CH205018A

CH205018A - Verfahren zur Herstellung eines Kücken-Vitamin-D-präparates aus einem Steringemisch.

Info

Publication number: CH205018A
Authority: CH
Inventors: Gloeilampenfabrieken N Philips
Original assignee: Philips Nv
Priority date: 1935-06-22
Filing date: 1936-06-22
Publication date: 1939-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung eines Kücken-Vitamin-D-präparates aus einem Steringemisch. Seit,es bekannt ist, dass Cholesterin kleine Mengen Provitamin-D enthält, hat man ver sucht,,dieses Provitamin-D-Sterin zu konzen trieren und so rein wie möglich zu isolieren.

Insbesondere nach .der Entdeckung von Waddell (Journ. of the Biol. Chemistry, Band 105, Juli 1934, Nr. 4, Seite 711/739), dass dieses Provitamin sich hinsichtlich der Aktivierbarkeit zu Kückenvitamin-D von pflanzlichem Ergosterin unterscheidet, ist die Herstellung .des praktisch reinen tierischen Provitamins-D bedeutungsvoll geworden.

Zur Konzentrierung dieses Provitamins hat man verschiedene Methoden anzuwenden versucht, z. B. fraktionierte Kristallisation, fraktio nierte Verdampfung im Hochvakuum, frak tionierte Extraktion des Digitoninkomplexes, fraktionierte Adsorption mit bestimmten Ad sorptionsstoffen. Keine dieser Methoden hat jedoch ein nennenswertes Resultat ,gehabt.

Es ist nun gefunden worden, dass es mög lich ist, ein gückenvitamin-D-Präparat zu er- halten, wenn man von einem Ester eines Pro vitamin-D enthaltenden.Steringemisches aus geht und den Provitamin-D-Glehalt durch fraktionierte Adsorption so weit, vorzugs weise bis mindestens 40 bis 50 %, steigert, dass diese @Steigerung mittels Umkristallisie- ren:

aus einem Lösungsmittel, zweckmässig aus Methylalkohol fortgesetzt werden kann, und nach idem Verseifen das so erhaltene konzentrierte Provitamin-D-Präparat be strahlt.

Für die Veresterung wird zweckmässig eine Säure gewählt, die an und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption An lass gibt, weil dadurch die Unterschiede in der Absorbierbarkeit der verschiedenen im Gemisch enthaltenen Sterine, wodurch .die Trennung überhaupt möglich wird, verdeckt werden könnten.

Vorzugsweise werden Steringemische als Ausgangsmaterial benutzt, die bereits einen ziemlich hohen Gehalt an Kückenprovita- min-,1) besitzen. Steringemische mit einem besonders hohen Gehalt können aus wirbel losen, Tieren, wie Salzwassermuscheln, Teich muscheln, Kreiselschnecken, Mehlwürmern. Erdschnecken, Wellhornschnecken, Regen würmern und andern erhalten werden.

Beil der Darstellung der für die Anwen dung der Erfindung zu benutzenden Aus- gangsmaterialien aus den obengenannten wirbellosen Tieren muss man dem Umstand Rechnung tragen, dass das Küekenprov ita- min-D ein verhältnismässig instabiler und gegen Sauerstoff empfindlicher Stoff ist.

Ein dafür geeignetes präparatives Ver fahren, bei dem für das Provitamin-D schäd liche Handlungen unterlassen werden, ist bei spielsweise das folgende: Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur mässig erhöhter Temperatur (z.

B. etwa50') ge trocknet oder nach Zermahlen und gegebenen falls Zerreiben mdt Sand mittelst Na..,SO, Alkohol oder Aceton getrocknet. Alus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann da.s Fett extrahiert, wobei zweck mässig niedrig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petrolä_ther, verwendet und zweckmässig halogenhaltige Extraktions mittel wie Chloroform oder Tetrachlorkohlen- stoff,

vermieden werden, da diese zur Bin dung von Salzsäure Anlass gehen können. Eine länger andauernde Berührung mit Äther ist zweckmässig zu vermeiden. da er häufig Peroxyd enthält oder wenigstens hei seiner Verwendung die Bildung von Peroxy den schwer ziz verhindern ist.

