CA1197187A - Procede et chaine reactionnelle pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique - Google Patents
Procede et chaine reactionnelle pour le diagnostic de la leucose bovine enzootiqueInfo
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique caractérisé par la mesure de l'activité enzymatique d'une chaîne réactionnelle consistant en une matrice sur laquelle est adsorbé un anticorps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'antigène gp51, cet anticorps étant mis en contact avec l'antigène gp51, qui lui-même réagit avec une préparation d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 et finalement avec des anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase. La leucose bovine enzootique est une des maladies contagieuses affectant naturellement ou artificiellement les cheptels bovins, caprins et ovins.
Description
73L~
Procédé et chaine réactionnelle pour le diaqnostic de la leucose bovine enzaotique.
La leucose bovine enzootique est une des maladies contagieuses aFfectant naturellement ou artificiellement les S cheptels bovins, caprins et ovins. L'agent étiologique de cette maladie est le rétrovirus BLV (Bovine Leukemia Virus).
Les signes cliniques (lymphocytose, tumeurs) de la maladie n'apparaissent que tardivement. Les animaux infectés synthétisent des anticorps dirigés contre au moins les deux protéines virales majeures, l'une p24 (24 000 daltons) est interne au virion~
l'autre gp51 (51 000 daltons) est la protéine d'enveloppe, glycosylée. Ces anticorps peuvent apparaitre deux à trois semai-nes après l'infection et constituent le signe précoce de l'infec-tion.
~5 Un test sérologique s'impose pour détecter précocement la maladie afin de prendre les mesures prophylactiques nécessaires et d'éviter la propagation de celle-ci. Ce test s~rologique se justifie d'autant plus, qu'au sein d'une région, des exploitations agricoles sont totalement exemptes de leucose, et 2Q qu'au niveau des échanges internationaux, des pays quasiment exempts de la maladie, alors que d'autres régions présentent des taux d'infection du bétail supérieurs à 20 ~.
Différentes méthodes sérologiques sont décrites et préconisées pour le disgnostic précoce de la leucose enzootique :
dosages radioimmunologiques, immunodiffusion, détection immunoenzymatiq~e. L'ensemble des expériences montre que chez les animaux inFectés, les anticorps anti-gp51 apparaissent les premiers et le titre des immunoglobulines anti-gp51 est quasi toujours supérieur au titre anti-p2~. Toutes les techniques 3n utilisant l'antigène gp51 s'avèrent dès lors les plus efFic~ces pour un diagnostic précoce. Parmi celles-ci, le dosage rfldioimmunologique se révèle extrêmement sensible. Cependant ce dosage nécessite un matériel et un personnel hautement spécialisés qui empêchent le développement de cette méthode en médecine vétérinaire. Toutefois, si sur un plan pratique de police sanitaire, un test optimalisé d'immunodiffusion à pu ~i7~
convenir pour le contrôle de la maladie, il manque cependant de sensibilit~.
Grâce à leur simplicité, les tests immunoenzymatklues du type ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) deviennent des S méthodes de choix pour le screening d'antigènes viraux ou d'anti-corps dirigés contre ces antig~nes.
Plusieurs publications scientifiques décrivent un test ELISA
appliqué au cas de la leucose bovine enzootique (HOFF-~RGENSEN, R. (1980) in "CEC scientific workshop on bovine leucosis". L.M.
1~ Markson ed., ECSC-EEC-E~EC, Brussels-Luxembourg, pp. 55-56.; RES-S~NG, A.A., GIELKENS, A.L.J., QUAK, J. and MASTENBROEK, N.
(19aO~., in "CEC scientific workshop on bovine leucosis".9L.M.
Markson ed., ECSC-EEC-EAEC, Brussels Lùxembourg, pp. 67-80.;
MAN~, D., ~IEGAND, D. ? BEHRENS,F. and ~IEGELMAIER, R. (1981).
~5 Zbl. Vet. Med. B., 28, 280-291; ALTANER, C, ZAJAC, V, and BAN, J. (1982). ~bl. Vet. Med. 29, 583-590 .; BAN, ~., ZA~AC, V., ~LTANER, C. and CERNY, L. (1982). Zbl. Vet. Med~ 29, 591-595.;
GRAVES, D.C., MC QUADE, M. and WEI8EL, K; (1982). Am. ~. Vet.
Res., 43, 960-966.; MARIS, P., NOUGAYREDE, Ph. and PERRIN, G.
2Q (1983). Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., ~ 5-50).
Le procédé suivant est généralement utilis~ : les antigènes du virus BLV ou le BLY sont adsorbés sur les cupules en plastic des microplaques, les dilutions de sérums sont ensuite incubéeæ dans les cupules et les anticorps liés aux antigènes viraux sont dé-tectés par des anticorps antiimmunoglobulines bovineæ couplés à
l'enzyme peroxydase ou phosphatase alcaline.
Cette technique donne toutefois des bruits de fond élevés provenant de l'adsorption sur la microplaque de constituants non viraux contaminant la préparation d'antigènes du virus BLV et 3~ réagissant de facon non spécifique avec les réactifs immunoenzy-matiques clu test et de l'utilisation d'anticorps antiimmunoglobu-Lines bovines non purifiés par chromatographie d'affinité et non débarrassés de leur fragment Fc. Les bruits de fond élevés pro-viennent principalement de l'adsorption non spécifique par leur fragrnent Fc d'immunoglobulines couplées à un enzyme, non spécifi~
ques dans le test.
... .... . . . , . , ... _ . _ .. , ~71i~7 Cette technique ELISA généralement utilisée donne un signal positif faible pour un sérum contenant des anticorps sp~cifique~
Les antigènes viraux sont en g~néral présents en très petite pro-portion dans les préparations virales utilisées. Il en résulte un signal positif pour les anticorps spécifiques significativement peu différent du signal observé en l'absence d'snticorps spécifi-ques. L'utilisation d'antigène purifié gp51 permettr it de résou-dre ce problème mais entraînerait un coût signiFicatifvement plus élevé du test.
- ~Enfin, il apparait difficile d'uniformiser les r~sultats entre laboratoires principalement à cause du manque de pureté des réactifs utilisés, (antisérums et/ou antigène gp51).
