CH617863A5 - - Google Patents

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CH617863A5
CH617863A5 CH957576A CH957576A CH617863A5 CH 617863 A5 CH617863 A5 CH 617863A5 CH 957576 A CH957576 A CH 957576A CH 957576 A CH957576 A CH 957576A CH 617863 A5 CH617863 A5 CH 617863A5
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solution
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amino polysaccharide
purification
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CH957576A
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Jean-Louis Tayot
Michel Tardy
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Merieux Inst
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Description

La présente invention a pour objet un matériau à caractère cationique capable de fixer soit des macromolécules biologiques, soit des substances de faible poids moléculaire.
Jusqu'à présent, il n'a pas été possible de mettre au point des supports, pour la Chromatographie par échanges d'ions de tels types de molécules, présentant, d'une part, d'excellentes propriétés chimiques et, d'autre part, d'excellentes propriétés mécaniques.
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En effet, il a déjà été proposé de nombreux types de supports, parmi ceux-ci certains présentent de très bonnes propriétés chimiques et permettent ainsi des séparations sélectives mais possèdent par contre des propriétés mécaniques tout à fait médiocres.
Inversement, il a été également proposé des supports ayant de très bonnes qualités mécaniques notamment pour une utilisation préparative ou industrielle en colonne, mais il s'est avéré que ces supports possédaient des propriétés chimiques tout à fait insuffisantes vis-à-vis notamment des macromolécules biologiques, ces supports présentant des sites d'absorption irréversible.
Etant donné que les techniques modernes de séparation des macromolécules biologiques nécessitent à la fois l'utilisation de supports présentant, d'une part, une excellente activité chimique et, d'autre part, une grande résistance mécanique, la société titulaire, après d'importantes recherches, vient de constater qu'il était possible d'obtenir de tels résultats en utilisant un matériau d'un type particulier.
Ce matériau est caractérisé par le fait qu'il est constitué d'un oxyde minéral poreux ou de ses dérivés revêtu directement sur sa surface d'un polymère polysaccharidique aminé.
Les différents essais effectués par la société titulaire ont permis de montrer que ce type de matériau bénéficie de qualités mécaniques, physiques, chimiques et biologiques du support minéral poreux tout en ayant une nouvelle surface chimique particulièrement appropriée pour la séparation chromatographique des macromolécules biologiques.
Le support minéral poreux peut être de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane, ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que verres, silicates, kaolin, etc.
Le polymère polysaccharidique aminé est fixé sur le support minéral poreux par encollage, ce mécanisme d'adhésion ne semble pas uniquement de type électrostatique, car des supports poreux tels que l'alumine de surface non négative peuvent être également revêtus de polymère polysaccharidique aminé et conduire à des matériaux d'excellentes qualités.
Il s'ensuit que le revêtement de polymère polysaccharidique aminé est fixé de façon pratiquement irréversible sur le support. Toutefois, dans certaines conditions, qui seront décrites ci-après, il est possible, après un certain temps d'utilisation, de régénérer le support minéral poreux qui peut alors être réutilisé pour une nouvelle imprégnation à l'aide d'un polymère polysaccharidique aminé.
La surface interne du support minéral poreux est de préférence inférieure ou égale à 100 m2/g et si possible comprise entre 5 et 80 m2/g. Le diamètre poreux moyen est de préférence supérieur ou égal à 25 nm et si possible compris entre 50 et 1000 nm; des intervalles plus précis peuvent être conseillés suivant le type d'application envisagé. Pour des surfaces plus grandes ou des diamètres poreux faibles, la surface interne du support devient inaccessible au polymère polysaccharidique aminé et ultérieurement aux macromolécules à séparer. Selon un mode préféré de l'invention, le support poreux minéral est de la silice ou de l'alumine et de préférence un support de silice poreuse à caractère anionique obtenue par exemple selon les procédés décrits dans les brevets français N° 1473239, N° 1473240, N° 1475929 et N° 1482867. On utilise par exemple des silices poreuses commercialisées par Rhône-Poulenc Chimie Fine sous les dénominations de Sphérosils XOB 030, XOB 015 et XOC 005, ces silices ayant des surfaces respectives de 50,25 et 10 m2/g.
De préférence, le polymère polysaccharidique aminé, qui sert à imprégner et à recouvrir la surface interne du support poreux minéral, a un caractère cationique prononcé et de bonnes propriétés d'hy-drophilie. De préférence, son poids moléculaire est au moins égal à 104 daltons et si possible compris entre 105 et 10® daltons. Sa formule peut être quelconque et il peut en particulier être un dérivé aminé du dextrane, de l'amidon, de la cellulose, de l'agarose ou d'un polymère naturel ou synthétique de tous les oses connus à condition, bien entendu, qu'il ne comporte pas de groupements anioniques tels que carboxyliques ou sulfoniques en quantité appréciable de telle sorte que le polymère possède des charges électriques négatives importantes qui gêneraient lors de l'utilisation du support comme échangeur d'anions.
s Les fonctions aminés du polymère polysaccharidique peuvent être primaires, secondaires ou tertiaires ou éventuellement quaternaires. Les fonctions secondaires, tertiaires et quaternaires sont cependant préférables.
