JPH04507103A - テトラヒドロ葉酸から誘導されたジアステレオマー化合物，還元フォレートの６ｓ及び６ｒジアステレオマーの合成におけるジアステレオマー化合物の製造及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 テトラヒドロ葉酸から誘導されたジアステレオマー化合物、還元フオレートの６ ８及び６Ｒジアステレオマーの合成におけるジアステレオマー化合物の製造及び 使用方法 発明の分野 本発明は、テトラヒドロ葉酸から誘導されたジアステレオマー化合物の新規な製 造方法に関する。このジアステレオマー化合物には、工業上のものとして、（ｉ ）モル比（６Ｐ／６Ｑ）が約７／３であり後に定義される（そして、後述の１式 及び■式をそれぞれおそらく有する）６Ｐ及び６Ｑジアステレオマーの混合物、 （ｉｉ）純粋な６Ｐジアステレオマー、及び（ｉｉｉ　）純粋な６Ｑジアステレ オマーか含まれる。

本発明は、さらに、特に以下の酸及びそれらの塩のような還元フすレートの６８ 及び６Ｒジアステレオマーの合成における前記６Ｐ及び６Ｑのジアステレオマー の使用方法に関する。

５−ＣＨＯ−（６Ｓ）−ＴＨＦ ５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦ ５−Ｍｅ−（６Ｓ）−ＴＨＦ ５−Ｍｅ−（６Ｒ）−ＴＨＦ ５．１Ｏ−ＣＨ“−（６Ｒ）−ＴＨＦ ５．１０−ＣＨ”　−（６Ｓ）−ＴＨＦ略語 便宜上、ここでは次の略語を使用する。

ａ）還元フオレート ＴＨＦ　＝５．６，７．８−テトラヒドロ葉酸５−ＣＨＯ−（６ＲＳ）−ＴＨＦ ＝　（６ＲＳ）−５−フすルミルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸（ 又は、（６Ｒ３）−フオリニン酸） ＝　（６Ｓ）−５−フすルミルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸（又 は、ロイコノストク・シトロボルムの発育因子）。いわゆる「自然」立体配置の 群に属しており、この酸のカルシウム塩は［カルシウム・ロイコポリン」として 知られている。

５−ＣＨＯ−（６Ｒ）ＴＨＦ ＝フオリニン酸の６Ｒジアステレオマー。いわゆるｒ人工」立体配置の群に属し ている。

５−Ｍｅ−（６ＲＳ）−ＴＨＦ ＝　（６ＲＳ）−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸 ５−Ｍｅ−（６Ｓ）−ＴＨＦ ＝　（６Ｓ）−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。いわゆる「自 然」立体配置の群に属している。

５−Ｍｅ−（６Ｒ）−ＴＨＦ ＝（６Ｒ）−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。いわゆる「人工 」立体配置の群に属している。

［：５．１Ｏ−ＣＨ”　−（６ＲＳ）−ＴＨＦ）Ｘ−＝　（６ＲＳ）−Ｎ’　、 Ｎ”−ｙｌテニル−５，６，７゜８−テトラヒドロ葉酸の険イオンＸ−を含む塩 （又は「アンヒドロ・ロイコポリンＪ） （５，１Ｏ−ＣＨ“−（６Ｒ）−ＴＨＦ）Ｘ−”　（６Ｒ）　−Ｎ”　、Ｎ１６ −メテニル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸の陰イオンＸ−を含む瓢いわゆ る「自然」立体配置の群に属している。

［５，１，０−ＣＨ”　−（６Ｓ）−ＴＨＦ）Ｘ−＝　（６Ｓ）　−Ｎ’　、　 Ｎ１Ｇ−メチ＝ルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸の陰イオンＸ−を 含む塩。いわゆる「人工」立体配置の群に属している。

Ｃ５，１０−ＣＨ”　−（６Ｒ３）−ＴＨＦ）Ｘ−・ＨＸ＝　（６Ｒ３）−Ｎ’ 　、Ｎ”−メチ＝ルー５，６，７゜８−テトラヒドロ葉酸の陰イオンＸ−及び酸 ＨＸを含む塩 （５，１Ｏ−ＣＨ“−（６Ｓ）−ＴＨＦ：ｌ　Ｘ−・ＨＸ＝　（６Ｓ）　−Ｎ’ 　、　Ｎ１６−メテ＝ルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸の陰イオン Ｘ−及び酸ＨＸを含む塩 ５．１０−ＣＨ，−（５Ｒ３）−ＴＨＦ＝　（６Ｒ３）−Ｎ’　、Ｎ”−メチレ ン−５，６，７゜８−テトラヒドロ葉酸 ５、　１．０−ＣＨ２−ぐ６Ｒ）−ＴＨＦ＝　（６Ｒ）−Ｎ’　、Ｎ”−メチレ ン−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。いわゆる「自然」立体配置の群に属し ている。

５、Ｉ　０−ＣＨ，−（６Ｓ）−ＴＨＦ＝　（６Ｓ）−Ｎ’　、ＮＩｏ−ｙｌｆ メチレン、６，７．８−テトラヒドロ葉酸。いわゆる「人工」立体配置の群に属 している。

ｂ）他の略語 ＤＭＳ○　＝ジメチルスルフｔキシド ＦＡＢ　＝高速原子核衝撃 ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィーＨ−ＴＳＡ　＝ｐ−トルエンスルフォン ＭＳ　−質量スペクトル ＭＳ　（ＦＡＢ）＝高速原子核衝撃装置での質量スペクトルｐｙ　＝ピリジン ＲＴ　＝室温（１５〜２０℃） ＴＳＡ−　＝ｐートルエンスルフォン酸イオン従来技術 命名法上（６ＲＳ）−５−フォルミルー５．　６，　７．　８−テトラヒドロ葉 酸、及び（６ＲＳ）−５−フォルミルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロプ テロイル葉酸−Ｌ−グルタミン酸と称される工業上の葉酸〔即ち、５−ＣＨＯ− 　（６ＲＳ）−ＴＨＦ）は、特に、そのカルシウム塩とともに、葉酸またはＮ１ 　、Ｎｌ６−メテニル−５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸から製造され る〔例えば、特許公報ＣＨ−Ａ−４９６，０１２及びＧＢ−Ａ−１，５８０．３ ７２）。この工業上の葉酸は、Ｃ’　（ブテリジニル環から６番目の炭素原子） における立体配置が互いに異なる２つのジアステレオマーの１．１／１モル混合 物として知られている。

特許公報ＣＢ−Ａ−１．５６０．３７２　（２頁４〜６行）に、（６ＲＳ）−フ ォリニン酸及びそのカルシウム塩の合成における出発原料として、アンヒドロ・ ロイコポリン（式（５，１　０−ＣＨ”　−　（６ＲＳ）−ＴＨＦ）Ｘ−の化合 物）の錯体（内部塩または両性イオン）を使用することが示されている。これは 、Ｒ−ｐ−ベンゾイル−（Ｌ）−グルタミン酸の残基のカルボキシルイオン（Ｃ ＯＯ−）の１つが、Ｎｌ，Ｃ１１及びＮ１６の原子に非極在化している陽電荷と 反応したものである。

