JPH06506827A - 抗体およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体およびその使用方法 本発明は抗体に関するものであり、かつ詳細には、これに制限されるものではな いが、モノクローナル抗体、あるいは２特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）または ３特異的（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）等の長持異的（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆ　ｉ ｃ　）抗体を使用した診断用および治療用の方法に関する。

モノクローナル技術に基づく抗体検定は、〜殻的には研究室において訓練された 操作員により実施されなければならないため、その潜在能力を完全には発揮して いない、比較的簡単な検定でさえ、洗浄工程と手作業による数多い試薬の添加を 必要とする。広い分野に適用し得る１工程のシステムが必要とされている。

モノクローナル抗体はまた、疾患の治療においても用途が見いだされている。

例えば、体内の腫瘍を定位および治療するために、抗体蛋白に付着された、リジ ンおよび放射性沃素を包含する、毒性物質で腫瘍を破壊するモノクローナル抗体 複合体が使用されている。

モノクローナル抗体技術により２特異的抗体が開発されつつあり、２特異的免疫 グロブリンＧの例では、各々の２特異的抗体が特異性の異なる２つの抗原結合部 位を有している。２特異的抗体は、それぞれ目的物（１ｎｔｅｒｅｓｔ　）抗原 に対するモノクローナル抗体を分泌する２つの異なるハイブリドーマを融合して 、［時に゛′ポリドーマ（ｐｏ　ｌ　ｙｄｏ＋ｎａ）　”と称される、コ１つの 雑種ハイブリドーマまたは“ヒユーシーマ（ｆ　ｕｓｏｍａ　）　”を形成する ことにより製造され得る［Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ、　Ｓ　ａｎｄＬａｎｃｈｍ ａｎｎ　Ｐ、Ｊ、　（１９９０）　Ｃ１１ｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　７９． ３１５　ａｎｄ　５ｕｒｅｓｈ　ＨＲｅｔ　ａ戟@（１９８６） Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ　＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳΔξＩ３２．７９８９　ａｎ ｄ　ＧＢ２１６９９２１八コ、親ハイフ′リドーマは凛準ＨＡＴ選抜または選抜 可能な薬剤耐性の導入により取り除くことができる［Ｄｅ的抗体は慣用の免疫検 定に用いられた［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｃｕｅｌｌｏ＾、Ｃ，、（ １９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３（臣５３７］　、この抗体は、モノクローナル抗体 を分泌する細胞と免疫マウスからの牌！ｉａ胞とを融合することにより製造され た。第一結合部位は目的物抗原に特異的であった。酵素の結合部位である第二結 合部位はマーカー酵素に特異的であった。実際に行われた免疫検定は、検定感度 、信号に対するノイズの減少、染色処理の簡素化、および超微構造細部の保存を 増加させた。

２特異的抗体は、抗体との結合を維持する、腫瘍に対する効果器トキシンを目標 とする［Ｃｏｒｖａｌａｎ　ＪＲＦ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ　２４１３３コA あるいは細胞毒性キラー細胞上の細胞抗原と標的腫瘍とを交叉連結させる［Ｎ１ ｔｔａＴ、、　ｅｔ　ａｌ　（１９９０）　Ｌａｎｃｅｔ　３３５３６８　ａｎ ｄ　Ｆａｎｇｅｒ　ＭＷ　ａｎｄ　Ｇｕｙｒｅ　ＰＭ、　Ｔｉｂｔ■モ■@９゜ ３７５−３８０　（１９９１）］等の新規な治療方式において広範な用途が見い だされている。

２特異的または３特異的抗体の、１ヒ学的リンケージ等のその他の製法は、後者 の論文において総括されている。

ＷＯ２０１０７７１４明細書は、ある酵素が２特異的抗体と結合することにより 、熱変性に対して安定化される免疫検定を開示している。

Ｗ○９１１０９１３４明細書は、不活性な抗癌剤前駆体をその活性な形態に変換 する酵素とヒト癌細胞の双方と結合し得る２特異的抗体を開示している。この抗 体と酵素とを含む免疫複合体は、不活性な薬剤前駆体と共に癌患者に投与され、 最小限の副作用で癌細胞を選択的に殺すことができる。この酵素は活性な形態を 維持して抗体に結合している。また、ポリドーマの製造方法も開示されている。

本発明の目的の１つは、従来の免疫検定法よりも反応工程数の少ない、好ましく は１工程のみを含む免疫検定法を提供することである。

本発明の１つのｇ様によれば、ある抗原が１つの抗体抗原結合部位に結きするこ とが、隣接する第二抗体抗原結合部位からの他の抗原の放出を引き起す方法が提 供される。理論による裏付けを望むものではないが、新たな抗原と結きしていた 抗原との間の立体障害が、結合していた抗原の第二抗体抗原結合部位からの放出 を引き起こすのであると本発明者らは確信している。第一および第二抗体抗原結 合部位は、同一の長持異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体または物理的に 隣接する別の抗体により提供されることができる。”長持異的”という術語は、 ２特異的および３特異的抗体等の、１つより多い抗原結合部位を有する抗体全て を包含する。

第一部位への他の分子の結合を介する第二部位からの結合分子の放出は、抗体仲 介信号形質導入（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａ ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と名付けることができる０本文中で用いられる゛′抗体パ という術語は、ＩｇＧ、ＩｇＡ−ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等の免疫グロブリ ン、ならびに自然に生じる抗体または組換えＤＮＡ技術またはその他の頭似の方 法全てにより製造される抗体の抗原結合特性を有する他の蛋白質を包含する。