Le procédé et la chaîne réactionnelle pour le diagnostic de la leucose bovine emzootique bas~s sur un test immunoenzymatique du type ELISA, faisant l'objet de la pr~sente invention9 permet-tent d'éliminer les inconvénients énoncés ci-avant.
Suivant la présente invention le procédé pour le diagnostic de la lsucose bovine enzootique est caractéris~ par la mesure de l'activité enzymatique d'une chaine réactionnelle consistant en une matrice sur laqu~lle est adsorbé un anticorps monoclonal puriFi~
réagissant spéci~iquement à l'antigène gp51. cet anticorps étant mis en contact avec l'antigène gp51 qui lui meme réagit avec une préparation d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiquss de l'antigène gp51 et avec des anticorps spécifiques des immunoglo-bulines couplés à l'en~yme peroxydase.
La matrice consiste en un support de matière polymbre parexemple naturelle ou syn~thétique. En g~néral, on utilise du poly-styrène. Toutefois, d'autres matières peuvent être utilisées, par exemple du chlorure de polyvinyle, du nitrate de cellulose, du 3û polyacrylamide.
La matrice peut se présenter sous une forme quelconque, par exemple sous Forme de microplaques, d'un tube, d'un filtre, de billes.
La matrice est mise en présence d'un anticorps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'antigène gp51.
L8~
L'antigbne gp51 est la glycoproteine majeure d'enveloppe de virus BLV (Bovine Leukemia Virus), associée au ViI'US BLV ou libre présente dans le surnageant de cellules en culture, chroniquement infectées par le virus BLV. Ces cellules proviennent de rein de foetus de mouton ou de poumon de chauve-souris. On utilise le surnageant de culture de cellules confluentes, d~barrassé par centrifugation (10.000 9,15 min) des débris cellulaires.
L'anticorps monoclonal purifié adsorbé ~ la ~urface de la matrice est obtenu par la fusion cellulaire de cellules de rate ~Q provensnt d'une souris im~unisée aYec de l'antigène gp~l svec des cellules de myélomes de souris, par la sélection et le clon~ge des cellules hybrides obtenues, par le d~veloppement des clones hybrides sélectionnés in vitro, par le trsnsfert en souris des clones sélectionnés, par l'extraction des anticorps monoclonsux ~5 du liquide ascitique de ces animaux et par la purificstion des anticorps obtenus par chromatographie sur DEAE-Affi-gel blue ~BIû-RAD~.
L'anticorps monoclonal utilisé dans le test et obtenu 8Ui-vant le procédé revendiqué porte le num~ro GA12. Il e~t obtenu de 2Q la manière ~uiYante.
Des souris Balb C mâles sont imn~lnisé~s par voie sous-cutanée et intrap~riton~ale avec 50 ~icroyl d'sntig~ne gp 51 dont la pureté est supérieure ~ 50 ~, émulsionn~s dans l'adjuYant complet de Freund.
Les cellules de rste de ces souris immunisées sont ensuite fusionnées avec des cellules de myélome provenant d'un clone dé-rivant du clone original SP2, sélectionné pour une croissance optimale en milieu solidifié par de l'agarose et pour une ef-ficience de fusion optimale.(~R~NSSEN, 3-D., HERION, P. snd 3~ URBAIN, J. (1982) in "Protides of de biological fluides" H.
PEETERS, ed. Pergamon Press, Oxford, 29, 645-648).
Le produit de la fusion est ensuite distribué dans des puits de plflques Microtest, dans un milieu s~lectif HAT,(Hypoxanthine-aminoptérinethymidine); les hybrides sont clonés par la m~thode des dilutions limites. Après treize jours, les clones producteurs d'anticorps antigp51 sont détectés par dosage radioimmunologique * (m~rque de commerce) ~' ~L~97~LB~7 utilisant l'sntigène gp 51 marqué ~ l'iode 125. Ces clones pro-ducteurs sont alors subclonés deux fois dans un milieu de culture solidifi~ par de l'agarose, puis multipli~s dans la cavite intra-péritonéale de souris syngéniques, traitées au pristane. Le li-quide ascitique des souris est prélevé après 8-10 jours~ centri-Fug~ à 1000 9 durant 5 min, puls, à lOO.ûOO g durant 30 min. Le liquide est ensuite dialysé contre du tampon TRIS-HCl 0,02 M
pH 7, 2 pendant une nuit à 4 DC et centrifug~ à lOoOOO g durant 15 min.
~Q Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir de 1 ml de liquide d'ascite ainsi traité par passage à 4 C sur une colonne de 7 ml de DEAE-Affi gel blue, équilibrée dans le tampon TRIS-HCL
0,02 M pH 7,2. Les anticorps monoclonaux sont élués de la colonne par un gradient de NaCl O-lOOmM dans le même tampon.
~5 Des anticorps monoclonaux obtenus et purifiés, on a sélec-tionné le numéro GA12 pour notre test.
La monoclonalité de la préparation d'anticorps GA12 est dé-terminée par focalisation isoélectrique sur couche mince.
L'anticorps monoclonal GA12 appartient à la classe d'immuno-2U globuline IgGl.
Son avidité pour l'antigène gp~l fixé sur un support solideest très faible, comparée aux autres anticorps monoclonaux obte-nus.
Le site antiyénique reconnu par l'anticorps monoclonal GA12 Z5 n'inhibe pas des activités biologiques du virus BLV comme l'in-fectivité ou la formation de polycaryotes sur des cellules ci bles; il ne possède pas d'activité cytotoxique en présence de complément pour des cellules productrices de BLV.
Le site antigènique reconnu par l'anticorps monoclonal GA12 3~ est situées sur un polypeptide de 15.000 daltons, obtenu après digestion par l'urokinase de l'antigène gp51 et sur lequel sont situées les activités biologiques du virus BLV énoncées ci-dessus.
Les caractéristiques de l'anticorps monoclonal GA12 sont clonnées dans les publications suivantes, BRUCK, C, MATHOT, S, PORTETELLE, D; BERTE, C; FRAI~lSSEN, J.D.; HERION, P. and BURNY, A, ~7~
(1982, b), Virology,122,342-352; BRUCK, C; PORTETELLE, D;
BURNY, A and ZAVADA, J. (1982 c), Virology,122,353-362.
