Verfahren zur Herstellung eines Kücken-Provitamin-D-präparates aus einem Steringemisch. Seit es bekannt ist, dass Cholesterin kleine Mengen Provitamin-D enthält, hat man ver sucht, dieses Provitamin-D-Sterin zu konzen trieren und so rein wie möglich zu isolieren.
Insbesondere nach der Entdeckung von Wad- .d..ell (Journ. of the Biol. Chemistry, Band 105, Juli 1934, Nr. 4, Seite 711/739), dass dieses Provitamin sich hinsichtlich der Ak- tivierbarkeit zu Kückenvitamin-D von pflanz lichem Ergosterin unterscheidet, ist die Her stellung des praktisch reinen tierischen Pro viatmins-D bedeutungsvoll geworden.
Zur Konzentrierung dieses Provitamins hat man verschiedene Methoden anzuwenden versucht, z. B. fraktionierte Kristallisation, fraktio nierte Verdampfung im Hochvakuum, frak tionierte Extraktion des Digitoninkomplexes, fraktionierte Adsorption mit bestimmten Ad- sorptionsstoffen. Keine dieser Methoden hat jedoch ein nennenswertes Resultat gehabt.
Es ist nun gefunden worden, dass es mög lich ist, das Kückenprovita.min-D erheblich zu konzentrieren, wenn man von einem Ester eines Provitamin-D enthaltenden Sterin gemisches ausgeht und den Provitamin-D- gehalt durch- fraktionierte Adsorption so weit, vorzugsweise bis mindestens 40 bis 50 %, steigert, dass diese Steigerung mittels Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, zweckmässig aus Methylalkohol, fortgesetzt werden kann.
Für die Veresterung wird zweckmässig eine Säure gewählt, die an und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption Anlass gibt, weil dadurch die Unterschiede in der Adsorbierbarkeit der verschiedenen im Ge misch enthaltenen Sterine, wodurch die Tren nung überhaupt möglich wird, verdeckt wer den könnten.
Vorzugsweise werden Steringemische als Ausgangsmaterial benutzt, die bereits einen ziemlich hohen Gehalt an Kückenprovitamin- D besitzen. Steringemische mit einem beson ders hohen Gehalt können aus wirbellosen Tieren, wie Salzwassermuscheln, Teich muscheln, Kreiselschnecken, Mehlwürmern, Erdschnecken, Wellhornschnecken, Regen würmern und andern erhalten werden.
Bei der Darstellung der für die Anwen dung der Erfindung zu benutzenden Aus gangsmaterialien aus den obengenannten wir bellosen Tieren muss man dem Umstand Rech nung tragen, dass das Kückenprovitamin-D ein verhältnismässig instabiler und gegen Sauerstoff empfindlicher Stoff ist.
Ein dafür geeignetes präpetives Ver fahren, bei dem für das Provitamin-D schäd liche Handlungen unterlassen werden, ist bei spielsweise das folgende.
Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur mässig er höhter Temperatur (z. B. etwa 50 ) getrock- net oder nach Zermahlen und gegebenenfalls Zerreiben mit Sand mittels Na2S0,, Alkohol oder Aceton getrocknet.
Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmässig nie drig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther, verwendet und zweckmässig halogenhaltige Extraktionsmittel, wie Chloro form oder Tetrachlorkohlenstoff, vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure Anlass geben können.
Eine länger andauernde Berührung mit Äther ist zweckmässig zu ver meiden, da er häufig Peroxyd enthält oder wenigstens bei seiner Verwendung die Bil dung von Peroxyden schwer zu verhindern ist.
Ist der Grundstoff mit Hilfe von Al kohol oder Aceton getrocknet worden, so kann der darin gelöste Teil des Fettes durch Eindampfen des Lösungsmittels im Vakuum oder durch Extrahieren mit Äther oder Pe- troläther nach Verdünnen mit Wasser gewon nen werden. Die Fettlösung wird durch Fil trieren von gegebenenfalls suspendierten Ei weissbestandteilen befreit und das Lösungs mittel durch Destillieren entfernt.