本発明者らは、非常に高い濃度、標準的な濃度が典型的には１〜５　ｕｇ／ｍｌ であるのに対し、例えば１０〜１００１１ｇ／ｍｌ　よりも高い濃度でマイクロ タイタートレー（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｔｒａｙ）上に抗体がコーティングさ れると、ある抗体抗原結合部位が隣接する第二抗体抗原結合部位に結合した他の 抗原の放出を引き起こし得るほど隣接する抗原結合同士が非常に近接して配置さ れるという、驚くべき知見を得た。好ましい実施態様において、免疫検定は、約 ２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約５０　ｌＩｇ／ｌａｌよりも高い蛋白質濃度で容 器表面に抗体を結合させることを含む。

第２の抗原は第二抗体抗原結合部位に不活性な形態で結合され、そして第１の抗 原が第一抗体抗原結合部位へ結合する際に活性な形態で放出されることができる 。第２の抗原は、薬剤またはその他の治療用作用素、酵素または池の検出可能な マーカー、あるいは化粧用作用薬であることができる。この酵素は、例えば、β −ガラクトシダーゼまたはウレアーゼであることができる。

モノクローナル抗体は癌治療薬剤の作用をブロックすると報告されている。例え ば、抗体Ｎｏ−１は強い抗癌薬剤であるマイトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒ ｏｎｅ　）の細胞毒作用を中和する［Ｆｌａｖｅｌｌ　ＳＯ，Ｆｌａｖｅｌｌ　 ＤＪ（１９９１）　Ｂｒ、Ｊ、ｌ（ａｅｍａｔｏｌ、　７８．３３０−３コ。本 発明による、薬剤に方向付けられた結き部位を１つ備え、その薬剤を不活性にす る２特異性抗体は、この２特異性抗体の第二抗原結合部位が方向付けられている 分子の発現部位において活性な薬剤を放出する。

第二抗原結合部位からの抗原の放出は、放出された抗原、例えば、酵素または別 の触媒分子の、あるいは存在するならばその反応生成物の１つ、例えば、放出さ れた抗原により触媒された反応の反応生成物の、隣接する抗体上の第三部位にお ける結合を誘導することができ、それにより、隣接する第四抗原結合部位からの 第三の結き抗原の放出を引き起こすことができる。

診断用長持異的抗体は、第２の゛治療”型多特異的抗体における治療用作用素の 放出を誘導することができるが、それは、診断用インジケータのＭｌの抗体の第 −結合部位への結合が第１の抗体の第二結合部位にすでに結合していた酵素の放 出をもたらし、この放出された＃紫またはその反応生成物の１つが第２の抗体に 結合し、そして次に、この二番目の結合事象（ｅｖｅｎｔ　）が第２の抗体に結 合されていた治療用作用素の放出を引き起こす、カスゲート作用による。酵素の 反応生成物の結合は、初期結合信号の増幅を生むので、好ましいことである。や はりカスケード作用により作動する診＠／治原用の３特異的抗体では、第一抗原 結合部位が診断用マーカーに方向付けられ、第二部位がインジケータ酵素に方向 付けられ、そして第三抗原結合部位が不活性な形態で治療用作用素を担うことが できる。抗体をその用途に適するように誂えることが可能であることは理解され よう。

例えば、１０の異なる反応工程を特徴とするＩｇＭ抗体が使用され得る。

好ましい実施態様においては、ある抗原結合部位が、触媒酵素の活性部位または 治療用薬剤の作用にとって本質的な分子成分等のインジケータ／治療の活性部位 あるいはその近傍における分子結合により、不活性な形態で診断用または治療用 の作用薬を保持する。診断方法において、第二抗原結合部位は、疾患または微生 物等を示すマーカー等の試験対象分子に対して方向付けられる。このマーカーの 存在下に、不活性な形にで保持された作用薬が、２つの異なる抗体抗原結合部位 の非常な近接による立体障害の結果として、活性な形態で放出される。治療用途 においては、結合された不活性な作用薬が、前記の試験対象の診断用分子または 他の抗原、あるいは治療が実施されているＨ菌、ウィルスまたは他の微生物に担 われた分子または他の抗原の存在により放出されることができる。

本発明の抗体の診断用の使用は、さらに以下のことを包含する。

羊水、＠頭の吸引液、消化管の吸引液、血液、組織切片中の５Ｐ−Ａの測定。

５Ｐ−Ａの不存在または低いレベルがリスクを表す、呼吸困難症候群（ＲＤＳ） のリスクの評洒。

ＲＤＳ患児および成人ＲＤＳの成人患者における肺機能の状況の監視。５Ｐ−Ａ の増加したレベルが正常な肺機能を表す。

人工表面活性物質置換治療の首尾の監視、肺機能の状況の回復は５Ｐ−Ａの状況 により特徴ｒ寸けられる。

異なる抗体からの２つの異なる結合分子の放出は、双方の放出分子が存在すると きにのみ起こる反応を起こすことができる１反応生成物は、基質の放出を誘発る ことかできる。インヒビンのＡ鎖とＢ鎖の存在下に、グルコースはグルコースり 変換される６陽性結果が得られる前に２つの異なる抗原部位が検出されねばなら ない従来の抗原捕獲検定と同じく、陽性結果が得られる。

により、提供され得る。前記事象（ｉ）は細胞間形質導入であると考えられ、同 時に前記（ｉｉｉ）は細胞内形質導入であると考えられる。前記事象（ｉｉ）は 細胞る分泌された免疫グロブリンを分離するための処理により、経済的に達成さ れ得不動化した酵素、治Ｉ用薬荊または診断用分子を使用したクロマトグラフィ ーまを示す放出された活性酵素の活性を検出することを含む、即ち、本発明のこ の態様は１反応工程を含む簡単な免疫検定方法を提供する。

理論による裏付けを望むものではないが１本発明者らは、新たに結合した抗原式 で酵素と結合して、酵素が抗原の不存在下に結合を解くことがないようにするべ きである。酵素は、その活性部位で抗体と結合することが好ましい。