L'anticorps monoclonal purifié réagissant sp~cifiquement l'antigène gp51 adsorbé sur la matrice est mls en contact avec l'antigbne gp51 qui ensuite est mis en réaction avec une pr~para-tion d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 et finalement avec des anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase.
On entend par préparation d'immunoglobulines diverses 301u-tions pouvant contenir des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 par exemple du sérum ou du plasma sanguin, du lait, du li-quide extrait de viande.
Les préparations d'immunoglobulines dont les anticorps spé-cifiques se fixent sur l'antigène gp51, proviennent de diverses espèces animales. En général, on les obtient à partir de l'espèce bovine.
Les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à
l'enzyme peroxydase sont obtenus à partir de sérum de lapins im-munisés avec des immunoglobulines de chèvre qui sont clivées ~ la
Procédé et chaine réactionnelle pour le diaqnostic de la leucose bovine enzaotique.
La leucose bovine enzootique est une des maladies contagieuses aFfectant naturellement ou artificiellement les S cheptels bovins, caprins et ovins. L'agent étiologique de cette maladie est le rétrovirus BLV (Bovine Leukemia Virus).
Les signes cliniques (lymphocytose, tumeurs) de la maladie n'apparaissent que tardivement. Les animaux infectés synthétisent des anticorps dirigés contre au moins les deux protéines virales majeures, l'une p24 (24 000 daltons) est interne au virion~
l'autre gp51 (51 000 daltons) est la protéine d'enveloppe, glycosylée. Ces anticorps peuvent apparaitre deux à trois semai-nes après l'infection et constituent le signe précoce de l'infec-tion.
~5 Un test sérologique s'impose pour détecter précocement la maladie afin de prendre les mesures prophylactiques nécessaires et d'éviter la propagation de celle-ci. Ce test s~rologique se justifie d'autant plus, qu'au sein d'une région, des exploitations agricoles sont totalement exemptes de leucose, et 2Q qu'au niveau des échanges internationaux, des pays quasiment exempts de la maladie, alors que d'autres régions présentent des taux d'infection du bétail supérieurs à 20 ~.
Différentes méthodes sérologiques sont décrites et préconisées pour le disgnostic précoce de la leucose enzootique :
dosages radioimmunologiques, immunodiffusion, détection immunoenzymatiq~e. L'ensemble des expériences montre que chez les animaux inFectés, les anticorps anti-gp51 apparaissent les premiers et le titre des immunoglobulines anti-gp51 est quasi toujours supérieur au titre anti-p2~. Toutes les techniques 3n utilisant l'antigène gp51 s'avèrent dès lors les plus efFic~ces pour un diagnostic précoce. Parmi celles-ci, le dosage rfldioimmunologique se révèle extrêmement sensible. Cependant ce dosage nécessite un matériel et un personnel hautement spécialisés qui empêchent le développement de cette méthode en médecine vétérinaire. Toutefois, si sur un plan pratique de police sanitaire, un test optimalisé d'immunodiffusion à pu ~i7~
convenir pour le contrôle de la maladie, il manque cependant de sensibilit~.
Grâce à leur simplicité, les tests immunoenzymatklues du type ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) deviennent des S méthodes de choix pour le screening d'antigènes viraux ou d'anti-corps dirigés contre ces antig~nes.
Plusieurs publications scientifiques décrivent un test ELISA
appliqué au cas de la leucose bovine enzootique (HOFF-~RGENSEN, R. (1980) in "CEC scientific workshop on bovine leucosis". L.M.
1~ Markson ed., ECSC-EEC-E~EC, Brussels-Luxembourg, pp. 55-56.; RES-S~NG, A.A., GIELKENS, A.L.J., QUAK, J. and MASTENBROEK, N.
(19aO~., in "CEC scientific workshop on bovine leucosis".9L.M.
Markson ed., ECSC-EEC-EAEC, Brussels Lùxembourg, pp. 67-80.;
MAN~, D., ~IEGAND, D. ? BEHRENS,F. and ~IEGELMAIER, R. (1981).
~5 Zbl. Vet. Med. B., 28, 280-291; ALTANER, C, ZAJAC, V, and BAN, J. (1982). ~bl. Vet. Med. 29, 583-590 .; BAN, ~., ZA~AC, V., ~LTANER, C. and CERNY, L. (1982). Zbl. Vet. Med~ 29, 591-595.;
GRAVES, D.C., MC QUADE, M. and WEI8EL, K; (1982). Am. ~. Vet.
Res., 43, 960-966.; MARIS, P., NOUGAYREDE, Ph. and PERRIN, G.
2Q (1983). Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., ~ 5-50).
Le procédé suivant est généralement utilis~ : les antigènes du virus BLV ou le BLY sont adsorbés sur les cupules en plastic des microplaques, les dilutions de sérums sont ensuite incubéeæ dans les cupules et les anticorps liés aux antigènes viraux sont dé-tectés par des anticorps antiimmunoglobulines bovineæ couplés à
l'enzyme peroxydase ou phosphatase alcaline.
Cette technique donne toutefois des bruits de fond élevés provenant de l'adsorption sur la microplaque de constituants non viraux contaminant la préparation d'antigènes du virus BLV et 3~ réagissant de facon non spécifique avec les réactifs immunoenzy-matiques clu test et de l'utilisation d'anticorps antiimmunoglobu-Lines bovines non purifiés par chromatographie d'affinité et non débarrassés de leur fragment Fc. Les bruits de fond élevés pro-viennent principalement de l'adsorption non spécifique par leur fragrnent Fc d'immunoglobulines couplées à un enzyme, non spécifi~
ques dans le test.
... .... . . . , . , ... _ . _ .. , ~71i~7 Cette technique ELISA généralement utilisée donne un signal positif faible pour un sérum contenant des anticorps sp~cifique~
Les antigènes viraux sont en g~néral présents en très petite pro-portion dans les préparations virales utilisées. Il en résulte un signal positif pour les anticorps spécifiques significativement peu différent du signal observé en l'absence d'snticorps spécifi-ques. L'utilisation d'antigène purifié gp51 permettr it de résou-dre ce problème mais entraînerait un coût signiFicatifvement plus élevé du test.
