CA1088007A - Materiau a caractere cationique, capable de fixer de facon reversible, des macromolecules biologiques, procedes de preparation et application - Google Patents
Materiau a caractere cationique, capable de fixer de facon reversible, des macromolecules biologiques, procedes de preparation et applicationInfo
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Abstract
L'invention concerne un nouveau matériau utilisable comme échangeur d'anions pour fixer des macromolécules biologiques ou des substances à faibles poids moléculaires. Le matériau selon l'invention est caractérisé par le fait qu'il comprend un support constitué d'un oxyde minéral poreux ayant une surface interne inférieure ou égale à 100 m2/g et un diamètre poreux supérieur ou égal à 25 nm, le support étant revêtu directement sur sa surface par un polymère polysaccharidique aminé porteur de charges positives; ce polymère a un poids moléculaire supérieur ou égal à 104 daltons. Le matériau selon l'invention est particulièrement utile à la purification ou à la séparation des macromolécules biologiques, notamment de protéines.
Description
~ 8C~
La présente invention a pour objet un nouveau matériau .
à caractère cationique capable de fixer de facon réversible des macromolécules biologiques, des proteines diverses, des acides nucléiques, etc Jusqu'à présent, il n'a pas été possible de mettre au .
point des supports, pour la chromatographie par échanges d'ions de tels types de molécules, présentant d'une part d'excellentes propriétés chimiques et d'autre part d'excellentes propriétés mécaniques.
En effet, il a déjà été proposé de nombreux types de ~:
supports, parmi ceux-ci certains présentent de très bonnes propri- ~
étés chimiques et permettent ainsi des séparations sélectives mais :
possèdent par contre des propriétés mécaniques tout-à-fait .
médiocres.
Inversement, il a été également proposé des supports ayant de très bonnes qualités mécaniques notamment pour une utilisa-tion préparative ou industrielle en colonne~ mais il s'est avéré
que ces supports possédaient des propriétés chimiques tout~à-fait insuffisantes vis-à-vis notamment des macromolécules biologiques, ` .
20 ces supports présentant des sites d'absorption irréversible.
Etant donné que les techniques modernes de séparation des macromolécules biologiques nécessitent à la Eois l'utilisation de supports présenkant d'une part une excellente activité chimiques et d'autre part une grande résistance mécanique, la Société deman- .
deresse après d'imporkantes recherches, vient de constater qu'il .
était possible d'obtenir de tels résultats en utilisant un matériau d'un type particulier~
La présente invention a donc pour objet à titre de produits industriel nouveau un matériau capable de fixer de facon réversible des macromolécules biologiques, ce matériau étant ca- ~
ractérisé par le fait qu'i.l comprend un support constitué d'un . .
h~
oxyde minéral poreux ayan~ une surface interne inferieure ou égale à 100 m2/y et un diamètre poreux supérieur ou égal à 25 nm, ledit support étant revêtu directement sur sa surface par un polymère polysaccharidique aminé porteur de charges positives, ledit polymère ayant un poids moléculaire supérieur ou égal à
104 daltOns.
Les différents essais ef~ectués par la Société demande-resse ont permis de montrer que ce type de matériau béné~icie de qualités mécaniques, physiques, chimiques et biologiques du support minéral poreux tout en ayant une nouvelle surface chimique particulièrement appropriée pour la séparation chromatographique - des ~acromolécules biologiques.
Selon l'invention, le support minéral poreux peut être de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane, ou leurs dérivés s~nthétiques ou naturels tels que verres, sili-cates, kaolin, etc Le polymère polysaccharidique aminé est fixé sur le support minéral poreux par encollage, ce mécanisme dladhésion ne semble pas uniquement de type électrostatique car des supports poreux tels que l'alumine de surface non négative peuvent être également revêtus de polymère polysaccharidique aminé et conduire à des matériaux selon l'invention d'excellentes qualités.
Il s'ensuit c~ue le revêtement de polymère polysaccha-ridique aminé est Eixé de Eaçon pratiquement irréversible sur le support. Toutefois, dans certaines conditions qui seront décrites ai-apres il est possible après un certain temps d'utilisation de réyénérer le support minéral poreux qui peut alors à nouveau être réutilisé pour une nouvelle imprégnation à l'aide d'un polymère polysaccharidique aminé.
Le support minéral poreux doit avoir une porosité con-trôlée bien définie. La surface interne de support doit être in-férieure ou égale à 100 m2/g; elle est de préférence comprise ,' , . ' .~ ~
38/~
entre 5 et 80 m /g. Le diamètre poreux moyen est supérieur ou égal à 25 nm et, de préférence, compris entre 50 et 1000 nm, `
des intervalles plus précis pouvant être conseillés suivant le type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles la surface interne du support devient inaccessible au polymère polysaccharidique aminé et ultérieurement aux macromolécules à séparer. Selon un mode préfére de l'invention, le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine et de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue par exemple selon les procédés décrits dans les brevets franQais No 1.473.239, No 1.473.240, No 1.475.929 et No 1.482.~67.
On utilise par exemple des silices poreuses vendues par RHONE-POULENC CHIMIE FINE sous les marques de commerce SPHEROSILS XOB
030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives de 50, 25 et 10 m /g.
Le polymère polysaccharidique aminé qui sert à imprégner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral doit avoir un caractère cationique prononcé et avoir de bonnes pro-priétés d'hydrophilie. Il a un poids moléculaire au moins égal à lQ4 daltons et, de préférence, compris entre 105 et 106. Sa ;
formule peut être quelconque et il peut en particulier être un dérivé aminé du dextrane, de ].'amidon, de la cellulose, de l'agarose ou d'un polymère naturel ou synthé~ique de tous les oses connus à condition,bien entendu qu'il ne comporte pas de groupements anionigues tels que carboxyliques ou sulfoniques en quantité ap-préciable de telle sorte que le polymère possède des charges élec-triques négatives importantes qui gêneraient lors de l'utilisation du support comme échangeur d'anions.
Les fonctions amines du polymère polysaccharidique peuvent être primaires, secondaires ou tertiaires ou éventuellement quaternaires. Les fonctions secondaires tertiaires, et quaternaires sont cependant préférables.
~y .
Se1on un mode préférentiel, le polymère polysaccharidique aminé correspond à la formule suivante:
R ~ CH2)n N ~ R2 ~~~~~~~~-----~
~o~
dans laquelle: :
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'ag~rose, ;
n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, Rl et R2 identiques ou diérents représentent les radicaux suivants: CH3, CH2 CH3l CH2OH, CH2 C 2 u C 2 CHOH - CH3, ce composé pouvant être quaternisé à l'aide d'un agent quaternisant classi~ue tel que les halogénures et en particulier les iodures et bromures d'alkyle ou d'hydroxyalkyle, le sulfate de diméthyle etc...
Parmi ces composés de ce t~pe on peut.en particulier citer les composés connus sous les dénominations de DEAE DEXTRAN
(diéthylamino eth~l dextran) de poids moléculaire 500.000 et de .
QAE DEXTRAN (diethylamino ethyl dextran quaternisé) vendus par la firme PHARM~CIA et le composé connu sous la dénomination de DEAE amidon (diéthylamino éth~l amidon) ainsi que les amidons cationiques tels que ceux vendus sous la marque de commerce CATO par la Societé RO~UETTE NATIONAL.
Selon un autre mode preférentiel de l'invention le poly-mère polysaccharidi~ue aminé peut être réticulé à l'aide d'un . ::.
agent réticulant tel que le 1-4 butanedioldiglycidyléther ou l'épichlorhydrine~ l'épibromhydrine, un diépoxyde de Eormule:
CH2 - CH - R~ - N - R3 - C \- /H2 O O
dans laquelle: .
Rl est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inérieur de 1 à 4 atomes de carbone, R2 et R3 représen-tent une chaine hydrocarbon~e de l à 10 atomes de carbone et de préférence un radical alkylène inférieur par exemple le diépoxyde de formule:
. - 4 -., .:
.
`
CH
(fH2)3 H2 !CH - CH2 - N - CH2 ~ C~ -/CH2 O O
La pr~sente invention a également pour objet le procédé
de preparation du matériau ~ caract~re cationique selon l'inven-tion capable de fixer de façon réverRible des macromolecules biolo-giquesO
Ce procéd~ peut 8tre réali~é selon deux methodes diffé-rentes ~ ~a~oir l'imprégnation en colonne et l'impr~gnation aufour.
Selon la premi~re m~thode, on introduit l'ox~de minéral poreux dans une colonne de chromatographie en versant directement la poudre sèche et homog~ne. On lave et homogé~éise ensuite pour chasser les bulles d'air en faisant passer une solution d'acide par exemple l'acide chlorhydrique 0,1 N. On fait alors passer un ; tampon de pH 3 ~ 12 (par exemple tampon TRIS 0,05 M pH 7) jusqu~ ;
équilibre.
On introduit ensuite le polym~re polysaccharidique amin~
en solution ~ ~roid ou ~ chaud dans le tampon précédent ou dans de l'eau ajustée au m8me pH~ L'excès de polymère poly~accharidi-que amin~ est alors élimin~ par ~lution à l'aide du tampon préce-dent puis ~ l'aide d'une solution d'un sel par e~emple ~ l'aide de citrate trisodlque; 1'ab~ence da~s l'éluat ~inal de polymère ; polysaccharidique aminé peut 8tre détermine par électrophor~se en ac~tate de cellulose et coloration de la plaque au rouge Ponceau ou encore par précipitation en présence d'acide polyacry- ;
liqu~.
Le matériau ainsi obtenu permet de fixer de faço~
réversible environ 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support. -~
Ce matériau présente une grande stabilité dans unelarge gamme de pH (~ ~ 12 environ)O
: .
5 - ;
Selon la deuxiame méthode dite d9imprégnation au four, 1'oxyde minéral poreux après avoir été pesé est imprégné ~ froid ou à chaud ~ l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccha-ridique aminé, ~ un pH compris indif~éremment entre 3 et 12. On s~che ensuite à l'~tuve entre 50 et 120 et de preférence ~ 80G
jusqu'~ ce que l'on obtienne un poids constantr La poudre ainsi obte~ue es~ alors homog~néis~e et tamisée si cela s'av~re nécessaire pour éliminer d7éventuels agglomérats.
Le matériau obtenu par imprégnation au four peut alors 8tre utilisé
en colonne apr~s lavage prealable ~ l'aide de solution tampon ou de citrate 0,05 M pH 4 ou 0,05 M pH 6, 8; le matériau o~te~u par cette méthode permet de ~ixer de façon réversible environ 40 à
200 mg de protéines par gra~me de support.
Comme on peut le constater, cette méthode d'i~prégnation au four augmente de façon appréciable les capacités de fixation des protéines.
La méthode d'imprégnation au four permet également d'obtenir un matériau dont le rev8temen-t de polymère polysaccha-ridique ami~é est ~ixé de ~açon prati~uement irréversible.