Selon un mode préférentiel, le polymère polysaccharidique io aminé correspond à la formule suivante:
.Ri
R (CH2)n-N
/ \
Ra dans laquelle:
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'agarose,
n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, Ri et R2, 20 identiques ou différents, représentent les radicaux suivants: —CH3; -CH2-CH3,CH2OH, -CH2-CH2OHou — CH2—CHOH—CH3, ce composé pouvant être quaternisé à l'aide d'un agent quaternisant classique tel que les halogénures et en particulier les iodures et bromures d'alkyle ou d'hydroxyalkyle, le 25 sulfate de diméthyle, etc.
Parmi ces composés de ce type, on peut en particulier citer les composés connus sous les dénominations de DEAE Dextran (diéthylaminoéthyldextran) de poids moléculaire 500000 et de QAE Dextran (diéthylaminoéthyldextran quaternisé) vendus par 30 la firme Pharmacia et le composé connu sous la dénomination de DEAE Amidon (diéthylaminoéthylamidon) ainsi que les amidons cationiques tels que ceux vendus sous la dénomination commerciale de Cato par la Société Roquette National.
Selon un autre mode préférentiel de l'invention, le polymère 35 polysaccharidique aminé peut être réticulé à l'aide d'un agent réticulant tel que le 1-4 butanedioldiglycidyléther ou l'épichlor-hydrine, l'épibromhydrine, un diépoxyde de formule:
Ri
I
40 CH2-CH-Ri-N-R3-CH-CH2
V V
dans laquelle:
Ri est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un 45 alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone, R2 et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone et de préférence un radical alkylène inférieur par exemple le diépoxyde de formule:
CH3 I
(CH2)3
CH2-CH-CH2-N-CH2- CH-CH2 \/
!S 0 0
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du matériau à caractère cationique caractérisé par le fait que l'on introduit dans une colonne de Chromatographie l'oxyde minéral poreux sous forme de poudre, que l'on fait passer un 60 tampon de PH 3 à 12 jusqu'à équilibre, que l'on introduit en solution le polymère polysaccharidique aminé dans le même tampon et que l'on élue ensuite toujours avec le même tampon jusqu'à absence de polymère polysaccharidique aminé dans l'éluat ou que l'on imprègne l'oxyde minéral poreux à l'aide d'une solution (>5 aqueuse de polymère polysaccharidique aminé à un pH compris entre 3 et 12 et que l'on sèche ensuite à l'étuve entre 50 et 120°C jusqu'à poids constant. L'absence dans l'éluat final de polymère polysaccharidique aminé peut être déterminée par électrophorèse
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en acétate de cellulose et coloration de la plaque au rouge ponceau ou encore par la précipitation en présence d'acide polyacrylique.
Le matériau ainsi obtenu permet de fixer de façon réversible environ 20 à 50 mg de protéines par gramme de support.
Ce matériau présente une grande stabilité dans une large gamme de pH (3 à 12 environ).
L'oxyde minéral poreux, après avoir été pesé, peut être alternativement imprégné à froid ou à chaud à l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé, à un pH compris indifféremment entre 3 et 12. On sèche ensuite à l'étuve entre 50 et 120° C et de préférence à 80° C jusqu'à ce que l'on obtienne un poids constant.
La poudre ainsi obtenue peut être alors homogénéisée et tamisée si cela se révèle nécessaire pour éliminer d'éventuels agglomérats. Le matériau ainsi obtenu peut être alors utilisé en colonne après lavage préalable à l'aide de solution tampon ou de citrate 0,05M pH 4 ou 0,05M pH 6,8 ; le matériau obtenu par cette méthode permet de fixer de façon réversible environ 40 à 200 mg de protéines par gramme de support.
On augmente ainsi de façon appréciable les capacités de fixation des protéines.
Il est d'autre part possible d'obtenir ainsi un matériau dont le revêtement de polymère polysaccharidique aminé est fixé de façon pratiquement irréversible.
En effet, ce matériau peut être lavé par de l'acide chlor-hydrique 0,1N, par de la soude ou par de l'ammoniaque 0,1N sans affecter ces propriétés d'échangeur d'anions, alors que, selon la méthode d'imprégnation en colonne, de tels lavages régénèrent l'oxyde minéral poreux initial. Si l'on souhaite régénérer l'oxyde minéral poreux des matériaux ainsi obtenus, il importe de traiter le matériau dans des conditions beaucoup plus énergiques, par exemple à l'aide d'acide nitrique fumant.
Il est ainsi possible d'utiliser le matériau selon l'invention pour de nombreuses opérations sans pour cela affecter ses excellentes propriétés d'échangeur d'anions.
Il est possible, après imprégnation selon l'une des méthodes décrites ci-dessus, et après avoir séché à l'étuve entre environ 50 et 80° C pour obtenir une poudre homogène, de traiter le produit obtenu à l'aide d'une solution d'un agent réticulant dans un solvant volatil tel que l'éther éthylique par exemple, comme agent réticulant on peut utiliser l'un quelconque de ceux précédemment mentionnés.
Dans ce cas, le produit à traiter est agité jusqu'à évaporation complète du solvant, cela de façon à obtenir une imprégnation régulière.
On porte ensuite à une température comprise entre 40 et 120° C de préférence voisine de 80° C, pendant environ 15 h. Après tamisage éventuel, le support est alors monté à sec en colonne, lavé par de la soude, puis par une solution de chlorure de sodium et enfin équilibré avec le tampon de Chromatographie souhaité.