- ~Enfin, il apparait difficile d'uniformiser les r~sultats entre laboratoires principalement à cause du manque de pureté des réactifs utilisés, (antisérums et/ou antigène gp51).
Le procédé et la chaîne réactionnelle pour le diagnostic de la leucose bovine emzootique bas~s sur un test immunoenzymatique du type ELISA, faisant l'objet de la pr~sente invention9 permet-tent d'éliminer les inconvénients énoncés ci-avant.
Suivant la présente invention le procédé pour le diagnostic de la lsucose bovine enzootique est caractéris~ par la mesure de l'activité enzymatique d'une chaine réactionnelle consistant en une matrice sur laqu~lle est adsorbé un anticorps monoclonal puriFi~
réagissant spéci~iquement à l'antigène gp51. cet anticorps étant mis en contact avec l'antigène gp51 qui lui meme réagit avec une préparation d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiquss de l'antigène gp51 et avec des anticorps spécifiques des immunoglo-bulines couplés à l'en~yme peroxydase.
La matrice consiste en un support de matière polymbre parexemple naturelle ou syn~thétique. En g~néral, on utilise du poly-styrène. Toutefois, d'autres matières peuvent être utilisées, par exemple du chlorure de polyvinyle, du nitrate de cellulose, du 3û polyacrylamide.
La matrice peut se présenter sous une forme quelconque, par exemple sous Forme de microplaques, d'un tube, d'un filtre, de billes.
La matrice est mise en présence d'un anticorps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'antigène gp51.
L8~
L'antigbne gp51 est la glycoproteine majeure d'enveloppe de virus BLV (Bovine Leukemia Virus), associée au ViI'US BLV ou libre présente dans le surnageant de cellules en culture, chroniquement infectées par le virus BLV. Ces cellules proviennent de rein de foetus de mouton ou de poumon de chauve-souris. On utilise le surnageant de culture de cellules confluentes, d~barrassé par centrifugation (10.000 9,15 min) des débris cellulaires.
L'anticorps monoclonal purifié adsorbé ~ la ~urface de la matrice est obtenu par la fusion cellulaire de cellules de rate ~Q provensnt d'une souris im~unisée aYec de l'antigène gp~l svec des cellules de myélomes de souris, par la sélection et le clon~ge des cellules hybrides obtenues, par le d~veloppement des clones hybrides sélectionnés in vitro, par le trsnsfert en souris des clones sélectionnés, par l'extraction des anticorps monoclonsux ~5 du liquide ascitique de ces animaux et par la purificstion des anticorps obtenus par chromatographie sur DEAE-Affi-gel blue ~BIû-RAD~.
L'anticorps monoclonal utilisé dans le test et obtenu 8Ui-vant le procédé revendiqué porte le num~ro GA12. Il e~t obtenu de 2Q la manière ~uiYante.
Des souris Balb C mâles sont imn~lnisé~s par voie sous-cutanée et intrap~riton~ale avec 50 ~icroyl d'sntig~ne gp 51 dont la pureté est supérieure ~ 50 ~, émulsionn~s dans l'adjuYant complet de Freund.
Les cellules de rste de ces souris immunisées sont ensuite fusionnées avec des cellules de myélome provenant d'un clone dé-rivant du clone original SP2, sélectionné pour une croissance optimale en milieu solidifié par de l'agarose et pour une ef-ficience de fusion optimale.(~R~NSSEN, 3-D., HERION, P. snd 3~ URBAIN, J. (1982) in "Protides of de biological fluides" H.
PEETERS, ed. Pergamon Press, Oxford, 29, 645-648).
Le produit de la fusion est ensuite distribué dans des puits de plflques Microtest, dans un milieu s~lectif HAT,(Hypoxanthine-aminoptérinethymidine); les hybrides sont clonés par la m~thode des dilutions limites. Après treize jours, les clones producteurs d'anticorps antigp51 sont détectés par dosage radioimmunologique * (m~rque de commerce) ~' ~L~97~LB~7 utilisant l'sntigène gp 51 marqué ~ l'iode 125. Ces clones pro-ducteurs sont alors subclonés deux fois dans un milieu de culture solidifi~ par de l'agarose, puis multipli~s dans la cavite intra-péritonéale de souris syngéniques, traitées au pristane. Le li-quide ascitique des souris est prélevé après 8-10 jours~ centri-Fug~ à 1000 9 durant 5 min, puls, à lOO.ûOO g durant 30 min. Le liquide est ensuite dialysé contre du tampon TRIS-HCl 0,02 M
pH 7, 2 pendant une nuit à 4 DC et centrifug~ à lOoOOO g durant 15 min.
~Q Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir de 1 ml de liquide d'ascite ainsi traité par passage à 4 C sur une colonne de 7 ml de DEAE-Affi gel blue, équilibrée dans le tampon TRIS-HCL
0,02 M pH 7,2. Les anticorps monoclonaux sont élués de la colonne par un gradient de NaCl O-lOOmM dans le même tampon.
~5 Des anticorps monoclonaux obtenus et purifiés, on a sélec-tionné le numéro GA12 pour notre test.
La monoclonalité de la préparation d'anticorps GA12 est dé-terminée par focalisation isoélectrique sur couche mince.
L'anticorps monoclonal GA12 appartient à la classe d'immuno-2U globuline IgGl.
Son avidité pour l'antigène gp~l fixé sur un support solideest très faible, comparée aux autres anticorps monoclonaux obte-nus.
Le site antiyénique reconnu par l'anticorps monoclonal GA12 Z5 n'inhibe pas des activités biologiques du virus BLV comme l'in-fectivité ou la formation de polycaryotes sur des cellules ci bles; il ne possède pas d'activité cytotoxique en présence de complément pour des cellules productrices de BLV.
Le site antigènique reconnu par l'anticorps monoclonal GA12 3~ est situées sur un polypeptide de 15.000 daltons, obtenu après digestion par l'urokinase de l'antigène gp51 et sur lequel sont situées les activités biologiques du virus BLV énoncées ci-dessus.
Les caractéristiques de l'anticorps monoclonal GA12 sont clonnées dans les publications suivantes, BRUCK, C, MATHOT, S, PORTETELLE, D; BERTE, C; FRAI~lSSEN, J.D.; HERION, P. and BURNY, A, ~7~
(1982, b), Virology,122,342-352; BRUCK, C; PORTETELLE, D;
BURNY, A and ZAVADA, J. (1982 c), Virology,122,353-362.
