BRPI9917718B1 - Bactéria pertencente ao gênero escherichia e tendo uma capacidade para produzir um l-aminoácido selecionado do grupo que consiste de ácido l-glutâmico, l-histidina, l-prolina e l-treonina, e, processo para produzir um l-aminoácido selecionado do grupo que consiste de ácido l-glutâmico, l-histidina, l-prolina e l-treonina. - Google Patents

Description

“BACTÉRIA PERTENCENTE AO GÊNERO ESCHERICHIA E TENDO UMA CAPACIDADE PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO SELECIONADO DO GRUPO QUE CONSISTE DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO, L-HISTIDINA, L-PROLINA E L-TREONINA, E, PROCESSO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO SELECIONADO DO GRUPO QUE CONSISTE DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO, L-HISTIDINA, L-PROLINA E L-TREONINA.” Dividido do PI 9906287-9, depositado em 28/12/1999.

CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a um processo para produzir um aminoácido. Em particular, a presente invenção diz respeito a uma bactéria que produza L-aminoácido pertencente ao gênero Escherichia e a um processo para produzir L-aminoácidos, mais especificamente, ácido L-glutâmico, L-lisina, L-treonina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-arginina, L-valina e L-isoleucina, usando-se a bactéria.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Para a produção de um L-aminoácido por fermentação, uma cepa isolada do mundo natural ou um mutante artificial da cepa foi usado para melhorar a produtividade. Por exemplo, no caso da L-lisina, muitos mutantes artificiais que produzem L-lísina são conhecidos e a maioria deles são mutantes resistentes a S-2-aminoetilcisteína (AEC) e pertencem ao gênero Brevibacteriwn, Corynebacterium, Bacillus ou Escherichia. Também foram propostas várias técnicas para aumentar a produção de aminoácido, tal como o uso de um transformante obtido usando-se um DNA recombinante (Patente U.S. No. 4.278.765).

As técnicas são, na maior parte, fundamentadas na intensificação de uma atividade de uma enzima envolvida em um caminho biossintético de aminoácido, a conversão da enzima àquela dessensibilizada na inibição e outras (como para a bactéria pertencente ao gênero Escherichia, ver o Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 56-18596 (1981) e a Publicação Internacional No, WO 95/16042).

Por outro lado, como um exemplo da melhora da produtividade de aminoácido pela intensificação de uma proteína de excreção de aminoácido, é conhecida uma bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium em que um gene de excreção de L-lisina, o lysE é intensificado. Entretanto, como para bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, desconhece-se ainda se uma proteína de excreção de L-amínoácido está ou não presente. Portanto, é desconhecido se a intensificação da proteína de excreção de L-aminoácido é eficaz na produção de L-aminoácido usando-se uma bactéria pertencente ou não ao gênero Escherichia.

Embora, a seqüência completa de nucleotídeo da cepa E. coli K-12 pertencente ao gênero Escherichia seja facilmente determinada (Science, 277, 1453-1474 (1997)), existe um grande número de proteínas das quais as funções são desconhecidas. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Um objetivo da presente invenção é obter uma proteína que participe na excreção de um L-aminoácido fornecendo, desse modo, uma cepa melhorada na produção de L-aminoácido e um processo melhorado para produzir um L-aminoácido por fermentação.

Os inventores conduziram a avaliação quanto a participação da proteína na excreção de um L-aminoácido, Como um resultado, os presentes inventores observaram que um rendimento de um L-aminoácido com base no açúcar consumido é aumentado quando um gene particular é intensificado. Com base na descoberta, a presente invenção foi completada.

Desse modo, a presente invenção fornece uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tem uma capacidade para produzir um L-aminoácido, em que a capacidade para produzir o L-aminoácido é aumentada aumentando-se uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das seguintes proteínas de (A) até (H) (a seguir também referida como "a bactéria da presente invenção"): (A) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10 na Listagem de Seqüência; (B) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ÍD NO: 10 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína; (C) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüência; (D) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína; (E) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Seqüência; (F) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína; (G) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 na Listagem de Seqüência; ou (H) uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido que inclua a supressão, substituição, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 na Listagem de Seqüência, e que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o L-aminoácido da bactéria que tenha a proteína. A bactéria da presente invenção, preferivelmente uma bactéria que produza a L-lisina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (D), (G) e (H) é aumentada; uma bactéria que produza ácido L-glutâmico em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (H) é aumentada; uma bactéria que produza a L-alanina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; uma bactéria que produza a L-valina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; uma bactéria que produza a L-histidina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (C) até (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-prolina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (A) até (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-treonina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (E) e (F) é aumentada; uma bactéria que produza a L-arginina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (G) e (H) é aumentada; ou uma bactéria que produza a L-isoleucina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (C) e (D) é aumentada.

Preferivelmente, na bactéria da presente invenção, um número de cópia de um DNA que codifica para a dita proteína em uma célula é aumentado. 0 DNA é preferivelmente carregado em um vetor de cópia múltipla ou em um transposon na célula. A presente invenção também fornece um processo para produzir um L-aminoácido que compreende as etapas de: cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e recuperar o L-aminoácido do meio (a seguir, também referido como "o processo da presente invenção"). O processo da presente invenção, preferivelmente um processo de produção de L-lisina que usa uma bactéria que produza a L-lisina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (D), (G) e (H) é aumentada; um processo de produção de ácido L-glutâmico que usa uma bactéria que produza o ácido L-glutâmico em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas de (A) até (H) é aumentada; um processo de produção de L-alanina que usa uma bactéria que produza a L-alanina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; um processo de produção de L-valina que usa uma bactéria que produza a L-valina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das proteínas (C) e (D) é aumentada; um processo de produção de L-histidina que usa uma bactéria que produza a L-histidina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (C) até (F) é aumentada; um processo de produção de L-prolina que usa uma bactéria que produza a L-prolina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas de (A) até (F) é aumentada; um processo de produção de L-treonina que usa uma bactéria que produza a L-treonina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (E) e (F) é aumentada; um processo de produção de L-arginina que usa uma bactéria que produza a L-arginina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (G) e (H) é aumentada; ou um processo de produção de L-isoleucina que usa uma bactéria que produza a L-isoleucina em que uma quantidade de expressão de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste das ditas proteínas (C) e (D) é aumentada.

Preferivelmente, no processo da presente invenção, um número de cópia de um DNA que codifica para a dita proteína em uma célula da bactéria é aumentado. O DNA é preferivelmente carregado em um vetor de cópia múltipla na célula ou em um transposon na célula.

De acordo com a presente invenção, uma capacidade para produzir um L-aminoácido de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia pode ser aumentada. Também, um processo para produzir um L-aminoácido pode ser melhorado em uma razão de produção de um L-aminoácido. A presente invenção será explicada abaixo, em detalhes. Em seguida, um aminoácido é de configuração L a menos que de outro modo observado.