Ist der ('.rund- stoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton ge trocknet worden, so kann der darin gelöste Teil des Fettes durch Eindampfen des Lö- sungsmittels im Vakuum oder durch Extra hieren mit Äther oder Petroläther nach Ver dünnen mit )blasser gewonnen -erden. Die Fettlösung wird durch Filtrieren von gege benenfalls suspendierten Eiweissbestandteilen befreit und das Lösungsmittel durch Destillie ren entfernt.

Das Fett wird dann auf übliche Weise verseift, wobei zweckmässig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden -erden und zum Beispiel eine Lösung von Na.OH oder KOH in wenigstens 80 % igem Alkohol verwendet wird.

Die Seifenlösung kann ge- wünschtenfalls durch Destillieren von einem Teil des Alkohols befreit werden. worauf der unverseifbare Teil entweder dadurch erhalten werden kann.

da.ss die Seifenlösung mit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird, oder dass in der wässerigen Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen nie.- dergeschlagenen unverseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen extrahiert wer den.

Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfrak- tion durch Umkristallisieren. z. B. aus Al kohol, abgeschieden werden; zur weiteren Reinigung kann mit Erfolg eine Umkristal- lisierung aus Methylalkohol angewendet wer den. in dem bestimmte verunreinigende, z. B.

ölartige Stoffe oder farbige Lipoidbesta.nd- teile sehr wenig löslich sind. so dass sie auf diese Weise entfernt werden können. Insbe sondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseifbaren Bestandteile erhebliche Men gen von Farbstoffen. wie Carotinoi.den, ent halten, kann unter dem Einfluss von Licht und Luft ein Teil des Provitamins verloren gehen; es ist daher erwünscht, auch diesem Umstand Rechnung zu tragen.

Beispiel I: 7 g eines 6,7% Provitaininacetat enthal tenden Sterinacetatgeinisehes, das aus einem aus Salzwassermuscheln (My tilus e@dulis) ge wonnenen Sterin hergestellt worden ist, wur den in 105 cm' eines Gemisches von Benzol und Petroläther (Siedepunkt -10 -60' C, Verhältnis 1 : 1) gelöst.

Die Lösung wurde auf eine aus315 g Aluminiumoxyd nach Brockmann hergestellte Adsorptionssäule von 35 mm Durchmesser gegossen, die mit Pet_rol- äther vorbehandelt war. Die Herstellung einer solchen Adsorptionssäure ist in der Ar beit von A. Wintersteiner und G. Stein, Z. f. Physiol. Chem., Bd. 220, Seite 247 ff., 1933 beschrieben worden.

Nachdem die Lö sung in der Säule aufgenommen war, wurde mit im Ganzen520 cm' Lösungsmittel (Ben- zol-Petroläther 1 : 1,) entwickelt.

Das gesamte Filtrat, 626 cm', enthielt 4;43g Acetat gemisch mit nur sehr wenig Provitaminacetat. Nach .Beendigung der Entwicklung wurden die obern 2 cm der Säule, die durch Verunrei nigungen gelblich gefärbt waren, mit einem Spatel vorsichtig entfernt und dann die ganze Säule mit 600 cm' Gemisches von Benzol und Methylalkob:ol (11:

1) eluiert. Das Eluat enthielt 2,51 g Acetatgemisch mit 1,5 % Pro,- vitamänacetat. 2,47 g dieses Präparates wur den in 317;5 cm3 Benzol-Petroläthergemisch (1 :

1) gelöst und damit eine zweite Adserp- tion vorgenommen (Säule aus 112,5 g A1203, 2,0 mm Durchmesser, ,200 cm' Entwicklungs,- flüssigkeit). Das Filtrat,2137,5 cm' wurde verworfen, die obern 2 cm der Säule ent fernt, und der Rest der Säule mit 200 cm' Benzol-Methylalkoholgemisch (11, :