En e~et, ce matériau peut etre lavé par de l'acide chlor-hydrique 0,1 N, par de la æoude ou par de l'ammoniaque 0,1 N sans af~ecter ces propriétés d'échangeur d'anions alors que selon la méthode d'imprégnation en colonne, de tels lavages régénèrent l'oxyde minéral poreux initial. Si l'on souhaite rénégerer l'oxyde minéral poreux des matériaux obtenus selon la méthode d'impré-gnation au four, il importe de traiter le materiau dans des condltions beaucoup plus énergiques par exemple à l'aide d'acide nitrique fumant.
Il résulte donc que selon la méthode par imprégnation au four, il est possible d'utiliser le matériau selon l'invention pour de nombreuses opérations sans pour cela affecter ses excellen-tes propriétés d'échangeur d'anions.
'.
Selon un autre mode de réalisation du procédé s~lon l'invention, il est possible apr~s imprégnation selon l'une des méthodes décrites ci-dessus, et après avoir séché à l'étuvc entre environ 50 et 80C pour obtenir une poudre homogène, de traiter le produit obtenu à l'aide d'une solution d'un agent réticulant dans un solvant volatil tel que l'éther éthylique par exemple comme agent réticulant on peut`utiliser l'un quelconque de ceux précédemment mentionnés.
Dans ce cas le produit à traiter est agité jusqu'~
évaporation complète du solvant ceci de ~açon ~ obtenir une imprégnation réguliare.
On porte ensuite à une température compri~e entre 40 et 120C de pré~érence voisine de 80C pendant environ 15 heures.
Apr~s tamisage éventuel le support est alors monté ~ sec en colonne, lavé par de la soude puis par une solution de chlorure de sodium et en~in équilibré avec le tampon de chromatographie souhaité.
Par cette réticulation on obtient ainsi un matériau présentant d'excellentes qualités et qui peut être lavé de façon réguli~re par de la soude ou de l'ammoniqaue 0,1 N ou de l'acide chlorhydrique 0,1 N sans pour cela altérer soit ses qualités geparatriceS 50it sa capacité de fixation réversible des protéines.
La capacité du mat~riau ainsi obtenu est aomprise entre 40 et 200 mg de protéines par gramme de support~ Pour des sur-faces du support poreux initial allant de 10 à 80 m2/g cette capacité est ~ peu pr~s constante.
Co~me pour les matériaux obtenu~ selon le procédé d'im- ~
prégnation en colonne ou au ~our il est également possible dans ;
le cas présente de laver le matériau ~ l'acide nitrique concentr~
de façon ~ régénérer 1'oxyde minéral poreux servant de support.
La présente invention a en outre pour objet l'applica-tion des nouveaux matériaux décrits ci-dessus ~ la purification ~ 7-~
ou ~ la séparation des macromolécules biologiques, notamment des protéines.
D'une façon g~nérale cette application consiste à utili-ser les propriétés cationiques du matériau selon l "nvention soit pour fixer s~lectivement les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier soit pour retenir sélectivement les impu-retés ou autres protéines non désirés.
La fixation sélective des protéines est facilement obtenue en réglant le pH et la molarité selon les m~thodes bien connues d~utilisation des échangeurs d'ions.
D'une ~açon générale cette application est caract~risée par le fait ~ue l'on fait passer sur le matériau objet de l'in~en-tion, une solution contenant les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier en réglant le pH et la molarit~ ;
pour que ledit matériau ~ixe sélec~ivement soit les macromolécules biologiques que l'on désire purifier ou isoler soit les impuretés non désirées.
Dans le cas o~ le matériau ~ixe les macromolécules que l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées avec une solution de pH et de molarité convenables.
Dans le cas où le matériau fi~e les impuretés on recueil- ;
le directement les macromolécules biologiques en ~olution. On élue ensuite avec une solution de pH et de molarit~ convenables pour ~limlner les impuretés et rég~n~rer al~si le matériau pour une nouvelle opération.
Quelques applications selon l'invention sont mentionnées ci-après à titre d'illustration seulement :
a) Puri~ication de~ gammaglobulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
~0 b) Elimination de l'hémoglobine dans le procédé de purification de l'albumine ~ partir du sang placentaire et concen-tration des autres protéines.
, ,, ~ . . .
c) Concentration d'une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et ~limination de l'alcool.
d) Concentration et purification de l'albumine dans une solution de caprylate de sodium.
e) Concentration et purification de gangliosides partir d'extraits aqueux de cerveaux dianimaux.
Ce~ dif~érentes applications du matériau selon l'inven-tion seront décrites en dé~tails dans les exemples de réalisation don~és ci-apr~s.
Le mat~riau selon l'in~ention trouve également une application pour la purification d'anticorps ou d'an~ig~nes. Dans :~:
ce cas on im~obilise sur le matériau selon l'in~ention des anti-g~nes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la purification et la concentration des anticorps et antiganes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la puri-fication et la concentration des anticorps e-t antig~nes corres-: pondants.
Ainsi il est possible d'immobiliser : ..
- L'albumine, les alpha b8ta et gammaglobulirles humaines ou animales.
! - Tout antigene bactérien et viral pourvu ~u'ils pOs~
dent des charges électriques négatives ~ pH 6,8. C'est le cas de la plupart des protéines, polysaccharides et acides nucléiques connus.
A titre non limitat~ on peut par exemple également citer~ les toxlnes bactériennes9 l'anatoxine t~tanique, l'antigène HBS a~socié ~ l'hépatite B, le virus grippal, le virus de la rage, le virus de l'herpès, le ~irus de la rougeole, le virus de la :~:
rubéole? les ad~novirus, les papora~irus, les arboYirus, les `:
rhinovirus, les picorna~irusj les ent~rov{rus, les poxivirus, les myxo~iru~, les paranyxovirus, les réovirus, les coronavirus~ ou leurs produits de dégradation tels que leurs antigènes divers.
_ 9 _ ' De m8me que les materiaux selon l'invention peuvent immobiliser des antiganes ou anticorp~, ceux-ci peu~ent é~alement immobiliser divers enzymes conduisant à des materiaux d~activité
enzymatique suiva~te :
pepsine, trypsine, chrymotrypsine, plasmine, lacticode- ~-shydrogénase, L aminoacylase~ invertase~ glucose isomerase, amyloglucosidase, glucose oxydase, catalase, lipase, uréase.
Selon un mode de réalisation particulier ces substances macromoléculaires immobilis~es peuvent 1'8tre de façon irréversi~
bles si on ré~lise ultérieurement une réticulation ~ l'aide d'un agent réticulan~ tels que ceux énumérés ci-dessus.
Cette réticulation est en g~néral e~fectuée ~ température ambi~nte~
En~in, les matériaux selon l'invention peuvent également 8tre utilisés pour immobiliser des molecules de ~aibles poids molé-culaires telles que certains amino-acides ou certains ligands possedant des fonctions amines, alcools ou thiols en présence d'un agent couplant tel que le glutaraldéhyde ou des composés dipéoxy tels que ceux énumérés ci-dessus.
C'est ainsi qu'il est possible d'immobiliser par exemple de la lysine et le matériau obtenu peut être utilisé pour purifier ou éliminer le plasminogènss ou la plasmine, protéine du sang ayant une a~finité ~orte pour la lysine.
De m~me il est possible d'immobiliser diver~ stéro1des et utiliser de tels matériaux ainsi modi~iés pour purifier leurs protéines de tra~sport. Enfin,il est possible d'immobiliser divers récepteurs cell~laires par exemple des gangliosides pré-alablement désacétylés pour faire appara~tre les fonctions aminées les plus réactives et utiliser ces matériaux pour l'élimin~ion, la neutralisation ou la purification de leurs ligands.
~n va maintemant donner ~ titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif plusieurs exemples de préparation du ~ ~
~' '' '' ' ~
matériau selon l'inventîon ainsi que plusieurs exemples d'applica-tion de ce matériau.
E:XE:MPLE 1 .
10 g de Sphérosil X0 C005 sont mis en colonne de chroma-tographie en versant directement la poudre sèche et ~omog~ne, ce qui facilite le montage de la colonne. 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique HCl n,l N sont alors introduits dan~ la colonne grâce ~ u~e pompe péristaltique à un débit de 500 ml/h~
pour laver, imprégner la colonne et chasser toutes les bulles d'air (le sens d~élution ascendante es~ préférable)~ Un tampon de pH 3 ~ 12 est alors introduit dans la colonne (tampon TRIS 0,05 M pH 7 par exemple3 jusqu'~ equilibre, contrôlé par mesure du pH
et de la résistivité du tampon en sortie de colcnne . Environ 150 ml d'une solution de DEAE dextran ~ 1 % (ou 30 ml ~ 5 %) dans le tampon précédent ou dans de l'eau aJustée à ce pH, sont alors introduits à un débit de 100 ml/h. Ensuite l'excès de DEAE dextran non fixé sur la colonne est élué par le tampon précédent puis par du citrate 0,05 M pH 4 et du citrate 0,05 M pH 8 à un débit de 1000 ml/h. Enfin la colonne est é~uilibrée dans le tampon de ~;
chromatographie souhaité. L'absence de DEAE ~extr~n dan~ l'éluat final peut être déterminée par électrophor~se en acétate de cellulo~e et coloration de la plaque au rouge PDnceau, ou par précipitation en présence d'acide polyacryliq~e. Le support ainsi impr~gné est stable dans une large gamme de pH (3 à 12 environ) et se comporte en ~changeur d'anions, il est particulière-ment adapté à la purification ou la concentration des protéines.
Dans un système tampon adéquat, il est capable de fixer de mani~re réversible de 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support ~mprégné.
Dans cet exemple le DEAE Destran peut ~tre avantageuse-ment remplace par le OAE Dextran.
", .. . . .. - . . ~ : .
10 g de Sphérosil XO B 015 sont peses et imprégnés de 20 ml d'une solution aqueuse de polysaccharide aminé ~DEAE Dextran par exemple~ à une concentration comprise entre 1 et 10 % de préférence comprise entre 5 et 8 ~, et à un pH compris indifférem-ment e~tre 3 et 12. L~ensemble est séché ~ l~étuve entre 50 et 120C, mais de pre~érence ~ 80C pendant le temps ~éce~saire (15 h. par exemple~ pour avoir un poids constant (élimination de l'eau). La poudre obtenue est homogénéisée et tami~ée si néces-saire pour él~miner d'eventuels agglomérats , puis montée encolonne.
Apras remplissag~ d~une colonne et lavages préalables par les tampons HCl 0,1 N, ou citrate 0,05 M pH 49 OU citrate 0,05 M pH 6,8 ou NaOH 0,1 N, la colonne est équilibrée dans le tampon adéqua-t pour le type de chromatographie recherchée. La capacité de fixation des protéines est cette fois plus élevée, ;. `
elle est de l'ordre de 40 à 200 mg/g en ~onction des conditions de chromatographie. :
Dans cet exemple le DEAE9 Dextran peut être avantageuse-ment remplacé par un autre polymère polysaccharidique aminé telque le DEAE amidon.
