Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12.
In der Literatur sind versehiedene Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 aus Leber und aus Gärbrühen angegeben. Beispielsweise wurde von Riekes u. a. in Science 108, 634-35 (1948), nachgewiesen, da# Vitamin B12 aus Gärbrühen erhalten werden kann, welche durch Kultivieren von Streptomyces griseus erzeugt wurden. Ferner haben Pierce u. a., J. A. C. S. 71, 2952, gezeigt, da# Vitamin Bl2 ebenfalls aus Gärbrühen erhalten werden kann, welche durch Strepto myces aureofaciens erzeugt werden. Die Gärbrühen, die durch Kultivieren von Vitamin B12 erzeugenden Mikroorganismen erhalten werden, stellen an sich brauehbare Quellen für die technische Herstellung von Vitamin B12 dar.
Untersuchungen auf diesem Gebiet haben ergeben, dass solche Brühen auch Gärungsprodukte enthalten, welche mit Vitamin B12 nahe verwandt sind, jedoch nur einen Bruchteil der Wirksamkeit gegen pernieiose Anaemie und hinsichtlich des ani malisehen Proteinfaktors, verglichen mit der jenigen von Vitamin B12 selbst, zeigen. Bei der IIerstellung von Vitamin B 12 von gleich- mässiger Reinheit war die Entfernung dieser vitamin-Bl2-ähnliehen Substanzen ein schwie- riges Problem, das nur durch Anwendung komplizierter und kostspieliger Verfahren gelöst werden konnte.
Es wurde nun gefunden, da. es moglieh ist, diese vitamin-B12-ähnlichen Substanzen durch Zusatz von Cyanionen liefernden Substanzen nahezu quantitativ in Vitamin Bl2 umzuwandeln und dadurch nicht nur die Iso lierung von reinem Vitamin B12 erheblich zu vereinfachen, sondern gleichzeitig die Ausbeute an Vitamin B12 beträchtlich zu erhohen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 aus bei der Kultivierung von Vitamin B 13 er zeugenden Mikroorganismen neben Vitamin B12 entstandenen vitamin-B12-ähnlichen Stoffen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass diese Stoffe mit einer Cyanionen liefernden Substanz behandelt werden.
Die Umwandlung der vitamin-Bi2-ähn- lichen Substanzen in Vitamin B12 kann unter verschiedenen Bedingungen und unter Verwendung verschiedener Quellen von Cyanionen bewirkt werden. Beispielsweise kann man als Cyanionen liefernde Substanzen Metallcyanide, Ammoniumeyanid oder Cyanwasserstoff verwenden. Die Umsetzung kann in Gegenwart von Lösungsmitteln erfolgen. Als Lösungsmittel sind zum Beispiel Wasser, Gemische von Wasser und organischen Losungsmitteln oder organische Losungs- mittel, in welehen die B12-ähnlichen
Substanzen löslich sind, geeignet. Für praktische Zwecke wurde es als zweckmässig befunden, die Reaktion in wässrigem Medium auszuführen.
Untersuchungen haben gezeigt, dass an sich pro Mol B12-ähnliche Substanz ein Mol Cyanionen erforderlich ist ; es ist jedoch zweckmässig, einen übersehuss an Cyanionen zu verwenden, um die vollständige Umwand- lung sicherzustellen. Wenn man die Umsetzung in wässeriger alkalischer Losung unter Verwendung eines Überschusses an Metallcyanid, zum Beispiel Natrium-oder Ammoniumeyanid, durchführt, entsteht ein purpurfarbiges Zwischenprodukt. Diese purpurfarbige Verbindung seheint die gleiche Substanz zu sein wie diejenige, welche gebildet wird, wenn Natriumcyanid einer wässrigen Losung von Vitamin B 13 zugefügt wird.
Nach Ansäuern einer diese purpurfarbige Verbindung ent- haltenden Losung nimmt die Lösung wieder die rote Farbe an, welche für Vitamin B12 charakteristisch ist. Wenn man dagegen keinen Überschu# an Metalleyanid verwendet bzw. in nicht alkalisehem Medium arbeitet, so wird die purpurfarbige Verbindung nicht ge- bildet. Wenn Cyanwasserstoff als Quelle von Cyanionen verwendet wird, wird die purpur farbigeVerbindung selbst dann nicht gebildet, wenn ein erheblicher Überschuss verwendet wird. Das bei dieser Reaktion erhaltene Vitamin B12 ist in jeder Beziehung identisch mit dem Vitamin B12, welches unmittelbar aus Gärbrühen erhalten wird.
Diese Identität i ; wurde naehgewiesen an Hand der ultravioletten, sichtbaren und infraroten Ab @ der optischen Drehung, der Elementaranalysen, der Wristallstlxlktur, der sehmelz-oder Zersetzungspunkte, der Phasen lösliehkeit, des polarographischen Verhaltens und des Verteilungskoeffizienten, ferner aueh durch mikrobiologische und klinische Versuche.
Der Zusatz der Cyanionen liefernden
Substanzen kann in versehiedenen Stadien der Verarbeitung der Gärbrühen erfolgen. So kann die Substanz beispielsweise der Gärbrühe als solchen oder einem Konzentrat, aus dem das Vitamin Bis gegebenenfalls schon entfernt worden ist, zugesetzt werden.