1) eluiert. Im Eluat befanden. sich O,7,8 g Aoetatgemisch mit etwa W % Provitaminacetat. Mit diesem Präparat wurde eine :dritte Adsorption vor genommen: 0,77 g wurden in 12 cm' Benzol- Petrol@äthergemis,ch (1 :

1) gelöst (Säule aus 36 g A1203, 11 mm Durchmesser, 115 cm' Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat wurde in zwei Teilen gesondert aufgefangen;

die ersten 80 cm@, sowie die obern 2 cm der ,Säule wurden nach Vollendung der Entwicklung verworfen., die restlichen 9.7 cm' des Filtrates wurden mit dem mit 100 em3 Benzol-Methyl- alkoholgemisch (11: 1) gewonnenen F"luat vereinigt. Die Ausbeute .betrug 224 mg eines etwa V%igen Aoetatgemis,chm.

Dieses 57%ige Acetatgemisch wurde drei mal aus Methylalkohol (2-0, 15 und 12 cm') umkristallisiert, und ergab dann 49 mg gut kristallisiertes, Sterinacetat, dessen Absorp tionsspektrum zwischen 31002500 % . E praktisch dasselbe ist als beim Ergos terin- aoetat, das aber nach der Verseifung in be strahltem Zustande eine im Verhältnis zu bestrahltem Ergosterin sehr hohe antirachi tische Aktivität der Kücken hat.

Nach noch maliger Kristallisation aus Methylalkohol schmilzt es im evakui@erfen Schmelzpunkt- röhrchen bei 16,0'-1G1 , die Drehung be trägt [a] D = - 78 (in Benzol).

Aus diesem Acetat wird durch Versei fung und Kristallisation aus Methylalkohol ,das Sterin gewonnen. Es schmilzt im Va kuum bei 1:49;5 -15,0 C ([ä] D = 11$, [in Benzol]) sein Absorptionsspektrum un- terscheidet sich fast nicht von dem .des Ergo sterins. Das so erhaltene Präparat wird nun bestrahlt.

Beispiel II: 8 g eines aus Muscheln erhaltenen .Sterin- gemisches, das spektroskopisch gemessen, etwa116 % Provitamin enthielt, wurden durch Behandlung mit 10 g Isobuttersäure- anhydrid und 20 cm@ Pyridin in das Iso- butyrat umgewandelt.

Nach anderthalbstün diger Erhitzung im Vakuum auf11.0' C wurde die Lösung abgekühlt und in 200 cm@ Alkoholgegossen. Das niedergeschlagene Ge misch von Isobutyraten wurde filtriert, mit kaltem Alkohol gewaschen bis es frei von Pyridin war und getrocknet. Ausbeute: 7,5 g.

7,45 .g dieses Isabutyratgemisches wurden in 105 em@eines Lösungsmittels gelöst, das aus gleichen Teilen: Benzol und Petroläther, bestand, Kochpunkt 40-G4 C. Diese Lö sung wurde in eine auf die im: Beispiel I an gegebene Weise aus 3'17 g A1203 hergestellte Adsorptionss ulegegossen;

die Säule wurde darauf mit1960 cm' -Lösungsmittel ge- wa,sichen. Da der Provitaminester stärker ad- s6rbiert wurde, traten die Ester-der andern im Gemisch vorhandenen Sterine im Filtrat früher als der Provitaminester auf.

Durch Beobachtung,der Adsorpti.on des Filtrates in dem Gebiet zwischen 300,0 und 2i800 A (mit tels - einer photoelektrischen Cd-,Zelle mit Uviolglasfilter) liess sich leicht der Augen blick, in dem der Provitaminester im Filtrat zum Vorschein kam, sowie -der Augenblick seiner höchsten Konzentration feststellen.

