Procédé de fabrication d'une préparation d'insuline injectable, avec effet retard.
L'effet retard des préparations ordinaires d'insuline, génératriees de dépôt, est dû à la présence ou à la formation d'insuline solide, sous une forme peu soluble au PH du sang.
L'insolubilité de l'insuline est obtenue au moyen de substances étrangères à réaction ba telles telles que protamine, globine ou le produit marque Slrfene , qui donnent avec l'insuline des composés peu solubles en milieu neutre.
La présente invention montre qu'il est possible de s'affranchir complètement de ces principes, et que l'on peut abandonner l'em- p) oi de substances auxiliaires spéciales qui compliquent l'obtention de ces préparations et leur usage clinique.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une préparation d'in- suline injectable avec effet retard ; ce procédé est caractérisé en ce que l'on prépare une sus pension de cristaux d'insuline dans un milieu aqueux injectable ayant, un pjj supérieur à 5 et. inférieur à 9, ce milieu contenant une proportion telle de l'un au moins des métaux exi gés par la eristallisation de l'insuline, que les cristaux d'insuline fixent par réaction chi- mique une partie du métal contenu dans ledit milieu.
Les métaux exigés par la cristallisation de l'insuline sont, par exemple, le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manganèse et le fer.
La quantité de l'un au moins desdits métaux qui doit être présente dans le milieu aqueux pour que les cristaux d'insuline puissent fixer par réaction chimique une partie du métal contenu dans ce milieu dépend de la valeur du pu du milieu, de la concentration de l'insuline et de la teneur en métal que manifestent d'avance les cristaux d'insuline.
En employant des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc d'environ 0, 4"/a ou une teneur correspondante en un des autres métaux et lorsque le pH du milieu s'élève à environ 7, le milieu aqueux doit avoir une teneur en métal supérieure à 5 X l X 10-3 milliéquiva- lents par litre,. l indiquant le nombre d'uni- tés internationales d'insuiline par millilitre de la suspension.
L'augmentation de la teneur en métal, des cristaux d'insuline est due à une réaction chi- mique entre les cristaux et le métal en solu- tion dans le milieu de suspension. L'existence d'une réaction chimique entre l'insuline pré cipitée et. l'un des métaux précités, à savoir le zinc, a été démontrée par Eisenbrand et. IVe- gel, dans < xMedizin und Chemie , IV, pages 278-292 (1942). Selon ces auteurs, l'insuline amorphe est capable de fixer du zinc en quantité correspondant à l'équivalent de ses groupes carboxyliques libres.
La présente invention est basée sur l'ob- servation que des cristaux d'insuline mis en suspension dans un milieu aqueux contenant l'un desdits métaux peuvent fixer par réaction chimique une pa. rtie du métal contenu dans ce milieu et que le métal ainsi fixé se trouve chimiquement lié à l'insuline cristalli- sée, de sorte qu'on obtient des cristaux d'insuline ayant une teneur augmentée en métal.
Cette teneur augmentée en métal n'est pas due à une simple précipitation de l'hydroxyde métallique, étant donné qu'elle se produit aussi dans une zone de p ; j où l'hydroxyde mé- tallique n'est pas précipité. La structure des cristaux d'insuline permet en effet que les substances pénètrent par diffusion dans les cristaux pour s'intégrer, par réaction chimique avec l'insuline, dans le réseau cristallin.
Des examens biologiques et cliniques ont montré que la suspension de cristaux d'insuline avee une teneur augmentée en métal a un effet retard prononcé dans le cas de l'injec- tion hypodermique ou intramusculaire.
Fisher et Seott [Journal of Pharmaeo- logy 58, 93-104 (1936)], à l'oeeasion de recherches scientifiques sur l'importance de la présence du zinc dans les préparations d'in- suline-protamine, avaient déjà obtenu une suspension de cristaux d'insuline dans de l'eau distillée, mais ils trouvèrent, en injec- tant cette suspension par voie hypodermique à des lapins, que 1'effet n'en était pas essen- tellement différent de celui de l'insuline dissoute.