L'anticorps monoclonal purifié réagissant sp~cifiquement l'antigène gp51 adsorbé sur la matrice est mls en contact avec l'antigbne gp51 qui ensuite est mis en réaction avec une pr~para-tion d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 et finalement avec des anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase.
On entend par préparation d'immunoglobulines diverses 301u-tions pouvant contenir des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 par exemple du sérum ou du plasma sanguin, du lait, du li-quide extrait de viande.
Les préparations d'immunoglobulines dont les anticorps spé-cifiques se fixent sur l'antigène gp51, proviennent de diverses espèces animales. En général, on les obtient à partir de l'espèce bovine.
Les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à
l'enzyme peroxydase sont obtenus à partir de sérum de lapins im-munisés avec des immunoglobulines de chèvre qui sont clivées ~ la
2~ papaine et sélectionnées par chromatographie sur échsngeur d'ions et par chromatographie d'afFinité sur Sépharose - Immunoglobuli-nes bovines.
L'enzyme peroxydase utilisé doit présenter un haut degré de pureté : densité optique à ~û3 nm/densité optique de 275 nm supé-rieur à 3.
Des anticorps spécifiques dirigés contre des immunoglobuli-nes de chèvre sont obtenus après immunisation de lapins avec des immunoglobulines de chèvre purifiées par chromatographie sur DEAE
cellulose et injectées en présence d'adjuvant complet de Freund.
L'enzyme peroxydase utilisé doit présenter un haut degré de pureté : densité optique à ~û3 nm/densité optique de 275 nm supé-rieur à 3.
Des anticorps spécifiques dirigés contre des immunoglobuli-nes de chèvre sont obtenus après immunisation de lapins avec des immunoglobulines de chèvre purifiées par chromatographie sur DEAE
cellulose et injectées en présence d'adjuvant complet de Freund.
3~ Ces anticorps sont ensuite purifiés à partir d'un m~lange de plusieurs sérums de lapin - par précipitation au sulfate d'ammonium (35 ~ de satura tion), - par chromatographie sur DEAE-cellulose.
Les fragments Fab de ces anticorps sont obtenus après diges-tion à la papaine et purification des Fab sur colonne échangeuse 7~7 d'ion CM52. Les Fab spécifiques sont ensuite purifiés par chroma-tographie d'affinité (immunoglobulines bovines fixées sur une rési~e de aminohexyl-Sépharose 4B).
Ces fragments Fab reconnaissent spécifiquement les immuno-globulines bovines, caprines et ovines.
La préparation du conjugué peroxydaae - Fab est réalis~e par la méthode d'oxydation au periodate. Le protocole est celui dé-crit par û'SULLIVAN et MARKS (Methods in Enzymology (1981), 73, 154-157, Academic Press, NY). Dans ce protocole, les étapes de ~U traitement au NaBH4 et de purification sur Séphadex G-100 sont omises. Le conjugué après dialyse contre du tampon phosphste iS3 tonique (pH 7,4~ est dilué 10 fois dans le même tampon en pr~sen-ce de 10 mg/ml d'albumine bovine (Sig~a A4378) et de O,l g/l de "Thimerosal7'. Le conjugué est stocké en fraction ~ 4C ou ~ -20DC
~5 ~ l'abri de la lumi~re.
Le test immunoenzymatigue du type Elisa faisant l'objet de ls présente inYention peut s'appliquer à toute préparation obte-nue à partir d'animaux appartenant au genre des bovid~s (vache, chèvre, mouton,...). Le test peut s'appliquer à des préparation~
2n p~ovenant d'sutres espèces sni~sles9 in~ect~es naturellem~nt ou srtificiellement avec le virus BLV . capybaras (Hy~lochoerus-hy-drochaeris), porc, singe9 lapin. On peut également utili~er une preparation d'i~munoglobulines provenant de l'esp~ce humaine.
Quand la prépsration ne provient pas de bovid~s5 on utilise de la protéine A couplée ~ l'enzyme peroxydase.
La présente invention concerne également les chaines réac-tionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique caractérisées en ce qu'elles comprennent une matrice sur laquelle est adsorbée un anticorps monoclonal purifi~ réagissant spécifi-3~ quement avec l'antigène gp51, l'sntigène gp51, les anticorps spé-cifiques de cet antigène présents dans une préparation d'immuno-globulines, les anticorps spécifiques des immunoglobulines cou-plés à l'enzyme peroxydase. Les cha~nes réactionnelles peuvent être schématisées de la facon suivante :
- anticorps rnonoclonal - antigène gp51 - anticorps - snti3nti-corps = peroxydase -~ substrat enzymatique.
* (marque de commerce ) Les chaines réactionnelles revendiquées peuvent être utilisées par exemple sous la forme d'une trousse de détection comprenant :
- une matrice sur laquelle est adsorbé l'anticorFs monoclo nal purifié réagissant spécifiquement avec l'antigène gp51 et l'antigène gp519 - un flacon contenant les anticorps spécifiques des immuno globulines couplés b l'enzyme peroxydase;
des flacons contenant du tampon concen~ré lû x pour le ~Q lavage des plaques ou la dilution des échantillons et des réactifs, - un protocole détaillé.
L'originalité de l'emploi d'un anticorps monoclonal spécifique de l'antigène gp51 dans le test ELISA suivant le schéma ci-dessous procure les avantages suivants :
- grande reproductibilité du test car l'anticorps monoclonal est un réactif homogène9 bien caractérisé et de qua]ité
constante et disponible en quantité illimitée;
- grande sensibilit~ car l'anticorps monoclonal n'interfère 2Q pas avec les sites reconnus par les anticorps bovins; gra-ce à l'anticorps monoclonal, des sites reconnus par les anticorps bovins ne sont pas cachés suite à l'adsorption sur la paroi du puits;
- faible coût du tPSt : moins de 100 ng d'anticorps mono~
clona~ sont nécessaires par test; aucune purification de l'antigène n'est n~cessaire à partir du milieu de culture cellulaire .
- le bruit de fond du test ELISA se trouve réduit par rap-port à d'autres tests n'incluant pas d'anticorps monoclo-3Q naux.