EXEMPLE ~
A 10 g de Sphérosil XOB 030 ~mprégnés selon l'une des deux méthodes préc~dentes, par une solution de cpolysaccharide amlné de pH compris entre 8 et 13, mais de préférence égal à
11,5 puis sécbé ~ l'étuve pour obtenir une poudre homogène,sont additionés ~0 ml d'une solution de 1-4 butanedioldiglycidyl~ther de 0,02 % ~ 2 % dans l'éther ~thylique, mais de pré~érence égale ~ 0,15 %. L'ensemble est agité en continu ~ une température de 40C, jusqu'à évaporation complète de l'éther éthylique et pour obtenir une imprégnation régulière par ce composé diépoxy servant d'agent réticulant.
. .
,' .:.~; ` ;
L'ensemble est ensuite porté ~ une température comprise entre 40 et 120C, de préférence voisine de 80~C 9 pendant 15 heures environ. Après tamisage éventuel en final, le support est alors monté ~ sec en colonne, lavé par 1 litre de soude 0,1 N
puis 1 litre de NaCl M et enfin équilibré a~ec le tampon de chromatographie. -La capacite de fixation des protéines est comprise entre 40 et 200 mg par gramme de support en ~onction des conditions de chromatographie. Pour des sur~aces du support poreux initial allant de 10 ~ 80 m2/g, cette capacité est ~ peu près constante.
... . _ , .
serums ou ~lasma humains ou animaux.
1, 2 ou 3 précédents :
- Equilibrage de la colonne ~ pH 6,8 par exemple (entre 6,3 et 8) (tampon P04 0,01 à 0,02 ~ ou tampon TRIS-HCl 0,05 ou NaCl 1 à 3 g/1)9 ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
- Introduction de 50 ml plasma ou ~érun préalablement dialysé contre le tampon de chromatographie et filtré pour éliminer toute possibilité de colmatage. (Débit moyen 50 ~ 100 ml/cm2/h).
Pour un support préparé suivant l'exemp~e 1 la quantit~ de sérum ou plasma par cycle doit ~tre ramenée à 2~ ml, - ~avage de la colonne par le tampon d* chromatographie.
- Collection du pi~ de sortie constitué de gammaglobu-lines pures en immunoélectrophorèse, avec un rendement compris entre 50 et 100 % sui~ant les tampons utilisés. Le rendement est meilleur pour les pH plus bas que pH 6~8 ou les forces ioniques les plus ~ortes, mais la puret~ risque alors d'~tre moi~s bo~ne.
Une telle préparation de gammaglobulines est débarrassée des substances pyrog~nes et de l'~ntig~ne associé à l'hépatite B
(Ag HBS) éventuellement présents dans la matiare brute de départ.
... , . , ,",, ,. .~ , , "" . ~ , ", - , - Elution des autres protéines retenues sur la colo~ne par un tampon quelconque de pH 4 ou par le tampon de chromato-graphie additionné de 10 ~ 60 g/l de ~aCl, ou enfin par un tampon citrate 0,05 M de pH L~ ~ ~. La durée de ce cycle est d'environ
La présente invention a pour objet un nouveau matériau .
à caractère cationique capable de fixer de facon réversible des macromolécules biologiques, des proteines diverses, des acides nucléiques, etc Jusqu'à présent, il n'a pas été possible de mettre au .
point des supports, pour la chromatographie par échanges d'ions de tels types de molécules, présentant d'une part d'excellentes propriétés chimiques et d'autre part d'excellentes propriétés mécaniques.
En effet, il a déjà été proposé de nombreux types de ~:
supports, parmi ceux-ci certains présentent de très bonnes propri- ~
étés chimiques et permettent ainsi des séparations sélectives mais :
possèdent par contre des propriétés mécaniques tout-à-fait .
médiocres.
Inversement, il a été également proposé des supports ayant de très bonnes qualités mécaniques notamment pour une utilisa-tion préparative ou industrielle en colonne~ mais il s'est avéré
que ces supports possédaient des propriétés chimiques tout~à-fait insuffisantes vis-à-vis notamment des macromolécules biologiques, ` .
20 ces supports présentant des sites d'absorption irréversible.
Etant donné que les techniques modernes de séparation des macromolécules biologiques nécessitent à la Eois l'utilisation de supports présenkant d'une part une excellente activité chimiques et d'autre part une grande résistance mécanique, la Société deman- .
deresse après d'imporkantes recherches, vient de constater qu'il .
était possible d'obtenir de tels résultats en utilisant un matériau d'un type particulier~
La présente invention a donc pour objet à titre de produits industriel nouveau un matériau capable de fixer de facon réversible des macromolécules biologiques, ce matériau étant ca- ~
ractérisé par le fait qu'i.l comprend un support constitué d'un . .
h~
oxyde minéral poreux ayan~ une surface interne inferieure ou égale à 100 m2/y et un diamètre poreux supérieur ou égal à 25 nm, ledit support étant revêtu directement sur sa surface par un polymère polysaccharidique aminé porteur de charges positives, ledit polymère ayant un poids moléculaire supérieur ou égal à
104 daltOns.
Les différents essais ef~ectués par la Société demande-resse ont permis de montrer que ce type de matériau béné~icie de qualités mécaniques, physiques, chimiques et biologiques du support minéral poreux tout en ayant une nouvelle surface chimique particulièrement appropriée pour la séparation chromatographique - des ~acromolécules biologiques.
Selon l'invention, le support minéral poreux peut être de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane, ou leurs dérivés s~nthétiques ou naturels tels que verres, sili-cates, kaolin, etc Le polymère polysaccharidique aminé est fixé sur le support minéral poreux par encollage, ce mécanisme dladhésion ne semble pas uniquement de type électrostatique car des supports poreux tels que l'alumine de surface non négative peuvent être également revêtus de polymère polysaccharidique aminé et conduire à des matériaux selon l'invention d'excellentes qualités.
Il s'ensuit c~ue le revêtement de polymère polysaccha-ridique aminé est Eixé de Eaçon pratiquement irréversible sur le support. Toutefois, dans certaines conditions qui seront décrites ai-apres il est possible après un certain temps d'utilisation de réyénérer le support minéral poreux qui peut alors à nouveau être réutilisé pour une nouvelle imprégnation à l'aide d'un polymère polysaccharidique aminé.
Le support minéral poreux doit avoir une porosité con-trôlée bien définie. La surface interne de support doit être in-férieure ou égale à 100 m2/g; elle est de préférence comprise ,' , . ' .~ ~
38/~
entre 5 et 80 m /g. Le diamètre poreux moyen est supérieur ou égal à 25 nm et, de préférence, compris entre 50 et 1000 nm, `
des intervalles plus précis pouvant être conseillés suivant le type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles la surface interne du support devient inaccessible au polymère polysaccharidique aminé et ultérieurement aux macromolécules à séparer. Selon un mode préfére de l'invention, le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine et de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue par exemple selon les procédés décrits dans les brevets franQais No 1.473.239, No 1.473.240, No 1.475.929 et No 1.482.~67.
On utilise par exemple des silices poreuses vendues par RHONE-POULENC CHIMIE FINE sous les marques de commerce SPHEROSILS XOB
030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives de 50, 25 et 10 m /g.
Le polymère polysaccharidique aminé qui sert à imprégner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral doit avoir un caractère cationique prononcé et avoir de bonnes pro-priétés d'hydrophilie. Il a un poids moléculaire au moins égal à lQ4 daltons et, de préférence, compris entre 105 et 106. Sa ;
formule peut être quelconque et il peut en particulier être un dérivé aminé du dextrane, de ].'amidon, de la cellulose, de l'agarose ou d'un polymère naturel ou synthé~ique de tous les oses connus à condition,bien entendu qu'il ne comporte pas de groupements anionigues tels que carboxyliques ou sulfoniques en quantité ap-préciable de telle sorte que le polymère possède des charges élec-triques négatives importantes qui gêneraient lors de l'utilisation du support comme échangeur d'anions.
Les fonctions amines du polymère polysaccharidique peuvent être primaires, secondaires ou tertiaires ou éventuellement quaternaires. Les fonctions secondaires tertiaires, et quaternaires sont cependant préférables.
~y .
Se1on un mode préférentiel, le polymère polysaccharidique aminé correspond à la formule suivante:
R ~ CH2)n N ~ R2 ~~~~~~~~-----~
~o~
dans laquelle: :
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'ag~rose, ;
n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, Rl et R2 identiques ou diérents représentent les radicaux suivants: CH3, CH2 CH3l CH2OH, CH2 C 2 u C 2 CHOH - CH3, ce composé pouvant être quaternisé à l'aide d'un agent quaternisant classi~ue tel que les halogénures et en particulier les iodures et bromures d'alkyle ou d'hydroxyalkyle, le sulfate de diméthyle etc...
Parmi ces composés de ce t~pe on peut.en particulier citer les composés connus sous les dénominations de DEAE DEXTRAN
(diéthylamino eth~l dextran) de poids moléculaire 500.000 et de .
QAE DEXTRAN (diethylamino ethyl dextran quaternisé) vendus par la firme PHARM~CIA et le composé connu sous la dénomination de DEAE amidon (diéthylamino éth~l amidon) ainsi que les amidons cationiques tels que ceux vendus sous la marque de commerce CATO par la Societé RO~UETTE NATIONAL.
Selon un autre mode preférentiel de l'invention le poly-mère polysaccharidi~ue aminé peut être réticulé à l'aide d'un . ::.
agent réticulant tel que le 1-4 butanedioldiglycidyléther ou l'épichlorhydrine~ l'épibromhydrine, un diépoxyde de Eormule:
CH2 - CH - R~ - N - R3 - C \- /H2 O O
dans laquelle: .
Rl est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inérieur de 1 à 4 atomes de carbone, R2 et R3 représen-tent une chaine hydrocarbon~e de l à 10 atomes de carbone et de préférence un radical alkylène inférieur par exemple le diépoxyde de formule:
. - 4 -., .:
.
`
CH
(fH2)3 H2 !CH - CH2 - N - CH2 ~ C~ -/CH2 O O
La pr~sente invention a également pour objet le procédé
de preparation du matériau ~ caract~re cationique selon l'inven-tion capable de fixer de façon réverRible des macromolecules biolo-giquesO
Ce procéd~ peut 8tre réali~é selon deux methodes diffé-rentes ~ ~a~oir l'imprégnation en colonne et l'impr~gnation aufour.
Selon la premi~re m~thode, on introduit l'ox~de minéral poreux dans une colonne de chromatographie en versant directement la poudre sèche et homog~ne. On lave et homogé~éise ensuite pour chasser les bulles d'air en faisant passer une solution d'acide par exemple l'acide chlorhydrique 0,1 N. On fait alors passer un ; tampon de pH 3 ~ 12 (par exemple tampon TRIS 0,05 M pH 7) jusqu~ ;
équilibre.