<1> BACTÉRIA DA PRESENTE INVENÇÃO A bactéria da presente invenção é uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tenha uma capacidade para produzir um aminoácido, em que a capacidade para produzir um aminoácido é aumentada aumentando-se uma quantidade de expressão de uma proteína que tenha uma atividade de aumentar a capacidade de produzir o aminoácido da bactéria ou uma atividade de aumentar a resistência a um aminoácido ou um análogo de aminoácido. Em seguida, a proteína é referida como "proteína de excreção de aminoácido" em consideração à conveniência. Entretanto, o termo não significa que a função da proteína seja limitada à excreção de aminoácido.

Os exemplos das proteínas de excreção de aminoácido incluem uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 e uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16. A proteína de excreção de aminoácido pode ter seletividade para aminoácido. Uma proteína de excreção de aminoácido apropriada para cada aminoácido pode ser determinada deixando-se a proteína de excreção de aminoácido ser expressa em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tenha uma capacidade para produzir o aminoácido e medindo-se um aumento de um rendimento do aminoácido ou medindo-se um aumento de uma concentração mínima de inibição (MIC) de um aminoácido ou de um análogo de aminoácido.

Por exemplo, no caso da Usina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, 12 ou 16 é eficaz; no caso do ácido glutâmico, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10,12,14 ou 16 é eficaz, no caso da alanina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 é eficaz; no caso da valina uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 é eficaz; no caso da histidina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12 ou 14; no caso da prolina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10, 12 ou 14 é eficaz; no caso da treonina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 14 é eficaz; no caso da arginina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 16 é eficaz e no caso da isoleucina, uma proteína que tenha uma seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ED NO: 12 é eficaz.

O termo "uma quantidade de expressão é aumentada" usado neste, geralmente significa que a quantidade de expressão é maior do que aquela de uma cepa selvagem de E. coli, tal como a cepa MG1655 ou W3110. Os termos também significam que quando uma cepa é obtida pela modificação através das técnicas da engenharia genética ou outras, a quantidade de expressão é maior do que a anterior à modificação. A quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido pode ser determinada diretamente pela determinação da proteína de excreção de aminoácido ou indiretamente pela determinação de MIC de um aminoácido ou de um análogo de aminoácido ou da produtividade de aminoácido de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tenha a proteína de excreção de aminoácido. O processo para aumentar a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é exemplificado por um processo para aumentar o número de cópia do DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido em uma célula da bactéria.

Para aumentar o número de cópia na célula, um fragmento de DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido pode ser ligado a um vetor que funciona em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia para produzir um DNA recombinante que é introduzido em um hospedeiro para transformá-lo. O número de cópia do gene que codifica para a proteína de excreção de aminoácido (gene da proteína de excreção de aminoácido) na célula da cepa transformante aumenta, desse modo, aumentando a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido. O vetor é preferivelmente um vetor de cópia múltipla. O aumento do número de cópia na célula pode ser alcançado deixando-se cópias múltiplas do gene da proteína de excreção de aminoácido para existir no DNA cromossômico do hospedeiro. A introdução de cópias múltiplas do gene da proteína de excreção de aminoácido ao DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, pode ser conduzida através da recombinação homóloga usando-se uma seqüência da qual as cópias múltiplas existem no DNA cromossômico como um alvo. Como a seqüência das quais as cópias múltiplas existem no DNA cromossômico, um DNA repetitivo e uma repetição invertida presente em uma porção terminal de um elemento transponível podem ser usados.

Altemativamente, como divulgado no Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 2-109985 (1990), as cópias múltiplas podem ser introduzidas ao DNA cromossômico fazendo-se com que o gene da proteína de excreção de aminoácido seja carregado em um transposon e deixando que o transposon seja transposto, o que é preferido. De acordo com qualquer um dos processos mencionados acima, o número de cópias do gene da proteína de excreção de aminoácido na cepa transformante aumenta, aumentando-se assim a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido. O vetor de cópia múltipla é exemplificado pelos vetores plasmídicos, tais como pBR322, pMW118, pUC19 ou outros e vetores de fago, tais como λ1059, XBFIOI, M13mp9 ou outros. O transposon é exemplificado por Mu, TnlO, Tn5 ou outros. A introdução de um DNA em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia pode ser realizada, por exemplo, por um processo de D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) ou um processo em que as células bacterianas receptoras são tratadas com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade do DNA (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53,159 (1970)) e outros.

Além disso, a aplicação do gene mencionado acima, o aumento da quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido também pode ser alcançada substituindo-se uma seqüência reguladora de expressão tal como um promotor do gene da proteína de excreção de aminoácido por uma mais forte (ver o Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 1-215280 (1989)). Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac, o promotor Pr e o promotor PL do fago lambda e outros são conhecidos como um promotor forte. A substituição pelo promotor intensifica a expressão da proteína de excreção de aminoácido, desse modo aumentando-se a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido. A intensificação da seqüência reguladora de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópia da proteína de excreção de aminoácido.

Na bactéria da presente invenção, as quantidades de expressão das proteínas de excreção de aminoácido podem ser aumentadas. A proteína de excreção de aminoácido é codificada pelos genes que são conhecidos como gene yahN, gene yeaS, gene yfiK e gene yggA e dos quais as funções não são conhecidas. Portanto, o DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido pode ser obtido sintetizando-se iniciadores com base em seqüências conhecidas (por exemplo, a seqüência de nucleotídeo inteira do cromossomo do Escherichia coli da cepa K-12 já foi determinada (Science, 277, 1453-1474 (1997))), e conduzindo-se a amplificação pelo PCR usando-se o DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia como um padrão. Também, o fragmento de DNA em questão pode ser selecionado pela hibridização de uma biblioteca de DNA cromossômico de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia pela preparação de uma investigação com base nas seqüências conhecidas. Altemativamente, o DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido pode ser sintetizado com base nas seqüências conhecidas. A seqüência de nucleotídeo do DNA que codifica a proteína de excreção de aminoácido é exemplificada por aquelas apresentadas na SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 na Listagem de Seqüência.

Os processos para a preparação de DNA cromossômico, preparação de biblioteca de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de DNA plasmídico, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e outros podem ser processos usuais bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Estes processos são descritos em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) e outros. A proteína de excreção de aminoácido pode compreender a substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou vários aminoácidos em uma ou uma pluralidade de posições, desde que a atividade de aumentar a capacidade para produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia e que tem a proteína não seja deteriorada. O termo "vários" pode variar dependendo de uma posição em uma estrutura estérica da proteína e de uma espécie de um resíduo de aminoácido. Isto ocorre porque alguns aminoácidos, tais como a isoleucina e a valina, têm alta similaridade uns aos outros, e uma diferença entre os tais aminoácidos não afetam amplamente a estrutura estérica da proteína. O DNA que codifica para a substancialmente mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, como descrito acima, pode ser obtido, por exemplo, modificando-se a seqüência de nucleotídeo, por exemplo, por meio do processo de mutagênese direcionada por sítio, de modo que um ou mais resíduos de aminoácido em um local especificado envolva a substituição, supressão, inserção, adição ou inversão. O DNA modificado como descrito acima pode ser obtido pelo tratamento de mutação convencionalmente conhecido. O tratamento de mutação inclui um processo para tratar um DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido in vitro, por exemplo, com hidroxilamina e um processo para tratar um microorganismo, por exemplo uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia, que abriga um DNA que codifica para a proteína de excreção de aminoácido com irradiação ultravioleta ou um agente de mutação tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NG) e ácido nitroso, comumente usado para o tratamento de mutação. A substituição, supressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais resíduos de aminoácido incluem uma mutação ou variação que ocorre naturalmente que são resultados de uma diferença entre os microorganismos individuais que tenham a proteína de excreção de aminoácido e uma diferença entre espécies, cepas ou outros. O DNA, que codifica para, substancialmente a mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, pode ser obtido deixando-se um DNA que tenha a mutação como descrita acima, ser expresso em uma célula de uma bactéria apropriada pertencente ao gênero Escherichia e que investiga o aumento da produtividade de aminoácido da célula.

