CH282222A - Verfahren zur Herstellung von Vitaminsubstanzen. - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von Vitaminsubstanzen.    Gegenstand der Erfindung ist ein Verfah  ren zur Herstellung sowohl therapeutisch als  für die Ernährung wertvoller Substanzen  durch einen mikrobiologischen     Prozess,    und  zwar ein Verfahren zur Herstellung von Vi  taminsubstanzen mit wachstumsfördernden  <B>E</B>igenschaften für den Mikroorganismus     Lacto-          baeillus        laetis        Dorner,    wie das Vitamin B12.  Dieses Vitamin ist ein wasserlöslicher roter  kristalliner Stoff, welcher aus Leber gewon  nen werden kann und bei der Behandlung  gewisser Arten Anämie beim Menschen, z. B.  der     pernieiösen        Anämle,    wertvoll ist.

   Ausser  dem ist Vitamin B12 als Nahrungsfaktor für  Menschen und Tiere wichtig.  



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur Her  stellung von Vitaminsubstanzen ist dadurch  gekennzeichnet,     dass    man in einem Nähr  medium, welchem Kobalt zugesetzt wurde,  einen zu den Pilzen gehörenden Mikroorganis  mus     züehtet,    welcher eine Substanz mit     Vi-          tamin-B,2-Wirkung    erzeugt.  



  Substanzen mit     Vitamin-B12-Wirkung     haben die Eigenschaft, das Wachstum des       Lactobaeillus        laetis        Dorner    zu fördern. Die  Aktivität der nach dem erfindungsgemässen  Verfahren gewonnenen Vitaminsubstanzen,  z. B. Vitamin B12, kann durch eine mikrobio  logische Methode bestimmt werden, wobei der       Lactobaeillus        laetis        Dorner        (LLD)    als Test  organismus verwendet wird.

   Die Versuchsbe-         dingungen    sind von     Short   <B>(J.</B>     Biol.        Chem.   <B>169,</B>  <B>455-6)</B> angegeben worden. Die Wirksamkeit  dieser Vitaminsubstanzen, der mit ihnen     an-          gereieherten    Brühen und Konzentrate, wird  zweckmässig in     LLD-Einheiten        ausgedrüekt,     und zwar auf der Basis eines willkürlich ge  wählten     Leber-Standards,    welcher eine Aktivi  tät von<B>1000</B>     LLD-Einh./mg    hat.

   Es wurde  festgestellt,     dass    reines kristallisiertes Vita  min B 12 eine Wirksamkeit aufweist von etwa  <B>1.1</B> Millionen     LLD-Einh./mg.    Anderseits ist  die Wirksamkeit von Brühen, welche durch  die Vergärung gewöhnlicher Nährmedien  durch die fraglichen Organismen erhalten  werden, im Vergleich zum reinen Vitamin     B12     äusserst gering. Je nach der Art des verwen  deten Pilzes besitzen sie eine     LLD-Wirksam-          keit,    die einem     Vitamin-B,2-Gehalt    in der  Grössenordnung von etwa<B>0,00003</B>     mg/ein3    ent  spricht.

   Es ist schwierig, reines Vitamin     BI2     oder Konzentrate reich an     LLD-Wirksamkeit     aus solchen Brühen zu gewinnen.  



  Es hat sieh gezeigt,     dass    beim Kultivieren  der Pilze in einem Nährmedium mit einem  Zusatz von Kobalt erheblich grössere Mengen  von     LLD-wirksamen    Substanzen durch den  Mikroorganismus erzeugt werden, so     dass    die  Gewinnung von z. B. reinem Vitamin B12     auts     der Gärbrühe erleichtert wird und es möglich  ist, die festen Bestandteile der Brühe direkt  als     Zusatzhahrung    für Tiere zu verwenden.      Die Wirkung ist überraschend, weil Kobalt  als sehr starkes Gift für viele Mikroorganis  men bekannt ist.