Ｊ．Ｃ．ＦＯＮＴＥＣ　ＩＬＬＡ−ＣＡＭＰＳ他の論文（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ．、１０１，６１４：１９７９）には、生物学的に活性なフオリニン酸の ジアステレオマーは６Ｓ立体配置を有していることが示されている。そこには、 そのジアステレオマーが過去にはその生物学的活性を理由に便宜上「自然異性体 」と一方で称さね、またｒ（１．Ｌ）−フォリニン酸」と他方で称されていたこ とが指摘されている。なお、「ｌ」はＣ′における立体配置のことであり、ｒＬ 」はグルタミン酸側鎖の立体配置のことである。

（６ＲＳ）−７ｒ’Ｊニン酸（すなわち５−ＣＨＯ−　（６ＲＳ）−ＴＨＦ）Ｉ ｔ、そのカルシウム塩とともに、メトトレキサートによる抗癌化学療法が行われ ている患者に対する［補助的なＪ治療手段として、また５−フルオロウラシル及 び５−フルオロ−２°　−デオキシウリジン等の抗癌剤によるチミジル酸シンテ ターゼに対する抑制を強化する手段として一般に使用されている。

フナリニン酸の６Ｒジアステレオマー（生物学的に活性な６Ｓと対本体であり、 便宜上「人工異性体」と称される）は、長い間不活性であると考えられていた。

しかし、その６Ｒジアステレオマーが、活性な６Ｓジアステレオマーの輸送ある いはポリグルタミン化を妨害する能力を有していることが既に指摘されている（ Ｆ．Ｍ．Ｓ　ｒＲＯＴＮＡＫ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．、２８，２９９ ３：１９７９、及びＪ．に、ＳＡＴ○他．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎ ｃｅｒＲｅｓ．、２５，３１２：１９８４参照）。

このため、少なくともフすリニン酸に関しては、（６ＲＳ）混合物からの分離に よって、あるいは立体規則性合成によって純粋な６Ｓジアステレオマーを得る技 術を開発することか望まれている。

Ｄ．Ｂ．ＣＯＳＵＬＩＣＨ池（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７４，４２　１ ５：１．９５２）による技術〔）オリニン酸のカルシウム塩を水中で分別結晶さ せることによりフすリニン酸の立体異性体を分離すること〕、及びＣ．ＴＥＭＰ ＬＥ他（Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，６５，１１１． ７：１９８１、）による技術〔水中におけるカルシウム塩の溶解度差を用いて、 （ＳＲＳ）混合物からの（６Ｓ）−フオリニン酸を分離すること〕は残念ながら 効果的ではない。それらの技術では、モル比１／ｌの６Ｓ及び６Ｒの混合物が得 られるからである。

（６ＲＳ）混合物から（６Ｓ）−フｔリネートカルシウムを分離するため、ＰＣ Ｔ国際公開ＷＯ−Ａ−８８０８８４４号（ＥＰＲＯＶＡ）では別の方法が推奨さ れている。その方法は、Ｃａ”過剰のアルカリ水溶液から（６ＲＳ）−フオリネ ートカルシウムを選択的に結晶化させる方法を基礎にしている。

また、酵素を用いた手法によって（６Ｓ）又は（６Ｒ）のテトラヒドロ葉酸のい ずれかからジアステレオマー的に純粋な形態を有する還元フオレートを得ること （Ｆ．Ｍ．ＳＩＲＯＴＮＡＫ他（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．、２８，２９９ ３：１９７９）（上述）、Ｈ．Ｃ．Ｓ．ＷＯＯＤ他（Ｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏ ｌ．ｏｆ　Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ，５３３：１９８３、及びＰ．　Ｌ．　ＣＨＥ Ｌらに、長時間を要しかつ面倒な化学的かつクロマトグラフィ的手法によって得 られたものからノアステレオマ−的に純粋な形態を育する還元）オレートを得る こ：１９６９、Ｂ．Ｖ．ＲＡＭＡＳＡＳＴＲＹ他（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ，上２。４７８＋１９６３、Ｊ．Ｃ．ＷＨＩＴＥ他 くＣｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｌ．ｏｆ　Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ，６２５：１９７ ９、及びＪ．ＦＥＥＮＥＹ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０．１８３７＋１ ９８１）参照〕が既に知られている。現在、それらの方法によっては、ごく微量 （ｍｇ単位）の生産が行われているだけであり、結晶化した固体の形では分離さ れていないし、また８０％以下の純度の凍結乾燥粉末の形態で得られているのみ であり、充分ではない。

さらに、化学的手法によって不斉合成的にジヒドロ葉酸を減少させる試みは、ジ アステレオマー的に純粋な還元フオレートを大量に利用できるようになれば、各 ジアステレオマーの異性体の酵素学的、生物学的及び／又は治療上の作用を比較 しそして評価することが可能になるであろう。実際に行われている実験の大多数 は、今までのところ、モル比１／１のジアステレオマーの混合物か、又はいわゆ る「自然」ジアステレオマーを用いて行われており、いわゆる「人工」ジアステ レオマーの作用は、前記１／１モル混合物で得られた値と自然ジアステレオマー から得られた値とから補性によってめられているＣＪ．Ａ．ＳＴＲＡＷ他（Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，３９３６：１９８１）参照）。出願人の知 るところでは、実験に使用されたことのある「人工」フｒｌＪニン酸異性体のみ のものは、フォリニン酸及びＮ３−メチル−５．　６，　７．　８−テトラヒド ロ葉酸に間するものである。それは、対応する「自然ノ異性体の酵素的消滅（す なわち除去あるいは抑制）によって実験室的に得られたものである〔上述のＪ． 　Ｋ、ＳＡＴＯ参照〕。

特許公報ＥＰ−Ａ−０．３４８．６４１　（１９９０年１月３日公開）には、い わゆる「自然」群に属する立体配置を有する還元フオレートを得るための２つの 方法（Ｉ及び■）が示されている。方法Ｉでは、省略式（５，１０−ＣＨ’　− ’（６ＲＳ）　ＴＨＦ）ＣＩ−・ＨＣｌ　・２Ｈｔ　Ｏ（’）ｒ（６ＲＳ）−５ ，１０メテニル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸塩化物・塩酸・２水Ｊを、 ＨＣＯＯＨ／２Ｎ　ＨＣＩ混合物で処理し、結晶化によって式（５，ｌ　０−Ｃ Ｈ”　−（６Ｒ’）−ＴＨＦ）Ｃ１−・ＨＣＩの自然ジアステレオマーを得る。

方法■は次の工程を含んでいる。まず（特許公報ＥＰ−Ａ−０，３４，８，６４ １の実施例５．１に基づき）、（ａ）式［５，１０−ＣＨ”　−（６ＲＳ）−Ｔ ＨＦ）ＣＩ−・ＨＣＩ・２Ｈ１０で表される上述の錯塩を、ＨＣＯＯＨ酸内で可 溶化し、（ｂ）得られた溶液を、陰イオン交換樹脂（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ＠　Ｉ ＲＡ−６８）で処理し、（Ｃ）集められた溶出液を減圧下で蒸発させ、そして（ ｄ）蒸発残留物をＡｃＯＨ及びＭｅＯＨで処理して５．１０−ＣＨ−（６Ｒ３） −ＴＨＥ酸の内部塩として知られている生産物を沈殿させる。次に（特許公報Ｅ Ｐ−Ａ−０，３４８，６４１の実施例１１に基づき）、前記内部塩を、攪拌しな がら２０°ＣでＨＣＯＯＨの水溶液中で反応させ、沈殿物を得る。そして、６Ｓ 壓のジアステレオマーが７３％含まれた５、Ｉ　０−ＣＨ−（６Ｓ）−ＴＨＥ酸 の内部塩を濾過によって得る（６Ｓ型のジアステレオマーの比率は、沈殿操作を 繰り返すことによって９０％まで上昇する）。アセトンを含む濾液に対する処理 により、純度７５％の５．１０−ＣＨ−（６Ｒ）−ＴＩ（Ｆ酸の内部塩が沈殿す る。