Também, o DNA que codifica substancialmente para a mesma proteína como a proteína de excreção de aminoácido, pode ser obtido isolando-se um DNA que hibridiza com o DNA que têm, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15 na listagem de seqüência sob condições rigorosas e que codifica para uma proteína que tenha a atividade de aumentar a capacidade de produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia, de DNAs que codificam as proteínas de excreção de aminoácido que tenham mutações ou células que contenham os DNAs. O termo "condições rigorosas" referido neste, significa uma condição sob a qual um híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. E difícil expressar claramente esta condição usando-se qualquer valor numérico. Entretanto, por exemplo, as condições rigorosas incluem uma condição sob a qual os DNAs que tenham alta homologia, por exemplo, DNAs que tenham homologia de não menos do que 70% entre eles sejam hibridizados e DNAs que tenham homologia entre eles, menor do que a acima não sejam hibridizados ou uma condição de uma concentração de sal que corresponda a 60°C, 1 x SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS que é uma condição de lavagem de hibridização comum do sul.

Embora, possa ser um gene em que um códon de interrupção é feito no meio ou um gene que codifique uma proteína que perdeu a atividade devido a mutação do centro ativo entre os genes que hibridizam sob tais condições, tais genes podem ser facilmente eliminados ligando-se os genes a um vetor de expressão de atividade comercialmente disponível e que determina a atividade de aumento da capacidade para produzir o aminoácido da bactéria pertencente ao gênero Escherichia como descrito acima. O termo "DNA que codifica para uma proteína" usado neste significa um DNA do qual um dos filamentos codifica para a proteína quando o DNA é de filamento duplo.

Aumentando-se uma quantidade de expressão de uma proteína de excreção de aminoácido em uma bactéria que produza aminoácido pertencente ao gênero Escherichia como descrito acima, uma quantidade produzida do aminoácido pode ser aumentada. Como a bactéria pertencente ao gênero Escherichia na qual a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é para ser aumentada, as cepas que tenham capacidade para produzir os aminoácidos desejados (produtividades de aminoácido) são usadas. Além disso, uma capacidade para produzir um aminoácido pode ser comunicada a uma bactéria em que a quantidade de expressão da proteína de excreção de aminoácido é aumentada. Os exemplos de bactéria que produza aminoácido, pertencentes ao gênero Escherichia incluem E. coli AJ13199 (patente FR No. 2747689) e aquelas obteníveis dos materiais conhecidos (por exemplo, E, coli W3110 (tyrA)/pCABD2, E. coli VL614, E coli VL2054, E. coli VL2160, E. coli VL2151, E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10 como descrito nos Exemplos abaixo).

Por referência, a proteína de excreção de aminoácido de acordo com a presente invenção foi identificada pela primeira vez, como descrito abaixo.

Os presentes inventores identificaram o rhtB e o rhtC como genes de proteína de excreção de treonina de uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia. Os presentes inventores pesquisaram o banco de dados com base em uma hipótese de que as proteínas de excreção de aminoácido pudessem compartilhar uma estrutura comum. Isto é, a pesquisa BLAST e PSI-BLAST (Altschul, S. F. et ai, Nucleic Acids Res., 25, 3389 a 3402 (1997)) quanto a homologia de uma proteína codificada pelo rhtB foi realizada em GenBank CDS, PDB, SWISS-PROT, Spupdate e PIR. A pesquisa Tblastn foi realizada em genomas microbianos não acabados. A pesquisa BLITZ (Sturrock, S. S. e Collins, J. F., Mpsch versão 1.3. Unidade de Pesquisa de Biocomputação da Universidade de Edinburgh, UK (1993)) foi realizada no banco de dados SWALL. A pesquisa SMART (Ogiwara, I. et al, Protein Sei., 5, 1991 a 1999 (1996)) foi realizada no banco de dados de translações e SWISS-PROT. Das amostras de mais do que 60 seqüências encontradas, a YeaS (que corresponde ao £212 de ACESSO No. AE000274 no GenBank), a YahN (que corresponde ao £223 de ACESSO No. AE000140 no GenBank), a YfiK (que corresponde ao ol95 de ACESSO No. AE000344 no GenBank) e a YggA (que corresponde ao £211 de ACESSO No. AE000375 no GenBank) permaneceram como proteínas que podem ter função similar ao RhtB, entre aqueles que se originam do E. coli. Visto que as funções de qualquer um destes genes são desconhecidas, os genes são atualmente obtidos e os efeitos destes no MIC dos aminoácidos e dos análogos de aminoácidos e na produção de aminoácido foram examinados intensificando-se as suas atividades. Como um resultado, um efeito de aumentar o MIC de alguns aminoácidos e análogos foi observado com respeito a YeaS, YfiK, YahN e YggA. Outro exame revelou que as proteínas codificadas por estes genes apresentam um efeito de aumentar uma acumulação de aminoácido, embora possam ter alguma seletividade de aminoácido.

<2> PROCESSO DA PRESENTE INVENÇÃO O processo da presente invenção compreende as etapas de cultivar a bactéria da presente invenção, em um meio de cultura, para produzir e acumular o aminoácido no meio e recuperar o aminoácido do meio.

Os aminoácidos adequados incluem, Usina, ácido glutâmico, alanina, valina, histidina, prolina, treonina, arginina e isoleucina.

No processo da presente invenção, o cultivo da bactéria pertencente ao gênero Escherichia, a coleta e purificação do aminoácido do meio líquido podem ser realizadas de uma maneira similar àquela do processo convencional para produzir um aminoácido pela fermentação usando-se uma bactéria. Um meio usado no cultivo pode ser um meio sintético ou um meio natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma de nitrogênio e minerais e, se necessário, nutrientes que a bactéria usada requer para se desenvolver em quantidades apropriadas. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos, tais como a glicose e a sacarose e vários ácidos orgânicos, dependendo da capacidade assimiladora da bactéria usada, o álcool, incluindo o etanol e o glicerol, pode ser usado. Como fonte de nitrogênio, amônia, vários sais de amônio, tais como sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio, tais como aminas, uma fonte natural de nitrogênio, tal como peptona, hidrólito de soja e micróbios digeridos, de fermentação são usados. Como minerais, fosfato de monopotássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês e carbonato de cálcio são usados. O cultivo é preferivelmente cultivado sob uma condição aeróbica, tal como uma cultura de vibração e uma cultura de aeração e de agitação. A temperatura da cultura é usualmente de 20 a 40°C, preferivelmente de 30 a 38°C. O pH da cultura está usualmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases e tampões. Geralmente, um cultivo de 1 a 3 dias leva à acumulação do aminoácido alvo no meio. A recuperação do aminoácido pode ser realizada removendo- se os sólidos do meio, tais como as células, por centrifiigação ou por fíltração da membrana após o cultivo e então coletando-se e purifícando-se o aminoácido alvo por troca de íon, processos de concentração e fração cristalina e outros.

