BRPI9908281B1 - Variante de uma alfa-amilase maltogência precursora, sequência de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, bactéria gram-positiva ou gram-negativa transformada, e, processos para produzir polipeptídeo e para preparar uma massa ou um produto cozido preparado da massa - Google Patents

Description

"VARIANTE DE UMA ALFA-AMILASE MALTOGÊNICA PRECURSORA, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, BACTÉRIA GRAM-POSITIVA OU GRAM-NEGATIVA TRANSFORMADA, E, PROCESSOS PARA PRODUZIR POLIPEPTÍDEO E PARA PREPARAR UMA MASSA OU UM PRODUTO COZIDO PREPARADO DA MASSA." CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a variantes de amilase maltogênica e a processos para construir tais variantes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A alfa-amilase maltogênica (glicano 1,4-a-maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar a amilose e a amilopectia em maltose na configuração alfa, e é também capaz de hidrolisar a maltotriose, assim como a ciclodextrina. A alfa-amilase maltogênica do Bacillus (EP 120 693) é comercialmente disponível sob o nome comercial de Novamyl® (produto da Novo Nordisk A/S, Dinamarca) e é amplamente usada na indústria de padaria como um agente anti-envelhecimento devido à sua capacidade de reduzir a retrogradação do amido. O Novamyl® compartilha de várias características com as ciclodextrina glicanotransferases (CGTases), incluindo a homologia de seqüência (Henrissat B., Bairoch A. 1996) e a formação de produtos de transglicosilação (Christophersen, C., et al., 1997, Starch, vol. 50, 1,39-45). A ciclomaltodextrina glicanotransferase (E.C. 2.4.1.19), também designada ciclodextrina glicanotransferase ou ciclodextrina glicosiltransferase, aqui abreviada como CGTase, catalisa a conversão de amido e substratos semelhantes em ciclomaltodextrinas através de uma reação intramolecular de transglicosilação, dessa forma formando ciclomaltodextrinas (ou CD) de vários tamanhos.

As CGTases são amplamente distribuídas e de várias fontes bacterianas diferentes, incluindo Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Kebsiella, Micrococcus, Thermoanaerobacter, e o Thermoanaerobacterio tem sido extensivamente descrito na literatura. A CGTase produzida por Thermoanaerobacfer sp. foi apresentada em Norman B. E., Jorgensen S. T.; Denpun Kagaku, 1992 39 99-106, e na WO 89/03421, e a seqüência de aminoácidos foi apresentada na WO 96/33267. A seqüência de CGTases de Therrnoanaerobacterium thermosulfurigenes e de Bacillus circulansis disponível na Internet (home pages SCOP ou PDF) como arquivo pdf 1 CIU, e a seqüência de uma CGTase de B. circulans é disponível como arquivo pdf 1CDG.

Tachibana, Y., Journal of Fermentation and Bioengineering, 83 (6), 540-548 (1997) descreve a clonagem e a expressão de uma CGTase. Variantes das CGTases foram descritas por Kim, Y. H., Biochemistry and Molecular Biology International, 41 (2), 227-234 (1997); Sin K-A, Journal of Biotechnology, 32 (3), 283-288 (1994); D Penninga, Biochemistry, 34 (10), 3368-3376 (1995); and WO 96/33267.

Recentemente, a estrutura terciária de várias CGTases foi apresentada. Hofman et al. [Hofman B. E., Bender H., Schultz G. E.; J. Mol. Biol. 1989 209 793-800] e Klein & Schulz [Klein C., Schulz G. E.; J Mol. Biol. 1991 217 737-750] apresentam a estrutura terciária de uma CGTase derivada da Cepa 8 de Bacillus circulans, Kubota et al. [Kubota M., Matsuura Y., Sakai S. e Katsube Y; Denpun Kagaku 1991 38 141-146] apresentam a estrutura terciária de uma CGTase derivada de Bacillus stearothermophilus TC-91, Lawson et al. [Lawson C. L., van Montfort R., Strokopytov B., Rozeboom H. J., Kalk K. H., de Vries G. E., Penninga D., Dijkhuizen L. e Dijkstra B. W.; J. Mol. Biol. 1994 236 590-600] apresentam a estrutura terciária de uma CGTase derivada da Cepa 251 de Bacillus circulans, Strokopytov et al. [Strokopytov B., Penninga D., Rozeboom H. J.;

Kalk K. H., Dijkhuizen L. e Dijkstra B. W.; Biochemistry 1995 34 2234-2240] apresentam a estrutura terciária de uma CGTase derivada da Cepa 251 de Bacillus circulans, CGTase esta que foi complexada com acarbose, um inibidor eficaz da CGTase, e Knegtel et al. [Knegtel R. Μ. A., Wind R. D., Rozeboom H. J., Kalk K. H., Buitelaar R. M., Dijkhuizen L. e Dijkstra B. W.; J. Mol Biol. 1996 256 611-622] apresentam a estrutura terciária de uma CGTase derivada de Thermoanaerobacíerium themosulfurigenes.

BREVE APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO

Os inventores modificaram a seqüência de aminoácidos de uma alfa-amilase maltogênica para obter variantes com propriedades melhoradas, com base na estrutura tridimensional da alfa-amilase maltogênica Novamyl. As variantes alteraram as propriedades físico-químicas, por exemplo uma condição mais favorável de pH alterado, termostabilidade melhorada, atividade específica aumentada, um padrão de divagem alterado ou uma capacidade aumentada para reduzir a retrogradação do amido ou envelhecimento do pão.

Consequentemente, a presente invenção fornece um processo de construção de uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, em que a variante tem pelo menos uma propriedade alterada em comparação com a dita alfa-amilase maltogênica, processo esse que compreende: i) testar a estrutura da alfa-amilase maltogênica para identificar, à base de uma avaliação das considerações estruturais, pelo menos um resíduo de aminoácido ou pelo menos uma região estrutural da alfa-amilase maltogênica, que é de relevância para alterar a dita propriedade; ii) construir uma variante da alfa-amilase maltogênica, que, em comparação com a precursora, foi modificada no resíduo de aminoácidos ou na parte estrutural identificada em i), de modo a alterar dita propriedade; e iii) testar a variante da alfa-amilase maltogênica resultante quanto à dita propriedade. A propriedade que pode ser alterada pelos processos da presente invenção podem ser, por exemplo, a estabilidade, a atividade dependente do pH, a capacidade de reduzir a retrogradação do amido ou o envelhecimento do pão, a atividade específica ou a especificidade do substrato. Assim, a variante pode ter, por exemplo, termostabilidade aumentada ou atividade mais elevada em um pH inferior, uma condição mais favorável de pH alterado, termostabilidade melhorada, atividade específica aumentada ou uma capacidade aumentada para reduzir a retrogradação do amido ou o envelhecimento do pão.

Em ainda outros aspectos, a invenção diz respeito a variantes de uma alfa-amilase maltogênica, o DNA codificando tais variantes e processos de preparo das variantes. Finalmente, a invenção diz respeito ao uso das variantes para várias finalidades industriais, em particular de padaria. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Alfa-amilase maltogênica A alfa-amilase maltogênica é uma enzima classificada na EC 3.2.1.133. A atividade enzimática não requer um fim não redutor sobre o substrato e a atividade enzimática principal resulta na degradação da amilopectina e da amilose em maltose e maltodextrina mais longa. Ela é capaz de hidrolisar a amilose e a amilopectina em maltose na configuração alfa, e é também capaz de hidrolisar a maltotriose, bem como a ciclodextrina.

Uma alfa-amilase maltogênica particularmente preferida é a amilase clonada do Bacillus, como descrito na EP 120 693 (daqui em diante referida como Novamyl). A Novamyl tem a seqüência de aminoácidos apresentada em aminoácidos 1 a 686 da SEQ ID NO: 1. A Novamyl é codificada no gene abrigado na cepa NCIB 11837 de Bacillus, que tem a seqüência, de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1. A estrutura tridimensional da Novamyl é descrita abaixo.

Em geral, uma alfa-amilase maltogênica preferida deve ter uma ou mais das seguintes propriedades: i) uma homologia estrutural tridimensional à Novamyl, ii) uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, preferivelmente pelo menos 80% ou 90%, por exemplo 95% ou 98%, iii) uma seqüência de DNA que hibridize à seqüência do DNA apresentada na SEQ ID NO: 1 ou à seqüência de DNA codificando a Novamyl abrigada na cepa NCIB 11837 de Bacillus; iv) um sítio de ligação de cálcio compreendendo um equivalente de coordenação a um átomo de carbonila da espinha dorsal de Asn77, átomo de cadeia lateral OD1 e OE1 de Glul02, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asp79, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asp76, e um átomo de cadeia lateral OE1 de GlulOl, e uma molécula de água WAT V21, átomo OWO, em que as posições são como mostradas no Apêndice 1; v) uma seqüência de cinco aminoácidos correspondente a Pro-Ala-Gly-Phe-Ser em uma posição equivalente aos resíduos 191 a 195 na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. A homologia estrutural referida acima em i) se baseia nas homologias das outras seqüências, na análise da agregação hidrofóbica ou por filamento reverso [Huber, T.; Torda, A. E,, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, N- 1 pp. 142-149 (1998)] e a qual, por qualquer destes processos é prognosticada como tendo a mesma estrutura terciária da Novamyl, em que a estrutura terciária se refere à reduplicação global ou à reduplicação dos Domínios A, B e C, mais preferivelmente incluindo o Domínio D e, mais preferivelmente, o Domínio E. Altemativamente, um alinhamento estrutural entre a Novamyl e uma alfa-amilase maltogênica pode ser usado para identificar posições equivalentes. O sítio de ligação de cálcio referido acima em iv) se baseia no sítio de ligação de cálcio identificado na estrutura tridimensional da Novamyl, e é examinado abaixo na seção “Sítios de ligação de cálcio”. A “posição equivalente” referida acima em v) se baseia no alinhamento da seqüência de aminoácidos ou de DNA ou na homologia estrutural usando-se processos conhecidos na técnica.

Estrutura tridimensional da alfa-amilase maltogênica A Novamyl foi usada para elucidar a estrutura tridimensional formando a base para a presente invenção. A estrutura da Novamyl foi solucionada de acordo com o princípio para os processos cristalográficos de raio-x, por exemplo como dado em X-Ray Strucíure Determinaíion, Stout, G. K. e Jensen, L. H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989.

As coordenadas estruturais para a estrutura de cristalina solucionada de Novamyl em resolução de 2,2 Â usando o processo de substituição isomorfa, são dadas no formato padrão do PDB (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT) conforme apresentado no Apêndice 1. Deve ficar entendido que o Apêndice 1 faz parte do presente pedido. No contexto do Apêndice 1, as seguintes abreviaturas são usadas: CA se refere a íon de cálcio ou átomo de alfa-carbono da espinha dorsal de polipeptídeo, WAT se refere a água ou a cálcio, MAL se refere a maltose, HEX se refere a uma unidade de carboidrato de um análogo do substrato, e SUL se refere a um íon de sulfato.

Os resíduos de aminoácidos da enzima são aqui identificados por seu respectivo código de aminoácidos de uma ou três letras. A estrutura da dita alfa-amilase maltogênica é composta de cinco domínios globulares, ordenados A, B, C, D e E. Os domínios podem ser definidos como sendo os resíduos 1 a 132 e 204 a 403 para o Domínio A, os resíduos 133 a 203 para o Domínio B, os resíduos 404 a 496 para o Domínio C, os resíduos 497 a 579 para o Domínio D, e os resíduos 580 a 686 para o Domínio E, em que a numeração se refere à seqüência de aminoácidos em SEQID NO: 1. Aspectos dos Domínios A, B e C de particular interesse são descritos abaixo.

Domínio A O Domínio A é o domínio maior e contém o sítio ativo que compreende uma agregação de três resíduos de aminoácidos, D329, D228 e E256, especialmente dispostos no fundo de uma fenda na superfície da enzima. A estrutura do Domínio A apresenta uma duplicação global em comum com a aamilase para a qual a estrutura é conhecida, a saber, o tambor 8 (beta/alfa) com oito filamentos beta centrais (numerados de 1 a 8) e oito a-hélices de flanqueio. O tambor β é definido por McGregor op. cit. A extremidade terminal C do filamento beta 1 é conectada às hélices 1 por uma alça denotada alça 1 e um padrão idêntico é encontrado para as outras alças, embora as alças apresentem alguma variação no tamanho e algumas possam ser bastante extensas.

Os oito filamentos beta centrais nos (beta/alfa) 8 tambores se sobrepõem razoavelmente bem com as estruturas conhecidas das CGTases. Esta parte da estrutura, incluindo as adjacências próximas do sítio ativo localizado na extremidade terminal C dos filamentos beta, mostra um alto grau de identidade com as CGTases.

