CA2056433A1 - Composes diastereoisomeres derives de l'acide tetrahydrofolique; methode de preparation et utilisation pour la synthese de diastereoisomeres 6s et 6r de folates reduits - Google Patents

Abstract

La présente invention à trait à un nouveau procédé de préparation de diastéréoisomères dérivant de l'acide tétrahydrofolique. Par réaction de (i) l'acide (6RS)-folinique ou de l'un de ses sels, ou (ii) de l'acide 5,10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, avec HCOOH à pH 2,0-2,6 on obtient un précipité constitué par un mélange de deux diastéréoisomères de structure orthoamide et de formules : et (III) (IV) où R représente le reste p-benzoyl-(L)-glutamique, dans un rapport molaire IV/III d'environ 7/3, le composé III étant de configuration dite naturelle et le composé IV de configuration dite non-naturelle. On isole le composé IV pur dudit précipité, et le composé III pur du filtrat correspondant. A partir du composé III et respectivement IV on prépare les diastéréoisomères des folates réduits et de leurs sels de configuration naturelle, et respectivement non-naturelle.

Description

2 ~ J 3 CONPOS~S DIAST~R~OISOM~S D~IV~T D~ Li~CID~
T~T~HYDROFOLIQ~, PBO~ED~ DE P~PA~ IO~ ET UTI~ISA~ION
D~NS LA SYNT~ESE D~ DI~ST~OISOM~ES 6S ~T 6~ D~ FOLAT~S
BEDUITS
DONAIN~ D~ L'INV~TIV~
La présente invent.ion concerne un nouveau prock-dé de préparation de composés diastéréoisorn~res dérivant de l'acide tetrahydrofolique. Ces composés comprennent en tant que produits industriels (i) le mélange de diastéréoisom~res 6P et 6Q tels que d~finis ci-apr~s (et répondant vraisemblablement aux formule~ III et respectivement IV données plus loin), dans le rapport molaire 6P/6Q d'environ 7/3, (ii) le diastér~oisomère 6P
pur et (iii) le diastéréoisomère 6Q pur.
L'invention concerne également l'utillsation desdits dia~t~r~oisomères 6P et 6Q dans la synthèse de dias~éréoisomère~ 6S et 6R de folates r~duits ~els que notamment les acides 5-CHO-(6S)-THF 9 5-CHO-(6R)-THF, 5-Me-(6S)-THF, 5-Me-(6R)-THF, 5,10-CH~-(6R~-THF, 5,10-CH~-(6S)-THF, et leur~ sels.
_2 ~B~VIATIO~S
Dans la présente description on a utilisé par commodité les abrévia~ions suivantes :
a) our les -Eolates réduits THF = acide 5,6,7,8-tétrahydrofolique 5-CH0-(6RS)-~HF = acide (6RS) 5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique (ou acide folinique) 5-CH0 (6S)-THF = acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-té-trahydrofolique (ou facteur de croissance du Leuconostoc citro-vorum), appartenant à la série de configuration dite "naturel-le",le sel de calcium de cet acide étant connu sous le nom de "leucovorine"
5-CH0-(6R)-THF = diastéréoi.somère 6R de l'acide folinique, appartenant ~ la série de configuration dite "non-naturelle"
5-Me-(6RS)-TEF = acide (6RS~-5-méthyl-5,6,7,8- .
tétrahydrofolique 5-Me-(6S)-THF = acide (6S)-5-méthyl-5,6,7,8-té-trahydrofolique,appartenant ~ la série de configuration dite "naturelle"
5-Me-(6R)-THF = acide (6R)-5-mé~hyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique appartenant à
la série de configura~ion dite "non-naturelle"
[5,10-CH~-(6RS)-THF]X-= sel de l'acide (6RS)-N5,N10 méthényl-5,6,7,8-tétrahydro-folique (ou "anhydro-leucovori-ne") avec l'anion X~
[5,10-CH~-(6R)-THF]X
= sel de l'acide (6R)-N5,N10-méthényl-5,6,7,8 tétrahydrofo-l.ique avec l'anion X , apparte-nant à la série de configuration dite "naturelle"
~5,10-CH~-(6S)-THF]X
= sel de l'acide (6S)-N5,N10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli-que avec l'anion X~, appartenant à la série de configuration dite "non naturelle"
[5,10-CH~-(6RS)-THF]X ,XX
= sel de l'acide (6RS)-N5,N10 méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofo-lique avec l'anion X~ et l'acide HX
[5,10-CH~-(6S)-THF]X ,HX
= sel de l'acide (6S)-N5,N10-méthényl-5,6,7,8-~étrahydrofo-lique avec l'anion X~ et l'aci.de HX
5,10-CH2-(6RS)-THF = acide (6RS)-N5,N10-méthyl~ne-5,6,7,8-tétrahydrofolique 5,10-CH2-(6R)-THF = acide (6R)-N5,Nl~-méthylène-5,6,7,8-~étrahydrofolique appar-tenant à la série de configura-tion dite "naturelle"
5,10-CH2 (6S)-THF = acide (6S)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8-tétrahydrofolique appar-tenant à la s~rie de configura tlon dite "non-naturelle"
b) ~
DMS0 = diméthylsulfoxyde -4~
FAB = bombardement atomique rapide (de l'anglais: '~fast atomic bombard-ment") HPLC = chromatographie liquide haute performance H-TSA = acide p-toluènesulfonique MS = spectrométri.e de masse MS(FAB) = spectrométrie de masse avec dis-positif de bombardement atomique rapide py = pyridine RT = température ambiante ~15-20~C) TSA = ion p-toluènesulfonate ABT ~NTE~I~UR
On sait que l'acide folinlque commercial [ou 5-CHO-(6RS)-~NF], qui répond aux nomenclatures d'acide (6RS)-5-formyl~5~6,7,8-tétrahydrofo].ique et d'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydroptéroyl-L-glutamique et qui est notamment préparé avec son sel de calcium à
partir de l'acide folique ou de l'acide N5,N10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofolique [voir par exemple les brevets CH-A-496 012 et GB-A-l 560 372], est un mélange molaire 1/1 de deux diastéréoisomères qui diffèrent l'un de l'autre par leur configuration en c6 (atome de carbone en position 6 du cycle ptéridinyle).
On sait que le brevet britannique GB-~-l 560 372 envisage dan~ sa description (voir page 2, lignes 4-6) l'utilisation d'un complexe, ~el interne ou zwitterlon~
de l'anhydro-leucovorine (composé de formule [5,10-CHI
-(6RS)-~HF]X ) dans lequel l'un des ions carboxylate COO~
du reste R-p-benzoyl-(L~-glutamique a réagi avec la char-ge positive d~localisee sur les atomeq N5, cll et N10 comme matière première dans la synthase de l'acide (6RS)-folinique et de ~on sel de calcium.
~5~l~33 On sait de l'article de J.C. FONTECILLA-CAMPS et al., J. Am. Chem. Soc. 9 101 ~ 614 (1979) que le dias~éréo-isomère biologiquement actif de l'acide folinique est de configuration 6S. Il est rappelé que ce diastéréoisomère 5a été dénommé dans le passé "isomère naturel" par commodité en raison de son activi~é biologique, d'une part, et "acide (l,L)-folinique" où le terme "1" se réfère à la configuration en c6 et le terme "L" à la configuration de la chaîne latérale acide glutamique 9 10d'autre part.
L'acide (6RS)-folinique 5-CHO-(6RS)-THF est généralement et communément utilisé, avec son sel de cal-cium, en tant que moyen thérapeutique de "secours" chez les patients soumis à une chimiothérapie an~i-cancer à
15base de métho~réxate e~ en tant que moyen augmentant l'inhibition de la thymidylate synthétase par les agents anti-cancéreux tels que les 5-fluorouracil et 5-fluoro-