Par cette réticulation, on obtient ainsi un matériau présentant d'excellentes qualités et qui peut être lavé de façon régulière par de la soude ou de l'ammoniaque 0,1N ou de l'acide chlorhydrique 0,1N, sans pour cela altérer soit ses qualités séparatrices, soit sa capacité de fixation réversible des protéines.
La capacité du matériau ainsi obtenu est comprise entre 40 et 200 mg de protéines par gramme de support. Pour des surfaces du support poreux initial allant de 10 à 80 m2/g, cette capacité est à peu près constante.
Il est également possible dans ce cas de laver le matériau à l'acide nitrique concentré de façon à régénérer l'oxyde minéral poreux servant de support.
L'invention a en outre pour objet ime utilisation des matériaux décrits pour la purification ou pour la séparation de macromolécules biologiques ou pour la fixation de substances de faible poids moléculaire.
On peut ainsi utiliser les propriétés cationiques du matériau, soit pour fixer sélectivement les macromolécules biologiques que l'on désire isoler ou purifier, soit pour retenir sélectivement les impuretés ou autres protéines non désirées.
La fixation sélective des protéines est facilement obtenue en réglant le pH et la molarité selon les méthodes bien connues d'utilisation des échangeurs d'ions.
D'une façon générale, cette utilisation est caractérisée par le fait que l'on fait passer sur ledit matériau une solution contenant les macromolécules biologiques ou une solution contenant les substances de faible poids moléculaire, en réglant le pH et la molarité pour que ledit matériau, soit fixe sélectivement les macromolécules biologiques ou les impuretés non désirées, soit fixe les substances de faible poids moléculaire.
Dans le cas où le matériau fixe les macromolécules que l'on désire purifier ou isoler, celles-ci sont ensuite éluées avec une solution de pH et de molarité convenables.
Dans le cas où le matériau fixe les impuretés, on recueille directement les macromolécules biologiques en solution. On élue ensuite avec une solution de pH et de molarité convenables pour éliminer les impuretés et régénérer ainsi le matériau pour une nouvelle opération.
Quelques utilisations selon l'invention sont mentionnées ci-après à titre d'illustration seulement:
a) Purification des gammaglobulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
b) Elimination de l'hémoglobine dans le procédé de purification de l'albumine à partir du sang placentaire et concentration des autres protéines.
c) Concentration d'une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et élimination de l'alcool.
d) Concentration et purification de l'albumine dans une solution de caprylate de sodium.
e) Concentration et purification de gangliosides à partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
Ces différentes applications du matériau selon l'invention seront décrites en détail dans les exemples de réalisation donnés ci-après.
Le matériau selon l'invention trouve également une application pour la purification d'anticorps ou d'antigènes. Dans ce cas, on immobilise sur le matériau selon l'invention des antigènes ou anticorps et on utilise le matériau ainsi modifié pour la purification et la concentration des anticorps et antigènes correspondants.
Ainsi il est possible d'immobiliser:
- l'albumine, les alpha-, bêta- et gammaglobulines humaines ou animales;
- tout antigène bactérien et viral pourvu que celui-ci possède des charges électriques négatives à pH 6,8. C'est le cas de la plupart des protéines, Polysaccharides et acides nucléiques connus.
A titre non limitatif, on peut par exemple également citer les toxines bactériennes, l'anatoxine tétanique, l'antigène HBS associé à l'hépatite B, le virus grippal, le virus de la rage, le virus de l'herpès, le virus de la rougeole, le virus de la rubéole, les adéno-virus, les papovavirus, les arbovirus, les rhinovirus, les Picornavirus, les entérovirus, les poxvirus, les myxovirus, les paranyxovirus, les réovirus, les Coronavirus, ou leurs produits de dégradation tels que leurs antigènes divers.
De même que les matériaux selon l'invention peuvent immobiliser des antigènes ou anticorps, ceux-ci peuvent également immobiliser divers anzymes conduisant à des matériaux d'activité enzymatique suivante: pepsine, trypsine, chrymotrypsine, plasmine, lacticodéshydrogénase, L-aminoacylase, invertase, glucose, isomérase, amyloglucosidase, glucose-oxydase, catalase, lipase, uréase.
Selon un mode de réalisation particulier, ces substances macromoléculaires immobilisées peuvent l'être de façon irréversible, si on réalise ultérieurement une réticulation à l'aide d'un agent réticulant tel que ceux énumérés ci-dessus.
Cette réticulation est en général effectuée à température ambiante.
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Enfin, les matériaux selon l'invention peuvent également être utilisés pour immobiliser des molécules de faible poids moléculaire telles que certains aminoacides ou certains ligands possédant des fonctions aminés, alcools ou thiols en présence d'un agent couplant tel que le glutaraldéhyde ou des composés diépoxy tels que ceux énumérés ci-dessus.
C'est ainsi qu'il est possible d'immobiliser par exemple de la lysine et le matériau obtenu peut être utilisé pour purifier ou éliminer le plasminogène ou la plasmine, protéine du sang ayant une affinité forte pour la lysine.
De même, il est possible d'immobiliser divers stéroïdes et utiliser de tels matériaux ainsi modifiés pour purifier leurs protéines de transport. Enfin, il est possible d'immobiliser divers récepteurs cellulaires, par exemple des gangliosides préalablement désacétylés, pour faire apparaître les fonctions aminées les plus réactives et utiliser ces matériaux pour l'élimination, la neutralisation ou la purification de leurs ligands.