   Versuche haben gezeigt,     dass     in höheren Konzentrationen Kobalt auch  toxisch wirkt auf diejenigen Pilzstämme,  welche Substanzen mit     LLD-Wirksamkeit    er  zeugen. Beispielsweise verhindert ein     Kobalt-          zusatz    (in Form des Nitrats) von<B>10</B> bis  20 Teilen pro Million     zum    Nährmedium die  Herstellung von     LLD-wirksamen    Substanzen  durch den     Streptomyces        griseLis.     



  Die während der Gärung gegenwärtige     Ko-          baltmenge    kann<B>je</B> nach der Art des Nähr  mediums variieren, doch ist es gewöhnlich  zweckmässig, Kobalt in einer Menge zwischen  etwa<B>0,1</B> und 20 Teilen pro Million Teile  Nährmedium zu verwenden. In manchen Fäl  len kann es vorteilhaft sein,<B>je</B> nach der     Gil-          tigkeit    von Kobalt für die verwendete Pilzart  grössere oder kleinere Mengen Kobalt zu ver  wenden.

   Bei Verwendung von     Streptomyces          griseus    wurden     Gärbrühen    von hoher     LLD-          Wirksamkeit    und ausgezeichnete Ausbeuten  von kristallisiertem Vitamin     Bl?    erhalten  durch Verwendung von etwa 2 Teilen Kobalt  in Form von     Kobaltnitrat    pro Million Teile  Nährmedium.  



  Das Kobalt kann in metallischer Form der  Brühe zugesetzt werden, doch wird zweck  mässig eine     Kobaltverbindung,    vorzugsweise  ein     Kobaltsalz,    z. B.     Kobaltnitrat,    zugesetzt.  Es kann aber auch das Kobalt in der Form  eines in der Natur vorkommenden     Kobaltsalzes     oder einer Verbindung, wie sie in     kobalt-          reichen        mikrobischen    Nahrungsstoffen vor  kommen, verwendet werden, jedoch sind letz  tere schwierig zu beschaffen.  



  Die Nährmedien können im übrigen die  beim Kultivieren von Pilzen übliche Zusam  mensetzung aufweisen. Für bestimmte Pilze  variiert allerdings die Ausbeute an     LLD-wirk-          samen    Stoff en<B>j</B>e nach dem verwendeten Nähr  medium, doch wurde stets gefunden,     dass    ein  an Kobalt armes Medium durch Zugabe einer  kleinen Menge Kobalt     LLD-wirksame    Substan  zen in stark erhöhter Ausbeute lieferte.

    Die     übliehen    Nährmedien enthalten eine  Quelle von     assimilierbarem    Kohlenstoff, eine    Quelle von     assimilierbarem    Stickstoff,     anor-          ganisehe    Salze und nötigenfalls auch Wachs  tumsfaktoren. Die     Kohlenstoffquelle    kann ein  Kohlehydrat, z. B.     Destrose,        Maltose,        Xylose,          Invertzucker,    ein Getreideauszug und     derglei-          ehen    sein.

   Als     Stiekstoffquelle    kommen in  Betracht:     Ammonitimsalze,        Aminosäuren    oder  Proteine, z. B. Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefe  extrakte, ferner     Tryptinabbauprodukte    von  Casein,     Fleisehextrakt,        Blutinehl,    proteinreiche  Fleisch- und Knochenabfälle,     Salmmehl,        Fiseh-          mehl,        Fisehextrakte,    lösliche Bestandteile voll       Schlempe    und dergleichen.

   Die Pilze können  auch in Medien ohne Kohlehydrate kultiviert  werden, in welchem Falle Proteine oder       Aminosäuren    sowohl den benötigten Kohlen  stoff als auch den Stickstoff liefern.  



  Zur Durchführung des     erfindLingsgemässen     Verfahrens können     Myxomyeeten,        Sehizo-          myceten    und     Eumyeeten    verwendet werden.  Besonders geeignet sind     Sehizomyeeten,    vor  zugsweise gewisse Stämme der Spezies     Strep-          tomyces        griseus,    welche auch     zur    Erzeugung  der     Antibiotiea        Streptomvein    und     Grisein     dienen können.