2'-désoxyuridine.
On a longtemps pensé que le diastéréoisomère 6R
20de l'acide folinique, dénommé par commodité "isomère non-naturel" (par opposition au 6S biologiquement actif~
était inactif; cependant il a été signalé ~voir F.M.
SIROTNAK et al., Biochem. Pharm., 28, 2993 (1979); et J.K. SATO et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 25, 312 25(1984)] que ledit dias~éréoisomère 6R est susceptible d'interférer aYec le transport ou la polyglumatation du diastéréoisomère 6S actif.
Il existe en conséquence un besoin de mettre au point, en ce qui concerne l'acide folinique, une techni-30que d'obtention du diastéréoisomère 6S pur par séparation du mélange (6RS) ou par synth~se stéréospécifique.
Il se trouve que les techniques décrites par D.B.
COSULICH et al., J. Am. Chem. Soc., 74, 4215 (1952) [pro-posant la séparation des stéréoisomères de l'acide 35folinique par cristallisation fractionnée de leurq sels de calcium dans l'eau], d'une part, et par C. TEMPLE et -6~ 2 3 al., Cancer Treatment Reports, 65, l1].7 (1981) [proposant la séparation de l'acide (6S)-folinique ~ partir du mélange (6RS) par solubilisation différentielle des sels de calcium dans l'eau], d'autre part, sont inefficaces dès lor~ qu'elles conduisent à un mélange de 6S et 6R
dans le rapport molaire 1/1.
Pour i~oler le (6S)-folinate de calcium à partir du mélange (6RS) une autre méthode a été préconisée dans la demande internationale PCT publiée WO-A-8808844 (EPROVA) qui est fondée sur la cristallisa~ion préféren-tielle du (6S)-folinate de calcium à partir d'un milieu alcalin aqueux contenant Ca2~ en excès.
On sait par ailleurs que d'autres folates reduits ont été obtenus sous une forme diastéréoisomériquement pure, soit à partir d'acides (6S)- et (6R)-tétrahydrofo-liques préparés par voie enzymatique [voir notamment F.M.
SIROTNAK et al., Biochem. Pharm., 28, 2993 (1979) pré-cit~; H.C.S. WOOD et al., Chem. and Biol~ of Pteridines, 533 (1983); P.L. CHELLO et al., Biochem. Pharm., 31, 1527 (198?)], soit encore par d'autres méthodes chimiques et chromatographiques longues et fastidieuses [voir notamment B.T. KAUFMAN et al. 9 J. Biol. Chem., 238, 1498 (1963); S~B. HORWITZ et al., J. Med. Chem.~ 12S 49 (1969); B.V. RAMASASTRY et al., J. Biochem. Biophy~. Res.
Comm., 12, 478 (1963); J.C. WHI~E et al., Chem. and Biol.
of Pteridines, 625 (1979); et J. FEENEY et al., 8iochemistry, 20, 1837 (1981)]; or il se trouve que toutes ces méthodes, qui conduisent ~ l'obtention de tra~
petites quantité3 (de l'ordre du milligramme) de pro-