On va maintenant donner à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif plusieurs exemples de préparation du matériau selon l'invention ainsi que plusieurs exemples d'application de ce matériau.
Exemple 1
10 g de Sphérosil XOC 005 sont mis en colonne de Chromatographie en versant directement la poudre sèche et homogène, ce qui facilite le montage de la colonne. 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique HCl 0,1N sont alors introduits dans la colonne,
grâce à une pompe péristaltique, à un débit de 500 ml/h, pour laver, imprégner la colonne et chasser toutes les bulles d'air (le sens d'élution ascendante est préférable). Un tampon de pH 3 à 12 est alors introduit dans la colonne (tampon Tris 0,05M pH 7 par exemple) jusqu'à équilibre, contrôlé par mesure du pH de la résisti-vité du tampon en sortie de colonne. Environ 150 ml d'une solution de DEAE Dextran à 1 % (ou 30 ml à 5%) dans le tampon précédent ou dans de l'eau ajustée à ce pH, sont alors introduits à un débit de 100 ml/h. Ensuite l'excès de DEAE Dextran non fixé sur la colonne est élué par le tampon précédent, puis par du citrate 0,05M pH 4 et du citrate 0,05M pH 8 à un débit de 1000 ml/h. Enfin la colonne est équilibrée dans le tampon de Chromatographie souhaité. L'absence de DEAE Dextran dans l'éluat final peut être déterminée par électrophorèse en acétate de cellulose et coloration de la plaque au rouge ponceau, ou par précipitation en présence d'acide polyacry-lique. Le support ainsi imprégné est stable dans une large gamme de pH (3 à 12 environ) et se comporte en échangeur d'anions, il est particulièrement adapté à la purification ou la concentration des protéines. Dans un système tampon adéquat, il est capable de fixer de manière réversible de 20 à 50 mg de protéines par gramme de support imprégné.
Dans cet exemple, le DEAE Dextran peut être avantageusement remplacé par le QAE Dextran.
Exemple 2
10 g de Sphérosil XOB 015 sont pesés et imprégnés de 20 ml d'une solution aqueuse de Polysaccharide aminé (DEAE Dextran par exemple) à une concentration comprise entre 1 et 10%, de préférence comprise entre 5 et 8%, et à un pH compris entre 3 et 12. L'ensemble est séché à l'étuve entre 50 et 120° C, mais de préférence à 80°C pendant le temps nécessaire (15 h par exemple) pour avoir un poids constant (élimination de l'eau). La poudre obtenue est homogénéisée et tamisée si nécessaire pour éliminer d'éventuels agglomérats, puis montée en colonne.
Après remplissage d'une colonne et lavages préalables par les tampons HCl 0,1N, ou citrate 0,05M pH 4, ou citrate 0,05M pH 6,8 ou NaOH 0,1N, la colonne est équilibrée dans le tampon adéquat pour le type de Chromatographie recherchée. La capacité de fixation des protéines est cette fois plus élevée, elle est de l'ordre de 40 à 200 mg/g en fonction des conditions de Chromatographie.
Dans cet exemple, le DEAE Dextran peut être avantageusement remplacé par un autre polymère polysaccharidique aminé tel que le DEAE Amidon.
Exemple 3
A 10 g de Sphérosil XOB 030 imprégnés selon l'une des deux méthodes précédentes, par une solution de Polysaccharide aminé de pH compris entre 8 et 13, mais de préférence égal à 11,5, puis séchée à l'étuve pour obtenir une poudre homogène, sont additionnés 20 ml d'une solution de 1-4 butanedioldiglycidyléther de 0,02% à2% dans l'éther éthylique, mais de préférence égale à0,15%. L'ensemble est agité en continu à une température de 40° C,
jusqu'à évaporation complète de l'éther éthylique et pour obtenir une imprégnation régulière par ce composé diépoxy servant d'agent réticulant.
L'ensemble est ensuite porté à une température comprise entre 40 et 120° C, de préférence voisine de 80° C, pendant 15 h environ. Après tamisage éventuel, le support est alors monté à sec en colonne, lavé par 11 de soude 0,IN puis 1 IdeNaCl 1M et enfin équilibré avec le tampon de Chromatographie.
La capacité de fixation des protéines est comprise entre 40 et 200 mg par gramme de support en fonction des conditions de Chromatographie. Pour des surfaces du support poreux initial allant de 10 à 80 m2/g, cette capacité est à peu près constante.
Exemple 4 :
Purification directe des gammaglobulines à partir de sérums ou plasma humains ou animaux.
Schéma d'un cycle sur 50 g de support préparé selon les exemples 1, 2 ou 3
- Equilibrage de la colonne à pH 6,8 par exemple (entre 6,3 et 8) (tampon po4 0,01 à 0,02M ou tampon Tris-HCl 0,05M ou NaCl
1 à 3 g/1), à un débit de 200 ml/cm2/h.
- Introduction de 50 ml de plasma ou sérum préalablement dialysé contre le tampon de Chromatographie et filtré pour éliminer toute possibilité de colmatage. (Débit moyen 50 à 100 ml/cm2/h.) Pour un support préparé suivant l'exemple 1, la quantité de sérum ou de plasma par cycle doit être ramenée à 25 ml.