Suivant une réalisation préférentielle9 le test permet de détecter des anticorps spécifiques de la leucose bovine non seu-lement dflns le sérum sanguin mais aussi dans le lait.
L'exemple non limitatif suivant permettra de mieux compren-dre la présente invention.
Les tampons utilisés ians cet exemple ont la signification ~3i7~87 suivante :
- Tampon 1 : PBS : NaHbPO~H~O 0,01 M
NaCl 0,15 M
ajuster b pH 7,4 avec KOH
- Tampon 2 : tampon de lavaqe PBS additionné de T~een 80 0,2 - Tampon 3 : tampon de saturation NaH~PO~H~ 0,~ ~
NaCl 0,~5 M
~0 5érumalbumine bovine (Sigma A9647) 2 X
A7IDE D,06 X
Ajuster le pH ~ 7,4 AVec KOH
- Tsmpon 4 : tampon de dilution des sérums Na~ PO~H~o O,OlM
~5 NsCl 0,15M
S~rumalbumine bovine ~Sigma A9647) 0,5 Tween 80 2 Glyc~rol 10 ~
Azide n,o6 X
2~ Ajuster le pH ~ 7~4 avec KOH
~ Tampon 5 : tampon pour le ~ubstrat en2ymatique NaH,~P04 1~ 0 O ,1 M
Ajuster ~ pH av~c .YOH
l.Matrice La matrice consiste en une plaque en polystyrène de type "Microtest" ~ fond plat GIBCO 26g.62Q.
2.Fixation de l'snticorps monoclonsl On dispose psr puits de plaque microtest au moyen d'une mi-cropipette à cansux multi50~1 de tsmpon 1 contenant 100 ng d'an~
3~ ticorps monoclonal purifié GA12. Par agitation, on étale cette solution sur le fond des puits et on incube ensuite la plaque Microtest pendant 16 heures a 4C, dans une atmosphère saturée d'humidite, afin d'~viter une évaporation du liquide dposé dans les puits.
3.Fixation de l'antiqène qp51 La solution contenant l'excès d'anticorps monoclonal non * ~marque de commerce) adsorbé est éllminée par aspiration et les puits sont lavés deux fois successivement avec 200/~1 de tampon 2. On distribue ensuite par puits 50~ de tampon 3. Après une incubation de 30 minutes ~ temp~rature ambiante, on ajoute 50,~ de surnageant de culture S de cellules productrices de virus BLV, amenées à confluence (le surnageant de culture est débarassé des débris cellulaires par centrifugation et est stocké à -20C jusqu'au moment de l'utili-sntion). On recouvre la plaque Microtest de papier adhésif trans-parent; les plaques sont conservées à 4C pendant au moins 48 heures et au maximum 1 mois. La plaque apr~s au moins 2 jours d'incubation, peut aussi être lavée deux fois avec le tampon 2, séchée sous vidP et conservée ~ température smbi~nte.
Les fragments Fab de ces anticorps sont obtenus après diges-tion à la papaine et purification des Fab sur colonne échangeuse 7~7 d'ion CM52. Les Fab spécifiques sont ensuite purifiés par chroma-tographie d'affinité (immunoglobulines bovines fixées sur une rési~e de aminohexyl-Sépharose 4B).
Ces fragments Fab reconnaissent spécifiquement les immuno-globulines bovines, caprines et ovines.
La préparation du conjugué peroxydaae - Fab est réalis~e par la méthode d'oxydation au periodate. Le protocole est celui dé-crit par û'SULLIVAN et MARKS (Methods in Enzymology (1981), 73, 154-157, Academic Press, NY). Dans ce protocole, les étapes de ~U traitement au NaBH4 et de purification sur Séphadex G-100 sont omises. Le conjugué après dialyse contre du tampon phosphste iS3 tonique (pH 7,4~ est dilué 10 fois dans le même tampon en pr~sen-ce de 10 mg/ml d'albumine bovine (Sig~a A4378) et de O,l g/l de "Thimerosal7'. Le conjugué est stocké en fraction ~ 4C ou ~ -20DC
~5 ~ l'abri de la lumi~re.
Le test immunoenzymatigue du type Elisa faisant l'objet de ls présente inYention peut s'appliquer à toute préparation obte-nue à partir d'animaux appartenant au genre des bovid~s (vache, chèvre, mouton,...). Le test peut s'appliquer à des préparation~
2n p~ovenant d'sutres espèces sni~sles9 in~ect~es naturellem~nt ou srtificiellement avec le virus BLV . capybaras (Hy~lochoerus-hy-drochaeris), porc, singe9 lapin. On peut également utili~er une preparation d'i~munoglobulines provenant de l'esp~ce humaine.
Quand la prépsration ne provient pas de bovid~s5 on utilise de la protéine A couplée ~ l'enzyme peroxydase.
La présente invention concerne également les chaines réac-tionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique caractérisées en ce qu'elles comprennent une matrice sur laquelle est adsorbée un anticorps monoclonal purifi~ réagissant spécifi-3~ quement avec l'antigène gp51, l'sntigène gp51, les anticorps spé-cifiques de cet antigène présents dans une préparation d'immuno-globulines, les anticorps spécifiques des immunoglobulines cou-plés à l'enzyme peroxydase. Les cha~nes réactionnelles peuvent être schématisées de la facon suivante :
- anticorps rnonoclonal - antigène gp51 - anticorps - snti3nti-corps = peroxydase -~ substrat enzymatique.
* (marque de commerce ) Les chaines réactionnelles revendiquées peuvent être utilisées par exemple sous la forme d'une trousse de détection comprenant :
- une matrice sur laquelle est adsorbé l'anticorFs monoclo nal purifié réagissant spécifiquement avec l'antigène gp51 et l'antigène gp519 - un flacon contenant les anticorps spécifiques des immuno globulines couplés b l'enzyme peroxydase;
des flacons contenant du tampon concen~ré lû x pour le ~Q lavage des plaques ou la dilution des échantillons et des réactifs, - un protocole détaillé.