発明の目的 本発明によれば、上述の要求を満たす還元フオレートの６Ｒ及び６Ｓジアステレ オマーの合成が可能になるという新規な技術的解決法がもたらされる。この新規 な技術的解決法は、上述の特許公報ＥＰ−Ａ−０，３４，８，６４１の方法■と は異なっている。特に、陰イオン交換樹脂とＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ混合液とを用い た処理が、５−ＣＨＯ−（６ＲＳ）−ＴＨＦ又は（５，１Ｏ−ＣＨ“−（６Ｒ３ ）−ＴＨＦ）Ｘ−をｐＨ２，０〜２．６でＨＣＯＯＨ酸と反応させることに置き 換えられる。

この新規な技術的解決法では、後述する式■及び弐■にそれぞれ対応すると考え られる６Ｐ及び６Ｏ立体配置のジアステレオマー的に純粋な化合物（後述）を得 ることができる。この技術的解決法は、還元フすレートを得るための新規な手段 を含んでいる。何故なら、（６Ｓ）−及び（６Ｒ）−フォリニン酸、（６Ｓ）− 及び（６Ｒ）−Ｎ’　、Ｎ”−メチ１ノン−５，６，７，８，−テトラヒドロ葉 酸、及び（６Ｓ）−及び（ＳＲ）−Ｎ’−メチル−５，６，７，８−テトラヒド ロ葉酸、及びそれらの塩等のジアステレオマー的に純粋な化合物を式■及び■の 前記ノアステレオマ−から合成することが特に可能になるからである。

発明の主題 本発明の一見地によれば、テトラヒドロ葉酸から誘導される化合物及びそのジア ステレオマーを得るための好ましい方法には、次の事項が含まれる。

１）以下の群から選ばれた１つのテトラヒドロ葉酸化合物を、ｐＨ２，０〜２． ６でＨＣＯＯＨと反応させること。

（１）次式で表される（６ＲＳ）　−５−フォルミルー５．　６．　７．　８− テトラヒドロ葉酸及びその塩 なお、Ｒは次式で表されるｐ−ベンゾイル−（Ｌ）−グルタミン酸残基である但 しＡはＨｌ及び （１１）次式で表されるＮゝ　Ｎ＋０−メテニル−５，６，７，８−テトラヒド ロ葉但し、Ｘ−は陰イオンであり、Ｒは上述の通りである。

２）形成された沈殿を濾過により一方で回収し、対応する濾液を他方で回収する こと。

３）人工立体配置の群に属する第４純粋ジアステレオマー（以下６Ｑジアステレ オマーと称し、おそらく式■の構造を有している）を分別結晶法により前記沈殿 物から分離すること。

４）必要に応じ、工程２）で得られた濾液及び／又は工程３）の分別結晶に係る 濾液から、自然立体配置の群に属する第２純粋ジアステレオマー（以下６Ｐジア ステレオマーと称し、おそらく式■の構造を育している）を分離すること。

この方法によれば、モル比（６Ｑ／６Ｐ）が約７／３の６Ｑ及び６Ｐジアステレ オマーの沈殿物が工程２）において得られる。

式■において、ＮＳ及びＮｌｏ窒素原子を結ぶ鎖線の結合（−−−）は、陽電荷 かＮｓ、ＣＩ′及びＮ”原子に非極在化していることを示している。

本発明の別の見地による前記６Ｑ及び６Ｐジアステレオマー及びその混合物（特 に上述のモル比７／３の混合物）は、新規な工業上の製造物である。６ＰシアＴ ＨＦ、５，１Ｏ−ＣＨ，−（６Ｒ）−ＴＨＦ、及び５−Ｍｅ’−（８Ｓ）−ＴＨ Ｅ等の還元フオレートのジアステレオマー及びそれらの塩を含むいわゆる自然群 に属する。６Ｑジアステレオマーは、５−ＣＨＯ−（ＳＲ）−ＴＨＦ、５，１Ｏ −ＣＨ−（６Ｓ）−ＴＨＦ、５．１０−ＣＨ，−（６Ｓ）−ＴＨＦ及び５−Ｍｅ −（６Ｒ）−ＴＨＦ等の還元フオレートのジアステレオマー及びそれらの塩を含 むいわゆる人工群に属する。

本発明のさらに別の見地によれば、前記６Ｐ及び６Ｑジアステレオマーは、自然 及び人工群のジアステレオマー的に純粋な還元フオレートを得るために使用され ることが好ましい。

発明の詳細な説明 本発明に係るジアステレオマーは、便宜上６Ｐ及び６Ｑという。それらの立体配 置を直接決定することは不可能だからである。それにもかかわわらず、６Ｐ化合 物が６Ｐ立体配置を有していると見なしたり、６Ｏ化合物が６Ｓ型体配置を育し ていると見なしたりする見方が存在する。また、それらのジアステレオマーがオ ルトアミド型の化合物であり、式■及び■を有していると考える見方も存在する 。（たとえそうであるとしても、現段階における知識では、それらの推定事項は 出願人を拘束しない仮定である。） 上述のように、自然群に属している６Ｐジアステレオマーは、おそらく次式のま た、６Ｑジアステレオマーはおそらく次式の構造を有している。

６Ｐ及び６Ｑオルトアミド誘導体の５−ＣＨＯ−ＴＨＦ、５−Ｍｅ　−ＴＦ（Ｆ 及び５．１０−ＣＨ，−ＴＨＦへの変化は、Ｃ＠を中心とした立体化学特性には 影響しない。したがって、一方で、自然立体配置の群に属するジアステレオマー は、下式■、■、■及びＸＩで表されるようなＣ＠における空間配置を育してい る。他方、人工立体配置の群に属するジアステレオマーは、下式ＶＴ、　ＩＸ、 　Ｘ及びＸ■で表されるようなＣ１における空間配置を有している。それらに対 し、ＲあるいはＳの記号は、命名法の規則に従って各群内で変化する。たとえば 、自然立体配置の群では、６Ｓジアステレオマー（たとえば５−ＣＨＯ−（６Ｓ ）７ＴＨＦまたは５−Ｍｅ−（６Ｓ）−ＴＨＦ）から６Ｒジアステレオマー（た とえば５゜１０−ＣＨ−（６Ｒ）−ＴＨＦまたは５．１．　ＯＣＨ２ｓ　６　Ｒ ）−ＴＨＦ）まで、プテリジニル残基の二環式構造が三環式になるときに変化す る。