3~ duits qui n'ont pas été isolés 90US forme de solides cristalli3és ou qui ont été obtenus sou~ forme de poudre lyophilisée de pureté toujours inférieure ou égale à 80 %, ne sont pas ~atisfaisantes~
De plus, il se trouve que les tentatives de réduire asymétriquement l'acide dihydrofolique par voie _7 ~ 3 chimique n'ont jamais été couronnées de succ~s [voir L.
REES et al., Tetrahedron, 429 117 (1986)].
Le fait de disposer de quantités importantes de folates réduits diastéréoisomériquement purs permettrait de comparer et apprécier de fa~on claire les activit~s enzymatiques, biologiques et/ou thérapeutiques de chaque diastéréoisomère. En effet, jusqu'à présent la plupart des expérimentations qui ont é~é entreprises ont été
réalisées soit avec le mélange molaire 1/1 de~
diastéréoisomères soit avec le diastéreoisomère dit "naturel"g les activités du diastéréoisom~re dit "non-naturel" étant extrapolées à partir des valeurs obtenues à paxtir dudit mélange molaire 1/1 et dudit diastéréoi~omère naturel [voir notamment J.A. STRAW et alO, Cancer Research, 41, 3936 (1981)]. A la connaissance de la Demanderesse, les seuls isomères foliniques "non-naturels" avec lesquels des expérimentations ont été
~ effectuée~ sont ceux de l'acide folinique et de l'acide N5-méthyl~596,7,8 tétrahydrofolique, qui ont été obtenus in situ par déplétion (i.eu élimination ou inhibition) enzymatique de l'isomère "naturel" correspondant [voir notamment J.K. SATO précité].
On connait enfin de EP~A-O 348 641 (date de pu-blication : 3 janvier 1990), deux méthodes (I et II) d'accès aux folates réduits ayant la configur~tion de la série dite "naturelle". Selon la méthode I, on traite ~e sel complexe dénommé "(acide (6RS)-5,10-méthenyl-5,6,7,8-tétrahydofolique) chlorure, chlorhydrate, dihydrate" de formule abrégée : ~5~10-CH~-(6RS)-THF]Cl ,HCl92~I20 au moyen d'un mélange ~IC30H/HC1 2N pour obtenir par cristal-lisation le dias~éréoisomère naturel répondant à la formule [5,10-CH~-(6R)-THF]Cl ,HCl.
La méthode II, comprend le~ étapes ~uivantes : en premier lieu (selon l'exemple 5.1 de EP-A-O 348 641)~ (a~
on solubilise ledi~ sel complexe précité~ de formule [5,10-CH~-~6RS)-THF]Cl ,HC1~2H20, dans l'acide HCOOH, (b) on traite la solution ré~ultante avec une résine échan-geuse d'anions [AMBERLITER IRA~68], (c) on évapore sous pression réduite liéluat qui a été recueilli, puis (d) on traite le résidu d'évaporation, ainsi obtenu, avec AcOH
et MeOH, pour précipiter un produit dénommé sel interne de l'acide 5,10-CE-(6RS)-THF, puis en second lieu (~210n l'exemple 11 de EP-A-O 348 641), on fait réagir ledi~ sel interne avec une solution aqueuse de HCOOH à 20~C sous agitation, il se forme un précipité et, par filtration, on recueille le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6S)-THF
avec une teneur en diastéréoisomère de forme 6S de 73%, (en répétant l'opération de précipitation on augmente la teneur en diastéréoi.somère de forme 6S jusqu'à 90~); et, par traitement des filtrats combinés au moyen d'acétone, on précipite le sel interne de l'acide 5,10-CH-(6R)-~HF à
75 ~ de pureté.
BUT ~E L'INYENTION
Selon l'invention on propose une nouvelle solu-tion technique permettant la synthèse des diastéréoiso-m~res 6R et 6S de folates réduits pour satisfaire les besoins précités. Cette nouvelle solution technique se diPférencie de la méthode II de EP-A-O 348 641 rappelée ci-dessus no~amment par le fait que le traitement avec la résine échangeuse d'anions puis le mélange AcOH/MeOH eYt remplacé par la réaction de 5-CHO-(6RS)-THF ou de [5,10 CH+-(6RS)-THF]X avec l'acide HCOOH à un pH se situan~
dans la gamme de 2,0 à 2,6.
Cette nouvelle solution technique conduit à l'ob-tention de composés diastéréoisomériquement purs, défini~
ci-après, de configuration 6P et 6Q et répondant très vraisemblablemen~ aux formule~ III et respectivement IV
données ci après. Cette solution technique constitue une nouvelle source d'aceès aux folate~ réduits, dè~ lors qu'elle permet notamment la préparation de composés dias-~9~ 3'~
téréoisomériquement purs tels que les acides (6S)- et (6R)-foliniques, (6S)- et (6R)-N5,N10-methyl~ne-5,6,7,8-tetrahydrofoliques, (6S)- e~ (6R)-N5~méthyl~5,6,7,8-té-trahydrofoliques et leurs sels, ~ partir des di~s dia-stéréoisomere~ de formules III et IV.
OBJ~T DE L'I~VE~TIO~
Selon l'un des aspects de l'invention, on préco-nise un procédé de préparation d'un composé d~rivant de l'acide tétrahydrofolique et de se~ diastéréoisom~res, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
1~) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) l'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule ~10 o H2 ~ ~ H (I) dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta-mique de formule :
~ CO-Nff-CH-COOA (~III) \
_10 -où A est h; et ~es sels, e~ (ii) 1' acide N5, N10-méthényl-5,6,7,8-tétrahydrofoli~
que de formule o 11 N- R
~ U (II) dans laquelle X~ est un anion et R e~t défini comme ci-dessus;
avec HCOOH à un pH se situant dan3 la ga~me de 2,0 ~ 2,6;
et 2~) la récupération du précipité, qui s~est for mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon-dant, d'autre part;
3~~ la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant ~ la ~érie de configuration non naturelle, dénommé ci-aprè~ diast~réo-i~omère 6Q, et répondant trè~ vraisemblablement à la formule IV, par recristalli~ation fractionnée; et,

4~) ~i néce3saire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2~) et/ou des filtrats de recristallisation selon le stade 3~), d'un second dia-stéréoisomare pur appartenant à la ~éxie de configuration na~urelle, d~nommé ci-après diastér~oisomère 6R, et r~pondant tr~s vraisemblablement à la formule III.
Selon ce procédé, on obtien~ au s~ade 2~) un précipité de dia~téréoisomères 6Q et 6P dans un rapport molaire 6Q/6P d'environ 7/3.
Dan~ la formule II, la liaison en poin~illé~ --relian~ les atomes d'azote N5 et N10 a pour but de ~igna~