On peut admettre que eeei s'explique par le fait que les cristaux ordinaires d'insuline se dissolvent assez facilement à ! a valeur du
PH (7, 2) habituelle dans le sang et les liquides des tissus. Ainsi, si des cristaux d'insuline tels qu'on les connaît communément, sont mis en suspension dans de l'eau distillée et que le PH de la suspension soit porté à 7, par exemple par de la soude caustique, les cristaux se dissoudront complètement ou en grande partie. En conséquence, les suspensions de cristaux d'insuline dans l'eau distil- lée n'ont trouve aucun usage clinique.
Des expériences biologiques et cliniques effectuées par les inventeurs ont prouve main- tenant. qu'il est possible, par l'emploi de suspensions de cristaux d'insuline préparées d'après la présente invention, d'obtenir par injection hypodermique ou intramusculaire un effet retard qui correspond entièrement a celui des préparations spéciales d'insuline connues jusqu'à maintenant et qui peut même être considérablement plus grand.
Avec une teneur en zinc, dans les cristaux, d'environ 1 /o, par exemple, les préparations obtenues pourront présenter un effet retard non inférieur à celui des préparations connues d'insuline-zine-protamine. Avec une teneur en zinc encore augmentée, il sera possible d'obtenir un effet retard plus grand.
Suivant une forme de mise en oeuvre pré férée du procédé ci-dessus défini, le milieu aqueux eontient une proportion telle d'un des métaux précités que la teneur en métal des cristaux d'insuline de la suspension devienne supérieure à 0, 90 milliéquivalent par gramme.
Quant à la teneur en métal du milieu aqueux de suspension, elle dépend de la teneur en insuline de la suspension, et de la teneur en métal des cristaux d'insuline qu'on désire obtenir. Ainsi, si le milieu de suspen- sion eontient 40 unités internationales d'insuline par millilitre et que son pjj soit de 7
(corrigé par exemple au moyen d'nn hydro xyde alcalin), on obtiendra des cristaux d'in- suline avec une teneur en zinc de 2. 3"/o environ, si le milieu de suspension eontient du zinc à raison de 0, 008 /o ;
dans les mêmes conditions, on obtiendra des cristaux avec une teneur en zinc d'environ 2, 6 /os si le milieu contient 10 unités internationales d'insuline par millilitre, et des cristaux d'insuline avee une teneur en zinc d'environ 1, 8 /o, dans un milieu contenant 80 unités internationales d'insuline par millilitre ; ces chiffres se rapportent à des essais où les cristaux contenaient environ 0, 4 /o de zinc avant d'être mis en suspension.
Pour une même quantité de cristaux d'in- suline par unit. de volume du milieu de suspension, une augmentation de la teneur en métal du milieu a pour effet d'augmenter allssi la teneur en métal des cristaux.
Ainsi, avee une concentration de 40 unités internationales d'insuline par millilitre, la plus fréquemment utilisée en pratique, dans un milieu de suspension contenant 0, 002 . ! o de zinc et présentant un pH de 7, des cristaux d'insuline avec une teneur initiale en zinc d'environ 0, 4 /o augmenteront eette teneur jusqu'à environ 1, 1 /o. Dans les mêmes conditions, mais avec une teneur en zinc de 0, 004 dans le milieu de suspension, les cristaux contiendront environ 1, 7 /o de zinc, tandis qu'une teneur en zinc de 0, 008 /n du milieu de suspension aura pour effet une teneur en zinc d'environ 2,
3 /o dans les cri'.- taux d'insuline.
Si le milieu de suspension a un pH de 7 environ, on peut obtenir que les cristaux contiennent finalement jusqu'à 2, 7 /o de zinc, par exemple, ce qui correspond au nombre de groupements acides de la molécule d'insuline.
Pour les autres métaux, les conditions sont semblables.