工程１）を実行する場合には、反応媒体のｐＨが２．０〜２．６に調整されるこ とが重要となる。ｐＨをこの範囲にする調整は、ＮＨａまたはＮＨ４ＯＨを加え ることによって容易に行える。工程１）では、反応媒体のｐＨは好ましくは２． ２〜２．４の範囲内であり、より好ましくは２．３０〜２．３５の範囲内である 。

また、工程１）の反応を、温度４０〜６５°Ｃ（好ましくは４５〜６０℃）にお いて少なくとも０．２５時間行うのが好ましい。

実際上、本発明に係る工程１）は、次２つの異なるルートで実施されることにな ろう。

（ａ）Ｘ→■＋■ （ｂ）　Ｉ　４＋ＩＶ ルート（ａ）では、ｐＨを調整するためＩ［＋Ｈ，Ｏ／ＨＣＯＯＨ混合物内に直 接的にアンモニアを入れ、反応を温度５５〜６５”Ｃで少なくとも０．２５時間 行う。ルート（ｂ）では、化合物Ｉを温度６０〜６５°Ｃで少な（とも１時間Ｈ ｔＯ／ＨＣＯＯＨ混合物と反応させ、得られた媒体を４０〜４５°Ｃに冷却し、 そしてアンモニアを混合する。さらに反応を、少なぐとも０，２５時間４０〜４ ５°Ｃで続ける。

両ルートにおいて、室温への冷却中に、反応混合物は明るい黄色の結晶性沈殿物 を生じる。これは、一般的な溶媒中では通常溶解しないものである。

元素分析によれば、この沈殿物は■及び■の構造を育している。この沈殿物は、 （ｉ）プテリジン構造のＣ″位置おける環外すキソグルーブの二ノール化と、（ ｉｉ）式■のＣ１ｌの炭素原子とオギサニオンとの結合による環化とによっても たらされるオルトアミドの混合物である。

式■及び■の化合物のオルトアミド構造は、次の事実によっても確認できる。

まず、質量スペクトル、すなわちＭＳ　（ＦＡＢ）を用いた式■及び■の化合物 に関する分析によれば、弐■の前駆物質のスペクトルと実質的に同一のものか得 られ、またプロトン化／脱プロト・ン化型の変化であるＩＩ　＝　Ｉ［／ＩＶの 反応か示される。また、過剰のｐ−トルエンスルホン酸で処理された生産物Ｉ［ ／ＩＶの試料は、ＨＰＬＣ分析（ノン−カイラルカラム使用）によっては式■の 生産物（又は■／■のペア）からは区別できない。

本発明では、工程３）及び４）での分別結晶化を、カイラル分離用カラムを用い たクロマトグラフィに変えることができる。実際には、分別結晶化によって化合 物■及び■それぞれにおける自然立体配置及び人工立体配置のジアステレオルマ ー比率を増加させ、また、必要に応じ、カイラルカラムを用いたＨＰＬＣによっ て各生産物をさらに精製することか望ましい。

本発明に係る方法を実施する際には、式■の化合物の陰イオンＸ−は適切な陰イ オンであり、特にＦ−、ＣＩ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＣｈ−，１／２ＳＯ４２−。

１／３ＰＯ，’−、シュウ酸エステル、ｐ−トルエンスルホン酸エステル、マレ イン酸エステル、ベンゼンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル、ト リフルオロアセテート及びトリクロロアセテートのイオン群から選ばれたものが 好ましい。

式■及び■のオルトアミドは、１００°Ｃ，ｐＨ７で加水分解によりそれぞれ化 合物■及び■及びそれらの塩に変換され得る。

及び 式■及び■のオルトアミドは、また、それぞれ式■のジアステレオマー的に純粋 な酸５．ｌ　０−ＣＨ２−（６Ｒ）−ＴＨＦ及び式Ｘのジアステレオマー的に純 粋な酸５．１０−ＣＨ，−（６Ｓ）−ＴＥ（Ｆ及びそれらの塩を、■及び■の■ 及び■へのそれぞれの変換と、ピリジンを含む非プロトン化溶媒中（こお【する ＮａＢＨ４を用いた引き続いての処理と、本願出願人のスイス特許出願Ｎｏ、０ ２．　７３６／８９での教示内容に基づいたさらなる精製とによって製造するの （こも用し）られ得る。

及び 一方、 及び 式■及びＸ（または式ＸＩ及びＸＩ）の化合物の合成の際には、必要に応じ、そ れぞれの中間体■及び■が分離され得る。しかしながら、かかる操作は必須では なく、前記合成は一般に、前記化合物■及び■の分離を伴わずに実行される。

同様に、式■及び■のオルトアミドは、それぞれ■及び■への変換と非プロトン 化溶媒中でのＮａＢＨｓ　ＣＮを用いた還元とによって、それぞれ式ＸＩのジア ステレオマー的に純粋な酸５−Ｍｅ−（６Ｓ）−ＴＨＦ及び式Ｘｌｌのジアステ レオマー的に純粋な酸５−Ｍｅ−（６Ｒ）　−ＴＨＦ及びそれらの塩を得るのに 使用され得る。

及び 式■、■及びＸＩの自然立体配置のジアステレオマーの塩と、式ＶＬＸ及びＸ■ の人工立体配置のジアステレオマーの塩とは、本発明にでは、（ｉ）金属塩（特 にＮａ、に、、Ｃａ及びＭｇ等のアルカリ及びアルカリ土類金属）と、（ｉｉ） エチルアミン、２−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）エタノール、２−（Ｎ、Ｎ−ジ メチルアミ刀エタノール、モルフすリン、ピペリジン等の有機塩基を含む付加塩 とを含む。

以下の反応例が、本発明の最良の実施例である。

（ａ）　（ｂ） なお、式Ｉの残基Ｒに存在するグループＡは１／２Ｃａ”であり、式■、■及び ■の残基Ｒに存在するグループＡはＨであり、式■に存在するグループＸ−はＣ なお、式■及び■の残基Ｒに存在するグループＡはｌ／２Ｃａ”であり、式■及 び■の残基Ｒに存在するグループＡはＨである。

（以下余白） 反応例３ なお、式■及びＸの残基Ｒに存在するグループＡはＩ／２Ｍｇ”″であり、式■ 、■、■及び■の残基Ｒに存在するグループＡはＨであり、式■及び■に存在す るグループＸ−はｐ−トルエンスルホン酸イオン（ＴＳＡ−）である。

なお、式■、■、ＸＩ及びＸＩＩの残基Ｒに存在するグループＡはＨであり、式 ■及び■に存在するグループＸ−はＩ）−トルエンスルホン酸イオンである。

本発明のさらなる利点及び特徴は、以下の製造実施例の記載からより明らかにな るであろう。但し、その記述は、本発明を限定するものではなく、例示のための ものである。

製造工 式■のオルトアミド（実施例１）及び式■のオルトアミド（実施例２）の製造水 １２００ｍ１とギ酸２７０ｍ、Ｉとの混合液にアンモニア水溶液を加え、ｐＨ２ ，３となるまで不活性ガス（窯素ガスまたはアルゴンガス）中かつＲＴで充分に 攪拌する。得られた溶液を、６０°Ｃに加熱し、式■の（５，１０−ＣＨ”　− （６ＲＳ）−ＴＨＦ）Ｘ”　（但しｘ＝ｃｉであり、Ｃ，ＴＥＭＰＬＥ他、Ｊ、 　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、２２．７３１：１９７９に記載された方法によって得ら れたもの）を１５．４１ｇ加える。そして、固体が完全に溶解するまで攪拌する 。反応した媒質を濾過し、４８時間ＲＴて放置する。嵩高に形成された明るい黄 色の沈殿物をブフナー漏斗を用いて濾過して集め、水そしてアセトニトリルによ って洗浄する（濾液は後続の処理のために集められる）。さらに、集めた沈殿物 を５゜°Ｃで減圧下において１時間乾燥し、式■及び■のオルトアミドの混合物 を７．７６ｇ得る（収率；５４％）。

