Verfahren zur Herstellung eines Kücken-Provitamin-D-präparates aus einem Steringemisch. Seit es bekannt ist, dass Cholesterin kleine Mengen Provitamin-D enthält, hat man ver sucht, dieses Provitamin-D-Sterin zu konzen trieren und so rein wie möglich zu isolieren.
Insbesondere nach der Entdeckung von Wad- .d..ell (Journ. of the Biol. Chemistry, Band 105, Juli 1934, Nr. 4, Seite 711/739), dass dieses Provitamin sich hinsichtlich der Ak- tivierbarkeit zu Kückenvitamin-D von pflanz lichem Ergosterin unterscheidet, ist die Her stellung des praktisch reinen tierischen Pro viatmins-D bedeutungsvoll geworden.
Zur Konzentrierung dieses Provitamins hat man verschiedene Methoden anzuwenden versucht, z. B. fraktionierte Kristallisation, fraktio nierte Verdampfung im Hochvakuum, frak tionierte Extraktion des Digitoninkomplexes, fraktionierte Adsorption mit bestimmten Ad- sorptionsstoffen. Keine dieser Methoden hat jedoch ein nennenswertes Resultat gehabt.
Es ist nun gefunden worden, dass es mög lich ist, das Kückenprovita.min-D erheblich zu konzentrieren, wenn man von einem Ester eines Provitamin-D enthaltenden Sterin gemisches ausgeht und den Provitamin-D- gehalt durch- fraktionierte Adsorption so weit, vorzugsweise bis mindestens 40 bis 50 %, steigert, dass diese Steigerung mittels Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, zweckmässig aus Methylalkohol, fortgesetzt werden kann.
Für die Veresterung wird zweckmässig eine Säure gewählt, die an und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption Anlass gibt, weil dadurch die Unterschiede in der Adsorbierbarkeit der verschiedenen im Ge misch enthaltenen Sterine, wodurch die Tren nung überhaupt möglich wird, verdeckt wer den könnten.
Vorzugsweise werden Steringemische als Ausgangsmaterial benutzt, die bereits einen ziemlich hohen Gehalt an Kückenprovitamin- D besitzen. Steringemische mit einem beson ders hohen Gehalt können aus wirbellosen Tieren, wie Salzwassermuscheln, Teich muscheln, Kreiselschnecken, Mehlwürmern, Erdschnecken, Wellhornschnecken, Regen würmern und andern erhalten werden.
Bei der Darstellung der für die Anwen dung der Erfindung zu benutzenden Aus gangsmaterialien aus den obengenannten wir bellosen Tieren muss man dem Umstand Rech nung tragen, dass das Kückenprovitamin-D ein verhältnismässig instabiler und gegen Sauerstoff empfindlicher Stoff ist.
Ein dafür geeignetes präpetives Ver fahren, bei dem für das Provitamin-D schäd liche Handlungen unterlassen werden, ist bei spielsweise das folgende.
Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur mässig er höhter Temperatur (z. B. etwa 50 ) getrock- net oder nach Zermahlen und gegebenenfalls Zerreiben mit Sand mittels Na2S0,, Alkohol oder Aceton getrocknet.
Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmässig nie drig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther, verwendet und zweckmässig halogenhaltige Extraktionsmittel, wie Chloro form oder Tetrachlorkohlenstoff, vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure Anlass geben können.
Eine länger andauernde Berührung mit Äther ist zweckmässig zu ver meiden, da er häufig Peroxyd enthält oder wenigstens bei seiner Verwendung die Bil dung von Peroxyden schwer zu verhindern ist.
Ist der Grundstoff mit Hilfe von Al kohol oder Aceton getrocknet worden, so kann der darin gelöste Teil des Fettes durch Eindampfen des Lösungsmittels im Vakuum oder durch Extrahieren mit Äther oder Pe- troläther nach Verdünnen mit Wasser gewon nen werden. Die Fettlösung wird durch Fil trieren von gegebenenfalls suspendierten Ei weissbestandteilen befreit und das Lösungs mittel durch Destillieren entfernt.
Das Fett wird dann auf übliche Weise verseift, wobei zweckmässig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden und zum Beispiel eine Lösung von NaOH oder gOH in wenigstens 80 % igem Alkohol verwendet wird.
Die Sei fenlösung kann gewünschtenfalls durch De stillieren von einem Teil des Alkohols be freit werden, worauf der unverseifbare Teil entweder dadurch erhalten werden kann, dass die Seifenlösung mit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird,
oder dass in der wässerigen Seifenlösung durch Be handlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen niedergeschlagenen unverseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen ex- trahiert werden. Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfraktion durch Umkristallisieren, z. B.
aus Alkohol, abgeschieden werden; zur wei teren Reinigung kann mit Erfolg eine U m- kristallisierung aus Methylalkohol angewen det werden, in dem bestimmte verunreini gende, z.