5~3 ler que la charge positive est délocalisée sur les atomes N5, Cll et NIO
Suivan~ un autre aspect de l'invention~ on propo-se en tant que produits industriels nouveaux lesdits diastéréoisomères 6Q, 6P et leurs mélanges, notamment le mélange molaire 7/3 précité. Le diastéréoisomère 6P
appartient à la série dite naturelle en ce sens qu'il conduit au-x diastéréoisomères de folates réduits tels que les 5-CHO-(6S)-~HF, 5,10-CH-(6R)-THF, 5,10-CH2-(6R)-~HF
et 5-Me-(6S)-~HF, et à leurs sels. Le diastéréoisomère 6Q
appartient à la série dite non-naturelle en ce sens qu'il conduit aux diastéréoisomeres de folates réduits tels que les 5-CHO-(6R)-THF, 5,10-CH (6S)-THF, 5,10-CH2-(6S)-T~IF
e~ 5-Me-(6R)-THF, et à leurs sels.
Suivant encore un autre aspect de l'in~ention, on préconise lrutilisation desdits diastéréoisomères 6P et 6Q pour l'obtention des folates réduits dia~téréoisoméri-quement purs des séries naturelle e~ non-naturelle.
DESC~IPTION DETAILLR~ DE L'INYENTION
Les diastéréoisom~res selon l'invention ont été
désignés 6P et 6Q par commodité, car il n'a pas é~é
possible de déterminer de façon directe leur configura-tion. On a néanmoins de sérieuses raisons de pré~umer que le composé 6P est de configuration 6R et que le composé
6Q est de configuration 6S; on a également de sérieuses raisons de penser que ces diastéréoisom~res sont des com-posés du type orthoamide et répondent aux formules III et IV, (même si dans l'état ac~uel des connais~ance~ il s'a girait d'hypothèses ne liant pas la Demanderesse).
Comme indiqué ci~de~sus, le diastéréoisomère 6P
appartenant ~ la série naturelle répond très vraisembla-blement ~ la formule :
2 ~ 3 ~
~ ~ N R
et le diastéréoisom~re 6Q répond tr~ vraisemblablemen~
la formule :
~T N--R
H2Nl~ ~ (IV) La tran~forma~ion des dérivés orthoamides 6P et 6Q en 5-CH0-THF~ 5-Me-THF et 5,10-CH2-THF, n'affecte pas la ~t~r~ochimie du centre C6. Ainsi les diast~réoisomères appartenant ~ la série de configuratlon naturelle présentent une configuration spatiale en c6 telle qu'illu3tr~e notamment par le9 formules V, VII, VIII, ee XI ci-apr~s, d'une part, et les dia~t~réoi~omères appartenant ~ la 3érie de configuration non-naturelle présentent une configuration spatiale en c6 telle qu'illu3tree notammen~ par les formulea VI9 IX, ~, et XII
ci-aprag, d'autre part. En revanche~ la no~ation R ou S
change ~ l'int~rieur de chaque s~rie eu égard aux r~les de nommenclature; dans la série de configura~ion na~urell on pas~e du dia~t~r~oisom~re 6S [par exemple S--~3~
CHO-(6S)-THF ou 5-Me (6S)-THF] au diastéréoi.somère 6R
[par exemple 5,1Q-CH-(6R)-~HF ou 5,10-CH2-(6R)-THF] quand le squelette bicyclique du reste ptéridinyle devient tricyclique.
Il est important que lors de la mise en oeuvre du stade 1~) le pH du milieu réactiomlel soit ajusté entre 2,0 et 2,6. Le réglage du pH à l'in~,érieur de cette gamme sera avantageusement effectué par addition de NH3 ou NH40H. De préférence9 au stade 1~), le pH du milieu réac-tionnel sera compris entre 2,2 et 2,~ et plus avantageu-sement de l'ordre de 2,30-2,35.
De fa,con également avantageuse, la réac~ion du stade 1~) sera effec~uée pendant au moins 0,25 h, à une température de 40 à 65~C, et mieux à une température de 45-60~C.
De façon pratique, le stade 1~) selon l'invention sera mis en oeuvre suivant deux voies différentes :
(a) II > III ~ IV
(b) I ~ IV.
Dans la voie (a), on incorpore directement l'ammoniac dans le mélange II + H20/ HCOOH pour réguler le pH, la réaction étant effectuée à une température de 55-65~C, pendant au moins 0,25 h. Dans la voie (b), l'on fait réagir le composé I avec un mélange H20/HCOOH à 60-65~C pendant au moins lh, refroidit le milieu réactionnel résultant ~ 40-45~C, puis introduit l'ammoniac, la réac-tion se poursuivant ensuite ~ 40-45QC pendant au moins 0,25 h.
Dans les deux voies, le mélange réactionnel donne par refroidissement à RT un pr~cipité cristallin de couleur jaune brillant qui est pratiquement insoluble dans les solvants usuels.
L'analyse élémentaire de ce précipi~é est en accord avec les structures III et IV; il s'agit d'un mélange d'orthoamides résultant (i) de l'énolisation du 2 ~ 3 groupe oxo exocyclique (en position C4 du squelet~e ptéridinyle) de la fonction lactame et (ii) d'une cycli~ation par formation d'une liaison entre l'oxanion et l'atome de carbone en cll de la formule II~
La s~ructure or~hoamid~ des compos~s de formules III et IV e~t également confirmé par le~ fait~ suivants :
- l'analyse par spectrométrie de mas~e SM(FAB) d~s com-po~és de formule~ III et IV donne un spectre pratiquement identique à celle du précurseur de formule II et indique que la réaction II = III/IV traduit une conversion du type protonation/déprotonation;
- un échantillon du produit III/IY traité avec un excès d'acide p-toluènesulfonique ne se di~tingue pas du produit de formule II (ou du couple VII/IX) par analyse HPLC (sur colonne non-chirale).
Selon l'invention, les cristallisation~ fraction-nées des stades 3~) et 4~) peuvent ~tre remplacées par une chromatographie sur colonne pour séparation chirale.
En pratique on prefère enrichlr les teneurs respectives en dias~éréoi~omères de configuration na~urelle et respectivement de configuration non-naturelle des compo-sés III et respectivement IV par cristallisation frac-tionnée, puis, si néce3saire, purifier chaque produit par HPLC sur colonne chirale.
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'anion X du composé de formule II sera un anion approprié, et pourra notamment être choisi parmi l'enAsemble constitu~ par les ion~ F , Cl , Br , I 9 N03 , lt2S042-, 1/3P043-, oxalate, p-toluènesulfonate, maléate, benz~nesulfonate, méthane~ulfona~e, trifluoroacétate, et trichloroacétate.
Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent 8tre convertis en compo~és V et re~pectivement VI par hydrolyse à lQ0~C ~ pH 7 et en leurs sel~ :
UN ~ ~ CH2 NH- R (V) H ~ N N
et O ~
A~ ~\Cu2--N~--n (VI) Les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être également utilisés pour la préparation des acide~ diastéréoisomériquement pur~ 5,10-CH2-(6R)-THF
de formule VIII et re~pec~ivement S,10-CH2-~6S)-THF de formule X, et de leur~ ~el~, par conver3ion de III et IV
en VII et respectivement IX, trai~ement ensuite avec NaBH4 dan~ un solvant aprotique contenant de la pyridinel puis purification suivant l'enseignement de la demande de brevet suisse No 02 736/89 de la Demandere~e :
0 ~ N _ R
U (VII~
~2 2 ~
et Il ~7N~R
}~ ~ N ~;1 X
( IX ) H21~N--~N /
d ' une part, N--R
~ N J
2~N J (VIII ) et Il I~N--R
HN , N ~ \~
H2~N J~N j~ ( X ) d ' autre part O
1 7 2 ~ 6 ~gr 3~ 3 Dans la synthès2 des composés de formules VIII et X, (ou encore de formules XI et XII), on peut 9 Si cela est nécessaire, isolex les composés intermédlaires VII et re~pectivemPnt IX. Toutefois, une telle opération n'est pas es~entielle, et la suite de la synth~se es~ générale-ment effectuée sans isoler ledit composé VII ou r~specti-vement IX.
De même les orthoamides de formules III et respectivement IV peuvent être utilisés pour la prépara-ration des acides diastéréoisomériquement purs 5-.Me-(6S) TEF de formule XI et respectivement 5-Me-(6R)-THF de formule XII, et de leurs sels, par conversion en VII et respe~tivement IX9 suivie d'une réduction avee NaBH3CN
dans un solvant aprotique :
~N~Cil --liN--11 (XI) O C~3 3 N ~ C32--lYN--R (XII~
Les sels des dia~téréoisomères de configuration natur~lle de formules V, VIII et XI, d'une part, et de configuration non-naturelle de formules VI, X et XII, d'autre par~, comprennent ~elon l'invention (i~ le~ sels métallique~, no~amment ceux de~ métaux alcalins et alea-~ 8 3 ~
lino-terreux, tels que Na, K, Ca e~ Mg, et (ii) les sel~
d'addition obtenus avec les bases or~aniques, telles que en particulier le~ éthylamine, 2-(N,N-dimethylamino)é~ha-nol, 2-(N,N-diéthylamino)éthanol, morpholine, pipéridine et analogue~.
Le meilleur mode de miqe en oeuvre de l'invention es~ illustré par les sch~mas r~actiormels suivant~.
SC:~EMA 1 (a) (b) O C,HO
~H
_H20 H30~Gl I
O ~
H ~ X- 1~)HCOOH/H20/~
2 H 2~)NH40H
¦HCOOH/~I20 NH4~HCOO
O ~ N--B
H2nJ~
+
H
O~
~ N ~1 2 ~ 3 6 i ~ 3 ou le groupe A intervenant dans le reste R de la formule I est 1/2Ca~, le groupe A intervenant dans le reste R
des formules II, III et IV est H, et le groupe X~
intervenant dans la formule II est Cl .
SC.~EM~ 2 ~/tampon Tris o ~lo III~,A~ 2~ R (Y) purif./cristall. ~2H
~/tampon Tris o ~
IV ~ > ~ ~ CH2-~-R
Ca 1NJ~ (V~) purif./cristall . H2N 8 où le groupe A intervenant dans le reste R des formule~ V
et VI est 1/2Ca2~,1e groupe A intervenant dans le reste R
de~ formules III et IV est Ho ~ Q ~ 3 SCH~M~ 3 H-~SA/DMSO ~ r -~ R
' VII
Py/NaBH4/DMSO
Mg2t o purif./cristall.
R
''X ~J
- rr SA / DM S O ~ r;~ N--R
IV ~ 2~ I~
Py/NaB~I4/DMSO
Mg2+
purif./cri~tall.
N--a H ~