Das Fett wird dann auf übliche Weise verseift, wobei zweckmässig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden und zum Beispiel eine Lösung von NaOH oder gOH in wenigstens 80 % igem Alkohol verwendet wird.
Die Sei fenlösung kann gewünschtenfalls durch De stillieren von einem Teil des Alkohols be freit werden, worauf der unverseifbare Teil entweder dadurch erhalten werden kann, dass die Seifenlösung mit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird,
oder dass in der wässerigen Seifenlösung durch Be handlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen niedergeschlagenen unverseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen ex- trahiert werden. Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfraktion durch Umkristallisieren, z. B.
aus Alkohol, abgeschieden werden; zur wei teren Reinigung kann mit Erfolg eine U m- kristallisierung aus Methylalkohol angewen det werden, in dem bestimmte verunreini gende, z.
B. ölartige Stoffe oder farbige Li- poidbestandteile sehr wenig löslich sind, so dass sie auf diese Weise entfernt werden kön nen. Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseifbaren Bestandteile erheb liche Mengen von Farbstoffen, wie Carotinoi- den, enthalten, kann unter dem Einfluss von Licht und Luft ein Teil des Provitamins ver loren gehen; es ist daher erwünscht, auch diesem Übelstand Rechnung zu tragen.
<I>Beispiel I:</I> 7 g eines<B>6,7%</B> Provitaminaeetat enthal tenden Sterinacetatgemisches, das aus einem aus Salzwassermuscheln (Mytilus edulis) ge wonnenen Sterin hergestellt worden ist, wur den in 105 cm' eines Gemisches von Benzol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis <B>60'</B> C, Verhältnis 1 :
1) gelöst. Die Lösung wurde auf eine aus 315g Aluminiumoxyd nach Brockmann hergestellte Adsorptionssäule von 33 mm Durchmesser gegossen, die mit Petrol- äther vorbehandelt war. Die Herstellung einer solchen Adsorptionssäule ist in der Ar beit von A. Wintersteirer und G. Stein, Z. f. Physiol. Chem., Bd. 220, Seite 247 ff., 1933 beschrieben worden.
Nachdem die Lösung in der Säule aufgenommen war, wurde mit im Ganzen 520 cm' Lösungsmittel (Benzol- Petroläther 1 :1) entwickelt. Das gesamte Filtrat, 625 cma, enthielt 4,43 g Acetat gemisch mit nur sehr wenig Provitamin- acetat. Nach Beendigung der Entwicklung wurden die obern 2 cm der Säule, die durch Verunreinigungen gelblich gefärbt waren,
mit einem Spatel vorsichtig entfernt und dann die ganze Säule mit 600 cm@ eines Ge misches von Benzol und Methylalkohol (11 :1) eluiert. Das Eluat enthielt 2,51 g Acetatgemisch mit 157o Provitaminacetat. 2,47 g dieses Präparates wurden in 37,5 cm' Benzol-Petroläthergemisch (1 :
1) gelöst und damit eine zweite Adsorption vorgenommen (Säule aus 112,5 g A1203, 20 mm Durch messer, 200 cm' Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat, 237,5 cmg wurde verworfen, die obern 2 cm der Säule entfernt, und der Rest der Säule mit 2,00 cm# Bienzal-Methyia1kohol- gemisch (11 :
1) eluiert. Im Eluat befanden sich 0,78 g Acetatgemisch mit etwa 30 Provitaminacetat. Mit diesem Präparat wurde eine dritte Adsorption vorgenommen:
0,77 g wurden in 12 cm' Benzol-Petroläther- gemisch (1 : 1), gelöst (Säule aus 36 g A1203, 11 mm Durchmesser, 115 cm' Entwicklungs- flüssigkeit). Das Filtrat wurde in zwei Tei len gesondert aufgefangen;
die ersten 80 cm@, sowie die obern 2 cm der Säule wurden nach Vollendung der Entwicklung verworfen, die restlichen 47 ems des Filtrates wurden mit dem mit 100 cms Benzol-Methylalkohol- gemisch (11 : 1) gewonnenen Eluat vereinigt. Die Ausbeute betrug 224 mg eines etwa 57%igen Acetatgemisches.