On introduit ensuite le polym~re polysaccharidique amin~
en solution ~ ~roid ou ~ chaud dans le tampon précédent ou dans de l'eau ajustée au m8me pH~ L'excès de polymère poly~accharidi-que amin~ est alors élimin~ par ~lution à l'aide du tampon préce-dent puis ~ l'aide d'une solution d'un sel par e~emple ~ l'aide de citrate trisodlque; 1'ab~ence da~s l'éluat ~inal de polymère ; polysaccharidique aminé peut 8tre détermine par électrophor~se en ac~tate de cellulose et coloration de la plaque au rouge Ponceau ou encore par précipitation en présence d'acide polyacry- ;
liqu~.
Le matériau ainsi obtenu permet de fixer de faço~
réversible environ 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support. -~
Ce matériau présente une grande stabilité dans unelarge gamme de pH (~ ~ 12 environ)O
: .
5 - ;
Selon la deuxiame méthode dite d9imprégnation au four, 1'oxyde minéral poreux après avoir été pesé est imprégné ~ froid ou à chaud ~ l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccha-ridique aminé, ~ un pH compris indif~éremment entre 3 et 12. On s~che ensuite à l'~tuve entre 50 et 120 et de preférence ~ 80G
jusqu'~ ce que l'on obtienne un poids constantr La poudre ainsi obte~ue es~ alors homog~néis~e et tamisée si cela s'av~re nécessaire pour éliminer d7éventuels agglomérats.
Le matériau obtenu par imprégnation au four peut alors 8tre utilisé
en colonne apr~s lavage prealable ~ l'aide de solution tampon ou de citrate 0,05 M pH 4 ou 0,05 M pH 6, 8; le matériau o~te~u par cette méthode permet de ~ixer de façon réversible environ 40 à
200 mg de protéines par gra~me de support.
Comme on peut le constater, cette méthode d'i~prégnation au four augmente de façon appréciable les capacités de fixation des protéines.
La méthode d'imprégnation au four permet également d'obtenir un matériau dont le rev8temen-t de polymère polysaccha-ridique ami~é est ~ixé de ~açon prati~uement irréversible.
En e~et, ce matériau peut etre lavé par de l'acide chlor-hydrique 0,1 N, par de la æoude ou par de l'ammoniaque 0,1 N sans af~ecter ces propriétés d'échangeur d'anions alors que selon la méthode d'imprégnation en colonne, de tels lavages régénèrent l'oxyde minéral poreux initial. Si l'on souhaite rénégerer l'oxyde minéral poreux des matériaux obtenus selon la méthode d'impré-gnation au four, il importe de traiter le materiau dans des condltions beaucoup plus énergiques par exemple à l'aide d'acide nitrique fumant.
Il résulte donc que selon la méthode par imprégnation au four, il est possible d'utiliser le matériau selon l'invention pour de nombreuses opérations sans pour cela affecter ses excellen-tes propriétés d'échangeur d'anions.
'.
Selon un autre mode de réalisation du procédé s~lon l'invention, il est possible apr~s imprégnation selon l'une des méthodes décrites ci-dessus, et après avoir séché à l'étuvc entre environ 50 et 80C pour obtenir une poudre homogène, de traiter le produit obtenu à l'aide d'une solution d'un agent réticulant dans un solvant volatil tel que l'éther éthylique par exemple comme agent réticulant on peut`utiliser l'un quelconque de ceux précédemment mentionnés.
Dans ce cas le produit à traiter est agité jusqu'~
évaporation complète du solvant ceci de ~açon ~ obtenir une imprégnation réguliare.
On porte ensuite à une température compri~e entre 40 et 120C de pré~érence voisine de 80C pendant environ 15 heures.
Apr~s tamisage éventuel le support est alors monté ~ sec en colonne, lavé par de la soude puis par une solution de chlorure de sodium et en~in équilibré avec le tampon de chromatographie souhaité.
Par cette réticulation on obtient ainsi un matériau présentant d'excellentes qualités et qui peut être lavé de façon réguli~re par de la soude ou de l'ammoniqaue 0,1 N ou de l'acide chlorhydrique 0,1 N sans pour cela altérer soit ses qualités geparatriceS 50it sa capacité de fixation réversible des protéines.
La capacité du mat~riau ainsi obtenu est aomprise entre 40 et 200 mg de protéines par gramme de support~ Pour des sur-faces du support poreux initial allant de 10 à 80 m2/g cette capacité est ~ peu pr~s constante.
Co~me pour les matériaux obtenu~ selon le procédé d'im- ~
prégnation en colonne ou au ~our il est également possible dans ;
le cas présente de laver le matériau ~ l'acide nitrique concentr~
de façon ~ régénérer 1'oxyde minéral poreux servant de support.
La présente invention a en outre pour objet l'applica-tion des nouveaux matériaux décrits ci-dessus ~ la purification ~ 7-~
ou ~ la séparation des macromolécules biologiques, notamment des protéines.
D'une façon g~nérale cette application consiste à utili-ser les propriétés cationiques du matériau selon l "nvention soit pour fixer s~lectivement les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier soit pour retenir sélectivement les impu-retés ou autres protéines non désirés.
La fixation sélective des protéines est facilement obtenue en réglant le pH et la molarité selon les m~thodes bien connues d~utilisation des échangeurs d'ions.
D'une ~açon générale cette application est caract~risée par le fait ~ue l'on fait passer sur le matériau objet de l'in~en-tion, une solution contenant les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier en réglant le pH et la molarit~ ;
pour que ledit matériau ~ixe sélec~ivement soit les macromolécules biologiques que l'on désire purifier ou isoler soit les impuretés non désirées.
Dans le cas o~ le matériau ~ixe les macromolécules que l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées avec une solution de pH et de molarité convenables.
Dans le cas où le matériau fi~e les impuretés on recueil- ;
le directement les macromolécules biologiques en ~olution. On élue ensuite avec une solution de pH et de molarit~ convenables pour ~limlner les impuretés et rég~n~rer al~si le matériau pour une nouvelle opération.
Quelques applications selon l'invention sont mentionnées ci-après à titre d'illustration seulement :
a) Puri~ication de~ gammaglobulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
~0 b) Elimination de l'hémoglobine dans le procédé de purification de l'albumine ~ partir du sang placentaire et concen-tration des autres protéines.
, ,, ~ . . .
c) Concentration d'une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et ~limination de l'alcool.
d) Concentration et purification de l'albumine dans une solution de caprylate de sodium.
e) Concentration et purification de gangliosides partir d'extraits aqueux de cerveaux dianimaux.
Ce~ dif~érentes applications du matériau selon l'inven-tion seront décrites en dé~tails dans les exemples de réalisation don~és ci-apr~s.
Le mat~riau selon l'in~ention trouve également une application pour la purification d'anticorps ou d'an~ig~nes. Dans :~:
ce cas on im~obilise sur le matériau selon l'in~ention des anti-g~nes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la purification et la concentration des anticorps et antiganes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la puri-fication et la concentration des anticorps e-t antig~nes corres-: pondants.
Ainsi il est possible d'immobiliser : ..
- L'albumine, les alpha b8ta et gammaglobulirles humaines ou animales.
! - Tout antigene bactérien et viral pourvu ~u'ils pOs~
dent des charges électriques négatives ~ pH 6,8. C'est le cas de la plupart des protéines, polysaccharides et acides nucléiques connus.
A titre non limitat~ on peut par exemple également citer~ les toxlnes bactériennes9 l'anatoxine t~tanique, l'antigène HBS a~socié ~ l'hépatite B, le virus grippal, le virus de la rage, le virus de l'herpès, le ~irus de la rougeole, le virus de la :~:
rubéole? les ad~novirus, les papora~irus, les arboYirus, les `:
rhinovirus, les picorna~irusj les ent~rov{rus, les poxivirus, les myxo~iru~, les paranyxovirus, les réovirus, les coronavirus~ ou leurs produits de dégradation tels que leurs antigènes divers.
_ 9 _ ' De m8me que les materiaux selon l'invention peuvent immobiliser des antiganes ou anticorp~, ceux-ci peu~ent é~alement immobiliser divers enzymes conduisant à des materiaux d~activité
enzymatique suiva~te :
pepsine, trypsine, chrymotrypsine, plasmine, lacticode- ~-shydrogénase, L aminoacylase~ invertase~ glucose isomerase, amyloglucosidase, glucose oxydase, catalase, lipase, uréase.
Selon un mode de réalisation particulier ces substances macromoléculaires immobilis~es peuvent 1'8tre de façon irréversi~
bles si on ré~lise ultérieurement une réticulation ~ l'aide d'un agent réticulan~ tels que ceux énumérés ci-dessus.
Cette réticulation est en g~néral e~fectuée ~ température ambi~nte~
En~in, les matériaux selon l'invention peuvent également 8tre utilisés pour immobiliser des molecules de ~aibles poids molé-culaires telles que certains amino-acides ou certains ligands possedant des fonctions amines, alcools ou thiols en présence d'un agent couplant tel que le glutaraldéhyde ou des composés dipéoxy tels que ceux énumérés ci-dessus.
C'est ainsi qu'il est possible d'immobiliser par exemple de la lysine et le matériau obtenu peut être utilisé pour purifier ou éliminer le plasminogènss ou la plasmine, protéine du sang ayant une a~finité ~orte pour la lysine.
De m~me il est possible d'immobiliser diver~ stéro1des et utiliser de tels matériaux ainsi modi~iés pour purifier leurs protéines de tra~sport. Enfin,il est possible d'immobiliser divers récepteurs cell~laires par exemple des gangliosides pré-alablement désacétylés pour faire appara~tre les fonctions aminées les plus réactives et utiliser ces matériaux pour l'élimin~ion, la neutralisation ou la purification de leurs ligands.
~n va maintemant donner ~ titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif plusieurs exemples de préparation du ~ ~
~' '' '' ' ~
matériau selon l'inventîon ainsi que plusieurs exemples d'applica-tion de ce matériau.
E:XE:MPLE 1 .