Au. so behandelter Gärbrühe kann das Vitamin B12 mit Hilfe von Adsorptionsmitteln, zum Beispiel Fuller-Erde, Holzkohle usw., entfernt werden. Das Adsorbat kann zur Vitaminisierung animalischer Nahrungsmittel verwendet werden oder auch als Ausgangsmaterial zur Gewinnung von reinem Vitamin Bis. Vorzugsweise geht man von einem Konzentrat der vitamin-B12-ähnlichen Materialien aus, da hierdurch das Volumen der zu behandelndeta Materialien vermindert wird und die Schwierigkeiten verringert werden, welche mit der Entfernung der nicht zur Reaktion gelangten Cyanide verbunden sind.
Es ist auch vorzuzielen, ein Konzentrat zu behandeln, welches das ursprünglich gebildete Vitamin B12 noch enthalt, da dadurch die Schwierigkeiten linsichtlieh der Isolierung des Vitamins Bis verringert werden.
Nach Zusatz der Cyanionen liefernden Substanz zu einem flüssigen Produkt wird die Mischung zweckmä#ig gründlich gerührt und dann einige Zeit, zum Beispiel etwa 15 bis 45 Minuten, stehengelassen. Hierbei können beliebige Cyanionen liefernde Substanzen verwendet werden, zum Beispiel flüssiger oder gasförmiger Cyanwasserstoff, ein Metall- oder das Ammoniumsalz der Blausaure oder eine Blausäure liefernde Mischung eines Metallcyandis und einer Säure. Gut geeignet sind die Alkali- und Erdalkalieyanide, beispielsweise die Cyanide von Natrium, Kalium, Barium, Calcium.
Man kann auch ein festes Konzentrat mit flüssigem oder gasförmigem Cyanwasserstoff behandeln ; die Blausäure ist genügend ionisiert, da# die Reaktion auch in Abwesen- heit eines Losungsmittels stattfindet. Die Reaktion zwisehen den vitamin-Bl2-ahnlichen Materialien und Salzen der Blausäure wird jedoch vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt, welches die Ionisierung des Salzes begünstigt, z. Beispeil von Wasser, von Alkohlolen mit zwei oder drei Kohlenstoffatomen und von Mischungen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln, in welchen die vitamin-B12-ähnlichen Materialien und die Cyanionen liefernde Substanz loslich sind.
Beim Arbeiten in teelinisehem Massstab wird die Reaktion am zweck mä#igsten und ökonomischsten in wässeriger. alkalischer Lösung ausgeführt.
Die günstigste Menge der Cyanionen liefernden Substanz wird zweckmässig für , edes Ausgangsmaterial experimentell bestimmt, da die Zusammensetzung der verschie- denen Briihen und Konzentrate erheblieh variiert. Eine angenäherte Bestimmung der erforderlichen Cyanidmenge kann auch durch Messen der optischen Dichte einer Probe des zu behandelnden Materials unter Verwendung von Licht von 5500 A erfolgen, einer der charakteristischen Absorptionsspitzen für reines Vitamin B12. Der erhaltene Wert, welcher der vom Vitamin B1. 2 herrührenden Farbe, falls solches vorhanden ist, plus derjenigen, welche von vitamin-B12-ähnlichen Substanzen herrührt, entspricht, kann als massgebend gewertet werden.
Für 1 mg derart berechnetes wirksames Vitamin B 12 werden vorzugsweise etwa 0, 5 I) is 2 mg Cyanionen verwendet, was als erheblicher Überschu# zu betrachten ist.
Normalerweise sind zahlreiche nicht identi fizierte Verunreinigungen zusammen mit den vitamin-B12-ähnlichen Materialien vorhanden.
Insofern diese Verunreinigungen auch mit C'yanionen reagieren, ist es angezeigt, einen solchen Überschlu# an Cyanionen vorzusehen, daL, nach Umsetzung der Verunreinigungen noch genügend Cyanionen für die vollständige Umwandlung der B12-ähnlichen Materialien vorhanden sind.
Wenn die Reaktion in wässeriger Lösung unter Verwendung eines Metalleyanids bei alkalischem pg ausgeführt wird, so zeigt die Bildung der vorerwähnten purpurfarbigen Verbindung unmittelbar an, dass ein Über- schuss an Cyanid zugefügt wurde. Die purpurfarbige Verbindung kann durch Ansäuern des Reaktionsgemisehes auf ein PH von etwa 5 oder weniger in Vitamin B12 umgewandelt werden. Hierfür kann zum Beispiel Salz-, Schwefel- und Essigsäure verwendet werden.
Atan kann aueh mit weniger als der zur vollständigen Umsetzung erforderlichen Menge ('yanid arbeiten, da selbst dann eine erheb liche Erhöhung der Ausbeute an Vitamin B12 errielt wird, wenn nieht alle vitamin-B12- ähnliche Substanzen umgesetzt werden.
Nach Beendigung der Reaktion kann allenfalls nicht umgesetztes Cyanid durch Ansäurern und Wegdampfen der in Freiheit gesetzten Blausäure entfernt werden. Das Wegdampfen erfolgt zweckmä#ig bei einer Temperatur von 50-60 C und unter vermindertem Druck. Das Wegdampfen wird am besten so lange fortgesetzt, bis annähernd der gesamte Überschuss an Cyanwasserstoff entfernt ist. Wenn ein festes Konzentrat mit flüs- sigem oder gasförmigem Cyanwasserstoff zur Reaktion gebracht wurde, kann die überschüs sige Blausäure ebenfalls durch Weddampfen im Vakuum oder bei Atmosphärendruck erfolgen.