Dieses 57 % ige Acetatgemisch wurde drei mal aus Methylalkohol (20, 15 und 12 cm') umkristallisiert, und ergab dann 49 mg gut kristallisiertes Sterinacetat, dessen Absorp tionsspektrum zwischen 3100 bis 2500 RE praktisch dasselbe ist als beim Ergosteriu- acetat,
das aber nach der Verseifung in be strahltem Zustande eine im Verhältnis zu bestrahltem Ergosterin sehr hohe antirachi- tische Aktivität für Kücken hat. Nach noch= maliger Kristallisation aus Methylalkohol schmilzt es im evakuierten Schmelzpunkt s röhrchen bei 160 bis 161 , die Drehung be trägt (a) D = - 78 (in Benzol).
Aus diesem Acetat wird durch Verseifung und Kristallisation aus Methylalkohol das Sterin gewonnen. Es schmilzt im Vakuum bei 149,5 bis 150 C (Eal D = -118 [in. Benzol) sein Absorptionsspektrum unter scheidet sich fast nicht von dem des Ergo sterins.
<I>Beispiel</I> II 8 g eines aus Muscheln erhaltenen Ste- ringemisches, das, spektroskopisch gemessen, etwa 16 % Provitamin enthielt, wurden durch Behandlung mit 10 g Isobuttersäure- Anhydrid und 20 cm3 Pyridin in das Iso- butyrat umgewandelt. Nach anderthalbstün diger Erhitzung im Vakuum auf<B>110 </B> C wurde die Lösung abgekühlt und in 200 cm' Alkohol gegossen.
Das niedergeschlagene Ge misch von Isobutyraten wurde filtriert, mit kaltem Alkohol gewaschen, bis es frei von Pyridin war und getrocknet. Ausbeute: 7,5 g.
7,45 g dieses Isobutyratgemisches wurden in 105 cm' eines Lösungsmittels gelöst, das aus gleichen Teilen Benzol und Petroläther, bestand, Kochpunkt 40 bis<B>60'</B> C. Diese Lö sung wurde in eine auf die im Beispiel I angegebene Weise aus 317 g A120, herge stellte Adsorptionssäule gegossen; die Säule wurde darauf mit 1960 cm' Lösungsmittel gewaschen.
Da der Provitaminester stärker adsorbiert wurde, traten die Ester der an dern im Gemisch vorhandenen Sterine im Filtrat früher als der Provitaminester auf.
Durch Beobachtung der Absorption des Fil trates in dem Gebiet zwischen 3000 und 2800 R (mittels einer photoelektrischen Cd- Zelle mit Uviolglasfilter) liess sich leicht der Augenblick, in dem der Provitaminester im Filtrat zum Vorschein kam, sowie der Augen blick seiner höchsten Konzentration fest stellen.
Das Filtrat wurde in drei Teilen auf gefangen; der erste Teil wurde aufgefangen, bis der ProvitamineAer erschien, der zweite Teil bis der Provitaminester seine höchste Konzentration erreichte und der dritte Teil bis der Provitaminester nahezu vollkommen aus der Säule gewaschen war.
Im vorliegen den Beispiel enthielten die ersten 375 cm' 0,62 g provitaminesterfreies Isobutyrat, die folgenden<B>110</B> cm' 4,50 g Isobutyrat mit etwa <B>7.5%</B> Provitaminester, die letzten 1580 cm', 2,32 g Isobutyrat mit etwa 37,5 % Pro- vitaminisobutyrat. Diese 2,32 g wurden in 8 cm' des Lösungsmittels gelöst und in die selbe Säule gegossen, ihnen folgten 1455 cm' Lösungsmittel.