10 g de Sphérosil X0 C005 sont mis en colonne de chroma-tographie en versant directement la poudre sèche et ~omog~ne, ce qui facilite le montage de la colonne. 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique HCl n,l N sont alors introduits dan~ la colonne grâce ~ u~e pompe péristaltique à un débit de 500 ml/h~
pour laver, imprégner la colonne et chasser toutes les bulles d'air (le sens d~élution ascendante es~ préférable)~ Un tampon de pH 3 ~ 12 est alors introduit dans la colonne (tampon TRIS 0,05 M pH 7 par exemple3 jusqu'~ equilibre, contrôlé par mesure du pH
et de la résistivité du tampon en sortie de colcnne . Environ 150 ml d'une solution de DEAE dextran ~ 1 % (ou 30 ml ~ 5 %) dans le tampon précédent ou dans de l'eau aJustée à ce pH, sont alors introduits à un débit de 100 ml/h. Ensuite l'excès de DEAE dextran non fixé sur la colonne est élué par le tampon précédent puis par du citrate 0,05 M pH 4 et du citrate 0,05 M pH 8 à un débit de 1000 ml/h. Enfin la colonne est é~uilibrée dans le tampon de ~;
chromatographie souhaité. L'absence de DEAE ~extr~n dan~ l'éluat final peut être déterminée par électrophor~se en acétate de cellulo~e et coloration de la plaque au rouge PDnceau, ou par précipitation en présence d'acide polyacryliq~e. Le support ainsi impr~gné est stable dans une large gamme de pH (3 à 12 environ) et se comporte en ~changeur d'anions, il est particulière-ment adapté à la purification ou la concentration des protéines.
Dans un système tampon adéquat, il est capable de fixer de mani~re réversible de 20 ~ 50 mg de protéines par gramme de support ~mprégné.
Dans cet exemple le DEAE Destran peut ~tre avantageuse-ment remplace par le OAE Dextran.
", .. . . .. - . . ~ : .
10 g de Sphérosil XO B 015 sont peses et imprégnés de 20 ml d'une solution aqueuse de polysaccharide aminé ~DEAE Dextran par exemple~ à une concentration comprise entre 1 et 10 % de préférence comprise entre 5 et 8 ~, et à un pH compris indifférem-ment e~tre 3 et 12. L~ensemble est séché ~ l~étuve entre 50 et 120C, mais de pre~érence ~ 80C pendant le temps ~éce~saire (15 h. par exemple~ pour avoir un poids constant (élimination de l'eau). La poudre obtenue est homogénéisée et tami~ée si néces-saire pour él~miner d'eventuels agglomérats , puis montée encolonne.
Apras remplissag~ d~une colonne et lavages préalables par les tampons HCl 0,1 N, ou citrate 0,05 M pH 49 OU citrate 0,05 M pH 6,8 ou NaOH 0,1 N, la colonne est équilibrée dans le tampon adéqua-t pour le type de chromatographie recherchée. La capacité de fixation des protéines est cette fois plus élevée, ;. `
elle est de l'ordre de 40 à 200 mg/g en ~onction des conditions de chromatographie. :
Dans cet exemple le DEAE9 Dextran peut être avantageuse-ment remplacé par un autre polymère polysaccharidique aminé telque le DEAE amidon.
EXEMPLE ~
A 10 g de Sphérosil XOB 030 ~mprégnés selon l'une des deux méthodes préc~dentes, par une solution de cpolysaccharide amlné de pH compris entre 8 et 13, mais de préférence égal à
11,5 puis sécbé ~ l'étuve pour obtenir une poudre homogène,sont additionés ~0 ml d'une solution de 1-4 butanedioldiglycidyl~ther de 0,02 % ~ 2 % dans l'éther ~thylique, mais de pré~érence égale ~ 0,15 %. L'ensemble est agité en continu ~ une température de 40C, jusqu'à évaporation complète de l'éther éthylique et pour obtenir une imprégnation régulière par ce composé diépoxy servant d'agent réticulant.
. .
,' .:.~; ` ;
L'ensemble est ensuite porté ~ une température comprise entre 40 et 120C, de préférence voisine de 80~C 9 pendant 15 heures environ. Après tamisage éventuel en final, le support est alors monté ~ sec en colonne, lavé par 1 litre de soude 0,1 N
puis 1 litre de NaCl M et enfin équilibré a~ec le tampon de chromatographie. -La capacite de fixation des protéines est comprise entre 40 et 200 mg par gramme de support en ~onction des conditions de chromatographie. Pour des sur~aces du support poreux initial allant de 10 ~ 80 m2/g, cette capacité est ~ peu près constante.
... . _ , .
serums ou ~lasma humains ou animaux.
1, 2 ou 3 précédents :
- Equilibrage de la colonne ~ pH 6,8 par exemple (entre 6,3 et 8) (tampon P04 0,01 à 0,02 ~ ou tampon TRIS-HCl 0,05 ou NaCl 1 à 3 g/1)9 ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
- Introduction de 50 ml plasma ou ~érun préalablement dialysé contre le tampon de chromatographie et filtré pour éliminer toute possibilité de colmatage. (Débit moyen 50 ~ 100 ml/cm2/h).
Pour un support préparé suivant l'exemp~e 1 la quantit~ de sérum ou plasma par cycle doit ~tre ramenée à 2~ ml, - ~avage de la colonne par le tampon d* chromatographie.
- Collection du pi~ de sortie constitué de gammaglobu-lines pures en immunoélectrophorèse, avec un rendement compris entre 50 et 100 % sui~ant les tampons utilisés. Le rendement est meilleur pour les pH plus bas que pH 6~8 ou les forces ioniques les plus ~ortes, mais la puret~ risque alors d'~tre moi~s bo~ne.
Une telle préparation de gammaglobulines est débarrassée des substances pyrog~nes et de l'~ntig~ne associé à l'hépatite B
(Ag HBS) éventuellement présents dans la matiare brute de départ.
... , . , ,",, ,. .~ , , "" . ~ , ", - , - Elution des autres protéines retenues sur la colo~ne par un tampon quelconque de pH 4 ou par le tampon de chromato-graphie additionné de 10 ~ 60 g/l de ~aCl, ou enfin par un tampon citrate 0,05 M de pH L~ ~ ~. La durée de ce cycle est d'environ
2 heures, un nouveau cycle peut alors ~tre immédiatement entrepris, si bien qu'a~ec un automatisme assez simple9 une dizaine de cycles peu~ent ~tre réalisés dans la m8me jou~née7 soit un débit de traitement voisi~ de 10 litr~s de sérum ou plasma par kilo-gramme d'oxyde minéral poreux et par jour.
~ . ,, . ~
Le ~ractionnement du sang placentaire par llalcool seion la methode de Cohn passe par une étape de précipitation du bloc globulines à pH 6,8 et 20 ~ 25 % d'éthanol. Dans ces conditions, 1'albumine, certaines alpha 1, alpha 2 globulines et 1'hémoglobine pour 1'essentiel restent en qolution dan~ le surnageant. Celui-ci est recueilli par c~ntrifugation au froid, dilué dans un volume égal d'eau distillée (pour diminuer la concentration en alcool)9 a~usté ~ un pH compris entre 6 et 7 et clarifié par filtration sur membrane~ d'esters de cel}ulose.
Schéma d'un cycle de puri~ication sur ~0 ~ de support (100 g de support sont n~cessaires s'il s~agit de celui obtenu selon l'exemple 1.) - Equilibrage de la colonne en tampon P0~0,01 M ou TRIS-HCl 0,05 M pH 6 à 7 (6,5 de pr~érence) ~ un débit de 200 ml/cm2/h~
- Introduction ~ un débit moyen de 100 ml/cm2/h de 1000 ml de la solution ~ purifier précedente.
- Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie au même débit. L'hémoglobine puri~iée sort de la colonne avec - 14 _ un ~acteur de dilution négligeable alors que les ~utres protéines, dont l'albumine, restent fixées sur la colonne.
- Elution des protéines ~ixées sur la colonne dans des conditlons identiques ~ l'exemple 4, le pic contient les protéines concentrées et pratiquement débarrassées d'hémoglobine.
- La durée de ce cyle est d'environ 4 heures, un nouveau cycle peut alors etre immédiatement entrepris.
EXEMPLE 6 ~
~L ". ," ,.. : "
10 ~
Le ~ractio~nement des pr~téines, selon la m~thode de Cohn, entra~ne inévitablement lors de diverses étapes des redis-solutions de précipités alcooliques. Pour cela il est préférable de dlluer fortement le précipité pour diminuer la concentration en alcool résiduel qui gênerait. Ensuite, il y a donc nécessité, d'une part d'éliminer la présence d'alcool, d'autre part de concen-trer les protéines présentes. Ceci est généralement ef~ectué par concentration SOU5 vide, lyophilisation ou dialyse, ces deux derni-ères étapes étant ou très onéreuses ou sourced~ pyrogènes, on pro-pose le procédé suivant extr8mement commode, rapide et économiqueO
Exemple d'~ne solution d'albumine à 2 % contenant 10 %d'alcool.
Schéma d'un c~cle de puri~ication etQ onçentration sur 1 K~J de ~Y~E~ (pr~paré selo~ les exemple~ 2 ou 3, dans le cas de l'exem-ple 1, il y a lieu de doubler la quant~t~ de support nécessaire) sa durée est de l'ordre de 4 heures~
1) Equillbrage du support en tampo~ phosphate 0,01 M
pH 7 - Débit 200 ml/cm2~h.
~ ) Introduction de la solution alcoolique d'albumine ~0 ajustée à pH 7 par addition de HCl ou NaOH selon le pH initial~
Débit moyen 100 ml/cm2/h.
Il est ainsi possible de fixer 200 g ~'albumine sur , .~
cette colonne (soit 10 litres de la solution/cycle3 si l'albumine se fixe mal sur la colonne, il suffit de diluer davantage la solution initiale dans l'eau distillée de maniere ~ baisser la force ionique du milieu.
~ . ,, . ~
Le ~ractionnement du sang placentaire par llalcool seion la methode de Cohn passe par une étape de précipitation du bloc globulines à pH 6,8 et 20 ~ 25 % d'éthanol. Dans ces conditions, 1'albumine, certaines alpha 1, alpha 2 globulines et 1'hémoglobine pour 1'essentiel restent en qolution dan~ le surnageant. Celui-ci est recueilli par c~ntrifugation au froid, dilué dans un volume égal d'eau distillée (pour diminuer la concentration en alcool)9 a~usté ~ un pH compris entre 6 et 7 et clarifié par filtration sur membrane~ d'esters de cel}ulose.
Schéma d'un cycle de puri~ication sur ~0 ~ de support (100 g de support sont n~cessaires s'il s~agit de celui obtenu selon l'exemple 1.) - Equilibrage de la colonne en tampon P0~0,01 M ou TRIS-HCl 0,05 M pH 6 à 7 (6,5 de pr~érence) ~ un débit de 200 ml/cm2/h~
- Introduction ~ un débit moyen de 100 ml/cm2/h de 1000 ml de la solution ~ purifier précedente.
- Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie au même débit. L'hémoglobine puri~iée sort de la colonne avec - 14 _ un ~acteur de dilution négligeable alors que les ~utres protéines, dont l'albumine, restent fixées sur la colonne.
- Elution des protéines ~ixées sur la colonne dans des conditlons identiques ~ l'exemple 4, le pic contient les protéines concentrées et pratiquement débarrassées d'hémoglobine.
- La durée de ce cyle est d'environ 4 heures, un nouveau cycle peut alors etre immédiatement entrepris.