２種類のジアステレオマーのモル比を決定するため、得られた混合物の試料を式 ＸＩ及びＸＩ［のＨ５−メチルテトラヒドロ葉酸の混合物に変換し、そしてＫ。

Ｅ、ＣＨＯＩｆｌｆＬ　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、、１６８．３９８〜４０４ペー ジ（１９８８）の記載に基づいてＲＥＳＯＬＶＯＳ　ＩＬ＠のカイラルカラムを 用いたＨＰＬＣにより分析する。この目的のために、得られたＩ［［／ＩＶ混合 物の１１ｍｇを、ｐ−トルエンスルホン酸を１８ｇ／ｌ含む水溶液１．５ｍｌに 縣濁させ、少量の水に６ｍｇのＮａＢＨｓ　ＣＮを溶解させた溶液を加え、得ら れた混合物をＲＴで０．２５時間攪拌し、その混合物をＨＰＬＣ装置に導入する 前に７．５倍の水で希釈する。その結果（ジアステレオマーの比ＸＩＩ／ＸＩか ら）、前記混合物■／■中における２種類のジアステレオマーはモル比ＩＶ／Ｉ Ｉが７／３であるということが推論される。

Ｈ４０／ＨＣＯＯＨ（ｖ／ｖか６／ｌ）を用いて前記混合物ＩＩＩ／ＩＶの再結 晶を繰り返し、その結果として、式■のジアステレオマー的に純粋なオルトアミ ドを１゜１ｇ得る（収率、１５，４％）。

化合物■の製造で得られる母液については、寄せ集め、１９０ｍ１の水で処理し 、そして４℃で６２時間放置する。そして、濾過により分離し、Ｈ，Ｏさらにア セトニトリルにより洗浄し、５０℃で１時間減圧下で乾燥することにより明るい 黄色の沈殿物を得る。これにより、モル比ＴｆＬ／Ｗが９６／４の混合物を含む 物質が２．２ｇ得られる（ＲＥＳＯＬＶＯ３ＩＬ＠カラムを用いたＨＰＬＣ分析 による）。得られた混合物を、次のようにして再結晶させる。ＮＨ，ＯＦ（を、 ２５２ｍ１の水と５７ｍ１のＨＣＯＯＨとの混合物中に加え、ＲＴかつ不活性雰 囲気中でｐＨ２，３となるように充分に攪拌する。次に、得られた混合物を６０ °Ｃに加熱し、その後に前記混合物ＩＩ／ＩＶ　（９６／４）を加える。完全に 溶解が済むまで攪拌した後、得られた反応媒質をブフナー漏斗を用いて濾過し、 濾液を８時間ＲＴで放置し、さらに６０時間４°Ｃで放置する。沈殿した明るい 黄色の固体を、濾過により分離し、水モしてアセトニトリルにより洗浄し、５０ °Ｃで１時間減圧下で乾燥する。これにより、式■のジアステレオマー的に純粋 なオルトアミドが１４１ｇ得られる（収率：２０％）。このことは、ＲＥＳＯＬ ＶＯＳ　ＩＬＯカラムを用いた分析により確認される。

製造■ （６Ｒ３）−フオリニン酸のカルシウム塩からの、式■のオルトアミド（実施例 １）及び式■のオルトアミド（実施例２）の製造１８．９ｇの式Ｉのフすリネー ト・ペンタハイドレート・カルシウムを、４６４ｍ１の水及び１３６ｍ１のＥ（ ＣＯＯＨからなる混合物に加え、ｐＨ電極を備えた反応槽中において不活性雰囲 気中で５５〜６０°Ｃで攪拌する。得られた混合物を、１時間５５〜６０゛Ｃで 攪拌する。前記混合物は、４５°Ｃに冷却か１濃アンモニア水溶液を適量滴下す ることによりｐＨ（見かけ）を２．３５に調整する。

そして、その混合物を一夜ＲＴで攪拌する。形成された黄色の沈殿物を濾過及び 水とアセトンとによる洗浄によって分離する。１時間５０°Ｃで減圧下において 乾燥することにより、モル比ＩＶ／Ｉ［Ｉが７／３の混合物が８．８１ｇ得られ る（上述のＲＥＳＯＬＶＯＳ　ＩＬｅカラムを用いた分析による）。

Ｈ，Ｏ／ＨＣＯＯＨ（６／１）を用いて混合物の再結晶を繰り返せば、式■のジ アステレオマー的に純粋なオルトアミドが１．３２ｇ得られる（収率：１８゜４ ％）。なお、その確認は上述と同様にＨＰＬＣ分析により行う。

Ｃ７゜Ｈ２＋Ｎ２　Ｏ＠　・４Ｈ１０に対する元素分析結果：理論：Ｃ＝４５． ５５％；Ｈ＝５．５４％；Ｎ＝１８．５９％実際：Ｃ＝４５．９１％、Ｈ＝５． ２７％、Ｎ＝１８．４５％ＭＳ’　（ＦＡＢ）による質量スペクトル：（マトリ クス：チオグリセロール；８ｋｅＶ）：４５６　（ｍ”、ｆｏｏ）、４１２　（ ７，５）、４１０　（９，１）。

３２６　（１０）、３１１　（７，０）、２８３　（１１，６）。

２８２　（２１，２） 母液については、寄せ集めそして水８０ｍ１で希釈する。混合物を０°Ｃに冷却 し、その温度で２４時間不活性雰囲気中で攪拌する。得られた沈殿物をブフナー 漏斗を用いた濾過により集め、水そしてアセトンによって洗浄し、そして５０° Ｃで減圧下において乾燥させる。これにより、モル比ＩＩＩ／ＩＶが９８／２の 生産物が２．６７ｇ得らｔする（ＲＥＳＯＬＶＯ３ＩＬ■カラムを用いた上述の ＨＰＬＣ分析による）。上述の製造■（化合物■を得るためのもの）における方 法と同様の方法を用いて再結晶化を行うことにより、式■のジアステレオマー的 に純粋な物質を１．．９１ｇ得る（収率：２３．９％）（ＲＥＳＯＬＶＯＩＬＯ カラムを用いた上述のＨＰＬＣで確認）。

Ｃ□Ｈ＊　１Ｎ７０ｓ　・ＨＣＯＯＨ・１／２Ｈ，Ｏに対する元素分析の結果。

理論：Ｃ＝４９．４２％；Ｈ＝４．７４％：Ｎ＝１９．２１％実際：Ｃ＝４９． ４５％；Ｈ＝４．７０％：Ｎ＝１９．４．５％ＭＳ　（ＦＡ、Ｂ）による出カス ベクトル：（マトリクス：チオグリセロール；８ｋｅＶ）：４５６　（ｍ”、１ ００）、４１２　（１３，３）、４１０　（１０゜８）。