- Lavage de la colonne par le tampon de Chromatographie.
- Collection du pic de sortie constitué de gammaglobulines pures en immunoélectrophorèse, avec un rendement compris entre 50 et 100% suivant les tampons utilisés. Le rendement est meilleur pour les pH plus bas que pH 6,8 ou les forces ioniques les plus fortes, mais la pureté risque alors d'être moins bonne. Une telle préparation de gammaglobulines est débarrassée des substances pyrogènes et de l'antigène associé à l'hépatite B (AgHBs) éventuellement présents dans la matière brute de départ.
- Elution des autres protéines retenues sur la colonne par un tampon quelconque de pH 4 ou par le tampon de Chromatographie additionné de 10 à 60 g/1 de NaCl, ou enfin par un tampon citrate 0,05M de pH 4 à 8. La durée de ce cycle est d'environ 2 h; un nouveau cycle peut alors être immédiatement entrepris, si bien qu'avec un automatisme assez simple, une dizaine de cycles peuvent être réalisés dans la même journée, soit un débit de traitement voisin de 101 de sérum ou de plasma par kilogramme d'oxyde minéral poreux et par jour.
Exemple 5 :
Elimination de l'hémoglobine dans le procédé de purification de l'albumine à partir du sang placentaire et concentration des autres protéines
Le fractionnement du sang placentaire par l'alcool selon la méthode de Cohn passe par une étape de précipitation du bloc de globulines à pH 6,8 et 20 à 25% d'éthanol. Dans ces conditions, l'albumine, certaines alpha-1-, alpha-2-globulines et l'hémoglobine pour l'essentiel restent en solution dans le surnageant. Celui-ci est recueilli par centrifugation au froid, dilué dans un volume égal d'eau distillée (pour diminuer la concentration en alcool), ajusté à
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un pH compris entre 6 et 7 et clarifié par filtration sur membranes d'esters de cellulose.
Schéma d'un cycle de purification sur 50 g de support
(100 g de support sont nécessaires s'il s'agit de celui obtenu selon l'exemple 1.)
- Equilibrage de la colonne en tampon PO4 0,01M ou Tris-HCl 0,05M pH 6 à 7 (6,5 de préférence) à un débit de 200 ml/cm2/h.
- Introduction, à un débit moyen de 100 ml/cm2/h, de 1000 ml de la solution à purifier précédente.
- Lavage de la colonne par le tampon de Chromatographie au même débit. L'hémoglobine purifiée sort de la colonne avec un facteur de dilution négligeable alors que les autres protéines, dont l'albumine, restent fixées sur la colonne.
- Elution des protéines fixées sur la colonne dans des conditions identiques à l'exemple 4; le pic contient les protéines concentrées et pratiquement débarrassées d'hémoglobine.
- La durée de ce cycle est d'environ 4 h, un nouveau cycle peut alors être immédiatement entrepris.
Exemple 6:
Concentration d'une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et élimination de l'alcool
Le fractionnement des protéines, selon la méthode de Cohn, entraîne inévitablement, lors de diverses étapes, des redissolutions de précipités alcooliques. Pour cela, il est préférable de diluer fortement le précipité pour diminuer la concentration en alcool résiduel qui gênerait. Ensuite, il y a donc nécessité, d'une part, d'éliminer la présence d'alcool, d'autre part, de concentrer les protéines présentes. Cela est généralement effectué par concentration sous vide, lyophilisation ou dialyse, ces deux dernières étapes étant ou très onéreuses ou source de substances pyrogènes, on propose le procédé suivant extrêmement commode, rapide et économique.
Exemple d'une solution d'albumine à 2% contenant 10% d'alcool.
Schéma d'un cycle de purification et concentration sur 1 kg de support (préparé selon les exemples 1,2 ou 3 ; dans le cas de l'exemple 1, il y a lieu de doubler la quantité de support nécessaire); sa durée est de l'ordre de 4 h.
1) Equilibrage du support en tampon phosphate 0,01M pH 7. Débit 200 ml/cm2/h.
2) Introduction de la solution alcoolique d'albumine ajustée à pH 7 par addition de HCl ou NaOH selon le pH initial. Débit moyen 100 ml/cm2/h.
Il est ainsi possible de fixer 200 g d'albumine sur cette colonne (soit 101 de la solution/cycle); si l'albumine se fixe mal sur la colonne, il suffit de diluer davantage la solution initiale dans l'eau distillée de manière à baisser la force ionique du milieu.
3) Lavage par de l'eau distillée. Débit 200 ml/cm2/h. Vérification que l'albumine ne sort pas, mais que par contre l'alcool termine de sortir.
4) Elution de l'albumine dans un des tampons suivants :
NaCl 0,1M ou citrate 0,05M pH 6,8; on obtient généralement des concentrations finales en albumine de 10 à 20% environ; l'élimination de l'alcool est totale; le rendement de l'opération est voisin de 100%. Ce procédé est applicable pour toute protéine dont le point isoélectrique est inférieur à 6,5. Pour des protéines dont le point isoélectrique serait supérieur, la méthode serait applicable à condition d'augmenter le pH du tampon de Chromatographie. Enfin, il est évident que toute impureté présente dans ces solutions protéiques peut ainsi être éliminée à condition qu'elle soit électriquement neutre (glucides et Polysaccharides) ou chargée positivement de la même manière que le support (cations). Dans le cas d'impuretés chargées négativement, il peut y avoir compétition sur le support avec les protéines négatives que l'on cherche à fixer. Dans ce cas, si l'affinité de l'impureté pour le support est plus faible que celle de la protéine et si la solution peut être diluée suffisamment dans l'eau pour obtenir une force ionique compatible avec la fixation de la protéine sur le support, il est alors possible d'éliminer même les anions. L'application suivante illustre une telle séparation.