   Andere Spezies wie     Strepto-          myces        albidoflavus,        Strept.        eolombiensis        nov.          sp.,        Strept.        roseochromogenus    und     Strept.        anti-          biotieus    enthalten ebenfalls Stämme, die     LLD-          wirksame    Substanzen in hoher Ausbeute er  zeugen.

   Weitere verwendbare     Sehizomveeten     sind Glieder des     Genus        Clostridium   <B>'</B> wie     Clo-          stridium        tetanomorphum,   <B>Cl.</B>     mehlearium,   <B>Cl.</B>       flabelliferum    und<B>Cl.</B>     butyricium.    Andere  Pilze, welche beim erfindungsgemässen Verfah  ren Substanzen mit     LLD-Wirksamkeit    liefern,  sind     Torula,

          Eremotheeium        ashbyii    und     Esche-          richia        coll.       Das Nährmedium wird zweckmässig sterili  siert und das sterile Medium mit dem     ge-          wünsehten        Kobaltzusatz    sodann mit einer Kul  tur des gewählten Pilzes geimpft, worauf die  Brühe bis zur optimalen     LLD-Wirksamkeit   <B>9</B>  entwickelt wird. Die Gärzeit beträgt vorteil  haft etwa 2 bis<B>7</B> Tage.

   Die Entwicklung er  folgt zweckmässig unter der Oberfläche des  Mediums und bei einer für den betreffenden  Pilz geeigneten Temperatur.<B>9</B>      Um kristallisiertes Vitamin B12 aus der       Gärbrühe    zu isolieren, kann folgendermassen  vorgegangen werden. Die Brühe wird filtriert  und das Filtrat mit Aktivkohle behandelt, wo  bei das Vitamin B 1.2     adsorbiert    wird. Das       Adsorbat    wird sodann mit einer     wässrigen     Lösung von     Pyridin    oder von     a-Pieolin        el-Liiert     und das     Eluat    zur Trockne eingedampft.

   Der  Rückstand wird mit einem     niedri-siedenden          aliphatisehen    Alkohol, z. B. Methanol, extra  hiert und der gewonnene Extrakt durch eine  Kolonne mit aktiver Tonerde abgezogen, wobei  das Vitamin     Bl.,    an die Tonerde     adsorbiert     wird. Die Kolonne wird sodann mit frischem  Methanol     eluiert.    Die     Eluate    mit     LLD-Wirk-          samkeit    werden gesammelt und eingeengt. Die  erhaltene konzentrierte     methanolische    Lösung  wird dann mit einer Flüssigkeit versetzt,  welche mit der Lösung     misehbar    ist, aber in  der die aktive Substanz unlöslich ist, z.

   B.  Aceton. Der Niederschlag wird     abfiltriert,    in  Alkohol gelöst, durch Zusatz von     Aeeton    aus  gefällt lind das gereinigte Produkt durch       Umkristallisierung    aus Wasser, unter Zusatz  von     Aeeton,    in reines kristallisiertes Vita  min B12 übergeführt.  



  <I>Beispiel<B>1:</B></I>  Es wurden Nährmedien, bestehend aus       einer        Suspension        von        2%        Troekenhefe        in          dest.    Wasser hergestellt und mit variierenden  Mengen von     Kobaltnitrat    versehen, wie in der  nachfolgenden Tabelle angegeben. Je<B>50</B>     em3     der Nährbrühen wurden in     250-em3-Erlen-          meyer-Kolben    gegeben und während einer hal  ben Stunde bei     12011   <B>C</B> unter ständiger Bewe  gung sterilisiert.