３２６　（１３，３）、３１１　（１０，４）、２８３　（１３，７）。

２８２　（２４，１）、２３２　（３９，４）製造■ ５−ＣＨＯ−（６Ｓ）−ＴＨＦのカルシウム塩（実施例３：式Ｖ）（７）製造上 述の製造■によって得られる純粋なジアステレオマー■の８０ｇとトリス（ヒド ロキシメチルアミノ）−メタンの２Ｍ水溶液の１００ｍ１とを、脱気した２リツ ターの水と２０ｍ１の２−メルカプトエタノールとの混合物に加え、還流凝縮器 とｐＨｔ極とを備えた反応槽中において不活性雰囲気下でＲＴで攪拌する。

得られた混合物を、４５〜５０℃に加熱し、固体が完全に溶けるまで、トリス（ ヒドロキシメチルアミノ）メタンを必要量加えることによりｐＨを７．３に維持 する。得られた媒質を４．５時間還流させ、３．３ｇのカーボンブラックを熱い その溶液に加え、さらに１時間連続的に攪拌する。その間に、前記媒質はＲＴま で冷却される。反応媒質をシーライトで濾過した後、８７ｍ１のＣａＣ１，の２ Ｍ水溶液を濾液に加える。得られた溶液をゆっくりと３．６リツターのＥｔＯＨ （９４％）で希釈する。このように希釈された溶液を、０°Ｃに一夜維持し、形 成された沈殿物を濾過により集め、ＥｔＯＨ（９４％）そしてＭｅＣＯＭｅで洗 浄する。減圧下において５０°Ｃで２時間乾燥すれば、７９ｇの未精ｍ（６Ｓ） −フォリネートカルシウムが得られる。この生産物はＨＰＬＣによれば９６％の 純度を育しており、ＨｔＯを用いて再結晶を繰り返し、５０°Ｃで減圧下におい て乾燥すれば、純粋な（６Ｓ）−フオリネートカルシウムが４３．５ｇ得られる （収率：４８．５％）。

分析 ◎Ｈ，Ｏ含有量（ＦＴＳＣＥ（ＥＲによる）：１５％◎Ｃａ含有量：８．ｌ１％ （理論ニア、８４％）◎ＨＰＬＣ純度：１００％ ◎ＨＰＬＣテスト〔米国薬局方の（６ＲＳ）標準に対する〕　：９９．５％ ◎ジアステレオマー的純度（カイラルカラムを用いた評価）＝１００％ ◎ＵＶスペクトル（０，０１ＮのＮａＯＨ中で２０ｍｇ／ｌ）：λ、、、＝２８ ２ｎｍ　（ε＝３０，０６０）λ、、＋、＝２４２ｎｍ ２吸収ピークの比ＡＩ　／Ａｌ　＝４．　９６◎〔α〕。＝−１４，６°　（Ｈ ２Ｃ中でｃ＝１）製造■ ５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦのカルシウム塩（実施例４：式■）の製造得よう とする物質は、前記製造■における方法にしたがって得られる（但し、式■のジ アステレオマーが式■のジアステレオマーに変わることを除く）。

分析 ◎ＨｔＯ含有量（ＦＩＳＣＨＥＲによる）：１０．２％◎ＨＰＬＣ純度＝９９％ ◎ＨＰＬＣテスト〔米国薬局方の（６Ｒ３）標準に対する〕　：９５％◎ジアス テレオマー的純度（カイラルカラムによる評優）：９８％以上 ◎ＵＶスペクトル（０，０ＩＮのＮａＯＨ中で２０ｍｇ／ｌ）：λ、、、＝２８ ２ｎｍ　（ε＝２８，３５０）λ１１１；２４２ｎｍ ２吸収ピークの比Ａ＋　／Ａｓ　＝４．　２５◎（ａ）　ｏ　＝±３９．８’　 （Ｈｌ　Ｏ中でｃ＝１）製造■ ５．１Ｏ−ＣＨｔ　−（６Ｓ）−ＴＨＦのマグネシウム塩（実施例５：式Ｘ）の 製造 １０ｇの式■のオルトアミドジアステレオマーを、１３０ｍ１の乾ｆｉＤＭｓ。

に４．１８ｇのＨ−ＴＳＡを溶かした溶液中に縣濁させ、完全に溶解が終わるま で不活性雰囲気下においてＲＴで攪拌する。４４ｍ１のピリジンをＲＴで加え、 さらに４４ｍ１のＴＭＳＯに８８０ｍｇのＮａＢＨｎを溶解させた溶液をゆっ（ す１０分以上の時間をかけて加える。得られた混合物を１０分間ＲＴで攪拌した 後、その反応媒質を水浴を用いて冷却し、ｌリッターのメチルエチルケトンを用 いて希釈する。得られた混合物をＯ’Ｃで２０分間攪拌し、形成された黄色の沈 殿物を濾過により集める。集められた沈殿物を、アセトンによって２度洗浄し、 ５０″Ｃで１時間減圧下において乾燥させる。これにより、６．１４ｇの未精製 の５、ｌ　０−ＣＨ，−（６Ｓ）−ＴＨＦ　（おそら＜Ｎａ″″塩とピリジニウ ム塩との混合物）を得る。この生産物は、ＨＰＬＣ純度が８７．２％であり、約 １１％の５−Ｍｅ−ＴＨＦを含んでいる。

得られた未精製の生産物を、微量のＮａＯＨを含む水８０ｍ１に、０°Ｃで不活 性雰囲気下において攪拌しながら加える。この操作中において、ｐＨは、必要に 応じてＩＮのＮａＯＨを加えることにより約９．０に維持する。６．０ｍｌのＭ ｇＣＬの２Ｍ水溶液を得られた溶液に加え、ｐＨを８．４とする。少量の不溶性 物質を、シーライトを用いた濾過により除去する。得られる濾液を、０゛Ｃで攪 拌し、一方で１０５ｍ１のアセトンを滴下することにより希釈する。さらに０゛ Ｃで４５分間攪拌した後、濾過により沈殿物を回収し、アセトンにより２度洗浄 し、ｓｏ’ｃで１時間減圧下において乾燥させる。これにより、３．９ｇの式Ｘ のマグネシウム塩が得られる。

分析 ◎Ｈ，Ｏ含有量（ＦＩＳＣＨＥＲによる）、１４％◎ＨＰＬＣ純度：９２．３％ （５−Ｍｅ−（６Ｒ）−ＴＨＦの含有量は６％） ◎ジアステレオマー的純度（カイラルカラムによる評価）・９８９６又はそれ以 上 ◎Ｕｖスペクトル（０，ＯＩＮのＮａＯＨ中で２０ｒｎｇ／ｌ）：λ１．ヨ＝２ ９６ｎｍ（ε＝２８，３００）λ−１，＝　２４４．　５１ｍ） ２吸収ピークの比Ａ＋　／Ａｘ　＝３．　６８◎〔α〕。＝−８８，７°　（Ｈ ｔＯ中でｃ＝１）製造■ ５．１．０−ＣＨ２−（６Ｒ）−ＴＨＦのマグネシウム塩（実施例６１式■）の 製造 この物質は、式■のオルトアミドジアステレオマーから８発する製造■で述べた ものと同等の方法により得られる。