L'originalité de l'emploi d'un anticorps monoclonal spécifique de l'antigène gp51 dans le test ELISA suivant le schéma ci-dessous procure les avantages suivants :
- grande reproductibilité du test car l'anticorps monoclonal est un réactif homogène9 bien caractérisé et de qua]ité
constante et disponible en quantité illimitée;
- grande sensibilit~ car l'anticorps monoclonal n'interfère 2Q pas avec les sites reconnus par les anticorps bovins; gra-ce à l'anticorps monoclonal, des sites reconnus par les anticorps bovins ne sont pas cachés suite à l'adsorption sur la paroi du puits;
- faible coût du tPSt : moins de 100 ng d'anticorps mono~
clona~ sont nécessaires par test; aucune purification de l'antigène n'est n~cessaire à partir du milieu de culture cellulaire .
- le bruit de fond du test ELISA se trouve réduit par rap-port à d'autres tests n'incluant pas d'anticorps monoclo-3Q naux.
Suivant une réalisation préférentielle9 le test permet de détecter des anticorps spécifiques de la leucose bovine non seu-lement dflns le sérum sanguin mais aussi dans le lait.
L'exemple non limitatif suivant permettra de mieux compren-dre la présente invention.
Les tampons utilisés ians cet exemple ont la signification ~3i7~87 suivante :
- Tampon 1 : PBS : NaHbPO~H~O 0,01 M
NaCl 0,15 M
ajuster b pH 7,4 avec KOH
- Tampon 2 : tampon de lavaqe PBS additionné de T~een 80 0,2 - Tampon 3 : tampon de saturation NaH~PO~H~ 0,~ ~
NaCl 0,~5 M
~0 5érumalbumine bovine (Sigma A9647) 2 X
A7IDE D,06 X
Ajuster le pH ~ 7,4 AVec KOH
- Tsmpon 4 : tampon de dilution des sérums Na~ PO~H~o O,OlM
~5 NsCl 0,15M
S~rumalbumine bovine ~Sigma A9647) 0,5 Tween 80 2 Glyc~rol 10 ~
Azide n,o6 X
2~ Ajuster le pH ~ 7~4 avec KOH
~ Tampon 5 : tampon pour le ~ubstrat en2ymatique NaH,~P04 1~ 0 O ,1 M
Ajuster ~ pH av~c .YOH
l.Matrice La matrice consiste en une plaque en polystyrène de type "Microtest" ~ fond plat GIBCO 26g.62Q.
2.Fixation de l'snticorps monoclonsl On dispose psr puits de plaque microtest au moyen d'une mi-cropipette à cansux multi50~1 de tsmpon 1 contenant 100 ng d'an~
3~ ticorps monoclonal purifié GA12. Par agitation, on étale cette solution sur le fond des puits et on incube ensuite la plaque Microtest pendant 16 heures a 4C, dans une atmosphère saturée d'humidite, afin d'~viter une évaporation du liquide dposé dans les puits.
3.Fixation de l'antiqène qp51 La solution contenant l'excès d'anticorps monoclonal non * ~marque de commerce) adsorbé est éllminée par aspiration et les puits sont lavés deux fois successivement avec 200/~1 de tampon 2. On distribue ensuite par puits 50~ de tampon 3. Après une incubation de 30 minutes ~ temp~rature ambiante, on ajoute 50,~ de surnageant de culture S de cellules productrices de virus BLV, amenées à confluence (le surnageant de culture est débarassé des débris cellulaires par centrifugation et est stocké à -20C jusqu'au moment de l'utili-sntion). On recouvre la plaque Microtest de papier adhésif trans-parent; les plaques sont conservées à 4C pendant au moins 48 heures et au maximum 1 mois. La plaque apr~s au moins 2 jours d'incubation, peut aussi être lavée deux fois avec le tampon 2, séchée sous vidP et conservée ~ température smbi~nte.
4.Aiout de la préparation d'immunoqlobulines La solution d'antigène est enlevée par aspiration et les ~5 puits sont lavés trois fois avec 20 ~ de tampon 2. Si la plaque a été séchée sous vide, elle est lavée une fois avec 200~AAl de tampon 2.
On distribue ensuite par puits 20 ~ de tampon 4 contenant la préparation d'immunoglobulines. Dans le cas d'un sérum ou d'un 2~ plasma sanguin, la première dilution est 102û. Dans le cs de li-quide extrait de viande ou de lait, la premlère dilution est 1:2 Si on effectue plusieurs dilutions successives, le facteur en-tre chaque dilution est 1:3.
On incube la plaque 16 h a 4C dans une atmosphère humide 9 en agitant légèrement.
On distribue ensuite par puits 20 ~ de tampon 4 contenant la préparation d'immunoglobulines. Dans le cas d'un sérum ou d'un 2~ plasma sanguin, la première dilution est 102û. Dans le cs de li-quide extrait de viande ou de lait, la premlère dilution est 1:2 Si on effectue plusieurs dilutions successives, le facteur en-tre chaque dilution est 1:3.
On incube la plaque 16 h a 4C dans une atmosphère humide 9 en agitant légèrement.
5.Ajout des anticorps spécifiques des immunoqlobulines cwplés à
l'enzyme peroxydase Après avoir enlevé par aspiration la solution contenant la préparation d'immunoglobulines, on lave les puits quatre fois 3~ avec 200~ de tampon 2. On ajoute ensuite par puits 50f~1 de tam-pon 2 additionné de conjugué antiimmunoglobulines bovines-peroxy-dase, à une concentration de 4û ng d'équivalent Fab.
On incube la solution 4 heures à température ambiante, dans une atmosphère humide.
~97~
l'enzyme peroxydase Après avoir enlevé par aspiration la solution contenant la préparation d'immunoglobulines, on lave les puits quatre fois 3~ avec 200~ de tampon 2. On ajoute ensuite par puits 50f~1 de tam-pon 2 additionné de conjugué antiimmunoglobulines bovines-peroxy-dase, à une concentration de 4û ng d'équivalent Fab.
On incube la solution 4 heures à température ambiante, dans une atmosphère humide.
~97~
6.Mise en évidence de l'~ctivité enzymatique associée à la cha~~
ne reactionnelle.
Après avoir enlevé par aspiration 18 solution de conjugué
les puits de la plaque Microtest sont lavés quatre fois avec 20û/~ de tampon 2. On ajoute ensuite par puits 100~1 de subs-trflt enzymatique préparé extemporanément dans le tampon 5 (0,04 û-phénylénediamine; O,û2 ~ peroxyde d'urée).