MELHOR MANEIRA PARA REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo por referência aos Exemplos: EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA QUE CODIFICAM PARA AS PROTEÍNAS DE EXCREÇÃO DE AMINOÁCIDO A seqüência de nucleotídeo completa do cromossomo da cepa E. coli K-12 foi determinada (Science, 277,1453 a 1474, 1997). Com base na seqüência de nucleotídeo relatada, os iniciadores foram sintetizados e os genes YahN, YfiK, YeaS e YggA foram amplificados por PCR. (1). O DNA cromossômico da cepa E. coli MG1655 foi usado como um padrão. O DNA cromossômico foi preparado por um processo usual (Sambrook, J., Fritsch E. F. e Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a íaboratoiy manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Na reação de PCR, uma condição padrão descrita no "PCR protocols. Current methods and applications". (White, B. A., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993) foi usada. Os produtos de PCR obtidos foram purificados por um processo comum e digeridos com enzimas de restrição como descrito abaixo. O gene YahN foi amplificado usando-se os iniciadores No. 1 e No. 2.

Iniciador No. 1: gtgtggaaccgacgccggat (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 1885 até a base 1904 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000140 no GenBank; SEQID NO: 17), e Iniciador No. 2: tgttgtatggtacggggttcgag (uma seqüência da base 223 até a base 245 na mesma; SEQID NO: 18). O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Pstl e Stul e ligado ao vetor pUC21 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189 a 194,1991) digerido com a enzima Pstl e EcoKV usando-se um conjunto de ligação. Então, a transformação das células aptas do E. coli TG1 (Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, Segunda Edição", Cold Spring Harbor, N. Y.) com o produto foi conduzida e as células foram espalhadas no meio L (10 g/1 de Bactotrypton, 5 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, 15 g/1 de agar, pH 7,0) contendo 10 μg/ml de IPTG (isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo) e 40 μg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo) e 100 μg/ml de ampicilina e cultivado durante a noite. Surgiram colônias brancas que foram retiradas e submetidas ao isolamento de colônia única para se obter transformantes. O plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes usando-se um processo de extração alcalina e designado como pYAHN. O gene YeaS foi amplificado usando-se os iniciadores No. 3 e No. 4.

Iniciador No. 3: ctttgccaatcccgtctccc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 7683 até a base 7702 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000274 no GenBank; SEQ ID NO: 19);

Iniciador No. 4: gccccatgcataacggaaag (uma seqüência da base 5542 até a base 5561 na mesma; SEQ ID NO 20). O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com uma enzima de restrição Aval e ligado ao vetor pUC19. Após a transformação do E. coli TG1 como acima, o plasmídeo designado como pYEAS foi obtido. O gene YfiK foi amplificado usando-se os iniciadores No. 5 e No. 6.

Iniciador No. 5: gaagatcttgtaggccggataaggcg (uma seqüência da base 4155 até a base 4177 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000344 no GenBank; com um sítio Bglll de enzima de restrição adicionado na extremidade 5' desta SEQ ID NO: 21);

Iniciador No. 6: tggttttaccaattggccgc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 6307 até a base 6326 na mesma; SEQ ID NO: 22). O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Bglll e Muni e ligado ao vetor pUC21 digerido com enzimas de restrição Bglll e EcoRl. Após a transformação do E. coli TG1 como acima, o plasmídeo designado pYFIK foi obtido. O gene YggA foi amplificado usando-se os iniciadores No. 7 e No. 8.

Iniciador No. 7: acttctcccgcgagccagttc (uma seqüência complementar a uma seqüência da base 9606 até a base 9626 em uma seqüência de nucleotídeo registrada sob o ACESSO No. AE000375 no GenBank; SEQ ID NO: 23);

Iniciador No. 8: ggcaagcttagcgcctctgtt (uma seqüência da base 8478 até a base 8498 na mesma; SEQ ID NO: 24). O produto de PCR obtido após a purificação foi digerido com enzimas de restrição Hindlll e Claíl e ligado ao vetor pOK12 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189 a 194, 1991) digerido com a mesma enzima de restrição. Após a transformação do E. coli TG1 como acima, o plasmídeo designado pYGGA foi obtido. (2). O DNA cromossômico da cepa E. coli W3110 foi usado como um padrão. O gene YahN foi amplificado usando-se os iniciadores No. 9 (SEQ ID NO. 1) e No. 10 (SEQ ID NO. 2) O gene YeaS foi amplificado usando-se os iniciadores No. 11 (SEQID NO. 3) e No. 12 (SEQ ID NO. 4) O gene YfiK foi amplificado usando-se os iniciadores No. 13 (SEQ ID NO. 5) e No. 14 (SEQ ID NO. 6) O gene YggA foi amplificado usando-se os iniciadores No. 15 (SEQ ID NO. 7) e No. 16 (SEQ ID NO. 8) O produto de PCR obtido foi purificado, digerido com enzimas de restrição Saci e Xbal (EcoRI e Pstl para YggA) e ligado ao plasmídeo pMW118 (Nippon Gene). O plasmídeo no qual um fragmento de DNA cuja seqüência foi idêntica à seqüência relatada, foi inserido e designado como segue: Um que carrega YahN: pMWl 18: -.YahN Um que carrega YeaS: pMWl 18: \YeaS Um que carrega YfiK: pMWl l%::YfiK Um que carrega YggA : pMWl 18: :YggA EXEMPLO 2. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA YahN, YeaS, YfiK E YggA NA RESISTÊNCIA DO E. coli TG1 A ALGUNS AMINOÁCIDOS E ANÁLOGOS DE AMINOÁCIDO. A homologia dos produtos de gene YahN, YeaS, YfiK e YggA com o transportador de lisina, LysE, do Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al., Mol. Microbiol., 22, 815 a 826, 1996) e a proteína RhtB envolvida na excreção de homosserína, indica a função análoga para estas proteínas. É bem conhecido que a expressão aumentada dos genes envolvidos em antibióticos e um efluxo de metal pesado aumenta o nível de resistência aos medicamentos (Nikaido, H. J. Bacteriology, 178, 5853 a 5859,1996). Portanto, o efeito dos plasmídeos pYEAS, pYAHN, pYFIK e pYGGA na suscetibilidade da cepa TG1 a alguns aminoácidos e análogos de aminoácido foi testado. Durante a noite, as culturas das cepas E. coli TGl/pYEAS, TGl/pYAHN, TGl/pYFIK e TGl/pYGGA e das cepas de controle TGl/pUC21, TGl/pUC19 e TGl/pOK12, cultivadas em meio M9 mínimo com um antibiótico apropriado em um agitador rotativo (109 cfu/ml) foram diluídos 1:100 em meio M9 mínimo e cultivadas por 5 horas no mesmo meio. Então, as culturas de fase log assim obtidas foram diluídas e cerca de 104 células vivas foram aplicadas às placas de teste de reservatório seco com agar M9 contendo os incrementos de duplicação dos aminoácidos ou análogos. Assim, a concentração mínima de inibição (MIC) destes compostos foi examinada.