分析 ◎Ｈ２０含有量（ＦＩＳＣＨＥＲによる）＋１４．０％◎ＨＰＬＣ純度＋９５． ７％（５−Ｍｅ−（６Ｓ）ＴＨＦの含有量は３□　６％） ◎ジアステレオマー的純度（カイラルカラムによる評価）二９９％◎ＵＶスペク トル（０，０１ＮのＮａＯＨ中で２０ｍｇ／ｌ）：λ−、！＝２９６ｎｍ　（ε ＝２８，３００）λ、ア＝２４５ｎｍ ２吸収ピークの比ＡＩ　／Ａｚ　＝４．　１１◎〔α〕。＝＋１２３．９°　（ Ｈ２Ｃ中でｃ＝１）製造■ ５−Ｍｅ−（６３）−ＴＨＦの酸（実施例７１式ＸＩ）の製造１、Ｏｇの式■の オルトアミドジアステレオマーを、５３ｍ１の水に９１０ｍｇのＨ−ＴＳＡを溶 かした溶液に加え、ＲＴで不活性雰囲気中において攪拌する。１ｍｌの水に５０ ０ｍ、ｇのシアノポロヒドロナトリウムを溶かした溶液を続いて１滴ずつ加え、 得られた混合物をＲＴで５時間攪拌する。得られた白色の沈殿物を、濾過により 分離し、冷水、エタノール及びアセトンで洗浄し、さらに５０“Ｃで１時間減圧 下において乾燥する。これにより、未精製の式ＸＩの酸が９２３ｍｇ得られる。

この未精製物質を、３７ｍ１の水と０．２５ｍ１の２−メルカプトエタノールの 混合物中に縣濁させる。得られた混合物を不活性雰囲気中でＲＴで攪拌し、さら に完全に溶解させるのに充分な量のＩＮのＮａＯＨを加える。溶液を濾過し、ｐ Ｈ３，５となるまでＩＮのＨＣＩを１湾ずつ加えることにより濾液を酸性化する 。得られた縣濁液をＯ″Ｃで１時間攪拌した後、遠心分離処理する。そして、固 体部分をまず水を用いて耳輪濁化し、次にエタノールを用いて耳輪濁化し、最後 にアセトンを用いて耳輪濁化する。５０°Ｃにおいて１時間減圧下で乾燥させた 後、式ＸＩの酸が８３６ｍｇ得られる。

分析 ◎ＨｔＯ含有量（ＦＩＳＣＨＥＲによる）。１０％◎ＨＰＬＣ純度：９６．０％ ◎ジアステレオマー的純度（カイラルカラムによる評価）・１００％ ◎ＵＶスペクトル（０，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）中で２０ｍｇ／ｌ）： λ、、、＝２９０ｎｍ（ε＝３２．１００）λ、、、＝２４５ｎｍ ２吸収ピークの比ＡＩ　／Ａ！　＝３．６５◎〔α〕。＝＋３８．０°　（０， １Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）中でｃ＝０．５） ！食！ ５−Ｍｅ−（ＳＲ）−ＴＨＦの酸（実施例８：式ＸＩ［）の製造この人工立体配 置の酸は、製造■で記載された方法によって得られる（但し、式■のジアステレ オマーが、式■のジアステレオマーに変わることを除く）。

分析 ◎Ｈ，Ｏ含有量（ＦＩＳＣＨＥＲによる）：１１．５％◎Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ純 度：９６．３％◎ジアステレオマー的純度（カイラルカラムによる評価）：１０ ０％◎ＵＶスペクトル（０，１Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）中で２０ｍｇ／ｌ ）： λ、。＝２９０ｎｍ（ε＝３２．５００）１ｍ１ｍ　＝２４５　ｎｍ ２吸収ピークの比Ａｔ　／Ａ２　＝３．　７４◎〔α〕。＝−９，２６（０，１ Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）中で式ＸのＮ’　、Ｎ”−メｆレン−（６Ｓ）− ５，６，７，８−ナト５１：：Ｆ口葉酸及びその塩（特に上述の製造■の方法に よって得られるマグネシウム塩）は、人工立体配置の還元フォレー　トの群に属 するジアステレオマー的に純粋な物質であり、治療において使用される。そｎら は、チミジル酸シンテターゼを抑制し、また治１１Ｉ（特に癌に対する治療）に おいて細胞分裂させないようにするために効果的に使用される。

本発明によれば、ジアステレオマー的に純粋な５．１０　ＣＨｔ　（６Ｓ）−Ｔ ＨＦの酸及びそのジアステレオマー的に純粋な塩は、したがって、新規な工業上 の生産物として利用され得る。

また、チミジル酸シンテターゼを抑制し、また癌の治療等の治療時に細胞分裂を させないようにするための薬物を得る際には、５．ｌ　０−ＣＨ２−（６Ｓ）− ＴＨＦの酸、その非毒性塩及びそれらの混合物の群から選ばれたジアステレすマ ー的に純粋な物質を使用することが望ましい。

また、変形例として、５．１０−ＣＨ，−（８Ｓ）−ＴＨＦの酸、その非毒性塩 及びそれらの混合物の群から選ばれたジアステレオマー的に純粋な物質（１）を 、５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２′−デオキシウリジン、メトトレキ サート、シス−プラチナ及びそれらの混合物の群から選ばれた抗腫瘍剤（２）と ともに使用することが勧められる。

この使用方法では、前記物質（１）と剤（２）とが生理学的に受容され得る付形 剤を伴う化合物の形が好ましい。（１）＋　（２）の組合せは、相乗剤的効果を もたらす。

しかも、いわゆる人工立体配置の群に属するジアステレオマー５−ＣＨＯ−（Ｓ Ｒ）　−ＴＨＦ及びその塩は、治療上興味深い細胞分裂抑制特性を育しているこ とがわかった。それらの細胞分裂抑制特性が検出され得るという事実は、（ｉ） いわゆる自然立体配置の群に属する５−ＣＨＯ−（６Ｓ）−ＴＨＦ、式５−ＣＨ Ｏ−（６Ｒ３）−ＴＨＦの市販の葉酸及びそれらの塩が従来メトトレキサート等 の細胞分裂抑制剤の効果を制限してきたのであるから驚くべきことであり、しか も（ｉｉ）毒性が低い５−ＣＨＯ−（ＳＲ）−ＴＨＦ及びその塩が全部あるいは 部分的に、メトトレキサート等のような細胞に対して毒性か強（また育害である ことが良く知られている細胞分裂抑制剤あるいは抗腫瘍剤に代えて使用され得る のであるから有益である。

現段階の知見では、出願人は、５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦ及びその塩が細胞 分裂抑制効果を示すのは、細胞の１またはそれ以上の必須酵素に対するそれら化 合物の効果的な活性によるものであると考えている。但し、この理論的な見地に 出願人が拘束されるものではない。

このように、本発明では、癌のように腫瘍を伴う疾病に対する治療上に際し使用 できる細胞分裂抑制剤として、式５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦに係る（６Ｒ） −５−フォルミルー５．　６．　７．　８−テトラヒドロ葉酸、その非毒性塩及 びそれらの混合物の群から選ばれたジアステレオマー的に純粋な物質を使用する ことが勧められる。