例えば、その欠乏が早産の未熟児に起こる呼吸困難症候群のリスクのインジク原 であってもよい、この呼吸状態は全新生児の２％と冒し、そして生後１週間以シ ダーゼて′あることができる。また、前記第２の酵素はホースラディッシュベル ンサに用いて、ヒトゴナドトロピン［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｃ＾、　ｅｔ　ａｔ　 （１９８７）　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ出されている。しかし、検出用抗体は抗体 結合抗原の測定前に洗浄によって除去されてしまうにちがいないことおよび酵素 の再生にも問題があることがら、一般的適用は不可能であると証明されている０ 本発明の方法は内在性酵素（ｉｎｔ＋４ｒａｌｅｎｚｙｍｅ　）を使用するので 、２特異的抗体は１極および半導体変換器に直接組み込まれることができる１例 えば、酸素電極またはイオン応答性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）はグル コースオキシダーゼを結合した２特異的抗体を含むことができ、あるいは、尿素 ｔ８ｉまたは化学的感応性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）はウレアー ゼを結合した２特異的抗体を含むことができる。

酵素および本発明の方法に用いられ得る長持異的抗体の調製の例を下記に記載す るが、これらは単に例示のためのものにすぎない。

β−ガタクトシダーゼは充分に特性付けられており、そしてその活性は容易に検 定され得る。

グルコースオキシダーゼはアスパラギルス・ニゲル（ｂ匹」±山徂山二）カら安 価に分離され、１８６ｋＤの分子量を有する。グルコースオキシダーゼはマでき る［Ｋｏｚｕｌｉｅ　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）＾ｐｐｌεｉｏｃｈｅｍ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１５．２８５コ、グルコースオキシダーゼ多量体のサ イズは化学反応により調節することができる。グルコースオキシダーゼは、酸素 電極の酵素成分として使用され得る。

タチナタマメから安価に分離され得るウレアーゼは、分子量５９０ｋＤの６量体 （ｈｅｘａｍｅｒｉｃ　）蛋白であり、９６ｋＤのサブユニット各々に１つの活 性部位を炭酸脱水素酵素は二酸化炭素の水和および炭酸水素塩からの説水を触媒 し、そしてヒト赤血球から安価に分離され得る。

ホースラディツシュペルオキシダーゼは充分に特性付けられたヘム部位を有する ［Ｌａ　Ｍａｒ　ＧＮ　ｅｔ　ａｔ　（１９８０）　Ｊ　Ｂｉａｌ　Ｃｈｅｍ　 ２５５．６６４６］、ホースラディツシュペルオキシダーゼは、グルコースオキ シダーゼにより生成されてホースラディツシュペルオキシダーゼの基質として作 用する過酸化水素による酵素カスケードを生じさせるために、グルコースオキシ ダーゼを第一部位に、かつホースラディッシュペルオキシダーゼを第二部位に備 えた、２つの部位による免疫検定方法（を−。

５ｉｔｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ）に用いることができる。

以下に、本発明による抗体の調製およびそれらの使用方法を、羊なる例示である 図１〜５を用いて説明する。まず、図面の簡単な説明する。

図１は、本発明による抗体の働きを説明している。

図２は、本発明による抗体の用途を説明している。

図３は、本発明による抗体から放出された酵素の活性を説明しているグラフであ る。

図４は、本発明による抗体から放出された酵素の活性を説明しているグラフであ る。

図５は、本発明による抗体から放出された酵素の活性を説明しているグラフであ る。

区１に示される免疫グロブリンＧ型の２特異的抗体は、第１の抗原１６および第 ２の抗原１８との結合にそれぞれ用いる第−結合部位１２と第二結合部位１４と を含む。第１の抗原１６の第一抗原結合部位１２への結合は、結きしていた第２ の抗原の第二結合部位１４がらの放出を引き起こす。

（２１２ｉ）に示される診断用途において、２特異的抗体２ｏは、目的物の分析 物２６、例えば５Ｐ−Ａ、ならびに容易に検出可能な基質変換活性を有する酵素 ２８、例えばβ−ガラクトシダーゼにそれぞれ方向付けられた第一抗原結合部位 ２２と第二抗原結合部位２４を有する。この酵素２８は、第二結合部位２４て抗 体に結合しているときには、例えばその活性部位または活性部位近傍での結合、 あるいは活性部位の立体構造の変ｆヒによる結合により、不活性化されている。

試料から第−結き部位２２への分析物２６の結合は、前記分析物２６の存在３示 す酵素２８の活性が容易に検出され得る媒体中への、結合していた酵素２８の放 出を引き起こす。

図２目）て′説明される治療用途において、２持異的抗体３ｏは、癌細胞の表面 上の抗原３６および抗癌薬剤３８にそれぞれ方向付けられた第一および第二結合 部位３２．３４を有している。前記薬剤３８は、第二結合部位３４て抗体に結合 しているときには不活性化されている。前記抗原３６の第−結合部位３２への結 合は、抗原３６を発現する癌細胞に対して作用し得る活性な形態での結合藁屑３ ８の放出を引き起こす。

図２１ｉｉ）に示される診断および治療を組み合わせた用途においては、２つの 異なる２特異的抗体４０．４２が使用される。抗体４０はａａｌｌ胞に担われる 抗原４４および不活性な形態で結合する酵素４６に対するｆｉ＋異性を有してい る。抗体４２は、抗癌薬剤４８ならびに酵素４６または該酵素の反応生成物に対 する特異性を有している。前記抗Ｎ４４の抗体４０への結合は、活性な形態での 前記酵素４６の放出を引き起こす、この放出された酵素の活性は容易に検出され 得る１次に、前記酵素４６またはその反応生成物の１つが第二の抗体４２に結合 し、それにより薬剤４８の放出が引き起こされて抗原４４を発現する癌細胞を殺 す。