Os resultados são mostrados na Tabela 1. Conclui-se da Tabela 1 que as cópias múltiplas do gene yfiK conferiram resistência aumentada à prolina, homosserina, histidina, treonina, glutamato, lisina, ácido a-amino-p-hidroxivalérico (AHVA), S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC) e ao ácido α-aminobutírico; as cópias múltiplas do gene yahN conferiram resistência aumentada à prolina, as cópias múltiplas do gene yeaS conferiram resistência aumentada à treonina, homosserina, lisina, glutamato, histidina, prolina e ao ácido α-aminobutírico; as cópias múltiplas do gene yggA conferiram resistência aumentada à S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), lisina e arginina. Estes resultados indicam que exceto para a YahN, cada um dos transportadores supostos têm especificidade a diversos substratos (aminoácidos e análogos de aminoácido) ou podem mostrar efeitos não específicos como um resultado de amplificação. EXEMPLO 3. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS, yahN, E yfiK NA PRODUÇÃO DO ÁCIDO GLUTÂMICO. A cepa E. coli AJ13199 (patente FR No. 2747689) foi transformada com o vetor pUC21 e com cada um dos plasmídeos pYAHN, pYEAS e pYFIK. Assim as cepas AJ13199/pUC21 (VKPM B-7728), AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729), AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731) e AJ13199/pYFIK (VKPMB-7730) foram obtidas.

Estas cepas foram, cada uma, cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/í de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação contendo 100 mg/1 de ampicilina em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivados a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de ácido glutâmico no meio foi determinada pelo processo conhecido. A composição do meio de fermentação (g/1): TABELA 1 Glicose 80 (NH4)2S04 22 K2HPO4 2 NaCl 0,8 MgS04.7H20 0,8 FeS04.7H20 0,02 MnS04.5H20 0,02 Tiamina HC1 0,0002 Extrato de levedura 1,0 CaCC>3 30,0 (esterilizado em aquecimento seco a 180°C por 2 horas) (A glicose e K2HP04 foram esterilizados separadamente) Os resultados são mostrados na Tabela 2. Como mostrado na Tabela 2, as cepas AJ13199/pYAHN, AJ13199/pYEAS e AJ13199/pYFIK acumularam ácido glutâmico em uma quantidade maior do que as cepas AJ13199/pUC21 em que uma quantidade de expressão das proteínas de excreção de aminoácido não foi intensificada. TABELA 2 EXEMPLO 4. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNAyeaS, yahN E yfiK NA PRODUÇÃO DE LISINA. (1). Como a bactéria que produz lisina pertencente ao gênero Escherichia, cepa E. coli W3110 (TyrA) descrita na Publicação de Patente Européia No. 488424 a qual 0 plasmídeo pCABD2 foi introduzido, descrito na Publicação Internacional No. WO 95/16042) foi usada. Especificamente, 0 plasmídeo pCABD2 e cada um dos plasmídeos pMW118: :yahN, pMW118: \yeaS, pMW118: :yfiK e pMWl 18 foram introduzidos na cepa E. coli W3110 (TyrA) para obter as seguintes cepas: W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: :yahN W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: \yeaS W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18: \yfiK W3110 (tyrA) / pCABD2+pMWl 18. A produtividade de lisina destas cepas foi estimada pela cultura. A composição do meio usado foi como segue (g/1): Glicose 40,0 MgS04.7H20 1,0 (NH4)2S04 16,0 K2HP04 1,0 FeS04.7H20 0,01 MnS04.7H20 0,01 Extrato de levedura (Difco) 2,0 Tirosina 0,1 Ajustado para o pH 7,0 e submetido a autoclave a 115°C por 10 minutos. (A glicose e o MgS04.7H20 foram esterilizados separadamente) CaC03 farmacopéico 25 g/1 (esterilizado em aquecimento seco a 180°C por 2 horas).

Como antibióticos, 20 mg/1 de estreptomicina e 50 mg/1 de ampicilina foram adicionadas dependendo do tipo de plasmídeo. O cultivo foi conduzido a 37°C por 30 horas com agitação a 115 rpm. Os resultados são mostrados na Tabela 3. 0 resultado na Tabela 3 mostra que a quantidade produzida e o rendimento com base no açúcar consumido da lisina é aumentado pela intensificação do YahN e YeaS. (2). Como a bactéria que produz lisina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL614 foi usada. Esta cepa é uma derivada da cepa E. coli VL613 conhecida (Patente US No. 1354458). Sucessivamente, a cepa VL613 foi obtida a partir da cepa Gif 102 conhecida (Theze, J. e Saint Girons. J.Bacteriol., 118, 990 a 998,1974) nas três etapas: Na primeira etapa os mutantes resistentes a 2 mg/ml de S-(2-aminoetil)-L-cisteína foram selecionados, e entre eles observou-se que a cepa VL611 é capaz de produzir L-lisina.

Na segunda etapa, os genes envolvidos na utilização de sacarose e localizados no transposon Tn2555 (Doroshenko et ai, Mol. Biologiya, 22, 645 a 658, 1988), foram introduzidos na VL611 usando-se a transdução mediada pelo fago PI dando a cepa VL612.

Na terceira etapa a mutação rhtAÜ da cepa VKPM B-3996, que confere resistência à treonina e à homosserina (Patente US No. 5.175.107) foi introduzida na VL612 pela transdução do fago PI dando a cepa VL613. A cepa E. coli VL614 foi obtida pela transdução do alelo do tipo selvagem do gene rhtA da cepa E. coli VKPM B-6204 (MG1655 TABELA 3 zó/3058: :TnlO) para a VL613. Os transdutantes foram selecionados do meio L contendo 10 mg/I de tetraciclina e entre eles, a cepa VL614 (rhtA+) sensível a 10 g/1 de homosserina foi encontrada. A cepa VL614 foi transformada com o plasmídeo pYGGA ou com o vetor pOK12 para se obter as cepas VL614/pYGGA (VKPM B-7719) e VL614/pOK12 (VKPM B-7722).

Estas cepas foram, cada uma, cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 50 mg/1 de canamicina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 0,3 g/1 de treonina, 0,3 g/1 de metionina e 50 mg/1 de canamicina, em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, cada quantidade acumulada de lisina e glutamato no meio foi determinada pelo processo conhecido.

Os resultados são mostrados na Tabela 4. _______________________________TABELA 4 ___________ Como mostrado na Tabela 4, a cepa VL614/pYGGA acumulou lisina em uma quantidade maior do que a cepa VL614/pOK12 na qual o gene yggÀ não foi intensificado. Além disso, a cepa VL614 acumulou mais ácido glutâmico do que a cepa VL614/pOK12. EXEMPLO 5. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS, yahN E yfiK NA PRODUÇÃO DE TREONINA, ALANINA, VALINA EISOLEUCINA.