où le groupe A intervenant dan~ le reste R des formules VIII e~ X est 1/2Mg2~,le groupe A intervenant dan~ le reste R de~ formules III, IV, VII et IX est ~, e~ le 2 ~ 3 groupe X intervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate (TSA ).
SC~EM~ 4 O C~3 NaBH3CN/DMSO HN ~ N ~C~2--NH--iq S VII ------------------------- I ~ ~f~
purif./cristall. H N~N ~ N~ XI
IX _ __ __ __ __ __, ~ 2-~-R
purif./cristall . H2 N N N
XII
ou le groupe A intervenant dans le reste R de~ formules VII, IX, XI et XII est H~ et le groupe X in~ervenant dans les formules VII et IX est l'ion p-toluènesulfonate.
D'autre avantages et caractéristiques de l'inven-tion seront mieux compris ~ la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donné~ ~ ti~re d'illustration.
P~P~R~TIO~ I
Obtention de l'orthoamide de formule III (e~emple 1) et de l'orthoamide de ~ormule IV (exemple 2) Dan~ un mélange de 1200 ml d'eau et 270 ml d'acide formique, sous agitation à RT et sous a~mo~phère iner~e (azote ou argon), on ajoute une quantité suffisan-~e d'ammoniaque pour arriver à un pH de 2,3. On chauffe la solution résultante ~ 60~C e~ ajoute 15~41 g de ~5,10-CH~-(6RS)-THE]X de formule II (où X = Cl obtenu ~elon le procédé décrit par C. TEMPLE et al., J. Med. Chem~, 2f 9 731~ (1979). On maintien~ l'agitation jusqu'~ dissolution 22 2~ 3 totale des matières solides. On filtre le milieu réactionnel et laisse reposer le filtra~ à R~ pendan~ 48 h. Le précipité volumineux de couleur jaune brillant qui s'est formé est recueilli par filtration sur BUchner et lavé avec de l'eau puis de l'acétonitrile (les filtra~s son~ recueillis pour traitement ultérieur) et séché
pendan~ 1 h sous pression réduite à 50~C. On obtient 7,76 g (rendement : 54 ~) du mélange d'orthoamides de formules III et IV.
Pour déterminer le rapport molaire des deux dia-stéréoisomères, un échantillon du mélange ainsi obtenu est transformé en un mélange d'acides N5-méthyl-tétrahydrofolique de formules XI et XII puis analysé par HPLC au moyen d'une colonne chirale ~ESOLVOSILR selon l'enseignement de K.E.CMOI et al. Anal. Bioch.,168,pages 398-404 (1988). Dans ce but, 11 mg du mélange III/IV qui a été obtenu est mis en supension dans 1,5 ml d'une solution aqueuse d'acide p-toluènesulfonique ~ 18 g/l; on ajoute 6 mg de NaBH3CN en solution dans une faible quanti~é d'eau et agite le mélange résultant pendant 0,Z5 h à RT; on dilue ce mélange avec 7,5 volumes d'eau avant introduction dans le syst~me HPLC. On déduit (du rapport des diastéréoisomères XII/XI) que, dans ledit mélange, III/IV les deux diastéréoisomères sont dans un rapport molaire IV/III de 7/3.
Par recristallisation répétée dudit mélange III/IV au moyen de H20/HCOOH 6/1 v/v, on obtient 1,1 g (rendement : 15,4 ~) d'orthoamide de formule IV diasté-réoisométriquement pur.
On combine les liqueurs mères de la prépara~ion du composé IV, les traite avec 190 ml d'eau et le9 lai~se reposer à 4~C pendant 62 h. On obtien~ ~m précipité jaune brillan~ que l'on isole par filtration, lave avec E20 pUi9 arec de l'acétonitrile, sèche sou~ pression réduite ' 23 .. ~
2 ~ ~3 $ ~ ~'J 3 pendant 1 h à 50~C. On obtient ainsi 2,2 g d'un produit qul est cons~itué (selon analyse HPLC sur colonne RESOLVOSILR) d'un mélange III/IV dans un rapport molaire 96/4. La recristallisation de ce mélange est réalisee comme suit : à un mélange de 252 ml d'eau et de 57 ml de ~COOH sous agitation, à RT et sous atmosph~re inerte, on ajoute une quantité suffisante de NH40~ pour ajuster le pE à 2,3; on porte le mélange résul~ant ~ la température de 60~C puis ajoute ledit mélange III/IV 96/4 ; on agite jusqu'à dissolution complète; le milieu réactionnel résultant est ensuite filtré ~ chaud sur BUchner, et on laisse le filtrat reposer à RT pendant 8 h puis ~ 4~C
pendant 60 h; le solide jaune brillant qui a précipité
est isolé par filtration, lavé avec de l'eau puis de llacétonitrile et séché sous pression réduite pendant 1 h à 50~C pour donner 1,41 g (rendement : 20 %) de l'ortho-amide de formule III diasté.réoisométriquement pur, comme cela est confirmé par analyse sur colonne RESOLVOSIL~.
PX~P~ATION II
Obtention de l'orthoamide de form~le III (exemple 1) et de l'orthoamide de formule IV (exemple 2) à partir du sel de calcium de l'acide (6RS)-folinique Dans un mélange de 464 ml d'eau et de 136 ml de HCOOH sous agitation à 55-60~C et sous atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'une électrode de pH, on introduit 18,9 g de folina~e de calcium pentahydraté de formule I, et agite le mélange resultan~ à 55-60~C
pendant 1 h. On refroidit ledit mélange ~ 45~C, ajuste le pH (apparent) à 2,35 en ajoutant goutte à goutte la quantité appropriée d'ammoniaque concentrée, et agite pendant une nuit ~ RT. Le précipité jaune qui s'est formé
est isolé par filtration, lavage ~ l'eau pUi3 l'acétone. Par sechage sous pression rédui~e à 50~C
pendant 1 h, on obtient 8,81 g d'un mélange IV/III dans un rapport molaire de 7/3 selon l'analy~e sur colonne -RESOLVOSILR précitee.
Par recristallisation répétée de ce mélange au moyen de H20/HCOOH 6/1 on obtient 1,32 g ~rendement 18,4 %) d'orthoamide de formule IV diastéréoisomeri-quement pur (confirmation par analyse HPLC comme indiqué
ci-dessus).
Analyse élémentaire pour C20H21N7O6~4H2O
théorie : C = 45~55% ; H = 5,54% ; N = 18,59%
trouvé : C = 45,91% ; H = 5,27~ ; N = 18,45 Spectre de ma~se MS(FAB) (matrice :thioglycérine; 8 keV) :
456(m~,100), 412(7,5), 410(9,1)7 326(10), 311(7,0), 283(11,6), 282(21,2) On combine les liqueurs mères et les dilue avec ml d'eau. On refroidit à 0~C et agite ~ cette température sous atmosphère inerte pendant 24 h. On recueille le précipité formé par filtration sur BUchner9 lave avec de l'eau puis de l'acétone et sèche sous pression réduite à 50~C. On obtient 2,67 g d'un produit constitué de III/IV dans un rapport molaire de 98/2, selon l'analyse HPLC sur colonne RESOLVOSILR précitée.
Par recristallisation selon le mode opératoire donné à la préparation I ci-dessus (pour l'obtention du composé
III), on recueille 1,91 g (rendement : 23,9%) du produit de formule III diastéréoisométriquement pur (confirmation par HPLC sur colonne RESOLVOSILR précitée.) Analyse ~lémentaire pour CzoH2lN7067HCOOH,l/2H2O
théorie : C = 49,42% ; H = 4,74% ; N = 19,21%