Ao contrário, as alças conectando os filamentos beta e as hélices alfa apresentam um alto grau de variação a partir das estruturas conhecidas das CGTases. Estas alças constituem o contexto estrutural do sítio ativo, e a maioria dos contatos com o substrato é encontrada entre os resíduos localizados nestas alças. Características distintas, tais como a especificidade do substrato, a ligação do substrato, o perfil de atividade do pH, o padrão de divagem do substrato, e outras, são determinadas pelos aminoácidos específicos e as posições que eles ocupam nestas alças. Na Novamyl, o Domínio A contém dois sítios de ligação de cálcio, um dos quais sendo homólogo ao sítio de ligação de cálcio nas CGTases; o outro é único para a Novamyl. A estrutura do sítio de ligação do cálcio é examinado ainda abaixo na seção “Sítios de ligação de cálcio”.

Domínio B O Domínio B, também referido como alça 3 do tambor 8 (beta-alfa), compreende os resíduos de aminoácidos 133 a 203 da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. A estrutura é parcialmente homóloga à estrutura do Domínio B nas CGTases, a mais notável diferença sendo a presença de um inserto de cinco aminoácidos correspondentes às posições 191 a 195 na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, que não é encontrada nas CGTases. Este inserto é posicionado espacialmente próximo dos resíduos ativos do sítio e em contato íntimo com o substrato.

Domínio C O Domínio C na Novamyl compreende os resíduos de aminoácidos 404 a 496 da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. O Domínio C é composto inteiramente de filamentos β, que formam uma estrutura única de lâmina de 8 filamentos que se dobra sobre si mesma, e assim pode ser descrita como uma estrutura em sanduíche β. Uma parte da lâmina β forma a interface com o Domínio A. Sítios de ligação de cálcio A estrutura da alfa-amilase maltogênica apresenta três sítios de ligação de cálcio; isto é, três íons de cálcio são mostrados estarem presentes na estrutura. Em comum com a maioria das 13 estruturas de famílias conhecidas, um íon de cálcio, WAT 693 no Apêndice 1, fica localizado entre os domínios A e B. Este íon de cálcio é coordenado por um átomo de carbonila da espinha dorsal a partir de Glnl84 e His232, átomos de cadeia lateral OD2 e OD1 da Aspl98, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asnl31, e três moléculas de água WAT VI, WAT V5 e WAT V8.

Um segundo íon de cálcio é localizado no domínio A e é comum às CGTases, mas não encontrado em α-amilases. O íon de cálcio WAT 694 é coordenado por um átomo de carbonila da espinha dorsal a partir de Gly48 e Asp23, átomo de cadeia lateral OD2 da Asp50, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asp21, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asn26, e um átomo OD1 de Asn27, e uma molécula de água WAT V62. O terceiro íon de cálcio é localizado no Domínio A e é único para a Novamyl. O íon de cálcio é WAT 692 e a coordenação compreende um átomo de carbonila da espinha dorsal, da Asn77, átomo de cadeia lateral OE2 e OE1 de Glul02, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asp79, um átomo de cadeia lateral OD1 de Asp76, e um átomo de cadeia lateral de OE1 de GlulOl, e uma molécula de água WAT V21; Sítio de Ligação do Substrato As partes da alça examinadas acima no contexto dos domínios A e B são de particular interesse para a interação do substrato e da reatividade do sítio ativo. Em particular, no domínio A, os resíduos 37 a 45 na alça 1, os resíduos 261 a 266 na alça 5, os resíduos 327 a 330 na alça 7 e os resíduos 370 a 376 na alça 8; no domínio B, os resíduos 135 a 145 na alça 3, os resíduos 173 a 180 e 188 a 196 na alça 3, em que as posições dos resíduos correspondem aos aminoácidos na seqüência de aminoácidos SEQ IDNO: 1.

Sem que sejamos limitados por qualquer teoria, acredita-se presentemente que a ligação entre um substrato e uma enzima seja suportada por interações favoráveis encontradas dentro de uma esfera de 4 a 6 Á entre a molécula de substrato e a enzima, tal como ligações de hidrogênio ser limitado e/ou interação eletrostática forte. Os seguintes resíduos de Novamyl (SEQ ID NO: 1), estão dentro de uma distância de 6 Â do substrato HEX e, assim, acredita-se estarem envolvidas nas interações com dito substrato: 44, 89, 90, 92, 93, 127, 129, 132, 135, 177, 178, 188, 191, 194, 196, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 256, 258-261, 288, 328, 329, 371, 372.373.376 e 690.

Os seguintes resíduos de Novamyl estão dentro de uma distância de 4 À do substrato HEX e, assim, acredita-se estarem envolvidos nas interações com dito substrato: 90, 92, 93,129, 132, 177, 188,189, 190, 191, 196, 226, 228, 229.231.232.256.258.259.260.261.328.329.372.376 e 690.

Construção da homologia da Novamvl® A estrutura da Novamyl® foi construída em modelo na estrutura aqui apresentada no Apêndice 1. A estrutura de outras alfa-amilases maltogênicas podem ser construídas de forma análoga.

Uma estrutura modelo de uma alfa-amilase maltogênica pode ser construída usando-se o programa Homology ou um programa comparável, por exemplo o Modeller (ambos da Molecular Simulations, Inc. San Diego, CA). O princípio é alinhar a seqüência da alfa-amilase maltogênica com a estrutura conhecida com aquela da alfa-amilase maltogênica, para a qual uma estrutura conhecida deva ser construída. As regiões estruturalmente conservadas podem, então, ser construídas na base de seqüências de consenso. Em áreas carentes de homologia, as estruturas de alça podem ser inseridas, ou as seqüências podem ser deletadas com a subsequente ligação dos resíduos necessários, usando-se, por exemplo, o programa Homology. As subsequentes moderação e otimização da estrutura pode ser feita usando-se ou o Homology ou outro programa de simulação molecular, por exemplo, CHARMm DAS Simulações Moleculares.

Processos para proietar novas variantes de alfa-amilase maltogênica Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um processo de construção de uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, em que dita variante tenha pelo menos uma propriedade alterada, em comparação com dita α-amilase precursora, processo este que compreende: i) testar a estrutura da alfa-amilase maltogênica para identificar pelo menos um aminoácido ou região estrutural da dita a-amilase, que, na base das considerações estruturais ou funcionais, é determinada a ser de relevância para alterar dita propriedade da alfa-amilase maltogênica precursora; ii) construir uma variante da alfa-amilase maltogênica, que, em comparação com a precursora, tenha sido modificada no resíduo de aminoácido, ou a região estrutural identificada em i) tenha sido modificada de modo a alterar dita propriedade; e iii) testar a variante resultante quanto à dita propriedade. A parte estrutural que é identificada na etapa i) do processo da invenção pode ser composta de um resíduo de aminoácido. No entanto, normalmente a parte estrutural compreende mais do que um resíduo de aminoácido, tipicamente constituindo uma das partes da estrutura de alfa-amilase maltogênica, tal como um dos domínios A, B, C, D ou E, uma interface entre qualquer destes domínios, um sítio de ligação de cálcio, uma estrutura de alça, o sítio de ligação do substrato, ou coisa parecida.

As considerações estruturais ou funcionais podem envolver uma análise da estrutura relevante ou parte estrutural, e seu impacto considerado na função da enzima. Por exemplo, uma análise das diferenças funcionais entre a alfa-amilase maltogênica e as várias CGTases, pode ser usada para designar certas propriedades da Novamyl a certas partes da estrutura da Novamyl ou para considerar tal relacionamento. Por exemplo, as diferenças no padrão ou estrutura das alças que circundam o sítio ativo, podem resultar em diferenças no acesso ao sítio ativo do substrato e, assim, diferenças na especificidade do substrato e/ou padrão de divagem.

Além disso, as partes de uma alfa-amilase maltogênica envolvida na ligação do substrato, e, assim, por exemplo, a especificidade e/ou divagem do substrato envolvidas na ligação do substrato, a ligação de íons de cálcio, importante, por exemplo, quanto à dependência de cálcio da enzima, e outros, foram identificados (ver abaixo). A modificação de um resíduo ou região estrutural de aminoácidos é tipicamente realizada por modificações adequadas de uma seqüência de DNA codificando a enzima precursora em questão. A modificação pode ser por substituição, deleção ou inserção de um resíduo de aminoácido ou uma parte estrutural. A propriedade a ser modificada pode ser a estabilidade (por exemplo a termostabilidade), a atividade dependente do pH, a especificidade do substrato, a atividade específica ou capacidade para reduzir a retrogradação do amido ou o envelhecimento do pão. Assim, a propriedade alterada pode ser uma atividade específica alterada em um dado pH e/ou uma especificidade alterada do substrato, tal como um padrão alterado da divagem do substrato ou um padrão alterado da inibição do substrato.

Na etapa ii) do processo de acordo com a invenção, a parte da estrutura a ser identificada é preferivelmente uma que, na enzima reduplicada acredita-se esteja em contato com o substrato (conforme a apresentação acima na seção intitulada “Sítio de Ligação do Substrato”) ou envolvida na especificidade do substrato e/ou padrão de divagem, e/ou uma que esteja contribuindo para o perfil de pH ou de temperatura da enzima, ou seja de outra forma responsável pelas propriedades da alfa-amilase maltogênica.

Descritos no seguinte, acham-se os tipos específicos de variantes que têm sido planejadas pelo uso do processo da invenção.

As variantes da invenção podem compreender modificações adicionais além das modificações aqui descritas. As variantes preferivelmente têm um aminoácido que tem mais do que 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, preferivelmente mais do que 80%, particularmente mais do que 90%, especialmente mais do que 95%, por exemplo mais do que 98%.

Variantes de alfa-amilase maltogênica com perfil de atividade dependente de pH alterada. O perfil de atividade dependente do pH pode ser mudado pela troca do pKa dos resíduos dentro de 10 Â dos resíduos do sítio ativo da alfa-amilase maltogênica. A modificação do pKa dos resíduos do sítio ativo é obtida, por exemplo, pela modificação da interação eletrostática ou interação hidrofóbica entre os grupos funcionais das cadeias laterais de aminoácidos de um dado resíduo de aminoácido e suas adjacências próximas. Para obter uma atividade mais elevada em um pH mais elevado, resíduos negativamente carregados são colocados perto de um ácido doador de hidrogênio, ao passo que os resíduos positivamente carregados colocados perto de um ácido nucleofílico resultarão em atividade mais elevada em pH baixo. Igualmente, um decréscimo no pKa pode ser obtido pela redução da acessibilidade da água ou aumentando-se a hidrofobicidade do ambiente.

Assim, outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, em que a variante tenha um perfil de atividade dependente de pH alterado em comparação com a precursora, em que a variante pode ser obtida pelo seguinte processo: i) identificar um resíduo de aminoácido dentro de 15 Â de um resíduo do sítio ativo de uma alfa-amilase maltogênica na estrutura tridimensional da dita alfa-amilase maltogênica precursora, em particular 10 À de um resíduo do sítio ativo, em que dito resíduo de aminoácido é considerado como envolvido nas interações eletrostática ou hidrofóbica com um resíduo do sítio ativo; ii) substituir, na estrutura, dito resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido que modifique as adjacências eletrostáticas e/ou hidrofóbicas de um resíduo do sítio ativo, e avaliar a acomodação do resíduo de aminoácido na estrutura, iii) opcionalmente, repetir a etapa i) e/ou ii) recorrentemente até que tenha sido identificada uma substituição de aminoácido, a qual esteja acomodada na estrutura, iv) construir uma variante de alfa-amilase maltogênica resultante das etapas i) e ii) e, opcionalmente, iii), e testar a atividade enzimática dependente do pH, da dita variante.

Em uma modalidade preferida, a variante da alfa-amilase maltogênica tendo um perfil de atividade dependente do pH alterado em comparação com a alfa-amilase maltogênica, compreende uma modificação de um resíduo de aminoácido correspondente a um ou mais dos seguintes resíduos da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQID NO: 1: D127, V129, F188, A229, Y258, V281, F284, T288, N327, M330, G370, N371 eD372, L71, S72, V74, L75, L78, T80, L81, G83, T84, D85, N86, T87, G88, Y89, H90, G91, T94, R95, D96, F97,1174, S175, N176, D178, D179, RI80, Y181, E182, A183, Q184, K186, N187, F188, T189, D190, A192, G193, F194, S195, L196.