Exemple 7;
Concentration et purification de l'albumine dans une solution de caprylate de sodium
Des méthodes de fractionnement extrêmement intéressantes utilisent le caprylate de sodium pour coaguler toutes les protéines à l'exception de l'albumine, uniquement, qui reste donc en solution en présence de caprylate.
Exemple d'une solution contenant 15 g/l d'albumine et 3 g/l de caprylate:
Schéma d'un cycle sur 1 kg de support (préparé selon l'exemple 1, 2 ou 3 ; dans le cas de l'exemple 1 il faut doubler la quantité de support nécessaire).
1) Equilibrage du support en tampon phosphate 0,01M pH 6. Débit 200 ml/cm2/h.
2) Introduction de la solution d'albumine et caprylate, ajustée elle-même à pH 6 (diluée dans l'eau dans le cas de forces ioniques trop élevées). Le débit moyen est de 100 ml/cm2/h.
Environ 81 de la solution peuvent être introduits sur la colonne. Il est aisé de constater la fixation et d'observer la sortie du caprylate de sodium en continu (odeur très marquée de chèvre).
3) Lavage de la colonne par le tampon de Chromatographie jusqu'à ce que plus rien ne sorte de la colonne.
4) Elution de l'albumine selon la même méthode que dans les applications précédentes. On obtient une solution de 10 à 20% d'albumine qui, ramenée à 20%, contient moins de 2,5 g/l de caprylate de sodium. La durée totale du cycle est de 4 h environ.
Il est évident que cette méthode peut être généralisée à la purification et concentration de diverses molécules biologiques chargées négativement à certains pH (acide nucléique, protéines, Polysaccharides anioniques, glycolipides anioniques). Pour montrer que cette généralisation est possible et qu'une telle colonne supporte sans conséquence le passage de liquides de polarité très diverse, nous avons réalisé l'application suivante.
Exemple 8:
Concentration et purification de gangliosides à partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux
Les gangliosides sont des glycolipides dont les biochimistes étudient actuellement le rôle physiologique ou pathologique extrêmement important, qu'ils jouent au niveau des membranes cellulaires, comme récepteur et effecteur. Ils contiennent plus ou moins d'acide sialique et à ce titre sont chargés négativement au-dessus de pH 3 environ.
A partir de 1 kg de cervelles de veau, il est possible d'obtenir un extrait aqueux d'environ 71. (Selon un procédé décrit dans une publication de L. Svennerholm: «Gangliosides, isolation», in «Méthods in carbohydrate chemistry», vol. 6, édition R.L.
Whister et J.N. Bemiller, Acad. Press, New York, 1972.)
Cet extrait aqueux est passé directement sur une colonne de 50 g d'un support réalisé suivant l'exemple 3, préalablement équilibrée en tampon Tris-HCl 0,05M pH 6,8. Le débit est de 200 ml/cm2/h. Tous les gangliosides s'accrochent sur la colonne dans ces conditions. Un lavage préalable par les solutions suivantes et dans l'ordre indiqué:
Tris-HCl 0,05M pH6,8 NaOH 0,IN
h2o
Chloroforme/Méthanol/eau en proportions volumétriques respectives suivantes (30/60/25)
permet d'éliminer des impuretés nombreuses.
L'élution des gangliosides sous forme concentrée et purifiée est alors réalisée au même débit avec le mélange chloroforme/
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méthanol/HCl 0,1N en proportions volumétriques respectives (30/60/25).
Aussitôt après l'élution, le pic recueilli est neutralisé par addition de NaOH 0,1N, évaporé et repris dans un système chromato-graphique quelconque pour analyse. Le rendement est de 100%. Il est remarquable de constater que la colonne peut, sans aucune conséquence nuisible, passer d'un solvant organique à une solution aqueuse et inversement.
Cela peut être, le cas échéant, exploité pour des nettoyages particuliers ou pour maintenir des conditions stériles dans la colonne.
Exemple 9:
Utilisation du matériau selon l'invention comme support d'anatoxine tétanique pour purifier et concentrer des anticorps antitétaniques
La capacité élevée de fixation de protéines, révélée dans les applications précédentes, peut être mise à profit pour immobiliser l'anatoxine tétanique sur une colonne de support minéral poreux. Par exemple, 10 g de Sphérosil XOC 005 (surface spécifique 10 m2/g) sont imprégnés de DEAE Dextran suivant l'exemple 1, et équilibrés en tampon phosphate 0,01M pH 6,8.25 ml d'anatoxine tétanique (de titre biologique voisin de 1500 lf ou unités floculantes) sont dilués à 250 ml dans ce même tampon et introduits sur la colonne en continu. Au début du passage, la fixation de l'anatoxine tétanique est quantitative, aucune trace n'est décelable, en sortie de colonne, par les méthodes immunologiques appropriées jusqu'à environ 200 ml d'éluat. Les 50 derniers millilitres sont introduits malgré tout pour qu'on soit certain d'avoir un revêtement uniforme et complet d'anatoxine tétanique. Puis la colonne est rincée par le tampon de Chromatographie. Il est alors possible d'immobiliser définitivement l'anatoxine tétanique en la réticulant, de manière qu'elle ne puisse être éluée dans une gamme de pH assez large (pH 2 à 12).