２特異的抗体はハイブリドーマ細胞融合技術により簡単に調製することができる 。最初に、適切なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が分離され 、そして特性付けられる１次に、親ａｒＷ！１系が種々の選択培地における生長 による薬剤耐性を発現させられる。これらの薬剤耐性クローンは、次いで、異な る薬剤耐性のＭ細胞系の間の、あるいは薬剤耐性ハイブリドーマと免疫マウス由 来の膵臓細胞との間の細胞融合による２特異的抗体生産に使用される。細胞融合 および選抜の後、培養物は所望の反応性を有する抗体生産のためにスクリーニン グされる。選択された培養物はクローン化され、そして免疫検定により、このヒ ユーシーマによる２特異的免疫グロブリンの分泌が確認される。

本発明の使用において、分泌される免疫グロブリンは蛋白Ａアフィニティクロマ トグラフィーにより濃縮される。次いで、濃縮された抗体がシーゲンシャルアフ ィニティクロマトグラフィ一工程に掛けられて、均質な２特異的免疫グロブリン が分離される。

２居ｊ１に百蛤へ調製 Ａ）　適　ｔモノクローナル　を　ｉ・、するハイブリドーマの；。制２特異的 抗体はヒユーシーマ技術により簡単に調製される。

最初に、モノクローナル抗体を分泌する細胞系を、目的物酵素および細胞毒性薬 剤メトトレキセートに対して分離する。

メトトレキセートを、抗原（酵素）提示の際の免疫原性を増加させるために卵白 アルブミンと連結する。免疫化のために、天然の形態で、あるいは免疫原性を強 化するためにキーホールリンベントヘモシアニンとの複合体として、酵素を使用 する。

免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清反応を監視し、そして適切な反応の世代にお いて免疫マウス由来の膵臓細胞をマウスの５Ｐ２１０骨髄腫細胞に細胞融合する ことにより、ハイブリドーマを調製する。まず最初に、ハイブリドーマを、標的 抗原またはメトトレキセート複合体に対して、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩ 　ＳＡ）によりスクリーニングする。次に、酵素に対する抗体を分泌するクロー ンｒヒハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を、酵素仲介基質変 換反応をブロックする能力でスクリーニングする。そのような反応をブロックす る能力と有するモノクローナル抗体は、酵素の活性部位またはその近傍で結合す る次に、適切なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを毒性培地中で培 欠損変種を選択する。

チオグアニン耐性を誘導するために、４Ｘ１０’個のハイブリドーマ細胞を６× ４８ウエルの組織培養用培養板肉に分けて蒔いたが、これらのウェル内には１０ ％（ｖ／ｖ）熱不活性化つシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むアルファＭＥＭ培地［５ ｔａｎｎｅｒｓ　ＣＰ、　Ｅｌｉｃｅｒｉ　Ｇ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅ’ｎ　Ｈ１９ ７１，Ｎａｔｕｒｅ、　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ　２３０，５Q］、 Ｊ７７４マクロファージ細胞系からの２０％（ｖ／ｖ）調整培地［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９７７３７．５４６］−および５１ＪＥＩ／＋１１１の６ −チオグアニン（Ｓ　ｉｇｍａ　Ａ４６６０　）が含まれていた。はぼ３週聞役 、薬剤耐性クローンのクローン外層が観察された。

クローンをピペッティングによりウェルから取り出し、モして続代培養した。抗 体の分泌登確認し、選抜培養物を貯蔵した０次にこれらの変種を、標準１（ＡＴ 選抜システムＥＬｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ　Ｊ、Ｗ、　（１９６４）　５ｃｉｅｎ ｃｅ　１４５．７０９］により選抜する。

薬剤耐性細胞もまた、Ｖ乳動物細胞膜のナトリウム−カリウムＡＴＰアーゼを阻 害する強心配糖体であるウアバインく。ｕａｂａｉｎ）の濃度を増加させた培地 における培養により選抜する。ウアバインの存在下では野生型細胞は死亡するが 、耐性クローンは１８０ホルト（ｆｏｌｄ）を越える薬剤濃度中で生長すること ができる［Ｍａｎｋｏｖｉｔｚ　Ｒｅｔ　ａｌ　（１９７４）　Ｃｅ１ｌ　３． ２２１］　。

ウアバイン耐性３誘導するために、２Ｘ１０’個のハイブリドーマを培養し、そ してアルフｙ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む１μＭがら０．５ｍ Ｍまで増加させた濃度のウアバイン買Ｓｉｇｍａ　０３１２５）を合わせた培地 で該ハブリドーマを継代培養した。

２重薬剤（即ちウアバインおよびチオグアニン）耐性を誘導するために、上記と 同様に増加させた濃度のウアバイン中で細胞を生長させた。０．５ｍＭウアバイ ン培地中での生長が可能となった細胞に、上記と同様にして６−チオグアニンに 対する薬剤耐性を誘導した。

６−チオグアニンおよびウアバインに対する耐性を有するハイブリドーマを、ヒ ユーシーマの生産のためにクローニングした。

ｂ）　ζエニＡニヱ０工厘 一連の細胞融き実験における慣用技術により、２特異的抗体を分泌するヒユーシ ーマを生産し、酵素反応性結き手（ｅｎｚｙｍｅ−ｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｒｍ） および目的物抗原と認識する第二抗体結合部位を備える２特異的抗体を生産する しューゾーマを選抜する。ヒユーシーマを、免疫マウスの膵臓細胞またはハイブ リドーマである゛酵素反応性細胞″、および゛抗原反応性細胞”から誘導する。

抗原反応性細胞の例は、４３ｋＤの卵白アルブミンを認識する抗体Ａ１５．８０ ０ｋＤのキーホールリンベントヘモシアニンを認識する抗体ＫＬＨ１，ならびに 双方共にヒト肺表面活性物質アポ蛋白Ａ（ＳＰ−Ａ）と反応する抗体Ｄ４および Ｅ８　ＥＲａｎｄｌｃＢＪｅｔ　ａｌ　（１９９２）準備中コを生産する細胞と 包含している。抗体Ｅ８は、クロモらの論文［Ｋｕｒｏｋｉ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ　 、八ｍ、　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１９８６１２４；　２５−３３コに記載された抗 体ＰＥｌ０に票似しているものと考えられている。下記に示す３組の実験により 細胞融合実験を実施する。

