DK148797B - Fremgangsmaade til fremstilling af en stabil kultur af en mikroorganisme af slaegten lactobacillus - Google Patents

Description

i 148797

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en stabil kultur af en mikroorganisme af slægten Lactobacillus,/'der udviser mindst ét eks-trachromosomalt genetisk element, der dels stimulerer 5 dens evne til at producere mælkesyre ud fra lactose, og dels kontrollerer dens evne til at metabolisere N-acetyl-D-glucosamin.

Et vigtigt problem inden for mælkeproduktindustrien, såsom ved oste og yogurthprodukter, ligger i install] bilitet af de mikroorganismestammer, der er udviklet til og anvendes ved fabrikationen af disse produkter, navnlig de mikroorganismer, der producerer mælkesyre ud fra lactose, for eksempel arterne af slægten Lactobacillus.

Det er i virkeligheden kendt, at de såkaldte mælkesyre-15 mikroorganismers evne til at producere mælkesyre ud fra lactose, hvilket i det følgende også betegnes "aktivitet" eller "kapacitet til mælkesyreproduktion", kan aftage med tiden.

Nogle specialister har studeret mekanismen ved 20 mælkesyreproduktion ud fra et genetisk standpunkt. Det vides derfor nu, at et plasmid er ansvarligt for fermenteringen af lactose ved hjælp af Streptococcus lactis, og at plasmider kan være impliceret i metabolismen af lactose af visse Lactobacilli.

25 Plasmiderne er ekstrachromosomale genetiske ele menter, der foreligger i form af et cirkulært molekyle af desoxyribonucleinsyre (DNA), hvis vægt svarer til nogle promille eller nogle gange ti promille af mikroorganismens chromosomvægt.

30 2 148797

Med mindre et plasmid er fuldstændigt ansvarligt for fermenteringen af lactose ved hjælp af en mikroorganisme, for hvilket tilfælde det er tilstrækkeligt at dyrke mikroorganismen i mælk for at bevare dens aktivitet, 5 er det imidlertid så at sige ikke muligt i industrien at drage nytte af den aktuelle viden, hvad angår stabiliteten af mælkesyremikroorganismernes aktivitet.

Det vides også, at forskellige stammer af samme art mikroorganisme kan afvige betydeligt, hvad angår deres 10 kapacitet til mælkesyreproduktion. Dette gælder navnlig mikroorganismen Lactobacillus helveticus understamme jugurti. Denne mikroorganisme anvendes ved fabrikationen .. af gruyere, emmenthaler og parmesan. Det ville med andre ord være langt mere end en akademisk bedrift at finde en 15 løsning på denne forskelligartethed og at kunne garantere en maksimal aktivitet hos hver stamme.

Den foreliggende opfindelse giver en løsning på dette problem.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er karakteriseret 20 ved, at mikroorganismen dyrkes i et næringsmedium, hvis hovedkilde for assimilerbart carbon består af N-acetyl-D-glucosamin.

Ved udtrykket "hovedkilde for assimilerbart carbon" forstås her den afgørende kilde, uden hvilken mikroorga-25 nismen ikke ville kunne udvikle sig, hvilket ikke udelukker tilstedeværelsen af andre "mindre" kilder, der vil blive sat til mediet sammen med en kilde for oligoelemen-ter og vitaminer, såsom en gærekstrakt.

Det er, under et grundigt sammenlignende studium af 30 egenskaberne af to stammer af samme art af Lactobacillus, nemlig Lactobacillus helveticus underart jugurti, hvoraf den ene havde en tydeligt større kapacitet for mælkesyreproduktion end den anden, konstateret, at denne stærke kapacitet skyldtes tilstedeværelsen af et plasmid på 35 13,17 kilobaser (kb). Dette plasmid var fraværende hos stammen med ringe kapacitet. Det er konstateret, at dette plasmid ikke kontrollerer stammens evne til at producere 3 148797 mælkesyre ud fra lactose, men at det stimulerer denne evne, at det med andre ord kontrollerer en faktor, der stimulerer produktionen af mælkesyre, hvilken produktion, hvad enten den er stimuleret eller ej og er svag eller 5 stærk, kontrolleres af gener beliggende på chromosomet.

Det er endvidere konstateret, at dette samme plasmid fuldstændigt kontrollerer mikroorganismens evne til at metabolisere N-acetyl-D-glucosamin. Man har således påvist årsagen til, at de to stammer af samme art ikke har 10 samme kapacitet til nedbrydning af mælkesyre, og således fundet et for industrien meget anvendeligt middel til at dyrke og bevare stabile stammer med stærk aktivitet af disse mikroorganismer.

Plasmiderne er tilbøjelige til at blive mistet un-15 der celledelingen. Dels er replikationen af chromosomerne ikke nødvendigvis ledsaget af replikation af plasmiderne, og dels er de fra replikationer stammende plasmider ikke nødvendigvis fordelt i samme mængder i de celler, der stammer fra celledelinger. Hvis imidlertid cellerne dyr-20 kes på et medium, hvis carbonkilde kun kan udnyttes takket være plasmid, vil de celler, der er uden plasmider, ikke være levedygtige, og de vil forsvinde til fordel for cellerne med plasmid.