Si]'on désire que les cristaux d'insuline en suspension soient saturés de zinc, c'està-dire contiennent environ 2, 74)/o de zinc, le milieu de suspension doit contenir, aux con- litions indiquées ci-dessus, beaucoup plus de zinc, soit environ 0, 03 /o pour une e concen- tration d'insuline de 40 unités internationales par millilitre.
Le pu du milieu de suspension est un des facteurs décisifs de. la teneur métallique aug- mentée des cristaux. Il ne serait pas possible d'obtenir une teneur en métal augmentée dans ! es cristaux d'insuline en suspension si le pu cl. milieu de suspension avait une valeur égale ou inférieure à 5. li est.
en général, pré- férable de donner au milieu de suspension aqueux un pH sensiblement égal à 7, en partie parce que la teneur métallique des cristaux augmente avee la valeur du pH et en partie parce que c'est pour cette valeur du Ptl que les suspensions d'insuline cristallisée donnent les meilleurs résultats dans les applications cliniques.
La stabilisation du PH du milieu de suspension à la valeur désirée peut être effeetuée au moyen d'une substance tampon ou d'un mélange de substances tampons. Des exemples en seront donnés plus loin. En choisissant la substance tampon et pour d'autres substances qu'on peut ajouter au milieu aqueux de suspension, il faut prendre en considération le fait suivant :
On a observé que la présence dans le milieu de suspension de certains anions a une influence sur le pouvoir des cristaux de s'en- richir en métal prélevé du milieu de suspen- sion. Ainsi, si par exemple on met en suspen- sion des cristaux ordinaires d'insuline dans une solution aqueuse de pH 5 contenant 0, 008 /o de zinc et du phosphate de sodium.
(pour rendre la solution 1/120 molaire) et qu'on amène le PH du milieu de suspension à 7, on constate que les cristaux se dissolvent complètement ou en partie sans fixer de zinc.
Le même cas se présente si on emploie un tampon au citrate au lieu du tampon au phosphate. En revanche, avec une solution contenant du nickel et un tampon au phosphate, les cristaux ne se dissolvent pas lorsqu'on amène le pli à 7, mais fixent du nickel prélevé du milieu de suspension.
On suppose donc que les ions phosphate ont une plus grande affinité pour les ions zinc que l'affinité des cristaux d'insuline et fixent ainsi les ions zinc en milieu neutre, tandis que les ions phosphate sont incapables de fixer les ions nickel pour les soustraire aux cristaux d'insuline.
C'est pourquoi, si pn utilise une substance tampon pour régler le PH du milieu de suspension, on doit employer une substance tampon dont l'anion ne fixe pas, en milieu neu- tre, le métal présent dans le milieu de suspen- sion.
Il est, en outre, possible de fabriquer une préparation d'insuline ayant en sus d'un effet retard un effet initial, par exemple en ajoutant, en outre, de l'insuline à l'état amorphe au milieu aqueux,
En faisant varier la teneur du milieu de suspension en zinc et métaux semblables, le WH du milieu et sa teneur en insuline dissoute ou précipitée amorphe, il sera possible d'ob- tenir des préparations d'insuline qui produl- ront, à la fois, un effet retard de durée déterminée d'avance, et de même à un degré déterminé d'avance, le même effet que l'insuline à l'état dissous.
On peut aussi provoquer la cristallisation de 1'insuline dans le milieu aqueux de suspension, en veillant que, à la suite de cette cristallisation, les cristaux d'insuline fixent par réaction chimique une partie du métal contenu dans ce milieu ; ceci peut être réalisé en modifiant, après la cristallisation, le pg d n milieu, de sorte que les cristaux d'insuline deviennent capables de fixer par réaction chi- mique une partie du métal contenu dans ce milieu. On peut cependant aussi ajouter la quantité nécessaire du métal seulement après la cristallisation. En outre, on peut ajouter d'autres substances désirées, telles que les substances nécessaires pour rendre le milieu isotonique et des agents de conservation.