第−組：　抗原反応性または酵素反応性でありチオグアニンに耐性なＨＡＴＳ受 性ハイブリドーマと、酵素反応性または抗原反応性の免疫マウスの膵臓細胞との 融合、および該融合細胞のＨＡＴ選抜。

第二組：　抗原反応性または酵素反応性のどちらか一方であるチオグアニン耐性 ハイブリドーマと、該ハイブリドーマが抗原反応性であるときには酵素反応性で ありその他の場合には抗原反応性であるウアバイン耐性ハイブリドーマとの融合 、および該融合細胞のウアバイン−チオグアニン培地による選抜。

第三組：　抗原反応性または酵素反応性のどちらか一方であるチオグアニン／ウ アバイン２重耐性ハイブリドーマと、該ハイブリドーマが抗原反応性であるとき には酵素反応性でありその他の場合には抗原反応性である野生型ハイブリドーマ との融合および該融合細胞のＨＡＴ−ウアバイン培地中での選抜。

細胞融合は標準的な技術により実施する。チオグアジン耐性ハイブリドーマを免 疫マウス由来譚ｍ細胞とそれぞれ１：１０の細胞比率で混合しく第一組）、そし て血清未含有培地中で５０％（ｗ／ｖ　）ポリエチレングリコール１５００の存 在下に７５秒間インキュベートすることによりヒユーシーマを調製する。細胞融 合事象を、血清含有生育培地の一定時間後の添加により終了させる０次に、ヒユ ーシーマをマルチウェル培養機内に８００以上の別々の培養として植え、そして ２会によりヒユーシーマを生産するときく第二組）には、融合に先立ち１：１の 比率で細胞同士を混合する。融合事象は血清未含有培地中で５０％（ｗ／ｖ）ポ リエチレングリコール１５００の存在下に７５秒間実施する。この反応は、一定 の速度で５分間にわたる血清含有培地の添加により終了させる。得られたヒユー シーマは、マルチウェル培養機内で２００の別々の培養として、５　ｕｇ／ｒｎ Ｉチオグアジンと０．５ｍＭウアバインを含有する選抜培地中に植える６３７℃ にて５％（ｖ／ｖ）ｃｏ、空気中で２週間インキュベートした後に、培養を調査 する。

２重薬剤耐性ハイブリドーマと野生型ハイブリドーマとの融合によりヒユーシー マを生産するときく第三組）には、融合に先立ち１：１の比率で細胞同士を混合 する。融合事象は、血清未含有培地中で５０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコー ル１５００の存在下に７５秒間実施する。この反応は、一定速度で５分間にわた る血清含有培地の添加により終了させる。ヒユーシーマは、マルチウェル培養機 内で２００の別々の培養として、０　、５　ｍ　Ｍウアバインを含有するＨＡＴ 選抜培地中に植える。

次に培養物を前記酵素またはメトトレキセートの認識でスクリーニングする。

そして、反応性培養物を選択された抗原の認識に関して試験する。培養物を、酵 素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、選択された抗原と反応する抗体の 分泌でスクリーニングする。ウェル当たり５０μ】の０．１Ｍ炭酸Ｍ衝液（ｐＨ ９，６）中において４℃で一晩インキユベートすることにより、５〜１０１１ｇ ／ｍｌの濃度で９６−ウェル培養板上に抗原を不動化する。１０％（ｖ／ｖ）ウ シ胎仔血清を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をウェル当たり１００μ！用いて 、室温で２時間に互って培養板をプロ・ツクした。試験される培養上澄みを、ウ ェル当たり５０μｍで重複して試験に供し、そして室温で１時間インキュベート する。この培養板を０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、 次いで、第二層酵素に結合した抗マウス免疫グロブリン抗体を用いて、酵素基質 変換の連続的な検出により結合抗体を検出する１次いで、２特異的抗体を分泌す ると同定されな培養物を限定希釈および単細胞手技の標準的な技術によりクロー ン化して、ミリグラム単位の量の分泌免疫グロブリンを生産するために培養する 。そして分泌された抗体を、イオン交換クロマトグラフィーにより特性付けし［ １＋ＩｏｎｇＪＴ　ａｎｄＣｏｌｖｉｎ　Ｒｅ　（１９８７）　Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　１３９．１３６９］　、実験的な於断に使用するために精製する９本 実施例においては、免疫グロブリンの精製のためにアフィニティクロマトグラフ ィーを用いた。

検定Ｏ！」 ヒユーシーマにより分泌される２特異的免疫グロブリンまたは濃縮免疫グロブリ ンを、ＥＬＩＳＡコーティングｆｆｆｆ１液中でインキュベートしてマルチウェ ル培養板上に不動化する。培養板は、１０％（ｖ／ｖ）Ｆｅ２を含むＰＢＳでブ ロフクする１次に、前記抗体を酵素含有培地中でインキュベートすることにより 酵素と結きさせる。未結合酵素は洗浄により除去し、そして抗体酵素複合体は使 用準備が整う。

前記複合体は抗体を測定するために２つの異なる方法で使用する。第一番目の配 接合体に添加する０両方の場合において、試料中の抗原の存在を示す基質変換住 ｌ：＋５　を　二する２、・ 動物、ｌ１ｌｌ！１１培養コレクシヨン［ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｎ１ａａｌ　Ｃａ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ■B Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏ＊ｎυｎ１ｔｅｄ　Ｋｒｎｇｄｏｔａｌに寄託されている。