B. ölartige Stoffe oder farbige Li- poidbestandteile sehr wenig löslich sind, so dass sie auf diese Weise entfernt werden kön nen. Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseifbaren Bestandteile erheb liche Mengen von Farbstoffen, wie Carotinoi- den, enthalten, kann unter dem Einfluss von Licht und Luft ein Teil des Provitamins ver loren gehen; es ist daher erwünscht, auch diesem Übelstand Rechnung zu tragen.
<I>Beispiel I:</I> 7 g eines<B>6,7%</B> Provitaminaeetat enthal tenden Sterinacetatgemisches, das aus einem aus Salzwassermuscheln (Mytilus edulis) ge wonnenen Sterin hergestellt worden ist, wur den in 105 cm' eines Gemisches von Benzol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis <B>60'</B> C, Verhältnis 1 :
1) gelöst. Die Lösung wurde auf eine aus 315g Aluminiumoxyd nach Brockmann hergestellte Adsorptionssäule von 33 mm Durchmesser gegossen, die mit Petrol- äther vorbehandelt war. Die Herstellung einer solchen Adsorptionssäule ist in der Ar beit von A. Wintersteirer und G. Stein, Z. f. Physiol. Chem., Bd. 220, Seite 247 ff., 1933 beschrieben worden.
Nachdem die Lösung in der Säule aufgenommen war, wurde mit im Ganzen 520 cm' Lösungsmittel (Benzol- Petroläther 1 :1) entwickelt. Das gesamte Filtrat, 625 cma, enthielt 4,43 g Acetat gemisch mit nur sehr wenig Provitamin- acetat. Nach Beendigung der Entwicklung wurden die obern 2 cm der Säule, die durch Verunreinigungen gelblich gefärbt waren,
mit einem Spatel vorsichtig entfernt und dann die ganze Säule mit 600 cm@ eines Ge misches von Benzol und Methylalkohol (11 :1) eluiert. Das Eluat enthielt 2,51 g Acetatgemisch mit 157o Provitaminacetat. 2,47 g dieses Präparates wurden in 37,5 cm' Benzol-Petroläthergemisch (1 :
1) gelöst und damit eine zweite Adsorption vorgenommen (Säule aus 112,5 g A1203, 20 mm Durch messer, 200 cm' Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat, 237,5 cmg wurde verworfen, die obern 2 cm der Säule entfernt, und der Rest der Säule mit 2,00 cm# Bienzal-Methyia1kohol- gemisch (11 :
1) eluiert. Im Eluat befanden sich 0,78 g Acetatgemisch mit etwa 30 Provitaminacetat. Mit diesem Präparat wurde eine dritte Adsorption vorgenommen:
0,77 g wurden in 12 cm' Benzol-Petroläther- gemisch (1 : 1), gelöst (Säule aus 36 g A1203, 11 mm Durchmesser, 115 cm' Entwicklungs- flüssigkeit). Das Filtrat wurde in zwei Tei len gesondert aufgefangen;
die ersten 80 cm@, sowie die obern 2 cm der Säule wurden nach Vollendung der Entwicklung verworfen, die restlichen 47 ems des Filtrates wurden mit dem mit 100 cms Benzol-Methylalkohol- gemisch (11 : 1) gewonnenen Eluat vereinigt. Die Ausbeute betrug 224 mg eines etwa 57%igen Acetatgemisches.
Dieses 57 % ige Acetatgemisch wurde drei mal aus Methylalkohol (20, 15 und 12 cm') umkristallisiert, und ergab dann 49 mg gut kristallisiertes Sterinacetat, dessen Absorp tionsspektrum zwischen 3100 bis 2500 RE praktisch dasselbe ist als beim Ergosteriu- acetat,
das aber nach der Verseifung in be strahltem Zustande eine im Verhältnis zu bestrahltem Ergosterin sehr hohe antirachi- tische Aktivität für Kücken hat. Nach noch= maliger Kristallisation aus Methylalkohol schmilzt es im evakuierten Schmelzpunkt s röhrchen bei 160 bis 161 , die Drehung be trägt (a) D = - 78 (in Benzol).
Aus diesem Acetat wird durch Verseifung und Kristallisation aus Methylalkohol das Sterin gewonnen. Es schmilzt im Vakuum bei 149,5 bis 150 C (Eal D = -118 [in. Benzol) sein Absorptionsspektrum unter scheidet sich fast nicht von dem des Ergo sterins.
