra a expressão superficial de Ldp23 em promastigotos L. donovani vivos. A linha pontilhada mostra a imunofluorescência indireta realizada usando soro de camundongo pré-imune e a linha sólida mostra o resultado obtido com antisoro de Ldp23 anti GST de camundongo. A intensidade da fluorescência foi analisada por FACScan. A figura 7 mostra a estimulação por Ldp23 de proliferação de célula T especifica de Leishmania. Os resultados estão apresentados como número de célula relativo como uma função da intensidade de fluorescência. Células T (105/reservatório) foram purificadas de nódulos linfáticos de camundongos BALB/c imunizados no coxim da pata com promastigotos L. donovani em CFA e foram cultivadas com várias concentrações de Ldp23 recombinante purificado, na presença de células mononucleares de baço de BALB/c normais tratadas com 2 x 105 de Mitomycin C. A proliferação de células T foi medida a 27 horas da cultura. Os valores são expressos como cpm e representam a média da incorporação [H3]TdR de culturas em triplicata. A figura 8 ilustra a produção de citocina induzida pró Ldp23, por células de nódulo linfático de camundongos BALB/c. As culturas foram incubadas com várias quantidades de Ldp23 ou lisado de Leishmania, apresentados como μρ/ml, e foram ensaiadas por ELISA para a produção de interferon-γ (painel A) ou interleucina-4 (painel B) ambos os quais, são mostrados como ng/ml. A figura 9 mostra a amplificação PCR de mRNAs de citocina isolados de PBMC de paciente ML ( painel A) e CL (painel B) antes e após estimulação com polipeptideos representativos da presente invenção. Faixas 0 e - indicam o nivel de produtos PCR no inicio da cultura e após 72 horas de cultura, respectivamente, na ausência de polipeptideo adicionado; faixas Lb, 83a e 83b indicam o nivel de produtos PCR seguinte à cultura de PBMC com lisado de L. braziliensis, Lbhsp83a e Lbhsp83b, respectivamente. A figura 10 apresenta uma comparação dos níveis de interferon-γ (painel A) e TNF-alfa (painel B) nos sobrenadantes de culturas PBMC de 72 horas de indivíduos de controle e infectados por Leishmania, em resposta à estimulação com lisado de parasita ou o polipeptideo indicado. A figura 11 ilustra os níveis de IL-10 p40 (em pg/ml) no sobrenadante de culturas de PBMC de indivíduos infectados com L. braziliensis e controles não infectados de 72 horas, seguinte à estimulação com lisado de promastigoto de parasita (Lb), Lbhsp83a ou Lbsp83b. A figura 12 apresenta as reatividades de soros de infecção de L. braziliensis de pacientes com polipeptideos representativos da presente invenção em um teste ELISA padrão. Os valores estão expressos como absorbância a 405 nm. (nanômetros) As figuras 13A e 13B, ilustram o nível de IL-4 e IFN-γ (em pg/ml) estimulados em culturas de nódulo linfático de camundongo mediante adição de polipeptídeos representativos da presente invenção. A figura 14 mostra o nivel de IFN-γ (em pg/ml) secretado por PBMC de humano infectado com Leishmania e não infectado, estimulado por M15, se comparado aos níveis estimulados por lisado de L. major e L-Rack, um antígeno que não parece ser reconhecido por humanos infectados por Leishmania. A figura 15 mostra o nível de IFN-γ ) em pg/ml secretado por PBMC de humano infectado e não infectado, estimulado por antígenos de Leishmania solúveis (antígenos S), se comparados aos níveis estimulados por lisado de L. major e L-rack. A figura 16 ilustra a proliferação de culturas de nódulo linfático de murinos estimuladas pela adição de polipeptídeos representativos da presente invenção. Os valores são expressos como cpm. A figura 17 mostra a proliferação de PBMC de humano, preparado de indivíduos Leishmania-imunes e não infectados, estimulados por M15 em comparação à proliferação com a proliferação estimulada por lisado de L. major e L-Rack. Os valores são expressos como cpm. A figura 18 ilustra a proliferação de PBMC de humano preparado de indivíduos infectados e não infectados, estimulados por antígenos de Leishmania solúveis, em comparação com a proliferação estimulada por meio de cultura, lisado de L. major e L-Rack. Os valores estão expressos como cpm. A figura 19 apresenta uma comparação de uma sequência Lbhsp83 com sequências homólogas de L. amazonensis (Lahsp83), T. cruzi (Tchsp83) e humanos (Huhsp89).

Descrição Detalhada da Invenção Como observado acima, a pressente invenção é geralmente direcionada à composições e métodos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose, bem como para estimular respostas imune em pacientes. As composições da invenção em questão, incluem polipeptideos que compreendem ao menos uma parte imunogênica de um antígeno Leíshmanla , ou uma variante desse antigeno que difere somente em substituições e/ou modificações conservadoras. Em uma modalidade preferida, composições da presente invenção incluem polipeptideos múltiplos selecionados de modo a prover proteção intensificada contra uma variedade de espécies de Leishmania.

Polipeptideos dentro do escopo da presente invenção incluem, porém sem limitação, polipeptideos que compreendem partes imunogênicas de antigenos de Leishmania com as sequências ditadas na SEQ ID NO: 2 (aqui referidas como M15) , SEQ ID N0:4( aqui referidas como Ldp23), SEQ ID NO:6 (aqui referidas como Lbhsp83), SEQ ID NO:8 (aqui referidas como Lt-210) e SEQ ID NO:10 (aqui referidas como LbeIF4A) . Como aqui usado, o termo "polipeptídeo" engloba cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, (ou seja, antígenos), em que os resíduos de aminoácido estão ligados por ligações covalentes. Assim, um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de um dos antígenos acima, pode consistir totalmente da parte imunogênica, ou pode conter sequências adicionais. As sequências adicionais podem ser derivadas de antígeno de Leishmania nativo ou podem ser heterólogas, e tais sequências podem, (mas não precisam) ser imunogênicas. Um antígeno "tendo" uma sequência particular é um antígeno que contém dentro de sua sequência de comprimento total, a sequência ditada. 0 antígeno nativo, pode ou não conter sequência de aminoácido adicional.

Uma parte 1 imunogênica de um antígeno de Leishmania é uma parte que é capaz de despertar uma resposta imune (ou seja, celular e/ou humoral) em um paciente atualmente ou previamente infectado por Leishmania ( como um humano ou um cão) e/ou culturas de células de nódulo linfático ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC), isoladas de indivíduos atualmente ou previamente infectados por Leishmania. As células nas quais a resposta é solicitada pode compreender uma mistura de tipos de célula ou pode conter células de componente isolado, (incluindo, sem limitação, a células T, células NK, macrófagos, monócitos e/ou células B). Em particular, partes imunogênicas são capazes de induzir proliferação de célula T e/ou uma resposta de citocina com dominância do tipo Thl. (por exemplo, IL-2, IFN-γ, e/ou produção de TNF-alfa por células T e/ou células NK; e/ou produção de IL-12 por monócitos, macrófagos e/ou células B) . Partes imunogênicas de antigenos aqui descritos, podem, geralmente ser identificadas usando técnicas conhecidas aos peritos comuns na técnica, tais como os métodos representativos aqui fornecidos.

As composições e métodos da presente invenção, também englobam variantes dos polipeptídeos acima. Uma "variante" como aqui usado, é um polipeptídeo que difere do antigeno nativo somente nas substituições e/ou modificações conservadoras, tais que a capacidade do polipeptídeo em induzir uma resposta imune é mantida. Tais variantes, podem geralmente ser identificadas por modificação de uma das sequências de polipeptídeo acima e avaliação das propriedades imunogênicas do polipeptídeo modificado, usando por exemplo, procedimentos representativos aqui descritos.

Uma "substituição conservadora" é uma em que substitui-se um aminoácido por um outro aminoácido que possui propriedades similares, tais que um perito na técnica da química de peptídeos, esperaria que a estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo fosse substancialmente inalterada. Em geral, os seguintes grupos de aminoácidos representam alterações conservadoras: (1) ala, pró gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his.

Variantes podem também (ou alternativamente) ser modificadas por exemplo, por supressão ou adição de aminoácidos que têm influência mínima nas propriedades imunogênicas, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma sequência de sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína que co-translacionalmente ou pós-translacionalmente direciona a transferência da proteína. 0 polipeptídeo pode também ser conjugado a um ligador ou outra sequência para farmaceuticamente aceitável facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo poli-His), ou para aumentar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma região FC de imunoglobulina. "Polipeptídeos" como aqui descritos, também incluem polipeptídeos de combinação. Um polipeptídeo de combinação" é um polipeptídeo que compreende pelo menos uma das partes imunogênicas acima e uma ou mais sequências de Leishmania imunogênica adicionais, que são unidas via uma ligação peptídica em uma cadeia de aminoácido única. As sequências podem ser unidas diretamente (ou seja, sem intervenção de aminoácidos) ou podem ser unidas por meio de uma sequência ligadora (por exemplo Gly-Cys-Gly) que não diminui significantemente as propriedades imunogênicas dos polipeptideos componentes.

Em geral, antigenos de Leishmania com propriedades imunogênicas , e sequências de DNA codificando tais antigenos, podem ser preparados usando quaisquer de uma variedade de procedimentos de uma ou mais espécies de Leishmania , incluindo, mas sem limitação, L. donovani, L. chagasir L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. tropica, e L. guuyanensís. Tais espécies são disponíveis, por exemplo, de ATCC, Rockville, MD. Por exemplo peptídeos isolados de moléculas MHC classe II de macrófagos infectados com uma espécie Leishmania, podem ser usados para resgatar os antigenos doadores de Leishmania. Moléculas MHC classe II são expressadas principalmente por células do sistema imune, incluindo macrófagos. Essas moléculas apresentam peptídeos, que são normalmente 13-17 aminoácidos de comprimento, derivados de antigenos estranhos que são degradados em vesículas celulares. A ligação antigenos com peptídeo é a seguir reconhecida por células CD4 T. Consequentemente, peptídeos estranhos isolados de moléculas MHC classe II de, por exemplo, macrófagos de murino infectados por Leishmania podem ser usados para identificar proteínas de Leishmania imunogênicas. Resumidamente, peptídeos derivados de antigenos de Leishmania podem ser isolados por comparação de perfil HPLC de fase inversa de peptídeos extraídos de macrófagos infectados com o perfil de peptídeos extraídos de células não infectadas. Peptídeos que dão origem a picos HPLC distintos somente a macrófagos infectados, podem então ser sequenciados usando, por exemplo, Química Edrnan, como descrito em Edman e Berg, Eur J. Biochem, 80:116-132 (1967). Um fragmento de DMA correspondendo a uma parte de um gene Leishmania que codifica o peptídeo pode então ser ampliado de uma biblioteca cDNA de Leishmania usando um primer de sentido oligonucleotídeo derivado da sequência de peptídeo e um primer antisentido oligo dT. 0 fragmento de DNA resultante pode então ser usado como um ensaio para peneirar uma biblioteca Leishmania para um cDNA de comprimento total ou clone genômico que codifica o antígeno de Leishmania . Tais peneiramentos podem geralmente ser realizados usando técnicas bem conhecidas aos peritos comuns na arte, tais como os descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Esta abordagem pode ser usada para identificar um antígeno de Leishmania donovani (aqui referido como Ldp23) . A sequência de uma molécula de DNA codificando Ldp23 é provida na SEQ ID NO: 3 e a sequência de aminoácido de Ldp23 é provida na SEQ ID NO: 4. Usando os métodos aqui descritos, Ldp23 demonstrou induzir uma resposta Thl imune em células T preparadas de camundongos infectados por Leishmania.

Alternativamente, um cDNA de Leishmania ou biblioteca de expressão genômica pode ser peneirada com soro de um indivíduo infectado com Leishmania, usando técnicas bem conhecidas aos peritos comuns na técnica. Moléculas de DNA codificando antígenos reativos podem então ser usados para expressar o antígeno recombinante para purificação. As propriedades imunogênicas dos antígenos de Leishmania purificados podem então ser avaliadas usando, por exemplo, os métodos representativos aqui descritos.

Por exemplo soro de camundongos infectados com Leishmania pode ser usado para peneirar uma biblioteca de cDNA preparada de amastigotos de Leishmania. Clones reativos podem então ser expressos e proteínas recombinantes ensaiadas quanto a habilidade de estimular células T ou células NK derivadas de indivíduos imunes à Leishmania (ou seja, indivíduos com evidência de infecção, como documentado por reatividade sorológica positiva com anticorpos específicos para Leishmania e/ou uma resposta DTH específica para Leishmania sem sintomas clínicos de leishmaniose). Este procedimento, pode ser usado para obter-se uma molécula de DNA recombinante codificando o antigeno de Leishmania designado M15. A sequência de uma tal molécula de DNA é provida na SEQ ID N0:1, e a sequência de aminoácido da proteína codificada é provida na SEQ ID NO:2.

Um procedimento similar, pode ser usado para isolar uma molécula de DNA genômico codificando um antigeno de Leishmania braziliensis aqui referido como Lbhsp83. Mais especificamente, um clone genômico codificando Lbhsp83 pode ser isolado por rastreamento de uma biblioteca de expressão L. braziliensis com soro de um indivíduo infectado por Leishmania. 0 DNA codificando Lbhsp83 é homólogo ao gene codificando a proteína de choque térmico eucariótica de 83 kD. A sequência de uma molécula de DNA codificando de perto todo os Lbhsp83 está apresentada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de aminoácido codificada é provida na SEQ ID NO: 6. Usando os métodos descritos abaixo, Lbhsp83 descobriu-se que estimula a proliferação, e um perfil de citocina misto Thl e Th2, em PBMC isolado de pacientes infectados por L. braziliensis. Consequentemente, Lbhsp83 é um antigeno de Leishmania imunogênico. Regiões de Lbhsp83 que não são conservadas com o gene de mamífero, descobriu-se que são particularmente potentes para estimulação de célula T e ligação a anticorpo. Tais regiões podem ser identificadas, por exemplo, por inspeção visual da comparação da sequência fornecida na figura 19.

Esta abordagem pode também ser utilizada para isolar uma molécula de DNA codificando um antigeno L. tropica referido aqui como Lt-210. A preparação e caracterização de Lt-210 e as porções imunogênicas do mesmo (tal como Lt-1 e sequências imunogênicas de repetição e não repetição, está descrita em detalhe no Pedido Número de Série 08/511.872, depositado em 4 de agosto de 1995. A sequência de uma molécula de DNA codificando Lt-1 é provida na SEQ ID NO:7 e a sequência de aminoácido codificado está apresentada na SEQ ID NO: 8. A abordagem acima pode ainda ser usada para isolar uma molécula de DNA codificando um antigeno L. braziliensis aqui referido como LbeIF4A. Resumidamente, um tal clone pode ser isolado por peneiração de uma biblioteca de expressão L. braziliensis com soro obtido de um paciente afetado com leishmaniose de mucosa e análise dos antigenos reativos para a capacidade de estimular as respostas proliferativas e produção de citocina Thl preferencial em PBMC isolado de pacientes infectados por Leishmania, como abaixo descrito. A preparação e caracterização de LbeIF4A está descrita em detalhe no Pedido de Patente U.S. n°s de série 08/454.036 e 08/488.386, que são continuações parciais do Pedido de Patente U.S. n° de série 08/232/534, depositado em 22 de abril de 1994. A sequência de uma molécula de DNA codificando LbeIF4A é provida na SEQ ID NO:9 e a sequência de aminoácido codificada está apresentada na SEQ ID NO: 10. Homóloqos de LbeIF4A, tais como os encontrados em L. major, podem também ser isolados usando esta abordagem, e estão dentro do escopo da presente invenção.

As composições da presente invenção, podem também, ou alternativamente, conter antigenos de Leishmania solúveis. Como aqui usado, "antigenos de Leishmania solúveis" refere-se a uma mistura de pelo menos 8 antigenos de Leishmania diferentes, que podem ser isolados do sobrenadante de promastigotos de Leishmania de quaisquer espécies cultivadas por 8-12 horas em meio isento de proteína. Resumidamente, os organismos são crescidos em fase log posterior em meio complexo com soro até que atinjam uma densidade de 2-3 x 107 organismos viáveis por ml de meio. Os organismos são cuidadosamente lavados para remover os componentes do meio e ressuspensos a 2-3 x 107 organismos viáveis por ml de meio isento de soro definido consistindo de partes iguais de RPMI 1640 e meio 199, ambos da Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Após 8-12 horas, o sobrenadante contendo antigenos de Leishmania solúveis é removido, concentrado 10 vezes e dializado contra solução salina tamponada com fosfato por 24 horas. A presença de pelo menos oito antigenos diferentes dentro da mistura de antigenos de Leishmania, pode ser confirmada usando SDS-PAGE (ou seja, mediante observação de pelo menos 8 faixas diferentes). As propriedades imunogênicas de antigenos de Leishmania solúveis podem ser confirmadas por avaliação da capacidade da preparação em obter uma resposta imune em culturas de células de nódulo linfático e/ou células monocucleares de sangue periférico (PBMC) isoladas de indivíduos atualmente ou previamente infectados por Leishmania. Tal avaliação pode ser realizada como descrito abaixo.

Apesar do método de preparação, os antigenos descritos aqui são imunogênicos. Em outras palavras, os antigenos (e partes imunogênicas do mesmo) são capazes de obter uma resposta imune em culturas de células de nódulo linfático e/ou células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) isoladas de indivíduos atualmente ou previamente infectados por Leishmania. Mais especificamente, os antigenos e partes imunogênicas do mesmo, têm a capacidade de induzir a proliferação de célula T e/ou de obter uma resposta de citocina dominantemente do tipo Thl (por exemplo, produção de IL-2, IFN-γ e/ou TNF-alfa por células T e/ou células NK; e/ou produção de IL-12 por monócitos macrófagos e/ou células B em células isoladas de indivíduos infectados atualmente ou previamente por Leishmania. Um indivíduo infectado por Leishmania pode ser atribulado com uma forma de leishmaniose (como sub- clinica, cutânea, mucosa ou visceral ativa) ou pode ser assintomática. Tais indivíduos podem ser identificados usando métodos conhecidos aos peritos comuns na técnica. Indivíduos com leishmaniose podem ser identificados com base em descobertas clínicas associadas com pelo menos um dos seguinte: isolamento do parasita das lesões, um teste de pele positivo com lisado de Leishmania, ou um teste sorológico positivo. Indivíduos assintomáticos são indivíduos infectados que não possuem sinais ou sintomas da doença, mas tais indivíduos podem ser identificados com base em um teste sorológico positivo e/ou teste de pele com lisado de Leishmania. 0 termo "PBMC" que se refere a uma preparação de células nucleadas que estão presentes o sangue periférico, englobam ambas as misturas de células e preparações de um ou mais tipos de célula purificados. PBMC pode ser isolado por centrifugação de densidade através, de por exemplo, Ficol™ (Winthrop Laboratories, New York). Cultuas de nódulo linfático podem, geralmente, ser preparadas imunizando-se camundongos BALB/c (por exemplo, no coxim da pata traseira) com promastigotos de Leishmania, emulsifiçados em adjuvante completo de Freund. A drenagem dos nódulos linfáticos pode se excisada seguindo imunização e as células T podem ser purificadas em uma coluna Ig anti-camundongo para remover as células B, seguido por uma passagem por uma coluna Sephadex G10 para remover os macrófagos. De forma semelhante, células de nódulo linfático, podem ser isoladas de um humano seguinte à biópsia ou remoção cirúrgica do nódulo linfático. A capacidade de um polipeptídeo (por exemplo, antígeno de Leishmania ou uma parte ou outra variante do mesmo) em induzir a reposta em PBMC ou culturas de célula de nódulo linfático pode ser avaliada contatando-se as células com o polipeptídeo e medindo-se uma resposta adequada. Em geral, a quantidade de polipeptídeo que é suficiente para a avaliação de cerca de 2 x 105 de células varia de cerca de 10 ng a cerca de 100 μg, e preferivelmente é de cerca de l-10μg. A incubação do polipeptídeo com células é tipicamente realizada a 37°C por cerca de 1-3 dias. Seguinte à incubação com polipeptídeo, as células são ensaiadas para uma resposta apropriada. Caso a resposta for uma resposta proliferativa, qualquer de uma variedade de técnicas bem conhecidas aos versados na técnica comum pode ser empregada. Por exemplo as células podem ser expostas a um pulso de timidina radioativa e medindo a incorporação de rótulo em DNA celular. Em geral, um polipeptídeo que resulta em pelo menos um aumento de três vezes, na proliferação acima do segundo plano, (ou seja, proliferação observada para células cultivadas sem polipeptídeo) é considerada capaz de induzir proliferação .