Le milieu de suspension injectable peut être de l'eau distillée additionnée de l'un des métaux mentionnés, par exemple sous forme de leurs sels. Pour des raisons cliniques, il est cependant plus avantageux d'employer un milieu de suspension isotonique. On peut employer des substances telles que le glucose, le chlorure de sodium ou la glycérine pour ren- dre le milieu aqueux isotonique. Il est également avantageux d'ajouter au milieu aqueux un ou plusieurs agents de eonservation eouramment utilisés dans ce but, tels que phénol et dérivés du phénol, p-oxybenzoate de méthyle
fproduit marque Nipagine ), p-oxybenzoare de propyle ou acétate de mercure-pheyle.
Les exemples suivants illustrent l'inven- tion.
. remple 1 :
On prépare un milieu aqueux de suspension contenant : 0, 9% de chlorure de sodium, 0, 7. ! a de p-oybenzoate de'méthyle, 0, 004 /o de zinc (sous forme de chlorure).
On règle le pH cle ce milieu entre 6 et 7, et on y met en suspension des cristaux d'insu- line qui contiennent déjà environ 0, 4% de zinc, en quantité telle que le milieu de suspension en contienne 40 unités internationales par millilitre ; les cristaux en suspension voient leur teneur en zinc augmenter jusqu'à environ 1, 7 /0.
Si on emploie des cristaux d'insuline sensiblement plus grands que 10 microns, il est avantageux d'ajouter au milieu une substance augmentant sa viscosité (par exemple un po lysaeeharide) de façon que les cristaux restent en suspension après agitation de l'ampoule. Ce cas est illustré par l'exemple suivant :
Exemple 2:
On prépare un milieu aqueux de suspen- sion contenant : 0, 9 /o de ehlorure de sodium, 0, 2 /o de trierésol (mélange de m-, o-et p-erésol), 0, 005% de nickel (. sous forme de chlorure).
5 /tlb dextranum de polymerisatum.
Le pu est porté à 6-7 par de la soude caustique.
On met en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline qui ne contiennent pas de nickel, en quantité telle que le milieu de suspension renferme 40 unités internationales d'insuline par millilitre : les cristaux en suspension contiendront du nickel.
Ezeselplc 3 :
On prépare un milieu aqueux de suspen- sion ayant la même acidité que les tissus du corps humain, étant isotonique par rapport au sang et contenant : 1, 3 /o en volumes de glycérine, 0, 1 /o de p-oxybenzoate de méthyles 0, 00 /o de zinc (sous forme de chlorure). acide diéthylbarhituriquef pour rendre la solu-
tion X o molaire).
Le. PIl est porté à environ 7, 2 par \aOH.
On y met en suspension des cristaux d'insuline qui eontiennent déjà environ 0,4% de zinc, en quantité telle que le milieu de suspension en contienne 40 unités internationales par millilitre ; les cristaux en suspension voient leur teneur en zinc augmenter jusqu'à environ 1,1%.
Exeeylple f :
On prépare un milieu aqueux de suspen- sion a réaetion faiblement alealine et conte nuant : 1, 3 /o en volumes de glycérine, 0, l /u de p-oxvbenzoate de méthyle, 0, 016% de zine (sous forme de chlorure), acide borique (pour rendre la solution 1/120
molaire).
Le pj ; est porté à environ 8 par NaOlI.
On met en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline contenant environ 0, 4 /o de zinc, en quantité telle que le milieu de sus pensionencontienne40unitésinternationales par minilitre : ces cristaux auront une teneur en xinc augmentée.
Exemple 5 :
On prépare une solution aqueuse conte- nant : 0, 8% de chlorure de sodium, 0, 14"A ; de p-oxybenzoate de méthyle, 0, 008% de nickel (sous forme de chlorure),
Na2HPO4 (pour rendre la solution 1/120 mo
laire) et on ramené le PH à 7 par fici.
On met en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline avec une teneur en nickel d'environ 0, 3 /o, en quantité telle que la suspension en contienne 40 unités internationales par millilitre ; les eristaux d'insuline en suspension présenteront une teneur augmentée en nickel.