   Sodann wurde mit etwa  <B>1</B>     em3    einer 48stündigen vegetativen Kultur  eines     Grisein    erzeugenden Stammes von       Streptomyces        griseus    geimpft. Dieser Stamm  war auf einem Gemisch von     Fleisehextrakt     und einem     Tryptinabbauprodukt    von Casein  gezüchtet worden. Die geimpften Brühen wur  den 4 Tage bei     281'   <B>C</B> entwickelt, während     wel-          eher    Zeit die Flaschen ständig auf einer       Schüttelmasehine        -esehüttelt    wurden. Nach  Beendigung der Gärperiode war die Wirksam  keit der Brühen wie folgt-.

    
EMI0003.0046     
  
    Teile <SEP> Kobalt <SEP> LLD-Einh./cms
<tb>  pro <SEP> Million <SEP> Teile <SEP> Gärflüssigkeit
<tb>  Nährmedium
<tb>  <B>0 <SEP> 300</B>
<tb>  <B>1 <SEP> 2760</B>
<tb>  2 <SEP> <B>3000</B>
<tb>  <B>10</B> <SEP> 4600
<tb>  20 <SEP> <B>3000</B>       <I>Beispiel 2:</I>  Es wurde ein Medium folgender Zusam  mensetzung hergestellt:

    
EMI0003.0047     
  
    Proteinreiche <SEP> Fleisch  und <SEP> Knochenabfälle <SEP> <B>8</B> <SEP> %
<tb>  Natriumehlorid <SEP> <B>0,51/0</B>
<tb>  FeS0,1 <SEP> <B>. <SEP> 7H?O <SEP> 15</B> <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million
<tb>  Dest. <SEP> Wasse <SEP> r <SEP> ad. <SEP> 1001/o       Es wurde halbiert, sterilisiert und entwickelt,  wie in Beispiel<B>1.</B> Die eine Hälfte erhielt in  Form von     Kobaltnitrat    einen Zusatz von  2 Teilen pro Million Kobalt, während die  andere Hälfte keinen solchen Zusatz bekam.

    Am Ende der     Gärperiode    zeigten die Brühen:  
EMI0003.0050     
  
    <B>1.</B> <SEP> Kobalt,
<tb>  2 <SEP> Teile <SEP> pro <SEP> Million <SEP> <B>590</B> <SEP> LLD-Einh./em3
<tb>  2. <SEP> ohne <SEP> Kobaltzusatz <SEP> <B>160</B> <SEP> LLD-Einh./em3       <I>Beispiel<B>3:</B></I>  Es wurde ein Nährmedium folgender Zu  sammensetzung hergestellt:

           Tryptinabbauprodukt     
EMI0003.0052     
  
     <B>9500</B> Liter dieses Nährmediums wurden steri  lisiert und dann mit etwa<B>800</B> Liter der vege  tativen Kultur eines     Grisein    erzeugenden  Stammes von     Streptomyees        griseus    geimpft<B>5</B>  und die Brühe bei     281)   <B>C</B> während 48 Stunden  entwickelt, und zwar unterhalb der Oberfläche  des Mediums und bei Durchlüftung.      Die     LLD-Wirksamkeit    der fertigen Gär  brühe wurde bestimmt und letztere     auf    kristalli  siertes Vitamin     B12    aufgearbeitet. Die Brühe  wurde filtriert und mit Aktivkohle behandelt.

    Das     Adsorbat    wurde mit einer     wässrigen        Py-          ridinlösung        eluiert    und das     Eluat    bei vermin  dertem Druck zur Trockne eingedampft. Das  Trockenprodukt wurde mit Methanol extra  hiert und der     methanolische    Extrakt durch  eine Kolonne mit aktiver Tonerde abgezogen  und das     Adsorbat    mit frischem Methanol       eluiert.    Die Fraktionen mit starker<B>LLD-Ak-</B>         tivität    wurden vereinigt und eingeengt.

   Die  konzentrierte     LÖsung    wurde mit     Aeeton    ver  setzt, wobei rohes Vitamin B12 ausgefällt  wurde. Das Rohprodukt wurde durch     Umfäl-          lung    aus einer     Äthanollösung    mit Aceton ge  reinigt. Das so erhaltene gereinigte Produkt  wurde aus     -%vässrigem        Aeeton    unikristallisiert  und so kristallisiertes     VitaminB12    erhalten.