Wenn eine Lösung mit einem Cyanid zur Reaktion gebracht wurde, ist es manchmal ratsam, einen Stickstoff-oder Luftstrom zum Beschleunigen der Entfernung des über schüssigen Cyanids zu verwenden.
Die Isolierung des Vitamins B12 kann auf verschiedene Arten erfolgen. Zum Beispiel hat sich folgende Arbeitsweise als zweckmässig erwiesen : Die Vitamin-Bl2-Losung wird mit einem anorganischen Salz (zum Beispiel Am moniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat oder Aluminiumsulfat) gesättigt, die gesät- tigte Lösung mit Benzylalkohol extrahiert, der benzylalkoholische Extrakt getrocknet, zum Beispiel durch Erhitzen im Vakuum auf etwa 75-80 C, und Xther zu der getrockneten benzylalkoholischen Losung zugefügt, um das rohe Vitamin Bl2 auszufällen. Der Nieder- schlag wird darauf in mit Benzylalkohol ge sättigtem Wasser,
welches etwa 2-3 % Eisessig enthält, gelost. Diese Lösung und ein etwa gleiches Volumen von mit Benzylalkohol gesättigtem Wasser werden in Gefässe gefüllt und darauf nacheinander mit angenähert gleichen Mengen von mit Wasser gesättigtem Benzylalkohol extrahiert. Diese Extraktionen können fortlaufend oder durch aufeinander- folgendes Extrahieren der beiden ersterwähnten Lösungen mit 6-8 Teilen mit Wasser gesättigtem Benzylalkohol erfolgen. Die vereinigten benzylalkoholisehen Extrakte werden dann getrocknet und reines Vitamin B12 wird durch Zugabe von Äther ausgefällt. Dieser Niederschlag kann in Wasser gelöst und auskristallisiert werden, wobei man Vitamin B12 von etwa 95% Reinheit erhält, welches für klinische Zwecke gut geeignet ist.
Weitere Reinigung kann auch durch Umkristallisieren aus Wasser erfolgen.
Falls der bei der Extraktion mit Benzylalkohol erhaltene Niederschlag nicht genügend rein ist, um naeh der Kristallisation Vitamin Big von 95%oder höherer Reinheit zu erhalten, kann der Niedersehlag weiter gereinigt der- den durch Lösen in Methanol, Adsorbieren des Vitamins B12 aus der Losung an eine Kolonne aus aktivierter Tonerde, Entwickeln und Eluieren der Kolonne mit Methanol.
Das Eluat ergibt, mit Äther versetzt, einen weiteren Niedersehlag von gereinigtem Vitamin 12 Die veitere Reinigung kann anderseits auch durch Wiederholen der Benzylalkohol Extraktion erfolgen.Mankanndiewässerigen Rückstände der Benzylalkohol-Extraktion und bei der ehromatographischen Reinigung anfallende Fraktionen des Eluates mit geringem Vitamin-B12-Gehalt nochmals mit Cyanion in der beschriebenen Weise behandeln und so zu sätzliehe 3Iengen von Vitamin Bis gewinnen.
Zur Bestimmung der Menge von Vitamin B12 in den versehiedenen Stadien des Verfahrens hat sieh eine Methode als vorteilhaft erwiesen, welche auf einer Extraktion mit wässerigem Benzylalkohol im (tegenstrom beruht. Dieses Verfahren stiitzt sich auf einen experimentell bestimmten Verteilungskoeffi zienten für Vitamin Big von 1, 2 für das System Wasser/Benzylalkohol.
Bei diesem Bestimmungsverfahren wird Material mit unbekanntem Vitamin-B12-Gehalt einem Gegenstrom-Verteilungssystem mit acht Platten zwischen gleichvolumigen Teilen von Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Es wurde gefunden, dass vitamin-B12-ähnliche und andere störende Substanzen erheblich höhere Verteilungskoeffizienten besitzen und sieh in den ersten drei Platten des Verteilungs- systems finden. Allenfalls vorhandene Substanzen mit niedrigen Verteilungskoeffizienten werden in den letzten drei Platten des Systems gefunden Die Verteilungskurve für reines Vitamin B12 weist eine Spitze bei der vierten Platte auf.
Die optische Dichte des Inhaltes der vierten (oder fünften) Platte wird mit Lie'iit von 5500 A gemessen ; der erhaltene 'Wertentspricht der von Vitamin B12 herrührenden Farbe. Durch Vergleich mit der optischen Dichte von reinem Vitamin B12 (E1 cm1% = 63) kann der Vitamin-B12-Gehalt der Platte berechnet werden. Die vierte Platte enthält 29,1% (die fünfte Platte 24,2%) des gesamten in dem unbekannten Material ent haltenen Vitamins B12. Auf diese Weise kann die gesamte vorhandene Menge an Vitamin B12 berechnet werden.