Exemple 6:
On prépare une solution aqueuse contenant : 0, 8 /o de chlorure de sodium, 0, l /o de p-oxybenzoate de méthyle, 0, 0061/o de cuivre (sous forme de chlorure), acétate de sodium (pour rendre la solution
1/120 molaire), et on ramène la valeur du pH à 6 par HCl.
On met en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc d'environ 0, 4 /Ï, en quantité telle que la suspension contienne 40 unités internationales par millilitre de suspension ; les cristaux d'in- suline en suspension contiendront du cuivre.
Les milieux de suspension pour les cris- taux d'insuline utilisés dans les exemples cidessus, ont une composition telle que les cristaux seront pratiquement insolubles dans ces milieux. Les préparations ainsi obtenues seront tout d'abord et surtout marquées par leur effet retard. Comme on l'a déjà indique, on peut aussi obtenir des préparations qui présentent en partie un effet retard et en partie un effet initial.
Ceei est illustré dans l'exemple suivant :
Exemple 7 :
On prépare une solution aqueuse chlorhydrique contenant : 1, 3 % en volumes de glycérine, 0, 1% de p-oxybenzoate de méthyle, 0, 008% de zinc (sous forme de chlorure), acide diéthylbarbiturique (pour rendre la so
lution 1/120 molaire), 0, 087% d'insuline (23 unités internationales
par milligramme) dissoute dans HCI.
Le PH de la solution est porté à environ 7 par NaOH, ce qui provoque la précipitation quantitative, sous forme amorphe, de l'insuline dissoute (20 unités internationales par millilitre).
On ajoute ensuite à cette suspension d'insuline à l'état amorphe des cristaux d'insuline qui, par réaction chimique, fixent une partie du zinc contenu dans le milieu de la suspension, avec formation de cristaux d'insuline ayant une teneur augmentée en zinc.
Dans les exemples ci-dessus, les métaux sont utilisés sous forme de leurs chlorures. Cependant, rien n'empêche de les utiliser sous forme d'autres composés minéraux ou organiques, tels que sulfates, nitrates, acétates, phosphates, hydroxydes, oxydes ou composés métalliques complexes ou sous forme du métal lui-même, pourvu que le métal ou le composé métallique employé se présente dans un état tel que, dans les conditions de prépara tion, le inétal puisse être fixé par les cristaux
d'insuline.
ExenLple 8 :
174 milligrammes d'insuline cristallisée
sont dissous dans 20 millilitres d'HCl 0, 01 n,
après quoi, on ajoute 20 millilitres de solu- tion de chlorure de sodium à 4% et 10 millilitres d'une solution d'acétate de sodium 1/12 2 molaire.
Le pH de la solution est alors ramené à
environ 5, 5, ce qui provoque la cristallisation d'une partie de l'insuline. Lorsque la cristal lisation est terminée, on ajoute 50 millilitres d'une solution de zinc contenant 0, 16"/e de zinc et 0, 2"/o de p-oxybenzoate de méthy] e. Le nu de la suspension résultante est ensuite ramené à environ 7, ce qui permet aux cristaux d'insuline de fixer, par réaction chimique, une partie du zinc qu'on vient d'ajouter.
Exemple 9 :
174 milligrammes d'insuline cristallisée contenant 0, 4 //a de zine sont mis en suspension dans 50 millilitres d'un milieu de suspen- sion aqueux contenant : 1, 6 ouzo de chlorure de sodium, 0, 2 ouzo de p-oxybenzoate de méthyle, acétate de sodium (pour rendre la solution
1/60 molaire), et on ramène le PH à environ 5, 5 par addition d'acide chlorhydrique. A cette suspension, on ajoute 50 millilitres d'une solution de zinc de même acidité et contenant 0, 016 /o zinc.
Une solution de zinc d'acidité différente de celle du milieu de suspension peut aussi être employée, auquel cas il faut ensuite corriger le pg de la suspension finale. Les cristaux d'insuline en suspension contiendront environ 0, 8 /o de zinc.