La réticulation se fait par circulation continue de 100 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 0,5% en tampon phosphate 0,01M pH 6,8 pendant 2 h à un débit de 40 ml/cm2/h environ et à la température du laboratoire.
Puis la colonne est rincée par plusieurs tampons, successivement:
Phosphate 0,01M pH 6,8 Glycocolle 0,2M pH 8,2
Glycocolle 0,2M pH 7,2 (avec et sans NaCl 60 g/l)
Citrate 0,05M pH 2,8
Retour final et conservation en glycocolle 0,2M pH 7,2. La colonne est alors prête à l'emploi et peut permettre de faire de nombreux cycles identiques de purification. Plusieurs dizaines de cycles successifs ont été ainsi réalisés sur la même colonne et conservent toutes les propriétés de celle-ci.
Schéma d'un cycle de purification pour cette colonne de 10 g
1,51 d'une solution de gammaglobulines ou de sérums ou de plasma, ajustés aux concentrations suivantes:
Glycocolle 15 g/l NaCl pH 7,2
et titrant environ 5 U.I./ml en anticorps antitétaniques est introduit dans la colonne à un débit de 40 ml/cm2/h, à la température du
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laboratoire. Moins de 5% des anticorps antitétaniques sont décelables en sortie de colonne, par les méthodes immunologiques appropriées, alors que toutes les autres protéines traversent la colonne.
La colonne est ensuite rincée par le tampon glycocolle 0,2M pH 7,2 contenant 60 g/l de NaCl, puis par le même tampon sans NaCl jusqu'à ce que l'éluat de colonne n'absorbe plus la lumière ultraviolette à 280 nm de manière significative. Chaque tampon est appliqué environ 15 mn à un débit de 200 ml/cm2/h.
L'élution des anticorps antitétaniques fixés sur la colonne d'anatoxine est alors réalisée par application du tampon citrate trisodique/acide citrique 0,05M pH 2,8.à 20° C et à un débit de 40 ml/cm2/h.
L'éluat de colonne est récolté dans un récipient réfrigéré et neutralisé immédiatement à pH 7 par addition continue de soude normale commandée par un pH-mètre enregistreur. Dès que le pic d'élution (lecture par absorption à 280 nm) est élué, la colonne est rééquilibrée dans le tampon glycocolle de départ, et un nouveau cycle peut immédiatement recommencer. La solution d'anticorps antitétaniques purifiés peut être concentrée par les moyens classiques (ultrafiltration, précipitation par le polyéthylèneglycol, l'alcool ou le sulfate d'ammonium). L'activité moyenne des solutions d'anticorps antitétaniques ainsi purifiés est de 30 à 100 U.I./mg de protéine. Le rendement en anticorps antitétaniques varie de 20 à 100%.
En suivant rigoureusement le même procédé que celui décrit à l'exemple 9, il est possible d'immobiliser différents antigènes ou anticorps tels que ceux qui ont été énumérés dans la description de la présente demande.
Pour certains antigènes dont le point isoélectrique est supérieur à pH 6, il est préférable de réaliser l'étape de fixation sur la colonne en tampon phosphate 0,01M pH 8 au lieu de pH 6,8. Il peut même être préférable de remplacer les ions phosphates par des ions chlore en utilisant du chlorure de sodium 0,01 à 0,05M au même pH 8. Une autre solution consisterait à employer des échangeurs quaternaires selon l'invention, fortement ionisés à pH 8. C'est le cas notamment des protéines à activité anticorps de type bêta-2-, gamma-1- ou gamma-2 provenant des espèces animales courantes (chèvre, mouton, lapin, cheval, cobaye, etc.) ou humaines.
Exemple 10
A 10 g de Sphérosil XOB 015 imprégnés de DEAE Dextran suivant l'un quelconque des exemples 1,2 ou 3, on ajoute 30 ml d'une solution de butanedioldiglycidyléther à 0,1 % ; on évapore ensuite le solvant pendant 30 mn à 80° C, et additionne enfin une solution de lysine dans l'eau à pH 11,5 (30 ml à 1 %). Le tout est alors porté 15 h à 80° C. Le matériau obtenu est monté en colonne, puis lavé par du tampon citrate 0,05M pH 6,8. Il est facile de vérifier par rapport à des supports témoins (n'ayant pas eu d'agent couplant) qu'un fort pourcentage de lysine a été couplé définitivement sur le support imprégné de DEAE Dextran (les réactions colorées avec la ninhydrine sont utiles pour un tel bilan).
A l'aide de la colonne ainsi formée par le matériau recouvert de lysine, il est possible de réaliser dans d'excellentes conditions la purification ou l'élimination du plasminogène ou de la plasmine, protéine du sang ayant une grande affinité pour la lysine.
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Claims (22)

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1. Matériau à caractère cationique capable de fixer soit des macromolécules biologiques, soit des substances de faible poids moléculaire, caractérisé par le fait qu'il est constitué d'un oxyde minéral poreux ou de ses dérivés revêtu directement sur sa surface d'un polymère polysaccharidique aminé.