Alternativamente, a resposta a ser medida pode ser a secreção de uma ou mais citocinas (tais como interferon-γ, (IFN-γ), interleucina-4 (IL-4), interleucina-12 (p70 e/ou p40), interleucina-2- (IL-2) e/ou fator α de necrose tumoral (TNF-α) ou o nível de mRNA que codifica uma ou mais citocinas especificas. Em particular, a secreção de interferon-γ, interleucina-2, fator-α de necrose tumoral e/ou interleucina-12 é indicação de uma resposta Thl, que é responsável para o efeito protetor contra Leishmania. Ensaios para quaisquer das citocinas acima, podem geralmente ser realizados usando métodos conhecidos aos peritos comuns na técnica, tal como um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Anticorpos adequados par uso em tais ensaios, podem ser obtidos de uma variedade de fontes, tais como Chemicon, Temucula, CA e PharMingen, San Diego, CA, e podem geralmente ser usados de acordo com as instruções do fabricante. 0 nível de mRNA codificando uma ou mais citocinas específicas pode ser avaliada, por exemplo, por amplificação mediante reação em cadeia de polimerase (PCR) . Em geral, um polipeptídeo que é capaz de induzir em uma preparação de cerca de 1-3 x 105 células a produção de 30 pg/ml de IL-12, IL-4, IFN-γ, TNF-α ou IL-12 p40, ou 10 pg/ml de IL-12 p70, é considerado capaz de estimular produção de uma citocina.

Partes irnunogênicas dos antigenos descritos aqui, podem ser preparados e identificados usando técnicas conhecidas, tais como as resumidas em Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (Raven Press, 1993) e referências ali citadas. Tais técnicas incluem rastreamento de polipeptídeos derivados de antigeno nativo para propriedades irnunogênicas usando, por exemplo, as técnicas representativas aqui descritas. Uma parte imunogênica de um polipeptídeo é uma parte que, dentro de tais ensaios representativos, gera uma resposta imune (por exemplo, proliferação e/ou produção de citocina) que é substancialmente similar àquela gerada pelo antigeno de comprimento total. Em outras palavras, uma parte imunogênica de um antigeno pode gerar pelo menos cerca de 25%, e preferivelmente pelo menos cerca de 50% da resposta gerada pelo antigeno de comprimento total nos ensaios modelo aqui descritos.

Partes e outras variantes dos antigenos de Leishmania imunogênicos podem ser gerados por meios sintéticos ou recombinantes. Polipeptídeos sintéticos com menos que cerca de 100 aminoácidos, e geralmente menos que cerca de 50 aminoácidos, podem ser gerados usando técnicas bem conhecidas aos versados na técnica comum. Por exemplo, tais polipeptídeos podem ser sintetizados usando quaisquer das técnicas comercialmente disponíveis de fase sólida, tal como método de síntese de fase sólida de Merrifield, onde os aminoácidos são adicionados em sequência a uma cadeia de aminoácido crescente. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc 85:2146, 1963. Equipamento para síntese automatizada de polipeptídeos está comercialmente disponível de fornecedores tais como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, e podem ser operados de acordo com as instruções do fabricante.

Polipeptídeos recombinantes contendo partes e/ou variantes de um antígeno nativo, podem ser facilmente preparados de uma sequência de DNA codificando o antígeno. Por exemplo, sobrenadantes de sistemas hospedeiro/vetor adequados, que secretam proteína recombinante em meio de cultura, podem ser primeiro -concentrados usando um filtro comercialmente disponível. Seguinte à concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada, tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca de íon. Finalmente uma ou mais etapas HPLC de fase inversa podem ser empregadas para purificar ainda mais uma proteína recombinante.

Em geral, qualquer de uma variedade de vetores de expressão, conhecidos aos versados na técnica comum, podem ser empregados para expressar os polipeptídeos recombinantes desta invenção. Expressão pode ser conseguida em qualquer célula hospedeiro adequada, que tenha sido transformada ou transfectada com um vetor de expressão contendo uma molécula de DNA que codifica um polipeptideo recombinante. Células hospedeiro adequadas incluem procariotes, levedura e células eucarióticas superiores. Preferivelmente, as células hospedeiras empregadas são E. coli, levedura ou uma linha celular de mamífero, tal como COS ou CHO. As sequências de DNA expressadas desta maneira, podem codificar antígenos de ocorrência natural, partes de antígenos de ocorrência natural ou outras variantes do mesmo. Por exemplo, variantes de um antígeno nativo, podem ser geralmente preparados usando técnicas de mutagênese padrão, tais como uma mutagênese específica de sítio direcionado para oligonucleotídeo, e seções da sequência de DNA podem ser removidas para permitir preparação de polipeptídeos truncados.

Em alguns aspectos da presente invenção, descrita em detalhe abaixo, os polipeptídeos e/ou antígeno de Leishmania solúveis podem ser incorporados em composições farmacêuticas ou vacinas. Composições farmacêuticas compreendem um ou mais polipeptídeos, cada um dos quais, pode conter uma ou mais das sequências acima (ou variantes da mesma) e um veículo fisiologicamente aceitável. Vacinas compreendem um ou mais dos polipeptídeos acima e um intensificador da resposta imune não específico, como um adjuvante (por exemplo LbeIF4A, interleucina-12 ou outras citocinas) ou um lipossoma (no interior do qual, o polipeptideo é incorporado). Vacinas podem adicionalmente conter um veículo de liberação, como uma microsfera biodegradável (apresentada, por exemplo, na Patente U.S. n°s. 4.897.268 e 5.075.109). Composições farmacêuticas e vacinas dentro do escopo da presente invenção podem também conter outros antígenos de Leishmania, ou incorporado em uma combinação de polipeptídeo ou presente dentro de um ou mais polipeptídeos separados.

Alternativamente, uma vacina pode conter DNA codificando um ou mais dos polipeptídeos como descritos acima, de modo que o polipeptídeo seja gerado in situ. Em tais vacinas, o DNA pode estar presente dentro de quaisquer de uma variedade de sistemas de liberação conhecidos aos versados comuns na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucleico, sistemas de expressão de bactéria e viral. Sistemas de expressão de ácido nucleico apropriados contém a s sequências de DNA necessárias para expressão no paciente (tal como um promotor adequado e sinal de terminação). Sistemas de liberação bacteriana envolvem a administração de uma bactéria (como Bacilo de Calmette e Guerrin) que expressa uma parte imunogênica do polipeptídeo em sua superfície celular. Em uma modalidade preferida, o DNA pode ser introduzido usando um sistema de expressão viral (por exemplo vaccinia ou outro vírus de bexiga, retrovírus, ou adenovírus), que podem envolver o uso de um vírus de replicação competente não patogênico (defeituoso). Técnicas para incorporar DNA em tais sistemas de expressão, são bem conhecidos aos versados na técnica comum. 0 DNA pode também ser "despido" como descrito, por exemplo em Ulmer et al., Science 259:1745-1749 (1993) e revisto por Cohen Science 259:1691-1692 (1993). A ascendência de DNA nu pode ser aumentada revestindo o DNA sobre contas biodegradáveis, que são eficientemente transportadas nas células.

Embora qualquer veiculo adequado conhecido aos versados comuns na técnica possa ser empregado nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de veiculo irá variar dependendo do modo de administração. Para administração parenteral, tal como injeção subcutânea, o veiculo de preferência compreende água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, quaisquer dos veículos acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, podem ser empregados. Microsferas biodegradáveis (por exemplo galactídeo poliláctico) pode também ser empregado, como veículos para as composições farmacêuticas desta invenção. Microsferas biodegradáveis adequadas estão apresentadas, por exemplo nas Patentes U.S. n°s 4.897.268 e 5.075.109.

Qualquer um de uma variedade adjuvantes, pode ser empregado nas vacinas desta invenção para intensificar de modo não específico, a resposta imune. A maioria dos adjuvantes contém uma substância designada para proteger o antigeno de catabolismo rápido, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador não específico de respostas imunes, tal como Lipídeo A, Bordella pertussis ou Mycobacterlum tuberculosis. Adjuvantes adequados são comercialmente disponíveis de por exemplo, Adjuvante Incompleto de -Freund e Adjuvante Completo (Difco Laboratories, Detroit MI), Adjuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NF) , alumínio, microsferas biodegradáveis, lipídeo A monofosforílico e quilo A. Adjuvantes preferidos incluem LbeIF4A, IL-12 e outras citocinas, tais como IFN-γ ou fator estimulante de colônia macrófago-granulócito (GM-CSF). Em virtude de sua capacidade de induzir uma resposta imune Thl exclusiva, o uso de LbeIF4A e variantes deste, como um adjuvante nas vacinas da presente invenção , é particularmente preferido.

Em uma modalidade preferida, composições da presente invenção incluem polipeptídeos múltiplos selecionados de modo a prover proteção melhorada contra uma variedade de espécies Leishmania. Tais polipeptídeos podem ser selecionados com base nas espécies de origem do antigeno nativo ou com base em um alto grau de conservação da sequência de aminoácido entre espécies diferentes de Leishmania. Uma combinação de polipeptídeos individuais pode ser particularmente eficaz como uma vacina profilática e/ou terapêutica porque: (1) a estimulação da proliferação e/ou produção de citocina por polipeptideos individuais pode ser aditiva, (2) a estimulação da proliferação e/ou produção de citocina por polipeptideos individuais pode ser sinérgica, (3) polipeptideos individuais podem estilar perfis de citocina de tal modo, a serem complementares ente si e/ou (4) polipeptideos individuais podem ser complementares uns aos outros quando alguns deles são expressos mais abundantemente nas espécies ou cepas individuais de Leishmania responsáveis pela infecção. Uma combinação preferida contém polipeptideos que compreendem partes imunogênicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, L6-1 e LbeIF4A. Alternativamente, ou além disso, a combinação podem compreender antigenos de Leishmania solúveis.

As composições farmacêuticas e vacinas acima podem ser usadas, por exemplo, para induzir imunidade protetora contra Leishmania em um paciente tal como um humano ou um cão para evitar leishmaniose. Doses apropriadas e métodos de administração para estas finalidades estão descritos em detalhes abaixo.

As composições farmacêuticas e vacinas aqui descritas, podem também ser usadas para estimular uma resposta imune, que pode ser celular e/ou humoral, em um paciente. Para pacientes infectados por Leishmania, a resposta imune que pode ser gerada inclui uma resposta imune Thl preferencial (ou seja uma resposta caracterizada pela produção das citocinas interleucina-1/ interleucina-2-, interleucina-12 e/ou interferon-γ, bem como fator-α de necrose tumoral). Para pacientes não infectados, a resposta imune pode ser a produção de interleucina-12 e/ou interleucina-2- ou a estimulação de células T gama delta. Em quaisquer categorias de paciente, a resposta estimulada pode incluir produção de IL-12. Tais respostas podem também ser obtidas em amostras biológicas de PBMC ou componentes deste, derivados de indivíduos infectados ou não por Leishmania. Como acima observado, ensaios para quaisquer das citocinas acima, podem geralmente ser realizados usando métodos conhecidos aos peritos comuns na técnica, tais como um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

Composições farmacêuticas adequadas e vacinas para uso neste aspecto da presente invenção são os que contém pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma parte imunogênica de LbeIF4A (ou uma variante deste) , M15, antigenos de Leishmania solúveis, e/ou Ldp23 (ou uma variante deste. Polipeptídeos compreendendo uma parte imunogênica de Lbhsp83 e/ou Lt-1 pode também ser usado, em combinação com um polipeptídeo que contem pelo menos uma parte imunogênica de LbeIF4A. De preferência, os polipeptídeos empregados nas composições farmacêuticas e vacinas são complementares, como acima descrito. Uma combinação particularmente preferida contém polipeptideos que compreendem partes imunogênicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 e LbeIF4A. Antigenos de Leishmania solúveis, com ou sem polipeptídeo adicionais podem também ser empregados.

As composições farmacêuticas e vacinas descritas aqui, podem também ser usadas para tratar um paciente perturbado com uma doença sensível à estimulação com IL-12 . 0 paciente pode ser qualquer animal de sangue quente, tal como um humano ou um cão. Tais doenças incluem infecções (que podem ser por exemplo bacterianas, virais ou de protozoários) ou doenças como câncer. Em uma modalidade, a doença é leishmaniose e o paciente pode apresentar sintomas clínicos ou pode ser assintomático. Em geral, a receptividade de uma doença particular à estimulação de IL-12 pode ser determinada pela avaliação do efeito de tratamento com uma composição farmacêutica ou vacina da presente invenção em correlatos clínicos de imunidade. Por exemplo, se o tratamento resulta em uma resposta TH1 elevada ou a conversão de um perfil Th2 em um Thl, com aperfeiçoamento de acompanhamento clínico no paciente tratado, a doença é sensível à estimulação por IL-12/ A administração de polipeptídeo pode ser como descrito abaixo, ou pode se estender por um período de tempo maior, dependendo da indicação. Preferentemente, os polipeptideos empregados nas composições farmacêuticas e vacinas são complementares, como acima descrito. Uma combinação preferida particularmente contém polipeptideos que compreendem partes imunogênicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 e LbeIF4A. Antígenos de Leishmania solúveis com ou sem polipeptideos adicionais, podem também ser empregados.

Vias e frequência de administração, bem como dosagens, para os aspectos acima da presente invenção irão variar de indivíduo para indivíduo e podem se alinhar aos atualmente usados na imunização contra outras infecções, incluindo infecções por protozoário, virais e bacterianas. Em geral, as composições farmacêuticas e vacinas podem ser administradas ou injeção (por exemplo, intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasal (por exemplo, por aspiração) ou na forma oral. Entre 1 e 12 doses, pode ser administrado durante um período de 1 ano. Para vacinação terapêutica, (ou seja tratamento de um indivíduo infectado), 12 doses são preferivelmente administradas, em intervalos de 1 mês. Para uso profilático, 3 doses são preferentemente administradas, a intervalos de 3 meses. Em quaisquer casos, vacinações de reforço podem ser dadas periodicamente a seguir. Protocolos alternados podem ser adequados para pacientes individuais. Uma dose adequada é uma quantidade de polipeptídeo ou DNA que, quando administrado como descrito acima, é capaz de elevar uma resposta imune em um paciente imunizado, suficiente para proteger o paciente da leishmaniose por pelo menos 1-2 anos. Em geral, a quantidade de polipeptideo presente em uma dose (ou produzida in situ pelo DNA em uma dose) varia de cerca de 100 ng a cerca de 1 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 μρ a cerca de 100 μρ. Quantidades de dose adequadas irão variar, com o tamanho do paciente, mas tipicamente, ficarão na faixa de cerca de 0,1 ml a cerca de 5 ml.

Em um outro aspecto, esta invenção provê métodos para uso de um ou mais polipeptideos descritos acima para diagnosticar infecção por Leishmania em um paciente fazendo uso de teste de pele. Como aqui usado, um "teste de pele" é qualquer ensaio realizado diretamente em um paciente no qual uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) (tal como endurecimento acompanhada por vermelhidão) é medida seguinte a injeção intradérmica de um ou mais polipeptideos como acima descrito. Tal injeção pode ser conseguida usando qualquer dispositivo adequado suficiente para contatar o polipeptideo ou polipeptideos com células da derme do paciente, tal como uma seringa de tuberculina ou seringa de 1 ml. Preferivelmente, a reação é medida pelo menos 48 horas após a injeção, mais preferivelmente 72 horas após a inj eção. A reação DTH é uma resposta imune mediada por célula, que é maior em pacientes que foram expostos previamente a um antigeno de teste (ou seja, uma parte imunogênica de um polipeptideo empregado, ou uma variante deste). A resposta pode ser medida visualmente usando uma régua. Em geral, o endurecimento que é maior do que cerca de 0,5 cm de diâmetro, preferivelmente maior que cerca de 1,0 cm de diâmetro, é uma resposta positiva, indicativa de infecção por Leishmania, que pode ou não ser manifestada como uma doença ativa.

Os polipeptídeos desta invenção são preferivelmente formulados, para uso em um teste de -pele, como composições farmacêuticas contendo pelo menos um polipeptideo e um veiculo fisiologicamente aceitável, como descrito acima. Tais composições tipicamente contém um ou mais dos polipeptídeos acima, em uma quantidade que varia de cerca de 1 μg a 100 μg, preferivelmente de cerca de 10 μg a 50 μρ em um volume de 0,1 ml. De preferência, o veículo empregado em tais composições farmacêuticas é uma solução salina com preservativos adequados, tais como fenol e/ou Tween 8 0™.

Os Exemplos a seguir são oferecidos à guisa de ilustração e não num sentido limitativo. EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de M15 Este exemplo ilustra a preparação de um antígeno de Leishmania M15, tendo a sequência fornecida em SEQ ID NO:2.

Uma biblioteca de expressão cDNA de amastigoto (cepa Friedlan) L. major preparada no vetor λΖΑΡΙΙ (Stratagene, La Jolla CA) foi peneirada de acordo com as instruções do fabricante usando soro obtido de camundongos BALB/c infectados com L. major (8 semanas pós inoculação). Aproximadamente 40.000 placas foram peneiradas e quatro clones expressando antigenos reativos foram purificados até a homogeneidade por duas etapas subsequentes de peneiramento de baixa densidade. Inserções de fagemídeo Bluescript foram excisados de clones positivos para análise posterior. Um fragmento de restrição EcoRI/SstII da terminação 5' de um inserção de cDNA parcial isolado durante a primeira rodada do peneiramento (pLmal-1) foi subseqüentemente usado como uma ensaio para ser novamente passado por crivo quanto a clones contendo inserções cDNA de comprimento total. O teste foi rotulado até alta atividade especifica (~ 109 cpm^g) com [a-P32]dCTP usando o método básico aleatório e foi usado para crivar -10.000 placas da biblioteca de expressão L. major .descrita acima. Clones positivos foram comparados por digestão de enzima de restrição e o clone com a maior inserção (pfll-1) foi escolhido para análise subsequente.