Das Filtrat wurde wieder in Teilen aufgefangen; die letzten 960 cm' ent hielten 0,59 g Isobutyratgemisch mit etwa 84% Provitaminisobutyrat. 0,58 g des letz teren Gemisches wurden umkristallisiert, zu nächst aus 50 cm' Äther-Methylalkohol und dann aus 25 cm' Alkohol. Ausbeute 0.43 g Provitaminisobutyrat von 94%.
Der Pro- vitamin-D-Ester wird hierauf verseift. <I>Beispiel I11:</I> Aus etwa 8 kg Tubifex wurde auf die in der Beschreibung angegebene Weise die Sterinfraktion hergestellt. Diese Sterinfrak- tion wurde durch Behandlung mit Essig- sä.ureanhydrid und Pyridin in das Acetat um gewandelt.
Das erhaltene Acetatgemisch wurde auf nahezu die gleiche Weise wie im Beispiel 1I einer fraktionierten Filtration durch eine Adsorptionssäule A1=03 unter worfen. Aus 12,5 g Acetatgemisch mit 24 % Provitaminacetat wurde nach einer einzigen Behandlung eine Fraktion von 5,10g mit etwa 47 % Provitaminacetat erhalten. Diese Fraktion wurde für die zweite Behandlung benutzt, durch die eine Fraktion von 3,12 g mit etwa<B>62%</B> Provitaminacetat erhalten wurde.
Diese Fraktion wurde abermals einer ähnlichen Behandlung unterworfen; die stärkste Fraktion, die erhalten wurde, im Gewicht von 1,11 g, enthielt etwa<B>83%</B> Pro vitaminacetat. Dieses Präparat wurde aus Methylalkohol umkristallisiert.
Ausbeute: 0,97 g mit 91 % Provitaminacetat. Nach einer wiederholten Umkristallisierung aus Methyl alkohol ergab sich, dass der Provitaminacetat- gehalt bis zu 96 % angastigen war. Nr Provitamin-D-Ester wird hierauf verseift.
Process for the production of a chicken provitamin D preparation from a sterling mixture. Since it was known that cholesterol contains small amounts of provitamin-D, attempts have been made to concentrate this provitamin-D-sterol and isolate it as pure as possible.
In particular after the discovery of Wad- .d..ell (Journ. Of the Biol. Chemistry, Volume 105, July 1934, No. 4, Pages 711/739) that this provitamin can be activated to give chicken vitamin D different from vegetable ergosterol, the production of the practically pure animal proviatmin-D has become significant.
Attempts have been made to use various methods to concentrate this provitamin, e.g. B. fractional crystallization, fractional evaporation in a high vacuum, fractional extraction of the digitonin complex, fractional adsorption with certain adsorbents. However, none of these methods has had any significant result.
It has now been found that it is possible, please include to concentrate the Kückenprovita.min-D considerably, if one starts from an ester of a sterol mixture containing provitamin-D and the provitamin-D content by fractional adsorption so far, preferably up to at least 40 to 50%, so that this increase can be continued by means of recrystallization from a solvent, expediently from methyl alcohol.
For the esterification, an acid is expediently chosen which in and of itself does not give rise to particularly strong adsorption, because this could hide the differences in the adsorbability of the various sterols contained in the mixture, making separation possible at all .
Preferably, sterling mixtures are used as starting material, which already have a fairly high content of chicken provitamin-D. Stering mixtures with a particularly high content can be obtained from invertebrates such as saltwater clams, pond clams, top snails, mealworms, ground snails, whelks, rainworms and others.
When describing the starting materials to be used for the application of the invention from the abovementioned weevil animals, one must take into account the fact that the chicken provitamin-D is a relatively unstable and oxygen-sensitive substance.
A suitable preventive method in which actions harmful to provitamin-D are neglected is, for example, the following.
The ground mass to be treated is either dried in vacuo at only a moderately increased temperature (e.g. about 50) or, after grinding and, if necessary, triturating with sand, dried using Na2SO, alcohol or acetone.