trouvé : C a 49945% ; H = 4,70% ; N = 19,45%
Spectre de masse MS(FAB) (matrice :thioglycérine; 8 keV~ :
456(m~,100), 412(13,3), 410(10,8), 326(13,3), 311(10,4), 283(13,7), 2~2(2~,1), 232(3974~
2 ~ 3 ~
PB~PA~TION III
Obtention du sel de calcium de 5~CHO-(6S)-T~F
(exemple 3 ; formule V) Dans un mélange degazé de 2 litres d'eau et de 20 ml de 2 mercaptoéthanol maintenu sous agitation à RT ~ous une atmosphère inerte dans un réacteur pourvu d'un condenseur de reflux et d'une électrode de pH, on introduit 80 g du dia~téréoisom~re III pur obtenu selon la préparation II ci-dessus, puis 100 ml d'une solution aqueuse de tris(hydroxyméthylamino)méthane 2M. On chauffe le mélange résultant à 45-50~C et maintient le pH à 793 par addition de la quantité nécessaire de la solution de tris(hydroxyméthylamino)méthane jusqu'~ dissolution com pl~te de la matière solide. Le milieu ré3ultant est porté
au reflux pendant 4,5 h; on ajoute 3,3 g de noir de carbone à la solution chaude et poursuit l'agitation pendant 1 h tandis que l'on refroidit ledit milieu ~ RT.
Apr~s filtration du milieu réactionnel sur celite, on ajoute au fitrat 87 ml d'une solution aqueuse de CaC12 2M
et dilue lentement la solution résultante avec 3,6 litre~
de EtOH (~ 94 %). On conserve ladite solution ainsi diluée pendant une nuit à 0~C, on re~ueille par filtration le précipité formé, le lave avec EtOH (à 94~) puis MeCOMe. Par séchage sous pre~sion réduite ~ 50~C
~5 pendan~ 2 h, on obtient 79 g de (6S)-folinate de calcium brut. Ce produit pr~sente par HPLC une pureté de 96 ~;
par recristallisation répétée au moyen de H20 et séchage sou~ pression réduite à 50~C, on obtient 43,5 g (rende-ment : 48,5 ~) de (6S)-folinate de calcium pur.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 15 ~
- teneur en Ca : 8,11 ~ (théorie : 7,84 ~) - pure~é HPLC : lQQ ~
- te~t HPLC [ contre l'étalon (6RS) de la phama~
copée US] : 99,5 %
2 6 ~ r ~ ~
- pureté dias~éréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : 100 %
- spectre UV (20 mg/l dans NaOH O,OlN) :
max = 282 nm (~ = 30 060) ~ min = 242 nm rapport des 2 pic d'adsorp~ion Al/A2 = 4~96 ~ [~]D = -14,6~ ( c = 1 dans H20) P~EP~R~TIO~ IV
Obtention du sel de calcium de 5-CEIO-(6R)-THF
(exemple 4 ; formule VI) En procédant selon les modalités opératoires d~crites à la prépaxation III ci-de~sus, mais en remplaçant le diastéréoisomère de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient le produit attendu.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 10,2 - pureté HPLC : 99 %
- test HPLC [ contre l'~talon (6RS) de la phama-copée US] : 95 %
- pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure à 98 ~
- spectre UV (20 mg/l dans NaOH O,OlN) :
~max - 282 nm (~ =28 350) ~min = 242 nm rapport des 2 pic d'ad~orption Al/A2 = 4,25 ~ [~D = +39,8~ ( c = 1 dans H20) P~P~TIO~ V
ObtPntion du sel de magné~ium de 5jlOrCH2-(6S)-THF
(exemple 5 ; formule ~) On met en suspension 10 g du diastéréoi~omère orthoamide de formule IV dans une solution de 4,18 g de H TS~ dans 130 ml de DMSO sec et agite ~ RT SOU9 atmo~ph~re inerte jusqu'~ dis301ution compl~te. On ajoute à RT 44 ml de pyridine pUi9 on ajoute lentemen~ (pPndant 10 minutes) une solution de 880 mg de NaBH4 dans 44 ml de DMSO. Après avoir agité le mélange resultant à RT pendant une durée de 10 minutes on refroidit le milieu réactionnel au moyen d'un bain de glace e~ on le dilue goutte à goutte avec un litre de méthyléthylcétone. On agite pendant 20 minutes ~ 0~ C et recueille le précipité
jaune formé par filtration ; on lave ce précipité avec de l'acétone (2 fois) et le sèche sous pres~ion réduite a 50~ C pendant 1 h pour obtenir 6,14 grammes de 5,10-CH2-(6S)-~H~ brut (probablement sous forme d'un sel mixte de Na~/pyridinium), Ce produit a une pureté apparente par HPLC de 87,2 % et contient environ 11 ~ de 5-Me-THF.
On ajoute par portion ce produit brut à 80 ml d'eau contenant des traces de NaOH sou~ agitation à 0~ C
sous atmosphère inerte : pendant cette opération le pH
est maintenu ~ environ 9,0 par addition le moment venu de NaOH lN. On ajoute à la solution résultante 6,0 ml d'une solution aqueuse de MgCl 2M, ce qui amène le pH à 8,4. On élimine la petite quantité d'insoluble par fil~ration sur celite. Le filtrat résultant est agité a 0~ C tout en étant dilué goutte à gout~e avec 105 ml d'acétone ; apr~s agitation pendant 45 autres minutes à 0~ C on recueille le précipité par filtration, le lave (2 fois) à l'acétone et le sèche sous pression réduite à 50~ C pendant 1 h. On obtient 3,g g du sel de magnésium attendu de formule X.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 14 - pureté HPLC : 92,3 ~
(le produit contient 6 ~ de 5-Me-(6R)-THF) - pureté diastér~oisomérique (évaluée sur colonne chirale) : supérieure ou égale ~ 98 %
- spectre UV (20 mg/l dans NaOH O,OlN) :
max = 296 nm (~ =28 300) ~min ' 244,5 nm rapport des 2 pic d'adsorption Al/A2 = 3,68 . 2~ 2~ 33 ~ [~]D = -88,7~ ( c = 1 dans H20) P~PA~ATIO~ VI
Obtention du sel de magnésium de 5,10-CH2-~6R)~TXF
(Exemple 6 ; formule VIII) Ce produit est obtenu selon des modalités opératoires analogues à celles décrites dans la préparation V à partir du dia~téréoiisomère orthoamide de formule III.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 14~0 %
- pureté EPLC : 95,7 ,0 (le produit contient 3,6 % de 5-Me-(6S)-THF) - pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale à 99 %
- ~pectre UV (20 mg/l dans NaOH O~OlN) :
max = 296 nm (~ =28 300) ~ min = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption AllA2 = 4,11 ~ [~]D = ~123,9~ ( c = 1 dans H20) P~EP~B~TIO~ VII
Obtention de l'acide 5-Me-(6S)-THF
(Exemple 7 ; formule XI) A une solution de 910 mg de H TSA dans 53 ml d'eau, sous agitation ~ RT et ~ous atmosphère inerte, on ajoute 1,0 g du diastéréoisomère orthoamide de formule III. On ajoute ensuite goutte à goutte une solution de 500 mg de cyanoborohydrure de sodium dans 1 ml d'eau pui~
agite le mélange résultant pendant 5 h ~ RT ; il se forme un précipit~. blanc que l'on isole par ~iltration, lave a~ec de l'eau froide, de l~éthanol puis de l'acétoneg s~che sous pression réduite à 50~ C pendant 1 h. On obtien~ 923 mg de l'acidP brut de formulz XI.
Ce produit brut est mis en ~uspension dans un mélange de 37 ml d'eau et 0,25 ml de 2-mer~ap~oéthanol.