Análises de sequência de DNA foram realizadas em um sequenciador automático Applied Biosystems usando polimerase Taq e corante acoplado aos terminadores ddNTP ou primers sequenciadores rotulados com corante. A sequência completa da inserção 2685 bp foi determinada usando uma combinação de sequenciamento direcionado ao primer e por sequenciamento de uma série de subclones de exclusão Exonuclease III de sobreposição, gerados usando o sistema Erase-a-base (Promega, Madison WI). A sequência desta inserção está providenciada na SEQ ID N0:1, e a sequência de aminoácido deduzida é provida em SEQ ID NO:2. A inserção completa do clone pfl-1 foi excisado por digestão com BamHI/Kpnl e foi subclonado na estrutura em pQE31 (QUIAGEN) digerido com BamHI/Kpnl para gerar o pM251A de construção. E. coli contendo este construtor estimulavelmente expressado de altos níveis do antígeno L. major codificado por pfll-1 (designado como M15) com adição de um rótulo 6-histidina no terminal amino. Culturas de grande volume (500 ml) de células hospedeira E. coli contendo o construtor pM151A foram induzidas para expressar proteína recombinante mediante adição de 2mM de IPTB na fase de crescimento log-mediana. O crescimento continuou por 4 a 5 horas e as bactérias foram a seguir formadas em pelotas e lavadas uma vez com PBS frio. As bactérias foram ressuspensas em 20 ml de tampão de lise (50 mM Na2HP04, pH 8,0 300 mM de NaCl, 10 mM de β-mercaptoetanol) contendo 20 mg de lisozima e foram lisadas por incubação de 1 hora a 4°C seguido por breve tratamento de som. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 10.000 xg por 10 minutos e embora a proteína recombinante fosse distribuída igualmente entre as frações solúveis e insolúveis, o material insolúvel foi descartado neste ponto. A proteína recombinante contendo o rótulo de histidina amino terminal foi purificada por afinidade usando resina Ni-NTA (QUIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 8 ml de resina Ni-NTA ressuspensa em tampão de lise foi adicionada à fração lisada solúvel e foi feita a ligação com misturação constante por 1 hora a 4°C. A mistura foi a seguir carregada em uma coluna de fluxo de gravidade e o material não aglutinado foi deixado passar. A matriz Ni-NTA foi lavada 3 vezes com 25 ml de tampão de lavagem (50 mM Na2HP04, pH 6, 0 300 mM de NaCl, 10 mM de β-mercaptoetanol). O material eluído foi a seguir dializado conta 3 trocas de PBS, filtrado para tornar estéril e armazenado a -20°C. A proteína recombinante purificada foi demonstrada por análise SDS-PAGE como isenta de qualquer quantidade significativa da proteína E. coll. Um pequeno número de faixas de menor peso molecular foram dados como produtos proteolíticos do antígeno L. major com base em sua reatividade por análise de manchamento Western. Um anti-soro policlonal de alta titulação contra M15 foi gerado em coelhos por injeção repetida subcutâneamente da proteína recombinante. A análise de mancha Western dos lisados de promastigotos e amastigotos de L. major usando este anti-soro indicou que a proteína é expressada constitutivamente por todo o ciclo de vida do parasita. EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE Ldp23 Este exemplo ilustra a preparação de um antígeno de Leishmania Ldp23, com a sequência provida na SEQ ID NO:4. A Purificação de Peptídeos associados com MHC Classe II de Macrófagos P388D1 Infectados com L. donovani Para apurar a infecção in vitro de macrófagos que invadiríam suas moléculas MHC classe II com peptídeos parasitas, experimentos iniciais foram realizados para testar a capacidade de linhagem de célula P388D1 de macrófagos infectados com L. donovani em apresentar antígenos parasitas para células T específicas de L. donovani. Esta linhagem de células de macrófago foi escolhida porque ela possui o mesmo haplotipo H-2 do camundongo BALB/c, que é uma linhagem de camundongo moderadamente susceptível à infecção por L. donovani e selecionada para conduzir os ensaios in vivo. Usando uma proporção de 3-5 parasitas por célula e uma incubação inicial a temperatura ambiente por 4-6 horas, a seguir por 37°C por 24-48 horas, quase 90% dos macrófagos foram infectados. O nivel de expressão de molécula MHC classe II como determinado por análise FACS indicou que a infecção não ocasionou um efeito sobre os níveis de expressão MHC classe II quando comparado com células de controle não infectadas.

Para testar a capacidade das células P388D1 infectadas com L. donovani em apresentar antígenos de parasita, macrófagos foram infectados como indicado acima e incubados a 26°C por 6 horas, e a seguir em 37°C por ou 24, 48 ou 72 horas. Em cada um desses horários, as células não aderentes e parasitas livres foram lavados e as células aderentes foram mecanicamente deslocadas, lavadas e fixadas com paraformaldeído. Essas células foram a seguir usadas como células apresentando antígeno (APCs) para células T de nódulo linfático purificadas de camundongos BALB/c imunizados com promastigotos L. donovani. Para gerar essas células T específicas para anti- L. donovani, camundongos BALB/c (H-2d) de ambos os sexos (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram imunizados em 8 a 14 semanas de idade no coxim da pata traseira com 5-10 x 106 de promastigotos de L. donovani emulsifiçados em adjuvante completo de Freund (CFA) (Difco Laboratories, Madison, MI) como descrito em Rodrigues et al., Parasite Immunol. 14:49(1992). Os nódulos linfáticos de drenagem foram excisados 8 dias após a imunização e as células T foram purificadas em uma coluna Ig anti-camundongo para remover as células B, como descrito em Bunn-Moreno e Campos-neto, J. Immunol. 127:427 (1981), seguido por uma passagem por uma coluna Sephadex G10 para remover os macrófagos. 0 índice de estimulação foi calculado dividindo-se o cpm obtido pelas células cultivadas na presença de macrófagos P388D1 infectados, pelo cpm obtido para as células cultivadas na presença de macrófagos não infectados, mas submetidos as mesmas condições dos macrófagos infectados. Os resultados mostrados na Figura 1 indicam que antígenos de parasita no processo de macrófago P388D1 infectados com L. donovani e a apresentação ótima ocorre após 48 horas de infecção. Nenhuma estimulação das células T pelos macrófagos não infectados foi observada.

Para isolar os peptídeos L. donovani associados com MHC classe II, macrófagos P388D1 foram infectados com promastigotos de L. donovani para uma incubação inicial de 6 horas a temperatura ambiente. As culturas foram a seguir transferidas para 37°C para o restante do período de incubação de 48 horas. A uma relação de 3-5 parasitas por macrófago quase 90% dos macrófagos foram infectados após 24 horas de incubação a 37°C.

As moléculas MHC classe II foram a seguir purificadas por afinidade. Aproximadamente 1,5 x IO10 de macrófagos infectados com L. donovani ou um número igual de macrófagos P388D1 não infectados foram usados para cada purificação. As células foram colhidas, lavadas com PBS e incubadas por 30 minutos em tampão de lise frio (PBS, 1% Nonidet P40, 25 mM de iodoacetamida, 0,04% de azida de sódio, 1 mM aprotinina e lmM PMSF) O material insolúvel foi removido por centrifugação a 40.000g por 7 hora e o sobrenadante foi reciclado durante a noite a 4°C sobre uma coluna Sepharose (H-2d) de moléculas anti-MHC classe 11(5 ml). (coluna Proteína G Sepharose à qual o anticorpo monoclonal MK-D6 foi aderido). Os sobrenadantes da cultura de células de hibridoma MK-D6 (ATTC, Rockville, MD) foram empregadas como a fonte para anticorpo monoclonal (H-2d) classe anti-MHC. A coluna foi lavada com 50 ml de tampão de lise e a seguir com 50 ml de PBS contendo 0,5% de detergente octil glicopiranosídeo. as moléculas aderidas foram eluídas da coluna com ácido acético 1M e 0,2% de NaCl. As moléculas de MHC/peptídeo foram separadas do IgG (anticorpo monoclonal MK-D6) usando uma unidade de filtro Centricon 100 (Amicon Division, W.R. Grace & Composição., Beverly, MA). Os peptídeos foram a seguir dissociados das moléculas classe II mediante adição de ácido acético 2J, seguido por separação usando uma unidade de filtro Centricon 10. A preparação de peptídeo resultante, presente na amostra de baixo peso molecular, foi a seguir seca usando um concentrador de velocidade a vácuo (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY).

Os peptideos foram redissolvidos em 200 μΐ de 0,05% de TFA e separados por cromatografia liquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) usando uma coluna de 2,1 mm x 25 cm Vydac C-18 a uma velocidade de fluxo de 0,15 m/min, empregando um gradiente de acetonitrila 1 a 30% (60 min) seguido por um gradiente de 30 a 60% (30 min) e a seguir um gradiente de 60 a 80% (90-110 min.). Células P388D1 não infectadas foram da mesma forma processadas para servir como um controle de segundo plano para peptideos associados com MHC classe II endógenos. A figura 2 mostra uma experiência representativa; quatro picos distintos que estão presentes somente no material isolado de macrófagos infectados (painel B) e não no material isolado de macrófagos não infectados (painel A) estão indicados. À parte de três extrações de peptídeo independentes, vinte e cinco picos de peptídeo HPLC distintos foram isolados de macrófagos infectados com L. donovani e foram submetidos à análise de sequência de proteína usando degradação Edman automática em um sequenciador de proteína de fase gasosa Applied Biosystems 477. A sequência de proteína e análise de aminoácido foram realizadas pelo W.M. Keck Foundation, Biotecknology Resource Laboratory, Yale University, New Haven, CT. Em praticamente todas as determinações, nenhuma designação pode ser feita para a primeira posição. Também, na maioria dos casos a definição dos resíduos de aminoácido das posições 10-15 foi baseada na dominância quantitativa de um resíduo sobre outros. Usando esta abordagem, as sequências obtidas para vários peptídeos mostrou a presença de 3-6 diferentes resíduos em muitos dos ciclos de sequência 10-15, analisados para cada determinação, refletindo uma mistura de peptídeos. Além disso, sequências não puderam ser obtidas para alguns picos, porque os peptídeos foram bloqueados. Não obstante, três sequências de peptídeos foram determinados. Sequências de aminoácido foram pesquisadas quanto à identidade com proteínas na base de dados GenBank usando os programas GenPETP, PIR e SWISSPROT. A análise de base dos dados revelou que um dos peptídeos era altamente homólogo para desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato de várias espécies. Um outro peptídeo tinha homologia com o fator de alongamento de várias espécies, incluindo Leishmania. A terceira sequência não foi claramente relacionada a quaisquer proteínas conhecidas e é mostrada abaixo: XQXPQ(L/K)VFDEXX. B. Clonagem e Sequenciamento do Gene Ldp23 De modo a recuperar a proteína L.donovani que foi processada em um peptídeo associado com moléculas MHC classe II de macrófagos infectados, a sequência de peptídeo de origem desconhecida foi escolhida para guiar a estratégia para clonagem do gene parasita correspondente. Um fragmento de DNA foi inicialmente ampliado a partir de cDNA de promastigoto de L.donovani. 0 primer sentido era um peptídeo derivado do oligonucleotídeo (5'> GGAATTCCCInCAGCTInTTCGACX 3') contendo um sítio de endonuclease de restrição EcoRI (sublinhado). As bases foram selecionadas seguindo o uso do códon preferencial de L.donovani, como descrito em et al. Exp. Parasitol. 74:; 3 60 (1992) . Foi usado Inosina para os resíduos das posições 4, 6 e 7 devido a certeza do uso do códon inferior para os correspondentes aminoácidos. Além disso, o ácido L-glutâmico carboxila terminal não foi incluído para o projeto do primer. O primer antisentido era um oligonucleotídeo poli-timidina (primer a jusante oligo dT) contendo um sítio endonuclease de restrição Shol. O fragmento do gene foi ampliado a partir de uma preparação de cDNA de promastigoto de L.donovani usando as seguintes condições de reação: um ciclo de 3 min a 94°C imediatamente seguido pró 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 45°C e 1 min a 72°C. O cDNA de L.donovani foi preparado de 5 x 107 foras de promastigoto lavadas, colhidas na fase de crescimento log (3 dias de cultura) . 0 cDNA foi obtido usando um kit de ciclo™ cDNA Invitrogen (Invitrogen Composição., San Diego, CA) . Os primers de oligonucleotideo foram sintetizados por DNA Synthesis Laboratory, Department of Pathology, Yale University School of Medicine.

Os produtos PCR foram analisados pró eletroforese de gel. Somente uma faixa de aproximadamente 300 bp foi obtida. Este fragmento foi clonado e sua sequência confirmou a sequência do primer a base de peptideo incluindo o códon de ácido glutâmico, deliberadamente não incluído na sequência de primer. O fragmento de gene ampliado PCR foi ligado ao vetor pCR™ usando o sistema de clonagem TA (Invitrogen Composição., San Diego, CA). Transformantes foram selecionados em meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina e o DNA de plasmídeo foi isolado usando o kit de purificação de DNA Wizard™ Minipreps (Promega Composição. Madison, Wi) . DNA de inserção foi liberado com as enzimas de restrição EcoRI e Shol (New England Biolabs, Beverly, MA) , purificado de uma eletroforese de gel de agarose e rotulado com P32 usando um método de priming aleatório (Megaprime Labeling Kit, Amersham Life Science, Buckinghamshire, England).

Este fragmento de DNA foi usado como ensaio para crivar uma biblioteca de cDNA de promastigoto de L.donovani, como descrito em Skeiky et al., Infect. Immun. 62:1643 (1994). Um cDNA (Ldp23) de aproximadamente 650 bp foi excisado do fagemideo por uma excisão in vivo usando o protocolo Stratagene. 0 sequenciamento de DNA foi realizado usando o sistema 2 da versão Sequenase (kit de sequenciamento de DNA) na presença ou ausência de 7-deaza-GTP (United States Biochemical, Cleveland, OH) . A sequência é provida como SEQ ID NO: 3 e mostra homologia completa com o fragmento PCR original de 300 bp. Uma estrutura de leitura aberta de 525 bp contendo um códon ATG que segue as 4 últimas bases da sequência lider fendida e 3 códons terminais adjacentes à poli extremidade A foi identificada. Esta estrutura também codifica a sequência carboxila terminal (KVFDE) do peptídeo associado MHC classe II purificado. A análise de sequência da sequência de proteína deduzida revelou um sítio de glicosilação potencial (Asn-Cys-Ser_ nas posições 68-70. A análise de sequência foi realizada usando os Programas de Grupo de Computador Genético de Wisconsin e o GenBank e bases de dados EMB1 de proteína e sequências de DNA. A procura para homologia do gene Ldp23 com sequências conhecidas não revelou homologia significativa. C. Expressão Bacteriana e Purificação de Proteína Recombinante A proteína doadora de peptídeo L.donovani recombinante foi produzida em E. coli transformada com o vetor de expressão pGEX2T em que o gene Ldp23 foi subclonado na armação. Foi usado PCR para subclonar o gene clonado na armação em um vetor de expressão pGEX 2T. Primers contendo as enzimas de sítio de restrição apropriadas, códons de iniciação e terminação foram: 5' >

GGATCCATGGTCAAGTCCCA

CTACATCTGC <3' para o primer a montante e 5' > GAATTCAGACCGGATAGAAA TAAGCCAATGAAA <3' para o primer a jusante (sítios de restrição de BamHI e EcoRI são sublinhados respectivamente.) Condições PCR foram como indicados acima para a amplificação do fragmento de DNA relacionado com peptideo original. A matriz usada será plasmídeo pBluescript contendo o gene clonado para a biblioteca de cDNA. A super expressão da proteína de fusão recombinante foi realizada pelo crescimento e E. Coli transformada (DH5a) e indução do promotor tac com lmM de isopropil-p-tiogalactopiranosídeo (IPTG) (Stratagene, La Jolla, CA) . As células foram coletadas, centrifugadas e analisadas quanto à presença de proteína de fusão por SDS-PAGE. Uma proteína de fusão glutationa-S-transferase de 43-44 kD foi produzida, indicando uma proteína de leishmaniose de aproximadamente 18 kD, como glutationa-S-transferase (GST) com um peso molecular de 26 kD. Contudo, a proteína de fusão era muito insolúvel e portanto não pôde ser purificada por cromatografia de afinidade, usando uma coluna de glutationa. 0 uso de detergentes de baixa concentração como SDS, sarcosila, deoxicolato e octil-glicopiranosídeo durante as etapas de extração foi eficiente para solubilizar a proteína, mas desafortunadamente, evitou sua ligação à coluna glutationa. Outras manobras, tais como o crescimento de E. coli e incubação e indução do promotor tac com IPTG a 33°C não aumentou a solubilidade da proteína. Contudo, a purificação foi conseguida por preparação de SDS-PAGE. A faixa foi visualizada com 0,1 M de KC1, cortada e eletroeluída a partir do gel, seguido por diálise extensa contra PBS e concentração em filtros de Centricon 10.