      Die folgende Tabelle zeigt die Resultate  zweier     Vergleiehsversuehe,    ohne und mit     Ko-          baltzLisatz    (als     Kobaltnitrat):     
EMI0004.0026     
  
    Teile <SEP> Kobalt <SEP> Wirksamkeit <SEP> Ausbeute <SEP> an
<tb>  Versuch <SEP> Nr. <SEP> pro <SEP> Million <SEP> der <SEP> Brühe <SEP> in <SEP> kristallisiertem
<tb>  LLD-Einh./cm-' <SEP> Vitamin <SEP> BI2
<tb>  <B>1 <SEP> 0 <SEP> 1-73</B> <SEP> 18,4 <SEP> mg
<tb>  2 <SEP> 2 <SEP> <B>2250 <SEP> 106,7</B> <SEP> mg
<tb>  (Durchschnittswert       <I>Beispiel</I>     4:

       Es wurde ein     Gärmedium    folgender Zu  sammensetzung hergestellt -  
EMI0004.0029     
  
    Sojabohnenmehl <SEP> 31/o
<tb>  Dextrose <SEP> 20/0
<tb>  Natriumehlorid <SEP> 0,251/o
<tb>  Lösl. <SEP> Anteil <SEP> von <SEP> Schlempe <SEP> 0,751/o
<tb>  Wasser <SEP> ad. <SEP> <B>1001/0</B>       Von diesem Medium wurden<B>je</B>     40ems    in     Er-          lenmeyer-Plaschen   <B>250</B>     em3    gegeben und vari-         ierende    Mengen von Kobalt in Form von     Ko-          baltnitrat    zugesetzt, wie in der nachfolgenden  Tabelle angegeben.

   Die Flaschen wurden mit  <B>je 1</B>     em3    einer 48stündigen vegetativen Kultur       eines        Streptomy        #        ein        erzeugenden        Stammes        von          Streptomycin        grisei-is    geimpft.

   Die geimpften  Brühen wurden<B>3</B> Tage bei<B>270 C</B> gehalten,  während welcher Zeit die Flaschen ständig       auf    einer     Sehüttelmasehine    geschüttelt wur  den.     Naeh    Beendigung der Gärperiode zeigten  die Brühen folgende     Streptomvein-    und     LLD-          Wirksamkeit:

       
EMI0004.0053     
  
    Teile <SEP> Kobalt <SEP> Streptornycin
<tb>  pro <SEP> Million <SEP> ktivität <SEP> LLD-Einh./cm3
<tb>  <B>-i/CM3</B>
<tb>  <B>0 <SEP> 850 <SEP> 300</B>
<tb>  <B>035 <SEP> 825 <SEP> 3000</B>
<tb>  <B>1)0</B> <SEP> 845 <SEP> <B>3100</B>
<tb>  2,0 <SEP> <B>650</B> <SEP> 4200
<tb>  4,0 <SEP> <B>235 <SEP> 5000</B>
<tb>  <B>6,0 <SEP>  <  <SEP> 150</B> <SEP> 2400
<tb>  <B>8,0 <SEP>  <  <SEP> 150</B> <SEP> 2000
<tb>  12,0 <SEP> <B> <  <SEP> 150</B> <SEP> 220
<tb>  4         <I>Beispiel<B>5:</B></I>  Es wurde ein Gärmedium folgender Zu  sammensetzung hergestellt:

    
EMI0005.0001     
  
    Hirn/Herz-Auszug <SEP> <B>18,5 <SEP> g</B>
<tb>  Agar <SEP> <B>1,85 <SEP> g</B>
<tb>  Wasser <SEP> 495 <SEP> eM3       Von diesem Medium mit einem pH-Wert<B>7,0</B>  bis<B>7,2</B> wurden<B>je 100</B>     ems    in     125-em3-Erlen-          meyer-Plaschen    gegeben und sodann bei 1200<B>C</B>  während<B>25</B> Minuten sterilisiert. Die Flaschen  wurden auf<B>370 C</B> abgekühlt und mit<B>1</B>     em3     einer Suspension von     Clostridium        tetanomor-          phum    geimpft, die     anaerobisch    auf einem       Hirn/Leber/Herz-Medium    gezüchtet wurde.