この細胞系は、アルファＨＡＴ培地中で慣用の方法にて培養され、撹拌しない単 層培養生長条件において、１ｍｌ当たりほぼ５μｇの免疫グロブリンを生産す用 いた標準的なアフィニティクロマトグラフィー技術により分離した。簡潔に説濃 縮された画分の間接ＥＬＩＳＡによる抗体力価は、β−ガラクトシダーゼに対し ては１・１０６、そして５Ｐ−Ａに対しては１：１０’であった。

−゛ラクトシ　−ゼお　び５Ｐ−Ａ　の切＝を　六　７　、、濃縮ＧＡＬ３０． １９を抗原捕獲ＥＬＩＳＡ方式に用いて、β−ガラクトシダーゼおよび５Ｐ−Ａ を検出することができる。簡潔に説明すれば、炭酸水素塩緩衝板（Ｆａｌｃｏｎ 　Ｃａｔ　Ｎｏ、　３９１２）にコーティングした。１０％（ｖ　／　ｖ　）　 Ｆ　ＣＳ　？：含むＰＢＳをウェル当たり１００μｌ用い、培養板をＮ温で２時 間ブロックした。

β−ガラクトシダーゼ抗原捕獲： ０から１００　ｕｓ／ＩＩｌの増加した濃度のβ−ガラクトシダーゼを５０μｍ 容積づつ研究に供し、室温にて１時間インキュベートした。０５％（ｖ／Ｖ）ツ イーン２０を含むＰＢＳ　２００μｌを用いてウェルを２回洗浄し、そして結合 β−ガラ（Ｓｉｇｍａ　Ｎ−１１２７；○ＮＰＧ）２０．５ｍｇを含む、０ＮＰ Ｇ溶液８３２μｌをリン酸緩衝液５ｍｌに添加したが、この緩衝液は、ウシ血清 アルブミン（ｂｓａ）と塩化マグネシウムを下記の割合： ２．７ｍｌ　０．１Ｍ　ｐＨ７，３リン酸緩衝液：０．５％（ｗ／ｖ　）　ｂ　 ｓ　ａを含む０．１ｍｌ　０．０３Ｍ塩化マグネシウム、で含有していた。抗原 捕獲方式において、ＧＡＬ３０．１９は、最小限１ｍｌ当たり５μｇのβ−ガラ クトシダーゼを検出した。

５Ｐ−Ａ抗原捕獲： Ｓ　Ｐ−Ａｌ１．　Ｐ　Ｂ　Ｓ中の１：３０２８ビオチンのウェル当たり５０μ ｍの添加（このインキュベーションの後、培養板をツイーン２０を含むＰＢＳて ２回洗浄し、ニルホスフェ−１〜の六水和物　二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　１０ ４−１０５Ｅ）への変換るこより検出した。簡潔に説明すれば、ウェル当たり５ ０μｍの基質、即ち″ア／Ｌ力ｌノホスファターゼ基質”を１Ｍジェタノールア ミン緩衝液（ｐＨ９，８＞１ｍｌ当たり１ｍｇで添加した。アルカリホスファタ ーゼ基質緩衝液は、ジェタノールアミン９７ｍ１、水８００ｍ１、塩化マグネシ ウム六水和物１００ｍｇからなる１０（Ｖ／Ｖ）ジェタノールアミン緩衝液を含 んでいた。１Ｍ塩酸を該液のｐＨが９．８となるまで添加し、次に水を添加して その体積を１リツトルとした。

使用するまで４℃の暗所にて貯蔵した。酵素による基質変換は、４１０ｎｍにお ける光学濃度の測定により検出した。この抗原捕獲方式を用いたときに、Ｇ　Ａ 、　Ｌ３０．１９は最小限６．２５μｇ／ｍ　ｌの５Ｐ−Ａを検出することがで きた。

ＧＡＬ３０．１９によるβ−ガラクトシダーゼ活性のブロック１　ｍｇ／…１の 濃縮ＧＡＬ３０．１９免疫グロブリン５０μＩをβ−ガラクトシダーゼのＰＢＳ 溶液５０μｌに添加して５００μｇ／…１の濃度とした。これにβ−ガラクトシ ダーゼ基質１００μｍを添加して４１０ｎｍにおける光学濃度で基質変換を監視 した。抗体溶液の代わりにＰＢＳ　５０μｍを用いた対照実験も平行して実施し た。５公開後、試験試料中の酵素生成物の光学濃度は、抗体の不存在下では０． ９２０、そしてＧＡＬ３０．１９の存在下では０．５９７であった。

ことを明示している。

均質化のための２特異的ＧＡＬ３０．１９免疫グロブリンの精製均質な２特異的 免疫グロブリンを、シーケンシャルアフィニティクロマトクラフ１−により濃縮 抗体から分離した。選抜方法はシーケンシャルアフィニティクロマトグラフィー てあった。第一抗原部位を保有する免疫グロブリンを、精製５Ｐ−Ａを保有する ビードマトリックスを用いたアフィニティクロマトクラフィーにより分離した。

溶離は標準的な１Ｍジエチルアミン（ｐＨ１１）を用いで行い、そして画分は１ Ｍトリス塩酸（ｐＨ８＞にて中和した。中和した画分を０２５セフアデツクス（ 商標）ア過を用いてＰＢＳに緩衝液交換して゛脱塩゛シた。

この試料を次に、β−ガラクトシダーゼを保持するビードマトリックスをゲルマ トリックスが保持しているクロマトグラフィーゲルを用いた第二のアフイニテイ クロマトグラフイ一工程に供した。ＤＥＡ溶離を実施し、均質な２特異的抗体を 脱塩し、そして０．０２％アジドを含むＰＢＳ中に、使用時まで４°Ｃにて貯蔵 した。クロマトグラフィーの完了時には、′ａ縮免疫グロブリン２　、７　ｒｎ 　ｇ力）ら工句質Ｇ　Ａ　Ｌ　３０　、１９のＨ鎖およびＬ鎖の存在は、前記均 質な試料の還元条件下における１、０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ　ＰＡＧＥ電気泳動法 により確認した。