Das Filtrat wurde .in drei Teilen aufgefangen; .der erste Teil wurde aufgefangen, bis, der Provitaminester 'erschien, der zweite Teil bis der Provitaminester seine höchste Kon- zentration erreichte und der dritte Teil bis der Provitaminester nahezu vollkommen aus der Säule gewaschen war.

Im vorliegenden Beispiel enthielten die ersten375 ein' 0,62 g provitaminesterfreies Isobutyra.t, die folgen den 110 ein:' 4,50 g Isobutyrat mit etwa 7,5 % Provitaminester, ;

die letzten 1580 cm', 2,39 g Isobutyra-t mit .etwa 37,5 % Provitaminiso- butyrat. Diese 2,32 g, wurden in 8 cm' des Lösungsmittels gelöst und in dieselbe Säule gegossen, ihnen folgten 1455 cm' Lösungs- mittel. Das: Piitrat wurde wieder in Teilen aufgefangen;

die letzten 960 cm' enthielten 0,59 Isobutyra-tgemisch mit etwa 84% Pro- vita-minisobutyrat. 0,58 g des letzteren Ge misches wurden umkristallisiert, zunächst aus 50 cm' Äther-3iethylalkohol und dann aus 25 cm' Alkohol. Ausbeute 0,43g Provitamin- isobutyrat von 94 %. Der Provitamin-D-Ester wird hierauf verseift und das Verseifungsr produkt bestrahlt.

Reispiel I11: Aus etwa 8 kg Tubifex wurde auf die in der Beschreibung angegebene Weise die Sterinfraktion hergestellt.

Diese Sterinfrak- tion wurde durch Behandlung mit Essig- säurea.nhydrid und Pyri.din in das Acetat umgewandelt. Das erhaltene Aoetatgemisch wurde auf nahezu die gleiche Weise wie im Beispiel 1I einer fraktionierten Filtration durch eine Adsorptionssäule aus A1=0, unter- worfen. Aus 12;

5 g Acetatgemisch mit 2'4 Provitaminacetat wurde nach einer einzigen Behandlung eine Fraktion von 5,10 g mit etwa 47% Provitaminacetat erhalten. Diese Fraktion wurde für die zweite Behandlung benutzt, durch -die eine Fraktion von 3,12, g mit etwa 6,2% Provitaminacetat erhalten wurde. Diese Fraktion wurde abermals einer ähnlichen Behandlung unterworfen;

die stärkste Fraktion, die erhalten wurde, im Gewicht von 1,11 g, enthielt etwa 83 % Pro- vitaminacetat. Dieses Präparat wurde ans Methylalkohol umkristallisiert. Ausbeute: 0,97 g mit 91 % Provitaminacetat. Nach einer wiederholten Umkristallisierung aus Methyl alkohol ergab sich, dass der Provitaminacetat- gehalt bis zu 96 % angestiegen war.

Der Pro- vitamin-D-Ester wird hierauf verseift.

Zur Herstellung eines Lückenvitamin D- Präparates wird das erhaltene konzentrierte Provita.min-D-Präparat bestrahlt.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung eines Kücken v itamin-D-Präparates, dadurch gekennzeich net, da.ss man zunächst ein Provitamin-D - _c haltendes Steringemisch mit einer Säure, die an und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption Anlass gibt, verestert, dann den Provitamin-D-(xeha.lt durch frak tionierte Adsorption so weit steigert, da.ss diese Steigerung durch weitere Reinigung mittels L:

mkristallisieren aus einem Lösungs mittel fortgesetzt werden kann, und nachdem Verseifen das so erhaltene konzentrierte Pro- vitamin-D-Präparat bestrahlt. UNTERANSPRtCHE: 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den Provitamin- D-Grehalt bis mindestens 40 bis 50 steigert. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Umkristallisation ans Methylalkohol stattfindet. 3.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass von einem aus einem wirbellosen Tier erhall,enc n Provitamin-D enthaltenden Steringemiseh ausgegangen wird.