The fat is then extracted from the raw material pretreated in this way, in which case it is advisable to use low-boiling fat solvents, such as ether or petroleum ether, and expediently halogen-containing extraction agents, such as chloroform or carbon tetrachloride, to be avoided, since these can give rise to the formation of hydrochloric acid.
Prolonged contact with ether should be avoided because it often contains peroxide or, at least when it is used, it is difficult to prevent the formation of peroxides.
If the base material has been dried with the help of alcohol or acetone, the part of the fat dissolved in it can be obtained by evaporating the solvent in vacuo or by extracting it with ether or petroleum ether after diluting it with water. The fat solution is freed of any suspended egg white components by filtration and the solvent is removed by distillation.
The fat is then saponified in the usual way, again advantageously avoiding very high temperatures and using, for example, a solution of NaOH or gOH in at least 80% alcohol.
The soap solution can, if desired, be freed from part of the alcohol by distilling it, after which the unsaponifiable part can either be obtained by diluting the soap solution with water and then extracting the unsaponifiable part with the aid of ether or petroleum ether,
or that in the aqueous soap solution by treatment with a lime salt, the lime soaps are precipitated and the unsaponifiable components precipitated together with the lime soaps, eg. B. with acetone, can be extracted from them. From the unsaponifiable part obtained in this way, the sterol fraction can often be recrystallized, e.g. B.
from alcohol, to be deposited; for further purification, a crystallization from methyl alcohol can be successfully applied, in which certain contaminants, such.
B. oily substances or colored lipoid components are very sparingly soluble, so that they can be removed in this way. Particularly in those cases in which the unsaponifiable constituents contain considerable amounts of colorants such as carotenoids, some of the provitamin can be lost under the influence of light and air; it is therefore desirable to take this deficiency into account as well.
<I> Example I: </I> 7 g of a sterol acetate mixture containing <B> 6.7% </B> provitamine acetate, which has been produced from a sterol obtained from saltwater mussels (Mytilus edulis), was measured in 105 cm 'a mixture of benzene and petroleum ether (boiling point 40 to <B> 60' </B> C, ratio 1:
1) solved. The solution was poured onto an adsorption column of 33 mm diameter made from 315 g of Brockmann aluminum oxide, which had been pretreated with petroleum ether. The production of such an adsorption column is in the work of A. Wintersteirer and G. Stein, Z. f. Physiol. Chem., Vol. 220, page 247 ff., 1933.
After the solution had been taken up in the column, a total of 520 cm 'of solvent (benzene-petroleum ether 1: 1) was developed. The entire filtrate, 625 cma, contained 4.43 g of acetate mixture with only very little provitamin acetate. After completion of the development, the upper 2 cm of the column, which had been colored yellow by impurities,
carefully removed with a spatula and then eluted the entire column with 600 cm @ of a mixture of benzene and methyl alcohol (11: 1). The eluate contained 2.51 g of acetate mixture with 157 ° provitamin acetate. 2.47 g of this preparation were in 37.5 cm 'benzene-petroleum ether mixture (1:
1) dissolved and thus carried out a second adsorption (column of 112.5 g A1203, 20 mm diameter, 200 cm 'developing liquid). The filtrate, 237.5 cm g, was discarded, the top 2 cm of the column was removed, and the rest of the column was filled with 2.00 cm of bienza-methyl alcohol mixture (11:
1) eluted. The eluate contained 0.78 g acetate mixture with about 30% provitamin acetate. A third adsorption was carried out with this preparation:
0.77 g were dissolved in 12 cm 'benzene-petroleum ether mixture (1: 1) (column of 36 g A1203, 11 mm diameter, 115 cm' developing liquid). The filtrate was collected separately in two parts;
the first 80 cm @ and the top 2 cm of the column were discarded after development was completed, the remaining 47 ems of the filtrate were combined with the eluate obtained with 100 cms of benzene-methyl alcohol mixture (11: 1). The yield was 224 mg of an approximately 57% acetate mixture.