Em uma modalidade mais preferida, a variante compreende uma modificação correspondente a uma ou mais das seguintes modificações na seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1: D127N/L, V129S/T/G/V, F188E/K/H, A229S/T/G/V, Y258E/D/K/R/F/N, V281L/T, F284K/H/D/E/Y, T288E/K/R, N327D, M330L/F/I/D/E/K, G370N, N371D/E/G/K e D372N/V, L71I, S72C, V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/T/N/Q/K/H, G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L, T84S/A/N/D/G, D85A/T/S/N/G, N86Q/E/D/Y/H/K, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/H/N, T189N/D/A/S/H/Y/G, D190E/Q/H/N/K, A192T/D/E/N/K, G193A/S/T, F194Y, S195N/D/E/R/K/G, L196I.

Modificações semelhantes podem ser introduzidas em posições equivalentes de outras alfa-amilases maltogênicas. Variantes de particular interesse têm uma combinação de uma ou mais das acima, com qualquer uma das outras modificações aqui apresentadas.

Variantes de alfa-amilase maltogênica com estabilidade alterada Uma variante com estabilidade melhorada (estabilidade tipicamente aumentada) pode ser obtida pela estabilização de ligação de cálcio, substituição com prolina, substituição de histidina com outro aminoácido, introdução de uma ligação dissulfeto interdomínio, remoção de um sítio de desamidação, alteração de um contato de ligação de hidrogênio, enchimento de uma cavidade estrutural interna com um ou mais aminoácidos com grupos laterais mais volumosos, introdução de interações interdomínio, alteração da distribuição de carga, cobertura da hélice ou introdução de uma ponte de sal.

Ligação de cálcio A invenção provê uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, que tem uma estabilidade alterada devido a uma, estabilização da ligação de cálcio alterada (Ca2+). A variante enzimática pode ter termostabilidade alterada ou estabilidade dependente de pH, ou pode ter atividade de alfa-amilase maltogênica na presença de uma concentração menor de íon de cálcio. Acredita-se presentemente que os resíduos de aminoácido localizados dentro de 10 Â de um íon de cálcio, estejam envolvidos na, ou sejam de importância para, a capacidade de ligação de Ca2+ da enzima.

Os resíduos de aminoácidos encontrados dentro de uma distância de 10 Â dos sítios de ligação de Ca2+ da alfa-amilase maltogênica com a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1 foram determinados como descrito no Exemplo 2, e são como seguem: 16,17,18,19,20, 21,22, 23,24,25, 26,27,28 29,30, 31, 32, 33, 35, 36, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 87, 88, 89, 91, 93, 94, 95, 96, 99,100, 101, 102, 103, 104, 105, 109, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 145, 150, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 174, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 206, 210, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 378 e 637.

De modo a construir uma variante de acordo com este aspecto da invenção, é desejável substituir pelo menos um dos resíduos de aminoácido acima mencionados, que esteja determinado a ser envolvido em uma ligação de cálcio não ótima, por qualquer outro resíduo de aminoácido que melhore a afinidade de ligação de Ca2+ da enzima variante. Consequentemente, outro aspecto da invenção diz respeito a um processo de construção de uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, em que dita variante tenha uma ligação de Ca2+ estabilizada em comparação com dita precursora, dito processo compreendendo: i) identificar um resíduo de aminoácido dentro de 10 Á de um sítio de ligação de Ca2+ de uma alfa-amilase maltogênica em um modelo da estrutura tridimensional da dita α-amilase, a qual, das considerações estruturais ou funcionais, é determinada como sendo responsável por uma interação não ótima de íons de cálcio; ii) construir uma variante em que dito resíduo de aminoácido seja substituído por outro resíduo de aminoácido, a partir de considerações estruturais ou funcionais, seja determinado como sendo importante para estabelecer uma afinidade de ligação de Ca2+ alterada; e iii) testar a ligação de Ca2+ da variante de alfa-amilase maltogênica resultante.

Substituir um resíduo de aminoácido responsável pela interação de íons de cálcio não ótima com outro resíduo, pode alterar uma interação da enzima de ligação de íons de cálcio. Por exemplo, o resíduo de aminoácido em questão pode ser selecionado na base de um ou mais dos seguintes objetivos: a) obter uma interação melhorada entre um íon de cálcio e um resíduo de aminoácido como identificada da estrutura da alfa-amilase maltogênica. Por exemplo, se o resíduo de aminoácido em questão for exposto a um solvente circunjacente, pode ser vantajoso aumentar a proteção do dito resíduo de aminoácido a partir do solvente, de modo a estabilizar a interação entre dito resíduo de aminoácido e um íon de cálcio. Isto pode ser obtido mediante substituição do dito resíduo, ou um resíduo de aminoácido na vizinhança do dito resíduo contribuir para a proteção, com um resíduo de aminoácido com um grupo lateral mais volumoso ou que de outra forma resulte em um efeito protetor melhorado. b) estabilizar um sítio de ligação de cálcio, por exemplo pela estabilização da estrutura da alfa-amilase maltogênica, por exemplo pela estabilização dos contatos entre dois ou mais dos cinco domínios ou estabilização de um ou mais dos domínios individuais como tais. Isto pode, por exemplo, ser obtido fomecendo-se uma melhor coordenação às cadeias laterais do aminoácido, o que pode, por exemplo, ser obtido pela substituição de um resíduo N com um resíduo D e/ou um resíduo Q com um resíduo E, por exemplo dentro de 10 Â e, preferivelmente, dentro de 3 ou 4 Á, de um sítio de ligação de cálcio. c) aperfeiçoar a coordenação entre o íon de cálcio e os resíduos de ligação de cálcio, por exemplo melhorando-se a interação entre o íon e os resíduos coordenantes ou aumentando-se o número de coordenações de cadeia lateral pela substituição de uma água de coordenação por uma cadeia lateral de aminoácido. d) substituir água por um resíduo coordenante de aminoácido do cálcio.

Preferivelmente, o resíduo de aminoácido a ser modificado fica localizado dentro de 8 Â de um íon de Ca2+. Os resíduos de aminoácido dentro de 8 Â e de 5 Á, respectivamente, podem facilmente ser identificados por um processo análogo usado para identificar os resíduos de aminoácido dentro de 10 Á (conforme Exemplo 2).

Em uma modalidade preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica tendo uma ligação alterada de Ca2+ em comparação com a alfa-amilase maltogênica precursora, compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a um ou mais dos seguintes resíduos da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQID NO: 1: D17, A30, S32, R95, H103, N131, Q201,1174 e/ou H169, V74, L75, L78, T80, L81, T87, G88, Y89, H90, G91, T94, R95, D96, F97, Y167, F168, H169, H170, N171, G172, D173,1174, S175, N176, D178, D179, R180, Y181, E182, A183, Q184, K186, N187, F188, T189.

Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição correspondente a uma ou mais das seguintes substituições na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1: D17E/Q, A30M/L/A/V/I/E/Q, S32D/E/N/Q, R95M/L/A/V/I/E/Q, H103Y/N/Q/D/E, N131D, Q201E, I174E/Q e H169N/D/E/Q V741, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T801/L/V/S/N/G, L811/V/S/T/N/Q/K/H, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/1, F97Y, Y167F/R/C, F168Y, H169N/Q/K, H170N/Q/K, N171D/E/Q/H/R/K/G, G172A/T/S, D173N/S/T/Y/R/G, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, Τ189N/D/A/S/H/Y/G.

Em outra modalidade preferida da invenção com respeito a alteração da ligação de Ca2+ de uma alfa-amilase maltogênica, a seqüência parcial N28-P29-A30-K31-S32-Y33-G34 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, é modificada.

Substituições semelhantes podem ser introduzidas em posições equivalentes de outras alfa-amilases maltogênicas. Modificações de particular interesse são qualquer combinação de uma ou mais das acima com qualquer uma das outras modificações aqui apresentadas.

Outras substituições Variantes com estabilidade melhorada da enzima podem ser obtidas melhorando-se a existente ou introduzindo-se novos contatos interdomínio ou intradomínio. Tal estabilidade melhorada pode ser obtida pelas modificações listadas abaixo. A alfa-amilase maltogênica tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 pode ser estabilizada pela introdução de uma ou mais ligações dissulfeto interdomínio. Consequentemente, outra modalidade preferida da presente invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, que tenha estabilidade melhorada e pelo menos uma ou mais pontes dissulfeto interdomínio, em comparação com a dita precursora, em que dita variante compreenda uma modificação em uma posição correspondente a pelo menos um dos seguintes pares de posições na SEQ ID NO: 1: G236 + S583, G618 + R272, T252 + V433 e/ou A348 + V487.

Em uma modalidade mais preferida, a substituição corresponde a pelo menos um dos seguintes pares: G236C + S583C, G618C + R272C, T252C + V433C e/ou A348C + V487C.

Outra modalidade preferida da invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora que tem uma estabilidade melhorada e uma interação interdomínio alterada, em comparação com a dita precursora, em que dita variante compreende uma substituição em uma posição correspondente pelo menos a um dos seguintes conjuntos de posições na SEQID NO: 1: i) F143, F194, L78; ii) A341, A348, L398,1415, T439, L464, L465; III) L557; iv) S240, L268; v) Q208, L628;

vi) F427, Q500, N507, M508, S573; E vii) 1510, V620.

Em uma modalidade preferida, a substituição corresponde a pelo menos um dos seguintes conjuntos: i) F143Y, F194Y, L78Y/F/W/E/Q; ii) A341S/D/N, A348V/I/L, L398E/Q/N/D, I415E/Q, T439D/E/Q/N, L464D/E, L465D/E/N/Q/R/K; iii) L557Q/E/N/D; iv) S240D/E/N/Q, L268D/E/N/Q/R/K; v) Q208D/E/Q, L628E/Q/N/D; vi) F427E/Q/R/K/Y, Q500Y, N507Q/E/D, M508K/R/E/Q, S573D/E/N/Q; e/ou vii) 151OD/E/N/Q/S, Y620D/E/N/Q.

Outra modalidade preferida da invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora que tem uma estabilidade melhorada e uma ou mais pontes de sal, em comparação com dita precursora, em que dita variante compreende uma substituição em uma posição correspondente pelo menos a um dos seguintes conjuntos de posições naSEQ IDNO:l: N106, N320eQ624.

Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição correspondente às seguintes substituições na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1: N106R, N320E/D e/ou Q624E.

Outra modalidade da invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora que tem uma estabilidade melhorada e em que dita variante compreende uma substituição em uma posição correspondente pelo menos a um dos seguintes conjuntos de posições na SEQ ID NO: 1: K40, V74, S141, T142, F188, N234, K249, D261, D261, L268, V279, N342, G397, A403, K425, S442, S479, S493, T494, S495, A496, S497, A498, Q500, K520, A555 e N595.

Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição correspondente a uma ou mais das seguintes substituições por prolina na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1: V74P, S141P, N234P, K249P, L268P, V279P, N342P, G397P, A403P, S442P, S479P, S493P, T494P, S495P, A496P, S497P, A498P, Q500P e/ou A555P.

Outras substituições preferidas são K40R, T142A, F188I/L, D261G, K425E, K520R e/ou N595I.

Analogamente, pode ser preferível que um ou mais resíduos de histidina presentes na alfa-amilase maltogênica precursora seja ou sejam substituídos por um resíduo não histidina, tal como Y, V, I, L, F, Μ, E, Q, N ou D. Consequentemente, em outra modalidade preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a um ou mais dos seguintes resíduos da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQID NO 1: H103,H220,eH344 Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição correspondente a uma ou mais das seguintes substituições na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1: H103Y/V/I/L/F/Y, H220Y/L/M e H344E/Q/N/D/Y.

Pode ser preferível que um ou mais resíduos de aspargina ou glutamina presentes na alfa-amilase maltogênica seja ou sejam substituídos por um resíduo desprovido da amida na cadeia lateral. Consequentemente, em outra modalidade preferida, a variante de uma semelhante à Novamyl compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a um ou mais dos seguintes resíduos da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1: Q13, N26, N77, N86, N99, Q119, N120, N131, N152, N171, N176, NI87, Q201, N203, N234, Q247, N266, N275, N276, N280, N287, Q299, N320, N327, N342, Q365, N371, N375, N401, N436, N454, N468, N474, Q500, N507, N513, Q526, N575, Q581, N621, Q624 e N664.

Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma substituição correspondente a uma ou mais das seguintes substituições na seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1: Q13 S/T /A/V/L/I/F/M, N26S/T/A/V/L/I, N77S/T/A/V/L/I, N86S/T/A/V/L/I, N99T/S/V/L, Q119T/S, N120S/T/A/V/L/I, N131S/T/A/V/I, N152T/S/V/L, N171Y/D/S/T, N176S/T/A/V/L/I, N187S/T/A/V/L/I, Q201S/T/A/V/L/I/F/M, N203D/S/T/A/V/L/I, N234S/T/A/V/L/I, Q247S/T/A/V/L/I/F/M, N266S/T/A/V/L/I, N275S/T/A/V/L/I, N276S/T/A/V/L/I, N280S/T/A/V/L/I, N287S/T/A/V/L/I, Q299L/T/S, N320S/T/A/V/L/I, N327S/T/A/V/L/I, N342S/T/A/V/L/I, Q365S/T/A/V/L/I, Ν3 71S/Τ/ΑΛΖ/L/I, N375S/T/A/V/L/I, N40IS/T/A/V/L/I, N436S/T/A/V/L/I, N454D/S/T/A/V/L/I, N468D/S/T/A/V/L/I, N474D/S/T/A/V/L/I, Q5 OOS/T/A/V/L/I/F/M, N507S/T/A/V/L/I, N513S/T/A/V/L/I, Q526D/S/T/A/V/L/I, N575S/T/A/V/L/I, Q5 81S/T/A V/L/I/F/M, N621S/T/A/V/L/I, Q624S/T/A/V/L/I/F/M e N664D/S/T/A/V/L/I.

Outra modalidade da invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora que tem estabilidade melhorada e contatos de ligação de hidrogênio melhorados, em comparação com a dita precursora, em que referida variante compreende uma modificação em uma posição correspondente a uma ou mais das seguintes posições em SEQ ID NO: 1: 116, L35, M45, P73, D76, D79, Al92, 1100, A148, A163+G172, L268, V281, D285, L321, F297, N305, K316, S573, A341, M378, A381, F389, A483, A486, 1510, A564, F586, K589, F636, K645, A629 e/ouT681.

Em uma modalidade preferida, a modificação corresponde a uma ou mais das seguintes: I16T/D/N, L35Q, M45K, P73Q, D76E, D79E/Y, A192S/D/N, 1100T/S/D/N/E/Q, A148D/N/E/Q/S/T/R/K, A163Y+G172S/D/N, L268R/K, V281/Q, D285R/K, L321Q, F297N/D/Q/E, N305K/R, K316N/D, S573N/D, A341R/K, M378R/K, A381S/D/N, F389Y, A483S/D/N, A486Q/E, I510R/K, A564S/D/N, F586S/D/N, K589S/D/Q/N, F636Y, K645T, A629N/D/E/Q e/ou T681D/N/E/Q/S.

Substituições semelhantes podem ser introduzidas em posições equivalentes de outras alfa-amilases maltogênicas. Substituições de particular interesse são qualquer combinação de uma ou mais das acima, por qualquer uma das outras modificações aqui apresentadas.

Antes de realmente construir uma variante de alfa-amilase maltogênica para se obter qualquer um dos objetivos acima, pode ser conveniente avaliar se, ou não, a modificação considerada de aminoácidos pode ser acomodada na estrutura da alfa-amilase maltogênica, por exemplo em um modelo da estrutura tridimensional da alfa-amilase maltogênica precursora.

Variantes da alfa-amilase maltogênica com termostabilidade alterada e/ou perfil de atividade dependente da temperatura alterado A invenção ainda diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica, que resulta de substituição, deleção ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácidos, de modo a obter-se uma variante tendo uma termostabilidade alterada ou perfil de atividade dependente da temperatura. A estrutura da alfa-amilase maltogênica contém várias cavidades internas únicas que podem conter água e várias fendas. A fim de aumentar a termostabilidade do polipeptídeo, pode ser desejável reduzir o número ou o tamanho das cavidades e fendas, por exemplo pela introdução de um ou mais contatos hidrofóbicos, preferivelmente obtidos pela introdução de aminoácidos com grupos laterais de mais volume na vizinhança ou adjacências da cavidade. Por exemplo, os resíduos de aminoácido a serem modificados são aqueles que se acham envolvidos na formação da cavidade.

Consequentemente, em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo de aumentar a termostabilidade e/ou alterar o perfil da atividade dependente da temperatura de uma alfa-amilase maltogênica precursora, processo esse que compreende: i) identificar uma cavidade interna ou uma fenda da alfa-amilase maltogênica precursora na estrutura tridimensional do dito polipeptídeo; ii) substituir, na estrutura, um ou mais resíduos de aminoácido na vizinhança da cavidade ou fenda identificada na etapa i), por outro resíduo de aminoácido que, a partir de considerações estruturais ou funcionais, seja determinado para aumentar a interação hidrofóbica e para preencher ou reduzir o tamanho da cavidade ou fenda; e iii) construir uma variante da alfa-amilase maltogênica precursora resultante da etapa ii) e testar a termostabilidade e/ou atividade dependente da temperatura da variante. A estrutura identificada no Apêndice 1 pode ser usada para identificar a cavidade ou fenda da alfa-amilase maltogênica precursora.

Será entendido que a cavidade, ou fenda, é identificada pelos resíduos de aminoácido circundantes à dita cavidade ou fenda, e que a modificação dos ditos resíduos de aminoácido são de importância para encher ou reduzir o tamanho da dita cavidade ou fenda. Preferivelmente, a modificação é uma substituição com um resíduo de aminoácido mais volumoso, isto é, um com um volume maior de cadeia lateral. Por exemplo, todos os aminoácidos são mais volumosos do que Gly, enquanto Tyr e Trp são mais volumosos do que Phe. Os resíduos particulares de aminoácido referidos abaixo são aqueles que, em uma estrutura cristalina, foram observados flanquearem a cavidade ou fenda em questão.

Em uma modalidade preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica, a fim de encher, ou completamente ou parcialmente, as cavidades localizadas intemamente na estrutura, compreende uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente a um ou mais dos seguintes resíduos da seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1: L51, L75, L78, G88, G91, T94, VI14, 1125, V126, T134, G157, L217, S235, G236, V254, V279, V281, L286, V289, 1290, V308, L321,1325, D326, L343, F349, S353,1359,1405, L448, Q449, L452,1470, G509, V515, S583, G625, L627, L628 e A670. L71, S72, V74, L75, L78, Τ80, L81, G83, Τ84, D85, Ν86, Τ87, G88, Υ89, Η90, G91, Τ94, R95, D96, F97, Υ167, F168, Η169, Η170, Ν171, G172, D173, 1174, S175, Ν176, D178, D179, RI80, Y181, El82, A183, Q184, K186, N187, F188, T189, D190, A192, G193, F194, S195, L196.

Em uma modalidade mais preferida, a variante de uma alfa-amilase maltogênica compreende uma ou mais substituições correspondentes às seguintes substituições na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ IDNO: 1: L217 em combinação com L75 (por exemplo L217F/Y em combinação com L75F/Y), L51W, L75F/Y, L78I, G88A/V/T, G91T/S/V/N, T94V/I/L, V114V/I/L, I125L/M/F/Y/W, V126I/L, T134V/I/L/M/F/Y/W, G157A/V/I/L, L217V/I/M/F/Y/W, S235I/L/M/F/Y/W, G236A/V/I/L/M/F/Y/W, V254I/L/M/F/Y/W, V279M/I/L/F, V281I/L/M/F/Y/W, L286F, V289I/L/R, I290M/L/F, V308I/L/M/F/Y/W, L321I/M/FY/W, I325L/M/F/Y/W, D326E/Q, L343M/F/Y/W, F349W/Y, S353V/I/L, 1359L/M/F/Y/W, I405M/L/Y/F/W, L448Y, Q449Y, L452M/Y/F/W, I470M/L/F, G509AV/I/L/M/S/T/D/N, V515I/L, S583V/I/L/V, G625A/V/I//L/M/F/Y/W, L627M/F/Y, L628M/I/F/Y/W E A670V/I/L/M/F/Y/W, L71I, S72C, V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/T/N/Q/K/H, G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L, T84S/A/N/D/G, D85A/T/S/N/G, N86Q/E/D/Y/H/K, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/AMV/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, Y167F/R/C, F168Y, H169N/Q/K, H170N/Q/K, N171D/E/Q/H/R/K/G, G172A/T/S, D173N/S/T/Y/R/G, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/D/A/S/H/Y/G, D190E/Q/H/N/K, A192T/D/E/N/K, G193A/S/T, F194Y, S195N/D/E/R/K/G, L196I.

Substituições semelhantes podem ser introduzidas em posições equivalentes de outras alfa-amilases maltogênicas. Variantes de particular interesse têm uma combinação de uma ou mais das acima, com qualquer uma das outras modificações aqui apresentadas.

Variantes de alfa-amilase maltogênica com um padrão de divagem alterado Um objetivo da presente invenção é mudar as características de degradação de uma alfa-amilase maltogênica. Assim, a Novamyl hidrolisa amido para formar predominantemente maltose (G2) e uma pequena quantidade de glicose (Gl), mas virtualmente nenhum oligossacarídeo superior (G3+). Pode ser desejável mudar este padrão de divagem, por exemplo de modo a formar quantidades mais elevadas de oligossacarídeos superiores, tais como maltotriose (G3), maltotretaose (G4) e maltopentaose (G5).

Uma variante de uma alfa-amilase maltogênica em que o padrão de divagem do substrato seja alterado, em comparação com dita precursora, pode ser construída por um processo que compreende: i) identificar a área de ligação do substrato da alfa-amilase maltogênica precursora em um modelo da estrutura tridimensional, por exemplo dentro de uma esfera de 4 Á a partir do sítio de ligação do substrato, conforme definido na seção acima intitulada “Sítio de Ligação do Substrato”; ii) substituir no modelo um ou mais resíduos de aminoácido da área de ligação do substrato da fenda identificada em i), que é, ou acredita-se que seja, responsável pelo padrão de divagem da precursora com outro resíduo de aminoácido, que, a partir de considerações estruturais ou funcionais, acredita-se resultar em um padrão de divagem do substrato alterado, ou deletar um ou mais resíduos de aminoácido da área de ligação do substrato considerada para introduzir interações favoráveis no substrato ou adicionar um ou mais resíduos de amínoácido na área de ligação do substrato considerada para introduzir interações favoráveis no substrato; e iii) construir uma variante de alfa-amilase maltogênica resultante da etapa ii) e testar o padrão de divagem do substrato da variante.

Consequentemente, outro aspecto da invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase maltogênica que tenha um sítio de ligação do substrato alterado em comparação com dita precursora, variante essa que compreende uma modificação em uma posição correspondente a uma ou ambas das seguintes posições na SEQID NO: 1: V281 e/ou A629.

Em uma modalidade preferida, a variante compreende uma modificação correspondente a: V281Q e/ou A629N/D/E/Q.

Modificações semelhantes podem ser introduzidas em posições equivalentes de outras alfa-amilases maltogênicas. Substituições de particular interesse são qualquer combinação de uma ou mais das acima, com qualquer uma das outras modificações aqui apresentadas.

Variantes de alfa-amilase maltogênica com capacidade melhorada para reduzir a retrogradação do amido e/ou o envelhecimento do pão A invenção fornece variantes de alfa-amilase maltogênica que têm capacidade melhorada para reduzir a retrogradação do amido e/ou o envelhecimento do pão. Variantes preferidas compreendem uma modificação em uma ou mais posições correspondentes aos seguintes resíduos de amínoácido na SEQ ID NO: 1: A30, K40, NI 15, T142, F188, T189, P191, Al92, G193, F194, S195, D261, N327, K425, K520 e N595.

Em uma modalidade mais preferida, a variante compreende uma ou mais modificações correspondentes às seguintes na SEQ ID NO: 1: A30D, K40R, NI15D, T142A, F188L, T189Y, Δ (191-195), D261G, D261G, N327S, Κ425Ε, K520R e N595I.

Determinação de resíduos dentro de 10 À dos íons de cálcio As coordenadas do Apêndice 1 são lidas no programa INSIGHT (BIOSYM Technologies). As coordenadas espaciais são apresentadas mostrando as ligações entre os átomos. Os íons são apresentados, assim como os átomos da água. A parte do pacote do programa para criar subconjuntos foi usada para criar um subconjunto de 10 Â ao redor dos íons de cálcio na estrutura, mediante o uso do comando ZONE. Todos os resíduos identificados como tendo um átomo dentro da distância designada de 10 Â de um íon de cálcio, são compilados e listados pelo uso do comando LIST MOLECULE. Dando aos íons o nome de “VAT CA” no arquivo de coordenadas, uma esfera de 10 Â ao redor de todos os átomos, chamada “VAT CA”, é compilada. Os resíduos específicos identificados desta maneira são dados mais acima na seção intitulada “Ligação de cálcio”. Determinação das cavidades A estrutura solucionada da Novamyl com as coordenadas estruturais apresentadas no Apêndice 1, revela muitas fendas e cavidades internas. Quando da análise de tais cavidades, o programa Connolly é normalmente usado (Lee, B. e Richards, F. M. (1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400). O programa utiliza uma sonda com raios para pesquisar a superfície externa e interna da proteína. A fenda menor observável desta maneira tem o raio da sonda.