Dieses Bestimmungsverfahren liefert in der Regel gute Werte für Vitamin B12, wenn das unbekannte Material einen hohen Vitamin-B12-Gehalt aufweist, das hei#t mehr als etwa T5"/o, je nach der Natur der Verunreinigung. Mit abnehmender Reinheit ist das Verfahren weniger zuverlässig.
Das Bestimmungsverfahren gibt dann nur an, wie viel Vitamin Bl2 maximal vorhanden sein kann. Rohmaterialien, welche einen sehr ge- ringen Vitamin-B12-Gehalt besitzen und störende Farbstoffe enthalten, können einer Gegenstrom-Verteilung mit nachfolgender LLD-Probe der vierten (oder fünften) Platte anstatt der Farbmessung unterworfen werden.
Die maximale Alenge des vorhandenen Vitamins B12 wird dann auf der Basis von 11 000 000 LLD-Einheiten pro mg Vitamin B12 bereelmet. Im folgenden wird ein Beispiel fiir die Ausführung des vorerwähnten Be stimmungsverfahrens angegeben.
In jedes von acht 15-em3-Zentrifugen- gläsern werden 5 em3 mit Benzylalkohol gesät- tigtes Wasser eingebracht. Dem ersten Glas wird eine solche des zu untersuchenden festen Materials zugefügt, welche schätzungs- weise etwa 1-10 mg Vitamin B enthält.
Dem ersten Glas werden dann 5 em3 mit 'WassergesättigterBenzylalkoholzugegeben, worauf das Glas geschüttelt wird und die Phasen durch Zentrifugieren getrennt werden.
Die untere (benzylalkoholisehe) Phase wird in das zweite Glas übergeführt und das Verfahren wiederholt. Das Verfahren wird in jedem nachfolgenden Glas wiederholt, bis die benzyalkoholisehe Phase im Gleich gewieht mit dem Wasserdesachten Glases ist. Eine zweite Menge von 5 cm3 mit Wasser gesättigtem Benzylalkohol wird dann naeheinander durch jedes Glas in der leiehen Weise gebracht, bis es mit dem Wasser des siebenten Glases im Gleichgewicht ist.
DiesesVerfahren wird mit sechs zusätzlichen Teilen Benzylalkohol fortgesetzt, worauf alle acht Gläser zwei Phasen im Gleichgewicht entlialten. Dem Inhalt des vierten (oder fünften) blases werden 10 cm3 Chloroform zugefügt, um das Vitamin B12 in die Wassersehicht zu iiberfiihren. Die optisehe Diehte der Wasser srhielit wird dann in einer 1-cm-Zelle mit Lielit von 5500 Abestimmt. Die totale vorhandene Vitamin-Bi2-Menge wird dann aus diesem Wert in der oben beschriebenenWeise berechnet.
Beispiel 1 : Herstellung von Vitamin-B12-Konzentrat.
8300 Liter Gärbrühe, welche aus der Verarbeitung eines Stammes von S. griseus erhalten wurde und deren LLD-Wirksamkeit zu 4630 Einh./cm3 festgestellt wurde, wird durch Filtrieren mit Diatomeenerde geklärt, mit Phosphorsäure auf pH 2, 5, dann mit Natrium- hydroxyd auf pH 7-8 eingestellt und nochmals mit Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wird dann mit 40 kg aktivierter Holzkohle behandelt, um die aktiven Faktoren zu adsorbie ren. Nach Filtrieren wird die Holzkohle mit 170 Litern n-Butanol 15 Min. gerührt. Der Mischung werden 132 Liter Wasser und 11, 3 kg Filtermaterial zugefügt und das Gemiseh 45 Min. gerührt.
Die festen Bestandteile werden auf der Zentrifuge abfiltriert und dann mehrmals auf der Zentrifuge mit einer Gesamtmenge von etwa 150 Liter Wasser, welches vorangehend mit Butanol gesättigt wurde, mehrmals gewaschen. Das Filtrat und die Wasehflüssigkeit werden vereinigt und die Butanol-lmd Wasserschichten getrennt. Die Wassersehieht, welche praktiseh das gesamte LLD-wirLsame Alatelial enthält, wird zwecks Abtrennmng der Kohle filtriert. Der erhaltenen filtrierten Wasserschicht (325 Liter) werden 56, 7 Liter Benzylalkohol und 193 kg Ammoniumsulfat zugefügt. Das Gemisch wird 15 Min. gerührt und dann eine Stunde stehen gelassen.
Die Wassersehicht wird abgetrennt und nochmals mit 32, 5 Litern Benzylalkohol extrahiert. Die benzylalkoholischen Extrakte werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Volumen der getrockneten Extrakte beträgt etwa 106 Liter. Der Volumenzuwachs beruht auf der Anwesenheit von Butanol.
Die benzylalkoholisehe Losung wird dann mit 20 kg aktivierter Tonerde chromatographiert. Wenn die gesamte Lösung der Kolonne zugeführt ist, wird die Kolonne mit einem Gemisch von Methanol und Aceton im Verhältnis von 1 : 2 gewaschen, bis die ausfliessende Flüssigkeit farblos ist. Die Kolonne wird dann mit Methanol entwickelt, wobei das Eluat (52 Liter) mit roter Farbe aufgefangen wird. Diese 52 Liter enthalten die wertvollen Bestandteile.