抗体仲介信号形質導入の明示 実施例１．濃縮免疫グロブリン検定（［１３参照）０．０５％（Ｖ／〜・）ツイ ーン２０を含むＰＢＳ２００Ｊ１１で２回洗浄し、不動化した形質導入複体複ａ ・体から未結合酵素を取り除いた。

次に、洗浄緩衝液で希釈した、６２５〜１００　ｕ８／ｍｌの増加した濃度の、 特異的抗原５Ｐ−Ａ、分子１８００ｋＤ（ダルトン）の非特異的抗原Ｋ　Ｌ　Ｈ ｌおよび分子ｆｉｌｏｏｏｋＤの非特異的抗原１ｇＭであるマウス免疫グロブリ ンμを、５０μｌ容量づつ重複してウェルに供した。１５分間後にその上澄みを 取り出して、β〜ガラクトシダーゼ基質変換により、複合体からの酵素の放出３ 評価した。

試料５０μｍ容量をβ−ガラクトシダーゼ基質緩衝液５０μｍとインキュベート した。基質から生成物への変換は、前記上澄み中に放出された酵素の存在を示す 、４１０ｎｍにおける光学濃度により測定した。

形質導入複合体からの酵素の放出は、β−ガラクトシダーゼ基質変（ヒ、および ４１０ｎｍにおける生成物光学濃度の測定により、前記上澄み中で測定された。

１２００にダル１ヘンの分子量を有する５Ｐ−Ａの存在下でのみ酵素が放出され 、類似する分子量の抗原であるＫＬＨ（８００ｋＤ）およびＩｇＭ（１０００ｋ Ｄ）の存在下では酵素は放出されなかった。この効果は滴定することができ、そ して高濃度の５Ｐ−Ａにおいて飽和効果が記録された。

この方式では、ＧＡＬ３０．１９形質導入抗体は、最小限６．２５μ８７珀１の ５Ｐ−Ａを検出する。

実施例２．精製２持異的免疫グロブリン検定特異的抗原の存在下に、酵素の放出 が明示されたく図４μ照）。

ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液である炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，６）をウェル 当たり５０μｌ用い、該液１ｍｌ当たり２０μｇで、精製ＧＡＬ３０ｉ、９免疫 グロブリンを４°Ｃにて一晩インキユベートして容器表面をコーティングしな。

培！板分、１０％　（ｖ／ｖ）Ｆｅ２を含むＰＢＳをウェル当たり１００μｊ用 いて室温で２時間ブロックした。次に、ウェルを、０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清 アルブミン（ＳｉｇｍａΔ７８８Ｂ　）を含有するＰＢＳ洗浄洗浄緩衝液１当ｌ 当２０μｇのβ−ガラクトシダーゼを含む液５０μｍと室温で１時間インキュベ ートした。そして、ウェルをツイーン２０を含むＰＢＳで２回洗浄して、未結合 酵素を不動化した形質導入抗体複合物から取り除いた。

次に、洗浄緩衝液１ｒｎｌ当たり６．２５〜１００μｇに希釈した濃度範囲の特 異的抗原５Ｐ−Ａおよび５Ｐ−Ａによく似た分子量の非特異的抗原ＫＬＨを５０ μＩ容量づつ、重複してウェルに洪した。１５分間後、上澄みを収り出して、β −ガラクトシダーゼ基質変換により前記複合体からの酵素放出を評価した。

笑施例３．ｆｉ１ｇ！２特異的免疫グロブリンを用いた１工程抗体仲介信号形質 導入検定（図５参照） もたらしたことを明確に示している。

Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒｅ　４ Ｆｉｇｕｒｅ　５ 国際調査報告　。、□７゜Ｑ　Ｑ７／ｎｎ７ＡＱフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｍ　１／３４　Ｆ 　７２２９−４ＢＣ１２Ｎ　５／２０ ＧＯＩＮ　３３１５３６　Ｚ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　５／２０ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、Ｕ Ｓ Ｉ