Como a bactéria que produz treonina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL 2054 foi usada. Esta cepa foi derivada da cepa E. coli VKPM B-3996 (Patente US No. 5.175.107) como segue.

Inicialmente, uma nova cepa receptora foi construída em várias etapas: - 0 derivado sem plasmídeo da cepa VKPM B-3996 foi selecionado após a eliminação espontânea do plasmídeo pVIC40. - O alelo do tipo selvagem do gene rhtA da cepa E. coli VKPM B-6204 (MG1655 zè/3058: :TnlO) foi introduzida na cepa assim obtida pela transdução mediada pelo fago PI como no Exemplo 4. - Um gene kani inativador de mutação do transposon Tn5 inserido no gene tdh foi obtido após a mutagênese NG e seleção das células sensíveis à canamicina ainda incapazes de degradar a treonina. Desse modo, a cepa VL2053 foi obtida.

Por outro lado, o opéron de treonina do pVIC40 foi clonado em vetores Mud integradores sob o promotor PR do fago lambda. Além disso, o gene cat do Tn9 que confere resistência ao cloranfenicol foi clonado no mesmo vetor. O constructo assim obtido foi inserido no cromossomo da cepa E. coli C600 pelo uso do processo conhecido (Patente US No. 5.595.889) e transduzido a partir da cepa assim obtida para a VL2053, dando a nova cepa VL2054 que produz a treonina sem plasmídeo. Esta cepa também acumulou no caldo de cultura, alanina, valina e isoleucina. A cepa VL2054 foi transformada com cada um dos plasmídeos pYEAS, pYFIK e com o vetor pUC21 para obter as cepas E. coli VL2054/pYEAS (VKPM B-7707), VL2054/pYFIK (VKPM B-7712) e VL2054/pUC21 (VKPM B-7708).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/1 de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/1 de ampicilina em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivados a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, cada quantidade acumulada de treonina, alanina, valina e isoleucina no meio foi determinada pelo processo conhecido. EXEMPLO 6. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yeaS E yfiK NA PRODUÇÃO DE HISTIDINA.

Como a bactéria que produz histidina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa E. coli VL2160 foi usada. Esta cepa foi obtida na base da cepa NK5526 hisG: :TnlO (VKPM B-3384) pela transdução mediada pelo fago PI da mutação de hisGR que dessensibiliza a fosforribosiltransferase da cepa CC46 (Astvatsaturianz et al, Genetika, 24, 1928 a 1934, 1988). A cepa E. coli VL2160 foi transformada com cada um dos plasmídeos pYEAS, pYFIK e com os vetores pUC21 para se obter as cepas E. coli VL2160/pYEAS (VKPM B-7753), E. coli VL2160/pYFIK (VKPM B-7754), E. coli VL2l60/pUC21 (VKPM B-7752).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/1 de ampicilína e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml do meio de fermentação (Exemplo 3) contendo uma quantidade aumentada de extrato de levedura (3 g/1) e 100 mg/1 de ampicilína em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivados a 34°C por 68 horas com um agitador rotativo.

Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Como mostrado na Tabela 5, a cepa VL2054/pYFIK acumulou treonina em uma quantidade maior do que a cepa VL2054/pUC21 na qual o gene yfiK não foi intensificado. Além disso, a cepa VL2054/pYEAS acumulou mais alanina, valina e isoleucina do que a cepa VL2054/pUC21 na qual o gene yeaS não foi intensificado. TABELA 5 Como mostrado na Tabela 6, as cepas E. coli VL2160/pYEAS e E. coli VL2160/pYFIK acumularam histidina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli VL2160/pUC21 na qual os genes yeaS e yfiK não foram intensificados. EXEMPLO 7. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yahN, yfiKEyeaSNA PRODUÇÃO DE PROLINA.

Como a bactéria que produz prolina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa YL2151 (W3350 proB* AputAP TnlO) foi usada. Esta cepa foi obtida pela transdução no W3350 da mutação AputAP ligada ao TnlO e selecionando os transdutantes resistentes à tetraciclina incapazes de utilizar a prolina como uma fonte única de carbono. A cepa W3350 AputAP TnlO assim obtida foi submetida à mutagênese com NG e os mutantes resistentes a 20 mg/1 de 3,4-deidro-DL-prolina foram selecionados. Entre eles, observou-se que a cepa VL2151 (W3350proB* AputAP TnlO) foi capaz de produzir prolina. A cepa E. coli VL2151 foi transformada com cada um dos plasmídeos pYEAS, pYFIK, pYAHN e com os vetores pUC21 para se obter as cepas E. coli VL2151/pYEAS (VKPM B-7714), VL2151/pYFIK (VKPM B-7713), VL2151/pYAHN (VKPM B-7748) e E. coli VL2151/pUC21 (VKPMB-7715).

Estas cepas foram, cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas Após o cultivo, uma quantidade acumulada de histidina no meio foi determinada pelo processo conhecido. Os resultados são mostrados na Tabela 6. _________________________TABELA 6___________ Como mostrado na Tabela 7, as cepas E. coli VL2151/pYFIK, E. coli VL2151/pYAHN e E. coli VL2151/pYEAS acumularam prolina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli VL2151/pUC21 na qual os genes yfiK, yahN, e yeaS não foram intensificados. A amplificação do gene yfiK teve o efeito mais pronunciado. EXEMPLO 8. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA yggA NA PRODUÇÃO DE ARGININA.

Como a bactéria que produz arginina pertencente ao gênero Escherichia, a cepa W3350 argE: :Tnl0/pKA10 foi usada. Esta cepa abriga um plasmídeo, pKAIO, que contém uma região de DNA da Corynebacterium (Brevibacterium) flavum que complementa pelo menos as mutações argA e argE na cepa receptora de E. coli K-12 (Kharitonov A. Tarasov A. P. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. No. 9, 29 a 33,1986). A cepa E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10 foi transformada com o plasmídeo pYGGA, ou com o vetor pOK12 para se obter as cepas E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pYGGA (VKPM B-7716) e E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pOK12 (VKPM B-7718). em um caldo nutriente com 100 mg/1 de ampicilina e 0,3 ml da cultura obtida foi inoculada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/1 de ampicilina em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de prolina no meio foi determinada pelo processo conhecido. Os resultados são mostrados na Tabela 7. TABELA 7 Como mostrado na Tabela 8, as cepas E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, o pYGGA acumulou arginina em uma quantidade maior do que a cepa E. coli W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pUC21 em que o gene yggA não foi intensificado.