Das Eluat wird bei einer Temperatur unter 35 C bei vermindertem Druck auf etwa 2 Liter eingeengt, und ein Volumen Aceton und 4 Volumen Äther werden zugefügt.
Der dabei entstandene Niederschlag wird mehrmals mit Methanol extrahiert, bis ein weisser Rüekstand zurüekbleibt. Die optische Dichte der methanolischen Lösung wurde mit Licht von 5500 A gemessen und zeigte ein Maximum von 416 mg Vitamin B 12 und vitamin-B12-ähnliche Materialien. Ein aliquo- ter Teil der methanolischen Lösung wurde mit Äther behandelt und. der entstandene Niedersehlag einer 8-rohrigen Gegenstrom- Verteilung in dem System Benzylalkohol- Wasser unterworfen. Die maximale vorhandene Vitamin-Bt2-Menge, welche durch das Gegenstrom-Verfahren bestimmt wurde, betrug 187 mg.
Umwandlung der vitamin-B12-ähnlichen
Materialien mit Cyanid.
Die restliche Losung wird in Hälften unterteilt und der einen Hälfte Äther zugefügt. Der entstandene Niederschlag wird in etwa 100 cm3 Wasser gelöst. 8 cm3 1%ige wässrige Kaliumcyanidlosung wird unter Rühen zugegeben und die Lösung etwa 15 Min. tehen gelassen. Die Losung wird dann durch 3ehandeln mit Salzsäure auf ein pn von etwa @ eingestellt. 70 g Ammoniumsulfat werden zugefügt und das Gemisch nacheinander mit ; @ cm3, 10 em3 und 10 cm3 Benzylalkohol extrahiert.
Die benzylalkoholisehen Extrakte tverdendurchErhitzenauf75-80 Cunter v-emindertem Druek getrocknet, die entstan- dene Losung wird filtriert und Äther zugefügt.
Der entstandene Niedersehlag wird in 20 cm3 Wasser gelöst, welches vorher mit Benzylalkohol gesättigt wurde und welchem 0, 5 em3 Eisessig zugegeben worden waren.
Die Losung wird in ein 40-em3-Zentrifugen- glas gebracht. In ein zweites 40-cm3-Zentri fugenglas werden 20 cm3 mit Benzylalkohol gesättigtes Wasser gebracht. Sieben Teil mengen von 20 cm3 mit Wasser gesättigtem
Benzylalkohol werden dann durch die beiden
Gläser im Gegenstrom geleitet, wobei jede Teilmenge Benzylalkohol dazu verwendet wird, zunäehst das Glas Nr. l und dann das Glas Nr. 2 zu extrahieren. Die benzylalkoholi- sehen Losungen werden darauf vereinigt, durch Erhitzen unter vermindertem Druck getrocknet und darauf zwecks Fällung Äther zugefügt.
Der Niederschlag wird in 1, 1 cm3 Wasser gelöst und d Auskristallisierens stehen s gelassen. Die Kristalle werden durch Zentri fugieren abgetrennt und durch Loden in 10 cm3 Wasser umkristallisiert, wobei Aceton (etwa 120 cm3) bis zur Trübung zugefügt und die Losung stehen gelassen wird. Das Gewicht der erhaltenen, bei 100 C unter vermindetem Drues getrockneten Kristalle betrug 127 mg.
Sie zeigten bei einer Gegenstrom-Verteilungs bestimmung eine Reinheit von 95%. Die
Identität dieser Kristalle mit auf anderem
Wege gewonnenem Vitamin B12 wurde durch
Vergleich der physikalischen und chemischen
Eigenschaften nachgeprüft. Die Resultate sind in folgender Tabelle angegeben : Vergleich des durch Behandeln mit Cyanid erhaltenen Produktes mit auf anderem Wege erhaltenem Vitamin B12.
Produkt aus dem Vitamin B12
Cyanid-Verfahren Verteilungskoeffizient Wasser/Benzylalkohol 1, 2 1, 2 Absorptionsspektrum, # max. (Ä) 2780, 3615, 5500 2780, 3610, 5500 Infrarot-Absorption Beide lIaterialien stimmten bis in die
Einzelheiten miteinander überein.
Refraktions-Indices : a 1, 618 ¯ 0,002 1, 616 0, 002 ss 1,650 ¯ 0,002 1,652 ¯ 0, 002 γ 1,668 ¯ 0,002 1,664 ¯ 0,002
Optische Drehung [a]6563 23 - 61 # 9 - 59 # 9 Löslichketis-Vergleich
Die Bestimmung sowohl der absol. uten Los lichkeit in wässriger Losung als auch der gemischten Loslichkeit in einer mit authenti- schen Vitamin gesättigten Losung zeigten an, dass beide Materialien iclentiseh sind.
Die aus der oben beseliriebenen modifi- zierten Gegenstromvert. eilung zurüekbleibende wässrig'e Losung wird nochmals mit Kalium- cyanid behandelt, die Losung nochmals ange- säuert, dann mit einem Gemisch von Kohlen stufftetrachlorchlorid und Kresol im Verhältnis von 2 : 1 extrahiert und dem Extrakt Äther zugefügt. Der dabei entstandene Niederschlag wird in einer geringen Menge Methanol telöst nnd wiederum Nther zugegeben. Der entstandene Niederschlag wird dann in 0, 13 cm3 Wasser gelost und auskristallisiert.