Para testar a estrutura solucionada, uma versão modificada do programa Connolly incluída no programa do INSIGHT foi usada. Na primeira etapa, as moléculas de água e os íons foram removidos por emersão destes átomos da estrutura solucionada. Mediante o uso do comando MOLECULE SURFACE SOLVENT, a área superficial acessível ao solvente foi calculada para todos os átomos e resíduos, usando um raio de sonda de 1,4 Á e apresentada graficamente junto com o modelo da estrutura solucionada. As cavidades internas são então observadas como superfícies de pontos sem qualquer conexão com a superfície externa.

As sugestões quanto às modificações específicas para completar as cavidades são dadas acima na seção intitulada “Variantes com termostabilidade alterada e/ou perfil de atividade alterada dependente da temperatura”. Mediante o uso das estruturas construídas da homologia ou/e comparações com base no alinhamento das seqüências, as mutações quanto às estruturas homólogas de alfa-amilases maltogênicas podem ser produzidas. Nomenclatura para as modificações de aminoácidos A nomenclatura aqui usada para definir mutações é essencialmente como descrito na WO 92/05249. Assim, F188H indica uma substituição do aminoácido F (Phe) na posição 188 pelo aminoácido H (His). V129S/T/G/V indica uma substituição do aminoácido VI29 por S, T, G ou V. Δ (191-195) ou Δ (191-195) indica uma deleção de aminoácidos nas posições 191-195. 192-A-193 indica uma inserção de A entre os aminoácidos 192 e 193.

Identidade da seqüência de polipeptídeo Para a finalidade da presente invenção, o grau de identidade pode ser adequadamente determinado de acordo com o processo descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D., Journal of Molecular Biology, 48, 443-445, com as seguintes colocações quanto à comparação de seqüências de polipeptídeos: penalidade de criação do GAP de 3,0 e penalidade de extensão do GAP de 0,1. A determinação pode ser feita por meio de um programa de computador conhecido, tal como o GAP fornecido no pacote do programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

As variantes da invenção têm uma identidade de aminoácido com os aminoácidos 1 a 686 da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, preferivelmente de pelo menos 80%, por exemplo de pelo menos 90%, particularmente de pelo menos 95%, ou de pelo menos 98%.

Hibridizacão Condições experimentais adequadas para determinar a hibridização entre uma sonda de nucleotídeo e um DNA homólogo ou seqüência de RNA, envolve o pré-embebimento do filtro contendo os fragmentos de DNA ou o RNA para hibridizar 5x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio, Sambrook et al, 1989) por 10 minutos, e pré-hibridização do filtro em uma solução de 5x SSC, 5x solução de Denhardt (Sambrook et al, 1989), SDS 0,5% e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado exposto à energia sonora (Sambrook et al, 1989), seguida por hibridização na mesma solução contendo uma sonda aleatoriamente iniciada [Feinberg, A. P. e Vogelstein, B (1983) Anal Biochem. 132: 6-13], sonda rotulada :,2P-dCTP (atividade específica > 1 x 109 cpm/pg) por 12 horas em cerca de 45°C. O filtro foi então lavado por duas vezes por 30 minutos em 2x SSC, SDS 0,5% pelo menos 55°C (baixa estringência), preferivelmente pelo menos 60°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos 65°C (média/alta estringência), mais preferível pelo menos 70% (alta estringência), mesmo mais preferível pelo menos 75°C (estringência muito alta).

As moléculas que hibridizam às sondas de oligonucleotídeos sob estas condições são detectadas por exposição a filme de raio-x.

Processos de preparo de variantes das alfa-amilases maltogênicas Clonagem de uma seqüência de DNA codificando um polipeptídeo semelhante à Novamvl A seqüência de DNA codificando uma alfa-amilase maltogênica precursora pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo que produza a alfa-amilase maltogênica em questão, usando vários processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, da cepa NCIB 11837 d zBacillus.

Primeiro, o DNA genômico e/ou biblioteca de cDNA devem ser construídos usando-se DNA cromossômico ou RNA mensageiro a partir do organismo que produz a alfa-amilase maltogênica a ser estudada. Depois, se a seqüência de aminoácido da α-amilase for conhecida, sondas de oligonucleotídeos homólogos rotulados podem ser sintetizadas e usadas para identificar os clones codificadores da alfa-amilase maltogênica a partir de uma biblioteca genômica preparada a partir do organismo em questão. Altemativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulado contendo seqüências homólogas a um gene de α-amilase conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar os clones codificadores de alfa-amilase maltogênica, usando condições de hibridização e lavagem de estringência inferior.

Outro processo para identificar os clones codificadores da alfa-amilase maltogênica envolve a inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformando as bactérias negativas de aamilase com a biblioteca de DNA genômico resultante, e então colocando-se em placa as bactérias transformadas em agar contendo um substrato para a alfa-amilase maltogênica, dessa forma permitindo que os clones expressem a atividade da alfa-amilase maltogênica a ser identificada.

Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por processos padrão estabelecidos, por exemplo o processo da fosforoamidita descrito por S. L. Beaucage e Μ. H. Camthers (1981) ou o processo descrito por Matthes et al. (1984). No processo da fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador automático de DNA, purificado, recozido, ligado e clonado em vetores apropriados.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem genômica e sintética mista, de origem sintética e de cDNA mista ou de origem mista genômica e de cDNA, preparada pela ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA, em que os fragmentos correspondem a várias partes da seqüência de DNA inteira, de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica. A seqüência de DNA pode também ser preparada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo como descrito na U.S. 4.683.202 ou em R. K. Saiki et al. (1988).

Mutaeênese dirigida ao sítio Uma vez a seqüência de DNA codificando a alfa-amilase maltogênica tenha sido isolada, e os sítios desejáveis para a modificação identificados, as modificações podem ser introduzidas usando-se oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm seqüência de nucleotídeos que flanqueiam os sítios de modificação desejados; os nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese do oligonucleotídeo. Em um processo específico, um intervalo de DNA de filamento único, ligando em ponte a seqüência codificando a alfa-amilase maltogênica, é criado em um vetor transportando o gene de alfa-amilase maltogênica. Então, o nucleotídeo sintético, conduzindo a modificação desejada, é recozido em uma porção homóloga do DNA de filamento único. O intervalo remanescente é então enchido com DNA polimerase I (fragmento de Klenow) e a construção é ligada usando-se ligase T4. Um exemplo específico deste processo é descrito em Morinaga et al. (1984). A Patente 4.760.025 apresenta a introdução de oligonucleotídeos codificando modificações múltiplas realizando alterações secundárias do cassete. No entanto, uma variedade mesmo maior de modificações pode ser introduzida a qualquer tempo pelo processo de Morinaga, porque uma multidão de oligonucleotídeos, de vários comprimentos, pode ser introduzida.

Outro processo de introduzir modificações em seqüências de DNA codificando uma alfa-amilase maltogênica, é descrito em Nelson e Long (1989). Ele envolve uma geração de 3 etapas de um fragmento da PCR contendo a modificação desejada introduzida pelo uso de um filamento de DNA quimicamente sintetizado, como um dos iniciadores nas reações de PCR. A partir do fragmento gerado por PCR, um fragmento de DNA carregando a modificação pode ser isolado por divagem com endonucleases de restrição e re-inserido em um plasmídeo de expressão.

Mutagênese Aleatória A mutagênese aleatória é adequadamente realizada ou como mutagênese aleatória localizada ou específica da região, em pelo menos três partes do gene transladando à seqüência de aminoácidos em questão apresentada, ou dentro do gene total. A mutagênese aleatória de uma seqüência de DNA codificando uma alfa-amilase maltogênica precursora pode ser convenientemente realizada pelo uso de qualquer processo conhecido na técnica.

Em relação ao acima, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um processo para gerar uma variante de uma a-amilase precursora semelhante à Novamyl, em que a variante apresenta estabilidade aumentada em pH baixo e em concentração de cálcio baixa em relação à precursora, o processo compreendendo: (a) submeter uma seqüência de DNA codificando a a-amilase precursora semelhante a Novamyl a mutagênese aleatória, (b) expressar a seqüência de DNA transformada obtida na etapa (a) em uma célula hospedeira, e (c) examinar as células hospedeiras que expressem uma a-amilase semelhante a Novamyl, que tenham uma propriedade alterada em relação à α-amilase precursora semelhante a Novamyl. A etapa (a) do processo da invenção supra é preferivelmente realizada usando-se iniciadores dopados, conforme descrito nos exemplos de trabalho aqui incluídos (vide abaixo).

Por exemplo, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de um agente de mutagenização físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo-se a seqüência de DNA a mutagênese gerada pela PCR. Além disso, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes de mutagenização. O agente de mutagenização pode, por exemplo, ser um que induza transições, transversões, inversões, misturas, deleções e/ou inserções.

Exemplos de um agente de mutagenização física ou química adequado para a presente finalidade, incluem a irradiação ultravioleta (UV), a hidroxilamina, a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), a hidroxilamina O-metílica, o ácido nitroso, o sulfonato de metano etílico (EMS), o bissulfito de sódio, o ácido fórmico e os análogos de nucleotídeos. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada pela incubação da seqüência de DNA codificando a enzima precursora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha, sob condições adequadas para a mutagênese a ter lugar, e selecionando-se quanto ao DNA transformado tendo as propriedades desejadas.

Quando ao mutagênese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou bloqueado com os três nucleotídeos não precursores durante a síntese do oligonucleotídeo nas posições que devam ser mudadas. A dopagem ou bloqueio podem ser feitos de modo que os códons para os aminoácidos indesejáveis sejam evitados. O oligonucleotídeo dopado ou bloqueado pode ser incorporado no DNA que codifica a enzima alfa-amilase maltogênica por qualquer técnica publicada, usando-se, por exemplo, PCR, LCR ou qualquer DNA polimerase e ligase, como julgado apropriado.

Preferivelmente, a dopagem é realizada usando-se “dopagem aleatória constante”, em que o percentual de tipo selvagem e modificação em cada posição seja pré-definida. Além disso, a dopagem pode ser dirigida para a uma preferência pela introdução de certos nucleotídeos, e dessa forma uma preferência para a introdução de um ou mais resíduos específicos de aminoãcidos, A dopagem pode ser produzida, por exemplo, de modo a permitir a introdução de 90% do tipo selvagem e 10% de modificações em cada posição. Uma consideração adicional na escolha de um esquema de dopagem se baseia na genética, bem como nas restrições estruturais da proteína, O esquema de dopagem pode ser produzido pelo uso do programa DOPE que, entre outros, garante que a introdução dos códons de parada seja evitada.

Quando a mutagênese gerada pela PCR. for usada, ou um gene quimicamente tratado ou não tratado codificando uma enzima de alfa-amilase maltogênica precursora é submetida a PCR sob condições que aumentam desincorporação de nucleotídeos (Deshier 1992; Leung et al, Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15).

Uma cepa de E. coli transformadora (Fowler et a/., Molec. Gen. Genet, 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae ou qualquer outro organismo microbiano podem ser usados para a mutagênese aleatória do DNÀ codificando a alfa-amílase maltogênica mediante, por exemplo, a transformação de um ptasmídeo contendo a enzima precursora na cepa transformadora, cultivando a cepa transformadora com o píasmídeo e isolando-se o píasmídeo transformado da cepa transformadora. O píasmídeo transformado pode ser subsequentemente transformado no organismo de expressão. A sequência de DNA a ser mutagenizada pode estar convenientemente presente em uma biblioteca genômica ou de cDNA preparada de um organismo que expresse a alfa-amilase maltogênica precursora. Altemativamente, a sequência de DNA pode estar presente em um vetor adequado, tal como um plasmídeo ou um bacteriófago, que, como tal, pode ser incubado, ou de outra forma exposto, com o agente de mutagenização. O DNA a ser mutagenizado também pode estar presente em uma célula hospedeira ou estar integrado no genoma da dita célula ou estar presente em um vetor abrigado na célula. Finalmente, o DNA a ser mutagenizado pode estar na forma isolada. Será entendido que a seqüência de DNA a ser submetida a mutagênese aleatória é preferivelmente um cDNA ou uma seqüência de DNA genômica.

Em alguns casos, pode ser conveniente ampliar a seqüência de DNA transformada antes de realizar a etapa b) de expressão ou a etapa c) de exame. Tal ampliação pode ser realizada de acordo com processos conhecidos na técnica, o processo presentemente preferido sendo a ampliação gerada pela PCR usando iniciadores de oligonucleotídeos preparados na base da seqüência de DNA ou de aminoácido da enzima precursora.