Aproximadamente 500 μρ de proteína purificada foi obtida. A proteína purificada é mostrada na figura 3. No painel A, E. coli (DH5aa) transformada com o vetor de expressão pGEX2T, contendo o gene Ldp23 foi crescida em meio LB e o promotor tac foi induzido com ITPG por 3 horas. As células foram peletizadas, ressuspensas em tampão de carregamento e submetidas a SDS-PAGE (10%) sob condição de redução. O gel foi manchado com azul de Coomassie. 0 canto 1 mostra a E. coli não induzida e o canto 2 mostra a E. coli induzida. A seta indica a proteína recombinante. 0 painel B mostra a proteína preparada como no painel A e submetida a uma preparação de SDS-PAGE. A faixa correspondente à proteína de fusão recombinante foi identificada por KCl, cortada, eletroeluída da tira de gel, dializada contra PBS e submetida à SDS-PAGE analítico (12%) . os números do lado esquerdo indicam os pesos moleculares dos marcadores. Tentativas para purificar mais a proteína de leishmaniose, por divagem da mesma da proteína de fusão GST com trombina, não obteve sucesso. D. Expressão de Ldp23 Para determinar que ao peptídeo Ldp23 é expressado em organismos Leishmania, foi realizado uma análise de manchamento Northern usando RNA preparado de diferentes fases de crescimento de promastigoto (logarítmica e estacionária) e de forma amastigoto desses parasitas. 0 RNA foi preparado de 2 x 107 células de parasita usando o kit de isolamento Micro RNA (Stratagena, La Jolla, CA) de acordo com as instruções recomendadas pela companhia. RNA foi preparado de promastigotos de L.donovani (fase de crescimento log.); de promastigotos de L. major (fases de crescimento logarítmica e estacionária); de L. amazonensis ambos promastigotos (logarítmica e estacionaria) e amastigotos purificados de camundongos infectados com CBA/J; e de L. pifanoi ambos promastigotos (fases de crescimento logarítmica e estacionária) e amastigotos ) de meio de cultura axênico) . L.donovani (linhagem IS),L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016) , L. major (MHOM/IR/79/LRC-L251) e promastigotos de L. Pifanoi (MHOM/VE/60/Ltrod) foram crescidos e mantidos a 26° em meio de Schneider contendo 20% de FCS e 50μg/ml de gentamicina. As formas de amastigoto de L. amazonensis foram obtidas pró centrifugação diferencial de uma lesão no coxim da pata "semelhante a pús" de um camundongo CBA/J infectado por 6 meses com este parasita. Amastigotos de L. pifanoi foram obtidos de cultura axênica como previamente relatado por Pan et al., J. Euk. Microbiol. 40:213(1993). A hibridização foi realizada a 45°C na presença de 50% de formamida, 5 x solução de Denhardt, 0,1% de SDS, 100 μg/ml de DNA de filamento único de esperma de salmão e 5 x SSPE usando filtros de membrana Nytran de 0,45 μτη (Schleicher & Schuell Keene, NH) . O ensaio era o gene Ldp23 rotulado com P32. A figura 4 mostra que uma única faixa de RNA de 680 bp foi observada para todas as fases e formas de crescimento de todas Leishmania testadas. Na figura 4, os números 1, 2 e 3 referem-se a RNA obtido de promastigotos na fase de crescimento logarítmica, promastigotos na fase de crescimento estacionário e formas de amastigoto, respectivamente, e os números do lado esquerdo indicam os pesos moleculares dos marcadores em pares de base. Este resultado é coerente com o tamanho do gene correspondente (525 bp) e com o peso molecular da proteína expressada e pontos para a distribuição de ubiqüidade e expressão deste gene dentro do gênero Leishmania. E. Indução de Resposta de Anticorpo Anti- L.donovanl em Camundongos e Coelhos por Proteína Recombinante Purificada De modo a avaliar a imunogeneicidade da proteína de leishmaniose recombinante e a investigar sua expressão nos parasitas, camundongos e coelhos foram imunizados com proteína de fusão GST em CFA. Camundongos BALB/c foram imunizados no coxim da pata traseira com 5-lC^g de proteína emulsificada em CFA. A concentração da proteína foi determinada usando o reagente de Ensaio de Proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) . Os camundongos foram reforçados 7 dias depois com 5-lC^g de proteína emulsificada em adjuvante incompleto de Freund (IFA) inoculado na cavidade peritoneal. Os camundongos foram sangrados 7 dias após a segunda imunização. Coelhos brancos da Nova Zelândia (Millbrok Farm, Amherst, MA) foram imunizados de acordo com o seguinte protocolo: uma injeção intramuscular (IM) de 25-3C^g de proteína recombinante purificada emulsificada em CFA em cada coxa no dia um; uma injeção IM de 25-30μρ de proteína purificada emulsifiçada em IFA em cada ombro no dia 7; no dia 15, 25-3C^g da proteína purificada em PBS foi injetada em cada tecido subcutâneo. 0 coelho foi sacrificado 7 dias pós a última imunização.

Foi preparado o soro e a resposta de anticorpo anti-Leishmania foi medida por análise de mancha Western e por FACScan. Em ambos os casos promastigotos de L.donovani foram crescidos em meio Schneider por 3 dias (fase log.), foram lavados com PBS, lisados com tampão carregado com SDS-PAGE e submetidos a eletroforese sob condições reduzidas usando um gel de poliacrilamida a 15%. As proteínas foram transferidas para uma membrana de transferência Immobilon-P de 0,45μ (Millipore Composição. Bedford, MA) usando um eletromanchador do tipo úmido (Mini Trans-Blot Eletrophoretic Transfer Cell, Bio Rad Life Science Division, Richmond, CA)por 2 horas a 50 V. As membranas foram bloqueadas toda a noite a temperatura ambiente com PBS contendo soro de ovelha normal a 3% (NGS), 0,2% de Tween-20 e 0,05% de azida de sódio, seguido por 3 lavagens com PBS. As manchas foram então incubadas por 3-4 horas a 4°C com uma diluição 1/200 de soro de coelho pré-imune (faixa B, figura 5) ou com a mesma diluição de anti-soro de coelho de proteína anti-fusão (faixa B, figura 5) . Os soros foram previamente absorvidos 2 x com Mycobacterlum tuberculosis dessecada H-37 RA (Difco Laboratories, Detroit, MI) e foram diluídos em PBS contendo 1% de NGS e 5% de leite de vaca desengordurado em pó (Carnation, Nestlé Food Company, Glendale, CA). As membranas foram a seguir lavadas com PBS, incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com anticorpo IgG anti-coelho de ovelha conjugado com fosfatase alcalina (Promega, Madison, WI), lavado uma vez com PBS e 2x com tampão veronal pH 9,4. A reação foi visualizada usando mistura 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato de substrato e tetrazólio nitroazul (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante. A figura 5 mostra que o anti-soro de proteína anti-recombinante de coelho detecta uma única proteína de 23 kDa (Ldp23) na preparação de antígeno de extrato puro de Leishmania. Nenhuma faixa foi observada quanto foi usado um anti-soro anti-GST (não mostrada) Além disso, a análise de FACScan (figura 6) mostra que o anticorpo induzido pelo recombinante Ldp23 reage com promastigotos de L.donovani vivos intatos, assim apontando para uma expressão superficial de célula dessa molécula nesses organismos. A linha pontilhada na figura 6 mostra a imunofluorescência indireta realizada usando soro de camundongo pré-imune, e a linha sólida na figura 6 mostra o resultado obtido com anti-soro Ldp23 de anti- GST de camundongo. Ambos os soros foram diluídos a 1/100. Parasitas foram lavados com tampão de manchamento e incubados com anticorpo de imunoglobulina de anti-camundongo de ovelha conjugado com FITC. A intensidade da fluorescência foi analisada por FACScan. F. Reconhecimento de Ldp23 Recombinante por Células T de Nódulo Linfático Específico de Leishmania Para testar a receptibilidade de células T para proteína Ldp23, dois conjuntos de experiências foram realizadas. Na primeira experiência, células T de nódulo linfático (105/reservatório) de camundongos BALB/c imunizados com promastigotos de L.donovani (como acima descrito) foram estimuladas para proliferar com células de baço mononucleares normais tratadas com 2 x 105 de Mitomycin C (APC) e pulsadas com proteína de fusão recombinante purificada. A proliferação das células T foi medida a 72 horas da cultura. Valores são expressos na figura 7 como cpm e representam a média de incorporação [H3]TdR de culturas em triplicata. Cpm em segundo plano de células (células T + APC) cultivadas na presença de meio sozinho foi de 1291. A figura 7 mostra que células T específicas para Leishmania proliferam bem e em uma maneira de resposta de dose para o recombinante Ldp23. Nenhuma resposta foi observada quando GST purificado foi adicionado ao invés de proteína de fusão recombinante, nem quando células T de nódulo linfático de camundongos imunizados com CFA sozinho foram estimuladas para proliferar na presença da proteína de fusão de leishmaniose (não mostrado). 0 reconhecimento da proteína Ldp23 recombinante por células T específicas para Leishmanía foi também testado usando dois modelos de murino de leishmaniose, o camundongo BALB/c altamente suscetível para L. major e o camundongo CBA/J suscetível para L. amazonensis, como descrito em Champsi e McMahon-Pratt, Infect. Immun. 56:3212 (1988). Esses modelos foram selecionados para investigar o padrão de citocina induzido por Ldp23. No modelo de camundongo de leishmaniose, a resistência está associada com citocinas Th 1 enquanto a susceptibilidade está ligada a respostas Th 2. Células de nódulo linfático foram obtidas 3 semanas após a iniciação de infecção de camundongos BALB/c com L. major e a capacidade dessas células em reconhecer o recombinante Ldp23 foi medida por proliferação e pela produção de citocinas IFN-γ e IL-4. 2 x 106 células obtidas de nódulo linfático popliteal de drenagem de camundongos infectados foram cultivadas por 72 horas na presença do recombinante Ldp23 ou lisado de Leishmanía. Os níveis de IFN-γ e IL-4 em sobrenadantes de cultura foram medidos por ELISA como previamente descrito (Chatelain et al., J. Immunol. 148:1112 (1992), Curry et al., J. Immunol Meth 104:131 (1987) e Mossman e Fong J. Immunol Meth. 116:151 (1989)) usando IFN-γ e anticorpos IL-4 monoclonais (PharMingen, San Diego, CA).

Ldp23, de fato estimula essas células a proliferarem (não mostrado) e induziu um tipo de Thl típico de resposta de citocina como indicado pela produção de altos níveis de IFN-γ (painel A da figura 8) e nenhum IL-4 (painel B da figura 8) A estimulação dessas células com um lisado puro de Leishmania rendeu um perfil de citocina Th misto. Exatamente o mesmo padrão de produção de citocina foi obtido de camundongos CBA/J infectados com L. amazonensis (não mostrado). Esses resultados indicam claramente que Ldp23 é um poderoso e seletivo ativador de citocinas Thl por células de camundongo.

Exemplo 3 Preparação de Hsp83 Este exemplo ilustra a preparação de um antígeno Hsp83 de Leishmania, tendo a sequência provida em SEQ ID NO:6.

Uma biblioteca de expressão genômica foi construída com DNA cortado de L. brazíliensis (MHOM/BR/85/M2903) em bacteriófago λΖΑΡ II (Stratagene, La Jolla, CA). A biblioteca de expressão foi peneirada com soro de Escherichia coli pré-adsorvido de um indivíduo com ML infectado com L. brazíliensis. Placas imunoreativas foram purificadas e o fagemídeo pBSK(-) foi excisado por protocolos sugeridos pelo fabricante. Exclusões de abrigados foram realizadas com exonuclease III para gerar cancelamento de sobreposição para preparações e sequenciamento de matrizes de filamento único. Matrizes de filamento único foram isoladas a seguir a infecção com fago auxiliar VCSM13 como recomendado pelo fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) e sequenciado pelo método terminador de cadeia dideóxi ou pelo sistema de terminação de corante Taq usando o modelo 373A sequenciador automático da Applied Biosystems.

Antígenos recombinantes produzidos por esses clones foram purificados de 500 ml de culturas induzidas de isopropil-p-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) como descrito em Skeiky et al., J. Exp. Med. 17 6:201211 (1992). Esses antígenos foram a seguir ensaiados quanto a habilidade de estimularem PBMC de indivíduos infectados com Leishmanía para proliferar e secretar citocina. Sangue periférico foi obtido de indivíduos vivendo em uma área onde L. braziliensis é endêmica (Corte de Pedra, Bahia, Brasil) e onde estudos de epidemiologia, clínicos e imunológicos foram feitos durante uma década e PBMC foram isolados de sangue total por centrifugação de densidade através de Ficoll (Winthrop Laboratories, New York, N.Y.). Para ensaios de proliferação in vitro, 2 x 105 a 4 x 105 células por reservatório foram cultivados em meio completo (RPMI 1640 suplementado com gentamicina, 2-mercaptoetanol, L-glutamina e 10% de aglomerado A peneirado + soro humano; Trimar, Hollywood, Calif) em placas de fundo plano de 96 reservatórios, com ou sem 10 pg dos antigenos indicados por ml de 5 pg de fito-hemaglutinina por ml (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.) por 5 dias. As células foram então pulsadas com 1 pCi de [H3]timidina para as 18 horas finais de cultura. Para determinação de produção de citocina 0,5 a 1 ml de PBMC foi cultivado em 1 x 106 a 2 x 106 células por ml com ou sem os antigenos de Leishmania por 48 horas e 72 horas.

Os sobrenadantes e células foram coletados e analisados quanto à citocina secretada ou mRNAs de citocina. Alíquotas dos sobrenadantes foram ensaiadas para γ-interferon (IFN-γ), fator-α de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-4 (IL-4) e IL-10 como descrito em Skeiky et al., J. Exp. Med. 181/1527-1537 (1995). Para análise de PCR mRNA de citocina , RNA total foi isolado de PBMC e cDNA foi sintetizado usando-se poli(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ) e transcriptase inversa de vírus de micoblastose de avícolas . Seguinte a normalização para β-actina, cDNA diluído foi amplificado por PCR usando polimerase Taq (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) com concentrações de 0,2 pM dos respectivos primers externos 5'e 3' em um volume de reação de 50 μΐ. As sequências de nucleotídeo dos pares primários e das condições PCR usadas, foram como descrito em Skeiky et al., J. Exp. Med. 181:1527-1537 (1995). Verificamos que nossas condições PCR estavam dentro da faixa semi-quantitativa por realização inicial de diluições em série de cDNAs e variando-se o número de ciclos usados para PCR. Plasmideos contendo as sequências humanas para IL-2, IFN-γ, 11-4, IL-10 e β-actina foram digeridos e as inserções de DNA foram purificadas após separação em géis de agarose a 1%. Testes radiorotulados com P32 foram preparados pelo método de priming aleatório. Produtos PCR foram analisados por eletroforese em géis de agarose 1,5%, transferidos para membranas de náilon e testadas com inserções de DNA rotuladas com P32.

Um clone recombinante foi identificado em ensaios acima os quais, seguinte a comparação da sequência de sua sequência de aminoácido previsível com sequências de outras proteínas, foi identificado como um homólogo de Leishmania braziliensis da proteína (Lbhsp83) de choque térmico de 83 kD eucariótica. A sequência do clone está providenciada na SEQ ID NO:5 e a sequência de proteína deduzida está providenciada na SEQ ID NO: 6. Com base na homologia, este clone designado Lbhsp83a parece ser destituído dos primeiros 47 resíduos de 703 resíduos de aminoácidos de comprimento total. Lbhsp83 tem uma homologia global de 94% (91% identidade e 3% de substituição conservadora), 91% (84% identidade e 7% substituição conservadora) e 77% (61% identidade e 16% substituição conservadora) com L. amazonensis hsp83, T. cruzi hsp83 e humano hsp89, respectivamente. Um segundo clone (designado Lbhsp83b) que continha a parte C-terminal de 3 kD de hsp83 (resíduos 331 a 703) foi também isolado. A figura 19 apresenta uma comparação da sequência Lbhsp83 com L. amazonensis hsp83 (Lahsp83), T. cruzi hsp83 (Tchsp83) e humano hsp89 (Huhsp89).

Os resultados dos ensaios de proliferação usando Lbhsp83 estão mostrados na Tabela 1. Células de todos os pacientes com leishmaniose de mucosa (ML proliferaram fortemente, em reposta a Lbhsp83a, com índices de estimulação (Sis) variando de 19 a 558 (como comparado com 20 a 1.634 para lisado de parasita). A proliferação de PBMC de pacientes com leishmaniose cutânea (CL) foi variável e excetuando-se os níveis em dois pacientes (IV e VII) os níveis foram significativamente menores do que aqueles níveis de pacientes ML. Em comparação, as respostas proliferativas de indivíduos com auto-cura CL para Lbhsp83a eram similares àqueles de indivíduos com ML. Contudo, as respostas de todos os seis indivíduos de auto-cura para Lbhsp83 foram coerentemente maiores do . que aqueles para Lbhsp83b. Isto sugere que PBMC de pacientes CL de auto-cura, reconhecem preferencialmente um ou mais epitopos de célula T localizados dentro da parte amino de Lbhsp83.

Uma análise mais detalhada de padrões de citocina de PBMC de pacientes ML foi realizada por transcriptase reversa PCR. mRNAs de citocina foram avaliadas em células antes da cultura (figura 9, faixas 0) ou seguinte a cultura na ausência (faixas -) ou presença do antigeno indicado para 48 e 72 horas. A figura 4A mostra os resultados para cinco de seis pacientes ML, cujos PBMC foram analisados. Cerca da metade dos pacientes ML, PBMC não cultivados (repouso) tinham níveis detectáveis de mRNA para IFN-γ, IL-1 e IL-4 porém não para IL-IO. PBMC de paciente CL, contudo tinha mRNA de IL-10 no estado de repouso além de mRNAs para outras citocinas testadas (figura 4B) . Seguindo cultura in vitro sem antigeno, os níveis de mRNA para IFN-γ, IL-2 e IL-4 em células de repouso, de paciente ML diminuiu para níveis de segundo plano enquanto níveis de mRNA de IL-10 aumentaram. Em contraste, PBMC da maioria de pacientes CL tinha mRNa de IL-10 estável ou aumentado, enquanto os mRNAs para IL-2, IFN-γ e 11-4 foram reduzidos para, quando muito, níveis detectáveis na ausência da estimulação do antigeno.

Em PBMC de três pacientes ML, a estimulação com lisado resultou em expressão aumentada de mRNA para IFN-γ, IL-2 e IL-4 mas não IL-10. Por comparação ambos os polipeptídeos Lbhsp83 obteve a produção de mRNaA para IFN-γ e IL-2 de todos os PBMC de paciente ML testados. Em contraste, perfis de mRNA para IL-10 e 11-4 eram diferentes para os dois polipeptideos hsp83. Lbhsp83a estimulou a produção de IL-10, porém não mRNA de IL-4 (pacientes I, II, III e IV) , enquanto Lbhsp83b estimulou a produção de 11-4, mas não mRNA de IL-10 em todos os seis pacientes.

Todos os pacientes CL testados responderam a ambos os polipeptideos Lbhsp83, bem como ao lisado de parasita por regulamento superior da síntese de mRNAs para IL-2 e IFN-γ, e em dois de quatro pacientes (I e IV), o nível de mRNA de IL-4 também aumentou, indicando estimulação de citocinas Thl e Th2. Interessantemente, e como no caso de paciente ML, PBMC não cultivado que não obteve níveis detectáveis de mRNA de IL-10, Lbhsp83a e não PBMC estimulado por Lbhsp83b de um paciente CL (IV) para sintetizar mRNA de IL-10. Contudo, nos outros três pacientes, (I, II e III) com níveis de repouso de mRNA de IL-10, ambos os polipeptideos rLbhsp83, bem como o lisado de parasita, regularam por baixo a expressão de mRNA de IL-10.

Sobrenadantes de PBMC foram também ensaiados quanto à presença de IFN-γ secretado, TNF-a, 11-4 e II-10. Células de todos os pacientes ML e Cl auto-curantes (sete e seis pacientes, respectivamente) e de quatro de sete pacientes CL, foram analisados quanto à iFN-γ secretado seguinte a estimulação com ambos os polipeptideos rLbhsp83, lisado de parasita e Lbhsp70, um homólogo de proteína L. braziliensis para a proteína de choque térmico de 70 kD eucariótica (figura 10A) . Em geral rLbhsp83a estimulou PBMC de paciente a secretar maiores níveis de IFN-γ do que o fez rLbhsp83b (0,2 a 36 e 0,13 a 28 ng/ml, respectivamente. A presença de IFN-γ secretado correlacionou-se bem com o mRNA correspondente detectado por PCR. PBMC de quatro entre cinco pacientes ML (I, II, V e VII) tinham níveis TNF-α sobrenadantes (0,8 a 2,2 ng/ml) mais altos dos que os detectados em culturas de PBMC de controles não infectados seguinte a estimulação com lisado de parasita (figura 10B). Similarmente, o mesmo PBMC foi estimulado por rLbhsp83 para produzir níveis de TNF-α em sobrenadantes variando de 0,61 a 2.9 ng/ml. Comparados com aqueles controles não infectados, PBMC de três (I, V e VI), cinco (I, II, IV, V e VI), e dois (II e V) de seis indivíduos analisados produziram maiores níveis de TNF-α, em resposta ao lisado de parasita, rLbhsp83a e rLbhsp83b, respectivamente. Os níveis de TNF-α produzidos por PBMC de pacientes CL, em resposta ao lisado de parasita, foram comparáveis aqueles produzidos por controles não infectados. Contudo, rLbhsp83 estimulou a produção de TNF-alfa no PBMC de dois desses pacientes, rLbhsp83a estimulou maiores níveis de produção de TNF-alfa do que o fez rLbhsp83b. Na ausência da estimulação do antígeno, somente PBMC de pacientes ML (cinco de seis) produziram níveis detectáveis de sobrenadante TNF-alfa (60 a 190 pg/ml).