As seguintes cepas E. coli foram depositadas (de acordo com o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste) na Coleção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM) em 29 de Dezembro de 1998 sob os números de acesso mostrados em parênteses. AJ13199/pUC21 (VKPMB-7728) AJ13199/pYAHN (VKPM B-7729) AJ13199/pYEAS (VKPM B-7731) AJ13199/pYPIK (VKPM B-7730) VL614/pYGGA (VKPM B-7719) VL614/pOKI2 (VKPM B-7722) VL2054/pYEAS (VKPMB-7707) VL2054/pYFIK (VKPM B-7712) VL2054/pUC2I (VKPMB-7708) Os transformantes assim obtidos foram, cada um, cultivados a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/1 de ampicilina e 50 mg/1 de canamicina e 0,3 ml da cultura obtida foi inocuíada em 3 ml de um meio de fermentação (Exemplo 3) contendo 100 mg/1 de ampicilina e 50 mg/1 de canamicina em um tubo de teste de 20 x 200 mm e cultivada a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de arginina no meio foi determinada pelo processo conhecido.

Os resultados são mostrados na Tabela 8. TABELA 8 VL2160/pYEAS (VKPMB-7753) VL2160/pYFIK (VKPM B-7754) VL2160/pUC21 (VKPMB-7752) VL2151/pYFIK (VKPM B-7713) VL2151/pYEAS (VKPMB-7714) VL2151/pYAHN (VKPM B-7748) VL2151/pUC21 (VKPMB-7715) W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pYGGA (VKPM B-7716) W3350 argE: :Tnl0/pKA10, pOK12 (VKPM B-7718) LISTAGEM DAS SEQÜENCIAS <110> Livshíts, Vitaliy Arkadievich Zakataeva, Natalia Pavlovna Nakanishi, Kazuo Aleshin, Vladimir Veniaminovich Troshin, Petr Vladimirovich Tokhmakova, Irina Lyvovna <120> Processo para Produzir L-Aminoácido <130>

<160> 24 <210> 1 <211> 27 <212>DNA <2I3> Seqüêncía Artificial <220> <223> Descrição de Seqüêncía Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Escherichia coli <400> 1 ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27 <210> 2 <211> 27 <212>DNA <213> Seqüêncía Artificial <220> <223> Descrição de Seqüêncía Artificial: iniciador para amplificar o gene yahN do Eschêrichia coli <400> 2 cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli <400>3 ggcgagctca gattggttag catattc 27 <210> 4 <2U> 27 <212>DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yeaS do Escherichia coli <400> 4 cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27 <210> 5 <211> 27 <212>DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli <400>5 ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yfiK do Escherichia coli <400>6 ggctctagat agcaagttac taagcgg 27 <210 7 <211> 35 <212>DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli <400 7 ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 3 5 <210>8 <211> 38 <212>DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Descrição de Seqüência Artificial: iniciador para amplificar o gene yggA do Escherichia coli <400> 8 cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa 3 8 <210 9 <211> 672 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(672) <400> 9 atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa ate act atg gat cct 43 Met Het Gin Leu Vai His Leu Phe Het Asa 61 u Ile Thr Met Asp Pr o 1 S 10 15 ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt 95 Leu His Ala Vai Tyr Leu Thr Vai Gly Leu Phe Vai Ile Thr Phe Phe 20 25 30 aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc age ctg gct tcc 144 Asn Pro Gly Ala Asn leu Phe Vai Vai Vai Gin Thr Ser Leu Ala Ser 35 40 45 ggt cga cgc gea ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat 192 Gly Arg Arg Ala Gly Vai Leu Thr Gly Leu Gly Vai Ala Leu Gly Asp 50 55 60 gea ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gea acg cta att acg 240 Ala Phe Tyr Ser Gly leu Gly leu Phe Gly Leu Ala Thr leu Ile Thr 65 70 75 B0 cag tgt gag gag att ttt tcg ctt ate aga ate gtc ggc ggc gct tat 288 Gin Cys Glu Glu Ile Pha Ser leu Ile Arg Ile Vai Gly Gly Ala Tyr 85 90 95 ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc age atg cgc cgc cag tca. aca ccg caa 336 Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Het Arg Arg Glrt Ser Thr Pro Gin 100 105 110 atg age aca cta caa caa ccg att age gcc ccc tgg tat gtc ttt ttt 384 Met Ser Thr Leu Gin Gin Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Vai Phe Phe 115 120 125 cgc cgc gga tta att acc gat ctc tet aac ccg caa acc gtt tta ttt 432 Arg Arg Gly leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gin Thr Vai Leu Phe 130 135 140 ttt ate agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tgg 4S0 Phe I1e Ser Ile Phe Ser Vai Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp 145 150 155 ISO gea cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gea tca att ate tgg 528 Ala Arg teu Hat Ala Trp Ala Gly Ile Vai Leu Ala Ser Ile Ile Trp 165 170 175 cga gtt-ttt ctt agt cag gcg ttt tet ttg ccc gct gtg cgt cgt gct 576 Arg Vai Phe Leu Ser Gin Ala Phe Ser Leu Pro Ala Vai Arg Arg Ala ISO 185 190 tat ggg cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg gtt att ggt gea att att 624 Tyr Gly Arg Met Gin Arg Vai Ala Ser Arg Vai Ile Gly Ala Ile Ile 195 200 206 ggt gta ttc gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg gtg acg cag cgg tga S72 Gly Vai Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Vai Thr Gin Arg 21Õ 215 220 <210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> Escherichia coli <400>10 Het Het Gin Leu Vai HU Leu Phe Het Asp 51 u lie Thr Het Asp Pro 1 5. 10 15 Leu His Ala Vai Tyr Leu Thr Vai Gly Leu Phe Vai ITe Thr Phe Phe 20 25 30 Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Vai Vai Va1 Gin Thr Ser Uu Ala Ser 35 40 45 Gly Arg Arg Ala Gly Vai Leu Thr Sly leu Gly Vai Ala Leu Gly Asp 50 55 60 Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr 65 70 75 80 Gin Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Vai Gly Gly Ala Tyr 85 90 S5 leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Het Arg Árg Gin Ser Thr Pro Sln 100 105 110 Het Ser Thr Leu Gin Gin Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Vai Phs Phe 115 120 125 Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gin Thr Vai Leu Phe 130 135 140 Phe Ile Ser Ile Phe Ser Yal Thr leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp 145 150 155 160 Ala Arg Leu Het ÁU Trp Ala Gly Ile Vai Leu Ala Ser Ile íls Trp 165 170 175 Arg Vai Phe Leu Ser Sln Ala Phe Ser leu Pro Ala Vai Arg Arg Ala 180 185 190 Tyr Gly Arg Met Gin Árg Vai Ala Ser Arg Vai Ile Gly Ala Ile Ile 195 200 205 Gly Vai Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Vai Thr Sln Arg 210 215 220 <21011 <211> 639 <212>DNA <213> Escherichia coli <220> <221>CDS <222> (1).. (639) <400> 11 gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat ctg gtt ggg 4S

Met Phe Ala Gly Tyr Gly Vai Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Vai Gly 16 10 15 gcc att ttt att gtg ttg gtg cca gss cea aat acc ctg ttt gta ctc 95 Ala lie Phe Ile Vai Leu Vai Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Vai Leu 20 25 30 aaa aat age gtc agt age ggt atg aaa ggc ggt tat ctt gcg gcc tgc 144 Lys Asn Ser Vai Ser Ser Gly Met Lys Gly 61y Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt ctg gea tgg gct gga 192 Gly Vai Phe Ile Gly Asp Ala Vai Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta ttc aac att gta cgt 240 Vai Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro lie leu Phe Asn Ile Vai Arg 65 70 75 80 tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg agt aaa att ctt tac 2SS