<I>Beispiel</I> II 8 g eines aus Muscheln erhaltenen Ste- ringemisches, das, spektroskopisch gemessen, etwa 16 % Provitamin enthielt, wurden durch Behandlung mit 10 g Isobuttersäure- Anhydrid und 20 cm3 Pyridin in das Iso- butyrat umgewandelt. Nach anderthalbstün diger Erhitzung im Vakuum auf<B>110 </B> C wurde die Lösung abgekühlt und in 200 cm' Alkohol gegossen.
Das niedergeschlagene Ge misch von Isobutyraten wurde filtriert, mit kaltem Alkohol gewaschen, bis es frei von Pyridin war und getrocknet. Ausbeute: 7,5 g.
7,45 g dieses Isobutyratgemisches wurden in 105 cm' eines Lösungsmittels gelöst, das aus gleichen Teilen Benzol und Petroläther, bestand, Kochpunkt 40 bis<B>60'</B> C. Diese Lö sung wurde in eine auf die im Beispiel I angegebene Weise aus 317 g A120, herge stellte Adsorptionssäule gegossen; die Säule wurde darauf mit 1960 cm' Lösungsmittel gewaschen.
Da der Provitaminester stärker adsorbiert wurde, traten die Ester der an dern im Gemisch vorhandenen Sterine im Filtrat früher als der Provitaminester auf.
Durch Beobachtung der Absorption des Fil trates in dem Gebiet zwischen 3000 und 2800 R (mittels einer photoelektrischen Cd- Zelle mit Uviolglasfilter) liess sich leicht der Augenblick, in dem der Provitaminester im Filtrat zum Vorschein kam, sowie der Augen blick seiner höchsten Konzentration fest stellen.
Das Filtrat wurde in drei Teilen auf gefangen; der erste Teil wurde aufgefangen, bis der ProvitamineAer erschien, der zweite Teil bis der Provitaminester seine höchste Konzentration erreichte und der dritte Teil bis der Provitaminester nahezu vollkommen aus der Säule gewaschen war.
Im vorliegen den Beispiel enthielten die ersten 375 cm' 0,62 g provitaminesterfreies Isobutyrat, die folgenden<B>110</B> cm' 4,50 g Isobutyrat mit etwa <B>7.5%</B> Provitaminester, die letzten 1580 cm', 2,32 g Isobutyrat mit etwa 37,5 % Pro- vitaminisobutyrat. Diese 2,32 g wurden in 8 cm' des Lösungsmittels gelöst und in die selbe Säule gegossen, ihnen folgten 1455 cm' Lösungsmittel.
Das Filtrat wurde wieder in Teilen aufgefangen; die letzten 960 cm' ent hielten 0,59 g Isobutyratgemisch mit etwa 84% Provitaminisobutyrat. 0,58 g des letz teren Gemisches wurden umkristallisiert, zu nächst aus 50 cm' Äther-Methylalkohol und dann aus 25 cm' Alkohol. Ausbeute 0.43 g Provitaminisobutyrat von 94%.
Der Pro- vitamin-D-Ester wird hierauf verseift. <I>Beispiel I11:</I> Aus etwa 8 kg Tubifex wurde auf die in der Beschreibung angegebene Weise die Sterinfraktion hergestellt. Diese Sterinfrak- tion wurde durch Behandlung mit Essig- sä.ureanhydrid und Pyridin in das Acetat um gewandelt.
Das erhaltene Acetatgemisch wurde auf nahezu die gleiche Weise wie im Beispiel 1I einer fraktionierten Filtration durch eine Adsorptionssäule A1=03 unter worfen. Aus 12,5 g Acetatgemisch mit 24 % Provitaminacetat wurde nach einer einzigen Behandlung eine Fraktion von 5,10g mit etwa 47 % Provitaminacetat erhalten. Diese Fraktion wurde für die zweite Behandlung benutzt, durch die eine Fraktion von 3,12 g mit etwa<B>62%</B> Provitaminacetat erhalten wurde.
Diese Fraktion wurde abermals einer ähnlichen Behandlung unterworfen; die stärkste Fraktion, die erhalten wurde, im Gewicht von 1,11 g, enthielt etwa<B>83%</B> Pro vitaminacetat. Dieses Präparat wurde aus Methylalkohol umkristallisiert.
Ausbeute: 0,97 g mit 91 % Provitaminacetat. Nach einer wiederholten Umkristallisierung aus Methyl alkohol ergab sich, dass der Provitaminacetat- gehalt bis zu 96 % angastigen war. Nr Provitamin-D-Ester wird hierauf verseift.