Em concordância com mRNA de IL-10, IL-10 foi detectado por ELISA em sobrenadantes de cultura de PMBC estimulados polipeptídeo antígeno de pacientes ML e CL. Os níveis (49 a 190 pg) foram significantemente maiores (até 10 vezes) seguinte à estimulação com rLbhsp83a comparados com aqueles após estimulação paralela das mesmas células com rLbhsp83b (figura 11). Lisado de parasita também estimulou PMBC de alguns dos pacientes para produzir IL-10. Embora o PMBC estimulado por rLbhsp83 de indivíduos não infectados para produzir IL-10, com uma excepção, os níveis foram menores do que aqueles observados com PMBC de paciente. IL-4 não foi detectado em quaisquer dos sobrenadantes analisados. Portanto, o nível de qualquer IL-4 secretado está abaixo do limite de detecção do teste ELISA empregado (50 pg/ml). Reunidos, os resultados demonstram que um perfil de citocina do tipo Thl predominante está associado com PMBC de indivíduos infectados com L. braziliensis seguinte a estimulação com polipeptídeos rLbhsp83. A fim de determinar a correlação existente entre as respostas de célula TNF-alfa observadas e produção de anticorpos para Lbhsp83, comparou-se as re-atividades de anticorpo (imunoglobulina G) para Lbhsp83 em soros de três grupos de paciente (figura 12) . As reatividades ELISA de soros de pacientes ML com rLbhsp83a foram comparáveis àqueles observados com lisado de parasita, e, em geral, existia uma correlação direta entre titulo de anticorpo anti-Lbhsp83 de paciente ML e proliferação de célula T. De 23 amostras de soro de pacientes ML analisados, 22 era positivos (~ 96%) com valores de absorbância de 0,20 a >3,0. Onze das amostras de soro de paciente ML tinham valores de densidade óptica que era >1. Em geral, pacientes CL tinham títulos de anticorpo anti-Lbhsp83 significativamente menores (_x = 0,74; erro padrão da média [SEM] = 0,1) comparado aos de pacientes ML. Portanto, títulos de anticorpo anti-rhsp83 de pacientes ML e Cl correlacionaram com suas respectivas respostas proliferativas de célula T. Títulos do anticorpo anti-rLbhsp83 foram significantemente maiores em pacientes com ML (x = 1,5; SEM =0,2) do que em pacientes CL auto-curantes (x = 0,35; SEM = 0,056), embora suas respostas proliferativas de célula TNF-alfa fossem similares. De fato, títulos de anticorpo anti-Lbhsp83 em soro de pacientes CL auto-curantes foram comparáveis com os controles não infectados (x = 0,24; SEM = 0,028). Usando-se dois desvios padrões maiores do que o valor de absorbância médio de controle não infectado (0,484) como um critério para reatividade positiva para Lbhsp83, oito de nove das amostras de soro de paciente auto-curantes testadas foram negativas.

Exemplo 4 Preparação de Clones Codificando Lt-210 Este exemplo ilustra a preparação de clones codificando partes de antigeno de Leishmaniâ Lt-210, e que tem a sequência provida em SEQ ID NO: 8.

Uma biblioteca de expressão foi construída a partir de DNA genômico de L. tropica (MHOM/SA/91/WR10 63C) . 0 DNA foi isolado por solubilização de promastigotos de L. tropica em 1 mM de Tris-HCL, pH 8,3, 50 mM de EDTA, 1% SDS e tratamento com 100 μρ/πιΐ de RnaseA e 100 μg/ml de proteinase K. A amostra foi a seguir extraída em sequência com um volume igual de fenol, fenol:clorofórmio (1:1), e Clorofórmio. O DNA foi precipitado pela adição de 0,1 de volume de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 2,5 volume etanol a 95%. O precipitado foi ressuspenso em 10μΜ de Tris, lmM EDTA. O DNA foi separado por passagem através de uma agulha de calibre 3 0 a um tamanho de faixa de 2-6 kilobase e foi reparado por incubação com poli DNA na presença de 100 μΜ cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Adaptadores EcoRI foram ligados aos fragmentos de DNA. Após remoção de adaptadores não ligados por passagem sobre uma coluna Sephadex ™ G-25, os fragmentos foram inseridos em corte Larnbda ZapII de EcoRI (Stratagene, La Jolla, Ca).

Aproximadamente 43.000 pfu foram colocados em placas e peneirados com soros isolados de pacientes com leishmaniose viscerotrópica (VTL). Os soros de pacientes com VTL foram recebidos dos Drs. M. Grogl e A. Magill. 0 grupo de pacientes VTL incluiram oito indivíduos, dos quais foram isolados os parasitas e cultivados, sete dos quais, tinham infecção confirmada com L tropica. Quatro outros pacientes eram negativos à cultura, mas eram ainda considerados estarem infectados com base em ou análise PCR ou um espalhamento de anticorpo monoclonal positivo (Dr. Max Grogl, comunicação pessoal). Amostras de soro de 11 pacientes infectados foram agrupadas e a reatividade anti-i?, coli removida por cromatografia de afinidade (Sambrook et al., supra, pág. 12-27 - 12-28) . Proteínas reativas expressando fago lambda foram detectadas após ligação do anticorpo por peroxidase de rábano de cavalo de proteína A e substrato ABTS.

Três clones, Lt-1, Lt-2 e Lt-3, contendo uma parte do gene Lt-210 foram identificados e purificados. Os clones variaram em tamanho de 1,4 a 3,3 kb e codificaram polipeptídeos de 75 kD, 70 kD e 120 kD, respectivamente. Esses três clones contém sequências parciais do gene Lt-210. Lt-1 e Lt-2 são clones de sobreposição e foram escolhidos para estudo ulterior.

As sequências de DNA de Lt-1 e Lt-2 foram determinadas. A digestão de exonuclease III foi usada para criar deleções de sobreposição dos clones (Heinikoff, Gene 28:351-359, 1984). Matriz de filamento único foi preparada e a sequência determinada com Modelo 373A Sequenciador Automático de Applied Biosystems ou por sequenciamento dideóxi de Sanger. A sequência de ambos os filamentos da parte codificadora do clone Lt-1 foi determinada. A sequência parcial de um filamento do clone Lt-2 foi determinada. SEQ ID NO: 7 apresenta a sequência de DNA de Lt-1 e SEQ ID NO: 8 provê a sequência de aminoácido vaticinada do quadro de leitura aberto. A sequência de DNA da parte de codificação do clone Lt-1 inclui uma sequência de nucleotideo repetida na parte 5' do clone contendo oito cópias de uma repetição de 99 bp, três cópias de uma unidade de repetição de 60 bp, que é parte da repetição de 99 bp maior, e 800 bp da sequência de não repetição. A sequência de aminoácido deduzida de 99bp de repetição contém degenerações limitadas. A massa da proteína recombinante deduzida do quadro de leitura aberto rendeu homologia insignificante para as sequências previamente submetidas. A estrutura secundária deduzida da parte de repetição do clone é inteiramente α-helicoidal. A análise de sequência de Lt-2 revelou que a parte 3' do clone consistia de uma mistura de 60 e 99 repetições de 99bp que eram idênticas, excetuando degenerações ocasionais, às repetições de 60 e 99 bp observadas em Lt-1. De modo coletivo, os dados de sequenciamento sugerem que Lt-1 e Lt-2 são partes diferentes do mesmo gene, Lt-2 estando a montante de Lt-1, com possivelmente uma pequena sobreposição. A análise de hibridização confirmou que rLt2 e rLt-1 contém sequências de sobreposição. DNAs genômicos de várias espécies Lelshmania foram restritos com uma variedade de enzimas, separadas por eletroforese de gel de agarose, e manchadas em filtro de membrana Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) . Inserções de rLt-1 e rLt-2 foram rotuladas com CTP-P32 por transcriptase reversa de primers de oligonucleotideo aleatórios e usados como testes após separação dos nucleotideos não incorporados em uma coluna Sephadex G-50. Hibridizações usando o teste rLt-1 ou o rLt-2 são realizadas em 0,2M de NaH2P04/ 3,6 M de NaCl a 65°C, enquanto hibridização usando o teste rLt-lr é realizado em 0,2 M de NaH2P04/3,6 M de NaCL/ 0,2 M de EDTA a 60°C toda a noite. Os filtros são lavados em 0,075 M de NaCl/0,0075 M de citrato de sódio pH 7,0 (0,15 M NaCL/0,050M de citrato de sódio para o teste Lt-lr) , mais 0,5% de SDS na mesma temperatura como hibridização. DNA genômico de uma série de espécies de Leishmania incluindo L. tropica foram analisados por manchamento Southern como descrito acima usando os insertos Lt-1, Lt-2 e Lt-lr separadamente como testes. Coletivamente, várias purificações de DNA de L. tropica indicam que este gene tem um baixo número de cópia. Um padrão de sobreposição similar, foi observado usando, ou o inserto Lt-1 ou Lt-2 como uma prova, coerente com a premicia que esses dois clones contém sequências próximas ou sobrepondo-se umas às outras. Além disso, sequências que hibridizam com esses clones estão presentes em outras espécies de Leishmania.

Isolados de L. tropica têm heterogeneidade limitada. Análises Southern de DNA genômico digerido de quatro cepas parasitas de L tropica isoladas de pacientes VTL e três cepas parasitas de L. tropica isoladas de casos CL (dois humanos, um canino) foram realizadas. 0 inserto Lt-lr descrito abaixo foi rotulado e usado como uma prova. Os sete diferentes isolados de L. tropica renderam intensidades similares e padrões de restrição, com apenas um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, entre os isolados. Esses dados, juntamente com análises Southern com enzimas adicionais, indicam heterogeneidade limitada nesta região entre os isolados L. tropica.

As proteínas recombinantes de Lt-1 e Lt-2 foram expressadas e purificadas. 0 conjunto de deleções abrigadas de Lt-1 formados para sequenciamento incluiu um clone referido como Lt-lr, que contém um e 1/3 de repetições. Este polipeptídeo foi também expressado e purificado. Excisão in vivo do fagemideo pBluescript SK" de Lambda Zap II foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Partículas do vírus do fagemídeo foram usadas para infectar E. coli XL-1 Blue. A produção de proteína foi induzida pela adição de IPTG. Proteína foi recuperada por, primeiramente, lisar as pelotas de bactéria induzida em tampão (LB, 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10 mM de EDTA) usando uma combinação de lisozima (750 μρ/πιΐ) e tratamento com som. rLt-1, rLt-2 e rLt-lr, foram recuperados dos corpos de inclusão após solubilização em uréia 8M (rLt-1 e rLt-2) ou uréia 4M (rLt-lr). Proteínas rLtOl e rLt-2 foram enriquecidas e separadas por precipitação com sulfato de amônio 25% -40% e rLt-lr foi enriquecido por precipitação com sulfato de amônio 10% - 25% . As proteínas foram ainda purificadas por eletroforese de gel preparado em 10% de SDS-PAGE. Proteínas recombinantes foram eluídas dos géis e dializadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A concentração foi medida por ensaio Pierce BCA (Rockford, IL) e a pureza avaliada por manchamento com azul de Coomassie após SDS-PAGE.

Exemplo 5 Preparação de LbeIf4A

Este exemplo ilustra a clonagem molecular de uma sequência de DNA codificando o antígeno ribossomal L. braziliensis LbeIF4A.

Uma biblioteca de expressão genômica foi construída com DNA cisalhado de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) em bacteriófago λΖΑΡΙΙ (Stratagene, La Jolla, CA). A biblioteca de expressão foi peneirada com soro de paciente pré-adsorbido de E. coli de um indivíduo infectado com L. braziliensis com leishmaniose mucosal. Placas contendo antígenos recombinantes imunoreativos, foram purificadas e o fagemídeo pBSK(-) excisado usando o protocolo do fabricante. Deleções abrigadas foram realizadas com Exonuclease III para gerar deleções de sobreposição para preparações de matrizes de único filamento e sequenciamento. Matrizes de único filamento, foram isoladas seguinte à infecção com fago auxiliar VCSM13 como recomendado pelo fabricante (Stratagene, La Jolla CA) e sequenciada pelo método terminador de cadeia dideóxi ou pelo sistema terminador de corante Taq usando o Modelo Sequenciador Automático da Applied Biosystems 373A.

Os antígenos recombinantes imunoreativos foram a seguir analisados em ensaios de célula TNF-alfa de paciente quanto à sua capacidade em estimular uma produção proliferativa e de citocina, como descrito nos Exemplos 7 e 8 abaixo.

Um clone recombinante foi identificado nos ensaios acima, que seguinte a comparação de sequência de sua sequência de aminoácido previsível com sequências de outras proteínas, foi identificado como um homólogo de Leishmania braziliensis do fator de iniciação eucariótico 4A (eIF4A). 0 clone isolado (pLeIF.1) não tinha os primeiros 48 resíduos de aminoácidos (144 nucleotídeos) da sequência de proteína de comprimento total. 0 inserto pLeIF.1 foi subsequentemente usado para isolar a sequência genômica de comprimento total. SEQ ID NO:7 mostra toda a sequência de nucleotídeo do polipeptídeo LbeIF4A de comprimento total. 0 quadro de leitura aberto )nucleotídeos 115 a 1323) codificou uma proteína com 403 aminoácidos com um peso molecular previsível de 45,3 kD. Uma comparação da sequência de proteína previsível de LbeIf4A com as proteínas homólogas de tabaco (TeIF4A), camundongo (MeIF4A), e levedura YeIF4A) mostra homologia de sequência extensa, com os primeiros 20-30 aminoácidos sendo os mais variáveis. Os comprimentos (403, 413, 407, e 395 aminoácidos) pesos moleculares (45,3, 46,8, 46,4, e 44,7 kDa) e pontos isoelétricos (5,9, 5,4, 55, e 4,9) de lbeIf4A, TeIF4A, MeIF4A e YeIF4A, respectivamente são similares. LbeIF4A mostra uma homologia global de 75,5% (57% de identidade, 18,5% de substituição conservadora) com TeIF4A, 68,6% (50% de identidade, 18,6% de substituição conservadora) com MeIF4A e 67,2% (47,6% de identidade, 19,6% de substituição conservadora ) com YeIF4A.

Exemplo 6 Preparação de Antígenos de Leishmania Solúveis Este exemplo ilustra a preparação de antigenos de Leishmania solúveis de um sobrenadante de cultura de L. major. Promastigotos de L. major foram cultivados até a fase de log tardia em meio complexo com soro até atingir uma densidade de 2-3 x 107 de organismos viáveis por ml de meio. Os organismos são cuidadosamente lavados para remover componentes de meio e ressuspensos a 2-3 x 107 de organismos viáveis por ml de meio isento de soro definido consistindo de partes iguais de RPMI 1640 e meio 199, ambos da Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Após 8-12 horas, o sobrenadante é removido, concentrado 10 vezes e dializado contra solução salina tamponada com fosfato por 24 horas. A concentração de proteína é a seguir determinada e a presença de pelo menos oito antigenos diferentes confirmado por SDS-PAGE. A mistura é referida aqui como "antigenos de Leishmania solúveis." Exemplo 7 Comparação de Produção de Interleucina-4 e Interferon-γ Estimulada por Antigenos de Leishmania Este exemplo ilustra as propriedades imunogênicas dos antigenos preparados de acordo com Exemplos 1,2,5 e 6, como determinado por sua capacidade de estimular 11-4 e IFN-γ, em culturas de nódulo linfático de camundongos infectados e em preparações PBMC de humano. Culturas de nódulo linfático para uso nesses estudos, foram preparadas de camundongos BALB/c infectados com L. Major 10 dias após infecção, como descrito no Exemplo 2. PBMC foi preparado usando sangue periférico obtido de indivíduos com infecções por L. donovani curadas, que eram imunologicamente sensíveis à Leishmania. O diagnóstico dos pacientes foi feito por descobertas clínicas associadas com pelo menos um dos seguintes: isolamento do parasita de lesões, um teste de pele positivo com lisado de Leishmania ou um teste sorológico positivo. Indivíduos não infectados foram identificados com base em uma falta de sinais clínicos ou sintomas, uma falta de história de exposição ou viagem à áreas endêmicas e a ausência de uma resposta sorológica ou celular para antígenos de Leishmania. Sangue periférico, foi coletado e PBMC isolado por centrifugação de densidade através de Ficoll™ (Winthrop Laboratories, New York).

Sobrenadantes de cultura foram ensaiados quanto a níveis de IL-4 secretado e IFN-γ. IFN-γ foi quantificado por um ELISA entremeado duplo usando IFN-γ mAb anti-humano de camundongo (Chemicon, Temucula CA) e soro IFN-γ anti-humano de coelho policlonal. rIFN-γ de humano (Genenteck Inc., San Francisco, CA) foi usado para gerar ma curva padrão. IL-4 foi quantificado em sobrenadantes por um teste ELISA entremeado duplo, usando um IL-4 mAb (Ml) anti-humano de camundongo e um soro (P3) IL-4 anti-humano de coelho policlonal. IL-4 de humano (immunex Corp., Seattle, WA) foi usado para gerar uma curva padrão variando de 50 pg/ml para 1 ng/ml.

As figuras 13A e 13B, ilustram o nível médio de IL-4 e IFN-γ, respectivamente 72 horas após adição de 10 μρ/ιηΐ de cada um dos seguintes antígenos para uma cultura de nódulo linfático preparado como descrito acima: antígeno de Leishmania solúvel (ou seja, um extrato preparado de promastigotos rompidos que contém membrana e antígenos internos (SLA) ), Ldp23, LbeIF4A (LeIF), Lbhsp83, M15 e LmelF (o homólogo L. major de LbeIF4A) . Os níveis de IL-4 e IFN-γ secretado em meio apenas (ou seja, não estimulado) são também conhecidos. Embora SLA obtenha uma resposta Th2 predominante das células de nódulo linfático de camundongos infectados com Leishmania, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 e M15 obteram relativamente pouco IL-4 e grandes quantidades de IFN-γ, coerente com um perfil de resposta Thl. A figura 14 mostra o nível de IFN-γ secretado em filtrado de cultura de preparações de PBMC de humano infectado e não infectado, 72 horas após adição de 10 μρ/ιηΐ de lisado de L. major M15 ou L-Rack, um antígeno de leishmaniose imunodominante em leishmaniose de murino. De forma similar, a figura 15 ilustra o nível de IFN-γ secretado em filtrado de cultura de preparações PBMC de humano infectado e não infectado, após adição de 10 μρ/ιηΐ de lisado de L. major, antigenos de Leishmania solúveis (preparados como descrito no Exemplo 6) ou L-Rack. Esses resultados indicam que M15 e antigenos de Leishmania solúveis, porém não L.Rack, são estimuladores potentes da produção de IFN-γ em PBMC de paciente, mas não em PBMC obtido de indivíduos não infectados. Assim, M15 e antigenos de Leishmania solúveis obtém um perfil de citocina Thl dominante em ambos, camundongos e humanos infectados com Leishmania.