Tyr Leu Gly Âla Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 S5 gcg acc ctg aag ggt aaa aat age ga.g gcc aaa tcc gat gag ccc caa 336 Ala Thr Leu Lys fily Lys Asn Ser Glu Ala tys Ser A$p Slu Pro Gin 10Q 105 110 tac ggt gct att ttt aaa cgc gcg tta att ttg age ctg act aat ccg 384 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 aaa gcc att ttg tto tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt ate gat gtt 432 Lys Ala lie Leu Phe Tyr Vai Ser Phe Phe Vai Gin Phe lie Asp Vai 130 135 140 aat gcc cca cat acg gga att tea ttc ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480 Asn Ala Pro His Thr Gly Ils Ser Phe Phe Πβ Leu Ala Ala Thr teu 145 150 155 160 gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg age ttc ctg att ata tet ggt gct 528 Glu Leu Vai Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu He Ile Ser Gly A.U 165 170 175 ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg gct aaa gtt ggc 5T6 Phe Vâl Thr Gin Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Vai Gly 180 185 190 aac tea ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc gct gcc cga ctg gcg 624 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Vai Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 acg ctg caa tcc tga 639 Thr Leu Gin Ser 210 <210> 12 <211> 212 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Met Pbe Ala ülu Tyr Sly Vai Leu Asm Tyr Trp Thr Tyr leu Vai Gly 1 5 10 15 Ala He Phe Ile Vai Leu Vai Pro 61 y Pro Asn Thr Leu Phe Vai teu 20 25 30 Lys Asn Ser Vai Ser Ser Gly Het tys Sly Sly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Vai Phe Ile Gly Asp Ala Vai leu Met Phe Leu Ala Trp Ala 61 y 50 55 60 Vai Ala Thr Leu lie Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Vai Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Lsu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile leu Tyr 85 90 95 Ala íbr Leu Lys Gly Lys Asn Ser GIu Al a Lys Ser Asp 61 u Pro Gin 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 lys AU I1e Leu Phe Tyr Vai Ser Phe Phe Vai Gin Phe Ile Asp Vai 130 135 . 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 GIu teu Vai Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe leu Ile Ile Ser Gly Al a 165 170 ‘ 175 Phe Vai Thr Gin Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Vai Gly 18Q 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Vai Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 20 0 205 Thr Leu 61n Ser 210 <210> 13 <211> 588 <212> DNA <213> Escherichia coli <220 <221> CDS <222> (1),. (588) <400> 13 gtg aca ccg acc ctt tta agt gct ttt tgg act tac acc ctg att acc 48 Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu-IIe Thr 15 10 15 gct atg acg cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt age tet gct acg 96 Ala ffet Thr Pro Gly Pro Asn Asn IIe Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr 20 25 30 ■ tcg cat gga ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gea ggg atg agt ctg 144 Ser His Gly Phe Arg Gin Ser Thr Arg Vai Leu Ala Gly Met Ser Leu 35 40 45 gga ttt ttg att gtg atg tta ctg tgt gcg sgc att tea ttt tea ctg 192 Gly Phe Leu Ile Vai Hat Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu 50 55 50 gea gtg att gac ccg gea gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg 240 Ala Vai Ile Asp Pro Ala Ala Vai His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 80 gea tat att gtc tgg ctg gcg tgg aaa ate gcc acc age cca aca aag 288 Ala Tyr Ile Vai Trp Leu Ala Trp lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr lys 85 §0 95 gaa gac gga ctt cag gea aaa cca ate age ttt tgg gcc age ttt gct 335 Glu Asp Glv Leu Gin Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala 1QQ 105 110 ttg cag ttt gtg aac gtc aaa ate att ttg tac ggt gtt acg gea ctg 384 Leu Gin Phe Vai Asn Va1 Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Vai Thr Ala leu 115 ^ 120 125 tcg acg ttt gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta age tgg gta gtt ggc 432 Ser Thr Phe Vai leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu Ser Trp Vai Vai Gly 130 135 140 gtc age gtt ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg 480’ Vai Ser Vai Leu leu Ala Met IIe Gly Thr Phe Gly Asn Vai Cys Trp 145 150 155 150 gcg ctg gcg ggg cat ctg ttt cag cga ttg ttt cgc cag tat ggt cgc 528 Ala Leu Ala Gly Bis Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr Gly Arg 165 170 175 cag tta aat ate gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc 57S

Gin Leu Asn Ile Vai Leu Ala Leu Leu Leu Vai Tyr Cys Ala Vai Arg 180 185 ISO att ttc tat taa 588 Ile Phe Tyr 1S5 <210 14 <211> 195 <212>PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Ket Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr 15 10 15 Ala Met Thr Pro GTy Pro Asn Asn lie Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr 25 25 30 Ser His Gly Phe Arg Gin Ser Thr Arg Vai Leu Ala Gly Met Ser leu 35 40 45 Gly Phe Leu Ile Vai Met Leu Leu Cys Ala Gly íle Ser Phe Ser Leu 50 55 60 Ala Vai Ile Asp Pro Ala Ala Vai His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala 65 70 75 ' BO

Ala Tyr íle Vai Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr lys 85 90 95 Glu Asp Gly Leu Gin Ala Lys Pro íle Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala 100 105 110 Leu Gin Phe Vai Asn Vai Lys Ile Ile leu Tyr Gly Vai Thr Ala Leu 115 120 125 Ser Thr Phe Vai leu Pro Gin Thr Gin Ala Leu Ser Trp Vai Va1 Gly 130 135 140 Vai Ser Vai Leu Leu Ala Het Ile Gly Thr Phe Gly Asn Vai Cys Trp H5 150 155 160 Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gin Arg Leu Phe Arg Gin Tyr G]y Arg 155 170 175 Gin Leu Asn Ile Vai Leu Ala Leu Leu Leu Vai Tyr Cys Ala Vai Arg 180 185 190 Ile Phe Tyr 195 <210> 15 <211> 636 <212>DNA <213> Escherichia coli <220>

Claims (4)

1. Bactéria pertencente ao gênero Escherichia e tendo uma capacidade para produzir um L-aminoácido selecionado do grupo que consiste de ácido L-glutâmico, L-histidina, L-prolina e L-treonina, caracterizada pelo fato de que a capacidade para produzir o L-aminoácido é aumentada pelo aumento do número de cópias do DNA da SEQ ID NO: 13 e/ou pela substituição de um promotor do DNA da SEQ ID NO: 13 por um mais forte por transformação, para aumentar a quantidade de expressão de uma proteína codificada pelo DNA da SEQ ID NO: 13 em relação à bactéria não transformada.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito DNA da SEQ ID NO: 13 é carregado em um vetor de cópia múltipla na célula.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito DNA da SEQ ID NO: 13 é carregado em um transposon na célula.

4. Processo para produzir um L-aminoácido selecionado do grupo que consiste de L-glutâmico, L-histidina, L-prolina e L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em um meio de cultura, para produzir e acumular o L-aminoácido no meio, e recuperar o L-aminoácido do meio.