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．第１の抗原の第一抗体抗原結合部位への結合が隣接する第二抗体抗原結合部 位からの第２の抗原の放出を引き起こす、抗体からの抗原放出方法。
2. ２．前記第一および第二抗体抗原結合部位が同一の抗体により提供される、請求 項１に記載の方法。
3. ３．前記抗体が２特異的抗体、３特異的抗体または他の多特異的抗体である、請 求項２に記載の方法。
4. ４．前記第一および第二抗体抗原結合部位がそれぞれ第１および第２の抗体によ り提供される、請求項１に記載の方法。
5. ５．生体内または試験管内で実施される診断用、治療用または美容用の方法であ る、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の方法。
6. ６．前記第２の抗原が酵素または他の検出可能なマーカーである、請求項５に記 載の診断用の方法。
7. ７．前記第２の抗原が治療作用薬である、請求項５に記載の治療方法。
8. ８．前記第一および第二抗体抗原結合部位が、２０μｇ／ｍｌを越える蛋白濃度 で表面に結合された、１つの抗体または第１および第２の抗体により提供される 、請求項６に記載の方法。
9. ９．前記抗体が５０〜１００μｇ／ｍｌの蛋白濃度で表面に結合されている、請 求項８に記載の方法。
10. １０．前記表面がマイクロタイタートレーのウエルの表面である、請求項８また は９に記載の方法。
11. １１．前記第２の抗原が第二抗体抗原部位に不活性な形態で結合しているかまた は該部位に結合することにより不活性となり、かつ第１の抗原の第一抗体抗原結 合部位への結合の際に活性な形態で放出される、請求項１〜１０のいずれかひと つに記載の方法。
12. １２．前記第２の抗原が薬剤または他の治療作用薬、酵素または化粧用作用薬で ある、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記第２の抗原の第二抗原結合部位からの放出に引き続き、該放出された 第２の抗原または該第２の抗原の反応生成物の第三抗原結合部位への結合が起こ り、それにより、隣接する第四抗体抗原結合部位からの該部位に結合していた第 ３の抗原の放出を引き起こす、請求項１〜１２に記載の方法。
14. １４．診断用マーカーおよび酵素または他の検出可能な診断用インジケータにそ れぞれ対する第一および第二抗原結合部位を有し、抗体への結合が前記酵素また は他の検出可能なマーカーを不活性にする第１の抗体、該酵素または他の検出可 能なマーカーあるいは該酵素または他の検出可能なマーカーの反応生成物、ある いはそれらにより触媒される反応の反応生成物に対する第一抗原結合部位と薬剤 または他の治療作用薬に対する第二抗原結合部位を有する第２の抗体をそれぞれ 含み、前記第１の抗体に対する前記診断用マーカーの結合が、活性な形態での前 記結合した酵素または他の検出可能な診断用マーカーの放出を引き起こし、そし て、該酵素または他の検出可能な診断用マーカーが前記第２の抗体に結合して、 結合した薬剤または他の治療作用薬の該第２の抗体からの放出を引き起こす、請 求項１３に記載の方法に使用するためのキット。
15. １５．診断用マーカーに方向付けられた第一抗原結合部位、インジケータ酵素に 方向付けられた第二抗原結合部位、および不活性な形態で担われる結合した薬剤 または他の治療作用薬を有する第三抗原結合部位を含む、請求項１３の方法に使 用するための３特異的抗体。
16. １６．疾患または微生物を示すマーカーである第１の抗原に方向付けられた第一 抗原結合部位ならびに薬剤または他の治療作用薬に方向付けられた第二抗原結合 部位を有し、該第１の抗原の第一抗原結合部位への結合が第二結合部位からの前 記治療作用薬の放出を引き起こす、多特異的抗体。
17. １７．前記薬剤または他の治療作用薬が不活性な形態で前記第二抗原結合部位に 結合するか該部位に結合することで不活性な形態となる、請求項１３〜１６のい ずれかひとつに記載のキットまたは多特異的抗体。
18. １８．１つの抗原結合部位から薬剤前駆体が放出され、そして別の部位からは別 の薬剤前駆体が放出されるが、このとき、これらの薬剤前駆体は互いにもう一方 の薬剤前駆体が存在するときに活性となる薬剤前駆体である、請求項１〜１７に 記載の治療用の方法。
19. １９．第１および第２の酵素がそれぞれ第一および第二抗原結合部位から活性な 形態で放出されるが、このとき、これら２つの放出される酵素は共にもう一方の 酵素の存在下で反応を触媒するものである、請求項１〜１８に記載の診断用の方 法。
20. ２０．抗原および酵素に対する結合部位を有し、該酵素の抗体への結合は該酵素 を不活性とする多特異的抗体と試料とを接触させ、その際前記抗原の該抗体への 結合が該抗体からの前記酵素の活性な形態での放出をもたらすこと、ならびに試 料中の前記抗原の存在を示す前記放出される酵素の活性を検出することを含む、 試料中の前記抗原の存在または不存在を測定するための免疫検定方法。
21. ２１．前記抗体が２特異的抗体である、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記酵素がその活性部位により抗体と結合される、請求項２０または２１ に記載の方法。
23. ２３．前記抗原が肺表面活性物質アポ蛋白Ａである、請求項２０〜２２のいずれ かひとつに記載の方法。
24. ２４．前記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアー ゼ、炭酸脱水素酵素、またはホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求 項２０〜２３のいずれかひとつに記載の方法。
25. ２５．酵素が抗体への結合により不活性とされ、そして抗原の抗体への結合の際 に活性な形態で放出される、抗原および酵素に対する結合部位を有する多特異的 抗体。
26. ２６．前記多特異的抗体が２特異的抗体である、請求項２５に記載の多特異的抗 体。
27. ２７．肺表面活性物質蛋白Ａおよび酵素に対する結合部位を有し、該酵素の抗体 への結合が該酵素を不活性とする多特異的抗体と試料とを接触させ、その際肺表 面活性物質蛋白Ａの該抗体への結合が該抗体からの前記酵素の活性な形態での放 出をもたらすこと、ならびに試料中の肺表面活性物質蛋白Ａの存在を示す前記放 出される酵素の活性を検出することを含む、哺乳動物体液試料中の肺表面活性物 質蛋白Ａを検出する方法。
28. ２８．前記抗体が２特異的抗体である、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．ＳＰ−Ａおよび酵素に対する結合部位を有し、該酵素の抗体への結合が該 酵素を不活性とし、ＳＰ−Ａの抗体への結合が抗体からの前記酵素の活性な形態 での放出をもたらす、請求項２７〜２９のいずれかひとつに記載の方法に使用す るための多特異的抗体。
31. ３１．前記抗体が、ブダペスト条約の契約条項に従い、英国、ポートンダウンの 欧州動物細胞培養コレクションに受託番号９２０４２２１１として寄託されてい る細胞系ＧＡＬ３０．１９により生産される抗体である、請求項２７〜３０のい ずれかひとつに記載の方法または抗体。
32. ３２．第一および第二抗原結合部位を備える前記抗体がバイオセンサの表面に結 合される、請求項１〜３２のいずれかひとつに記載の診断用の方法または免疫検 定方法に使用するためのバイオセンサ。
33. ３３．請求項１６または１７に記載の多特異的抗体ならびに該抗体に結合した薬 剤または他の治療作用薬を含むキット。
34. ３４．ブダベスト条約の契約条項に従い、英国、ポートンダウンの欧州動物細胞 培養コレクションに受託番号９２０４２２１１として寄託されている細胞系ＧＡ Ｌ３０．１９。