勿論、細胞分裂抑制活性を示すものとして５．１０　ＧＨｚ−（６Ｓ）　ＴＨＥ 、５−ＣＨＯ−（６Ｒ）−ＴＨＦ及びそれらの非毒性塩を使用するという本発明 に係る新規な方法の範囲内で、各活性物質は治療上有効な量か投与されるであろ う。その場合、使用される化合物は、生理学的に受容され得る付形剤とともに、 （ａ）化合物５．１０−ＣＨ２−（６Ｓ）−ＴＨＦ、その非毒性塩及びそれらの 混合物、及び（ｂ）化合物５−ＣＨＯ−（ＳＲ）−ＴＨＦ、その非毒性塩及びそ れらの混合物から選ばれた、細胞分裂抑制効果を発揮し得る量の活性添加物を含 有し得る。

要約書 本発明は、テトラヒドロ葉酸から誘導されるジアステレオマーの新規な製造方法 に関する。（ｉ）（６Ｒ３）−フｔリニン酸またはその塩の１つ、または（ｌｌ ）５．１０−メテニル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸をｐＨ２，０〜２゜ ６においてＨＣＯＯＨと反応させることによって、オルトアミド構造の２つのジ アステレオマーであって次の化学式で表されるものの混合物を含む沈殿を得る。

なお、Ｒはｐ−ベンゾイル−（Ｌ）−グルタミン酸残基である。モル比ＩＶ／Ｉ は約７／３である。化合物■はいわゆる自然立体配置のものであり、また化合物 ■はいわゆる人工立体配置のものである。純粋の化合物■は前記沈殿物から分離 さＬそして純粋の化合物■は対応す濾液から分離される。

自然及び人工の立体配置を有する還元フオレートのジアステレオマー及びそれら の塩は、それぞれ化合物■及び■から得られる。

国際調査報告 ｌｍ−−１１４１−１＾−ｍｋ−ｍ−Ｎ−、ＰＣＴ／ＦＲ９１１００１８５国際 調査報告 ＦＲ９１０（１１８５ ＳＡ　４５７３０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テトラヒドロ葉酸から誘導される化合物及びそのジアステレオマーの製造方 法であって、 （１）次の化合物の群から選ばれたテトラヒドロ葉酸化合物をｐＨ２．０〜２． ６でＨＣＯＯＨと反応させる工程 （ｉ）次式で表される（６ＲＳ）−５−フォルミル−５，６，７，８−テトラヒ ドロ葉酸及びその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）Ｒは次式で表されるｐ−ベンゾイル− （Ｌ）−グルタミン酸残基である▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＩＩＩ ）但しＡはＨ、及び （ｉｉ）次式で表されるＮ５，Ｎ１０−メテニル−５，６，７，８−テトラヒド ロ葉酸 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）但しＸ−は陰イオンであり、Ｒは前 記定義により定義されるものであり；（２）得られた沈殿物を濾過により集め、 またそれに対応する濾液を集める工程； （３）人工立体配置の群に属する第１純粋ジアステレオマーを前記沈殿物から分 離する工程；そして （４）必要に応じ、自然立体配置の群に属する第２純粋ジアステレオマーを前記 工程（２）において得られた濾液から分離する工程、を含む製造方法。 ２．前記工程（１）が、 （ａ）式Ｉの化合物またはその塩の１つを５５〜６５℃で少なくとも１時間Ｈ２ Ｏ／ＨＣＯＯＨ混合物と反応させる工程、（ｂ）得られた混合物を４０〜４５℃ に冷却する工程、（ｃ）前記反応を、ｐＨを２．０〜２．６に維持しながら少な くとも０．２５時間４０〜４５℃で続ける工程、 を含む請求項１に記載の方法。 ３．前記工程（１）は、式ＩＩの化合物をｐＨ２．０〜２．６で５５〜６５℃で 少なくとも０．２５時間Ｈ２Ｏ／ＨＣＯＯＨ混合物と反応させる工程を含む、請 求項１に記載の方法。 ４．前記工程（１）は、アンモニア水溶液を加えることにより反応媒質のｐＨが ２．０〜２．６の範囲に設定されている、請求項１，２及び３のいずれかに記載 の方法。 ５．前記工程（１）は、反応媒質のｐＨが２．２〜２．４の範囲に設定されてい る、請求項４に記載の方法。 ６．前記工程（３）及び（４）における分離が分別結晶化を含んでいる、請求項 １に記載の方法。 ７．前記工程（２）で得られる物質が、モル比約７／３の前記第１ジアステレオ マーと前記第２ジアステレオマーとの混合物である、請求項１に記載の方法。 ８．請求項１の前記工程（４）の方法によって得られるテトラヒドロ葉酸化合物 であって、自然立体配置の群に属し、かつ次のオルトアミド化学式で表されるテ トラヒドロ葉酸化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）９．請求項１の前記工程（３）の 方法によって得られるテトラヒドロ葉酸化合物であって、人工立体配置の群に属 し、かつ次のオルトアミド化学式で表されるテトラヒドロ葉酸化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）１０．請求項８または請求項９に記 載のジアステレオマーテトラヒドロ葉酸化合物の使用方法であって、前記ジアス テレオマーテトラヒドロ葉酸化合物をジアステレオマー的に純粋な６Ｓ及び６Ｒ の還元フォレートを得るために使用する、ジアステレオマーテトラヒドロ葉酸化 合物の使用方法。 １１．式ＩＩＩのジアステレオマーから、次の群から選ばれた化合物を得る請求 項１０に記載の使用方法。 （ａ）（６Ｓ）−５−フォルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、（ｂ） （６Ｓ）−Ｎ５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、（ｃ）（６Ｒ） −Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、及び （ｄ）それらの塩 １２．式ＩＶのジアステレオマーから、次の群から選ばれた化合物を得る請求項 １０に記載の使用方法。 （ａ）（６Ｒ）−５−フォルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、（ｂ） （６Ｒ）−Ｎ５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、（ｃ）（６Ｓ） −Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、及び （ｄ）それらの塩 １３．Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸 、及びそのジアステレオマー的に純粋な付加塩。 １４．チミジル酸シンテターゼを抑制し、かつ治療、特に癌に対する治療の際に 細胞分裂抑制のために使用される薬剤を得るため、Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−（ ６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、その非毒性塩及びそれらの混合物 の群から選ばれたジアステレオマー的に純粋な物質を使用することを特徴とする 使用方法。 １５，Ｎ５，Ｎ１０−メチレン−（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸 、その非毒性塩及びそれらの混合物の群から選ばれたジアステレオマー的に純粋 な物質（１）に、５−フルオロウラシル、５−フルオロ−２′−デオキシウリジ ン、メトトレキサード、シス−プラチナ及びそれらの混合物の群から選ばれた抗 腫瘍剤（２）を組み合わせる、請求項１４に記載の使用方法。 １６．腫瘍疾病に対する治療において使用され得る細胞分裂抑制剤を得るため、 （６Ｒ）−５−フォルミル−５，６，７．８−テトラヒドロ葉酸、その非毒性塩 及びそれらの混合物の群から選ばれたジアステレオマー的に純粋な物質を使用す ることを特徴とする使用方法。