2 ~ 3 Le mélange résultant est agité à RT sous atmosphère inerte et on ajoute une quantité suffisante de NaOH lN
pour obtenir une dissolution compl~te. On filtre et acidifie le filtrat en ajoutant goutte à goutte HCl lN
pour atteindre un pH de 3,5. Après agitation de la suspen~ion résultante pendant 1 h à 0~ C , on centrifuge~
remet en ~uspension le solide d'abord dans de l'eau, puis dan~ de l'éthanol e~ enfin dans de l'acétone. Après séchage sous pre~sion réduite à 50~ C pendant 1 h, on ob~ient 636 mg de llacide de formule XI attendu.
Analyses - teneur en H20 (selon FISCHER) : 10 pureté HPLC : 96,0 %
~ pureté diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale) : égale ~ 100 - spectre UV
(20 mg/l dans tamyon phosphate 0,1 M; pH 6,5) :
max = Z90 nm t~ =32 100) ~min = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption Al/A2 - 3,65 ~ [~]D = +38~0~ ( c = 0,5 dans tampon phosphate O,lM ; p~ 6,5) P~P~RATIO~ VIII
Obtention de l'acide 5-Me-(6R)-THF
(Exemple 8 ; formule XII) En procédant ~elon les modalités opératolres décrite~ à la préparation VII, mais en rempla~ant le diast~réolsomare de formule III par le diastéréoisomère de formule IV, on obtient l'acide attendu de configu-ration non naturelle.
Analyses - teneur en HzO (~elon FISCHER) : 11,5 %
~ pureté HPLC : 96,3%
- pure~é diastéréoisomérique (évaluée sur colonne chirale~ : égale ~ 100 %
-30- 2~ 3 - spectre UV
(20 mg/l dans tampon phosphate O,l M; pH 635) :
max = 290 nm ( =32 500) ~ min = 245 nm rapport des 2 pic d'adsorption Al/A2 = 3,74 ~ [~]D = -9,2~ ( c = 0,5 dans tampon phosphate O,lM ; pH 6,5) UTILIS~TIO~ T~ P~DTIQ~
L'acide N5,NlO-méthylène-(6S)-5,6,7,8-t~trahydro-folique de formule X et ses sels (notamment le sel de magné~ium obtenu selon le procédé de la préparation V ci-dessus) sont des produits diastéréoisomériquement purs, appartenan~ à la série des folates réduits de configuration non-naturelle, et utiles en thérapeutique.
On a trouvé qu1ils inhibent la thymidylate synthétase et sGnt avantageusement destinés à un usage cyto.~tatique en thérapeutique, notamment contre le cancer.
Selon l'invention, on préconise donc en tant que produits industriels nouveaux, l'acide 5,lO--CH2-(6S)-THF
diastéréoisomériquement pur et ~es sels diastéréoisoméri-quement pur 9 .
On préconise égalemen~ l'utilisation d'une substance diastéréoisomérique~ent pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 5,lO-CH2-(6S)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase destinée à un usage cytostatique en thérapeutique, nota~ment contre le cancer.
En variante, on préconise également l'utilisa-tion dans laquPlle (l) ladite.substance diastéréoisoméri-quement pure, choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide 59lO-CH2-(6S)-~HF, ses sels non-to~iques et leur~
mélanges e~t associée avec (23 un agent an~in~oplasme notamment choisi parmi le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-21-- sl~
désoxyuridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges Dans cette dernière utilisation, ladite substance (1) et ledit agent (2) sont avantageusement présentés sous la forme d'une composition en association avec un excipient physiologiquement acceptable. L'association (1) ~ (2) offre l'avantage de présen~er des effets syner-gétiques.
Par ailleurs, on vient de trouver que le diasté-r~oisomère de la série dite de configuration non-naturelle 5-CH0-(6R)-T~F et se~ sels présentent des pro-priétés cytostatiques intéressantes en thérapeutique. Le fait d'avoir pu déceler ces propriété~ cytostatique~ est (i) surprenant en ce sens que le 5-~H0-(6S)-THF de la série dite de configuration naturelle, l'acide folinique commercial de formule 5-CH0-(6RS)-THF et leurs sels ont été utilisés jusqu'à présent pour limiter les effets des agents cytostatiques tels que le methotréxate, et (ii) bénéfique en ce sens que le 5-CH0-(6R)-T~IF et ses sels9 qui sont peu toxiques, peuvent avantageusement remplacer, en totalité ou en partie 9 les agents cytostatiques ou antinéoplasmes de référence réputé~ très toxiques ou néfa~es vis-~-vi~ de la cellule, tels que le métho-tréxate.
Dans l'état actuel des connaissance~, la Demande-resse présume que l'effet cyto~tatique qu'elle a décelé
pour le 5-CH0-(6R)-THF et ses sels 3erait dû à une action bénéfique de ces produits sur un ou plusieurs enzymes essentiels des cellules; cependant, la Demanderesse n'est nullement liée par cet aspect théorique.
Ain~i selon l'inven~ion, on pr~conise une nouvel-le utilisation d'une substance diastéreoisomériquement pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide (6R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule 5-C~I0-(6R)-~HF, ses ~els non toxiques et leurs mélanges, pour -32~ S~ ?~
l'obtention d'un médicament cytostatique destiné à un usage en thérapeutique vis-~-vis des maladies néopla-siques, notamment le cancer.
Bien entendu, selon l'invention~ dans le cadre de la nouvelle utilisation des 5,10-CH2-(6S)-THF, 5-CHO-(6R)-THF et de leurs sels non toxiques en tant que prin-cipes actifs cytostatiques, chaque principe actif inter-viendra à une dose thérapeutiquement efficace. Dans cette optique, on fera appel à une composition renfermant, en association avec un excipient physiologiquement accepta-ble, une quantité cytostatiquement efficace d'un ingré-dient actif choisi parmi (a) le composé 5,10-CH2-(6S)-THF, ses sels non toxiques et leurs mélanges, et (b) le composé 5-CHO-(6R)-THF, ses sels non-toxiques et leurs mélanges.