Die Kristalle werden in wässrigem Aeeton um- krista. llisiert. Es wurden 47 mg Kristalle er haltes (bei 100 C unter vermindertem Druck getrocknet). Durch die Gegenstrom Verteilungsbestimmung wurde festgestellt, dal @ die Kristalle 73% reines Vitamin B12 enthalten.
Auf diese Weise wurde das Äquivalent von 153,3 mg reinem Vitamin Bis aus 4160 Liter erhalten.
Die zweite Hälfte der ursprünglichen met. hanolisehen Losung ergab eine Ausbeute von etwa 50 mg Vitamin B12 bei der Behandlung in angenähert gleicher Weise wie bei der ersten Hälfte, mit der Ausnahme, da# die Behandlung mit dem Cyanid fortfiel, woraus sich ergibt, dass die Behandlung mit Cyanid eine Erhöhung der isolierten Vitamin Bjs- Venge auf das dreifaehe ergibt.
Bei Wiederholung dieses Verfahrens unter Verwendung von Ammonium-, Barium-und Calciumeyanid an Stelle von Kaliumcyanid, zeigten die Resultate in jedem Fall eine Erhöhung der Vitamin-B12-Menge auf ungefähr das dreifache.
Beispiel 2:
Ein durch Kultivieren von S. griseus erhaltenes Konzentrat, welches Vitamin B12 und vitamin-B12-ähnliche Substanzen enthält, wird durch Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol gereinigt, wobei zwei Roliren vemvendet werden und durch jede derselben nacheinander eine Gesamtmenge von 7 Teilen Benzylalkohol in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise geleitet wird.
Das Konzentrat wurde vorher nicht mit Cyanid behandelt. Das in den benzylalkoholi schen Extrakten gereinigte Material wird zur Erzeugung von reinem Vitamin B12 weiter verarbeitet. Die Wassersehichten, welche vitamin-B12-ähnliche Materialien, eine geringe Menge Vitamin B12 und unbekannte Verun- reinigungen enthalten, werden vereinigt imd mit Äther behandelt, wobei sich ein amorpher Niedersehlag bildet, welcher isoliert und ge- trocknet wird. Beim Arbeiten nach den bisher bekannten Methoden wurde dieser Nieder- schlag gewöhnlieh nochmals mit andern minderwertigen Fraktionen verarbeitet, um eine zusätzliche Menge Vitamin B12 nach zahlreichen Reinigungsmassnahmen zu ergeben.
Hierbei trat jedoch noch ein beträchtlicher Verlust an aktiven Substanzen ein.
Ein Teil des amorphen Niederschlages wird für Vergleiehszweeke behandelt und andere Teile werden in folgender Weise mit Cyanid behandelt : a) Ein Teil des Niedersehlages wird in Wasser gelöst und spektrographisch analysiert. Adsorptionsspitzen werden bei 3610 und 5200 A 00 Ä beobachtet. Die Lösung wird dann der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol in der beschrie- benen Weise unterworfen.
Die Messungen der optischen Dichte in der fünften Robre der Gegenstromverteilung ergab, dass ein Maximum von 51 /o, der Summe von Vitamin B12 und der vitamin-Bi2-ähnlichen Substanzen tatsächlich Vitamin B12 waren, was 0, 112 mg Vitamin pro mg der ursprüngliehen festen Stoffe darstellt. b) 10, 5 mg des amorphen Niederschlages werden in 3 em3 Wasser gelöst und 0, 2 em3 flüssige Blausäure zugefügt. Die Lösung wird nach kurzem Stehenlassen auf 50-60 C er hitzt, um die übersehüssige Blausäure zu entfernen.
Die spektrographische Analyse der entstandenen Lösung ergibt Adsorptionsspitzen bei 3610 , 5200 A und 5500 A, was eine Änderung gegen das Vitamin-B12 Spektrum hin anzeigt. Die Lösung wird der Gegenstromverteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen.
Eine Messung der optischen Dichte der Lösung in der fünften Robre zeigte, dass 88, 3 /o der Summe von Vit amin Big und der vitamin-Bl2-ähnlichen Substanzen Vitamin B12 ist ; dies entspricht 0, 220 mg Vitamin B12 pro mg des Ausgangs- materials bzw. einem Zuwachs von 96 %. c) 9, 6 mg des amorphen Niedersehlages werden in 2 cm3 31ethanol gelöst und 0, 2 em3 und wasserfreie flüssige Blausäure zugegeben.
Die Losung wird in einem Eisbad 15 Min. gekühlt und dann bei 50-60 C zur Trockne eingedampft. Der Rüekstand wird in Wasser gelöst. Die spektrographische Analyse ergibt Adsorptionsspitzen bei 3610 A, 5200 A, 5500 A, was eineÄnderung gegen das Vitamin-B12 Spektrum hin erkennen lässt.
Die wässrige Lösung wird der Gegenstrom- Verteilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Die Messung der optischen Dichte der Materialien in der fünften Robre zeigt, dass 81 /o der Summe von Vitamin B12 und der vitamin-B12-ähnliehen Substanzen Vitamin B12 ist ; dies entspricht 0, 219 mg Vitamin B12 pro mg Ausgangs- material bzw. einem Zuwachs von 95, 5%.