Subsequente à incubação com, ou à exposição ao, agente de mutagenização, o DNA transformado é expresso pelo cultivo de uma célula hospedeira adequada transportando a seqüência de DNA sob condições que permitam que a expressão ocorra. A célula hospedeira usada para esta finalidade pode ser uma que tenha sido transformada com a seqüência de DNA transformada, opcionalmente presente em um vetor, ou uma que tenha sido transportada pela seqüência de DNA codificando a enzima precursora durante o tratamento de mutagênese. Exemplos de células hospedeiras adequadas são as seguintes: bactérias Gram-positivas, tais como Bacillus subtillus, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus’, e bactérias Gram-negativas, tais como E. coli. A seqüência de DNA transformada pode ainda compreender uma seqüência de DNA codificando funções que permitam a expressão da seqüência de DNA transformada.

Mutagênese aleatória localizada A mutagênese aleatória pode ser vantajosamente localizada em uma parte da alfa-amilase maltogênica precursora em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso quando certas regiões da enzima tenham sido identificadas como sendo de particular importância para uma dada propriedade da enzima, e, quando modificadas, espera-se que resultem em uma variante tendo propriedades melhoradas. Essas regiões podem normalmente ser identificadas quando a estrutura terciária da enzima precursora tiver sido elucidada e relacionada à função da enzima. A mutagênese aleatória localizada, ou específica da região, é convenientemente realizada mediante o uso de técnicas de mutagênese geradas por PCR, como descrito acima, ou qualquer outra técnica adequada conhecida na técnica. Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a parte da seqüência de DNA a ser modificada, pode ser isolada, por exemplo por inserção em um vetor adequado, e dita parte pode ser subseqüentemente submetida a mutagênese pelo uso de qualquer dos processos de mutagênese examinados acima.

Quanto à mutagênese aleatória específica da região com vistas a melhorar a estabilidade da ligação de cálcio de uma alfa-amilase maltogênica precursora, as posições do códon correspondentes aos seguintes resíduos de aminoácidos da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 pode apropriadamente ser alvejada: Resíduos: Regiões: 16-33,35-36,40:16-40 46-54,56:46:56 73-81:73-81 87-89,91,93-96,99-105,109:87-109 129-134,(145,150): 129-134 167-172,174,177,180-189: 167-189 196-202,106-210 :196-210 228-235,237:228-237 378 637 Com vistas a obter ligação melhorada de um substrato, isto é, ligação melhorada de uma espécie da carboidrato, tal como amilose ou amilopectina, por uma variante de alfa-amilase maltogênica com uma especificidade do substrato modificada, por exemplo, mais elevada e/ou uma especificidade modificada, por exemplo mais elevada, com respeito à divagem, isto é, hidrólise, do substrato, parece que as seguintes posições do códon nas seguintes regiões da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, pode em particular apropriadamente, ser alvejada para modificação por mutagênese específica da região: 70-97, 127-143, 174-198, 226-233, 255-270, 282-292, 324- 331,370-376.

Para a mutagênese aleatória específica da região, com vistas a alterar a especificidade do substrato e/ou o perfil de atividade dependente do pH, as seguintes regiões da SEQ ID NO: 1 podem ser alvejadas: 70-97,174-198.

As seguintes regiões podem ser alvejadas com vistas a melhorar a termostabilidade: 70-109,167-200.

Processo geral para a mutagênese aleatória, pelo uso do programa POPE A mutagênese aleatória pode ser realizada mediante as seguintes etapas: 1. Selecionar as regiões de interesse para modificação na enzima precursora 2. Decidir sobre os sítios de mutação e os sítios não transformados na região selecionada 3. Decidir sobre qual a espécie de mutações deve ser realizada, por exemplo com respeito à estabilidade desejada e/ou ao desempenho da variante a ser construída 4. Selecionar as mutações estruturalmente razoáveis 5. Ajustar os resíduos selecionados pela etapa 3,com respeito à etapa 4. 6. Testar, pelo uso de um algoritmo dope adequado, a distribuição dos nucleotídeos. 7. Se necessário, ajustar os resíduos desejados ao realismo do código genético, por exemplo levando em conta as restrições resultantes do código genético, por exemplo de modo a evitar a introdução de códons de parada; a pessoa versada estará ciente de que algumas combinações de códons não podem ser usadas na prática e necessitarão ser adaptadas. 8. Produzir os iniciadores 9. Realizar a mutagênese aleatória pelo uso dos iniciadores 10. Selecionar as variantes da α-amilase resultantes, mediante exame quanto às propriedades melhoradas desejadas.

Algoritmos dope adequados para uso na etapa 6 são bem conhecidos na técnica. Um tal algoritmo é descrito por Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38. Outro algoritmo é o DOPE (Jensen, L. J., Andersen, K. V., Svendsen, A. e Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26: 697-702).

Expressão de variantes de alfa-amilase maltogênica A construção da variante de interesse é realizada cultivando-se um microorganismo que compreenda uma sequência de DNA codificando a variante sob condições que sejam conducentes para produzir a variante, e, de forma opcional, subseqüentemente, recuperando a variante do caldo de cultura resultante. Isto é descrito em detalhes mais abaixo.

Em conformidade com a invenção, uma seqüência de DNA codificando a variante produzida pelos processos descritos acima, ou por quaisquer processos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressa, na forma de uma proteína ou polipeptídeo, usando-se um vetor de expressão que tipicamente inclui as seqüência de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de iniciação da translação e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores. O vetor de expressão recombinante carregando a seqüência de DNA que codifica uma variante de alfa-amilase maltogênica da invenção pode ser qualquer vetor que possa convenientemente ser submetido a procedimentos recombinantes de DNA, e a escolha do vetor ffeqüentemente dependerá da célula hospedeira na qual ele deva ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação seja independente da replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossômico, minicromossoma ou um cromossoma artificial. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) em que ele tenha sido integrado.

No vetor, a seqüência de DNA deve ser operavelmente conectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que apresente atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, e pode ser derivada dos genes que codifiquem proteínas, ou homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da seqüência de DNA codificando a variante de alfa-amilase maltogênica da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do opéron lac de E. coli, os promotores dagk do gene de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene α-amilase do Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene (amyM) da amilase maltogênica do Bacillus steatothermophilus, os promotores da α-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, os promotores dos genes xylA e xylB do Bacillus subtilis, etc. Para a transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica a amylase TAKA de A. oryzae, a proteinase aspártica do Rhizomucor miehei, a a- amylase neutra de A. niger, a α-amilase estável ácida de A. niger, a glicoamilase de A. niger, a lipase de Rhizomucor miehei, a protease alcalina de A. oryzae, a triosefosfato isomerase de A. oryzae ou a acetamidase de A. nidulans. O vetor de expressão da invenção pode também compreender um terminador da transcrição adequado e, em eucariotas, as seqüências de poliadenilação operavelmente conectadas à seqüência de DNA codificando a variante da alfa-amilase maltogênica da invenção. As seqüências de terminação e de poliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes do promotor. O vetor pode ainda compreender uma seqüência de DNA que permita que o vetor se replique na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBl 10, pE194, pAMBl e pIJ702. O vetor também pode compreender um marcador selecionável, por exemplo um gene cujo produto complemente uma anomalia na célula hospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou de B. licheniformis, ou um que confira resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, à canamicina, ao cloranfenicol ou à tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB, niaD e sC, um marcador fazendo surgir uma resistência à higromicina, ou a seleção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo conforme descrito na WO 91/17243.

Embora a expressão intracelular possa ser vantajosa em algumas circunstâncias, por exemplo quando do uso de certas bactérias como células hospedeiras, é geralmente preferível que a expressão seja extracelular. Em geral, as α-amilases de Bacillus aqui mencionadas compreendem uma pré-região que permite a secreção da protease expressa no meio de cultura. Se desejável, esta pré-região pode ser substituída por uma pré-região diferente ou seqüência de sinal, convenientemente realizada pela substituição das seqüências de DNA codificando as pré-regiões respectivas.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA da invenção codificando a variante de alfa-amilase maltogênica, o promotor, o terminador e outros elementos, respectivamente, e para inseri-los em vetores adequados contendo a necessária informação para replicação, são bem conhecidos das pessoas versadas na técnica [conforme, por exemplo, Sambrook et al (1989)]. A célula da invenção, ou compreendendo uma construção de DNA ou um vetor de expressão da invenção como definido acima, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de alfa-amilase maltogênica da invenção. A célula pode ser transformada com a construção de DNA da invenção codificando a variante, conveniente pela integração da construção de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem, já que a seqüência de DNA é mais provável de ser estavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA no cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com processos convencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão, como descrito acima em conexão com os tipos diferentes de células hospedeiras. A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior, tal como um mamífero ou um inseto, mas preferivelmente uma célula microbiana, por exemplo uma célula bacteriana ou uma íungica (incluindo a levedura).

Exemplos de bactérias adequadas são as bactérias Gram-positivas, tais como Baciüus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas, tais como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos ou pelo uso de células competentes de uma maneira por si conhecida. O organismo da levedura pode favoravelmente ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae. O fungo filamentoso pode vantajosamente pertencer a uma espécie de Aspergillus, por exemplo Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolva a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida pela regeneração da parede celular de uma maneira por si conhecida. Um procedimento adequado para transformação das células hospedeiras de Aspergillus é descrito na EP 238 023.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo de produção de uma variante de alfa-amilase maltogênica da invenção, processo esse que compreende cultivar uma célula hospedeira como descrito acima, sob condições conducentes à produção da variante, e recuperar a variante das células e/ou meio de cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para o cultivo da célula hospedeira em questão e obtenção da expressão da variante da alfa-amilase maltogênica da invenção.

Meios adequados acham-se disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo conforme descrito nos catálogos da American Type Culture Collection). A variante de alfa-amilase maltogênica secretada das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo a separação das células do meio, mediante centrifugação ou filtração, e precipitação dos componentes proteináceos do meio por intermédio de um sal, tal como sulfato de amônio, seguida pelo uso de procedimentos cromatográficos, tais como cromatografía de troca de íons, cromatografía por afinidade, ou coisa parecida.

Testes das variantes da alfa-amilase maltogênica As variantes da alfa-amilase maltogênica, produzidas por qualquer dos processos descritos acima, podem ser testadas, ou antes ou após a purificação, quanto à atividade amilolítica em um ensaio de avaliação que mede a capacidade da variante de degradar o amido. A avaliação na etapa 10 no processo de mutagênese aleatória mencionado acima, da invenção, pode ser convenientemente realizada pelo uso de um ensaio de filtragem à base do seguinte procedimento: um microorganismo capaz de expressar a alfa-amilase maltogênica transformada de interesse é incubado em um meio adequado e sob condições adequadas para a secreção da enzima, o meio sendo coberto com dois filtros compreendendo um filtro de ligação proteínica colocado sob um segundo filtro apresentando uma capacidade baixa de ligação proteínica. O microorganismo é cultivado no segundo filtro de cima. Subseqüentemente à incubação, o filtro de ligação proteínica de baixo, contendo as enzimas secretadas do microorganismo, é separado do segundo filtro contendo o microorganismo. O filtro de ligação proteínica é então submetido a avaliação quanto à atividade enzimática desejada, e as colônias microbianas correspondentes presentes no segundo filtro são identificadas. O primeiro filtro usado para ligação da atividade enzimática pode ser qualquer filtro de ligação proteínica, por exemplo náilon ou nitrocelulose. O segundo filtro carregando as colônias do organismo de expressão pode ser qualquer filtro que tenha nenhuma ou baixa afinidade quanto às proteínas de ligação, por exemplo acetato de celulose ou Drapore®. A avaliação consiste de tratar o primeiro filtro ao qual a proteína secretada está ligada, com um substrato que permita a detecção da atividade da α-amilase. A atividade enzimática pode ser detectada por um corante, por fluorescência, precipitação, indicador de pH, absorbância de infravermelho ou qualquer outra técnica conhecida para detecção da atividade enzimática. O composto de detecção pode ser imobilizado por qualquer agente imobilizador, por exemplo agarose, agar, gelatina, poliacrilamida, amido, papel de filtro, pano; ou qualquer combinação de agentes imobilizadores. Por exemplo, a atividade da α-amilase pode ser detectada por amilopectina rotulada de Cibacron Red, que é imobilizada em agarose. A atividade da α-amilase sobre este substrato produz zonas na placa com intensidade reduzida da cor vermelha.

Para avaliar quanto às variantes com estabilidade aumentada, o filtro com variantes ligadas de alfa-amilase maltogênica pode ser pré-tratado antes da etapa de detecção descrita acima para inativar variantes que não tenham estabilidade melhorada em relação à alfa-amilase maltogênica precursora. Esta etapa de inativação pode consistir, sem estar a isto limitada, de incubação em temperaturas elevadas na presença de uma solução tamponada em qualquer pH de pH 2 a 12, e/ou em um tampão contendo outro composto conhecido ou que se considere contribua para a estabilidade alterada, por exemplo tensoativos, EDTA, EGTA, componentes da farinha de trigo, ou quaisquer outros aditivos relevantes. Os filtros assim tratados para um tempo especificado são então lavados brevemente em água desionizada e colocados em placas para detecção da atividade, como descrito acima. As condições são escolhidas de tal modo que as variantes estabilizadas apresentem atividade enzimática aumentada em relação à precursora após a incubação nos meios de detecção.