2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'oxyde minéral poreux est de la silice, de l'alumine, de la magnésie, un oxyde de titane ou leurs dérivés synthétiques ou naturels tels que verres, silicates, kaolin.
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revendications
3. Matériau selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'oxyde minéral poreux a une surface interne inférieure ou égale à 100 m2/g, comprise entre 5 et 80 m2/g.
4. Matériau selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le diamètre poreux de l'oxyde minéral est supérieur ou égal à 25 nm et de préférence compris entre 50 et 1000 nm.
5. Matériau selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'oxyde minéral poreux est de la silice poreuse ayant des surfaces internes de 10,25 ou 50 m2/g.
6. Matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est soluble dans l'eau et a un poids moléculaire supérieur ou égal à 104 daltons et de préférence compris entre IO5 et 106 daltons.
7. Matériau selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisé par le fait que la fonction amine du polymère polysaccharidique est primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire, mais de préférence secondaire, tertiaire ou quaternaire.
8. Matériau selon l'une des revendications 1,6 ou 7, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est un dérivé aminé synthétique ou naturel du dextran, de la cellulose, de l'agarose ou de l'amidon.
9. Matériau selon l'une des revendications 1 ou 6 à 8, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé a de préférence de formule générale suivante:
ri r (ch2)n-n^
rz dans laquelle:
R représente un reste de dextrane, d'amidon, de cellulose ou d'agarose,
n est un nombre entier de 1 à 10 et de préférence de 2 à 5, Rj et R2, identiques ou différents, représentent les radicaux :
-ch3; -ch2-ch3, -ch2oh, -ch2-ch2ohou
-ch2-choh-ch3
ledit composé pouvant être quaternisé.
10. Matériau selon la revendication 9, caractérisé par le fait que le dérivé polysaccharidique aminé est le diéthylaminoéthyldextran, le diéthylaminoéthyldextran quaternisé, le diéthylaminoéthyl-amidon.
11. Matériau selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que le polymère polysaccharidique aminé est réticulé à l'aide de 1-4 butanedioldiglycidyléther, d'épichlorhydrine, d'épi-bromhydrine ou d'un époxyde de formule:
R
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ch2—ch-rs-n—r3 —ch—ch2
V
o o dans laquelle:
R4 est un alkyle de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence un alkyle inférieur de 1 à 4 atomes de carbone,
Rs et R3 représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 10 atomes de carbone et de préférence un radical alkylène inférieur.
12. Procédé de préparation du matériau selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on introduit dans une colonne de Chromatographie l'oxyde minéral poreux ou son dérivé sous forme de poudre, que l'on fait passer un tampon de pH 3 à 12 jusqu'à équilibre, que l'on introduit en solution le polymère polysaccharidique aminé dans le même tampon et que l'on élue ensuite toujours avec le même tampon jusqu'à absence de polymère polysaccharidique aminé dans l'éluat ou que l'on imprègne l'oxyde minéral poreux ou son dérivé à l'aide d'une solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé à un pH compris entre 3 et 12 et que l'on sèche ensuite à l'étuve entre 50 et 120° C jusqu'à poids constant.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la solution aqueuse de polymère polysaccharidique aminé est comprise entre 1 et 10%, de préférence entre 5 et 8%.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé par le fait qu'après séchage à l'étuve le matériau sec est traité à l'aide d'une solution de 1-4 butanediolglycidyléther ou d'épichlorhydrine puis est à nouveau séché à une température de
40 à 120° C.
15. Utilisation des matériaux selon la revendication 1 pour la purification, soit pour la séparation de macromolécules biologiques, soit pour la fixation de substances de faible poids moléculaire, caractérisée par le fait que l'on fait passer sur ledit matériau une solution contenant les macromolécules biologiques ou une solution contenant les substances de faible poids moléculaire, en réglant le pH et la molarité pour que ledit matériau, soit fixe sélectivement les macromolécules biologiques ou les impuretés non désirées,
soit fixe les substances de faible poid moléculaire.
16. Utilisation selon la revendication 15 pour la purification des gammaglobulines à partir de sérums ou de plasmas humains ou animaux.
17. Utilisation selon la revendication 15, pour la séparation de l'hémoglobuline dans le procédé de purification de l'albumine à partir de sang placentaire et concentration des autres protéines.
18. Utilisation selon la revendication 15, pour la concentration d'une solution de protéines diluées en milieu alcoolique et élimination de l'alcool.
19. Utilisation selon la revendication 15 pour la concentration et la purification de l'albumine dans une solution de caprilate de sodium.
20. Utilisation selon la revendication 15 pour la concentration et la purification de gangliosides à partir d'extraits aqueux de cerveaux d'animaux.
21. Utilisation selon la revendication 15 pour la fixation d'antigènes, d'anticorps ou d'enzymes.
22. Utilisation selon la revendication 15 pour la fixation d'aminoacides, de ligands, de stéroïdes ou de glangliosides par réticulation à l'aide de glutaraldéhyde ou d'un diépoxyde de formule:
R4
I
CH2-CH-R5-N-R3-CH-CH2
V
R4, R5 et R3 ayant les mêmes significations que celles données dans la revendication 11.
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