Drei weitere Teile des amorphen Niederschlages werden mit flüssiger wasserfreier Blausäure inÄther, Benzylalkohol-bzw.
Kresollösung anstatt der Methanollösung behandelt. In allen Fällen werden Zunahmen des Vitamin-B12-Gehaltes erhalten, wobei die Zunahme in der gleichen Grossenordnung ist, wie diejenige, welche unter Verwendung von Zlethanol erhalten wird. d) 10, 8 mg amorpher Niedersehlag werden mit 2, 2 em3 flüssiger wasserfreier Blausäure gründlich gemischt und stehen gelassen, bis der Cyanwasserstoff verdampft ist. Der Niederschlag wird in Wasser gelost. Die spektrographische Analyse der entstandenen Lösung ergibt Adsorptionsspitzen bei 3610 Ä, 5200 A und 5500 A, was eine Änderung gegen das Vitamin-Bi2-Spektrum hin anzeigt.
Die wässrige Lösung wird der Gegenstromver- teilung zwischen Wasser und Benzylalkohol unterworfen. Eine Messung der optischen Dichte der fünften Robre zeigte an, dass 81"/o der Summe von Vitamin B12 und der vitamin B12-ähnliehen Substanzen Vitamin B12 ist, was 0, 198 mg Vitamin B12 pro mg Ausgangs- material bzw. einem Zuwachs von 77% entspricht.
Beispiel 3 :
11300 Liter Gärbrühe aus verschiedenen Chargen, welche durch Kultivieren eines Stammes von S. griseus erhalten wurde, werden an Holzkohle absorbiert, mit wässrigem Butanol eluiert, mit Benzylalkohol extrahiert, ehromatographiert und, wie im Beispiel 1 be schrieben, zur Aufällung gebracht. Der teste Niederschlag wird mit Methanol extrahiert, bis ein wei#er Rückstand zurückblieb. Die optische Dichte der erhaltenen Methanol- lösung wird durch Messung mit Licht von 5500 A bestimmt. Ein Vergleich mit dem Wert für reines Vitamin B12 ergibt, dass 540 mg Vitamin B12 und vitamin-Bl2-älmliehe Sub- stanzen anwesend sind.
Die methanolisehe Lösung wird durch Zugabe von Aceton und Äther zur Ausfällung gebracht, bis die Flüssigkeiten keinen rosa Farbstoff mehr enthalten.
Der Niederschlag wird in 300 em3 Wasser gelöst und durch wässriges Natriumhydroxyd auf ein pg von etwa 8 eingestellt. Dieser Lösung werden 2, 7 g Natriumcyanid zugefügt, worauf sie unter zeitweisem Rühren 45 Min. stehen gelassen wird. (Die Losung ist purpurfarbig, was anzeigt, da# ein Überschu# an Cyanid zugefügt worden ist).
Die Losung wird dann mit Salzsäure auf pjj 3 eingestellt, worauf Stiekstoff zur Entfernung der Blau säure durch die Losung geleitet wird. 210 g Ammoniumsulfat werden zugefügt und darauf die Losung mit 50 cm3, 25 cm3, 25 cm3 und ssehliesslieh mit 10 cm3 Benzylalkohol extrahiert. Die Extrakte werden durch Er hitzen auf 75-80 C bei vermindertem Druelc getrocknet und die getroekneten Extrakte durch ein gesintertes Glasfilter filtriert. Das Filtrat wird dureh Zugabe von Äther zur Aus- fällung gebracht.
Der Niedersehlag wird in einem Gemisch von 100 cm3 Wasser und 2 em3 Eisessig gelöst und in eine zweite Röhre werden 100 em3 mit Benzylalkohol gesättigtes Wasser gebracht.
Ein Reinigungsverfahren mit Gegenstromver teilung wird in der Weise ausgefiihrt, dass 7 Port. ionen von 100 em3 mit Wasser gesättig- tem Benzylalkohol nacheinander durch jede Rohre geleitet werden, wie im Beispiel 1 be schrieben. Nach Entfernen aus der 2. Röhre werden die benzylalkoholischen Extrakte ver einigt. Die vereinigten Extrakte werden durch Erhitzen auf 75-80 C bei vermindertem Druck getrocknet. Den getrockneten Extrak- ten wird Äther zugefügt.
Der entstandene Niedersehlag wird in Methanol gelöst und mit aktivierter Tonerde chromatographiert, wobei die Kolonne mit AIethanol entwielçelt wird. Die wertvolle Fraktion des Eluats wird zweeks Fällung mit Äther versetzt. Die letzten Fraktionen der Chromatographie weisen eine Farbe von 5500 A auf. Als Vitamin B12 berechnet, ergibt dies ein Äquivalent von etwa 90 mg Vitamin B12. Diese Fraktionen werden zur Weiterverarbeitung aufgehoben. Der Niedersehlag wird in 1, 9 em3 Wasser. gelöst und auskristallisier. Die roten Kristalle werden in 20 em3 Wasser gelöst und die Losung filtriert.
Weitere 20 em3 Wasser werden zum Waschen der Apparatur verwendet und der Lösung zu ,, Nach Zugabe von 520 cm3 Aceton tritt Kristallisation ein. Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Aeeton gewaschen und bei 56 C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug ") 24, 7 mg rote Kristalle. Eine Probe der Kristalle verlor beim Trocknen bei 100 C =) o/o ihres Gewichtes. Die getrocknete Probe envies sich als 94%iges Vitamin B12 bei der Gegenstrom-Verteilungsbestimmung, was einer Ausbeute von 290 mg reinem Vitamin B12 entspricht.