Para avaliar quanto às variante com termostabilidade alterada, os filtros com variantes ligadas são incubados em tampão em um dado pH (por exemplo, na faixa de pH 2 a 12) em uma temperatura elevada (por exemplo na faixa de 50°C a 110°C), por um período de tempo (por exemplo de 1 a 20 minutos), para inativar quase toda alfa-amilase maltogênica precursora, lavados em água, depois colocados diretamente sobre uma placa de detecção contendo amilopectina rotulada de Cibracon Red imobilizado e incubados até que a atividade seja detectável. De forma semelhante, a estabilidade dependente de pH pode ser avaliada pelo ajuste do pH do tampão na etapa de inativação acima, de tal modo que a alfa-amilase maltogênica precursora seja inativada, dessa forma permitindo a detecção apenas daquelas variantes com estabilidade aumentada no pH em questão. Para avaliar quanto às variantes com estabilidade dependente de cálcio aumentada, queladores de cálcio, tais como o ácido etileno glicol-bis(éter β-aminoetílico) Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraacético (EGTA), são adicionados ao tampão de inativação em uma concentração tal que a alfa-amilase maltogênica precursora seja inativada sob condições ainda definidas, tais como o pH do tampão, a temperatura ou um uma extensão especificada da incubação.

As variantes da invenção podem ser adequadamente testadas ensaiando-se a atividade da variante de degradação do amido, por exemplo pelas células hospedeiras em cultivo transformadas com uma seqüência de DNA codificando uma variante em uma placa de agarose contendo amido, e identificando as células hospedeiras de degradação do amido, conforme descrito acima. Outros testes com respeito a propriedades alteradas, incluindo a atividade específica, a especificidade do substrato, ao padrão de divagem, à termoativação, à termostabilidade, à atividade dependente de pH ou ótima, à estabilidade dependente de pH, à atividade dependente da temperatura ou ótima, à atividade de transglicosilação, à estabilidade e a qualquer outro parâmetro de interesse, podem ser realizados nas variantes purificadas de acordo com processos conhecidos na técnica, conforme descrito abaixo.

Degradação da dextrina β-limite por alfa-amilase maltogênica: Outro parâmetro importante na avaliação da especificidade do substrato de variantes de alfa-amilase maltogênica pode ser o grau em que tais enzimas são capazes de degradar o amido, o que tem sido exaustivamente tratado com a β-amilase exoglicosilase. Para avaliar as variantes que apresentam padrões de degradação sobre um tal substrato diferentes dos padrões produzidos pela alfa-amilase maltogênica precursora, o seguinte ensaio é realizado: a dextrina β-limite é preparada por incubação de 25 ml de amilopectina a 1% em tampão de Mcllvane (citrato 48,5 mM e fosfato de sódio 193 mM, pH 5,0) com 14 pg/ml de β-amilase durante a noite a 30°C. A amilopectina não hidrolisada (isto é, a dextrina β-limite) é precipitada com 1 volume de etanol 98%, lavada e redissolvida em água. 1 ml de dextrina β-limite é incubado com 18 μΐ de enzimas (em 2,2 mg/ml) e 100 μΐ de citrato 0,2 M-fosfato, pH 5,0 por 2 horas a 30°C, e testado por HPLC, conforme descrito acima. A hidrólise total de dextrina β-limite é realizada em HC12M a 95°C. A concentração de extremidades de redução é medida por processos conhecidos na técnica.

Afinidade de ligação de cálcio A não reduplicação das alfa-amilase maltogênica pela exposição a calor ou a desnaturantes, tais como o cloridreto de guanidina, é acompanhada por um decréscimo na fluorescência, e a perda de íons de cálcio conduz à não reduplicação. Assim, a afinidade de uma variante de alfa-amilase maltogênica para com o cálcio pode ser medida por medições da fluorescência antes e após a incubação da variante (por exemplo, em uma concentração de 10 mg/ml) em um tampão (por exemplo, HEPES 50 mM, pH 7) com diferentes concentrações de cálcio (por exemplo, na faixa de 1 mM a 100 mM) ou de EGTA (por exemplo na faixa de 1 a 1000 mM) por um período de tempo suficientemente longo (tal como de 22 horas, a 55°C). A fluorescência medida, F, é composta de contribuições das formas reduplicadas e não reduplicadas da enzima. O seguinte padrão pode ser derivado para descrever a dependência de F sobre a concentração de cálcio ([Ca]): onde aNé a fluorescência da forma nativa (reduplicada) da enzima, bN é a dependência linear de aN sobre o logaritmo da concentração de cálcio (como observado experimentalmente), âO é a fluorescência da forma não reduplicada e by é a dependência linear de a0 sobre o logaritmo da concentração de cálcio. Ki]SS é a constante de ligação aparente de cálcio para um processo de equilíbrio, como segue: 1ζ ■^■diss N-Ca« U + Ca (N=enzima nativa; U=enzima não reduplicada) De fato, a não reduplicação prossegue extremamente lenta e é irreversível. O índice de não reduplicação é dependente da concentração de cálcio, e tal dependência para uma dada enzima fornece uma medida da afinidade de ligação de cálcio da enzima. Pela definição de um conjunto de padrões de condições de reação (por exemplo, 22 horas a 55°C, uma comparação significativa de Kiiss para diferentes variantes de alfa-amilase maltogênica pode ser feita.

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

As variantes de alfa-amilase maltogênica da invenção possui propriedades valiosas que podem ser vantajosamente usadas em várias aplicações industriais. Em particular, a enzima encontra aplicação potencial para retardar ou impedir a retrogradação, e assim o envelhecimento, do alimento com base em amido, tal como é comum na indústria de padaria. A variante pode ser usada para a preparação de pão e outros produtos de pão, de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica.

Acredita-se que a modificação da fração de amido pelo uso da presente invenção, resulte em volume aumentado nos produtos cozidos e qualidades organolépticas aumentadas, tais como o sabor, a sensação na boca, o sabor, o aroma e a cor da côdea. A variante de alfa-amilase maltogênica pode ser usada como a única enzima ou como a atividade enzimática principal em combinação com uma ou mais enzimas adicionais, tais como a xilanase, a lipase, a glicose oxidase e outras oxidorredutases, ou uma enzima amilolítica.

As variantes ezimáticas da invenção também encontram aplicabilidade industrial como um componente nas composições detergentes para lavagem, lavagem de louça e limpeza de superfícies duras. Algumas variantes são particularmente úteis em um processo para a fabricação de oligossacarídeos lineares, ou na produção de edulcorantes e etanol de amido, e/ou para desengomadura têxtil. Condições para processos convencionais de conversão de amido, incluindo a liquefação de amido e/ou os processos de sacarificação, são descritos, por exemplo, na U.S. 3.912.590 e nas publicações das patentes EP 252.730 e 63.909. A invenção é ainda ilustrada com referência aos seguintes exemplos, que não intentam ser de qualquer maneira limitativos do escopo da invenção, como reivindicada. DETERMINAÇÃO DA AMILASE MALTOGÊNICA EM MANUs Uma Unidade Novo de Amilase Maltogênica (MANU) é a quantidade de enzima que, sob padrão, clivará um pmol de maltotriose por minuto. As condições padrão são 10 mg/ml de maltotriose, 37°C, pH 5,0, tempo de reação de 30 minutos. A dependência do pH é obtida pela repetição desta medida nas mesmas condições, mas em diferentes valores de pH.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE UMA VARIANTE DE NOVAMYL COM ATIVIDADE DEPENDENTE DE pH ALTERADA.

Novamyl é expressa em Bacillus subtilis de um plasmídeo aqui denotado como pLBeiOlO. Este plasmídeo contém amyM em que a expressão de amyM é direcionada por seu próprio promotor e pelo gene completo que codifica a Novamyl, por exemplo, conforme contido na cepa DSM 11837. O plasmídeo contém a origem de replicação, ori, do plasmídeo pUBl 10 e um marcador de resistência à canamicina para fins de seleção. O pLBeiOlO é apresentado na Figura 1.

SEOÜÊNCIASINICIADORAS

Os mutantes dirigidos ao sítio da Novamyl foram construídos pelo processo megainiciador essencialmente como descrito por Kammann et al. (1989). Resumidamente, um iniciador de oligonucleotídeo mutagênico é usado junto em uma reação de PCR com um iniciador de extremidade de filamento de DNA oposta adequado para criar um produto de PCR preliminar. Este produto é então usado como um megainiciador junto com outro iniciador de extremidade de filamento de DNA oposta para criar um produto de DNA de duplo filamento. O produto da reação final da PCR foi rotineiramente usado para substituir um fragmento correspondente de DNA no plasmídeo pLBeiOlO mediante procedimentos padrão de clonagem. Os mutantes foram transformados diretamente na cepa SHa273 de Bacillus subtilis, um derivado da Bacillus subtilis 168, que é apr', npr', amyR2‘ e preparado por processos conhecidos na técnica.

Iniciadores de oligonucleotídeos usados na construção das variantes descritas, são conforme listados abaixo: Seqüências de Variantes (5’-»3’) F188H: SEQIDN0:3 F188E: SEQ IDN0:4 F284E: SEQ IDN0:5 F284D: SEQ IDN0:6 F284K: SEQ IDN0:7 F327D: SEQ ID NO: 8 Seqüências de Variantes T288K: SEQ ID NO: 9 T288R: SEQ ID NO: 10 As variantes de Aspartato de F284, T288 e N327 foram obtidas usando-se o iniciador Al89 (SEQ ID NO: 11) e B649 (SEQ ID NO: 12) como iniciadores terminais.

As variantes F188 F188L, T189Y foram obtidas usando-se o iniciador A82 (SEQ ID NO: 13) e B346 (SEQ ID NO: 14) como iniciadores terminais.

Os produtos de PCR com a(s) modificação(ões) desejadas foram purificados, digeridos com enzimas apropriadas, separados por eletroforese em gel de agarose e extraído, precipitados em etanol na presença de glicogênio, recolocados em suspensão em H20, ligados ao pLBeiOlO que havia sido digerido com as mesmas enzimas apropriadas, e transformados em Bacillus subtilis SHa273. Os transformantes foram conferidos quanto ao tamanho por PCR de colônia e quanto a inserção ou remoção de sítios de restrição específicos mediante digestão de enzimas de restrição. As colônias positivas foram verificadas por processos de seqüenciação de DNA conforme descrito na técnica.

FERMENTAÇÃO

Os clones do mutante SHa273 de B. subtilis foram cultivados durante a noite sobre placas de Amido LB-Kana (10 mg/ml) a 37°C. As colônias da placa foram recolocadas em suspensão em 10 ml de caldo Luria.

Um sexto de cada uma das suspensões foi inoculado em frascos vibradores de 500 ml contendo 100 ml de meio PS-1, um meio com base em came de soja/sacarose, canamicina para uma concentração final de 10 pg/ml e 100 μ 1/ml de NaOH 5M. O pH foi ajustado para 7,5 com NaOH antes da inoculação. As culturas foram incubadas por cinco dias a 30°C com vibração em 270 a 300 rpm.