Exemplo 8 Comparação da Proliferação Estimulada por Antigenos de Leishmania Este exemplo ilustra as propriedades imunogênicas dos antigenos preparados de acordo com Exemplos 1,2,5 e 6, como determinado por sua capacidade de estimular a proliferação em culturas de nódulo. linfático de camundongos infectados e em preparações de PBMC de humano.

Para testes de proliferação in vitro, 2 - 4 x 105 células/reservatório foram cultivadas em meio completo (RPMI 1640 suplementado com gentamicina, 1-ME-L-glutamina, e 10% de aglomerado peneirado A + soro humano: Trimar, Hollywood, CA) em placas de fundo plano de 96 reservatórios com ou sem 10 μρ/πιΐ dos antigenos indicados ou 5 μg/ml de PHA (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) por 5 dias. As células foram a seguir pulsadas com 1 μΰί de timidina [H3] para as 18 horas finais de cultura. A figura 16 ilustra a proliferação observada após adição de 10 μς/πιΐ ou 2 0 μρ/ιαΐ de cada um dos seguintes antigenos para uma cultura de nódulo linfático preparada como descrito no Exemplo 7: SLA, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 e M15. O nivel de proliferação sem a adição de antigeno é também conhecida. Os dados estão representados como cpm médio. Esses resultados demonstram que uma variedade de antigenos da Leishmaniose são capazes de proliferação celular de nódulo linfático estimularia a partir de camundongos infectados com Leishmania.

As figuras 17 e 18 ilustram a proliferação observada em preparações PBMC de humano de indivíduos Leishmania-imunes e não infectados, seguindo a adição de 10 μg/ml de M15 e antigenos de Leishmania solúveis, respectivamente. Esses valores são comparados com a proliferação observada seguindo a adição de meio de cultura, lisado de L. major ou L-Rack. Os resultados mostram que M15 e antigenos de Leishmania solúveis estimulam a proliferação em PBMC imune à Leishmania, porém não em PBMC obtido de indivíduos não infectados, demonstrando que M15 e antigenos solúveis (mas não L-Rack) são reconhecidos por PBMC de indivíduos imunes à Leishmania devido a uma infecção prévia. A partir do precedente, será apreciado, que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas aqui com a finalidade de ilustração, várias modificações podem ser feitas, sem que se desvie do espirito e escopo da invenção. LISTAGEM DA SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE: Reed, Steven G.

Campos-Neto, Antonio Webb, John R.

Dillon, Davin C.

Skeiky, Yasir A W.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: "ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA USO NA TERAPIA E DIAGNOSE DA LEISHMANIOSE" (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: SEED and BERRY (B) RUA: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington (E) PAÍS: USA (F) CEP: 98104-7092 (v) FORMA LEGÍVEL DO COMPUTADOR: (A) TIPO MÉDIO: Floppy disk (B) COMPUTADOR: IBM PC Compatible (C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1,0, Version #1,30 (vi) DADOS DO PRESENT PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US (B) DATA DO DEPÓSITO: 22-SET-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÕES DO PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Maki, David J. (B) NÚMERO DO REGISTRO: 31.392 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOCUMENTO: 210121420 (ix) INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (206) 622-4900 (B) TELEFAX: (206) 682-6031 (C) TELEX: 3723836 SEEDANDBERRY (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3134 pares base (B) TIPO: Ácido nucleico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTCA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAÇÃO: 421..2058 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNÇIA: SEQ ID NO: 1: CAAGTGTCGA AGGACAGTGT TCNCCGTGTG AGATCGCCGG CTGTGCGTGT GAAGGCGGTG 60 CCATCGGANA AACAACACCG GTGGANCCGC AGGAAACCAT CTTTCTCCGC AGGTCTCTTT 120 TTGTTGTCGA TTGAGAGTGC NCCAAACCCT GCTGGTGCCC TTCTCACATA TCATGTTTTT 180 CGTTGTGCGC TCGCTTTGCC ITTCCTCTCC TTTCCCTCTC TTCCGTGGTG CCGTGTATAC 240 TTCTGGCACC CGCTACGTCA CTTCGCTGGT TTGAACAGAA CCACTGTGAA CACCCACGGG 300 CGATCGCACA CATACACATC CCTCACTCAC ACACACAGCT ACATCTATCC TACATAAAGC 360 TGAAAAAAAA GTCTACGAAC AATTTTGTTT TTACAGTGCG TTGCCGCACA TTTCTCCGTA 420 ATG GAC GCA ACT GAG CTG AAG AAC AAG GGG AAC GAA GAG TTC TCC GCC 468 Met Asp Ala Thr Glu Leu Lys Asn Lys Gly Asn Glu Glu Phe Ser Ala 1 5 10 15 GGC CGC TAT GTG GAG GCG GTG AAC TAC TTC TCA AAG GCG ATC CAG TTG 516 Gly Arg Tyr Vai Glu Ala Vai Asn Tyr Phe Ser Lys Ala IIe Gin Leu 20 25 30 GAT GAG CAG AAC AGT GTC CTC TAC AGC AAC CGC TCC GCC TGT TTT GCA 56^ Asp Glu Gin Asn Ser Vai Leu Tyr Ser Asn Arg Ser Ala Cys Phe Ala ' 35 40 45 GCC ATG CAG AAA TAC AAG GAC GCG CTG GAC GAC GCC GAC AAG TGC ATC 612 Ala Met Gin Lys Tyr Lys Asp Ala Leu Asp Asp Ala Asp Lys Cys IIe 50 55 60 TCG ATC AAG CCG AAT TGu GCC AAG GGC TAC GTG CGC CGA GGA GCA GCT 660 Ser Ile Lys Pro Asn Trp Ala Lys Gly Tyr Vai Arg Arg Gly Ala Ala . 65 70 75 80 CTC CAT GGC ATG CGC CGC TAC GAC GAT GCC ATT GCC GCG TAT GAA AAG 708 Leu His Gly Met Arg Arg Tyr Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr Glu Lys 85 90 95 GGG CTC AAG GTG GAC CCT TCC AAC AGC GGC TGC GCG CAG GGC GTG AAG 756 Gly Leu Lys Vai Asp Pro Ser Asn Ser Gly Cys Ala Gin Gly Vai Lys 100 105 110 GAC GTG CAG GTA GCC AAG GCC CGC GAA GCA CGT GAC CCC ATC GCT CGC 804 Asp Vai Gin Vai Ala Lys Ala Arg Glu Ala Arg Asp Pro Ile Ala Arg 115 120 125 GTC TTC ACC CCG GAG GCG TTC CGC AAG ATC CAA GAG AAT CCC AAG CTG 852 Vai Phe Thr Pro Glu Ala Phe Arg Lys Ile Gin Glu Asn Pro Lys Leu 130 135 140 TCT CTA CTT ATG CTG CAG CCG GAC TAC GTG AAG ATG GTA GAC ACC GTC 900 Ser Leu Leu Met Leu Gin Pro Asp Tyr- Vai Lys Met Vai Asp Thr Vai 145 150 . 155 160 ATC CGC GAC CCT TCG'CAG GGC CGG CTG TAC ATG GAA GAC CAG CGC TTT 948 Ile Arg Asp Pro Ser Gin Gly Arg Leu Tyr Met Glu Aso Gin Arg Phe 165 170 ' 175 GCC CTG ACG CTC ATG TAC CTG AGC GGA ATG AAG ATT CCC AAC GAT GGT 996 Ala Leu Thr Leu Met Tyr Leu Ser Gly Met Lys Ile Pro Asn Asp Gly 180 185 190 GAT GGC GAG GAG GAG GAA CGT CCG TCT GCG AAG GCG GCA GAG ACA GCG 1044 Asp Gly Glu Glu Glu Glu Arg Pro Ser Ala Lys Ala Ala Glu Thr Ala 195 200 205 AAG CCA AAA GAG GAG AAG CCT CTC ACC GAC AAC GAG AAG GAG GCC CTG 1032 Lys Pro Lys Glu Glu Lys Pro Leu Thr Asp Asn Glu Lys Glu Ala Leu 210 215 220 GCG CTC AAG GAG GAG GGC AAC AAG CTG TAC CTC TCG AAG AAG TTT GAG 1140 Ala Leu Lys Glu Glu Gly Asn Lys Leu Tyr Leu Ser Lys Lys Phe Glu 225 230 235 240 GAG GCG CTG ACC AAG TAC CAA GAG GCG CAG GTG AAA GAC CCC AAC AAC 1188 Glu Ala Leu Thr Lys Tyr Gin Glu Ala Gin Vai Lys Asp Pro Asn Asn 245 250 255 ACT TTA TAC ATT CTG AAC GTG TCG GCC GTG TAC TTC GAG CAG GGT GAC 1236 Thr Leu Tyr I1e Leu Asn Vai Ser Ala Vai Tyr Phe Glu Gin Gly Asp 260 265 270 TAC GAC AAG TGC ATC GCC GAG TGC GAG CAC GGT ATC GAG CAC GGT CGC 1284 Tyr Asp Lys Cys IIe Ala Glu Cys Glu His Gly lie Glu His Gly Arg 275 280 285 GAG AAC CAC TGC GAC TAC ACA ATC ATT GCG AAG CTC ATG ACC CGG AAC 1332 Glu Asn His Cys Asp Tyr Thr IIe IIe Ala Lys Leu Met Thr Arg Asn 290 295 300 GCC TTG TGC CTC CAG AGG CAG AGG AAG TAC GAG GCT GCT ATC GAC CTT 1380 Ala Leu Cys Leu Gin Arg Gin Arg Lys Tyr Glu Ala Ala IIe Asp Leu 305 310 315 320 TAC AAG CGC GCC CTT GTC GAG TGG CGT AAC CCT GAC ACC CTC AAG AAG 1428 Tyr Lys Arg Ala Leu Vai Glu Trp Arg Asn Pro Asp Thr Leu Lys Lys 325 330 335 CTG ACG GAG TGC GAG AAG GAG CAC CAA AAG GCG GTG GAG GAA GCC TAC 1476 Leu Thr Glu Cys Glu Lys Glu His Gin Lys Ala Vai Glu Glu Ala Tyr 340 345 350 ATC GAT CCT GAG ATC GCG AAG CAG AAG AAA GAC GAA GGT AAC CAG TAC 1524 Ile Asp Pro Glu I1e Ala Lys Gin Lys Lys Asp Glu Gly Asn Gin Tyr 355 360 365 TTC AAG GAG GAT AAG TTC CCC GAG GCC GTG GCA GCG TAC ACG GAG GCC 1572 Phe Lys Glu Asp Lys Phe Pro Glu Ala Vai Ala Ala Tyr Thr Glu Ala 370 375 380 ATC AAG CGC AAC CCT GCC GAG CAC ACC TCC TAC AGC AAT CGC GCG GCC 1620 Ile Lys Arg Asn Pro Ala Glu His Thr Ser Tyr Ser Asn Arg Ala Ala 385 390 395 400 GCG TAC ATC AAG CTT GGA GCC TTC AAC GAC GCC CTC AAG GAC GCG GA.G 1668 Ala Tyr I1e Lys Leu Gly Ala Phe Asn Asp Ala Leu Lys Asp Ala Glu 405 410 415 AAG TGC ATT GAG CTG AAG CCC GAC TTT GTT AAG GGC TAC GCG CGC AAG 1716 Lys Cys IIe Glu Leu Lys Pro Asp Phe Vai Lys Gly Tyr Ala Arg Lys 420 425 430 GGT CAT GCT TAC TTT TGG ACC AAG CAG TAC AAC CGC GCG CTG CAG GCG 1764 Gly His Ala Tyr Phe Trp Thr Lys Gin Tyr Asn Arg Ala Leu Gin Ala 435 440 445 TAC GAT GAG GGC CTC AAG GTG GAC CCG AGC AAT GCG GAC TGC AA.G GAT 1312 Tyr Asp Glu Gly Leu Lys Vai Asp Pro Ser Asn Ala Asp Cys Lys Aso 450 455 460 ' ' GGG CGG TAT CGC ACA ATC ATG AAG ATT CAG GAG ATG GCA TCT GGC CAA 1S60 Gly Arg Tyr Arg Thr IIe Met Lys Πe Gin Glu Met Ala Ser Gly Gin 465 470 475 480 TCC GCG GAT GGC GAC GAG GCG GCG CGC CGG GCC ATG GAC GAT CCT GAA 1908 Ser Ala Asp Gly Asp Glu Ala Ala Arg Arg Ala Met Asp Asp Pro Glu 485 490 ' 495 ATC GCG GCA ATC ATG CAA GAT AGC TAC ATG CAA CTA GTG TTG AAG GAG 1956 ' IIe Ala Ala Ile Met Gin Asp Ser Tyr Met Gin Leu Vai Leu Lys Glu 500 505 510 ATG CAG AAC GAT CCC ACG CGC ATT CAG GAG TAC ATG AAG GAC TCC GGG 2004 Met Gin Asn Asp Pro Thr Arg Ile Gin Glu Tyr Met Lys Asp Ser Gly 515 520 525 ATC TCA TCG AAG ATC AAC AAG CTG ATT TCA GCT GGC ATC ATT CGT TTT 2052 Ile Ser Ser Lys Ile Asn Lys Leu Ile Ser Ala Gly Ile Ile Arg Phe 530 535 540 GGT CAG TAGACTTCTA CGCTGCCTCA TCTTTTCCGT GTCTTTGCGT CGGCGGGTAT 2108 Gly Gin 545 CGTAAAGCAC AATAAAGCAG CGATTCACAT GCACGAGTAA AGTGCTGCGC CTCTCAAACA 2168 CGACGTCGAG GCTGTGGTGC AGATGCGCGT CCTGCATGAA GGTAGTGAAG AGGAAAGTAA 2228 GGGATGTTGT TTGTGGGCCT TCGTGGCTGC GCACACACCT CTTATCTCCT TCGCTTGGTA 2288 CCTTCTCCCT TTTTCC-TCTT CACCCCCCTT TCTCTTCTCA CGCTCTCCCT GGCGCGGTGG 2348 TGCAACGATT TCGTTTTATT TACGTCTGTG TAGCTCCTCT ATTCAACGGT GCGATGACGC 2408 TAACGAAGCT GGCCTGTATT CGGCTAAGGC GAAGGCAAAA GACTAGGAGG GGGGGGGGAA 2468 GGAGACGGCG TGACCATCAC TGCGAAGAAA CAAGCCGAAG AAAAGGCCCC GAACGCCTGC 2523 ATTTCCGCGC GCCCTCGCCC GCCTTCCTTC CTTCCTTCGC TCTCTCTCTC TCTCTCTCTC 2533 GCTATCTTCT CAACGGAGAC ATGAAAGGCG TTTGTTAGGA AAAGAGGGGG GGGGGAAGAG 2648 TGGGACGACG CGCTGCGTCT TTTGGGCACT GGTCACGTGC GTCACCCTCT TTTTTTATCT 2708 CTATTGGCAC TGTCTTGTTT CTTTTCCCTT TCCTATCATA CGCGTCTCGC AAACGACTCC 2768 GCGCTGAGCA GCCATGTGCT GCGGCGTGGA GGAAGTACAC AGACATCACG GATGCATATG 2828 TGCGCGTCCG TGTACGCGCT TGTATGGGGC TTCTAACAGC GCCTGTGTGT GTTTGTGTGT 2888 GTGTGTGTGT GTGTGTCTGT GTATTTCGAG CGTCTGTATG CTATTCTATT AAGCACCGAA 2948 GAAGAGACAC ACACGACAGC GAAGGAGATG GTGTCGGCTT TTCGGCTAAT CACTCCCTTC 3008 CATAGCTTCT CTGAAGGAGG CTCTCTTCCA GAGGAATAGA CTGCAGATGG GGTCCACGTT 3068 TATCTGA.GGA GTCAACGGAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3128 CTCGAG 3134 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 546 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Met Asp Ala Thr G1u Leu Lys Asn Lys Gly Asn Glu Glu Phe Ser Ala 1 5 i0 15 Gly Arg Tyr Vai Glu Ala Vai Asn Tyr Phe Ser Lys Ala IIe Gin Leu 20 25 30 Asp Glu Gin Asn Ser Vai Leu Tyr Ser Asn Arg Ser Ala Cys Phe Ala 35 40 45 Ala Met Gin Lys Tyr Lys Asp Ala Leu Asp Asp Ala Asp Lys Cys IIe 50 55 50 Ser IIe Lys Pro Asn irp Ala Lys Gly iyr Vai Arg Arg Gly Ala Ala 65 70 75 80 Leu His Gly Met Arg Arg Tyr Asp Asp Ala Π e Ala Al a Tyr Glu Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Vai Asp Pro Ser Asn Ser Gly Cys Ala Gin Gly Vai Lys 100 105 110 Asp Vai Gin Vai Ala Lys Ala Arg Glu Ala Arg Asp Pro íle Ala Arg 115 120 125 Vai Phe Thr Pro Glu Ala Phe Arg Lys I1e Gin Glu Asn Pro Lys Leu 130 135 140 Ser Leu Leu Met Leu Gin Pro Asp Tyr Vai Lys Met Vai Asp Thr Vai 145 150 155 160 Ile Arg Asp Pro Ser Gin Gly Arg Leu Tyr Met Glu Asp Gin Arg Phe 165 170 175 Ala Leu Thr Leu Met Tyr Leu Ser Gly Met Lys Ile Pro Asn Asp Gly 180 185 190 Asp Gly Glu Glu Glu Glu Arg Pro Ser Ala Lys Ala Ala Glu Thr Ala 195 200 ' 205 Lys Pro Lys Glu Glu Lys Pro Leu Thr Asp Asn Glu Lys Glu Ala Leu 210 215 220 Ala Leu Lys Glu Glu Gly Asn Lys Leu Tyr Leu Ser Lys Lys Phe Glu 225 230 235 240 Glu Ala Leu Thr Lys Tyr Gin Glu Ala Gin Vai Lys Asp Pro Asn Asn 245 250 255 Thr Leu Tyr Ile Leu Asn Vai Ser Ala Vai Tyr Phe Glu Gin Gly Asp 260 265 270 Tyr Asp Lys Cys Ile Ala Glu Cys Glu His Gly Ile Glu His Gly Arg 275 280 285 Glu Asn His Cys Asp Tyr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Met Thr Arg Asn 290 295 300 Ala Leu Cys Leu Gin Arg Gin Arg Lys Tyr Glu Ala Ala Ile Asp Leu 305 310 . 315 320 Tyr Lys Arg Ala Leu Vai Glu Trp Arg Asn Pro Asp Thr Leu Lys Lys 325 330 ·. 335 Leu Thr Glu Cys Glu Lys Glu His Gin Lys Ala Vai Glu Glu Ala Tyr 340 345 350 Ile Asp Pro Glu lie Ala Lys Gin Lys Lys Asp Glu Gly Asn Gin Tyr 355 350 365 Phe Lys Glu Asp Lys Phe Pro Glu Ala Vai Ala Ala Tyr Thr Glu Ala 370 375 380 Ile Lys Arg Asn Pro Ala Glu His Thr Ser Tyr Ser Asn Ara Ala Ala 385 390 395 " 400 Ala Tyr Ile Lys Leu Gly Ala Phe Asn Asp Ala Leu Lys Asd Ala Glu 405 410 ' 415 Lys Cys Ile Glu Leu Lys Pro Asp Phe Vai Lys Gly Tyr Ala Ara Lys 420 425 430 ' Gly His Ala Tyr Phe Trp Thr Lys Gin Tyr Asn Arg Ala Leu Gin Ala 435 440 445 Tyr Asp Glu Gly Leu Lys Vai Asp Pro Ser Asn Ala Asp Cys Lys Asp 450 455 460 ’ Gly Arg Tyr Arg Thr Ile Met Lys Ile Gin Glu Met Ala Ser Gly Gin 465 470 475 480 Ser Ala Asp Gly Asp Glu Ala Ala Arg Arg Ala Met Asp Asp Pro Glu 485 490 495 Ile Ala Ala Ile Met Gin Asp Ser Tyr Met Gin Leu Vai Leu Lys Glu 500 . 505 510 Met Gin Asn Asp Pro Thr Arg Ile Gin Glu Tyr Met Lys Asp Ser Gly 515 520 ' 525 Ile Ser Ser Lys Ile Asn Lys Leu Ile Ser Ala Gly Ile Ile Arg Phe 530 535 540 Gly Gin 545 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 676 pares base (B) TIPO: Ácido nucleico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍ STCA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAÇÃO: 26..550 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AATTCGGCAC GAGGCATTGT GCATA ATG GTC AAG ICC CAC TAC ATC TGC GCG 52 Met Vai Lys Ser His Tyr IIe Cys Ala 550 555 GGC CGC CTG GTG CGC ATC CTG CGT GGC CCC CGC CAG GAC CGC GTT GGT 100 Gly Arg Leu Vai Arg Ile Leu Ara Gly Pro Arg Gin Asp Arg Vai Gly 560 565 570 GTG ATC GTC GAC ATT GTC GAC GCG AAC CGC GTG CTG GTG GAG AAC CCG 148 Vai Ile Vai Asp Ile Vai Asp Ala Asn Arg Vai Leu Vai Glu Asn Pro 575 580 585 GAG GAC GCG AAG ATG TGG CGC CAC GTG CAG AAC CTG AAG AAC GTG GAG ' 196 Glu Asp Ala Lys Met Trp Arg His Vai Gin Asn Leu Lys Asn Vai Glu 590 595 600 CCG CTG AAG TAC TGC GTG AGC GTC AGC CGC AAC TGC AGC GCG AAG GCG 244 Pro Leu Lys Tyr Cys Vai Ser Vai Ser Arg Asn Cys Ser Ala Lys Ala 605 610 615 CTG AAG GAT GCG CTG GCC TCG TCG AAG GCG CTG GAG AA.G TAC GCG AAG 292 Leu Lys Asp Ala Leu Ala Ser Ser Lys Ala Leu Glu Lys Tyr Ala Lys 620 625 630 635 ACG CGC ACT GCT GCG CGC GTG GAG GCG AAG AAG GCG TGC GCC GCG TCG 340 Thr Arg Thr Ala Ala Arg Vai Glu Ala Lys Lys Ala Cys Ala Ala Ser 640 645 650 ACG GAC TTC GAG CGC TAC CAG CTG CGC GTT GCG CGC CGT TCT CGC GCG 388 Thr Asp Phe Glu Arg Tyr Gin Leu Arg Vai Ala Arg Arg Ser Arg Ala 655 660 665 CAC TGG GCG CGC AAG GTG TTC GAC GAG AAG GAC GCG AAG ACG CCC GTG 436 His Trp Ala Arg Lys Vai Phe Asp Glu Lys Asp Ala Lys Thr Pro Vai 670 675 680 TCG TGG CAC AAG GTT GCG CTG AAG AAG ATG CAG AAG AAG GCC GCA AAG 484 Ser Trp His Lys Vai Ala Leu Lys Lys Met Gin Lys Lys Ala Ala Lys 685 690 695 ATG GAC TCG ACC GAG GGC GCT AAG AGG CGC ATG CAG AAG GCG ATC GCT 532 ' Met Asp Ser Thr G1u Gly Ala Lys Arg Arg Met Gin Lys Ala I1e Ala 700 705 710 715 GCC CGC AAG GCG AAA AAG TAAGGCCATA CCCTCACTTC GCTTGTTTCG 580 Ala Arg Lys Ala Lys Lys 720 . TGATTTTTCG TGGGAGTCGG TGGCCCTACC AGCGGTCTTT CATTGGCTTA TTTCTATCCG 640 GTCTGAAAGA GGTACAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 676 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 175 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: Met Vai Lys Ser His Tyr IIe Cys Ala Gly Arg Leu Vai Arg IIe Leu 15 10 15 Arg Gly Pro Arg Gin Asp Ara Vai Gly Vai IIe Vai Asp I1e Vai Asp 20 25 30 Ala Asn Arg Vai Leu Vai Glu Asn Pro Glu Asp Ala Lys Met Trp Ara 35 40 45 His Vai Gin Asn Leu Lys Asn Vai Glu Pro Leu Lys Tyr Cys Vai Ser 50 55 60 Vai Ser Arg Asn Cys Ser Ala Lys Ala Leu Lys Asp Ala Leu Ala Ser 65 ~ 70 75 80 Ser Lys Ala Leu Glu Lys Tyr Ala Lys Thr Arg Thr Ala Ala Arg Vai 85 90 95 Glu Ala Lvs Lys Ala Cys Ala Ala Ser Thr Asp Phe Glu Arg Tyr Gin 100 105 110 Leu Arg Vai Ala Arg Ara Ser Arg Ala His Trp Ala Arg Lys Vai Phe ’ 115 ' 120 125 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Thr °ro Vai Ser Trp His Lys Vai Ala Leu ~ 130 135 140 Lys Lys Met Gin Lys Lys Ala Ala Lys Met Asp Ser Thr Glu Gly Ala 145 150 155 150 Lys Arg Arg Met Gin Lys Alc I1e Ala Ala Arg Lys Ala Lys Lys ' 155 170 175 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2040 pares base (B) TIPO: Ácido nucleico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍ STCA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAÇÃO: 62..2029 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: CGCGGTGGCG GCCGCTCTAG AACTAGTGGA TCCCCCGGGC TGCAGGAATT CGGCACGAGA 50 G AGC CTG ACG GAC CCG GCG GTG CTG GGC GAG GAG ACT CAC CTG CGC 105 Ser Leu Thr Asp Pro Ala Vai Leu Gly Glu Glu Thr His Leu Ara 180 185 ISO GTC CGC GTG GTG CCG GAC AAG GCG AAC AAG ACG CTG ACG GTG GAG GAT 154 Vai Arg Vai Vai Pro Asp Lys Ala Asn Lys Thr Leu Thr Vai Glu Asp 195 200 205 AAC GGC ATC GGC ATG ACC AAG GCG GAC CTC GTG AA.C AAT CTG GGC ACG 202 Asn Gly IIe Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Vai Asn Asn Leu Gly Thr 210 215 220 ATC GCG CGC TCC GGC ACG AAG GCT TTC ATG GAG GCA CTG GAG GCC GGC 250 IIe Ala Arg Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu Ala Leu Glu Ala Gly 225 230 235 GGC GAC ATG AGC ATG ATC GGC CAG TTC GGT GTC GGC TTC TAC TCC GCG 2SS