Es zeigte sich, dass angenähert die gleichen Resultate erhalten werden, wenn die Behandlung mit Cyanid in wässriger Methanol-und wässriger Äthanollosung ausgeführt wird.
Beispiel 4 :
Die Behandlung mit Cyanid zur Umwandlung der vitamin-B12-ähnlichen Materialien in Vitamin B12 wird auf die Gärbrühe angewendet und die Umwandlung durch Verwendung des Gegenstrombestimmungsverfah- rens geprüft. 3 Liter Gärbrühe, welche durch Kultivierung eines Stammes von S. griseus erhalten wurden, werden mit 2, 1 g in einer kleinen Menge Wasser gelöstem Natriumcyanid behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden gerührt und mit konzentrierter Salzsäure auf pli 4 eingestellt. Im Vakuum wird über Nacht in Blasen Luft durch die Flüssigkeit gesaugt.
Der Lösung werden 2150 g Ammoniumsulfat und 30 em3 Benzylalkohol zugegeben. Die Mischung wird gerührt, bis zur Entmischung stehen gelassen und die benzylalkoholische Schicht abgetrennt. Die wässrige Schicht wird darauf nochmals mit einer Teilmenge von 20 em3 und 3 Teilmengen von 10 em3 Benzylalkohol extrahiert. Die Wasserschicht, welclie keine LLD-Wirksamkeit aufweist, wird entfernt.
Die vereinigten benzylalkoholisehen Extrakte werden mit 2 Volumen Chloroform verdünnt und mit 3 Teilen von 5 em3 Wasser extrahiert. 10 cm3 der wässrigen Losung, welche etwa 300000 LLD-Einheiten pro cm3 enthalten, werden einem 8-Platten-Gegen stromverteilungssystem mit Benzylalkohol unter Verwendung von 10-cm3-Phasen unterworfen. Die Resultate der Gegenstromverteilung sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
Eine identische Behandlung wurde auf 3 Liter der gleichen Brühe angewendet, mit der Ausnahme, dass kein Natriumeyanid zugefügt wurde. Die ursprüngliche wässrige Lösung, welche durch benzylalkoholische Extraktion erhalten wurde, wurde wieder der Gegenstromverteilung mittels Benzylalkohol unterworfen. Weitere Resultate sind in der Tabelle angegeben.
Die Wirkung von Natriumcyanid in bezuy auf die Umwandlung der LLD-Wirksamkeit der Brille in Vitamin B12.
(Resultate des Gegenstromverteihmg-Bestimmungsverfahrens in dem System Benzylalkohol/Wasser).
Prozentuale Verteilung Rohr Nr. Unbehandelte Brühe Behandelte Brühe Reines Vitamin B,,
1 28,7 1 1,4 2 19, 1 6, 1 8, 3 3 23, 4 29, 0 20, 9 4 15, 5 29, 2 29,-]
5 5,4 20,9 24,2
6 3,9 11,2 12, 1
72, 62, 63, 3
8 0, 7 0, 9 0, 4
Die obige Tabelle zeigt eine ausgesprochene Ändertmg der LLD-Wirksamkeit bei der Gegenstromverteilung in Richtung gegen das reine Vitamin B12 hin nach Behandeln der Brühe mit Natriumcyanid.
Aus den obigen Daten ist es nicht möglieh, die Mengen von Vitamin B12 genau zu berechnen, welche in den behandelten und unbehandelten Brühen enthalten sind. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Verteilung der behandelten Brühen von der unbehandelten Brühe versehieden und sehr ähnlieh der Verteilung von reinem Vitamin B12 ist. Weiter ist ersichtlich, dass die Wirksamkeit der behandelten Brühe in der vierten Robre (welche den maximalen Vitamin-B12-Gehalt aufweist), angenähert doppelt so gro# ist wie diejenige der unbehandelten Brühe.
Beispiel 5 :
100 Liter einer Gärbrühe, erhalten durch Kultivierung eines Stammes von S. griseus, werden mit Salzsäure auf PH 2, 5 eingestellt. Die Brühe wird dann mit 220 mg Natriumeyanid behandelt und das Gemisch 10 Min. gerührt. 100 g Fullererde und 100 g Diatomeenerde werden zugefügt, die entstandene Aufsehlemmung 30 Min. gerührt, das Adsorbat abfiltriert und bei 50"C getrocknet.
Es zeigte eine Wirksamkeit von 843000 Einh. pro g bei einem Versueh mit L. Laetis Dorner mit der Sehalenmethode, sowie eine Förde rung des Wachstums von Kücken.
Unter den beschriebenen Bedingungen wird durch Behandeln mit Fullererde im wesentlichen sämtliches aktives Material der Brühe adsorbiert. Da der Vitamin-Bl2-Gehalt der Brühe durch die Behandlung mit Cyanid ausgesprochen erhöht wird, wie im Beispiel 4 nachgewiesen ist, wird derVitamin-Bl2-Gehalt des so aus der behandelten Brülle hergestellten Adsorbates proportional erhöht.