Udøvelsen af den foreliggende fremgangsmåde indebæ-25 rer således anvendelse af en mikroorganisme af slægten Lactobacillus, der udviser mindst ét ekstrachromosomalt genetisk element, med andre ord mindst ét plasmid, der dels stimulerer dens evne til at producere mælkesyre ud fra lactose og dels kontrollerer dens evne til at metabo-30 lisere N-acetyl-D-glucosamin. Mikroorganismen er fortrinsvis Lactobacillus helveticus af underarten jugurti S 36-2, der kan fås fra det agronomisk-mikrobiologiske institut ved universitetet i Bologne, Italien.

Mikroorganismen kan bevares eller konserveres ved 35 hver måned at overføre den til et vandigt medium med et tørstofindhold på 5-10 vægtprocent indeholdende en passende kilde for assimilerbart nitrogen, salte, oligoele- 4 148797 menter: og vitaminer tillige med N-acetyl-D-glucosamin som hovedkilde for assimilerbart carbon, hvilket medium forud for overføringen er steriliseret, for eksempel ved opvarmning i autoklav i 30 minutter ved 115°C. Det til-5 såede medium kan inkuberes ved en temperatur, der er gunstig for mikroorganismens vækst, f.eks. 40-42°C, indtil dets optiske tæthed svarer til for eksempel den logaritmiske halvvækst. Det kan mellem overføringerne holdes ved en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til, at mi-10 kroorganismen ikke formerer sig, for eksempel 5-10°C.

Når der ønskes produceret en mikroorganismemængde, der er nødvendig for en industriel fabrikation af for eksempel ost eller yogurth, kan man gå ud fra ovennævnte kulturer., dyrke dem og overføre dem det nødvendige antal 15 gange, for eksempel tre eller fire gange, ved en temperatur, der er gunstig for deres.vækst, i mælk. Overføringerne kan foregå i mængder på fra 0,5 til nogle procent, fortrinsvis 1 volumenprocent af den kultur, der skal overføres, i forhold til det volumen mælk, der skal 20 inokuleres.

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempel, hvori de angivne procenter er vægtprocenter.

Eksempel 25 Der blev separat dyrket to stammer af Lactobacil lus helvetlcus underart jugurti, med numrene henholdsvis - S Γ3-8 og S 36-2, erhvervet fra det agronomisk-mikrobio- . logiske institut ved universitetet i Bologne, Italien, i én suspension af 10% skummetmælkspulver og 0,1% gæreks-30 trakt i vand, hvilken suspension var steriliseret i autoklav i 30 minutter ved 115°C. Efter inkubation i 8 timer ved 42°C havde stammen S 13-8 produceret 1,5% mælke-syre i suspensionen, og stammen S 36-2 havde produceret 2,4%.

35 Endvidere blev stammen S 36-2 dyrket på MRS-medium (J.C. de Man, M. Rogosa og M.F. Sharpe, J.Appl. Bact.23, 130-135 (1960)) for lactobacilli. Prøver af denne kultur 148797 5' blev overført til frisk MRS-medium, hvortil der var sat 7 pg/ml af acriflavin. Der blev inkuberet 24 timer. Der blev priklet på MRS-medium, der var størknet, ved tilsætning af 1,5% agar, og der blev inkuberet i en atmosfære 5 af hydrogen og C02· Der blev isoleret individuelle kolonier.

Derefter blev der i et modificeret MRS-medium med følgende sammensætning: N-acetyl-D-glucosamin 10 g 10 Polypepton 10 g Gærekstrakt 5 g "Tween 80" x) 1 ml K2HP04 2 g CH3C00Na,3H20 5 g 15 Diammoniumcitrat 2 g

MgS04,7H20 0,2 g

MnS04,4H20 0,05 g

Destilleret vand 1 liter x) (polyoxyethylensorbitanmonooleat) 20 individuelt dyrket et vist antal prøver af stammen S 36-2, der ikke havde undergået behandlingen med acriflavin, og de ovennævnte kolonier, der havde undergået behandlingen med acriflavin. Det blev konstateret, at ca. 60% af disse kolonier var ude af stand til at vokse på ovennævn-25 te medium, hvor N-acetyl-D-glucosamin var hovedkilden for assimilerbart carbon, mens kun 1% af referenceprøverne ikke var i stand dertil. Det blev i vandig suspension af 10% skummetmælk s pulver og 0,1% gærekstrakt konstate- . ret, at de kolonier, der ikke var i stand til at metabo-30 lisere N-acetyl-D-glucosamin, i løbet af 8 timer producerede mælkesyremængder beliggende mellem 1,3 og 1,6%,dvs. lige så meget som stammen S 13-8. Derimod var referenceprøverne praktisk taget alle i stand til at vokse på det modificerede MRS-medium, og de producerede i løbet af 8 35 timer 2,3-2,6% mælkesyre på mediet med skummetmælkspulver og gærekstrakt. Denne evne forbliver intakt, så længe disse prøver dyrkes og holdes på det modificerede 6 148797 MRS-medium.

Det blev ved passende teknik for hydrolyse, adskillelse ved centrifugering under vægtfyldegradient for ClCs-ethidiumbromid og elektronmikroskopi konstateret, at 5 det er et plasmid på 13,17 kb, der er til stede i stammen S 36-2, fraværende i stammen S 13-8 og neutraliseret i stammen S 36-2 behandlet med acriflavin, der er ansvarligt dels for den forøgede mælkesyreproduktion fra ca.

1,5 til ca.2,4%, som ovenfor påvist, og dels for metabo-10 liseringen af N-acetyl-D-glucosamin.