This 57% acetate mixture was recrystallized three times from methyl alcohol (20, 15 and 12 cm '), and then yielded 49 mg of well-crystallized sterol acetate, the absorption spectrum of which between 3100 and 2500 RE is practically the same as that of ergosteriol acetate,
but after saponification in the irradiated state it has a very high anti-rachitic activity for chicks in relation to irradiated ergosterol. After another crystallization from methyl alcohol, it melts in the evacuated melting point tube at 160 to 161, the rotation is (a) D = - 78 (in benzene).
The sterol is obtained from this acetate by saponification and crystallization from methyl alcohol. It melts in a vacuum at 149.5 to 150 C (Eal D = -118 [in. Benzene), its absorption spectrum is almost indistinguishable from that of the ergo sterol.
<I> Example </I> II 8 g of a stone mixture obtained from mussels, which, measured spectroscopically, contained about 16% provitamin, were converted into isobutyrate by treatment with 10 g isobutyric anhydride and 20 cm3 pyridine. After one and a half hours of heating in vacuo to <B> 110 </B> C, the solution was cooled and poured into 200 cm of alcohol.
The precipitated mixture of isobutyrates was filtered, washed with cold alcohol until free of pyridine and dried. Yield: 7.5 g.
7.45 g of this isobutyrate mixture were dissolved in 105 cm 'of a solvent which consisted of equal parts of benzene and petroleum ether, boiling point 40 to 60 ° C. This solution was converted into a solution similar to that in Example I. specified manner from 317 g A120, Herge made cast adsorption column; the column was then washed with 1960 cm 'of solvent.
Since the provitamin ester was more strongly adsorbed, the esters of the other sterols present in the mixture appeared earlier in the filtrate than the provitamin ester.
By observing the absorption of the filtrate in the area between 3000 and 2800 R (by means of a photoelectric Cd cell with uviol glass filter), the moment at which the provitamin ester appeared in the filtrate and the moment of its highest concentration could easily be determined .
The filtrate was collected in three parts; the first part was collected until the provitamineaer appeared, the second part until the provitamin ester reached its highest concentration and the third part until the provitamin ester was almost completely washed out of the column.
In the present example, the first 375 cm 'contained 0.62 g of provitaminester-free isobutyrate, the following <B> 110 </B> cm' 4.50 g of isobutyrate with about <B> 7.5% </B> provitamin ester, the last 1580 cm ', 2.32 g isobutyrate with about 37.5% protitamin isobutyrate. This 2.32 g was dissolved in 8 cm "of the solvent and poured into the same column, followed by 1455 cm" of solvent.
The filtrate was again collected in parts; the last 960 cm 'contained 0.59 g of isobutyrate mixture with about 84% provitamin isobutyrate. 0.58 g of the latter mixture were recrystallized, first from 50 cm 'ether-methyl alcohol and then from 25 cm' alcohol. Yield 0.43 g of provitamin isobutyrate of 94%.
The pro-vitamin D ester is then saponified. <I> Example I11: </I> The sterol fraction was produced from about 8 kg of Tubifex in the manner indicated in the description. This sterile fraction was converted into the acetate by treatment with acetic anhydride and pyridine.
The obtained acetate mixture was subjected to fractional filtration through an adsorption column A1 = 03 in almost the same manner as in Example 1I. After a single treatment, a fraction of 5.10 g with about 47% provitamin acetate was obtained from 12.5 g of an acetate mixture with 24% provitamin acetate. This fraction was used for the second treatment, by which a fraction of 3.12 g with about 62% provitamin acetate was obtained.
This fraction was again subjected to a similar treatment; the strongest fraction obtained, weighing 1.11 g, contained about 83% pro-vitamin acetate. This preparation was recrystallized from methyl alcohol.
Yield: 0.97 g with 91% provitamin acetate. After repeated recrystallization from methyl alcohol it was found that the provitamin acetate content was up to 96% deficient. No provitamin D ester is then saponified.