    Die geimpften Brühen wurden stationär bei  <B>370</B>     C    während den in     naehstehender    Tabelle  angegebenen Zeiten entwickelt. Eine zweite  Gruppe von Flaschen mit dem gleichen Nähr  medium erhielt einen Zusatz von<B>10</B> Mikro  gramm     Kobaltnitrat-Hexahydrat   <B>je</B> Kubik  zentimeter (etwa 2 Teile Kobalt pro Million  Teile des Mediums)     und    wurde in gleicher  Weise sterilisiert, geimpft und entwickelt.

   Am  Ende der Gärperiode zeigten die Brühen fol  gende Werte:  
EMI0005.0015     
  
    Gärdauer <SEP> Ohne <SEP> Kobalt <SEP> Kobaltzusatz
<tb>  Tage <SEP> LLD-Einh./cm3 <SEP> 2TeileproMillion
<tb>  LLD-Einh./em3
<tb>  4 <SEP> <B>660</B> <SEP> 4600
<tb>  <B>7 <SEP> 760 <SEP> 6300</B>       Die angegebenen Werte sind die Durchschnitts  werte von vier verschiedenen Gärungen, welche  unter den genannten Bedingungen durchge  führt wurden.  



  Das     erfindungsgemässe    Verfahren kann  auch unter Verwendung fester Nährmedien,  z. B. Getreidekleie, anstatt mit     wässrigen     Nährmedien     durehgeführt    werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Vitamin substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Nährmedium, welchem Kobalt zu gesetzt wurde, einen zu den Pilzen gehören- den Mikroorganismus züchtet, welcher eine Substanz mit Vitamin-B,2-Wirkung erzeugt. UNTERANSPRÜCHE: <B>1.</B> Verfahren nach Patentansprueh, da durch gekennzeichnet, dass ein Streptomyees- Stamm verwendet wird. 2.

   Verfahren nach Unteranspruch<B>1,</B> da durch gekennzeichnet, dass ein Vitamin B12 er zeugender Stamm von Streptomyees griseus verwendet wird. <B>3.</B> Verfahren nach Patentansprueh, da durch gekennzeichnet, dass ein Clostridium- Stamm verwendet wird. 4. Verfahren nach Unteranspruch<B>3,</B> da durch gekennzeichnet" dass ein Stamm von, Clostridium tetanomorphum verwendet wird.

   <B>5.</B> Verfahren nach Patentansprueh, da durch gekennzeichnet, dass das Nährmedium pro Million Teile zwischen<B>0,1</B> und 20 Teile Kobalt enthält. <B>6.</B> Verfahren nach Unteransprueh <B>5,</B> da durch gekennzeichnet, dass das Nährmedium pro Million Teile etwa 2 Teile Kobalt enthält. <B>7.</B> Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass die Züchtung unter der Oberfläche und bei Durchlüftung des Nährmediums erfolgt.

   <B>8.</B> Verfahren aneh Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass ein Nährmedium verwendet wird, welches eine Quelle von assi- milierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff ist, ferner anorgani- sehe Salze enthält, und in welchem das Ko balt in der Form eines lösbaren Kobaltsalzes gegenwärtig ist. <B>9.</B> Verfahren nach Unteransprueh <B>8,</B> da durch gekennzeichnet, dass das Kobalt als Kobaltnitrat vorhanden ist.

   <B>10.</B> Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass das Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 2811 C gehalten wird und während 2 bis<B>7</B> Tagen dauernd gerührt und durchlüftet wird, -um Sauerstoff im Medium zu verteilen.