Gly Aso Met Ser Met Ile Gly Gin Phe Gly Vai Gly Phe Tyr Ser Ala 240 245 250 TAC CTT GTG GCG GAC CGC GTG ACG GTG GTG TCG AAG AAC AAC TCG GAC 3^6 Tyr Leu Vai Ala Asp Arg Vai Thr Vai Vai Ser Lys Asn Asn Ser Asp 255 260 265 270 5AG GCG TAC TGG GAA TCG TCT GCG GGG GGC ACG TTC A.CC ATC ACG AGC 394 Glu Ala Tyr Trp Glu Ser Ser Ala Gly Gly Thr Phe Thr Ile Thr Ser 275 280 285 GTG CAG GAG TCG GAC ATG AAG CGC GGC ACG AGT ACA ACG CTG CAC CTA 4*2 Vai Gin Glu Ser Asp Met Lys Arg Gly Thr Ser Thr Thr Leu His Leu 290 295 300 AAG GAG GAC CAG CAG GAG TAC CTG GAG GAG CGC CC-G GTG AAG GAG CTG 490 Lys Giu Asp Gin Gin Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Vai Lys Glu Leu 305 310 315 ATC AAG AAG CAC TCC GAG TTC ATC GGC TAC GAC ATC GAG CTG ATG GTG 538 Ile Lys Lys His Ser Glu Phe Ile Gly Tyr Asp Ile Glu Leu Met Vai 320 325 330 GAG AAG ACG GCG GAG AAG GAG GTG ACG GAC GAG GAC GAG GAG GAG GAC 586 Glu Lys Thr Ala Glu Lys Glu Vai Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp 335 340 345 350 GAG TCG AAG AAG AAG TCC TGC GGG GAC GAG GGC GAG CCG AAG GTG GAG 634 Glu Ser Lys Lys Lys Ser Cys Gly Asp Glu Gly Glu Pro Lys Vai Glu 355 360 365 GAG GTG ACG GAG GGC GGC GAG GAC AAG AAG AAG AA.G ACG AAG AAG GTG 632 Glu Vai T'nr Glu Gly Gly Glu Asp Lys Lys Lys Lys Thr Lys Lys Vai 370 375 380 AAG GAG GTG AAG AAG ACG TAC GAG GTC AAG AAC AAG CAC AAG CCG CTC 730 ' Lys Glu Vai Lys Lys Thr Tyr Glu Vai Lys Asn Lys His Lys Pro Leu 385 390 395 TGG ACG CGC GAC ACG AAG GAC GTG ACG AAG GAG GAG TAC GCG GCC TTC 778 Trp Thr Arg Asp Thr Lys Asp Vai Thr Lys Glu Glu Tyr Ala Ala Phe 400 405 410 TAC AAG GCC ATC TCC AAC GAC TGG GAG GAC ACG GCG GCG ACG AAG CAC 826 Tyr Lys Ala Ile Ser Asn Asp Trp Glu Asp Thr Ala Ala Thr Lys His 415 420 425 430 TTC TCG GTG GAG GGC CAG CTG GAG TTC CGC GCG ATC GCG TTC GTG CCG 874 Phe Ser Vai Glu Gly Gin Leu Glu Phe Arg Ala Ile Ala Phe Vai Pro 435 440 445 AAG CGC GCG CCG TTC GAC ATG TTC GAG CCG AAC AAG AAG CGC AAC MG 922 Lys Ara Ala Pro Phe Asp Met Phe Glu Pro Asn Lys Lys Arg Asn Asn 450 455 450 ATC MG CTG TAC GTG CGC CGC GTG TTC ATC ATG GAC MC TGC GAG GAC 970 lie Lys Leu Tyr Vai Arg Arg Vai Phe 11e Met Asp Asn Cys Glu Asp 455 ^70 475 CTG TGC CCG GAC TGG CTC GGC TTC GTG AAG GGC GTC GTG GAC AGC GAG 1018 Leu Cys Pro Asp Trp Leu Gly Phe Vai Lys Gly Vai Vai Asp Ser Glu 480 485 490 GAC CTG CCG CTG MC ATC TCG CGC GAG MC CTG CAG CAG MC MG ATC 1065 Asp Leu Pro Leu Asn IIe Ser Arg Glu Asn Leu Gin Gin Asn Lys IIe 495 500 505 510 CTG AAG GTG ATC CGC AAG AAC ATC GTG MG MG TGC CTG GAG CTG TTC 1114 Leu Lys -Vai 11 e Arg Lys Asn ile Vai Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe 515 520 525 GAA GAG ATA GCG GAG AAC AAG GAG GA.C TAC MG CAG TTC TAC GAG CAG 1162 Glu Glu Ile Ala Glu Asn Lys Glu Asp Tyr Lys Gin Phe Tyr Glu Gin 530 535 540 TTC GGC MG MC ATC MG CTG GGC ATC CAC GAG GAC ACG GCG MC CGC 1210 Phe Gly Lys Asn Ile Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Thr Ala Asn Arg 545 550 555 MG MG CTG ATG GAG TTG CTG CGC TTC TAC AGC ACC GAG TCG GGG GAG 1258 Lys Lys Leu Met Glu Leu Leu Arg Phe Tyr Ser Thr Glu Ser Gly Glu 560 565 570 GAG ATG ACG ACA CTG MG GAC TAC GTG ACG CGC ATG MG CCG GAG CAG 1306 Glu Met Thr Thr Leu Lys Asp Tyr Vai Thr Arg Met Lys Pro Glu Gin 575 580 585 590 MG TCG ATC TAC TAC ATC ACT GGC GA.C AGC MG MG MG CTG GAG TCG 1354 Lys Ser Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Asp Ser Lys Lys Lys Leu Glu Ser 595 600 605 TCG CCG TTC ATC GAG MG GCG AGA CGC TGC GGG CTC GAG GTG CTG TTC 1402 Ser Pro Phe Ile Glu Lys Ala Arg Arg Cys Gly Leu Glu Vai Leu Phe 610 615 620 ATG ACG GAG CCG ATC GAC GAG TAC GTG ATG CAG CAG GTG MG GAC TTC 1450 Met Thr Glu Pro Ile Asp Glu Tyr Vai Met Gin Gin Vai Lys Asp Phe 625 630 635 GAG GAC MG AAG TTC GCG TGC CTG ACG MG GAA GGC GTG CAC TTC GAG 1498 Glu Asp Lvs Lys Phe Ala Cys Leu inr Lys Glu Gly Vai His t’he Glu 640 645 650 GAG ICC GAG GAG GAG AAG AAG CAG CGC GAG GAG AAG AAG GCG GCG TGC 1546 Glu Ser Glu Glu Glu Lys Lys Gin Arg Glu Glu Lys Lys Ala Ala Cys 655 660 665 670 GAG AAG CTG TGC AAG ACG ATG AAG GAG GTG CTG GGC GAC AAG GTG GAG 1594 Glu Lys Leu Cys Lys íhr Met Lys Glu Vai Leu Gly Asp Lys Vai Glu 675 630 685 AAG GTG ACC GTG TCG GAG CGC CTG TTG ACG TCG CCG TGC ATC CTG GTG 1642 Lys Vai Thr Vai Ser Glu Arg Leu Leu Thr Ser Pro Cys IIe Leu Vai 690 695 700 ACG TCG GAG TTT GGG TGG TCG GCG CAC ATG GAA CAG ATC ATG CGC AAC 1690 Thr Ser Glu Phe Gly Trp Ser Ala His Met Glu Gin Ile Met Arg Asn 705 710 715 CAG GCG CTG CGC GAC TCC AGC ATG GCG CAG TAC ATG GTG TCC AAG AAG 1738 Gin Ala Leu Arg Asp Ser Ser Met Ala Gin Tyr Met Vai Ser Lys Lys 720 725 730 ACG ATG GAG GTG AAC CCC GAC CAC CCC ATC ATC AAG GAG CTG CGC CGC 1786 Thr Met Glu Vai Asn Pro Asp His Pro Ile Ile Lys Glu Leu Arg Arg 735 740 745 750 CGC GTG GAG GCG GAC GAG AAC GAC AAG GCC GTG AAG GAC CTC GTC TTC 1834 Arg Vai Glu Ala Asp Glu Asn Asp Lys Ala Vai Lys Asp Leu Vai Phe 755 760 765 CTG CTC TTC GAC ACG TCG CTG CTC ACG TCC GGC TTC CAG CTG GAT GAC 1882 Leu Leu Phe Asp Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Phe Gin Leu Asp Asp 770 775 780 CCC ACC GGC TAC GCC GAG CGC ATC AAC CGC ATG ATC AAG CTC GGC CTG 1930 Pro Thr Gly Tyr Ala Glu Arg Ile Asn Arg Met Ile Lys Leu Gly Leu 785 790 795 TCG CTC GAC GAG GAG GAG GAG GAG GTC GCC GAG GCG CCG CCG GCC GAG 1978 Ser Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Vai Ala Glu Ala Pro Pro Ala Glu 800 805 810 GCA GCC CCC GCG GAG GTC ACC GCC GGC ACC TCC AGC ATG GAG CAG GTG 2026 Ala Ala Pro Ala Glu Vai Thr Ala Gly Thr Ser Ser Met Glu Gin Vai 815 820 825 830 GAC TGAGCCGGTA A 2040 Asp (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 6 arriinoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: Ser Leu Thr Asp Pro Ala Vai Leu Gly Glu Glu Thr His Leu Arg Vai I 5 10 15 Arg Vai Vai Pro Asp Lys Ala Asn Lys Thr Leu Thr Vai Glu Asp Asn 20 25 30 Gly Πe Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Vai Asn Asn Leu Gly Thr IIe 35 40 45 Ala Arg Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu Ala Leu Glu Ala Gly Gly 50 55 60 Asp Met Ser Met I1e Gly Gin Phe Gly Vai Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr 65 70 75 80 leu Vai Ala Asp Arg Vai Thr Vai Vai Ser Lys Asn Asn Ser Asp Glu 85 90 95 Ala Tyr Tro Glu Ser Ser Ala Gly Gly Thr Phe Thr Ile Thr Ser Vai 100 105 110 Gin Glu Ser Asp Met Lys Arg Gly Thr Ser Thr Thr Leu His Leu Lys 115 120 125 Glu Asp Gin Gin Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Vai Lys Glu Leu Ile 130 . 135 140 Lys Lys His Ser Glu Phe Ile Gly Tyr Asp Ile Glu Leu Met Vai Glu 145 150 155 160 Lys Thr Ala Glu Lys Glu Vai Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu 165 170 175 Ser Lys Lvs Lys Ser Cys Gly Asp Glu Gly Glu Pro Lys Vai Glu Glu ' ' 180 185 190 Vai Th.r Glu Gly Gly Glu Asp Lys Lys Lys Lys Thr Lys Lys Vai Lys 195 200 205 Glu Vai Lys Lys Thr Tyr Glu Vai Lys Asn Lys His Lys Pro Leu Trp 210 215 220 Thr Arg Asp Thr Lys Asp Vai Thr Lys Glu Glu Tyr Ala Ala Phe Tyr 225 230 235 240 Lys Ala He Ser Asn Asp Trp Glu Asp Thr Ala Ala Thr Lys His Phe 245 ■ ■ 250 255 Ser Vai Glu Gly Gin Leu Glu Phe Arg Ala Ile Ala Phe Vai Pro Lys 260 ■ 265 270 Arg Ala Pro Phe Asp Met Phe Glu Pro Asn Lys Lys Arg Asn Asn Ile 275 280 285 Lys Leu Tyr Vai Arg Arg Vai Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Asp Leu 290 295 300 Cys Pro Asp Trp Leu Gly Phe Vai Lys Gly Vai Vai Asp Ser Glu Asp 305 310 315 320 Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg Glu Asn Leu Gin Gin Asn Lys Ile Leu 325 ' 330 335 Lys Vai Ile Arg Lys Asn Ile Vai Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe Glu 340 345 350 Glu Ile Ala Glu Asn Lys Glu Asp Tyr Lys Gin Phe Tyr Glu Gin Phe 355 360 365 Gly Lys Asn Ile Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Thr Ala Asn Arg Lys 370 375 380 Lys Leu Met Glu Leu Leu Arg Phe Tyr Ser Thr Glu Ser Gly Glu Glu 385 390 395 400 Met Thr Thr Leu Lys Asp Tyr Vai Thr Arg Met Lys Pro Glu Gin Lys 405 410 415 Ser Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Asp Ser Lys Lys Lys Leu Glu Ser Ser 420 425 430 Pro Phe Ile Glu Lys Ala Arg Arg Cys Gly Leu Glu Vai Leu Phe Met 435 440 445 Thr Glu Pro Ile Asp Glu Tyr Vai Met Gin Gin Vai Lys Asp Phe Glu 450 455 460 Asp Lys Lys Phe Ala Cys Leu ihr Lys Glu Gly Vai His Phe Glu Glu 465 470 475 430 Ser Glu Glu Glu Lys Lys Gin Arg Glu Glu Lys Lys Ala Ala Cys Glu 485 490 495 Lys Leu Cys Lys Thr Met Lys Glu Vai Leu Gly Asp Lys Vai Glu Lys 500 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GAG GAG GCG GCC CGC CTG GAT GTC ATG 384 Arg Ala Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met 115 120 125 CAT GCG GCC GAG CAG GCC CGC GTC CAG GCC CTC GAG GAG GCA GCG CGT 432 His Ala Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg 130 135 140 CTC CGC GCG GAG CTG GAG GAG GCC GAG GAG GCG GCC CGC CTG GAG GCC 480 Leu Arg Ala Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala 145 150 155 160 ATG CAC GAG GCC GAG CAG GCC CGC TCC CAG GCC CTC GAG GAG GCA GCG 528 Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Ser Gin Ala Leu Glu Glu Ala A':a 165 170 . 175 CGT CTC CGC GCG GAG CTG GAG GCG GCC GAG GAG GCG GCC CGC CTG GAT 576 Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asp 180 185 190 ’ GTC ATG CAC GAG GCC GAG CAG GCC CGT GTC CAG GCC CTC GAG GAG GCG 624 Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala 195 200 205 GCG CGC CTG GAT GTC ATG CAC GAG GCC GAG CAG GCC CGC GTC CAG GCC 672 Ala Ara Leu Asp Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala 210 215 220 * CTC GAG GAG GCA GCG CGT CTC CGC GCG GAG CTG GAG GCG GCC GAG GAG 720 Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Glu 225 230 235 240 GCG GCC CGC CTG GAT GTC ATG CAC GAG GCC GAG CAG GCC CGC GTC CAG 768 Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin 245 250 ’ 255 GCC CTC GAG GAG GCA GCG CGT CTC CGC GCG GAG CTG GAG GCG GCC GAG 816 Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu 260 265 270 GAG GCG GCC CGC CTG GAT GTC ATG CAC GAG GGC GAG CAG GCC CGT GTC 864 Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Glu Gly Glu Gin Ala Arg Vai 275 280 285 CAG GCC CTC GAG GAG GCG GCC CGC CTG GAG GCC ATG CAC GAG GCC GAG 912 Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Met His Glu Ala Glu 290 295 300 CAG GCC CGC TCC CAG GCC CTC GAG GAG GCA GCG CGT CTC TGC GCG GAG 960 Gin Ala Arg Ser Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Cys Ala Glu 305 310 315 320 CTG GAG GCT GAG GAG GAG GAA AAA GAT GAG CGG CCG GCG ACG TCG AGC 1008 Leu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Lys Asp Glu Arg Pro Ala Thr Ser Ser 325 330 335 TAC AGC GAG GAG TGC AAA GGG CGA CTG CTA TCG AGG GCG CGG CCG GAT 1056 Tyr Ser Glu Glu Cys Lys Gly Arg Leu Leu Ser Arg Ala Arg Pro Asp 340 345 350 CCG CGG AGG CCG CTG CCG CGG CCG TTC ATT GGG ATG TCA CTG TTG GAG 1104 Pro Arg Arg Pro Leu Pro Arg Pro Phe Ile Gly Met Ser Leu Leu Glu 355 360 365 GAT GTG GAG AAG AGT ATT CTC ATT GTG GAC GGG CTC TAC AGG GAT GGG 1152 Asp Vai Glu Lys Ser IIe Leu IIe Vai Asp Gly Leu Tyr Arg Asp-Gly 370 375 380 CCG GCG TAC CAG ACG GGC ATC CGC CTC GGG GAT GTC CTC TTG CGT ATC 1200 Pro Ala Tyr Gin Thr Gly IIe Arg Leu Gly Asp Vai Leu Leu Arg IIe 385 390 395 400 GCG GGG GTT TAC GTG GAT TCA ATA GCG AAG GCG AGG CAG GTG GTC GAT 1248 Ala Gly Vai Tyr Vai Asp Ser IIe Al a Lys Ala Arg Gin Vai Vai Asp 405 410 415 GCG CGT TGC CGC TGC GGC TGC GTC GTT CCC GTG ACG CTG GCG ACG AAG 1295 Ala Arg Cys Arg Cys Gly Cys Vai Vai Pro Vai Thr Leu Ala Thr Lys 420 425 430 ATG AAC CAG CAG TAC AGC GTG GCT CTG TAT ATC ATG ACG GTG GAT CCG 1344 Met Asn Gin Gin Tyr Ser Vai Ala Leu Tyr I1e Met Thr Vai Asp Pro 435 440 445 CAG CAC AAC GAC AAG CCC TTT TTT TTT GAT GTG CAC ATC CAC CAC CGC 1392 Gin His Asn Asp Lys Pro Phe Phe Phe Asp Vai His IIe His His Arg 450 455 460 ATC GAG AGC TCG CAC ATG GGG AAG AAG GCG CAG TGG ATG GAA GTT CTT 1440 Ile Glu Ser Ser His Met Gly Lys Lys Ala Gin Trp Met Glu Vai Leu 465 470 475 480 GAG AGC CCA TCC GTA TCT TCG GCT GCC ACC ACC CCT CTC GTG CCG CTC 1488 Glu Ser Pro Ser Vai Ser Ser Ala Ala Thr Thr Pro Leu Vai Pro Leu 485 490 495 TTG CGT GAG CCG ACG CCG CGT AGG GGC TCA GAG CTG CAG TCA AGT GCT 1536 Leu Arg Glu Pro Thr Pro Arg Arg Gly Ser Glu Leu Gin Ser Ser Ala 500 " 505 510 CGT TCC GCC TTC GTT GCC ACG TCT TAC TTC TCG AGC GCG CGC AGG TCG 1584 Arg Ser Ala Phe Vai Ala Thr Ser Tyr Phe Ser Ser Ala Arg Arg Ser 515 520 525 GTC AGC TCA GAA AGT GAG CGA CCG-CGC GGG TCC TCT AGC GTG GCT ATG 1532 Vai Ser Ser Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Ser Ser Ser Vai Ala Met 530 535 540 GCG GAG GAG GCG ATC GCG CTG GCG CCG CAA GGG TAT ACC CCA CCC AAC 1580 Ala Glu Glu Ala Ile Ala Leu Ala Pro Gin Gly Tyr Thr Pro Pro Asn 545 550 555 560 CAA GTG CGC GGC CGT AGT TGACGTCTCT GTGTGAGTGT GTGTCGCTCC 1728 Gin Vai Arg Gly Arg Ser 565 GTCTCCTTCC TTTTTCGTCA TGTGTTTTAT TCATTTCTTT TTC 1771 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 566 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Glu 15 10 15 Leu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Ala Ala 20 25 30 Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala 35 40 45 Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Ala 50 55 60 Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg 65 70 75 S0 Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Met His 85 90 95 Glu Ala Glu Gin Ala Arg Ser Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu 100 105 110 Arg Ala Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met 115 120 125 His Ala Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg 130 135 140 Leu Arg Ala Glu Leu Glu Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala 145 150 155 . 