PURIFICAÇÃO DEO ENZIMAS

As partículas grandes dos meios foram removidas por floculação antes da cromatografia por afinidade. Superfloc C521 (American Cyanmide Company) foi usado como o floculante catiônico e Superfloc Al 30 (American Cyanmide Company) como o floculante aniônico. A suspensão da cultura foi diluída a 1:1 com água desionizada e o pH foi ajustado em aproximadamente 7,5. Um volume de 0,01 ml de CaCl2 a 50% p/p por ml de cultura diluída, foi adicionado durante agitação. Um volume de 0,015 ml de aluminato de Na 20% p/p por ml de cultura diluída foi titulado com ácido fórmico a 20%, enquanto se mantinha o pH entre 7 e 8. Enquanto se agitava, acrescentou-se 0,025 ml de C521 a 10% v/v por ml de cultura diluída, seguido por 0,05 ml de A130 a 1% p/v por ml de cultura diluída, ou até que a floculação fosse observada. A solução foi centrifugada a 4500 rpm por 30 minutos. A filtração foi realizada usando-se um filtro de tamanho de poros de 0,45 pm, para excluir as partículas maiores e quaisquer bactérias remanescentes. A solução filtrada foi armazenada a -20°C. MOBILIZAÇÃO DE UMA a-CICLODEXTRINA EM AGAROSE DE DSY Cem mg de uma α-ciclodextrina de peso molecular de 972,86 g/mol (Fluka 28705) foram dissolvidos em 20 ml de tampão de acoplagem (Na2C03 0,5M, pH 11). Dez ml de agarose de DSV (Mini-Leak, Meio de agarose ativada por sulfona divinílica 10-20 mmoles/litro (Kem-En-Tec) foram lavados completamente com água desionizada, depois secados por sucção e transferidos para a solução de α-ciclodextrina. Após a mistura ter sido agitada por 24 horas em temperatura ambiente, o gel foi lavado com água desionizada, seguido por KHC03 0,5M. O gel foi transferido para o tampão de bloqueio (20 ml KHC03 0,5M + 1 ml de mercaptoetanol), agitado por 2 horas em temperatura ambiente, depois lavado com água desionizada. CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE

As variantes foram purificadas por cromatografia por afinidade usando-se o Sistema FPLC da Pharmacia. Um volume de 0,04 de acetato de Na 1M, pH 5, foi adicionado ao filtrado obtido por floculação, para ajustar o pH, e CaCl2 foi adicionado até uma concentração final de IO"10 Μ. A solução foi filtrada e desgaseificada. Uma coluna XK16 da Pharmacia foi preparada com dez ml da α-dextrina imobilizada, depois equilibrada no tampão de equilíbrio (acetato de Na 25 mM, pH 5) mediante lavagem com aproximadamente 10 vezes o volume da coluna. O filtrado foi aplicado à coluna XK16, que foi então lavada com o tampão de equilíbrio até que a proteína não mais pudesse ser detectada no tampão de lavagem. A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio contendo NaCl 0,5M para eluir material não específico, seguido por outra lavagem com 2 a 3 vezes o volume da coluna do tampão de equilíbrio. Todas as lavagens foram realizadas usando-se um índice de fluxo de 10 ml/minuto. O material especificamente ligado foi eluído usando-se uma solução de α-ciclodextrina a 2% no tampão de lavagem, e coletado utilizando o Liquid Chromatography Collector LCC-500 Plus, da Pharmacia, usando-se um índice de fluxo de 5 ml/minuto. EXEMPLO 2: ATIVIDADE DAS VARIANTES DEPENDENTE DO Ph As variantes preparadas no Exemplo precedente foram testadas quanto à atividade em vários valores de pH, como segue: Um ensaio colorimétrico de glicose oxidase-peroxidase quanto à glicose liberada da maltotriose ou amilopectina, foi usado para determinar os perfis da atividade do pH das variantes enzimáticas (Processo de Glicose/GOD-Perid®, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). A atividade foi ensaiada em um tampão de citrato 25 mM-fosfato, CaCl2 0,1 mM, em valores de pH de 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8 e 8,6. O pH do tampão foi ajustado usando-se NaOH e as enzimas foram diluídas em tampão de citrato 25 mM-fosfato, pH 5. As medições foram feitas em duplicata, para se obter um valor médio. Todos os valores são relativos ao pH em que o níveis mais elevados de atividade foram observados.

Os resultados, apresentados na tabela abaixo, indicam que cada uma das variantes tem uma alteração no perfil de atividade dependente do pH, em comparação com a Novamyl® precursora. O nível mais elevado de atividade para cada variante é designado como 100% e a atividade daquela variante medida nos outros valores de pH indicados é um percentual relativo daquele máximo. -------^ Além disso, várias variantes de Novamyl foram testadas quanto à atividade em pH 4,0 e 5,0, tomando-se a atividade da Novamyl no mesmo pH como de 100%. A atividade foi determinada por hidrólise da maltotriose (10 mg/ml) a 60°C, acetato de sódio 50 mM, CaCl2 1 mM. Os resultados estão expressos como a relação entre a atividade em pH 5,0 e em pH 4,0: Os resultados demonstram que as variantes com um ótimo de pH superior ou inferior podem ser obtidas de acordo com a invenção. EXEMPLO 3: TERMOSTABILIDADE DAS VARIANTES Incubação a 80°C A termostabilidade de várias variantes de Novamyl foi testada pela incubação de uma solução aquosa a 80°C e pH 4,3, e medição da atividade residual da amilase em vários tempos. A enzima precursora, a Novamyl, foi incluída para comparação. Os resultados são expressos como atividade residual em vários tempos, em percentual da atividade inicial: Os dados acima mostram uma termostabilidade claramente melhorada quanto às variantes comparadas com a amilase precursora. Incubação a 85°C com cálcio A variante S32E da Novamyl foi testada por incubação com Ca++1 mM a 85°C durante 15 minutos. A variante apresentou uma atividade residual de 48%, ao passo que a enzima precursora (Novamyl) apresentou atividade residual de 32% nas mesmas condições.

DCS

Além disso, a termostabilidade foi testada para algumas variantes da Novamyl, por DSC (calorimetria de varredura diferencial) em pH 4,3 ou 5,5. Novamente, a amilase precursora foi incluída para comparação. Os resultados são expressos como a temperatura de desnaturação (Tm): Os resultados mostram termostabilidade melhorada para ambas as variantes.

EXEMPLO 4: ATIVIDADE ESPECÍFICA DAS VARIANTES A atividade da amilase foi determinada por uma medição colorimétrica após a ação sobre tabletes de Phadebas em pH 5,0 e 60°C. Os resultados para as duas variantes da Novamyl, em relação à Novamyl, foram como segue: A atividade específica foi ainda testada pela ação sobre a maltotriose em pH 4,0, 60°C, pelo processo MANU descrito acima. Os resultados mostraram que as variantes G370N, N371G têm uma atividade de maltotriose de 106%, em comparação com a Novamyl.

EXEMPLO 5: INIBIÇÃO DA RETROGRADAÇÃO A eficiência da Novamyl e das variantes da Novamyl para inibir a retrogradação, foi determinada como segue: 730 mg de pasta de amilopectina 50% (p/p) em acetato de sódio 0,1 M, em um pH selecionado (3,7, 4,3 ou 5,5) foram misturados com 20 μΐ de uma amostra de enzima, e a mistura foi incubada em uma ampola selada durante 1 hora a 40°C, seguido por incubação a 100°C por 1 hora, de modo a gelatinizar as amostras. A amostra foi então envelhecida por 7 dias em temperatura ambiente para permitir a recristalização da amilopectina. Um controle sem enzima foi incluído.

Após envelhecer, DSC foi realizada na amostra mediante varredura a partir de 5°C até 95°C em um índice de varredura constante de 90°C/hora. A área sob o primeiro pico endotérmico no termograma foi tomada para representar a quantidade de amilopectina retrogradada, e a inibição relativa de retrogradação foi tomada como a redução da área (em %) em relação ao controle sem enzima.

Na tabela abaixo, a eficiência da enzima é expressa como a relação da inibição relativa de retrogradação para a dosagem enzimática (em MANU/ml): Os resultados demonstram que várias variantes são mais eficientes do que a amilase precursora para inibir a retrogradação. EXEMPLO 6: EFEITO ANTI-ENVELHECIMENTO DAS VARIANTES Pão foi produzido pelo processo European Straight Dough ou do fermento com ou sem a adição de enzimas, e os pães foram cozidos em recipientes tampados, para evitar efeitos de volume. O pão foi deixado esfriar por 2 horas, e a textura foi testada. Os pães remanescentes foram então envolvidos em sacos de plástico e armazenados em temperatura ambiente para análise da textura após 1,4 e 7 dias. A análise da textura de cada pão foi feita mediante corte de 4 fatias; a força foi medida em 25% de compressão (Pl), em 40% de compressão (P2) e após manter 40% de compressão constante por 30 segundos (P3). Pl foi tomado como a firmeza, e a relação de (P3/P2) foi tomada como a elasticidade do miolo. A extensão da retrogradação após 7 dias de armazenagem foi determinada por DSC, como descrito no Exemplo 7. EUROPEAN STRAIGHT DOUGH (Pasta Contínua Européia) ípH 5.5 a 6.0) Uma variante de Novamyl (T142A+ N327S+ K425E+ K520R+ N595I) foi testada em dosagens na faixa de 0 a 2 mg de enzima/kg de farinha, e a enzima precursora (Novamyl) foi usada para comparação.

Os resultados mostraram que, em dosagens iguais, a variante dá melhor elasticidade (P3/P2) do que a enzima precursora apos duas horas e 1 dia. Os resultados após 7 dias mostraram que a variante em dosagens de 1 a 2 mg/kg deu miolo significativamente mais macio (firmeza inferior, Pl) do que a enzima precursora na mesma dosagem. Assim, a variante tem um melhor efeito anti-envelhecimento na totalidade de um período de armazenagem de 7 dias. FERMENTO íoH APROXIMADO DE 4,5).

Uma variante de Novamyl (F188L+ D261G+ T288P) foi testada em fermento, e a enzima precursora (Novamyl) foi usada para comparação. Os seguintes resultados foram obtidos quanto à firmeza (Pl) após 7 dias, a elasticidade (P3/P2) após 4 e 7 dias, e a retrogradação após 7 dias: Os resultados mostram que a variante tem um efeito marcadamente melhorado sobre a textura avaliada como firmeza e elasticidade em fermento a pH 4,5. Uma dosagem de 1 a 3 mg/kg da variante é superior a 13 mg/kg da enzima precursora sobre todos os parâmetros testados, e a elasticidade obtida com a variante não pôde ser alcançada pela enzima precursora em qualquer dosagem.

EXEMPLO 7: PADRÃO DE CLIVAGEM DAS VARIANTES O padrão de divagem na hidrólise do amido foi comparado quanto a duas variantes com a enzima precursora, a Novamyl.

Os resultados abaixo indicam o % em peso de cada oligossacarídeo (G1-G8) formado após 14 horas de incubação em 1% (p/v) de amido, usando-se acetato de sódio 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 5,0, a 50°C. Os oligossacarídeos foram identificados e quantificados usando-se HPLC.

Os resultados demonstram um padrão de divagem significativamente alterado. A Novamyl, após 24 horas, produz principalmente maltose e, virtualmente, nenhum oligossacarídeo superior. Ao contrário, as duas variantes produzem quantidades significativas de maltotriose e de oligossacarídeos superiores. REFERÊNCIAS CITADAS Klein, C. et al, Biochemistry 1992,31, 8740-8746, Mizuno, H. et al, J. Mol. Biol. (1993) 234,1282-1283, Chang, C. et al, J. Mol. Biol (1993) 229,235-238, Larson, S. B., J. Mol Biol (1993) 235,1560-1584, Lawson, C. L., J. Mol Biol (1994) 236,590-600, Qian, M., et al, J. Mol Biol (1993) 231, 785-799, Brady, R. L. et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47,527-535, Swift, H. J. et al, Acta Crystallogr. sect. B, 47,535-544, A. Kadziola, Ph.D. Thesis: “An alpha-amylase from Barley and its Complex with a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography”, Department of Chemistry University of Copenhagen 1993 MacGregor, E. A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol. 1, n2 5-6, p. B. Diderichsen e L. Christiansen, Cloning of a maltogenic α-amilase de Bacillus stearothermophilus, FEMS Microbioil. letters: 56: pp. 53-60 (1988) Hudson et al., Practical Immunology, Terceira edição (1989), Blackwell Scientific Publications, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor, 1989. S. L. Beaucage e Μ. H. Carathers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869 Matthes et al, TheEMBOJ. 3,1984, PP. 801-805. R. K. Saiki et al, Science 239,1988, pp. 487-491.

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Boel et al., 1990, Biochemistry 29, pp. 6244-6249.

Claims (8)

1. Variante de uma alfa-amilase maltogênica precursora, caracterizada pelo fato de que: a) possui atividade de alfa-amilase maltogênica; b) possui a sequência mostrada como SEQ ID NO: 2, mas com uma modificação de aminoácido que consiste em uma substituição na posição F188; e c) possui estabilidade melhorada em comparação com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.

2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a modificação consiste em uma substituição correspondente a F188I ouF188L.

3. Sequência de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de codificar o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de ácido nucléico como definida na reivindicação 3, um promotor e sinais transcricionais e traducionais de parada.

5. Bactéria gram-positiva ou gram-negativa transformada, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de ácido nucléico como definida na reivindicação 3 ou o vetor como definido na reivindicação 4.

6. Processo para produzir o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender: a) cultivar a bactéria transformada como definida na reivindicação 5, sob condições conducentes à expressão da variante; e b) recuperar a variante.

7. Processo para preparar uma massa ou um produto cozido preparado da massa, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar o polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, ou uma variante produzida pelo processo como definido na reivindicação 6, à massa, em uma quantidade que seja eficaz para retardar o envelhecimento do pão.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a variante é adicionada em uma quantidade de 0,1 a 5 mg por kg de farinha, preferivelmente de 0,5 a 2 mg/kg.