EXEMPLE 6 ~
~L ". ," ,.. : "
10 ~
Le ~ractio~nement des pr~téines, selon la m~thode de Cohn, entra~ne inévitablement lors de diverses étapes des redis-solutions de précipités alcooliques. Pour cela il est préférable de dlluer fortement le précipité pour diminuer la concentration en alcool résiduel qui gênerait. Ensuite, il y a donc nécessité, d'une part d'éliminer la présence d'alcool, d'autre part de concen-trer les protéines présentes. Ceci est généralement ef~ectué par concentration SOU5 vide, lyophilisation ou dialyse, ces deux derni-ères étapes étant ou très onéreuses ou sourced~ pyrogènes, on pro-pose le procédé suivant extr8mement commode, rapide et économiqueO
Exemple d'~ne solution d'albumine à 2 % contenant 10 %d'alcool.
Schéma d'un c~cle de puri~ication etQ onçentration sur 1 K~J de ~Y~E~ (pr~paré selo~ les exemple~ 2 ou 3, dans le cas de l'exem-ple 1, il y a lieu de doubler la quant~t~ de support nécessaire) sa durée est de l'ordre de 4 heures~
1) Equillbrage du support en tampo~ phosphate 0,01 M
pH 7 - Débit 200 ml/cm2~h.
~ ) Introduction de la solution alcoolique d'albumine ~0 ajustée à pH 7 par addition de HCl ou NaOH selon le pH initial~
Débit moyen 100 ml/cm2/h.
Il est ainsi possible de fixer 200 g ~'albumine sur , .~
cette colonne (soit 10 litres de la solution/cycle3 si l'albumine se fixe mal sur la colonne, il suffit de diluer davantage la solution initiale dans l'eau distillée de maniere ~ baisser la force ionique du milieu.
3) Lavage par de l'eau dlstillée. Débit 200 ml/cm2th. et vérification que l'albumine ne sort pas mais que par contre l'al-cool termine dc sor-tir.
4) Elution de l'albumine da~s un des tampons sulvants:
NaCl 0,1 M ou citrate de 0,05 M pH 6,8 on obtient généralement ~ -de~ concentrations finales en albumine de 10 ~ 20 % environ, l'élimination de l'alcool est totale, le rendement de l'opération est voisin de 100 %. Ce procédé est applicable pour toute `
protéine dont le point isoélectrique est inférieur ~ 6,5. Pour des protéines dont le point isoélectrique serait supérieur~ la méthode serait applicable à condition d'augmenter le pH du tampon de chromatographie. Enfin, il est évident que toute impureté
présente dans ces solutions prot~igues peut ainsi 8tre éliminée à condition qu'elle soit électriquement neutre ~glucides et polysaccharides) ou chargée positivement de la même manière ~ue le support (cations). Dans le cas d'impuretés chargées négative-ment, il peut y avoir compétition sur le support avec les protéinesnégatives que l'on cherche ~ fixer. Dans ce cas, si l'affinité
de l'impureté pour le support est plus ~aible que celle de la protéine et si la solution peut ~tre diluee suffisamment dans lleau pour obtenir une force ioni~ue compatible avec la fixation de la protéine sur le support~ il est alors possible d'éliminer m8me les anions. L'application suivante illustre une telle séparation.
EX_ Concentration et puri~ication de l'albumine dans une solution de caPrylate de sodium.
Des m~thodes de fractionnement extr~menent intéressantes utilisent le caprylate de sodium pour coaguler toutes les prot~ines l'exception de l'albumine uniqueme~t, qui reste donc en solution en présence de caprylate.
Exemple dlune solution contenant 15 g/l d~albumine et 3 g/l de caprylate. , Schéma d~un cycle sur 1 k~ de sup~ort (préparé selon les exemples 2 ou 3, dans le cas de l'~xemple 1 il faut doubler la quantité
de support nécessaire).
1) Equilibrage du support e~ tampon Phosphate 0901 M
pH 6 - Débit 200 ml/cm2/h.
2) Introduction de la solution d'albwmine et caprylate ajustée elle m~me ~ pH 6 (diluée dans l'eau dans le cas de ~orces ioni~ues trop élevées)~ Le débit moyen est de 100 ml/cm2/h.
Environ 8 1 de la solution peuvent être introduits sur la colonne. Il est aisé de constater la fixation et d'observar la sortie du caprylate de sodium en continu (odeur très marquée ; de ch~vre).
3) Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie jusqu'~ ce que rien ne sorte plus de la colonne~
4) Elution de l'albumine selon la m8me méthode que dans les applications précédentes. On obtient une solution de 10 à
20 % d'albumine qui ramenée à 20 % contlent en final moins de 2,5 g/l de caprylate de sodium. La durée totale du cycle est de 4 heures environ.
Il est évident que cette méthode peut ~tre généralisée ~ la purification et concentration de diverses molécules biologi-ques chargées négativement à certains pH (acides nucléiques, protéines, polysaccharides anioniques, glycolipides anioniques).
Pour montr~r que cette générali~ation est possible et qu'une telle colonne supporte sans conséquence le passage de liquides de polarité tr~s diverses nous a~ons réalisé 1'application suivante.
.
- - ~o~0~
Concentration_et ~urification de ~an~liosides ~ partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
Les gangliosides sont des glycolipides dont les bio-chimistes étudient actuellement le rôle physiologique ou patho-logique extr8mement important, qu'ils jouent au niveau des membra-nes cellulaires, comme récepteur et effecteur.. Ils contiennent plus ou moins d'acide sialique et à ce titre sont chargés négati-vement au-dessus de pH ~ environ.
A partir de 1 kg de cervelles de veau, il est possible d'obt~nir un extrait aqueux d'environ 7 1. (selon un procédé
décrit dans une publication de L. SVEMNERHOLM : Gangliosides, isolation. In: Methods in carbohydrate chemistry vol. 6 Edition R.L. Whister and J.N. BEMILLER Acad. Press New York 1972).
Cet extrait aqueux est passé directement sur une colonne de 50 g d'un support réalisé suivant l'exemple 3, préalablement équilibrée en tampon TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8. Le débit est de 200 ml/cm2/h. Tous les gangliosides s'accrochent sur la colonne dans ces conditions. Un lavage préalable par les solutions suivantes et dans 1'ordre indiqué:
TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8 NaOH 0,1 N
Chloroforme - Methanol - eau en proportions volumétri-ques respectives ~uivantes ~30-60-25~ permet d'éliminer des impureté~ nombreuses.
L'élution des gangliosides sous forme concentrée et pur~fiée est alors réalis~e au m~me débit avec le mélange :
Chloro~orme - Méthanol - HCl 0,1 N en proportions volumétriques respectives (30-60-25).
Aussit8t l'élution, le pic recueilli est neutralisé
par addition de NaOH 0,1 N, évaporé et repris dans un syst~me chromatographique quelconque pour analyseO Le rendement est de 100 %. Il est remarquable de constater que la colonne peut, sans aucune conséquence nuisible, passer d'un solvant orga~ique une solution aqueuse et inversement. Ceci peut être le cas éché-ant exploité pour des nettoyages particuliers, ou pour maintsnir des conditions stériles dans la colonne.
. ,.
.~ .
~9~. ..
La capacité élevée de fixation de protéin~s révélée dans les applications précédentes peut ~tre mise ~ profi-t pour immobili-ser l'~natoxine tétanique sur une colonne de support minéral poreux. Par exemple 10 g de Sphérosil XOC 005 (surface spécifique 10 m2/g) sont imprégnés de DEAE Dextran suivant l'exemple l; et équilibrés en tampon phosphate 0,01 M pH 6,8. 25 ml d'anatoxine tétanique (de titre biologique voisin de 1500 Lf ou Unités floculantes) sont dilués ~ 250 ml dans ce même tampon et intro-duits sur la colonne en continu. Au début du passage la fixation de l'anatoxine tétanique est quantitative, aucune trace n'est décelable en sortie de colonne par les méthodes immunologiques appropriées jusqu'~ environ 200 ml d'éluat. Les 50 derniers ml sont introduits malgré tout pour 8tre certain d'avoir un rev~tement uniforme et complet d'anatoxine tétanique~ Puis la colonne est rinc~e par le tampon de chromatographie. Il e~t alors possible d'immobiliser d~finitivement l'anatoxine tétanique en la réticu-lant, de mani~re ~ ce qu'elle ne puisse être éluée dans une gamme de pH a~sez large (pH 2 ~ 12).
La réticulation se fa~t par circulation continue de 100 ml d'u~e solution de glutaraldéhyde ~ 095 % en tampon phosphate 0,01 M pH 6,8 pendant 2 heures ~ un débit de 40 ml/cm2/h environ et à la température du laboratoire.
Puis la colonne est rincée par plusieurs tampons, .
.. ...
~0~ 7 successiYement : ~ -Phosphate 0~01 M pH 6~8 , Glycocolle 092 M pH 8,2 Glycocclle 0,2 M pH 7~2 (aveC et sans NaCl 60 g/l) Citrate 0,05 M pH 2,8 Retour ~i~al et conservation en glycocolle 0~2 M pH 7j2.
La colonne est alors pr~te ~ l'emploi et peut permettre de faire de nombreux cycles identiques de puri~ication. Plusieurs ~izaines de cycles successifs ont ainsi été réalis~s sur la m8me colonne et conservant toutes les propriétés de celle-ci.
.~
1,5 litre d'une solution de gamma-globulines ou de séru~s ou de plasma~ ajustés aux concentrations suivantes:
Glycocolle 15 g/l NaCl pH 7,2 et titrant environ 5 U.I/ml en anticorps antit~taniques sontintro-duits dans la colonne ~ un débit de 40 ml/cm2/h,à la temperature du laboratoire. Moins de 5~ des anticorps antitétaniques sont décela-bles en sortie de colonne, par les méthodes immumologiques appropri-~es,alors que toutes les autres protéines traversent la colonne.
La colonne est ensuite rincée par le tampon gl~cocolle 0,2 M pH 7,2 contenant 60 g/l de NaCl, puis par le m8me tampon San8 NaCl ~usqu'~ ce quo l'~luat de colonnc n'absorbe plus la lumière ultraviolette ~ 280 nm de manière signi~icative~ Chaque tampon est a~pliqué environ 15 nm ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
L'~lution des a~ticorps antit~tanique~ fixés sur la colonne d'anatoxine est alors réalisée par application du tampon citrate trisodique-acide citri~ue 0905 M pH 2,8 à 20C et ~ un débit de 40 ml/cm2/h.