Claims (16)

- 33 -REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un composé dérivant de l'acide tétrahydrofolique et de ses diastéréoismères, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
1°) la réaction d'un composé tétrahydrofolique choisi parmi l'ensemble constitué par (i) l'acide (6RS)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique de formule (I) dans laquelle R représente le reste p-benzoyl-(L)-gluta-mique de formule :
(XIII) où A est H; et ses sels, et (ii) le composé acide N5, N10-méthényl-5,6,7,8-tétra-hydrofolique de formule (II) dans laquelle X- est un anion et R est défini comme ci-dessus;
avec HCOOH, ladite réaction comportant la régulation du pH dans la gamme de 2,0 à 2,6; et 2°) la récupération du précipité, qui s'est for-mé, par filtration, d'une part, et du filtrat correspon-dant, d'autre part;
3°) la séparation, à partir dudit précipité, d'un premier diastéréoisomère pur appartenant à la série de configuration non-naturelle; et, 4°) si nécessaire, la séparation, à partir dudit filtrat, obtenu selon le stade 2°) d'un second diastéré-oisomère pur appartenant à la série de configuration naturelle.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que le stade 1°) comporte :
(a) la réaction du compose de formule I ou de l'un de ses sels avec un mélange H2O/HCOOH, pendant au moins 1h, à une température de 55-65°C, (b) le refroidissement du mélange résultant à 40-45°C, et (c) la poursuite de la réaction à 40-45°C, pen-dant au moins 0,25 h, à un pH régulé à 2,0-2,6.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que le stade 1°) comporte :
la réaction du composé de formule II avec un mélange H2O/HCOOH, pendant au moins 0,25 h, à une température de 55-65°C, à un pH régulé à 2,0-2,6.

4. Procédé suivant l'une quelconque des revendica-tions 1, 2 et 3, caractérisé en ce que au, stade 1°), le pH du milieu réactionnel est ajusté entre 2,0 et 2,6 par addition d'ammoniaque.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé
en ce que au, stade 1°), le pH du milieu réactionnel est ajusté entre 2,2 et 2,4.

6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que les séparations des stades 3°) et 4°) comportent des cristallisations fractionnées.

7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé
en ce que le produit obtenu au stade 2°) est un mélange dudit premier diastéréoisomère et dudit second diastéréo-isomère dans un rapport molaire d'environ 7/3.

8. Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 4°) de la revendica-tion 1, appartient à la série de configuration naturelle et répond à la formule orthoamide suivante :

(III)

9. Composé tétrahydrofolique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé du stade 3°) de la revendica-tion 1, appartient à la série de configuration non-naturelle et répond à la formule orthoamide suivante :
(IV)

10. Utilisation d'un composé tétrahydrofolique dias-téréoisomère selon l'une quelconque des revendications 8 et 9 pour l'obtention de folates réduits 6S et 6R
diastéréoisomériquement purs.

11. Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob-tention, à partir du diastéréoisomère de formule III, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par (a) l'acide (6S)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli-que, (b) l'acide (6S)-N5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo-lique, (c) l'acide (6R)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8-tétra-hydrofolique, et (d) leurs sels.

12. Utilisation selon la revendication 10 pour l'ob-tention, à partir du diastéréoisomère de formule IV, d'un composé choisi parmi l'ensemble constitué par (a) l'acide (6R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofoli-que, (b) l'acide (6R)-N5-méthyl-5,6,7,8-tétrahydrofo-lique, (c) l'acide (6S)-N5,N10-méthylène-5,6,7,8-tétra-hydrofolique, et (d) leurs sels.

13. Acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofo-lique et ses sels d'addition diastéréoisomériquement purs.

14. Utilisation d'une substance diastéréoisomérique-ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N5,N10-méthylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médicament inhibant la thymidylate synthétase et destiné
à un usage cytostatique en thérapeutique notamment contre le cancer.

15. Utilisation selon la revendication 14, caractéri-sée en ce que (1) ladite substance diastéréoisomérique-ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide N5,N10-methylène-(6S)-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non-toxiques et leurs mélanges, est associée avec (2) un agent anti-néoplasme, notamment choisi parmi l'ensemble comprenant le 5-fluorouracil, la 5-fluoro-2'-désoxy-uridine, le méthotréxate, le cisplatine et leurs mélanges.

16. Utilisation d'une substance diastéréoisomérique-ment pure choisie parmi l'ensemble constitué par l'acide (6R)-5-formyl-5,6,7,8-tétrahydrofolique, ses sels non toxiques et leurs mélanges, pour l'obtention d'un médica-ment cytoqtatique destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des maladies néoplasiques.