160 Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Ser Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Leu Asd 180 185 190 ' Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala Leu Glu Glu Ala 195 200 205 Ala Arg Leu Asp Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin Ala 210 215 220 Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu Glu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Glu Ala Glu Gin Ala Arg Vai Gin 245 250 255 Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Ala Glu 260 265 270 Glu Ala Ala Arg Leu Asp Vai Met His Glu Gly Glu Gin Ala Arg Vai 275 280 285 Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Met His Glu Ala Glu 290 295 300 Gin Ala Arg Ser Gin Ala Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Cys Ala Glu 305 310 315 320 Leu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Lys Asp Glu Arg Pro Ala Thr Ser Ser 325 330 335 Tyr Ser Glu Glu Cys Lys Gly Arg Leu Leu Ser Arg Ala Arg Pro Asp 340 345 350 Pro Arg Arg Pro Leu Pro Arg Pro Phe He Gly Met Ser Leu Leu Glu ' 355 360 365 Asp Vai Glu Lys Ser Ile Leu I1e Vai Asp Gly Leu Tyr Arg Asp Gly 370 375 380 Pro Ala Tyr Gin Thr Gly Ile Arg Leu Gly Asp Vai Leu Leu Arg Ile 385 390 395 400 Ala Gly Vai Tyr Vai Asp Ser Ile Ala Lys Ala Arg Gin Vai Vai Asp 405 410 415 Ala Arg Cys Arg Cys Gly Cys Vai Vai Pro Vai Thr Leu Ala Thr Lys ' 420 425 430 Met Asn Gin Gin Tyr Ser Vai Ala Leu Tyr Ile Met Thr Vai Asp Pro 435 440 445 Gin His Asn Asp Lys Pro Phe Phe Phe Asp Vai His Ile His His Arg 450 455 460 IIe Glu Ser Ser His Met Gly Lys Lys Ala Gin Trp Met Glu Vai Leu 465 470 475 480 Glu Ser Pro Ser Vai Ser Ser Ala Ala Thr Thr Pro Leu Vai Pro Leu 485 490 495 Leu Arg Glu Pro Thr Pro Arg Arg Gly Ser Glu Leu Gin Ser Ser Ala 500 505 5io Arg Ser Ala Phe Vai Ala Thr Ser Tyr Phe Ser Ser Ala Arg Arg Ser 515 520 525 Vai Ser Ser Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Ser Ser Ser Vai Ala Met 530 535 540 Ala Glu Glu Ala IIe Ala Leu Ala Pro Gin Gly Tyr Thr Pro Pro Asn 545 550 555 550 Gin Vai Arg Gly Arg Ser 565 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1618 pares base (B) TIPO: Ácido nucleico (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTCA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAÇÃO: 115..1323 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: CCACTCTCTC GGTCGTCTGT CTCCCACGCG CGCACGCAGT TGATTTCCGC CTTCTTAAAC 60 GCTCTCTTTT TTTTTATTTT TCACCTGACC AACCGCACCA CGTCGGCCTC CATC ATG 117 ■ Met 1 TCG CAG CAA GAC CGA GTT GCC CCA CAG GAC CAG GAC TCG TTC CTC GAC 165 Ser Gin Gin Asp Arg Vai Ala Pro Gin Asp Gin Asp Ser Phe Leu Asp 5 10 15 GAC CAG CCC GGC GTC CGC CCG ATC CCG ICC TTC GAT GAC ATG CCG TTS 213 Asp Gin Pro Gly Vai Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro Leu 20 25 30 CAC CAG AAC CTT CTG CGC GGC ATC TAC TCG TAC GGC TTC GAG AAA CCG 251 His Gin Asn Leu Leu Arg Gly ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys Pro 35 40 45 TCC AGC ATC CAG CAG CGC GCC ATC GCC CCC TTC ACG CGC GGC GGC GAC 309 Ser Ser Ile Gin Gin Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly Asp 50 55 60 65 ATC ATC GCG CAG GCG CAG TCC GGT ACC GGC AAG ACG GGC GCC TTC TCC 357 Ile Ile Ala Gin Ala Gin Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe Ser 70 75 80 ATC GGC CTG CTG CAG CGC CTG GAC TTC CGC CAC AAC CTG ATC CAG GGC 405 Ile Gly Leu Leu Gin Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gin Gly 85 90 S5 CTC GTG CTC TCC CCG ACC CGC GAG CTG GCC CTG CAG ACG GCG GAG GTG 453 Leu Vai Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gin Thr Ala Glu Vai 100 105 110 ATC AGC CGC ATC GGC GAG TTC CTG TCG AAC AGC GCG AAG TTC TGT GAG 501 Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys Glu 115 120 125 ACC TTT GTG GGT GGC ACG CGC GTG CAG GAT GAC CTG CGC AAG CTG CAG 549 Thr Phe Vai Gly Gly Thr Arg Vai Gin Asp Asp Leu Arg Lys Leu Gin 130 135 140 145 GCT GGC GTC GTC GTC GCC GTG GGG ACG CCG GGC CGC GTG TCC GAC GTG 597 Ala Gly Vai Vai Vai Ala Vai Gly Thr Pro Gly Arg Vai Ser Asp Vai 150 155 150 ATC AAG CGC GGC GCG CTG CGC ACC GAG TCC CTG CGC GTG CTG GTG CTC 645 Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Vai Leu Vai Leu 165 170 175 GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAT CAG ATT TAC 693 Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gin Gly Phe Ala Asp Gin Ile Tyr 180 185 190 GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC TCC 741 Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gin Vai Ala Leu Phe Ser 195 200 205 GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTG CTG GAG CTG ACA AAG AAG TTC ATG CGC 789 Ala Thr Met Pro Glu Glu Vai Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met Arg 210 215 220 225 GAC CCC GTA CGC ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG GGC 837 Asp Pro Vai Arg I1e Leu Vai Lys Arç Glu Ser Leu Thr Leu Glu Gly 230 235 240 ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAG GAG GAG CAC AAG CTG GAC ACG 885 Ile Lys Gin Phe Phe Ile Ala Vai Glu Glu Glu His Lys Leu Asp Thr 245 250 255 CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC TTC 933 Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Vai Ser Ile Ala Gin Ser Vai Ile Phe 260 265 270 GCC AAC ACC CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAT CAG 981 Ala Asn Thr Ara Arg Lys Vai Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn Gin 275 280 285 AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC GAC 1029 Ser Asn His Thr Vai Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser Asp 290 295 300 305 CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG CTC 1077 Arg Glu Arg Vai Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Vai Leu 310 315 320 GTA ACG ACC GAC CTC GTG GCC CGC GGC ATC GAC GTG CAC CAC GTG AAC 1125 Vai Thr Thr Asp Leu Vai Ala Arg Gly Ile Asp Vai His His Vai Asn 325 330 335 ' ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCG ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG CAC 1173 Ile Vai Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu His 340 345 350 CGC ATT GGC CGC GGC GGC CGC TAC GGC GTA AAG GGT GTT GCC ATC AAC 1221 Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Vai Lys Gly Vai Ala Ile Asn 355 360 365 TTC GTG ACG GAG AAA GAC GTG GAG CTG CTG CAC GAG ATC GAG GGG CAC 1269 Phe Vai Thr Glu Lys Asp Vai Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly His 370 375 380 385 TAC CAC ACG CAG ATC GAT GAG CTC CCG GTG GAC TTT GCC GCC TAC CTC 1317 Tyr His Thr Gin Ile Asp Glu Leu Pro Vai Asp Phe Ala Ala Tyr Leu 390 395 400 GGC GAG TGA GCGGGCCCCT GCCCCCCTTC CCTGCCCCCC TCTCGCGACG 1366 Gly Glu AGAGAACGCA CATCGTAACA CAGCCACGCG AACGATAGTA AGGGCGTGCG GCGGCGTTCC 1426 CCTCCTCCTG CCAGCGGCCC CCCTCCGCAG CGCTTCTCTT TTGAGAGGGG GGCaGGSGGA 1486 GGCGCTGCGC CTGGCTGGAT GTGTGCTTGA GCTTGCATTC CGTCAAGCAA GTGCTTTGTT 1546 TTAATTATGC GCGCCGTTTT GTTGCTCGTC CCTTTCGTTG GTGimTTC GGCCGAAACG 1606 GCGTTiAAAG CA j^g (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 403 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: Met Ser Gin Gin Asp Arg Vai Ala Pro Gin Asp Gin Asp Ser Phe Leu 15 10 15 Asp Asp Gin Pro Gly Vai Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro 20 25 30 Leu His Gin Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys 35 40 45 Pro Ser Ser Ile Gin Gin Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly 50 55 60 Asp Ile Ile Ala Gin Ala Gin Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe 65 70 75 80 Ser He Gly Leu Leu Gin Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gin 85 90 95 Gly Leu Vai Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gin Thr Ala Glu 100 105 110 Vai Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys 115 120 125 Glu Thr Phe Vai Gly Gly Thr Arg Vai Gin Asp Asp Leu Arg Lys Leu 130 135 140 Gin Ala Gly Vai Vai Vai Ala Vai Gly Thr Pro Gly Arg Vai Ser Asp 145 150 155 160 Vai Πe Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Vai Leu Vai 165 170 175 Leu Aso Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gin Gly Phe Ala Asp Gin IIe 180 185 190 Tyr Glu íle Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp IIe Gin Vai Ala Leu Phe 195 200 205 Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Vai Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met 210 215 220 Arg Asp Pro Vai Arg IIe Leu Vai Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu 225 230 235 240 Gly Ile Lys Gin Phe Phe Ile Ala Vai Glu Glu Glu His Lys Leu Asp 245 250 255 Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Vai Ser Ile Ala Gin Ser Vai Ile 260 265 270 Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Vai Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn 275 280 285 Gin Ser Asn His Thr Vai Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser 290 295 300 Asp Arg Glu Arg Vai Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Vai 305 310 315 . . ^ 320 Leu Vai Thr Thr Asp Leu Vai Ala Arg Gly ί'1'e Asp Vai His His Vai 325 330 335 Asn Ile Vai Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu 340 345 350 His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Vai Lys Gly Vai Ala Ile 355 360 365 Asn Phe Vai Thr Glu Lys Asp Vai Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly 370 375 380 His Tyr His Thr Gin Ile Asp Glu Leu Pro Vai Asp Phe Ala Ala Tyr 385 390 395 400 Leu Gly Glu REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Vetor de expressão recombinante, CARACTERIZADO por compreender um promotor operacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo compreendendo uma porção imunogênica de um antigeno de Leishmania tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, ou uma vaziante do referido antigeno que difira somente em substituições e/ou modificações conservativas, em que a referida seqüência de aminoácidos é codificada por um polinucleotideo tendo a seqüência de SEQ ID N0:1.

2. Vetor de expressão recombinante, CARACTERIZADO por compreender um promotor operacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotideos selecionada do grupo que consiste em: a) nucleotideos 421 até 2058 da SEQ ID NO:l; e b) seqüências de DNA que hibridizam em uma seqüência de nucleotideo recombinante complementar aos nucleotideos 421 até 2058 da SEQ ID NO:l sob condições moderadamente estringentes.

3. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA por consistir essencialmente em um polipeptideo isolado compreendendo uma porção imunogênica de um antigeno de Leishmania tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, ou uma variante do referido antigeno que difira somente em substituições e/ou modificações conservativas, em que o referido polipeptideo está presente em uma concentração de 10 pg/mL a 100 pg/mL e um veiculo fisiologicamente aceitável, exceto água.

4. Vacina, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um amplificador inespecifico de resposta imune e um polipeptideo isolado compreendendo uma porção imunogênica de um antigeno de Leishmania tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:2, ou uma variante do referido antigeno que difira somente em substituições e/ou modificações conservativas, em que o referido polipeptideo está presente em uma concentração de 10 pg/mL a 100 pg/mL.