L'éluat de colonne est récolté dans un récipient réfrigéré
et neutralisé immédiatement ~ pH 7 par addition continue de soude q normale commandée par un pH mètre enregistreur. Dès que le pic d'élution (lecture par absorption ~ 280 nm) est éluré, la colonne est rééquilibrée dans le tampon glycocolle de départ~ et un nouveau cycle peut immédiatement recommencer~ La solution d'anticorps antitétaniques pur$fiés peut 8tre concentrée par les moyens classi-ques (ultra~iltration, précipitation par le polyéthylaneglycol , l'alcool ou le sulfate d'ammo~ium). L'aotivité moyenne des solu-tions d'anticorps antitétaniques ainsi puri~iés est de 30 à 100 U.I./mg de protéine. Le rendement en anticorps antitétanique varie de 20 ~ 100 %.
En suivant rigoureusement le m8me procédé que celui décrit ~ l'exemple 9 il est possible d'immobiliser différents antig~nes ou anticorps tels que ceux qui ont été énumérés dans la description de la présente demande.
Pour certains antigènes dont le point iso~lectrique est supérieur à pH 6 il est préférable de réaliser l'étape de fixation sur la colonne en tampon phosphate 0901 M pH 8 au lieu de pH 6,8. Il peut meme 8tre pré~erable de remplacer les ions phosphates par des ions chlore en utilisant du chlorure de sodium ~ 0,01 à 0,05 M au m8me pH 8. Egalement une solution consisterait à
employer des échangeurs quaternaires selon l'invention ~ortement ionis~s à pH 8. C'est le cas notamment des protéines à activité `
anticorps de type b~ta 2, gamma 1 ou gamma 2 provenant des espèces animales courante~ (chèvre, mouton, lapin, cheval, cobaye, etc...) ou humaines. `
A 10 g de Spherosil XOB 015 imprégnés de DEAE Dextran suivant l'un quelcon~ue des exemples 1-2 ou 3, on a~oute 30 ml d'une solution de butane-diol-diglycidyl éther ~ 0,1 %, on é~apore ensuite le solvant pendant 30 minutes ~ 80C, et additionne en~in une solution de lysine dans l'eau à pH 11,5 (30 ml ~ 1 %). Le tout est alors porté 15 h à 80C. Le matériau obtenu est monté
. . , ; ; ~ :~
en colonne, puis lavé par du tampon citrate OjO5 M pH 6,8. Ilest ~acile de vérifier par rapport ~ des supports témoins (n'ay-ant pas eu d'agent couplant) qu'un fort pouroentage de lysine a été
couplé définitivement sur le support imprégné de DEhE Dextran, ; (les réactions colorées avec la ninhydrine sont utiles pour un tel bilan).
A l'aide de la colonne ainsi formée par le matériau recouvert de lysine il est possible de réaliser dans d'excellentes conditions la purification ou l'éIimination du plasminog~ne ou de la plasmine, protéine du sang ayant une grande affinité pour ia lysine~
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NaCl 0,1 M ou citrate de 0,05 M pH 6,8 on obtient généralement ~ -de~ concentrations finales en albumine de 10 ~ 20 % environ, l'élimination de l'alcool est totale, le rendement de l'opération est voisin de 100 %. Ce procédé est applicable pour toute `
protéine dont le point isoélectrique est inférieur ~ 6,5. Pour des protéines dont le point isoélectrique serait supérieur~ la méthode serait applicable à condition d'augmenter le pH du tampon de chromatographie. Enfin, il est évident que toute impureté
présente dans ces solutions prot~igues peut ainsi 8tre éliminée à condition qu'elle soit électriquement neutre ~glucides et polysaccharides) ou chargée positivement de la même manière ~ue le support (cations). Dans le cas d'impuretés chargées négative-ment, il peut y avoir compétition sur le support avec les protéinesnégatives que l'on cherche ~ fixer. Dans ce cas, si l'affinité
de l'impureté pour le support est plus ~aible que celle de la protéine et si la solution peut ~tre diluee suffisamment dans lleau pour obtenir une force ioni~ue compatible avec la fixation de la protéine sur le support~ il est alors possible d'éliminer m8me les anions. L'application suivante illustre une telle séparation.
EX_ Concentration et puri~ication de l'albumine dans une solution de caPrylate de sodium.
Des m~thodes de fractionnement extr~menent intéressantes utilisent le caprylate de sodium pour coaguler toutes les prot~ines l'exception de l'albumine uniqueme~t, qui reste donc en solution en présence de caprylate.
Exemple dlune solution contenant 15 g/l d~albumine et 3 g/l de caprylate. , Schéma d~un cycle sur 1 k~ de sup~ort (préparé selon les exemples 2 ou 3, dans le cas de l'~xemple 1 il faut doubler la quantité
de support nécessaire).
1) Equilibrage du support e~ tampon Phosphate 0901 M
pH 6 - Débit 200 ml/cm2/h.
2) Introduction de la solution d'albwmine et caprylate ajustée elle m~me ~ pH 6 (diluée dans l'eau dans le cas de ~orces ioni~ues trop élevées)~ Le débit moyen est de 100 ml/cm2/h.
Environ 8 1 de la solution peuvent être introduits sur la colonne. Il est aisé de constater la fixation et d'observar la sortie du caprylate de sodium en continu (odeur très marquée ; de ch~vre).
3) Lavage de la colonne par le tampon de chromatographie jusqu'~ ce que rien ne sorte plus de la colonne~
4) Elution de l'albumine selon la m8me méthode que dans les applications précédentes. On obtient une solution de 10 à
20 % d'albumine qui ramenée à 20 % contlent en final moins de 2,5 g/l de caprylate de sodium. La durée totale du cycle est de 4 heures environ.
Il est évident que cette méthode peut ~tre généralisée ~ la purification et concentration de diverses molécules biologi-ques chargées négativement à certains pH (acides nucléiques, protéines, polysaccharides anioniques, glycolipides anioniques).
Pour montr~r que cette générali~ation est possible et qu'une telle colonne supporte sans conséquence le passage de liquides de polarité tr~s diverses nous a~ons réalisé 1'application suivante.
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- - ~o~0~
Concentration_et ~urification de ~an~liosides ~ partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
Les gangliosides sont des glycolipides dont les bio-chimistes étudient actuellement le rôle physiologique ou patho-logique extr8mement important, qu'ils jouent au niveau des membra-nes cellulaires, comme récepteur et effecteur.. Ils contiennent plus ou moins d'acide sialique et à ce titre sont chargés négati-vement au-dessus de pH ~ environ.
A partir de 1 kg de cervelles de veau, il est possible d'obt~nir un extrait aqueux d'environ 7 1. (selon un procédé
décrit dans une publication de L. SVEMNERHOLM : Gangliosides, isolation. In: Methods in carbohydrate chemistry vol. 6 Edition R.L. Whister and J.N. BEMILLER Acad. Press New York 1972).
Cet extrait aqueux est passé directement sur une colonne de 50 g d'un support réalisé suivant l'exemple 3, préalablement équilibrée en tampon TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8. Le débit est de 200 ml/cm2/h. Tous les gangliosides s'accrochent sur la colonne dans ces conditions. Un lavage préalable par les solutions suivantes et dans 1'ordre indiqué:
TRIS-HCl 0,05 M pH 6,8 NaOH 0,1 N
Chloroforme - Methanol - eau en proportions volumétri-ques respectives ~uivantes ~30-60-25~ permet d'éliminer des impureté~ nombreuses.
L'élution des gangliosides sous forme concentrée et pur~fiée est alors réalis~e au m~me débit avec le mélange :
Chloro~orme - Méthanol - HCl 0,1 N en proportions volumétriques respectives (30-60-25).
Aussit8t l'élution, le pic recueilli est neutralisé
par addition de NaOH 0,1 N, évaporé et repris dans un syst~me chromatographique quelconque pour analyseO Le rendement est de 100 %. Il est remarquable de constater que la colonne peut, sans aucune conséquence nuisible, passer d'un solvant orga~ique une solution aqueuse et inversement. Ceci peut être le cas éché-ant exploité pour des nettoyages particuliers, ou pour maintsnir des conditions stériles dans la colonne.
. ,.
.~ .
~9~. ..
La capacité élevée de fixation de protéin~s révélée dans les applications précédentes peut ~tre mise ~ profi-t pour immobili-ser l'~natoxine tétanique sur une colonne de support minéral poreux. Par exemple 10 g de Sphérosil XOC 005 (surface spécifique 10 m2/g) sont imprégnés de DEAE Dextran suivant l'exemple l; et équilibrés en tampon phosphate 0,01 M pH 6,8. 25 ml d'anatoxine tétanique (de titre biologique voisin de 1500 Lf ou Unités floculantes) sont dilués ~ 250 ml dans ce même tampon et intro-duits sur la colonne en continu. Au début du passage la fixation de l'anatoxine tétanique est quantitative, aucune trace n'est décelable en sortie de colonne par les méthodes immunologiques appropriées jusqu'~ environ 200 ml d'éluat. Les 50 derniers ml sont introduits malgré tout pour 8tre certain d'avoir un rev~tement uniforme et complet d'anatoxine tétanique~ Puis la colonne est rinc~e par le tampon de chromatographie. Il e~t alors possible d'immobiliser d~finitivement l'anatoxine tétanique en la réticu-lant, de mani~re ~ ce qu'elle ne puisse être éluée dans une gamme de pH a~sez large (pH 2 ~ 12).
La réticulation se fa~t par circulation continue de 100 ml d'u~e solution de glutaraldéhyde ~ 095 % en tampon phosphate 0,01 M pH 6,8 pendant 2 heures ~ un débit de 40 ml/cm2/h environ et à la température du laboratoire.
Puis la colonne est rincée par plusieurs tampons, .
.. ...
~0~ 7 successiYement : ~ -Phosphate 0~01 M pH 6~8 , Glycocolle 092 M pH 8,2 Glycocclle 0,2 M pH 7~2 (aveC et sans NaCl 60 g/l) Citrate 0,05 M pH 2,8 Retour ~i~al et conservation en glycocolle 0~2 M pH 7j2.
La colonne est alors pr~te ~ l'emploi et peut permettre de faire de nombreux cycles identiques de puri~ication. Plusieurs ~izaines de cycles successifs ont ainsi été réalis~s sur la m8me colonne et conservant toutes les propriétés de celle-ci.
.~
1,5 litre d'une solution de gamma-globulines ou de séru~s ou de plasma~ ajustés aux concentrations suivantes:
Glycocolle 15 g/l NaCl pH 7,2 et titrant environ 5 U.I/ml en anticorps antit~taniques sontintro-duits dans la colonne ~ un débit de 40 ml/cm2/h,à la temperature du laboratoire. Moins de 5~ des anticorps antitétaniques sont décela-bles en sortie de colonne, par les méthodes immumologiques appropri-~es,alors que toutes les autres protéines traversent la colonne.
La colonne est ensuite rincée par le tampon gl~cocolle 0,2 M pH 7,2 contenant 60 g/l de NaCl, puis par le m8me tampon San8 NaCl ~usqu'~ ce quo l'~luat de colonnc n'absorbe plus la lumière ultraviolette ~ 280 nm de manière signi~icative~ Chaque tampon est a~pliqué environ 15 nm ~ un débit de 200 ml/cm2/h.