Après une incubation de ~O minutes à température ambiante à
l'abri de la lumi~re, la réaction enzymatique est bloquée en a-~Q joutant 100~1 de HCL6N. On mesure le plus rapidement possible les densités optiques des solutions de chaque puits au moyen d'un appareil de lecture semi-automatique ou automatique pour chaque plsque Microtest.
.
,~
ne reactionnelle.
Après avoir enlevé par aspiration 18 solution de conjugué
les puits de la plaque Microtest sont lavés quatre fois avec 20û/~ de tampon 2. On ajoute ensuite par puits 100~1 de subs-trflt enzymatique préparé extemporanément dans le tampon 5 (0,04 û-phénylénediamine; O,û2 ~ peroxyde d'urée).
Après une incubation de ~O minutes à température ambiante à
l'abri de la lumi~re, la réaction enzymatique est bloquée en a-~Q joutant 100~1 de HCL6N. On mesure le plus rapidement possible les densités optiques des solutions de chaque puits au moyen d'un appareil de lecture semi-automatique ou automatique pour chaque plsque Microtest.
.
,~
Claims (8)
1. Procédé pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique caractérisé par la mesure de l'activité
enzymatique d'une chaîne réactionnelle consistant en une matrice sur laquelle est adsorbé un anticorps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'antigène gp51, cet anticorps étant mis en contact avec l'antigène gp51, qui lui-même réagit avec une préparation d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 et finalement avec des anticorps spécifiques des immunoglobu-lines couplés à l'enzyme peroxydase.
enzymatique d'une chaîne réactionnelle consistant en une matrice sur laquelle est adsorbé un anticorps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'antigène gp51, cet anticorps étant mis en contact avec l'antigène gp51, qui lui-même réagit avec une préparation d'immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques de l'antigène gp51 et finalement avec des anticorps spécifiques des immunoglobu-lines couplés à l'enzyme peroxydase.
2. Procédé pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que l'anticorps monoclonal purifié adsorbé à la sur-face de la matrice est obtenu par la fusion cellulaire de cellules de rate provenant de souris immunisée avec de l'antigène gp51 avec des cellules de myélomes de souris, par la sélection et le clonage des cellules hybrides obtenues, par le développement des clones hybrides sélec-tionnés in vitro, par le transfert en souris des clones sélectionnés, par l'extraction des anticorps monoclonaux du liquide ascitique de ses animaux et par la purification des anticorps obtenus par chromatographie sur DEAE-Affigelblue.
en ce que l'anticorps monoclonal purifié adsorbé à la sur-face de la matrice est obtenu par la fusion cellulaire de cellules de rate provenant de souris immunisée avec de l'antigène gp51 avec des cellules de myélomes de souris, par la sélection et le clonage des cellules hybrides obtenues, par le développement des clones hybrides sélec-tionnés in vitro, par le transfert en souris des clones sélectionnés, par l'extraction des anticorps monoclonaux du liquide ascitique de ses animaux et par la purification des anticorps obtenus par chromatographie sur DEAE-Affigelblue.
3. Procédé pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que les préparations d'immunoglobulines dont les anticorps spécifiques se fixent sur l'antigène gp51, pro-viennent de bovidés ou d'autres espèces animales.
en ce que les préparations d'immunoglobulines dont les anticorps spécifiques se fixent sur l'antigène gp51, pro-viennent de bovidés ou d'autres espèces animales.
4. Procédé pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase sont obtenus à partir de sérums de lapins immunisés avec des immunoglobulines de chèvre qui sont clivées à la papaïne et sélectionnées par chromatographie sur échangeur d'ions et par chromatographie d'affinité sur Sépharose Immunoglobulines bovines.
en ce que les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase sont obtenus à partir de sérums de lapins immunisés avec des immunoglobulines de chèvre qui sont clivées à la papaïne et sélectionnées par chromatographie sur échangeur d'ions et par chromatographie d'affinité sur Sépharose Immunoglobulines bovines.
5. Chaînes réactionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique, caractérisées en ce qu'elles comprennent une matrice sur laquelle est adsorbé un anti-corps monoclonal purifié réagissant spécifiquement à l'anti-gène gp51, l'antigène gp51, les anticorps spécifiques de cet antigène présents dans une préparation d'immunoglobulines et, les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase.
6. Chaînes réactionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendication 5, caractérisées en ce que l'anticorps monoclonal purifié est obtenu suivant la revendication 2.
7. Chaînes réactionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendica-tion 5, caractérisées en ce que la préparation d'immuno-globulines dont les anticorps spécifiques se fixent sur l'antigène gp51 est obtenue suivant la revendication 3.
8. Chaînes réactionnelles pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique suivant la revendication 5, caractérisées en ce que les anticorps spécifiques des immunoglobulines couplés à l'enzyme peroxydase sont obtenus suivant la revendication 4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE896752 | 1983-05-17 | ||
| BE0/210776A BE896752A (fr) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | Procede et chaine reactionnelle pour la diagnostic de la leucose bovine enzootique. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA1197187A true CA1197187A (fr) | 1985-11-26 |
Family
ID=3862146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA000444335A Expired CA1197187A (fr) | 1983-05-17 | 1983-12-28 | Procede et chaine reactionnelle pour le diagnostic de la leucose bovine enzootique |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| BE (1) | BE896752A (fr) |
| CA (1) | CA1197187A (fr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2603382B1 (fr) * | 1986-08-28 | 1989-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de detection immunologique de la leucose bovine, les moyens de sa mise en oeuvre et leur application dans le domaine de la prophylaxie |
| US5151504A (en) * | 1989-11-17 | 1992-09-29 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Method for purification of monoclonal antibodies |
| PL239791B1 (pl) * | 2019-08-12 | 2022-01-10 | Bioscientia Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia | Test paskowy do wykrywania enzootycznej białaczki bydła i sposób wykrywania enzootycznej białaczki bydła z wykorzystaniem tego testu paskowego |
-
1983
- 1983-05-17 BE BE0/210776A patent/BE896752A/fr unknown
- 1983-12-28 CA CA000444335A patent/CA1197187A/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE896752A (fr) | 1983-09-16 |
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