L'~lution des a~ticorps antit~tanique~ fixés sur la colonne d'anatoxine est alors réalisée par application du tampon citrate trisodique-acide citri~ue 0905 M pH 2,8 à 20C et ~ un débit de 40 ml/cm2/h.
L'éluat de colonne est récolté dans un récipient réfrigéré
et neutralisé immédiatement ~ pH 7 par addition continue de soude q normale commandée par un pH mètre enregistreur. Dès que le pic d'élution (lecture par absorption ~ 280 nm) est éluré, la colonne est rééquilibrée dans le tampon glycocolle de départ~ et un nouveau cycle peut immédiatement recommencer~ La solution d'anticorps antitétaniques pur$fiés peut 8tre concentrée par les moyens classi-ques (ultra~iltration, précipitation par le polyéthylaneglycol , l'alcool ou le sulfate d'ammo~ium). L'aotivité moyenne des solu-tions d'anticorps antitétaniques ainsi puri~iés est de 30 à 100 U.I./mg de protéine. Le rendement en anticorps antitétanique varie de 20 ~ 100 %.
En suivant rigoureusement le m8me procédé que celui décrit ~ l'exemple 9 il est possible d'immobiliser différents antig~nes ou anticorps tels que ceux qui ont été énumérés dans la description de la présente demande.
Pour certains antigènes dont le point iso~lectrique est supérieur à pH 6 il est préférable de réaliser l'étape de fixation sur la colonne en tampon phosphate 0901 M pH 8 au lieu de pH 6,8. Il peut meme 8tre pré~erable de remplacer les ions phosphates par des ions chlore en utilisant du chlorure de sodium ~ 0,01 à 0,05 M au m8me pH 8. Egalement une solution consisterait à
employer des échangeurs quaternaires selon l'invention ~ortement ionis~s à pH 8. C'est le cas notamment des protéines à activité `
anticorps de type b~ta 2, gamma 1 ou gamma 2 provenant des espèces animales courante~ (chèvre, mouton, lapin, cheval, cobaye, etc...) ou humaines. `
A 10 g de Spherosil XOB 015 imprégnés de DEAE Dextran suivant l'un quelcon~ue des exemples 1-2 ou 3, on a~oute 30 ml d'une solution de butane-diol-diglycidyl éther ~ 0,1 %, on é~apore ensuite le solvant pendant 30 minutes ~ 80C, et additionne en~in une solution de lysine dans l'eau à pH 11,5 (30 ml ~ 1 %). Le tout est alors porté 15 h à 80C. Le matériau obtenu est monté
. . , ; ; ~ :~
en colonne, puis lavé par du tampon citrate OjO5 M pH 6,8. Ilest ~acile de vérifier par rapport ~ des supports témoins (n'ay-ant pas eu d'agent couplant) qu'un fort pouroentage de lysine a été
couplé définitivement sur le support imprégné de DEhE Dextran, ; (les réactions colorées avec la ninhydrine sont utiles pour un tel bilan).
A l'aide de la colonne ainsi formée par le matériau recouvert de lysine il est possible de réaliser dans d'excellentes conditions la purification ou l'éIimination du plasminog~ne ou de la plasmine, protéine du sang ayant une grande affinité pour ia lysine~
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Claims (34)
1. Matériau utilisable comme échangeur d'anions pour fixer des macromolécules biologiques ou des substances à faibles poids moléculaires, caractérisé par le fait qu'il comprend un support constitué d'un oxyde minéral poreux ayant une surface interne inférieure ou égale à 100 m2/g et un diamètre poreux supérieur ou égal à 25 nm, ledit support étant revêtu directement sur sa surface par un polymère polysaccharidique aminé porteur de charges positives, ledit polymère ayant un poids moléculaire supérieur ou égal à 104 daltons.
2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'oxyde minéral poreux est de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane ou un dérivé synthétique ou naturel de ceux-ci.
3. Matériau selon les revendications 1 ou 2, caracté-risé par le fait que l'oxyde minéral poreux a une surface interne comprise entre 5 et 80 m2/g.
4. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le diamètre poreux du support est compris entre 50 et 1000 nm.
5. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support est de la silice poreuse ayant des surfaces internes de 10, 25 ou 50 m2/g.
6. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé a un poids molé-culaire compris entre 105 et 106 daltons.
7. Matériau selon les revendications 1 ou 6, caractérisé
par le fait que la fonction amine du polymère polysaccharidique est primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire.
par le fait que la fonction amine du polymère polysaccharidique est primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire.
8. Matériau selon les revendications 1 ou 6, caractérisé
par le fait que la fonction amine du polymère polysaccharidique est secondaire, tertiaire ou quaternaire.
par le fait que la fonction amine du polymère polysaccharidique est secondaire, tertiaire ou quaternaire.
9. Matériau selon les revendications 1 ou 6, caractérisé
par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est un dérivé, aminé synthétique ou naturel du dextran, de la cellulose, de l'agarose ou de l'amidon.
par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est un dérivé, aminé synthétique ou naturel du dextran, de la cellulose, de l'agarose ou de l'amidon.
10. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé répond à la formule générale:
dans laquelle: .
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'agarose, n est un nombre entier de 1 à 10, R1 et R2 identiques ou différents représentent les radicaux: -CH3, -CH2-CH3, -CH2OH, -CN2-CHOH ou -CH2-CHOH-CH3;
ledit composé étant, le cas échéant, quaternisé à l'aide d'un agent quaternisant.
dans laquelle: .
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'agarose, n est un nombre entier de 1 à 10, R1 et R2 identiques ou différents représentent les radicaux: -CH3, -CH2-CH3, -CH2OH, -CN2-CHOH ou -CH2-CHOH-CH3;
ledit composé étant, le cas échéant, quaternisé à l'aide d'un agent quaternisant.
11. Matériau selon la revendication 10, caractérisé par le fait que n est un nombre entier de 2 à 5.
12. Matériau selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'agent quaternisant est choisi dans le groupe que constituent les halogénures d'alkyle et d'hydroxyalkyle et le sulfate de diméthyle.
13. Matériau selon la revendication 10, caractérisé
par le fait que le dérivé polysaccharidique aminé est le diéthyl-aminoéthyldextran, le diéthylamino éthyl dextran quaternisé ou le diéthylaminoéthyl amidon.
par le fait que le dérivé polysaccharidique aminé est le diéthyl-aminoéthyldextran, le diéthylamino éthyl dextran quaternisé ou le diéthylaminoéthyl amidon.
14. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est réticulé à
l'aide d'un agent de réticulation.
l'aide d'un agent de réticulation.
15. Matériau selon la revendication 14, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est choisi dans le groupe que constituent le 1-4 butanedioldiglycidyléther, l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine et les diépoxydes de formule:
dans laquelle R1 est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, R2 et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone.
dans laquelle R1 est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, R2 et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone.
16. Matériau selon la revendication 15, caractérisé
par le fait que R1 est un alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone.
par le fait que R1 est un alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone.
17. Matériau selon les revendications 15 ou 16, carac-térisé par le fait que R2 et R3 représentent un radical alkylène inférieur.
18. Procédé de préparation d'un matériau tel que défini à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on introduit dans une colonne de chromatographie le support minéral poreux sous forme de poudre, que l'on fait passer un tampon de pH 3 à 12 jusqu'à équilibre, que l'on introduit en solution le polymère polysaccharidique aminé dans le même tampon et que l'on élue ensuite toujours avec le même tampon jusqu'à absence de polymère polysaccharidique aminé dans l'éluat.
19. Procédé de préparation d'un matériau tel que défini à la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on imprègne le support minéral poreux à l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé à un pH compris entre 3 et 12 et que l'on sèche ensuite à l'étuve entre 50 et 120°C jusqu'à poids constant.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait que la solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé
est comprise entre 1 et 10%.
est comprise entre 1 et 10%.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé par le fait que la solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé
est comprise entre 5 et 8%.
est comprise entre 5 et 8%.
22. Procédé selon les revendications 19, 20 ou 21, caractérisé par le fait qu'après séchage à l'étuve le matériau sec est traité à l'aide d'une solution d'un agent réticulant puis est à nouveau séché à une température d'environ 40 à 120°C.
23. Procédé selon les revendications 19, 20 ou 21, caractérisé par le fait qu'après séchage à l'étuve le matériau sec est traité à l'aide d'une solution d'un agent réticulant choisi parmi le 1,4-butanediol glycidyléther et l'épichlorhydrine, puis est à nouveau séché à une température d'environ 40 à 120°C.
24. Procédé de purification ou de séparation de macro-molécules biologiques, caractérisé par le fait que l'on fait passer sur un matériau tel que défini à la revendication 1 une solution contenant les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier, en réglant le pH et la molarité pour que ledit matériau fixe sélectivement soit les macromolécules biologiques que l'on désire purifier ou isoler, soit les impuretés non désirées.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé
par le fait que l'on purifie des gamma-globulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
par le fait que l'on purifie des gamma-globulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
26. Procédé selon la revendication 24, caractérisé
par le fait que l'on sépare l'hémoglobine par purification de l'albumine à partir du sang placentaire et concentre les autres protéines.
par le fait que l'on sépare l'hémoglobine par purification de l'albumine à partir du sang placentaire et concentre les autres protéines.
27. Procédé selon la revendication 24, caractérisé
par le fait que l'on concentre une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et élimine l'alcool.
par le fait que l'on concentre une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et élimine l'alcool.
28. procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'on concentre et purifie l'albumine dans une solution de caprylate de sodium.
29. Procédé selon la revendication 24, caractérisé par le fait que l'on concentre et purifie les gangliosides à partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
30. Procédé de fixation de substances macromoléculaires choisi parmi les antigènes, anticorps et enzymes, caractérisé
par le fait que l'on soumet lesdites substances à l'action d'un matériau tel que défini à la revendication 1.
par le fait que l'on soumet lesdites substances à l'action d'un matériau tel que défini à la revendication 1.
31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé par le fait que les substances sont fixées de façon irréversible par réticulation.
32. Procédé selon les revendications 30 ou 31, carac-térisé par le fait que l'on fixe de façon irréversible l'anatoxine tétanique par réticulation à l'aide de glutaraldéhyde.
33 Procédé de fixation de substances à faibles poids moléculaires, caractérisé par le fait que l'on soumet lesdites substances à l'action d'un matériau tel que défini à la reven-dication 1, en présence d'un agent couplant choisi parmi le glu-taraldéhyde et un diépoxyde de formule:
dans laquelle R1 est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, R2 et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone.
dans laquelle R1 est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, R2 et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone.
34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé
par le fait que lesdites substances sont choisies dans le groupe que constituent les amino-acides, ligands, stéroïdes et récepteurs cellulaires.
par le fait que lesdites substances sont choisies dans le groupe que constituent les amino-acides, ligands, stéroïdes et récepteurs cellulaires.
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